CN108893428B - 一种高酶活谷氨酰胺转氨酶菌株及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种高酶活谷氨酰胺转氨酶菌株及其应用。本发明提供的高酶活谷氨酰胺转氨酶新菌株为茂源链轮丝菌(Streptomyces sp.)KL‑Q1，其具有产谷氨酰胺转胺酶活性高和发酵能力强的优点，其发酵生产谷氨酰胺转氨酶的酶活大于25U/ml。同时，本发明提供的利用茂源链轮丝菌(Streptomyces sp.)KL‑Q1发酵生产谷氨酰胺转氨酶的方法操作简单，成本低，有利于该方法的推广和应用。

Description

一种高酶活谷氨酰胺转氨酶菌株及其应用
技术领域
本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种高酶活谷氨酰胺转氨酶菌株及其应用。
背景技术
谷氨酰胺转氨酶(简称TGase)又称为转谷氨酰胺酶，其是由331个氨基组成的具有活性中心的单体蛋白质酰基转移酶，广泛存在于动、植物和微生物机体组织中。TGase的主要作用是在蛋白质之间架桥生成ε-(γ-谷氨酰基)赖氨酸异肽键，从而催化蛋白质或多肽分子间形成共价交联及蛋白质分子内谷氨酰胺基的水解，形成分子内和分子间的网状结构，进而改善蛋白质的结构和功能特性甚至带来新的功能。
20世纪80年代末，ANDOH等以链轮丝菌Streptoverticillium发酵生产谷氨酰胺转氨酶，经分离提取而得到纯化了174倍的酶。谷氨酰胺转氨酶能催化许多蛋白质进行共价交联聚合，改善各种蛋白质的功能特性，在食品工业、纺织工业和医药工业上具有广泛的应用前景及优势。目前，对谷氨酰胺转氨酶的研究主要集中在菌株的分离和选育、发酵条件和分离纯化等方面，尤其对于生产谷氨酰胺转胺酶的新菌株诱变分离的研究更为广泛。
专利文献CN03152956.9公开了一种谷氨酰胺转胺酶高产菌及其筛选方法和用该菌株发酵法生产谷氨酰胺转胺酶，所述的菌种为一株吸水链(Streptomyceshygeroscopicus)，保藏号为CCTCC NO：M203062，是从奶牛厂土壤中经平板菌落特征初筛，采用一级发酵逐一摇瓶培养，利用标准色带进行对比测试，再经酶活测定，比较谷氨酰胺转胺酶活性大小而得到。经液体深层发酵可得谷氨酰胺转胺酶，酶活为5.0U/ml。该谷氨酰胺转胺酶可用于食品工业蛋白质交联剂。
专利文献CN103981130A公开了一株谷氨酰胺转氨酶高产菌及其应用，所述谷氨酰胺转氨酶高产菌的分类命名为吸水链霉菌(streptomyces hygroscopicus)NYU-70，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2014121。该以吸水链霉菌是以(streptomyce shygroscopicus)NY-1为出发菌株，进行低能离子注入诱变，诱变后菌株经酪蛋白凝胶法比较，比色法进一步测定酶活性，筛选出产谷氨酰胺转氨酶活性较高的突变株，作为下一轮诱变的出发菌，重复上述步骤筛选得到。该菌株发酵产谷氨酰胺转氨酶活性高，遗传稳定性好。利用该突变株进行液体摇瓶发酵可得谷氨酰胺转氨酶，酶活为16.9U/mL。
目前，生产谷氨酰胺转胺酶的新菌株产谷氨酰胺转氨酶的酶活力较低，酶活不超过20U/mL，而且其发酵条件筛选不理想，导致产谷氨酰胺转胺酶菌株的发酵能力较低。因此，提供一种高酶活谷氨酰胺转氨酶菌株或者是理想的发酵条件是目前亟需解决的难题。
发明内容
为了提高谷氨酰胺转胺酶的产量，本发明提供了一种高酶活谷氨酰胺转氨酶菌株及其应用，以解决上述缺陷。
本发明提供了一株高酶活谷氨酰胺转氨酶菌株，其分类命名为茂源链轮丝菌(Streptomyces sp.)KL-Q1，于2018年5月18日保藏在广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为：GDMCC No：60371，保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省微生物研究所。
本发明提供的茂源链轮丝菌(Streptomyces sp.)KL-Q1是以茂源链轮丝菌(Streptoverticillium mobarense)为出发菌，采用常压室温等离子体+紫外线进行诱变处理，诱变后经比色法挑选出酶活最高的10％株，重新做摇瓶发酵，再检测，挑选出酶活最高的菌株作为下一轮诱变选育的出发菌，重复以上步骤，直至筛选到目标菌株茂源链轮丝菌(Streptomyces sp.)KL-Q1。
本发明的诱变原理为：本发明采用氦气为工作气体的常压室温等离子体源的活性能量粒子对菌株的遗传物质造成损伤，并诱发生物细胞启动SOS修复机制。SOS修复过程为一种高容错率修复，因此修复过程中会产生种类丰富的错配位点，并最终稳定遗传进而形成突变株。
本发明提供的高酶活谷氨酰胺转氨酶菌株的诱变选育方法，具体步骤如下：
(1)菌悬液制备：取30℃恒温培养6d的茂源链轮丝菌(Streptoverticilliummobarense)，用无菌的生理盐水洗下斜面上的孢子，倒入装有玻璃珠的无菌三角瓶中，振荡20min，用脱脂棉过滤，5000rpm离心10min后取沉淀洗涤复溶，制得孢子悬浮液，用血球计数板直接计数，调整孢子浓度约为106个/ml备用；
(2)常压室温等离子体+紫外诱变：取分别0.1ml步骤(1)中的菌悬液均匀涂布在多粒无菌载片上，置于常压室温等离子体诱变机中，分别每隔20s为一个梯度，处理20～100s。处理完毕后，取出载片，分别放入预先装有1ml无菌生理盐水的的EP管中进行洗脱2min，抽取0.1ml洗脱液涂布到平板培养基上，结合紫外灯照射，用15W紫外灯管，把上述涂布好的平板置于灯管正下方，分别处理20～100s，处理完毕之后在30℃下倒置培养7d；
(3)摇瓶发酵：将步骤(2)筛选到的生长良好的菌株接种至斜面培养基，在30℃下培养6d，取斜面培养物接种至种子液培养基，250ml三角瓶中装液量50ml，于28℃恒温摇床，转速为300rpm培养20h，后以10％的接种量接种至发酵液培养基，250ml三角瓶中装液量为50ml，于28℃恒温摇床，转速为300rpm，培养40h；
(4)酶活检测：比色法测定酶活，以CBZ-Gln-Gly为作用底物，L-谷氨酸-γ-单羟肟酸标准曲线。1个单位的TGase酶活定义为：37℃时每分钟催化形成1μmol的L-谷氨酸-γ-单羟肟酸的酶量(U/mL)。
试剂A：0.2mol/LTris-盐酸缓冲液(pH6.0)，0.1mol/L羟胺，0.01mol/L还原型谷胱甘肽，0.03mol/L苯甲基氧化碳酰-L-谷氨酰胺甘氨酸(CBZ-Gln-Gly)；
试剂B：3mol/L盐酸，12％三氯乙酸，5％六水三氯化铁(溶解于0.1mol/L盐酸中)；
2mL试剂A中加入0.2mL酶液，在37℃反应10min，加入2mL试剂B使反应终止，所形成红色的铁化合物，在525nm处比色，对照组用失活的酶液；同批次挑选出酶活最高的10％株，重新做摇瓶发酵，再检测，挑选出酶活最高的菌株作为下一轮诱变选育的出发菌，重复以上步骤，直至筛选到目标菌株；
(5)培养基成分：所述步骤(1)中的平板培养基和步骤(2)中的斜面培养基为：可溶性淀粉22～28g/L，酵母浸膏3～8g/L，磷酸二氢钾1～3g/L，硫酸镁1～3g/L，琼脂15～25g/L，其余为水，初始pH为7.3；
所述步骤(3)中的种子液培养基为：甘油18～22g/L，酵母浸膏8～12g/L，大豆蛋白粉8～12g/L，鱼蛋白胨12～16g/L，磷酸二氢钾1～3g/L，硫酸镁1～3g/L，初始pH为7.3；
所述步骤(3)中的发酵液培养基为：甘油18～22g/L，酵母浸膏12～18g/L，大豆蛋白粉3～8g/L，鱼蛋白胨18～22g/L，磷酸二氢钾1～3g/L，硫酸镁1～3g/L，轻质碳酸钙3～8g/L，初始pH为7.3。
另外，本发明还提供了所述的高酶活谷氨酰胺转氨酶菌株在发酵产谷氨酰胺转氨酶中的应用。
进一步地，所述的高酶活谷氨酰胺转氨酶菌株在发酵产谷氨酰胺转氨酶的具体步骤为：
S1平板培养：将所述的茂源链轮丝菌(Streptomyces sp.)KL-Q1接种至平板培养基上培养，培养温度为28～35℃，培养时间为6d；
S2斜面培养：将步骤S1平板培养的茂源链轮丝菌(Streptomyces sp.)KL-Q1接种至斜面培养基上培养，培养温度为28～35℃，培养时间为6d；
S3种液培养：将步骤S2中茂源链轮丝菌(Streptomyces sp.)KL-Q1斜面培养物接种至种液培养基中培养，培养温度为25～30℃，摇床转速为300rpm，恒温培养20h；
S4发酵培养：将步骤S3中茂源链轮丝菌(Streptomyces sp.)KL-Q1的种子液按接种量为10％(v/v)接种至发酵培养基中，培养温度为25～30℃，摇床转速为300rpm，恒温培养40h；
S5干燥处理：将步骤S4得到的发酵液调节pH为6.0-8.0，压滤，得滤液；将滤液经5～10微米孔径袋滤过滤去除杂质，再经0.1～1微米孔径滤棒微滤，最后经20000分子量超滤膜超滤8～15倍，得浓缩液，加入浓缩液体积5倍的体积浓度为95％酒精，于0～4℃的条件下搅拌静止2h，悬浮液离心，得沉淀物，冷冻干燥，粉碎，即得。
进一步地，所述步骤S1的平板培养基和步骤S2的斜面培养基由以下组分组成：可溶性淀粉22～28g/L，酵母浸膏3～8g/L，磷酸二氢钾1～3g/L，硫酸镁1～3g/L，琼脂15～25g/L，其余为水，初始pH为7.3。
进一步地，所述步骤S1的平板培养基和步骤S2的斜面培养基由以下组分组成：可用性淀粉25g/L，酵母浸膏5g/L，磷酸二氢钾2g/L，硫酸镁2g/L，琼脂20g/L，其余为水，初始pH为7.3。
进一步地，所述步骤S3的种子液培养基由以下组分组成：甘油18～22g/L，酵母浸膏8～12g/L，大豆蛋白粉8～12g/L，鱼蛋白胨12～16g/L，磷酸二氢钾1～3g/L，硫酸镁1～3g/L，初始pH为7.3。
进一步地，所述步骤S3的种子液培养基由以下组分组成：甘油20g/L，酵母浸膏10g/L，大豆蛋白粉10g/L，鱼蛋白胨15g/L，磷酸二氢钾2g/L，硫酸镁2g/L，初始pH为7.3。
进一步地，所述步骤S4的发酵培养基由以下组分组成：甘油18～22g/L，酵母浸膏12～18g/L，大豆蛋白粉3～8g/L，鱼蛋白胨18～22g/L，磷酸二氢钾1～3g/L，硫酸镁1～3g/L，酪蛋白酸钙2～4g/L，硫辛酸钠1～2g/L，轻质碳酸钙3～8g/L，初始pH为7.3。
进一步地，所述步骤S4的发酵培养基由以下组分组成：甘油20g/L，酵母浸膏15g/L，大豆蛋白粉5g/L，鱼蛋白胨20g/L，磷酸二氢钾2g/L，硫酸镁2g/L，酪蛋白酸钙3g/L，硫辛酸钠1.5g/L，轻质碳酸钙5g/L，初始pH为7.3。
本发明提供的利用茂源链轮丝菌(Streptomyces sp.)KL-Q1生产谷氨酰胺转氨酶的方法中，所述发酵培养基添加了特定含量的酪蛋白酸钙和硫辛酸钠，二者联合使用可以提高发酵培养液的流动性，解决了谷氨酰胺转胺酶在发酵的过程中使发酵培养基中蛋白质氮源交联，导致发酵培养液变黏稠，降低发酵培养液的溶氧量的问题，有利于促进茂源链轮丝菌(Streptomyces sp.)KL-Q1的生长和发酵，同时，酪蛋白酸钙还可以促进茂源链轮丝菌(Streptomyces sp.)KL-Q1的发酵能力，进一步提高茂源链轮丝菌(Streptomyces sp.)KL-Q1的酶活性。而经试验发现，过量的硫辛酸钠会降低茂源链轮丝菌(Streptomyces sp.)KL-Q1的产酶的活性。
与现有技术相比，本发明提供的技术方案具有以下优势：
(1)本发明提供的茂源链轮丝菌(Streptomyces sp.)KL-Q1具有产谷氨酰胺转胺酶活性高和发酵能力强的优点，是一株较为理想的产谷氨酰胺转胺酶的新菌株；
(2)本发明提供的利用茂源链轮丝菌(Streptomyces sp.)KL-Q1产谷氨酰胺转氨酶的方法操作简单，成本低，有利于该方法的推广和应用。
本发明提供的高酶活谷氨酰胺转氨酶新菌株，其分类命名为茂源链轮丝菌(Streptomyces sp.)KL-Q1，于2018年5月18日保藏在广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为：GDMCC No：60371，保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省微生物研究所。
具体实施方式
以下通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。本发明采用的成分均为市售常规成分，例如：大豆蛋白粉购于河南盛之德商贸有限公司，食品级，鱼蛋白胨购于青州市启迪生物科技有限公司。
实施例1、高酶活谷氨酰胺转氨酶菌株的诱变选育方法
(1)菌悬液制备：取30℃恒温培养6d的茂源链轮丝菌(Streptoverticilliummobarense)，用无菌的生理盐水洗下斜面上的孢子，倒入装有玻璃珠的无菌三角瓶中，振荡20min，用脱脂棉过滤，5000rpm离心10min后取沉淀洗涤复溶，制得孢子悬浮液，用血球计数板直接计数，调整孢子浓度约为106个/ml备用；
(2)常压室温等离子体+紫外诱变：取分别0.1ml步骤(1)中的菌悬液均匀涂布在多粒无菌载片上，置于常压室温等离子体诱变机中，分别每隔20s为一个梯度，处理20～100s。处理完毕后，取出载片，分别放入预先装有1ml无菌生理盐水的的EP管中进行洗脱2min，抽取0.1ml洗脱液涂布到平板培养基上，结合紫外灯照射，用15W紫外灯管，把上述涂布好的平板置于灯管正下方，分别处理50s，处理完毕之后在30℃下倒置培养7d；
(3)摇瓶发酵：将步骤(2)筛选到的生长良好的菌株接种至斜面培养基，在30℃下培养6d，取斜面培养物接种至种子液培养基，250ml三角瓶中装液量50ml，于28℃恒温摇床，转速为300rpm培养20h，后以10％的接种量接种至发酵液培养基，250ml三角瓶中装液量为50ml，于28℃恒温摇床，转速为300rpm，培养40h；
(4)酶活检测：比色法测定酶活，以CBZ-Gln-Gly为作用底物，L-谷氨酸-γ-单羟肟酸标准曲线。1个单位的TGase酶活定义为：37℃时每分钟催化形成1μmol的L-谷氨酸-γ-单羟肟酸的酶量(U/mL)。
试剂A：0.2mol/LTris-盐酸缓冲液(pH6.0)，0.1mol/L羟胺，0.01mol/L还原型谷胱甘肽，0.03mol/L苯甲基氧化碳酰-L-谷氨酰胺甘氨酸(CBZ-Gln-Gly)；
试剂B：3mol/L盐酸，12％三氯乙酸，5％六水三氯化铁(溶解于0.1mol/L盐酸中)；
2mL试剂A中加入0.2mL酶液，在37℃反应10min，加入2mL试剂B使反应终止，所形成红色的铁化合物，在525nm处比色，对照组用失活的酶液；同批次挑选出酶活最高的10％株，重新做摇瓶发酵，再检测，挑选出酶活最高的菌株作为下一轮诱变选育的出发菌，重复以上步骤，直至筛选到目标菌株；
(5)培养基成分：所述步骤(1)中的平板培养基和步骤(2)中的斜面培养基为：可溶性淀粉25g/L，酵母浸膏5g/L，磷酸二氢钾2g/L，硫酸镁2g/L，琼脂20g/L，其余为水，初始pH为7.3；
所述步骤(3)中的种子液培养基为：甘油20g/L，酵母浸膏10g/L，大豆蛋白粉10g/L，鱼蛋白胨15g/L，磷酸二氢钾2g/L，硫酸镁2g/L，初始pH为7.3；
所述步骤(3)中的发酵液培养基为：甘油20g/L，酵母浸膏15g/L，大豆蛋白粉5g/L，鱼蛋白胨20g/L，磷酸二氢钾2g/L，硫酸镁2g/L，轻质碳酸钙5g/L，初始pH为7.3。
实施例2、茂源链轮丝菌(Streptomyces sp.)KL-Q1的生化特征及其遗传稳定性
茂源链轮丝菌(Streptomyces sp.)KL-Q1形态学及生理生化学特征为：
菌落颜色：白色；
菌落大小：1mm～5mm；
菌落形态：表面干燥、突起、不规则；
气生菌丝：初期为白色，后期菌落中心显浅灰色；
基内菌丝：浅黄色；色素：无；
镜检形态：气生菌丝直、有分枝、生长旺盛、基丝无横隔、孢子圆形、表面光滑、孢子丝为紧密螺旋；
需氧方式：好氧；
营养方式：化能异氧；
适宜生长温度：25～35℃。
(1)所述茂源链轮丝菌(Streptomyces sp.)KL-Q1的传代发酵试验结果如表1所示
表1茂源链轮丝菌(Streptomyces sp.)KL-Q1的遗传稳定性
传代次数 发酵液中谷氨酰胺转氨酶的酶活(U/ml)
1 25.5
2 25.8
3 25.2
4 25.9
5 25.5
6 25.8
从表1可知，经过6次连续传代，茂源链轮丝菌(Streptomyces sp.)KL-Q1突变株发酵产谷氨酰胺转氨酶，发酵液中谷氨酰胺转氨酶的产量比较稳定，具有很好的传代稳定性，可作为进一步研究和开发的生产菌株。
实施例3、谷氨酰胺转氨酶的制备
S1平板培养：将茂源链轮丝菌(Streptomyces sp.)KL-Q1接种至平板培养基上培养，培养温度为28℃，培养时间为6d；所述平板培养基由以下组分组成：可溶性淀粉22g/L，酵母浸膏3g/L，磷酸二氢钾1g/L，硫酸镁1g/L，琼脂15g/L，其余为水，初始pH为7.3。
S2斜面培养：将步骤S1平板培养的茂源链轮丝菌(Streptomyces sp.)KL-Q1接种至斜面培养基上培养，培养温度为28℃，培养时间为6d；所述斜面培养基由以下组分组成：可溶性淀粉22g/L，酵母浸膏3g/L，磷酸二氢钾1g/L，硫酸镁1g/L，琼脂15g/L，其余为水，初始pH为7.3。
S3种液培养：将步骤S2中茂源链轮丝菌(Streptomyces sp.)KL-Q1斜面培养物接种至种液培养基中培养，250ml三角瓶中装液量50ml，培养温度为25℃，摇床转速为300rpm，恒温培养20h；所述种子液培养基由以下组分组成：甘油18g/L，酵母浸膏8g/L，大豆蛋白粉8g/L，鱼蛋白胨12g/L，磷酸二氢钾1g/L，硫酸镁1g/L，初始pH为7.3。
S4发酵培养：将步骤S3中茂源链轮丝菌(Streptomyces sp.)KL-Q1的种子液按接种量为10％(v/v)接种至发酵培养基中，250ml三角瓶中装液量50ml，培养温度为25℃，摇床转速为300rpm，恒温培养40h；所述发酵培养基由以下组分组成：甘油18g/L，酵母浸膏12g/L，大豆蛋白粉3g/L，鱼蛋白胨18g/L，磷酸二氢钾1g/L，硫酸镁1g/L，酪蛋白酸钙2g/L，硫辛酸钠1g/L，轻质碳酸钙3g/L，初始pH为7.3。
S5将上述发酵液进行比色法测定酶活以CBZ-Gln-Gly为作用底物，L-谷氨酸-γ-单羟肟酸标准曲线。1个单位的TGase酶活定义为：37℃时每分钟催化形成1μmol的L-谷氨酸-γ-单羟肟酸的酶量(U/mL)。
试剂A：0.2mol/LTris-盐酸缓冲液(pH6.0)，0.1mol/L羟胺，0.01mol/L还原型谷胱甘肽，0.03mol/L苯甲基氧化碳酰-L-谷氨酰胺甘氨酸(CBZ-Gln-Gly)；
试剂B：3mol/L盐酸，12％三氯乙酸，5％六水三氯化铁(溶解于0.1mol/L盐酸中)；
2mL试剂A中加入0.2mL酶液，在37℃反应10min，加入2mL试剂B使反应终止，所形成红色的铁化合物，在525nm处比色，对照组用失活的酶液；测定酶活为28U/ml，将该发酵液调节pH为6.0～8.0，压滤，得滤液；将滤液经5～10微米孔径袋滤过滤去除杂质，再经0.1～1微米孔径滤棒微滤，最后经20000分子量超滤膜超滤8～15倍，得浓缩液，加入浓缩液体积5倍的体积浓度为95％酒精，于0～4℃的条件下搅拌静止2h，悬浮液离心，得沉淀物，冷冻干燥，粉碎，得酶活5000U/g以上的成品。
实施例4、谷氨酰胺转氨酶的制备
S1平板培养：将茂源链轮丝菌(Streptomyces sp.)KL-Q1接种至平板培养基上培养，培养温度为30℃，培养时间为6d；所述平板培养基由以下组分组成：可溶性淀粉25g/L，酵母浸膏5g/L，磷酸二氢钾2g/L，硫酸镁2g/L，琼脂20g/L，其余为水，初始pH为7.3。
S2斜面培养：将步骤S1平板培养的茂源链轮丝菌(Streptomyces sp.)KL-Q1接种至斜面培养基上培养，培养温度为30℃，培养时间为6d；所述斜面培养基由以下组分组成：可溶性淀粉25g/L，酵母浸膏5g/L，磷酸二氢钾2g/L，硫酸镁2g/L，琼脂20g/L，其余为水，初始pH为7.3。
S3种液培养：将步骤S2中茂源链轮丝菌(Streptomyces sp.)KL-Q1斜面培养物接种至种液培养基中培养，250ml三角瓶中装液量50ml，培养温度为28℃，摇床转速为300rpm，恒温培养20h；所述种子液培养基由以下组分组成：甘油20g/L，酵母浸膏10g/L，大豆蛋白粉10g/L，鱼蛋白胨15g/L，磷酸二氢钾2g/L，硫酸镁2g/L，初始pH为7.3。
S4发酵培养：将步骤S3中茂源链轮丝菌(Streptomyces sp.)KL-Q1的种子液按接种量为10％(v/v)接种至发酵培养基中，250ml三角瓶中装液量50ml，培养温度为25℃，摇床转速为300rpm，恒温培养40h；所述发酵培养基由以下组分组成：甘油20g/L，酵母浸膏15g/L，大豆蛋白粉5g/L，鱼蛋白胨20g/L，磷酸二氢钾2g/L，硫酸镁2g/L，酪蛋白酸钙3g/L，硫辛酸钠1.5g/L，轻质碳酸钙5g/L，初始pH为7.3。
S5将上述发酵液进行比色法测定酶活以CBZ-Gln-Gly为作用底物，L-谷氨酸-γ-单羟肟酸标准曲线。1个单位的TGase酶活定义为：37℃时每分钟催化形成1μmol的L-谷氨酸-γ-单羟肟酸的酶量(U/mL)。
试剂A：0.2mol/LTris-盐酸缓冲液(pH6.0)，0.1mol/L羟胺，0.01mol/L还原型谷胱甘肽，0.03mol/L苯甲基氧化碳酰-L-谷氨酰胺甘氨酸(CBZ-Gln-Gly)；
试剂B：3mol/L盐酸，12％三氯乙酸，5％六水三氯化铁(溶解于0.1mol/L盐酸中)；
2mL试剂A中加入0.2mL酶液，在37℃反应10min，加入2mL试剂B使反应终止，所形成红色的铁化合物，在525nm处比色，对照组用失活的酶液；测定酶活为28.5U/ml，将该发酵液调节pH为6.0～8.0，压滤，得滤液；将滤液经5～10微米孔径袋滤过滤去除杂质，再经0.1～1微米孔径滤棒微滤，最后经20000分子量超滤膜超滤8～15倍，得浓缩液，加入浓缩液体积5倍的体积浓度为95％酒精，于0～4℃的条件下搅拌静止2h，悬浮液离心，得沉淀物，冷冻干燥，粉碎，得酶活5000U/g以上的成品。
对比例1、谷氨酰胺转氨酶的制备
S1平板培养：将茂源链轮丝菌(Streptomyces sp.)KL-Q1接种至平板培养基上培养，培养温度为30℃，培养时间为6d；所述平板培养基由以下组分组成：可用性淀粉25g/L，酵母浸膏5g/L，磷酸二氢钾2g/L，硫酸镁2g/L，琼脂20g/L，其余为水，初始pH为7.3。
S2斜面培养：将步骤S1平板培养的茂源链轮丝菌(Streptomyces sp.)KL-Q1接种至斜面培养基上培养，培养温度为30℃，培养时间为6d；所述斜面培养基由以下组分组成：可用性淀粉25g/L，酵母浸膏5g/L，磷酸二氢钾2g/L，硫酸镁2g/L，琼脂20g/L，其余为水，初始pH为7.3。
S3种液培养：将步骤S2中茂源链轮丝菌(Streptomyces sp.)KL-Q1斜面培养物接种至种液培养基中培养，250ml三角瓶中装液量50ml，培养温度为28℃，摇床转速为300rpm，恒温培养20h；所述种子液培养基由以下组分组成：甘油20g/L，酵母浸膏10g/L，大豆蛋白粉10g/L，鱼蛋白胨15g/L，磷酸二氢钾2g/L，硫酸镁2g/L，初始pH为7.3。
S4发酵培养：将步骤S3中茂源链轮丝菌(Streptomyces sp.)KL-Q1的种子液按接种量为10％(v/v)接种至发酵培养基中，250ml三角瓶中装液量50ml，培养温度为25℃，摇床转速为300rpm，恒温培养40h；所述发酵培养基由以下组分组成：甘油20g/L，酵母浸膏15g/L，大豆蛋白粉5g/L，鱼蛋白胨20g/L，磷酸二氢钾2g/L，硫酸镁2g/L，酪蛋白酸钙4.5g/L，轻质碳酸钙5g/L，初始pH为7.3。
S5将上述发酵液进行比色法测定酶活以CBZ-Gln-Gly为作用底物，L-谷氨酸-γ-单羟肟酸标准曲线。1个单位的TGase酶活定义为：37℃时每分钟催化形成1μmol的L-谷氨酸-γ-单羟肟酸的酶量(U/mL)。
试剂A：0.2mol/LTris-盐酸缓冲液(pH6.0)，0.1mol/L羟胺，0.01mol/L还原型谷胱甘肽，0.03mol/L苯甲基氧化碳酰-L-谷氨酰胺甘氨酸(CBZ-Gln-Gly)；
试剂B：3mol/L盐酸，12％三氯乙酸，5％六水三氯化铁(溶解于0.1mol/L盐酸中)；
2mL试剂A中加入0.2mL酶液，在37℃反应10min，加入2mL试剂B使反应终止，所形成红色的铁化合物，在525nm处比色，对照组用失活的酶液；测定酶活为18U/ml，将该发酵液调节pH为6.0～8.0，压滤，得滤液；将滤液经5～10微米孔径袋滤过滤去除杂质，再经0.1～1微米孔径滤棒微滤，最后经20000分子量超滤膜超滤8～15倍，得浓缩液，加入浓缩液体积5倍的体积浓度为95％酒精，于0～4℃的条件下搅拌静止2h，悬浮液离心，得沉淀物，冷冻干燥，粉碎，即得。
对比例2、谷氨酰胺转氨酶的制备
S1平板培养：将茂源链轮丝菌(Streptomyces sp.)KL-Q1接种至平板培养基上培养，培养温度为30℃，培养时间为6d；所述平板培养基由以下组分组成：可用性淀粉25g/L，酵母浸膏5g/L，磷酸二氢钾2g/L，硫酸镁2g/L，琼脂20g/L，其余为水，初始pH为7.3。
S2斜面培养：将步骤S1平板培养的茂源链轮丝菌(Streptomyces sp.)KL-Q1接种至斜面培养基上培养，培养温度为30℃，培养时间为6d；所述斜面培养基由以下组分组成：可用性淀粉25g/L，酵母浸膏5g/L，磷酸二氢钾2g/L，硫酸镁2g/L，琼脂20g/L，其余为水，初始pH为7.3。
S3种液培养：将步骤S2中茂源链轮丝菌(Streptomyces sp.)KL-Q1斜面培养物接种至种液培养基中培养，250ml三角瓶中装液量50ml，培养温度为28℃，摇床转速为300rpm，恒温培养20h；所述种子液培养基由以下组分组成：甘油20g/L，酵母浸膏10g/L，大豆蛋白粉10g/L，鱼蛋白胨15g/L，磷酸二氢钾2g/L，硫酸镁2g/L，初始pH为7.3。
S4发酵培养：将步骤S3中茂源链轮丝菌(Streptomyces sp.)KL-Q1的种子液按接种量为10％(v/v)接种至发酵培养基中，250ml三角瓶中装液量50ml，培养温度为25℃，摇床转速为300rpm，恒温培养40h；所述发酵培养基由以下组分组成：甘油20g/L，酵母浸膏15g/L，大豆蛋白粉5g/L，鱼蛋白胨20g/L，磷酸二氢钾2g/L，硫酸镁2g/L，硫辛酸钠4.5g/L，轻质碳酸钙5g/L，初始pH为7.3。
S5将上述发酵液进行比色法测定酶活以CBZ-Gln-Gly为作用底物，L-谷氨酸-γ-单羟肟酸标准曲线。1个单位的TGase酶活定义为：37℃时每分钟催化形成1μmol的L-谷氨酸-γ-单羟肟酸的酶量(U/mL)。
试剂A：0.2mol/LTris-盐酸缓冲液(pH6.0)，0.1mol/L羟胺，0.01mol/L还原型谷胱甘肽，0.03mol/L苯甲基氧化碳酰-L-谷氨酰胺甘氨酸(CBZ-Gln-Gly)；
试剂B：3mol/L盐酸，12％三氯乙酸，5％六水三氯化铁(溶解于0.1mol/L盐酸中)；
2mL试剂A中加入0.2mL酶液，在37℃反应10min，加入2mL试剂B使反应终止，所形成红色的铁化合物，在525nm处比色，对照组用失活的酶液；测定酶活为16U/ml，将该发酵液调节pH为6.0～8.0，压滤，得滤液；将滤液经5～10微米孔径袋滤过滤去除杂质，再经0.1～1微米孔径滤棒微滤，最后经20000分子量超滤膜超滤8～15倍，得浓缩液，加入浓缩液体积5倍的体积浓度为95％酒精，于0～4℃的条件下搅拌静止2h，悬浮液离心，得沉淀物，冷冻干燥，粉碎，即得。

Claims (6)

1.一株高酶活谷氨酰胺转氨酶菌株，其分类命名为链霉菌(Streptomyces sp.)KL-Q1，于2018年5月18日保藏在广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为：GDMCC No：60371，保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省微生物研究所。
2.如权利要求1所述的高酶活谷氨酰胺转氨酶菌株在发酵产谷氨酰胺转氨酶中的应用。
3.如权利要求2所述的高酶活谷氨酰胺转氨酶菌株在发酵产谷氨酰胺转氨酶中的应用，其特征在于，包括以下步骤：
S1平板培养：将权利要求1所述的链霉菌(Streptomyces sp.)KL-Q1接种至平板培养基上培养，培养温度为28～35℃，培养时间为6d；
S2斜面培养：将步骤S1平板培养的链霉菌(Streptomyces sp.)KL-Q1接种至斜面培养基上培养，培养温度为28～35℃，培养时间为6d；
S3种液培养：将步骤S2中链霉菌(Streptomyces sp.)KL-Q1斜面培养物接种至种子液培养基中培养，培养温度为25～30℃，摇床转速为300rpm，恒温培养20h；
S4发酵培养：将步骤S3中链霉菌(Streptomyces sp.)KL-Q1的种子液按接种量为10％(v/v)接种至发酵培养基中，培养温度为25℃，摇床转速为300rpm，恒温培养40h；
S5干燥处理：将步骤S4得到的发酵液调节pH为6.0～8.0，压滤，得滤液；将滤液经5～10微米孔径袋滤过滤去除杂质，再经0.1～1微米孔径滤棒微滤，最后经20000分子量超滤膜超滤8～15倍，得浓缩液，加入浓缩液体积5倍的体积浓度为95％酒精，于0～4℃的条件下搅拌静止2h，悬浮液离心，得沉淀物，冷冻干燥，粉碎，即得；
所述步骤S1的平板培养基和步骤S2的斜面培养基由以下组分组成：可溶性淀粉22～28g/L，酵母浸膏3～8g/L，磷酸二氢钾1～3g/L，硫酸镁1～3g/L，琼脂15～25g/L，其余为水，初始pH为7.3；
所述步骤S3的种子液培养基由以下组分组成：甘油18～22g/L，酵母浸膏8～12g/L，大豆蛋白粉8～12g/L，鱼蛋白胨12～16g/L，磷酸二氢钾1～3g/L，硫酸镁1～3g/L，初始pH为7.3；
所述步骤S4的发酵培养基由以下组分组成：甘油18～22g/L，酵母浸膏12～18g/L，大豆蛋白粉3～8g/L，鱼蛋白胨18～22g/L，磷酸二氢钾1～3g/L，硫酸镁1～3g/L，酪蛋白酸钙2～4g/L，硫辛酸钠1～2g/L，轻质碳酸钙3～8g/L，初始pH为7.3。
4.如权利要求3所述的高酶活谷氨酰胺转氨酶菌株在发酵产谷氨酰胺转氨酶中的应用，其特征在于，所述步骤S1的平板培养基和步骤S2的斜面培养基由以下组分组成：可溶性淀粉25g/L，酵母浸膏5g/L，磷酸二氢钾2g/L，硫酸镁2g/L，琼脂20g/L，其余为水，初始pH为7.3。
5.如权利要求3所述的高酶活谷氨酰胺转氨酶菌株在发酵产谷氨酰胺转氨酶中的应用，其特征在于，所述步骤S3的种子液培养基由以下组分组成：甘油20g/L，酵母浸膏10g/L，大豆蛋白粉10g/L，鱼蛋白胨15g/L，磷酸二氢钾2g/L，硫酸镁2g/L，初始pH为7.3。
6.如权利要求3所述的高酶活谷氨酰胺转氨酶菌株在发酵产谷氨酰胺转氨酶中的应用，其特征在于，所述步骤S4的发酵培养基由以下组分组成：甘油20g/L，酵母浸膏15g/L，大豆蛋白粉5g/L，鱼蛋白胨20g/L，磷酸二氢钾2g/L，硫酸镁2g/L，酪蛋白酸钙3g/L，硫辛酸钠1.5g/L，轻质碳酸钙5g/L，初始pH为7.3。
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