CZ20022007A3 - Farmaceutický prostředek - Google Patents

Description

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká prostředků obsahujících enzymy a způsobů použití enzymů jako antiinfekčních činidel, v souvislosti s léčbou nebo snížením rizika infekcí zažívacího traktu.

Dosavadní stav techniky

V r. 1998 v Revision of the World Population Estimates a Projections předpokládala the United Nations Department of Economic and Sociál Affairs Population Division, že světová populace dosáhne v roce 1999 6 miliard. Zpráva také předpokládala, že zvýšení populace z 5 na 6 miliard bude trvat pouze 12 let ve srovnání se zvýšením z 1 na 2 miliardy, které trvalo 123 let. V polovině 21. století se předpokládá populace mezi 7,3 a 10,7 miliardami. Vzestup populace v poslední dekádě je částečně způsoben úspěchy v produkci potravin v důsledku aplikací technologií a intenzifikace produkce potravin. Pro další růst populace budou potřeba ještě účinnější pokroky v produkci potravin.

Jeden způsob pro zefektivnění produkce masa zahrnuje používání antimikrobiálních sloučenin a antibiotik ve zvířecím krmivu. Ve velkých farmách je šíření infekce v podmínkách stád velmi rychlé. Různá onemocnění jsou proto kontrolována profylaktickým nebo terapeutickým používáním těchto substancí, například je běžné používání chemických činidel v potravě pro kontrolu kokcidiových infekcí (zde se používá například salinomycin, monensin, roxarson (3-nitro), halquinol, carbadox a olaquindox), stejně jako antimikrobiální antibiotika *· <r

(například bacitracin, virginiamycin, tylosin, tetracyklin, chlortetracyklin, penicilín, oleandomycin, novobiocin, lincomycin, bambermyciny, apramycin, spiramycin, erythromycin, neomycin a další). Je dobře známo, že tyto postupy podporují růst a zlepšují přeměnu krmivá.

Nárůst mnohotné antibiotické resistence u lidských patogenů, jako je Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenza, Neisseria gonorrhoeae a Mycobacterium tuberculosis, budí obavy, že resistence na antibiotika vzniklá u mikrobů asociovaných se zvířaty na farmách, může migrovat na lidské patogeny prostřednictvím přenosných faktorů lékové resistence. Existují důkazy, že zvířata krmená antibiotiky jsou zdrojem bakterií s přenosnými faktory resistence. Viz Hooge, Feedstuffs 71(20):59, 1999. Ačkoliv jsou antibiotika používaná u zvířat a u člověka obvykle odlišná, mají podobné mechanismy účinku, což může vést ke zkřížené resistenci. V jednom případě jsou fluorochinolony schválené pro léčbu infekcí E. coli (colibacilosi) u některých zvířat také používána v humánní medicíně, viz výše Hooge. Nedávno FDA/CVM navrhl odebrání schválení pro použití fluorchinolonu enrofloxacinu u drůbeže z důvodu vzniku kampylobakteru resistentního na fluorchinolon a jeho přenosu na člověka. Viz Murhead, S., Feedstuffs 72(45):1-4, 2000.

V oblasti masného průmyslu také panuje obava ze snížení zisků a návratu zvířecích chorob po zákazu používání antibiotik a antimikrobiálních činidel v potravě. V roce 1986 například Švédsko zakázalo používání antibiotik v krmivu a zvýšil se počet onemocnění zvířat. Toto bylo doprovázeno zvýšeným používání terapeutických antibiotik, což vedlo k celkovému zvýšení používání antibiotik, stejně jako ke zvýšení nákladů na produkci masa. Viz Smith, Feedstuffs ►·

71(13):1, 1999. V prosinci 1998 EU Council of Ministers rozhodla zakázat používání šesti antimikrobiálních činidel, která byla formálně schválena jako činidla podporující růst přidávaná do krmivá (Official Journal of the European Communities 29.12.98, Council Regulation No. 282 1/98 concerning Directive 70/524). V srpnu 1999 byly také zakázány dvě přísady na bázi chinoxalinu v důsledku zbytků v mase. Důsledkem těchto zákazů bylo také zvýšení prevalence onemocnění formálně považovaných za vymýcená, včetně nekrotické enteritidy u broilerů, enteritidy způsobené Clostridium perfringens u odstavených selat, dysenterie prasat a spirochetového průjmu a E. coli-asociovaného průjmu. Viz Miller, United States Animal Health Association, 1999 Proceedings Antibiotic Usages in Food Animal Production and Resistance-European Perspective.

Udává se 30000 lidských úmrtí za rok způsobených nosokomiálními infekcemi resistentními patogeny, ale mnohem méně úmrtí na infekce patogeny z potravy. Žádné z úmrtí na potravinové patogeny není spojeno s resistentní na antibiotika (viz Smith, výše). Tak není jasné, zda používání antibiotik při produkci masa přispívá k problému nosokomiálních infekcí resistentními patogeny u člověka. Dalším problémem je chybění nových antibiotik pro léčbu.infekcí způsobených resistentními patogeny. Viz Henry, C.M., Chemical and Engineering News, 6.3.2000, str. 41-58. To může znamenat, že když se vyvine patogen významně resistentní na antibiotika, nemusí být žádné antibiotikum pro léčbu infekce k dispozici. Obtíže při vývoji nových antibiotik, velikost trhu a regulační nařízení způsobily, že většina farmaceutických firem přesunula svůj zájem pryč od vývoje nových antibiotik, zejména pro použití u zvířat. Nová navržená pravidla pro registraci léčiv pro použití u zvířat jsou tak obtížná, že byl vývoj takových léků • · · A ♦ A · ····

AAA· AAAA A A A

AAAA ·· ·· ·· ·· AAA· zastaven. Viz Smith, výše. Nicméně, existuje několik malých společností zabývajících se vývojem nových antibiotik (Henry, výše) .

V některých zvířecích populacích je infekce již pandemická. Například ptačí kokcidiosa je onemocnění, které je pouze zvládáno, nikoliv pod skutečnou kontrolou. Prakticky všechna hejna jsou infikována a chemická činidla proti kokcidiose jsou běžně střídavě přidávána do potravy, aby se kontrolovalo poškození a omezil vznik resistentních kmenů. Kokcidiosa stojí producenty drůbeže ročně 350 milionů dolarů na ztrátách a nákladech na léky, jako je salinomycin. Viz Suszkiw, USDA Agricultural Research Service News, October 28, 1997. V roce 1999 se předpokládalo, že léky proti kokcidiose budou stát v USA přibližně 114 milionů dolarů. Viz Frost & Sullivan, US. Pharmaceutical Products for Food Animals, Report 5245-54,

1995.

Existuje jasná potřeba nových a účinnějších metod pro léčbu infekcí zažívacího traktu u zvířat, která jsou chována v intenzifikovaných chovech. Tato potřeba je založena na potřebě dosažení lepší účinnosti produkce pro potřeby rychle rostoucí světové populace. Lepší kontrola střevních infekcí garantuje rychlejší růst a lepší účinnost krmení. Existuje také potřeba alternativy k používání antibiotik při produkci zvířat, která by řešila možný problém vzniku antibiotické resistence u lidských patogenů.

Při použití léčby na bázi enzymů, která působí jinak než všechna antibiotika, neexistuje riziko stimulace vývoje resistentních patogenních mikroorganismů, které by mohly být problémem pro člověka. Protože enzymy jsou proteiny, neexistuje možnost, že by byla nebezpečná chemická residua « · • · ♦ *>

• *

inkorporována v masových výrobcích, jak je tomu u některých antibiotik a činidel proti kokcidiose. Viz American Feed Control Officials lne., Official Publication, 1999, Drugs and Feed Additives, Section 30.0 Enzymes,' str. 206-217, ISBN 1878341-10-3.

Podstata vynálezu

Proto je předmětem předkládaného vynálezu poskytnout enzymatickou léčbu pro snížení dopadu infekcí zažívacího traktu.

Dalším předmětem předkládaného vynálezu je poskytnout mechanismus snížení dopadu infekcí zažívacího traktu, kde uvedený mechanismus interferuje s vazbou patogenů na buňky zažívacího traktu.

Ještě dalším předmětem vynálezu je způsob zvýšení přírůstku hmotnosti a konverze krmivá u zvířat, která jsou infikována patogeny způsobujícími infekce nebo nekrotizující enteritidu.

Dalším předmětem předkládaného vynálezu je poskytnout dávkovou formu vhodnou pro orální podání, která je účinná pro zlepšení stavu jedince infikovaného mikrobiálním patogenem nebo rizikového z hlediska takové infekce.

Pro splnění těchto a dalších předmětů vynález také v jednom aspektu poskytuje prostředek obsahující (i) enzym, který štěpí vazbu, která uskutečňuje uvolňování proteinu nebo karbohydrátu z buněčného povrchu, kde enzym je jiný než endo1,4-P-D-mannanasa, a (ii) fyziologicky přijatelný nosič pro enzym, kde prostředek je ve formě vhodné pro orální podání a neobsahuje jiné antiinfekční činidlo než enzym. V jednom • · · ♦ ♦ · * · * · · • ··· · ··· · · « .· : : ·: :: : ·: : ,· ···· ·· ·· ·· ·· ···· provedení štěpí daný enzym vazbu, která uvolňuje protein buněčného povrchu.

Ve výhodném provedení je enzym obsažený v prostředku sfingomyelinasa nebo fosfolipasa, zejména fosfolipasa typu C nebo D. V jiném výhodném provedení je enzym vybrán ze skupiny zahrnující esterasy, cerebrosidasy a karbohydrasy, které štěpí vazbu, která štěpí vazbu, která uvolňuje protein nebo karbohydrát z buněčného povrchu. V jiném provedení je enzym připraven z kmene Bacillus cereus, výhodně ATCC 7004 nebo ATCC 6464. Alternativně je enzym získán expresí rekombinantní DNA kódující enzym v Bacillus megaterium. V jiném provedení je enzym obsažen v obalu želatinové kapsle a je v prostředku přítomen v dávce 200 IU/kg až 4000 IU/kg krmivá.

V jiném aspektu předkládaný vynález poskytuje prostředek obsahující výše uvedené složky (i) a (ii), kde fyziologicky přijatelným nosičem je krmivo, do kterého je enzym inkorporován. Tak může být prostředkem zvířecí krmivo, které neobsahuje žádné jiné anti-infekční činidlo než enzym.

Prostředek ve formě zvířecího krmivá podle předkládaného vynálezu dále obsahuje zrnitý materiál, jako je kukuřice, čirok, pšenice, ječmen nebo oves, zdroj proteinu, jako jsou fazole nebo hrách, a vitaminy, aminokyseliny a minerály.

V ještě dalších aspektech předkládaný vynález poskytuje prostředek, jak byl popsán výše, který jev pevné nebo kapalné dávkové formě.

Dále předkládaný vynález poskytuje způsob léčby nebo zmírnění rizika infekce zažívacího traktu, který zahrnuje orální podání - jedinci trpícímu infekcí nebo rizikovému z hlediska infekce - účinného množství enzymu, který štěpí vazbu, která uvolňuje protein nebo karbohydrát z buněčného povrchu, kde enzym je jiný než endo-1,4-p-D-mannanasa. Dále způsob nezahrnuje podání jiného antiinfekčního činidla než enzymu. Infekce může být způsobena prvoky, jako je Eitneria a Cryptosporidium, bakteriemi, jako je Clostridium, houbami nebo kvasinkami.

Dále vynález poskytuje prostředek obsahující (i) enzym, který štěpí vazbu, která uvolňuje protein nebo karbohydrát z buněčného povrchu (ii) fyziologicky přijatelný nosič pro enzym, kde prostředek je ve formě vhodné pro orální podání a neobsahuje anti-infekční činidlo jiné než enzym.

Dále předkládaný vynález poskytuje způsob léčby nebo zmírnění rizika infekce zažívacího traktu, který zahrnuje orální podání - jedinci trpícímu infekcí nebo rizikovému z hlediska infekce - účinného množství enzymu, který štěpí vazbu, která uvolňuje protein nebo karbohydrát z buněčného povrchu, kde způsob nezahrnuje společné podání antimikrobiálně účinného množství jiného antiinfekčního činidla s enzymem.

Další předměty, vlastnosti a výhody předkládaného vynálezu budou jasné z následujícího podrobného popisu. Podrobný popis a příklady provedení ukazuj-í konkrétní výhodná provedení, ale jsou uvedena pouze pro ilustraci, protože odborníkům jsou zřejmé různé modifikace a variace předkládaného vynálezu.

Dále, příklady demonstrují princip předkládaného vynálezu, ale neilustrují použití předkládaného vynálezu na všechny příklady infekcí, kde by je odborník pokládal za použitelné.

Přehled obrázků na výkresech

Obr. 1 ukazuje anti-kryptosporidiální aktivitu rekombinantního • fefefe

PI-PLC enzymu produkovaného kmenem Bacillus megaterium. Podrobný popis vynálezu

Bylo zjištěno, že enzymy určité třídy, charakterizované schopností štěpit vazbu, která uvolňuje proteiny nebo karbohydráty buněčného povrchu, vykazují po orálním podání významnou antibiotickou aktivitu, která je účinná například při léčbě infekcí zažívacího traktu. Mezi takové třídy enzymů patří například sfingomyelinasy a fosfolipasy typu C a D a enzymy podobné specificity. Příklady této třídy jsou proto enzymy, které uvolňují glykoproteiny nebo karbohydráty, které jsou zakotveny v membráně vazbou na fosfatidylinositol. Proto je enzym fosfatidylinositol-specifická fosfolipasa C (E.C. 3.1.4.10), též známý pod zkratkou PI-PLC nebo jako 1fosfatidylinositol-fosfodiesterasa, členem této třídy. Jiným příkladem je glykosylfosfatidylinositol-specifická fosfolipasa D, nebo GPI-PLD. Low a Prasad, Proč. Nati. Acad. Sci. 85: 980984, 1988.

GPI-PLD a PI-PLC enzymy byly popsány z eukaryotických zdrojů. Viz Low, Degradation of glykosyl-fosfatidylinositol anchors by specific fosfolipases, kapitola 2, str. 35-63, v MOLECULAR AND CELL BIOLOGY OF MEMBRANE PROTEINS: GLYKOLIPID ANCHORS OF CELL—SURFACE PROTEINS, A.J. Turner (ed.), Ellis Horwood, New York, 1990; Low a Prasad, Proč. Nati. Acad. Sci. 85:980-984, 1988; Essen et al., Nátuře 380:595-602, 1996; a Essen et al., Biochemistry 36:2753-2762, 1997. PI-PLC byly popsány z prokaryotických zdrojů, včetně extracelulární produkce bakteriemi. Mezi známé bakteriální zdroje PT-PLC patří Bacillus cereus (Stein a Logan, J. Bacteriol. 85:369381, 1963; Stein a Logan, J. Bacteriol. 90: 69-81, 1965; Ikezawa et al., Biochimica et Biophysica Acta 450:154-164, 1976; Griffith et al., Methods in Enzymology 197:493-502, •· 0· 0« 00 ·00· · 0 0 0 0 0 00 0 « 0 0 00 000 0 0

00 00 0000

1991; Volwerk et al., J. Cell. Biochem. 39:315-325, 1989; a Kuppe et al., J. Bacteriol. 171:6077-6083, 1989), Bacillus thuringiensis (Ikezawa a Taguchi, Methods in Enzymology 71:731-741, 1981; Japonská patentová přihláška JP 55034039), Staphylococcus aureus (Low a Finean, Biochem J. 162:235-240, 1977) a Clostridium novyi (Taguchi a Ikezawa, Arch. Biochem. Biophys. 186:196-201, 1978).

Vylepšené enzymové testovací techniky pro PT-PLC enzym jsou založeny na fluorescentním substrátu. Viz Hendrickson el al., Biochemistry 31:12169-12172, 1992; Hendrickson, Anal. Biochem. 219:1-8, 1994; Hendrickson et al., Bioorg. Med Chem. Letters. 1:619-622, 1991.

Bez definitivní vazby na jakoukoliv teorii předkladatelé vynálezu předpokládají, že enzym PI-PLC může štěpit fosfatidylinositol-glykolipidové zakotvení proteinů buněčného povrchu a jiných glykosyl-fosfatidylinositolů. Viz Low, výše; Low a Saltiel, Science 239: 268-275, 1988. Například různé povrchové glykoproteiny a jiné povrchové proteiny a karbohydráty několika jednobuněčných parazitů jsou zakotveny glykosyl-fosfatidylinositolovými lipidy (GPI zakotvení) a jsou sensitivní na trávení a uvolňování PI-PLC. Ilustrativní druhy náleží k rodu Schistosoma, Toxoplasma, Plasiruxodium,

Trypanosoma a Leishmania (Low, výše), stejně jako Eimeria, Babesia, Theileria, Giardia, Leptomonas a Entamoeba. Viz McConville a Ferguson, Biochemical J. 294: 305-324, 1993; Pearce a Sher, J. Immunol. 142:979-984, 1989; Sauma et al., Mol. Med. Biochem, Parasitol. 46:73-80, 1991; Hawn a Strand, Mol. Med Biochem. Parasitol. 59:73-82, 1993.

Tento mechanismus zakotvení složek buněčného povrchu se zdá být universální pro eukaryotické buňky v rozsahu od kvasinek * · • 0 ··

·

00 0000 000 •00000 ·· ·· ·♦ ···· k savcům. Přítomnost GPI zakotvení u Giardia lamblia, která je považována za velmi primitivní eukaryotický organismus, naznačuje, že se tento typ zakotvení vyvinul u eukaryot časně. V souladu s tímto předpokladem je objev nového fosfoglycerolipidu GlcNal-6-myo-inositol-P-dialkylglycerolu u archaebakterií (Nishihara et al., J. Biol. Chem. 267:1243212435, 1992), kde tato sloučenina je základem pro komplexnější eukaryotické GPI kotevní struktury, které se vyvinuly později. U protozoí je GPI kotevní systém využíván více než u vyšších eukaryot a existují důkazy, že struktury zakotvené přes GPI jsou významné pro přežívání parazitů v hmyzích a savčích hostitelích. (McConville a Ferguson, výše) . Například může být hojná přítomnost různých povrchových glykoproteinů mechanismem bránícím útoku imunitního systému.

Prvok Eimeria tenella obsahuje fosfatidylinositolem zakotvené struktury podobné glykoproteinu/glykolipidu Trypanosoma brucei. Tyto struktury se považují za významné pro vazbu na membránu a následnou infekci. Viz Gurnett et al.,

Mol. Med. Biochem. Parasitol. 41:177-186, 1990. Eimeriové struktury jsou štěpeny lipasou trypanosom a Bacillus thuringiensis PT-PLC (Gurnett, výše). In vivo zpracování parazitů PI-PCL, pokud bude proveditelné, pravděpodobně pomůže imunitnímu systému hostitele a bude interferovat s vazbou a infekcí patogenů vstupujících do organismu zažívacím traktem. Eimerie jsou rozšířeným a nákladným problémem v drůbežářském průmyslu. Jiný protozoární parazit, Cryptosporidium parvum, je značně rozšířen a způsobuje akutní průjmová onemocnění u člověka a mnoha zvířat. Sporozoitový protein, GP15/45/60, je patrně podle DNA sekvence GPI-vázaný protein, a monoklonální protilátky proti tomuto proteinu inhibují infekci (Strong, W.B., et al., Infection and Immunity 68: 4117-4134, 2000; Cevallos, A.M., et al., Infection and Immunity 68: 41084116, *· · · » ·· ··· · · * · « ♦ · · · ··· ··«· »« ♦· ·♦ »· ····

2000). Proto je C. parvum dalším patogenem potenciálně léčitelným PI-PLC.

Prokaryotické bakterie neobsahují povrchové glykoproteiny a karbohydráty zakotvené fosfatidylinositolem (McConville a Ferguson, výše), ale PT-PLC může stále ještě redukovat bakteriální infekce interferencí s procesem navázání.

Patogenní E. coli a mnoho dalších dobře známých patogenních Enterobacteriaceae exprimují bakteriální adhesin FimH, 29 kD lektin vážící manosu, který je přítomen na distálním konci fimbrií. Abraham et al., Nátuře 336: 682-684, 1988. Bylo prokázáno, že tento adhesin se váže na CD48 žírných buněk, tj. na molekulu zakotvenou GPI. Viz Malaviya et al., Proč. Nati.

Acad. Sci. USA 96:8110-8115, 1999. In vitro trávení PI-PLC redukuje vazbu mutantního GPI-zakotveného receptoru pro difterický toxin (z Corynebacterium diphtheria) na myší NIH3T3 buňky. Viz Lanzrein et al., EMBO J. 15:725-734, 1996. Dále, alfa toxin Clostridium septicum a aerolysin Aeromonas hydrophila jsou oba navázané na buněčný povrch přes Cterminální GPI-zakotvení a mohou být odstraněny z povrchu buněk pomocí PI-PLC. Viz Gordon et al., J. Biol. Chem. 274: 27274-27280, 1999.

Mechanismus účinku PI-PLC v redukci účinnosti bakteriální infekce souvisí s uvolněním vazebného místa pro CD48 z žírných buněk hostitele. Také vazba FimH na žírné buňky spouští zánětlivou reakci. Podle předkládaného vynálezu může tedy snížení počtu vazebných míst také redukovat zánět, který může být nadměrný a škodlivý pro střevní tkáň samotnou, protože zánětlivá reakce zahrnuje uvolňování faktoru nekrosy nádorů a (Malaviya, výše). Tak může mechanismem redukce zánětu a související sekrece faktoru nekrosy nádorů zpracování fosfolipasou podle předkládaného vynálezu zmírnit příznaky _1Π 44 44» 44 4*4 4 »

44444444»· • 444 4» ·* ** 44 4444 charakterizující onemocnění jako je syndrom dráždivého tračníku, colitis a Crohnova nemoc. Viz van Deventer. S.J.,

Ann. Rheum. Dis. 58(1):1114-1120 (listopad 1999).

Předkládaný vynález může být také účinný in vivo proti virovým infekcím, tím, že narušuje vazbu mezi virem a buňkou, kterou virus infikuje. Ve světle objevů podle předkládaného vynálezu týkajících se účinnosti orálního podání je zajímavé, že zpracování viru chřipky fosfolipasou C, způsobující uvolnění přibližně 5 0% virového fosfolipidu, vede k významnému snížení infektivity v kuřecích embryích. Viz Mizutani et al., Nátuře 204:781-782, 1964. Naopak, zpracování kultivovaných fibroblastů z kuřecích embryí fosfolipasou C, isolovanou z Clostridium perfringens, významně snižuje následnou infekci buněk Semliki Fořest virem. Viz Friedman a Pastan, Proč. Nati. Acad Sci. USA 59:1371-1378, 1968. Ačkoliv se v oboru nepřikládá těmto jevům žádný terapeutický význam, jsou v souladu s jedním mechanismem, který je podkladem předkládaného vynálezu, konkrétně se štěpením ligandu na povrchu patogenu a/nebo jeho příslušného receptoru na buněčné membráně, což narušuje interakci, která je nezbytná pro infekci.

Jiným způsobem, jak může být předkládaný vynález účinný v prevenci virové infekce, je narušení vazby virových GPIzakotvených proteinů na citlivé buňky. Příkladem GPIzakotveného proteinu, který je sensitivní na PI-PLC trávení, je Dengue Virus NS1 (nonstrukturální protein 1). Viz Jacobs et al., FASEBJ 14:1603-1610, 2000. Existuje několik příkladů GPIzakotvených proteinů hostitelských buněk, které jsou vazebnými místy pro virus. Těmito příklady jsou lidské Echoviry 6,7,12 a 21 a Enterovirus 70, které se váží na GPI-zakotvený CD55 (faktor akcelerující rozklad, DAF). Viz Clarkson et aL, J.

• 9

9 99 • 9 ·

9 9 ’ 9 9 9 99 9 9 99

9999 99 ·9 ·9 99 999·

Virology 69: 5497-5501, 1995; Bergeison, et al., Proč. Nati.

Acad Sci. USA 91: 6245-6248, 1994; a Karnauchow, et al., J. Virology 70: 5143-5152, 1996. Infekce psím parvovirem (CPV) může být blokována in vitro předchozím ošetřením kočičích buněk PI-PLC. Viz Barbis a Parrish, Brazilian J. Med. Biol.

Res. 27:401-407, 1994.

Některé buněčné povrchové receptory, domněle důležité pro inicializaci infekce, jsou navázány na membrány mechanismy jinými než jsou GPI zakotvení. Mezi takové mechanismy patří struktury jako jsou estery cholesterolu (Rostand a Esko, J.

Biol. Chem. 268:24053-24059, 1993), nefosforylované glykosfingolipidy (Karlsson, Ann Rev. Biochem 58: 309-350,

1989) a jiné fosfolipidy, jako je fosfatidylethanolamin a fosfatidylserin. Viz Sylvester, Infect. Immun. 64:4060-4066,

1996.

Z důvodů uvedených výše může být cílené ovlivnění takových struktur vhodnými esterasami, cerebrosidasami, karbohydrasami a fosfolipasami aktivními v uvolňování takových struktur z povrchu buněk výhodné, při orálním podání podle předkládaného vynálezu, pro léčbu infekcí zažívacího traktu.

V důsledku universálního charakteru povrchových proteinů a karbohydrátů navázaných na fosfatidylinositol u eukaryot, má terapeutický způsob podle předkládaného vynálezu, zahrnující podání enzymu, akutně nebo profylakticky, pro štěpení zakotvení takových povrchových proteinů a/nebo karbohydrátů buněčného povrchu, rozsáhlé použití při léčbě protozoárních, bakteriálních, mykotických a virových infekcí zažívacího traktu. Z tohoto hlediska je klíčovým aspektem předkládaného vynálezu průkaz toho, že enzym, který je aktivní ve štěpení povrchových složek buněčného povrchu, může být podán orálně • to toto •

to · ·· ♦ · · ♦ · · *··· ·· toto to to • ♦ • · • · • to • · • · to ···· jako antiinfekční činidlo a je účinný in vivo. Významné je to, že ačkoliv je vhodný representativní enzym, PI-PLC, dostupný od roku 1960, nebyl doposud takový způsob navržen.

Jiným aspektem předkládaného vynálezu je použití enzymu, jak byl popsán výše, jako účinného anti-infekčního činidla při přípravě zvířecího krmivá, kde toto činidlo může léčit nebo zmírnit riziko infekcí zažívacího traktu u zvířat, která konzumují toto krmivo. Krmivá obsahující endo-1,4-β-ϋmannanasu, jsou známá a některé práce přisuzují mannanase antimykotickou aktivitu. Viz WO 00/21381 (PCT/EP99/07835) a Kudo et. al., Experentia 48:227-261, 1992. V těchto případech je mannanasa kombinována se známým antibiotikem, ačkoliv byl obecně popsán mysl použití enzymu v krmivu neobsahujícím antibiotikum. Adams, Feed Mix (Speciál 2000), str. 16— 18.

V jednom aspektu se tedy vynález týká prostředků, včetně krmiv, které obsahují enzym charakterizovaný výše uvedenou štěpící aktivitou, který je jiný než mannanasa, nebo přesněji jiný než endo-1,4^-D-mannanasa, který se liší od enzymu specifického pro mannan ve specificitě štěpení, jak je popsáno v ENZYME NOMENCLATURE 1992 (Academie Press) (viz kapitoly 3.2.1.77, 3.2.1.78, 3.2.1.101, 3.2.1.106, 3.2.1.130, a 3.2.1.137). Dále předkládaný vynález zahrnuje prostředky, které obsahují takový enzym, včetně mannanasy, ale které neobsahují jiné antiinfekční činidlo.

Tak mohou být podle předkládaného vynálezu extracelulární enzymové přípravky, získané od Bacillus cereus a standardizované na obsah PI-PLC, použity pro významné zlepšení přírůstků hmotnosti a konverze krmivá v přítomnosti infekce. Toto je překvapivé, protože B. cereus je oportunní patogen, který často způsobuje potravinovou gastroenteritidu a B.

»*

0 0 0

0 00 »4 ·« • · · • 0 ·· • · · • 000 44

0 0 0

00 • 0 00 0 * 0 ·

0 0

0·

0 0

0000 cereus-endophthalmitidu.

Dřívější práce popisují, že injekce extracelulárního enzymu B. anthracis nebo B. cereus králíkům způsobuje fosfasemii a případně smrt. Například viz Stein a Logan, J. Bacteriol. 85: 369-381, 1963. Proto je překvapivé, že extracelulární enzym od patogenu,který způsobuje gastroenteritidu, může mít kurativní efekt v souvislosti s nemocemi způsobenými bakteriální infekcí.

Bacillus cereus vyrábí mnoho enzymů aktivních na extracelulární membráně a cytolytických toxinů, včetně PI-PLC a Cereolysinu AB, který se skládá z fosfolipasy C a sfingomyelinasy. Viz Gilmore, J. Bacteriol. 171:744-753, 1989. Ve výše uvedeném enzymové^,přípravku je jako aktivní složka obsažena fosfatidylinositol-specifická fosfolipasa C [např. 3.1.4.10], produkovaná B. cereus. Enzymová léčba podle předkládaného vynálezu funguje stejně účinně jako kokcidiostatická a antibiotická léčba. Proto je tato léčba účinným a komerčně životaschopným přístupem pro léčbu infekcí zažívacího traktu, zejména tehdy, když jsou v současnosti používané substance zakázány.

Pokud nejsou potaženy, mohou být enzymy ireversibilně inaktivovány žaludeční tekutinou. US patent č. 4,079,125 popisuje vylepšené prostředky obsahující enzym s enterálním potahem určené pro savce s deficitem enzymu. Překvapivě vede přidání PI-PLC do zvířecího krmivá bez potahu k účinné léčbě patogenní infekce.

Enzymové prostředky podle předkládaného vynálezu jsou připraveny jako sušené, pevné nebo kapalné orální prostředky. Takové prostředky obvykle obsahují stabilizační činidla, jako

W* ·0 *0

0 ·0

0

0 0000 00 • 0

I 1 jsou pufry, karbohydráty a/nebo glykoly. Sušené prostředky obsahující enzym se stabilním obsahem, vhodné, podle předkládaného vynálezu, pro inkorporaci v tabletách nebo kapslích, mohou být připraveny lyofilizací, sušením postřikem v sušičce s fluidním ložem s inertním nebo karbohydrátovým nosičem, nebo za použití odpařovacích technik společně se stabilizačními činidly vytvářejícími sklovinu. Viz Franks et al., Biopharm. 4:38-55, 1991. Jiným způsobem je použití srážení solí, například srážení síranem amonným nebo rozpouštědlem, jako je například aceton (pro přípravu prášku), a potom sušení a smísení s nosičem.

Některé karbohydráty, zejména monosacharidy, disacharidy a nižší oligosacharidy, jsou významnými karbohydráty vytvářejícími sklovinu. Příklady karbohydrátů použitelných jako nosiče jsou xylosa, fruktosa, glukosa, sorbitol a maltotriosa, jak jsou popsány v Franks, výše. Výběr karbohydrátového nosiče je založen na kompatibilitě s enzymem, nízké hygroskopické tendenci a výhodné křivce přechodu ve sklovinu. Stabilizační činidlo trehalosa je zejména vhodné pro přípravu biologických činidel stabilních při teplotě místnosti. Viz U.S. patent č. 4,891,319; Roser, Biopharm. 4 (8):47-53, 1991; Colaco et al., Bio/Technology 10:1007-1011, 1992; Aldridge, Genetic Engineering News, 15.3.1995, str.1011.

Enzymy pro předkládaný vynález mohou být připraveny v kapalné formě, například jako sirupy se sorbitolem nebo glycerolem, za účelem snížení aktivity ve vodě a pro stabilizování proteinu. Takové roztoky jsou obvykle před farmaceutickým použitím sterilně přefiltrovány.

Jak bylo uvedeno výše, týká se předkládaný vynález v jednom • 44 4

4 4· · • 44 • 44 4444 4

4444 44 44 44 aspektu podání enzymu jako složky krmivá. Krmivo se skládá obvykle hlavně ze zrnitého materiálu, zdroje proteinů, vitamínů, aminokyselin a minerálů. Zrnitým materiálem je obvykle kukuřice, čirok, pšenice, ječmen nebo oves. Zdrojem proteinů mohou být například fazole nebo hrách. Příkladem minerálů, aminokyselin a vitamínů jsou B12, A, kyselina pantothenová, niacin, riboflavin, K, DL-methionin, L-lysin, cholin-chlorid, kyselina listová, fosforečnan vápenatý, magnesium-sulfonát, síran draselný, uhličitan sodný, chlorid sodný, selenitan sodný, oxid manganičitý, jodid vápenatý, oxid měďnatý, oxid zinečnatý a D-aktivovaný živočišný sterol.

Pro použití v krmivu může být kapalný prostředek obsahující enzym připraven se solí (například NaCl, 15-18% hmot./hmot.) nebo sirupem pro snížení aktivity ve vodě a pro prevenci růstu mikrobů v koncentrovaném produktu. Další konzervační činidla, jako je natrium-benzoát, propylparaben, natrium nebo kaliumsorbát a ascorbyl-palmitát, jsou příklady schválených chemických konzervačních činidel, které mohou být také použita pro prevenci růstu mikroorganismů v produktu. Viz Association of American Feed Control Officials, lne., Official Publication 2000, Part 18, Chemical Preservativesstr.215-217, ISBN 1878341-11-1. Tato konzervační činidla mohou být zapracována do krmivá po peletování za použití automatizované postřikové technologie s velkým ředěním činidel. Viz Fodge et al., Feedstuffs, 29.9.1997. Takové kapalné přípravky mohou obsahovat stabilizační karbohydráty, jako je sorbitol nebo glycerol, pokud jsou kompatibilní. Materiály, které jsou žádoucími složkami krmivá, jako jsou jiné enzymy a vitamíny, mohou být obsaženy pro zvýšení účinnosti.

V případech, že je krmivo použito v nepeletované formě (tj. bez tepelného zpracování), mohou být enzymy podle • 4 •4 4444

4 * · · 44 • 4 4 • 4 44 · 4

4 4

4444 44

4 4 4

4# 4·

4 4 4

4 ·

4 4 • 4 44 4 4 předkládaného vynálezu připraveny ve formě suchého koncentrátu určeného pro přidání do mísícího zařízení pro přípravu krmivá. Takové suché enzymové koncentráty se připraví nejprve zahuštěním kapalného enzymového prostředku za použití 10 Kd NMWC nebo jiného vhodného ultrafiltru, při kterém se dosáhne vysokého procenta obsahu enzymu, a potom smísením s velmi suchým nosičem, jako jsou kukuřičná zrna, sojová zrna, nebo inertní materiál nebo nerozpustná sůl, které jsou schválené pro použití v krmivu. Viz Official Publication, American Feed Contral Officials, výše, Part 582, Substances genrally regarded as safe in animal feeds.

Existuje mnoho technik pro přípravu enzymů dostatečně stabilních pro tolerování procesu peletování v některých mlecích zařízeních pro krmivo, za zachování dostatečné aktivity při nízkých teplotách takže jsou tyto enzymy potom funkční v zažívacím traktu. Je známo, že modifikací proteinové struktury, primárně v důsledku změn kódující DNA sekvence, nebo sekundárně v důsledku chemických modifikací, je možno dosáhnout vyšší stability enzymů vůči inaktivaci. Jednou ilustrací takové modifikace je použití chemického zesítění krystalů enzymů. Viz Collins et al., Organic Process Research and Development 2(6):400-406, 1998. Jiným přístupem pro zvýšení stability enzymu pro předkládaný vynález je změna aminokyselin mutagenesí genu, který kóduje daný enzym, nebo získání genů nebo částí genů pro výrobu nových genů. Viz Crameri et al., Nátuře 391:288-291, 1998; Arnold, Nátuře Biotechnol. 16:617-6 18, 1998b; Zhao et al., Nátuře Biotechnol. 16:258-235, 1998; Zhao a Arnold, Protein Eng. 12:47-53, 1999. Je také možná mutace a selekce pro řízenou evoluci enzymů s požadovanými vlastnostmi. Viz například Giver et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 95:12809-12813, 1998; Liao et al., Proč. Nati Acad. Sci. USA 83:576-580, 1986; Cherry et ·· ·ν »· ·* ♦· • 99 <999 9999 t 999 · 9 99 99 · • 9 99* 99 »99 9 9

99 9 9 9 9 999

9999 99 9· 99 99 9999 al., Nátuře Biotechnol. 17:379-384, 1999.

Některé proteinové modifikace, včetně glykosylace, PEGylace a sukcinylace, mohou také zvyšovat stabilitu a měnit optimální pH, což jsou charakteristiky, které mohou být optimalizovány pro enzym, který má být použit v předkládaném vynálezu. Proto mohou být použity známé protokoly pro přípravu modifikovaných enzymů, které se potom testují podle uvedených příkladů na vhodnost k použití ve způsobech podle předkládaného vynálezu.

Účinnou metodou pro produkci PI-PLC je klonování genu B. cereus do B. megaterium. Expresní systém (Rygus a Hillen,

Appl. Microbiol. Bacteriol. 35:594-599, 1991) využívá elementy z Bacillus megaterium xylosového regulonu (Rygus et al., Arch. Microbiol. 155:535-542, 1991), a je komerčně dostupný od BIO101 Corp. (Vista, California). Byla připravena fůze mezi PI-PLC genovou vedoucí kódující sekvencí a prvními třemi aminokyselinami B. megaterium xylA genu, a tato fůze byla připravena v plasmidu stabilizovaném.tetracyklinovou resistencí a regulovaném represorem reagujícím na xylosu.

Kmeny tohoto typu, s amplifikovanou expresí, poskytují vhodné prostředky pro produkci komerčně použitelných množství PI-PLC, který by byl potom inkorporován do zvířecího krmivá způsobem podle předkládaného vynálezu.

některé izoláty Bacillus cereus produkují antibiotika, jako je tunicamycin. Viz Kainogashira et al., Agric. Biol. Chem. 52:859-861, 1988. Jiný izolát Bacillus cereus (ATCC 53522) je popsán v U.S. patentech č. 4,877,738 a č. 5,049,379, jako biologické kontrolní činidlo pro prevenci hniloby a hnití kořenů u rostlin. Předpokládá se, že tento efekt je důsledkem účinku dvou antibiotik, označených jako Zwittermicin, což je 396 Da lineární aminopolyol, a Antibiotikum B, což je • A ·« ·· ·· • · 0 • · • · • Α«· AA

A* • t · • 1 • · · A ·· ♦* *· • · * • · * • · · » · · *· mi aminoglykosid. V příkladech uvedených dále je účinek těchto dvou antibiotik eliminován tím, že se možná antibiotika s nízkou molekulovou hmotností vyloučila z enzymového prostředku.

Konkrétně, bezbuněčné fermentační medium se zahustilo pomocí membrány s limitem propustnosti 10 Kd. Koncentrát, obsahující proteiny větší než 10 Kd, se použil pro další zpracování. Antibiotika s malou molekulovou hmotností, jako jsou antibiotika popsaná v Handelsman, výše, procházejí tímto filtrem. Dále se srážení síranem amonným použilo pro vysrážení proteinů s vysokou molekulovou hmotností, což zanechá materiál s nízkou molekulovou hmotností v roztoku. Po opětovném rozpuštění materiálu vysráženého síranem amonným se získaný roztok enzymu dialyzuje proti pufru, což je další zpracování, které odstraní antibiotika s nízkou molekulovou hmotností, nakonec se protein podruhé vysráží, opět síranem amonným, pro odstranění jakékoliv další sloučeniny s nízkou molekulovou hmotností z roztoku.

Kombinované použití těchto zpracování silně eliminuje možnost, že pozorované antibiotické účinky jsou způsobeny antibiotiky s nízkou molekulovou hmotností, jako jsou antibiotika produkovaná ATCČ 6464 nebo ATCC 7004. Fermentační medium se také testovalo, za použití testovacího kmene E. coli, na přítomnost antibiotik, ale nebyla detekována žádná antibiotická aktivita.

Předkládaný vynález je dále popsán na následujících ilustrativních příkladech.

Příklad 1: Příprava zmrazených zásobních kultur Bacillus cereus ATCC 6464 a ATCC 7004

4«	44	4*		• 4	44	44
4 4	•	•	•	4 4	•	4	4 4
•		•	4	• 4	4	4	4
•	4 4	4	•	4 4	4	4	4
• ••4	··	··		44	• 4	4444

Fioly s lyofilizovanými buňkami z ATCC se otevřely a naočkovaly se do Vizd media složeného z Amberferm 4015 (Red Star) 10 g/1, Amberex 695 (Red Star) 5 g/1 a chloridu sodného 5 g/1, pH 7,0, a provedla se kultivace při 30°C. Iniciální kultura se naočkovala na LB Broth agarové plotny a získané jednotlivé kolonie se naočkovaly zpět do 20 ml Vizd media ve 250 ml baňce s přepážkou (Bellco) a provedla se kultivace za třepání při 30 °C. Když hustota kultury dosáhla Οϋεοο 1,5, přidal se sterilní glycerol na přibližně 10 % obj./obj. a fioly obsahující 1,8 ml kultury se zmrazily při -80 °C.

Příklad 2: Kultivace ATCC 6464 a ATCC 7004 izolátů Bacillus cereus pro produkci fosfatidylinositol-specifické fosfolipasy C

Dva Biostat C fermentory, každý o objemu 30 litrů, se naplnily mediem následujícího složení, ve vodovodní vodě: Nutrient Broth č. 2 (Oxoid) v koncentraci 25 g/1, Trypton (Difco) v koncentraci 10 g/1, kvasinkový extrakt (Difco) v koncentraci 10 g/1 a Mazu DP1OP Modli protipěnivé činidlo (BASF) v koncentraci 0,1 ml/1. Počáteční objem vsádky byl 9,5 1 a medium se sterilizovalo při 121°C po dobu 40 minut. Iniciální pH se upravilo po sterilizaci plynným amoniakem na 7,0.

Očkovací kultury se připravily v 500 ml stejného media v 4litrové třepací baňce opatřené přepážkou napojené na aspirátor (Bellco) s napojenými silikonovými hadicemi s konektory pro inokulaci. Baňky se sterilizovaly v autoklávu při 121 °C po dobu 50 minut před inokulaci 1,8 ml zmrazené zásobní kultury připravené z ATTC zásilky (příklad 1). Očkovací kultury se kultivovaly při 30 °C po dobu 5,5 hodiny s třepáním při 200 otočkách za minutu v inkubační třepačce s řízeným prostředím. (NBS model G-25). Před naočkováním měla ATCC 7004 kultura Οϋεοο 1,53 a pH 6,58. ATCC 6464 kultura měla Οϋεοο 1,28 a pH 6,79.

500 ml očkovacích kultur se naočkovalo do 30 1 fermentorů a provedla se fermentace za následujících podmínek: teplota 30 °C, míšení 600 otoček za minutu, průtok vzduchu 10 1/min. a tlak 0,5 Baru. Οϋβοο iniciální kultury bylo 0,81. Po 6 hodinách se fermentace ukončila s konečným Οϋεοο 22,1 (ATCC 7004) a Οϋεοο 24,2 (ATCC 6464). Fermentace se prováděla bez řízení pH a konečné pH bylo 8,17 (ATCC 7004) a pH 8,13 (ATCC 6464). Medium se odstranilo z fermentorů a před dalším zpracováním se ochladilo na teplotu 8 °C.

Fermentace se provedla podruhé za použití v podstatě identického postupu s oběma ATCC izoláty Bacillus cereus.

V tomto případě se očkovací kultury použily v šesti hodinách s Οϋεοο 2,86 (ATCC 7004) a Οϋεοο 1,98 (ATCC 6464), a pH 6,69 (ATCC 7004) a pH 6,65 (ATCC 6464). Hlavní fermentace se prováděly po dobu 6,5 hodin s Οϋεοο 35,9 (ATCC 7004) a Οϋεοο 33,6 (ATCC 6464). Konečné pH bylo 8,38 (ATCC 7004) a pH 8,47 (ATCC 6464) v době ochlazení.

Příklad 3: Odstranění buněk filtrací a zahuštění PI-PLC enzymu

Buňky se odstranily a promyly se z každé ze čtyř fermentačních vsádek popsaných v příkladu 2 za použití dvou AIG Technology (UFP-500-K-6A) 3 mm filtrů z dutých vláken s limitem propustnosti 500000 (500 Kd NMWC) navázaných na sebe konci. Ochlazené medium se pumpovalo skrz filtry a pomocí peristaltické pumpy rychlostí přibližně 2 litry za minutu s recyklací zpět do zásobníku. Permeát obsahující enzym se odebíral do zásobníku chlazeného na ledu. Počáteční objem · 4 media obsahujícího buňky, který byl přibližně 9 litrů, se zahustil na přibližně 2 litry, a potom se zahájila diafiltrace za použití 10 mM Tris-HCl, pH 8,5. Po získání celkového objemu permeátu přibližně 14 litrů se promývání buněk ukončilo.

500 Kd permeát přibližně 14 litrů z každého fermentoru) se zahustil za použití dvou A/G Technology (UFP-10-C-4XTCA) 0,5 mm filtrů z dutých vláken s limitem propustnosti 10000 (10 Kd), které byly na sebe navázány konci. Použilo se stejné pumpování s recyklací koncentrátu s tou výjimkou, že permeát se odstraňoval. Finální koncentrát o objemu přibližně 500 ml z každého fermentoru se uschoval pro další zpracování.

Příklad 4: Další přečištění a zahuštění PI-PLC enzymu

Kd ultrafiltrační koncentrát (příklad 3) získaný z každé fermentace Bacillus cereus, se upravil na 80% saturaci síranem amonným a mísil se na ledu po dobu 60 minut. Roztok se odstřeďoval po dobu 15 minut při 6000 otočkách za minutu na Sorvall GSA rotoru. Supernatant se odstranil a sraženina se rozpustila v minimálním objemu 10 mM Tris-HCl, 0,2 mM EDTA (pH 7,5) a potom se dialyzovala za studená proti stejnému pufru.

Protein v každém koncentrátu se měřil za použití testu vazby barviva (BioRad) a stanovila se koncentrace PI-PLC (Hendrickson et al., Bioorg. Med. Chem. Letters 1:619-622,

1991) za použití detekční metody na bázi HPLC a fluorescentního substrátu (Molecular Probes, lne., P-3 764, 1 -pyrenbutyl-myo-inositol-l-fosfát, lithná sůl). Tabulka 1 shrnuje data z tohoto testu a určuje přibližnou čistotu a celkový obsah enzymu pro každou čistou bázi získanou pro každý ze čtyř přípravků. Enzymové přípravky byly uskladněny při -20 °C do dalšího zpracování.

···· ·· ·· ·· ·· ····

Tabulka 1. Souhrn analýzy přípravků surového enzymu PI-PLC

Enzym. přípravek	ATCC kmen č.	Protein mg/1	Specif. aktivita U/ml1	Celkem mg proteinu v prostř.	Předpokl. čistota2	Celkem mg PI- PLC na čistou bázi
1	7004	1,86	1,75	325	2,92	9,49
2	6464	1,44	0,52	345	0,867	2,99
3	7004	1,35	4,42	208	7,36	15,3
4	6464	2,06	1,72	256	1,95	5,00

¹ U = jednotka = 1 mikromol/minutu.

² podle předpokladu, že 100% čistý protein má specifickou aktivitu 60 U/mg (Hendrickson, výše).

Příklad 5: Sloučení a zahuštění enzymových přípravků před aplikací do zvířecího krmivá

Enzymové prostředky 1, 2, 3 a 4 se smísí za zisku celkového objemu 675 ml. Pomalu se přidá síran amonný (492 g) a roztok se mísí na ledu po dobu několika minut. Roztok se odstředí za zisku pelety. Peleta se rozpustí v minimálním množství 20 mM fosfátového pufru (pH 7,0).

Získaný roztok měl objem 70,9 ml a hustotu 1,057 g/cm . Koncentrace proteinu byla přibližně 25,5 mg/ml. Aktivita PIPLC byla přibližně 1,13 U/mg s čistotou PI-PLC 1,88%. Roztok se zmrazil při -20 °C a potom se rozmrazil a použil se uniformně pro zpracování 200 liber (90,8 kg) kuřecího krmivá.

Příklad 6: Klonování a exprese Bacillus cereus PI-PLC genu v Bacillus megaterium

Byl sekvencován gen kódující fosfatidylinositol-specifickou fosfolipasu C (PI-PLC). Viz Kuppe et at., J. Bacteriol. 171:6077-6083, 1989. Za použití PCR technologie byl PT-PLC gen klonován z Bacillus cereus (ATCC 6464) chromosomální DNA. Použil se expresní vektor pMEGA (BIO 101, Vista, CA), pro Bacillus megaterium. Dva PCR primery, konkrétně

5'GACTAGTAATAAGAAGTTAATTTTG-3' (primer 1) a 5'CGGGATCCATATTGGTTGGTTATTGG-3' (primer 2) se navrhly se Spěl místem v primeru-1 a BamHI místem v primerů 2.

PCR-amplifikovaný PI-PLC gen se potom ligoval do pMEGA Spel-BamHI místa za zisku plasmidů pCG682. PI-PLC protein se fúzoval s prvními třemi aminokyselinami xylA genového produktu v Spěl místu expresního vektoru. Exprese PI-PLC genu byla pod kontrolou xylA promotoru. Fermentace v baňce za třepání byla použita pro hodnocení produkce fosfatidylinositol-specifické fosfolipasy C v Bacillus megaterium. LB medium s 10 pg/ml tetracyklinu (20 ml) se naočkovalo 0,2 ml očkovací kultury a provedla se inkubace při 37°C za třepání při 250 otočkách za minutu. Při ODeoo přibližně 0,5 se přidalo 5 g/1 D( + )-xylosy pro indukci xylA promotoru. Po 3 hodinách se supernatant získal odstředěním. Aktivita fosfatidylinositol-specifické fosfolipasy C se měřila metodou fluorescenčního substrátu (Hendrickson, et at., Biochemistry 31: 12169-12 172, 1992; Hendrickson, Anal. Biochem. 219: 1-8, 1994), za použití 1pyrenbutyl-myo-inositol-l-fosfátového substrátu (Molecular Probes, Eugen, OR) a pomocí HPLC detekce.

Tabulka 2: Měření exprese PI-PLC

Testovaný materiál	přidání xylosy	Specifická aktivita (jednotky/mg proteinu)
Frakce buněčného lyzátu
B. megaterium/pCG682	-	0

«9 · · 9999

B. megaterium/pCG682	+	0,436
B. megczterium/pCG6S2	-	0
B. megaterium/pCG682	+	0,365
B. megaterium/pCG6S2	-	0
B. megaterium/pCG682	+	4,087
B. megaterium/pCG682	-	0
B. megaterium/pCG682	+	4,56

Tato data ukazují, že většina PI-PLC byla extracelulárně a že exprese probíhala pouze po přidání D(+)xylosy (Tabulka 2). Předpokládá se, že tento rekombinantní kmen má alespoň 15násobek produktivity (mg/l/OD) průměrného přirozeného kmene, který je kultivován způsobem podle příkladu 2.

Příklad 7: Fermentace B. megaterium pro produkci PI-PLC

B. megaterium/pCG682 popsaný v příkladu 6 se použil pro produkci PT-PLC fermentací. Medium (PM) pro očkování a fermentaci obsahovalo 20 g/1 Amberferm 4015 (Universal Flavors Bionutrients, Indianapolis, IN), 10 g/1 Amberex 695 kvasinkového extraktu (Universal Flavors Bionutrients, Indianapolis, IN), 10 g/1 NZ Čase Plus (Quest International, Hoffman Estates, IL) , 2,0 g/1 K₂HP0₄, 0,1 g/1 MgSO₄. 7 H₂O a 2,0 g/1 glukosy iniciálně a 12,5 mg/1 tetracyklinu. pH bylo upraveno na 7,5.

Inokulační stadium (500 ml v 2,8-1 baňce s přepážkou) se zahájilo naočkováním z inokulační zásobní baňky a provedlo se třepání při 250 otočkách za minutu při 30°C. Inokulační baňky se připravily přidáním jediné kolonie kultivované na LB agarové plotně do 20 ml PM v 250 ml třepací baňce, o kultivaci na přibližně 1,0 Οϋεοο při 30 °C se přidalo 5 ml 50% sterilního glycerolu, směs se promísila a roztok se rozdělil do 2 ml • · fe · plastových zkumavek a zmrazil se při -60 °C.

500 ml očkovací baňky se použily po růstu na přibližně 1,2 až 1,8 ΟΟδοο nm po 9 hodinách třepání. Dvě baňky se použily pro inokulaci 60 1 fermentoru naplněného 50 1 stejného media sterilizovaného párou. Tetracyklin se sterilně přefiltroval (0,2 micronový filtr) jako 1% roztok ve 40% ethanolu a přidal se po sterilizaci a ochlazení na 30 °C. Ve fermentorech se 0,1 ml/l Mazu DF1OPMOD11 antipěnivého činidla (BASF, Gumee, IL) také přidal o iniciální vsádky a během fermentace se přidávalo toto činidlo podle potřeby pro prevenci pěnění. Podmínky pro první fermentaci byly následující: podtlak 0,5 až 2,5 psig; teplota 30 °C ± 0,5 °C; třepání 200 až 450 otoček za minutu; přívod vzduchu 25 až 50 SLPM; rozpuštěný kyslík - 25%. pH se upravovalo na 6,9 až 8,1 za použití 21,25% H3PO4 nebo 5N

NaOH. když OD600 dosáhlo 8-10, byly obsahy použity pro naočkování 600 1 fermentoru obsahujícího 425 1 stejného media.

Podmínky pro 600 1 fermentaci byly následující: podtlak 0,5 až 2,5 psig; teplota 30 °C ± 0,5 °C; třepání 100 až 300 otoček za minutu; přívod vzduchu 250 až 500 SLPM; rozpuštěný kyslík > 25%. pH se upravovalo na 6,9 až 8,1 za použití 21,25% H3PO4 nebo 5N NaOH. Když se po 5 hodinách vyčerpala počáteční glukosa a ODgoo bylo přibližně 17, přidalo se xylosové medium (presterilizované autoklávováním při 121 °C během 20 minut) skládající se z 10 kg D-(+)-xylosy a 10 litrů vody). D-xylosa se získala od Varsal Instruments, New Jersey. Medium se přidávalo zpočátku rychlostí 25 ml/minutu po dobu 1,5 hodiny, a potom se rychlost zvýšila na 43 ml/minutu. Tato druhá rychlost se udržovala do té doby, než bylo spotřebováno všech 22,5 litrů xylosového media. Procento rozpuštěného kyslíku se udržovalo pomocí zvyšování přívodu vzduchu po 50 SLPM až do 500 SLPM. Když byl přívod vzduchu 500 SLPM, tak se zvýšila

rychlost odstřeďování. Ferraentace se ukončila po 20 hodinách. Po 17 hodinách se akumulovalo 7440 U/l (jednotek definovaných v příkladu 4).

Fermentační medium se odebíralo za použití Pall Filtron CIO Skid a čtyř CellFlo Microgon modulů (0,2 μιη póry membrány, vlákna průměru 1 mm s 8,382 cm². Permeát z 0,2 μιη membrány se zahustil za použití LT100 Pall Filtron Skid AG/Technologies Size 85 10K ultrafiltrační membránou. Výsledný koncentrát měl objem 10 litrů a byl zmrazen při —20 °C.

Příklad 8: Bacillus cereus fermentační medium neobsahuje antibiotickou aktivitu

Fermentace s Bacillus cereus (ATCC 7004) se provedla způsobem popsaným v příkladu 2 s tou výjimkou, že počáteční objem byl zvýšen na 20 litrů. Test na přítomnost antibiotik se provedl s E. coli MG1655 jako testovacím kmenem a s výsledným fermentačním mediem nebo s částečně přečištěným PI-PLC připraveným z způsobem podle příkladů 3-5. Test se provedl jako test na desce obsahující kolečka enzymu. Viz Brantner, Pharmazie 52(1):34-40, 1997. Nebyly pozorovány žádné zóny projasnění okolo koleček obsahujících vzorky enzymu, což ukazuje na nepřítomnost antibiotické aktivity.

Příklad 9: PI-PLC test s fluorescenčním testem na mikrotitrační plotně

Byl vyvinut lepší biochemický test na PI-PLC, než je test podle Hendrickson et at. (výše) použitý v příkladu 4. Substrát 4-methylumbelliferyl-myo-inositol-l-fosfát, N-methylmorfolinová sůl, se získal od Biosynth (Napervilie, Illinois). Reakce se sledovaly na Flouroscan II čtečce fluorescence na • · ·♦ • · · · · · · · · « 9999 9· 99 99 99 9999 mikrotitračních plotnách získané od MTX Lab Systems (Vienna, Virginia). Pro testování fermentačního media nebo enzymových koncentrátů se reakce 200 μΐ provedly v černých mikrotitračních plastových plotnách složených z 10 mM Tris-Cl, 0,16% deoxycholatu, 0,8 mM 4-methylumbelliferyl-myo-inositol-1fosfátu, N-methyl-morfolinové soli, a ředěný enzym při pH 8,0. Pokud to bylo potřebné, tak se ředění enzymu provedly v 0,1 % roztoku BSA ve vodě. Reakce se sledovaly při 37°C po dobu 30 minut s odečítáním ve 2-minutových intervalech za sledování uvolňování methylumbelliferonu ze substrátu s excitací při 350 nm a emisí při 450 nm.

Korelace jednotek fluorescencen na mikromoly methylumbelliferonu se použila pro výpočet vzniklých jednotek (mikromolů za minutu) na dávku přidaného roztoku enzymu.

Reakce při pH 8,0 je kompromisem mezi pH optimálním pro enzym a pH pro maximální fluorescenci methylumbelliferonu (pH 10).

Při pH 9,0 a výším se rychlost neenzymatického uvolňování methylumbelliferonu stala signifikantní. Za těchto podmínek je specifická aktivita (U/mg) přibližně 39,3-vyšší než při použití metody dle Hendrickson et al. (výše). Pro účinnost testování v pokusech se zvířecím krmivém se jednotky změřené za použití tohoto testu konvertovaly na ekvivalent

Hendricksonových jednotek pro usnadnění srovnání s testy použitými před tímto testem.

Příklad 10: test PI-PLC přidaného v účinných dávkách do zvířecího krmivá

Sensitivnější varianta testu na PI-PLC na bázi 4methylumbelliferyl-myo-inositol-1-fosfátu, N-methylmorfolinové soli (příklad 9) byla navržena pro měření enzymu po přidání do zvířecího krmivá, a tato varianta použití ♦ ♦

9 99 jednoho pH pro test a druhého pH pro měření fluorescence.

Enzym se extrahoval z testovaného krmivá odvážením 4 g krmivá a přidáním těchto 4 g do 20 ml 10 mM Tris-Cl (pH 7,5) s 0,1 % deoxycholátem za zisku 20 g/1 krmivá. Kaše se potom třepala v NBS G-25 mísím zařízení (New Brunswick Scientific) po dobu 1 hodiny při teplotě místnosti a 250 otočkách za minutu. Kaše se odstředila při 13,000 otáčkách za minutu na IEC Micromax mikroodstředivce s 1,5 ml mikrocentrifugačními zkumavkami. Vhodná ředění extraktu se připravila v 0,1 % BSA (hovězím sérovém albuminu). Vzorky extrahované z krmivá za použití 10 U/0,454 kg se neředily.

První stupeň reakce: Připravily se následující zkumavky: Standardy při ředění 1:100 nebo 1:200 0,12 U/ml PI-PLC (jednotky podle příkladu 4) a kontrolní roztoky neobsahující enzym. Reakční směsi se zakryly folií pro chránění před světlem.

μΐ Tris-HCl, 0,10 M, pH 6,0 40 μΐ deoxycholátu (0,8%) μΐ PT-PLC substrátu (4 mM)

100 μΐ enzymu

200 μΕ/zkumavku = celkový objem při 25 °C

Ve dvou dobách (30 minut a 60 minut) se odebralo 0,10 ml každé reakční směsi. Alikvoty se zahřívaly při 65 °C po dobu 15 minut pro ukončení reakce enzymu a potom se ochladily na ledu. Nakonec se vzorky odstředily při 12,000 otáčkách za minutu na mikroodstředivce během 5 minut.

Odečet na fluorometru - 120 μΐ 0,10 M Tris pufru (pH 8,0) se přidalo do mikrotitrační jamky v černé plastové plotně a potom se přidalo 80 μΐ reakční směsi, jak je popsáno v příkladu 7. Odečetly se kontrolní hodnoty pro pozadí . Vypočetla se • · • 0 ·0 0· ···· rychlost produkce fluorescenčních jednotek za minutu. Jednotky fluorescence se přeměnily na mikromoly produktu reakce a vypočetly se enzymové jednotky extrahované na původních 0,454 kg krmivá.

Příklad 11: Pokusy s krmením kuřat a expozicí patogenů

I. Pokus 1 s krmením brojlerů

První pokus s krmením se provedl s brojlery stáří jeden den. Připravilo se typické uniformní kuřecí krmivo označené jako startovací krmivo, které bylo vyrobeno tak, aby splňovalo nebo převyšovalo National Research Council's NUTRIENT REQUIREMENTS FOR POULTRY (9 vydání, 1994), a toto se podávalo ve formě krmné směsi. Kuřata se rozdělila do boxů (30,48 x 60,96 cm) do čtyřech terapeutických skupin, kde v každé skupině byly čtyři další skupiny s 6 kuřaty na box (tabulka 3). Voda a krmivo se podávaly ad libitum během 21 denního testovacího období. Rozdělení kuřat do skupin a boxů bylo náhodné. Všechny boxy, krmítka a zásobníky na vodu byly před testem dezinfikovány. Světlo bylo kontinuální (24 hodin denně) ze stropních lamp. tělesná hmotnost se hodnotila pouze v den 1 a v den 21. Spotřeba krmivá se měřila v den 21.

V den 5 se všechna kuřata infikovala 200,000 oocystami na kuře Eimeria acervulina orálním podáním tekutiny. V den 7 byla všechna kuřata dále infikována vodou 500,000 Clostridium perfringens. V negativní kontrole (TI) nebyla žádná léčba infekce. V pozitivní kontrole (T2) se do krmivá přidalo kokcidiostatikum a antibiotikum. Jednalo se o kokcidiostatikum Sacox (salinomycin v dávce 60 g/tunu) a antibiotikum BMD-50 (50 g/tunu). Pro léčené skupiny T3 a T4 se krmivo ošetřené přirozeným PT-PLC enzymem (přibližně 0,34 gramů PI-PLC na

0 0 0 0 0 0 0 0 « · 000» · ♦ 00 00 0

00 0000 000 000· ·· 00 00 00 0000 čistý základ krmivá) podávalo ode dne 5, tj. od orální podání Eimeria acervulina. všechna krmivá byla připravena v jedné vsádce a potom byla tato vsádka rozdělena pro přidání antibiotika (Testovací skupina T2) nebo enzymu (Testovací skupiny T3 a T4). Výsledky analýzy hmotnosti kuřat jsou uvedeny v tabulce 4 a výpočty poměru krmivo/přírůstek hmotnosti jsou uvedeny v tabulce 5.

Tabulka 3: Experimentální léčba v pokusu I krmení brojlerů

Testovací skupina	Popis	Testovaný materiál	Replikace	Kuřat na replikaci
TI	negativní kontrola	žádný	4	6
T2	pozitivní kontrola	kokcidiostatikum a salinomycin	4	6
T3	PI-PLC, přirozený	0,34 g enzymu/tunu (čistého základu)	4	6
T4	PI-PLC, přirozený	0,34 g enzymu/tunu (čistého základu)	4	6

Tabulka 4: Průměrná tělesná hmotnost (g) v den 21

Repl.	Léčba
TI	T2	T3	T4
1	323,00	341,67	377,83	366,67
2	326,67	321,33	383,83	361,17
3	299,33	337,33	378,83	361,33
4	211,67	254,00	374,33	403,40
Průměr	290,17	313,58	378,71	373,14
STÁT	b	b	a	a
S.D.	46, 52	35, 22	3,40	17, 61
c.v.	16, 03	11,23	0, 90	4,72

00 0* 0· 00 00 000 000* 0000

0000 0000 00 0

0· 0*00 000 0000 ·· ·· 00 00 0000

Tabulka 5: Průměrná konverze krmivá (0-21 dnů) korigovaná na váhu mortality kuřat

Rcpl„	. Léčba:
TI	T2	T3	T4
1	1.486	1.569	1.407	1.445
2	1.562	1.532	1.423	1.421
3	1.524	1.562	1.432	1.406
4	1.760	1.462	1.438	1.404
Průměr	1.583	1.531	1.425	1.419
STÁT	b	b	a	a
S.D.	0.11	0.04	0.01	0.02
C.V.	6.68	2.78	0.82	1.1-7

V obou uvedených tabulkách jsou průměry v řádkách bez společného písmena statisticky významně odlišné (p<0,05), podle Duncanova testu signifikance.

II. Pokus 2 s krmením brojlerů

Druhý pokus s krmením se provedl s kuřecími samci věku jeden den. Základní krmivo bylo navrženo tak, aby splňovalo nebo přesahovalo National Research Council's Nutrient Requirements for Poultry (9 vydání, 1994) a připravilo se ve formě krmné směsi pro zajištění uniformity. Test byl proveden v randomizovaných skupinách boxů, zaslepeně, a testoval se vliv PI-PLC vyrobeného z přirozeného zdroje, Bacillus cereus (přirozený typ PI-PLC), nebo z rekombinantního Bacillus megaterium, na stav brojlerů v 21 dnech věku. Přirozený zdroj také obsahuje jiné enzymy, ale PI-PLC připravený z Bacillus megaterium je vysoce přečištěný a byl dále přečištěn ultrafiltrací za použití 30-Kd NMWC membrány. Kuřata byla infikována v den 8 věku ptačí kokcidií (200000 oocyst E. acervulina na kuře, ve vodě) a v 10 dnu věku Clostridium perfringens (100000 na kuře, ve vodě). Každá z 9 typů léčby »* ♦ · toto ·♦ toto • ♦ to 9·«· totototo ··«· « to*· · · « • toto totototo to·· ···· ·· ·* ·· ·· ···· (tabulka 6) byla provedena 10 - krát nebo na 10 boxech. Každý box obsahoval 6 vakcinovaných (Newcasfle-Bronchitis, Mareks) Cobb x Cobb brojlerů s prostorem 12,192 cm²/ptáka. Mrtví ptáci, pokud byly takoví, se neodstraňovaly po dnu 8. krmivo se podávalo ve formě krmné směsi ad libitum během celého testu (den 0 až den 21) .

Běžná a nezpracovaná bazální krmná směs neobsahující antibiotika se podávala všem ptákům ode dne 0 do dne 7. Potom se od dne 8 do dne 21 podávalo devět zpracovaných krmiv ve formě krmné směsi. Bazální startovací krmivo pro brojlery obvykle obsahuje 22% surového proteinu, s obsahem ME (metabolizovatelné energie) 1400 kcal/0,454 kg.

Tabulka 6: Experimentální zpracování krmivá pro brojlery v pokusu 2

Zpracování	Testovaná složka	Infekce 1
TI	žádná	+
T2	Bacitracin-methylen-salicylát (BMD 50 g/tunu) a Salinomycin (Sacox, 60 g/tunu)	+
T3	Rekombinantní PI-PLC (3 U/lb) produkovaný Bacillus megaterium	+
T4	Rekombinantní PI-PLC (10 U/lb) produkovaný Bacillus megaterium	+
T5	Rekombinantní PI-PLC (30 U/lb) produkovaný Bacillus megaterium	+
T6	Rekombinantní PI-PLC (90 U/lb) produkovaný Bacillus megaterium	+
T7	PI-PLC (10 U/lb) s další extracelulární enzymy z Bacillus megaterium	+
T8	žádná	žádná
T9	Rekombinantní PI-PLC (90 U/lb) produkovaný Bacillus megaterium	žádná

¹ 200000 oocyst E. acervulina se podalo na kuře ve vodě v den 7 a v den 10 se podalo 100000 Clostridium perfringens na kuře ve vodě.

ΦΦ φφ φφ *· φ ·· φφφφ φφφφ φ φ φφ • φ · φφφφ • ΦΦΦ φφ φφ φφ • · ·· φ φ φ φ φ φ · φφφ φφφ φ φ φφφφ

Tabulka 7: Pokus 2 s krmením brojlerů

léčba	1	2	3	4	5	6	7	8	9
infekce	+	+	+	+	+	+	+	-	-
medikace typ PI-PLC cíl U/lb | I · 1*1»*	-	+	-	-	-	-	-	-	-
		Rec'	Rec1	Rec*	Rec*	Wt-		Rec*
-	-	n 2	10	30	90	10	-	90
	0.36	0.32	0.32’	0.71	1.74	5.96	2.46	0.12	5.94
hmot. přírůstek v dny 8-21	309.72	333.83	323.24	324.78	320.64	32829	298.98	326.12	338.8
	cd	ab	bc	ab	bc	ab	D	Ab	a
konverze krmivá v dny 8-21 (korigovaná)	1.859	1.642	1.702	1.732	1.699	1.739	1.876	1.651	1.650
	c	a	ab	b	ab	b	C	A	a
Průměrné skóre střevních lézí	1.447	0.833	1.120	1.133	0.842	0.808	1.267	0.983	0.847
	d	A	bc	bc	a	a	Cd	ab	a

¹Rekombinantní PI-PLC produkovaný Bacillus megaterium.

²Přirozený PI-PLC z Bacillus cereus.

³Dávka PI-PLC byla příliš nízká pro efektivní extrakci a měření a jevila se jako základní hodnota pozadí.

V prvním pokusu, kde se bakteriální infekce podala ve vodě k napájení (příklad 11-lj. byla ve všech kriteriích léčba přirozeným PI-PLC produkovaným Bacillus cereus stejně dobrá nebo lepší než léčba Salinomycinem + BMD (Tabulky 4-5) . Ve druhém testu s rekombinantním PI-PLC (příklad 11-11, Tabulka 7), kde byl PI-PLC přidán v různých koncentracích, byla zjištěna dávková závislost snížení skóre střevních lézí a konverze krmivá (T3-T6) a zvýšení přírůstku hmotnosti. Dále léčba rekombinantním PT-PLC, v dávce 90 U/0,454 kg, za absence léčby Salinomycinem + BM7D, snižovala skóre střevních lézí a měla pozitivní efekt na konverzi krmivá a přírůstek hmotnosti. Přirozený PI-PLC z Bacillus cereus neúčinkoval v tomto testu

44 • 4 • 4 44 • 4 »4 *4 44

44 4 4 44 4

4 44 4 4 4

4 4 4444 4 4 4

4444 4· 4# 44 4* 4444 tak dobře jako rekombinantní PI-PLC při stejné koncentraci (10 U/lb (0,454 kg)).

III. Pokus III s krmením brojlerů s enzymy PI-PLC a endo-1,4-D-mannanasou

Pokus se provedl v randomizováných Petersime boxech pro testování vlivu PI-PLC a endo-1,4-p-D-mannanasy (U.S. Patent 5429828) na stav brojlerů v den 21 věku. Ptáci byli infikováni v 8 den věku ptačí kokcidií (75000 Eacervulina oocyst a 1,250 E. maxima oocyst na ptáka orálně v nápoji) a v den 11, 12 a 13 věku Clostridium perfringens (orálně v nápoji každý den 1 ml čerstvého kultivačního media obsahujícího 10⁸ cfu/ml). Každá terapie (tabulka 8) se skládala z 8 provedení nebo boxů a v každém boxu bylo umístěno 14 Mareks-vakcinovaných, Cobb x Cobb brojlerů (počet byl snížen na 10 v den 14, protože 4 ptáci byli odebráni z každého boxu a byly skórováni na léze) s prostorem na ptáka 10,97 cm². Mrtví ptáci se odstraňovali z boxů při zjištění a nenahrazovali se. Krmivo se podávalo ve formě krmné směsi ad libitum během celého testu (den 0 až den 21) .

Krmivo se podávalo ve formě krmné směsi ode dne 0 do dne 21 věku. Bazální krmivo bylo typické startovací krmivo pro brojlery obsahující 22% surového proteinu s ME 1400 kcal/lb (0,373 kg).

4« ·4 ·» «4 *4 44

444 4444 4444

44·· 4444 4« 4

44 4444 449

4444 44 ·4 «4 44 4444

Tabulka 8: Experimentální léčba v pokusu krmení brojlerů III

Léčba	Medikace1	Infekce3	PI-PLC	Mannanasa2
1	+	—	-	-
2	+	—	-	100 MU/T
3	—	+	-	-
4	—	+	-	100 MU/T
5		+	Přirozený PI-PLC (10 U/lb) produkovaný Bacillus cereus
6		+	Rekombinantní PI-PLC (30 U/lb) produkovaný Bacillus megaterium
7		+	Rekombinantní PI-PLC (10 U/lb) produkovaný Bacillus megaterium	100 MU/T
8		+	Rekombinantní PI-PLC (30 U/lb) produkovaný Bacillus megaterium	100 MU/T
9	+	+	—	-
10	+	+	Rekombinantní PI-PLC (30 U/lb) produkovaný Bacillus megaterium
1 Krmivo obsahující bacitracin-methylen-disalicylát	(BMD, 50

g/t) a salinomycin (Sacox, 60 g/t).

² 100 MU/t je rovno 100 x 10⁶ jednotkám na tunu krmivá ³ Ptáci byli infikováni v 8 den věku ptačí kokcidií 75000 Eacervulina oocyst a 1,250 E. maxima oocyst na ptáka orálně v nápoji a v den 11, 12 a 13 věku Clostridium perfringens orálně v nápoji každý den 1 ml čerstvého kultivačního media obsahujícího 10⁸ cfu/ml.

Konverze krmivá se upravila z hlediska rozdílů v průměrné hmotnosti ptáků pro účely srovnání léčby. Infekce zhoršovala • 4 «*

4 4 • 4 44

4 4

4 4

44*4 4« • 4

4 4 4 * 44

4 4 4

4 4 4

44

44 • 4 4 4

4 4

4 4 <

4 4

4444

AF/G (konverzi krmivá korigovanou na hmotnost) o přibližně 23% (0,147 AF/G jednotek). Použití salinomycinu a BMD zcela obnovilo AF/G na normální hodnoty, ale tato dvě chemická činidla nebyla lepší než kombinace β-mannanasy a PT-PLC v redukci střevních lézí způsobených infekcí. 100 MU β-mannanasy na tunu buď samostatně nebo v kombinaci s PI-PLC částečně ruší škodlivé následky infekce, jak je patrné z 65% až 70% zlepšení AF/G vzhledem k infikovaným kontrolám (viz T3 vs Tl). β-mannanasa snižovala skóre střevních lézí způsobených E. acervulina více než E. maxima. Částečné obnovení AF/G bylo dosaženo u infikovaných kuřat léčených PI-PLC v krmivu, ale bylo odstraněno pouze 33-41% zhoršení. Nicméně v obou třídách PI-PLC snižoval skóre střevních lézí způsobených oběma druhy Eimeria. V případě E. maxima byla redukce lézí statisticky významná. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 9.

Tabulka 9: Pokus s krmením brojlerů III s PI-PLC a endo-1,4-p~D-mannasou při infekci kuřat E. acervulina, E. maxima a C. perfringens

Popis léčby

Spotřeba krmivá

Konv. krmivá

Hm. přírůstek

ž.hm

Skóre lézí

Hm.

I1

M

β-man- nanasa

PI- PLC

den 0-21

den 8-21

den 0-21

den 8-21

den 0-21

den 8-21

den 21

E. acer.

E. max.

AF/G2 3 V. léčba I

1

ne

ano

ne

ne

11,178“

8,866*

1,433“

l,446d

0,659*

0,540*

0,701*

0,00'

0,00'

1,433

2

ne

ano

100 MU/t

ne

11,2301

8,841*

1,402

1,424“

0,678’

0,548*

0,720*

0,00'

0,00'

1,416

3

ano

ne

ne

ne

10,497“

8,155b'

1,669*

1,704*

0,538“

0,429'

0,579“

1,38’

1,56’

1,579

4

ano

ne

100 MU/t

ne

10,787’'

8,435“'

1,501“

1,536'

0,6 IT'

0,49Ób

0,652'

1,16“

1,44“

1,465

5

ano

ne

ne

lxReo lOU/lb

10,456“

8,228’bc

1,560'

l,591b

0,594'

0,477

0,635'

1,34’

1,19'

1,512

6

ano

ne

ne

3xRec 30U/lb

10,266“

7,982'

1,572

1,621“

0,597'

0,483b

0,638'

1,16“

1,13'd

1,526

7

ano

ne

100 MU/t

lxRec lOU/lb

10,533“'

8,227’b'

1,514b'

1,536'

0,598'

0,482

0,639'

l,09b

1,25'

1,469

8

ano

ne

100 MU/t

3x Reo 30U/lb

10,496“

8,156

1,516

1,562'

0,601'

0,478

0,643'

1,25“

1,38’'

1,474

9

ano

ano

ne

ne

11,060“

8,658’

1,423

1,447“

0,650*

0,522’

0,692’

1,03

0,88“

1,416

10

ano

ano

ne

3xRec 30U/lb

10,666“

8,359“

1,430'

1,444“

0,647“

0,526*

0,688“

1,03

l,13Cd

1,420

‘1 = infekce ²M = medikace (Salinomycin 60 g/t) a BMD (50 g/t)) ³AF/G = hmotnost upravená na konverzi krmivá (ošetření 1 lb_de„2i - ošetření x lb_den2i)/3 + spotřebované krmivo/přirůstek hmotnosti _{(den 0}-2i))

PI-PLC jednotk yjsou podle příkladu 4.

Hemicell MU = milion jednotek ChemGen.

** «Α «9 ·9 ·· ·»· · · * · ·9Α· • · ·· > % ·« ·« 9 · t · ··«· . · · • ·· · »» ♦ ♦ ·» «.« «·«*

IV. Pokus IV s krmením brojlerů

Pokus se provedl v randomizovaných Petersime boxech pro testování vlivu PI-PLC, mannanasy (U.S. Patent 5429828) a mykotické mannanasy na stav brojlerů v den 21 věku. Ptáci byli infikováni v 8 den věku kokcidií (75000 E.acervulina oocyst a 1,250 E. maxima oocyst na ptáka orálně v nápoji) a v den 11, a 13 věku Clostridium perfringens (orálně v nápoji každý den 1 ml čerstvého kultivačního media obsahujícího 10⁸ cfu/ml).

Každá terapie (tabulka 8) se skládala z 8 provedení nebo boxů a v každém boxu bylo umístěno 14 Mareks-vakcinovaných, Cobb x !

Cobb brojlerů (počet byl snížen na 10 v den 14, protože 4 ptáci byli odebráni z každého boxu a byly skórováni na léze) s prostorem na ptáka 10,97 cm². Ptáci se nenahrazovali. Krmivo a voda se podávaly ad libitum během celého testu (den 0 až den

21). Krmivo se podávalo ve formě krmné směsi ode dne 0 do dne věku. Bazální krmivo bylo typické kukuřičné/sojové startovací krmivo pro brojlery obsahující 22% surového « proteinu s ME 1400 kcal/lb (0,373 kg).

Výsledky shrnuté v tabulce 10 ukazují reprodukovatelný přínos přidání buď PI-PLC nebo mannanasy do krmivá brojlerů infikovaných dvěma druhy ptačí kokcidie a Clostridium perfringens, kde toto přidání vedlo k zlepšení jak v přírůstku i

hmotnosti, tak v konverzi krmivá. Důležité je, že tato studie ukázala, že PI-PLC nebo mannanasa, při kombinaci se salinomycinem, ale bez antibiotika BMD (testy 6 a 5) obnovuje stav kuřat prakticky na stav neinfikovaných jedinců (č. 1 a

2). Toto je důkazem antibakteriálního účinku. V tomto případě účinkoval PI-PLC/Salinomycin o něco lépe než mannanasa a lépe než současné přidávání kombinace BMD a salinomycinu při léčbě infikovaných hejn (test 4) .

9

9 99 *9 • 9

9«

999«

9

9 ΰ

9 «

9999

Tabulka 10: Pokus IV s krmením brojlerů

Teší	1’	E?	M3	1 skóre lézí	konverze krmivá	hmot. přírůstek	živá hmotnost den;27
E. acer.	E. ntax.
Upper	Mi. '	den 0-21	den 8-21	den*, o-21	i den, 8-21
1	-	-	-	0.00	0.00	1.652	1.694	0.527	0.427	0.565
2	-	-	B/S	0.00	0.00	1.612	1.656	0.546	0.437	0.583
3	+	-	-	2.44	2.31	1.813	1.909	0.394	0.296	0.432
10			B	2.25	1.94	1.707	1.770	0.453	0.352	0.490
7	+	-	S	1.00	1.09	1.709	1.719	0.458	0.368	0.496
4	+	-	B/S	0.59	1.63	1.585	1.671	0.509	0.397	0.547
16	+	PI-PLC	-	2.25	1.50	1.701	• 1.778	0.451	0.347	0.486
9	+	PI-PLC	B	2.03	1.34	1.760	1.844 .	0.445	0.342	0.482
6	+	PI-PLC	S	1.06	1.28	1.584	1.613	0.526	0.419	0.564
12	+	Man.	-	1.94	1.34	1.803	1.849	0.433	0.338	0.483
13	+	Man. 5x	-	2.13	2.00	1.740	1.813	0.437	0.339	0.471
8	+	Man.	B	2.09	1.34	1.707	1.772	0.448	0.348	0.486
5	+	Man.	S	0.97	1.09	1.652	1.688	• 0.500	0.397	0.538
11	+	Man.	B/S	0.78	1.16	1.622	1.666	0.502	0.390	0.540

^XI = Infekce: infikování v den 8 věku 75000 oocyst E.

acervulina a 1250 oocyst E.maxima na ptáka orálně v nápoji a v den 11, 12 a 13 věku Clostridium perfringens orálně v nápoji každý den 1 ml čerstvého kultivačního media obsahujícího 10⁸ cfu/ml.

²E = Enzymy: PI-PLC = rekombinantní PI-PLC produkovaný B. megaterium přidaný v dávce 30 U/lb. Jednotky jsou definovány jako v příkladu 4; Man.= B. lentus endo-ÍŤ^-D-mannanasa (U.S. Patent 5429828) přidaná v dávce 121 MU/tunu (miliony CheJOř^Gen jednotek/tunu), nebo 5x při 506 MU/tunu.

³M = Medikace (B = BMD při 50 g/tunu); S = Salinomycin (v dávce 60 g/tunu).

• ·· · · · · ··· ···· ·· ·* 99 99 9999

Příklad 12: Stanovení vlivu enzymů na životaschopnost a buněčnou invazi sporozoitů Eimeria acervulina a Eimeria in vitro

Sporozoity Eimeria acervulina nebo sporozoity Eimeria tenella a kultura fetálních buněk křeččí ledviny se připravily publikovanými metodami. Viz Augustine, Avian a Poultry Biology Reviews 11:113-122, 2000. Pro ošetření buněk se buněčné kultury převrstvily ředěními enzymů podle tabulky 11 a testovaly se na morfologické změny během 5 až 45 minut po převrstvení. Po 45 minutách se monovrstevné kultury dvakrát promyly a potom se naočkovaly neošetřenými sporozoity E. acervulina nebo E. tenella. Pro aplikaci během infekce se sporozoity suspendovaly ve vhodném ředění enzymu a naočkovaly se ihned do buněčné kultury. Po 45 minutách inkubace se kultury fixovaly, barvily se a kvantifikovala se invaze.

Pozorovaly se změny morfologie sporozoitů nebo buněk během léčby enzymem. Při koncentracích enzymů použitých v těchto pokusech nebyly zaznamenány morfologické změny. Invaze sporozoitů do kultivovaných buněk se měřila po dvou způsobech ošetření buněk enzymem, stejně jako bez ošetření enzymem, histologickým barvením a mikroskopicky. Viz Augustine, výše.

Data v Tabulce 11 ukazují signifikantní redukci invaze sporozoitů jak pro E. acervulina, tak pro E. tenella. Oba relativně málo přečištěné přípravky PT-PLC enzymu z extracelulárního media B. cereus, a vysoce přečištěný rekombinantní PI-PLC produkovaný v rekombinantním B. megaterium, vedly ke statisticky významné redukci invaze ve většině pokusů. I při dávce přibližně jedné poloviny přirozeného přípravku z PT-PLC byl rekombinantní PI-PLC prostředek stále aktivní. Tak bylo předléčení buněk enzymem a vymytí enzymu stejně účinné jako přidání enzymu současně během infekce. Nicméně, podle pokusů s extrakcí enzymu z krmivá nevedou dva kroky promytí pravděpodobně k odstranění veškerého enzymu.

Enzymový prostředek s endo-1,4]-D-mannanasou také způsoboval statisticky signifikantní redukci invaze ve dvou pokusech, kdy byly buňky předléčeny enzymem před infekcí. Tyto pozitivní výsledky byly dosaženy v jednom pokusu s každým typem patogenu. Tak účinkuje mannanasa stejně dobře jako B. cereus PT-PLC v redukci invaze sporozoitů in vitro.

Tabulka 11: In vitro invaze BHK buněk sporozoity Eimeria acervulina nebo Eimeria tenella s a bez ošetření enzymem ___Předléčení buněk

Enzymy a koncentrace	enzymem následované promytím »	Aplikace enzymu během infekce
£. acervulina sporozoity	Testi	Test 2	Testi	Test 2
Kontrol»-	22 + 1*	33±4*	50±4*	35±7*
PI-PLC from B. cereus1 0.0403 U/mL	15 + lb	26 ± 1 *b	33 ± 3 b	25 + 2
Pl-PLC 1 z rekombinantního B. megateriaum2 0.261 U/mL	14 ± 1b	22 + 1b	16±2C	' 18+IU
PI-PLC; z rekombinantního B. megateriaum' 0.0261 U/mL	18 + l*b	26 ± 1*b	36±3b	9 + 2'
endo-J, 4-^-D-mannanaseJ 5100 U/mL	16 ± 1b	29 ± 2 *b	ŇD’	ND
£, tenella sporozoity	Testi	Test 2	Test 1	Test 2
Kontrol»-	44±2*	26±4*	63±5*	42 + 4*
PI-PLC from B. cereus' 0.0403 U/mL	38±2b	21 ±2’	52 + 13 *b	37 + 2*b
PI-PLC r z rekombinantního B. megateriaum' 0.261 U/mL	30 + 1'	15 ±0*	28±2b	39±4*b
PI-PLC from Recombinant B. megateriaum 2 0.0261 U/mL	ND	17± 1 *	18±1'	29 ± Ib
endo-1,4-j 5 -D-mannanaseJ 5100 U/mL	35 ± 1 b	19±5*	46 + 6*b	ND

4

Počty invazí jsou udávány jako průměr ± standardní odchylka z průměru měřeného z 1-3 krycích sklíček/aberaci (BHK buňky byly kultivovány na krycích sklíčkách vložených do kultivačních disků). Průměry v testovaných skupinách s různými indexy se statisticky významně liší (P < nebo = 0,05).

¹ Extracelulární enzym z B. cereus dialyzovaný ve fosfátem pufrovaném salinickém roztoku, jednotky standardizované způsobem podle příkladu 4.

Extracelularni enzym z rekombinantního B. megaterium dialyzovaný ve fosfátem pufrovaném salinickém roztoku, jednotky standardizované způsobem podle příkladu 4.

³Mannanasa získaná z Bacillus lentus způsobem podle U.S. Patentu 5429828 a dialyzovaná do fosfátem pufrovaného salinického roztoku, jednotky jsou definovány podle ChemGen Corp. testu redukce sacharidů.

⁴ ND = nestanoveno.

Příklad 13: Hodnocení PI-PLC pro Cryptosporidiovou infekci in vitro

Enzym PI-PLC se hodnotil na anti-kryptosporidiovou aktivitu a toxicitu při koncentracích v rozmezí od 0,001 so 30 U/ml a test se provedl na 4-denních Madin-Darby buňkách psí ledviny (MDCK). Enzymové jednotky byly definovány stejně jako v příkladu 4, ale měřeny byly podle příkladu 9. Použitým enzymovým prostředkem byl prostředek z rekombinantního Bacillus megaterium. Léčba byla zahájena 3 hodiny po infekci a pokračovala po dobu 48 hodin.

Chemiluminiscenční imunotest. Před infekcí se oocysty promyly a resuspendovaly se v DMEM bázi s 0,75% taurocholátem sodným a inkubovaly se po dobu 10 minut při 37°C (You et al., • fe • ·

FEMS Microbiol. Letters 136:251-256, 1996; You et al., J. Antimicrobial. Chemother. 41:293-296, 1998). Excystační směs se naředila Ultraculture mediem, rychle se přenesla na plotny obsahující MDCK buňky, při 100% konfluenci, a udržovala se v Ultraculture mediu po dobu 4 dnů. Inokulum se inkubovalo s buňkami po dobu 3 hodin před promytím PBS a nahrazením čerstvým Ultraculture mediem s nebo bez testovaného enzymu. Plotny se inkubovaly při 37°C, v 5% atmosféře CO2, po dobu 48 hodin. Kultury se promyly PBS a fixovaly se Bouinovým roztokem.

Fixované plotny se promyly TBST pufrem (20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, 0,05% Tween 20) a blokovaly se 1% BSA-TBST (TBST pufr obsahující 1% hovězí sérový albumin) po dobu 30 minut při 25°C za mírného třepání. Králičí anti-Cryptosporidium parvum sérum (ředění 1:200) se aplikovalo na plotny a provedla se inkubace po dobu 1 hodiny. Po promytí TBST se vzorky sekvenčně inkubovaly s kozí protilátkou proti králičímu IgG značenou biotinem a streptavidinem značenou křenovou peroxidasou (pracovní ředění, 1:1000, KPL lne., Gaithersburg, MD). Obohacený luminol (4-jodofenol a peroxid vodíku, Aldrich Chemical Co. Inc., Milwaukee, WI) se použil jako substrát. Plotny se odečítaly za použití ML3000 Luminometer (Dynatech Lab., Chantilly, VA) a určily se relativní světelné jednotky (RLU). Průměry RLU se vypočetly ze 4 jamek a všechny pokusy se opakovaly alespoň dvakrát.

Test toxicity. Enzym se testoval za použití komerčního testu redukce tetrazoliového barviva (CellTiter 96; Promega Corp., Madison, WI, USA). Stručně, každá koncentrace enzymu uvedená dále se vnesla do 96-jamkové plotny obsahující konfluentní monovrstvu MDCK buněk. Každé ředění se hodnotilo v trojím provedení. Enzym se inkuboval na monovrstvách při 37°C a 5%

C0₂. Po 4 8 hodinách se plotny vyvíjely po dobu 1 hodiny a odečítaly se v ELISA čtečce ploten při 490 nm. Výsledky byly zaznamenány a analyzovány. Procento toxicity se vypočetlo odečtením průměrné OD kontrolního media bez enzymu od průměrné OD s enzymem a potom dělením OD media a násobením 100. Skóre cytotoxicity byly následující:

Toxicita % Skóre

0-5% 0

6-25% 1

26-50% 2

51-75% 3

76-100% 4

Signifikantní toxicita byla pozorována pro 3U/ml nebo vyšší koncentrace enzymu. Žádná významná toxicita nebyla pozorována pro tento enzym v rozmezí 0,1-1 U/ml (tabulka 12). Proto byla sada pokusů s tímto rozmezím koncentrace (1,0 U/ml nebo nižší) provedena pro stanovení aktivity enzymu a specificity enzymu.

V prvním pokusu byly MDCK buňky infikovány excystovanými sporozoity. Po 3-hodinové inkubaci se monovrstva buněk promyla a enzym se přidal v různých koncentracích na dobu 48 hodin.

Jak je uvedeno v tabulce 13, vykazoval enzym antikryptosporoidální aktivitu v rozmezí 0,01-1 U/ml in vitro. Přibližně 50% inhibice bylo dosaženo při koncentraci 0,1 U/ml (Obr. 1) .

• · • · · · • · ι • ·· » · · <

I · · 4 • · · ·

Tabulka 12. Toxicita rekombinantního PI-PLC připraveného v B. megaterium pro monovrstvu MDCK buněk

Koncentrace	%Toxicity (95% CL)	Skóre toxicity
10 U/ml	83	4
3	57	3
1	13	1
0,3	11	1
0,1	10	1

Tabulka 13. Aktivita rekombinantního PI-PLC enzymu v buněčných kulturách MDCK buněk infikovaných C. parvum

Léčba	U/ml	Procentuální inhibice	Průměrný počet Ciyptosporidií na jamku mikrotitrační plotny	95% CL
Po infekci na 3 hodiny	1	77,36	285,28	0,01
	0,3	77,26	286,5	0,04
	0,1	52,74	595,53	0,18
	0,03	27,62	912,15	0,22
	0,01	7,33	1167,78	0,09
Infikované	-	0	1260,18	0,09
Neinfikované	-	100	0	0,02

Druhá sada pokusů se provedla pro hodnocení specificity enzymu. Sporozoity se ošetřily enzymem v různých koncentracích po během 45 minut a krátce se promyly. Ošetřené sporozoity se potom nechaly infikovat neošetřené hostitelské buňky a nechaly se vyvíjet a množit po dobu 48 hodin. V samostatném pokusu se hostitelské buňky inkubovaly s různými koncentracemi enzymu, promyly se a infikovaly se neošetřenými sporozoity.

Jak je uvedeno dále (Tabulka 14), ošetření sporozoitů nebo hostitelských buněk enzymem vedlo k částečné inhibici. Dávková závislost pro inhibici nebyla při těchto koncentracích pozorována. To může být způsobeno krátkou inkubační dobou enzymu s hostitelskými buňkami nebo s parazitem (45 minut) nebo částečným nebo nekompletním štěpením receptorů hostitele/parazita. Dále, na infekci se patrně podílejí jiné receptory hostitele/parazita, které mohou být příčinou růstu pozorovanému v hostitelských buňkách.

Tabulka 14: Ošetření sporozoitů nebo MDCK buněk před infekcí a vliv ošetření na infektivitu C. parvum

Průměrný počet

Tr< léčba	PI-PLC U/mlt/ml	% inhibice on	kryptosporidií na jamku mikrotitrační plotny	95% CL
Sporozoiti ošetření před	1	6727	4I2.4U	0.02
infekcí	0.3	65.64	433.04	0.06
	O.i	57.40	536.80	0.03
	0.03	58.13	527.59	0.03
	0.01	56.98	542.15	0.01
Hostitelské buňky ošetřené před inf.	1	68.76	393.64	0.12 1
	0.3	50.07	629.24	0.26
	0.1	63.82	455.88	0.19
	0.03	58.53	522.66	0.12
	0.01	56.84	543.85	0.10
Infikované		0	1260.18	0.09
Neinfikované		100	0	0.02

Příklad 14. Hodnocení PI-PLC při Cryptosporidiové infekci in vivo

Enzym se hodnotil na antikryptosporidiovou účinnost za použití myšího modelu imunodeficitních SCID myší. Stručně, inokulum oocyst se připravilo promytím přečištěných oocyst (skladovaných <6 měsíců) 0,1% BSA, PBS (pH 7,2) pro odstranění dvojchromanu draselného. SCID myši (4-5 týdnů staré) se infikovaly 10⁶ oocystami (IOWA kmen) a léčily se způsobem uvedeným dále. Od myší se odebíraly vzorky stolice, přečistily se přes diskontinuální sacharosu a testovaly se na obsah parazitů pomocí průtokové cytometrie, jak bylo popsáno dříve. Viz Arrowwood et al., J. Parasitol. 81: 404-409, 1995.

Tabulka 15. Léčebné režimy pro terapeutické pokusy

Skupina myší	A	B	C
Počet myší	10	10	10
Inokulační dávka	10	10	10
Sloučenina	PI-PLC	PI-PLC	Placebo
Dávka (mg/kg)	90U/ml	30U/ml	PBS
Způsob podání	vkrmivu	vkrmivu	vkrmivu
Frekvence	Ad lib	Ad lib	Ad lib

Granulované myší krmivo se potáhlo buď 30 nebo 90 U/lb (0,434 kg) PI-PLC v PBS nebo PBS. Všechny myši se krmily ad libitum. Myším se podávalo krmivo ihned po injekci. Vzorky stolice a hmotnost se odebíraly a určovaly dvakrát týdně. Spotřeba krmivá se měřila denně. Myši se utratily injekcí 0,2 cm³ 100 mg/ml Ketaminu, 100 mg/ml Xylazinu a 0,9% NaCl).

Průměrné množství potravy zkonzumované na den a myš a průměrné hmotnosti myší jsou uvedeny v tabulce 16. během 3týdenního období nebyly pozorovány statisticky významné *·

0 0

0 00

0

0 «000 00

00 0 0 0 0 0 0 · · 0 0 0 · » 00 000 0 ·

0 0 0 » 0 0 «0 * · 0· 00·· rozdíly ve spotřebě krmivá či hmotnosti.

Tabulka 16: Spotřeba krmivá a přírůstek hmotnosti u myší

dťfy	' zpracované skupiny	^Zkonzumované krmivo (g)/ Ujmyš/den	Hmotnost (g)
' 3		AVG	AVG
	A (90U/lb)	7.56	16.67
	B(30U/ib)	6.13	• 17.055
	C(PBS kontrola	5.46	16.88
7		AVG	AVG.
	A	8.31	16.95
	B	8.51	16.91
	C	727	16.89
~ 10		AVG	AVG
	A	8.55	17.29
	B	7.93	17.08
	C	7.1.1	16.97
, 14		AVG	AVG
	A	7.78	17.43
	B	8.06	.17.62
	C	7.55	17.38
~ , 17		AVG	AVG
	A	8.52	17.64
	B	8.53	17.84
	C	7.79	17.59
. 21		AVG	AVG
	A	7.89	18.25
	B	822	18.62
	C	8.51	18.14
24		AVG	AVG
	A	9.79	18.2
	B	8.3	18.63
	C	8.22	18.33

• 0

0 00 •090 00

Účinnost ve 3 týdnu po infekci. Vzorky stolice se odebraly za 3, 4 a 4,5 týdne po infekci a počet Cryptosporidií se měřil u SCID myší a u kontrolních skupin, jak je uvedeno v tabulce 17. Jak je uvedeno, myši léčené enzymem vykazovaly snížení počtu parazitů. V léčených skupinách byl pozorován obsah parazitů (34-54%). některá z těchto snížení byla statisticky významná při hodnocení za použití ANOVA statistické analýzy (jak je uvedeno dále a označeno symboly. Enzym vykazoval potenciál jako anti-kryptosporidální terapeutické činidlo. Vyšší dávky enzymu nebo lepší dodání enzymu do místa infekce může zvýšit jeho účinnost a může být předmětem dalších pokusů.

Tabulka 17: Účinnost PI-PLC in vivo pro redukci kryptosporidií ve stolici

— terap. Dávka skupina enzymu (U/lb)	Obsah % parazitů inhibice — (oocysty/100 μΐ) ( (SD) den 21 ’	Obsah % — parazitů inhibice u < (oocysty/100 μΐ)	Obsah parazitů % (oocysty/100 μΐ) inhibice (SD)den28
PI-PLC	90	22.7(11.4)	44.0	26.3(14)	48.9	87.5(52.9)	34.0
PI-PLC	30	16.2(4.7)	52.0	23.4(11)'	54.6	74.3(89.7)	40.0
PBS kontrola		33.5(16.2)		50.4 (29)		132.1(89.)

* hodnoty p byly statisticky významné při 0,05 nebo méně + hodnota p byla 0,08 nebo menší

Příklad 15: Ověření enzymu v krmivu použitém při testování růstu

Test na PT-PLC extrahovaný z krmivá použitého výše se provedl způsobem popsaným v příkladu 10. Výsledky jsou shrnuty v tabulkách 18-19.

··«· · · · · · · * • · · · 9 4 · · · · 4 · • · · · · · · 4 4 · «··· ·· «* *· 4» ··♦·

Tabulka 18: Cryptosporidiový test, myší krmivo

Léčba	Kontrola	30 U/lb	90 U/lb
cílová hodnota U/lb	0	30	90
Typ PI-PLC		Rekombinantní z B. megaterium	Rekombinantní z B. megaterium
PI-PLC šarže č.	-	45-46 SF	45-46 SF
Extrahováno U/lb	0	22,8	66,1
% extrahovaného z cílového		76, 0	73,4

Účinnost extrakce z krmivá se významně liší podle typu krmivá. Extrakce z myšího krmivá vykazuje 73,4 až 76% účinnost (Tabulka 18). DO tří různých přípravků kuřecího krmivá vyrobených na třech různých místech bylo opatrně přidáno 45 nebo 180 U/lb rekombinantního PT-PLC, a potom byl PI-PLC ihned extrahován a testován za použití způsobu podle příkladu 9 na to, zda je obsah PI-PLC v krmivu v rozmezí testovacího způsobu podle příkladu 9 (tabulka 19).

Tabulka 19: Testování účinnosti extrakce z různých kuřecích krmiv a kukuřičné moučky

*— - -	Zdr oj kuřecího krmivá 1	kukuřičná moučka
	ídroi I	Zdroj·' 2	Zdroj
Loading Le Units/Lb	45	180	45	180	45	180	45
extrahováno U/lb	128	9.3	53.2	3.66	82.7	8.46 Π	134.4	33
· ...........
% extrahovaných přidaných jednotek i '	71.1	20.7	29.6	8.1	45.9	18.8	74.7	73.3

Je vidět, že účinnost extrakce z kukuřičné moučky je podobná účinnosti extrakce z myšího krmivá. Nicméně, extrakce z některých vzorků kuřecího krmivá byla v tomto pokusu - a také v dalších pokusech - o něco horší.

V testu uvedené v tabulce 20 bylo podíl extrahovatelného enzymu přibližně 30-45% teoretického obsahu PI-PLC, zatímco βmannanasa byla snadno extrahovatelná s výtěžkem přibližně 100%. Přibližně 45% extrakce byla nej lepší extrakcí z tohoto krmivá v testu extrakce uvedeném výše. Tak jsou výsledky testu pro jednotku extrahovanou z 0,454 kg krmivá uvedené v tabulce 20 v rozmezí očekávaném pro použitý obsah.

Tabulka 20: Ověření obsahu enzymu v krmivu z pokusu III krmení brojlerů

	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
	í	-	+	+	+		+	+	+	+
Medikace	i +	+	-	-	-	-	-	-	+	+
Cíl(U/ml)	! 0	0	0	0	10	30	10	30	0	30
Typ PI-PLC	1 -	-	-	-	WT	Rec	Rec	Rec	-	Rec
			testy s U/lb PI-PLC r
Průměr U/lb	| 0.94	0.76	0.79	0.7	3.08	11.48	4.56	10.18		9.49
% cíle	1 -	-	-	-	30.75	3827	45.57	33.93		31.64
cíl MU/tunu	1 -	100	-	100	-	• -	100	100	-	-
Hemicell. mannanasa^	-	+	-	+	-	-	+	+	-	-
testy s MU/tunu mannanasy
MU/tunu	1 -	124.9	-	135.5	-	-	153.5	172.0	-	-
%cíle		124.9	-	135.5	-	-	153.5	172.0	-	-

Ačkoliv byla popsána určitá provedení a podrobnosti předkládaného vynálezu, bude odborníkům v oboru jasné, že existují různé změny a modifikace vynálezu, které spadají do jeho rozsahu.

Claims (70)

1. Patentové η

   1. Prostředek, vyznačuj ící obsahuje (i) enzym, který štěpí vazbu, která uvolňuje protein buněčného povrchu nebo karbohydrát, kde uvedený enzym je jiný než endo-1,4-p-D-mannanasa, a (ii) fyziologicky přijatelný nosič pro uvedený enzym, kde uvedený prostředek je ve formě vhodné pro orální podání.
2. 2. Prostředek podle nároku 1,. vyznačující se tím, že se jedná o krmivo.
3. 3. Prostředek podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že neobsahuje jiné antiinfekční činidlo než uvedený enzym.
4. 4. Prostředek podle kteréhokoli z nároků 1 až 3, vyznačující se tím, že uvedený enzym štěpí vazbu, která uvolňuje protein buněčného povrchu.
5. 5. Prostředek podle nároku 1, vyznačující se tím, že uvedený enzym,je vybrán ze skupiny zahrnující esterasy, cerebrosidasy a karbohydrasy, které štěpí vazby, které uvolňují protein buněčného povrchu nebo karbohydrát.
6. 6. Prostředek podle nároku 5, vyznačující se tím, že uvedené esterasy jsou vybrány ze skupiny zahrnující sfingomyelinasy a fosfolipasy.
7. 7. Prostředek podle nároku 6, vyznačující se tím, že uvedená fosfolipasa je fosfolipasa typu C nebo D.

   44 44

   4 4

   4 4 44

   4 9 ♦ *

   4 · ·

   444 44

   4 4 9 4 • 4 4 4

   4 4 4 4

   4 4 4 ·

   4 4 4 4 • · »4 •

   • «4 ·

   4 «

   4 4

   4 4

   4444
8. 8. Prostředek podle nároku 6, vyznačující se tím, že uvedená fosfolipasa je fosfatidylinositolspecifická fosfolipasa C.
9. 9. Prostředek podle kteréhokoli z nároků 1 až 8, vyznačující se tím, že dále zahrnuje stabilizátor, karbohydrátový nosič nebo konzervační přísadu.
10. 10. Prostředek podle nároku 9, vyznačující se tím, že stabilizátorem je pufr, karbohydrát nebo glykol.
11. 11. Prostředek podle nároku 9, vyznačující se tím, že karbohydrátový nosič je vybrán ze skupiny zahrnující xylosu, fruktosu, glukosu, sorbitol a maltotriosu.
12. 12. Prostředek podle nároku 9, vyznačující se tím, že konzervační přísada je vybrána ze skupiny zahrnující propylparaben, sorbát sodný, sorbát draselný a askorbylpalmitát.
13. 13. Prostředek podle kteréhokoli z nároků 1 až 12, vyznačující se tím, že uvedený nosič je poživatina, do které je uvedený enzym zapracován.
14. 14. Prostředek podle kteréhokoli z nároků 1 až 12, vyznačující se tím, že uvedená poživatina je krmivo pro zvířata složené ze zrnitého materiálu, zdroje proteinů, vitaminů, aminokyselin a minerálů.
15. 15. Prostředek podle nároku 14, vyznačující se tím, že uvedený zrnitý materiál je kukuřice, čirok, pšenice, ječmen nebo oves.

    44 44

    4 · · • 444 4 · · • « · «444 ·· • 4 44 • 4 · 4

    4 4 44 » 4 4 4 4

    4 4 4 «

    4 4 44

    4 4 4 4

    4 4 · • 44 ·

    4 4 4

    44 444«
16. 16. Prostředek podle nároku 14, vyznačující se tím, že zdrojem proteinů jsou fazole nebo hrách.
17. 17. Prostředek podle kteréhokoli z nároků 1 až 12, vyznačující se tím, že uvedený prostředek jev pevné nebo kapalné formě.
18. 18. Prostředek podle kteréhokoli z nároků 1 až 12, vyznačující se tím, že uvedený enzym je obsažen v tabletě nebo obalu želatinové kapsle.
19. 19. Prostředek podle nároku 1, vyznačující se tím, že uvedený enzym je připraven z kmene Bacillus cereus.
20. 20. Prostředek podle nároku 19, vyznačující se tím, že uvedený kmen Bacillus cereus je ATCC 7004 nebo

    ATCC 6464.
21. 21. Prostředek podle nároku 1, vyznačující se tím, že uvedený enzym je získán expresí rekombinantní DNA v hostitelském organismu.
22. 22. Prostředek podle nároku 21, vyznačující se tím, že uvedený hostitelský organismus je z kmene

    Bacillus megaterium.
23. 23. Prostředek podle nároku 1, vyznačující se tím, že uvedený enzym je přítomen v dávce 200 IU/kg až

    4000 IU/kg krmivá.
24. 24. Způsob léčby nebo zmírnění rizika infekce zažívacího traktu, vyznačující se tím, že zahrnuje

    99 9« • 9 9

    9 9

    9 9 99 9 9 9

    9 *

    9 9

    9999 99

    99 ·«

    9 9 9 9

    9 9 9 orální podání účinného množství enzymu, který štěpí vazbu, která uvolňuje protein buněčného povrchu nebo karbohydrát, kde enzym je jiný než endo-1,4-p-D-mannanasa, jedinci s takovou infekcí nebo s rizikem infekce.
25. 25. Způsob podle nároku 24, vyznačující se tím, že uvedený enzym štěpí vazbu, která uvolňuje protein buněčného povrchu.
26. 26. Způsob podle nároku 24, vyznačující se tím, že uvedený způsob nezahrnuje podání anti-infekčního činidla jiného než uvedený enzym.
27. 27. Způsob podle nároku 24, vyznačující se tím, že uvedená infekce je způsobena protozoárním, bakteriálním, kvasinkovým nebo mykotickým patogenem.
28. 28. Způsob podle nároku 27, vyznačující se tím, že uvedená infekce je způsobena protozoárním patogenem rodu Eimeria.
29. 29. Způsob podle nároku 27, vyznačující se tím, že uvedená infekce je způsobena protozoárním patogenem rodu Cryptosporidium.
30. 30. Způsob podle nároku 27, vyznačující se tím, že uvedená infekce je způsobena bakteriálním patogenem rodu Clostridium.
31. 31. Způsob podle nároku 24, vyznačující se tím, že zahrnuje orální podání uvedenému jedinci extracelulárního enzymového prostředku z kmene Bacillus cereus.

    4» *4

    4 * ·

    4 444

    4 4 4 • 4 4 •444 4«

    4 4 44

    4 4 4 4

    4 4 44

    4 4 4 4 ·

    4 4 4 4

    44 44 • 4 ··

    4 4 4

    4 4 4 • 44 9 • 4 4

    4 9 ···4
32. 32. Způsob podle nároku 31, vyznačující se tím, že uvedený kmen Bacillus cereus je ATCC 7004 nebo

    ATCC 6464.
33. 33. Způsob podle nároku 24, vyznačující se tím, že uvedený enzym je získán expresí rekombinantní DNA v hostitelském organismu.
34. 34. Způsob podle nároku 33, vyznačující se tím, že uvedený hostitelský organismus je z kmene

    Bacillus megaterium.
35. 35. Způsob podle nároku 24, vyznačující se tím, že uvedený enzym je vybrán ze skupiny zahrnující esterasy, cerebrosidasy a karbohydrasy, které štěpí vazby, které uvolňují protein buněčného povrchu nebo karbohydrát.
36. 36. Způsob podle nároku 35, vyznačující se tím, že uvedené esterasy jsou vybrány ze skupiny zahrnující sfingomyelinasy a fosfolipasy.
37. 37. Způsob podle nároku 36, vyznačující se tím, že uvedená fosfolipasa je fosfolipasa typu C nebo D.
38. 38. Způsob podle nároku 36, vyznačující se tím, že uvedená fosfolipasa je fosfatidylinositolspecifická fosfolipasa C.
39. 39. Prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje (i) enzym, který štěpí vazbu, která uvolňuje protein buněčného povrchu nebo karbohydrát, a (ii) fyziologicky přijatelný nosič pro uvedený enzym, kde uvedený prostředek je • φ φ « φ φ φ φ φφ φφ φφ • φ φ

    ΦΦΦ· φ φ φ · * φφφφ φφ • φ φ φ φ φ · φ · · · φφ φφ φφ φφ φ » φ · φ φ φ φφφ φ φ φ «φ φφφφ ve formě vhodné pro orální podání a neobsahuje jiné antiinfekční činidlo než uvedený enzym.
40. 40. Prostředek podle nároku 39, vyznačující se tím, že uvedeným nosičem je poživatina, do které je uvedený enzym zapracován.
41. 41. Prostředek podle nároku 40, vyznačující se tím, že uvedená poživatina je krmivo pro zvířata složené ze zrnitého materiálu, zdroje proteinů, vitaminů, aminokyselin a minerálů.

    42. Prostředek podle nároku 41, v y z n a č u j ící se t í m , že uvedený zrnitý materiál je kukuřice, čirok, pšenice, ječmen nebo oves. 43. Prostředek podle nároku 41, v y z n a č u j ící se

    tím, že zdrojem proteinů jsou fazole nebo hrách.
42. 44. Prostředek podle nároku 39, vyznačující se tím, že uvedený prostředek je v pevné nebo kapalné formě.
43. 45. Prostředek podle nároku 39, vyznačující se tím, že uvedený enzym je obsažen v tabletě nebo obalu želatinové kapsle.
44. 46. Prostředek podle nároku 39, vyznačující se tím, že uvedeným enzymem je hemicellulasa.
45. 47. Prostředek podle nároku 46, vyznačující se tím, že uvedenou hemicellulasou je mannanasa.
46. 48. Prostředek podle nároku 47, vyznačující se « A AA • A · • · • · •••A AA

    A A

    A A

    A A

    A · A

    A A tím, že uvedenou mannanasou produkovaná Bacillus lentus ATCC je endo-1,4-3~D-mannanasa

    55045.
47. 49. Prostředek podle nároku 39, vyznačující se tím, že uvedený enzym je vybrán ze skupiny zahrnující esterasy, cerebrosidasy a karbohydrasy, které štěpí vazby, které uvolňují protein buněčného povrchu nebo karbohydrát.
48. 50. Prostředek podle nároku 49, vyznačující se tím, že uvedené esterasy jsou vybrány ze skupiny zahrnující sfingomyelinasy a fosfolipasy.
49. 51. Prostředek podle nároku 50, vyznačující se tím, že uvedená fosfolipasa je fosfolipasa typu C nebo D.
50. 52. Prostředek podle nároku 50, vyznačující se tím, že uvedená fosfolipasa je fosfatidylinositolspecifická fosfolipasa C.
51. 53. Prostředek podle nároku 39, vyznačující se tím, že dále zahrnuje stabilizátor, karbohydrátový nosič nebo konzervační přísadu.
52. 54. Prostředek podle nároku 53, vyznačující se tím, že stabilizátorem je pufr, karbohydrát nebo glykol.
53. 55. Prostředek podle nároku 53, vyznačující se tím, že karbohydrátový nosič je vybrán ze skupiny zahrnující xylosu, fruktosu, glukosu, sorbitol a maltotriosu.
54. 56. Prostředek podle nároku 53, vyznačující se tím, že konzervační přísada je vybrána ze skupiny zahrnující propylparaben, sorbát sodný, sorbát draselný a askorbylpalmitát.
55. 57. Způsob léčby nebo zmírnění rizika infekce zažívacího traktu, vyznačující se tím, že zahrnuje orální podání účinného množství enzymu, který štěpí vazbu, která uvolňuje protein buněčného povrchu nebo karbohydrát, jedinci s takovou infekcí nebo s rizikem infekce, přičemž tento způsob nezahrnuje podávání antimikrobiálně účinného množství jiného antiinfekčního činidla s tímto enzymem.
56. 58. Způsob podle nároku 57, vyznačující se tím, že uvedená infekce je způsobena protozoárním, bakteriálním, kvasinkovým nebo mykotickým patogenem.
57. 59. Způsob podle nároku 58, vyznačující se tím, že uvedená infekce je způsobena protozoárním patogenem rodu Eimeria.
58. 60. Způsob podle nároku 58, vyznačující se ' tím, že uvedená infekce je způsobena protozoárním patogenem rodu Cryptosporidium.
59. 61. Způsob podle nároku 58, vyznačující se tím, že uvedená infekce je způsobena bakteriálním patogenem rodu Clostridium.
60. 62. Způsob podle nároku 57, vyznačující se tím, že zahrnuje orální podání uvedenému jedinci extracelulárního enzymového prostředku z kmene Bacillus cereus.
61. 63. Způsob podle nároku 62, vyznačující se tím, že uvedený kmen Bacillus cereus je ATCC 7004 nebo fefe fefe fe fefe • fe·· • fe 4 • · <

    •fefefe fefe • ·· • fe fefe » fefe '

    ATCC 6464.
62. 64. Způsob podle nároku 57, vyznačující se tím, že uvedený enzym je získán expresí rekombinantní DNA v hostitelském organismu.
63. 65. Způsob podle nároku 64, vyznačující se tím, že uvedený hostitelský organismus je z kmene

    Bacillus megaterium.
64. 66. Způsob podle nároku 57, vyznačující se tím, že uvedeným enzymem je hemicellulasa.
65. 67. Způsob podle nároku 66, vyznačující se tím, že uvedenou hemicellulasou je mannanasa.
66. 68. Způsob podle nároku 67, vyznačující se tím, že uvedenou mannanasou je endo-1,4-p-D-mannanasa produkovaná Bacillus lentus ATCC 55045.
67. 69. Způsob podle nároku 57, vyznačující se tím, že uvedený enzym je vybrán ze skupiny zahrnující esterasy, cerebrosidasy a karbohydrasy, které štěpí vazby, které uvolňují protein buněčného povrchu nebo karbohydrát.
68. 70. Způsob podle nároku 69, vyznačující se tím, že uvedené esterasy jsou vybrány ze skupiny zahrnující sfingomyelinasy a fosfolipasy.
69. 71. Způsob podle nároku 70, vyznačující se tím, že uvedená fosfolipasa je fosfolipasa typu C nebo D.
70. 72. Způsob podle nároku 70, vyznačující se