BRPI0016231B1 - composições compreendendo enzimas úteis para tratar ou melhorar os riscos de infecção do trato digestivo - Google Patents

Abstract

"composição compreendendo enzima com capacidade de clivar uma ligação que efetua a liberação de uma proteína ou carboidrato de superfície celular para ser usada no tratamento de infecções". enzimas de uma classe particular, caracterizadas pela capacidade de clivar uma ligação que efetua a liberação de uma proteína ou carboidrato de superfície celular, que não contêm um agente antiinfecção, apresentam significativa atividade antiinfecciosa. sob administração oral, essas enzimas são eficazes, por exemplo, no tratamento de infecções do trato digestivo em humanos e em animais. posteriormente, há benefícios de uma taxa de crescimento, eficácia de alimento, e saúde gerais significativamente aumentadas.

Description

COMPOSIÇÕES COMPREENDENDO ENZIMAS ÚTEIS PARA TRATAR OU MELHORAR OS RISCOS DE INFECÇÃO DO TRATO DIGESTIVO

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção se relaciona com uma composição que compreende e a uma metodologia para o uso de enzimas, como agentes anti-infecciosos, no contexto do tratamento ou diminuição do risco de infecções do trato digestivo.

FUNDAMENTO DA INVENÇÃO

Na sua Revision of the World Population Estimates and Projections de 1998, o United Nations Department of Economics and Social Affairs Population Division projetou que a população do mundo iria alcançar 6 bilhões em 1999. O relatório também afirmava que levou somente 12 anos para que a população aumentasse de 5 para 6 bilhões, comparados aos 123 anos para ir de um para dois bilhões. Por volta da metade do século 21 a população projetada está entre 7,3 e 10,7 bilhões. O crescimento populacional notável na última década é devido, em parte, aos ganhos eficientes na produção de alimentos que resulta da aplicação de tecnologia e das práticas de produção intensiva de alimento. Para crescimento futuro, ganhos mais eficientes na produção de alimento serão necessários para manter o ritmo.

Uma abordagem, que tornou a produção de carne animal mais eficiente, envolve o uso disseminado de químicos e antibióticos antimicrobianos no alimento animal. Em fazendas de grande escala, a disseminação de infecção é rápida sob as condições amontoadas de produção A disseminação de doença, portanto, é controlada por usos profiláticos e terapêuticos dessas substancias. Por exemplo, é prática comum incorporar químicas nos alimentos animais para controlar infecções por coccídeos (por exemplo, salinomicina, monensina, roxarsona (3-nitro), halquinol, carbadox e olaquindox), bem como antibióticos antimicrobianos (por exemplo, bacitracina, virginiamicina, tilosina, tetraciclina, clortetraciclina, penicilina, oleandomicina, novobiocina, lincomicina, bambermicinas, apramicina, espiramicina, eritromicina, neomicina e outros). Essa prática é bem conhecida como por promover o crescimento e aumentar a conversão de alimento. O crescimento na resistência antibiótica múltipla entre patógenos humanos, tais como Staphylococcus aureus, Streptococus pneumoniae, Haemophilus influenza, Neisseria gonorrhoeae, e Mycobacterium tuberculosis, criou medo de que a resistência a antibióticos desenvolvida em micróbios associados com animais de fazenda poderia migrar para patógenos humanos através de fatores de resistência transferíveis a droga. Há evidencias de que os animais alimentados com antibióticos são uma fonte de bactéria com fatores de resistência transferíveis. Veja Hooge, Feedstuffs 71 (20) :59, 1999. Embora os antibióticos usados em animais e humanos sejam geralmente diferentes, há similaridades em mecanismos que poderíam resultar em resistência cruzada. Em um caso, fluoroquinolonas são aprovadas para controle de infecções por E. coli (colibacilose) em alguns animais e também são usadas na medicina humana. Hooge, supra. Recentemente o PDA/CVM propôs retirar a aprovação para o uso da fluoroquinolona enrofloxacina em aves devido ao desenvolvimento de campilobacter resistente a fluoroquinolona e a transferência para humanos. Veja Murhead, S., Feedstuffs 72 (45) : 1-4, 2000.

Também há preocupações entre indústrias produtoras de carne de que poderíam ocorrer perdas na produção e um possível ressurgimento de doença animal se houver uma proibição no uso de antibióticos e ant imicrobianos no alimento. Em 1986, por exemplo, A Suécia proibiu o uso de antibióticos no alimento e a doença animal aumentou. Isso foi acompanhado por um uso aumentado de antibióticos terapêuticos que resultou no uso global de antibióticos, bem como no custo aumentado da produção de carne animal. Veja Smith, Feedstuffs 71(13):1, 1999. Em dezembro de 1998, o EU Council of Ministers decidiu suspender o uso de seis antimicrobianos que eram formalmente aprovados como livres de prescrição em promotores de crescimento em alimentos. (Official Journal of the European Communiti es, 2 9.12.98, Council Regulation No. 2821/99 concerning Directive 70/524). Dois aditivos baseados em quinoxalina também foram proibidos em agosto de 1999 devido a preocupações sobre resíduos na carne. O resultado dessas ações é uma prevalência aumentada de condições formalmente suprimidas incluindo: enterite necrótica em aves domésticas, enterite devido a Clostridium perfringens em porcos desmamados; diarréia por espiroqueta e disenteria suína; e diarréia associada a E. coli. Veja Miller, United States Animal Health Association, 1999, Proceedings antibiótic Usages in Food Animal Production and Resistance-European Perspective".

Ha 300.000 mortes humanas por ano causadas por infecções nosocomiais com patógenos resistentes, mas muito poucas mortes por patógenos gerados por alimentos. Nenhuma das mortes por patógenos gerados por alimentos foi ligada à resistência antibiótica (veja Smith, supra). Dessa forma, não está claro se o uso de antibióticos pelas indústrias produtoras de carne contribuiu para o problema de patógeno resistente a droga das infecções nosocomiais em humanos. Outra preocupação é a falta de novos antibióticos para tratar infecções com patógenos resistentes. Veja Henry, C.M., Chemical and Engineering News, 6 de março de 2000, pp 41-58. Isso poderia significar que quando se desenvolve uma resistência a antibiótico significativa, podem não estar disponíveis quaisquer novos antibióticos para tratar as infecções. A dificuldade de se desenvolver antibióticos, o tamanho do mercado, e questões reguladoras parece que fizeram com que as companhias farmacêuticas principais movessem seu foco de R&D (pesquisa e desenvolvimento) para longe do desenvolvimento de novos antibióticos, especialmente para uso em animais. Novas regulações propostas para o registro de uma droga para uso animal são tão difíceis que o desenvolvimento está sendo parado. Veja Smith, supra. Há, no entanto, várias companhias pequenas envolvidas no desenvolvimento de novos antibióticos (Henry, supra) .

Em certas populações animais, a infecção já é pandêmica. Por exemplo, coccidiose aviária é uma doença que é somente controlada, mas não está realmente sob controle. Virtualmente todos os rebanhos estão infectados e os químicos anti-coccidiose são comumente substituídos no alimento para controlar o dano e limitar o desenvolvimento de cepas resistentes. A coccidiose custa aos produtores de aves domésticas $350 milhões de dólares anualmente em perdas e despesas como medicação para drogas antibióticas tal como salinomicina. Veja, Suszkiw, USDA Agricultural Research Service News, 28 de outubro de 1997. Por volta de 1999, foi estimado que cerca de $114 milhões de dólares seriam gastos anualmente em coccidiostáticos nos Estados Unidos. Veja Frost & Sullivan, U.S. Pharmaceutical Products for Food Animais, Report 5245-54, 1995. Há uma necessidade evidente para se encontrar métodos novos e mais efetivos para se tratar animais que cresceram usando práticas de criação intensiva. Essa necessidade está baseada em um requisito para se obter melhor eficiência de produção a fim de se manter atualizada com a população mundial que se expande rapidamente. 0 controle mais aprimorado de infecção intestinal garante uma taxa de crescimento mais rápida e uma eficiência alimentar mais aperfeiçoada. Também há necessidade de alternativas para o uso de antibióticos na produção animal para lidar com a preocupação quanto ao possível desenvolvimento de resistência antibiótica em patógenos humanos. Não há risco de se estimular a evolução de microorganismos patogênicos resistentes que representem um problema para a saúde humana quando se usa um tratamento baseado em enzima que opera de um modo diferente de todos os antibióticos. Uma vez que enzimas são proteínas, não há possibilidade de que um resíduo químico perigoso será incorporado nos produtos de carne, como acontece com alguns químicos antibióticos e anti-coccidiose. Veja American Feed Control Officials Inc., Official Publication, 1999, "Drugs and Feed Additives, Seção 30.0 Enzimas", pp. 206-217, ISBN 1-878341-10-3.

RESUMO DA INVENÇÃO É portanto um objetivo da presente invenção fornecer um tratamento enzimático para reduzir o impacto de infecções do trato digestivo. É outro objetivo da presente invenção fornecer um mecanismo para reduzir o impacto de infecções do trato digestivo pela interferência com a ligação de patógenos às células do trato digestivo. É ainda outro objetivo da invenção fornecer uma abordagem para o aumento do ganho de peso e da conversão de alimento em relação aos animais que estão infectados com patógenos que causam infecções ou enterite necrótica. É um objetivo adicional da presente invenção fornecer uma forma de dosagem, adequada para administração oral que seja efetiva no aprimoramento da condição de um indivíduo infectado por ou em risco de infecção por um patógeno microbiano.

Na obtenção desses e de outros objetivos, também foi fornecido, de acordo com um aspecto da presente invenção, uma composição que compreende (i) uma enzima que cliva uma ligação que efetua a liberação de uma proteína ou carboidrato da superfície celular, a enzima sendo diferente de uma endo-1,4 -β-D-mananase, e (ii) um transportador fisiologicamente aceitável para a enzima, onde a composição está uma forma adequada para administração oral e não contém qualquer outro agente antiinfecção que não seja a enzima. Em uma modalidade, a enzima em questão cliva a ligação que efetua a liberação de uma proteína da superfície celular.

Em uma modalidade preferida, a enzima incluída na composição é uma esfingomielinase ou uma fosfolipase, especialmente uma fosfolipase do tipo C ou do tipo D. Em outra modalidade preferida, a enzima é selecionada do grupo que consiste em esterases, cerebrosidases, e carboidrases que clivam uma ligação que efetua a liberação de uma proteína ou carboidrato da superfície celular. Em outra modalidade, a enzima é preparada a partir de uma cepa de Bacillus cereus, preferentemente ATCC 7004 ou ATCC 6464. Alternativamente, a enzima é obtida pela expressão do DNA recombinante que codifica a enzima em Bacillus megaterium. Em outra modalidade, a enzima está contida em um invólucro de cápsula de gelatina e está presente em 200 IU/Kg - 4000 IU/Kg de alimento.

De acordo com outro aspecto da presente invenção, foi fornecida uma composição que tem os constituintes anteriormente mencionados e (i) e (ii), onde o transportador fisiologicamente aceitável é um produto alimentício no qual a enzima é incorporada. Dessa forma, a composição pode ser um alimento animal que não contém qualquer outro agente antiinfecção que não seja a enzima. A composição do alimento animal da presente invenção ainda compreende material de grão, tal como milho, sorgo, trigo, cevada ou aveia, uma fonte de proteína, tal como feijão ou ervilha, e vitaminas, aminoácidos, e minerais.

De acordo com ainda outro de seus aspectos, a presente invenção fornece uma composição, como acima descrito, que está em uma forma de dosagem sólida ou líquida.

Ainda é fornecido um método para o tratamento ou atenuação do risco de uma infecção do trato digestivo, que compreende a administração de forma oral, a um indivíduo que sofre de ou em risco de sofrer da infecção, uma quantidade efetiva de enzimas que cliva uma ligação que efetua a liberação de uma proteína ou carboidrato da superfície celular, onde a enzima é diferente de uma endo-1,4-β-D-mananase. Em adição, o método não inclui a administração de um outro agente antiinfecção que não seja a enzima propriamente dita. A infecção pode ser causada por uma patógeno de protozoário, tais como Eimeria e Cryptosporidium, bacteriano, tal como Clostridium, fúngico ou de levedura.

Ainda é adicionalmente fornecida uma composição que compreende (i) uma enzima que cliva uma ligação que efetua a liberação de uma proteína ou carboidrato da superfície celular e (ii) um transportador fisiologicamente aceitável para a enzima, onde a composição está uma forma adequada para administração oral e não contém qualquer outro agente antiinfecção que não seja a enzima.

Ainda é também fornecido um método para o tratamento ou atenuação do risco de uma infecção do trato digestivo, que compreende a administração de forma oral, a um indivíduo que sofre ou em risco de sofrer da infecção, uma quantidade efetiva de enzima que cliva uma ligação que efetua a liberação de uma proteína ou carboidrato da superfície celular, onde o método não inclui a administração, com a enzima, de uma quantidade antimicrobiana efetiva de outro agente antiinfecção.

Outros objetivos, características e vantagens da presente invenção irão se tornar aparentes a partir da seguinte descrição detalhada. A descrição detalhada e ou exemplos específicos, embora indiquem modalidades preferidas, são fornecidos somente para ilustração, uma vez que várias mudanças e modificações dentro do espírito e escopo da invenção irão se tornar aparentes para aqueles experientes na técnica a partir dessa descrição detalhada. Além disso, os exemplos demonstram o princípio da invenção para todos os exemplos de infecções onde serão obviamente úteis para aqueles experientes na técnica anterior.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A Figura 1 mostra a atividade anti-criptosporidium da enzima recombinante PI-PLC produzida por uma cepa de Bacillus megaterium.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Foi descoberto que enzimas de uma classe particular, caracterizadas pela habilidade para clivar uma ligação que efetua a liberação de uma proteína ou carboidrato da superfície celular, exibe atividade antibiótica significativa, sob administração oral, por exemplo, no tratamento de infecções do trato digestivo. A classe de enzima inclui mas não se limita as esfingomielinases e fosfolipases do tipo C e D, e enzimas de especificidade de divagem semelhante. Exemplares dessa classe, portanto, são enzimas que clivam e liberam glicoproteínas ou carboidratos que são ancoradas à membrana por meio de ligação ao fosfatidilinositol. Dessa forma, a enzima fosfolipase C específica para fosfatidilinositol (E.C. 3.1.4.10), também conhecida pela abreviação PI-PLC ou como 1-fosfatidilinositol fosfodiesterase, é um membro dessa classe. Outro exemplo é fosfolipase D específica para glicosil-fosfatidilinositol, ou GPI-PLD. Low e Prasad, Proc. Natl. Acad. Sei. 85:980-984, 1988.

As enzimas GPI-PLD e PI-PLC foram descritas a partir de fontes eucarióticas. Veja Low, "Degradation of glycosyl-phosphatidyllinositol anchors by specific phospholipases", Capítulo 2, pp 35-63, em MOLECULAR AND CELL BIOLOGY OF MEMBRANE PROTEINS: GLYCOLIPID ANCHORS OF CELL-SURFACE PROTEINS, A.J. Turner (ed.), Ellis Horwood, New York, 1990; Low e Prasad, Proc. Natl. Acad. Sei. 85:980-984, 1988; Essen e cols., Nature 380:595-602, 1996; e Essen e cols., Biochemistry 36:2153-2162, 1997. PI-PLC foi descrita a partir de fontes procarióticas, incluindo produção extracelular por bactéria. Dentre as fontes bacterianas conhecidas de PI-PLC estão Bacillus cereus (Stein e Logan, J Bacteriol. 85:369-381, 1963; Stein e Logan, J. Bacteriol. 90:69-81, 1965; Ikezawa e cols., Biochimica et Biophysica Acta 450:154-164, 1976; Griffith e cols., Methods in Enzymology 197:493-502, 1991; Volwerk e cols., J. Cell. Biochem. 39:315-325; e Kuppe e cols., J. Bacteriol. 171:6077-6083, 1989), Bacillus thuringiensis ( Ikezawa e Taguchi, Methods in Enzymology 71:731-741, 1981; documento de patente japonesa JP 55034039), Staphylococcus aureus (Low e Finean, Biochem. J. 162:235-240, 1977), e Clostridium novyi (Taguchi e Ikezawa, Arch. Biochem. Biophys. 186:196-201, 1978). Técnicas aperfeiçoadas de ensaio de enzima para a enzima PI-PLC foram desenvolvidas baseadas em um substrato fluorescente. Veja Hendrickson e cols., Biochemistry 31:12169-12172, 1992; Hendrickson, Anal. Biochem. 219:1-8, 1994; Hendrickson e cols., Bioorg. Med. Chem. Letters. 1:619-622, 1991.

Sem se relacionar definitivamente a qualquer teoria, os presentes inventores enfatizam que a enzima PI-PLC tem a habilidade de clivar a ancoragem de fosfatidilinositol glicolipideo de proteínas da superfície celular e outros glicosil fosfatidilinositóis. Veja Low, supra; Low e Saltiel, Science 239:268-275, 1988. Por exemplo, as glicoproteínas variantes de superfície e outras proteínas e carboidratos de superfície de vários parasitas protozoários são ancoradas por lipídeos glicosil fosfatidi1inositol (ancoragem de GPI) e são sensíveis à digestão e liberação de PI-PLC. Espécies ilustrativas pertencem aos gêneros Schistosoma, Toxoplasma, Plasmodium, Trypanosoma, e Leishmania (Low, supra) , bem como Eimeria, Babesia, Theileria, Giardia, Leptomonas e Entamoeba. Veja McConville e Ferguson, Biochemical J. 294:305-324, 1993; Pearce e Sher, J. Immunol. 142:979-984, 1989; Sauma e cols., Mol. Med. Biochem. Parasitol. 46:73-80, 1991; Hawn e Strand, Mol. Med. Biochem. Parasitol. 59:73-82, 1993.

Esse mecanismo de ancoragem para componentes da superfície celular parece ser universal para células eucarióticas que variam de levedura a mamíferos. A presença de inibidores de ancoragem de GPI em Giardia lamblia, considerada um eucariota muito primitivo, sugere que esse tipo de ancoragem se desenvolveu cedo em eucariotas. É consistente com essa interpretação a descoberta, nas arquebactérias, de um novo fosfoglicerolipídeo GlcNal-6-mio-inositol-P-dialquilglicerol (Nishihara e cols., J. Biol. Chem. 267:12432-12435, 1992), que é a base para as estruturas de ancoragem eucarióticas de GPI mais complexas que se desenvolveram. Em protozoários, o sistema de ancoragem de GPI é usado mais intensamente em eucariotas superiores, e há evidência de que estruturas ancoradas por GPI são importantes para a sobrevivência do parasita em hospedeiros insetos e mamíferos (McConville e Ferguson, supra) . Por exemplo, o vazamento frequente de glicoproteínas de superfície pode ser um mecanismo para evitar ataque do sistema imune. O protozoário Eimeria tenella contém estruturas ancoradas por fosfatidilinositol similares ao glicoproteína/glicolipídeo de Trypanosoma brucei. Considera-se que essas sejam importantes para a adesão à membrana e subseqüente infecção. Veja Gurnett e cols., Mol. Med. Biochem. Parasitol. 41:177-186, 1990. As estruturas de Eimeria são clivadas por lipase de tripanossomo e por PI-PLC de Bacillus thuringiensis (Gurnett, supra). O tratamento in vivo de parasitas com PI-PLC, se provado factível, provavelmente iria auxiliar o sistema imune do hospedeiro e interferir com a adesão e infecção por patógenos que entram no trato digestivo. Espécies de Eimeria são um problema disseminado e custoso para a indústria de aves domésticas. Outro parasito protozoãrio, Cryptosporidium parvum, é disseminado e causa doença diarréica aguda em humanos e em muitos animais. A proteína do esporozoíto, GP15/45/60, é prevista como sendo uma proteína ligada a GPI baseado na seqüência de DNA, e anticorpos monoclonais reativos a essa proteína do esporozoíto inibem infecção (Strong, W.B., e cols., Infection and Immunity 68:4117-4134, 2000; Cevallos, A.M. , e cols., Infection and Immunity 68:4108-4116, 2000).

Dessa forma, C. parvum é outro patógeno potencialmente tratãvel com PI-PLC.

As bactérias procarióticas não contêm glicoproteínas e carboidratos de superfície ancorados por fosfatidilinositol (McConville e Ferguson, supra), mas PI-PLC ainda podería reduzir infecções bacterianas pela interferência com os processos de adesão. E. coli patogênica e inúmeras outras Enterobacteriaceae patogênicas bem conhecidas expressam a adesina bacteriana FimH, uma lectina de ligação de manose de 29 kD apresentada na extremidade distai de fímbrias. Abraham e cols., Nature 336:682-684, 1988. Essa adesina mostrou que se liga a CD48 de mastócitos, uma molécula ancorada por GPI. Veja Malaviya e cols., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 96:8110-8115, 1999. A digestão in vitro com PI-PLC reduziu a ligação de um receptor mutante de toxina diftérica ancorada por GPI (de Corynebacterium diphtheria) a células murídeas NIH3T3. Veja Lanzrein e cols., EMBO J. 15:725-734, 1996. Em adição, alfa toxina de Clostridium septicum e aerolisina de Aeromonas hydrophila são ambas aderidos à superfície da célula por meio de uma ancoragem c-terminal de GPI e podem ser removidas da superfície da célula por tratamento com PI-PLC. Veja Gordon e cols., J. Biol. Chem. 274:27274:27280, 1999.

Um mecanismo para PI-PLC para reduzir o efeito de infecção bacteriana se relaciona à liberação do sítio de ligação de CD48 dos mastócitos do hospedeiro. De acordo com a presente invenção, portanto, a redução dos sítios de ligação também deve reduzir a inflamação, que podería ela própria se tornar excessiva e danosa à saúde intestinal, uma vez que a inflamação envolve a liberação de fator α de necrose tumoral (Malaviya, supra). Dessa forma, por meio desse mecanismo de diminuição da inflamação e da secreção subjacente de fator de necrose tumoral, um tratamento de fosfolipase, de acordo com a presente invenção, deve aliviar os sintomas que caracterizam condições tais como síndrome do intestino irritável, colite, e Doença de Crohn. Veja van Deventer S.J., Ann. Rheum. Dis. 58(1) :1114-1120 (novembro de 1999).

Também contra infecções virais, a presente invenção deve ser efetiva, por seu rompimento da ligação entre partículas virais e células que o vírus iria infectar in vivo. À luz da presente descoberta dos inventores da eficácia da administração oral, aqui descrita, é interessante que o pré-tratamento do vírus de influenza com fosfolipase C, que causa uma liberação de cerca de 50% do fosfolipídeo do vírus, resultou em uma diminuição significativa na infetividade em embriões de pinto Veja Mizutani e cols., Nature 204:781-782, 1964. Inversamente, o pré-tratamento de fibroblastos cultivados de embriões de pinto com fosfolipase C, isolada de Clostridium perfringens, inibiu marcadamente a infecção subseqüente das células por Vírus de Semliki Forest. Veja Friedman e Pastan, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 59:1371-1378, 1968. Embora a técnica não tenha considerado qualquer significância terapêutica nesses fenômenos, em retrospecto, eles são consistentes com um mecanismo considerado de suporte para a presente invenção, ou seja, a divagem de um ligante de superfície do patógeno e/ou seu receptor de membrana celular cognato, perturbando a interação que é necessária para infecção.

Outro modo onde a presente invenção pode ser efetiva para evitar infecção viral é pela abolição da ligação de proteínas virais ancoradas por GPI às células susceptíveis. Um exemplo de uma proteína viral ancorada por GPI que é sensível à digestão por PI-PLC é NS1 (proteína não-estrutural 1) do Vírus da Dengue. Veja Jacobs e cols., FASEB J. 14:1603-1610, 2000. Há vários exemplos de proteínas ancoradas por GPI de célula hospedeira que são os sítios de ligação para vírus. Esses exemplos incluem Ecovírus 6, 7, 12 e 21 e Enterovírus 7 0 humanos que se ligam a CD55 ancorado por GPI (fator de aceleração de queda, DAF) . Veja Clarkson e cols., J. Virology 69:5497-5501, 1995,- Bergelson, e cols., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91:6245-6248; e Karnauchow e cols., J. Virology 70:5143-5152, 1995. Infecções por Parvovírus canino (CPV) podem ser bloqueadas in vitro por pré-tratamento de células felinas com PI-PLC. Veja Barbis e Parrish, Brazilian J. Med. Biol. Res. 27:401-407, 1994.

Alguns receptores de superfície celular, de suposta importância para a iniciação de infecções, são aderidos às membranas por outros mecanismos que não ancoragem por GPI. Esses incluem estruturas tais como ésteres de colesterol (Rostand e Esko, J. Biol. Chem. 268:24053-24059, 1993), os glicoesfingolipídeos não-fosforilados (Karlsson e cols., Ann. Rev. Biochem. 58:309-350, 1989) e outros fosfolipídeos tais como fosfatidiletanolamina e fosfatidilserina. Veja Sylvester, Infect. Immun. 64:4060-4066, 1996.

Pelas razões acima listadas, portanto, visando tais estruturas com esterases, cerebrosidases, carboidrases, e fosfolipases apropriadas ativas para liberara essas estruturas das superfícies das células, deve ter efeitos benéficos, sob administração oral de acordo com a presente invenção, para tratar infecções do trato digestivo.

Em virtude da natureza universal de proteínas e carboidratos de superfícies ligados a fosfatidilinositol em eucariotas, a metodologia terapêutica da presente invenção, que preconiza a administração de enzima, aguda ou profilaticamente, para clivar uma ligação de ancoragem para tais proteínas e/ou carboidratos da superfície celular, irá encontrar uma aplicação ampla na condução de infecções por protozoários, bacterianas, fúngicas, e virais do trato digestivo. Para essa finalidade, um aspecto-chave da presente invenção é a demonstração de que uma enzima, que não somente é ativa na divagem dos componentes da superfície celular, pode ser administrada de forma oral como um agente antiinfecção e ser efetiva in vivo. Notavelmente, apesar de uma enzima representativa adequada, PI-PLC, estar disponível desde os anos 60, essa abordagem não tinha sido até aqui sugerida.

Outro aspecto da presente invenção é o uso de uma enzima, como descrito acima, como um agente antiinfecção efetivo em preparações de alimento animal, que trata ou atenua o risco de infecções do trato digestivo em animais que consumem o alimento. Preparações de alimento que contêm um endo-1,4-β-D-mananase são conhecidas, e alguns relatos propuseram uma atividade antifúngica para mananase. Veja WO 00/21381 (PCT/EP99/07835) e Kudo e cols., Experientia 48:227-281, 1992. Nesses casos, mananase é combinada com um antibiótico reconhecido, embora a possibilidade de uso da enzima em alimento livre de antibiótico tenha sido discutida de forma geral. Adams, Feed Mix (Especial 2000), nas páginas 16 - 18.

Em um de seus aspectos, portanto, a presente invenção se relaciona às composições, incluindo composições de alimento, que contêm uma enzima, caracterizadas pela atividade de divagem acima mencionada, que seja diferente de mananase ou, mais especificamente, diferente de uma endo-1,4-β-D-mananase, como distinguido, por exemplo, de uma enzima direcionada a manana com uma especificidade de divagem diferente, como descrito em ΕΝΖΥΜΕ NOMENCLATURE 1992 (Academic Press) (vejas entradas 3.2.1.77, 3.2.1.78, 3.2.1.101, 3.2.1.106, 3.2.1.130, e 3.2.1.137). Além disso, a presente invenção contempla uma composição que contém tal enzima, incluindo uma mananase, mas que não contém qualquer outro agente antiinfecção.

Dessa forma, de acordo com a presente invenção, uma preparação de enzima extracelular, obtida a partir de Bacillus cereus e padronizada para o conteúdo de PI-PLC, pode ser usada para produzir uma melhora muito significativa no ganho de peso e na conversão de alimento na presença de uma infecção. Esse resultado é inesperado porque B. cereus é um patôgeno oportunista que comumente causa gastrenterite de causa alimentar e endoftalmite por B. cereus.

Estudos iniciais relataram que a injeção de enzima extracelular de B. anthracis ou de B. cereus em coelhos causa fosfasemia e até mesmo morte. Por exemplo, veja Stein e Logan, J. Bacteriol. 85:369-381, 1963. É surpreendente, portanto, que uma enzima extracelular de um patôgeno que causa gastrenterite tivesse um efeito curativo, de acordo com a presente invenção, em relação a uma doença causada por uma infecção bacteriana.

Bacillus cereus elabora várias enzimas extracelulares ativas na membrana e toxinas citolíticas, incluindo PI-PLC e Cereolisina AB, composta de fosfolipase C e esfingomielinase. Veja Gilmore, J. Bacteriol. 171:744-753, 1989. Na preparação de enzima anteriormente mencionada, uma fosfolipase C [E.C. 3.1.4.10] extracelular com especificidade para fosfatidilinositol, produzida por B. cereus, é considerada como sendo um ingrediente ativo. O tratamento de enzima da presente invenção funcionou efetivamente como um coccidiostático e antibiótico. Dessa forma, uma abordagem efetiva e comercialmente viável para o tratamento de infecções do trato digestivo particularmente uma vez que as substancialmente usadas estão proibidas.

Se não forem revestidas, as enzimas são capazes de inativação irreversível por fluidos gástricos do estômago. A patente dos Estados Unidos No. 4.079.125 descreve composições entéricas aperfeiçoadas contendo enzima revestida para ingestão por mamíferos deficientes em enzima. Surpreendentemente, a adição de PI-PLC ao alimento animal sem revestimento resulta no tratamento efetivo de infecções patogênicas.

Composições de enzima de acordo com a presente invenção preferentemente são formuladas como composições orais secas, sólidas ou líquidas. Tais composições irão geralmente incluir estabilizadores, tal como um tampão, um carboidrato e/ou um glicol. Formulações secas, estáveis na prateleira, de enzimas que são adequadas, de acordo com a presente invenção, para incorporação em comprimidos ou cápsulas, por exemplo, podem ser preparadas por secagem por congelamento, secagem por pulverização em secadora de leito fluidificado com transportador inerte ou de carboidrato, ou pelo uso de técnicas de evaporação em conjunto com estabilizadores vitrificantes. Veja Franks e cols., Biopharm. 4:38-55, 1991. Outra abordagem envolve a precipitação de sal, por exemplo, precipitado de sulfato de amônio ou precipitado de solvente, assim como acetona para formação de pó, seguida pela secagem e mistura com um transportador.

Certos carboidratos, particularmente monossacarídeos, dissacarídeos e oligossacarídeos inferiores são importantes carboidratos vitrificantes. Carboidratos exemplares para uso como transportadores são xilose, frutose, glicose, sorbitol e maltotriose, dentre outros, como descrito por Franks, supra. A escolha de transportador de carboidrato é baseada na compatibilidade com a enzima, baixa tendência hidroscópica, e uma curva de transição de vitrificação favorável. O estabilizador trealose é particularmente adequado para a produção de produtos biológicos termoestáveis. Veja a patente U.S. No. 4.891.319/ Roser, Biopharm. 4(8) :47-53, 1991; Colaco e cols., Bio/Technology 10:1007-1011, 1992; Aldridge, Genetic Engineering News, 15 de março de 1995, pp 10-11.

Enzimas para a presente invenção podem ser formuladas como líquidos, por exemplo, como xaropes com sorbitol e glicerol para diminuir a atividade em água e estabilizar a proteína. Tais soluções são tipicamente filtradas de forma estéril, antes do uso farmacêutico.

Como observado previamente, a presente invenção diz respeito, em um aspecto, à liberação de enzima como um componente de alimento ou produto alimentar. Alimentos são compostas principalmente de material de grão, uma fonte de proteína, vitaminas, aminoácidos, e minerais. O material de grão inclui tipicamente milho, sorgo, trigo, cevada, ou aveia. A fonte de proteína pode ser feijão ou ervilhas, por exemplo. Minerais, aminoácidos e vitaminas exemplares incluem Bi2 , A, ácido pantotênico, niacina, riboflavina, K, DL-metionina, L-lisina, cloreto de colina, ácido fólico, fosfato dicãlcio, sulfonato de magnésio, sulfato de potássio, carbonato de cálcio, cloreto de sodio, selenita de sódio, oxido manganoso, iodeto de cálcio, oxido de cobre, e esterol animal D-ativado.

Para uso em alimentos, uma formulação líquida de enzima pode ser preparada com água salgada (por exemplo, NcCl, 15-18% p/p), ou xarope para diminuir a atividade da água e evitar o crescimento microbiano no produto concentrado. Outros preservativos para alimento tais como benzoato de sódio, propilparabeno, sorbato de sódio ou potássio, e ascorbil palmitato são exemplos de preservativos químicos aprovados que também podem ser usados para evitar um estrago potencial pelo crescimento microbiano no produto. Veja Association of American Feed Control Officials, Inc., Publicação Oficial 2000, Parte 18, "Chemical Preservatives" pp 215-217, ISBN 1-878341-11-1. Esses preservativos podem ser aplicados aos alimentos por pós-granulação com uma diluição grande por tecnologia automatizada de pulverização. Veja Fodge e cols., Feedstuffs, 29 de setembro de 1997. Tais preparações líquidas podem conter carboidratos estabilizadores tais como sorbitol ou glicerol, se compatíveis. Materiais que são componentes desejados de alimentos, tais como outras enzimas ou vitaminas que sejam termolábeis, podem ser incluídos para uma maior eficiência.

Em casos onde o alimento é utilizado em uma forma de massa não-granulada (ou seja, não termo-tratada) , as enzimas para a presente invenção podem ser fornecidas como um concentrado seco, para adição na mistura do alimento. Tais concentrados secos de enzima são preparados concentrando-se primeiro a preparação liquida de enzima, usando um ultrafiltro de 10 Kd NMWC ou outro ultrafiltro adequado, para obter uma alta percentagem de conteúdo de enzima, e então misturando com um transportador muito seco, tais como grãos de milho, grãos de soja ou mesmo material inerte ou sal insolúvel que seja aprovado para uso em alimentos. Veja Publicação Oficial, American Feed Control Officials, supra, Parte 582, "Substances generally regarded as safe in animal feeds". Há inúmeras técnicas disponíveis para a geração de enzimas estáveis o suficiente para tolerar o processo de granulação em alguns alimentos moídos, enquanto retêm atividade suficiente, em temperaturas mais baixas, para funcionarem no trato digestivo. É bem conhecido que a modificação da estrutura da proteína, primariamente através da mudança da sequência de DNA codificadora ou, secundariamente, através de modificação química pode gerar enzimas mais estáveis contra a inativação. Uma ilustração a esse respeito é o uso de entrecruzamento químicos de cristais de enzima. Veja Collins e cols., Organic Process Research and Development 2 (6) :400-406, 1998. Outra abordagem para aumentar a estabilidade de enzima para a presente invenção confere a mudança de aminoácidos por mutagênese do gene que codifica a enzima de interesse, ou a obtenção de genes ou partes de genes para misturar. Veja Crameri e cols., Nature 391:288-291, 1998; Arnold, Nature Biotechnol. 16:617-618, 1998b; Zhao e cols., Nature Biotechnol. 16:258-235, 1998; Zhao e Arnold, Protein Eng. 12:47-53, 1999. Mutação e seleção para "evolução direta" de enzimas com as propriedades desejadas também são factíveis. Por exemplo, veja Giver e cols., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 95:12809-12813, 1998; Liao e cols., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 83:576-580, 1986; Cherry e cols., Nature Biotechnol. 17:379-384, 1999.

Certas modificações de proteína, incluindo glicosilação, PEGilação e succinilação, também podem aumentar a estabilidade e alterar o pH ótimo, características que poderíam ser otimizadas para a enzima a ser usada na presente invenção. Dessa forma, poderíam ser empregados protocolos conhecidos a esse respeito para fazer enzima modificada, para teste, de acordo com os exemplos, para avaliar a adequabilidade na metodologia de tratamento da invenção.

Um método efetivo para a produção de PI-PLC surgiu da clonagem do gene de B. cereus em B. megaterium. O sistema de expressão (Rygus e Hillen, Appl. Microbiol. Bacteriol. 35:594-599, 1991) faz uso de elementos do regulon de xilose de Bacillus megaterium (Rygus e cols., Arch. Microbiol. 155:535-542, 1991), e era comercialmente disponível por BIO101 Corp. (Vista, Califórnia). Foi criada uma fusão, entre a seqüência codificadora líder do gene de PI-PLC e os três primeiros aminoácidos do gene xylA de B. megaterium, em um plasmídeo estabilizado com resistência a tetraciclina e regulada por um repressor que responde a xilose. Cepas desse tipo, com expressão amplificada, fornecem um meio factível para a produção de quantidades comercialmente úteis de PI-PLC, para incorporar em um alimento animal de acordo com a presente invenção.

Alguns isolados de Bacillus cereus produzem antibióticos tal como tunicamicina. Veja Kamogashira e cols., Agric. Biol. Chem. 52:859-861. Outro isolado de Bacillus cereus (ATCC 53522) é descrito, nas patentes U.S. No. 4.877.738 e No. 5.04 9.3 79, como um agente de biocontrole para evitar doença da semeadura e o apodrecimento da raiz em plantas. Acredita-se que esse efeito resulte da ação de dois antibióticos, designados "Zwittermicin", um aminopoliol linear de 396 Dalton, um "Antibiótico B", um aminoglicosídeo. Nos exemplos detalhados abaixo, a possibilidade de envolvimento desses dois antibióticos foi eliminada pela exclusão de possíveis antibióticos de baixo peso molecular da preparação de enzima.

Em particular, um caldo de fermentação livre de célula foi preparado por meio de uma membrana com um peso molecular de corte de 10 Kd. O concentrado, contendo proteína maior do que 10 Kd, foi usado para processamento adicional. Os antibióticos de baixo peso molecular, tais como aqueles descritos por Handelsman, supra, passariam através desse filtro. Além disso, foi empregada precipitação de sulfato de amônio para precipitar proteínas de alto peso molecular, deixando materiais de baixo peso molecular em solução. Após o precipitado de sulfato de amônio ter sido re-dissolvido, a solução de enzima resultante foi dialisada contra tampão, ainda outro tratamento que remove antibióticos de baixo peso molecular. Finalmente, a proteína foi precipitada uma segunda vez, novamente com sulfato de amônio, para extrair quaisquer compostos de baixo peso molecular restante da solução. O uso combinado desses quatro tratamentos combate fortemente contra a possibilidade de que o efeito antibiótico observado seja devido a um antibiótico de baixo peso molecular, produzido por ATCC 6464 ou ATCC 7004. O caldo de fermentação também foi testado, com uma cepa de teste de E. coli, para a presença de antibiótico, mas não foi detectada qualquer atividade antibiótica. A presente invenção é adicionalmente caracterizada abaixo por referência aos seguintes exemplos ilustrativos. EXEMPLO 1 Preparação de culturas de estoque congeladas de Bacillus cereus ATCC 6464 e ATCC 7004 Frascos com células liofilizadas da ATCC foram abertos e as células inoculadas em um meio de semeadura composto de Amberferm 4015 (Red Star) 10 g/1, Amberex 695 (Red Star) 5 g/1, e cloreto de sódio 5 g/1, pH 7,o e cresceram a 30°C. A cultura inicial foi listrada sobre placas de ágar de Caldo LB e uma única colônia resultante foi inoculada de volta em 20 ml do meio de semeadura em um frasco abafador (Bellco) de 250 ml e cresceu com agitação a 30°C. Quando a densidade de cultura alcançou uma leitura de OD60o foi adicionado glicerol estéril até aproximadamente 10% v/v e os frascos contendo 1,8 ml de cultura foram congelados a -80°C. EXEMPLO 2 Crescimento de isolados de ATCC 6464 e ATCC 7004 de Bacillus cereus para a produção de fosfolipase C específica para fosfatidilinositol Dois fermentadores Biostat C, 30 litros cada, foram loteados com meio da seguinte composição, em água corrente-. Caldo de Nutriente No. 2 (Oxoid) a 25 g/1, Triptona (Difco) a 10, extrato de levedura (Difco) a 10 g/1, e antiespuma Mazu DP10P Modll (BASF) a 0,1 ml por litro. O volume de lote inicial era de 9,5 1 e o caldo foi esterilizado a 121°C por 40 minutos. O pH inicial foi ajustado para 7,0 com gás de amônia após esterilização.

Foram preparadas culturas de semeadura em 500 ml do mesmo meio em frascos abafadores de agitação de 4 litros com conexão de aspirados (Bellco) com tubo de silicone anexado para inoculação. Os frascos foram esterilizados em uma autoclave a 121°C por 50 minutos antes da inoculação com 1,8 ml de estoque congelado de cultura preparado a partir da remessa de ATCC (EXEMPLO 1) . As culturas dos frascos de semeadura cresceram a 3 0 °C por 5,5 horas com agitação a 200 RPM em um ambiente controlado de um agitador de incubação (NBS modelo G-25). Antes da inoculação, a cultura tinha um OD60o de 1,53 e pH de 6,58. A cultura de ATCC 6464 tinha OD600 de 1,28 e pH de 6,79.

As culturas de semeadura de 500 ml foram inoculadas em f ermentadores de 3 0 1 e operadas sob as seguintes condições: temperatura de 30°C, mistura a 600 RPM, fluxo de ar de 10 litros por minuto, e pressão de 0,5 Bar. O OD600 da cultura inicial era 0,81. Em seis horas, a fermentação foi parada com OD600 final de 22,1 (ATCC 7 004) e OD600 de 24,2 (ATCC 6464). As fermentações ocorreram sem controle de pH e o pH final foi 8,17 (ATCC 7004) e pH 8,13 (ATCC 6464). O caldo foi removido dos f ermentadores e resfriado até 8°C antes de um processamento adicional.

Os fermentadores foram acionados uma segunda vez usando um procedimento virtualmente idêntico com ambos os isolados ATCC de Bacillus cereus. Nesse caso, as culturas de semeadura foram usadas em seis horas com OD600 de 2,86 (ATCC 7004) e ODgoo de 1,98 (ATCC 6464), e um pH de 6,69 (ATCC 7004) e pH de 6,65 (ATCC 6464) . As fermentações principais foram realizadas por 6,5 horas com OD600 final de 35,9 (ATCC 7004) e OD600 final de 33,6 (ATCC 6464). O pH final foi 8,38 (ATCC 7004) e pH final de 8,47 (ATCC 6464) no momento do resfriamento.

EXEMPLO 3 Remoção de célula por filtração e concentração de enzima PI-PLC

As células foram removidas e lavadas de cada um dos quatro grupos fermentadores descritos no EXEMPLO 2 usando dois filtros A/G Technology (UFP-500-K-6A) de fibra oca de 3 mm com valor de corte de peso molecular de 500.000 (500 Kd NMWC) anexados à extremidade. Foi bombeado caldo resfriado através dos filtros com uma bomba peristáltica em cerca de 2 litros por minuto com reciclagem de volta para o reservatório de retenção. O permeado contendo a enzima foi coletado em um reservatório resfriado em gelo. O volume do caldo inicial que continha célula de cerca de 9 litros foi concentrado até cerca de 2 litros, quando foi iniciada a diafiltração com Tris-HCl 10 mM, pH 8,5. Após um volume total de cerca de 14 litros de permeado ter sido coletado, foi terminada a lavagem de célula. O permeado de 500 Kd (cerca de 14 litros de cada fermentador) foi concentrado com dois filtros A/G Technology (UFP-10 -C-4XTCA) de fibra oca de 0,5 mm com valor de corte de peso molecular de 10.000 (10 Kd) anexados à extremidade. Foi usado o mesmo método de bombeamento com reciclagem do concentrado, exceto que o permeado foi descartado. O concentrado final com um volume de cerca de 500 ml de cada fermentador foi salvo para a próxima etapa de processamento.

EXEMPLO 4 Purificação e Concentração Adicional de Enzima PI-PLC O concentrado ultrafiltrado de 10 Kd (EXEMPLO 3) derivado de cada uma das fermentações de Bacillus cereus foi ajustado para 80% de saturação com sulfato de amônio e misturado em gelo por 60 minutos. A solução foi centrifugada por 15 minutos a 6000 RPM em um rotor Sorvall GSA. O sobrenadante foi descartado, e o precipitado foi dissolvido em um volume mínimo de Tris-HCl 10 mM, EDTA 0,2 mM (pH 7,5), e então dialisado no frio contra o mesmo tampão. A proteína em cada concentrado foi medida usando um ensaio de ligação de corante (BioRad) e o nível de PI-PLC foi medido (Hendrickson e cols., Bioorg. Med. Chem. Letters 1:619-622, 1991) usando um método de detecção baseado em HPLC e um substrato fluorescente (Molecular Probes, Inc. , P-3764, 1-pirenobutil mio-inositol-1-fosfato, sal de lítio). A Tabela 1 abaixo resume os dados do ensaio e prevê a pureza original a enzima total em uma base pura obtida de cada uma das quatro preparações. As preparações de enzima foram estocadas a -20°C até processamento posterior.

Tabela 1. Resumo da Análise de Preparações Cruas de Enzima PI-PLC______________________________________________ Prep. Número Proteína Atividade Proteína Pureza Total De ATCC mg/1 Específica total mg % PI- Enzima da U/mg1 na Estimada2 PLC

Cepa preparação mg em base pura 1 ____7004 1,86_______1,75________325_______2,92 9,49 2 ____6464 1,44 0,52 345 0,867 2,99 3 ____7004 1,35_______4,42 2 08 7,3 6 15,3 4 ____6464 2,06_______1,72 256 1,95 5,00 1U = unidade = 1 micromol/minuto 2 Baseada na presunção de que proteína 100% pura tem uma atividade específica de 60 U/mg (Hendrickson, supra) EXEMPLO 5 Formação de pool e concentração de preparações de enzima antes da aplicação ao alimento animal As preparações de enzima 1, 2, 3 e 4 foram reunidas em pool com um volume total de 675 ml. Foi adicionado sulfato de Amônio (4 92 g) vagarosamente e misturado em gelo por vários minutos. A solução foi centrifugada para coletar o precipitado. A fração granulada foi dissolvida em uma quantidade mínima de tampão fosfato 2 0 mM (pH 7,0) . A solução resultante foi 70,9 mM com uma densidade de 1,057 g/cc. A concentração de proteína foi medida em aproximadamente 25,5 mg/ml. A atividade de PI-PLC foi medida em aproximadamente 1,13 U/mg com uma pureza estimada de PI-PLC em 1,88%. A solução foi congelada a -20°C em sua totalidade, e então descongelada e usada para tratar uniformemente 90,718 kg de alimento de galinha. EXEMPLO 6 Clonagem e expressão do gene de PI-PLC de Bacillus cereus em Bacillus meaaterium O gene que codifica fosfolipase C específica para fosfatidilinositol (PI-PLC) foi seqüenciado. Veja Kuppe e cols., J. Bacteriol. 171:6077-6083, 1989. Usando tecnologia de PCR, o gene de PI-PLC foi clonado a partir de DNA cromossômico de Bacillus cereus (ATCC 6464). Foi usado um vetor de expressão, pMEGA (BIO 101, Vista, CA), para Bacillus megaterium. Dois iniciadores de PCR, especificamente, 5'-GCCTAGTAATAAGAAGTTAATTTTG-3' (iniciador 1) e 5'-CGGGATCCATATTGTTGGTTATTGG-3' (iniciador 2) foram projetados com um sítio Spel no iniciador-1 e um sítio BamHI no iniciador-2. O gene de PI-PLC amplificado por PCR foi ligado no sítio Spel - BarnH.1 de pMEGA e gerou um plasmídeo pCG682 . A proteína PI-PLC foi fundida com os primeiros três aminoácidos do produto de gene xylA no sítio Spel no vetor de expressão. A expressão do gene de PI-PLC foi sob a regulação do promotor xylA. O frasco de agitação de fermentação foi usado para avaliar a produção de fosfolipase C específica para fosfatidilinositol em Bacillus megaterium. Caldo LB com tetraciclina 10 pg/ml (20 ml) foi inoculado com 0,2 ml de cultura de semeadura e incubado em um agitador a 37°C a 250 rpm. Em OD60o de cerca de 0,5, 5 g/1 de D-(+)-xilose foram adicionados para induzir o promotor xylA. Após três horas, o sobrenadante foi coletado por centrifugação. A atividade de fosfolipase C específica para fosfatidilinositol foi medida por um método de substrato fluorescente (Hendrickson, e cols., Biochemistry 31:12169-12172, 1992; Hendrickson, Anal.

Biochem. 219:1-8, 1994), usando substrato 1-pirenobutil- mio-inositol-1-fosfato (Molecular Probes, Eugene, OR) e por detecção de HPLC.

Tabela 2. Medida de Expressão de PI-PLC

Esses dados mostram que a maioria da PI-PLC é extracelular e que a expressão ocorre somente após a adição de D( + )xilose (Tabela 2) . Estima-se que essa cepa recombinante tenha pelo menos 15 vezes a produtividade (mg/l/OD) da cepa selvagem média, como crescida no EXEMPLO 2 .

EXEMPLO 7 Fermentação de B. megaterium para a produção de PI-PLC O B. megaterium/pCG682 descrito no Exemplo 6 foi usado para a produção de PI-PLC por fermentação. O meio (PM) para os estágios de semeadura e fermentação continha 20 g/1 de Amberferm 4015 (Universal Flavors Bionutrients, Indianapolis, IN), 10 g/1 de extrato de levedura Amberex 695 (Universal Flavors Bionutrients, Indianapolis, IN), 10 g/1 de NZ Case Plus (Quest International, Hoffman Estates, IL) , 2,0 g/1 de K2HP04, 0,1 g/1 de MgS04 7H20 e 2 g/1 de glicose inicialmente e 12,5 mg/1 de tetraciclina. O pH foi ajustado para 7,5. O estágio de semeadura (500 ml em um frasco abafador de 2,8 1) foi iniciado pela inoculação de um frasco de semeadura congelado e agitação a 250 RPM a 30°C. Os frascos de semeadura foram preparados pela adição de um único crescimento de colônia sobre uma placa de ágar LB em 20 ml de PM em um frasco de agitação de 250 ml. Após crescimento até OD600 de cerca de 1,0 a 30°C, 5 ml de glicerol a 50% estéril foram adicionados, misturados e a solução foi distribuída em frascos plásticos estéreis de 2 ml e congelada a -60°C.

Os frascos de semeadura de 500 ml foram usados após crescimento até OD60o nm de cerca de 1,2 a 1,8 após 9 horas de agitação. Dois frascos foram usados para semear um fermentador de 60 1 cheio com 50 1 do mesmo meio esterilizado por vapor. A tetraciclina foi filtrada de forma estéril (filtro de 0,2 mícron) com uma solução a 1% etanol 40% e adicionada após esterilização e resfriamento até 30°C. Nos f ermentadores, 0,1 ml/1 de Mazu DF10PMOD11 antiespuma (BASF, Gurnee, IL) também foi adicionado no grupo inicial e adicionado à medida da necessidade para controlar a espuma durante as fermentações. As condições de operação para o primeiro estágio de semeadura do fermentador foram como segue: pressão de 3,45xl03 a l,72xl04 Pa; temperatura de 30°C ± 0,5°C; agitação de 200 a 450 RPM; aspersão de ar de 25 a 50 SLPM, oxigênio dissolvido > 25%. O pH foi controlado em 6,9 a 8,1 usando 21,25% de H3PO4 ou 5N NaOH. Quando o OD60o alcançou 8-10, os conteúdos foram usados para semear um fermentador de 600 1 contendo 425 1 do mesmo meio.

As condições para o fermentador de 60 0 1 de produção foram como segue: pressão de 3,45xl03 a l,72xl04 Pa; temperatura de 30°C ± 0,5°C; agitação de 100 a 300 RPM; aspersão de ar de 250 a 500 SLPM; oxigênio dissolvido > 25%. O pH foi controlado em 6,9 a 8,1 usando 21,25% de H3PO4 ou 5N NaOH. Quando a glicose inicial foi exaurida em 5 horas e ODsoo de cerca de 17, uma alimentação de xilose (pré-esterilizada por autoclave a 121°C por 20 minutos e composta de 10 kg de D-( + )xilose e 10 1 de água) foi iniciada. D-xilose foi obtida da Varsal Instruments, New Jersey. A alimentação foi iniciada inicialmente em 25 ml/minuto e mantida por 1,5 horas, e então aumentada até 43 ml/minuto. A segunda taxa foi mantida até que 22,5 1 de alimentação de xilose tivessem sido consumidos. O oxigênio dissolvido foi mantido pelo aumento da aspersão do ar em incrementos de 50 SLPM até 500 SLPM. Uma vez que o fluxo de ar fosse de 500 SLPM, então a RPM era aumentada. A fermentação foi terminada em 20 horas. Por volta de 17 horas, 7440 U/l (unidades como definidas pelo Exemplo 4) tinham acumulado. O caldo de fermentação foi coletado usando um Pall Filtron CIO Skid e quatro módulos CellFlo Microgon (poro de membrana de 0,2 μπρ fibras de 1 mm de diâmetro com 3,3 m2) . O permeado de membrana de 0,2 μτη foi concentrado usando um LT100 Pall Filtron Skid com uma membrana de ultrafiltração da AG/Technologies Tamanho 85 10K. O concentrado final foi 10 litros em volume e foi congelado a -20°C. EXEMPLO 8 Caldo de fermentação de Bacillus cereus não continha atividade antibiótica A fermentação com Bacillus cereus (ATCC 7004) foi conduzida de acordo com o método descrito no Exemplo 2, exceto que o volume inicial foi aumentado até 20 litros. Um teste para a presença de antibiótico foi conduzido com E. coli MG1655 como uma cepa de teste com caldo final de fermentação ou PI-PLC parcialmente purificado preparado de acordo com o método descrito nos EXEMPLOS 3-5. O teste foi conduzido como um teste de placa cilíndrica. Veja Brantner, Pharmazie 52(1):34-40, 1997. Nenhuma zona clara indicando atividade antibiótica foi observada em torno dos cilindros que continham as amostras de enzima. EXEMPLO 9 Ensaio de PI-PLC com ensaio de fluorescência com placa de microtítulo Foi desenvolvido um teste bioquímico aperfeiçoado para PI-PLC em relação ao método de Hendrickson e cols. (supra) usado no Exemplo 4.0 substrato 4-metilumbeliferil-myo-inositol-l-fosfato, sal de N-metil-morfolina foi obtido de Biosynth (Naperville, Illinois). As reações foram monitoradas em uma leitora de fluorescência de microtítulo Fluoroscan II obtida de MTX Lab Systems (Vienna, Virgínia). Para ensaios de caldo de fermentação ou de concentrados de enzima, as reações de 200 μΐ foram realizadas em placas de microtítulo de plástico preto compostas de 10 mM de Tris-HCl, desoxicolato a 0,16%, 0,8 mM de 4-metilumbeliferil- myo-inositol-l-fosfato, sal de N-metil-raorfolina, e enzima diluída em pH 8,0. As diluições de enzima, se necessárias, são feitas em solução de BSA a 1% em água. A reação foi seguida em leituras a 37°C por 30 minutos em intervalos de 2 minutos, para observar a liberação de metilumbeliferona do substrato com excitação a 350 nra e emissão a 450 nm. A correlação de unidades de fluorescência com micromoles de metilumbeliferona é usada para calcular as unidades (micromoles por minuto) formadas por quantidade de solução de enzima adicionada. A reação em pH 8,0 é um compromisso entre o pH ótimo para a enzima e o pH para fluorescência máxima de metilumbeliferona (pH 10) . Além disso, em pH 9,0 e acima, a taxa de liberação não-enzimática de metilumbeliferona torna-se significativa. Sob essa condição de ensaio, a atividade específica (unidades/mg) é de cerca de 39,3 vezes maior do que usando o método de Hendrickson e cols. (supra). Com o objetivo de testar a eficácia em experimentos de alimento animal, as unidades medidas usando esse ensaio foram convertidas para Unidades de Hendrickson equivalentes para facilitar a comparação com os primeiros testes antes desse ensaio ser usado. EXEMPLO 10 Ensaio de PI-PLC adicionado como doses efetivas em alimentos animais Uma variação mais sensível do ensaio de PI-PLC baseado em 4-metilumbeliferil mio-inositol-1-fosfato, sal de N-metil-morfolina (Exemplo 9) foi desenvolvido para a medida de enzima após adição ao alimento animal que envolve um pH para o ensaio, e outro pH para a medição da fluorescência.

As enzimas foram extraídas dos materiais de teste de alimento pesando-se 4 g de alimento e adicionando-o a 20 ml de Tris-CL 10 mM (pH 7,5) com desoxicolato 0,1% para fazer 20 g/1 de alimento. A mistura foi agitada em um misturador NBS G-25 (New Brunswick Scientific) por 1 hora em temperatura ambiente a 250 RPM. A mistura foi centrifugada a 13.000 RPM em uma microcentrífuga IEC Micromax com tubos de microcentrífuga de 1,5 ml. Foram feitas diluições apropriadas dos extratos em BSA 1% (albumina sérica bovina). Foram diluídas amostras extraídas dos alimentos com a aplicação de 22,22 U/kg.

Primeira Etapa de Reação-- Tubos foram preparados como segue. Padrões em diluições de 1:100 ou 1:200 de PI-PLC 0,12 U/ml (unidades como definidas no Exemplo 4) e uma em branco também devem ser incluídas. Reações de amostra devem ser revestidas em papel metálico para proteger o substrato da luz. 20 μΐ Tris-HCl, 010 mM, pH 6,0 40 μΐ Desoxicolato (0,8%) 40 μΐ substrato de PI-PLC (4,0 mM) 100 μΐ de enzima 200 μΐ/tubo de Reação Total a 25°C Dois pontos de tempo foram tomados (30 minutos e 60 minutos) pela remoção de 0,10 ml de cada reação. As alíquotas foram aquecidas até 65 °C por 15 minutos para parar a reação de enzima e resfriadas em gelo. Finalmente, as amostras foram centrifugadas a 12.000 RPM em um microcentrífuga por 5 minutos.

Leitura do Fluorômetro- - 120 μΐ de tampão Tris 0,,10 M (pH 8,0) foram adicionados a uma cavidade de microtítulo em uma placa plástica preta, então 80 μΐ da amostra da reação foram adicionados antes da leitura, como descrito no Exemplo 7. Os níveis de fundo de controle foram subtraídos. A taxa de produção de unidades de fluorescência por minuto foi calculada. As unidades de fluorescência foram convertidas para micromoles de produto de reação e as unidades de enzimas extraídas por peso original foram calculadas. EXEMPLO 11 Testes de Alimentação de Galinha com Ataque de Patôgeno I. Teste I de Alimentação de Galinha para Assar Foi realizado um primeiro teste de alimentação que se iniciava com frangos para assar com um dia de idade. Uma dieta alimentar típica uniforme de galinha de "alimentação de partida", programada para preencher ou exceder as National Council's Research NUTRIENT REQUIREMENTS FOR POULTRY (9a ed., 1994), foi preparada em forma amassada. As galinhas foram divididas em duas gaiolas (espaço de chão de 3 0,48 cm x 60,96 cm) em quatro grupos de tratamento com cada grupo de tratamento repetido quatro vezes e repetição de seis aves por gaiola (TABELA 3). Foram fornecidos água e alimento ad libitum através do período de teste de 21 dias. Um projeto de bloqueio randômico foi usado para alocar pintos a gaiolas e gaiolas a grupos de tratamento. Todas as gaiolas, alimentadores e bebedouros foram desinfetados antes do início do teste. A iluminação foi contínua (24 horas por dia) com lâmpadas incandescentes. Os pesos corporais foram determinados no primeiro dia e no dia 21. o consumo de alimento foi medido no dia 21.

No dia 5/ todas as galinhas foram infectadas com 200.000 oocistos por ave de Eimeria acervulina por engorda oral. No dia 7, todas as aves foram adicionalmente infectadas com 500.000 Clostridium perfringens através do suprimento de água. No controle negativo (Tl) não havia qualquer tratamento para infecção. No controle positivo (T2), foram adicionados ao alimento um coccidiostático e um antibiótico. Este foi o tratamento anti-coccidiose Sacox (salinomicina a 60 g/ton) e o antibiótico BMD-50 (50 g/ton) . Para grupos de tratamento, T3 e T4, o alimento com a enzima PI-PLC do tipo selvagem (cerca de 0,34 gramas de PI-PLC em base de pureza) foi usado iniciando no dia cinco da engorda oral com Eimeria acervulina. Todo o alimento foi preparado em um lote uniforme, e então dividido para a adição de antibiótico (Grupo de Teste T2) ou de enzima (Grupo de Teste T3 e T4). Os resultados da análise do peso das aves estão apresentados na Tabela 4 e os cálculos de alimento/ganho estão apresentados na Tabela 5.

Tabela 3. Tratamento Experimental para Alimento de Galinha para Assar Tabela 4. Peso Corporal Médio (g) em 21 Dias Tabela 5. Conversão Alimentar Média (0-21 dias) Corrigida para Peso de Aves Mortas Em ambas as tabelas anteriores, médias em uma linha sem uma letra comum são significativamente diferentes (P<0,05), pelo Teste de Duncan para significância. II. Teste II de Alimentação de Galinha para Assar Foi conduzido um segundo teste de alimentação que se iniciava com frangos para assar com um dia de idade. Todas as dietas basais foram projetadas para excederem os Requisitos de Nutrientes da National Research Council para Aves Domésticas (9a Ed., 1994) e foram preparadas em forma amassada para assegurar uniformidade. O estudo foi feito em baterias de gaiolas randômicas, em uma base cega, para testar o efeito de PI-PLC feita de fonte natural, Bacillus cereus (PI-PLC do tipo selvagem), ou um Bacillus megaterium recombinante em uma performance de frango para assar até 21 dias de idade. A fonte natural também contém outras enzimas extracelulares, mas a PI-PLC preparada a partir de Bacillus megaterium é altamente purificada e foi adicionalmente purificada por ultrafiltração usando uma membrana NMWC de 3 0 Kd. As aves foram atacadas aos 8 dias de idade com coccídeos Aviários (200.000 oocistos de E. acervulina por ave através da água de beber) e aos 10 dias de idade com Clostridium perfringens (100.000 por ave através da água de beber) . Cada um dos nove tratamentos (Tabela 6) teve 10 replicações ou gaiolas. Cada gaiola continha 6 frangos para assar Cobb x Cobb vacinados (Newcastle-Bronchitis, Mareks) com um espaço de 0,037 m2/ave. Aves mortas, se presentes, não foram substituídas após o 8 o dia. O alimento foi fornecido em forma amassada e em uma base ad libitum através de todo o período de teste do estudo (dia 0 ao dia 21) .

Uma dieta amassada basal comum e não-tratada, não contendo antibióticos, foi fornecida a todas as aves dos dias 0 a 7. Depois disso, nove dietas tratadas, em forma amassada, foram fornecidas dos dias 8-21 de idade. A alimentação basal foi um alimento típico de início para frango para assar contendo 22% de proteína bruta, com um ME (conteúdo de energia metabolizada) de l,29xl07 J/kg.

Tabela 6. Tratamento Experimental para o Teste II de Alimentação de Galinha para Assar 1 200.000 oocistos de E. acervulina foram administrados por ave por meio da água de beber aos 7 dias, e aos 10 dias de idade com 100.000 bactérias Clostridium perfringens por ave por meio da água de beber.

Tabela 7. Teste II de Alimentação de Galinha para Assar 1 PI-PLC recombinante produzido por Bacillus megaterium . 2 PI-PLC do Tipo Selvagem de Bacillus cereus. 3 O nível de adição de PI-PLC era muito baixo para ser efetivamente extraído e medido nesse experimento e apareceu como nível de fundo.

No primeiro teste quando a infecção bacteriana foi administrada através da água de beber (Exemplo 11-1) , por todos os critérios a PI-PLC do tipo selvagem produzida por Bacillus cereus funcionou tão bem ou melhor do que o tratamento Salinomicina + BMD (Tabelas 4-5) . Em um último teste acima mostrado com PI-PLC recombinante (Exemplo 11-II, Tabela 7), PI-PLC adicionada em concentrações variáveis, mostrou um efeito dose-dependente na diminuição da pontuação da lesão intestinal e na conversão alimentar (T3-T6) e no aumento do ganho de peso. Adicionalmente, o tratamento com PI-PLC recombinante, a 200 U/kg, na ausência do tratamento de Salinomicina + BMD, diminuiu a pontuação da lesão intestinal e teve um efeito positivo na conversão alimentar de no ganho de peso. PI-PLC do tipo selvagem de Bacillus cereus não funcionou de forma tão efetiva quanto sua contraparte recombinante na mesma concentração (22,02 U/kg) neste teste. III. Teste III de Alimentação de Galinha para Assar com enzimas, PI-PLC e endo-1,4-β-D-mananase Foi realizado um estudo em baterias de gaiolas de Petersime randômicas para testar o efeito de PI-PLC e endo-1,4-β-D-mananase (Patente U.S. 5.429.828) na performance de frangos para assar criados até 21 dias de idade. As aves foram atacadas aos 8 dias de idade com coccídeos aviários (75.000 oocistos de E. acervulina e 1.250 occistos de E. maxima por ave por engorda oral) e aos 11, 12, e 13 dias de idade com Clostridium perfringens (engorda oral cada dia com 1 ml de caldo de cultura fresco tendo 108 cfu/ml). Cada tratamento (Tabela 8) consistia de 8 replicações ou gaiolas e cada gaiola abrigava 14 frangos Cobb x Cobb vacinados com Mareks (reduzidos para 10 no Dia 14 uma vez que 4 aves foram removidas de cada gaiola e pontuadas quanto a lesões) com um espaço de 0,033 m2/ave. As aves mortas foram removidas das gaiolas quando elas foram detectadas e não foram repostas. A alimentação foi fornecida em forma amassada e em base ad libitum através de todo o período de teste (dia 0 ao dia 21) .

As dietas foram fornecidas em forma amassada dos dias 0-21 de idade. A alimentação basal foi um alimento típico de início para frango para assar contendo 22% de proteína bruta, com um ME de 1,29x1O7 J/kg.

Tabela 8. Tratamentos Experimentais com Teste II de Alimentação de Galinha para Assar 1 A dieta continha metileno dissalicilato de bacitracina (BMD, 50 g/ton) e salinomicina (Sacox, 60 g/ton). 2 100 UM/T é igual a 100 x 106 unidades de atividade por tonelada de alimento. 3 As aves foram atacadas aos 8 dias de idade com 75.000 oocistos de E. acervulina e 1.250 oocistos de E. maxima por ave por engorda oral e aos 11, 12, e 13 dias de idade com Clostridium perfringens por engorda oral cada dia com caldo de cultura fresco tendo 108 cfu/ml.

As conversões alimentares foram ajustadas para diferenças em pesos médios das aves para fins de comparação dos tratamentos. A infecção piorou o AF/G (conversão alimentar ajustada para o peso) em cerca de 23% (0,147 unidades AF/G). O uso de salinomicina e BMD restaurou completamente o AF/G aos níveis normais, mas esses dois agentes químicos não foram melhores do que a combinação de β-mananase e PI-PLC na redução das lesões intestinais causadas pela infecção. Cem milhões (100 MU) de unidades de β-mananase por tonelada, seja isoladamente ou em combinação com PI-PLC, superaram parcialmente as conseqüências deletérias da infecção, como evidenciado pela melhora de 65% para 70% na redução de AF/G no controle infectado (veja T3 v. Tl). A β-mananase parece ter diminuído a pontuação da lesão intestinal causada por E. acervulina mais do que de E. maxima. A restauração parcial am AF/G foi obtida em aves infectadas tratadas com PI-PLC no alimento, mas somente 33-41% da piora foi superada. No entanto, ambas as classes de PI-PLC diminuíram a pontuação da lesão intestinal causada por qualquer das espécies de Eimeria. No caso de E. maxima, a redução da lesão foi estatisticamente significativa. Os resultados estão mostrados na Tabela 9.

Tabela 9. Teste III de Alimentação de Galinha para Assar com PI-PLC e endo-l,4-p-D-mananase fornecidas a galinhas infectadas com E. acervulina, E. maxíma, e C. perfr *1= Infecção. 2Μ= Medicação (Salinomicina (60 g/ton) e BMD (50 g/ton)). 3AF/G= conversão alimentar ajustada ao peso (Tratamento 0,454 Kgdia 2i - Tratamento X 0,454 Kgdia 2i) /3 + (alimento consumido/ganho de peso (dia 0-21)· Unidades de PI-PLC são unidades baseadas no Exemplo 4.

Hemicell MU = milhões de unidades ChemGen IV. Teste IV de Alimentação de Galiirha para Assar O estudo foi feito em baterias de gaiolas de Petersime randômicas para testar o efeito de PI-PLC, mananase (Patente U.S. 5.429.828) e enzima mananase fúngica na performance de frangos criados até 21 dias de idade. As aves foram atacadas aos 8 dias de idade com coccídeos (75.000 oocistos de E. acervulina e 1.250 oocistos de E. maxima por ave por engorda oral) , e aos 11, 12, e 13 dias de idade com Clostridium perfringens (engorda oral a cada dia com caldo de cultura fresco tendo 108 cfu/ml) . cada gaiola inicialmente abrigou 14 frangos Cobb x Cobb vacinados com Mareks (reduzidos para 10 no Dia 14 uma vez que 4 aves foram removidas para pontuação das lesões) com um espaço de 0,033 m2/ave. As aves não foram repostas. O alimento e água foram fornecidos ad libitum através de todo o período de teste (Dias 0 ao Dia 21). As dietas fornecidas amassadas dos dias 0-21 de idade. A alimentação basal para os tratamentos 1 até o 16 foi uma alimentação inicial típica de milho/soja contendo 22% de proteína bruta com um ME de 1,29X1O7 J/kg.

Os resultados resumidos na Tabela 10 abaixo demonstram o benefício reprodutível da adição seja de PI-PLC ou de mananase nos alimentos de galinhas para assar infectadas com duas espécies de coccídeos e Clostridium perfringens aviários causando melhora tanto no ganho de peso quanto na conversão alimentar. De forma importante, esse estudo mostra que tanto PI-PLC quanto mananase, quando combinados com salinomicina, mas sem o antibiótico BMD (Testes 6 e 5) restaura a performance basicamente ao nível dos testes não- infectados (No. 1 e 2) . Isso fornece evidência quanto a função antibacteriana. Nesse caso, a PI-PLC/Salinomicina se comportou um pouco melhor do que a mananase, e melhor até mesmo do que a prática atual nos E.U.A. de adicionar uma combinação de BMD e salinomicina para rebanhos infectados (Teste 4).

Tabela 10. Teste IV de Alimentação de Galinha para Assar 11- Infecção: ataque aos 8 dias de idade com 75.000 oocistos de E. acervulina e 1.250 oocistos de E. maxima por ave por engorda oral, e aos 11, 12, e 13 dias de idade com Clostridium perfringens por engorda oral com 1 ml de caldo de cultura fresco tendo 1Q8 cfu/ml. 2 E= Enzimas: PI-PLC = PI-PLC recombinante produzida por B. megaterium adicionada a 66,07 U/kg, unidades como definidas no Exemplo 4; Man= endo-l,4-p-mananase de B. lentus (Patente U.S. 5.429.828) adicionada a 121 MU/ton (milhões de unidades ChemGen/ton), ou 5x a 506 MU/ton. 3 M= Medicação (B= BMD a 50 g/ton); S= Salinomicina (a 60 g/ton). EXEMPLO 12 Determinação do efeito de enzimas na viabilidade e invasão celular por esporozoítos Eimeria. acervulina e Eimeria tenella in vitro Esporozoítos de Eimeria acervulina ou esporozoítos de Eimeria tenella e células cultivadas de rim de bebê de hamster (BHK) foram preparados por métodos publicados. Veja Augustine, Avian and Poultry Biology Reviews 11:113-122, 2000. Para o pré-tratamento das células, as culturas de célula foram cobertas com diluições de enzimas como descrito na Tabela 11, e examinadas quanto a mudanças morfológicas de 5 a 45 minutos após a cobertura. Após 45 minutos, as culturas de monocamada foram lavadas duas vezes, e então inoculadas com esporozoítos não-tratados de E. acervulina e de E. tenella. Para aplicação durante infecção, os esporozoítos foram suspensos na diluição apropriada da enzima e inoculados imediatamente nas culturas de células. Após incubação de 45 minutos, as culturas foram fixadas, coradas, e a invasão foi quantificada.

As observações foram feitas procurando-se mudanças na morfologia grosseira de esporozoítos ou células devido ao tratamento de enzima. Nos níveis de enzima usados nesses experimentos, não foi observada qualquer mudança morfológica. A invasão de esporozoíto das células cultivadas foi medida após os dois métodos de tratamento de enzima, bem como sem tratamento de enzima, por procedimentos de coloração histológica e microscopia. Veja Augustine, supra.

Os dados na Tabela 11 mostram reduções significativas na invasão de esporozoíto nas invasões de esporozoíto tanto com E. acervulina quanto com E. tenella. Tanto a preparação de enzima PI-PLC relativamente impura de caldo extracelular de B. cereus, quanto a PI-PLC recombinante altamente pura produzida em caldo de B. megaterium recombinante resultaram em uma redução estatisticamente significativa de invasão na maioria dos experimentos. Até mesmo na dose de aproximadamente metade da preparação de PI-PLC do tipo selvagem de B. cereus, a preparação de PI-PLC recombinante ainda estava ativa. Dessa forma, o pré-tratamento das células com enzima e a lavagem da enzima era tão efetiva quanto a adição da enzima concomitantemente durante a infecção. No entanto, baseado na experiência com a extração de enzima do alimento, as duas etapas de lavagem provavelmente não iriam remover toda a enzima.

Uma preparação de enzima com endo-1,4 -β-mananase também causou uma redução estatisticamente significativa de invasão em dois experimentos onde as células foram pré-tratadas com enzima antes da infecção. Esses resultados positivos incluíram um experimento com cada tipo de patógeno. Dessa forma, mananase também teve um desempenho tão bom quanto a preparação de PI-PLC de B. cereus para reduzir a invasão de esporozoíto in vitro.

Tabela 11. Invasão in vitro de células BHK por esporozoítos de Eimeria acervulina ou Eimeria tenella com e sem tratamentos de enzima.

As contagens são relatadas como média ± erro-padrão da média medida de 1-3 tiras de cobertura/aberração (células BHK cresceram em tiras de cobertura inseridas nas placas de cultura). Médias dentro de grupos de teste com tiras de cobertura diferentes diferem significativamente (P < ou = 0,05). 1 Enzima extracelular de B. cereus dialisada em solução salina tamponada com fosfato, unidades padronizadas para o método do Exemplo 4. 2 Enzima extracelular de B. meçraterium recombinante dialisada em solução salina tamponada com fosfato, unidades padronizadas para o método do Exemplo 4. 3 Mananase obtida de Bacillus lentus como descrito na Patente U.S. 5.429.828 e dialisada em solução salina tamponada com fosfato, unidades são como definidas pelo ensaio de açúcar redutor de ChemGen Corp. 4 ND= Não determinado. EXEMPLO 13 Avaliação in vitro de PI-PLC para infecção por Cryptosporidium A enzima PI-PLC foi avaliada quanto à toxicidade e atividade anti-criptosporidium em concentrações variando de 0,001-30 U/ml usando-se células de rim canino Madin-Darby (MDCK) de 4 dias de idade. As unidades de enzima foram definidas como pelo método no Exemplo 4, mas medidas como no Exemplo 9. A preparação de enzima usada era de Bacillus megaterium recombinante. O tratamento foi iniciado 3 horas após a infecção e continuou através de 48 horas.

Imunoensaio de Quimiluminescência. Antes da infecção, os oocistos foram lavados e ressuspensos em base DMEM com taurocolato de sódio 0,75% e incubados por 10 minutos a 37°C (You e cols., FEMS Microbiol. Letters 136:251-256, 1996; You e cols., J. Antimicrobial. Chemother. 41:293-296, 1998). A mistura de desencistamento foi diluída com meio de UItracultura, prontamente distribuída em placas contendo células MDCK, em 100% de confluência, e mantida em meio de Ultracultura por 4 dias. O inóculo foi incubado com as células por 3 horas antes de lavar com PBS e reposto com meio de Ultracultura fresco com ou sem a enzima de teste. As placas foram incubadas a 37°C, em uma atmosfera de ar de C02 5% por 48 horas. As culturas foram lavadas com PBS e fixadas com solução de Bouin.

As placas fixadas foram lavadas com tampão de TBST (Tris-HCl 20 mM (pH 7,5), NaCl 150 mM, Tween-2 0 0,05%) e bloqueadas com BSA-TBST 1% (tampão de TBST contendo albumina sérica bovina 1%) por 30 minutos a 25°C com agitação suave. Soro de coelho anti-Cryptosporidium parvum (diluição 1:200) foi aplicado às placas e incubado por 1 hora. Após lavagem com TBST, as amostras foram incubadas seqüencialmente com IgG de cabra anticoelho rotulada com biotina e estreptavidina de raiz forte rotulada com peroxidase (diluição de trabalho, 1:1000, KPL Inc., Gaithersburg, MD) . Foi usado Luminol aprimorado (4- iodofenol e peróxido de hidrogênio, Aldrich Chemical Co.

Inc., Milwaukee, WI) como substrato. As placas foram lidas com Luminômetro ML3000 (Dynatech Lab , Chantilly, VA) e foram determinadas as unidades relativas de luz (RLU). Médias de RLU foram calculadas a partir de 4 cavidades replicadas e todos os experimentos foram repetidos pelo menos duas vezes.

Ensaio de toxicidade. A enzima foi testada usando um ensaio comercial de redução de corante tetrazolium (CellTiter 96; Promega Corp. , Madison, WI, USA) . De forma breve, cada concentração de enzima indicada abaixo foi introduzida em placas de 96 cavidades contendo monocamadas confluentes de células MDCK. Cada diluição foi avaliada em triplicata. A enzima foi incubada nas monocamadas a 37°C e C02 5%. Com 48 horas, as placas foram desenvolvidas por 1 hora e lidas no leitor de placa de ELISA a 490 nm. Os resultados foram anotados e analisados. A toxicidade percentual foi calculada subtraindo o OD médio do controle do meio sem a enzima do OD médio com a enzima e então dividindo pelo OD do meio e multiplicando por 100. As pontuações de citotoxicidade foram assinaladas como indicadas na tabela seguinte.

Toxicidade % Pontuação 0-5% 0 6-25% 1 26-50% 2 51-75% 3 76-100% 4 Foi observada toxicidade significativa com concentração igual ou maior do que 3 U/ml da enzima. Nenhuma toxicidade significativa foi observada com essa enzima na faixa de 0,1-1 U/ml (Tabela 12 Dessa forma, um conjunto de experimentos nessa faixa de concentração (1,0 U/ml ou inferior) foi realizado para determinar a atividade da enzima e a especificidade da enzima. No primeiro experimento, células MDCK foram infectadas com esporozoítos desencistados. Após um período de incubação de 3 horas, a monocamada de células foi lavada e a enzima foi adicionada em várias concentrações por um período de 48 horas. Como mostrado na Tabela 13, a enzima demonstrou atividade anti-criptosporidium na faixa de 0,01-1 U/ml in vitro. Foi obtida inibição de aproximadamente 50% em uma concentração de 0,1 U/ml (Figura 1).

Tabela 12. Toxicidade de PI-PLC recombinante preparada em B. megaterium para culturas de monocamadas de células MDCK

Tabela 13. Atividade de enzima PI-PLC recombinante com culturas de células MDCK infectadas com C. parvum Um segundo conjunto de experimentos foi realizado para avaliar a especificidade da enzima. Os esporozoítos foram tratados com a enzima em várias concentrações por 45 minutos e lavados brevemente. Permitiu-se então que os esporozoítos tratados infectassem células hospedeiras não-tratadas e se desenvolvessem e reproduzissem por 48 horas. Em um experimento separado, as células hospedeiras foram incubadas com a enzima em várias concentrações, lavadas e infectadas com esporozoítos não-tratados. Como mostrado abaixo (Tabela 14) , o tratamento tanto do esporozoíto quanto das células hospedeiras com a enzima resulta em inibição parcial. Uma inibição dose-dependente não foi observada nessa faixa de concentração. Isso pode ser devido ao curto período de incubação da enzima com as células hospedeiras ou parasitas (45 minutos) ou à divagem parcial ou incompleta dos receptores do hospedeiro/parasita. Adicionalmente, outros receptores do hospedeiro/parasita estão provavelmente envolvidos na infecção e são responsáveis pelo crescimento observado nas células hospedeiras.

Tabela 14. Tratamento de pré-infecção de esporozoítos ou células MDCK e o efeito na infetividade de C parvum Exemplo 14 Avaliação in vivo de PI-PLC para infecção por Cryptosporidium A enzima foi avaliada quanto à eficácia anti-criptosporidium usando um modelo de camundongo SCID imunodef iciente. De forma breve, os irtóculos de oocistos foram preparados pela lavagem de oocistos purificados (estocados a < 6 meses) com BSA 1%, PBS (pH 7,2) para remover dicromato de potássio. Camundongos SCID (4-5 semanas de idade) foram infectados com 106 oocistos (cepa IOWA) e tratados como indicado abaixo. Foram coletadas amostras fecais dos camundongos, purificadas através de sacarose descontínua e avaliadas quanto à carga de parasita por citometria de fluxo, como descrito previamente. Veja Arrowwood e cols., Parasitol. 81:404-409, 1995.

Tabela 15. Regime de Tratamento Para Experimentos Terapêuticos A ração granulada de camundongo foi revestida com 30 ou 9 0 U/ml de PI-PLC em PBS ou PBS. Todos os camundongos foram alimentados ad libitum. Os camundongos receberam alimentação imediatamente após a infecção. Amostras fecais e pesos foram coletados duas vezes por semana. O consumo de alimento foi medido diariamente. Os camundongos sofreram eutanásia injetando-se em cada 0,2 cm3 de Quetamina 10 0 mg/ml, Xilazina 100 mg/ml, e NaCl 0,9%. A alimentação média consumida por dia por camundongo e os pesos médios dos camundongos são mostrados na Tabela 16. Nenhuma diferença estatisticamente significativa no consumo de alimentação ou no peso foram observadas ao longo do período de 3 semanas.

Tabela 16. Consumo de alimento e ganho de peso de camundongos.

Eficácia em 3 semanas pôs-infecção. Foram coletadas amostras de fezes em 3, 4, e 4,5 semanas pós-infecção e as contagens de Criptosporidium em amostras de 100 microlitros foram medidas de grupos de camundongos SCID tratados e de controle, como mostrado na Tabela 17. Como mostrado, os camundongos tratados com a enzima demonstraram uma redução na carga parasitária. As cargas parasitárias foram observadas (34-54%) nos grupos tratados. Algumas dessas reduções foram estatisticamente significativas quando avaliadas usando a análise estatística ANOVA (mostrada abaixo e marcada com um símbolo). A enzima demonstra potencial como um agente terapêutico anti-criptosporidium. Doses mais elevadas da enzima ou uma melhor liberação da enzima ao local da infecção aumentaria sua eficácia e pode ser assunto de experimentos futuros.

Tabela 17. Eficácia de PI-PLC in vivo para reduzir Cryptosporidium nas fezes Valores de P foram significativos em 0,05 ou menos. + Valor de P foi 0,08 ou menos. EXEMPLO 15 Verificação de enzima em alimentos usados em testes de crescimento O ensaio de PI-PLC extraída de alimentos usados nos testes animais acima foi conduzido como descrito no Exemplo 10. Os resultados estão resumidos nas Tabela 18-19.

Tabela 18. Estudo de Criptosporidium, Alimento de Camundongo A eficiência da extração do alimento variou significativamente com o tipo de alimento. A extração do alimento de camundongo mostrou percentual de eficiência de 73,4 a 76 (Tabela 18) . Três preparações diferentes de alimento de galinha feitas em três locais diferentes foram cuidadosamente carregadas com 99,11 ou 396,47 U/kg de PI-PLC recombinante, e então imediatamente extraídas e testadas usando o procedimento de ensaio do Exemplo 9 uma vez que o nível de carga esteja na faixa do método de ensaio contínuo do Exemplo 9 (Tabela 19).

Tabela 19. Teste de Eficiência de Extração de Diferentes Fontes de Alimento de Galinha e de Refeição de Milho Pode-se observar que a eficiência da extração da refeição de milho é similar à extração do alimento de camundongo. No entanto, a extração de algumas amostras de alimento de galinha foi pobre nesse experimento, e também em outros.

No teste como mostrado na Tabela 20, a enzima passivel de extração foi aproximadamente 30-45% da PI-PLC teórica, enquanto que a β-mananase foi rapidamente extraível e o rendimento foi de aproximadamente 100%. Cerca de 45% da extração foi o melhor nível de extração observado com esse alimento com o teste de extração mostrado acima. Dessa forma, os resultados do ensaio para U/kg extraída para os alimentos do teste da Tabela 20 estão na faixa esperada para a carga usada.

Tabela 20. Verificação de Carga de Enzima No Teste III de Alimentação de Galinha Para Assar Embora certas modalidades representativas e detalhes tenham sido mostrados com a finalidade de ilustrar a invenção, será aparente para aqueles experientes na técnica que várias mudanças e modificações podem ser aqui feitas sem se afastar do escopo da invenção.

REIVINDICAÇÕES

Claims (51)

1. Composição, caracterizada pelo fato de compreender (i) uma fosfolipase C específica a fosfatidilinositol, e (ii) um transportador fisiologicamente aceitável para a enzima, onde a composição está em uma forma adequada para administração oral.

2. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a composição é um alimento.

3. Composição, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que a enzima é o único agente anti-infeccioso presente na composição.

4. Composição, de acordo com a reivindicação I, caracterizada pelo fato de que a composição também compreende um estabilizante, um transportador de carboidrato ou um preservativo.

5. Composição, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que o estabilizante é um tampão, um carboidrato ou um glicol.

6. Composição, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que o transportador de carboidrato é selecionado do grupo que consiste em xilose, frutose, glicose, sorbitol e maltotriose.

7. Composição, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que o preservativo é selecionado do grupo que consiste em propilparabeno, sorbato de sódio, sorbato de potássio, e ascorbil palmitato.

8. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o transportador é um alimento no qual a enzima é incorporada.

9. Composição, de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que o alimento é um alimento animal que compreende material de grãos, uma fonte de proteína, vitaminas, aminoácidos, e minerais.

10. Composição, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que o material de grãos é milho, sorgo, trigo, cevada ou aveia.

11. Composição, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que a fonte de proteína é feijão ou ervilha.

12. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a composição está em uma formulação sólida ou uma formulação líquida.

13. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a enzima está contida em um comprimido ou invólucro de cápsula de gelatina.

14. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a enzima é preparada a partir de uma cepa de Bacillus cereus.

15. Composição, de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo fato de que a cepa de Bacillus cereus é ATCC 7004 ou ATCC 6464.

16. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a enzima é obtida por expressão de um DNA recombinante em um organismo hospedeiro.

17. Composição, de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pelo fato de que o organismo hospedeiro é de uma cepa de Bacillus megaterium.

18. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a enzima está presente em 200 IU/kg-4000 IU/kg de alimento.

19. Uso de uma enzima fosfolipase C específica a fosfatidilinositol caracterizado pelo fato de ser para fabricação de um medicamento para tratar ou melhorar o risco de uma infecção do trato digestivo, em que referido medicamento é adequado para administração oral.

20. Uso, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que a enzima cliva uma ligação que efetua a liberação de uma proteína de superfície celular.

21. Uso, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que a enzima é o único agente anti-infeccioso presente no referido medicamento.

22. Uso, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que a infecção é causada por um patógeno de protozoário, bacteriano, de levedura, viral ou fúngico.

23. Uso, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que a infecção é causada por um patógeno de protozoário do gênero Eimeria..

24. Uso, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que a infecção é causada por um patógeno de protozoário do gênero Cryptosporidium.

25. Uso, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que a infecção é causada por um patógeno bacteriano do gênero Clostridium.

26. Uso, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que a enzima é preparada a partir de uma cepa de Bacillus cereus.

27. Uso, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que a cepa de Bacillus cereus é ATCC 7004 ou ATCC 6464.

28. Uso, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que a enzima é obtida por expressão de um DNA recombinante em um organismo hospedeiro.

29. Uso, de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que o organismo hospedeiro é de uma cepa de Bacillus megaterium.

30. Composição, caracterizada pelo fato de compreender (i) uma endo-1,4-β-D-mananase e (ii) um transportador fisiologicamente aceitável para a enzima, onde a composição está em uma forma adequada para administração oral e compreende endo-1,4-β-D-mananase como o único agente anti-infeccioso em uma quantidade eficaz para tratar ou reduzir o risco de uma infecção do trato digestivo.

31. Composição, de acordo com a reivindicação 30, caracterizada pelo fato de que o transportador é um alimento no qual a enzima é incorporada.

32. Composição, de acordo com a reivindicação 31, caracterizada pelo fato de que o alimento é um alimento animal que compreende material de grãos, uma fonte de proteína, vitaminas, aminoácidos, e minerais.

33. Composição, de acordo com a reivindicação 32, caracterizada pelo fato de que o material de grãos é milho, sorgo, trigo, cevada ou aveia.

34. Composição, de acordo com a reivindicação 32, caracterizada pelo fato de que a fonte de proteína é feijão ou ervilha.

35. Composição, de acordo com a reivindicação 30, caracterizada pelo fato de que a composição está em uma formulação sólida ou uma formulação líquida.

36. Composição, de acordo com a reivindicação 30, caracterizada pelo fato de que a enzima está contida em um comprimido ou invólucro de cápsula de gelatina.

37. Composição, de acordo com a reivindicação 30, caracterizada pelo fato de que a endo-1,4-β-D-mananase é a produzida pelo Bacillus lentus designado como ATCC 55045.

38. Composição, de acordo com a reivindicação 30, caracterizada pelo fato de que a composição também compreende um estabilizante, um transportador de carboidrato ou um preservativo.

39. Composição, de acordo com a reivindicação 38, caracterizada pelo fato de que o estabilizante é um tampão, um carboidrato ou um glicol.

40. Composição, de acordo com a reivindicação 38, caracterizada pelo fato de que o transportador de carboidrato é selecionado do grupo que consiste em xilose, frutose, glicose, sorbitol e maltotriose.

41. Composição, de acordo com a reivindicação 38, caracterizada pelo fato de que o preservativo é selecionado do grupo que consiste em propilparabeno, sorbato de sódio, sorbato de potássio, e ascorbil palmitato.

42. Uso de uma endo-1,4-β-D-mananase, caracterizado pelo fato de ser na fabricação de um medicamento para tratar ou melhorar o risco de uma infecção do trato digestivo, em que a endo-1,4-β-D-mananase é o único agente anti-infeccioso presente no medicamento, e em que o medicamento é adequado para administração oral.

43. Uso, de acordo com a reivindicação 42, caracterizado pelo fato de que a infecção ê causada por um patógeno de protozoário, bacteriano, de levedura, viral ou fúngico.

44. Uso, de acordo com a reivindicação 43, caracterizado pelo fato de que a infecção é causada por um patógeno de protozoário do gênero Eimeria.

45. Uso, de acordo com a reivindicação 43, caracterizado pelo fato de que a infecção é causada por um patógeno de protozoário do gênero Cryptosporidium.

46. Uso, de acordo com a reivindicação 43, caracterizado pelo fato de que a infecção é causada por um patógeno bacteriano do gênero Clostridium.

47. Uso, de acordo com a reivindicação 42, caracterizado pelo fato de que a enzima é preparada a partir de uma cepa Bacillus lentus.

48. Uso, de acordo com a reivindicação 42, caracterizado pelo fato de que a enzima é obtida por expressão de um DNA recombinante em um organismo hospedeiro.

49. Uso, de acordo com a reivindicação 42, caracterizado pelo fato de que a endo-1,4-β-D-mananase é a produzida pelo Bacillus lentus designado como ATCC 55045.

50. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o transportador é um alimento animal para um animal produtor de carne.

51. Composição, de acordo com a reivindicação 30, caracterizada pelo fato de que o transportador é um alimento animal para um animal produtor de carne.