UA78486C2 - Композиція для перорального введення птахам та тваринам для лікування або зниження ризику інфекції травного тракту (варіанти), її застосування (варіанти) та спосіб лікування або зниження ризику інфекцій травного тракту (варіанти) - Google Patents

Abstract

Композиція для перорального введення птахам та тваринам для лікування або зниження ризику інфекції травного тракту, що включає естеразу-фосфоліпазу або геміцелюлазу та фізіологічно прийнятний носій. Спосіб лікування або зниження ризику інфекцій травного тракту, який включає пероральне введення вказаних ферментів або застосування ферментів або пероральних лікарських форм ферментів як засобу для лікування хвороб травного тракту.

Description

Опис винаходу

Даний винахід стосується композиції, яка включає ферменти, та способів використання ферментів як 2 протиінфекційних агентів у контексті лікування або зниження ризику інфекцій травного тракту.

У своєму звіті (МУогід Роршіаййоп Евійтайїез апа Ргоіесіопе "Оцінки та прогнози щодо населення світу" за 1998 рік) Відділ народонаселення Департаменту ООН з економічних та соціальних справ прогнозував, що населення світу досягне 6 мільярдів у 1999 році. У звіті також зазначалося, що для збільшення населення з 5 до 6 мільярдів знадобилося лише 12 років, порівняно з 123 роками для збільшення з одного до двох мільярдів. 70 До середини ХХІ століття населення за прогнозами становитиме від 7,3 до 10,7 мільярдів. Помітне збільшення населення в останнє десятиріччя частково зумовлюється суттєвими досягненнями у виробництві продовольства в результаті застосування технологій та практики інтенсивного виробництва продовольства. Для подальшого росту необхідно буде дотримуватися темпів збільшення ефективності у виробництві продовольства.

Один з підходів, який дозволяє підвищити ефективність виробництва м'яса тварин, включає широке 12 застосування антимікробних хімічних продуктів та антибіотиків у раціоні тварин. На великих фермах, в умовах переповнених приміщень, поширення інфекції є дуже швидким. Таким чином, поширення хвороби контролюють шляхом профілактичного та терапевтичного застосування цих речовин. Наприклад, для контролю над кокцидіозними інфекціями загальною практикою є включення до раціону тварин хімічних продуктів (наприклад, саліноміцину, монензину, роксарзону (З-нітро), галхінолу, карбадоксу та олахіндоксу), а також антимікробних антибіотиків (наприклад, бацитрацину, віргінаміцину, тилозину, тетрацикліну, хлортетрацикліну, пеніциліну, олеандоміцину, новобіоцину, лінкоміцину, бамберміцинів, апраміцину, спіраміцину, еритроміцину, неоміцину та інших). Така практика широко застосовується завдяки тому, що вона сприяє ростові і поліпшує перетравлювання корму.

Вироблення комплексної резистентності до антибіотиків серед патогенів людини, таких як Зіарпуіососсив с ацгецв, зігеріососсиз рпецтопіає, Наеторпйиз іпїшсепга, Меїіззегіа допогпоеае та Мусорасіегішт іШрегсціовів, (3 дало підстави для побоювань, що ця резистентність до антибіотиків, яка виробилася у мікробах, пов'язаних зі свійськими тваринами, може мігрувати до патогенів людини через перехідні фактори резистентності до ліків.

Існує свідчення того, що тварини, яким вводили антибіотики, є джерелом бактерій з перехідними факторами резистентності |Див. Нооде, Рееавіцйв 71(20):59,1999). Хоча антибіотики, які застосовують для тварин і для ее, людей, як правило, є різними, між ними існують спільні особливості у механізмах, які можуть призводити до с перехресної резистентності. В одному випадку прийнятним для боротьби з інфекціями Е. соїї (колібацильозом) у деяких тварин вважають застосування фторхінолонів, а також застосовують їх для лікування людей. Див. Нооде, З зирга. Нещодавно ЕБА/СУМ запропонувало скасувати ухвалення щодо застосування с фторхінолон-енрофлоксацину для птиці через вироблення резистентної до фторхінолону кампілобацили та 3о перенесення її на людину. |Див. Мигпеад, 5. Рееавзішйв 72(45): 1-4,20001. в

Стурбованість серед виробників м'яса також викликає можливість зниження продуктивності та відновлення хвороб рослин у разі заборони застосування антибіотиків та антимікробних засобів у кормах. У 1986 році, наприклад, Швеція заборонила застосування кормових антибіотиків, і захворюваність тварин зросла. Це « супроводжувалося збільшенням застосування терапевтичних антибіотиків, що призвело до загального З 740 збільшення застосування антибіотиків, а також підвищення вартості виробництва. |Див. Зті(й, Рееазіцв 71 с (13); 1, 1999). У грудні 1998 року Рада міністрів ЄС вирішила призупинити застосування шести антимікробних з» засобів, які формально були ухвалені для відпускання без рецепта як активатори росту для введення з кормом (Опісіа! доигпа! ої (пе Еигореап Соттипіез 29.12.98, Постанова Ради Мо2821/98 стосовно Директиви 70/524).

Два додатки на основі хіноксаліну також були заборонені у серпні 1999 через стурбованість утворенням залишків у м'ясі. Результатом цих дій стала активізація поширення хвороб, які формально вважалися подоланими, серед і яких: некротичний ентерит у бройлерів; ентерит, спричинений Сіозігідійт репгіпдепз у молочних поросят;

Ге | дизентерія та спірохетозна діарея свиней; спричинена Е.соїї діарея. |Див. МіМПег, Опіей біагез Апіта! Неайй

Аззосіацоп, 1999 Ргосеедіпоз "Апіібіоїс Озадез іп Роса Апітаї! Ргодисіоп апа Кезівіапсе-Ецгореап Регзресіїме"). шк Щороку вмирає 30000 людей через внутрішньолікарняне зараження резистентними патогенами, але значно о 20 Менше смертей викликають харчові патогени. У жодному випадку смерть від харчових патогенів не була пов'язана з резистентністю до антибіотиків (див. Зтіїй, зирга). Таким чином, залишається нез'ясованим, чи щи загострює застосування антибіотиків у м'ясній промисловості проблему резистентних до ліків патогенів при внутрішньолікарняних зараженнях людей. Стурбованість також викликає брак нових антибіотиків для лікування заражень резистентними патогенами. Див. Непгу, С.М., Спетіса! апа ЄЕпдіпеегіпд Мему5, Магсп 6, 2000, 29 стор.41-58). Це може означати, що при виробленні значної резистентності патогенів до антибіотиків не завжди є

ГФ) нові антибіотики для лікування від інфекцій. Очевидно, труднощі, пов'язані з розробкою антибіотиків, розмір ринку та регулятивні проблеми спричинили ситуацію, коли більшість фармацевтичних компаній перестають о зосереджувати наукові дослідження на розробці антибіотиків, особливо для застосування на тваринах.

Запропоновані нові правила щодо реєстрації ліків для застосування на тваринах є настільки складними, що 60 розробки поступово припиняються. Див. Зті(й, зирга. Щоправда, існують дрібні компанії, які займаються розробкою нових антибіотиків (Непгу, зирга).

У деяких тваринних популяціях інфекція вже є пандемічною. Наприклад, кокцидіоз у птахів є хворобою, з якою можна боротися, але неможливо реально тримати під контролем. Інфікуються фактично всі зграї, і антикокцидіозні хімікати, як правило, додають до раціону для стримування шкоди та обмеження розвитку бо резистентних штамів. Кокцидіоз забирає у птахівників 5350 мільйонів щорічно за рахунок збитків та витрат на медикаментозне лікування антибіотиками, такими як саліноміцин. |Див. Зивз2кім, ОЗОА АдгісиНига! Кезеагсп

Зегмісе Мемув, Осіобег 28, 1997). Згідно з оцінками, у Сполучених Штатах до 1999 року має витрачатися близько

Ф114 мільйонів щорічно на зниження захворюваності на кокцидіоз. |Див. Егові 5: Зийймап, 0.5. РНагтасеціїсаї!

Ргодисів Тог Роса Апітаї5, Керогі 5245-54,1995).

Очевидно, що існує потреба в нових і більш ефективних способах контролю над інфекціями у травному тракті тварин, які вирощуються інтенсивними методами. В основі цієї потреби лежить вимога досягнення більшої ефективності виробництва, яке має встигати за швидким ростом населення світу. Поліпшення контролю над кишковими інфекціями гарантує прискорення росту та збільшення ефективності годування. Існує також потреба в /о альтернативі застосування антибіотиків у тваринництві для розв'язання проблеми можливої резистентності до антибіотиків, яка виробляється у патогенів людини.

Немає ніякого ризику сприяння розвиткові резистентних патогенних мікроорганізмів, які являють проблему для здоров'я людини при застосуванні в лікуванні на основі ферментів, які діють не так, як усі антибіотики.

Оскільки ферменти є білками, то не існує ризику вмісту небезпечного хімічного залишку у м'ясних продуктах, як /5 це трапляється у разі деяких антибіотиків та антикокцидіозних хімічних продуктів. |Див. Атегісап Реедй Сопігої

ОпПісіаів Іпс., ОПісіаї Рибіїсайоп, 1999, "Огидз апа Реей Адайімевз, Зесіоп 30.0 Епултев, стор. 206-217,

ІБВМ 1-878341-10-3).

Таким чином, мета даного винаходу полягає у забезпеченні ферментного лікування для зменшення впливу інфекцій травного тракту.

Ще однією метою даного винаходу є забезпечення механізму зменшення впливу інфекцій травного тракту шляхом втручання у зв'язування патогенів з клітинами травного тракту.

Ще однією метою даного винаходу є забезпечення способу збільшення вагових показників та перетворення корму для тварин, заражених патогенами, які викликають інфекції або некротичний ентерит.

Ще однією метою даного винаходу є забезпечення придатної для перорального введення дозованої форми, сч ов ефективної для поліпшення стану об'єкта який є зараженим або якому загрожує зараження мікробним о патогеном.

Для досягнення цих та інших цілей згідно з одним аспектом даного винаходу також було передбачено композицію, яка включає (і) фермент, який розщеплює зв'язок, що веде до вивільнення білка або вуглеводу клітинної поверхні, причому фермент не є ендо-1,4-4-ЮО-мананазою, та (ії) фізіологічно прийнятний носій для Ге ферменту, причому композиція передбачається у формі, придатній для перорального введення, і не містить іншого протиінфекційного агента, крім ферменту. В одному варіанті втілення даний фермент розщеплює зв'язок, со що веде до вивільнення білка клітинної поверхні. «І

В оптимальному варіанті втілення фермент, включений до композиції, є сфінгомієліназою або фосфоліпазою, особливо, фосфоліпазою типу С або типу О. В іншому оптимальному варіанті втілення фермент вибирають із со

Зз5 Групи, яка складається з естераз, цереброзидаз та карбогідраз, які розщеплюють зв'язок, що веде до че вивільнення білка або вуглеводу клітинної поверхні. В іншому варіанті втілення фермент одержують із штаму

Васіййв5 сегейв, в оптимальному варіанті - АТСС 7004 або АТСС 6464. В альтернативному варіанті фермент одержують шляхом експресії рекомбінантної ДНК, яка кодує фермент у Васіййв5 тедаїйегішт. В іншому варіанті втілення фермент міститься в оболонці желатинової капсули і є присутнім у композиції в кількості « 20 200МО/кг-А000МО/кг корму. шщ с Згідно з іншим аспектом даного винаходу, пропонується композиція, яка має вищезгадані компоненти (ії) та й (ії), у якій фізіологічно прийнятним носієм є кормовий продукт, до якого включено фермент. Таким чином, «» композиція може бути кормом для тварин, що не містить іншого протиінфекційного агента, крім ферменту.

Композиція корму для тварин згідно з даним винаходом також включає зерновий матеріал, такий як кукурудза, сорго, пшениця, ячмінь або овес, джерело білка, таке як боби або горох, і вітаміни, амінокислоти та мінерали. -і Згідно з іще одним з аспектів, даний винахід забезпечує композицію, як було описано вище, у твердій або рідкій дозованій формі. бо Крім того, забезпечується спосіб лікування або зниження ризику інфекцій травного тракту, який включає ї» пероральне введення суб'єктові, який є зараженим або перебуває під ризиком зараження, ефективної кількості ферменту, який розщеплює зв'язок, що веде до вивільнення білка або вуглеводу клітинної поверхні, причому бо фермент не є ендо-1,4-Д4-ЮО-мананазою. Крім того, спосіб не включає введення іншого протиінфекційного агента, 4) крім самого ферменту. Інфекція може бути викликана найпростішими, такими, як Еітегіа та Стуріозрогіаіїшт, бактеріальними, такими як Сіозігідіпт, грибковими або дріжджовим патогеном.

Пропонується також композиція, яка включає (ії) фермент, який розщеплює зв'язок, що веде до вивільнення білка або вуглеводу клітинної поверхні, і (ії) фізіологічно прийнятний носій для ферменту, причому композиція передбачається у формі, придатній для перорального введення і не містить іншого протиінфекційного агента, о крім ферменту. ко Забезпечується також спосіб лікування або зниження ризику інфекцій травного тракту, який включає пероральне введення суб'єктові, який є зараженим або перебуває під ризиком зараження, ефективної кількості бо ферменту, який розщеплює зв'язок, що веде до вивільнення білка або вуглеводу клітинної поверхні, причому цей спосіб не включає введення з ферментом ефективної проти мікробів кількості іншого протиінфекційного агента.

Інші цілі, особливості та переваги даного винаходу стануть зрозумілими з нижчеподаного детального опису.

Детальний опис та наукові приклади, хоча вони і вказують на оптимальні варіанти втілення, лише ілюструють винахід, оскільки різні зміни та модифікації, які відповідають сутності та обсягові винаходу, стануть 65 зрозумілими спеціалістові з цього детального опису. Крім того, на прикладах показано лише принцип винаходу, і вони не можуть пояснити застосування цього винаходу для всіх конкретних інфекцій, при яких він може бути корисним на думку спеціаліста.

На Фігурі 1 показано антикриптоспородійну активність рекомбінантного ферменту РІ-РІ С, який виробляється штамом Васійшв тедаїйегішт.

Було виявлено, що ферменти певного класу, який характеризується здатністю до розщеплення зв'язку, що веде до вивільнення білка або вуглеводу клітинної поверхні, виявляють після перорального введення значну антибіотичну активність, яка є ефективною, наприклад, при лікуванні інфекцій травного тракту. До ферментів такого класу належать, крім інших, сфінгомієлінази та фосфоліпази типів С та 0, а також ферменти з подібною специфічністю розщеплення. Таким чином, прикладами цього класу є ферменти, які розщеплюють і вивільнюють 7/0 глікопротеїни або вуглеводи, які зчеплюються з мембраною через зв'язок із фосфатидилінозитом. Отже, фермент фосфатидилінозит, специфічний до фосфоліпази С (Е.С. 3.1.4.10), відомий також під скороченою назвою РІ-РІ С або як 1-фосфатидилінозит-фосфодіестераза, належить до цього класу. Ще одним прикладом є глікозилфосфатидилінозит-специфічна фосфоліпаза Ю або СРІ-РІ Ю.. (І ому апа Ргазайд, Ргос. Маї). Асад. сі. 85: 980-984,19881.

Було описано ферменти ОРІ-РІО та РІ-РІС з еукаріотних джерел. |Див. Іом, "Оедгадайоп ої аїїсозуІ-рпозрпайауйповйо! апспоге Бу зресіїйс рпозрпоіаразевз", СПпаріег 2, стор.35-63, МоіІесшаг апа сеї

Віоюсду ої Метргапе Ргоївіпев: СіусоЇїріде Апспоге ої Сеї-випПасе Ргоїеіпв, А.). Тигпег (ей.), Єв

Ноплиооа, Мем/ МогкК, 1990; ом апа Ргазайд, Ргос. Май. Асай. сі. 85:980-984, 1988; Евззеп еї аї., Майшге 380:595-602, 1996; та Евзеп еї аї., Віоспептівігу 36:2753-2762, 1997). Було описано РІ-РЇ/С з прокаріотних джерел, включаючи позаклітинне вироблення бактеріями. Серед відомих бактеріальних джерел РІ-РІ С - Васіїйив сегеиз (|Зієвїп апа Іодап, 9. Васіегіої. 85:369-381, 1963; бієеіїп апа Іодап, 9. Васіегіої. 90: 69-81, 1965;

Ікегаула сеї аї.,, Віоспітіса еї Віорпузіса Асіа 450:154-164, 1976; США ей аї, Меїйодз іп Епгутоіоду 197:493-502, 1991; Може ей аї., 9. СеїЇ. Віоспет. 39:315-325, 1989; та Кирре еї аї.,, 9. Васіегіо|. 171:6077-6083, 1989), Васійив Іпигіпдіепзіз (Кегамжша апа Тадиснпі, Меїодз іп Епгутоіоду 71:731-741, 1981; сч японський патентний документ УР 55034039), (арпуіососсив ацйгейз (ом апа Ріпеап, Віоспет. 9. 162:235-240, 1977) та Сіовігідіит помуї |Тадиснпі апа Ікегамла, Агсп. Віоспет. Віорпуз. 186:196-201, 1978). і)

Удосконалені способи аналізу для ферменту РІ-РІ С було розроблено на основі флуоресцентного субстрату.

Див. Непагісквоп еї аї.,, Віоспетівігу 31:12169-12172, 1992; Непагісквоп, Апаї. Віоспет. 219:1-8, 1994;

Непагіскгоп еї аї., Віоогд. Мед. Спет. І еЦегв. 1:619-622, 19911. Ге зо Не посилаючись конкретно на жодну теорію, автори даного винаходу наголошують на тому, що фермент

РІ-Р С має здатність до розщеплення фосфатидилінозитгліколіпідного зчеплення білків клітинної поверхні та со інших глікозилфосфатидилінозитів. |Див. ом, зирга; ом апа ЗаїШе!ї, Зсіепсе 239: 268-275, 1988). Наприклад, «г різновиди поверхневих глікопротеїнів та інші поверхневі білки та вуглеводи кількох найпростіших паразитів зчеплюються глікозилфосфатидилінозитними ліпідами (ОРІ зчепленнями) і є чутливими до гідролізу та со вивільнення РІ-Р! С. Види, які можуть служити прикладами, належать до родів Зспівіозота, Тохоріазта, ї-

Ріазтодішт, Ттурапозота та І еізптапіа (І ому, зирга), а також ЕїЇтегіа, Варезіа, ТНеїйегіа, Сіагаіа, І еріюотопав та Епіатоебра. |Див. МсСопуійе апа Регдивоп, Віоспетіса! У. 294: 305-324, 1993; Реагсе апа ЗнНег, 9. Іттипо). 142:979-984, 1989; Зацта еї аі), Мої. Мей. Віоспет. Рагазію!. 46:73-80, 1991; Намжп апа Бігапа, Мої. Меа.

Віоспет. Рагазію!. 59:73-82, 1993). «

Цей механізм зчеплення з компонентами поверхні клітин є універсальним для еукаріотних клітин, від з с дріжджів то клітин ссавців. Присутність ОРІ зчеплень у Сіагаіа Іатріа, який вважають дуже примітивним . еукаріотом, вказує на те, що цей тип зчеплення розвивається в еукаріотах на ранній стадії. Підтверджує цю и?» думку виявлення в архебактерії нового фосфогліцероліпіду СІсМа!-6б-міо-інозит-Р-діалкілгліцерину (Мізпінага еї аІ., У. Віої. Спет. 267:12432-12435, 19921, який є основою для розвитку більш складних еукаріотних структур ЗРІ зчеплення. У найпростіших, система ОРІ зчеплення використовується більшою мірою, ніж у вищих -І еукаріотів, і є підстави вважати, що зчеплені ОРІ структури є важливими для життєздатності паразитів у хазяїв - комахах та ссавцях (МесСопуйе апа Регдизоп, зирга). Наприклад, часте скидання різних поверхневих со глікопротеїнів може служити механізмом уникнення впливу імунної системи. їх Найпростіше Еітегіа (епеМйа містить зчеплені фосфатидилінозитом структури, подібні до бор Глікопротеїну/гліколіпіду Ттураповота бБгисеі. Їх вважають важливими для мембранного приєднання та со наступного інфікування |Див. Си!гпей ей а). Мої. Мей. Віоспет. Рагазйої. 41:177-186, 1990). Структури

Ф Еітегпа розщеплюються трипаносомною ліпазою та РІ-Р/С Васійив5 Іпигіпдіепвіз (Сигпей, зирга). Обробка паразитів РІ-РС іп мімо, якщо її можливо здійснити, очевидно, може допомогти імунній системі хазяїна і завадити приєднанню та інфікуванню патогенами, які проникають у травний тракт. Види Еїітегіа є поширеною ов проблемою для птахівництва, яка вимагає великих витрат. Поширеним найпростішим паразитом є

Сгуріозрогідінт рагуит, який викликає гостру діарею у людей та багатьох тварин. Передбачається, що білок (Ф) споровиків, СР15/45/60, є зв'язаним ОРІ білком на основі послідовності ДНК, і моноклональні антитіла, які ка реагують із цим білком споровиків, інгібують інфекцію (Зігопо, МУ.В., ей аїЇ., Іпїесійоп апа Іттипіну 68: 4117-4134, 2000; СемаППовз, А.М., еї аї., іптесйоп апа Іттипійу 68: 4108-4116, 2000). Таким чином, С рагуит є бо ще одним патогеном, на який може діяти РІ-РІ С.

Прокаріотні бактерії не містять поверхневих глікопротеїнів та вуглеводів, зчеплених фосфатидилінозитом (МеСопуйШе апа Регдизоп, зирга), але РІ-РІ С все ж може зменшувати бактеріальні інфекції, заважаючи процесові приєднання. Патогенна ЕЕ. соїї та багато інших добре відомих патогенних бактерій Епіегорасіегіасеае експресують бактеріальний адгезин РітН, 29 КО манозозв'язувальний лектин, присутній на віддаленому кінці 65 бахроми. (Абгайат еї аїЇ., Майшге 336: 682-684, 1988)|. Було виявлено, що цей адгезин зв'язується з СОА8 мастоцитів, ОРІ-зчепленою молекулою. |Див. Маїаміуа еї аЇ.,, Ргос. МаїЇ. Асай, Зсі. ЮБА 96:8110-8115, 1999).

Іп міо гідроліз за допомогою РІ-РІ С зменшував зв'язування мутантного СРІ-зчепленого дифтеротоксинового (з

Согупебрасіегішт аїрпіпегіа) рецептора з МІНЗТЗ-клітинами мишей та щурів. |Див. І аплгеіїп еї аі, ЕМВО У. 15:725-734, 19961). Крім того, альфа-токсин Сіозігідійт зеріїсит та аеролізин Аеготопаз Ппудйгорпйа обидва приєднуються до поверхні клітин за допомогою С-кінцевого СРІ-зчеплення і можуть бути видалені з поверхні клітин під дією РІ-РІ С. |Див. Согаоп еї аї., 9. Віо!ї Спет. 274:27274-27280,1999).

Механізм РІ-Р/С для зменшення впливу бактеріальної інфекції пов'язаний з відокремленням місця зв'язування СО48 від мастоцитів хазяїв. Зв'язування РітН з мастоцитами також започатковує запальну реакцію.

Таким чином, згідно з даним винаходом, усунення місця зв'язування також має усувати запалення, яке може 7/0 стати надмірним і шкідливим для самого стану кишечника, оскільки запальна реакція викликає вивільнення фактора некрозу пухлин о (Маїаміуа, зирга). Отже, через цей механізм зменшення запалення та секреції фактора некрозу пухлин, яка лежить у його основі, фосфоліпазне лікування, згідно з даним винаходом, має послаблювати симптоми, які характеризують такі стани, як синдром подразненого кишечнику, коліт та хвороба

Крона. |Див. мап Оемепіег. 5.9У., Апп. Кпешт. Оів. 58(1):1114-1120 (Мометрбег 1999)).

Даний винахід також може бути ефективним проти вірусних інфекцій завдяки розриванню зв'язків між вірусними частинками та клітинами, які вірус може інфікувати іп мімо. З огляду на виявлення авторами даного винаходу ефективності описаного перорального введення, цікавим є те, що попередня обробка вірусу грипу фосфоліпазою С, яка викликає вивільнення приблизно 5095 фосфоліпіду вірусу, в результаті забезпечує значне зниження інфективності ембріонів курчат. |Див. Мілгшапі ей аїЇ., Майте 204:781-782, 1964). | навпаки, попередня обробка культивованих фібробластів ембріонів курчат фосфоліпазою С, виділених із Сіовігіаїт репгіпдепв, помітно інгібує наступне інфікування клітин вірусом Зетіїкі Рогевзі. |Див. Егіедтап апа Равіевп,

Рос. Май. Асай. Зсі. БА 59:1371-1378, 1968). Хоча спеціалісти не вбачають у цих явищах ніякого терапевтичного значення, якщо поглянути в минуле, то можна побачити, що вони відповідають одному механізмові, який лежить в основі даного винаходу, а саме - розщепленню поверхневого ліганду патогену та/або "сі спорідненого з ним рецептора клітинної мембрани, перешкоджаючи взаємодії, необхідній для інфекції.

Ще одним шляхом ефективного застосування даного винаходу для запобігання вірусній інфекції є о руйнування зв'язування вірусного СРІ-зчеплених білків зі сприйнятливими клітинами. Прикладом вірусного оРІ-зчепленого білка, який є чутливим до РІ-РІ С гідролізу, є вірус денге М51 (неструктурний білок 1). Див.

Уасоре еї аі,, РАБЕВ .4).14:1603-1610, 20001. Існує кілька прикладів (зРіІ-зчеплених білків клітин-хазяїв, які є Ге) місцями зв'язування для вірусів. До цих прикладів належать еховірус людини 6, 7, 12 та 21 і ентеровірус 70, які зв'язуються з ОРіІ-зчепленим СО55 (фактор розпаду, ЮА). |Див. Сіагквоп еї аї., 9. Мігоіоду 69: со 5497-5501,1995; Вегдеївоп, еї аї.,, Ргос. Май Асад. 5сі БА 91: 6245-6248, 1994; та Кагпаиспом, еї аї., 9. «І

Мігоюду 70: 5143-5152, 1996). Інфікування парвовірусом собачих (СРМ) може бути блоковане іп мйго шляхом попередньої обробки клітин котячих РІ-РІ С. Див. Вагріз апа Раїтізій, Вгаліїйап У). Меа. Віо!. Кез. 27: 401-407, 1994). со

Деякі рецептори клітинної поверхні, які нібито відіграють важливу роль у викликанні інфекцій, приєднують ї- до мембран із застосуванням механізмів, відмінних від СРІ-зчеплення. До них належать такі структури, як естери холестерину Ц(Ковзіапа апа ЕвКо, У). Віої Спет. 268:24053-24059, 1993), нефосфорильовані глікосфінголіпіди |Кагіззоп, Апп Кем, Віоспет 58: 309-350, 1989| та інші фосфоліпіди, такі як фосфатидилетаноламін та фосфатидилсерин. Див. Зуімевіег, Іпгесі. Іттип. 64:4060-4066, 19961. «

Отже, з вищевказаних причин обробка таких структур відповідними естеразами, цереброзидазами, Ще) с карбогідразами та фосфоліпазами, які діють для відчеплення цих структур від поверхонь клітин, після й перорального введення згідно з даним винаходом має сприятливий вплив на лікування від інфекцій травного "» тракту.

Завдяки універсальному характерові фосфатидилінозит-зв'язаних поверхневих білків та вуглеводів в еукаріотах, терапевтична методологія даного винаходу, пов'язана з введенням ферменту, при гострих -і захворюваннях або профілактично, для розщеплення зчеплювального зв'язку для таких білків та/або вуглеводів клітинної поверхні, знаходить широке застосування у подоланні викликаних найпростішими, бактеріями, бо грибками та вірусами інфекцій травного тракту. З цієї точки зору головним аспектом даного винаходу є ї» демонстрація того, що фермент, який не лише є активним у розщеплювальних компонентах поверхні клітин, 5р Може вводитись перорально як протиінфекційний агент і бути ефективним іп мімо. Слід зважити, що хоча типовий бо придатний фермент, РІ-РІ С, є доступним з 1960-х років, цей підхід раніше ще не пропонувався.

Ф Ще одним аспектом даного винаходу є використання ферменту, як було описано вище, як ефективного протиіїнфекційного агента у кормі для тварин з метою лікування або зниження ризику інфекцій травного тракту у тварин, які вживають корм. Відомими є корми, які містять ендо-1,4- Д-Ю-мананазу, і в деяких повідомленнях припускалася протигрибкова активність мананази. Див. УУО 00/21381 (РСТ/ЕРО9/07835) та Кидо еї аі!., Ехрегепііа 48:227-281, 1992). У цих випадках мананазу комбінували з визнаним антибіотиком, хоча в цілому о обговорювалася перспектива використання ферменту в кормах, які не містять антибіотиків. | дат», Реед Міх ко (Зресіа! 2000), стор.16-18).

Таким чином, в одному з аспектів даний винахід стосується композицій, включаючи кормові композиції, які бо містять фермент, що характеризується вищезгаданою розщеплювальною активністю і не є мананазою або, точніше, ендо-1,4-Д-О-мананазою, і відрізняється, наприклад, від мананоспрямованого ферменту іншою специфічністю розщеплення, як описано в (Еплуте потепсіайшге 1992 (Асадетіс Ргезв) (див. статті 3.2.1.77, 3.2.1.78, 3.2.1.101, 3.2.1.106, 3.2.1.130 та 3.2.1.137|Ї1. Крім того, даний винахід розглядає композицію, яка містить такий фермент, включаючи мананазу, але не містить ніяких інших протиінфекційних агентів. 65 Таким чином, згідно з даним винаходом, позаклітинна ферментна композиція, одержана з Васіїїив5 сегецв і стандартизована щодо вмісту РІ-РІ С, може бути використана для досягнення дуже значного приросту ваги та перетворення корму у присутності інфекції. Цей результат є несподіваним, оскільки В. сегеоз є умовним патогеном, який зазвичай викликає гастроентерит, який переноситься з кормом, та ендофтальміт В. сегецв.

Раніше проведені дослідження показали, що зроблена кролям ін'єкція позаклітинного ферменту В. апінгасів або В. сегеиз викликає фосфасемію і навіть смерть. Наприклад, |див. біеіп апа Іодап, 9. Васіеєгіо!, 85:369-381, 1963). Отже, несподіваним є те, що позаклітинний фермент із патогена, який викликає гастроентерит, згідно з даним винаходом має цілющий вплив по відношенню до хвороби, викликаної бактеріальною інфекцією.

Васійв сегейз перетворює різноманітні діючі у позаклітинній мембрані ферменти та цитолітичні токсини, 7/0 Включаючи РІ-РІС та Сегеоїузіп АВ, які складаються з фосфоліпази С та сфінгомієлінази. |Див. Сіїтоге, 5).

Васіегіої. 171:744-753, 1989). У вищезгаданій ферментній композиції позаклітинну специфічну до фосфатидилінозиту фосфоліпазу С (Е.С. 3.1.4.10), вироблену В. сегеи5, вважають активним інгредієнтом.

Ферментне лікування згідно з даним винаходом є ефективним протикокцидіозним і антибіотичним засобом. Отже, воно являє собою ефективний і реально здійсненний з комерційної точки зору підхід до лікування інфекцій /5 травного тракту, особливо за умов заборони нині застосовуваних речовин.

Якщо вони не є вкритими, ферменти здатні на необоротну інактивацію шлунковими рідинами. У |(патенті США

Мо40791251 описано поліпшені композиції кишкової дії, які містять вкритий фермент, для приймання ссавцями з дефіцитом ферментів. Несподівано було виявлено, що додавання РІ-РС до раціону тварин без покриття в результаті забезпечує ефективне лікування патогенних інфекцій. 20 Ферментні композиції згідно з винаходом в оптимальному варіанті створюють як висушені, тверді або рідкі композиції для перорального введення. Такі композиції, як правило, включають стабілізатори, такі як буфер, вуглевод та/або гліколь. Висушені, стійкі при зберіганні композиції ферментів, згідно з даним винаходом придатні для включення до таблеток або капсул, одержують, наприклад, шляхом ліофілізації, розпилювального сушіння в сушарці з псевдозрідженим шаром з інертним або вуглеводним носієм, або шляхом застосування с 25 технологій випарювання у поєднанні зі склотвірними стабілізаторами. |Див. Ргапкз еї аї, Віорпагт. 4:38-55,1 9911. Інший підхід пов'язаний з осадженням солей, наприклад, сульфату амонію або розчинника, так як за (8) допомогою ацетону для утворення порошку, з наступним висушуванням та змішуванням з носієм.

Деякі вуглеводи, зокрема, моносахариди, дисахариди та нижчі олігосахариди, є важливими склотвірними вуглеводами. Прикладами вуглеводів для застосування як носіїв є, крім інших, ксилоза, фруктоза, глюкоза, Ге зо сорбіт та мальтотріоза, як описано Франксом (Ргапк5, зирга). В основі вибору вуглеводного носія лежить сумісність із ферментом, схильність до слабкого поглинання вологи та сприятлива крива склування. Стабілізатор со грегалоза є особливо придатним для створення стійкого до температури біологічного середовища. |Див. патент «Е

США Мо4 891 319; Козег, Віорпагт. 4 (8):47-53,1991; СоІасо еї аї., Віо/Гесппоїоду 10:1007-1011, 1992;

Аїагідде, Сепеїйїс Епдіпеегіпд Мемув, Магсй 15, 1995, стор.10-11). со 35 Ферменти для даного винаходу приготовляють у рідкій формі, наприклад, як сиропи з сорбітом або ї- гліцерином для зниження активності води та стабілізації білка. Такі розчини перед фармацевтичним застосуванням, як правило, стерилізують фільтруванням.

Як зазначалося раніше, даний винахід в одному з аспектів стосується забезпечення ферменту як компонента корму або кормового продукту. Корми складаються, головним чином, із зернового матеріалу, джерела білка, « 40 Вітамінів, амінокислот та мінералів. Зерновий матеріал зазвичай включає кукурудзу, сорго, пленицю, ячмінь або пт») с овес. Джерелом білків можуть бути, наприклад, боби або горох. Прикладами мінералів, амінокислот та вітамінів є В.о, вітамін А, пантотенова кислота, ніацин, рибофлавін, К, 0 -метіонін, І-лізин, холінхлорид, фолієва ;» кислота, дикальційфосфат, сульфонат магнію, сульфат калію, карбонат кальцію, хлорид натрію, селеніт натрію, оксид марганцю, йодат кальцію, оксид міді, оксид цинку та О-активований тваринний стерин. 45 Для застосування в кормах рідку ферментну композицію приготовляють із сольовим розчином (наприклад, -і масі, 15-1895 (маса/маса)) або сиропом для зниження активності води та запобігання розвиткові мікробів у концентрованому продукті. Прикладами інших випробуваних хімічних консервантів для кормів є бензоат натрію, со пропілпарабен, сорбат натрію або калію та аскорбілпальмітат, які також застосовують для запобігання їх можливому псуванню Через розвиток мікробів у продукті. |Див. Аззосіайоп ої Атегісап Реей Сопіго! Опісіа!в, 50 Іпс., ОПісіаї Рибіїсайоп 2000, Частина 18, "Спетіса! Ргезегуаймев", стор.215-217, ІЗВМ 1-878341-11-11.. Ці со консерванти можуть бути застосовані в кормах шляхом гранулювання з розведенням у великій кількості з

Ф застосуванням технології автоматичного розпилення. |Див. Родде еї аї, Рееазішіїв5, Зеріетбрег 29,1997). Такі рідкі композиції можуть містити стабілізуючі вуглеводи, такі як сорбіт або гліцерин, якщо вони є сумісними.

Для підвищення ефективності можуть бути включені матеріали, які є необхідними компонентами кормів, такі як дво Інші ферменти або вітаміни, нестійкі при нагріванні.

У випадках, коли корм застосовують у формі негранульованого місива (тобто без термообробки), ферменти

Ф) для даного винаходу пропонуються у вигляді сухого концентрату для додавання у змішувач кормової суміші. Такі ка сухі ферментні концентрати одержують, спочатку концентруючи рідку ферментну композицію з використанням а

Ка МмММУс або іншого підходящого ультрафільтра для досягнення високого відсоткового вмісту ферменту, а бо потім змішуючи з дуже сухим носієм, таким як кукурудзяна крупа, соєва крупа, або навіть з інертним матеріалом чи нерозчинною сіллю, прийнятною для використання в кормах. Див. ОПісіа! Рибіїсайоп, Атегісап Реед Сопігої!

ОгпісіаІв, зирга, Рагі 582, "Зура(апсез депегаїПу гедагадеасй аз заїе іп апітаї Тееав".

Існує багато способів утворення ферментів для функціонування у травному тракті, достатньо стійких при низьких температурах, щоб витримувати процес гранулювання у кормодробарках, зберігаючи достатню 65 активність. Загальновідомо, що модифікація структури білка, насамперед, через зміну кодуючої послідовності

ДНК або, у другу чергу, через хімічну модифікацію, може надавати ферментам більшої стійкості проти інактивації. Ілюстрацією цього є застосування хімічного зшивання кристалів ферменту. Див. СоїІйпе еї аї,

Огдапіс Ргосезз Кезеагсп апа ЮОемеіортепі 2(6):400-406, 1998). Інший спосіб підвищення стійкості ферменту для даного винаходу пов'язаний зі зміною амінокислот шляхом мутагенез гена, який кодує потрібний фермент, або одержання генів чи частин генів для перестановок. |Див. Статегі еї аіЇ., Майте 391:288-291, 1998; Агпоїа,

Маїшге ВіобесппоїЇ. 16:617-618, (1998); 2пао еї аїЇ., Маїшге ВіоїесппоЇ. 16:258-235, 1998; 2пао апа Агпоїа,

Ргоївіп Епа. 12:47-53, 1999). Можливо також здійснити мутацію та відбір на "спрямовану еволюцію" ферментів з потрібними властивостями. Наприклад, |див. Сімег еї аї., Ргос. Май! Асад. сі. ОБА 95:12809-12813,1998; ІП іао еї а, Ргос. Маг! Асад. Зсі. ОБА 83:576-580, 1986; СпПе!ту еї аі!., Майиге ВіоФїесппої!. 17:379-384,1999). 70 Деякі модифікації білків, включаючи глікозилування, РЕС-ілування та сукцинілування, також можуть підвищувати стійкість і змінювати оптимальні показники рН - характеристики, які можуть бути оптимізовані для ферменту, який має використовуватися згідно з даним винаходом. Таким чином, можуть бути застосовані відомі протоколи для одержання модифікованого ферменту для випробування згідно з прикладами, з метою перевірки придатності для способів згідно з винаходом. 15 Ефективний спосіб вироблення РІ-Р/С було виявлено при клонуванні гена В. сегеиз у В. тедайегт.

Експресійна система |(Кудиз апа Нійеп, Аррі. Місгобріо!. ВасіегіоЇ. 35:594-599,1991| використовує елементи з регулону ксилози Васіїїиз тедаїйегішт |Кудиз еї аї., Агсп. МісгобіоІї. 155:535-542,19911| і постачалася на ринок від ВІОІОЇ Согр. (Мівіа, Саїйогпіа). Створювалося злиття між лідерною кодуючою послідовністю РіІ-РІ С гена та першими трьома амінокислотами гена В. тедаїйегцт хуїА у плазміді, стабілізованій резистентністю до 2о тетрацикліну і регульованій чутливим до ксилози репресором. Штами цього типу з посиленою експресією забезпечують реальний засіб виробництва РіІ-РІ С у промислових кількостях для включення до раціону тварин згідно з даним винаходом.

Деякі ізоляти Васійи5 сегенз виробляють антибіотики, такі як тунікаміцин. |Див. Катодазвзнпіга еї аї.,

Адтгіс. Віої, Спет. 52:859-861, 1988). Ще один ізолят Васіив сегеиз (АТОС 53522) описано у |патентах США МоМо4 с ов ЗТ 738 та 5 049 379) як агент біоконтролю для запобігання загибелі рослин від мільдью та гнилі коренів рослин. Вважають, що цей вплив є результатом дії двох антибіотиків, які отримали назви "цвітерміцин," і) лінійний амінополіол, 396 Дальтон, та "антибіотик В", аміноглікозид. У прикладах, детально описаних нижче, можливість залучення цих двох антибіотиків усувалася через виключення можливих антибіотиків з низькою молекулярною масою з ферментної композиції. Ге зо Зокрема, за допомогою мембрани з виключенням молекулярної маси 10 Ка концентрували безклітинний ферментативний бульйон. Для подальшої обробки використовували концентрат, який містить білок, більший за со

Ка. Антибіотики малої молекулярної маси, такі як описані Гандельсманом (НапаеїЇзтап, зирга), проходять «г крізь цей фільтр. Крім того, застосовували осадження сульфату амонію, щоб осадити білки великої молекулярної маси, залишивши матеріали низької молекулярної маси у розчині. Після повторного розчинення осаду сульфату со з5 амонію одержаний в результаті ферментний розчин діалізували на буфері, піддаючи додатковій обробці з ча видаленням антибіотиків з низькою молекулярною масою. | нарешті, білок осаджували вдруге, знову з сульфатом амонію, для перенесення будь-якої решти сполук з низькою молекулярною масою до розчину.

Комбіноване застосування цих чотирьох видів обробки майже виключає можливість зумовлення антибіотичного впливу, який спостерігають, антибіотиком з низькою молекулярною масою, який виробляється «

АТСС 6464 або АТСС 7004. Ферментативний бульйон також піддавали випробуванню випробувальним штамом 2-2 с Е. соїї на присутність антибіотика, але ніякої антибіотичної активності не було виявлено.

Даний винахід далі описується з посиланням на нижчеподані пояснювальні приклади. ;» Приклад 1. Одержання заморожених вихідних культур Васійив сегениз АТСС 6464 та АТСС 7004

Склянки з ліофілізованими клітинами з АТСС відкривали й інокулювали у висівне середовище, яке бКкладалося з Атрбрепегт 4015 (Кей 5іаг), 10г/л, Атрегех 695 (Кей (аг), 5г/л, та хлориду натрію, 5г/л, рН7,0, -І і вирощували при 302С. Первісну культуру наносили штрихуванням на агарові планшети з ІВ-бульйоном, отриману в результаті єдину колонію знову інокулювали у 2Омл висівного середовища у 250мл колбі з бо перегородкою (ВеїЇсо) і вирощували зі збовтуванням при 309. Коли густина культури досягала ОО 600 з т» показником 1,5, додавали стерильний гліцерин до приблизно 1095 (об'єм/об'єм), і склянки, які містили 1,8мл

Культури, заморожували при -8020. бо Приклад 2. Вирощування ізолятів АТСС 6464 та АТОС 7004 Васійив сегенз для одержання специфічної до 4) фосфатидилінозиту фосфоліпази С

У два ферментатори Віозіаї С, по 30 літрів кожен, подавали середовище такого складу у водопровідній воді: живильний бульйон Мо2 (Охоїід), 25г/л, триптон (Оіїсо), ЛОг/л, екстракт дріжджів (Осо), 10Ог/л, та протиспінювач Маги ЮОРІОР Моаї 1 (ВАР), О,їмл на літр. Первісний об'єм порції становив 9,5л, і бульйон о стерилізували при 1212 протягом 40 хвилин. Первісний рівень рН доводили до 7,0 газоподібним аміаком після стерилізації. їмо) Висівні культури приготовляли у 500мл такого самого середовища у 4-літрових колбах для збовтування з перегородками з приєднаним через силіконову трубку аспіратором (Веїсо) зі з'єднувачем для інокуляції. Колби 60 стерилізували в автоклаві при 12123 протягом 50 хвилин до інокуляції 1,8мл замороженої вихідної культури, одержаної з партії АТТС (Приклад 1). Культури з колби для висівання вирощували при 302С протягом 5,5 години зі збовтуванням при 200об/хв в інкубаторі з регульованим середовищем (МВ5 модель 0-25). Перед інокуляцією культура АТСС 7004 мала показник ОЮвоо 1,53 і рНб,58. Культура АТСС 6464 мала ООвоо 1,28 і рнНб,79.

Б5О0Омл висівних культур інокулювали у (Пе З0-літрові ферментатори і обробляли за таких умов: температура бо 309С, змішування бОбоб/хв, повітряний потік 10 літрів на хвилину, і тиск О,5бар. ОО вро первісної культури становив 0,81. Через шість годин ферментацію припиняли з кінцевим показником ОО воо 22,1 (АТСС 7004) і 242 (АТСС 6464). Ферментація проходила без регулювання рн, і кінцевий показник рН становив 8,17 (АТСС 7004) і 8,13 (АТОСС 6464). Бульйон забирали з ферментатора і охолоджували до 82С перед подальшою обробкою.

Ферментатори запускали вдруге, застосовуючи фактично ту ж саму процедуру з обома ізолятами АТСС

Васійив сегеийв. У цьому разі висівні культури використовували шість годин при ОЮОсоо 2,86 (АТОСС 7004) і 1,98 (АТСС 6464), та рнб,69 (АТСС 7004) і 6,65 (АТСС 6464). Основна ферментація тривала протягом 6,5 годин з кінцевим ОЮвоо 35,9 (АТСС 7004) і 33,6 (АТСС 6464). Кінцевий рівень рН становив 8,38 (АТСС 7004) і 8,47 (АТСС 6464) на час охолодження. 70 Приклад 3. Видалення клітин шляхом фільтрації та концентрація ферменту РІ-РІЇ С

Видаляли і промивали клітини з кожного з чотирьох ферментаторів, описаних у Прикладі 2, застосовуючи два послідовно з'єднані Змм фільтри АЛЗ Тесппоїоду (ШЕР-500-К-6А) з порожніх волокон 500000 з виключенням молекулярної маси (500 Ка МММУУС). Охолоджений бульйон перекачували крізь фільтри перистальтичним насосом при швидкості 2 літри на хвилину з рециркуляцією знову до резервуара для утримування. Розчинену 7/5 речовину, яка містила фермент, збирали до резервуара, охолодженого на льоді. Первісний об'єм бульйону, що містив клітини, приблизно 9 літрів, концентрували до приблизно 2 літрів, і в цей момент розпочинали розчинення в 10мМ Ттіз-НСІ, рНаВ,5. Після того, як було зібрано приблизно 14 літрів розчиненої речовини, промивання клітин припиняли. 500 Ка розчиненої речовини (приблизно 14 літрів з кожного ферментатора) концентрували, застосовуючи два послідовно з'єднані О0,5мм фільтри А/5 Тесппоіїосду (ШЕР-10-С-4ХТСА) з порожніх волокон 10000 з виключенням молекулярної маси (10 Ка). Застосовували такий самий спосіб перекачування з рециркуляцією концентрату, за винятком того, що розчинену речовину зливали. Кінцевий концентрат в об'ємі приблизно 500мл з кожного ферментатора зберігали для наступного етапу обробки.

Приклад 4. Подальше очищення та концентрація ферменту РІ-РІ С с 10 ка ультрафільтрований концентрат (Приклад 3), одержаний після кожної ферментації Васійив5 сегецв, доводили до 8095 насичення сульфатом амонію і перемішували на льоді протягом 6бО хвилин. Розчин о центрифугували протягом 15 хвилин при бОООбоб/хв у роторі Зогма! З5А. Спливаючий шар видаляли, а осад розчиняли у мінімальному об'ємі Л0мММ Тгіз-НСІ, 0,2ММ ЕОТА (рн?7,5), а потім діалізували у холоді на тому самому буфері. Ге)

Рівень білка у кожному концентраті вимірювали, застосовуючи аналіз зв'язування з барвником (ВіоКад), а рівень РІ-Р С вимірювали (|Непагіскзоп еї аї, Вісогд. Мед. Спет. І ейеге 1:619-622,19911), застосовуючи спосіб со виявлення на основі НРІС та флуоресцентний субстрат (Моіесшаг Ргоревз, Іпс., Р-3764,1-піренбутил «І міо-інозит-1-фосфат, літієва сіль). Нижче у Таблиці 1 показано зведені дані та прогнозовану приблизну чистоту і загальну кількість чистого ферменту, одержаного для кожної з чотирьох композицій. Ферментні композиції со

Зберігали замороженими при -202С до подальшої обробки. ї- 5 20 РІ-Р'С, мг - - ї» : 2 На основі припущення, що 10095 чистий білок має питому активність б0Ш/мг (Непагісквоп, вирга). (ее) їз Приклад 5. Об'єднання і концентрація ферментних композицій до застосування в раціоні тварин

Ферментні композиції 1, 2, З та 4 об'єднували в загальному об'ємі 675мл. Поволі додавали сульфат амонію (ее) 50 (492г) і розчин перемішували на льоді кілька хвилин Розчин центрифугували для збирання осаду. Гранульовану

Ф фракцію розчиняли у мінімальній кількості 20мММ фосфатного буфера (рн7,0).

В результаті було одержано 70,9мл розчину з густиною 1,057г/см3. Концентрація білка становила приблизно 25,5мг/мл. Активність РІ-Р/С становила приблизно 1,130/мг при розрахованій чистоті РІ-Р/С 1,8895. Увесь вв розчин заморожували при -202С, давали відтанути і застосовували для рівномірної обробки 200 фунтів корму для курчат. (Ф) Приклад 6. Клонування та експресія РІ-РІ С гена Васійиз сегеиз у Васійив тедайегішт ко Секвенували ген, який кодує специфічну до фосфатидилінозиту фосфоліпазу С (РІ-РІ С). |Див. Кирре еї! а), у.

Васіегіої. 171:6077-6083, 1989). Застосовуючи технологію полімеразної ланцюгової реакції (РСК), РІ-РІ С ген бо Клонували з хромосомної ДНК Васійив сегеиз (АТОС 6464). Застосовували вектор експресії, РМЕСА (ВІО 101,

Мівга, СА), для Васійнв // тедайегішт. Було синтезовано два праймери РСК, а саме, 5-САСТАСТААТААСААСТТААТТТТО-3" (праймер 1) та 5-СООСБАТОСС АТАТТОТТОСТТАТТОО-3" (праймер 2), з ділянкою Зреї у праймері-1 та ділянкою Ватні у праймері-2.

Посилений РОК РІ-РІ С ген лігували у ЗреІ-Ватні ділянку РМЕСА і одержували плазміду рСОоб82. РІ-РІС в5 білок зливали з першими трьома амінокислотами хуїА генного продукту в ділянці Зре! у векторі експресії.

Експресія РІ-Р С гена відбувалася при регулюванні ху(А промотора. Ферментацію у колбі зі збовтуванням застосовували для визначення вироблення специфічної до фосфатидилінозиту фосфоліпази С у ВасшШив тедаїйегішт. І В-бульйон з 1Омг/мл тетрацикліну (20ММ) інокулювали з 0,2мл висівної культури і інкубували у струшувані при 372С і 250об/хв. При ООсоо приблизно 0,5 додавали 5г/л О-(ї)-ксилози для утворення хуЇїА промотора. Через три години спливаючий шар збирали шляхом центрифугування. Активність специфічної до фосфатидилінозиту фосфоліпази С вимірювали способом флуоресцентного субстрату |Непагісквоп, еї аї.,

Віоспетівігу 31: 12169-12172,1992; Непагісквоп, АпаЇ. Віоспет. 219: 1-8, 1994), використовуючи 1-піренбутил-міо-інозит-ї -фосфатний субстрат (МоЇІесціаг Ргобез, Ейдепе, ОК) і застосовуючи виявлення шляхом НРІ С. (Ш/мг білка)

Частиниляуєтти 0 5 В тедетитсовю 10117010

Вотеоеляттсяв 1010710 ю Частини ферментативного бульв! 1111111 5 теовелитсввв? 00111710

Вотеоіелитьсявв 010710 сч 25 Ці дані показують, що більша частина РІ-РІ С є позаклітинною, і що експресія відбувається лише після (о) додавання О (ж) ксилози (Таблиця 2). За розрахунками, цей рекомбінантний штам має щонайменше у 15 разів вищу продуктивність (мг/л/О0), ніж середній штам дикого типу, який вирощували у Прикладі 2.

Приклад 7. Ферментація В. тедай(егішт для вироблення РІ-РІ С с

В. тедайегішт/рСо682 описаний у Прикладі 6, використовували для вироблення РІ-РІ С шляхом ферментації.

Середовище (РМ) для етапів висівання та ферментації містило 20г/л Атрепегт 4015 (Опімегва! Ріамогв (ее)

Віопшігіепів, Іпаіапароїїв, ІМ), ЛОг/л екстракту дріжджів Атрегех 695 (Мпімегва! Ріамогв Віопигіепів, «

Іпаіапароїїв, ІМ), 1Ог/л МА Саве Ріиз (Оцезві Іпіегпайопаї!, Ноїйтап Езіагез, І), 2,Ог/л КоНРО,, О,1г/л Ма5О,-7НоО і спочатку 2,0г/л глюкози та 12,5мг/л тетрацикліну. Рівень рН доводили до 7,5. с

Етап висівання (50Омл у 2,8-літровій колбі з перегородкою) започатковували шляхом інокуляції з чн замороженої висівної склянки і збовтування при 250об/хв і 302С. Висівні склянки підготовляли шляхом додавання окремої колонії, яку вирощували на планшеті з І В-агаром, до 20мл РМ у 25О0мл колбі для збовтування. Після вирощування до приблизно 1,0 ОО бою при 3023 додавали 5мл 5095 стерильного гліцерину, змішували і розчин розподіляли по 2мл пластмасових стерильних склянках і заморожували при -6026. «

Б5ООмл висівні колби використовували після вирощування до приблизно 1,2-1,8 ОО вро нм після 9 годин - с збовтування. Дві колби використовували для висівання у бОо-літровий ферментатор, заповнений 50л того ж ц самого стерилізованого парою середовища. Тетрациклін стерилізували фільтруванням (0,2-мікронний фільтр) як "» 196 розчин у 4095 етанолі і додавали після стерилізації та охолодження до 30 «С. У ферментатори також додавали О,Тмл/л протиспінювача Маги ОРТОРМООТ11 (ВАЗЕ, Сигпее, І) у первісному об'ємі, який додавали у разі потреби для стримування піни під час ферментації. Робочі умови для етапу висівання у першому - І ферментаторі були такими: тиск від 0,5 до 2,5рзід; температура 302С-0,59С; струшування при 200-45О0об/хв; со барботування повітрям 25-50 ЗІ РМ; розчинений кисень 225905. Показник рН контролювали на рівні від 6,9 до 8,1, застосовуючи 21,2595 НзРО, або 5М Маон. Коли показник ОЮОсоо досягав 8-10, вміст використовували для т» висівання у б00-літровий ферментатор, що містив 425л такого самого середовища. со 50 Робочі умови 6О00-літрового ферментатора для продукування були такими: тиск від 0,5 до 2,5 рвзід; температура 302С--0,52С; струшування при 100-300об/хв; барботування повітрям 250-500 5І РМ; розчинений 42) кисень 22595. Показник рН контролювали на рівні від 6,9 до 8,1, використовуючи 21,2595 НеРО, або 5М Ммаон.

Коли через 5 годин при ООвоо приблизно 17 вичерпувалася початкова глюкоза, розпочинали подачу ксилози (яку було попередньо стерилізовано автоклавуванням при 1219 протягом 20 хвилин і яка складалася з 1Окг

Ю-()-ксилози та 10 літрів води). О-ксилозу отримували від Магзаї! Іпвігитепів, Мем дегвеу. Подачу розпочинали

ГФ! при 25мл/хв і здійснювали на цій швидкості 1,5 години, а потім посилювали до 4Змл/хв. Другу швидкість підтримували доти, доки не витрачалися всі 22,5 літра ксилози. Рівень розчиненого кисню підтримували, о ступінчасто посилюючи барботування повітрям на 50 БІ РМ до 500 5І РМ. По досягненні повітряного потоку 500

ЗІРМ збільшували кількість обертів на хвилину. Ферментацію припиняли Через 20 годин. За 17 годин 60 накопичувалося 7440Ш/л (одиниці визначено у Прикладі 4).

Ферментативний бульйон збирали, застосовуючи Раї! Рійоп СІО 5Кій та чотири модулі СеїІРіо Місгодоп (мембранні пори 0,2мкм, волокна діаметром їмм, 3,3м7). Розчинену речовину, пропущену крізь 0,2мкм мембрану, концентрували, застосовуючи !Т100 РаїЇ Рійоп 5Кій з ультрафільтраційною мембраною від

Ас/Гесппоіодіез, розмір 85 10К. Об'єм кінцевого концентрату становив 10 літрів, і його заморожували при -2026. бо Приклад 8. Ферментативний бульйон Васі: сегеиз не мав антибіотичної активності

Ферментацію з Васі сегеиз (АТСС 7004) здійснювали згідно зі способом, описаним у Прикладі 2, за винятком того, що первісний об'єм збільшували до 20 літрів. Випробування на присутність антибіотика здійснювали з В. сої МО! 655 як тестовим штамом з кінцевим ферментативним бульйоном або частково очищеним РІ-РІ С, приготовленим згідно зі способом, описаним у Прикладах 3-5. Випробування здійснювали шляхом аналізу на циліндрах. Див. Вгапіпег, Рпагталіе 52 (1):34-40, 1997). Чистої зони, яка свідчила б про антибіотичну активність, навколо циліндрів, що містили зразки ферменту, не спостерігали.

Приклад 9 Випробування РІ-РІ С шляхом флуоресцентного аналізу мікротитрувальних планшетів

Було розроблено удосконалене біохімічне випробування для РІ-РІ С способом Хендриксона (Непагісквоп еї /о а. (вирга)), застосованим у Прикладі 4. Субстрат 4-метилумбелліферил-міо-інозит-1-фосфату,

М-метил-морфолінову сіль отримували від Віозупій (МарегміПе, ПШіпоіїв). Реакції спостерігали у зчитувальному пристрої для флуоресцентного аналізу мікротитрувальних планшетів Ріоигозсап ІІ від МТХ Гав Зузіетв (Міеппа,

Мігдіпіа). Для аналізу ферментативного бульйону або ферментних концентратів у чорних пластмасових мікротитрувальних планшетах приготовляли 200мкл реакційної суміші, яка складалася з 10мММ Ттів-СІ, 0,1690 /5 деоксихолату, 0,8ММ 4-метилумбелліферил-міо-інозит-1-фосфату, М-метил-морфолінової солі та розведеного ферменту, рН8,О. Розведення ферменту в разі потреби здійснювали у 0,195 розчину ВБА у воді. Реакцію проводили при 372 протягом 30 хвилин зі зчитуванням з 2-хвилинними інтервалами для спостереження вивільнення метилумбелліферону з субстрату зі збудженням при З5Онм та емісією при 45Онм.

Для розрахунку одиниць (мікромолів на хвилину), утворених на кількість доданого ферментного розчину, 2о застосовували кореляцію одиниць флуоресценції з мікромолями метилумбелліферону. Реакція при рН8,О являє собою компроміс між рівнем рН, оптимальним для ферменту, та рівнем рН для максимальної флуоресценції метилумбелліферону (рНІтТО0). Крім того, при рНО і вище швидкість неферментного вивільнення метилумбелліферону стає значною. За цих умов аналізу питома активність (ОД/мг) є приблизно у 39,3 рази вищою, ніж при застосуванні способу Непагіскгоп еї аї, (зирга). Для ефективності випробувань в експериментах с

З раціоном тварин одиниці, виміряні з застосуванням цього аналізу, перетворювали на еквівалентні одиниці

Хендриксона для можливості порівняння з першими випробуваннями до застосування цього аналізу. о

Приклад 10. Аналіз РІ-РІ С, який додавали в ефективних дозах до раціону тварин

Для вимірювання ферменту після додавання до раціону тварин було розроблено аналіз РІ-РІ С на основі більш чутливого варіанта 4-метилумбелліферил міо-інозит-1-фосфату, М-метил-морфолінової солі (Приклад 9), «о який передбачає один рівень рН для аналізу та інший рівень рН для вимірювання флуоресценції. Фермент видобували з кормового матеріалу для випробувань шляхом зважування 4г корму та додавання його до 20мл со 1ОММ Ттів-СІ (рН7,5) з 0,195 деоксихолату для одержання 20г/л. Цю суспензію струшували у струшувачі МВ «І 0-25 (Мем Вгипемжіск Зсіепійс) протягом 1 години при кімнатній температурі і 25О0об/хв. Суспензію центрифугували при 13000об/хв у мікроцентрифузі ІЕС Місготах з 1,5мл пробірками для мікроцентрифугування. со

Відповідне розведення екстрактів здійснювали у 0,195 ВЗА (альбумін сироватки великої рогатої худоби). Зразки, ча видобуті з корму при ТООД/Б, не розводили.

Перший етап реакції. Пробірки готували таким чином. Включали пробірки зі стандартним 1:100 або 1:200 розведенням 0,12Од/мл РІ-РІ С (одиницю визначено як у Прикладі 4) та чисті пробірки. Зразки реакційної суміші мали бути накриті плівкою для захисту субстрату від світла. « 2Омкл Ттів-Неї, 0,10 М, рнНб,о шщ с 4Омкл деоксихолату (0,895) й 4Омкл РІ-РІ С-субстрату (4мММ) «» 100мкл ферменту 20Омкл/пробірку Тоїа! Кеасі при 2590

У два моменти часу (ЗОхв та бОхв) забирали 0,10мл кожної реакційної суміші. Аліквоти нагрівали при 6590 -і протягом 15 хвилин для зупинення ферментної реакції і охолоджували на льоді. | нарешті, зразки со центрифугували при 12000об/хв у мікроцентрифузі протягом 5 хвилин.

Флуорометричні показники. 120мА 0,10М Ттіз-буфера (рна,0). Тгіз-буфер додавали у мікротитрувальну лунку

Сг» в чорному пластмасовому планшеті, після чого перед зчитуванням, описаним у Прикладі 7, додавали ЗОмкл со 50 реакційної суміші. Віднімали фоновий контрольний рівень. Розраховували швидкість вироблення одиниць флуоресценції за хвилину. Одиниці флуоресценції перетворювали на мікромолі продукту реакції і розраховували 4) кількість одиниць ферменту, видобутого на первісний фунт корму.

Приклад 11. Випробування корму для курчат шляхом піддання дії патогену

Ї. Годування курчат-бройлерів. Випробування

Здійснювали перше випробування з годуванням, починаючи з самців курчат-бройлерів одноденного віку. У формі місива приготовляли типовий однорідний раціон "початкового корму" для курчат, який за о характеристиками відповідав або перевищував вимоги для продуктів живлення для птахівництва Національної іме) ради з досліджень (пиїгіепі гедцігетепів ог роцігу (9"ед., 1994)). Курчат розсаджували у клітки (площею 12х24 дюйми) по чотирьох дослідних групах, причому кожна група розподілялася на чотири однакові підгрупи, які 60 складалися з шести птахів на одну клітку (Таблиця 3). Воду та корм давали без обмежень протягом усього 21-денного періоду випробування. Курчат по клітках і клітки по групах розподіляли шляхом рандомізації по групах. Усі клітки, годівниці та напувалки перед початком випробування піддавали дезінфекції. Освітлення лампами розжарювання було безперервним (24 години на добу). Масу тіла визначали на перший та 21-й день.

Споживання їжі вимірювали на 21-день. 65 На 5-й день кожного з курчат пероральним шляхом інфікували 200000 социст Еітегіа асегуціїпа. На 7-й день усіх птахів додатково інфікували 500000 Сіовігідічт рептгтіпдепе через споживання ними води. Негативні контрольні групи (Т1) лікуванню від інфекції не піддавали. Позитивним контрольним групам (12) з кормом давали антикокцидіозні та антибіотичні засоби. Це були засіб антикокцидіозного лікування бЗасох (бОг/тонну саліноміцину) та антибіотик ВМО-50 (5Ог/тонну). Для підданих лікуванню груп, ТЗ та 74, застосовували оброблений ферментом РІ-РІ С дикого типу корм (приблизно 0,34г РІ-РІ С на чистій основі), починаючи з п'ятого дня під час перорального введення Еїтегіа асегуціпа. Увесь корм приготовляли однією однорідою партією, а потім розділяли для додавання антибіотика (Дослідна група 12) та ферменту (Дослідні групи ТЗ та Т4).

Результати аналізу маси птахів представлено в Таблиці 4, а розрахунки годування/додавання у вазі представлено в Таблиці 5. група Мо ле еетивний юютольнеме 11111111111111104185 5 Ло Позитивний. контроль Антикокцидіозне та саліноміцинове люувантя 55 73 РІРіодиюютиу заг ферменту атонту чиста сен) 00205 ла |РіРІСдикоютипу озаг ферменту на точну (чиста основа) 1416 см 2 о вті вва |в ю зо со (см. твоз|1оз ово 4то « с зв м « о 2 с їз» вт 15611158 18 щі -І

Го! В обох представлених вище таблицях, середні значення в ряду без літер мають значні розбіжності (Р «0,05), за тестом Дункана. ве ІІ. Годування курчат-бройлерів. Випробування ЇЇ о 50 Здійснювали друге випробування з годуванням, починаючи з самців курчат-бройлерів одноденного віку. У формі місива, для забезпечення однорідності, приготовляли базовий раціон, який за характеристиками 0 відповідав або перевищував вимоги для продуктів живлення для птахівництва Національної ради з досліджень (пигієпі гедцігетепів ог роцігу (917 ед., 19943). Дослідження здійснювали шляхом випадкової вибірки у клітках для перевірки впливу РІ-РІ С з природного джерела, Васіїїиз сегейз (РІ-РІ С дикого типу), або рекомбінантного Васішв тедаїйегішт, на характеристики бройлерів, вирощених до 21-денного віку. Природне джерело також

ГФ) містить інші позаклітинні ферменти, але РІ-РІ С, одержаний з Васійй5 тедайегійт, є високоочищеним, і його піддавали подальшому очищенню шляхом ультрафільтрації з застосуванням 30 Ка мембрани ММУУС. Птахів о інфікували на 8 день життя кокцидіозом птахів (200000 ооцист Е. асегуціпа на кожного з птахів з водою для пиття), а та 10-й день життя - Сіовігідіцт рептіпдепе (100000 на кожного з птахів з водою для пиття). Кожна 60 з дев'яти груп (Таблиця 6) мала 10 підгруп або кліток. Кожна клітка вміщувала б вакцинованих (Мем/сазе-Вгопспйіз, Магекв) самців бройлерів СоррхСорЬ, з площею по 0,40 квадратних футів на кожного птаха. Померлих птахів, якщо такі були, після 8-го дня не забирали. Корм давали у формі місива без обмежень протягом усього періоду випробувань (з 0 по 21-й день).

Однаковий необроблений базовий раціон у формі місива, який не містив антибіотиків, давали всім птахам з 0 65 по7-й день. Після цього з 8 по 21 день давали дев'ять оброблених раціонів у формі місива. Базовий корм являв собою типовий початковий корм для бройлерів, який містив 22906 необробленого білка, з МЕ (вмістом засвоюваної енергії) 140Оккал/Ір. й 20000000 |Бацитрацин метилен дисаліцилат (ВМО, 5Ог/т) та Саліноміцин (Засох, бОг/т) о пт РІРІС (1ООДЛ/Ь) та інші позаклітинні ферменти з Васійи5 сегеи5 ів 1 200 000 ооцист Е. асегуціпа давали кожному з птахів з водою для пиття на 7-й день, а у віці 1 днів - 100000 бактерій Сіовігідіит регітіпдепе на кожного з птахів з водою для пиття. - -

Таблиця 7. Годування курчат-бройлерів, Випробування ІЇ

Обровка ши че тв - Щ

Інфекція я |. - її ги Ж к і. й | с -Е:.. т-: А. - ЙЗЦУЧ--- «От - пня ---- - 65 Ге)

Тип РІ-РІ С -4ї Рек ІРек/ ІРеко реко Дт Рек." : !

Задан. ОДЛЬ т З о двю 096 00 1-1 ую (те;

Середн. вимів. 0,36 оз пе? ої 174 вав гав осол2 58 со

ОДлЬ

ІНвіех І ! . - --- 1... «

ІДодавання У вназіз0е т» 533,53 зга га | ЗР, тв |323,64 |за віра ВІЗ г

Із В по 21 день : : г) 3о Ще са ав со ав 6 аб |в де а т : : . в--- . -

Перетворення таб Баг о исе |за оба ие |в (101,50 корму, 8-21 день ! : випраенпено с. | - . ! « с Сер. показник |1.447 |0,833 для» |сярв 4,67 |(дояз |б84т "в кишкового ! п раження ин Шо що а. А Їве а ал |в |в -І (ее) ТРекомбінантний РІ-РІ С, вироблений Васіїйв тедагегічт. 2 РІ-РІ С дикого типу з Васіїйив5 сегецйв.

ЧК»

Зрівень додавання РІ-Р/С в цьому експерименті був надто низьким для ефективного видобування й бо вимірювання і являв собою фоновий рівень

Ф У першому випробуванні, коли бактеріальну інфекцію вводили з водою для пиття (Приклад 11-І), за всіма критеріями РІ-РІ С дикого типу, вироблений Васій5 сегецз, діяв так само або краще, ніж саліноміцин - ВМО (Таблиці 4-5). У більш пізньому випробуванні, показаному вище з рекомбінантним РІ-РІС (Приклад 11-11,

Таблиця 7), РІ-РІ С, який додавали у різних концентраціях, виявляв залежну від дози дію на зниження кишкового ураження та Перетворення корму (13-16) і збільшення додавання у вазі. Крім того, піддання дії рекомбінантного іФ) РІ-Р/С при 9ООД/БЬ, за відсутності саліноміцину - ВМО, знижувало показник кишкового ураження і мало ко позитивний вплив на перетворення корму та приріст ваги. РІ-Р С дикого типу з ВасіШ5 сегенз не був таким ефективним, як його рекомбінантний відповідник у тій самій концентрації (10Ш/Б) в цьому випробуванні. во І. Випробування ІІІ корму для курчат-бройлерів з ферментами. РІ-РІ С та ендо-1,4-3-О-мананазою

Дослідження здійснювали у випадково вибраних клітках Рейегвіте для випробування впливу РІ-РІ С та ендо-1,4-8Д-О-мананази (Патент США 5 429 828) на характеристики самців бройлерів, вирощених до 21-денного віку. Птахів інфікували на 8 день життя кокцидами птахів (75000 ооцист Е. асегуціїпа та 1250 ооцист Е. тахіта для кожного з птахів пероральним шляхом) і на 11, 12 та 13-й дні життя - Сіовігідійт репгіпдепз (щоденне 65 пероральне введення їмл свіжого культурального бульйону, який мав 10 Зстш/мл). Кожна дослідна група (Таблиця 8) складалася з 8 однакових підгруп або кліток, і кожна клітка вміщувала 14 Магекз-вакцинованих самців бройлерів СоррхСорЬ (кількість яких знижували до 10 на 14-й день, коли 4 птахів з кожної клітки забирали і знімали показники ураження), де на кожного птаха відводили по 0,3бкв. фута площі. Померлих птахів забирали з кліток, коли їх виявляли, і новими не замінювали. Корм давали у формі місива без обмежень протягом усього періоду випробування (з 0 по 21 день).

Раціон давали у формі місива з 0-21-денного віку. Базовим кормом був типовий початковий корм для бройлерів, який містив 22965 необробленого білка, з МЕ 140Оккал/Ір.

Таблиця 8. Експерименти з обробкою корму дпя курчат-бройлерів,

Е т-- ипразування ПІ ин - - «- « - - й ул нини - 56565 4 6 ': -

Обробка |Лікування! (Інфікування? Р-РС Маначала? з . - - і. ! - т Жити Тнипичиниш дО ги --. ШЕ 10000000 МОП

З ,". ця - - а КВ поомодя

В - ь в-і С дикого тилу (101-

ОДлЛОЗЬ вчроблений васйв

В - 4 - -:- - -102ЗВ0000000Ш00 ЩЕНЯ

Е Не - Рекогмічантний РР СІ- ! : (30 ОДіВ)Ю виросСпений сч в шк нн под зреое люджовнт, ря 7 й т ігекомбінантяий РІС (11100 МОДІ о

ОДГЬ), вироблекий Бастшиев чо пня я се нн пня Ї пи, ШИ т піс у, ЕК я пт в - т Рекомбінантямії РІАРІ С гЗп01100 Мод Ге) зо | СДАБі. вироблена? Васуйев

Я й Що | Й ітедайвнит . со а ня ни - - «І 10 - я і Рекомп нантний РІ-РІ Є СЯ0Н- с

І Ї СДАБІ виройпений Влєнигх

ВАЗ КАШ 9 5 :533.-.....ШМВОВІНОШТІ и т

Раціон містив бацитрацин метилен дисаліцилат (ВМО 5о0г/т) та саліноміцин (Засох, бОг/т) 2100 МОД/Т дорівнює 100х105 одиниць активності на тонну корму «

ЗПтахів інфікували на 8-й день життя 75000 ооцист Е. асегуціпа та 1250 ооцист Е тахіта на кожного птаха пероральним шляхом і на 11, 12 та 13-й дні життя - Сіовігідіюгп репгіпдепз шляхом щоденного перорального - с введення свіжого культурального бульйону, який містив 10Усгти/мл. ч Перетворення корму коректували, враховуючи різницю середньої маси птахів для порівняння способів и? . Я : о лікування. Інфекція погіршувала АР/З (скоректоване за масою перетворення корму) приблизно на 23905 (0,147

АР/б одиниць). Використання саліноміцину та ВМО повністю відновлювало АРБ/5 до нормального рівня, але ці дві хімічні речовини були не кращі за комбінацію р-мананази та РІ-РІ С при зниженні викликаних інфекцією - кишкових уражень. Один мільйон (ЛТ00МОД) одиниць р-мананази на тонну, окремо або у комбінації з РІ-РІ С, о частково долав шкідливі наслідки інфекції, про що свідчить 65-7096 поліпшення щодо зниження АР/5, яке спостерігали у інфікованих контрольних птахів (див. ТЗ і Т1). Д-маназа знижувала показник кишкового ураження, ть викликаного Е. асегуцііпа, більше, ніж викликаного Е. тахіта. У інфікованих птахів, яких лікували РІ-РІС у

Ге | 20 складі корму, досягали часткового відновлення АРБ/б, але подолати вдавалося лише 33-4195 погіршення. Однак

Ф в обох класах РІ-РІ С знижувався показник кишкового ураження, викликаний обома видами Еїтегіа. У разі Е. тахіта зменшення ураження було статистично значущим. Результати показано у Таблиці 9.

Ф) іме) 60 б5

Таблиця 9. Випробування Ш корму для кхрчат-брайлерів з РІ-РІ.С та ендо- 1,4-0-0-мананазою, який давали курчатам, інфікованим Е, асегуцііна, Е, пахіта та С. Регйтищепе

Сблобке Спожиє., Псдерже. |Дабаватня У жива Панадн, кар коп вазі . па ТКраження 70 й ТваєІяа 7

М й-та- |Б- а Б-21 (0-21 |шщ-21 102? |8-21 |21-й |. Болт х. |Масе нача- СС о |йеньо |беньо|деньо |бень Ійее саень о |бйень о |всаг, де за Я і пор. з 1- и

Осн ся НИ са сс са сис с с С

МОДІ Й з так фев (но ЗмлоиєІвнли яви Зб Залевт ря сля зи зай Тіт 4 так ні 100 тбувутнх | дачею пд фев зані под г . вдо і- - зо

СД І. . -. - с

То |так 106 1Х рек | зола |влати |та Гллре |ллая фадяях (олля |1лє тд 1лЕЙ о модт ел) '

Так |Ні 12 гях век, | тою дар явір фявває |в |лятя | сови 1.47а моде |30 о Дадль |. 111 ї-оі 9 так Тая |ні І лк |даме ета |тдат? |ізомУ |пеиж о |ажелб о 4 ле ле | г)

Так |Так |Ні Їях рек. | тов: | лева | таад: святе |до" |одадж |та ти

Зо « оди 1 І 2 І І І (ее)

І 2 Інфікування "М - Лікування (саліноміцин (бОг/т) та ВМО (50Гг/т)). 3о ЗАЕ/З - скоректоване за масою перетворення корму (Обробка 1 Ірз 24 день"Обробка Х 1рев21 деньг)/3) - (спожитий корм/додавання у вазі (0-21 дні))

НетісеїЇ МОД - мільйон одиниць СпетСеп

ІМ. Годування курчат-бройлерів. Випробування ІМ «

Дослідження здійснювали у випадково вибраних клітках Рефегзіте для випробування впливу РІ-РІ С, мананази (Патент США 5 429 828) та грибкового ферменту мананази на характеристики самців бройлерів, З с вирощених до 21-денного віку. Птахів інфікували на 8-й день життя кокцидами (75000 ооцист Е. асегуціїпа і "» 1250 осоцист Е. тахіта для кожного з птахів пероральним шляхом, і на 11, 12 та 13-й дні життя - Сіовігідійт " рептіпдепе (щоденне пероральне введення свіжого культурального бульйону, який має 10 Зсти/мл) Кожна група розподілялася на 8 однакових підгруп або кліток Кожна клітка спочатку вміщувала 14 Магекз-вакцинованих - 45 самців бройлерів СоррхСобь (їх кількість зменшувалася до 10 на 14-й день, коли 4 птахів забирали для зняття показників ураження), причому на кожного птаха відводили по 0,3бкв. дюйма площі. Померлих птахів новими не (ее) замінювали. Корм та воду давали без обмежень протягом усього періоду випробування (з 0 по 21 день). Раціон їз давали у формі місива з 0-21-денного віку. Базовим кормом для груп обробки 1-16 був типовий початковий корм для бройлерів з кукурудзи/сої, який містив 2295 необробленого білка і мав МЕ 140Оккал/Ір. (ее) 50 Результати, зведені нижче у Таблиці 10, показують відновлювану перевагу додавання РІ-РІ С або мананази

Ф до кормів для курчат-бройлерів, інфікованих двома видами кокцид птахів та Сіовзігідіпт репгіпдеп5, що забезпечувало поліпшення щодо приросту ваги та перетворення корму. Важливим є те, що це дослідження показує, що РІ-РІ С або мананаза, у комбінації з саліноміцином, але без антибіотика ВМО (Випробування 6 та 5), відновлює характеристики по суті до рівня неінфікованих піддослідних птахів (МоМо1 та 2). Це свідчить про 59 антибактеріальну функцію У цьому разі РІ-РІ С/саліноміцин діяли дещо краще за мананазу і навіть краще за

ГФ) прийняте нині в США додавання комбінації ВМО та саліноміцину для інфікованих зграй (Випробування 4). іме) 60 б5

Табсмун 13 Гадунианнн курчав-брайпнуів, Ба прасування п 4 --. шен | 7 - .

Коасо (В отиєо (Перваж порчу пасів вля тах омели

Я ДА сЯгрнмо вс Зак Зі лжь. З овль лає Ма ня иа и-и тв дм: п ча - Кот кл ин. их ШЕННЯ ее ан ам тля Ст шилютрє ; п ' 2-4.- іні ми Ле т, Матх ска мит 4 ще ок пЧ Ше ил Мнє, ом НЯ а 2. ом. - зви пли міх ам пат 70 ДЕ НИМИ РЕННЯ ПЕРУН РУЧНІ РУДИ МУ МАМИН кими Р ча із пед мч Фк

Що ши |х ти. іа п-х жк, так :- ' я . Н . ' Н ' - г ж и п ЕРА ОН л1гз о гтнтм 2оовормев. дія лдФо лю из. руно пла -їЇ те: їв фе 02: Др пвх лю чані, " - 29- оїе ї- шал пк --7 Щи |» Й

НИ Іо Ївче Лю |та» шт На м, іх. ша: ;

КТ: ожсювш я пфікисаско ча Я корми мія ТО ЖК соми Б. йосбьеи й 1 йгдя

Сопіт сймеєру з похйнорерорилінии Црозця бро б 42 о гз росі ожегсл

Спивретють ра сли перрнлюєтія «появою з я: імсяпоо кнчлусипіного Ббеявна-у квня він ЗАСТ

Тож оелювніно ЗБ. з ресзкинантний СІ. пороююєном Мо лачдлиєяит гля чина у сть: ай Ло денс вналячайн 3. Провинд сні я

Мач ох од о мигує бици-1іА.- А Пазл енгоі іЙагт СІ, 5 й Бо: ву асдамиітя ж шльнтт 1 КЛ Ат їв теноня одна овечих і ня км. Зо че Сб ТЯСЛхТ

ТЯ жо Пачяввне Но ЯКУ, БАЛ Я би нааміска Не нн,

Приклад 12 Визначення впливу ферментів на життєздатність та клітинну інвазію споровиків Еїтегіа асегуціїпа та Еітегіа (епейа іп мйго

Споровики Еїтегіа асегуціпа або Еїітегіа (Їепеа та культивовані клітини нирок новонародженого хом'яка (ВНК) підготовляли способами, опублікованими у роботі |(Ацдивіїпе, Аміап апа Рошйгу Віоіоду Кеміємз с 11:113-122, 2000). Для попередньої обробки культури клітин вкривали розведеними ферментами, як описано у г)

Таблиці 11, і перевіряли на морфологічні зміни з 5 по 45 хвилини після вкривання. Через 45 хвилин культури моношару двічі промивали, потім інокулювали необробленими споровиками Е. асегуціпа або Е. (епеПа. Для застосування під час інфекції споровики суспендували у відповідно розведеному ферменті та безпосередньо після цього інокулювали в культури клітин. Після 45 хвилин інкубації культури фіксували, забарвлювали і ісе) визначали ступінь інвазії. со

Спостереження здійснювали, відшукуючи зміни у загальній морфології споровиків або клітин через обробку ферментом. На рівні ферменту, який використовували в цих експериментах, ніяких морфологічних змін помічено « не було. Інвазію споровиків на культивовані клітини після двох способів ферментної обробки, а також без со ферментної обробки, вимірювали через гістологічне забарвлення та мікроскопію. Див. Ацйдизіїпе, зирга.

Зо Дані у Таблиці 11 показують значне зниження інвазії споровиків, як при Е. асегуційпа, так і при Е. ї- іїепеМа. | відносно забруднений ферментний препарат Рі-РІ/С з позаклітинного бульйону В. сегецв, і високоочищений рекомбінантний РІ-РІ С, вироблений у рекомбінантному бульйоні В. тедаїйегішт, в результаті забезпечували статистично значуще зниження інвазії у більшості експериментів. Навіть у дозі, яка приблизно « дорівнювала дозі препарату РІ-РІ С дикого типу В. сегеиз, рекомбінантний препарат РІ-РІ С зберігав активність. -

Таким чином, попередня обробка клітини ферментом та вимивання ферменту були такими самими с ефективними, як і паралельне додавання ферменту під час інфікування. Однак досвід видобування ферменту з "» корму показує, що два етапи промивання можуть не видалити весь фермент. " Ферментний препарат з ендо-1,4-8-О-мананазою також викликав статистично значуще зниження інвазії в двох експериментах, коли клітини перед інфікуванням піддавали попередній обробці ферментом. Ці позитивні 49 результати включали один експеримент для кожного типу патогенів. Отже, мананаза, так само, як і препарат

Ше РІ-РІ С В. сегеив, знижувала інвазію споровиків іп міїго. (ее) щ» (ее) 4) іме) 60 б5

Таблнця 717. пт крб інжах ля кпїтнн ВН спорсчнкаюи Сібпогуі ясеюила бо

Если спа з ферментом сбробфкон | Вез нни. ткати ха каніянлрація рапогьо пхетані Тс юмни двлілалету ера л пасту нов па чає Іру вань 5 . «ЛЕВИ кякАКа ! І -бторіноя Е похтенуля 00 бопраб 1 | чани тТооихотюя Ви, о бмляшть ал 0 3ятятоуаят а, вит ль тал" Шк" зх шій" озсазтоум. . | . -- пов і-й Бойтесзсліт 12317 Тк" ши вІ1А іграм

Вт єчтьнх Вот біл |н в" ех КЬшеИк ! та плече . ; . .

Флй т ек ранки рок І7 та" Г - І-е іі; бехма | ' «Єпоромися Б. блага «о Еипраб 10 |Зіятюнг 0 дилраф ої 0 Шипров ї калу. ит кат ли лет, на а змії" ГАЛЕН р тат тпгЛ Ем - . о... о. . . | Н

МЕ КІа пл лишили мб ТЕТ ит ри о Й «ІБ бЕУ, - нн, - - - | ' тела жін: б пхати на тв їх га" змеиснче . ше ГГ | і

Ї Енляеєтяню й гмийьили прі тих ап Іа - синя, -- -ш-- -. І зздевякти ІП ВекЗТАт ді Яке т сво КАТЕ, круачях заледета ВКМ За у че епк ет дів свА нат зая б іі БИ: афри й иль я ре. ар льне вв влажн р велі арте Сирий насе рож'язвллї рр З раллі гі рхя й я дьь тай Шале елегія ка ШТ НОЯ году ліз оре І Я лося З дива у тиски Йти кун жо мдю лю гу Кз алиежаю псшя р вша я 7 п кдданлеяжаа ддівсво бін нжеці Молю тен влякх у флеш убелають роки ялалаі «лаздаштакива» іл сіри-пллІмї шатаяііт завтярванс робіть зас: й пита з базан пі д ої ЯМ Яр рода лвнів г се

За ьч ти р ретий ее ль о Гийнтлиой сте Віт нта» яті йти в рен виь Тая зх Й ою лютих о

Приклад 13 Іп міїго оцінка РІ-РІ С після інфікування Стуріозропаіт

Фермент РІ-РІ С оцінювали на антикриптоспородійну активність та токсичність у концентраціях 0,001-30Од/мл з застосуванням клітин нирок 4-денних цуценят Мадіп-бСагру (МОСК). Одиниці ферменту визначали способом за

Прикладом 4, але вимірювали за Прикладом 9. Препарат застосованого ферменту одержували з ісе) рекомбінантного Васійиз тедайегічшт. Обробку розпочинали через З години після інфікування і здійснювали со протягом 48 годин.

Хемілюмінесцентний імунологічний аналіз. Перед інфікуванням социсти промивали і ресуспендували в основі «

ОМЕМ з 0,7595 таурохолату натрію і інкубували протягом 1О0хв при 372 |Мои еї аіІ., РЕМ5 Місгобіої!. І еНеге со 136:251-256, 1996; Мои еї аї, 9. АпіїтісгоріаЇ. СпетоїПпег. 41:293-296,1998). Ексцистаційну суміш розводили ультракультуральним середовищем, відразу розподіляли по планшетах, які містили клітини МОСК при 100905 в злитті, і тримали в ультракультуральному середовищі протягом 4 днів. Інокулят інкубували з клітинами протягом

Згод. перед промиванням РВЗ і замінювали свіжим ультракультуральним середовищем з випробуваним ферментом або без нього. Планшети інкубували при 372С в атмосфері 596 СО» протягом 48год. Культури « промивали РВ5 і фіксували Воціп-розчином. З т0 Зафіксовані планшети промивали ТВ5Т-буфером (20мММ Тгів-НСІ (рН7,5), 150мМ масі, 0,0595 Тмееп-20) і с блокували 195 ВБА-ТВЗТ (ТВ5Т-буфер, що містить 196 альбуміну сироватки великої рогатої худоби) протягом ч ЗОхв при 252 з легким збовтуванням. У планшети додавали сироватку кроля проти Сгуріозрогідінт рогмит и? (розведення 1:200) і інкубували протягом год. Після промивання ТВ5Т зразки послідовно інкубували з міченим 15 біотином дО кози проти кроля та міченим пероксидазою хрону стрептавідином (робоче розведення 1:1000, КРІ. -1 Іпс., Зайпегзриго, МО). Як субстрат застосовували Еппапсед І итіпо! (4-йодофенол та пероксид водню, Аїагісп

Спетіса! Со. Іпс., Мім'аКее, МУ). З планшетів зчитували показники за допомогою люмінометра МІ 3000 (ее) (Оупайїесі І аб., Спапійу, МА) і визначали відносні одиниці світла (КО). Середні значення КІ ОО розраховували їз на 4 однакових лунках, і всі експерименти повторювали принаймні двічі.

Аналіз токсичності. Фермент випробували, застосовуючи аналіз редукції тетразолу ІСеїІПег 96; Рготеда (ее) Согр., Мадізоп, УМІ, ОБА). Тобто кожну з нижчевказаних концентрацій ферменту вводили у 96-лункові планшети,

Ф які містили злиті моношари МОСК-клітин. Кожне розведення оцінювали у трьох примірниках. Фермент інкубували на моношарах при 372С і 596 СО». Через 48 годин планшети залишали на год і зчитували у зчитувальному пристрої ЕГІЗБА для планшетів при 490нм. Результати записували і піддавали аналізові. Відсоток токсичності розраховували шляхом віднімання середнього ОО контрольного середовища без ферменту від середнього ОО з ферментом, а потім ділення на ОЮ середовища та множення на 100. Показники цитотоксичності оцінювали, як

ГФ) показано у нижчеподаній таблиці. іме) ою о

Бі-твов твою бо З і і її ЗОді/ б ій. НН і ї начну токсичність спостерігали при концентрації ферменту д/мл або вищій. Не спостерігали значної токсичності для цього ферменту в діапазоні 0,1-1Од/мл (Таблиця 12). Таким чином, для визначення активності ферменту та специфічності ферменту у цьому діапазоні концентрації (1,0Од/мл або нижче) здійснювали серію експериментів. У першому експерименті МОСК-клітини інфікували ексцистованими споровиками. Після

З-годинного інкубаційного періоду моношар клітин промивали і протягом 48 годин додавали фермент у різних концентраціях. Як показано у Таблиці 13, фермент виявляв антикриптоспородійну активність у діапазоні 0,01-1Од/мл іп міго. Приблизно 5095 інгібування досягали при концентрації О,1Од/мл (Фігура 1).

Таблиця 12 Токснчиість ракомбінантнють Ре зо ВУ горами для шонюшаду купі.тур МОСК КклІТНН ' я . 70 ЗКапшсеграцю 000000 флокс я с Сича тоже янв

Меолтнь ни 1 --

НИ г . л шш . .

ІН нини ЯН с З вч ін ши

Таблиця 15 дклинністн рассшідінйнінуго фариненту РІС з інфіконлнями .Оралнл випь терамн МОСЬ влівна леви 0падлях о ФДЕшсееє 0 переано 000 С 14сітртякня Стуріднрюпгштть ня гу і мівретнтрняалі-ьйгі с. ш- А МяНтіл.і плете нфедімя-т. ЗД пз вх гл -й - пло 200 ря 00000100 п, . . ЩІ їх тА. виз зі - Іль г.

Їх, ге Інмасх Ше, дамо їх сть ІНД не - Ди нен нин ин еко шо шт, запа 200 ЇЇ 0. ж 00011000 нв сч

Другу серію експериментів здійснювали для оцінки специфічності ферменту. Споровики обробляли ферментом у різних концентраціях протягом 45хв і швидко промивали. Обробленим споровикам після цього і) давали інфікувати необроблені клітини-хазяї та залишали для розвитку і відтворення протягом 48 годин. В іншому окремому експерименті клітини-хазяї інкубували ферментом у різних концентраціях, промивали і інфікували необробленими споровиками. Як показано нижче (Таблиця 14), обробка будь-якого зі споровиківабо (о

Зо Клітин-хазяїв ферментом в результаті дає часткове інгібування. Залежного від дози інгібування у цьому діапазоні концентрацій не спостерігали. Це може бути зумовлено коротким періодом інкубації ферменту з со клітинами-хазяями або клітинами-паразитами (45хв), або частковим чи неповним розщепленням «г рецепторів-хазяїв/паразитів. Крім того, інші рецептори-хазяї/паразити, можливо, беруть участь в інфікуванні і відповідають за ріст, який спостерігали у клітинах-хазяях. со

Табгснця За. Переданфенецдіннао обробка сеюровнкії спо АЗСКоклітнно та і - чпПпин на інфсоштнімність. 0. ролет, вача вве, Енасстся "Сарішня віль сн Зала ді

Ода інлітенянки Стрілки -л прнах ваьрогетряжльного « ша 00000011 соманияяєі у

М лорсчавня, І! ст ша: З жк ная З с й - - 3-0 М 1110 - ше азй ка ИН ша ч - и ШО ю, - "» ще ЕЯ р, тех п дм а кепяч ми. Ще Б. лів т пл сгріолІн опежа лу . . І І - ий пат срок . щ га (ме оо Цета Галя (ее) : ше пе. «оф: й

Шавл Ша . ля плй т» - п и о пон ння п -Щ

Інв аанї, 4-- да БТ ГО 09 20 дже 717080

Ф Приклад 14 Іп мімо оцінка РІ-РІ С після інфікування Стуріозрогіаїйнт

Фермент оцінювали на антикриптоспоридійну ефективність на мишах 5СІЮО з імунодефіцитом. Тобто, інокуляти ооцист приготовляли шляхом промивання очищених ооцист (зберігали «б місяців) 0,196 ВЗА, РВ5 дво (рН7.2) для видалення дихромату калію. Мишей 5СІО (віком 4-5 тижнів) інфікували 10 9 ооцист (штам ІОУУА) і піддавали вказаним нижче процедурам. Збирали зразки фекалій мишей, очищали через переривчасту цукрозу і

Ф, оцінювали на паразитне навантаження шляхом проточної цитометрії, як описано вище. Див. Агоумлмоса еї аї|.,.). ко Рагазіої. 81:404-409, 19951).

Таблиця 15. Бежная пікеозння длп терапінчтячнния експоерниясняй я 60 тя яку? а Й п Й й Щ

Квт вк 000 Й - ай - ІЙ - ЯН ори яву, ПА . опи ра батвага со ЕЕ пев Гл . ' дані. . ЛКК . Відп "ви. п ЬеТИс Іл пн пет, 65 істота І Бсзойвстси: Бліазевлх | Есіаллєяма

Гранульовану їжу для мишей вкривали 30 або З0ОД/Ь РІ-Р С у РВ5 або РВ5. Усіх мишей годували без обмежень. Миші отримували їжу відразу після інфікування Зразки фекалій збирали і показники маси знімали двічі на тиждень. Кількість спожитої їжі вимірювали щодня. Мишей присипляли шляхом ін'єкції кожній О0,2см3 1О0Омг/мл кетаміну, 10Омг/мл ксилазину та 0,995 Масі).

Середню кількість спожитої їжі за день на одну мишу та середню масу мишей показано у Таблиці 16. За тритижневий період статистично значущої різниці у споживанні їжі або у масі не спостерігали

Таблиця 16. бпюжнезння їні тя преріст ваги мишей

І Й трти ши на |, еПожмій за ядНи Шозачі ш пал, Щ т нн чат що і ве йоли пла в-як й плчат пед плн ! сто е г-- -О

Ї є які | І лах: 7 ї їй Цей кий «изкдн Ічареан ни аг 7.21 г т в Що на й Що м

І пи и ечн ттчна 14 Пишдя Їсесяки - " пк ши Сто 0001 нини жи ИН ЯР сч бор о в. вії? ЩО поту ННЯ

КІ хоп - Ге)

ЛеньЇ1 Іляівнув тег зо - - - з --- -. сво - . со й й з й пи й п й «І и ші км дик м | Гїжсв кни» со з 010135 т пи м ни п зл

І 2 Пий и

Ефективність через З тижні після інфікування. Зразки фекалій збирали через 3, 4 та 4,5 тижні після « інфекції, і у мишей ЗСІЮО у групах, що піддавали лікуванню, та контрольних групах вимірювали показники - 70 Стгуріозрогідіит у 100 мікролітрах зразків, як показано у Таблиці 17. Як видно, у мишей, яким вводили фермент, с виявлялося зниження паразитного навантаження. Паразитне навантаження спостерігали (34-5495) у групах, що з» піддавали лікуванню. Деякі з цих показників зниження були статистично значущими при оцінці з застосуванням статистичного аналізу АМОМА (показано нижче і позначено символом). Фермент демонструє свій потенціал як антикриптоспоридійний терапевтичний агент. Більш високі дози ферменту або краще доставляння ферменту до місця інфекції можуть збільшити його ефективність і можуть бути застосовані в подальших експериментах. -і Тзблнідю 17 Ефниєтьньснікств. ОБІ-Фр по ур лля хнінтияняно інфокцін

Ге | беинвакділосми їх ше ій Ме. ДденИт т. пан

Ні МИ б СЕ ох што ії; тло т бю Так й тя --- ше - АГ - - пе рих шов - ї таз: ди о ЕЕ ттшсшеялі є пи знаярісокун гр З ях явінк

ІФ) я Попа не т кра СО Оз вени ко Приклад 15 Перевірка ферменту у кормах, використовуваних у випробуваннях з вирощуванням

Аналіз РІ-РІС, виділених із кормів, використовуваних у вищезгаданих випробуваннях на тваринах, 60 здійснювали, як описано у Прикладі 10. Результати зведено у Таблицях 18-19. б5

Таблицн 18. Доспіджиечнья сгерієкюсгідішт м їжі дл мнеей

Снірсовжка Каніропн. З Од "коді

Зматорль п . міш ш1 -- А зтмп РІЧ . «"Гасізівннь-кни 10 ІМессейн-ннсняй пз

Я ікри ліклореяи

ВІДМ, сер Ме . іввлену 7 зюткі: !

Із. сдяь. й ев п Й кааПпз. те ппвшасно | шо г о Що 1 Шк

Іо пд 00 заплаго то те І анпігнинин : : еп : : : : еп : еп -

Ефективність виділення з їжі була різною і значною мірою залежала від типу їжі. Виділення з їжі для мишей виявило ефективність від 73,4 до 76 відсотків (Таблиця 18). У три різні партії корму для курчат, виготовлені у трьох різних місцях, обережно вводили 45 або 1800ОД/Ь рекомбінантного РІ-РІ С, потім відразу виділяли і піддавали аналізові за процедурою Прикладу 9, оскільки рівень навантаження тримається в межах способу безперервного аналізу за Прикладом 9 (Таблиця 19).

Таспиця 19 Енаройусранно: афкечтанності андобуосіьня х врізння джарогі кору ля пурчит тА ккпуркоунної ирипя ! "Пікарепозарех але керлат Ї

І Лльпала з Льдпадтеї «Павлята 1 кКлькаразоля кпвля

Е Не Е

Тетьст ніш 1 я то т ли у лий Бе непантачсння слл

ЛЬ. вноілка нн ли І кі 812 зн -л Е- ча НЯ т подану МІЯ м? ва 31 8 т38. па зе і Ге) заенит. ввід І й

ПОН Ха

Можна побачити, що ефективність виділення з кукурудзяної крупи є такою ж самою, які і при виділенні з їжі для мишей. Однак виділення з деяких зразків корму для курчат у цьому експерименті та в інших було незначним. ікс,

У випробуванні, показаному в Таблиці 20, відсоток ферменту, який видобувається, становив приблизно со 30-4595 від теоретичного РІ-РІ С, тоді як р-мананаза легко видобувалася, та її вихід становив приблизно 100905.

Найкращий рівень видобування, який спостерігали для цього корму у вищезазначених випробуваннях, становив З приблизно 45905. Таким чином, результати аналізу для видобутих ОД/Ь для випробуваних кормів з Таблиці 20,не о виходять за межі очікуваних.

Зо Таблиця 20. Перекірка ферментноге нанянтаження при годуванні курчат» ї-

Бреонперів., Блграбч вання

Грума Ме г Із 4 | (в 5 |в ізо « в КТК зе - " -- -- 0 ТЕО СТГ гг в ' Вікупання 4 І» - - . - . - ї Н ч Задано ДДТЬ 2 вою мо оф1бо |за фе 30 сх зв,

І» -4 тес 1202311 ие я 5 ші ші. ; : - і Серадн. ОДЛЬ р.а оте ота 07 |зов ряяв'яово ла, паб

І шк пд пон В «што ні.

Го! ча від заданнхча - й - - зд. |Заст БЕ заз | ми

ЧК» - . . -

Задан. МОДА 1. - й й зо ї ін лю ро

Тимішел, мання |- я . Ми - з т Ї . г-щ іш ни ШИ Ми . шу ний м. внанга мот Менанахн

Модт 148. 1388|. 300 ваз ла І 55 . а від лаіданого . Цен - за, - 15 172,0 |. Ї (ФІ Хоча для пояснення винаходу було показано деякі типові варіанти втілення та деталі, спеціалістові стане юю зрозуміло, що допускаються різні зміни та модифікації без відхилення від обсягу винаходу.

Claims (72)

60 Формула винаходу

1. Композиція для перорального введення птахам та тваринам для лікування або зниження ризику інфекції травного тракту, яка відрізняється тим, що вона включає (ї) фермент, який являє собою естеразу, що розщеплює зв'язок, що складається з фосфатидилінозитолу, причому зазначене розщеплення приводить до бо вивільнення клітинного поверхневого білка або вуглеводу, та (ії) фізіологічно прийнятний носій для зазначеного ферменту.

2. Композиція за п. 1, яка відрізняється тим, що композиція є кормом.

3. Композиція за пп. 1 або 2, яка відрізняється тим, що композиція не містить іншого протиінфекційного агента, окрім зазначеного ферменту.

4. Композиція за будь-яким з пп. 1-3, яка відрізняється тим, що фермент розщеплює зв'язок, що приводить до вивільнення клітинного поверхневого білка.

5. Композиція за п. 1, яка відрізняється тим, що вказана естераза вибрана з групи, яка включає сфінгомієлінази та фосфоліпази.

6. Композиція за п.5, яка відрізняється тим, що фосфоліпаза являє собою фосфоліпазу типу С або типу 0. 70

7. Композиція за п. 5, яка відрізняється тим, що фосфоліпаза являє собою специфічну до фосфатидилінозитолу фосфоліпазу С.

8. Композиція за будь-яким з пп. 1-7, яка відрізняється тим, що додатково включає стабілізатор, вуглеводний носій або консервант.

9. Композиція за п. 8, яка відрізняється тим, що стабілізатор являє собою буфер, вуглевод або гліколь.

10. Композиція за п. 8, яка відрізняється тим, що вуглеводний носій вибраний із групи, яка включає ксилозу, фруктозу, глюкозу, сорбіт та мальтотріозу.

11. Композиція за п. 8, яка відрізняється тим, що консервант вибраний з групи, яка включає пропілпарабен, сорбат натрію, сорбат калію та аскорбілпальмітат.

12. Композиція за будь-яким з пп. 1-11, яка відрізняється тим, що носій являє собою кормовий продукт, у який включено фермент.

13. Композиція за п. 12, яка відрізняється тим, що кормовий продукт являє собою корм для тварин, який включає зерновий матеріал, джерело білка, вітаміни, амінокислоти та мінерали.

14. Композиція за п. 13, яка відрізняється тим, що зерновий матеріал являє собою кукурудзу, сорго, пшеницю, ячмінь або овес. с

15. Композиція за п. 13, яка відрізняється тим, що джерело білка являє собою боби або горох.

16. Композиція за будь-яким з пп. 1-11, яка відрізняється тим, що являє собою тверду або рідку композицію. і)

17. Композиція за будь-яким з пп. 1-11, яка відрізняється тим, що фермент знаходиться у таблетці або в капсулі з желатиновою оболонкою.

18. Композиція за п. 1, яка відрізняється тим, що фермент одержаний зі штаму Вастив» сегецв. «я зо

19. Композиція за п. 18, яка відрізняється тим, що штам Васшиув сегеуиз являє собою АТСС 7004 або АТОС 6464. со

20. Композиція за п. 1, яка відрізняється тим, що фермент одержаний шляхом експресії рекомбінантної ДНК «г в організмі-хазяїні.

21. Композиція за п. 20, яка відрізняється тим, що організм-хазяїн походить зі штаму Вастив тедаїепит. со

22. Композиція за п. 1, яка відрізняється тим, що фермент присутній у кількості 200 МО/кг - 4000 МО/кг корму. ї-

23. Композиція за п. 2, яка відрізняється тим, що фермент присутній у кількості 3-90 од/фунт корму (6,61 - 198,45 од./кг).

24. Композиція за п. 23, яка відрізняється тим, що фермент присутній у кількості З од/фунт корму (6,61 од./кг).

25. Композиція за п. 23, яка відрізняється тим, що фермент присутній у кількості 10 од/фунт корму (22,05 «

од./кг). з с

26. Композиція за п. 23, яка відрізняється тим, що фермент присутній у кількості ЗО од/фунт корму(66,15 од./кг). ;»

27. Композиція за п. 23, яка відрізняється тим, що фермент присутній у кількості 90 од/фунт корму (198,45 од./кг).

28. Спосіб лікування або зниження ризику інфекцій травного тракту, який включає пероральне введення -І суб'єкту, який страждає від інфекції або перебуває під ризиком інфікування, ефективної кількості ферменту, що являє собою фосфоліпазу, яка розщеплює зв'язок, що складається з фосфатидилінозитолу, причому зазначене со розщеплення приводить до вивільнення клітинного поверхневого білка або вуглеводу. їх

29. Спосіб за п. 28, який відрізняється тим, що фермент розщеплює зв'язок, що приводить до вивільнення бор /Клітинного поверхневого білка. со

30. Спосіб за п. 28, який відрізняється тим, що спосіб не включає введення іншого протиінфекційного агента, Ф окрім зазначеного ферменту.

31. Спосіб за п. 28, який відрізняється тим, що інфекція викликана вірусним патогеном з найпростіших, бактерій, дріжджів або грибків.

32. Спосіб за п. 31, який відрізняється тим, що інфекція викликана патогеном із найпростіших роду Е/пела.

33. Спосіб за п. 31, який відрізняється тим, що інфекція викликана патогеном із найпростіших Ф) роду Стуріозрогіаит. ка

34. Спосіб за п. 31, який відрізняється тим, що інфекція викликана патогеном із бактерій роду С/овзілат.

35. Спосіб за п. 28, який відрізняється тим, що фермент одержаний зі штаму Васпив сегеийв. во

36. Спосіб за п. 35, який відрізняється тим, що штам Васшив сегеиз являє собою АТСС 7004 або АТСС 6464.

37. Спосіб за п. 28, який відрізняється тим, що фермент одержаний шляхом експресії рекомбінантної ДНК в організмі-хазяїні.

38. Спосіб за п. 37, який відрізняється тим, що організмом-хазяїном є штама Васпив тедаїепит.

39. Спосіб за п. 28, який відрізняється тим, що фосфоліпаза являє собою фосфоліпазу типу С або типу 0. 65

40. Спосіб за п. 39, який відрізняється тим, що фосфоліпаза являє собою специфічну до фосфатидилінозитолу фосфоліпазу С.

41. Композиція для перорального введення, яка відрізняється тим, що вона включає (і) фермент, який являє собою геміцелюлазу та (ії) фізіологічно прийнятний носій для зазначеного ферменту та не містить іншого протиіїнфекційного агента, окрім зазначеного ферменту.

42. Композиція за п. 41, яка відрізняється тим, що як вказаний носій вона містить кормовий продукт з введеним в нього вказаним ферментом.

43. Композиція за будь-яким з п. 42, яка відрізняється тим, що кормовий продукт являє собою корм для тварин, який включає зерновий матеріал, джерело білка, вітаміни, амінокислоти та мінерали.

44. Композиція за п. 43, яка відрізняється тим, що зерновий матеріал являє собою кукурудзу, сорго, 7/0 пшеницю, ячмінь або овес.

45. Композиція за п. 43, яка відрізняється тим, що джерело білка являє собою боби або горох.

46. Композиція за п. 41, яка відрізняється тим, що являє собою тверду або рідку композицію.

47. Композиція за п. 41, яка відрізняється тим, що фермент знаходиться у пігулці або в капсулі з желатиновою оболонкою.

48. Композиція за п. 41, яка відрізняється тим, що геміцелюлаза являє собою мананазу.

49. Композиція за п. 48, яка відрізняється тим, що мананаза являє собою ендо-1,4- Д-О-мананазу, що продукована штамом Вастиз /ептивз, позначеним як АТСС 55045.

50. Композиція за п. 41, яка відрізняється тим, що додатково включає стабілізатор, вуглеводний носій або консервант.

51. Композиція за п. 50, яка відрізняється тим, що стабілізатор являє собою буфер, вуглевод або гліколь.

52. Композиція за п. 50, яка відрізняється тим, що вуглеводний носій вибраний із групи, яка включає ксилозу, фруктозу, глюкозу, сорбіт та мальтотріозу.

53. Композиція за п. 50, яка відрізняється тим, що консервант вибраний з групи, яка включає пропілпарабен, сорбат натрію, сорбат калію та аскорбілпальмітат. с

54. Композиція за п. 42, яка відрізняється тим, що фермент присутній у кількості 3-90 од./фунт корму (6,61 - 198,45 од./кг). і)

55. Композиція за п. 54, яка відрізняється тим, що фермент присутній у кількості З од.лфунт корму (6,61 од./кг).

56. Композиція за п. 54, яка відрізняється тим, що фермент присутній у кількості 10 од./фунт корму (22,05 «о

Од./кг).

57. Композиція за п. 54, яка відрізняється тим, що фермент присутній у кількості ЗО од./фунт корму (66,15 со од./кг). «І

58. Композиція за п. 54, яка відрізняється тим, що фермент присутній у кількості 90 од./фунт корму (198,45 од./кг). со

59. Спосіб лікування або зниження ризику інфекцій травного тракту, який включає пероральне введення ї- суб'єкту, який страждає від інфекції або перебуває під ризиком інфікування, ефективної кількості ферменту, що являє собою геміцелюлазу без введення разом з указаним ферментом ефективної кількості іншого протиіїнфекційного агента.

60. Спосіб за п. 59, який відрізняється тим, що інфекція викликана вірусним патогеном з найпростіших, « бактерій, дріжджів або грибків. шщ с

61. Спосіб за п. 60, який відрізняється тим, що інфекція викликана патогеном із найпростіших роду Е/пела. й

62. Спосіб за п. 60, який відрізняється тим, що інфекція викликана патогеном із найпростіших «» роду Стуріозрогіаит.

63. Спосіб за п. 60, який відрізняється тим, що інфекція викликана патогеном із бактерій роду С/овзілат.

64. Спосіб за п. 60, який відрізняється тим, що фермент одержаний зі штаму Вастиз» /еліив. -і

65. Спосіб за п. 59, який відрізняється тим, що фермент одержаний шляхом експресії рекомбінантної ДНК в організмі-хазяїні. бо

66. Спосіб за п. 65, який відрізняється тим, що організм-хазяїн походить зі штаму Васпив тедатепит. ї»

67. Спосіб за п. 59, який відрізняється тим, що геміцелюлаза являє собою мананазу.

68. Спосіб за п. 67, який відрізняється тим, що мананаза являє собою ендо-1,4- ВД-О-мананазу, що бо продукована штамом Вастиз /ептивз, позначеним як АТСС 55045. 4)

69. Застосування пероральної лікарської форми ферменту, який являє собою естеразу, яка розщеплює зв'язок, що складається з фосфатидилінозитолу, де зазначене розщеплення приводить до вивільнення клітинного поверхневого білка або вуглеводу, як засобу для лікування або зниження ризику інфекцій травного тракту.

70. Застосування ферменту, який являє собою фосфоліпазу, що розщеплює зв'язок, що складається з і) фосфатидилінозитолу, де зазначене розщеплення приводить до вивільнення клітинного поверхневого білка або ко вуглеводу, для виготовлення пероральної лікарської форми лікарського препарату для лікування або зниження ризику інфекцій травного тракту. 60

71. Застосування пероральної лікарської форми ферменту, який являє собою геміцелюлазу без ефективної кількості у відношенні до мікробів іншого протиінфекційного агента як засобу для лікування або зниження ризику інфекцій травного тракту.

72. Застосування ферменту, який являє собою геміцелюлазу без ефективної кількості у відношенні до мікробів іншого протиінфекційного агента для виготовлення пероральної лікарської форми лікарського препарату 65 для лікування або зниження ризику інфекцій травного тракту.