CN113817619B - 一种产耐高温谷氨酰胺转胺酶yzk06菌株及其应用 - Google Patents

一种产耐高温谷氨酰胺转胺酶yzk06菌株及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及产耐高温谷氨酰胺转胺酶yzk06菌株及其应用，可有效解决产耐高温谷氨酰胺转胺酶的制备，满足工业领域对耐高温谷氨酰胺转胺酶的需要问题，一种产耐高温谷氨酰胺转胺酶yzk06菌株，分类命名为酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），于2021年9月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No：23344，可有效用于生产耐高温谷氨酰胺转胺酶，实现在制备耐高温谷氨酰胺转胺酶中的应用，本发明不依赖钙离子的存在而起催化作用，pH值范围广，高温高压下稳定性好，在发酵过程中酶的活性成分可直接分泌到培养基中，分离纯化简单，每吨生产成本仅1.8～2.0万元，生产周期只有3～5天，容易进行工业化生产，满足工业生产中对耐高温谷氨酰胺转胺酶的需要。

Description

一种产耐高温谷氨酰胺转胺酶yzk06菌株及其应用
技术领域
本发明涉及一种微生物，特别是一种产耐高温谷氨酰胺转胺酶yzk06菌株及其应用。
背景技术
谷氨酰胺转胺酶(Transglutaminase)是一种能够催化酰基转移反应的转移酶。由于其具有在蛋白质间架桥形成ε-(γ-Glu)-Lys的异型肽键，可以催化相同或不同蛋白质分子间发生交联和聚合反应，改善和提升蛋白质的乳化性、凝胶性、粘性和热稳定性。谷氨酰胺转胺酶改变蛋白质性能的意义重大。一般酶法改性蛋白质通常采用水解酶作用于蛋白质的一定肽键，将大分子蛋白质水解为具有特定功能的小分子肽，而谷氨酰胺转胺酶则通过分子插入、交联反应、脱氨作用使蛋白质的分子结构发生变化。谷氨酰胺转胺酶在自然界中广泛存在于动物、植物和微生物的机体中。日常生活中人们一直都在食用自然界中天然形成的含有谷氨酰胺转胺酶催化形成的赖氨酸异型肽键的食物，因此，用含谷氨酰胺转胺酶生产的蛋白质类食品对人体的健康是安全。
谷氨酰胺转胺酶可以通过催化蛋白质分子之间发生的交联反应，改善蛋白质的许多重要性能。用谷氨酰胺转胺酶生产重组肉，不仅可将碎肉粘结在一起，还可以将各种非肉蛋白交联到肉蛋白上，明显改善肉制品的口感、风味、组织结构和营养。谷氨酰胺转胺酶可以将人体必需氨基酸(赖氨酸、蛋氨酸)共价交联到蛋白质上，阻止美拉德反应对氨基酸的破坏，提高蛋白质的营养价值。谷氨酰胺转胺酶还可以向氨基酸组成不理想的蛋白质中引入所缺氨基酸，增强其营养性能。谷氨酰胺转胺酶能够用于酸奶和奶酪中，提高产品得率。替代稳定剂使用，可以提高产品粘度和凝胶强度，强烈晃动不分散，改善持水性、减少乳清析出率，降低成本。改善奶制品的质地、口感、风味，提高市场价值。谷氨酰胺转胺酶在面制品中的应用，可提高面制品品质，改善面团面筋网络结构，增强面团弹性和粘弹性，增加面团气体保持能力，使面包、面条体积更大，内部组织更均匀，减少挂面断条率，增加面条的咬劲和耐煮性。经谷氨酰胺转胺酶交联过的酪蛋白脱水后可得到不溶于水的薄膜，这种薄膜能够被胰凝乳蛋白酶分解，是一种可食用的包装材料。
长期以来谷氨酰胺转胺酶商业化制品都是从豚鼠肝脏等动物组织中提取，由于分离精制过程复杂，而且来源稀有且含量少，使得产品价格十分昂贵，严重影响谷氨酰胺转胺酶产业的快速发展。微生物发酵制备的谷氨酰胺转胺酶属胞外酶，在发酵过程中微生物可直接将活性成分分泌到发酵培养基中，酶的分离纯化更容易。谷氨酰胺转胺酶在催化作用过程不需要Ca2+的存在而起作用。微生物发酵谷氨酰胺转胺酶的生产具有原料来源广、成本低、周期短，可以不受环境条件制约进行规模化生产而受到广泛关注，成为生物酶制剂领域研究和开发的热点产品。在食品工业、生物医药、化妆品、纺织工业等领域应用前景广阔，是各种新型蛋白质类制品生产和加工环节一种非常重要的酶制剂。
在微生物发酵生产谷氨酰胺转胺酶过程中，获得具有自主知识产权且生产性能优良菌株是首先必须解决的最关键因素。针对我国谷氨酰胺转胺酶商品化应用生产成本高、价格昂贵、推广应用困难等技术难题，许多研究者为提高谷氨酰胺转胺酶的产量和酶活，围绕着产酶微生物菌株的筛选和诱变技术进行了大量研究工作，一方面通过直接筛选高表达、高酶活的微生物菌株，另一方面通过微生物菌种诱变技术选育高效产酶菌株。
紫外线诱变虽然诱变谱比较广泛，但较难获得某些氨基酸的突变，而且突变效率较低。化学诱变突变谱相对较窄，难以获得理想的高产菌株。紫外线和化学方法相结合的诱变耗时又相对较长。离子注入是近年来兴起的一种材料表面处理技术，已被成功地应用于微生物的育种方面。研究表明，离子低剂量注入引发的突变，细胞损伤较轻，可获得较高的突变率和较宽的突变谱，为微生物筛选朝着有利突变型转变提供了较为广阔的空间。
谷氨酰胺转胺酶本身是一种蛋白质，其稳定性易受各种理化因素的影响。在贮存、运输及食品加工过程中受温度影响较明显，如在酸奶发酵前的巴氏消毒过程中、火腿的高温蒸煮、肉鱼丸的切割、斩拌等过程中会产生热量，使得谷氨酰胺转胺酶活性损失、交联效果大打折扣，影响酶本身作用效果和蛋白质类产品的品质。
目前阶段我国谷氨酰胺转胺酶主要依赖于进口，造成该酶的价格昂贵。对谷氨酰胺转氨酶的研究主要集中在链霉菌谷氨酰胺转胺酶高产菌株的筛选、高产工程菌构建以及发酵条件优化等方面。但谷氨酰胺转胺酶生产菌株的产酶量和酶活并未得到显著提高，而且链霉菌的发酵周期长，发酵培养复杂，限制了其在商业化生产中的运用，谷氨酰胺转胺酶对热的稳定性成为其在高温食品加工领域应用的瓶颈。因此，提供一种产耐高温谷氨酰胺转胺酶的菌株，实现在制备耐高温谷氨酰胺转胺酶中的应用势在必行，但至今未见有公开报导。
发明内容
针对上述情况，为克服现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种产耐高温谷氨酰胺转胺酶yzk06菌株及其应用，可有效解决产耐高温谷氨酰胺转胺酶的制备，满足工业领域对耐高温谷氨酰胺转胺酶的需要问题。
本发明解决的技术方案是，一种产耐高温谷氨酰胺转胺酶yzk06菌株，分类命名为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，于2021年9月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No：23344，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；
本发明一种产耐高温谷氨酰胺转胺酶yzk06菌株，可有效用于生产耐高温谷氨酰胺转胺酶，实现在制备耐高温谷氨酰胺转胺酶中的应用，应用方法为：
(1)对yzk06菌株活化：
无菌条件下，将yzk06菌株接种至培养基上，28℃培养24-36h，得活化的酿酒酵母yzk06菌株；
所述的培养基为麦芽汁150mL、琼脂3g(pH自然)，121℃灭菌20min；
(2)制备发酵种子液：
将活化的酿酒酵母yzk06菌株转接至种子培养基中，在温度28℃、转速150-180r/min，培养24-36h，得发酵种子液；
所述的种子培养基(YPD培养基)，将10g酵母膏和20g蛋白胨用水溶解，121℃灭菌20min，加入100ml含20g葡萄糖灭菌溶液，再用灭菌蒸馏水定容至1000mL，pH6.5；
(3)发酵生产谷氨酰胺转胺酶粗酶混合液：
将发酵种子液按发酵培养基体积(v/v)8％接种于发酵培养基中，pH6.5，发酵温度28℃，培养24-72h，得酿酒酵母yzk06菌株发酵产含培养基的耐高温谷氨酰胺转胺酶粗酶混合液；
所述的发酵培养基为葡萄糖20g，蔗糖20g，蛋白胨15g，酵母浸出物15g，磷酸二氢钾1g，磷酸氢二钾1g，7水硫酸镁0.5g，蒸馏水定容至1000mL，121℃灭菌20min，pH6.5；
(4)粗酶混合液固液分离：
粗酶混合液采用板框压滤机过滤实现固液分离，收集分离后的粗酶混合液；
(5)盐析纯化：
发酵粗酶液用硫酸氨盐析纯化，首先向发酵粗酶液中加入等体积的饱和度为30％的硫酸铵，搅拌均匀，静置，去除沉淀，得第一上清液；再向第一上清液中加入等体积的饱和度为60％的硫酸铵，搅拌均匀，静置，去除沉淀，得第二上清液；向第二上清液中加入等体积的饱和硫酸铵，搅拌均匀，静置，去除沉淀，得纯化的耐高温谷氨酰胺转胺酶酶液；
(6)葡聚糖凝胶浓缩：
向纯化的耐高温谷氨酰胺转胺酶酶液中加入质量浓度(m/m)20％的G50干葡聚糖凝胶，搅拌均匀，使凝胶充分吸水膨胀，再过滤去除凝胶，重复多次，得耐高温谷氨酰胺转胺酶酶浓缩液(至所需浓度)；
(7)喷雾干燥：
将耐高温谷氨酰胺转胺酶酶浓缩液用干燥机进行低温干燥，整体干燥过程酶液和物料表面温度不高于60℃，得干燥的耐高温谷氨酰胺转胺酶，回收率≥75％，产品酶活≥120U/g。
本发明是新筛选的一种产耐高温谷氨酰胺转胺酶yzk06菌株，可以完全不依赖钙离子的存在而起催化作用，对热稳定性强，pH值范围广，高温高压条件下具有更为显著的稳定性。同时该酶还属于胞外酶，在发酵过程中酶的活性成分可直接分泌到培养基中，分离纯化简单，每吨生产成本仅1.8～2.0万元，生产周期只有3～5天，且容易进行工业化生产，满足工业生产中对耐高温谷氨酰胺转胺酶的需要，有巨大的经济和社会效益。
具体实施方式
以下结合具体情况和实施例对本发明的具体实施方式作详细说明。
一种产耐高温谷氨酰胺转胺酶yzk06菌株，是以中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心提供的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)为原始菌种(购买)，经种子培养基、发酵培养基培养、筛选，得到的一种产耐高温谷氨酰胺转胺酶yzk06菌株，分类命名为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，于2021年9月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No：23344，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；
该菌株具有生产耐高温谷氨酰胺转胺酶之功能，实现在生产耐高温谷氨酰胺转胺酶中的应用，其应用方法可由以下实施例给出。
实施例1
本发明一种产耐高温谷氨酰胺转胺酶yzk06菌株制备耐高温谷氨酰胺转胺酶的方法为：
(1)对yzk06菌株活化：
无菌条件下取1环菌株yzk06接种至试管斜面培养基，28℃培养24h，得活化的yzk06菌株；
(2)制备发酵种子液：
取1环活化后的yzk06菌株转接至装液量为50mL/125mL的三角瓶种子培养基中，摇床温度28℃、转速180r/min，培养24h，得发酵种子液；
(3)发酵生产谷氨酰胺转胺酶粗酶混合液：
将发酵种子液按发酵培养基体积(v/v)的8％接入到装液量为400mL/1000mL的三角瓶发酵培养基中，pH6.5，发酵温度28℃、转速180r/min，培养72h，得酿酒酵母yzk06菌株发酵产含培养基的耐高温谷氨酰胺转胺酶粗酶混合液；
(4)粗酶混合液固液分离：
粗酶混合液采用板框压滤机过滤实现固液分离，板框压滤机设计为方形，板与框的两边侧上下各有四只开空角耳，构成液体和气体的通路，发酵粗酶混合液从板框上部的两条通道流入滤框，滤液沿滤板表面流出机外，收集起来即为发酵粗酶液，固体物形成的滤饼则留在板框内；
(5)盐析纯化：
发酵粗酶液用硫酸氨盐析纯化，首先向发酵粗酶液中加入等体积的饱和度为30％的硫酸铵，搅拌30min，静置6～8h，去除沉淀，得第一上清液；再向第一上清液中加入等体积的饱和度为60％的硫酸铵，搅拌30min，静置6～8h，去除沉淀，得第二上清液；向第二上清液中加入等体积的饱和硫酸铵，搅拌30min，静置6～8h，去除沉淀，得纯化的耐高温谷氨酰胺转胺酶酶液；
(6)葡聚糖凝胶浓缩：
向纯化的耐高温谷氨酰胺转胺酶酶液中加入质量浓度(m/m)20％的G50干葡聚糖凝胶，搅拌30min，使凝胶充分吸水膨胀，再过滤去除凝胶，重复3～5次，得耐高温谷氨酰胺转胺酶酶浓缩液(至所需浓度)；
(7)喷雾干燥
采用离心喷雾间歇卸料的干燥机对耐高温谷氨酰胺转胺酶酶浓缩液低温干燥，耐高温谷氨酰胺转胺酶酶浓缩液在进入干燥塔前先注入塔顶的小罐，加温至60℃，保持小罐内浓缩液恒定，确保浓缩液进入干燥塔内均匀；浓度液由小罐底部的管路进入干燥塔内高速旋转的离心喷雾盘，喷雾盘转速3000～5000r/min，浓度液通过离心喷雾盘形成雾状，与从塔顶部进入的热空气进行充分接触，造成强烈的传热和水分蒸发，空气温度随之降低，雾化颗粒在气流和自身重力作用下旋转而下，当达到出口时已完成干燥，通过双闸门的卸料阀卸料取得耐高温谷氨酰胺转胺酶；整个干燥过程酶液和物料表面温度不高于60℃，参照国标《谷氨酰胺转胺酶活性检测方法》(GB/T34795-2017)的测定方法，耐高温谷氨酰胺转胺酶后处理过程酶活回收率≥75％，产品酶活≥120U/g。
实施例2
本发明一种产耐高温谷氨酰胺转胺酶yzk06菌株制备耐高温谷氨酰胺转胺酶的方法为：
(1)对yzk06菌株活化：
无菌条件下取1环yzk06菌株接种至试管斜面培养基，28℃培养24h，得活化的菌株yzk06；
(2)制备发酵种子液：
取5环活化后的yzk06菌株转接至装液量为50mL/125mL的三角瓶种子培养基中，摇床温度28℃、转速180r/min，培养24h，得发酵种子液；
(3)发酵生产谷氨酰胺转胺酶粗酶混合液：
将发酵种子液按发酵培养基体积(v/v)的8％发酵种子液加入到装有2L发酵培养基的5L发酵罐中，pH6.5，发酵温度28℃、转速150～180r/min，0～48h通气量为1.0～1.5L/min，49～72h通气量为0.5～1.0L/min，期间pH值降低用氢氧化钠调节pH6.5，得酿酒酵母yzk06菌株发酵产含培养基的耐高温谷氨酰胺转胺酶粗酶混合液；
(4)粗酶混合液固液分离：
粗酶混合液采用板框压滤机过滤实现固液分离，板框压滤机设计为方形，板与框的两边侧上下各有四只开空角耳，构成液体和气体的通路，发酵粗酶混合液从板框上部的两条通道流入滤框，滤液沿滤板表面流出机外，收集起来即为发酵粗酶液，固体物形成的滤饼则留在板框内；
(5)盐析纯化：
发酵粗酶液用硫酸氨盐析纯化，首先向发酵粗酶液中加入等体积的饱和度为30％的硫酸铵，搅拌30min，静置6～8h，去除沉淀，得第一上清液；再向第一上清液中加入等体积的饱和度为60％的硫酸铵，搅拌30min，静置6～8h，去除沉淀，得第二上清液；向第二上清液中加入等体积的饱和硫酸铵，搅拌30min，静置6～8h，去除沉淀，得纯化的耐高温谷氨酰胺转胺酶酶液；
(6)葡聚糖凝胶浓缩：
向纯化的耐高温谷氨酰胺转胺酶酶液中加入质量浓度(m/m)20％的G50干葡聚糖凝胶，搅拌30min，使凝胶充分吸水膨胀，再过滤去除凝胶，重复3～5次，得耐高温谷氨酰胺转胺酶酶浓缩液(至所需浓度)；
(7)、喷雾干燥
采用离心喷雾间歇卸料的干燥机对耐高温谷氨酰胺转胺酶酶浓缩液低温干燥，耐高温谷氨酰胺转胺酶酶浓缩液在进入干燥塔前先注入塔顶的小罐，加温至60℃，保持小罐内浓缩液恒定，确保浓缩液进入干燥塔内均匀；浓度液由小罐底部的管路进入干燥塔内高速旋转的离心喷雾盘，喷雾盘转速3000～5000r/min，浓度液通过离心喷雾盘形成雾状，与从塔顶部进入的热空气进行充分接触，造成强烈的传热和水分蒸发，空气温度随之降低，雾化颗粒在气流和自身重力作用下旋转而下，当达到出口时已完成干燥，通过双闸门的卸料阀卸料取得耐高温谷氨酰胺转胺酶；整个干燥过程酶液和物料表面温度不高于60℃，参照国标《谷氨酰胺转胺酶活性检测方法》(GB/T34795-2017)的测定方法，耐高温谷氨酰胺转胺酶后处理过程酶活回收率≥75％，产品酶活≥120U/g。
实施例3
本发明一种产耐高温谷氨酰胺转胺酶yzk06菌株制备耐高温谷氨酰胺转胺酶的方法为：
(1)对yzk06菌株活化：
无菌条件下取5环yzk06菌株接种至装液量为500mL的三角瓶种子培养基200mL中，摇床温度28℃、转速180r/min，培养36h，得三角瓶摇床发酵一级种子液；
(2)制备发酵种子液：
将发酵一级种子液按发酵种子培养基体积(v/v)的8％接入装有3L发酵种子培养基的5L发酵罐中，pH6.5，发酵罐温度28℃、转速150～180r/min、通气量1.0～1.5L/min、罐压0.04～0.05Mpa，培养36h，得二级种子液；
(3)发酵生产谷氨酰胺转胺酶粗酶混合液：
将二级种子液按发酵培养基体积(v/v)8％接入装有30L发酵培养基的50L发酵罐中，pH6.5，温度28℃、转速180～200r/min，0～48h通气量1.5～2.0L/min、49～72h通气量1.0～1.5L/min、罐压0.04～0.05Mpa，期间pH降低用氢氧化钠调节pH6.5，连续培养72h，得酿酒酵母yzk06菌株发酵产含培养基的耐高温谷氨酰胺转胺酶粗酶混合液；
(4)粗酶混合液固液分离：
粗酶混合液采用板框压滤机过滤实现固液分离，板框压滤机设计为方形，板与框的两边侧上下各有四只开空角耳，构成液体和气体的通路，发酵粗酶混合液从板框上部的两条通道流入滤框，滤液沿滤板表面流出机外，收集起来即为发酵粗酶液，固体物形成的滤饼则留在板框内；
(5)盐析纯化：
发酵粗酶液用硫酸氨盐析纯化，首先向发酵粗酶液中加入等体积的饱和度为30％的硫酸铵，搅拌30min，静置6～8h，去除沉淀，得第一上清液；再向第一上清液中加入等体积的饱和度为60％的硫酸铵，搅拌30min，静置6～8h，去除沉淀，得第二上清液；向第二上清液中加入等体积的饱和硫酸铵，搅拌30min，静置6～8h，去除沉淀，得纯化的耐高温谷氨酰胺转胺酶酶液；
(6)葡聚糖凝胶浓缩：
向纯化的耐高温谷氨酰胺转胺酶酶液中加入质量浓度(m/m)20％的G50干葡聚糖凝胶，搅拌30min，使凝胶充分吸水膨胀，再过滤去除凝胶，重复3～5次，得耐高温谷氨酰胺转胺酶酶浓缩液(至所需浓度)；
(7)、喷雾干燥
采用离心喷雾间歇卸料的干燥机对耐高温谷氨酰胺转胺酶酶浓缩液低温干燥，耐高温谷氨酰胺转胺酶酶浓缩液在进入干燥塔前先注入塔顶的小罐，加温至60℃，保持小罐内浓缩液恒定，确保浓缩液进入干燥塔内均匀；浓度液由小罐底部的管路进入干燥塔内高速旋转的离心喷雾盘，喷雾盘转速3000～5000r/min，浓度液通过离心喷雾盘形成雾状，与从塔顶部进入的热空气进行充分接触，造成强烈的传热和水分蒸发，空气温度随之降低，雾化颗粒在气流和自身重力作用下旋转而下，当达到出口时已完成干燥，通过双闸门的卸料阀卸料取得耐高温谷氨酰胺转胺酶；整个干燥过程酶液和物料表面温度不高于60℃，参照国标《谷氨酰胺转胺酶活性检测方法》(GB/T34795-2017)的测定方法，耐高温谷氨酰胺转胺酶后处理过程酶活回收率≥75％，产品酶活≥120U/g。
实施例4
本发明一种产耐高温谷氨酰胺转胺酶yzk06菌株制备耐高温谷氨酰胺转胺酶的方法为：
(1)对yzk06菌株活化：
无菌条件下取5环yzk06菌株接种至400mL/1000mL的三角瓶培养基中，摇床温度28℃，180r/min发酵培养36h，得一级种子液；
(2)制备发酵种子液：
将一级种子液按发酵种子培养基体积(v/v)的8％接入装有30L发酵种子培养基的50L发酵罐中，pH6.5、发酵罐温度28℃、转速180～200r/min、通气量1.5～2.0L/min、罐压0.04～0.05Mpa，培养36h，得二级种子液；
(3)发酵生产谷氨酰胺转胺酶粗酶混合液：
将二级种子液按发酵培养基体积(v/v)8％接入装有300L发酵培养基的500L发酵罐中，pH6.5，发酵罐温度28℃、转速210～250r/min，0～48h通气量2.0～2.5L/min、49～72h通气量1.5～2.0L/min、罐压0.04～0.05Mpa，期间pH降低加氢氧化钠调节pH6.5，连续培养72h，得酿酒酵母yzk06菌株发酵产含培养基的耐高温谷氨酰胺转胺酶粗酶混合液；
(4)粗酶混合液固液分离：
粗酶混合液采用板框压滤机过滤实现固液分离，板框压滤机设计为方形，板与框的两边侧上下各有四只开空角耳，构成液体和气体的通路，发酵粗酶混合液从板框上部的两条通道流入滤框，滤液沿滤板表面流出机外，收集起来即为发酵粗酶液，固体物形成的滤饼则留在板框内；
(5)盐析纯化：
发酵粗酶液用硫酸氨盐析纯化，首先向发酵粗酶液中加入等体积的饱和度为30％的硫酸铵，搅拌30min，静置6～8h，去除沉淀，得第一上清液；再向第一上清液中加入等体积的饱和度为60％的硫酸铵，搅拌30min，静置6～8h，去除沉淀，得第二上清液；向第二上清液中加入等体积的饱和硫酸铵，搅拌30min，静置6～8h，去除沉淀，得纯化的耐高温谷氨酰胺转胺酶酶液；
(6)葡聚糖凝胶浓缩：
向纯化的耐高温谷氨酰胺转胺酶酶液中加入质量浓度(m/m)20％的G50干葡聚糖凝胶，搅拌30min，使凝胶充分吸水膨胀，再过滤去除凝胶，重复3～5次，得耐高温谷氨酰胺转胺酶酶浓缩液(至所需浓度)；
(7)喷雾干燥
采用离心喷雾间歇卸料的干燥机对耐高温谷氨酰胺转胺酶酶浓缩液低温干燥，耐高温谷氨酰胺转胺酶酶浓缩液在进入干燥塔前先注入塔顶的小罐，加温至60℃，保持小罐内浓缩液恒定，确保浓缩液进入干燥塔内均匀；浓度液由小罐底部的管路进入干燥塔内高速旋转的离心喷雾盘，喷雾盘转速3000～5000r/min，浓度液通过离心喷雾盘形成雾状，与从塔顶部进入的热空气进行充分接触，造成强烈的传热和水分蒸发，空气温度随之降低，雾化颗粒在气流和自身重力作用下旋转而下，当达到出口时已完成干燥，通过双闸门的卸料阀卸料取得耐高温谷氨酰胺转胺酶；整个干燥过程酶液和物料表面温度不高于60℃，参照国标《谷氨酰胺转胺酶活性检测方法》(GB/T34795-2017)的测定方法，耐高温谷氨酰胺转胺酶后处理过程酶活回收率≥75％，产品酶活≥120U/g。
本发明是提供的新的一种产耐高温谷氨酰胺转胺酶yzk06菌株，具有产耐高温谷氨酰胺转胺酶的作用，并经鉴定和试验，效果非常好，以实施例1为例，有关资料如下：
一、产谷氨酰胺转胺酶菌株的筛选与鉴定
1.菌种来源
以中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心提供的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)为原始菌种。
2.培养基
斜面及平板培养基:麦芽汁150mL，琼脂3g，pH自然，121℃灭菌20min，灭菌后制成平板或试管斜面培养基。
液体种子培养基(YPD培养基)：将10g酵母膏和20g蛋白胨用水溶解，121℃灭菌20min，加入100ml含20g葡萄糖灭菌溶液，再用灭菌蒸馏水定容至1000mL，pH6.5。
发酵培养基：葡萄糖20g，蔗糖20g，蛋白胨15g，酵母浸出物15g，磷酸二氢钾1g，磷酸氢二钾1g，7水硫酸镁0.5g，蒸馏水定容至1000mL，121℃灭菌20min，pH6.5。
3.样品处理
菌种活化：将保藏于试管斜面的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)原始菌种用10mL无菌水洗脱，10倍梯度进行稀释，取合适梯度涂布于平板培养基上，28℃培养3d,促使菌种复活。
样品处理：取平板生长良好的酿酒酵母菌落，移取1环于灭菌后的平皿中涂匀，以无菌风吹干，镜检无细胞重叠者即可进行离子注入。
4.离子注入
离子注入试验在中国科学院合肥物质科学研究院进行。离子注入机能量在5keV～50keV之间可调。将涂布酿酒酵母菌种的平皿置于微环境靶室的水冷靶台上，微环境靶室预抽至100Pa,打开隔离阀，待主真空室真空度达10～3Pa时开始离子注入。本试验选用N+注入剂量分别为1.0×1014ion/cm2、2.0×1014ion/cm2、3.0×1014ion/cm2、4.0×1014ion/cm2、5.0×1014ion/cm2、6.0×1014ion/cm2,并做真空平板对照。诱变后加入1mL无菌水洗涤菌体制成菌悬液。将菌悬液稀释104倍分别涂布于平板培养基上,28℃培养3d。将菌落存活、但菌落形态发生改变的标记为突变菌落；突变菌落中具有酵母菌典型特征的菌落标记为正突变菌落。观察平板存活菌落数、突变菌落数和正突变菌落数，计算菌落存活率、突变率和正突变率。结果如表1。表1表明，N+离子各剂量注入处理后的平板菌落，在相同条件下培养，菌落的存活率与注入离子的剂量有关，随着N+离子注入剂量的加大，菌落的存活率、突变率、正突变率显著降低。当注入剂量达到5×1014ion/cm2，正突变率为零。当注入剂量达到6×1014ion/cm2，存活率、突变率和正突变率全部为零。
表1不同N+离子注入剂量酿酒酵母的诱变效应
N<sup>+</sup>离子剂量 存活率(％) 突变率(％) 正突变率(％)
0×10<sup>14</sup>ion/cm<sup>2</sup> 100 0 0
1×10<sup>14</sup>ion/cm<sup>2</sup> 31 75 17
2×10<sup>14</sup>ion/cm<sup>2</sup> 22 61 11
3×10<sup>14</sup>ion/cm<sup>2</sup> 13 32 6
4×10<sup>14</sup>ion/cm<sup>2</sup> 7 13 2
5×10<sup>14</sup>ion/cm<sup>2</sup> 1 6 0
6×10<sup>14</sup>ion/cm<sup>2</sup> 0 0 0
5.突变菌株分离
取36株平板培养N+离子注入生长良好的正突变菌株各1环，加入10mL无菌水中制成菌悬浮液，充分振荡，静置20min后取上层悬液，依次制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5不同浓度的稀释液，取0.2mL不同浓度的稀释液涂布于平板培养基上，于28℃培养3d，观察菌落形态特征。从平板培养菌落中挑选符合酵母菌形态特征的单菌落进行划线培养3次，获得N+离子注入诱变的突变菌株。挑选特征最显著的突变菌株20个，编号为：yzk01、yzk02、yzk03、yzk04、yzk05、yzk06、yzk07、yzk08、yzk09、yzk10、yzk11、yzk12、yzk13、yzk14、yzk15、yzk16、yzk17、yzk18、yzk19、yzk20。
6.突变菌株三角瓶摇床发酵培养
将获得的20株突变菌株于斜面培养基活化后，取1环接入装有25mL液体种子培养基的125mL的三角瓶中，温度28℃、摇床转速180r/min、培养48h。将培养好的种子液按(v/v)8％的接种量接入装有100mL发酵培养基的250mL三角瓶，温度28℃、摇床转速180r/min、培养48h，离心取得发酵上清液。
7.蛋白质交联-絮凝沉淀法初筛
将离心取得的发酵上清液采用蛋白质交联－絮凝沉淀法初步判断突变菌株是否产酶。取1g酪蛋白加入少量的NaOH溶液湿润后，再加入pH 7.5的磷酸缓冲液(0.02mol/L)，使得酪蛋白浓度达到10％。将酪蛋白溶液与突变菌落发酵上清液按一定比例混合均匀，于37℃反应2h后静置，观察试验反应。根据是否有凝絮或沉淀反应判断是否产谷氨酰胺转胺酶。依据凝絮或沉淀反应程度，获得含谷氨酰胺转胺酶活性较高的菌株10株，编号分别为：yzk02、yzk03、yzk06、yzk09、yzk12、yzk15、yzk17、yzk18、yzk19、yzk20。
8.酶活测定法复筛
对产生凝胶现象的产酶活较高的10株突变菌株再于斜面培养基活化后，取1环接入装有25mL液体种子培养基的125mL的三角瓶中，温度28℃、摇床转速180r/min、培养48h，取得三角瓶摇床液体种子液。将三角瓶摇床液体种子液按(v/v)8％的接种量接入装有100mL发酵培养基的250mL三角瓶中，温度28℃、摇床转速180r/min、培养48h，离心取得发酵上清液。参照国标《谷氨酰胺转胺酶活性检测方法》(GB/T34795-2017)的测定方法测定上清液中谷氨酰胺转胺酶的酶活。结合突变菌株的产酶酶活和蛋白质交联凝絮反应的程度，获得产谷氨酰胺转胺酶酶活较高的突变菌株5株，编号为：yzk03、yzk06、yzk12、yzk19、yzk20，结果如表2。由表2可以看出，产酶活性最高的突变菌株为yz06菌株，达到5.53U/g。将5株产酶活性较高的菌株作为N+离子注入获得的突变菌株进行进一步的产耐高温谷氨酰胺转胺酶菌株的筛选和菌株的鉴定工作。
表2N+离子注入复筛菌株的产酶情况
菌株编号 yzk02 yzk03 yzk06 yzk09 yzk12 yzk15 yzk17 yzk18 yzk19 yzk20
酶活(U/g) 4.48 5.49 5.53 3.12 5.12 4.16 2.18 3.48 4.78 4.83
二、产耐高温谷氨酰胺转胺酶菌株筛选
1.菌株的选育
将酶活测定法复筛获得的产酶活性较高的5株突变株，于斜面培养基活化后，各取1环接入装有25mL液体种子培养基的125mL的三角瓶中，温度28℃、摇床转速180r/min、培养48h。将培养好的三角瓶摇床液体种子液按(v/v)8％的接种量接入装有100mL发酵培养基的250mL三角瓶中，温度28℃、摇床转速180r/min、培养48h，离心取得发酵上清液。参照国标《谷氨酰胺转胺酶活性检测方法》(GB/T34795-2017)的测定方法分别测定80℃水浴5min的前后酶活，计算80℃水浴5min的酶活残留率。酶活残留率(％)＝发酵上清液80℃保温5min后的谷氨酰胺转胺酶酶活/保温前的谷氨酰胺转胺酶酶活ⅹ100，结果如表3。表3表明，5株产酶活性较高的突变株中酶活残留率最低为18.9％，3株酶活残留率在20％～30％之间，yzk06菌株所产谷氨酰胺转胺酶对热的稳定性最好，酶活残留率达到41.3％，因此，选定yzk06菌株为产耐高温谷氨酰胺转胺酶的突变菌株，并对该菌株所产酶的热稳定性进行分析研究。
表3不同菌株80℃水浴5min酶活残留率
菌株编号 yzk03 yzk06 yzk12 yzk18 yzk19
酶活残留率(％) 26.2 41.3 23.7 28.4 18.9
2.yzk06菌株谷氨酰胺转胺酶对热稳定性分析试验
将yzk06菌株于试管斜面培养基活化后，取1环接入装有25mL液体种子培养基的125mL的三角瓶中，温度28℃、摇床转速180r/min、培养48h。将培养好的三角瓶摇床液体种子液按(v/v)8％的接种量接入装有100mL发酵培养基的250mL三角瓶中，温度28℃、摇床转速180r/min、培养48h，离心取得发酵上清液。取1mL于60℃和80℃分别水浴1min、2min、3min、4min、5min、6min，参照GB/T34795-2017的检测方法测定上清液中谷氨酰胺转胺酶酶活，比较不同时间水浴前后酶活，计算酶活残留率，结果如表4和表5。由表4、表5可以看出，60℃保持6min，谷氨酰胺转胺酶酶活残留率高达51.2％，80℃保持6min，谷氨酰胺转胺酶酶活残留率仍有33.6％，表明yzk06菌株所产的谷氨酰胺转胺酶对高温有明显的稳定性。
表4 60℃谷氨酰胺转胺酶酶活稳定性
时间(min) 1 2 3 4 5 6
酶活残留率(％) 98.6 90.2 79.8 68.4 55.8 51.2
表5 80℃谷氨酰胺转胺酶酶活稳定性
时间(min) 1 2 3 4 5 6
酶活残留率(％) 88.1 75.0 61.3 52.4 41.5 33.6
3.yzk06菌株产谷氨酰胺转胺酶的遗传稳定性试验
为了考察N+离子注入诱变菌株产谷氨酰胺转胺酶的遗传稳定性，应用yzk06菌株连续5代进行产谷氨酰胺转胺酶发酵培养，每代均按“复筛”的方法进行菌株的摇瓶发酵产酶试验，结果如表6。
表6 yzk06菌株产谷氨酰胺转胺酶的遗传稳定性
Figure GDA0004062935920000121
Figure GDA0004062935920000131
由表6可知，通过连续5代发酵产酶试验，yzk06菌株发酵液中谷氨酰胺转胺酶的酶活稳定在5.43U/g～5.56U/g之间，表明yzk06菌株产谷氨酰胺转胺酶具有良好的遗传稳定性。
三、yzk06菌株的活性分类鉴定
按照《酵母菌的特征与鉴定手册》(Barnett，J.A.等著，胡瑞卿译，青岛海洋大学出版社，1991)中的描述方法对yzk06菌株进行形态特征和培养特性、生理生化特性鉴定和分子生物学鉴定如下：
1.形态特征和培养特性
yzk06菌株细胞呈圆形或椭圆形，单个或成双，革兰氏染色阳性，无性繁殖方式为多边芽殖，每个细胞产1个或多个芽孢，芽孢也成圆形或椭圆形，菌落呈奶油状、乳白色、隆起、光滑、稍平坦、边缘整齐偶尔波纹、菌落质地软而湿润容易挑取，无真菌丝。
2.生理生化特性
溶解1g酵母膏和2g蛋白胨于100mL水中，121℃灭菌20min，分别向其中加入经煮沸的10％不同的糖液，糖液浓度达到2％，pH6.5。将配制好的培养基装入杜氏发酵管中，用接种环将yzk06菌株接入发酵管中，每种糖三个重复，以不加糖、不接菌的试管为空白对照，28℃培养，观察发酵管中气泡量。利用无碳源基础培养基和无氮源基础培养基，倒入yzk06菌株菌悬液，混匀后倒入培养皿中，待凝固后将测试碳源放其表面，28℃培养观察碳源周围是否形成生长圈。结果表明，选育的yzk06菌株可发酵葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、D-半乳糖、海藻糖、棉子糖，不发酵乳糖、密二糖、纤维二糖、菊糖、可溶性淀粉。能同化葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、D-半乳糖、海藻糖、棉子糖。不分解蛋白质和脂肪。兼性厌氧，有氧条件下，进行有氧呼吸。无氧条件下，进行酒精发酵。最适温度28℃，最适pH为6.5。
3.分子生物学
筛选的yzk06菌株送至华大基因有限公司进行基因测序，结果表明，yzk06菌株扩增产物的碱基长度约为750bp。测序序列与NCBI数据库同源性比对结果显示，yzk06菌株与酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae MT322849.1)和酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae KY273294.1)的序列相似性达到100％，因此，所筛选的yzk06菌株为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。
表7yzk06菌株与酵母菌相关菌株的相似性
Figure GDA0004062935920000132
Figure GDA0004062935920000141
基于以上综合特征比较，yzk06菌株鉴定为酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)，分类命名为分类命名为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，于2021年9月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No：23344，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
四、应用酿酒酵母yzk06菌株进行发酵产耐高温谷氨酰胺转胺酶的应用试验
在三角瓶摇床发酵产酶过程中研究发酵培养基组成、接种量、温度、初始pH和发酵培养时间等对产酶的影响。确定优化的培养基组成和培养条件后，逐步扩大发酵规模，在5L、50L和500L发酵罐中进行发酵产耐高温谷氨酰胺转胺酶应用。
上述所述的发酵培养基包括：
斜面及平板培养基:麦芽汁150mL，琼脂3g，pH自然，121℃灭菌20min，高温灭菌后制成平板或试管斜面培养基。
液体种子培养基(YPD培养基)：将10g酵母膏和20g蛋白胨用水溶解，121℃灭菌20min，加入100ml含20g葡萄糖灭菌溶液，再用灭菌蒸馏水定容至1000mL，pH6.5。
发酵培养基：葡萄糖20g，蔗糖20g，蛋白胨15g，酵母浸出物15g，磷酸二氢钾1g，磷酸氢二钾1g，7水硫酸镁0.5g，蒸馏水定容至1000mL，121℃灭菌20min，pH6.5。
上述所述的优化后的发酵培养条件为：接种量(v/v)8％、温度28℃、初始pH6.5。
本发明采用的发酵系统由镇江东方生物工程设备技术有限责任公司生产的5L、50L与500L的发酵罐组成。本套发酵设备由蒸汽发生器、蒸汽过滤系统、空气压缩机、空气过滤系统、冷却水循环设备、酸-碱-消泡剂及补料添加器、种子罐、发酵罐和发酵控制系统组成。发酵控制系统可以对发酵培养温度、pH值、搅拌速度以及酸、碱、消泡剂等在线自动监测和控制。
对所产的耐高温谷氨酰胺转胺酶，参照国标《谷氨酰胺转胺酶活性检测方法》(GB/T34795-2017)的测定方法，耐高温谷氨酰胺转胺酶后处理过程酶活回收率≥75％，产品酶活≥120U/g(国标只有检测方法，没有具体的理化指标和卫生指标，故删除)。
本发明在上述对实施例1试验的同时，还对其他实施例进行了相同的试验，均取得了相同和相近似的结果，这里不一一列举。
综上所述，本发明利用N+离子注入诱变技术，筛选出产谷氨酰胺转胺酶能力比较强的酿酒酵母突变株,再从产酶能力比较强的突变株中选育耐高温谷氨酰胺转胺酶菌株。本发明酿酒酵母yzk06菌株发酵生产工艺简单，菌株产酶活性高，酶活≥120U/g，酶活回收率≥75％。所产的耐高温谷氨酰胺转胺酶可以完全不依赖钙离子的存在而起作用。对热稳定性强，pH值稳定范围广，高温条件下具有更加显著的稳定性。同时该酶还属于胞外酶，在发酵过程中酶的活性成分可直接分泌到发酵培养基中，酶液分离纯化较简单。发酵原料来源广泛，每吨生产成本仅1.8～2.0万元，生产周期只有3～5天，且容易进行商品化生产。谷氨酰胺转胺酶作为一种新型食品添加剂，由于具有独特的功能特性，受到了国内外学者的广泛关注。相信随着研究的深入、技术的成熟以及工业化高产菌株不断的挖掘和应用，谷氨酰胺转胺酶的制备成本必将不断下降，市场的应用前景也将更加广阔。

Claims (7)

1.一种产耐高温谷氨酰胺转胺酶yzk06菌株，分类命名为酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），于2021年9月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No：23344，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
2.权利要求1所述的产耐高温谷氨酰胺转胺酶yzk06菌株在制备耐高温谷氨酰胺转胺酶中的应用。
3.权利要求2所述的产耐高温谷氨酰胺转胺酶yzk06菌株在制备耐高温谷氨酰胺转胺酶中的应用方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）对yzk06菌株活化：
无菌条件下，将yzk06菌株接种至培养基上，28℃培养24～36h，得活化的酿酒酵母yzk06菌株；
所述的培养基为麦芽汁150mL、琼脂3g，121℃灭菌20min；
（2）制备发酵种子液：
将活化的酿酒酵母yzk06菌株转接移至种子培养基中，在温度28℃、转速150～180r/min，培养24～36h，得发酵种子液；
所述的种子培养基，将10g酵母膏和20g蛋白胨用水溶解，121℃灭菌20min，加入100ml含20g葡萄糖灭菌溶液，再用灭菌蒸馏水定容至1000mL，pH6.5；
（3）发酵生产谷氨酰胺转胺酶粗酶混合液：
将发酵种子液按发酵培养基体积8%接种于发酵培养基中，pH6.5，发酵温度28℃，培养24～72h，得酿酒酵母yzk06菌株发酵产含培养基的耐高温谷氨酰胺转胺酶粗酶混合液；
所述的发酵培养基为葡萄糖20g，蔗糖20g，蛋白胨15g，酵母浸出物15g，磷酸二氢钾1g，磷酸氢二钾1g，7水硫酸镁0.5g，蒸馏水定容至1000mL，121℃灭菌20min，pH6.5；
（4）粗酶混合液固液分离：
粗酶混合液采用板框压滤机过滤实现固液分离，收集分离后的粗酶混合液；
（5）盐析纯化：
发酵粗酶液用硫酸氨盐析纯化，首先向发酵粗酶液中加入等体积的饱和度为30％的硫酸铵，搅拌均匀，静置，去除沉淀，得第一上清液；再向第一上清液中加入等体积的饱和度为60％的硫酸铵，搅拌均匀，静置，去除沉淀，得第二上清液；向第二上清液中加入等体积的饱和硫酸铵，搅拌均匀，静置，去除沉淀，得纯化的耐高温谷氨酰胺转胺酶酶液；
（6）葡聚糖凝胶浓缩：
向纯化的耐高温谷氨酰胺转胺酶酶液中加入质量浓度20%的G50干葡聚糖凝胶，搅拌均匀，使凝胶充分吸水膨胀，再过滤去除凝胶，重复多次，得耐高温谷氨酰胺转胺酶酶浓缩液；
（7）喷雾干燥：
将耐高温谷氨酰胺转胺酶酶浓缩液用干燥机进行低温干燥，整体干燥过程酶液和物料表面温度不高于60℃，得干燥的耐高温谷氨酰胺转胺酶，回收率≥75%，产品酶活≥120U/g。
4.根据权利要求3所述的产耐高温谷氨酰胺转胺酶yzk06菌株在制备耐高温谷氨酰胺转胺酶中的应用方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）对yzk06菌株活化：
无菌条件下取1环yzk06菌株接种至试管斜面培养基，28℃培养24h，得活化的yzk06菌株；
（2）制备发酵种子液：
取1环活化后的yzk06菌株转接至装液量为50mL/125mL的三角瓶种子培养基中，摇床温度28℃、转速180r/min，培养24h，得发酵种子液；
（3）发酵生产谷氨酰胺转胺酶粗酶混合液：
将发酵种子液按发酵培养基体积8%发酵种子液接入到装液量为400mL/1000mL的三角瓶发酵培养基中，pH6.5，发酵温度28℃、转速180r/min，培养72h，得酿酒酵母yzk06菌株发酵产含培养基的耐高温谷氨酰胺转胺酶粗酶混合液；
（4）粗酶混合液固液分离：
粗酶混合液采用板框压滤机过滤实现固液分离，板框压滤机设计为方形，板与框的两边侧上下各有四只开空角耳，构成液体和气体的通路，发酵粗酶混合液从板框上部的两条通道流入滤框，滤液沿滤板表面流出机外，收集起来即为发酵粗酶液，固体物形成的滤饼则留在板框内；
（5）盐析纯化：
发酵粗酶液用硫酸氨盐析纯化，首先向发酵粗酶液中加入等体积的饱和度为30％的硫酸铵，搅拌30min，静置6～8h，去除沉淀，得第一上清液；再向第一上清液中加入等体积的饱和度为60％的硫酸铵，搅拌30min，静置6～8h，去除沉淀，得第二上清液；向第二上清液中加入等体积的饱和硫酸铵，搅拌30min，静置6～8h，去除沉淀，得纯化的耐高温谷氨酰胺转胺酶酶液；
（6）葡聚糖凝胶浓缩：
向纯化的耐高温谷氨酰胺转胺酶酶液中加入质量浓度20%的G50干葡聚糖凝胶，搅拌30min，使凝胶充分吸水膨胀，再过滤去除凝胶，重复3～5次，得耐高温谷氨酰胺转胺酶酶浓缩液；
（7）喷雾干燥
采用离心喷雾间歇卸料的干燥机对耐高温谷氨酰胺转胺酶酶浓缩液低温干燥，耐高温谷氨酰胺转胺酶酶浓缩液在进入干燥塔前先注入塔顶的小罐，加温至60℃，保持小罐内浓缩液恒定，确保浓缩液进入干燥塔内均匀；浓度液由小罐底部的管路进入干燥塔内高速旋转的离心喷雾盘，喷雾盘转速3000～5000r/min，浓度液通过离心喷雾盘形成雾状，与从塔顶部进入的热空气进行充分接触，造成强烈的传热和水分蒸发，空气温度随之降低，雾化颗粒在气流和自身重力作用下旋转而下，当达到出口时已完成干燥，通过双闸门的卸料阀卸料取得耐高温谷氨酰胺转胺酶；整个干燥过程酶液和物料表面温度不高于60℃。
5.根据权利要求3所述的产耐高温谷氨酰胺转胺酶yzk06菌株在制备耐高温谷氨酰胺转胺酶中的应用方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）对yzk06菌株活化：
无菌条件下取1环yzk06菌株接种至试管斜面培养基，28℃培养24h，得活化的yzk06菌株；
（2）制备发酵种子液：
取5环活化后的yzk06菌株转接至装液量为50mL/125mL的三角瓶种子培养基中，摇床温度28℃、转速180r/min，培养24h，得发酵种子液；
（3）发酵生产谷氨酰胺转胺酶粗酶混合液：
将发酵种子液按发酵培养基体积8%发酵种子液加入到装有2L发酵培养基的5L发酵罐中，pH6.5，发酵温度28℃、转速150～180r/min，0～48h通气量为1.0～1.5L/min，49～72h通气量为0.5～1.0L/min，期间pH值降低用氢氧化钠调节pH6.5，得酿酒酵母yzk06菌株发酵产含培养基的耐高温谷氨酰胺转胺酶粗酶混合液；
（4）粗酶混合液固液分离：
粗酶混合液采用板框压滤机过滤实现固液分离，板框压滤机设计为方形，板与框的两边侧上下各有四只开空角耳，构成液体和气体的通路，发酵粗酶混合液从板框上部的两条通道流入滤框，滤液沿滤板表面流出机外，收集起来即为发酵粗酶液，固体物形成的滤饼则留在板框内；
（5）盐析纯化：
发酵粗酶液用硫酸氨盐析纯化，首先向发酵粗酶液中加入等体积的饱和度为30％的硫酸铵，搅拌30min，静置6～8h，去除沉淀，得第一上清液；再向第一上清液中加入等体积的饱和度为60％的硫酸铵，搅拌30min，静置6～8h，去除沉淀，得第二上清液；向第二上清液中加入等体积的饱和硫酸铵，搅拌30min，静置6～8h，去除沉淀，得纯化的耐高温谷氨酰胺转胺酶酶液；
（6）葡聚糖凝胶浓缩：
向纯化的耐高温谷氨酰胺转胺酶酶液中加入质量浓度20%的G50干葡聚糖凝胶，搅拌30min，使凝胶充分吸水膨胀，再过滤去除凝胶，重复3～5次，得耐高温谷氨酰胺转胺酶酶浓缩液；
（7）喷雾干燥
采用离心喷雾间歇卸料的干燥机对耐高温谷氨酰胺转胺酶酶浓缩液低温干燥，耐高温谷氨酰胺转胺酶酶浓缩液在进入干燥塔前先注入塔顶的小罐，加温至60℃，保持小罐内浓缩液恒定，确保浓缩液进入干燥塔内均匀；浓度液由小罐底部的管路进入干燥塔内高速旋转的离心喷雾盘，喷雾盘转速3000～5000r/min，浓度液通过离心喷雾盘形成雾状，与从塔顶部进入的热空气进行充分接触，造成强烈的传热和水分蒸发，空气温度随之降低，雾化颗粒在气流和自身重力作用下旋转而下，当达到出口时已完成干燥，通过双闸门的卸料阀卸料取得耐高温谷氨酰胺转胺酶；整个干燥过程酶液和物料表面温度不高于60℃。
6.一种产耐高温谷氨酰胺转胺酶yzk06菌株在制备耐高温谷氨酰胺转胺酶中的应用方法，所述yzk06保藏编号CGMCC No：23344，其特征在于，包括以下步骤：
（1）制备一级种子液：
无菌条件下取5环yzk06菌株接种至装液量为500mL的三角瓶种子培养基200mL中，摇床温度28℃、转速180r/min，培养36h，得三角瓶摇床发酵一级种子液；
所述的种子培养基，将10g酵母膏和20g蛋白胨用水溶解，121℃灭菌20min，加入100ml含20g葡萄糖灭菌溶液，再用灭菌蒸馏水定容至1000mL，pH6.5；
（2）、制备发酵种子液：
将发酵一级种子液按发酵种子培养基体积8%接入装有3L发酵种子培养基的5L发酵罐中，pH6.5，发酵罐温度28℃、转速150～180r/min、通气量1.0～1.5L/min、罐压0.04～0.05Mpa，培养36h，得二级种子液；
所述的发酵种子培养基为葡萄糖20g，蔗糖20g，蛋白胨15g，酵母浸出物15g，磷酸二氢钾1g，磷酸氢二钾1g，7水硫酸镁0.5g，蒸馏水定容至1000mL，121℃灭菌20min，pH6.5；
（3）发酵生产谷氨酰胺转胺酶粗酶混合液：
将二级种子液按发酵培养基体积8%接入装有30L发酵培养基的50L发酵罐中，pH6.5，温度28℃、转速180～200r/min，0～48h通气量1.5～2.0L/min、49～72h通气量1.0～1.5L/min、罐压0.04～0.05Mpa，期间pH降低用氢氧化钠调节pH6.5，连续培养72h，得酿酒酵母yzk06菌株发酵产含培养基的耐高温谷氨酰胺转胺酶粗酶混合液；
所述的发酵培养基为葡萄糖20g，蔗糖20g，蛋白胨15g，酵母浸出物15g，磷酸二氢钾1g，磷酸氢二钾1g，7水硫酸镁0.5g，蒸馏水定容至1000mL，121℃灭菌20min，pH6.5；
（4）粗酶混合液固液分离：
粗酶混合液采用板框压滤机过滤实现固液分离，板框压滤机设计为方形，板与框的两边侧上下各有四只开空角耳，构成液体和气体的通路，发酵粗酶混合液从板框上部的两条通道流入滤框，滤液沿滤板表面流出机外，收集起来即为发酵粗酶液，固体物形成的滤饼则留在板框内；
（5）盐析纯化：
发酵粗酶液用硫酸氨盐析纯化，首先向发酵粗酶液中加入等体积的饱和度为30％的硫酸铵，搅拌30min，静置6～8h，去除沉淀，得第一上清液；再向第一上清液中加入等体积的饱和度为60％的硫酸铵，搅拌30min，静置6～8h，去除沉淀，得第二上清液；向第二上清液中加入等体积的饱和硫酸铵，搅拌30min，静置6～8h，去除沉淀，得纯化的耐高温谷氨酰胺转胺酶酶液；
（6）葡聚糖凝胶浓缩：
向纯化的耐高温谷氨酰胺转胺酶酶液中加入质量浓度20%的G50干葡聚糖凝胶，搅拌30min，使凝胶充分吸水膨胀，再过滤去除凝胶，重复3～5次，得耐高温谷氨酰胺转胺酶酶浓缩液；
（7）喷雾干燥
采用离心喷雾间歇卸料的干燥机对耐高温谷氨酰胺转胺酶酶浓缩液低温干燥，耐高温谷氨酰胺转胺酶酶浓缩液在进入干燥塔前先注入塔顶的小罐，加温至60℃，保持小罐内浓缩液恒定，确保浓缩液进入干燥塔内均匀；浓度液由小罐底部的管路进入干燥塔内高速旋转的离心喷雾盘，喷雾盘转速3000～5000r/min，浓度液通过离心喷雾盘形成雾状，与从塔顶部进入的热空气进行充分接触，造成强烈的传热和水分蒸发，空气温度随之降低，雾化颗粒在气流和自身重力作用下旋转而下，当达到出口时已完成干燥，通过双闸门的卸料阀卸料取得耐高温谷氨酰胺转胺酶；整个干燥过程酶液和物料表面温度不高于60℃。
7.一种产耐高温谷氨酰胺转胺酶yzk06菌株在制备耐高温谷氨酰胺转胺酶中的应用方法，所述yzk06保藏编号CGMCC No：23344，其特征在于，包括以下步骤：
（1）制备一级种子液：
无菌条件下取5环yzk06菌株接种至400mL/1000mL的三角瓶培养基中，摇床温度28℃，180r/min发酵培养36h，得一级种子液；
所述的培养基，将10g酵母膏和20g蛋白胨用水溶解，121℃灭菌20min，加入100ml含20g葡萄糖灭菌溶液，再用灭菌蒸馏水定容至1000mL，pH6.5；
（2）制备发酵种子液：
将一级种子液按发酵种子培养基体积8%接入装有30L发酵种子培养基的50L发酵罐中，pH6.5、发酵罐温度28℃、转速180～200r/min、通气量1.5～2.0L/min、罐压0.04～0.05Mpa，培养36h，得二级种子液；
所述的发酵种子培养基为葡萄糖20g，蔗糖20g，蛋白胨15g，酵母浸出物15g，磷酸二氢钾1g，磷酸氢二钾1g，7水硫酸镁0.5g，蒸馏水定容至1000mL，121℃灭菌20min，pH6.5；
（3）发酵生产谷氨酰胺转胺酶粗酶混合液：
将二级种子液按发酵培养基体积8%接入装有300L发酵培养基的500L发酵罐中，pH6.5，发酵罐温度28℃、转速210～250r/min，0～48h通气量2.0～2.5L/min、49～72h通气量1.5～2.0L/min、罐压0.04～0.05Mpa，期间pH降低加氢氧化钠调节pH6.5，连续培养72h，得酿酒酵母yzk06菌株发酵产含培养基的耐高温谷氨酰胺转胺酶粗酶混合液；
所述的发酵培养基为葡萄糖20g，蔗糖20g，蛋白胨15g，酵母浸出物15g，磷酸二氢钾1g，磷酸氢二钾1g，7水硫酸镁0.5g，蒸馏水定容至1000mL，121℃灭菌20min，pH6.5；
（4）粗酶混合液固液分离：
粗酶混合液采用板框压滤机过滤实现固液分离，板框压滤机设计为方形，板与框的两边侧上下各有四只开空角耳，构成液体和气体的通路，发酵粗酶混合液从板框上部的两条通道流入滤框，滤液沿滤板表面流出机外，收集起来即为发酵粗酶液，固体物形成的滤饼则留在板框内；
（5）盐析纯化：
发酵粗酶液用硫酸氨盐析纯化，首先向发酵粗酶液中加入等体积的饱和度为30％的硫酸铵，搅拌30min，静置6～8h，去除沉淀，得第一上清液；再向第一上清液中加入等体积的饱和度为60％的硫酸铵，搅拌30min，静置6～8h，去除沉淀，得第二上清液；向第二上清液中加入等体积的饱和硫酸铵，搅拌30min，静置6～8h，去除沉淀，得纯化的耐高温谷氨酰胺转胺酶酶液；
（6）葡聚糖凝胶浓缩：
向纯化的耐高温谷氨酰胺转胺酶酶液中加入质量浓度20%的G50干葡聚糖凝胶，搅拌30min，使凝胶充分吸水膨胀，再过滤去除凝胶，重复3～5次，得耐高温谷氨酰胺转胺酶酶浓缩液；
（7）喷雾干燥
采用离心喷雾间歇卸料的干燥机对耐高温谷氨酰胺转胺酶酶浓缩液低温干燥，耐高温谷氨酰胺转胺酶酶浓缩液在进入干燥塔前先注入塔顶的小罐，加温至60℃，保持小罐内浓缩液恒定，确保浓缩液进入干燥塔内均匀；浓度液由小罐底部的管路进入干燥塔内高速旋转的离心喷雾盘，喷雾盘转速3000～5000r/min，浓度液通过离心喷雾盘形成雾状，与从塔顶部进入的热空气进行充分接触，造成强烈的传热和水分蒸发，空气温度随之降低，雾化颗粒在气流和自身重力作用下旋转而下，当达到出口时已完成干燥，通过双闸门的卸料阀卸料取得耐高温谷氨酰胺转胺酶；整个干燥过程酶液和物料表面温度不高于60℃。
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