TWI255189B - Enzyme treatment - Google Patents

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經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 發明範圍 本文發明關於一種包含酵素之組成物及使用酵素之 方法，以作為抗感染劑，就此而論以治療或降低消化道感 染之風險。 發明背景 於一九九八年修定版之【世界人口估計與展望】（world Population Estimates and Projections)中，聯合國經濟與社 會理事會人口司提出世界人口將於一九九九年達到六十億 人。報告中亦提及，相較於人口自1〇億增加至2〇億需要123 年，人口數自50億增至60億只要12年。到21世紀中期，預 測人口數在73億至107億之間。過去十年之間顯著的人口增 長部分起因於科技與密集食物生產方法之使用造成食物產 量的有效增加。對於未來的人口增加，食物產量更有效的 增加必須並駕齊驅。 使動物肉產量更有效的一種方法，牽涉在動物飼料中 廣泛使用的抗微生物化學藥品及抗生素。在規模龐大的農 場中’擁擠生產條件下的傳染病擴散非常迅速。因此擴散 的疾病經由這些物質之預防性或治療性使用加以控制。舉 例而言，常用的方法是在動物飼料中併入控制球蟲感染之 化學物質（如沙林黴素、巴西金葉樹苷、羅沙胂（3-硝鹽）、 哈喹諾、卡巴多司與奥喹多司）以及抗微生物抗生素（如枯 草桿菌素、維吉尼亞黴素、泰樂菌素、四環黴素、氣化四 環黴素、青黴素、竹桃黴素、新生黴素、林肯黴素、巴波 黴素、安普黴素、螺旋黴素、紅黴素、新黴素及其他）。此 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21 OX297公釐） T裝：-I (請先閱讀背面之注意裏再本頁) 訂 -線| »

In i 4 1255189 A7 B7 五、發明説明（） 2 方法已知能促進生長並改進飼料轉換率。 在人類致病原中，如金葡萄球菌、肺炎鏈球菌、流行 性感冒嗜血桿菌、淋病奈瑟球菌與結核桿菌，多種抗生素 抗藥性的增加，使人擔心與農場動物相關之微生物内發展 的抗生素抗藥性會透過可轉殖之抗藥因子轉移至人類致病 原内。有證據顯示含抗生素之動物飼料是帶有可轉移抗藥 因子的細菌的來源。參閱Hooge，Feedstuffs 71(20) : 59, 1999。雖然用於動物與人類的抗生素一般是不同的，但造 成交互抗藥性的機制卻有相似之處。在一實施例中，氟化 喹喳諾酮證實在某些動物身上可控制大腸桿菌傳染病（大 腸菌病），其亦可用於人類醫療。Hooge，同上。最近食品 與藥物管理局/CVM已研議要撤銷准許在家禽上使用氟化 嗜諾酮恩氟沙星，是因氟化4諾綱抗藥性彎曲菌之發展且 轉移至人類。參閱 Merhead，S· Feedstuffs 72(45): 1·4, 2000 ο 在製肉工業界中也有隱憂，如果禁止在飼料中使用抗 生素與抗微生物藥，獲利損失與動物疾病之復發可能會發 生。舉例而言，一九八六年瑞典禁止使用飼料抗生素，然 而動物疾病增加。此現象伴隨治療用抗生素之增加使用， 結果造成抗生素使用量總量增加且提高製肉動物產品費用 。參閱 Smith，Feedstuffs 71(13) : 1，1999。在一九九八年十 二月，歐盟部長會議決定暫停六種抗微生物藥的使用，其 曾被正式批准為非處方之飼養增長促進劑（Official Journal of the European Communities 29.12.98, Council Regulation 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） ^-- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T 線 經濟部如曰慧財產局員工消費合作社印製 1255189 A7 _B7 _ 五、發明説明（3 )

No· 2821/98 concerning Directive 70/524)。兩種嗜語啡添 加物也於一九九九年八月被禁止，因考量在肉内的殘餘物 。這些法案的結果是原已抑制的傳染病況更加流行，包含 :仔畜内的壞死腸炎；幼豬内因產氣莢膜梭菌引起的腸炎 ;豬隻痢疾與螺旋體腹瀉；以及與大腸桿菌相關的腹瀉。 參閱 Miller，United States Animal health Association, 1999 Proceedings “Antibiotic Usages in Food Animal Production and Resistance-European Perspective” o 每年有30,000人死於經醫院傳染之抗藥性致病原，但 是僅有少數人死於食物傳染之致病原。食物傳染致病原致 死實施例中沒有任何一個與抗生素抗藥性有關聯（參閱 Smith，同上）。因此，目前不清楚製肉工業界内抗生素的 使用是否引起造成人類在醫院感染抗藥性致病原的問題。 另一隱憂是缺乏新抗生素治療抗藥性致病原的感染。參閱 Henry, C.M., Chemical and Engineering News, March 6, 2000, pp41-58。此可能表示當重要抗生素的抗藥性致病原 產生時，可能沒有新的抗生素可供治療感染。研發新抗生 素的困難度、市場規模及規範議題似乎已經造成主要製藥 公司將其研究與發展的焦點自抗生素研發轉移開，特別是 針對在動物上的使用。新提出的動物用藥註冊規範極為嚴 格，造成研發中止。參閱Smith，同上。然而，有許多小公 司卻投入新抗生素的研發（Henry，同上）。 某些動物族群中，感染已是全國流行性的。舉例而言 ，鳥類球蟲病就是一種只能應付但非真正獲得控制的疾病 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ 297公釐） τ 裝 T·— (請先閱讀背面之注意事項再本頁) 訂 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1255189

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I 經*-一部智慧紂產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（4 ) 。實際上，所有鳥類都遭感染，且抗球蟲化學物質一般在 飼料中循環以控制災害，並限制抗藥株的發展。球蟲病造 成家禽養殖商每年損失及如沙利黴素之抗生素藥品醫藥花 費達三億五千萬美金。參閱Suskiw，USDA Agriculture Research Services News，October 28，1997。在一九九九年 ，經估計在美國每年約花一億一千四百萬美金於球蟲病上 。參閱Frost & Sullivan, U.S. Pharmaceutical Products for Food Animals，Report 5245-54，1995。 有一明確需求要找出嶄新而更有效的方法以控制集 中農場經營模式中成長的動物消化道内的感染。此一需要 是根基於獲得更好製造效率的要求，以跟上快速擴張的世 界人口。消化道内感染更佳的控制確保更快的生長速度及 增強的飼養效率。另外也需要動物生產上不同於抗生素使 用的方法，以顧及可能在人類致病原内發展的抗生素抗藥 性的憂慮。 當使用運作方式不同於所有抗生素之酵素為基礎的 治療時，便沒有呈現了類健康問題的刺激抗藥性致病微生 物演化的風險。既然酵素是蛋白質，便無如發生在某些抗 生素或抗球蟲病化學物質之危險化學殘餘物會進入肉製品 的可能性。參閱 American Feed Control Officials Inc·， Officials Inc.，Official Publication，1999，“Drugs and Feed Additives，section 30.0 Enzymes/9 pp.206-217, ISBN 1-878341-10-3 o 發明摘要 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） ---------批衣------IT------0 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1255189 五、 發明説明 本發明目的因此在提供 ^ 供種酵素療法，以降低消化道 琢&之影響。 本發明之另-目的在提供—機制，以降低消化道感染 之影響，其經由干擾致病原與消化道細胞結合。 本發明尚有另一目的在提供一種方法以提高重量辦 3 加與飼料轉換率，其關於遭致病原引起感染或壞死腸炎^ 染之動物。 本發明之進-步目的在提供一種藥物形式，適於口服 投用，其改善被微生物致病原感染或有感染風險之生物體 狀況極為有效。 除了上述或其他目的，根據本發明之一態樣，其亦提 供一種組成物，其包含⑴-可切割_鍵結之酵素，該鍵結 會致使一細胞表面蛋白質或醣類釋出，該酵素非為丨，4-石 -D-内切甘露聚糖酶，與⑼一生理上可接受之該酵素之載 劑，其中該組成物係呈一適於口服投用之形式，且不含非 為該酵素之抗感染劑。在一具體例中，所欲酵素可切割一 鍵結，而該鍵結會致使一細胞表面蛋白質或醣類釋出。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 較佳之具體例為包含於組成物中的酵素為一神經磷 脂酶或磷脂酶，特別是C型磷脂酶或D型磷脂酶。另一較佳 具體例為該酵素選自於由酯酶、腦誓脂酶及糖酶所構成之 群組中，該酵素可切割一鍵結之酵素，該鍵結會致使一細 胞表面蛋白質或醣類釋出。另一具體例為酵素製備自一蠟 樣芽孢桿菌arew)之一菌株，較佳為ATCC 7〇〇4 或ATCC 6464。除此外，該酵素可經由在巨大芽孢桿菌 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) M規格（210X297公釐） l255l89 A7 五 4 4 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 發明説明G ) 6 (如咖％价/·)内表現編碼有該酵素之重組型DNa 而獲得。另一具體例為此酵素包含於一明膠囊莢膜内，且 在飼料中之組成量為200 IU/Kg到4000 IU/Kg。 根據本發明之另一態樣，其係提供一種含有前述組成 物（1)及（ii)的組成物，其中生理上可接受之載劑為一種併合 有該酵素之食物。因此，該組成物可能為一動物飼料，其 不含非為該酵素之抗感染劑。本發明之動物飼料組成進一 步包含穀類物質，如玉米、高粱、小麥、大麥或燕麥，蛋 白質來源，如豆類或豌豆，及維生素、胺基酸及礦物質。 根據另外一態樣，本發明提供一種組成物，如上所述 ，為固態或液態藥物形式。 本發明更進一步提供治療或降低消化道感染風險之 方法，包含對一正罹患或有風險罹患感染之生物體，口服 投用一有效酵素量，以切割一會致使一細胞表面蛋白質或 醣類釋出的鍵結，其中酵素非為丨，‘石内切甘露聚糖酶 。此外，此方法不包含投用一非酵素本身之抗感染劑。此 感染可能受原生動物影響，如艾美球蟲屬（五與隱鞭 抱子 A M (Cryptosporidium)，細菌，如後菌屬（Clostridium) ，真菌類或酵母菌類致病原。 本發明更甚進一步提供一種組成物，其包含⑴一酵素 ，該酵素可切割一鍵結，該鍵結會致使一細胞表面蛋白質 或醣類釋出，與（ii)一生理上可接受之該酵素之載體，其中 該組成物係呈適於口服投用之形式，且不含除該酵素以外 之抗感染劑。 ¢------1T------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 9 1255189 A7 B7 五、發明説明（g ) 稱之為PI-PLC或1-磷脂醯肌醇磷酸二酯酶。另一例為糖笞 化峨脂酿肌醇專一填腊時D，或GPI-PLD。Low and Prasad， Proc. Natl· Acad· Sci· 85 : 980-984, 1988。

來源自真核細胞之GPI-PLD與PI-PLC酵素已有描述。 參閱 Low， “Degradation of glycosyl-phosphatidylinositol anchors by specific phospholipases” 第二章，pp 35-63，於 MOLECULAR AND CELL BIOLOGY OF MEMBRANE PROTEINS ： GLYCOLIPID ANCHORS OF CELL-SURFACE PROTEINS，A.J. Turner (ed·)，Ellis Horwood, New York, 1990; Low and Prasad, Proc. Natl. Acad. Sci. 85 : 980-984，1988; Essen et al·，Nature 380 : 595-602，1996;及Essen et al·，Biochemistry 36 : 2753-2762, 1997。來源自原核細胞之PI-PLC已有描述，其包含細菌於 胞外之生產。所有已知PI-PLC之細菌來源有蠟樣芽孢桿菌 (Stein and Logan, J. Bacterioil. 85 ： 369-381, 1963; Stein and Logan, J. Bacteriol. 90 ： 69-81, , 1965; Ikezawa et al.,

Biochimica et Biophysica Acta 450: 154-164，1976; Griffith et al·，Methods in Enzymology 197:493-502, 1991; Volwerk et al·，J. Cell Biochem. 39:3 15-325，1989; and Kuppe et al·， J. Bacteriol. 171 : 6077-6083,1989)，蘇雲金芽孢桿諂 (Ikezawa and Taguchi, Methods in Enzymology 71 ： 731-741, 1981; Japanese patent document JP 55034039)，金黃色葡萄 球菌（Low and Finean，Biochem J. 162 : 235-240，1977)， 及法微氏梭菌（Taguchi and Ikezawa, Arch. Biochem. 本纸張尺度適周中國國家榇準（CNS ) A4規格（2丨0X297公釐） -1 1 - (請先閱讀背而之注意事項再填寫本頁) •裝 -'ο 經濟部智达/財產局員工消货合作社印製 1255189 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明説明（9 ) Biophys. 186 : 196-201， 1978)。 PI-PLC酵素之改進的酵素定量技術係已以螢光受質 為基礎研發。參閱Hendrickson et al·，Biochemistry 31 : 12169-12172, 1992 ; Hendrickson, Anal. Biochem. 219： 1-8, 1994; Hendrickson et al., Bioorg. Med. Chem. Letters. 1 : 619-622, 1991 。 在未明確限定於任何理論下，本發明強調PI-PLC酵素 有能力切割磷脂醯肌醇糖脂固定之細胞表面蛋白質與其他 糖苷化罐脂醯肌醇。參閱Low，同上；Low and Saltiel， Science 239 : 268-275, 1988。舉例而言，許多原生動物寄 生蟲之各式表面醣蛋白與其他表面蛋白與醣類經由糖苷化 磷脂醯肌醇固定（GPI固定），且對PI-PLC消化與切割作用敏 感。上述之物種屬於血吸蟲屬、弓漿蟲屬、瘧原蟲屬、錐 蟲屬與利什曼原蟲屬（Low，同上），以及艾美球蟲屬、巴貝 蟲屬、泰累耳氏梨漿蟲屬、賈第蟲屬、細絲菌屬與内阿米 巴蟲屬。參閱McConville and Ferguson，Biochemical J· 294 :305-324，1993; Pearce and Sher，J. Immunol. 142 : 979-984, 1989; Sauma et al.5 Mol. Med. Biochem. Parasitol. 46 : 73-80，1991; Hawn and Strand，Mol. Med. Biochem. Parasitoi. 59 : 73-82，1993 o 此一細胞表面成分固定機制似乎普遍存於自酵母菌 至哺乳動物之真核細胞中。GPI固定出現在蘭伯氏賈第蟲 此被認為相當原始之真核細胞内，推測此種固定在真核細 胞中的演化相當早。與此一認知相呼應的是發現古細菌中 (請先閱讀背面之注意事項再 裝- 頁) 訂 線 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 12 1255189 經濟：邵智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（1()) 一種新 的磷酸 糖苷脂 GlcNal-6-myo-inositol-P-dialkylglycerol (Nishihara et al., J Biol· Chem· 267 : 12432-12435, 1992)，其為已演化出的許 多較複雜之真核細胞GPI固定結構的基礎。在原生動物中 ，GPI固定系統使用的情形比高等真核細胞多，且有證據 顯示GPI固定結構對寄生蟲生存於昆蟲與哺乳動物寄主内 極重要（McConville and Ferguson，同上）。舉例而言，各式 表面糖蛋白常出現的脫落現象可能就是一種避免免疫系統 攻擊的機制。 原生動物禽艾美球蟲含有磷脂醯肌醇固定結構，其類 似於布氏錐蟲的醣蛋白/醣脂。這些被認為對膜貼附與接 續的感染很重要。參閱 Gurnett et al·，Mol· Med· Biochem· Parasitol. 41 : 177-186, 1990。艾美球蟲結構會被錐蟲脂酶 及蘇雲金芽孢桿菌之PI-PLC切割（Gurnett，同上）。以PI-PLC 體内治療寄生蟲，如證實為可行，似乎能夠幫助寄主免疫 系統並干擾致病原進入消化道之貼附與感染。艾美球蟲屬 之物種對家禽工業為一普遍且耗費不貲的問題。另一原生 動物寄生蟲，微隱鞭孢子蟲，是一普遍且造成人類與許多 動物急性腹瀉病症。孢子體蛋白質，GP15/45/60,基於DNA 序列被預測為一 GPI連結蛋白質，且對此孢子體蛋白質之 單株抗體反應抑制感染（Strong，W.B·，et al.，Infection and Immunity 68 · 4117-4134，2000; Cevallos，A. M·，et al·，

Infection and Immunity 68 · 4108-4116，2000)。因此，微 隱鞭孢子蟲為另一種PI-PLC有潛力可治療的致病原。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） ---------批衣------、玎------^ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 13 1255189 A7 B7 五、發明説明L ) 原核細菌並不含經由磷脂醯肌醇固定之表面醣蛋白 及酶類（McConvi lie and Ferguson，同上），但是PI-PLC 依舊 能藉由干擾貼附過程以降低細菌感染。致病之大腸桿菌與 許多其他已知致病之腸桿菌科表現細菌黏蛋白FimH，其為 一種出現於繳遠端之29 kD甘露糖接合凝集素。Abraham et al·，Nature 336 : 682-684，1998。此黏蛋白已經證實結合 至肥大細胞之CD48,其為一GPI固定分子。參閱Malaviya et al·，Proc· Natl. Acad. Sci· USA 96 : 8110-8115，1999。以 PI-PLC體外消化降低一突變之GPI固定之白喉毒素（來自白 喉棒狀桿菌）受體結合至老鼠NIH3T3細胞。參閱Lanzrein et al·，EMBO J. 15 : 725-734, 1996。此外，敗毒梭菌 α 毒素 與嗜水氣單孢菌氣溶素皆會藉由一碳端GPI固定的方法貼 附至細胞表面，且能經由以PI-PLC處理而自細胞表面被移 除。參閱Gordon et al·，J· Biol. Chem· 274 : 27274-27280, 1999 〇 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 對PI-PLC降低細菌感染影響之機制關係到自寄主肥 大細胞釋出之CD48結合位置。此外，FimH結合至肥大細 胞會觸發發炎反應。因此，根據本發明，減少結合位置也 應該會減少發炎，其可能會成為腸道健康本身之負擔與傷 害’因為發炎反應牽涉到腫瘤壞死因子ex之釋放（Malaciya ’同上）。因此，根據本發明，透過此降低發炎之機制與腫 瘤壞死因子之基本釋放，磷脂酶療法應該會減緩病況特徵 如興奮性腸徵侯群、結腸炎與克羅恩氏病之症狀。參閱van Deventer S.J., Ann. Rheum Dis. 58(1) ： 1114-1120 本紙張尺度適用中國國家榡準（CNS ) A4規格（2l〇X297公羡)_ 1255189 經濟部智慧财產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（12 ) (November 1999) ° 同樣地，對抗病毒感染，藉由破壞病毒顆粒與病毒會 在體内感染之細胞的結合’本發明應該也有效。在本文描 述中，按照本發明之口服投用效率之發現，以磷脂酶C預 處理流感病毒是引人感興趣的，因其造成病毒填脂約有 50%被釋放，結果使雞胚感染率大幅下降。參閱Mizutani et al.，Nature 204 : 781-782, 1964。相反地，以自產氣莢膜梭 菌分離出的磷脂酶C預處理培養的雞胚母纖維細胞’顯著 的抑制Semliki Forest病毒之後績細胞感染。參閱Friedman and Pastan, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 59 · 1371-1378, 1968。當時知識無法了解這些現象中的治療重要性，事後 才知道，其與被認為隱於本發明背後之機制一致，意即， 致病原一表面配位子與/或其關聯細胞表面受體之切割， 擾亂了感染所需之交互作用。 本發明另一方面也許在預防病毒感染上有效，其藉由 消除病毒GPI固定蛋白質接合至可受感染細胞。對PI-PLC 消化敏感之GPI固定蛋白質之一例為登革熱病毒的NS1(無 結構蛋白 1)。參閱 Jacobs et al·，FASEB J 14: 1603-1610， 2000。許多實施例中寄主細胞GPI固定蛋白質為病毒之接 合位置。這些例子包含人類埃可病毒6、7、12與21以及腸 道病毒70,其結合至GPI固定之CD55 (衰退加速因子，DAF) 。參閱 Clarkson et al·，J· Virology 69 : 5497-5501，1995;

Bergelson, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 · 6245-6248, 1994 ;與Karnauchow et al·，J. Virology 70 : 5143-5152. 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇Χ；297公釐） 批衣 I 訂 I I線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 15 1255189 A7 B7 五、發明説明L ) 1996。犬細小病毒（CPV)感染可藉由膽細胞以PI-PLC預處 理而在體外阻斷。參閱 Barbies and Parrish, Brazilian J. Med. Biol. Res. 27 ： 401-407, 1994。 一些細胞表面受體，被推定對初期感染有重要性的， 是藉由非GPI固定機制貼附至膜上。這些包含如膽固醇酯 之結構（Rostand and Esko，J· Biol. Chem. 268 : 24053-24059，1993)，非磷酸化糖神經鞘脂質（Karlsson， Ann Rev. Biochem 58 ^ 309-350，1989)與其他如鱗脂酿乙 醇胺與罐脂絲胺酸之鱗脂。參閱Sylvester, Infect. Immun. 64 : 4060-4066, 1966 〇 因此，為了上述理由，針對該結構以具有釋放這些結 構活性之適當酯酶、腦誓脂酶，糖酶及磷脂酶，根據本發 明以口服投用時，應該有益於治療消化道感染。 依靠真核細胞磷脂醯肌醇連接之表面蛋白質與醣類 的普遍本性，本發明之治療方法，伴隨酵素之投用，急遽 地或預防性地，以切割如細胞表面蛋白質及/或醣類之固 定聯結，會發現其在控制原生動物、細菌、真菌、病毒之 消化道感染的廣泛應用。到目前為止，本發明之關鍵部分 為顯示一酵素，其不僅具有切割細胞表面成分之活性，且 能口服投用作為抗感染劑且在體内有效。值得注意地，雖 然一具代表性之適當酵素PI-PLC自1960年代起就已可獲 得，但此方法從未被提及。 本發明另一為酵素之用途，如上所述，以做為動物飼 料製備時之一種有效抗感染劑，以治療或降低因動物消化 本纸張尺度適用中國國家系*準（CNS ) Μ規格（210X297公釐了 (請先閱讀背面之注事項再本買) 裝-Ι 訂 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -16 - 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1255189 A7 B7 五、發明説明k ) 道感染而耗費飼料之風險。含有1，4-泠-D-内切甘露聚糖酶 之飼料製備法為已知，且一些報導也提出甘露聚糖酶之抗 真菌活性。參閱 WOOO/21381 (PCT/EP99/07835)與 Kudo et al·，Experentia 48 : 227-281，1992。這些實施例中，甘露聚 糖酶與一已知之抗生素合併，雖然在無抗生素飼料中使用 酵素之前景已曾普遍地被討論。Adams，Feed Mix (Special 2000)，頁16-18 。 因此，就一方面而言，本發明關係到之組成物，包含 食物組成，含有一酵素，其特徵在於以上提及之切割活性 ，其正非甘露聚糖酶，或更特定地，正不是1,4-/5-D-内切 甘露聚糖酶，舉例而言，已與具有不同切割專一性之甘露 聚糖相關酵素區別，其述於Enzyme Nomenclature 1992 (Academic Press)(參閱登錄號3.2.1.77、3·2·1·78、3.2.1.101 、3.2.1.106、3.2.1.130與3.2.1.137)。更進一步地，本發明 規劃一含有此類酵素組成物，涵蓋甘露聚糖酶，但不含其 他抗感染劑。 因此，根據本發明，獲自蠟樣芽孢桿菌且為PI_pLC標 準化之胞外酵素製備法，可以引起重量增加與飼料轉換率 在感染原存在下之大幅增加。此結果始料未及，因為蝶樣 芽孢桿菌為一投機性致病原，其一般造成食物傳染之胃腸 炎與蠟樣芽孢桿菌眼内炎。 早期研究報導將炭疽芽孢桿菌與蠟樣芽孢桿菌胞外 酵素注射入兔體子内，會引起磷酸鹽血症甚至死亡。舉例 而言，參閱 Stein and Logan，J· Bacteriol· 85 : 369-381，1963 本紙張尺度適用中國國家榡準（CNS ) A4規格（21〇X：297公釐） ! 1111 11 ΐ衣 I 11 I 111111 ^ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 17 1255189 A7 B7 五、發明説明 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 。因此’7人譯異的是，自-引起胃腸炎之致病原之胞外 酵素，按照本發明，對於一由細菌感染引起之疾病有治療 效果。 it樣芽孢桿g製造各式之細胞外膜活性酵素及嗟細 胞毒素，包含PI-PLC與CereolysinAB，由磷脂酶c與神經 磷脂酶組成。參閱 Gilmore，J· Bactedol. 171 : 744-753, 1989 。在之前提及之酵素製備中，一胞外磷脂醯肌醇專一磷脂 酶C [E.C.3.1.4.10]，係由蠟樣芽孢桿菌製造，係被認為是 一活性成分。本發明之酵素療法做為抑球蟲劑與抗生素均 有效。因此，特別是目前使用之物質被禁止時，本發明為 治療消化道感染有效且商業上可行之方法。 若未覆塗，酵素可能因胃部之胃液而不可逆的失效。 美國專利No· 4,079,125描述一改良的腸道用覆塗的含酵素 成分物以作為酵素失常哺乳動物之攝食用。令人驚訝地， 未覆塗之PI-PLC添加至動物飼料中結果在致病原感染上 有治療效果。 根據此發明，酵素組成物較佳化合為乾燥、固態或液 態口服成分。此成分一般會包含穩定劑，如緩衝液、糖及 /或甘油。乾燥而本身穩定之酵素化式，適於且按照本發 明以填入錠劑或膠囊，舉例而言，製備方式可為冷凍乾燥 於w體床乾燥器與無活性或糖類載劑進行喷霧乾燥或經 由與玻璃成型穩定劑結合之蒸發技術。參閱Frank et ai. Biopharm· 4: 38-55, 1991。另一方法涉及鹽類沉澱，例 如硫®^知丨儿瓜或/谷劑沉殿，同時加入丙網以成粉狀，接 本紙張尺^^國國家標準（CNS ) M娜（21GX297公餐）- ------ (請先閱讀背面之注意事項再頁 -1 I 1 · -裝· 線 18 1255189 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明L ) 著乾燥並與載劑攪拌。 某些醣類’特別是單聽、雙酶與低級募酶，均為重要 之玻璃成型醣。做為載劑使用醣類之例為木糖、果糖、山 梨醇與麥芽三糖，其他的述於Franks，同上。一糖類載劑 之選擇係基於與酵素之相容性、低收濕傾向與較佳之玻璃 轉相曲線。穩定劑_蜜糖特別穩定於製造雙性溫度穩定生 物製劑。參閱美國專利No. 4,891，319 ; Roser，Biopharm. 4(8) • 47-53，1991，Colaca et al·，Bio/Technology 10 : 1007-1011， 1992, Aldridge，Genetic Engineering News，March 15，1995, ppltMl 〇 為本發明所用之酵素可化合成液體，例如與山梨醇或 甘油混成糖漿以降低水活性並穩定蛋白質。於藥學使用之 前，此溶液經標準過濾除菌。 如前所註，本發明於一方面關注於酵素做為飼料或食 物成分之投用。飼料之組成主要為穀類物質、一蛋白質來 源、維生素、胺基酸及礦物質。榖類物質典型上包括玉米 、高粱、小麥、大麥或燕麥。蛋白質來源，舉例而言，可 能為豆類或豌豆。典型的礦物質、胺基酸與維生素包含Bi2 、維生素A、泛酸、菸鹼酸、核黃素、維生素K、DL_甲胺 酸、L-離胺酸、氣化膽鹼、葉酸、磷酸二鈣、磺酸鎂、硫 酸鉀、碳酸鈣、氣化鈉、硒酸鈉、氧化亞錳、碘酸鈣、氧 化_、氧化鋅及D-活性動物類固醇。 為用於飼料，液態酵素化式可以鹽水製備（如氣化鈉， 15-18% w/w)，或糖漿以降低水活性且防止微生物生長於凝 ---------装------訂------線 (請先閱讀背面之注意事項存填寫本頁) 19 1255189 A7 ___B7 五、發明説明L ) 聚之產物中。其他用於飼料之防腐劑，如苯曱酸鈉、羥苯 丙酯、山梨酸鈉或山離酸鉀及抗壞血棕櫚酸為改進之化合 防腐劑之例，其可用於防止微生物生長於產物中之潛藏的 破壞。參閱 Association of American Feed Control Officials, Inc., Official Publication 2000， Part 18? “Chemical Preservatices” pp215-217，ISBN 1-878341-11-1。這些防腐 劑可經自動化喷出技術大量稀釋之後製錠過程而應用於飼 料中。參閱Fodge et al·，Feedstuffs，September 29，1997。 如相容的話，此液態製備可能包含穩定糖如山梨醇或甘油 。飼料組成物中所需之礦物質，如其他受熱不穩定之酵素 或維生素可能被包含其中，以增加效率。 於飼料應用於非藥丸之糊狀（即非熱處理）實施例中， 本發明所用酵素可被提供為一乾燥濃縮體，以添加於飼料 混合物中。此類乾燥酵素濃縮體可經由第一次濃縮液態酵 素製備物以製備，使用一 10Kd NMWC或其他可用之超濾膜 ，以達一高百分比之酵素含量，隨後經由與一非常乾燥之 載體攪拌，如玉米磨光粉、大豆磨光粉或甚至證實可用於 飼料之無活性物質或不溶鹽類。參閱Official Publication， American Feed Control Officials,同上，Part 582, “Substances generally regarded as safe in animal feeds”。 有許多技術可用於生產足夠安定之酵素以承受某些 飼料磨製之製丸過程，但是在低溫下保留足夠之活性，以 在消化道產生作用。已知修飾過之蛋白質結構，主要透過 改變DNA序列編碼，或次要透過化學修飾，使酵素能更穩 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） Ί^衣；-- (請先閱讀背面之注意事項再本頁) 訂 線 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 20 _ 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1255189 A7 _B7_ 發明説明“） 定以抵抗失活性。在此考量下一方式為酵素結晶化學交聯 之使用。參閱Collins et al·，Organic Process Research and Development 2(6) : 400-406，1998。另一方法以增加本發 明酵素之穩定性，為經由攜帶有興趣之編碼為該酵素之基 因的突變而改變胺基酸，或獲得基因或部分基因之重組。 參閱 Crameri et al·，Nature 391 : 288-291，1998; Arnold， Nature Biotechnol. 16: 617-618，1998b; Zhao et al·，Nature Biotechnol. 16 : 258-235, 1998; Zhao and Arnold, Protein

Eng. 12 : 47-53, 1999。為了酵素帶有所需特性的「直接演 化」之突變與篩選方式亦可行。舉例而言，參閱Giver et al·， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 ： 12809-12813, 1998; Liao et al·，Proc· Nat’l Acad. Sci. USA 83 : 576-580, 1986; Cherry et al·，Nature Biotechnol· 17 : 379-384，1999 o 某些蛋白質修飾，包含糖化、磷脂醯乙醇胺糖化與琥 珀酸化也可加強穩定度並改變酸鹼最適值，成為本發明使 用之酵素最適化後之特性。因此，已知之步驟可在此考量 下被採用於製造修飾之蛋白質，根據實施例，做為測試治 療方法中估量可適度。 一 PI-PLC之生產有效方法來自於蠟樣芽孢桿菌基因 選殖至巨大芽孢桿菌。表現系統（Rygus and Hillen，Appl· Microbiol. Bacteriol. 35 : 594-599，1991)使用來自巨大芽孢 桿菌木糖調控子基因（Rygus et al·，Arch· Microbiol. 155 : 535-542，1991)而在商業上可獲得自 BIO101 Corp.(Vista California)。PI-PLC基因之引導編碼序列與巨大芽孢桿菌 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） ---------批衣------1T------0 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 21 1255189 A7 B7 五、發明説明) xylA基因前三個胺基酸間之接合基因，位於一由抗四環黴 素基因穩定且由木糖反應抑制子控制之質體中。此類之菌 株，帶有放大表現，提供一可行方法以產生商業上可用量 之PI-PLC，以根據本發明併入動物飼料中。 一些蠟樣芽孢桿菌分離菌株產生如膜黴素之抗生素 。參閱 Kamogashira et al·，Agric. Biol. Chem· 52 : 859-861， 1998。其他蠟樣芽孢桿菌之分離菌株（ATCC 53522)述於美 國專利No. 4,877,738與No. 5,049,379，係做為生物控制劑 以防止植物之腐爛與枯朽。此效果相信起因於兩種抗生素 之作用，命名為兩性黴素，其為一 396 Dalton之線性胺多 醇，以及「抗生素B」，一種胺基苷。於下詳述之實施例中 ，涉及此二種抗生素可能性之排除，係經由去除可能來自 酵素製備之低分子量抗生素。 特殊的是，一不含細胞之發酵培養基之濃縮，係經由 一帶有10Kd分子量阻斷膜之方法。含有大於10 Kd蛋白質 之濃縮物，用於進一步之步驟。小分子量抗生素，如述於 Handelsman，同上，能通過此遽膜。更甚者，硫酸錄沉澱 可應用於沉澱高分子量蛋白質，使低分子量蛋白質留於液 體中。在硫酸銨沉澱重新溶解後，產物之酵素溶液再透過 緩衝液透析，仍是另一種去除低分子量抗生素之處理方法 。最後，蛋白質再以硫酸銨沉澱第二次，以排除任何低分 子量物質殘餘在溶液中。 這四種處理方式之結合使用強烈阻斷一可能性，即觀 察到之抗菌效果係起因於由ATCC 6464或ATCC 7004製造 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再本頁) -裝· 訂 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 22 1255189 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明L ) 之低分子量抗生素。發酵培養基亦以經一大腸桿菌測試株 測試抗生素之表現，但無測得抗生素活性。 本發明於下之進一步描述，係參考以下描述之實施例 〇 f施例一蠟樣芽孢桿菌ATCC 6464與ATCC 7004冷凍庫 存培養之製備 開啟自ATCC之冷凍乾燥細胞瓶並接種至一種培養基 中，其組成為Amberferm 4015 (Red Star) 10g/L，Amberex 695 (Red Star) 5g/L與氣化鈉 5g/L，pH 7.0，培養於3(TC。 初培養於LB平板培養基上畫盤，產生之單一菌落再接種回 一置於250 mL屏障架培養瓶之20 mL種培養液中，於30°C 震盪培養。當培養密度達到OD6〇()讀數為1.5時，加入無菌 甘油至約10%(v/v)，且含1.8 mL培養之瓶冷凍於-80°C。 實施例二生產磷脂醯肌醇專一磷脂酶C之蠟樣芽孢桿菌 ATCC 6464與ATCC 7004單離株之培養 二個各為30升之Biostat C醱酵槽批式於自來水中含以 下成分之培養基：Nutrient Broth No. 2 (Oxiod)25 g/L，膜 蛋白胴（Difco)lO g/L，酵母浸膏（Difco) 10 g/L與每升中含 O.lmL之Mazu DP10P Modi 1止泡劑（BASF)。最初批式體積 為9.5升，培養液於121°C滅菌40分鐘。最初pH於滅菌後以 氨氣調整至7.0。 種培養係製備於4升屏障架震盪培養瓶内的500 mL相 同培養基中，其附有貼附矽膠管以與接種用聯結器之吸氣 機聯結（Bellco)。以1.8mL之製備自ATTC運來（實施例一） 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） ---------装------1T------^ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 23 1255189 A7 B7 五、發明説明 之冷/東種培養接種前’培養瓶先於滅菌鋼中以121 °c滅菌50 分鐘。種培養瓶培養於一控制環境之培養震堡箱中（Nb s G-25型）以200 RPM在30°C下震盪培養5.5小時。在接種之前 ’ ATCC 7004培養 〇D600值為 1.53，而 pH為 6.58。ATCC 6464 培養OD_值為1.28，而pH為6.79。 500 mL種培養接種至一 30升醱酵槽内，並在以下條件 下操作：溫度30°C，混合速度600 RPM，空氣流量每分鐘 10升，壓力為0.5 Bar。初始培養之OD^o為〇·81。六小時後 ，醱酵停止，終OD_為 22.1 (ATTC 7004)與24.2 (ATCC 6464)。潑酵進行時並未控制pH，而終pH為8.17 (ATCC 7004) 與8.13 (ATCC 6464)。將培養液自醋酵槽中移除，並在進 行下一步步驟前冷卻至8°C。 醱酵槽進行第二次培養時使用之步驟與兩種ATCC纖 樣芽孢桿菌單離株完全相同。此實施例中，種培養在六小 時之OD6〇〇為 2.86 (ATTC 7004)與 1.98 (ATCC 6464)，pH為 6.69 (ATCC 7004)與6.65 (ATCC 6464)。主醱酵進行6·5小時 ，終 〇D600 為 35.9 (ATTC 7004)與 33.6 (ATCC 6464)。在冷 卻時之終pH為 8.38 (ATCC 7004)與 8.47 (ATCC 6464)。 實施例三經過濾之細胞移除與PI-PLC酵素之濃縮 細胞自描述實施例二中之四個醱酵組中移除並沖洗 ，其係使用二根A/G Tchonology (UFP-500-K-6A) 3 mm空 心管500,000分離分子量（500 Kd KMWC)濾膜各端相接。 冷卻之培養液以每分鐘大約2升的速度以蠕動幫浦泵過濾 膜，並回收至控存儲槽中。含有酵素之滲透物收集於冷卻 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 請 先 閱 讀 背 面- 注 意 事- 項 再 頁 裝 訂 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 24 1255189 A7 B7 經 濟 -部 智 慧 -財 產 局 員 X 消 費 合 作 社 印 製 五、發明説明 於冰上之儲槽中。最初體積約9升之含細胞的培養液被濃縮 至約2升，此時開始以pH8_5之10mMTris-HCl超透析過濾 。在收集到總體積約14升之滲透物後，便終止細胞沖洗。 500Kd滲透物（每個醱酵槽約14升）係以二根A/G Techonology (UFP-10-C-4XTCA) 10,000分離分子量濾膜 (10 Kd)之0.5 mm空心管濃縮。除了丟棄滲透物外，使用相 同之濃縮物回收泵法。自各醱酵槽所得之終濃縮物體積約 為500 mL，將之儲存以為下一製程步驟。 實施例四PI-PLC之進一步純化與濃縮 獲自各蠟樣芽孢桿菌醱酵之l〇Kd超濾濃縮物（實施例 主）以硫酸銨將飽和度調至80%，並在冰上混合60分鐘。溶 液以Sorvall GSA轉子在6000 RPM離心15分鐘。上清液丟 棄，沉澱溶於最少體積之10mM Tris-HCl與0.2mM EDTA (ρΗ7·5)，並以相同緩衝液於低溫下透析。 各濃縮物内蛋白質量之測量，係使用一種染劑結合定 量法（BioRad)，PI-PLC 等級之測量（Hendrickson et al·， Bioorg. Med. Chem. Letters 1 : 619-622，1991)，則使用一 種基於高效能氣相色層分析之測量方法與螢光受質 (Molecular Probes, Inc.，P-3764，1·芘丁基-肌醇 _1-鱗酸酯 ，鋰鹽）。表1於下總結此定量之數據並預測大約純度與在 純酵素時獲自四製備之各別總酵素量。酵素製備物冷凍存 放於-20°C直至進一步加工處理。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X297公釐） ---------装------1T------0 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 25 1255189 A7 B-7 五 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 發明説明L ) 表1· PI_PLC粗碑素製備分析之總結 酵素 製備 ATCC 菌株號 蛋白質 mg/L 比活性 U/mg1 製備物中 之蛋白質 估計之 純度％2 --—___^ 純酵素時之 Π-Ρΐχ 總 mg 1 7004 1.86^ 1.75 __325 2.92 —------— 9.49__- 2 6464 1.44 0.52 ^J45 0.867 2 99 一 3 7004 1.35 4.42 __208 7.36 15.3___ 4 6464 2.06 1.72 256 1.95 Ί裝：-- (請先閱讀背面之注意事項再本頁) ιυ=單位=1微莫耳/分 2係基於假設100%純蛋白質有60 U/mg之比活性（Hendrickson，同 上卜 應用於動物飼料前之酵素製備物集中與濃縮 酵素製備物1、2、3與4集中後總體積為675 mL。硫酸 銨（492克）緩緩加入且溶液置於冰上混合數分鐘。溶液經離 心後收集沉澱物。沉澱部分溶於最小量之20 mM磷酸緩衝 液(pH 7.0)。 產生之溶液體積為7〇·9 mL，密度為1.057 grams/cc。 蛋白質濃度經測量約為25.5 mg/mL。PI-PLC活性經測量約 為M3 U/mg，PI-PLC估計之純度約在1.88%。溶液整個地 冷凍於-20°C，隨後解凍並用於均等地處理200磅之雞飼料 線 〇 實施例六巨大芽孢桿菌内臘狀芽胞桿菌PI-PLC基因之選 殖與表現 編碼為磷脂醯肌醇專一磷脂酶C(PI-PLC)之基因已被 定序。參閱Kuppe et al·，J· Bacteriol· 171 : 6077-6083, 1989 。使用聚合酶連鎖反應，PI-PLC基因可自臘狀芽孢桿菌 (ATCC 6464)染色體DNA中選殖出來。使用之載體為一巨 大芽孢桿菌所用之表現載體，pMEGA (BIO 101，Vista，CA) 。兩條聚合酶連鎖反應之引子’意即’ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 26 1255189 A7 B7 14 Φ 五、發明説明 5’-GACTAGTAATAAGAAGTTAATTTTG-3，（弓| 子 1)與 5’-0000入丁(：0八丁八丁丁0丁丁00丁丁八丁丁00-3，（弓|子2)設計為 在引子1有Spel而引子2有BamHI之限制酶切位置。 聚合酶連鎖反應放大之PI-PLC基因連接入pMEGA之 Spel-BamHI位置且產生一質體pCG682°PI-PLC蛋白質與在 表現載鱧内Spel位置之xylA基因產物的前三個胺基酸接合 。PI-PLC基因的表現受xylA啟動子的調控。震盪培養瓶醱 酵係做為估量巨大芽孢桿菌内磷脂醯肌醇專一磷脂酶C的 產量。含10/zg/mL四環黴素（20 mL)之LB培養基以0.2 mL 之種培養接種，並於37°C震盪箱中以250 rpm培養。在OD600 值約0.5時加入5 g/L之D-(+)·木糖以誘導xylA之啟動子。三 小時後，經離心收集上清液。經由螢光受質法測量磷脂醢 肌醇專一罐脂酶C活性（Hendrickson，et al·.，Biochemistry 31 : 12169-12172，1992; Hendeickson，Anal· Biochem. 219 :卜8，1994)，其使用1-芘丁基-肌醇-1-磷酸酯受質 (Molecular Probes，Eugene，OR)並經由高效能氣相色層分 析測量。 表2. PI-PLC表現之測量 ---------^------、訂------0 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 測試材料 木糖之 添加 比活性 (單位/毫克蛋白質） 細胞溶解產物部分 巨大芽孢桿菌/PCG682 — 0 巨大芽抱桿菌/pCG682 + 0.436 巨大芽孢桿菌/PCG682 — 0 巨大命抱桿菌/pCG682 + 0.365 醱酵培養液部分 巨大芽孢桿菌/PCG682 — 0 巨大芽孢桿菌/PCG682 + 4.087 巨大芽孢桿菌/PCG682 一 0 巨大芽孢桿菌/PCG682 + 4.56 度適用中國國家標準(CNS ) Α4規格（210X297公釐） 27 1255189 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A? B7五、發明説明^ ) 這些數據顯示PI-PLC位於細胞外且僅在D-(+)-木糖添 加後才表現（表2)。此重組菌株之產率（mg/L/OD)經估計至 少為實施例二中所培養之野生種平均之15倍。 實施例七生產PI-PLC用之巨大芽孢桿菌醱酵 述於實施例六之巨大芽孢桿菌/pCG682係做為經醱酵 生產之PI-PLC。做為種與醱酵階段之培養基（PM)包含20 g/L Amberferm 4015 (Universal Flavors Bionutrients, Indianapolis, IN)，10 g/L Amberex 695 酵母浸膏 (Universal Flavors Bionutrients, Indianapolis, IN) 5 10 g/L NZ Case Plus (Quest International, Hoffman Estates, IL), 2.0 g/L K2HP04,0.1 g/L MgS04.7H20與初始為 2·0 g/L之葡 萄糖與12.5 g/L之四環黴素。酸鹼值調整至7.5。 種階段（500 mL於2.8升屏障架培養瓶中）起始於接種 自一冷凍之種瓶，並在30°C下以250 RPM震盪。種瓶之製 備係將生長於LB培養平板之單一菌株加入在250毫升震盪 培養瓶内之20mL PM培養基中。在30°C培養至〇D60()約為 1.0後，50%之5 mL無菌甘油加入、混合且平均分裝至2 mL 塑膠無菌瓶内，並冷凍在-60°C中。 經9小時震盪培養至〇d6〇〇 nm約1.2至1.8之後，使用 500 mL之種培養瓶。二個培養瓶都做為60升醱酵槽佈種用 ，其内填滿50升相同蒸氣殺菌之培養基。四環黴素經過濾 除菌（0.2微米濾膜），溶在40%乙醇中成為1%溶液，在滅菌 後加入並冷卻至30°C。在醱酵槽中，添加0.1 mL/L之Mazu DF10PMOD11止泡劑（BASF，Gurnee，IL)至起始批次組中 (請先閱讀背面之注意事項再本頁) 裝·

、1T 線 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 28 1255189 經濟一部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明Q ) ’並依需要添加以控制醱酵中之發泡。第一醱酵槽種階段 之操作條件如下：壓力〇·5至2.5 psig ;溫度30°C ±0.5°C ;攪 拌速度200至450 RPM;噴入空氣25至50 SLPM;溶氧度> 25%。酸驗度以21.25% H3P04或5N NaOH控制在6.9至8.1 。當O.D_達到8-10時，内容物佈種於一含425升相同培養 基之600升醱酵槽中。 600升生產醱酵槽之操作條件如下：壓力〇.5至2.5 psig ;溫度30°C±0.5°C ;攪拌速度1〇〇至300 RPM;喷入空氣250 至500 SLPM ;溶氧度>25%。酸鹼度以21.25% H3P04或5N NaOH控制在6.9至8.1。當初始葡萄糖在5小時後耗盡且 OD_約17時，木糖供給（經滅菌鍋在121 °C預先滅菌20分鐘 且含10 kg D_(+)·木糖與1〇升的水）便開始進行。木糖係 獲自Varsal Instruments，New Jersey。供給速度起初開始為 25 mL/min並持續1.5小時，隨後增加至43 mL/min。第二階 段速率持續至所有22·5升之木糖供給均耗盡為止。溶氧度 之持續係經由增加喷入空氣50 SLPM增加至500 SLPM。一 旦空氣流量在500 SLPM，每分鐘的轉速便提高。醱酵在第 20小時終止。第17小時時，便會累積7440 U/L(單位定義同 實施例四）。 醱酵培養液之收取係使用一 Pall Filtron CIO Skid與四 個 CellFlo Microgom 搶（膜孔 0·2μηι，直徑 Ιμιη 面積 3.3 m2 之 fiber)。通過0·2μιη膜滲透物係使用一LT100 Pall Filtron Skid與一 AG/Technologies Size 85 10 K之超濾膜濃縮。最 終濃縮物鱧積為10升並冷凍在-20°C。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇X297公釐） ---------t衣------、玎------^ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 29 1255189 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明説明L ) 實施例八蠟樣芽孢桿菌醱酵培養液未含抗生素活性 蠟樣芽孢桿菌（ATCC 7004)之醱酵根據述於實施例二 之方法進行，除了初體積增至20升。抗生素存在測試之進 行，以大腸桿菌MG1655為測試菌株，與最終醱酵培養液 或根據實施例三至五之方法製備部分純化之PI-PLC。測試 之進行以圓柱平板測試。參閱Brantner，Pharmazie 52(1): 34-40, 1997。在含有酵素樣品之圓柱周圍，並未發現指示 抗生素活性之乾淨區域。 實施例九以微量滴定平盤螢光定量之PI-PLC定量 一改進之PIPLC生化測試係研發自使用於實施例四之 Hendrickson et al.(同上）方法。受質4-甲基-7-經基香豆素-肌醇-1·填酸酯，N-甲基-嗎琳鹽得自Biosynth (Naperville, Illnois)。反應於一購自 MTX Lab System (Vienna，Virginia) 之Fluorescan II螢光微量滴定平盤讀數計内觀察紀錄。醱酵 培養液或酵素濃縮物之定量，200 μ L之反應進行於黑色 塑膠微量滴定平盤中，其内含1〇111]^丁1^-11(：1，0.16%脫氧 膽酸，0.8 mM 4-甲基-7-經基香豆素-肌醇-1_填酸S旨，Ν-甲 基-嗎啉鹽，與pH為8.0之稀釋酵素。酵素若需稀釋則配製 於溶於水之0.1% BSA溶液中。反應接著於37°C進行30分鐘 ，每間隔二分鐘紀錄一次以觀察自受質釋出之甲基-7-羥基 香豆素，激發光波長350nm，放射波長為450nm。 螢光單位與甲基_7_羥基香豆素微莫耳之關聯係用於 計算單位酵素溶液量加入時形成的單位（每分微莫耳）。在 pH 8.0之反應為酵素酸鹼最適值與甲基-7-羥基香豆素最大 Ί裝：-- (請先閱讀背面之注意事項再本頁) 訂 線| 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 30 1255189 五 ΊΤ 經濟部智慧对產局員工消費合作社印製 Α7 Β7 發明説明k ) 螢光（pH 10)之間的折衷值。此外，在pH 9.0或以上非酵素 性的甲基-7-羥基香豆素釋放速率會變得顯著。在此測試條 件下，比活性（單位/毫克）約比使用Hendrickson et al·(同上） 方法時高出39.3倍。為了測試於動物餵食實驗中之效率目 的，此定量法測得之單位會轉換至等量之Hendrickson單位 ，以利與本定量使用前之第一次測試比較。 實施例十動物飼料中添加有效藥量之PI-PLC定量 以更敏銳的4-甲基-7·羥基香豆素-肌醇-1-磷酸酯，N-甲基-嗎啉鹽變化形為基礎之PI-PLC定量（實施例九）設置 之目的，在測量酵素在添加至動物飼料後涉及定量用之pH 值，及定量螢光用之另一 pH值。酵素萃取自重4克之飼料 測試材料中，並加入20 mL之10 mM Tris-HCl (pH 7.5)，以 及0.1 %脫氧膽酸，以製成20 g/L之飼料。此漿物在室溫下 以 250 RPM於NBS G-25 震盪器（New Brunwidk Scientific) 中震盪一小時。漿物置於1.5 mL離心管中以13,000 RPM在 IEC Micromax離心機中離心。萃取物適當稀釋在0.1 % BSA(牛血清球蛋白）中。萃取自含10 U/lb飼料之樣品則不 稀釋。 反應第一步一離心管之設置如下。在1 : 100與1 : 200 稀釋之0.12 U/mL PI-PLC(單位定義同實施例四）標準液與 一空白樣品也應該包含其中。樣品反應時需以錫箔紙覆蓋 以使受質不受光照。 20 //LTris-HCl，0.10M，pH6.0 40 //L 脫氧膽酸（0·8°/〇) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） ---------装------1Τ------^ (讀先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 31 1255189 A7 B7 五、發明説明L ) 40 //LPI-PLC 受質（4mM) 100 # L酵素_ 200 # L /管總體積25°C下反應 二時間點之時（30分鐘與60分鐘）各反應取出0.1 OmL。 反應液在65°C加熱15分鐘以終止酵素反應並在冰上冷卻。 最後，樣品在離心機中以12,000 RPM離心5分鐘。 螢光劑讀數一120#L之0·10 M Tris緩衝液（pH 8.0)加 入黑色塑膠平盤内之微量滴定井中，隨後80# L之反應樣 品再於讀取前加入，如實施例七所述。背景控制值已扣除 。計算每分鐘螢光單位產生之速率。螢光單位轉換成反應 產物之微莫耳數，且計算出萃取自每原始磅數飼料之酵素 單位。

實施例十一以致病原感染之雞餵食測試 I.仔雞餵食測試I 最初之餵食測試以一天大之雄仔雞進行。典型一致「 起始餵食」之雞飼料食物，經設計達到或超過國家研究委 員會之Nutrient Requirements for Puoltry (9th ed·， 1994)，製備並以糊狀餵食。雞分入四組不同處理組之籠内 (地面空間為12吋X 12吋），每處理組重複四次且每籠重複 實驗内均有六隻雞（表3)。水與飼料於21天測試期間中無限 制提供。將雞分配入籠子與籠子分配成處理組係採用隨機 區塊設計。所有籠子、餵食器與給水器在測試開始前均清 理過。白熱燈光照連續不輟（每天24小時）。體重在第1天與 第21天決定。食物消耗量在第21天測定。 第5天時，所有的雞均經由口服強飼使每隻雞感染叢 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） ^---ί— —I (請先閱讀背面之注意事再本頁) 訂 線| 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 32 1255189 A7 B7 五、發明説明<3Q ) 艾美球蟲200,000個卵。在第7天，所有的雞再透過水供給 以5 00,000產氣笑膜梭菌進一步感染。在負控制組（T1)中 ，沒有任何感染之處理。在正控制組（T2)中，球蟲與抗生 素均添加至飼料中。其為抗球蟲治療Sacox (60 g/ton之沙 利黴素）及抗生素BMD-50(50g/ton)。對處理組T3與T4，野 生種PI-PLC酵素處理之飼料（在純酵素時約0.34克之 PI-PLC)，在口月艮強飼叢艾美球蟲第5天時開始使用。所有 飼料都製備在一致之批次槽中，隨後依添加之抗生素（測試 組T2)或酵素（測試組T3與T4)分開。雞隻體重分析結果見表 4,且餵食/增重之計算見表5。 批衣 1-ί ϋ ^ 11 ϋ 111 ^ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 表4.第21天時之平均體重（克） 重複次 處理 T1 T2 T3 T4 1 323.00 341.67 377.83 366.67 2 326.67 321.33 383.83 361.17 3 299.33 337.33 378.83 361.33 4 211.67 254.00 374.33 403.40 平均 290.17 313.58 378.71 373.14 STAT b b a a 標準差 46.52 35.22 3.40 17.61 變異值 16.03 11.23 0.90 4.72 表5.平均飼料轉換率（0-21天）修正為存活雞隻體重 表3.仔雞餵食測試I之實驗處理 測試 組# 測試描述 測試材料 重複 次數 每次重複 雞數 T1 負控制 無 4 6 T2 正控制 球蟲與沙利黴素處理 4 6 T3 PI-PLC野生種 0.34克/噸(純酵素） 4 6 T4 PI-PLC野生種 0.34克/噸(純酵素） 4 6 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 33 1255189 A7 B7 五、發明説明L ) 重複次 _ 處理 T1 T2 T3 T4 1.486 1.569 1.407 1.445 2 1.562 1.532 1.423 1.421 3 1.524 1.562 1.432 1.406 1 n·11·1· 1.760 1.462 1.438 1.404 平均 1.583 1.531 1.425 1.419 STAT •欢必 ------ b b a a 標準差 0.11 0.04 0.01 0.02 變異值 6.68 2.78 0.82 1.17 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 在二接續之表中，各列無一般字母之平均值為顯著差 異（P<0·05)，各Duncan’s測試為顯著。 II·仔雞银食測試II 第二傲食測試以一天大之雄仔雞進行。基準食量設計 為超過國豕研究委員會之Nutrient Requirement for Poultry (9th Ed.，1994)，並製備成糊狀以確保一致性。在 盲目測試為基礎上，研究以隨機組籠進行，以測試天然來 源堰樣芽抱桿菌（野生種PI_PLC)或重組巨大芽孢桿菌 PI-PLC在雄仔雞飼養至第2丨天大時之效果。天然來源也包 含其他細胞外酵素但是自巨大芽孢桿菌製備之PI_PLC經 高度純化且經由使用3〇-Kd NMWC膜超過濾以進一步純化 。雞隻在第八天大時感染以鳥類球蟲（經由飲水給每隻雞 200,000叢艾美球蟲卵），且在第十天大時感染以產氣莢膜 梭菌（經由飲水給每隻雞1 〇〇,〇〇〇個）。九組測試（表6)之各組 均有十次重複或籠。各籠含6隻已接種疫苗 (Newcastle-Bronchitis，Mareks)之Cobbx Cobb雄仔雞，籠内 空間為每隻雞有0.40平方英呎。死亡仔雞，如有出現，第8 (請先閱讀背面之注意事項再1m本頁) •裝_ 、11 線| 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 34 1255189 A7 B7 五、發明説明L ) 天後就不再替換。飼料在整個測試期間（第〇至第21天）在無 限制供應基礎上以糊狀餵食。 一普通且未處理之不含抗生素基本糊狀飲食自第〇天 至第7天餵與所有的雞隻。此後，在自第8-21天大時餵食9 種處理過之糊狀食物。基礎飼料為一典型之仔雞起始飼料 ，含22%粗蛋白質與1400 kcal/lb之ME(可代謝之能量内含 物）。 ---------批衣------、玎------^ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 蟲卵，在第10天時 每隻雞經由飲水投予1〇〇,〇〇〇個產氣莢膜梭菌。 表7.仔雞餵食測試II 測試 1 2 3 4 5 6 7 8 9 表6.仔雞餵食測試II之測試處理 處理 測試内容 感染測試1 T1 無 + T2 桿菌太亞甲基二水楊酸酯（BMD，50 g/ton) 與沙利黴素(Sacox，60 g/ton) + T3 產自巨大芽孢桿菌之重組Π-PLC (3 U/lb) + T4 產自巨大芽孢桿菌之重組Π-PLC (10 U/lb) + T5 產自巨大芽孢桿菌之重組PI-PLC (30 U/lb) + T6 產自巨大芽孢桿菌之重組H-PLC (90 U/lb) + T7 產自蠟樣芽孢桿菌之PI-PLC (10 U/lb)與其 他細胞外酵素 + T8 無 無 T9 產自巨大芽孢桿菌之重組H-PLC (90 U/lb) 無 1每隻雞於第7天時經由飲水投予200,000個叢艾美球 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -35 - 1255189 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 、 尺五 紙 發明説明（33 感染 + + + + + + + —— — 投藥 — + PI-PLC 型 重組1 重組i 重組1 重組1 野生2 重組1 標的U/lb — — 3 10 30 90 10 — 90 平均測量 之 U/lb 0.36 0.32 0.323 0.71 1.74 5.96 2.46 0.12 5.94 8-21天增 加之體重 307.72 338.83 323.24 324.78 320.64 328.29 298.98 324.12 338.8 cd ab be ab be ab D Ab a 8-21天飼 料轉換率 (經校正） 1.859 1.642 1.702 1.732 1.699 1.739 1.876 1.651 1.650 C a ab h b ab b C A a 平均腸道 損害評分 1.447 0.833 1.120 1.133 0.842 0.808 1.267 0.983 0.847 1 土， 一 d A be be a a Cd ab a ^野生PI_PLC產自蠟樣芽孢桿菌 3此PI-PLC添加量仍太低以至於無法有效萃取並於本實 驗中測得，因而以背景值呈現 在第一組測試中，當細菌感染透過飲水投予時（實施例 1M) ’在各種條件下，得自蝶樣芽孢桿菌之野生Pi-PLc效 果與沙利黴素+ BMD處理效果相當或更好（表4-5)。在以重 組PI-PLC(實施例丨丨^卜表7)測試列於上之後者實驗中，以 各種不同濃度添加之PI-PLC顯示一與藥量有關之效果，其 降低腸道損害評分與飼料轉換率（T3-T6)並提昇增加之體 重。此外’以90U/lb重組PI-PLC處理而沒有沙利黴素+ BMD 處理時’亦降低腸道損害評分且對飼料轉換率與體重增加有 正面效果。得自蠟樣芽孢桿菌之野生PI-PLC之效果在本測試 中並未與同濃度（10 U/lb)之重組部分有效。 ΙΠ·仔雞以酵素、PI-PLC與1，4-冷-D-内切甘露聚糖酶餵食測試m 研究在隨機Petersime籠組實施以測試PI-PLC與i，4- yg ) Μ規F( ) (請先閱讀背面之注意事項再本頁) -裝 訂 線 36 1255189 A7 B7 五、發明説明（34 ) -D-内切甘露聚糖酶（美國專利5,429,828)在雄仔雞飼養至 21天大時實行之效果。雞隻在第8天大時感染以鳥類球蟲（ 經由口服強飼使每隻雞感染75,000叢艾美球蟲卵與1，250 最大艾美球蟲卵），並在第11、12與13天時感染以產氣莢膜 梭菌（每天口服強飼予1 mL内含108 cfu/mL新鮮培養之培 養液）。每組處理（表8)均含8次重複或籠且每籠飼養14隻 Mareks-疫苗接種之Cobbx Cobb雄仔雞（在第14天時降至10 隻，因4隻從各籠移出並對損害評分），空間為每隻雞0.36 ft2 。在檢測時死亡之雞隻自籠子移出且不替換。飼料在整個 測試期間（第〇至第21天)在無限制供應基礎上以糊狀餵食。 食物自第0-21天大時以糊狀餵食。基礎飼料為一典型 之仔雞起始飼料，含22%粗蛋白質與1400 kcal/lb之ME。 辦衣1T^ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 37 1255189 A7 B7 五、發明説明（35 ) 表8·仔雞餵食測試III之實驗處理 處理 投藥1 感染測試3 PI-PLC 甘露聚糖酶2 1 + — — — 2 + — 一 100 MU/T 3 — + — — 4 一 + — 100 MU/T 5 — + 產自巨大芽孢桿菌之 重組PI-PLC (10 U/lb) — 6 一 + 產自巨大芽孢桿菌之 重組PI-PLC (30 U/lb) — 7 一 + 產自巨大芽孢桿菌之 重組PI-PLC (10 U/lb) 100 MU/T 8 — + 產自巨大芽孢桿菌之 重組PI-PLC (30 U/lb) 100 MU/T _9 + + — —— 10 + + 產自巨大芽孢桿菌之 重組PI-PLC (30 U/lb) 一 (請先閱讀背面之注意事項再 裝 頁) 1此食物有桿菌肽亞曱基二水楊酸酯(BMD，50 g/ton)與沙利黴素（Sac〇x， 60g/ton)。 ’ 2100 MU/T相當於每噸飼料有100 x 1〇6之活性單位 3雞隻在第8天大時經由口服強飼使每隻雞感染75,000叢艾美球蟲卵與125〇 最大艾美球蟲卵，並在第11、12與13天時每天口服強飼予1 mL内‘1〇8 cfu/mL新鮮培養之培養液以感染產氣莢膜梭菌。 為比較處理，食物轉換率調整為平均雞體重之差異。 感染使AF/G(體重調整之食物轉換率）惡化約23%(〇.147 AF/G單位）。沙利黴素與BMD之使用完全回復af/G至正常 水準，但是此二種化學物質在降低因感染引起之腸道損害 卻無/5 -甘露聚糖酶與PI-PLC結合之效果好。每嘲一百個百 萬單位（100 MU) /5-甘露聚糖酶無論是單獨使用或與 PI-PLC結合能部分克服感染之致命後果，證據顯示在感染 控制組之AF/G降低有約65%至70%之改進（參閱丁 3與τι之 比較）。yS-甘露聚糖酶似乎在降低由叢艾美球蟲引起之腸 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210x297公I) 、-烊 線 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 38 1255189 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明ς6 ) 道損害評分上比最大艾美球蟲引起的好。部分AF/G回復之 達成係因在感染之雞隻食物以PI-PLC處理，但是只有 33-41%之惡化情形被克服。然而兩類PI-PLC均降低由兩種 艾美球蟲引起之腸道損害評分。在最大艾美球蟲的實施例 中，損害之降低在統計上有顯著性。結果列於表9。 表9.以PI-PLC與l，4-yS-D-内切甘露聚糖酶銀食感染叢艾美球蟲、最大艾美球蟲與 產氣莢膜梭菌雞隻之仔雞餵食測試m 處理敘述 飼料消耗量 飼料轉換率 增加之重量 存活 體重 損害評分 I1 M2 泠-甘露 聚糖酶 PI-PLC 0»21 天 Ml天 021天 &21天 0»21 天 »21 天 21天 叢艾 美贴 最大 艾美 重量 AF/G3v. 處理1 1 否 是 無 無 11.178^ 8.财 1.433d6 1.44^ 0.659^ 0540a 0.701* O.OOP 0.(Xf 1.433 2 否 是 100 MU/ton 無 1123(f 8.841a 1.402" 1.424d 0.47811 05488 0.7201 O.OOP aoor 1.416 3 是 否 無 無 10.4971°1 8.155^ 1.669^ 1.70f 053炉 0.429^ 0.5却 1388 1.56? 1.579 4 是 否 100 MU/ton 無 10.787^ 8.435^ 1501°1 153^ 0.611^ 0.49^ 0·65ί 1.16* 1.44* 1.465 5 是 否 無 1倍重組 10U/lb 10.45^ 8228^ 1撕 li91bc 0594c 0.4776 0.6350 1344 1.19^ 1.512 6 是 否 無 3倍重組 30U/lb 1026^ 7.98? \5lf 1.621* 05970 0.483b 0.63 铲 1.1^ 1.13d 1.526 7 是 否 100 MU/ton 1倍重組 10U/lb 10533^ &2274° lil4te 153^ 05带 0.48^ 0.做 1.09^ 125^ 1.469 8 是 否 100 MU/ton 3倍重組 30U/lb 10.49^ &15^ \5\^ 156^ 0.601c 0.478^ 0.643c 125* 138^ 1.474 9 是 是 無 無 11.060^ 8.658* 1.423c 1.4471 0.65(f (X52? 0.6¾4 1.03b 〇.破 1.416 10 是 是 無 3倍重組 30U/lb 10.66^ 8359^ 1.43CP 1.444d 0.647* 052^ 0.688* l.(Bb 1.13d 1.420 *1=感染。 2M=投藥(沙利黴素(60 g/ton)與BMD (50g/ton))。 3AF/G=艘重調整飼料轉換率((處理1磅數!^一處理X磅數觔4/3)+(食物效耗量/獲得之重量购天)）。 PI-PLC單位為同於實施例四之單位 Hemicell MU=百萬 ChemGen 單位 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 裝 訂 線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 39 1255189 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 k, B7五、發明説明（37 ) IV.仔雞餵食測試IV 研究在隨機Petersime籠組實施以測試PI-PLC與甘露 聚糖酶（美國專利5,429,828)與真菌甘露聚糖酶在雄仔雞 飼養至21天大時實行之效果。雞隻在第8天大時感染以球蟲 (經由口服強飼使每隻雞感染75,000叢艾美球蟲卵與1，250 最大艾美球蟲卵），並在第11、12與13天時感染以產氣莢膜 梭菌（每天口服強飼予1 mL内含108 cfu/mL新鮮培養之培 養液）。每組處理均含8次重複或籠。每籠起初飼養14隻 Mareks疫苗接種之Cobbx Cobb雄仔雞（在第14天時降至10 隻，因4隻從各籠移出並對損害評分），空間為每隻雞0.36 ft2 。雞隻不替換。飼料與水在整個測試期間（第〇至第21天） 在無限制供應基礎上以糊狀餵食。處理1至16之基礎飲食為 一典型玉米/大豆之仔雞起始飼料，含22%粗蛋白質與 1400 kcal/lb之ME。 總結於下表10之結果顯示可重複之益處，即添加 PI-PLC或甘露聚糖酶於受兩種鳥類球蟲與產氣莢膜梭菌 感染之仔雞飲食中，結果在體重增加與食物轉換率上均有 改善。重要的是，此研究顯示無論PI-PLC或甘露聚糖酶與 沙利黴素結合但不含抗生素BMD時，均有回復至未受感染 測試（測試1與2)基礎水準之表現。此提供抗菌功能之證據 。此實施例中，PI-PLC/沙利黴素某種程度上顯示效果比 甘露聚糖酶好，且遠超出甚至在美國目前為受感染家禽所 用添加BMD與沙利黴素之結合（測試4)。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 1255189 A7 B7 五、發明説明ς。） 3〇 表10.仔雞餵食測驗IV 測 試 I1 E2 Μ3 損害評分 食物轉換率 增加之重量 生存 重量 叢艾美 球蟲 最大艾 美球蟲 上 中 第0-21天 第8-21天 第0·21天 第8-21天 第21天 1 — — — 0.00 0.00 1.652 1.694 0.527 0.427 0.565 2 — — B/S' 0.00 0.00 1.612 1.656 0.546 0.437 0.583 3 + 一 — 2.44 2.31 1.813 1.909 0.394 0.296 0.432 10 + — B 2.25 1.94 1.707 1.770 0.453 0.352 0.490 7 + 一 S 1.00 1.09 1.709 1.719 0.458 0.368 0.496 4 + 一 B/S 0.59 1.63 1.585 1.671 0.509 0.397 0.547 16 + PI-PLC — 225 1.50 1.701 1.778 0.451 0.347 0.486 9 + PI-PLC B 2.03 1.34 1.760 1.844 0.445 0.342 0.482 6 + PI-PLC S 1.06 1.28 1.584 1.613 0.526 0.419 0.564 12 + Man. — 1.94 1.34 1.803 1.849 0.433 0.338 0.483 13 + 5 倍Man· 一 2.13 2.00 1.740 1.813 0.437 0.339 0.471 8 + Man. B 2.09 1.34 1.707 1.772 0.448 0.348 0.486 5 + Man. S 0.97 1.09 1.652 1.688 0.500 0.397 0.538 11 + Man. B/S 0.78 1.16 1.622 1.666 0.502 0.390 0.540 4=感染：雞隻在第8天大時經由口服強飼使每隻雞感染75,000叢艾美 球蟲卵與1，250最大艾美球蟲卵，並在第11、12與13天時每天口服強 飼予1 mL内含108 cfu/mL新鮮培養之培養液以感染產氣莢膜梭菌。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ΊΤ 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 2E=酵素：PI-PLC=產自巨大芽孢桿菌之重組PI-PLC，添加量為30 U/lb，單位定義同實施例4 ;

Man=遲緩芽胞桿菌之1，4-P-D-内切甘露聚糖酶（美國 專利5,429,828),添加量為121 MU/ton(百萬之ChemGen單位/噸）， 或5倍量即506 MU/ton。 3M=投藥（B= BMD，50 g/ton) ; S=沙利黴素（60 g/ton)。 實施例12酵素對生存率與叢艾美球蟲與禽艾美球蟲孢子 體外入侵細胞影響之決定 叢艾美球蟲孢子或禽艾美球蟲孢子與培養之幼大鼠 腎臟細胞的製備係依已發表之方法。參閱Augustine，Avian and Poultry Biology Reviews 11 : 113-122，2000。對細胞之 預處理，細胞培養以述於表11之酵素稀釋液覆蓋，並檢查 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 41 1255189

五、發明說明（40)

表現與蠟樣芽孢桿菌PI-PLC製備相同。 表11，經與未經酵素處理之叢艾美球蟲與禽艾美球* ^ 對BHK細胞之體外入侵 、蛾炮 酵素與濃度 球蟲孢子 __控制組,_ 1~蝶樣芽孢桿菌1之PI-PLC 0.0403 U/mL ~1巨大芽孢桿菌2之重組 子 以酵素預處理細^ ^ 著沖洗 在感米過程中使用ΐΧ]

入铋计數報告為平均值土平均標準差，計數來自 ，培人，皿内之蓋玻仙。_組辭均值以以 示子標不者有顯著地不同(Ρ〈或=〇 〇5)。 卜U知自蠟樣芽孢桿菌之胞外酵素透析於磷酸緩衝鹽水中，單 2根據實锋‘旱化係芽抱桿菌之細胞外酵素於碟酸緩衝鹽水中透析，單位標準 3化係根據實施例4之方法。 ’、懈自於描述於細專利5,429,828之遲«孢桿菌，且透5 ^^^^^*ChemGenCorp.3t^4t^^〇 對隱鞭孢子蟲感染2ΡΙ-ΡΙχ體外評量 酵素ΡI P L C係為抗隱鞭孢子蟲活性而評量，毒性 之濃度範圍自0·00 1 -30 u/mL之測試則使用4天大之

43 1255189 A7 _______ B7 五、發明説明（^ ) 41 7

Madin-Darby犬腎臟（MDCK)細胞。使用之酵素之製備來自 巨大芽孢桿菌。處理於感染後3小時開始並持續48小時。 化學螢光免疫定量。在感染前，卵經沖洗並重新懸浮 於含0.75%牛黃膽酸鈉之DMEM鹼中，並在37。(：培養1〇分鐘 (You et al.5 FEMS microbial. Letters 136 * 251-256, 1996; You et al” J. Antimicrobial· Chemother· 41 : 293-296，1998) 。脫囊混合物以Ultraculture培養基稀釋，快速地分配在含 MDCK細胞之平板上，細胞為1〇〇%全滿，並在Ultraculture 培養基中維持4天。接種物在以PBS沖洗前與細胞培養3小 時，並以含或不含酵素之新鮮Ultraculture培養基更換。平 板培養在37°C，含5%二氧化碳之空氣環境中48小時。培養 以PBS沖洗並以Bouin’s溶液固定。 固定之平板以TBST緩衝液（20mM Tris_HCl (pH 7.5) ’ 150mM NaCl，0.05% Tween-20)沖洗，並以 1% BSA-TBST(TBST緩衝液含1%牛血清白蛋白）在25°C緩緩 震盪覆蓋30分鐘。兔子抗血清（1 ·· 200稀釋）加在平板上並培養1小時。以TBST沖洗後，樣品 依序培養在生物素標識之抗兔免疫球蛋白與辣根過氧化氫 標識之鏈白素中（使用稀釋度為1 : 1000，KPL Inc.， Gaithersburg，MD)。Enhanced Lumino (4-埃苯齡與過氧化 氫，Aldrich Chemical Co. Inc·，Milwaukee，WI)作為受質。 平板以 ML3000 Luminometer (Dynatech Lab·，Chantilly， VA)讀數，且決定相對光單位（RLU)。相對光單位之平均係 計算自4重複井且所有實驗至少重複2次。 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） ---------——丨,—— (請先閱讀背面之注意事項再ιΐϋ本瓦) 、1Τ 線— 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -44 - 1255189 A7 五、發明説明 、42 毒性定量。酵素之測試係使用商業用四唑鏺染劑還原 測試法（CellTiter 96; Promega Corp·，Madison，WI，USA) 〇 簡而言之，列於下之各種酵素濃度引入含單層MDCK細胞 全滿之96-井平板中。每種稀釋濃度均評量三次。酵素在37 °C與5%二氧化碳之單層細胞上培養。在48小時後，平板顯 影1小時並在酵素聯結免疫吸附測定平板讀數計内以波長 490nm讀數。結果經紀錄並分析。百分毒性之計算係經由 自含酵素之平均0D扣除不含酵素之培養基控制組平均0D ，再除以培養基0D再乘以100。毒性評分之設計指示於下 表0 毒性％ 0-5% 6-25% 26-50% 51-75% 76-100% 評分 0 1 2 3 4 ---------^-------1T------0 (讀先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧对產局員工消費合作社印製 顯著毒性在酵素濃度3U/mL或更高時發現。在0.1-1 U/mL範圍内未發現顯著毒性。因此一組在此濃度範圍（1.0 U/mL或更低）内實驗組之進行，在決定酵素活性與酵素專 一性。在第一組實驗中，MDCK細胞以脫囊的孢子感染。 在3小時之培養期間後，沖洗細胞單層且加入不同濃度酵素 培養48小時。如表13所示，酵素在0.01-1 U/mL範圍内顯示 有體外抗隱鞭孢子蟲活性。在濃度0.1 U/mL時可達到約 50%抑制性。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 45 1255189

表12·置備自蠟樣芽孢桿菌之重組pi_plc對MDCK 單層細胞培養之毒性 濃度 %毒性（95°/。信心水準） 毒性評分 10 U/mL 83 4 3 57 3 1 13 ~ 1 0.3 11 1 0.1 f〇 1 ~ 表13.以微隱鞭抱子蟲感染MDCK細胞培養之重組 __PI-PLC酵素活性 處理 單位/mL 抑制百 分比 各微量滴定平板 井内隱鞭孢子蟲 之平均數 95% CL 感染後3小時 1 77.36 285.28 0.01 0.3 77.26 286.5 0.04 0.1 52.74 「 595.53 0.18 — 0.03 ^7.62 r 912.15 0.22 1 0.01 7.33 1167.78 0.09 感染 — 0 1260.18 0.09 未感染 一 100 0 0.02 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 第二組實驗之進行在評估酵素專一性。孢子以不同濃 度酵素處理45分鐘，並經簡易沖洗。處理過之孢子隨後感 染未處理之寄主細胞，且發展並複製48小時。在另一組實 驗中，寄主細胞與不同濃度酵素培養，並經沖洗與以未處 理之孢子感染。如下（表14)所示，無論是孢子或寄主細胞 以酵素處理結果均造成部份抑制性。藥量相關之抑制性則 未在此濃度範圍内被發現。此可能是因酵素與寄主或寄生 細胞之培養時間（4 5分鐘）短暫或部份或未完全切割寄主/ 寄生文體。此外，其他寄主/寄生受體也可能涉及感染且 負責在寄主細胞上發現之生長現象。

46 1255189 A7 B7 五、發明説明（44 ) 表14.孢子或MDCK細胞之感染前處理與微隱鞭孢子蟲之 感染率之影響 處理 PI-PLC 單位/mL 抑制百 分比 各微量滴定平板井 内之孢子平均數 95% CL 孢子在感染前 經處理 1 67.27 412.40 0.02 0.3 65.64 433.04 0.06 0.1 57.40 536.80 0.03 0.03 58.13 527.59 0.03 0.01 56.98 542.15 0.01 寄主細胞在感 染前經處理 1 68.76 393.64 0.12 0.3 50.07 629.24 0.26 0.1 63.82 455.88 0.19 0.03 58.53 522.66 0.12 0.01 56.84 543.85 0.10 感染 0 1260.18 0.09 未感染 100 0 0.02

I 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 實施例14對隱鞭孢子蟲感染之PI-PLC體内評估 酵素對抗隱鞭孢子蟲效用之評估，係使用一免疫不全 SCID老鼠模式。簡而言之，接種印製備為純化之卵（儲存 <6個月）係經由含1% BSA之PBS(pH 7.2)沖洗，以除去重 鉻酸鉀。SCID鼠（4-5週大）以106卵（IOWA品系）感染並經以 下指示處理。收集老鼠之糞便樣品，經由不連續蔗糖純化 且經由如前所述之流式細胞計數儀估量寄生物負荷量。參 閱 Arrowwood et al·，J. Parasitol· 81 : 404-409，1995 〇 ^1T^ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 47 1255189 五、發明說明（46) 表16.老鼠之飼料消耗量與增加之體重 處理組 飼料（克） —日 體重（克） 第3曰 平岣 平均 A(90U/lb) ------___«L J —— 1 6.67 B(30U/lb) 6 11 17.055 C(PBS控制組） -- 5.46 16.88 第7曰 平均 平均 16.95 A _ B --- -_ 16.91 C - 7.27 16.89 第10日 平均 A 8.55 丁/-J 17.29 B 193 17.08 C 7.11 16.97 第14日 平泊 平均 A —----—* J 7.78 17.43 B 8.06 1 7.62 C 7.55 17.38 — 第17日 平均 平均 17.64 — A 8.52 B 8.53 17.84 17.59 ^ C 7.79 第21日 _ 平均 平均 A 7.89 1 ’ J 18.25 B 8.22 18.62 C 8.51 18.14 第24日 平均 平均 — A 9.79 18.2 — B 8.3 18.63 C 8.22 18.33 感染後3週之效用。糞便樣品在感染後第3、4與45週 時收集，且計數自列於表17之處理與控制組SCID老鼠之 10 Ο μΐ樣内之隱鞭孢子蟲數量。如表所示，以酵素處理之 老鼠顯示寄生負荷量之下降。在處理組上可觀察到寄生負 荷量（34-54%)。這些下降之中有一些在使用變異數分析之 49 1255189 A7 B7 五、發明説明（47 ) 統計分析評估中（列於下且以符號標誌），有統計上的顯著 性。酵素顯示有能力作為抗隱鞭孢子蟲治療劑。對感染處 採高劑量酵素或較佳之酵素投用方式能增加其效用且也可 能在未來實驗中被強調。 表17.體内PI-PLC降低糞便中隱鞭孢子蟲之效用 處理組 酵素 劑量 (U/lb) 寄生蟲負載 量(卵數/ 100ul)(標 準差） 第21天 抑 制 百 分 比 寄生蟲負載 量(卵數/ 100ul)(標 準差） 第28天 抑、 制 百、 分一 寄生蟲負載 量(卵數/ 100ul)(標 準差） 第31天 抑 制 百 分 比 PI-PLC 90 22.7(11.4) 44.0 26.3 (14)* 48.9 87.5(52.9) 34.0 PI-PLC 30 16.2 (4.7) 52.0 23.4(11)* 54.6 74.3(89.7)+ 40.0 卜' PBS (控制組) — 33.5(16.2) — 50.4(29) 132.1 (89.) — *P俵在0.05或更小時為顯著。 +P值在0.08或更小時為顯著。 實施例15成長測試使用之飼料中之酵素檢定 萃取使用於上述動物實驗飼料之PKPLC的測試，實行 方式如實施例10所述。結果整理於表18^9.中。 (請先閱讀背面之注意事項再ιΡΡ本頁) 、11 線 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 表18.隱鞭孢子蟲研究，老鼠飼料 處理 控制組 30 U/lb ^ ^ 90 U/lb 目標U/lb 0 30 90 PI-PLC 型 — 自蠟樣芽孢桿$ 菌之重組物 自巨大芽孢桿 菌之重組物 PI-PLC批號 — 45-46 SF 、45-46 SF 萃取之測試U/lb 0 22.8 66.1 萃取之目標的％ — 76.0 73.4 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 50 1255189 A7 B7 經 濟 部 智 慧 '財 產 局 員 X 消 費 合 社 印 製 五、發明説明ς8 來自飼料之萃取物的效率因飼料形式不同而顯著地 不同。出自老鼠飼料之萃取物顯示73.4至76%之效率（表18) 。在不同地方製造之三種不同雞飼料製備物均小心地填充 45或180 U/lb之重組PI-PLC，隨後立即萃取並使用實施例9 之步驟測試，填充量在實施例9之連續測試方法範圍内。 表19自不同雞飼料來源與玉米餐之萃取物效率測試 雞飼料來源 來源1 來源2 來源3 玉米餐 填充量 單位/Lb 180 45 180 45 180 45 180 45 萃取之單位/lb 128 9.3 53.2 3.66 82.7 8.46 134.4 33 萃取物之添加 <單位％ 71.1 20.7 29.6 8.1 45.9 18.8 74.7 73.3 可以看出得自玉米餐之萃取物效率與得自老鼠飼料 之萃取物相同。然而，在實驗中得自相同雞飼料樣品之萃 取物效率卻不佳，其他亦是。 在列於表20之測試中，可萃取之酵素約為PI-PLC理論 值之30-45%，然而石-甘露聚糖酶已可被萃取且產量約在 100%。約45%萃取物為萃取之最佳量以此飼料。因此，表 20之餵食測試的萃取物之U/lb測試結果在預期為填充使用 之範圍内。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 裝 訂 線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 51 1255189 A7 ________B7 五、發明説明k ) 表20·填充於仔雞餵食測試in之酵素檢定 處理序號 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 感染 — + + + + + + + + 投藥 + + 一 - — — — — + + 目標單位/lb 0 0 0 0 10 30 10 30 0 30 PI-PLC 型 — - — — 野生 重組 重組 重組 重組 r PI-PLC之淛封草仲/lh 平均單位/lb 0.94 0.76 0.79 0.7 3.08 11.48 4.56 10.18 9.49 目標百分比 一 一 — 一 30.75 38.27 45.57 33.93 31.64 目標MU/ton Hemicell 甘 露聚糖酶 ____ ΓΤοο — 100 一 一 100 100 一 一 + — + - 一 + + — — 甘露聚糖梅之測試MU/ton — MU/ton 一 124.9 — 135.5 一 一 153.5 172.0 目標百分比 124.9 — 135.5 — 一 153.5 172.0 一 —-- 當為解釋本發明而呈現某些代表性的實體與細節時 ，對熟知此知識之人而言，其内容中未超出本發明範圍之 各式變化與修正是顯而易見的。 (請先閱讀背面之注意事項再^11本頁) _裝| 訂 線 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 尺 I張 一紙 本 準 標 家a 國 I中 用 I適 I釐 公 97 52

Claims (1)

1. Μ 126252唬專利再審查案申請專利範圍修正本 修正曰期·· 94年8月 使用方、/σ療或減緩消化道感染風險之方法中的組 成物’其包冷^ ·广·、 c 3 ·⑴一可完成一鍵結的切割的酵素，該鍵 結係由一磷脂醯肌醇所構成，其中該切割致使一細Ζ表 面蛋白貝或醣類的釋出；以及（ii) 一該酵素生理上可接 又的載劑中該組成物係呈一適於口服投藥之形式。 2·如申請專利範圍第1項之組成物，其中該酵素切割一鍵 結而致使一細胞表面蛋白質釋出。 士申π專利範圍第丨項之組成物，其中該組成物不包含 除了該酵素以外的抗感染劑。 4_如申請專利範圍第丨項之組成物，其中該組成物係為一 飼料。 … 5.如申清專利範圍第4項之組成物，其中該飼料組成物不 包含除了該酵素以的抗感染劑。

   6·如申請專利範圍第4項之組成物，#中該酵素係以3_90 U/lb飼料的數量而存在。 7.如申巧專利範圍第4項之組成物，其中該酵素係以3 U/lb飼料的數量而存在。 8·如申請專利範圍第4項之組成物，其中該酵素係以 U/lb飼料的數量而存在。 9.如申請專利範圍第4項之組成物，其中該酵素係以3〇 U/lb飼料的數量而存在。 1〇·如申請專利範圍第4項之組成物，其中該酵素係以9〇 -53 - 1255189 六、申請專利範圍 U/1 b飼料的數量而存在。 ’ 11·如申請專利範圍第i項之組成物，其中該酵素係選自於 由神經磷脂酶與磷脂酶所構成之群組。 k 於 12. 如申請專利範圍第n項之組成物，其中該酵素係 C型或D型鱗脂酶。 …種 13. 如申請專利範圍第12項之組成物，其中該酵素 醯肌醇專一性磷脂酶C。 ^曰 14. 如申請專利範圍第丨項之組成物，其中該酵素係選自於 由會切割-鍵結而致使一細胞表面蛋白質或酶類 出之酯酶所構成之群組。 15·如申請專利範圍第！至14項中任—項之組成物，其中該 載劑係為一種食物，而該酵素被併入於該食物中。Λ 16 ·如申請專利範圍第！ 5項之組成物，其中該食物係為一動 物飼料，該飼料係由榖類物質、一蛋白質來源、維生素 、胺基酸與礦物質所構成。 A如申4專利範圍第16項之組成物，其中該榖類物質係為 玉米、鬲粱、小麥、大麥或燕麥。 18·如申請專利範圍第16項之組成物，其中該蛋白質來源係 為豆類或豌豆。 a如申請專利範圍第1至14項中任-項之組成物，其中該 9組成物係呈一固體或一液體形式。 〜專利範圍第1至14項中任-項之組成物，其中該 酵素被包含於一明膠囊莢膜内。 申明專利範圍第1項之組成物，其中該酵素係製備自 54 1255189

   、申請專利範圍 一蠟樣芽孢桿菌（如C///W cere us) ^ ^ ° 22·如申請專利範圍第21項之組成物，其中該蠟樣芽孢桿菌 菌株係為 ATCC 7004或 ATCC 6464。 23.如申請專利範圍第丨項之組成物，其中該酵素係得自於 一寄主生物體内之一重組型DNA的表現。 24·如申請專利範圍第23項之組成物，其中該寄主生物體係 來自於一巨大芽孢桿菌（万meg攸n._)菌株。 &如申請專利範圍第丨項之組錢，其中該酵素係以2〇〇 至4000 IU/Kg飼料之數量而存在。 26’種包含:⑴一可完成一鍵結的切割的酵素，該鍵处係 由一碟龍肌醇所構成，其中該㈣致使-細胞表面蛋 白質或醣類的釋出；以及(ii) 一該酵素生理上可接受的 載劑之藥學組成物用於製備—藥物的用途，該藥物=用 以治療或減緩-消化道感染的風險，其中該藥物係呈— 適於口服投藥之形式。 27. 如申請專利範圍第26項之用途，其中該酵素切割一鍵結 而致使一細胞表面蛋白質釋出。 ° 28. ==圍第26項之用途’其中該藥學組成物不包 3 了该酵素以外的抗感染劑。 29_如申請專利範圍第％項之 i ^八T邊感染係肇因於一 原生動物、細菌、酵母菌、真菌或病毒致 30.如申請專利範圍第29項之用途， “ 愛美球蟲屬㈣㈣)之射動物致係肇因於— 31.如申請專利範圍第29項之用途，复Τ二 /、1访感染係肇因於一 1255189 、申W專利範圍 Μ鞭孢子螽屣（Cryptospon:dium)之原±動物致病原。 J2.如申明專利範圍第29項之用途，其中該感染係肇因於一 梭菌屬之細菌致病原。 33·如申請專利範圍第26項之用途，其中該酵素係製備自一 虫敗樣芽孢桿菌（5mz7/m cere⑽）菌株。 34·如申請專利範圍第33項之用途，其中該壤樣芽抱桿菌菌 株係為 ATCC 7004 或 ATCC 6464。 申請專利範圍第26項之用途，其中該酵素係得自於一 寄主生物體内之一重組型DNA的表現。 36.如申、請專·圍第35項之料，其中該寄主生物體係來 自於一巨大芽孢桿菌⑺π///Μ騰⑼化r/_)菌株。 37· -種使用於治療或減緩消化道感染風險之方法中的组 成物，其包含:⑴一酵素’該酵素係為—醣酶或腦苔脂 酶，以及⑼一該酵素生理上可接受的_，其中該紐 成物係呈-適於口服投藥之形式，而且不含 ^ 素以外的抗感染劑。 人 申請專利範圍第37項之組成物，其中該載劑係為—種 艮物，而该酵素被併入於該食物中。 议如申請專利範圍第38項之組成物，其中該食物係為 動物飼料，該飼料係由榖類物質、一蛋白質來源，、 素、胺基酸與礦物質所構成。 级如申請專利範圍第39項之組成物，其中該穀類物質 玉米、高粱、小麥、大麥或燕麥。 丁 ”、、 仏如申請專利範圍第39項之組成物，其_該蛋白質來源係 56 1255189

   1255189 六、申請專利範圍 5 1.如申請專利範圍第49項之用途，其中該感染係肇因於一 fe鞭孢子蟲屬"奶）之原生動物致病原。 52·如申請專利範圍第49項之用途，其中該感染係肇因於一 後m魇（Clostridium)之細儀致病滑、。 53.如申請專利範圍第48項之用途，其中該酵素係製備自一 虫鼠樣芽孢桿菌〜以似）菌株。 54·如申請專利範圍第53項之用途，其中該壞樣芽抱桿菌菌 株係為 ATCC 7004 或 ATCC 6464。 55·^申請專利範圍第48項之用途，其中該酵素係得自於一 寄主生物體内之一重組型DNA的表現。 %如申入請專利範圍第55項之用途，其中該寄主生物體係來 自方、巨大芽孢桿菌騰ga化n._)菌株。 57.^申請專利範圍第則之用途，其中該酵素係為一半纖 維素S每。 58_如申請專利範圍第57項之用途，其中該半纖維素酶係為 一甘露聚糖酶。 59_如申請專利範圍第58項之用途，其中該甘露聚糖酶係為 由寄存編號為ATCC 55045之遲緩芽孢桿菌（細心 /⑽〜勹所生成的1?4_点内切甘露聚糠酶。 58