JP3608620B2 - ヘミセルロース含有食品及び動物用飼料のエネルギー効率を改善するためのヘミセルラーゼ補充物 - Google Patents
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Description
発明の背景
例えば、グルカナーゼ、キシラナーゼ、もしくはマンナナーゼ（mannanase）のような様々な酵素は、特定タイプのヘミセルラーゼとして、それぞれ、グルカン、キシラン、もしくはマンナンからなる異種多糖類の加水分解を触媒する能力に基づいて分類される。ガラクタンもしくはグルコマンナンのようなマンナン類の加水分解を行う酵素は細菌及び真菌類を含む多様な微生物類により産生され、かつ、それらはある種の動物及び多数の植物内にも存在することが知られている。そのようなマンナナーゼ類を産生する微生物類には、アエロモナス（Aero monas）、アスペルギルス（Aspergillus）、ストレプトマイセス（Streptomyces）、ロドコッカス（Rhodococcu s）、及び、バチルス（Bacillus）がある。METHODS IN ENZYMOLOGY、Vol.160、Part Ａ、Sect.II（1988）を参照のこと。
ヘミセルラーゼ類は、コーヒー、チョコレート、ココア、紅茶、及び、セリアル食品類の加工において商業的に利用されている。これに関するヘミセルラーゼを利用することにより得られる主たる利点は、溶液粘性の低下であり、それにより食品類のより安価な加工が可能になる。従って、ヘミセルラーゼ類は、果汁を清澄化するため、スラリーもしくはピューレの粘性を低下させるため、ある種の細胞壁固体物を液化させるため、及び、味を改良するために用いられる。しかし、ヒト用食品及び動物用飼料製品の利用可能なエネルギー含量を、特に動物飼料において増加させることができるならば、コスト節減の機会となる。家禽類用食餌中のトウモロコシ補足物としての、グルカナーゼ処理した大麦の成功裏の使用は、このような例の一つである。Feedstuffs 62（４）:10（1990）を参照のこと。
アルファルファ、ココナッツ残留物（coconut residue）、グアー、ローカストビーンガム、カロブビーンガム（carob bean gum）、カッサバ、コプラ、ダイズ類のようなヘミセルロース系物質は、食品及び飼料製品の共通の構成成分である。ダイズの誘導物は、実質的な比率のヒト消費用の豆腐の成分を含み、更に、例えば、ダイズ蛋白質の濃縮物は、イヌ及びネコ、スワン、魚、及び、ニワトリ用の多くの飼料に使用されている。ダイズのあら粉（meal）は、ニワトリの雛用の飼料の25％ほどを含む。ブロイラーのようなニワトリ用の飼料は、最も安い費用を基本として、多数の成分から処方される複雑な混合物である。この飼料は、非常に大量に必要である。その結果、その飼料成分のための高価な貯蔵施設が混合作業に必要である。この飼料成分を混合して、蛋白質、必須アミノ酸類、無機質（またはミネラル）類、ビタミン類、及び、カロリー（つまり、エネルギー源）の至適栄養混合物を提供する。主エネルギー源とは考えられてはいないものの、ダイズあら粉は、必須アミノ酸を有する好ましい濃縮された蛋白質源であることが見出されている。ダイズあら粉は、ブロイラーニワトリの必要エネルギーの約20％を供給する。
ダイズあら粉はエネルギーを産生する幾つかの炭水化物類及び油類を提供するものの、その総炭水化物含有量の約10％はガラクタン類及びペントサン類からなる。これらの炭水化物類は、単胃動物によってはさほど吸収されないため、この動物は更なる生化学的な酸化のための単糖類を得るほど迅速に炭水化物類を消化することができない。ダイズあら粉のエネルギー含量を増加させるための一つの方法は、ガラクタン類及びペントサン類を、単胃動物によりより簡単に代謝され得る低分子量のオリゴ糖類もしくは単糖類に低分子化することである。
直接給餌用微生物培養物が、今世紀初頭以来利用されている。消化妨害物質を調節するための栄養付加物としてのラクトバチリ（Lactobacilli）の利用は、最初に、E.Metchnikoff、PROLONGATION OF LIFE（G.P.Putnam′s Sons,1908年）により示唆された。それ以来、微生物は、食品類の栄養価を増加させるための試みにおいて多様な方法で利用されてきている。例えば、ラクトバチルス培養物の直接給餌法は、腸管内での乳酸の産生のために、体重及び飼料効率を増加させることが報告されている。D.P.Hutcheson、“Historical Aspects、"in DIRECT−FED MICROBIALS IN ANIMAL PRODUCTION（Nat′l Feed Ingredients Assoc.,1991年）。一般的には、栄養付加物としてのラクトバチルスの有益な効果は、動物により摂取された食料に直接作用するというその微生物の能力よりはむしろ、腸管を活性化させ、有害な微生物と効果的に拮抗し、かつ、乳酸を産生するというその微生物の能力による。
酵母及び真菌類は、1960年代初期以降、栄養付加物として同様に利用されている。酵母と真菌類は、食品の利用可能なエネルギー含量を増大させることができるある種の消化酵素類、未同定の成長因子類、及び、ビタミンＢ類を産生すると考えられている。これに関して、ある種のこぶ胃に存在する真菌類は、動物におけるセルロースの利用を高めることが示されている。Hutcheson（上掲）参照のこと。この結果は、反芻動物は典型的には、その腸における微生物作用によってその栄養物の主に全てを取得しているという事実により説明することができる。
それとは対照的に、ヒト及び単胃動物類は、腸の微生物プロセスを通してはかなりの量の栄養物を取得することがない。従って、それらは、食品及び飼料品類のマンナン含有性ヘミセルロース成分のようなある種の炭水化物を消化することができない。そのため、マンナン含有性ヘミセルロース成分を、単胃動物類により代謝されることができる低分子量の炭水化物類に変換させることにより、食品及び飼料品類のヘミセルロース成分の利用できるエネルギー含量を増大させる方法についての必要性が存在する。
発明の概要
従って、本発明の目的は、組成物が新規のヘミセルラーゼを含有するための消費されるときにエネルギー含量が増大するヘミセルラーゼ含有組成物を提供することである。
本発明の別の目的は、ヘミセルロース系炭水化物を含む食品もしくは飼料、及び、そのようなヘミセルラーゼを産生し、それによって、消費されるときにエネルギー含量の増大をもたらす微生物から本質的になる培養物を提供することである。
本発明の別の目的は、複雑な炭水化物類を含むが、それにもかかわらず、ヒトもしくは単胃動物により利用されることができる栄養物質を産生する方法を提供することである。
これら及び他の目的を達成するために、本発明の一態様に従って、（Ａ）栄養学的に単胃動物もしくはヒトに適する蛋白質、ビタミン、及びミネラル；（Ｂ）マンナン含有ヘミセルロースを含む炭水化物源；及び、（Ｃ）該マンナン含有ヘミセルロースの分解を触媒し、該分解を触媒する活性に関して約pH4.5から約pH11までの範囲のpHプロフィルを有する酵素、を含む消費可能組成物（consumable composition）を提供する。好ましい実施態様においては、この消費可能組成物はヒトの消費のためのものであり、つまり、その成分は、動物用飼料に対立するものとして、ヒトの食品のための適切な規制要件にかなうものである。それとは対照的に、他の好ましい実施態様においては、本組成物は単胃動物用のものであり、従って、動物用飼料に適用される規制要件にのみかなう必要がある。
本発明の他の態様に従い、成分（Ｃ）として、（１）pHが８−11の範囲であり、かつ（２）温度が少なくとも60℃であるという両方の条件下において、マンナン含有ヘミセルロースの分解を触媒する活性を示す酵素を含む、上述の成分を含む組成物が提供される。
本発明の更に別の態様に従い、ダイズあら粉と、ヘミセルロースの分解を触媒する活性に関して約pH4.5から約pH11までの範囲のpHプロフィルを有するバチルス（Bacillus）から本質的に構成される酵素成分とを含む、消費可能組成物を提供する。１つの好ましい実施態様においては、上述のpHプロフィルは、約pH7と約pH9の間にピークを有する。
本発明の更に別の態様に従い、（Ａ）栄養学に的単胃動物もしくはヒトに適する、蛋白質、ビタミン及びミネラル；（Ｂ）マンナン含有ヘミセルロースを含む炭水化物源；及び、（Ｃ）該マンナン含有ヘミセルロースの分解を触媒し、該分解を触媒する活性に関し、約pH4.5から約pH11までの範囲のpHプロフィルを有する酵素を産生する微生物から本質的に構成される培養物、を含む消費可能組成物を提供する。好ましい実施態様においては、成分（Ｃ）は、pHが８〜11の範囲であり、かつ、温度が少なくとも60℃であるという両条件下で、マンナン含有ヘミセルロースの分解を触媒する活性を有する酵素を産生する微生物から本質的になる培養物である。
本発明の更に他の態様に従い、ダイズあら粉と、ヘミセルロースの分解を触媒する活性に対して約pH4.5から約pH11の範囲のpHプロフィルを有する酵素を産生する微生物から本質的に構成される培養物とを含む、消費可能組成物を提供する。１つの好ましい実施態様においては、上述のpHプロフィルは、約pH7と約pH9との間にピークを有する。
本発明の更に別の態様に従い、（Ａ）栄養学的に単胃動物もしくはヒトに適する蛋白質、ビタミン及びミネラル；（Ｂ）マンナン含有ヘミセルロースを含む炭水化物源；並びに、（Ｃ）（ｉ）該マンナン含有ヘミセルロースの分解を触媒し、該分解を触媒する活性に関し約pH4.5から約pH11までの範囲のpHプロフィルを有する酵素を産生する微生物から本質的に構成される培養物、及び、（ii）該酵素を含む発酵ブロス、を含む消費可能組成物を提供する。好ましい実施態様においては、成分（Ｃ）は、（ｉ）pHが８〜11の範囲であり、かつ、温度が少なくとも60℃であるという両方の条件下で、マンナン含有ヘミセルロースの分解を触媒する活性を有する酵素を産生する微生物から本質的になる培養物、および、（ii）該酵素を含む発酵ブロスである。
本発明の更に別の態様に従い、ダイズあら粉と、（ｉ）ヘミセルロースの分解を触媒する活性に対して約pH4.5から約pH11の範囲のpHプロフィルを有する酵素を産生する微生物から本質的に構成される培養物、及び、（ii）該酵素、を含む発酵ブロスとを含む消費可能組成物を提供する。１つの好ましい実施態様においては、上述のpHプロフィルは、約pH7と約pH9との間にピークを有する。
本発明の更に他の態様に従い、（Ａ）栄養学的に単胃動物もしくはヒトに適する蛋白質、ビタミン、及びミネラルを含むと共に、更に、マンナン含有ヘミセルロースからなる炭水化物源を含む消費可能組成物を製造するステップ、及び、（Ｂ）単胃動物もしくはヒトによる該ヘミセルロースのマンナン含有部分の使用を可能にするために、マンナン含有ヘミセルロースの分解を触媒し、該分解を触媒する活性に関し約pH4.5から約pH11までの範囲のpHプロフィルを有する酵素を該組成物中に配合するステップ、を含む栄養増強法（nutritive method）を提供する。あるいは、ステップ（Ｂ）は、マンナン含有ヘミセルロースの分解を触媒し、その活性について上述のpHプロフィルを有し、かつ、先に記載したように、単胃動物もしくはヒトによるヘミセルロースのマンナン含有部分の使用を可能にする酵素を産生する微生物から本質的に構成される培養物を該組成物中に配合することを包含する。これに代わる更に別の方法においては、ステップ（Ｂ）は、先に記載したように、（ｉ）培養物及び（ii）酵素を含む発酵ブロスを、組成物中に配合することを含む。好ましい実施態様においては、上記の炭水化物源は、ダイズ、アルファルファ、グアー、ローカストビーンガム、カロブビーンガム、カッサバ、コプラ、及びココナッツ残留物からなる群より選択される植物性物質であり、より好ましくは、ダイズ及びアルファルファである。他の好ましい実施態様においては、ステップ（Ｂ）は、該酵素及び該組成物を含む混合物を製造し、その後、その混合物をペレット化することを含む。更に他の好ましい実施態様においては、ステップ（Ｂ）は、該組成物、及び、先に記載したような酵素を産生する微生物から本質的になる培養物、を含む混合物を製造することを含む。更に他の好ましい実施態様においては、ステツプ（Ｂ）は、該組成物、及び、先に記載したような（ｉ）培養物および（ii）酵素を含む発酵ブロス、を含む混合物を製造することを含む。
本発明の他の目的、特徴、及び利点は、以下に示す詳細な説明から明らかになろう。しかしながら、詳細な説明及び具体的な実施例は、本発明の思想及び範囲内での多様な変更及び変形が、この詳細な説明から、当業者には明らかであろうという単なる理由から、本発明の好ましい実施態様を示しながら説明されている。
【図面の簡単な説明】
本発明の実施態様を説明する図面においては、
図１は、本発明の範囲内のヘミセルラーゼの活性を、それぞれ、60℃、75℃、及び90℃で（pH9.0）、時間に対してプロットしたグラフである。
図２は、本発明のヘミセルラーゼの酵素活性のpHプロフィルを、公知の市販酵素のものと比較したグラフである。
図３は、時間量に対する粘度の減少を示す代表的データであり、希釈した酵素をグアー溶液と共にインキュベートした。
図４は、対照食餌で生後21日間養育したニワトリの平均体重を、ヘミセルロース含有動物飼料の食餌で養育したニワトリの平均体重に対して示したデータである。両方の集団について、増加した体重の量に対する飼料消費の量の比率（飼料／体重増加（feed/gain））も示している。
図５は、対照食餌で生後46日間養育したニワトリの平均体重を、ヘミセルロース含有動物飼料の食餌で養育したニワトリの平均体重に対して示したデータである。両方の集団について、増加した体重の量に対する飼料消費の量の比率（飼料／体重増加）も示している。
好ましい実施態様の詳細な説明
食品物質中のヘミセルロースの分解を触媒し、その結果、その物質の有効エネルギー含量（available energy content）を増加させることが可能なヘミセルラーゼが、該酵素を産生する微生物から得ることができることを発見した。本発明の範囲内のヘミセルラーゼを産生する能力を有する微生物は、土地に固有の微小植物群（microflora）が繁殖することができる限定されたサブセクションを含む土壌から、従来の方法により単離することができる。ヘミセルラーゼ産生微生物は、バチルス・スブチリス（B.subtilis）もしくはバチルス・ブレビス（B.brevis）のような他の微生物を、このような土地固有の土壌微小植物群から標準的な組換えDNA技術によって得られるヘミセルラーゼコーディングDNAで形質転換することにより製造することもできる。
本発明のヘミセルラーゼを産生する微生物から本質的に構成される培養物において、当業界で周知の単離技術により、商業的に意味をなす量の該酵素を得ることができる。この説明において、ヘミセルラーゼ産生微生物のような「特定の種類の微生物から本質的に構成される培養物」とは、その培養物の顕著な機能特性がそれらの微生物により決定される程度に、その種類の微生物から主に構成される培養物である。しかしながら、他の種類の微生物は、例えば、ヘミセルラーゼ産生微生物から本質的に構成される培養物中に、その培養物によるヘミセルラーゼ産生を明らかに妨害しない限り、存在することができる。
本発明の範囲に含まれるヘミセルラーゼを産生する微生物を、広範な地理的区域から採取した土壌試料から単離することができる。この土壌試料は主に、上部２インチの土壌から採取され、更に、選択的な集積培地中で培養される。
特定の希望する特性を有する微生物を選択的に単離するための技術は当業界で良く知られている。複製及び増殖が希望する酵素を産生する能力に依存する条件に、このような微生物を潜在的に含む試料を暴露させることにより、特定の酵素を産生する能力について微生物を選択することができる。広く用いられている１つの選択法は、多大で多様な微生物集団を含む試料を、単一の炭素源からなる培地に暴露させることである。METODS IN ENZYMOLOGY、Vol.160:180−86（1988）を参照のこと。その炭素源を分解することができる酵素を産生することができるそれらの微生物のみがこの方法により回収されるだろう。この種の選択的培養技術により、試料採取した生息地の通常の植物群を含む無数の他の微生物から、希望する酵素を産生する微生物が効果的に選択される。
本発明の好ましい実施態様においては、土壌試料のアリコートを、ヘミセルロースが単一の炭素源として働くアルカリ性培養培地中に接種する。同一培地中で増殖した二次培養物の希釈物を、単一の炭素源としてヘミセルロースをも含む固体培地上にプレーティングする。形態学的に異なるコロニーを単離して、その後、ヘミセルラーゼ活性についてスクリーニングする。本発明の特に好ましい実施態様においては、グアーが単一の炭素源である、９〜9.5のpH範囲の選択的富栄養ブロスを土壌試料と共に接種し、37℃でインキュベートし、好気的に振盪する。インキュベーション後、選択的集積培地を使用して初期培養物の更なる希釈を行う。数回の継代後、最も希釈したブロス培養物の一連の希釈物を通常の食塩水中で調製し、グアーを単一の炭素源として含む固体培地上にプレーティングする。34℃で５〜７日間インキュベーションした後、形態学的に異なるコロニーをその固体培地から単離し、更に、ヘミセルラーゼの活性についてスクリーニングする。
高められたpHで、単一の炭素源としてヘミセルロースを利用する微生物についての初期選択により、全ての土壌微生物の有限の画分が回収される。典型的には、約40％の単離物は、本発明のヘミセルラーゼを産生する能力を特徴とする。この画分の特に好ましいサブグループは、グラム陽性バチルス（Bacillus）属の種を含む。
この好ましいサブグループの例は、CMG1240と表示されるバチルス・レンティス（B.lentis）株であり、この一般的な性質を下記表Ｉにまとめてある。CMG1240株は、ブダペスト条約に従い、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ロックビル、メリーランド州）に、受託番号第55045号として寄託されてある。好ましいサブグループの任意の微生物株としての、CMG1240株の要所となる性質は、本発明に記載の用途に適するヘミセルラーゼを培養培地中に産生する能力である。
セルラーゼ／ヘミセルラーゼ活性を測定するための従来の方法は、例えば、METHODS IN ENZYMOLOGY、Vol.160:180〜86及び368〜76（1988）に記載されている。これらの方法は、一般的に、予め決定してある量の基質を、予め決定してある量の粗製のまたは精製された酵素調製物に暴露させることを伴う。基質の、希望する最終生成物への変換率を、pH及び温度の特定の条件下で測定する。粗製の酵素調製物は、適切な培地中で微生物を培養し、その後、沈殿もしくは限外濾過のような従来の方法を使用して、細胞を囲んでいるブロス内に蓄積している酵素を濃縮することにより製造することができる。得られる酵素調製物は、それぞれ要所となる、不溶性基質の重量損失、多糖類懸濁液の濁度変化、還元性末端基の増加、β−マンナン類のような多糖類の粘性の減少、比色測定、多糖類−アガー中でのクリアランスゾーンの測定、もしくは、ポーラログラフィー等を含む、当業界で公知の方法により、比活性についてアッセイすることができる。
表Ｉ
a.形態学：
（１）バチルス形状：（0.8×1.7〜2.3）μｍ。
（２）単一及び対をなすものが主に生じる。
（３）内生胞子を形成することができる。
（４）グラム陽性（グラム可変性もしくはグラム陰性のものも出現する）。
b.増殖条件：
（１）トリプシン処理のダイズ−アガープレート培養：コロニーは不規則で、凸状、滑らか、波状、酪酸性（butyrous）、不透明、及び直径2mm（72時間、37℃）である。
c.生物学的特性：
（１）好気性。
（２）カタラーゼ陽性。
（３）オキシダーゼ陰性。
（４）非運動性。
（５）増殖温度:30〜50℃、最大増殖率は41℃において生じる。
（６）増殖pH（グルコース−無機塩基本培地中で、34℃で350rpmにおいて10時間培養した）:7.0〜8.5、最大増殖率はpH7.5において生じる。
（７）カゼイン及びゼラチン分解：陰性。
（８）デンプン加水分解：陽性。
（９）１〜５％NaCl中での増殖：陽性。
（10）利用された炭素源:D−グルコース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−フルクトース、Ｄ−キシロース、乳糖、マルトース、ショ糖、α−シクロデキストリン、デキストリン、グリコーゲン、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｌ−アラビノース、セロビオース、ゲンチオビオース、ラクツロース、マンニトール、Ｄ−マンノース、Ｄ−メリビオース、Ｄ−トレハロース、ツラノース、α−ケトブチル酸、ウリジン、及び、ｍ−イノシトールを含む。
（11）硫化水素生成：陰性。
（12）インドール生成：陰性。
（13）クエン酸の利用：陰性。
（14）ウレアーゼ：陰性。
（15）Voges−Proskauer:陰性。
（16）フェニルアラニンデアミナーゼ：陰性。
（17）リシンデカルボキシラーゼ：陰性。
（18）オルニチンデカルボキシラーゼ：陰性。
（19）アルギニンデヒドロラーゼ：陰性。
本発明に従い、ヘミセルロース含有ブロス培地中で、単離した微生物のコロニーを培養することにより、土壌単離物をヘミセルラーゼ産生についてスクリーニングする。インキュベーション後、そのブロス培地を遠心し、得られる上清を濾過して細胞を除去し、ヘミセルロースの粗製調製物を得る。この酵素を、好ましいヘミセルロースのアルカリ性で粘性がある調製物に添加して、その基質の液化の度合いの経時変化を測定する。
土壌単離物を、マンナン含有ヘミセルロースが単一の炭素源であるブロス培地中で培養することが好ましい。インキュベーション後、そのブロス培地を遠心し、得られる上清を濾過する。得られるこの粗製酵素調製物を、８〜11の範囲内のpHで、マンナン含有ヘミセルロースの孔粘性を有する調製物に添加する。該酵素の相対活性を、ヘミセルロースを液化させるのに必要な時間量により測定する。
土壌単離物を、先に記載したように、グアーが単一の炭素源である選択的集積培地中で培養することが特に好ましい。インキュベーション後、この培養物を遠心し、得られる上清を濾過して粗製酵素を回収する。この粗製酵素を、その後、架橋結合させたグアー調製物を含む管の中に、９〜9.5の範囲内のpHで、この調製物の粘性を上昇させるpH金属イオン類と共に導入する。39〜40℃で少なくとも１時間インキュベーションした後、従来の粘度測定法を使用して、酵素／グアー溶液の粘性を決定することにより、酵素活性を測定する。例えば、Biochem.Biophys.Acta 139:238及び248（1967）;Eur.J.Biochem.51:207（1975）を参照のこと。
先に記載したようにして取得されるヘミセルラーゼは、一般的に、最小値の約pH4.5と約pH11のそれぞれの間の、幾分6.5pH単位を越える範囲にわたるpHプロフィル−−特定の酵素活性とpHとの間の関係により定義される曲線−−により特徴付けられる活性を示す。このようなpHプロフィルは、例えば、約pH8以上では事実上不活性である既知のバチルスマンナナーゼについての対応するプロフィルと比較する場合、かなり異なる。AraujoとWard、J.,App.Bacteriol.、68:253〜61（1990）を参照のこと。
本発明において使用されるヘミセルラーゼは、約pH9から約pH7の間の範囲内にピーク（つまり、活性が最大になる該曲線の一部分）を有するpHプロフィルを有することが好ましい。また、この酵素が、高いアルカリ性及び高められた温度の両方により特徴付けられる条件下において、顕著な生物学的活性を示すことが好ましい。このような適切な酵素は、例えば、pHが８〜11の範囲内であり、かつ、温度が60℃もしくはそれより高い場合に、顕著な活性を示す。
本発明に記載の用途に特に好ましいヘミセルラーゼは、以下に示す特性を有するエンド−β−Ｄ−マンナナーゼである：
（１）活性：好ましい酵素は、ガラクトマンナン、グルコマンナン、及び、マンナンのようなマンナン炭水化物類を含有するヘミセルロース系物質に作用する。この関連の活性は、以下に示す方法で測定することができる。1.0％グアーを含む水性懸濁液を基質として使用し、2mLの2Mグリシンを16.0mLの基質に添加する。この混合物を完全に混ぜ合わせ、その後、38℃に予備加熱する。酵素をその基質に添加し、良く混ぜ合わせ、その後、ストップウオッチを用いてピペットの仕込み−排出時間を測定するような簡単な方法、もしくは、ブルックフィールド（Brookfield）もしくはファン（Fann）の粘度計のようなより複雑な装置を使用して、酵素／グアー溶液の粘度を測定する。マイルズ製B1500のような、既知の活性を有する、市販のヘミセルラーゼ酵素を使用して、標準曲線を作成する。市販のヘミセルラーゼのグラム数もしくは単位数を粘度を変化させるのに必要な時間に対してプロットし、新規のヘミセルラーゼを市販品のものと比較する。
（２）基質特異性：酵素は、Ｄ−ガラクトースとＤ−マンノースとがβ−1,4結合したポリマーであるグアーガム、及びローカストビーンガム、のような比較的単純な炭水化物のポリマー類、並びに、例えば、ダイズ及びアルファルファからの、より複雑なマンナン含有炭水化物類を分解する。他の適切な基質には、マンナン含有ココナッツ残留物（coconut residue）、カロブビーンガム、カッサバ、コプラ、及び、グアーを化学的に改質したものなどがある。
（３）至適pH：この酵素の至適pHは、約7.0もしくはややそれを上回り、例えば、7.1から7.5の範囲である。この酵素は、約4.5から11の範囲のpHで安定である（図２参照）。
（４）至適温度：酵素活性に対する至適温度は40℃であるが、酵素活性は、20℃から90℃の範囲の温度で観察される。図１に示すように、この酵素は、60℃から90℃の範囲の温度で顕著な活性を示す。
（５）温度及びpHにより不活性化:pH9.0においては、60℃で5.5時間後、75℃で45分後、及び、90℃で15分後に、この酵素は、最大活性の50％を保持している（図１参照）。
（６）分子量：均質になるまで精製した後、この酵素は、SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により測定したところによると、約32,000の分子量を有している。培養ブロスから粗製酵素調製物を得るために、細胞及び細胞破砕物を最初に0.1ミクロンのフィルターで除去する。この酵素を、その後、10,000分子量カットオフの膜で濃縮する。しかしながら、一度酵素を濃縮すると、酵素の大部分がその膜を通過することができる。
この最終透過物中の酵素は、5,000分子量カットオフ膜で濃縮するか、あるいは、３倍容量のアセトンで沈殿させることができる。沈殿物を遠心した後、上清をサイフォンを利用して除去し、ペレットを50mMのリン酸バッファー中に再懸濁させる。この濃縮物を10mMのリン酸バッファー（pH7.0）に対して透析し、その後、DEAE−セファセルカラム上に載置する。この酵素を、50mMのリン酸バッファー（pH7.0）中における、０〜1.25Mの範囲の上昇イオン強度の塩化ナトリウム勾配溶液で溶出する。画分を集め、酵素活性についてテストする。最大活性を示す画分をプールし、SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を使用して分析し、蛋白質分子量標準と比較する。
本発明に従い、商業的に有用な量のヘミセルラーゼを、従来の発酵技術を用いて前述のヘミセルラーゼ産生微生物を培養することにより製造することができる。この関連において、「発酵」は、有用な生成物が微生物が作用する基質から得られる任意の調節された微生物作用を広く意味するために使用される。本発明に従い、発酵は、攪拌タンク反応器内で行うことができる。この種の反応器は、主に、撹拌機、バッフル、熱交換コイル、並びに、温度、空気流、圧力、pH、及び泡立ちのための自動制御を含む密閉された円筒型タンクである。この種の発酵容器には、必須栄養物、及び、グアーガムのようなヘミセルラーゼ誘導物（inducer）が仕込まれる。滅菌後、反応容器に、先に記載したようにヘミセルラーゼを産生する能力について予め選択されている微生物類から本質的に構成される培養物を接種する。
バッチ培養の非稼働時間を排除した連続培養は、発酵生産率を増加させることができる。しかし、大規模連続培養において生産率を保持することは、時々困難である。従って、本発明の細菌を利用するバッチ発酵が好ましい。
本発明の好ましい実施態様においては、バチルス・レンティス（B.lentis）CMG1240のようなグラム陽性バチルス株を、商業的に有用な量の酵素を生産するのに利用する。工業用等級の栄養物類、グリセロール（炭素源）、及び、グアーのようなマンナン含有ヘミセルロースからなる培地を仕込んだ発酵容器に、先に記載したようなグラム陽性バチルス株から主になる培養物を接種する。この発酵容器を、約35℃に（500〜1,000rpm撹拌）、約12時間保持する。グアーのようなヘミセルロースを増殖期の間、発酵容器に添加して、更に酵素産生を誘導する。この発酵物を約１から7.5時間後に収集して、更にその後、例えば、粘度測定法により、酵素活性を測定する。
発酵産物の酵素活性は、発酵ブロスの一部を遠心し、更に、得られる上清をテストすることによりアッセイする。上清の（もしくは、その希釈物）のアリコートをグアー溶液に添加し、一定孔径のピペットから予め決定した容量を排出するのに必要な時間をルーチンに記録することにより、酵素／グアー溶液の粘度低下を測定する［先に列挙した、好ましいヘミセルラーゼの特性における項目（１）を参照のこと］。
0.5ミクロンのフィルターを通す濾過で、細胞を除去し、その後、5,000、10,000、もしくは50,000分子量カットオフ限外濾過膜を使用する限外濾過により、発酵ブロスから発酵を回収する。この濃縮物を、約４℃で３倍量のアセトンと混ぜ合わせて酵素を沈殿させる。この沈殿物を約24時間放置して沈降させた後、上清をサイフォンにより除去する。次いで、沈殿物を約４℃で遠心し、得られるペレットをリン酸バッファー中に再懸濁させてペーストを形成する。
本発明の範囲内に含まれるヘミセルラーゼを製造する特に好ましい方法においては、バチルス・レンティスCMG1240のようなグラム陽性バチルス株を利用して商業的に有用な量の酵素を生産する。例えば、グリセロール、イースト抽出物、必要なミネラル、及び、微量元素類からなる培地を仕込んだ２機の14リットル発酵容器に、先に記載したようなグラム陽性バチルス株から主になる培養物を接種する。600nmでの光学密度（OD）が約2.0に達するまで、この発酵容器を36〜37℃で、＞40％の溶存酸素濃度、及び、300〜1000rpmの撹拌速度にして維持する。
ODが2.0に達すると、温度を29〜30℃に下げ、インキュベーションを、ODが14に達するまで更に約13.5時間継続し、そのODになった時点で、温度を10℃に下げる。
その後、先に記載した培地ではあるが実質的にはより濃いイースト抽出物含量を含む培地を仕込んだ250リットルの発酵容器に、２機の14リットル発酵容器の内容物を接種する。300と500rpmとの間の撹拌速度で、溶存酸素を約70％の飽和状態に保持する。温度は28℃に保持し、pHは、8.0から8.45の範囲に保持する。泡立ちは、例えば、シリコーン泡防止剤で制御することができる。約15.5時間のインキュベーション後、ODが14に達し、温度を20℃に下げる。インキュベーションは、一般的には、ODが20に達するまで、約25時間継続する。
グリセロール、イースト抽出物、ダイズ粉、グアーガム、及び、必要な栄養物、及び、微量元素類からなる培地を仕込んだ1500リットルの発酵容器に、先に記載したように、250リットル発酵容器の内容物を接種する。温度を28℃に維持し、pHを約8.11〜8.44の範囲に維持する。240〜288rpmの撹拌速度で、溶存酸素濃度を約25％以上の飽和濃度に維持する。発酵容器内の空気流は、１分当たり600〜1000リットルに保持し、かつ、タンクの空気圧力を3psiと11psiとの間に保つことが好ましい。また、泡立ちをシリコーン消泡剤で制御することができる。
接種後約4.5時間で、ODが約5.6に達したとき、グアーガムを発酵容器に添加する。つまり、１リットル当たり総量約13.8グラムが添加されるまで、約９時間にわたり毎時間グアーガムの大体１から２キログラムを添加することができる。接種後10から13時間目に、１リットル当たり総量約３グラムが添加されるまで、グリセロールをゆっくりと発酵容器内に添加する。発酵は、ODが約23に達した時点で、接種後約14時間目に停止し、酵素活性を測定すると、１リットル当たり約2.67×107単位となった。
この酵素は、ウエストファリア（westphalia）製連続遠心機もしくは類似の装置を通すことによる細胞塊及び培地固形物の除去により回収される。残存している固形物及び高分子量物質を、例えば、0.1ミクロンの中空系繊維フィルターを通す濾過により除去する。その後、この粗製酵素を、50,000分子量カットオフ中空系繊維限外濾過膜を使用して濃縮する。この濃縮物をその後、滅菌した0.1ミクロンのフィルターにより濾過し、更にその後、粗製酵素を塩析する目的で、１リットル当たり550グラムの濃度で硫酸アンモニウム中に懸濁させる。この酵素沈殿物を、その後、５℃、8,000rpmでの遠心により回収する。このような方法により、この沈殿物の酵素活性を測定すると、１キログラム当たり一般的に、約5.0×108単位となった。
本発明の範囲内のヘミセルラーゼの製造の代替方法においては、ヘミセルラーゼをコードするDNAを単離し、これを用いて、既知の方法により、この酵素を組換え宿主により商業的に有用な量で産生するような適切な宿主生物を形質転換させることができる。ヘミセルラーゼをコードするDNAは、本発明に記載のヘミセルラーゼを発現する微生物から作製された核酸ライブラリーをスクリーニングすることにより単離することができる。例えば、Ausubelら、CURRENT PROTOCOLS IN MULECULAR BIOLOGY、セクション５及び６（John Wiley and Sons、New York）（1987年、1990年）
（「Ausubel」）を参照のこと。このようなライブラリーは、例えば、本発明の範囲内のヘミセルラーゼのＮ末端部分をコーリゴヌクレオチドプローブによりスクリーニングされる。このようなＮ末端部分の例としては、後述の実施例14に記載してあるような、アミノ酸配列、Ala−Ser−Gly−Phe−Tyr−Val−Xxx−Gly−Thr−Ile−Leu−Xxx−Asp−Ser−Thr−Gly−Asn−Pro−Phe−Lys−Ile−Xxx−Gly−Xxx−Asn［Xxxは、未決定アミノ酸を表す］である。Ausubelのセクション６を参照のこと。
それに代わるものとして、例えば先に記載したＮ末端配列に基づき、本発明のヘミセルラーゼをコードするポリヌクレオチドを単離するために有用な他のプローブを作製するための鋳型としてのプローブを用いて単離する場合、本発明のヘミセルラーゼの内在性コーディング配列を含むかあるいはそれに隣接する他の部分を使用することができる。このようなプローブは、先に記載したようなゲノムもしくはcDNAのライブラリーをスクリーニングするための公知の方法（先に引用したAusubelを参照のこと）、あるいは、本発明のヘミセルラーゼをコードする単離したRNAから作製されるcDNAを増幅させるのに用いるためのポリメラーゼ連鎖反応（PCR）プローブを合成するための公知の方法で使用することができる。このようなcDNAを、その後、適切な発現ベクター内にクローン化し、宿主生物を形質転換させるのに使用することができる。Ausubelのセクション15.4を参照のこと。
これに関する適切なポリヌクレオチドは、以下に記載するように、コドン使用、翻訳の開始、及び、本発明の範囲内の商業的に有用なヘミセルラーゼの回収可能な量の発現に関して、選択宿主に対して至適化される、所望のアミノ酸配列に対応するヌクレオチド配列を含むのが好ましい。また、このようなポリヌクレオチド分子で選択宿主生物を形質転換させるために選択されたベクターは、該ポリペプチドをコードする配列の効果的な保持及び転写を可能にすべきである。このようなベクターは、簡単に、市販の供給源から手に入れることができるか、あるいは、そこから誘導することができ、かつ、本発明のヘミセルラーゼを発現させるために使用される特別な宿主細胞に適合している。本発明に使用するのに適するベクターの例については、Ausubelのセクション２〜４を参照のこと。
本発明のヘミセルラーゼを発現させるのに適する宿主細胞には、原核生物もしくは真核生物細胞があり、それらは例えば、細菌細胞、藻類細胞、イースト細胞、昆虫細胞、哺乳類細胞、及びヒト細胞である。従って、本発明に適する宿主細胞には、アエロモナス（Aeromonas）、アスペルギルス（Aspergillus）、バチルス（Bacillus）、エシェリシア（Escherichia）、クルイベロマイセス（Kluyveromyces）、ピキア（Pichia）、ロドコッカス（Rhodococcus）、サッカロマイセス（Saccharomyces）、及びストレプトマイセス（Streptomyces）がある。この適切な宿主微生物類のより具体的な例は、細菌である大腸菌（E.coli）、バチルス・スブチリス（B.subutilis）、バチルス・ブレビス（B.brevis）（J.Bacteriol.172:1312−20）、及び、バチルス・レンチス；遺伝子型trp1 gal1 ade1 his2を有するイーストS.セレビシアエ（S.cerevisiae）株X2181−1B（イースト・ジェネティック・ストック・センター、バークレー、カルフォルニア州から入手できる）；遺伝子型his2 ade1 trp1 met14 ura3を有するATCC52683株（アメリカン・タイプタメルチャー・コレクション、ロックビル、メリーランド州から入手できる）；及び、遺伝子型his1 trp1を有するATCC46183株（これもアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションから入手できる）である。本発明のヘミセルラーゼをコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞は、回収可能な、もしくは、商業的に有用な量の本発明のヘミセルラーゼの発現を提供する条件下において増殖することができる。例えば、Ausubelのセクション１及び13を参照のこと。
ダイズのような植物性物質の多数の供給源は、エネルギー含有蛋白質及び炭水化物に富んでおり、かつ、動物用飼料の成分としてしばしば利用される。ダイズはまた、ヒトの消費のための食品の成分としても広く使用されている。ガラクタン類は、市販のダイズ製品の総炭水化物含量の主要成分であるが、しかし、それらの炭水化物類は、簡単に消化されないために吸収されないという理由により、単胃動物用飼料の成分として使用される場合には、ダイズあら粉の有効エネルギー含量にさほど寄与するわけではない。それらのエネルギー含量を活用するためには、ガラクタン類は、単胃動物及びヒトにより吸収かつ代謝されることができるより小さい分子量の炭水化物類へ低分子化させる必要がある。
本発明に従い、上述の性質を有するヘミセルラーゼを、食品及び動物用の飼料品のヘミセルロース系成分中に存在するガラクタン類及び他のマンナン炭水化物類特にダイズからの複合炭水化物類を含むもの、を分解させるのに使用することができる。本発明の消費可能な組成物中に含まれる酵素成分は、好ましくは、上述したようなヘミセルラーゼ、特にバチルスヘミセルラーゼから本質的に構成されるべきである。これに関して、「本質的に構成される」とは、酵素成分が、主に前述のヘミセルラーゼにより決定されるヘミセルロース分解活性を示すことを意味する。しかしながら、酵素成分のヘミセルロース分解活性を甚だしく妨害しない限り、恐らくは他の活性を有する他の酵素が存在してもよい。
好ましい実施態様においては、本発明のヘミセルラーゼの有効量を、ダイズあら粉の一部分に添加し、乾燥させる。得られる組成物を挽いて微粉末にし、その後、例えば、トウモロコシ及び他の栄養物からなる乾燥動物飼料と混合する。
この種の混合物は、従来のヘミセルラーゼ類を不活性化させる条件、特に、熱及びpHの条件下にで加工することができる。従って、前述のダイズをベースにした組成物を、圧縮ミルを通して処理して、予め決定されている比率で、ヘミセルラーゼ、ダイズあら粉、及び、他の動物飼料用成分を含む動物飼料のペレットを形成することができる。ヘミセルラーゼ含有動物飼料の食餌で養育する場合、ニワトリは平均して、ヘミセルラーゼを含まない同一の食餌で養育したニワトリよりも、摂取した飼料１ポンド当たりの体重が増加する。
本発明の他の態様に従い、本発明の範囲内のヘミセルラーゼを産生する微生物から本質的に構成される培養物を、一旦摂取されると微生物が本発明の範囲内のヘミセルラーゼを産生するように、適切な消化管を有するブタのような単胃動物類に対して直接給餌することができる。このような培養物を、飼料品のヘミセルロース成分類中に存在するガラクタン類及び他のマンナン炭水化物類、特にダイズからの複合炭水化物を含むもの、の分解を促進する目的で、飼料品と混合して上述の動物に直接給餌することができる。これに関して、「本質的に構成される」とは、その培養物成分が、本発明の範囲内のヘミセルラーゼを産生する微生物から主としてなることを意味する。しかしながら、この培養物成分のヘミセルラーゼ産生活性を甚だしく妨害しないかぎり、他の微生物が存在してもよい。本発明の消費可能組成物中に含まれる培養物成分は、好ましくは、先に記載したようなヘミセルラーゼ、特にバチルスヘミセルラーゼから本質的に構成されるべきである。好ましい実施態様においては、本発明の微生物から本質的に構成される培養物の有効量をダイズあら粉の一部に添加し、更に、乾燥させる。得られた組成物を挽いて微粉末にし、その後、例えば、トウモロコシ及び他の栄養物からなる乾燥動物飼料と混合することができる。この組成物を、その後、圧縮ミルを通して処理して、予め決められた比率で、本発明の微生物の培養物、ダイズあら粉、及び、他の動物飼料成分を含む動物用飼料のペレットを形成することができる。
あるいは、上述の培養物のみからなる調製物を製造し、そのような動物に直接給餌することができる。このような調製物は、本発明の範囲内の生きている微生物からなる濃縮ペーストの有効量からなる。この調製物はまた、そのような微生物の凍結乾燥した培養物の有効量からなる。
本発明の更に他の態様に従い、本発明の範囲内のヘミセルラーゼを産生する微生物の培養物を含む発酵ブロスを、先に記載したようなガラクタン類及び他のマンナン炭水化物類の分解を促進させる目的で、飼料品と混合して単胃動物類に直接給餌する。本発明の消費可能組成物中に含まれる発酵ブロス成分が、先に記載したようなヘミセルラーゼ、特にバチルスヘミセルラーゼを産生する微生物の培養物、及び、本発明の範囲内のこのようなヘミセルラーゼの有効量を含むことが好ましい。これに関して、発酵ブロスは、上述の培養物及びそのような培養物により産生される酵素に加えて、本発明の酵素を産生する微生物を培養するのに適する栄養物類を含む。
好ましい実施態様においては、このような発酵ブロスの有効量を噴霧乾燥させて、他の飼料成分類に添加する乾燥粉末を製造する。あるいは、他の好ましい実施態様においては、先に記載したような発酵ブロスを、ダイズあら粉のような飼料成分類の一つと直接混合し、乾燥させ、更にその後、他の成分類と混合する。更に別の実施態様においては、このような発酵ブロスを、完全飼料と直接混合する。特に好ましい実施態様においては、発酵ブロスを乾燥して濃縮物を形成し、これを飼料用ミルに輸送し、別の完全飼料混合物と配合される。このような飼料組成物を、その後、圧縮ミルを通して、予め決められた比率で、微生物の培養物及び本発明のヘミセルラーゼの有効量からなる発酵ブロス、ダイズあら粉、及び他の動物飼料成分を含む動物飼料のペレットを形成することができる。
本発明を、以下に示す例示的な実施例を参照することにより、以下に更に記載する。これらの実施例においては、以下に示す培地を使用した：
選択的集積ブロス（量／リットル）
10.0g グアーガム
5.0g （NH4）2SO4
pH9.5
選択的集積アガー（量／リットル）
2.0g グアーガム
1.0g Na2HPO4
3.0g （NH4）2SO4
0.2g NaCl
0.2g MgSO4・7H2O
50.0mg CaCl2・2H2O
1.0mL 微量元素溶液Ｉ（以下を参照のこと）
15.0g アガー ノーブル（Agar Noble）
50.0mM トリスバッファー（pH9.0）
1.0mL ビタミン溶液（以下を参照のこと）
微量元素溶液Ｉ（量／リットル）
100.0mg EDTA
230.0mg ZnSO4・7H2O
180.0mg MnSO4・H2O
60.0mg H3BO3
100.0mg CuSO4・5H2O
40.0mg Na2MoO4・2H2O
40.0mg CoCl2・6H2O
70.0mg KI
40.0mg FeSO4・7H2O
0.4mg NiCl/6H2O
8.0ML 0.1M H2SO4
ビタミン溶液（量／リットル）
1.0g ビタミンB12
1.0g リボフラビン、B2
1.0g ピリドキシン、B6
1.0g Ｄ−ビオチン
1.0g 塩酸チアミン
1.0g ニコチン酸
1.0g Ｄ−Ca−パントテン酸
シードブロス（量／リットル）
7.5g グリセロール
10.0g イースト抽出物
2.5g トウモロコシ浸漬液（Corn Steep Liquor）
1.0g KH2PO4
2.0g （NH4）2SO4
0.5g MgSO4・7H2O
1.0mL 微量元素溶液II（以下を参照のこと）
pH7.0〜7.5
発酵ブロス（量／リットル）
20.0g グリセロール
20.0g イースト抽出物
5.0g トウモロコシ浸漬液
2.0g KH2PO4
4.0g （NH4）2SO4
1.0g MgSO4・7H2O
2.0mL 微量元素溶液II
pH8.5
微量元素溶液II（量／リットル）
20.0g FeSO4・7H2O
20.0g FeCl3・6H2O
0.5g MnSO4・H2O
50.0mg CoSO4・7H2O
10.0mg CuSO4・5H2O
20.0g CaCl2・2H2O
50.0mg H3BO3
100.0mg ZnSO4・7H2O
100.0mg Na2MoO4・2H2O
振盪フラスコブロス
20.0g ソイトーン（Soytone）（ディフコ社）
4.0g KH2PO4
4.0g （NH4）2SO4
1.0g MgSO4・7H2O
1× 微量元素溶液III
pH8.0
14リットル発酵容器用ブロス（量／リットル）
30.0g グリセロール
10.0g イースト抽出物
4.0g KH2PO4
4.0g （NH4）2SO4
1.0g MgSO4・7H2O
2× 微量元素溶液III
pH8.5
注：このイースト抽出物は、他の成分類とは別にして滅菌する。蒸気滅菌後、これらの成分類を配合する。
250リットル発酵容器用ブロス
30.0g グリセロール
40.0g イースト抽出物
4.0g KH2PO4
4.0g （NH4）2SO4
1.0g MgSO4・7H2O
2× 微量元素溶液III
pH8.5
注：このイースト抽出物は、他の成分類とは別にして滅菌する。蒸気滅菌後、これらの成分類を配合する。
1500リットル発酵容器用ブロス
8.90g グリセロール
6.32g イースト抽出物（Ardamine YEP）
5.06g KH2PO4
5.06g （NH4）2SO4
1.26g MgSO4・7H2O
37.90g ダイズ粉（Cargill 200/70）
2.35g グアーガム（Sigma）
2× 微量元素溶液III
pH8.33
注:pHを蒸気滅菌の前に、硫酸で6.0に調整する。蒸気滅菌後、アンモニアの添加によりpHを8.33に調整し、8.11と8.44との間の範囲に保持する。
1000×微量元素溶液III（量／リットル）
0.2g ZnSO4・7H2O
0.5g MnSO4・H2O
0.1g H3BO3
0.1g CuSO4・5H2O
0.1g Na2MoO4.2H2O
0.05g CoCl2・7H2O
0.1g KI
1.0g FeSO4・7H2O
0.001g NiCl/6H2O
0.008ml H2SO4（0.1M）
1.0g FeCl3
1.0g NaCl
2.0g CaCl2・2H2O
実施例１：土壌からのヘミセルラーゼ産生性微生物の単離
熱帯雨林及び温和な庭園の両方から採取した土壌試料を、10％w/vの選択集積ブロスに添加した。この培養物を、37℃で４日間、調節装置を付けたエルレンマイヤーの振盪フラスコ内で振盪した。初期培養物の４種類の希釈物［1:10、1:20、1:800、及び、1:50,000］を、新しい選択的集積ブロスで作製し、37℃で４日間インキュベートした。1:50,000の希釈物を使用して、0.85％のNaCl中における一連の希釈物（10-1から10-8）を作成し、これを、選択的集積アガロース上に塗布し、34℃で５〜７日間インキュベートした。インキュベーション後、単離したコロニーを塗布した培養物から選択し、純度を保つために適切なアガー培地上に３回連続して筋を付けるように塗り付けた。このスクリーニング過程の結果、熱帯雨林から採取した土壌からの９種類の単離物、及び、温和な庭園から採取した土壌からの24種類の単離物を選択した。
実施例２：ヘミセルラーゼ活性についての土壌単離物のスクリーニング
熱帯雨林の土壌からの精製した各単離物を、選択的集積ブロスを含む振盪フラスコに移し、34℃で48〜72時間振盪した。インキュベーション後、この培養物を、10,000rpmで20−30分間遠心した（４℃）。得られた上清を、0.8及び0.45ミクロンのフィルターを連続して通して濾過して、微生物細胞を含まない粗製酵素を回収した。温和な庭園の土壌から精製した各単離物を、選択的集積ブロスを含む管に移し、34℃で12〜48時間振盪した。インキュベーション後、先に記載したように、この培養物を遠心し、濾過した。この粗製酵素溶液を、5mLの架橋結合させたグアー調製物（水400mL当たり、5.0gのグアー、2.0gの（NH4）2SO4、及び、0.6gの四ホウ酸ナトリウム、pH9.5）を含む管に添加し、少なくとも１時間、39〜40℃の水浴中でインキュベートした。酵素活性を測定するために、一定直径の1mL用ピペットに、1.0mLの混合物を充填し、0.9mLを押し出した。ストップウオッチを使用して、この押し出しが起こるのに必要な時間を測定した（本明細書中では、以降「滴下時間」とする）。２秒を下回る滴下時間は、ヘミセルラーゼ活性の測定できる量を示す。温和な庭園の土壌から回収した24種類の単離物の内12種類が、更に、熱帯雨林の土壌から回収した９種類の単離物のうち４種類が、測定できる量のヘミセルラーゼを産生した。
実施例３：脂質分析によるバチルス・レンチスCMG1240の性質決定
先の実施例１及び２の方法に従って単離した微生物のうちの一つのものの脂肪酸含量の分析を行った。微生物の性質を決定しかつ同定するために使用される脂肪酸分析の方法は、Eerola and O.P.Lehtonen、J.Clin.Microbiol.Vol.26:1745〜1753（1988）、及び、G.M.Mukwaya and D.F.Welch、J.Clin.Microbiol.Vol.27:2640〜2646（1989）により報告されている。これらの方法は、Microbial ID、Inc.社（ネワーク、デラウエアー州）、及び、Hewlett−Packard社により改善されている。MIDI微生物同定系として引用されるこの改善された方法は、ガス−液体クロマトグラフィーにより微生物の脂質類から調製される脂肪酸のメチルエステルを分析する。実施例１及び２の方法に従って単離した微生物、及び、命名されている株CMG1240をこのMIDI微生物同定系を使用して分析した。この分析の結果を、表IIに示している。テスト１から４においては、細胞は、標準的な微生物ID法によるTSBAアガロース上で、28℃及びpH6.7において増殖させた。テスト５においては、脂肪は、脂質組成に顕著な変化を引き起こす条件である、35℃及びpH8.5で増殖させた。
表IIにおいて示されている脂肪酸プロフィールの、MIDI脂肪酸データーベースにおける既知のバチルス種の全ての株のプロフィールとの比較により、標題プロフィールは、バチルス・レンチスとして同定される微生物のプロフィールに最も近似していることが明らかになった。
実施例4:商業的に有用な量のヘミセルラーゼの産生
バチルス・レンチス（CMG1240）の単一の、単離されたコロニーを、50mLの脳心臓浸出ブロスを含む、調節装置を取付けてあるエルレンマイヤーの振盪（プレ−シード）フラスコ内へ接種した。接種したフラスコを、35℃で12〜16時間インキュベート中は振盪した（300rpm）。インキュベーション後、このプレ−シードフラスコの全ての容量を、無菌的に、１リットルの種培地を含む調節装置を取付けてある4Lのエルレンマイヤー振盪フラスコ（シード）に移した。このシードフラスコを、35℃において12〜16時間振盪しながらインキュベートした。このシードフラスコの全ての容量を、無菌的に、9.0リットルの発酵ブロスを含む14リットルの発酵容器へ移した。発酵容器は、40℃、＞20％溶存酸素、及び、500〜1000rpmに保持した。0.05％の最終濃度となるようにグアーガムを、増殖期中に２もしくは３回、更に、定常期中に１回（0.5％）添加して、酵素産生を誘導した。１〜7.5時間後、発酵を停止して、実施例６の方法に従って酵素活性をアッセイした。アッセイデーターを図３に示す。
実施例５：ヘミセルラーゼ産生のための至適培養条件を決定するためのヘミセルラーゼ活性の測定
最高の粘性を得るために３時間混合した、水に溶解している１％グアーの20ミリリットルアリコート、及び、2Mグリシン−NaOHバッファー（pH9.0）の2mLアリコートを、循環式の水浴方法によって40℃に保持されているガラス性のジャケット付の反応容器に添加した。発酵産物の一部分を、マイクロフージ内で５分間遠心し、得られた上清を使用して、酵素活性についてのテストを行った。この上清の100〜200MLの試料を反応容器に添加した。酵素活性は、実施例６において記載したように測定した。試料の酵素活性を、標準として使用しているヘミセルラーゼ（マイルズ Ｂ−1500）の希釈物の滴下時間（秒）のlog値を、分で表示してあるインキュベーション時間に対してプロットすることにより作成した標準曲線から算出した。logプロットの勾配（直線記法における）を算出し、ヘミセルラーゼのグラム数もしくは「室単位（chamber units）」に対して再プロットした。
実施例６：標準物及び精製した酵素調製物をテストするのに適するヘミセルラーゼ活性のためのアッセイ
標準ヘミセルラーゼもしくは精製した酵素調製物の酵素活性をスクリーニングするのに適する方法においては、水に溶解している１％のグアーガムを含む約16.0mLのグアー調製物、及び、2.0mLの2Mグリシン（NaOHでpH9.0に調節してある）を、循環性の水浴方法によって38℃に保持してある、ガラス性のジャケット付の100mLの反応容器に添加した。この溶液を、該温度に達した後、磁石性の攪拌機により、完全に混合した。一定内径の1mLのピペットにおいて、1.0mLの印から0.7mLの印までその溶液を滴下させるのに必要な時間を測定することにより、ゼロ時間における粘度を決定した。酵素を添加しなかったグアー溶液の初期滴下時間は、75から90秒であった。反応容器への酵素添加（200〜500ML）の後、グアー／酵素溶液をインキュベートした。その溶液のゼロ時間の測定値は速やかに決定した。滴下時間測定は、５回の測定が行われたか、あるいは、滴下時間が30秒を下回るまで行った。標準曲線は、滴下時間のlog値を、異なる標準酵素希釈物を使用してインキュベーションの時間に対してプロットすることにより作成した。
実施例７：発酵物からのヘミセルラーゼの回収
実施例４において記載してある方法を、６回の14リットル発酵の各々におけるヘミセルラーゼの有効量の産生に使用した。発酵を停止した後、0.1ミクロンのフィルターを用いる限外濾過により、細胞を60Lの培養ブロスから除去した。その後、10,000分子量を取り除く限外濾過を使用して、約3.5Lの容積にまで酵素を濃縮した。この濃縮物を３倍量のアセトンと混ぜ合わせて、ヘミセルラーゼを沈殿させた。この沈殿物を24時間沈ませるることにより沈殿物を回収し、その後、上清をサイフォンを利用して除去した。その後、この沈殿を、４℃において10分間、6000rpmで遠心した。得られたペレットを直ちに170mLの50mMリン酸カリウムバッファー（PH7.0）中に再懸濁させて、300mLの最終容量にした。得られたヘミセルラーゼ溶液の酵素活性を、実施例６の方法に従って決定した。回収されたヘミセルラーゼペーストは、9.45×106室単位／リットルであり、これは、6.3kg/Lの標準物としての市販のヘミセルラーゼ（pH9.0においてアッセイした）、もしくは、標準ヘミセルラーゼ処方物の1.89Kg総量に等しかった。
実施例８：ヘミセルラーゼを回収するための別な方法
実施例７において記載した方法において、ヘミセルラーゼを沈殿させるに代わりメタノールを使用してヘミセルラーゼを回収した。上清はサイフォンにより除去し、沈殿を先に記載したように遠心した。ペースト様の沈殿物を、その後、10倍量（w/w）の乳糖と混ぜ合わせ、40℃以下での温度における真空下で乾燥させた。
実施例９：ヘミセルラーゼを回収するための別の方法
ヘミセルラーゼを、10,000分子量カットオフ限外濾過膜を使用して、約15Lの容量にまで濃縮した。固体の硫酸アンモニウムを、継続的に混ぜ合わせながら、75％飽和になるまでゆっくりと添加した。溶液から生成した沈殿は8,000rpmで45分間の遠心分離により回収した。得られたペレットの酵素活性は、実施例６の方法に従って決定した。酵素活性の回収率は、1.85×105単位／グラム（総計2.22×108単位）であった。沈殿の酵素活性の回収率は、15L濃縮物の総酵素活性の77％であった。
実施例10：ヘミセルラーゼの商業的に有用な量の産生のための別の方法
A.接種材料を含む振盪フラスコの準備
バチルス・レンチス（CMG1240）の単一な、単離したコロニーを、各々、50mlの脳心臓浸出ブロスを含む、制御装置を取付けた500mLのエルレンマイヤーの振盪（プレシード）フラスコ内に接種した。35℃において12〜16時間インキュベートしている間に、接種したフラスコを振盪した（300rpm）。インキュベーション後、各フラスコの全ての容量を無菌的に、各々500mlの振盪フラスコブロスを含む、制御装置を取付けた２個の4Lのエルレンマイヤー振盪フラスコのうちの一つに移した。この振盪フラスコを、35℃において12〜16時間振盪させながらインキュベートした。
B.14リットル発酵容器の準備
各振盪フラスコの全ての容量を無菌的に、各々8.0リットルの14リットル発酵ブロスを含む、２台の14リットル反応容器のうちの一つに移した。14リットル反応容器は、＞40％の溶存酸素濃度、及び、300rpmと1000rpmとの間の撹拌速度を用い、36から37℃の温度に維持した。発酵容器内での泡形成は、シリコンの消泡剤（ユニオン カーバイド社、SAG 5693）を利用して調節した。細胞密度は、600nmにおける吸光度の変化を観察することにより評定した。温度は、吸光度（OD）が2.0に達した時点で、29〜30℃に下げた。約13.5時間後、ODが14に達した時点で、温度を10℃に下げた。
C.250リットル発酵容器の準備
次いで、160リットルの250リットル発酵容器ブロスを含む250リットル発酵容器に、14リットル発酵容器の成分を接種した。溶存酸素の濃度は、300rpmと500rpmとの間の撹拌速度を使用して、70％飽和に維持した。pHは、8.0と8.45の範囲に維持した。発酵容器内の泡形成は、シリコンの消泡剤（ユニオン カーバイド社、SAG 5693）を使用して制御した。接種後約15.5時間後に、600nmのODが14に達するまで、温度は28℃に維持した。この時点において、接種後約25時間でODが約20に達するまで、温度を20℃に下げた。
D.1500リットル発酵容器の準備
その後、800リットルの1500リットル発酵容器ブロスを含む1500リットル発酵容器に、250リットル発酵容器の166リットルの成分を接種した。培地のpHは、8.11から8.44のpH範囲に保持した。温度は28℃に保持し、かつ、溶存酸素の濃度は、240rpmと288rpmとの間の駆動速度及び600リットル／分と1000リットル／分の間の空気流量で、25％飽和を越える価に保持した。タンクの空気圧は、3psiと11psiとの間に保持した。泡形成は、シリコンの消泡剤（ユニオン カーバイド社、SAG 5693）で制御した。
接種後約4.5時間、つまり、600nmにおける発酵容器成分のODの測定値が5.6となった時点で、発酵容器にグアーガムを添加した。約１から２キログラムの固体のグアーガムを、ここからの９時間の間、毎時間発酵容器に添加した。総量で13.8グラム／リットルのグアーガムを、発酵容器に添加した。接種後10.5時間と13時間の間、グリセロールをゆっくりと発酵容器に添加した。総量で３グラム／リットルのグリセロールを発酵容器に添加した。接種後約14.25時間に成分のODが600nmにて23.3に達した時点で発酵を停止し、酵素活性は2.67×107単位／リットルと測定された。
実施例11：発酵物からのヘミセルラーゼの回収のための別の方法
実施例10の方法による発酵を停止した後、細胞塊と固体培地類とを、ウエストファーリアの連続遠心機を通すことにより部分的に除去した。ウエストファーリア遠心流出液中に残存している固体類及び高分子量物質類を、0.1ミクロンの中空繊維フィルターを通すことにより除去した。0.1ミクロンフィルターを通過した未精製の酵素溶液を、その後、50,000分子量カットオフ中空系繊維の限外濾過膜を使用して濃縮した。この濃縮物を、0.1ミクロンの滅菌したフィルターで滅菌濾過し、その後、粗製酵素を塩析させる目的で、550グラム／リットルの濃度の硫酸アンモニウム中に懸濁させた。
５℃において、GS3ローターを使用したソルバール遠心機中で、8,000rpmで遠心することにより、酵素沈殿を回収した。得られた沈殿物の酵素活性は、約5.0×108単位／キログラムであった。
実施例12：ヘミセルラーゼの精製
より精製された産物を生産するために、２つの沈殿段階を使用して、精製された酵素を取得した。限外濾過からの濃縮物は、実施例７に記載の方法に従って調製した。その濃縮物は、6.39×106単位／リットルであり、比活性は1.11×103単位/mgであった。等量の（2.2リットル）の濃縮物及びアセトンを混合して50％（v/v）溶液を作製し、更に、得られた沈殿物を、その後、10℃において18時間沈殿させた。上清を回収した後、追加量のアセトンを添加して75％溶液（v/v）を作製した。得られた沈殿物を、10℃で24時間沈ませ、その後、最初にサイフォンを利用し、最終的には5000rpmでの遠心により上清を除去した。この沈殿物を、その後、222mLの50mMリン酸バッファー（pH7.0）に溶解した。活性を決定したところ、5.71×107単位／リットルで、比活性は6.17×103単位/mgであった。この精製段階の結果、単に20％の蛋白質で90％の総活性を回収し、比活性が5.56倍上昇したことになった。
実施例13：別のヘミセルラーゼ精製法
別の精製法を利用して、実施例12の沈殿段階を回避した。ヘミセルラーゼを、実施例12において記載したように、限外濾過により希望する濃度に濃縮した。この濃縮物の液体処方物を、その後、エチレングリコール、もしくは、それに代わるものとして、グリセロール、ソルビトール、安息香酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、メチルパラベン、アスコルビン酸ナトリウム、もしくは、等価物のような、安定化及び保存用試薬を添加することにより調製した。
実施例14：精製したヘミセルラーゼの性質決定
ブロス濃縮物を、限外濾過により調製した。つまり、細胞を0.1ミクロンの膜で除去し、更に、酵素を10,000分子量を取り除く膜で濃縮した。酵素が濃縮された状態になった時点で、いくらかのヘミセルラーゼが膜を通過したことが観察された。この通過画分を、10,000分子量カットオフ膜で再濃縮し、その後、更なる精製に使用した。再濃縮した通過物は、４℃における３倍量のアセトンの添加により沈殿させた。上清をサイフォンを利用して除去し、沈殿物を50mMのリン酸バッファー（pH7.0）中に再懸濁させて、最終容量を222mLとした。この酵素濃縮物を、続いて、10mMリン酸バッファー（pH7.0）に対して透析して、全ての塩を除去した。透析した濃縮物を、その後、DEAE−セファセルカラム（2.8×30cm）に供した。ヘミセルラーゼの溶出は、1mL/の流速で、カラムに対してイオン強度を増加した溶液を添加することにより行った。この溶液は、50mMのリン酸バッファー中に溶解している０〜1.25MのNaClからなる。10ミリリットルの画分を回収して、実施例６に記載してあるように、１％グアー溶液の粘性低下を測定することにより酵素活性のテストを行った。最高活性を示した画分96〜109を一まとめにし、その後、12.5％のSDS−ポリアクリルアミドゲル上で（分子量マーカー蛋白質と共に）分析した。この分析の結果により、ヘミセルラーゼは高度に精製され、かつ、32,000の分子量を有することが示された。ヘミセルラーゼ画分を同じ種類のSDS−ゲル上での電気泳動により完全に精製し、更に、イモビロン（Immobilon）Ｐ PVDF膜上にブロットし、Matsudaira、J.Biol.Chem.262:10035−38（1978年）の方法により、クマシーブルーで染色した。この膜上のヘミセルラーゼのバンドを切り出し、アミノ酸配列分析に使用した。この酵素は、バイオシステムス社の気相配列決定機を使用するエドマン分解法により分析した。精製した酵素のＮ−末端配列は、以下に示すように決定された：
実施例15：体重増加／摂取した飼料重量（ポンド）を調べるための動物飼料の組成物
３種類の異なるバッチの動物飼料を比較した。これらのバッチを、（ｉ）出発用飼料、（ii）成育用飼料、及び、（iii）仕上げ用飼料（finisher feed）として引用した。３種類の飼料の組成物類を、表IIIに示している。
実施例16：ヘミセルラーゼ／ダイズあら粉飼料補充物の調製
実施例４において記載した方法を有用な量のヘミセルラーゼの産生に使用した。ヘミセルラーゼは、実施例９において記載した様にして回収した。得られた約2.2ポンドのヘミセルラーゼペーストを、少量（8.8ポンド）のダイズのあら粉（48％の割合）に混合させて、ポンド当たりのヘミセルラーゼ／ダイズあら粉混合物の酵素活性が31.75×106単位になる濃度にした。この混合物を、ドラフト下に置いた広い蓋なしの皿の中で空気乾燥させた。この乾燥混合物をワーリングブレンダー内で挽いて微細粉末にして、使用するまで４℃に保存した。
実施例17：動物用飼料を含むヘミセルラーゼの調製
トン当たり２ポンドのヘミセルラーゼ／ダイズあら粉混合物を含む３種類の動物用飼料を、実施例16の方法に従い調製した。実施例15において記載されている方法に従って調製された、２ポンドのヘミセルラーゼ／ダイズあら粉混合物を、実施例15に従って調製した３種類の動物用飼料の各々からなる成分（イエローコーン及びダイズあら粉を除外する）に添加した。このヘミセルラーゼ／ダイズあら粉混合物と他の成分類とを垂直振盪機内で１分間混合した。この混合物を、その後、予め決定してある量のイエローコーン及びダイズあら粉と配合させ、更に、垂直振盪機内で3.5分間混合した。結果として得られるヘミセルラーゼ／飼料混合物を、水蒸気（10％ v/w）を配給するために装着してあるカリフォルニア圧縮ミル内でその飼料混合物を処理することにより、ペレットに成形した。この飼料混合物を型に合わせて圧断してペレットにし、これを、垂直強制空気冷却用塔内で直ちに冷却させた。ペレットを揺すって任意の微細粉末物質を除去し、この粉末は、ペレット室へ戻した。出発用飼料ペレットを、回転ミルを通して処理することによって粉砕した。
実施例18：飼料添加物としてのヘミセルラーゼの使用
ニワトリの平均体重増加／摂取した飼料重量（ポンド）に影響する要因としての、ダイズのあら粉を含む動物用飼料に対するヘミセルラーゼ添加の効果を調べた。１日令のヒヨコ（パターソン Ｘ アーバー アクレス種）をこの研究のために選択した。この鳥は、マレック疾患及びニューキャッスル−気管支炎に対してワクチン接種した。各性別の25羽の鳥をランダムに捕獲して体重測定して、容認できる体重の範囲を確立した。平均の＋／−５グラムの範囲を各性別ごとに決定した。鳥をランダムに捕獲し、適切な体重についてスクリーニングし、76羽の雌雄を混ぜ合わせたブロイラー用ニワトリからなる群にランダムに割り振った（38羽の雄及び38羽の雌）。総計で、テスト用ニワトリの７群及び対照用ニワトリの７群が存在した。
各群を個別のおりの中に居住させた。おりの温度は、研究の最初の２週間の間毎日検査した。居住温度及び湿度は、研究期間中毎日検査した。空気交換を、壁に取付けてあるファンで促進した。鳥は積み上げた敷き藁の上に配した。以前の研究からの湿った敷き藁を除去して、１インチの新しい敷き藁に置き換えた。人工照明を継続的に行ない、全ての鳥は水に接近できるようにしてあった。
研究の最初の７日間の内に死亡した全ての鳥は、鳥の同一の搬入元からの同一の性別の鳥と置き換えた。研究７日目の12:01pm後に置き換えた鳥はいなかった。
全てのヒヨコを、研究０日目に、それぞれの食餌に配した。ヒヨコには、０〜21日目に出発用飼料の粉砕したペレットを給餌した。22〜39日目には、成育用飼料のペレットをヒヨコに給餌した。40〜46日目には、仕上げ用飼料のペレットをヒヨコに給餌した。研究の間、おりは日に３回調査した。研究の間に死亡した鳥を検屍して死因を決定した。食事と水分を採ることができない鳥は淘汰した。全ての死亡及び淘汰した鳥の体重及び除去した日にちを記録した。ヒヨコの体重を、研究の21日目及び46日目に測定した。増加した体重（ポンド）によって、ニワトリが消費した飼料の量（ポンド）を割ることにより、飼料効率を決定した。21日目の研究の結果を、表IV、Ｖ及びVIに報告してあり、これらを、図５において図説してある。46日目の結果は、表VII、VIII及びIXにおいて報告してあり、これらを図５において図説してある。ダンカンの新多重範囲テスト（New Multiple Range Test）を利用した、この結果の統計学的解析を、表Ｘに示している。
実施例19：直接給餌用微生物培養物含有動物用飼料の調製
本発明の範囲内に含まれるヘミセルラーゼを産生する微生物から主になる培養物を、実施例１、２、及び、10に記載した方法に従って調製することができる。一度摂取すると、このような微生物に本発明に記載のヘミセルラーゼを産生させる消化管を有する動物により摂取された飼料の量に対する増加体重の比率を増加させる目的で、このような培養物の効果的な量を、実施例15において記載したもののような動物飼料バッチと配合することができる。
実施例20：直接給餌用微生物培養物及びヘミセルラーゼを含む発酵ブロスからなる動物用飼料の調製
微生物類及び本発明の範囲内に含まれるヘミセルラーゼを含む発酵ブロスを、実施例10Dの方法に従って調製することができる。摂取した飼料の量に対する増加体重の比率を増加させる目的で、このような発酵ブロスの有効量を、実施例15に記載したもののような動物用飼料のバッチと配合することができる。
例えば、30％のダイズのひき割り粉を含む飼料混合物のトン当たり、実施例10Dの方法に従って調製した約３リットルの発酵ブロスを添加することができる。この発酵ブロスを噴霧乾燥させて乾燥粉末を作製することができ、この乾燥粉末は、その後、飼料成分と配合させることができる。この発酵ブロスを、例えば、ダイズあら粉もしくはダイズあら粉の一部分のような、飼料成分の幾つかのものと直接混合し、その後、乾燥させることもできる。次には、粉の乾燥させたブロス／ダイズあら粉混合物を、他の飼料成分と後で混合することができる。その他の方法として、この発酵ブロスを、完全な飼料混合物と直接混合することができる。輸送費用を低減し、かつ、微生物の混入を制御する目的で、飼料用製粉所へ輸送して、更に、完全飼料混合物と配合させることができる濃縮物を形成するためこの発酵ブロスを乾燥させることができる。
例えば、グルカナーゼ、キシラナーゼ、もしくはマンナナーゼ（mannanase）のような様々な酵素は、特定タイプのヘミセルラーゼとして、それぞれ、グルカン、キシラン、もしくはマンナンからなる異種多糖類の加水分解を触媒する能力に基づいて分類される。ガラクタンもしくはグルコマンナンのようなマンナン類の加水分解を行う酵素は細菌及び真菌類を含む多様な微生物類により産生され、かつ、それらはある種の動物及び多数の植物内にも存在することが知られている。そのようなマンナナーゼ類を産生する微生物類には、アエロモナス（Aero monas）、アスペルギルス（Aspergillus）、ストレプトマイセス（Streptomyces）、ロドコッカス（Rhodococcu s）、及び、バチルス（Bacillus）がある。METHODS IN ENZYMOLOGY、Vol.160、Part Ａ、Sect.II（1988）を参照のこと。
ヘミセルラーゼ類は、コーヒー、チョコレート、ココア、紅茶、及び、セリアル食品類の加工において商業的に利用されている。これに関するヘミセルラーゼを利用することにより得られる主たる利点は、溶液粘性の低下であり、それにより食品類のより安価な加工が可能になる。従って、ヘミセルラーゼ類は、果汁を清澄化するため、スラリーもしくはピューレの粘性を低下させるため、ある種の細胞壁固体物を液化させるため、及び、味を改良するために用いられる。しかし、ヒト用食品及び動物用飼料製品の利用可能なエネルギー含量を、特に動物飼料において増加させることができるならば、コスト節減の機会となる。家禽類用食餌中のトウモロコシ補足物としての、グルカナーゼ処理した大麦の成功裏の使用は、このような例の一つである。Feedstuffs 62（４）:10（1990）を参照のこと。
アルファルファ、ココナッツ残留物（coconut residue）、グアー、ローカストビーンガム、カロブビーンガム（carob bean gum）、カッサバ、コプラ、ダイズ類のようなヘミセルロース系物質は、食品及び飼料製品の共通の構成成分である。ダイズの誘導物は、実質的な比率のヒト消費用の豆腐の成分を含み、更に、例えば、ダイズ蛋白質の濃縮物は、イヌ及びネコ、スワン、魚、及び、ニワトリ用の多くの飼料に使用されている。ダイズのあら粉（meal）は、ニワトリの雛用の飼料の25％ほどを含む。ブロイラーのようなニワトリ用の飼料は、最も安い費用を基本として、多数の成分から処方される複雑な混合物である。この飼料は、非常に大量に必要である。その結果、その飼料成分のための高価な貯蔵施設が混合作業に必要である。この飼料成分を混合して、蛋白質、必須アミノ酸類、無機質（またはミネラル）類、ビタミン類、及び、カロリー（つまり、エネルギー源）の至適栄養混合物を提供する。主エネルギー源とは考えられてはいないものの、ダイズあら粉は、必須アミノ酸を有する好ましい濃縮された蛋白質源であることが見出されている。ダイズあら粉は、ブロイラーニワトリの必要エネルギーの約20％を供給する。
ダイズあら粉はエネルギーを産生する幾つかの炭水化物類及び油類を提供するものの、その総炭水化物含有量の約10％はガラクタン類及びペントサン類からなる。これらの炭水化物類は、単胃動物によってはさほど吸収されないため、この動物は更なる生化学的な酸化のための単糖類を得るほど迅速に炭水化物類を消化することができない。ダイズあら粉のエネルギー含量を増加させるための一つの方法は、ガラクタン類及びペントサン類を、単胃動物によりより簡単に代謝され得る低分子量のオリゴ糖類もしくは単糖類に低分子化することである。
直接給餌用微生物培養物が、今世紀初頭以来利用されている。消化妨害物質を調節するための栄養付加物としてのラクトバチリ（Lactobacilli）の利用は、最初に、E.Metchnikoff、PROLONGATION OF LIFE（G.P.Putnam′s Sons,1908年）により示唆された。それ以来、微生物は、食品類の栄養価を増加させるための試みにおいて多様な方法で利用されてきている。例えば、ラクトバチルス培養物の直接給餌法は、腸管内での乳酸の産生のために、体重及び飼料効率を増加させることが報告されている。D.P.Hutcheson、“Historical Aspects、"in DIRECT−FED MICROBIALS IN ANIMAL PRODUCTION（Nat′l Feed Ingredients Assoc.,1991年）。一般的には、栄養付加物としてのラクトバチルスの有益な効果は、動物により摂取された食料に直接作用するというその微生物の能力よりはむしろ、腸管を活性化させ、有害な微生物と効果的に拮抗し、かつ、乳酸を産生するというその微生物の能力による。
酵母及び真菌類は、1960年代初期以降、栄養付加物として同様に利用されている。酵母と真菌類は、食品の利用可能なエネルギー含量を増大させることができるある種の消化酵素類、未同定の成長因子類、及び、ビタミンＢ類を産生すると考えられている。これに関して、ある種のこぶ胃に存在する真菌類は、動物におけるセルロースの利用を高めることが示されている。Hutcheson（上掲）参照のこと。この結果は、反芻動物は典型的には、その腸における微生物作用によってその栄養物の主に全てを取得しているという事実により説明することができる。
それとは対照的に、ヒト及び単胃動物類は、腸の微生物プロセスを通してはかなりの量の栄養物を取得することがない。従って、それらは、食品及び飼料品類のマンナン含有性ヘミセルロース成分のようなある種の炭水化物を消化することができない。そのため、マンナン含有性ヘミセルロース成分を、単胃動物類により代謝されることができる低分子量の炭水化物類に変換させることにより、食品及び飼料品類のヘミセルロース成分の利用できるエネルギー含量を増大させる方法についての必要性が存在する。
発明の概要
従って、本発明の目的は、組成物が新規のヘミセルラーゼを含有するための消費されるときにエネルギー含量が増大するヘミセルラーゼ含有組成物を提供することである。
本発明の別の目的は、ヘミセルロース系炭水化物を含む食品もしくは飼料、及び、そのようなヘミセルラーゼを産生し、それによって、消費されるときにエネルギー含量の増大をもたらす微生物から本質的になる培養物を提供することである。
本発明の別の目的は、複雑な炭水化物類を含むが、それにもかかわらず、ヒトもしくは単胃動物により利用されることができる栄養物質を産生する方法を提供することである。
これら及び他の目的を達成するために、本発明の一態様に従って、（Ａ）栄養学的に単胃動物もしくはヒトに適する蛋白質、ビタミン、及びミネラル；（Ｂ）マンナン含有ヘミセルロースを含む炭水化物源；及び、（Ｃ）該マンナン含有ヘミセルロースの分解を触媒し、該分解を触媒する活性に関して約pH4.5から約pH11までの範囲のpHプロフィルを有する酵素、を含む消費可能組成物（consumable composition）を提供する。好ましい実施態様においては、この消費可能組成物はヒトの消費のためのものであり、つまり、その成分は、動物用飼料に対立するものとして、ヒトの食品のための適切な規制要件にかなうものである。それとは対照的に、他の好ましい実施態様においては、本組成物は単胃動物用のものであり、従って、動物用飼料に適用される規制要件にのみかなう必要がある。
本発明の他の態様に従い、成分（Ｃ）として、（１）pHが８−11の範囲であり、かつ（２）温度が少なくとも60℃であるという両方の条件下において、マンナン含有ヘミセルロースの分解を触媒する活性を示す酵素を含む、上述の成分を含む組成物が提供される。
本発明の更に別の態様に従い、ダイズあら粉と、ヘミセルロースの分解を触媒する活性に関して約pH4.5から約pH11までの範囲のpHプロフィルを有するバチルス（Bacillus）から本質的に構成される酵素成分とを含む、消費可能組成物を提供する。１つの好ましい実施態様においては、上述のpHプロフィルは、約pH7と約pH9の間にピークを有する。
本発明の更に別の態様に従い、（Ａ）栄養学に的単胃動物もしくはヒトに適する、蛋白質、ビタミン及びミネラル；（Ｂ）マンナン含有ヘミセルロースを含む炭水化物源；及び、（Ｃ）該マンナン含有ヘミセルロースの分解を触媒し、該分解を触媒する活性に関し、約pH4.5から約pH11までの範囲のpHプロフィルを有する酵素を産生する微生物から本質的に構成される培養物、を含む消費可能組成物を提供する。好ましい実施態様においては、成分（Ｃ）は、pHが８〜11の範囲であり、かつ、温度が少なくとも60℃であるという両条件下で、マンナン含有ヘミセルロースの分解を触媒する活性を有する酵素を産生する微生物から本質的になる培養物である。
本発明の更に他の態様に従い、ダイズあら粉と、ヘミセルロースの分解を触媒する活性に対して約pH4.5から約pH11の範囲のpHプロフィルを有する酵素を産生する微生物から本質的に構成される培養物とを含む、消費可能組成物を提供する。１つの好ましい実施態様においては、上述のpHプロフィルは、約pH7と約pH9との間にピークを有する。
本発明の更に別の態様に従い、（Ａ）栄養学的に単胃動物もしくはヒトに適する蛋白質、ビタミン及びミネラル；（Ｂ）マンナン含有ヘミセルロースを含む炭水化物源；並びに、（Ｃ）（ｉ）該マンナン含有ヘミセルロースの分解を触媒し、該分解を触媒する活性に関し約pH4.5から約pH11までの範囲のpHプロフィルを有する酵素を産生する微生物から本質的に構成される培養物、及び、（ii）該酵素を含む発酵ブロス、を含む消費可能組成物を提供する。好ましい実施態様においては、成分（Ｃ）は、（ｉ）pHが８〜11の範囲であり、かつ、温度が少なくとも60℃であるという両方の条件下で、マンナン含有ヘミセルロースの分解を触媒する活性を有する酵素を産生する微生物から本質的になる培養物、および、（ii）該酵素を含む発酵ブロスである。
本発明の更に別の態様に従い、ダイズあら粉と、（ｉ）ヘミセルロースの分解を触媒する活性に対して約pH4.5から約pH11の範囲のpHプロフィルを有する酵素を産生する微生物から本質的に構成される培養物、及び、（ii）該酵素、を含む発酵ブロスとを含む消費可能組成物を提供する。１つの好ましい実施態様においては、上述のpHプロフィルは、約pH7と約pH9との間にピークを有する。
本発明の更に他の態様に従い、（Ａ）栄養学的に単胃動物もしくはヒトに適する蛋白質、ビタミン、及びミネラルを含むと共に、更に、マンナン含有ヘミセルロースからなる炭水化物源を含む消費可能組成物を製造するステップ、及び、（Ｂ）単胃動物もしくはヒトによる該ヘミセルロースのマンナン含有部分の使用を可能にするために、マンナン含有ヘミセルロースの分解を触媒し、該分解を触媒する活性に関し約pH4.5から約pH11までの範囲のpHプロフィルを有する酵素を該組成物中に配合するステップ、を含む栄養増強法（nutritive method）を提供する。あるいは、ステップ（Ｂ）は、マンナン含有ヘミセルロースの分解を触媒し、その活性について上述のpHプロフィルを有し、かつ、先に記載したように、単胃動物もしくはヒトによるヘミセルロースのマンナン含有部分の使用を可能にする酵素を産生する微生物から本質的に構成される培養物を該組成物中に配合することを包含する。これに代わる更に別の方法においては、ステップ（Ｂ）は、先に記載したように、（ｉ）培養物及び（ii）酵素を含む発酵ブロスを、組成物中に配合することを含む。好ましい実施態様においては、上記の炭水化物源は、ダイズ、アルファルファ、グアー、ローカストビーンガム、カロブビーンガム、カッサバ、コプラ、及びココナッツ残留物からなる群より選択される植物性物質であり、より好ましくは、ダイズ及びアルファルファである。他の好ましい実施態様においては、ステップ（Ｂ）は、該酵素及び該組成物を含む混合物を製造し、その後、その混合物をペレット化することを含む。更に他の好ましい実施態様においては、ステップ（Ｂ）は、該組成物、及び、先に記載したような酵素を産生する微生物から本質的になる培養物、を含む混合物を製造することを含む。更に他の好ましい実施態様においては、ステツプ（Ｂ）は、該組成物、及び、先に記載したような（ｉ）培養物および（ii）酵素を含む発酵ブロス、を含む混合物を製造することを含む。
本発明の他の目的、特徴、及び利点は、以下に示す詳細な説明から明らかになろう。しかしながら、詳細な説明及び具体的な実施例は、本発明の思想及び範囲内での多様な変更及び変形が、この詳細な説明から、当業者には明らかであろうという単なる理由から、本発明の好ましい実施態様を示しながら説明されている。
【図面の簡単な説明】
本発明の実施態様を説明する図面においては、
図１は、本発明の範囲内のヘミセルラーゼの活性を、それぞれ、60℃、75℃、及び90℃で（pH9.0）、時間に対してプロットしたグラフである。
図２は、本発明のヘミセルラーゼの酵素活性のpHプロフィルを、公知の市販酵素のものと比較したグラフである。
図３は、時間量に対する粘度の減少を示す代表的データであり、希釈した酵素をグアー溶液と共にインキュベートした。
図４は、対照食餌で生後21日間養育したニワトリの平均体重を、ヘミセルロース含有動物飼料の食餌で養育したニワトリの平均体重に対して示したデータである。両方の集団について、増加した体重の量に対する飼料消費の量の比率（飼料／体重増加（feed/gain））も示している。
図５は、対照食餌で生後46日間養育したニワトリの平均体重を、ヘミセルロース含有動物飼料の食餌で養育したニワトリの平均体重に対して示したデータである。両方の集団について、増加した体重の量に対する飼料消費の量の比率（飼料／体重増加）も示している。
好ましい実施態様の詳細な説明
食品物質中のヘミセルロースの分解を触媒し、その結果、その物質の有効エネルギー含量（available energy content）を増加させることが可能なヘミセルラーゼが、該酵素を産生する微生物から得ることができることを発見した。本発明の範囲内のヘミセルラーゼを産生する能力を有する微生物は、土地に固有の微小植物群（microflora）が繁殖することができる限定されたサブセクションを含む土壌から、従来の方法により単離することができる。ヘミセルラーゼ産生微生物は、バチルス・スブチリス（B.subtilis）もしくはバチルス・ブレビス（B.brevis）のような他の微生物を、このような土地固有の土壌微小植物群から標準的な組換えDNA技術によって得られるヘミセルラーゼコーディングDNAで形質転換することにより製造することもできる。
本発明のヘミセルラーゼを産生する微生物から本質的に構成される培養物において、当業界で周知の単離技術により、商業的に意味をなす量の該酵素を得ることができる。この説明において、ヘミセルラーゼ産生微生物のような「特定の種類の微生物から本質的に構成される培養物」とは、その培養物の顕著な機能特性がそれらの微生物により決定される程度に、その種類の微生物から主に構成される培養物である。しかしながら、他の種類の微生物は、例えば、ヘミセルラーゼ産生微生物から本質的に構成される培養物中に、その培養物によるヘミセルラーゼ産生を明らかに妨害しない限り、存在することができる。
本発明の範囲に含まれるヘミセルラーゼを産生する微生物を、広範な地理的区域から採取した土壌試料から単離することができる。この土壌試料は主に、上部２インチの土壌から採取され、更に、選択的な集積培地中で培養される。
特定の希望する特性を有する微生物を選択的に単離するための技術は当業界で良く知られている。複製及び増殖が希望する酵素を産生する能力に依存する条件に、このような微生物を潜在的に含む試料を暴露させることにより、特定の酵素を産生する能力について微生物を選択することができる。広く用いられている１つの選択法は、多大で多様な微生物集団を含む試料を、単一の炭素源からなる培地に暴露させることである。METODS IN ENZYMOLOGY、Vol.160:180−86（1988）を参照のこと。その炭素源を分解することができる酵素を産生することができるそれらの微生物のみがこの方法により回収されるだろう。この種の選択的培養技術により、試料採取した生息地の通常の植物群を含む無数の他の微生物から、希望する酵素を産生する微生物が効果的に選択される。
本発明の好ましい実施態様においては、土壌試料のアリコートを、ヘミセルロースが単一の炭素源として働くアルカリ性培養培地中に接種する。同一培地中で増殖した二次培養物の希釈物を、単一の炭素源としてヘミセルロースをも含む固体培地上にプレーティングする。形態学的に異なるコロニーを単離して、その後、ヘミセルラーゼ活性についてスクリーニングする。本発明の特に好ましい実施態様においては、グアーが単一の炭素源である、９〜9.5のpH範囲の選択的富栄養ブロスを土壌試料と共に接種し、37℃でインキュベートし、好気的に振盪する。インキュベーション後、選択的集積培地を使用して初期培養物の更なる希釈を行う。数回の継代後、最も希釈したブロス培養物の一連の希釈物を通常の食塩水中で調製し、グアーを単一の炭素源として含む固体培地上にプレーティングする。34℃で５〜７日間インキュベーションした後、形態学的に異なるコロニーをその固体培地から単離し、更に、ヘミセルラーゼの活性についてスクリーニングする。
高められたpHで、単一の炭素源としてヘミセルロースを利用する微生物についての初期選択により、全ての土壌微生物の有限の画分が回収される。典型的には、約40％の単離物は、本発明のヘミセルラーゼを産生する能力を特徴とする。この画分の特に好ましいサブグループは、グラム陽性バチルス（Bacillus）属の種を含む。
この好ましいサブグループの例は、CMG1240と表示されるバチルス・レンティス（B.lentis）株であり、この一般的な性質を下記表Ｉにまとめてある。CMG1240株は、ブダペスト条約に従い、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ロックビル、メリーランド州）に、受託番号第55045号として寄託されてある。好ましいサブグループの任意の微生物株としての、CMG1240株の要所となる性質は、本発明に記載の用途に適するヘミセルラーゼを培養培地中に産生する能力である。
セルラーゼ／ヘミセルラーゼ活性を測定するための従来の方法は、例えば、METHODS IN ENZYMOLOGY、Vol.160:180〜86及び368〜76（1988）に記載されている。これらの方法は、一般的に、予め決定してある量の基質を、予め決定してある量の粗製のまたは精製された酵素調製物に暴露させることを伴う。基質の、希望する最終生成物への変換率を、pH及び温度の特定の条件下で測定する。粗製の酵素調製物は、適切な培地中で微生物を培養し、その後、沈殿もしくは限外濾過のような従来の方法を使用して、細胞を囲んでいるブロス内に蓄積している酵素を濃縮することにより製造することができる。得られる酵素調製物は、それぞれ要所となる、不溶性基質の重量損失、多糖類懸濁液の濁度変化、還元性末端基の増加、β−マンナン類のような多糖類の粘性の減少、比色測定、多糖類−アガー中でのクリアランスゾーンの測定、もしくは、ポーラログラフィー等を含む、当業界で公知の方法により、比活性についてアッセイすることができる。
表Ｉ
a.形態学：
（１）バチルス形状：（0.8×1.7〜2.3）μｍ。
（２）単一及び対をなすものが主に生じる。
（３）内生胞子を形成することができる。
（４）グラム陽性（グラム可変性もしくはグラム陰性のものも出現する）。
b.増殖条件：
（１）トリプシン処理のダイズ−アガープレート培養：コロニーは不規則で、凸状、滑らか、波状、酪酸性（butyrous）、不透明、及び直径2mm（72時間、37℃）である。
c.生物学的特性：
（１）好気性。
（２）カタラーゼ陽性。
（３）オキシダーゼ陰性。
（４）非運動性。
（５）増殖温度:30〜50℃、最大増殖率は41℃において生じる。
（６）増殖pH（グルコース−無機塩基本培地中で、34℃で350rpmにおいて10時間培養した）:7.0〜8.5、最大増殖率はpH7.5において生じる。
（７）カゼイン及びゼラチン分解：陰性。
（８）デンプン加水分解：陽性。
（９）１〜５％NaCl中での増殖：陽性。
（10）利用された炭素源:D−グルコース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−フルクトース、Ｄ−キシロース、乳糖、マルトース、ショ糖、α−シクロデキストリン、デキストリン、グリコーゲン、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｌ−アラビノース、セロビオース、ゲンチオビオース、ラクツロース、マンニトール、Ｄ−マンノース、Ｄ−メリビオース、Ｄ−トレハロース、ツラノース、α−ケトブチル酸、ウリジン、及び、ｍ−イノシトールを含む。
（11）硫化水素生成：陰性。
（12）インドール生成：陰性。
（13）クエン酸の利用：陰性。
（14）ウレアーゼ：陰性。
（15）Voges−Proskauer:陰性。
（16）フェニルアラニンデアミナーゼ：陰性。
（17）リシンデカルボキシラーゼ：陰性。
（18）オルニチンデカルボキシラーゼ：陰性。
（19）アルギニンデヒドロラーゼ：陰性。
本発明に従い、ヘミセルロース含有ブロス培地中で、単離した微生物のコロニーを培養することにより、土壌単離物をヘミセルラーゼ産生についてスクリーニングする。インキュベーション後、そのブロス培地を遠心し、得られる上清を濾過して細胞を除去し、ヘミセルロースの粗製調製物を得る。この酵素を、好ましいヘミセルロースのアルカリ性で粘性がある調製物に添加して、その基質の液化の度合いの経時変化を測定する。
土壌単離物を、マンナン含有ヘミセルロースが単一の炭素源であるブロス培地中で培養することが好ましい。インキュベーション後、そのブロス培地を遠心し、得られる上清を濾過する。得られるこの粗製酵素調製物を、８〜11の範囲内のpHで、マンナン含有ヘミセルロースの孔粘性を有する調製物に添加する。該酵素の相対活性を、ヘミセルロースを液化させるのに必要な時間量により測定する。
土壌単離物を、先に記載したように、グアーが単一の炭素源である選択的集積培地中で培養することが特に好ましい。インキュベーション後、この培養物を遠心し、得られる上清を濾過して粗製酵素を回収する。この粗製酵素を、その後、架橋結合させたグアー調製物を含む管の中に、９〜9.5の範囲内のpHで、この調製物の粘性を上昇させるpH金属イオン類と共に導入する。39〜40℃で少なくとも１時間インキュベーションした後、従来の粘度測定法を使用して、酵素／グアー溶液の粘性を決定することにより、酵素活性を測定する。例えば、Biochem.Biophys.Acta 139:238及び248（1967）;Eur.J.Biochem.51:207（1975）を参照のこと。
先に記載したようにして取得されるヘミセルラーゼは、一般的に、最小値の約pH4.5と約pH11のそれぞれの間の、幾分6.5pH単位を越える範囲にわたるpHプロフィル−−特定の酵素活性とpHとの間の関係により定義される曲線−−により特徴付けられる活性を示す。このようなpHプロフィルは、例えば、約pH8以上では事実上不活性である既知のバチルスマンナナーゼについての対応するプロフィルと比較する場合、かなり異なる。AraujoとWard、J.,App.Bacteriol.、68:253〜61（1990）を参照のこと。
本発明において使用されるヘミセルラーゼは、約pH9から約pH7の間の範囲内にピーク（つまり、活性が最大になる該曲線の一部分）を有するpHプロフィルを有することが好ましい。また、この酵素が、高いアルカリ性及び高められた温度の両方により特徴付けられる条件下において、顕著な生物学的活性を示すことが好ましい。このような適切な酵素は、例えば、pHが８〜11の範囲内であり、かつ、温度が60℃もしくはそれより高い場合に、顕著な活性を示す。
本発明に記載の用途に特に好ましいヘミセルラーゼは、以下に示す特性を有するエンド−β−Ｄ−マンナナーゼである：
（１）活性：好ましい酵素は、ガラクトマンナン、グルコマンナン、及び、マンナンのようなマンナン炭水化物類を含有するヘミセルロース系物質に作用する。この関連の活性は、以下に示す方法で測定することができる。1.0％グアーを含む水性懸濁液を基質として使用し、2mLの2Mグリシンを16.0mLの基質に添加する。この混合物を完全に混ぜ合わせ、その後、38℃に予備加熱する。酵素をその基質に添加し、良く混ぜ合わせ、その後、ストップウオッチを用いてピペットの仕込み−排出時間を測定するような簡単な方法、もしくは、ブルックフィールド（Brookfield）もしくはファン（Fann）の粘度計のようなより複雑な装置を使用して、酵素／グアー溶液の粘度を測定する。マイルズ製B1500のような、既知の活性を有する、市販のヘミセルラーゼ酵素を使用して、標準曲線を作成する。市販のヘミセルラーゼのグラム数もしくは単位数を粘度を変化させるのに必要な時間に対してプロットし、新規のヘミセルラーゼを市販品のものと比較する。
（２）基質特異性：酵素は、Ｄ−ガラクトースとＤ−マンノースとがβ−1,4結合したポリマーであるグアーガム、及びローカストビーンガム、のような比較的単純な炭水化物のポリマー類、並びに、例えば、ダイズ及びアルファルファからの、より複雑なマンナン含有炭水化物類を分解する。他の適切な基質には、マンナン含有ココナッツ残留物（coconut residue）、カロブビーンガム、カッサバ、コプラ、及び、グアーを化学的に改質したものなどがある。
（３）至適pH：この酵素の至適pHは、約7.0もしくはややそれを上回り、例えば、7.1から7.5の範囲である。この酵素は、約4.5から11の範囲のpHで安定である（図２参照）。
（４）至適温度：酵素活性に対する至適温度は40℃であるが、酵素活性は、20℃から90℃の範囲の温度で観察される。図１に示すように、この酵素は、60℃から90℃の範囲の温度で顕著な活性を示す。
（５）温度及びpHにより不活性化:pH9.0においては、60℃で5.5時間後、75℃で45分後、及び、90℃で15分後に、この酵素は、最大活性の50％を保持している（図１参照）。
（６）分子量：均質になるまで精製した後、この酵素は、SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により測定したところによると、約32,000の分子量を有している。培養ブロスから粗製酵素調製物を得るために、細胞及び細胞破砕物を最初に0.1ミクロンのフィルターで除去する。この酵素を、その後、10,000分子量カットオフの膜で濃縮する。しかしながら、一度酵素を濃縮すると、酵素の大部分がその膜を通過することができる。
この最終透過物中の酵素は、5,000分子量カットオフ膜で濃縮するか、あるいは、３倍容量のアセトンで沈殿させることができる。沈殿物を遠心した後、上清をサイフォンを利用して除去し、ペレットを50mMのリン酸バッファー中に再懸濁させる。この濃縮物を10mMのリン酸バッファー（pH7.0）に対して透析し、その後、DEAE−セファセルカラム上に載置する。この酵素を、50mMのリン酸バッファー（pH7.0）中における、０〜1.25Mの範囲の上昇イオン強度の塩化ナトリウム勾配溶液で溶出する。画分を集め、酵素活性についてテストする。最大活性を示す画分をプールし、SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を使用して分析し、蛋白質分子量標準と比較する。
本発明に従い、商業的に有用な量のヘミセルラーゼを、従来の発酵技術を用いて前述のヘミセルラーゼ産生微生物を培養することにより製造することができる。この関連において、「発酵」は、有用な生成物が微生物が作用する基質から得られる任意の調節された微生物作用を広く意味するために使用される。本発明に従い、発酵は、攪拌タンク反応器内で行うことができる。この種の反応器は、主に、撹拌機、バッフル、熱交換コイル、並びに、温度、空気流、圧力、pH、及び泡立ちのための自動制御を含む密閉された円筒型タンクである。この種の発酵容器には、必須栄養物、及び、グアーガムのようなヘミセルラーゼ誘導物（inducer）が仕込まれる。滅菌後、反応容器に、先に記載したようにヘミセルラーゼを産生する能力について予め選択されている微生物類から本質的に構成される培養物を接種する。
バッチ培養の非稼働時間を排除した連続培養は、発酵生産率を増加させることができる。しかし、大規模連続培養において生産率を保持することは、時々困難である。従って、本発明の細菌を利用するバッチ発酵が好ましい。
本発明の好ましい実施態様においては、バチルス・レンティス（B.lentis）CMG1240のようなグラム陽性バチルス株を、商業的に有用な量の酵素を生産するのに利用する。工業用等級の栄養物類、グリセロール（炭素源）、及び、グアーのようなマンナン含有ヘミセルロースからなる培地を仕込んだ発酵容器に、先に記載したようなグラム陽性バチルス株から主になる培養物を接種する。この発酵容器を、約35℃に（500〜1,000rpm撹拌）、約12時間保持する。グアーのようなヘミセルロースを増殖期の間、発酵容器に添加して、更に酵素産生を誘導する。この発酵物を約１から7.5時間後に収集して、更にその後、例えば、粘度測定法により、酵素活性を測定する。
発酵産物の酵素活性は、発酵ブロスの一部を遠心し、更に、得られる上清をテストすることによりアッセイする。上清の（もしくは、その希釈物）のアリコートをグアー溶液に添加し、一定孔径のピペットから予め決定した容量を排出するのに必要な時間をルーチンに記録することにより、酵素／グアー溶液の粘度低下を測定する［先に列挙した、好ましいヘミセルラーゼの特性における項目（１）を参照のこと］。
0.5ミクロンのフィルターを通す濾過で、細胞を除去し、その後、5,000、10,000、もしくは50,000分子量カットオフ限外濾過膜を使用する限外濾過により、発酵ブロスから発酵を回収する。この濃縮物を、約４℃で３倍量のアセトンと混ぜ合わせて酵素を沈殿させる。この沈殿物を約24時間放置して沈降させた後、上清をサイフォンにより除去する。次いで、沈殿物を約４℃で遠心し、得られるペレットをリン酸バッファー中に再懸濁させてペーストを形成する。
本発明の範囲内に含まれるヘミセルラーゼを製造する特に好ましい方法においては、バチルス・レンティスCMG1240のようなグラム陽性バチルス株を利用して商業的に有用な量の酵素を生産する。例えば、グリセロール、イースト抽出物、必要なミネラル、及び、微量元素類からなる培地を仕込んだ２機の14リットル発酵容器に、先に記載したようなグラム陽性バチルス株から主になる培養物を接種する。600nmでの光学密度（OD）が約2.0に達するまで、この発酵容器を36〜37℃で、＞40％の溶存酸素濃度、及び、300〜1000rpmの撹拌速度にして維持する。
ODが2.0に達すると、温度を29〜30℃に下げ、インキュベーションを、ODが14に達するまで更に約13.5時間継続し、そのODになった時点で、温度を10℃に下げる。
その後、先に記載した培地ではあるが実質的にはより濃いイースト抽出物含量を含む培地を仕込んだ250リットルの発酵容器に、２機の14リットル発酵容器の内容物を接種する。300と500rpmとの間の撹拌速度で、溶存酸素を約70％の飽和状態に保持する。温度は28℃に保持し、pHは、8.0から8.45の範囲に保持する。泡立ちは、例えば、シリコーン泡防止剤で制御することができる。約15.5時間のインキュベーション後、ODが14に達し、温度を20℃に下げる。インキュベーションは、一般的には、ODが20に達するまで、約25時間継続する。
グリセロール、イースト抽出物、ダイズ粉、グアーガム、及び、必要な栄養物、及び、微量元素類からなる培地を仕込んだ1500リットルの発酵容器に、先に記載したように、250リットル発酵容器の内容物を接種する。温度を28℃に維持し、pHを約8.11〜8.44の範囲に維持する。240〜288rpmの撹拌速度で、溶存酸素濃度を約25％以上の飽和濃度に維持する。発酵容器内の空気流は、１分当たり600〜1000リットルに保持し、かつ、タンクの空気圧力を3psiと11psiとの間に保つことが好ましい。また、泡立ちをシリコーン消泡剤で制御することができる。
接種後約4.5時間で、ODが約5.6に達したとき、グアーガムを発酵容器に添加する。つまり、１リットル当たり総量約13.8グラムが添加されるまで、約９時間にわたり毎時間グアーガムの大体１から２キログラムを添加することができる。接種後10から13時間目に、１リットル当たり総量約３グラムが添加されるまで、グリセロールをゆっくりと発酵容器内に添加する。発酵は、ODが約23に達した時点で、接種後約14時間目に停止し、酵素活性を測定すると、１リットル当たり約2.67×107単位となった。
この酵素は、ウエストファリア（westphalia）製連続遠心機もしくは類似の装置を通すことによる細胞塊及び培地固形物の除去により回収される。残存している固形物及び高分子量物質を、例えば、0.1ミクロンの中空系繊維フィルターを通す濾過により除去する。その後、この粗製酵素を、50,000分子量カットオフ中空系繊維限外濾過膜を使用して濃縮する。この濃縮物をその後、滅菌した0.1ミクロンのフィルターにより濾過し、更にその後、粗製酵素を塩析する目的で、１リットル当たり550グラムの濃度で硫酸アンモニウム中に懸濁させる。この酵素沈殿物を、その後、５℃、8,000rpmでの遠心により回収する。このような方法により、この沈殿物の酵素活性を測定すると、１キログラム当たり一般的に、約5.0×108単位となった。
本発明の範囲内のヘミセルラーゼの製造の代替方法においては、ヘミセルラーゼをコードするDNAを単離し、これを用いて、既知の方法により、この酵素を組換え宿主により商業的に有用な量で産生するような適切な宿主生物を形質転換させることができる。ヘミセルラーゼをコードするDNAは、本発明に記載のヘミセルラーゼを発現する微生物から作製された核酸ライブラリーをスクリーニングすることにより単離することができる。例えば、Ausubelら、CURRENT PROTOCOLS IN MULECULAR BIOLOGY、セクション５及び６（John Wiley and Sons、New York）（1987年、1990年）
（「Ausubel」）を参照のこと。このようなライブラリーは、例えば、本発明の範囲内のヘミセルラーゼのＮ末端部分をコーリゴヌクレオチドプローブによりスクリーニングされる。このようなＮ末端部分の例としては、後述の実施例14に記載してあるような、アミノ酸配列、Ala−Ser−Gly−Phe−Tyr−Val−Xxx−Gly−Thr−Ile−Leu−Xxx−Asp−Ser−Thr−Gly−Asn−Pro−Phe−Lys−Ile−Xxx−Gly−Xxx−Asn［Xxxは、未決定アミノ酸を表す］である。Ausubelのセクション６を参照のこと。
それに代わるものとして、例えば先に記載したＮ末端配列に基づき、本発明のヘミセルラーゼをコードするポリヌクレオチドを単離するために有用な他のプローブを作製するための鋳型としてのプローブを用いて単離する場合、本発明のヘミセルラーゼの内在性コーディング配列を含むかあるいはそれに隣接する他の部分を使用することができる。このようなプローブは、先に記載したようなゲノムもしくはcDNAのライブラリーをスクリーニングするための公知の方法（先に引用したAusubelを参照のこと）、あるいは、本発明のヘミセルラーゼをコードする単離したRNAから作製されるcDNAを増幅させるのに用いるためのポリメラーゼ連鎖反応（PCR）プローブを合成するための公知の方法で使用することができる。このようなcDNAを、その後、適切な発現ベクター内にクローン化し、宿主生物を形質転換させるのに使用することができる。Ausubelのセクション15.4を参照のこと。
これに関する適切なポリヌクレオチドは、以下に記載するように、コドン使用、翻訳の開始、及び、本発明の範囲内の商業的に有用なヘミセルラーゼの回収可能な量の発現に関して、選択宿主に対して至適化される、所望のアミノ酸配列に対応するヌクレオチド配列を含むのが好ましい。また、このようなポリヌクレオチド分子で選択宿主生物を形質転換させるために選択されたベクターは、該ポリペプチドをコードする配列の効果的な保持及び転写を可能にすべきである。このようなベクターは、簡単に、市販の供給源から手に入れることができるか、あるいは、そこから誘導することができ、かつ、本発明のヘミセルラーゼを発現させるために使用される特別な宿主細胞に適合している。本発明に使用するのに適するベクターの例については、Ausubelのセクション２〜４を参照のこと。
本発明のヘミセルラーゼを発現させるのに適する宿主細胞には、原核生物もしくは真核生物細胞があり、それらは例えば、細菌細胞、藻類細胞、イースト細胞、昆虫細胞、哺乳類細胞、及びヒト細胞である。従って、本発明に適する宿主細胞には、アエロモナス（Aeromonas）、アスペルギルス（Aspergillus）、バチルス（Bacillus）、エシェリシア（Escherichia）、クルイベロマイセス（Kluyveromyces）、ピキア（Pichia）、ロドコッカス（Rhodococcus）、サッカロマイセス（Saccharomyces）、及びストレプトマイセス（Streptomyces）がある。この適切な宿主微生物類のより具体的な例は、細菌である大腸菌（E.coli）、バチルス・スブチリス（B.subutilis）、バチルス・ブレビス（B.brevis）（J.Bacteriol.172:1312−20）、及び、バチルス・レンチス；遺伝子型trp1 gal1 ade1 his2を有するイーストS.セレビシアエ（S.cerevisiae）株X2181−1B（イースト・ジェネティック・ストック・センター、バークレー、カルフォルニア州から入手できる）；遺伝子型his2 ade1 trp1 met14 ura3を有するATCC52683株（アメリカン・タイプタメルチャー・コレクション、ロックビル、メリーランド州から入手できる）；及び、遺伝子型his1 trp1を有するATCC46183株（これもアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションから入手できる）である。本発明のヘミセルラーゼをコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞は、回収可能な、もしくは、商業的に有用な量の本発明のヘミセルラーゼの発現を提供する条件下において増殖することができる。例えば、Ausubelのセクション１及び13を参照のこと。
ダイズのような植物性物質の多数の供給源は、エネルギー含有蛋白質及び炭水化物に富んでおり、かつ、動物用飼料の成分としてしばしば利用される。ダイズはまた、ヒトの消費のための食品の成分としても広く使用されている。ガラクタン類は、市販のダイズ製品の総炭水化物含量の主要成分であるが、しかし、それらの炭水化物類は、簡単に消化されないために吸収されないという理由により、単胃動物用飼料の成分として使用される場合には、ダイズあら粉の有効エネルギー含量にさほど寄与するわけではない。それらのエネルギー含量を活用するためには、ガラクタン類は、単胃動物及びヒトにより吸収かつ代謝されることができるより小さい分子量の炭水化物類へ低分子化させる必要がある。
本発明に従い、上述の性質を有するヘミセルラーゼを、食品及び動物用の飼料品のヘミセルロース系成分中に存在するガラクタン類及び他のマンナン炭水化物類特にダイズからの複合炭水化物類を含むもの、を分解させるのに使用することができる。本発明の消費可能な組成物中に含まれる酵素成分は、好ましくは、上述したようなヘミセルラーゼ、特にバチルスヘミセルラーゼから本質的に構成されるべきである。これに関して、「本質的に構成される」とは、酵素成分が、主に前述のヘミセルラーゼにより決定されるヘミセルロース分解活性を示すことを意味する。しかしながら、酵素成分のヘミセルロース分解活性を甚だしく妨害しない限り、恐らくは他の活性を有する他の酵素が存在してもよい。
好ましい実施態様においては、本発明のヘミセルラーゼの有効量を、ダイズあら粉の一部分に添加し、乾燥させる。得られる組成物を挽いて微粉末にし、その後、例えば、トウモロコシ及び他の栄養物からなる乾燥動物飼料と混合する。
この種の混合物は、従来のヘミセルラーゼ類を不活性化させる条件、特に、熱及びpHの条件下にで加工することができる。従って、前述のダイズをベースにした組成物を、圧縮ミルを通して処理して、予め決定されている比率で、ヘミセルラーゼ、ダイズあら粉、及び、他の動物飼料用成分を含む動物飼料のペレットを形成することができる。ヘミセルラーゼ含有動物飼料の食餌で養育する場合、ニワトリは平均して、ヘミセルラーゼを含まない同一の食餌で養育したニワトリよりも、摂取した飼料１ポンド当たりの体重が増加する。
本発明の他の態様に従い、本発明の範囲内のヘミセルラーゼを産生する微生物から本質的に構成される培養物を、一旦摂取されると微生物が本発明の範囲内のヘミセルラーゼを産生するように、適切な消化管を有するブタのような単胃動物類に対して直接給餌することができる。このような培養物を、飼料品のヘミセルロース成分類中に存在するガラクタン類及び他のマンナン炭水化物類、特にダイズからの複合炭水化物を含むもの、の分解を促進する目的で、飼料品と混合して上述の動物に直接給餌することができる。これに関して、「本質的に構成される」とは、その培養物成分が、本発明の範囲内のヘミセルラーゼを産生する微生物から主としてなることを意味する。しかしながら、この培養物成分のヘミセルラーゼ産生活性を甚だしく妨害しないかぎり、他の微生物が存在してもよい。本発明の消費可能組成物中に含まれる培養物成分は、好ましくは、先に記載したようなヘミセルラーゼ、特にバチルスヘミセルラーゼから本質的に構成されるべきである。好ましい実施態様においては、本発明の微生物から本質的に構成される培養物の有効量をダイズあら粉の一部に添加し、更に、乾燥させる。得られた組成物を挽いて微粉末にし、その後、例えば、トウモロコシ及び他の栄養物からなる乾燥動物飼料と混合することができる。この組成物を、その後、圧縮ミルを通して処理して、予め決められた比率で、本発明の微生物の培養物、ダイズあら粉、及び、他の動物飼料成分を含む動物用飼料のペレットを形成することができる。
あるいは、上述の培養物のみからなる調製物を製造し、そのような動物に直接給餌することができる。このような調製物は、本発明の範囲内の生きている微生物からなる濃縮ペーストの有効量からなる。この調製物はまた、そのような微生物の凍結乾燥した培養物の有効量からなる。
本発明の更に他の態様に従い、本発明の範囲内のヘミセルラーゼを産生する微生物の培養物を含む発酵ブロスを、先に記載したようなガラクタン類及び他のマンナン炭水化物類の分解を促進させる目的で、飼料品と混合して単胃動物類に直接給餌する。本発明の消費可能組成物中に含まれる発酵ブロス成分が、先に記載したようなヘミセルラーゼ、特にバチルスヘミセルラーゼを産生する微生物の培養物、及び、本発明の範囲内のこのようなヘミセルラーゼの有効量を含むことが好ましい。これに関して、発酵ブロスは、上述の培養物及びそのような培養物により産生される酵素に加えて、本発明の酵素を産生する微生物を培養するのに適する栄養物類を含む。
好ましい実施態様においては、このような発酵ブロスの有効量を噴霧乾燥させて、他の飼料成分類に添加する乾燥粉末を製造する。あるいは、他の好ましい実施態様においては、先に記載したような発酵ブロスを、ダイズあら粉のような飼料成分類の一つと直接混合し、乾燥させ、更にその後、他の成分類と混合する。更に別の実施態様においては、このような発酵ブロスを、完全飼料と直接混合する。特に好ましい実施態様においては、発酵ブロスを乾燥して濃縮物を形成し、これを飼料用ミルに輸送し、別の完全飼料混合物と配合される。このような飼料組成物を、その後、圧縮ミルを通して、予め決められた比率で、微生物の培養物及び本発明のヘミセルラーゼの有効量からなる発酵ブロス、ダイズあら粉、及び他の動物飼料成分を含む動物飼料のペレットを形成することができる。
本発明を、以下に示す例示的な実施例を参照することにより、以下に更に記載する。これらの実施例においては、以下に示す培地を使用した：
選択的集積ブロス（量／リットル）
10.0g グアーガム
5.0g （NH4）2SO4
pH9.5
選択的集積アガー（量／リットル）
2.0g グアーガム
1.0g Na2HPO4
3.0g （NH4）2SO4
0.2g NaCl
0.2g MgSO4・7H2O
50.0mg CaCl2・2H2O
1.0mL 微量元素溶液Ｉ（以下を参照のこと）
15.0g アガー ノーブル（Agar Noble）
50.0mM トリスバッファー（pH9.0）
1.0mL ビタミン溶液（以下を参照のこと）
微量元素溶液Ｉ（量／リットル）
100.0mg EDTA
230.0mg ZnSO4・7H2O
180.0mg MnSO4・H2O
60.0mg H3BO3
100.0mg CuSO4・5H2O
40.0mg Na2MoO4・2H2O
40.0mg CoCl2・6H2O
70.0mg KI
40.0mg FeSO4・7H2O
0.4mg NiCl/6H2O
8.0ML 0.1M H2SO4
ビタミン溶液（量／リットル）
1.0g ビタミンB12
1.0g リボフラビン、B2
1.0g ピリドキシン、B6
1.0g Ｄ−ビオチン
1.0g 塩酸チアミン
1.0g ニコチン酸
1.0g Ｄ−Ca−パントテン酸
シードブロス（量／リットル）
7.5g グリセロール
10.0g イースト抽出物
2.5g トウモロコシ浸漬液（Corn Steep Liquor）
1.0g KH2PO4
2.0g （NH4）2SO4
0.5g MgSO4・7H2O
1.0mL 微量元素溶液II（以下を参照のこと）
pH7.0〜7.5
発酵ブロス（量／リットル）
20.0g グリセロール
20.0g イースト抽出物
5.0g トウモロコシ浸漬液
2.0g KH2PO4
4.0g （NH4）2SO4
1.0g MgSO4・7H2O
2.0mL 微量元素溶液II
pH8.5
微量元素溶液II（量／リットル）
20.0g FeSO4・7H2O
20.0g FeCl3・6H2O
0.5g MnSO4・H2O
50.0mg CoSO4・7H2O
10.0mg CuSO4・5H2O
20.0g CaCl2・2H2O
50.0mg H3BO3
100.0mg ZnSO4・7H2O
100.0mg Na2MoO4・2H2O
振盪フラスコブロス
20.0g ソイトーン（Soytone）（ディフコ社）
4.0g KH2PO4
4.0g （NH4）2SO4
1.0g MgSO4・7H2O
1× 微量元素溶液III
pH8.0
14リットル発酵容器用ブロス（量／リットル）
30.0g グリセロール
10.0g イースト抽出物
4.0g KH2PO4
4.0g （NH4）2SO4
1.0g MgSO4・7H2O
2× 微量元素溶液III
pH8.5
注：このイースト抽出物は、他の成分類とは別にして滅菌する。蒸気滅菌後、これらの成分類を配合する。
250リットル発酵容器用ブロス
30.0g グリセロール
40.0g イースト抽出物
4.0g KH2PO4
4.0g （NH4）2SO4
1.0g MgSO4・7H2O
2× 微量元素溶液III
pH8.5
注：このイースト抽出物は、他の成分類とは別にして滅菌する。蒸気滅菌後、これらの成分類を配合する。
1500リットル発酵容器用ブロス
8.90g グリセロール
6.32g イースト抽出物（Ardamine YEP）
5.06g KH2PO4
5.06g （NH4）2SO4
1.26g MgSO4・7H2O
37.90g ダイズ粉（Cargill 200/70）
2.35g グアーガム（Sigma）
2× 微量元素溶液III
pH8.33
注:pHを蒸気滅菌の前に、硫酸で6.0に調整する。蒸気滅菌後、アンモニアの添加によりpHを8.33に調整し、8.11と8.44との間の範囲に保持する。
1000×微量元素溶液III（量／リットル）
0.2g ZnSO4・7H2O
0.5g MnSO4・H2O
0.1g H3BO3
0.1g CuSO4・5H2O
0.1g Na2MoO4.2H2O
0.05g CoCl2・7H2O
0.1g KI
1.0g FeSO4・7H2O
0.001g NiCl/6H2O
0.008ml H2SO4（0.1M）
1.0g FeCl3
1.0g NaCl
2.0g CaCl2・2H2O
実施例１：土壌からのヘミセルラーゼ産生性微生物の単離
熱帯雨林及び温和な庭園の両方から採取した土壌試料を、10％w/vの選択集積ブロスに添加した。この培養物を、37℃で４日間、調節装置を付けたエルレンマイヤーの振盪フラスコ内で振盪した。初期培養物の４種類の希釈物［1:10、1:20、1:800、及び、1:50,000］を、新しい選択的集積ブロスで作製し、37℃で４日間インキュベートした。1:50,000の希釈物を使用して、0.85％のNaCl中における一連の希釈物（10-1から10-8）を作成し、これを、選択的集積アガロース上に塗布し、34℃で５〜７日間インキュベートした。インキュベーション後、単離したコロニーを塗布した培養物から選択し、純度を保つために適切なアガー培地上に３回連続して筋を付けるように塗り付けた。このスクリーニング過程の結果、熱帯雨林から採取した土壌からの９種類の単離物、及び、温和な庭園から採取した土壌からの24種類の単離物を選択した。
実施例２：ヘミセルラーゼ活性についての土壌単離物のスクリーニング
熱帯雨林の土壌からの精製した各単離物を、選択的集積ブロスを含む振盪フラスコに移し、34℃で48〜72時間振盪した。インキュベーション後、この培養物を、10,000rpmで20−30分間遠心した（４℃）。得られた上清を、0.8及び0.45ミクロンのフィルターを連続して通して濾過して、微生物細胞を含まない粗製酵素を回収した。温和な庭園の土壌から精製した各単離物を、選択的集積ブロスを含む管に移し、34℃で12〜48時間振盪した。インキュベーション後、先に記載したように、この培養物を遠心し、濾過した。この粗製酵素溶液を、5mLの架橋結合させたグアー調製物（水400mL当たり、5.0gのグアー、2.0gの（NH4）2SO4、及び、0.6gの四ホウ酸ナトリウム、pH9.5）を含む管に添加し、少なくとも１時間、39〜40℃の水浴中でインキュベートした。酵素活性を測定するために、一定直径の1mL用ピペットに、1.0mLの混合物を充填し、0.9mLを押し出した。ストップウオッチを使用して、この押し出しが起こるのに必要な時間を測定した（本明細書中では、以降「滴下時間」とする）。２秒を下回る滴下時間は、ヘミセルラーゼ活性の測定できる量を示す。温和な庭園の土壌から回収した24種類の単離物の内12種類が、更に、熱帯雨林の土壌から回収した９種類の単離物のうち４種類が、測定できる量のヘミセルラーゼを産生した。
実施例３：脂質分析によるバチルス・レンチスCMG1240の性質決定
先の実施例１及び２の方法に従って単離した微生物のうちの一つのものの脂肪酸含量の分析を行った。微生物の性質を決定しかつ同定するために使用される脂肪酸分析の方法は、Eerola and O.P.Lehtonen、J.Clin.Microbiol.Vol.26:1745〜1753（1988）、及び、G.M.Mukwaya and D.F.Welch、J.Clin.Microbiol.Vol.27:2640〜2646（1989）により報告されている。これらの方法は、Microbial ID、Inc.社（ネワーク、デラウエアー州）、及び、Hewlett−Packard社により改善されている。MIDI微生物同定系として引用されるこの改善された方法は、ガス−液体クロマトグラフィーにより微生物の脂質類から調製される脂肪酸のメチルエステルを分析する。実施例１及び２の方法に従って単離した微生物、及び、命名されている株CMG1240をこのMIDI微生物同定系を使用して分析した。この分析の結果を、表IIに示している。テスト１から４においては、細胞は、標準的な微生物ID法によるTSBAアガロース上で、28℃及びpH6.7において増殖させた。テスト５においては、脂肪は、脂質組成に顕著な変化を引き起こす条件である、35℃及びpH8.5で増殖させた。
実施例4:商業的に有用な量のヘミセルラーゼの産生
バチルス・レンチス（CMG1240）の単一の、単離されたコロニーを、50mLの脳心臓浸出ブロスを含む、調節装置を取付けてあるエルレンマイヤーの振盪（プレ−シード）フラスコ内へ接種した。接種したフラスコを、35℃で12〜16時間インキュベート中は振盪した（300rpm）。インキュベーション後、このプレ−シードフラスコの全ての容量を、無菌的に、１リットルの種培地を含む調節装置を取付けてある4Lのエルレンマイヤー振盪フラスコ（シード）に移した。このシードフラスコを、35℃において12〜16時間振盪しながらインキュベートした。このシードフラスコの全ての容量を、無菌的に、9.0リットルの発酵ブロスを含む14リットルの発酵容器へ移した。発酵容器は、40℃、＞20％溶存酸素、及び、500〜1000rpmに保持した。0.05％の最終濃度となるようにグアーガムを、増殖期中に２もしくは３回、更に、定常期中に１回（0.5％）添加して、酵素産生を誘導した。１〜7.5時間後、発酵を停止して、実施例６の方法に従って酵素活性をアッセイした。アッセイデーターを図３に示す。
実施例５：ヘミセルラーゼ産生のための至適培養条件を決定するためのヘミセルラーゼ活性の測定
最高の粘性を得るために３時間混合した、水に溶解している１％グアーの20ミリリットルアリコート、及び、2Mグリシン−NaOHバッファー（pH9.0）の2mLアリコートを、循環式の水浴方法によって40℃に保持されているガラス性のジャケット付の反応容器に添加した。発酵産物の一部分を、マイクロフージ内で５分間遠心し、得られた上清を使用して、酵素活性についてのテストを行った。この上清の100〜200MLの試料を反応容器に添加した。酵素活性は、実施例６において記載したように測定した。試料の酵素活性を、標準として使用しているヘミセルラーゼ（マイルズ Ｂ−1500）の希釈物の滴下時間（秒）のlog値を、分で表示してあるインキュベーション時間に対してプロットすることにより作成した標準曲線から算出した。logプロットの勾配（直線記法における）を算出し、ヘミセルラーゼのグラム数もしくは「室単位（chamber units）」に対して再プロットした。
実施例６：標準物及び精製した酵素調製物をテストするのに適するヘミセルラーゼ活性のためのアッセイ
標準ヘミセルラーゼもしくは精製した酵素調製物の酵素活性をスクリーニングするのに適する方法においては、水に溶解している１％のグアーガムを含む約16.0mLのグアー調製物、及び、2.0mLの2Mグリシン（NaOHでpH9.0に調節してある）を、循環性の水浴方法によって38℃に保持してある、ガラス性のジャケット付の100mLの反応容器に添加した。この溶液を、該温度に達した後、磁石性の攪拌機により、完全に混合した。一定内径の1mLのピペットにおいて、1.0mLの印から0.7mLの印までその溶液を滴下させるのに必要な時間を測定することにより、ゼロ時間における粘度を決定した。酵素を添加しなかったグアー溶液の初期滴下時間は、75から90秒であった。反応容器への酵素添加（200〜500ML）の後、グアー／酵素溶液をインキュベートした。その溶液のゼロ時間の測定値は速やかに決定した。滴下時間測定は、５回の測定が行われたか、あるいは、滴下時間が30秒を下回るまで行った。標準曲線は、滴下時間のlog値を、異なる標準酵素希釈物を使用してインキュベーションの時間に対してプロットすることにより作成した。
実施例７：発酵物からのヘミセルラーゼの回収
実施例４において記載してある方法を、６回の14リットル発酵の各々におけるヘミセルラーゼの有効量の産生に使用した。発酵を停止した後、0.1ミクロンのフィルターを用いる限外濾過により、細胞を60Lの培養ブロスから除去した。その後、10,000分子量を取り除く限外濾過を使用して、約3.5Lの容積にまで酵素を濃縮した。この濃縮物を３倍量のアセトンと混ぜ合わせて、ヘミセルラーゼを沈殿させた。この沈殿物を24時間沈ませるることにより沈殿物を回収し、その後、上清をサイフォンを利用して除去した。その後、この沈殿を、４℃において10分間、6000rpmで遠心した。得られたペレットを直ちに170mLの50mMリン酸カリウムバッファー（PH7.0）中に再懸濁させて、300mLの最終容量にした。得られたヘミセルラーゼ溶液の酵素活性を、実施例６の方法に従って決定した。回収されたヘミセルラーゼペーストは、9.45×106室単位／リットルであり、これは、6.3kg/Lの標準物としての市販のヘミセルラーゼ（pH9.0においてアッセイした）、もしくは、標準ヘミセルラーゼ処方物の1.89Kg総量に等しかった。
実施例８：ヘミセルラーゼを回収するための別な方法
実施例７において記載した方法において、ヘミセルラーゼを沈殿させるに代わりメタノールを使用してヘミセルラーゼを回収した。上清はサイフォンにより除去し、沈殿を先に記載したように遠心した。ペースト様の沈殿物を、その後、10倍量（w/w）の乳糖と混ぜ合わせ、40℃以下での温度における真空下で乾燥させた。
実施例９：ヘミセルラーゼを回収するための別の方法
ヘミセルラーゼを、10,000分子量カットオフ限外濾過膜を使用して、約15Lの容量にまで濃縮した。固体の硫酸アンモニウムを、継続的に混ぜ合わせながら、75％飽和になるまでゆっくりと添加した。溶液から生成した沈殿は8,000rpmで45分間の遠心分離により回収した。得られたペレットの酵素活性は、実施例６の方法に従って決定した。酵素活性の回収率は、1.85×105単位／グラム（総計2.22×108単位）であった。沈殿の酵素活性の回収率は、15L濃縮物の総酵素活性の77％であった。
実施例10：ヘミセルラーゼの商業的に有用な量の産生のための別の方法
A.接種材料を含む振盪フラスコの準備
バチルス・レンチス（CMG1240）の単一な、単離したコロニーを、各々、50mlの脳心臓浸出ブロスを含む、制御装置を取付けた500mLのエルレンマイヤーの振盪（プレシード）フラスコ内に接種した。35℃において12〜16時間インキュベートしている間に、接種したフラスコを振盪した（300rpm）。インキュベーション後、各フラスコの全ての容量を無菌的に、各々500mlの振盪フラスコブロスを含む、制御装置を取付けた２個の4Lのエルレンマイヤー振盪フラスコのうちの一つに移した。この振盪フラスコを、35℃において12〜16時間振盪させながらインキュベートした。
B.14リットル発酵容器の準備
各振盪フラスコの全ての容量を無菌的に、各々8.0リットルの14リットル発酵ブロスを含む、２台の14リットル反応容器のうちの一つに移した。14リットル反応容器は、＞40％の溶存酸素濃度、及び、300rpmと1000rpmとの間の撹拌速度を用い、36から37℃の温度に維持した。発酵容器内での泡形成は、シリコンの消泡剤（ユニオン カーバイド社、SAG 5693）を利用して調節した。細胞密度は、600nmにおける吸光度の変化を観察することにより評定した。温度は、吸光度（OD）が2.0に達した時点で、29〜30℃に下げた。約13.5時間後、ODが14に達した時点で、温度を10℃に下げた。
C.250リットル発酵容器の準備
次いで、160リットルの250リットル発酵容器ブロスを含む250リットル発酵容器に、14リットル発酵容器の成分を接種した。溶存酸素の濃度は、300rpmと500rpmとの間の撹拌速度を使用して、70％飽和に維持した。pHは、8.0と8.45の範囲に維持した。発酵容器内の泡形成は、シリコンの消泡剤（ユニオン カーバイド社、SAG 5693）を使用して制御した。接種後約15.5時間後に、600nmのODが14に達するまで、温度は28℃に維持した。この時点において、接種後約25時間でODが約20に達するまで、温度を20℃に下げた。
D.1500リットル発酵容器の準備
その後、800リットルの1500リットル発酵容器ブロスを含む1500リットル発酵容器に、250リットル発酵容器の166リットルの成分を接種した。培地のpHは、8.11から8.44のpH範囲に保持した。温度は28℃に保持し、かつ、溶存酸素の濃度は、240rpmと288rpmとの間の駆動速度及び600リットル／分と1000リットル／分の間の空気流量で、25％飽和を越える価に保持した。タンクの空気圧は、3psiと11psiとの間に保持した。泡形成は、シリコンの消泡剤（ユニオン カーバイド社、SAG 5693）で制御した。
接種後約4.5時間、つまり、600nmにおける発酵容器成分のODの測定値が5.6となった時点で、発酵容器にグアーガムを添加した。約１から２キログラムの固体のグアーガムを、ここからの９時間の間、毎時間発酵容器に添加した。総量で13.8グラム／リットルのグアーガムを、発酵容器に添加した。接種後10.5時間と13時間の間、グリセロールをゆっくりと発酵容器に添加した。総量で３グラム／リットルのグリセロールを発酵容器に添加した。接種後約14.25時間に成分のODが600nmにて23.3に達した時点で発酵を停止し、酵素活性は2.67×107単位／リットルと測定された。
実施例11：発酵物からのヘミセルラーゼの回収のための別の方法
実施例10の方法による発酵を停止した後、細胞塊と固体培地類とを、ウエストファーリアの連続遠心機を通すことにより部分的に除去した。ウエストファーリア遠心流出液中に残存している固体類及び高分子量物質類を、0.1ミクロンの中空繊維フィルターを通すことにより除去した。0.1ミクロンフィルターを通過した未精製の酵素溶液を、その後、50,000分子量カットオフ中空系繊維の限外濾過膜を使用して濃縮した。この濃縮物を、0.1ミクロンの滅菌したフィルターで滅菌濾過し、その後、粗製酵素を塩析させる目的で、550グラム／リットルの濃度の硫酸アンモニウム中に懸濁させた。
５℃において、GS3ローターを使用したソルバール遠心機中で、8,000rpmで遠心することにより、酵素沈殿を回収した。得られた沈殿物の酵素活性は、約5.0×108単位／キログラムであった。
実施例12：ヘミセルラーゼの精製
より精製された産物を生産するために、２つの沈殿段階を使用して、精製された酵素を取得した。限外濾過からの濃縮物は、実施例７に記載の方法に従って調製した。その濃縮物は、6.39×106単位／リットルであり、比活性は1.11×103単位/mgであった。等量の（2.2リットル）の濃縮物及びアセトンを混合して50％（v/v）溶液を作製し、更に、得られた沈殿物を、その後、10℃において18時間沈殿させた。上清を回収した後、追加量のアセトンを添加して75％溶液（v/v）を作製した。得られた沈殿物を、10℃で24時間沈ませ、その後、最初にサイフォンを利用し、最終的には5000rpmでの遠心により上清を除去した。この沈殿物を、その後、222mLの50mMリン酸バッファー（pH7.0）に溶解した。活性を決定したところ、5.71×107単位／リットルで、比活性は6.17×103単位/mgであった。この精製段階の結果、単に20％の蛋白質で90％の総活性を回収し、比活性が5.56倍上昇したことになった。
実施例13：別のヘミセルラーゼ精製法
別の精製法を利用して、実施例12の沈殿段階を回避した。ヘミセルラーゼを、実施例12において記載したように、限外濾過により希望する濃度に濃縮した。この濃縮物の液体処方物を、その後、エチレングリコール、もしくは、それに代わるものとして、グリセロール、ソルビトール、安息香酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、メチルパラベン、アスコルビン酸ナトリウム、もしくは、等価物のような、安定化及び保存用試薬を添加することにより調製した。
実施例14：精製したヘミセルラーゼの性質決定
ブロス濃縮物を、限外濾過により調製した。つまり、細胞を0.1ミクロンの膜で除去し、更に、酵素を10,000分子量を取り除く膜で濃縮した。酵素が濃縮された状態になった時点で、いくらかのヘミセルラーゼが膜を通過したことが観察された。この通過画分を、10,000分子量カットオフ膜で再濃縮し、その後、更なる精製に使用した。再濃縮した通過物は、４℃における３倍量のアセトンの添加により沈殿させた。上清をサイフォンを利用して除去し、沈殿物を50mMのリン酸バッファー（pH7.0）中に再懸濁させて、最終容量を222mLとした。この酵素濃縮物を、続いて、10mMリン酸バッファー（pH7.0）に対して透析して、全ての塩を除去した。透析した濃縮物を、その後、DEAE−セファセルカラム（2.8×30cm）に供した。ヘミセルラーゼの溶出は、1mL/の流速で、カラムに対してイオン強度を増加した溶液を添加することにより行った。この溶液は、50mMのリン酸バッファー中に溶解している０〜1.25MのNaClからなる。10ミリリットルの画分を回収して、実施例６に記載してあるように、１％グアー溶液の粘性低下を測定することにより酵素活性のテストを行った。最高活性を示した画分96〜109を一まとめにし、その後、12.5％のSDS−ポリアクリルアミドゲル上で（分子量マーカー蛋白質と共に）分析した。この分析の結果により、ヘミセルラーゼは高度に精製され、かつ、32,000の分子量を有することが示された。ヘミセルラーゼ画分を同じ種類のSDS−ゲル上での電気泳動により完全に精製し、更に、イモビロン（Immobilon）Ｐ PVDF膜上にブロットし、Matsudaira、J.Biol.Chem.262:10035−38（1978年）の方法により、クマシーブルーで染色した。この膜上のヘミセルラーゼのバンドを切り出し、アミノ酸配列分析に使用した。この酵素は、バイオシステムス社の気相配列決定機を使用するエドマン分解法により分析した。精製した酵素のＮ−末端配列は、以下に示すように決定された：
３種類の異なるバッチの動物飼料を比較した。これらのバッチを、（ｉ）出発用飼料、（ii）成育用飼料、及び、（iii）仕上げ用飼料（finisher feed）として引用した。３種類の飼料の組成物類を、表IIIに示している。
実施例４において記載した方法を有用な量のヘミセルラーゼの産生に使用した。ヘミセルラーゼは、実施例９において記載した様にして回収した。得られた約2.2ポンドのヘミセルラーゼペーストを、少量（8.8ポンド）のダイズのあら粉（48％の割合）に混合させて、ポンド当たりのヘミセルラーゼ／ダイズあら粉混合物の酵素活性が31.75×106単位になる濃度にした。この混合物を、ドラフト下に置いた広い蓋なしの皿の中で空気乾燥させた。この乾燥混合物をワーリングブレンダー内で挽いて微細粉末にして、使用するまで４℃に保存した。
実施例17：動物用飼料を含むヘミセルラーゼの調製
トン当たり２ポンドのヘミセルラーゼ／ダイズあら粉混合物を含む３種類の動物用飼料を、実施例16の方法に従い調製した。実施例15において記載されている方法に従って調製された、２ポンドのヘミセルラーゼ／ダイズあら粉混合物を、実施例15に従って調製した３種類の動物用飼料の各々からなる成分（イエローコーン及びダイズあら粉を除外する）に添加した。このヘミセルラーゼ／ダイズあら粉混合物と他の成分類とを垂直振盪機内で１分間混合した。この混合物を、その後、予め決定してある量のイエローコーン及びダイズあら粉と配合させ、更に、垂直振盪機内で3.5分間混合した。結果として得られるヘミセルラーゼ／飼料混合物を、水蒸気（10％ v/w）を配給するために装着してあるカリフォルニア圧縮ミル内でその飼料混合物を処理することにより、ペレットに成形した。この飼料混合物を型に合わせて圧断してペレットにし、これを、垂直強制空気冷却用塔内で直ちに冷却させた。ペレットを揺すって任意の微細粉末物質を除去し、この粉末は、ペレット室へ戻した。出発用飼料ペレットを、回転ミルを通して処理することによって粉砕した。
実施例18：飼料添加物としてのヘミセルラーゼの使用
ニワトリの平均体重増加／摂取した飼料重量（ポンド）に影響する要因としての、ダイズのあら粉を含む動物用飼料に対するヘミセルラーゼ添加の効果を調べた。１日令のヒヨコ（パターソン Ｘ アーバー アクレス種）をこの研究のために選択した。この鳥は、マレック疾患及びニューキャッスル−気管支炎に対してワクチン接種した。各性別の25羽の鳥をランダムに捕獲して体重測定して、容認できる体重の範囲を確立した。平均の＋／−５グラムの範囲を各性別ごとに決定した。鳥をランダムに捕獲し、適切な体重についてスクリーニングし、76羽の雌雄を混ぜ合わせたブロイラー用ニワトリからなる群にランダムに割り振った（38羽の雄及び38羽の雌）。総計で、テスト用ニワトリの７群及び対照用ニワトリの７群が存在した。
各群を個別のおりの中に居住させた。おりの温度は、研究の最初の２週間の間毎日検査した。居住温度及び湿度は、研究期間中毎日検査した。空気交換を、壁に取付けてあるファンで促進した。鳥は積み上げた敷き藁の上に配した。以前の研究からの湿った敷き藁を除去して、１インチの新しい敷き藁に置き換えた。人工照明を継続的に行ない、全ての鳥は水に接近できるようにしてあった。
研究の最初の７日間の内に死亡した全ての鳥は、鳥の同一の搬入元からの同一の性別の鳥と置き換えた。研究７日目の12:01pm後に置き換えた鳥はいなかった。
全てのヒヨコを、研究０日目に、それぞれの食餌に配した。ヒヨコには、０〜21日目に出発用飼料の粉砕したペレットを給餌した。22〜39日目には、成育用飼料のペレットをヒヨコに給餌した。40〜46日目には、仕上げ用飼料のペレットをヒヨコに給餌した。研究の間、おりは日に３回調査した。研究の間に死亡した鳥を検屍して死因を決定した。食事と水分を採ることができない鳥は淘汰した。全ての死亡及び淘汰した鳥の体重及び除去した日にちを記録した。ヒヨコの体重を、研究の21日目及び46日目に測定した。増加した体重（ポンド）によって、ニワトリが消費した飼料の量（ポンド）を割ることにより、飼料効率を決定した。21日目の研究の結果を、表IV、Ｖ及びVIに報告してあり、これらを、図５において図説してある。46日目の結果は、表VII、VIII及びIXにおいて報告してあり、これらを図５において図説してある。ダンカンの新多重範囲テスト（New Multiple Range Test）を利用した、この結果の統計学的解析を、表Ｘに示している。
本発明の範囲内に含まれるヘミセルラーゼを産生する微生物から主になる培養物を、実施例１、２、及び、10に記載した方法に従って調製することができる。一度摂取すると、このような微生物に本発明に記載のヘミセルラーゼを産生させる消化管を有する動物により摂取された飼料の量に対する増加体重の比率を増加させる目的で、このような培養物の効果的な量を、実施例15において記載したもののような動物飼料バッチと配合することができる。
実施例20：直接給餌用微生物培養物及びヘミセルラーゼを含む発酵ブロスからなる動物用飼料の調製
微生物類及び本発明の範囲内に含まれるヘミセルラーゼを含む発酵ブロスを、実施例10Dの方法に従って調製することができる。摂取した飼料の量に対する増加体重の比率を増加させる目的で、このような発酵ブロスの有効量を、実施例15に記載したもののような動物用飼料のバッチと配合することができる。
例えば、30％のダイズのひき割り粉を含む飼料混合物のトン当たり、実施例10Dの方法に従って調製した約３リットルの発酵ブロスを添加することができる。この発酵ブロスを噴霧乾燥させて乾燥粉末を作製することができ、この乾燥粉末は、その後、飼料成分と配合させることができる。この発酵ブロスを、例えば、ダイズあら粉もしくはダイズあら粉の一部分のような、飼料成分の幾つかのものと直接混合し、その後、乾燥させることもできる。次には、粉の乾燥させたブロス／ダイズあら粉混合物を、他の飼料成分と後で混合することができる。その他の方法として、この発酵ブロスを、完全な飼料混合物と直接混合することができる。輸送費用を低減し、かつ、微生物の混入を制御する目的で、飼料用製粉所へ輸送して、更に、完全飼料混合物と配合させることができる濃縮物を形成するためこの発酵ブロスを乾燥させることができる。
Claims (53)
- （Ａ）栄養学的に単胃動物又はヒトに適しているタンパク質、ビタミン及びミネラルと、
（Ｂ）大豆、アルファルファおよびトウモロコシから成 る群より選択されるマンナン含有ヘミセルロースを含む炭水化物源と、
（Ｃ）前記マンナン含有ヘミセルロースの分解を触媒するマンナナーゼ
とを含んでおり、該マンナナーゼの添加により、該マンナナーゼを含まない同様の消費可能組成物を与えた動物に比較して、前記消費可能組成物を与えた動物の成長の期間における体重増加に対する給餌量の比率が低下し、または体重増加が亢進することを特徴とする前記消費可能組成物。 - 前記マンナナーゼのpHプロフィルが約pH7と約pH9との間にピークを有する請求項１に記載の消費可能組成物。
- 前記マンナナーゼがBacillus酵素である請求項２に記載の消費可能組成物。
- 前記群が大豆およびアルファルファからなる請求項１に記載の消費可能組成物。
- 前記組成物がヒトによって消費されるものである請求項１に記載の消費可能組成物。
- 前記組成物が単胃動物用のものである請求項１に記載の消費可能組成物。
- 前記マンナナーゼがエンド−β−マンナナーゼである請求項１に記載の消費可能組成物。
- 大豆あら粉を含むと共に、ヘミセルロースの分解を触媒する活性に関して約pH4.5〜約pH11の範囲のpHプロフィルを有するBacillusマンナナーゼで本質的に構成されたマンナナーゼ成分を含む消費可能組成物であり、該マンナナーゼ成分の添加により、該マンナナーゼ成分を含まない同様の消費可能組成物を与えた動物に比較して、前記消費可能組成物を与えた動物の成長の期間における体重増加に対する給餌量の比率が低下し、または体重増加が亢進することを特徴とする、前記消費可能組成物。
- 前記プロフィルが約pH7とpH9との間にピークを有する請求項８に記載の消費可能組成物。
- 前記マンナナーゼが60℃以上の温度で前記分解を触媒する活性を示す請求項８に記載の消費可能組成物。
- 前記マンナナーゼがエンド−β−マンナナーゼである請求項８に記載の消費可能組成物。
- （Ａ）栄養学的に単胃動物又はヒトに適しているタンパク質、ビタミン及びミネラルと、
（Ｂ）大豆、アルファルファおよびトウモロコシから選択されるマンナン含有ヘミセルロースを含む炭水化物源と、
（Ｃ）前記マンナン含有ヘミセルロースの分解を触媒するマンナナーゼ
とを含んでおり、前記マンナナーゼが、60℃以上の温度で前記分解を触媒する活性を示すことを特徴とする消費可能組成物であり、該マンナナーゼの添加により、該マンナナーゼを含まない同様の消費可能組成物を与えた動物に比較して、前記消費可能組成物を与えた動物の成長の期間における体重増加に対する給餌量の比率が低下し、または体重増加が亢進することを特徴とする前記消費可能組成物。 - 前記マンナナーゼがエンド−β−マンナナーゼである請求項12に記載の消費可能組成物。
- （Ａ）栄養学的に単胃動物に適しているタンパク質、ビタミン及びミネラルと、
（Ｂ）大豆、アルファルファおよびトウモロコシから成 る群より選択されるマンナン含有ヘミセルロースを含む炭水化物源と、
（Ｃ）前記マンナン含有ヘミセルロースの分解を触媒するマンナナーゼを産生する微生物で本質的に構成された培養物
とを含む消費可能組成物であり、該培養物の添加により、該培養物を含まない同様の消費可能組成物を与えた動物に比較して、前記消費可能組成物を与えた動物の成長の期間における体重増加に対する給餌量の比率が低下し、または体重増加が亢進することを特徴とする前記消費可能組成物。 - 前記マンナナーゼのpHプロフィルが約pH7と約pH9との間にピークを有する請求項14に記載の消費可能組成物。
- 前記培養物が本質的に、Bacillus属に属する微生物からなる請求項14に記載の消費可能組成物。
- 前記群が大豆及びアルファルファからなる請求項14に記載の消費可能組成物。
- 前記マンナナーゼがエンド−β−マンナナーゼである請求項14に記載の消費可能組成物。
- 大豆あら粉を含むと共に、マンナン含有ヘミセルロースの分解を触媒する活性に関して約pH4.5〜約pH11の範囲のpHプロフィルを有するマンナナーゼを産生するBacillus属に属する微生物で本質的に構成される培養物を含む消費可能組成物であって、該培養物の添加により、該培養物を含まない同様の消費可能組成物を与えた動物に比較して、前記消費可能組成物を与えた動物の成長の期間における体重増加に対する給餌量の比率が低下し、または体重増加が亢進することを特徴とする、前記消費可能組成物。
- 前記プロフィルが約pH7とpH9との間にピークを有する請求項19に記載の消費可能組成物。
- 前記マンナナーゼが60℃以上の温度で前記分解を触媒する活性を示す請求項19に記載の消費可能組成物。
- 前記マンナナーゼがエンド−β−マンナナーゼである請求項19に記載の消費可能組成物。
- （Ａ）栄養学的に単胃動物に適しているタンパク質、ビタミン及びミネラルと、
（Ｂ）大豆、アルファルファおよびトウモロコシから選択されるマンナン含有ヘミセルロースを含む炭水化物源と、
（Ｃ）前記マンナン含有ヘミセルロースの分解を触媒するマンナナーゼを産生する微生物で本質的に構成された培養物
とを含んでおり、前記マンナナーゼが、60℃以上の温度で前記分解を触媒する活性を示すことを特徴とする消費可能組成物であり、該培養物の添加により、該培養物を含まない同様の消費可能組成物を与えた動物に比較して、前記消費可能組成物を与えた動物の成長の期間における体重増加に対する給餌量の比率が低下し、または体重増加が亢進することを特徴とする前記消費可能組成物。 - 前記マンナナーゼがエンド−β−マンナナーゼである請求項23に記載の消費可能組成物。
- （Ａ）栄養学的に単胃動物に適しているタンパク質、ビタミン及びミネラルと、
（Ｂ）大豆、アルファルファおよびトウモロコシから成 る群より選択されるマンナン含有ヘミセルロースを含む炭水化物源と、
（Ｃ）発酵ブロス
とを含んでおり、前記発酵ブロスが、
（ｉ）前記マンナン含有ヘミセルロースの分解を触媒するマンナナーゼを産生する微生物で本質的に構成された培養物と、
（ii）前記マンナナーゼとを含んでいることを特徴とする消費可能組成物であり、該発酵ブロスの添加により、該発酵ブロスを含まない同様の消費可能組成物を与えた動物に比較して、前記消費可能組成物を与えた動物の成長の期間における体重増加に対する給餌量の比率が低下し、または体重増加が亢進することを特徴とする消費可能組成物。 - 前記マンナナーゼのpHプロフィルが約pH7と約pH9との間にピークを有する請求項25に記載の消費可能組成物。
- 前記培養物が本質的に、Bacillus属に属する微生物からなる請求項25に記載の消費可能組成物。
- 前記群が大豆及びアルファルファからなる請求項25に記載の消費可能組成物。
- 前記マンナナーゼがエンド−β−マンナナーゼである請求項25に記載の消費可能組成物。
- 大豆あら粉と発酵ブロスを含んでおり、この発酵ブロスが、
（ｉ）ヘミセルロースの分解を触媒する活性に関して約pH4.5〜約pH11のpHプロフィルを有するマンナナーゼを産生するBacillus属に属する微生物で本質的に構成された培養物と、
（ii）前記マンナナーゼ
とを含むことを特徴とする消費可能組成物であり、該発酵ブロスの添加により、該発酵ブロスを含まない同様の消費可能組成物を与えた動物に比較して、前記消費可能組成物を与えた動物の成長の期間における体重増加に対する給餌量の比率が低下し、または体重増加が亢進しることを特徴とする前記消費可能組成物。 - 前記プロフィルが約pH7とpH9との間にピークを有する請求項30に記載の消費可能組成物。
- 前記マンナナーゼが60℃以上の温度で前記分解を触媒する活性を示す請求項30に記載の消費可能組成物。
- 前記マンナナーゼがエンド−β−マンナナーゼである請求項30に記載の消費可能組成物。
- （Ａ）栄養学的に単胃動物に適しているタンパク質、ビタミン及びミネラルと、
（Ｂ）大豆、アルファルファおよびトウモロコシから選択されるマンナン含有ヘミセルロースを含む炭水化物源と、
（Ｃ）発酵ブロス
とを含んでおり、前記発酵ブロスが、
（ｉ）前記マンナン含有ヘミセルロースの分解を触媒するマンナナーゼであって、60℃以上の温度で前記分解を触媒する活性を示すマンナナーゼを産生する微生物で本質的に構成された培養物と、
（ii）前記マンナナーゼ
とを含んでいる消費可能組成物であり、該発酵ブロスの添加により、該発酵ブロスを含まない同様の消費可能組成物を与えた動物に比較して、前記消費可能組成物を与えた動物の成長の期間における体重増加に対する給餌量の比率が低下し、または体重増加が亢進することを特徴とする消費可能組成物。 - 前記マンナナーゼがエンド−β−マンナナーゼである請求項34に記載の消費可能組成物。
- （Ａ）栄養学的に単胃動物又はヒトに適しているタンパク質、ビタミン及びミネラルを含むと共に、大豆、アルファルファおよびトウモロコシからなる群より選択されるマンナン含有ヘミセルロースを含む炭水化物源を含む消費可能組成物を製造するステップと、
（Ｂ）単胃動物又はヒトによる前記ヘミセルロースのマンナン含有部分の使用を可能にするように前記マンナン含有ヘミセルロースの分解を触媒するマンナナーゼを前記組成物に配合するステップ
とを含む消費可能組成物の製造方法。 - 前記マンナナーゼがエンド−β−マンナナーゼである請求項36に記載の方法。
- 前記群が大豆及びアルファルファからなる請求項36に記載の方法。
- ステップ（Ｂ）が、（ｉ）前記マンナナーゼと前記組成物とを含む混合物を製造し、次いで（ii）この混合物を60℃以上の温度を含む条件下でペレット化することを包含する請求項36に記載の方法。
- 前記炭水化物源が大豆である請求項36に記載の方法。
- （Ａ）栄養学的に単胃動物に適しているタンパク質、ビタミン及びミネラルを含むと共に、大豆、アルファルファおよびトウモロコシからなる群より選択されるマンナン含有ヘミセルロースを含む炭水化物源を含む消費可能組成物を製造するステップと、
（Ｂ）単胃動物による前記ヘミセルロースのマンナン含有部分の使用を可能にするように前記マンナン含有ヘミセルロースの分解を触媒するマンナナーゼを産生する微生物で本質的に構成された培養物を前記組成物に配合するステップとを含む消費可能組成物の製造方法。 - 前記マンナナーゼがエンド−β−マンナナーゼである請求項41に記載の方法。
- 前記群が大豆及びアルファルファからなる請求項41に記載の方法。
- ステップ（Ｂ）が、（ｉ）前記培養物と前記組成物とを含む混合物を製造し、次いで（ii）この混合物を60℃以上の温度を含む条件下でペレット化することを包含する請求項41に記載の方法。
- 前記炭水化物源が大豆である請求項41に記載の方法。
- 前記培養物が本質的に、Bacillus属に属する微生物からなる請求項41に記載の方法。
- （Ａ）栄養学的に単胃動物に適しているタンパク質、ビタミン及びミネラルを含むと共に、大豆、アルファルファおよびトウモロコシからなる群より選択されるマンナン含有ヘミセルロースを含む炭水化物源を含む消費可能組成物を製造するステップと、
（Ｂ）発酵ブロスが単胃動物による前記ヘミセルロースのマンナン含有部分の使用を可能にするために、
（ｉ）前記マンナン含有ヘミセルロースの分解を触媒するマンナナーゼを産生する微生物で本質的に構成された培養物と、
（ii）前記マンナナーゼ
とを含む前記発酵ブロスを前記組成物に配合するステップとを含む消費可能組成物の製造方法。 - 前記群が大豆及びアルファルファからなる請求項47に記載の方法。
- ステップ（Ｂ）が、（ｉ）前記発酵ブロスと前記組成物とを含む混合物を製造し、次いで（ii）この混合物を60℃以上の温度を含む条件下でペレット化することを包含する請求項47に記載の方法。
- 前記炭水化物源が大豆である請求項47に記載の方法。
- 前記培養物が本質的に、Bacillus属に属する微生物からなる請求項47に記載の方法。
- 前記炭水化物源が大豆である請求項47に記載の方法。
- 前記マンナナーゼがエンド−β−マンナナーゼである請求項47に記載の方法。
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