CN107384820B

CN107384820B - 一株谷氨酰胺转氨酶高产诱变菌株及其应用

Info

Publication number: CN107384820B
Application number: CN201710614341.1A
Authority: CN
Inventors: 李春秀; 蒋莹; 许建和; 潘江; 钱小龙
Original assignee: Suzhou Baifu Enzyme Technology Co ltd; East China University of Science and Technology
Current assignee: Suzhou Baifu Enzyme Technology Co ltd
Priority date: 2017-07-25
Filing date: 2017-07-25
Publication date: 2020-04-07
Anticipated expiration: 2037-07-25
Also published as: CN107384820A

Abstract

本发明公开了一株谷氨酰胺转氨酶高产诱变菌株，即茂原链霉菌(Streptomyces mobaraensis)CGMCC 14389及其应用。本发明茂原链霉菌(Streptomyces mobaraensis)CGMCC 14389是由茂原链霉菌(Streptomyces mobaraensis)ECU7480出发，采用常压室温等离子体(ARTP)诱变技术，经过多轮迭代诱变，筛选获得。该菌株发酵生产谷氨酰胺转氨酶的产量高，达20.6U/mL。对该菌株发酵表达的谷氨酰胺转氨酶进行了序列测定以及活性测定，与出发菌株相比，茂原链霉菌CGMCC 14389表达的谷氨酰胺转氨酶有三个氨基酸位点突变，酶的比活力提高了6.5倍，为26.2U/mg蛋白。

Description

一株谷氨酰胺转氨酶高产诱变菌株及其应用

技术领域

本发明属于微生物发酵技术领域，尤其是涉及一株结合ARTP诱变技术和高效筛选获得的谷氨酰胺转氨酶高产菌株及其应用。

背景技术

谷氨酰胺转氨酶(Transglutaminase:Protein-glutamineγ-glutamyltransferase，又称为转谷氨酰胺酶，简称TGase，EC 2.3.2.13)，其系统命名为蛋白质-谷氨酰胺-γ-谷氨酰胺基转移酶，它是一种能催化酰基转移反应的硫醇酶。该酶作为一种新型的生物酶制剂，广泛应用于肉制品、乳制品、面制品以及水产品等食品的生产加工过程中，市场需求量极其巨大。谷氨酰胺转氨酶可以催化蛋白质分子与游离氨基酸的伯氨基发生连接而将一些必需氨基酸引入到蛋白质中，从而提高蛋白质产品的营养价值，也可以促使蛋白质发生分子内及分子间的交联反应以及谷氨酰胺残基的水解反应，改变蛋白质产品的结构，改善其功能，比如：乳化性、溶解性等。谷氨酰胺转氨酶具有的交联特性使其在食品、生物医药、纺织品、化妆品等领域都受到了广泛的关注与应用，在食品领域中的应用尤为突出，被誉为“21世纪超级黏合剂”。

按谷氨酰胺转氨酶在自然界中的来源，可将其分为三类：动物来源、植物来源和微生物来源。动植物中提取制备谷氨酰胺转氨酶的得率较低，生产成本较高。而微生物来源的谷氨酰胺转氨酶(MTG)具有较高的热稳定性和pH稳定性，易于分离和纯化，且酶的活性完全不依赖于Ca²⁺的存在，因而在食品领域中的应用更为广泛。1989年日本研究人员Ando等人首次从土壤中分离筛选出能分泌产生谷氨酰胺转氨酶的菌株Streptoverticillium S-8112，随后，日本味之素公司利用该菌株发酵生产谷氨酰胺转氨酶，并投放市场，获得了巨大的经济效益。近年来，国内外对于食品级谷氨酰胺转氨酶的生产研究主要集中在产生菌的筛选、诱变选育以及产酶条件的选择和优化，目前所知发酵法生产该酶的最高发酵活力为专利CN103981130B中所述菌株CCTCC M 204121，其5-L发酵产酶活力为16.9U/mL。虽然这些研究都取得了一定成果，但是目前为止，谷氨酰胺转氨酶的发酵产量仍然较低，且酶的比活力不高，需要予以改进。

发明内容

本发明针对现有技术中微生物谷氨酰胺转氨酶发酵产量不高的问题，从野生型茂原链霉菌出发，采用常压室温等离子体(ARTP)诱变技术进行诱变育种，提高茂原链霉菌谷氨酰胺转氨酶的活性以及酶的发酵产量，通过迭代诱变以及系统筛选，获得高产谷氨酰胺转氨酶的茂原链霉菌诱变菌种。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

本发明采用的技术方案之一：

一株谷氨酰胺转氨酶高产菌株，命名为茂原链霉菌(Streptomyces mobaraensis)ECU7480-mut，该菌株已于2017年7月6日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC 14389。

本发明所述谷氨酰胺转氨酶高产诱变菌株茂原链霉菌(Streptomycesmobaraensis)CGMCC 14389的筛选方法如下：以野生型茂原链霉菌(S.mobaraensis)ECU7480为诱变出发菌株，利用ARTP诱变技术对其孢子进行诱变，诱变的菌株进行试管发酵培养，采用比色法测定诱变菌株的发酵活力，筛选获得谷氨酰胺转氨酶发酵活力较高的突变株，以其作为下一轮诱变的出发菌株。经过八轮迭代诱变后，利用摇瓶发酵培养进行活性复筛以及遗传稳定性验证，最终获得遗传稳定的谷氨酰胺转氨酶高产菌株。

所述野生型茂原链霉菌(S.mobaraensis)ECU7480购自美国模式培养物集存库(American type culture collection)，原始编号为ATCC 29032，后自行保藏于本单位。

本发明所述谷氨酰胺转氨酶高产诱变菌株茂原链霉菌(S.mobaraensis)CGMCC14389的生理生化特征如下：

菌落颜色：白色；

菌落直径：2～4mm；

菌落形态：菌落表面干燥、突起，呈草帽型；

生长细胞镜检形态：在延迟期和对数期前期，菌丝稀疏纤细；进入对数期后，菌丝大量增长，茂密且相互盘绕；在稳定期，菌丝更加茂密粗壮，互相重叠，缠绕紧密；进入衰亡期后，菌丝密度减小，变得纤细脆弱，部分出现中空或断裂。

需氧方式：好氧

适宜生长温度：25～40℃。

本发明所述的谷氨酰胺转氨酶高产诱变菌株的诱变选育方法，具体步骤如下：

(1)出发菌株活化：将自行保藏的茂原链霉菌S.mobaraensis ECU7480接种至高氏一号固体培养基斜面上，30℃培养4～6d，作为ARTP诱变出发菌株；

(2)孢子悬液制备：用无菌水洗下斜面上的孢子，接入装有玻璃珠的无菌三角烧瓶中，适度振荡将成团孢子打散均匀，用3层灭菌擦镜纸过滤，制得孢子悬浮液。采用血球计数板计数法对孢子悬浮液的孢子浓度进行测定，通过系列稀释将孢子浓度调整为10^5～7个孢子/mL悬浮液，作为后续ARTP处理的出发孢子悬浮液；

(3)ARTP诱变处理：取5～15μL孢子悬浮液均匀涂布在灭菌金属垫片上，置于APRT诱变育种仪中，在等离子体源下进行诱变处理；

(4)诱变后培养：用1mL无菌水将诱变处理后的孢子洗下，适度稀释后涂布于新鲜的高氏一号固体培养基平板上，30℃下倒置培养4～6d；

(5)试管发酵初筛：从诱变平板上挑取单菌落至装有种子培养基及数颗玻璃珠的试管中，30℃、200rpm条件下培养24h，然后将种子液接种至装有发酵培养基的试管中，30℃、200rpm条件下培养96h后取发酵上清进行酶活力测定，筛选出发酵产酶活力较高的菌株，并以此作为下一轮诱变的出发菌株。

(6)摇瓶发酵复筛：将初筛获得的发酵活力提高的正突变株重新接种至高氏一号固体培养基斜面上，30℃培养4～6d后刮取斜面孢子接种至装有25mL种子培养基的250mL三角烧瓶中，30℃、200rpm条件下培养24h，再以一定比例接种至装有25mL发酵培养基的250mL三角摇瓶中，30℃、200rpm条件下培养96h，定期取发酵液进行酶活力测定。

(7)遗传稳定性：对复筛验证获得的高产突变菌株连续传代8次，每代菌株进行摇瓶发酵，验证突变株的遗传稳定性。

在上述筛选方法中，步骤(3)中ARTP处理参数设置为：工作气体为高纯氦气、射频功率40～100W、气体流量8～12slm、处理时间30～50s、照射距离2～4mm。

在上述筛选方法中，步骤(1)、(4)和(6)中高氏一号培养基的配方为：可溶性淀粉20.0g/L、蛋白胨3.0g/L、KNO₃ 1.0g/L、K₂HPO₄·3H₂O 0.5g/L、MgSO₄·7H₂O 0.5g/L、NaCl0.5g/L、FeSO₄·7H₂O 0.01g/L、琼脂20g/L，pH 7.4。

在上述筛选方法中，步骤(5)和(6)中种子培养基的配方为：甘油20.0g/L、蛋白胨20.0g/L、酵母膏提取物5.0g/L、MgSO₄·7H₂O 2.0g/L、K₂HPO₄·3H₂O 2.62g/L、KH₂PO₄ 2.0g/L，pH 7.0。

在上述筛选方法中，步骤(5)和(6)中发酵培养基的配方为：甘油20.0g/L、蛋白胨20.0g/L、酵母膏提取物5.0g/L、玉米浆干粉5.5g/L、MgSO₄ 2.0g/L、K₂HPO₄·3H₂O 2.62g/L、CaCO₃ 10.0g/L，pH 7.2。

在上述筛选方法中，步骤(5)和(6)中种子液的接种比例是8～10％。

在上述筛选方法中，步骤(5)和(6)中酶活力的测定方法为氧肟酸比色法。反应试剂的配方为：还原型谷胱甘肽GSH、盐酸羟胺和底物Na-CBZ-Gln-Gly溶解于200mM Tris-HCl中，浓度分别为10mM、100mM和30mM，pH 6.0。2mL反应试剂与0.2mL发酵上清液混合均匀后在37℃水浴保温反应10min，然后立即加入2mL显色剂(3M HCl：12％(w/v)三氯乙酸：5％(w/v)FeCl₃·6H₂O＝1:1:1)，快速混合均匀终止反应，8000rpm离心5min，测定525nm下离心上清液的吸光度。一个单位谷氨酰胺转氨酶的酶活力定义为：37℃条件下每分钟催化底物(Nα-CBZ-Gln-Gly)转化生成1μmol产物(L-谷氨酸-γ-单异羟肟酸)所需的酶量。

与出发菌株茂原链霉菌(S.mobaraensis)ECU7480相比，诱变菌株茂原链霉菌(S.mobaraensis)CGMCC 14389的摇瓶发酵酶产量由4.68U/mL提高到10.3U/mL，提高2.2倍。

本发明采用的技术方案之二：一种活性提高的谷氨酰胺转氨酶突变体。

对诱变筛选获得的高产菌株茂原链霉菌(S.mobaraensis)CGMCC 14389表达的谷氨酰胺转氨酶进行纯化以及基因序列测定，其核酸序列如序列表SEQ ID No.1所示；翻译的谷氨酰胺转氨酶的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.2所示，与诱变母本茂原链霉菌(S.mobaraensis)ECU7480表达的谷氨酰胺转氨酶SmTGase的氨基酸序列相比，有三个位点的氨基酸残基发生了突变：32位天冬氨酸突变为丝氨酸，39位苏氨酸突变为赖氨酸，288位丙氨酸突变为丝氨酸，将该酶命名为SmTGase-mut。与母本相比，突变酶SmTGase-mut的比活力由4.06U/mg protein提高到26.2U/mg protein，提高6.5倍。

突变酶SmTGase-mut可作为食品加工助剂的应用，所述的食品包括肉制品、乳制品、面制品或水产品。突变酶SmTGase-mut在食品、生物医药、纺织品、化妆品领域中可以作为交联剂应用。

本发明采用的技术方案之三：茂原链霉菌(Streptomyces mobaraensis)CGMCC14389发酵高产谷氨酰胺转氨酶SmTGase-mut的应用。

茂原链霉菌(Streptomyces mobaraensis)CGMCC 14389发酵生产谷氨酰胺转氨酶SmTGase-mut包括如下步骤：

1)固体培养基培养：将茂原链霉菌(Streptomyces mobaraensis)CGMCC 14389接种至固体培养基上培养，培养温度为25～40℃，培养时间为3～5天；使用的固体培养基优选高氏一号培养基。

2)种子液培养：将步骤1)的固体培养基上生长的茂原链霉菌(Streptomycesmobaraensis)CGMCC 14389的孢子接种到种子液培养基中，25～40℃，培养24h；

3)发酵培养：将步骤2)的种子液按5～10％的比例接种到发酵培养基中，25～40℃，培养3～5天。

所述种子液培养基和发酵培养基的配方为：碳源20～50g/L、有机氮源10～35g/L、无机盐2～10g/L、中和剂5～10g/L，初始pH 7.0～7.5；其中所述碳源是甘油或可溶性淀粉；所述有机氮源是蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、玉米浆中的一种或几种的混合，所述无机盐是钾盐、镁盐和磷酸盐中的一种或几种的混合；所述中和剂是碳酸钙、氢氧化钠和氨水中的一种。

在最优的摇瓶发酵条件下，茂原链霉菌(Streptomyces mobaraensis)CGMCC14389的谷氨酰胺转氨酶的摇瓶发酵活力达10.3U/mL，发酵罐发酵活力达20.6U/mL，超越了现有菌株的发酵水平。并且与母本酶相比，诱变酶的比活力提高6.5倍，可有效地减少食品加工应用中酶的用量，因此在食品领域中具有较好的应用前景。

具体实施方式

发明内容中所述的各反应或检测条件，可根据本领域常识进行组合或更改，并可通过实验得到验证。下面通过实施例的方式进一步说明本发明，应当理解，所列实施例虽然列举了本发明优选的实施方式，但所列具体实施例仅是为了更好地阐明本发明而给出，并不因此将本发明限制在所述实施例范围之内。

实施例1茂原链霉菌的常压室温等离子体诱变与筛选

具体步骤如下：

(1)出发菌株的准备：将自行保藏的出发菌株茂原链霉菌S.mobaraensis ECU7480转接至高氏一号固体培养基斜面上，30℃下培养5天。

其中高氏一号固体培养基配方为：可溶性淀粉20.0g/L、蛋白胨3.0g/L、KNO₃1.0g/L、K₂HPO₄·3H₂O 0.5g/L、MgSO₄·7H₂O 0.5g/L、NaCl 0.5g/L、FeSO₄·7H₂O 0.01g/L、琼脂15g/L，pH 7.4。

(2)孢子悬液制备：每支斜面试管中加入2mL无菌水，刮取茂原链霉菌斜面孢子，接入装有18mL无菌水和5颗玻璃珠的100ml三角烧瓶中，适度振荡30min，将成团孢子打散均匀，用3层灭菌擦镜纸过滤，制得孢子悬浮液。采用血球计数板计数法对孢子悬浮液的孢子浓度进行测定，使用无菌水对获得的孢子悬浮液进行系列稀释将孢子浓度调整为10⁷个孢子/mL悬浮液，应用于后续ARTP处理。

(3)ARTP诱变：取10μL孢子悬浮液均匀涂布在灭菌金属垫片上，将其置于提前开机预热的ARTP诱变育种仪中进行诱变处理。其中，诱变条件为：工作气体为高纯氦气、射频功率40W、气体流量10slm、处理时间40s、照射距离4mm。诱变结束，用490μL无菌水将孢子悬浮液洗下，适度稀释后涂布于新鲜的高氏一号固体培养基平板上，30℃下倒置培养5天。

(4)试管发酵初筛：从孢子诱变筛选固体培养基平板上挑取单菌落，接种至装有5mL种子培养基及5颗玻璃珠的试管(φ21mm×180mm)中，30℃、200rpm条件下振摇培养24h，然后按10％的接种比例将种子液接种至装有3mL发酵培养基的试管(φ21mm×180mm)中，30℃、200rpm条件下振摇培养96h后取发酵上清进行发酵产酶量测定。

其中种子培养基配方为：甘油20.0g/L、蛋白胨20.0g/L、酵母膏提取物5.0g/L、MgSO₄·7H₂O 2.0g/L、K₂HPO₄·3H₂O 2.62g/L、KH₂PO₄ 2.0g/L，pH 7.0；

发酵培养基配方为：甘油20.0g/L、蛋白胨20.0g/L、酵母膏提取物5.0g/L、玉米浆干粉5.5g/L、MgSO₄·7H₂O 2.0g/L、K₂HPO₄·3H₂O 2.62g/L、CaCO₃ 10.0g/L，pH 7.2。

通过对发酵产酶量的比较，筛选出每轮诱变中产酶量排名前八的菌株，并以这些菌株作为后一轮诱变的出发菌株，如此经历了八轮迭代诱变。

(5)摇瓶发酵复筛：将试管发酵初筛获得的正突变株分别接种至高氏一号固体培养基斜面上，30℃培养5天，刮取斜面孢子接种至装有25mL种子培养基的250mL三角烧瓶中，30℃、200rpm条件下培养24h，再以10％的接种比例接种至装有25mL发酵培养基的250mL三角烧瓶中，30℃、200rpm条件下振摇培养96h，定期取样进行发酵活力测定。通过综合比较，获得发酵产酶量最高的突变株，命名为茂原链霉菌(Streptomyces mobaraensis)ECU7480-mut，其谷氨酰胺转氨酶发酵活力达10.3U/mL，酶活最高时间缩短为60h。

突变株茂原链霉菌(Streptomyces mobaraensis)ECU7480-mut已经保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC 14389。

实施例2茂原链霉菌CGMCC 14389的遗传稳定性

将突变株CGMCC 14389接种到高氏一号固体培养基斜面上，30℃培养5天，然后刮取斜面孢子接种到新鲜的高氏一号固体培养基斜面上，如此连续传代8次。

每隔一代，刮取斜面孢子接种至装有25mL种子培养基的250mL三角烧瓶中，30℃、200rpm条件下培养24h，再以10％的接种比例接种至装有25mL发酵培养基的250mL三角烧瓶中，30℃、200rpm条件下振摇培养96h，定期取样进行发酵活力测定。各代最高发酵活力列于表1中，由此可知，经过8次连续传代，突变株CGMCC 14389的谷氨酰胺转氨酶的发酵产量比较稳定，具有良好的遗传稳定性，在谷氨酰胺转氨酶的实际生产过程中具有潜在的应用前景。

表1谷氨酰胺转氨酶的遗传稳定性

实施例3茂原链霉菌谷氨酰胺转氨酶的克隆及序列测定

采用高盐法抽提茂原链霉菌的基因组DNA。刮取茂原链霉菌的斜面孢子接种至种子培养基中，30℃、200rpm振摇培养24h，将2mL培养液转移至Eppendorf管中，12,000rpm离心2min，收集菌体沉淀，加入1mL溶菌酶液(10mM Tris-HCl，1mM EDTA，含10mg溶菌酶，pH8.0)重悬菌体，37℃温育1h；然后加入100μL10％SDS溶液和10μL蛋白酶K溶液(20mg/mL)，37℃温浴过夜；加入400μL饱和食盐水，剧烈振荡15s，14,000rpm离心15min；用等体积的酚：氯仿：异戊醇(25:24:1)萃取，14,000rpm离心10min，重复三次，吸取水相溶液，加入等体积无水乙醇，-20℃静置30min低温沉淀DNA，DNA析出后离心，弃去上清液，用70％乙醇重悬洗涤、干燥。向EP管中加入50μL TE缓冲液(10mM Tris-HCl,pH 8.0)溶解，加入1～2μL RNase(10mg/mL)，37℃放置30min，-20℃保存备用。

对诱变前后的茂原链霉菌谷氨酰胺转氨酶进行基因克隆和酶序列测定。

使用的引物为：

上游引物，如序列表SEQ ID No.3所示：

5’–CGGAATTCATGCCGTCCGCAGGC-3’，其中下划线所示序列为限制性内切酶EcoR I的酶切位点；

下游引物，如序列表SEQ ID No.4所示：

5’–CCCAAGCTTTCACGGCCAGCCCTG-3’，其中下划线所示序列为限制性内切酶HindIII的酶切位点。

PCR体系(50μL)：2×Taq mix 25μL，二甲基亚砜2.5μL，基因组DNA(约100ng/μL)2.5μL，上下游引物各2.5μL，diH2O补足至50μL。

PCR反应程序：(1)95℃预变性5min；(2)94℃变性60s；(3)65℃退火30s；(4)72℃延伸1.5min；(5)步骤(2)～(4)共进行30个循环；(6)72℃延伸10min，最后4℃保存产物。

用限制性内切酶EcoR I和Hind III对PCR产物和质粒pET-28a分别进行双酶切，电泳分离，回收酶切片段，同T₄DNA连接酶过夜连接，转化到大肠杆菌E.coli DH5α中，挑取阳性克隆子，对克隆获得的谷氨酰胺转氨酶基因进行序列测定。

诱变茂原链霉菌CGMCC 14389表达的谷氨酰胺转氨酶SmTGase-mut的DNA序列和推测的氨基酸序列分别如序列表SEQ ID No.1和2所示。与诱变母本茂原链霉菌ECU7480表达的谷氨酰胺转氨酶SmTGase相比，SmTGase-mut发生了三个位点的氨基酸突变：32位天冬氨酸突变为丝氨酸，39位苏氨酸突变为赖氨酸，288位丙氨酸突变为丝氨酸。

实施例4茂原链霉菌谷氨酰胺转氨酶的纯化及表征

对野生型及诱变茂原链霉菌分泌表达的谷氨酰胺转氨酶进行了纯化，纯化全过程在0～4℃下进行。

粗酶液的制备：将发酵液在10,000rpm下离心30min，所获上清液经0.45μm膜过滤后即得粗酶液。

硫酸铵沉淀：在粗酶液中缓慢加入硫酸铵粉末至饱和度为50％，搅拌使其完全溶解。调节酶液pH为7.5，10,000rpm离心10min后收集上清液，继续加入硫酸铵粉末至饱和度为80％，4℃静置数小时，离心收集沉淀。将沉淀溶解在Tris-HCl(20mM,pH 7.5)缓冲液中并在4℃透析数小时。

第一次离子交换层析：将酶液上样到预先用Tris-HCl(20mM,pH 7.5)缓冲液平衡好的离子交换柱Hitrap Q HP 1mL中，用Tris-HCl(20mM,pH 7.5，含1M氯化钠)的缓冲液进行梯度洗脱，流速为1mL/min，收集活性组分。合并收集到的全部活性组分，加入硫酸铵至80％饱和度，离心收集沉淀，用0.5ml的Tris-HCl(20mM,pH 7.5)缓冲液溶解。

凝胶过滤层析：将酶液上样到预先用Tris-HCl(20mM,pH 7.5)缓冲液平衡好的Superdex 75 10/300GL层析柱中，用含0.15M氯化钠的Tris-HCl(20mM,pH 7.5)缓冲液进行洗脱，流速为0.4mL/min，收集活性组分。

第二次离子交换层析：将收集到的活性组分用Tris-HCl(20mM,pH 8.5)缓冲液透析，然后上样到预先用Tris-HCl(20mM,pH 8.5)缓冲液平衡好的Hitrap Q HP 1mL离子柱中，用含0.4M氯化钠的Tris-HCl(20mM,pH 8.5)缓冲液进行洗脱，收集活性目的蛋白，经SDS-PAGE电泳分析，呈单一条带。

对纯化酶进行活力测定，野生型茂原链霉菌ECU7480表达的母本谷氨酰胺转氨酶SmTGase的比活力为4.06U/mg蛋白；而诱变茂原链霉菌CGMCC表达的突变酶SmTGase-mut的比活力为26.2U/mg蛋白，较野生型酶提高6.5倍。

实施例5茂原链霉菌ECU7480发酵生产谷氨酰胺转氨酶SmTGase

种子液培养基配方：甘油20.0g/L、蛋白胨20.0g/L、酵母膏提取物5.0g/L、MgSO₄·7H₂O 2.0g/L、K₂HPO₄·3H₂O 2.62g/L、KH₂PO₄ 2.0g/L，pH 7.0；

发酵培养基配方：甘油20.0g/L、蛋白胨20.0g/L、酵母膏提取物5.0g/L、玉米浆干粉5.5g/L、MgSO₄·7H₂O 2.0g/L、K₂HPO₄·3H₂O 2.62g/L、CaCO₃ 10.0g/L，pH 7.2。

将茂原链霉菌(Streptomyces mobaraensis)ECU7480接种至高氏一号固体培养基上培养，30℃培养5天；用1mL无菌水将固体培养基上的孢子洗下，接种到种子液培养基中，250mL三角摇瓶中装液量为25mL，置于30℃恒温摇床，转速为200rpm，培养24h；将种子液按10％的比例接种到发酵培养基中，250mL三角摇瓶中装液量为25mL，置于30℃恒温摇床，转速为200rpm，培养至86h，发酵活力最高，为4.68U/mL。

实施例6茂原链霉菌CGMCC 14389发酵生产谷氨酰胺转氨酶SmTGase-mut

种子液培养基配方：可溶性淀粉30.0g/L、蛋白胨10.0g/L、酵母膏提取物10.0g/L、MgSO₄·7H₂O 2.0g/L、K₂HPO₄·3H₂O 2.0g/L、KH₂PO₄ 2.0g/L，pH 7.2；

发酵培养基配方：可溶性淀粉30.0g/L、蛋白胨10.0g/L、酵母膏提取物10.0g/L、玉米浆干粉5.0g/L、MgSO₄·7H₂O 2.0g/L、K₂HPO₄·3H₂O 2.0g/L、CaCO₃ 10.0g/L，pH 7.2。

将茂原链霉菌(Streptomyces mobaraensis)CGMCC 14389接种至高氏一号固体培养基上，25℃培养5天；用1mL无菌水将固体培养基上生长的孢子洗下，接种到装有25mL种子液培养基的250mL三角烧瓶中，30℃、200rpm，振摇培养48h；将种子液按5％的比例接种到装有25mL发酵培养基的250mL三角烧瓶中，25℃、200rpm振摇培养至62h，发酵活力最高，为9.8U/mL。

实施例7茂原链霉菌CGMCC 14389发酵生产谷氨酰胺转氨酶SmTGase-mut

将茂原链霉菌(Streptomyces mobaraensis)CGMCC 14389接种至高氏一号固体培养基上，30℃培养5天，用1mL无菌水将固体培养基上生长的孢子洗下，接种到装有25mL种子液培养基的250mL三角烧瓶中，30℃、200rpm，振摇培养24h；将种子液按10％的比例接种到装有25mL发酵培养基的250mL三角烧瓶中，30℃、200rpm，振摇培养至60h，发酵活力最高，为10.3U/mL。

实施例8茂原链霉菌CGMCC 14389发酵生产谷氨酰胺转氨酶SmTGase-mut

种子液培养基配方：甘油50.0g/L、蛋白胨10.0g/L、牛肉膏提取物10.0g/L、MgSO₄·7H₂O 2.0g/L、K₂HPO₄·3H₂O 2.62g/L、KH₂PO₄ 2.0g/L，pH 7.0；

发酵培养基配方：甘油50.0g/L、蛋白胨10.0g/L、牛肉膏提取物10.0g/L、玉米浆干粉5.5g/L、MgSO₄·7H₂O 2.0g/L、K₂HPO₄·3H₂O 2.62g/L、CaCO₃ 10.0g/L，pH 7.2。

将茂原链霉菌(Streptomyces mobaraensis)CGMCC 14389接种至高氏一号固体培养基上，40℃培养3天；用1mL无菌水将固体培养基上生长的孢子洗下，接种到装有25mL种子液培养基的250mL三角烧瓶中，40℃、200rpm，振摇培养24h；将种子液按5％的比例接种到装有25mL发酵培养基的250mL三角烧瓶中，40℃、200rpm，振摇培养至60h，发酵活力最高，为9.6U/mL。

实施例9茂原链霉菌CGMCC 14389发酵生产谷氨酰胺转氨酶SmTGase-mut

种子液培养基配方：可溶性淀粉30.0g/L、蛋白胨20.0g/L、牛肉膏提取物5.0g/L、MgSO₄·7H₂O 2.0g/L、K₂HPO₄·3H₂O 2.62g/L、KH₂PO₄ 2.0g/L，pH 7.5；

发酵培养基配方：可溶性淀粉30.0g/L、蛋白胨20.0g/L、牛肉膏提取物5.0g/L、玉米浆干粉5.0g/L、MgSO₄·7H₂O 2.0g/L、K₂HPO₄·3H₂O 2.62g/L、CaCO₃ 10.0g/L，用氨水将pH调节至pH 7.5。

将茂原链霉菌(Streptomyces mobaraensis)CGMCC 14389接种至高氏一号固体培养基上，30℃培养5天；用1mL无菌水将固体培养基上生长的孢子洗下，接种到装有25mL种子液培养基的250mL三角烧瓶中，30℃、200rpm，振摇培养24h；将种子液按10％的比例接种到装有25mL发酵培养基的250mL三角烧瓶中，30℃、200rpm，振摇培养至60h，发酵活力最高，为10.0U/mL。

实施例10茂原链霉菌CGMCC 14389发酵生产谷氨酰胺转氨酶SmTGase-mut

种子液培养基配方：甘油20.0g/L、酵母膏提取物15.0g/L、牛肉膏提取物10.0g/L、MgSO₄·7H₂O 2.0g/L、K₂HPO₄·3H₂O 2.62g/L、KH₂PO₄ 2.0g/L，pH 7.0；

发酵培养基配方：甘油20.0g/L、酵母膏提取物15.0g/L、牛肉膏提取物10.0g/L、玉米浆干粉5.5g/L、MgSO₄·7H₂O 2.0g/L、K₂HPO₄·3H₂O 2.62g/L、CaCO₃ 10.0g/L，pH 7.2。

将茂原链霉菌(Streptomyces mobaraensis)CGMCC 14389接种至高氏一号固体培养基上，30℃培养5天；用1mL无菌水将固体培养基上生长的孢子洗下，接种到装有25mL种子液培养基的250mL三角烧瓶中，30℃、200rpm，振摇培养24h；将种子液按10％的比例接种到装有25mL发酵培养基的250mL三角烧瓶中，30℃、200rpm，振摇培养至63h，发酵活力最高，为9.5U/mL。

实施例11茂原链霉菌CGMCC 14389发酵生产谷氨酰胺转氨酶SmTGase-mut

发酵培养基配方：甘油20.0g/L、蛋白胨20.0g/L、酵母膏提取物5.0g/L、玉米浆干粉5.5g/L、MgSO₄·7H₂O 2.0g/L、K₂HPO₄·3H₂O 2.62g/L，加入0.5mL消泡剂，通过加入氢氧化钠将培养基pH调节至7.0。

将茂原链霉菌(Streptomyces mobaraensis)CGMCC 14389接种至高氏一号固体培养基上，30℃培养5天；用1mL无菌水将固体培养基上生长的孢子洗下，接种到装有25mL种子液培养基的250mL三角烧瓶中，30℃、200rpm，振摇培养24h；将种子液按8％的比例接种到装有3L发酵培养基的5L搅拌发酵罐中，发酵温度恒定为30℃，通气量设置为1vvm。发酵前24h，通过调节搅拌转速控制溶氧水平为35％左右以促进菌体的生长，发酵24h后调节搅拌转速控制溶氧水平在15～25％以促进谷氨酰胺转氨酶的合成。通过自动流加2M的硫酸和氢氧化钠使发酵过程中发酵液pH控制在7.0左右。

发酵过程中，间歇取样测定发酵液的谷氨酰胺转氨酶的活力，培养至120h，发酵活力最高，为20.6U/mL。

上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

<110> 华东理工大学，苏州百福安酶技术有限公司

<120> 一株谷氨酰胺转氨酶高产诱变菌株及其应用

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1224

<212> DNA

<213> 茂原链霉菌(Streptomyces mobaraensis)

<400> 1

atgcgcatac gccggagagc tctcgtcttc gccactatga gtgcggtgtt atgcaccgcc 60

ggattcatgc cgtcggccgg cgaggccgcc gccagcaatg gcgcggggga agagaagaag 120

tcctacgccg aaacctaccg cctcacggcg gatgacgtcg cgaacatcaa cgcgctcaac 180

gaaagcgctc cggccgcttc gagcgccggc ccgtcgttcc gggcccccga ctccgacgac 240

agggtcaccc ctcccgccga gccgctcgac aggatgcccg acccgtaccg tccctcgtac 300

ggcagggccg agacggtcgt caacaactac atacgcaagt ggcagcaggt ctacagccac 360

cgcgacggca ggaagcagca gatgaccgag gagcagcggg agtggctgtc ctacggctgc 420

gtcggtgtca cctgggtcaa ttcgggtcag tacccgacga acagactggc cttcgcgtcc 480

ttcgacgagg acaggttcaa gaacgagctg aagaacggca ggccccggtc cggcgagacg 540

cgggcggagt tcgagggccg cgtcgcgaag gagagcttcg acgaggagaa gggcttccag 600

cgggcgcgtg aggtggcgtc cgtcatgaac agggccctgg agaacgccca cgacgagagc 660

gcttacctcg acaacctcaa gaaggaactg gcgaacggca acgacgccct gcgcaacgag 720

gacgcccgtt ccccgttcta ctcggcgctg cggaacacgc cgtccttcaa ggagcggaac 780

ggaggcaatc acgacccgtc caggatgaag gccgtcatct actcgaagca cttctggagc 840

ggccaggacc ggtcgagttc gtccgacaag aggaagtacg gcgacccgga cgccttccgc 900

cccgccccgg gcaccggcct ggtcgacatg tcgagggaca ggaacattcc gcgcagcccc 960

accagccccg gtgagggatt cgtcaatttc gactacggct ggttcggcgc ccagacggaa 1020

gcggacgccg acaagaccgt ctggacccac ggaaatcact atcacgcgcc caatggcagc 1080

ctgggtgcca tgcatgtcta cgagagcaag ttccgcaact ggtccgaggg ttactcggac 1140

ttcgaccgcg gagcctatgt gatcaccttc atccccaaga gctggaacac cgcccccgac 1200

aaggtaaagc agggctggcc gtga 1224

<210> 2

<211> 407

<212> PRT

<213> 茂原链霉菌(Streptomyces mobaraensis)

<400> 2

Met Arg Ile Arg Arg Arg Ala Leu Val Phe Ala Thr Met Ser Ala

5 10 15

Val Leu Cys Thr Ala Gly Phe Met Pro Ser Ala Gly Glu Ala Ala

20 25 30

Ala Ser Asn Gly Ala Gly Glu Glu Lys Lys Ser Tyr Ala Glu Thr

35 40 45

Tyr Arg Leu Thr Ala Asp Asp Val Ala Asn Ile Asn Ala Leu Asn

50 55 60

Glu Ser Ala Pro Ala Ala Ser Ser Ala Gly Pro Ser Phe Arg Ala

65 70 75

Pro Asp Ser Asp Asp Arg Val Thr Pro Pro Ala Glu Pro Leu Asp

80 85 90

Arg Met Pro Asp Pro Tyr Arg Pro Ser Tyr Gly Arg Ala Glu Thr

95 100 105

Val Val Asn Asn Tyr Ile Arg Lys Trp Gln Gln Val Tyr Ser His

110 115 120

Arg Asp Gly Arg Lys Gln Gln Met Thr Glu Glu Gln Arg Glu Trp

125 130 135

Leu Ser Tyr Gly Cys Val Gly Val Thr Trp Val Asn Ser Gly Gln

140 145 150

Tyr Pro Thr Asn Arg Leu Ala Phe Ala Ser Phe Asp Glu Asp Arg

155 160 165

Phe Lys Asn Glu Leu Lys Asn Gly Arg Pro Arg Ser Gly Glu Thr

170 175 180

Arg Ala Glu Phe Glu Gly Arg Val Ala Lys Glu Ser Phe Asp Glu

185 190 195

Glu Lys Gly Phe Gln Arg Ala Arg Glu Val Ala Ser Val Met Asn

200 205 210

Arg Ala Leu Glu Asn Ala His Asp Glu Ser Ala Tyr Leu Asp Asn

215 220 225

Leu Lys Lys Glu Leu Ala Asn Gly Asn Asp Ala Leu Arg Asn Glu

230 235 240

Asp Ala Arg Ser Pro Phe Tyr Ser Ala Leu Arg Asn Thr Pro Ser

245 250 255

Phe Lys Glu Arg Asn Gly Gly Asn His Asp Pro Ser Arg Met Lys

260 265 270

Ala Val Ile Tyr Ser Lys His Phe Trp Ser Gly Gln Asp Arg Ser

275 280 285

Ser Ser Ser Asp Lys Arg Lys Tyr Gly Asp Pro Asp Ala Phe Arg

290 295 300

Pro Ala Pro Gly Thr Gly Leu Val Asp Met Ser Arg Asp Arg Asn

305 310 315

Ile Pro Arg Ser Pro Thr Ser Pro Gly Glu Gly Phe Val Asn Phe

320 325 330

Asp Tyr Gly Trp Phe Gly Ala Gln Thr Glu Ala Asp Ala Asp Lys

335 340 345

Thr Val Trp Thr His Gly Asn His Tyr His Ala Pro Asn Gly Ser

350 355 360

Leu Gly Ala Met His Val Tyr Glu Ser Lys Phe Arg Asn Trp Ser

365 370 375

Glu Gly Tyr Ser Asp Phe Asp Arg Gly Ala Tyr Val Ile Thr Phe

380 385 390

Ile Pro Lys Ser Trp Asn Thr Ala Pro Asp Lys Val Lys Gln Gly

395 400 405

Trp Pro

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

cggaattcat gccgtccgca ggc 23

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

cccaagcttt cacggccagc cctg 24

Claims

1.一株谷氨酰胺转氨酶高产诱变菌株，种属为茂原链霉菌(Streptomycesmobaraensis)，该菌株已于2017年7月6日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC 14389。

2.一种高活性的谷氨酰胺转氨酶，其特征在于，为如序列表SEQ ID No.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

3.根据权利要求2所述的一种高活性的谷氨酰胺转氨酶，其特征在于，其来源于如权利要求1所述的茂原链霉菌(Streptomyces mobaraensis)CGMCC 14389。

4.编码高活性的谷氨酰胺转氨酶的基因，其特征在于，其核苷酸序列如序列表SEQ IDNo.1所示。

5.权利要求1所述的株谷氨酰胺转氨酶高产诱变菌株的应用，其特征在于，所述的株谷氨酰胺转氨酶高产诱变菌株用于发酵生产如权利要求2所述的谷氨酰胺转氨酶，包括如下步骤：

1)固体培养基培养：将所述的株谷氨酰胺转氨酶高产诱变菌株接种至固体培养基上培养3～5天；

2)种子液培养：将步骤1)的固体培养基上生长的株谷氨酰胺转氨酶高产诱变菌株的孢子接种到种子液培养基中培养1～2天；

3)发酵培养：将步骤2)的种子液按5～10％的比例接种到发酵培养基中培养3～5天，得到如权利要求2所述的谷氨酰胺转氨酶。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于：所述种子液培养基的配方为：碳源20～50g/L、有机氮源10～35g/L、无机盐2～10g/L、中和剂5～10g/L，初始pH7.0～7.5；其中所述碳源是甘油或可溶性淀粉；所述有机氮源是蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、玉米浆中的一种或几种的混合，所述无机盐是钾盐、镁盐和磷酸盐中的一种或几种的混合；所述中和剂是碳酸钙、氢氧化钠和氨水中的一种；所述培养温度为25～40℃。

7.如权利要求5所述的应用，其特征在于：所述发酵培养基的配方为：碳源20～50g/L、有机氮源10～35g/L、无机盐2～10g/L、中和剂5～10g/L，初始pH 7.0～7.5；其中所述碳源是甘油或可溶性淀粉；所述有机氮源是蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、玉米浆中的一种或几种的混合，所述无机盐是钾盐、镁盐和磷酸盐中的一种或几种的混合；所述中和剂是碳酸钙、氢氧化钠和氨水中的一种；所述培养温度为25～40℃。

8.如权利要求2所述的高活性的谷氨酰胺转氨酶的应用，其特征在于：作为食品加工助剂的应用，所述的食品包括肉制品、乳制品、面制品或水产品。

9.如权利要求2所述的高活性的谷氨酰胺转氨酶的应用，其特征在于：在食品、生物医药、纺织品、化妆品领域中作为交联剂的应用。