CN110387360B - 羟基类固醇脱氢酶及其在合成熊去氧胆酸前体中的应用 - Google Patents

羟基类固醇脱氢酶及其在合成熊去氧胆酸前体中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及羟基类固醇脱氢酶及其在合成熊去氧胆酸前体中的应用。具体而言，本发明公开了来源于红球菌的12α‑羟基类固醇脱氢酶及其突变体，其编码基因和氨基酸序列，含有所述基因的重组表达载体和重组表达转化体，以及利用所述羟基类固醇脱氢酶催化12α‑羟基类固醇氧化生成12‑羰基类固醇的应用。与现有的技术相比，本发明使用的重组类固醇脱氢酶催化的氧化反应为NAD+辅酶依赖型的，具有辅酶应用成本低、操作简单、反应条件温和、环境友好、产率高等优势，因此在以胆酸为原料生产制备熊去氧胆酸前体的应用中具有很好的前景。

Description

羟基类固醇脱氢酶及其在合成熊去氧胆酸前体中的应用
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种来源于赤红球菌(Rhodococcusruber)的羟基类固醇脱氢酶，其基因，含有该基因的重组表达载体和重组表达转化体，以及利用该重组羟基类固醇脱氢酶或重组表达转化体作为生物催化剂，并特异性的催化固醇类化合物12α-羟基生成12-酮的应用。
背景技术
胆酸(Cholic Acid,CA)存在于许多动物的胆汁中，化学名为3α,7α,12α-三羟基-5β-胆甾烷-24-酸。熊去氧胆酸(Ursodeoxycholic Acid，UDCA)是名贵中药材熊胆的有效成分，化学名为3α,7β-二羟基-5β-胆甾烷-24-酸，又名乌索去氧胆酸。1902年瑞典化学家Hammarsten首先从北极熊的胆汁中发现UDCA，1927年日本冈山大学Shoda从中国黑熊胆汁中分离、结晶得到UDCA，并对其进行了命名，1954年Kanazawa通过化学法合成UDCA并开始应用于临床(Journal of Biotechnology,2014,191:11-21)。
UDCA在熊的胆汁中含量最高，而在其他动物的胆汁中含量很少。目前，UDCA主要从熊胆中提取，少量由人工合成。“活熊取胆”是从人工养殖黑熊活体中提取UDCA的方法，这种方法产率低，周期长，并且因违背自然伦理而一直受到争议。从二十世纪五十年代开始，就有化学法合成UDCA的报道，随着生物技术的发展，利用生物催化技术及与化学法结合的方法合成UDCA由于具有反应条件温和、选择性高、绿色环保等优点，得到极大关注。当前工业上采用传统的七步合成法生产UDCA，以牛、羊胆汁中的胆酸(CA)为原料，酸性条件下，羧基甲酯化，再用吡啶/冰醋酸进行3位和7位二乙酰化以保护羟基，12位羟基用氧化铬氧化，随后Wolff-Kishner-黄鸣龙还原，然后水解得到CDCA，进一步氧化生成7-羰基石胆酸(7-KLCA)，最后在正丙醇中用碱金属钠还原得到UDCA。这种方法步骤繁琐，合成路线长，反应条件剧烈，操作安全性差，总收率低(27％-32％)，环境污染严重，不符合当代可持续发展的理念。在日本专利(JP 02282393)的一份报道中，在丁醇溶液，氢氧化钠和钯碳存在的碱性条件下，于100℃，80kg/cm2的压力环境中，化学法催化7-KLCA的氢化反应，反应5h，UDCA的得率为88.2％。由于此方法需要在高压下反应，操作不便，没有投入实际应用。
近年来，鉴于化学法合成的低效性和对环境的严重污染，生物法成为新兴的熊去氧胆酸的合成方法，胆酸、鹅去氧胆酸、脱氢胆酸作为合成熊去氧胆酸的底物也备受关注。其中，以胆酸为底物合成熊去氧胆酸是最为廉价的方法。使用胆酸为底物合成熊去氧胆酸的合成方案是首先将胆酸的12位的羟基进行氧化，再通过黄鸣龙反应除去12位的羰基氧生成鹅去氧胆酸，接着，使用7α-羟基类固醇脱氢酶和7β-羟基类固醇脱氢酶对7位的羟基进行差向异构化，最终获得鹅去氧胆酸的差向异构体——熊去氧胆酸。
胆酸是合成熊去氧胆酸的重要廉价底物，12α-羟基类固醇脱氢酶是以胆酸为底物合成熊去氧胆酸过程中的一个关键的酶。2009年，Riva等报道了生物催化CA转化生成12-oxo-CDCA，进而利用化学法催化还原制备UDCA的方法(Adv Synth Catal,2009,351:1303-1311)。但是使用的12α-羟基类固醇脱氢酶是该课题组向其他公司购买，其氨基酸序列与核酸序列并未报到。2011年美国发明专利公开了一种梭菌属来源12α-羟基类固醇脱氢酶的母本和突变体的氨基酸和核酸序列以及该酶在合成12-oxo-CDCA中的应用(US20110091921A1)。2018年，美国Ridlona课题组通过对肠道微生物宏基因组的测序，并分别对固醇化合物各位置羟基氧化酶的挖掘，发现了一个来源于肠道微生物(Eggerthellasp.)的12α-羟基类固醇脱氢酶，并对其进行了系列表征，纯化后的酶对胆酸表现出22.6U/mg的活力(Appl Environ Microbiol,84:e02475-17)。同年该课题组又报道了另外三种梭菌来源的12α-羟基类固醇脱氢酶，并进行了一系列的表征，其中，对胆酸活力最高的达到近200U/mg(Appl Environ Microbiol,84:e00235-18)。
综上所述，用胆酸作为底物，酶法合成鹅去氧胆酸前体12-羰基鹅去氧胆酸的反应中，12α-羟基类固醇脱氢酶是一个关键的酶，目前为止，已报道序列的12α-羟基类固醇脱氢酶均是辅酶NADP+依赖型的，酶促反应液中需要加入辅酶NADP+。由于辅酶NADP+价格昂贵，高昂的辅酶应用成本是酶法工业化生产的限制因素。与NADP+相比，NAD+的价格相对低廉，并且更加稳定。辅酶NAD+与NADP+的分子结构上的差异在于：在辅酶的腺苷部分，NADP+的分子结构中多了一个额外的2'-磷酸基团。如果能够使用基因挖掘以及分子工程手段，得到NAD+依赖型的12α-羟基类固醇脱氢酶，并对其进行改造使其高效催化氧化生成12-羰基鹅去氧胆酸，对降低酶法合成熊去氧胆酸的生产成本将具有重大的意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，针对目前生物催化法以胆酸为底物合成熊去氧胆酸中辅酶应用成本较高的问题，通过基因挖掘和分子手段改造，提供一种赤红球菌(Rhodococcus ruber)来源的催化活性高，特异性强、NAD+辅酶依赖型的羟基类固醇脱氢酶。
所述赤红球菌(Rhodococcus ruber)购自中国普通微生物菌种保藏管理中心；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院；菌种保藏编号：CGMCC No.1.10360；分类命名：Rhodococcus ruber。
本发明还公开了包括该羟基类固醇脱氢酶基因的重组表达载体和重组表达转化体，以及所述重组羟基类固醇脱氢酶在固醇类化合物羟基氧化中的应用。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
本发明第一方面：提供了一种可以催化固醇12α-羟基氧化的羟基类固醇脱氢酶。
本发明所述羟基类固醇脱氢酶来源于菌种保藏编号为CGMCC No.1.10360的赤红球菌(Rhodococcus ruber)。申请人通过对自然界微生物以及实验室保存菌种的大量筛选，发现购自中国普通微生物菌种保藏管理中心的菌种保藏编号为CGMCC No.1.10360的赤红球菌(Rhodococcus ruber)经过培养，可以催化固醇类化合物的12α-羟基氧化。通过基因比对以及挖掘的方法获得了该菌株中相应的羟基类固醇脱氢酶，并将其命名为Rr12α-HSDH，该酶是NAD+依赖型。所述的羟基类固醇脱氢酶Rr12α-HSDH的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
本发明第二方面，还对所述羟基类固醇脱氢酶Rr12α-HSDH的氨基酸序列进行分子手段的改造，得到所述羟基类固醇脱氢酶的突变体，所述羟基类固醇脱氢酶的突变体为具有如下任一氨基酸序列的蛋白质：
(1)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第122位谷氨酰胺替换为丝氨酸，第55位谷氨酸替换为赖氨酸；
(2)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第114位苯丙氨酸替换为色氨酸，第139位甘氨酸替换为赖氨酸；
(3)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第61位丙氨酸替换为甘氨酸；
(4)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第181位缬氨酸替换为丙氨酸，第122位谷氨酰胺替换为丝氨酸；
(5)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第139位甘氨酸替换为赖氨酸；
(6)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第72位异亮氨酸替换为甲硫氨酸，第61位丙氨酸替换为甘氨酸；
(7)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第189位甘氨酸替换为赖氨酸；
(8)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第188位谷氨酸替换为谷氨酰胺；
(9)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第193位色氨酸替换为酪氨酸，第55位谷氨酸替换为赖氨酸；
(10)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第80位苯丙氨酸替换为酪氨酸。
本发明第三方面，还提供了上述羟基类固醇脱氢酶及其突变体的编码核酸。所述羟基类固醇脱氢酶Rr12α-HSDH的编码DNA的来源包括：通过基因克隆技术获得所述羟基类固醇脱氢酶Rr12α-HSDH的编码DNA，或者通过人工全序列合成的方法得到所述的羟基类固醇脱氢酶的编码DNA。
通过聚合酶链式反应(PCR)可获得编码所述的羟基类固醇脱氢酶Rr12α-HSDH以及其突变体的完整DNA序列。其中涉及的合成引物，优选的如SEQ ID No.3(上游引物)和SEQID NO.4(下游引物)所示：
上游引物：5’-CCGGAATTCATGAAACTGCGCGGGAAGA-3’，下划线所示序列为限制性内切酶EcoR I的酶切位点；
下游引物：5’-CCCAAGCTTTCACCGCAGCTTGATGCTGC-3’，下划线所示序列为限制性内切酶Hind III的酶切位点。
所述的羟基类固醇脱氢酶Rr12α-HSDH全长基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，全长为753个核苷酸碱基。其编码序列(CDS)从第一个碱基其至第753个碱基终止，起始密码子为ATG，终止密码子为TGA，无内含子，该基因编码的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
本发明第四方面，还提供了包含所述羟基类固醇脱氢酶Rr12α-HSDH或其突变体核酸序列的重组表达载体。所述重组表达载体可通过本领域常规方法将所述羟基类固醇脱氢酶基因克隆到各种表达载体上构建而成。所述的表达载体较佳的包括本领域常规的各种质粒载体，优选的为pET28a质粒。
可通过下述的方法制得本发明所述的重组表达载体：将通过PCR扩增所得的羟基类固醇脱氢酶Rr12α-HSDH或其突变体的基因序列DNA片段用限制酶EcoR I和Hind III双酶切，同时将空载体质粒pET28a同样用限制酶EcoR I和Hind III进行双酶切，回收上述酶切后的羟基类固醇脱氢酶DNA片段和质粒，通过T4DNA连接酶进行连接，构建获得包含所述羟基类固醇脱氢酶Rr12α-HSDH及其突变体基因的重组表达载体。
本发明第五方面，还提供了表达所述羟基类固醇脱氢酶Rr12α-HSDH或其突变体的重组表达转化体。所述重组表达转化体可通过将上述重组表达载体转化至宿主细胞中制得。所述宿主细胞为本领域常规的宿主细胞，只要能满足重组表达载体可稳定地自行复制，并且其所携带的羟基类固醇脱氢酶Rr12α-HSDH及其突变体的基因可被有效表达即可。所述宿主细胞优选为大肠杆菌，更优选的为：大肠杆菌E.coli BL21(DH3)。将所述重组表达载体转化至大肠杆菌E.coli BL21(DH3)中，即可获得本发明优选的基因工程菌株。例如，将重组表达载体pET28a-(Rr12α-HSDHM8)转化至大肠杆菌E.coli BL21(DH3)中，获得重组大肠杆菌E.coli BL21(DH3)/pET28a-(Rr12α-HSDHM8)。
本发明第六方面，还提供了羟基类固醇脱氢酶催化剂的制备方法。本发明所述重组羟基类固醇脱氢酶的制备方法较佳地为：培养如上所述的重组表达转化体，分离获得重组表达的羟基类固醇脱氢酶。其中所述重组表达转化体培养所用的培养基为本领域任何可使转化体生长并产生本发明所述重组羟基类固醇脱氢酶的培养基。所述培养基优选LB培养基，其配方为：蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 10g/L，pH 7.0。培养方法和培养条件没有特殊的限制，可以根据宿主细胞类型和培养方法等因素的不同，按本领域常规知识进行适当的选择，只要使转化体能够生长并生产所述的重组羟基类固醇脱氢酶即可。重组表达转化体培养的具体操作可按本领域常规操作进行。优选的，将本发明所述的重组大肠杆菌，接种至含卡那霉素的LB培养基中，37℃培养，当培养液的光密度OD600达到0.5～1.0(优选0.6)时，加入终浓度为0.1～1.0mmol/L(优选0.5mmol/L)的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)进行产酶诱导，在16℃继续培养24h，即可高效表达本发明所述的羟基类固醇脱氢酶。培养结束后，离心收集沉淀的菌体细胞，即为重组表达转化体的静息细胞；将收获的细胞悬浮于KPB缓冲液(100mM，pH 6.0)中，超声破碎，破碎液离心，收集上淸液，即可获得所述重组羟基类固醇脱氢酶的酶液；将离心收获的细胞沉淀冷冻干燥，可以获得冻干细胞，有利于长期存放，方便以后使用。
根据下式计算得到酶活力：
酶活力(U)＝EW×V×103/(6220×l)
式中，EW为1分钟内340nm处吸光度的变化；V为反应液的体积，单位为mL；6220为NADH的摩尔消光系数，单位为L/(mol·cm)；l为光程距离，单位为cm。1个酶活力单位(U)对应于上述条件下每分钟还原lμmol NAD+所需的酶量。
本发明第七方面，还提供了羟基类固醇脱氢酶催化剂，其是以下形式中的任意一种：
(1)培养所述重组表达转化体，分离含有羟基类固醇脱氢酶的转化体细胞；
(2)培养所述重组表达转化体，分离含有所述羟基类固醇脱氢酶突变体的转化体细胞，对含有羟基类固醇脱氢酶的转化体细胞进行破碎，获得的细胞破碎液；
(3)培养所述重组表达转化体，分离含有所述羟基类固醇脱氢酶突变体的转化体细胞，对含有羟基类固醇脱氢酶的转化体细胞进行破碎，获得的细胞破碎液，将羟基类固醇脱氢酶的细胞破碎液经冷冻干燥而得到的冻干酶粉；
(4)直接以所述的羟基类固醇脱氢酶或其突变体作为催化剂。
本发明第八方面，还提供了上述羟基类固醇脱氢酶催化剂(包括羟基类固醇脱氢酶Rr12α-HSDH及其突变体)在催化固醇类化合物的转化，特别是利用胆酸制备熊去氧胆酸前体12-氧代鹅去氧胆酸中的应用。其中所述固醇类化合物的化学结构如下所示：
Figure BDA0002098662030000061
本发明羟基类固醇脱氢酶催化剂，对上述固醇类化合物进行氧化反应，可按照下述的示例方法进行：在pH 7.0-10.0的磷酸盐缓冲液中，在乳酸脱氢酶和NAD+的存在下，在所述羟基类固醇脱氢酶突变体Rr12α-HSDHM8的作用下，催化上述所述的固醇类化合物的氧化，同时将辅酶NAD+还原成NADH。
优选地，为了进行辅酶NAD+的循环再生，向反应体系中额外添加丙酮酸钠和来自德氏乳杆菌的乳酸脱氢酶(如：基因登录号WP_011543503.1)。乳酸脱氢酶的活力单位上载可以与所述重组羟基类固醇脱氢酶相等或者高于所述重组酶。
优选地，所述反应条件为：在pH 6.0-10.5的缓冲盐溶液中进行，底物胆酸(CA)的浓度为20-80g/L，丙酮酸钠与底物的摩尔比为1.0-2.0，NAD+添加量为0.2-0.8mmol/L，温度20-50℃。所述缓冲盐溶液可以是本领域常规的任何缓冲液，只要其pH范围在6.0-10.5即可，比如磷酸钠、磷酸钾、Tris-HCl或者甘氨酸-NaOH缓冲液，优选pH范围为8.0-10.0，更优选pH 8.0的磷酸钾缓冲液。缓冲液的浓度可以为0.05-0.2mol/L，优选为0.1mol/L。所述氧化反应的温度可以是20-50℃，优选30-40℃。
优选的，根据所采用的上述反应体系，所述的羟基类固醇脱氢酶可以为10～100U/L。同时，根据所采用的上述体系，乳酸脱氢酶的活力单位的上载可以为同反应体系的所述重组羟基类固醇脱氢酶相等或者更高。
反应过程中，间歇取样测定反应转化率，反应时间以底物完全转化或反应转化率停止增长的时间为准，一般为0.5-24h。反应转化率采用液相色谱法进行分析，使用C-18柱(250mm×4.6mm)，流动相为甲醇：水＝75:25(磷酸调节pH为3.0)，柱温30℃，流速0.8mL/min，检测波长210nm，分析时间选择20min。反应结束后，将催化剂分离除去后经处理可获得高纯度的12-氧代鹅去氧胆酸(12-oxo-CDCA)。
与现有技术相比，本发明具有显著优势：
本发明的重组羟基类固醇脱氢酶Rr12α-HSDH及其突变体是辅酶NAD+依赖型的催化胆酸等固醇12位α羟基氧化的酶，在工业应用上，NAD+相比NADP+更廉价，并且稳定性更好。在后续的应用中，通过辅酶再生，可以使用用量更少的辅酶NAD+；其次，本发明的底物(胆酸，CA)上载量可以达到80g/L以上，时空产率高；另外，本发明具有生产成本低、操作简单、反应条件温和、环境友好，产率高等显著优点，适宜于工业应用。
具体实施方式
本发明内容中所述的各反应或检测条件，可根据本领域常识进行组合或更改，并可通过实验得到验证。下面将结合具体实施例，对本发明中的技术方案和技术效果进行清楚、完整地描述，但是本发明的保护范围并不限于这些实施例，凡是不背离本发明构思的改变或等同替代均包括在本发明的保护范围之内。
下列实施例中的材料来源为：
赤红球菌(Rhodococcus ruber)，保藏编号为CGMCC No.1.10360，该菌种保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心。
质粒载体pET28a购自Novagen公司。
E.coli DH5α和E.coli BL21(DE3)感受态细胞、2×Taq PCR MasterMix、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒均购自北京天根生化科技有限公司。
限制性内切酶EcoR I、Hind III、Xho I、Not I和Sac I均为New England Biolabs(NEB)公司的市售产品。
除非另有说明，下列实施例中的具体实验按照本领域常规方法和条件进行，或遵照试剂盒的商品说明书。
实施例1羟基类固醇脱氢酶Rr12α-HSDH的基因克隆以及转化表达
采用高盐法获取完整的保藏编号为CGMCC No.1.10360的赤红球菌(Rhodococcusruber)的基因组。将保藏编号为CGMCC No.1.10360的赤红球菌(Rhodococcus ruber)接种到LB培养基中，37℃培养24h，取100mL菌液，于8,000rpm下离心10min，收集菌体，用20mL生理盐水洗涤，重复两次，然后用20mL生理盐水重悬菌体。悬浮菌液中加入1mL溶菌酶液(50mg/mL)，37℃水浴恒温1h；加入1.6mL的十二烷基磺酸钠溶液(10％,w/v)，160μL蛋白酶K(20mg/mL)，55℃水浴保温，直到悬浮液变清。加入1/3体积的饱和NaCl溶液，振荡混匀至溶液变浑浊，然后高速离心10min，弃去细胞碎片。用等体积的酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)反复萃取，直到两相界面上看不到蛋白质时停止。吸取萃取之后的水相上清液，加入0.6倍体积的异丙醇，混匀后置于-20℃，低温析出DNA，离心弃去上清，用75％的乙醇洗涤沉淀DNA，室温干燥，最后加入20μL的TE缓冲液(100mM Tris-HCl,10mM EDTA,pH 8.0)溶解基因组DNA。
使用限制性内切酶EcoR I和Hind III对基因组DNA进行双酶切，对酶切片段进行电泳分离，收集500～1500kbp的DNA片段。将空载质粒pET28a用同样的限制性内切酶EcoR I和Hind III进行双酶切。使用T4连接酶将回收的DNA片段与质粒pET28a片段进行连接，两者的摩尔浓度比为3:1，于16℃过夜连接。将连接产物全部转化到大肠杆菌BL21中，涂布含有50μg/mL卡那霉素的LB固体培养基平板，37℃培养12h。用无菌牙签将所有的单克隆分别挑至96孔深孔板的孔洞中，每个孔洞中装有300μL含有50μg/mL的卡那霉素的LB培养基。37℃振荡培养12h，取50μL培养液转接至600μL含有100μg/mL卡那霉素的LB培养基，37℃振荡培养3h后加入终浓度为0.2mmol/L的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)，并于16℃诱导24h。3500×g离心10min，弃去上清培养基，放入-80℃冰箱冷冻2h。从冰箱中拿出深孔板，待菌液融化后，每个孔洞中加入200μL溶菌酶液(750mg溶菌酶和10mg DNA酶溶解于1L去离子水中)，震荡混匀，37℃静置1h。4℃、3500×g离心10min，分別取50μL破碎离心上淸液转移到新的96孔板中，加入15μL反应液(100mM KPB,pH 8.0,含有1mM CA以及0.25mM NAD+)，30℃震荡混匀，在酶标仪上读取340nm处吸光度值的减少。对吸光度值显著下降的克隆子进行活性复筛，将其接种到4mL含有100μg/mL卡那霉素的LB培养基中，37℃培养2h，加入终浓度为0.2mM的IPTG，16℃培养24h，8000×g离心10min，弃上清，加入500μL的KPB缓冲液(100mM，pH8.0)进行重悬，然后加入底物CA至终浓度为25mM，乳酸脱氢酶为15U/mL，丙酮酸钠37.5mM，NAD+终浓度0.2mM，30℃，100rpm的条件下反应24h。反应结束后使用HPLC检测有没有产物生成。有产物的克隆为阳性克隆子，委托上海桑尼生物技术有限公司进行序列测定，根据开放阅读框，获得如SEQ ID No.1所示的核酸序列，根据该核酸序列所推测的氨基酸序列如SEQID No.2所示，将该序列表达的羟基类固醇脱氢酶命名为Rr12α-HSDH。
实施例2羟基类固醇脱氢酶Rr12α-HSDH的随机突变
在实施例1酶的基因挖掘基础上，采用易错PCR技术随机突变，进一步提高酶的活性。
根据Rr12α-HSDH的开放阅读框，设计上、下游引物如下：
上游引物，如SEQ ID No.3所示：
5’-CCGGAATTC ATGAAACTGCGCGGGAAGA-3’
下游引物，如SEQ ID No.4所示：
5’-CCCAAGCTTTCACCGCAGCTTGATGCTGC-3’
其中上游引物下划线所示序列为EcoR I的酶切位点，下游引物下划线所示序列为Hind III的酶切位点。
以pET28a-12α-HSDH为模板，用rTaq DNA聚合酶进行易错PCR，构建随机突变库。
其中PCR体系(50μL)包含如下组分：
Taq DNA聚合酶0.5μl，10×PCR buffer(Mg2+Plus)5.0μl，dNTP Mixture(各2.0mM)4.0μl，终浓度为100μmol/L的MnCl2，pET28a-12α-HSDH质粒0.5ng，上下游引物(10μM)各2μl，加灭菌蒸馏水补足至50μl。
PCR反应程序如下所述：
(1)95℃预变性5min；(2)94℃变性30s；(3)58℃退火30s；(4)72℃延伸1min；步骤(2)～(4)共进行30个循环；最后72℃延伸10min，4℃保存产物。
PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分析验证后切胶纯化回收，对回收后的目的基因与空载质粒pET28a分别用限制性内切酶EcoR I和Hind III在37℃双酶切12h。双酶切产物经琼脂糖凝胶电泳分析验证后切胶纯化回收，用T4DNA连接酶于16℃连接过夜。将连接产物转化到大肠杆菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，并均匀涂布于含有50μg/ml卡那霉素的LB琼脂平板上，置于37℃培养箱中静置培养约12h。将所得到的单克隆菌落挑取到96孔深孔板中进行培养，对培养的细胞进行破壁，以NAD+为辅酶，在96孔板中对表达的蛋白进行高通量活力筛选，对活性较高的突变体进行纯化表征，对相应的基因进行测序。
所述Rr12α-HSDH突变体的高通量活力筛选测定方法：将含0.5mmol/L CA和0.1mmol/L NAD+的磷酸钾缓冲液(100mmol/L，pH 8.0)分装到96孔板中，预热至30℃，然后分别加入适量的Rr12α-HSDH突变体，30℃振荡反应，在酶标仪上检测340nm处NADH的吸光度变化，记录1分钟内吸光度的变化值，计算相应的酶活力。
通过筛选，得到了对NAD+活性显著提高的突变体，这些突变体的序列以及这些突变体对NAD+的活性列于表1中。在表1中，序列标号分别对应于表1后面的一系列序列。在活性列中，与母本Rr12α-HSDH相比，一个加号“+”表示突变体蛋白对NAD+的活性提高了1-10倍；两个加号“++”表示突变体蛋白对NAD+的活性提高了10-100倍；
表1. 10组突变体的突变位点及其活性变化
Figure BDA0002098662030000101
Figure BDA0002098662030000111
对应序列标号的Rr12α-HSDH突变体的氨基酸序列分别如下：
(1)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第122位谷氨酰胺替换为丝氨酸，第55位谷氨酸替换为赖氨酸；
(2)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第114位苯丙氨酸替换为色氨酸，第139位甘氨酸替换为赖氨酸；
(3)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第61位丙氨酸替换为甘氨酸；
(4)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第181位缬氨酸替换为丙氨酸，第122位谷氨酰胺替换为丝氨酸；
(5)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第139位甘氨酸替换为赖氨酸；
(6)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第72位异亮氨酸替换为甲硫氨酸，第61位丙氨酸替换为甘氨酸；
(7)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第189位甘氨酸替换为赖氨酸；
(8)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第188位谷氨酸替换为谷氨酰胺；
(9)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第193位色氨酸替换为酪氨酸，第55位谷氨酸替换为赖氨酸；
(10)将SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第80位苯丙氨酸替换为酪氨酸；
本实施例中所筛选得到的优良突变体中，具有最好的催化活性的突变体为上表中突变体编号为M8的突变体，其氨基酸序列如SEQ ID No.6所示，对应的核酸序列如SEQ IDNo.5所示。将M8突变体命名为Rr12α-HSDH M8。
实施例3羟基类固醇脱氢酶Rr12α-HSDH M8的基因克隆
在实施例1所述基因克隆的基础上，依据羟基类固醇脱氢酶Rr12α-HSDH M8的开放阅读框，设计上、下游引物，以核酸序列编号为SEQ ID No.6为模板，进行PCR扩增。
上游引物，如SEQ ID No.3所示：
5’-CCGGAATTCATGAAACTGCGCGGGAAGA-3’
下游引物，如SEQ ID No.4所示：
5’-CCCAAGCTTTCACCGCAGCTTGATGCTGC-3’
其中上游引物下划线所示序列为EcoR I的酶切位点，下游引物下划线所示序列为Hind III的酶切位点。
PCR体系为：2×Taq PCR MasterMix 25μL，上游引物和下游引物(10ng/μL)各2.5μL，1μL含有核酸序列编号为SEQ ID No.5基因的质粒(150ng/μL)，以及19μL ddH2O。PCR扩增程序为：95℃预变性5min后进行32次如下循环：94℃变性30秒，50℃退火30秒，72℃延伸1分钟；循环结束后，最后再72℃延伸10分钟。PCR扩增产物进行凝胶电泳纯化后，用DNA回收试剂盒回收目的片段。
实施例4羟基类固醇脱氢酶Rr12α-HSDH M8重组表达质粒和重组表达转化体的制备
将实施例3中PCR扩增所得的羟基类固醇脱氢酶的目的DNA片段以及pET28a空质粒同时用限制性内切酶EcoR I和Hind III双酶切4h，然后经琼脂糖凝胶电泳纯化、DNA试剂盒回收。将回收的酶切目的片段和空载体在T4DNA连接酶的作用下，于4℃连接12小时，得到重组质pET28a-(Rr12α-HSDHM8)。将所得重组质粒转化至E.coli DH5α，涂布到含有50μg/mL卡那霉素的LB培养基平板上，37℃培养8小时，对长出來的菌落进行菌落PCR验证，挑取成功扩增长度约754bp的目的条带的阳性克隆。测序验证后，提取质粒，进一步转化至E.coli BL21(DE3)，形成重组表达转化体E.coliBL21(DE3)/pET28a-Rr12α-HSDHM8。
实施例5羟基类固醇脱氢酶Rr12α-HSDH M8的诱导表达
将实施例3中所得的重组表达转化体E.coli BL21(DE3)/PET28a-Rr12α-HSDHM8，接种至含50μg/mL卡那霉素的LB培养基中，37℃摇床振荡培养12小时，之后按1％(v/v)的接种量接种至装有100mL LB培养基(含50μg/mL卡那霉素)的500mL三角烧瓶中，放入摇床中，37℃、180rpm振荡培养，当培养液的OD600达到0.6时，加入IPTG至终浓度0.2mmoL/L进行诱导，16℃诱导24小时后，将培养液以8000rpm转速离心，收集细胞沉淀，并用生理盐水洗涤，得到静息细胞，将其冷冻干燥，制得的冻干细胞，其比活力为4.2U/mg DCW。
将2.5g如上方法所得的静息细胞悬浮于100mL的磷酸钾缓冲液(l00mM，pH8.0)中，冰水浴中进行超声破碎，离心收集上清液，即为重组羟基类固醇脱氢酶Rr12α-HSDH M8的粗酶液。所得粗酶液经聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，重组羟基类固醇脱氢酶Rr12α-HSDH M8以可溶的形式存在。将获得的重组羟基类固醇脱氢酶Rr12α-HSDH M8的粗酶液进行冷冻干燥，制得重组羟基类固醇脱氢酶Rr12α-HSDH M8的粗酶粉，比活力为20U/mg。
纯化实验全部使用镍亲和自装柱完成，纯化过程中使用的缓冲液为：A液：50mMKPB,500mM NaCl,10mM咪唑,2mMβ-巯基乙醇,pH8.0；B液：50mM KPB,500mM NaCl,500mM咪唑,2mMβ-巯基乙醇,pH8.0；C液：50mM KPB,150mM NaCl,1mM DTT,pH9.0。纯化方法如下：
1、菌体用A液重悬后超声破碎，破碎后的粗酶液用低温高速离心机在4℃离心，12000rpm离心3min，离心后的上清液暂时保存在4℃冰箱或冷库里；
2、Ni柱用5～10倍柱体积的A液预先平衡；
3、保存的上清液经滤膜过滤后上样；
4、上样完成后用5～10倍柱体积的A和B混合液(10％B液)洗去杂蛋白；
5、用2个柱体积的B液洗脱目的蛋白并收集；
6、将收集到的目的蛋白用10kDa的超滤管进行离心浓缩，浓缩到0.5mL时添加5mL的C液继续浓缩超滤；重复3-4次降低咪唑浓度实现置换；
7、添加20％甘油，用液氮速冻后，置于-80℃冷冻保藏。
将纯化后的进行酶学性质的表征，经过对不同的底物进行表征动力学参数的测量，并通过origin Pro2015进行拟合，得到纯酶Vmax为270μmol/min/mg。
实施例6 pH对羟基类固醇脱氢酶Rr12α-HSDH M8催化活性的影响
在pH 6～10.5的范围内按标准方法测定pH对重组羟基类固醇脱氢酶Rr12α-HSDHM8氧化方向活性的影响。缓冲液分别为磷酸钾缓冲液(6.0～8.0)，Tris-HCl缓冲液(8.0～9.0)，甘氨酸-NaOII缓冲液(9.0～10.0)。
在l mL上述缓冲液体系中，加入胆酸和NAD+至终浓度分別为1mmol/L和0.25mmol/L，预热至30℃，然后加入适量的Rr12α-HSDHM8，混合均匀，30℃保温反应，在分光光度计上检测340nm处NADH的吸光度变化，测定不同的pH的缓冲溶液中，Rr12α-HSDHM8的活性差异，结果如表2所示。优选酶促反应的pH的范围为8.0～10.0。
表2.pH对Rr12α-HSDH M8催化氧化胆酸活力的影响
Figure BDA0002098662030000141
Figure BDA0002098662030000151
实施例7温度对羟基类固醇脱氢酶Rr12α-HSDHM8催化活性的影响
在l mL Gly-NaOH缓冲液(pH 10.0)体系中，加入胆酸和NAD+至终浓度分別为1mmol/L和0.25mmol/L，在20℃～50℃环境中预热10min，然后加入适量的Rr12α-HSDHM8，混合均匀，在与预热相同的温度环境中保温反应，在分光光度计上检测340nm处NADH的吸光度变化，测定不同温度的缓冲溶液中，Rr12α-HSDHM8的活性差异，结果如表3所示。优选酶促反应的温度范围为30℃～40℃。
表3.温度对Rr12α-HSDHM8催化氧化胆酸活力的影响
Figure BDA0002098662030000152
实施例8-11重组Rr12α-HSDH M8催化氧化系列固醇类底物
在10mL夹套反应器中，依次加入10mL磷酸钾缓冲液(100mM,pH 8.0)，20g/L(50mM)的CA、UCA、7-oxo-CDCA或DCA，75mM丙酮酸钠，10U/mL的如实施例3获得的重组Rr12α-HSDH M8粗酶液，15U/mL的乳酸脱氢酶，以及终浓度0.2mM的NAD+。30℃条件下200rpm磁力搅拌反应。间歇取样检测反应转化率，反应5h，转化率大于99％，终止反应。
上述反应产物经过纯化后，通过液相分析检测结果，检测使用C-18柱，甲醇：水＝75:25(磷酸调pH＝3)为流动相，柱温30℃，流速0.8mL/min，检测波长210nm，结果见表4。
表4重组Rr12α-HSDHM8催化氧化系列固醇类底物实验结果
Figure BDA0002098662030000161
实施例12重组Rr12α-HSDHM8催化合成12-oxo-CDCA
在10mL夹套反应器中，依次加入10mL磷酸钾缓冲液(100mM,pH 8.0)，0.203g的CA(50mM)，0.056g丙酮酸钠(50mM)，10U/mL的如实施例3获得的重组Rr12α-HSDHM8粗酶液，15U/mL的乳酸脱氢酶，以及终浓度0.2mM的NAD+。30℃条件下200rpm磁力搅拌反应。间歇取样检测反应转化率，反应4h，转化率为95％。终止反应，经过纯化后，得到0.155g产物，纯度大于95％。转化率检测使用C-18柱，甲醇：水＝75:25(磷酸调pH＝3)为流动相，柱温30℃，流速0.8mL/min，检测波长210nm。
实施例13重组Rr12α-HSDHM8催化合成12-oxo-CDCA
在10mL夹套反应器中，依次加入10mL磷酸钾缓冲液(100mM,pH 8.0)，0.410g的CA(100mM)，0.168g丙酮酸钠(150mM)，20U/mL的如实施例3获得的重组Rr12α-HSDHM8粗酶液，30U/mL的乳酸脱氢酶，以及终浓度0.2mM的NAD+。30℃条件下200rpm磁力搅拌反应。间歇取样检测反应转化率，反应16h，转化率为96％。终止反应后，经过纯化得到0.338g产物，纯度为93％。转化率检测使用C-18柱，甲醇：水＝75:25(磷酸调pH＝3)为流动相，柱温30℃，流速0.8mL/min，检测波长210nm。
实施例14重组Rr12α-HSDHM8催化合成12-oxo-CDCA
在10mL夹套反应器中，依次加入10mL磷酸钾缓冲液(100mM,pH 8.0)，0.410g的CA(100mM)，0.168g丙酮酸钠(150mM)，20U/mL的如实施例3获得的重组Rr12α-HSDH M8粗酶液，30U/mL的乳酸脱氢酶，以及终浓度0.4mM的NAD+。30℃条件下200rpm磁力搅拌反应。间歇取样检测反应转化率，反应1h，转化率大于99％。终止反应后，经过纯化得到0.346g产物，纯度大于95％。转化率检测使用C-18柱，甲醇：水＝75:25(磷酸调pH＝3)为流动相，柱温30℃，流速0.8ml/min，检测波长210nm。
实施例15重组Rr12α-HSDHM8催化合成12-oxo-CDCA
在10mL夹套反应器中，依次加入10mL磷酸钾缓冲液(100mM,pH 8.0)，0.82g的CA(200mM)，0.448g丙酮酸钠(400mM)，60U/mL的如实施例3获得的重组Rr12α-HSDH M8粗酶液，90U/mL的乳酸脱氢酶，以及终浓度0.8mM的NAD+。30℃条件下200rpm磁力搅拌反应。间歇取样检测反应转化率，反应16h，转化率为95％。终止反应后，经过纯化得到0.739g产物，纯度为90％。转化率检测使用C-18柱，甲醇：水＝75:25(磷酸调pH＝3)为流动相，柱温30℃，流速0.8mL/min，检测波长210nm。
实施例16重组Rr12α-HSDHM8催化合成12-oxo-CDCA
在10mL夹套反应器中，依次加入10mL磷酸钾缓冲液(100mM,pH 8.0)，0.82g的CA(200mM)，0.336g丙酮酸钠(300mM)，40U/mL的如实施例3获得的重组Rr12α-HSDH M8粗酶液，60U/mL的乳酸脱氢酶，以及终浓度0.5mM的NAD+。30℃条件下200rpm磁力搅拌反应。间歇取样检测反应转化率，反应16h，转化率为大于99％。终止反应后，经过纯化得到0.69g产物，纯度大于95％。转化率检测使用C-18柱，甲醇：水＝75:25(磷酸调pH＝3)为流动相，柱温30℃，流速0.8ml/min，检测波长210nm。
实施例18 1-L规模重组Rr12α-HSDHM8与LDH合成12-oxo-CDCA
在2L三颈烧瓶中，加入1L磷酸钾缓冲液(100mM,pH 8.0)，81.3g CA，33.6g丙酮酸钠，60kU Rr12α-HSDHM8，90kU乳酸脱氢酶，终浓度0.5mM的NAD+，30℃条件下机械搅拌反应，搅拌转速为350rpm，反应期间间歇取样检测反应转化率，反应6h后，终转化率高于99％。终止反应，用有机溶剂萃取出来，产品经过纯化烘干至恒重，得到78g白色固体，纯度95％。
实施例8-11给出了Rr12α-HSDHM8催化不同固醇类化合物氧化的实施方案，同时实施例12-16给出了不同的12-oxo-CDCA制备实施例，可以看出，利用本发明方法所得重组酶制剂可以高效利用相对廉价的氧化型辅酶I(NAD+)而非昂贵的氧化型辅酶II(NADP+)催化胆酸的氧化，有效降低了生产成本，并且具有操作简单、反应条件温和、环境友好，产率高等优势，在以胆酸为底物制备胆酸的工业应用上将具有很好的应用前景。
实施例19-27不同重组Rr12α-HSDH突变体在催化合成12-oxo-CDCA过程中的差异性
在10mL夹套反应器中，依次加入10mL磷酸钾缓冲液(100mM,pH 8.0)，不同浓度的CA，1.5倍摩尔量的丙酮酸钠，10mg/mL按实施例4和5相同方法获得的10个重组Rr12α-HSDH突变体冻干细胞，15U/mL的乳酸脱氢酶，以及终浓度0.5mM的NAD+。30℃条件下200rpm磁力搅拌反应。反应16h后取样检测反应转化率。转化率检测使用C-18柱，甲醇：水＝75:25(磷酸调pH＝3)为流动相，柱温30℃，流速0.8ml/min，检测波长210nm。各个突变体的反应结果如表5所示：
表5重组Rr12α-HSDH突变体催化氧化合成12-oxo-CDCA
Figure BDA0002098662030000181
Figure BDA0002098662030000191
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 华东理工大学、苏州百福安酶技术有限公司
<120> 羟基类固醇脱氢酶及其在合成熊去氧胆酸前体中的应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 753
<212> DNA
<213> 赤红球菌(Rhodococcus ruber)
<400> 1
gtgaaactgc gcgggaagac cgccgtcgtc accggcggtg cgggcgggat cggccgcgcg 60
gtgacccgcg tgttcgtccg cgagggcgcc cgcgtgctgt tcgtcgacgt cgacgacgat 120
cgggggcgcg cgctcgagtc cgagctgacc ggggccggcg gtgaggcgaa gttcctgcag 180
gccgacatct cccggcgcga gagcgcggac cagatccgcg acgccgccgt cgcggcgttc 240
ggcggcatcg acatcctggt caacaacgcg cacgcgtcgc gccaggcact gctggtcgag 300
cacaccccgg agatgttcga gctgtcgttc ggcacggggt tctaccccac cgtgcacctc 360
atgcaggcct gctacccgca gctcaagcag gcccggggtt ccgtcgtcaa cttcggctcc 420
gggtccgccc tcgacggcat gccgacgcag acgtcgtacg cggcggcgaa ggaggcgatc 480
cgggcggtca gccgggtggc cgcgaacgaa tgggccgccg acggcatccg cgtcaacgtc 540
gtgtgcccgt tcgccgcgac cgaaggcgtg caggcctggc agcaggcgtt ccccgaccgg 600
gcggccgccg cggcggcgaa ggtgccgttg cagcgcatcg gcgacccgga gacggacatc 660
gcgccggtgg tggtgttcct cgcctccgac gactcgaagt acatgacggg gcagacgctg 720
atggccgacg ggggcagcat caagctgcgg tga 753
<210> 2
<211> 250
<212> PRT
<213> 赤红球菌(Rhodococcus ruber)
<400> 2
Met Lys Leu Arg Gly Lys Thr Ala Val Val Thr Gly Gly Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ile Gly Arg Ala Val Thr Arg Val Phe Val Arg Glu Gly Ala Arg Val
20 25 30
Leu Phe Val Asp Val Asp Asp Asp Arg Gly Arg Ala Leu Glu Ser Glu
35 40 45
Leu Thr Gly Ala Gly Gly Glu Ala Lys Phe Leu Gln Ala Asp Ile Ser
50 55 60
Arg Arg Glu Ser Ala Asp Gln Ile Arg Asp Ala Ala Val Ala Ala Phe
65 70 75 80
Gly Gly Ile Asp Ile Leu Val Asn Asn Ala His Ala Ser Arg Gln Ala
85 90 95
Leu Leu Val Glu His Thr Pro Glu Met Phe Glu Leu Ser Phe Gly Thr
100 105 110
Gly Phe Tyr Pro Thr Val His Leu Met Gln Ala Cys Tyr Pro Gln Leu
115 120 125
Lys Gln Ala Arg Gly Ser Val Val Asn Phe Gly Ser Gly Ser Ala Leu
130 135 140
Asp Gly Met Pro Thr Gln Thr Ser Tyr Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ile
145 150 155 160
Arg Ala Val Ser Arg Val Ala Ala Asn Glu Trp Ala Ala Asp Gly Ile
165 170 175
Arg Val Asn Val Val Cys Pro Phe Ala Ala Thr Glu Gly Val Gln Ala
180 185 190
Trp Gln Gln Ala Phe Pro Asp Arg Ala Ala Ala Ala Ala Ala Lys Val
195 200 205
Pro Leu Gln Arg Ile Gly Asp Pro Glu Thr Asp Ile Ala Pro Val Val
210 215 220
Val Phe Leu Ala Ser Asp Asp Ser Lys Tyr Met Thr Gly Gln Thr Leu
225 230 235 240
Met Ala Asp Gly Gly Ser Ile Lys Leu Arg
245 250
<210> 3
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 3
ccggaattca tgaaactgcg cgggaaga 28
<210> 4
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 4
cccaagcttt caccgcagct tgatgctgc 29
<210> 5
<211> 753
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 5
gtgaaactgc gcgggaagac cgccgtcgtc accggcggtg cgggcgggat cggccgcgcg 60
gtgacccgcg tgttcgtccg cgagggcgcc cgcgtgctgt tcgtcgacgt cgacgacgat 120
cgggggcgcg cgctcgagtc cgagctgacc ggggccggcg gtgaggcgaa gttcctgcag 180
gccgacatct cccggcgcga gagcgcggac cagatccgcg acgccgccgt cgcggcgttc 240
ggcggcatcg acatcctggt caacaacgcg cacgcgtcgc gccaggcact gctggtcgag 300
cacaccccgg agatgttcga gctgtcgttc ggcacggggt tctaccccac cgtgcacctc 360
atgcaggcct gctacccgca gctcaagcag gcccggggtt ccgtcgtcaa cttcggctcc 420
gggtccgccc tcgacggcat gccgacgcag acgtcgtacg cggcggcgaa ggaggcgatc 480
cgggcggtca gccgggtggc cgcgaacgaa tgggccgccg acggcatccg cgtcaacgtc 540
gtgtgcccgt tcgccgcgac ccagggcgtg caggcctggc agcaggcgtt ccccgaccgg 600
gcggccgccg cggcggcgaa ggtgccgttg cagcgcatcg gcgacccgga gacggacatc 660
gcgccggtgg tggtgttcct cgcctccgac gactcgaagt acatgacggg gcagacgctg 720
atggccgacg ggggcagcat caagctgcgg tga 753
<210> 6
<211> 250
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 6
Met Lys Leu Arg Gly Lys Thr Ala Val Val Thr Gly Gly Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ile Gly Arg Ala Val Thr Arg Val Phe Val Arg Glu Gly Ala Arg Val
20 25 30
Leu Phe Val Asp Val Asp Asp Asp Arg Gly Arg Ala Leu Glu Ser Glu
35 40 45
Leu Thr Gly Ala Gly Gly Glu Ala Lys Phe Leu Gln Ala Asp Ile Ser
50 55 60
Arg Arg Glu Ser Ala Asp Gln Ile Arg Asp Ala Ala Val Ala Ala Phe
65 70 75 80
Gly Gly Ile Asp Ile Leu Val Asn Asn Ala His Ala Ser Arg Gln Ala
85 90 95
Leu Leu Val Glu His Thr Pro Glu Met Phe Glu Leu Ser Phe Gly Thr
100 105 110
Gly Phe Tyr Pro Thr Val His Leu Met Gln Ala Cys Tyr Pro Gln Leu
115 120 125
Lys Gln Ala Arg Gly Ser Val Val Asn Phe Gly Ser Gly Ser Ala Leu
130 135 140
Asp Gly Met Pro Thr Gln Thr Ser Tyr Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ile
145 150 155 160
Arg Ala Val Ser Arg Val Ala Ala Asn Glu Trp Ala Ala Asp Gly Ile
165 170 175
Arg Val Asn Val Val Cys Pro Phe Ala Ala Thr Gln Gly Val Gln Ala
180 185 190
Trp Gln Gln Ala Phe Pro Asp Arg Ala Ala Ala Ala Ala Ala Lys Val
195 200 205
Pro Leu Gln Arg Ile Gly Asp Pro Glu Thr Asp Ile Ala Pro Val Val
210 215 220
Val Phe Leu Ala Ser Asp Asp Ser Lys Tyr Met Thr Gly Gln Thr Leu
225 230 235 240
Met Ala Asp Gly Gly Ser Ile Lys Leu Arg
245 250

Claims (14)

1.一种羟基类固醇脱氢酶，其特征在于，其氨基酸序列为：将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第188位谷氨酸替换为谷氨酰胺。
2.一种核酸，其特征在于，编码如权利要求1所述的羟基类固醇脱氢酶。
3.一种重组表达载体，其特征在于，包含如权利要求2所述的核酸。
4.一种重组表达转化体，其特征在于，包含如权利要求3所述的重组表达载体。
5.一种羟基类固醇脱氢酶催化剂，其特征在于，是以下形式中的任意一种：
(1)培养如权利要求4所述重组表达转化体，分离含有所述羟基类固醇脱氢酶突变体的转化体细胞，对含有羟基类固醇脱氢酶的转化体细胞进行破碎，获得的细胞破碎液；
(2)培养如权利要求4所述重组表达转化体，分离含有所述羟基类固醇脱氢酶突变体的转化体细胞，对含有羟基类固醇脱氢酶的转化体细胞进行破碎，获得的细胞破碎液，将羟基类固醇脱氢酶的细胞破碎液经冷冻干燥而得到的冻干酶粉。
6.如权利要求5所述羟基类固醇脱氢酶催化剂的应用，其特征在于，所述羟基类固醇脱氢酶催化剂催化固醇类化合物12α-羟基氧化，生成相应的12-羰基化合物；
所述的固醇类化合物的化学结构如下所示：
Figure FDA0003316508640000011
所述羟基类固醇脱氢酶催化剂催化固醇类化合物12α-羟基氧化的反应需要辅酶NAD+，反应中NAD+还原为NADH，通过偶联其它脱氢酶，催化NADH氧化再生为NAD+；
所述反应的条件为：所述固醇类化合物的浓度为20-80g/L，辅底物丙酮酸钠与固醇类化合物的摩尔比值为1.0-2.0，NAD+添加量为0.2-0.8mmol/L，pH 6.0-10.5，温度为20-50℃。
7.根据权利要求6所述羟基类固醇脱氢酶催化剂的应用，其特征在于，所述反应的条件为：pH为8.0-10.0，温度为30-40℃。
8.根据权利要求6所述羟基类固醇脱氢酶催化剂的应用，其特征在于，所述的其它脱氢酶为乳酸脱氢酶，催化NADH氧化再生为NAD+，同时催化丙酮酸钠还原生成乳酸钠。
9.如权利要求1所述的羟基类固醇脱氢酶的应用，其特征在于，所述羟基类固醇脱氢酶催化固醇类化合物12α-羟基氧化，生成相应的12-羰基化合物；
所述的固醇类化合物的化学结构如下所示：
Figure FDA0003316508640000021
所述羟基类固醇脱氢酶催化固醇类化合物12α-羟基氧化的反应需要辅酶NAD+，反应中NAD+还原为NADH，通过偶联其它脱氢酶，催化NADH氧化再生为NAD+；
所述反应的条件为：所述固醇类化合物的浓度为20-80g/L，辅底物丙酮酸钠与固醇类化合物的摩尔比值为1.0-2.0，NAD+添加量为0.2-0.8mmol/L，pH 6.0-10.5，温度为20-50℃。
10.根据权利要求9所述羟基类固醇脱氢酶的应用，其特征在于，所述反应的条件为：pH为8.0-10.0，温度为30-40℃。
11.根据权利要求9所述羟基类固醇脱氢酶的应用，其特征在于，所述的其它脱氢酶为乳酸脱氢酶，催化NADH氧化再生为NAD+，同时催化丙酮酸钠还原生成乳酸钠。
12.如权利要求4所述重组表达转化体的应用，其特征在于，所述重组表达转化体催化固醇类化合物12α-羟基氧化，生成相应的12-羰基化合物；
所述的固醇类化合物的化学结构如下所示：
Figure FDA0003316508640000031
所述重组表达转化体催化固醇类化合物12α-羟基氧化的反应需要辅酶NAD+，反应中NAD+还原为NADH，通过偶联其它脱氢酶，催化NADH氧化再生为NAD+；
所述反应的条件为：所述固醇类化合物的浓度为20-80g/L，辅底物丙酮酸钠与固醇类化合物的摩尔比值为1.0-2.0，NAD+添加量为0.2-0.8mmol/L，pH 6.0-10.5，温度为20-50℃。
13.根据权利要求12所述重组表达转化体的应用，其特征在于，所述反应的条件为：pH为8.0-10.0，温度为30-40℃。
14.根据权利要求12所述重组表达转化体的应用，其特征在于，所述的其它脱氢酶为乳酸脱氢酶，催化NADH氧化再生为NAD+，同时催化丙酮酸钠还原生成乳酸钠。
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Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110760488A (zh) * 2019-12-12 2020-02-07 四川澄华生物科技有限公司 一种高含量12α-羟基类固醇脱氢酶发酵液的发酵方法
CN111593085A (zh) * 2020-05-26 2020-08-28 四川澄华生物科技有限公司 一种12-酮基胆酸的制备方法
CN113151207B (zh) * 2021-04-21 2023-03-31 重庆第二师范学院 NAD(H)依赖型3α-羟基类固醇脱氢酶及其编码基因
CN113604446B (zh) * 2021-08-16 2023-04-07 重庆大学 7α-羟基类固醇脱氢酶St-2-2的突变体R16Q
CN114107237A (zh) * 2021-09-07 2022-03-01 伊犁川宁生物技术股份有限公司 一种发酵生产鹅去氧胆酸氧化酶的方法
CN114134067A (zh) * 2021-10-19 2022-03-04 山东睿智医药科技有限公司 一种大肠杆菌及应用
CN114317663B (zh) * 2022-01-19 2023-09-01 常德云港生物科技股份有限公司 利用猪胆提取胆红素后的下料合成熊去氧胆酸的方法
CN114854707B (zh) * 2022-06-14 2023-09-12 苏州百福安酶技术有限公司 一种7β-羟基甾体脱氢酶突变体

Citations (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101421413A (zh) * 2006-04-11 2009-04-29 Iep有限责任公司 用羟基类固醇脱氢酶通过还原氧代类固醇化合物或者氧化羟基类固醇化合物制备类固醇衍生物的方法
CN102007210A (zh) * 2008-03-26 2011-04-06 细胞制药有限公司 新的12α-羟类固醇脱氢酶,产生及其用途
WO2012080504A1 (de) * 2010-12-16 2012-06-21 Pharmazell Gmbh NEUARTIGE 7ß-HYDROXYSTEROID DEHYDROGENASE-MUTANTEN UND VERFAHREN ZUR HERSTELLUNG VON URSODESOXYCHOLSÄURE
NZ603816A (en) * 2010-05-27 2014-06-27 Pharmazell Gmbh Novel 7alpha-hydroxysteroid dehydrogenase knockout mutants and use thereof
CN104136620A (zh) * 2012-02-07 2014-11-05 安尼基有限责任公司 用于氧化还原辅因子的酶再生的方法
WO2016023933A1 (de) * 2014-08-12 2016-02-18 Pharmazell Gmbh 3alpha-hydroxysteroid dehydrogenase-mutanten und verfahren zur herstellung von ursodesoxycholsäure
WO2015197698A3 (de) * 2014-06-24 2016-02-25 Pharmazell Gmbh Verfahren zur biokatalytischen ganzzellreduktion von dehydrocholsäureverbindungen, sowie 7beta-hydroxysteroid dehydrogenase-mutanten
CN106282138A (zh) * 2016-09-22 2017-01-04 重庆大学 撒丁岛梭菌7α‑羟基类固醇脱氢酶突变体T145S
CN106434582A (zh) * 2016-09-22 2017-02-22 重庆大学 撒丁岛梭菌7α‑羟基类固醇脱氢酶突变体R194A
CN106701882A (zh) * 2017-01-24 2017-05-24 尚科生物医药（上海）有限公司 化学‑酶法制备熊去氧胆酸
WO2017123592A8 (en) * 2016-01-11 2017-08-31 Synlogic, Inc. Bacteria engineered to treat disorders associated with bile salts
WO2017220486A2 (en) * 2016-06-20 2017-12-28 Pharmazell Gmbh Coupled, self-sufficient biotransformation of chenodeoxycholic acid to ursodeoxycholic acid and novel enzyme mutants applicable in said process
CN108546691A (zh) * 2018-05-09 2018-09-18 华东理工大学 7β-羟基甾醇脱氢酶突变体及其在制备熊脱氧胆酸中的应用
CN109055473A (zh) * 2018-08-21 2018-12-21 湖南宝利士生物技术有限公司 一种基于酶法偶联技术合成熊去氧胆酸和高手性纯度d-氨基酸的方法
CN109182284A (zh) * 2018-09-28 2019-01-11 湖南福来格生物技术有限公司 一种7β-羟基类固醇脱氢酶突变体、编码序列、重组表达载体、基因工程菌及应用
CN109722463A (zh) * 2019-03-18 2019-05-07 常德云港生物科技有限公司 一种通过半酶法将猪胆酸合成熊去氧胆酸的方法

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SG172076A1 (en) * 2008-12-11 2011-07-28 Bio Architecture Lab Inc Biosynthesis of commodity chemicals
CN107254453B (zh) * 2014-12-22 2019-10-25 武汉康复得生物科技股份有限公司 一种在生理pH条件下有活力的草酸氧化酶及其应用
CN107384820B (zh) * 2017-07-25 2020-04-07 华东理工大学 一株谷氨酰胺转氨酶高产诱变菌株及其应用
CN107418923B (zh) * 2017-09-20 2018-03-23 华东理工大学 伯克霍尔德菌及其应用
CN109355266B (zh) * 2018-11-06 2020-11-27 华东理工大学 亚胺还原酶突变体及其在光学活性1-取代-四氢异喹啉衍生物合成中的应用

Patent Citations (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101421413A (zh) * 2006-04-11 2009-04-29 Iep有限责任公司 用羟基类固醇脱氢酶通过还原氧代类固醇化合物或者氧化羟基类固醇化合物制备类固醇衍生物的方法
CN102007210A (zh) * 2008-03-26 2011-04-06 细胞制药有限公司 新的12α-羟类固醇脱氢酶,产生及其用途
NZ603816A (en) * 2010-05-27 2014-06-27 Pharmazell Gmbh Novel 7alpha-hydroxysteroid dehydrogenase knockout mutants and use thereof
JP2017079788A (ja) * 2010-12-16 2017-05-18 ファルマツェル、ゲーエムベーハー 新規７β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ変異体及びウルソデオキシコール酸の調製方法
WO2012080504A1 (de) * 2010-12-16 2012-06-21 Pharmazell Gmbh NEUARTIGE 7ß-HYDROXYSTEROID DEHYDROGENASE-MUTANTEN UND VERFAHREN ZUR HERSTELLUNG VON URSODESOXYCHOLSÄURE
CN105441399A (zh) * 2010-12-16 2016-03-30 细胞制药有限公司 新的7β-羟基类固醇脱氢酶突变体和制备熊去氧胆酸的方法
CN104136620A (zh) * 2012-02-07 2014-11-05 安尼基有限责任公司 用于氧化还原辅因子的酶再生的方法
WO2015197698A3 (de) * 2014-06-24 2016-02-25 Pharmazell Gmbh Verfahren zur biokatalytischen ganzzellreduktion von dehydrocholsäureverbindungen, sowie 7beta-hydroxysteroid dehydrogenase-mutanten
WO2016023933A1 (de) * 2014-08-12 2016-02-18 Pharmazell Gmbh 3alpha-hydroxysteroid dehydrogenase-mutanten und verfahren zur herstellung von ursodesoxycholsäure
WO2017123592A8 (en) * 2016-01-11 2017-08-31 Synlogic, Inc. Bacteria engineered to treat disorders associated with bile salts
WO2017220486A2 (en) * 2016-06-20 2017-12-28 Pharmazell Gmbh Coupled, self-sufficient biotransformation of chenodeoxycholic acid to ursodeoxycholic acid and novel enzyme mutants applicable in said process
CN106434582A (zh) * 2016-09-22 2017-02-22 重庆大学 撒丁岛梭菌7α‑羟基类固醇脱氢酶突变体R194A
CN106282138A (zh) * 2016-09-22 2017-01-04 重庆大学 撒丁岛梭菌7α‑羟基类固醇脱氢酶突变体T145S
CN106701882A (zh) * 2017-01-24 2017-05-24 尚科生物医药（上海）有限公司 化学‑酶法制备熊去氧胆酸
CN108546691A (zh) * 2018-05-09 2018-09-18 华东理工大学 7β-羟基甾醇脱氢酶突变体及其在制备熊脱氧胆酸中的应用
CN109055473A (zh) * 2018-08-21 2018-12-21 湖南宝利士生物技术有限公司 一种基于酶法偶联技术合成熊去氧胆酸和高手性纯度d-氨基酸的方法
CN109182284A (zh) * 2018-09-28 2019-01-11 湖南福来格生物技术有限公司 一种7β-羟基类固醇脱氢酶突变体、编码序列、重组表达载体、基因工程菌及应用
CN109722463A (zh) * 2019-03-18 2019-05-07 常德云港生物科技有限公司 一种通过半酶法将猪胆酸合成熊去氧胆酸的方法

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"12a-Hydroxysteroid dehydrogenase from Clostridium group P, strain C 48-50 Production, purification and characterization";Manfred BRAUN等;《Eur. J. Biochem.》;19930331(第196期);第439-450页 *
"12α-羟基类固醇的基因挖掘及在合成12-oxo-鹅去氧胆酸中的研究";石守城;《中国生物工程学会第十三届学术年会暨2019年全国生物技术大会会议论文集》;20191109;第1-2页 *
"17β-羟基类固醇脱氢酶的功能";苏文等;《生理科学进展》;20141231;第45卷(第1期);第27-31页 *
"SDR family NAD(P)-dependent oxidoreductase [Rhodococcus ruber]";NCBI;《Genbank Database》;20171231;Accession No：WP_026137560.1 *
"Targeted Synthesis and Characterization of a Gene Cluster Encoding NAD(P)H-Dependent 3α-, 3β-, and 12α- Hydroxysteroid Dehydrogenases from Eggerthella CAG:298, a Gut Metagenomic Sequence";Sean M. Mythen等;《Applied and Environmental Microbiology》;20180319;第1-13页 *
"牛磺熊去氧胆酸的获取方法及药理研究进展";史杰等;《上海中医药大学学报》;20170331;第31卷(第2期);第89-94页 *

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