ES2353371T3 - Tratamiento enzimático para infecciones del tracto digestivo. - Google Patents

Tratamiento enzimático para infecciones del tracto digestivo. Download PDF

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Abstract

Una composición que comprende (i) una enzima seleccionada de una fosfolipasa C específica de fosfatidilnositol y una fosfolipasa D específica de fosfatidilnositol, y (ii) un vehículo fisiológicamente aceptable para dicha enzima, en donde dicha composición está en una forma apropiada para la administración oral.

Description

Campo de la Invención
La presente descripción se refiere a una composición que comprende y metodología para utilizar enzimas, como agentes anti-infección, en el contexto de tratar o reducir el riesgo de infecciones del tracto digestivo.
Antecedentes de la invención
En su Revision of the World Population Estimates and Projections de 1998, la División de Población del Departamento de las Naciones Unidas de Asuntos Sociales y Económicos proyectó que la población mundial alcanzaría 6 mil millones en 1999. El informe también estableció que llevó solo 12 años que la población aumentara de 5 a 6 mil millones en comparación con 123 años para ir de uno a dos mil millones. Por mediados del siglo 21 la población proyectada está entre 7,3 y 10,7 mil millones. El crecimiento poblacional notable en la última década se debe parcialmente a las ganancias eficientes en la producción de alimentos resultantes de la aplicación de tecnología y prácticas intensivas de producción de alimentos. Para el crecimiento futuro, se necesitarán más ganancias de eficiencia en la producción de alimentos para mantener el ritmo.
Un abordaje, que ha hecho la producción de carne animal más eficiente, incluye el uso generalizado de productos químicos antimicrobianos y antibióticos en la alimentación animal. En las granjas a gran escala, la diseminación de infección es muy rápida en condiciones de producción abarrotadas. La enfermedad generalizada es por ello controlada mediante los usos profilácticos y terapéuticos de estas sustancias. Por ejemplo, es práctica común incorporar productos químicos en los alimentos de animales para controlar infecciones por coccidias (por ejemplo, salinomicina, monensina, roxarsona (3-nitro), halquinol, carbadox y olaquindox) así como antibióticos anti-microbianos (por ejemplo, bacitracina, virginiamicina, tilosina, tetraciclina, clortetraciclina, penicilina, oleandomicina, novobiocina, lincomicina, bambermicinas, apramicina, spiramicina, eitromicina, neomicina y otros). Esta práctica es bien conocida para promover el crecimiento y mejorar la conversión alimenticia.
El incremento en la resistencia a múltiples antibióticos entre patógenos humanos, tales como Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenza, Neisseria gonorrhoeae, y Mycobacterium tuberculosis, ha creado el temor de que la resistencia a antibióticos desarrollada en microbios asociados a animales de granja podría migrar a los patógenos humanos a través de factores transferibles de resistencia a fármacos. Existe evidencia de que los animales alimentados con antibióticos son una fuente de bacterias con factores de resistencia transferibles. Véase Hooge, Feedstuffs 71(20):59, 1999. Aunque los antibióticos utilizados en animales y en seres humanos son generalmente diferentes, existen similitudes en los mecanismos que podrían resultar en resistencia cruzada. En un caso, las fluroquinolonas están aprobadas para el control de infecciones con E. coli (colibacillosis) en algunos animales y también se utilizan en la medicina humana. Hooge, más arriba. Recientemente la FDA/CVM ha propuesto retirar la aprobación al uso de la fluroquinolona enrofloxacina en las aves de corral debido al desarrollo de campilobacteria resistente a la fluoroquinolona y la transferencia a seres humanos. Véase Murhead, S. Feedstuffs 72(45):1-4, 2000.
También existe una preocupación entre las industrias de producción de carne de que podría aparecer pérdida de producción y posible resurgimiento de enfermedad en animales si existiera una prohibición en el uso de antibióticos y anti-microbianos en la alimentación. En 1986, por ejemplo, Suecia prohibió el uso de antibióticos de alimentos y la enfermedad en animales creció. Esto estuvo acompañado de un incremento en el uso de antibióticos terapéuticos que dieron como resultado un aumento general en el uso de antibióticos así como un acrecentamiento en los costos de producción de animales para carne. Véase Smith, Feedstuffs 71(13):1, 1999. En diciembre de 1998, El Consejo de Ministros de la UE decidió suspender el uso de seis antimicrobianos que fueron formalmente aprobados como libres de prescripción en promotores del crecimiento para la alimentación (Official Journal of the European Communities 29.12.98, Regulación del Consejo N° 2821/98 con respecto a la Directiva 70/524). También se prohibieron dos aditivos basados en quinoxalina en agosto de 1999 debido a la preocupación acerca de los residuos en la carne. El resultado de estas acciones es un incremento en la prevalencia de condiciones formalmente suprimidas que incluyen: enteritis necrótica en pollos parrilleros; enteritis debido a Clostridium perfringens en cerdos destetados; disentería porcina y diarrea espiroquetal; y diarrea asociada a E. coli. Véase Miller, United States Animal Health Association, 1999 Proceedings "Antibiotic Usages in Food Animal Production and Resistance-European Perspective."
Hay 30.000 muertes de seres humanos por año causadas por infecciones nosocómicas con patógenos resistentes, pero muchas menos muertes por patógenos transmitidos por alimentos. Ninguna de las muertes por patógenos transmitidos por alimentos se ha conectado a la resistencia a antibióticos (véase Smith, más arriba). De ese modo, no está claro si el uso de antibióticos por las industrias de producción de carne ha contribuido al problema de patógenos resistentes a fármacos de las infecciones nosocómicas en seres humanos. Otra preocupación es la falta de nuevos antibióticos para tratar infecciones con patógenos resistentes.
Véase Henry, C.M., Chemical and Engineering News, 6 de marzo de 2000, páginas 41-58. Esto podría significar que cuando se desarrollan patógenos importantes resistentes a antibióticos, podría no haber ningún antibiótico nuevo disponible para tratar las infecciones. La dificultad de desarrollar antibióticos, el tamaño del mercado y los problemas regulatorios parecen haber causado que las compañías farmacéuticas principales alejen su foco de R&D del desarrollo de antibióticos, especialmente para el uso en animales. Las nuevas regulaciones propuestas para registrar un fármaco para uso en animales son tan difíciles que el desarrollo está siendo interrumpido. Véase Smith, más arriba. Existen, sin embargo, varias compañías pequeñas involucradas en el desarrollo de nuevos antibióticos (Henry, más arriba).
En ciertas poblaciones de animales, la infección ya es pandémica. Por ejemplo, la coccidiosis aviar es una enfermedad que solamente está manejada, pero no realmente bajo control. Virtualmente todas las bandadas están infectadas y comúnmente los productos químicos anti-coccidiosis se rotan en la alimentación para controlar el daño y limitar el desarrollo de cepas resistentes. La coccidiosis cuesta a los productores de aves de corral $350 millones anualmente en pérdidas y gastos de medicación para fármacos antibióticos tales como salinomicina. Véase Suszkiw, USDA Agricultural Research Service News, 28 de octubre de 1997. En 1999, se ha estimado que aproximadamente $114 millones se gastarían anualmente en coccidiostatos en los Estados Unidos. Véase Frost & Sullivan, US. Pharmaceutical Products for Food Animals, Report 5245-54, 1995.
El documento WO 97/41739 A describe composiciones de alimentos que comprenden hemicelulasas tales como mananasa para incrementar la eficiencia de alimentos, así como un agente anti-infeccioso.
Kuppe et al. describen la clonación y secuenciación de fosfolipasa C de Bacillus cereus específica para fosfatidilnositol. El documento EP0477739 describe la clonación y purificación de fosfolipasa D específica para glicosil fosfatidilnositol.
Existe una clara necesidad de descubrir métodos nuevos y más efectivos para controlar infecciones en el tracto digestivo de animales que se producen con prácticas de cría intensiva. Esta necesidad se basa en un requerimiento de obtener mejor eficiencia en la producción para mantenerse a la par de la rápida expansión de la población mundial. El control mejorado de la infección intestinal garantiza una tasa de crecimiento más rápida y una mejora en la eficiencia en alimentación. También existe una necesidad de alternativas al uso de antibióticos en la producción animal para tratar la preocupación del posible desarrollo de resistencia a antibióticos en patógenos humanos.
No existe riesgo de estimular la evolución de microorganismos patógenos resistentes que presenten un problema para la salud humana cuando se utiliza un tratamiento basado en enzimas que opera de una manera diferente a todos los antibióticos. Debido a que las enzimas son proteínas, no existe posibilidad de que un residuo químico peligroso se incorporará en los productos cárnicos , tal como sucede con algunos antibióticos y productos químicos anti-coccidiosis. Véase American Feed Control Officials Inc., Official Publication, 1999, "Drugs and Feed Additives, Section
30.0 Enzymes," páginas 206-217, ISBN 1-878341-10-3.
Compendio de la invención
En la presente memoria se describe un tratamiento enzimático para reducir el impacto de infecciones del tracto digestivo.
Se describe también un mecanismo para reducir el impacto de infecciones del tracto digestivo que interfiere con la unión de patógenos a células del tracto digestivo.
Y también un abordaje para incrementar la ganancia de peso y la conversión de alimentos con respecto a animales que están infectados con patógenos que causan infecciones o enteritis necrótica.
También se hace referencia a una forma de dosificación, apropiada para la administración oral que es efectiva para mejorar la condición de un sujeto infectado por o en riesgo de infección por un patógeno microbiano.
En conformidad con estos y otros objetos, la invención proporciona una composición que comprende (i) una enzima seleccionada de una fosfolipasa C específica para fosfatidilnositol y una fosfolipasa D específica para fosfatidilnositol, y
(ii) un vehículo fisiológicamente aceptable para dicha enzima, donde dicha composición está en una forma apropiada para la administración oral.
En una realización preferida, la enzima incluida en la composición se prepara a partir de una cepa de Bacillus cereus, preferiblemente ATCC 7004 o ATCC 6464. Alternativamente, la enzima se obtiene mediante expresión del ADN recombinante que codifica la enzima en Bacillus megaterium. En otra realización, la enzima está contenida en una cubierta de cápsula de gelatina y está presente en la composición en 200 UI/kg -4000 UI/kg de alimento.
En conformidad con otros aspectos de la presente descripción, se ha proporcionado una composición que posee los componentes arriba mencionados donde el vehículo fisiológicamente aceptable es un producto alimenticio en el que se incorpora una enzima. De ese modo, la composición puede ser un alimento para animales que contenga ningún otro agente anti-infeccioso distinto de la enzima. La composición de alimento para animales de la presente invención además comprende material de grano, tal como maíz, sorgo, trigo, cebada o avenas, una fuente de proteína, tal como porotos o guisantes, y vitaminas, aminoácidos y minerales.
En conformidad con aún otro de sus aspectos, la presente invención proporciona una composición, según lo descrito más arriba, que está en una forma de dosificación sólida o líquida.
Además se proporciona un uso de una enzima seleccionada de una fosfolipasa C específica para fosfatidilnositol y una fosfolipasa D específica para fosfatidilnositol, para la fabricación de una forma de dosificación oral de un medicamento para tratar o reducir el riesgo de infección del tracto digestivo. Además, dicho uso no incluye administrar un agente anti-infeccioso distinto de la misma enzima. La infección puede ser afectada por un patógeno protozoo, tal como Eimeria y Cryptosporidium, bacteriano, tal como Clostridium, fúngico o de levadura.
Aún además se proporciona una composición que comprende (i) una endo-1,4D-mananasa y (ii) un vehículo fisiológicamente aceptable para dicha enzima, donde dicha composición está en una forma apropiada para la administración oral y no contiene un agente anti-infeccioso distinto de dicha enzima, y donde dicha composición comprende dicha enzima en una cantidad efectiva para tratar o reducir el riesgo de infección del tracto digestivo.
También además se proporciona un uso de una endo-1,4-D-mananasa, donde dicha enzima no se administra con una cantidad antimicrobianamente efectiva de otro agente anti-infeccioso, para la fabricación de una forma de dosificación oral de un medicamento para tratar o reducir el riesgo de infección del tracto digestivo.
Otros objetos, características y ventajas de la presente invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada. La descripción detallada y ejemplos específicos, si bien indican realizaciones preferidas, se dan para ilustración solamente. Además, los ejemplos demuestran el principio de la invención y no puede esperarse que ilustren específicamente la aplicación de la presente invención a todos los ejemplos de infecciones donde será evidentemente útil para aquellos expertos en la técnica anterior.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 muestra la actividad anti-criptosporidial de la enzima recombinante PI-PLC producida por una cepa de Bacillus megaterium.
Descripción detallada de la invención
Se ha descubierto que las enzimas arriba definidas caracterizadas por la capacidad de escindir la unión que afecta la liberación de una proteína de superficie celular o carbohidrato, muestran importante actividad antibiótica, en la administración oral, que es efectiva, por ejemplo, en el tratamiento de infecciones del tracto digestivo. De ese modo, la enzima fosfolipasa C específica para fosfatidilnositol (E.C. 3.1.4.10), también conocida por la abreviatura PI-PLC o como fosfodiesterasa para 1fosfatidilnositol, es dicha enzima. Otro ejemplo es fosfolipasa D específica para glicosilil fosfatidilnositol, o GPI-PLD. Low and Prasad, Proc. Natl. Acad. Sci. 85: 980984, 1988.
Las enzimas GPI-PLD y PI-PLC se han descrito a partir de fuentes eucarióticas. Véase Low, "Degradation of glycosyl-phosphatidylnositol anchors by specific phospholipases ", Capítulo 2, páginas 35-63, en MOLECULAR AND CELL BIOLOGY OF MEMBRANE PROTEINS: GLYCOLIPID ANCHORS OF CELLSURFACE PROTEINS, A.J. Turner (ed.), Ellis Horwood, Nueva York, 1990; Low and Prasad, Proc. Natl. Acad. Sci. 85:980-984, 1988; Essen et al., Nature :380:595-602, 1996; y Essen et al., Biochemistry 36:2753-2762, 1997. PI-PLC se ha descrito a partir de fuentes procarióticas, que incluyen la producción extracelular por bacterias. Entre las fuentes bacterianas conocidas de PI-PLC están Bacillus cereus (Stein and Logan,
J. Bacteriol. 85:369-381, 1963; Stein and Logan, J. Bacteriol. 90: 69-81, 1965; Ikezawa et al., Biochimica et Biophysica Acta 450:154-164, 1976; Griffith et al., Methods in Enzymology 197:493-502, 1991; Volwerk et al., J. Cell. Biochem. 39:315-325, 1989; y Kuppe et al., J. Bacteriol. 171:6077-6083, 1989), Bacillus thuringiensis (Ikezawa and Taguchi, Methods in Enzymology 71:731-741, 1981; Documento de Patente Japonesa JP 55034039), Staphylococcus aureus (Low and Finean, Biochem J. 162:235-240, 1977), y Clostridium novyi (Taguchi and Ikezawa, Arch. Biochem. Biophys. 186:196201, 1978).
Las técnicas mejoradas de ensayo enzimático para la enzima PI-PLC se han concebido en base a un sustrato fluorescente. Véase Hendrickson et al., Biochemistry 31:12169-12172, 1992; Hendrickson, Anal. Biochem. 219:1-8, 1994; Hendrickson et al., Bioorg. Med. Chem. Letters. 1:619-622, 1991.
Sin atribuirla definitivamente a ninguna teoría, los presentes inventores enfatizan que la enzima PI-PLC posee la capacidad de escindir los anclajes de glicolípidos de fosfatidilnositol de las proteínas de la superficie celular y otros glicosil fosfatidilnositoles. Véase Low, más arriba; Low and Saltiel, Science 239: 268-275, 1988. Por ejemplo, Las glicoporteínas superficiales variantes y otras proteínas superficiales y carbohidratos de varios parásitos protozoos se fijan mediante los lípidos de glicosil fosfatidilnositol (anclajes GPI) y son sensibles a la digestión y liberación por PI-PLC. Las especies ilustrativas pertenecen a los géneros Schistosoma, Toxoplasma, Plasmodium, Trypanosoma, y Leishmania (Low, más arriba), así como Eimeria, Babesia, Theileria, Giardia, Leptomonas y Entamoeba. Véase McConville y Ferguson, Biochemical J. 294: 305-324, 1993; Pearce y Sher, J. Immunol. 142:979-984, 1989; Sauma et al., Mol. Med. Biochem. Parasitol. 46:73-80, 1991; Hawn and Strand, Mol. Med. Biochem. Parasitol. 59:73-82, 1993.
Este mecanismo de anclaje para los componentes de superficie celular parece ser universal para las células eucarióticas que varían de levadura a mamíferos. La presencia de anclajes GPI en Giardia lamblia, considerada una eucariota muy primitiva, sugiere que esta clase de anclaje evolucionó temprano en las eucariotas. Es consistente con esta interpretación el descubrimiento, en arquebacteria, de un nuevo fosfoglicerolípido G1cNal-6-mio-inositol-P-dialquilglicerol (Nishihara et al., J. Biol. Chem. 267:12432-12435, 1992), que es la base para las estructuras de anclaje GPI eucarióticas más complejas que han evolucionado. En los protozoos, el sistema de anclaje GPI se utiliza más ampliamente que en las eucariotas superiores, y existe evidencia de que las estructuras de anclaje GPI son importantes para la supervivencia de parásitos en huéspedes insectos y mamíferos (McConville y Ferguson, más arriba). Por ejemplo, la frecuente difusión de variantes de glicoproteínas superficiales puede ser un mecanismo para evitar el ataque del sistema inmune.
El protozoo Eimeria tenella contiene estructuras de anclaje al fosfatidilnositol similares a la glicoproteína/glicolípido de Trypanosoma brucei. Se piensa que estas son importantes para la unión a la membrana y posterior infección. Véase Gurnett et al., Mol. Med. Biochem. Parasitol. 41:177-186, 1990. Las estructuras de Eimeria son escindidas por una lipasa de tripanosoma y por PI-PLC de Bacillus thuringiensis (Gurnett, más arriba). El tratamiento in vivo de los parásitos con PI-PLC, si se prueba que es factible, posiblemente ayudaría al sistema inmune del huésped e interferiría con la unión e infección por patógenos que ingresan al tracto digestivo. Las especies de Eimeria son un problema generalizado y costoso para la industria de aves de granja. Otro parásito protozoo, Cryptosporidium parvum, está difundido y causa enfermedad diarreica aguda en seres humanos y muchos animales. La proteína del esporozoíto, GP15/45/60, se prevé que es una proteína unida a GPI basada en una secuencia de ADN, y anticuerpos monoclonales reactivos a esta proteína de esporozoíto inhiben la infección (Strong, W.B., et al., Infection and Immunity 68: 41174134, 2000; Cevallos, A.M., et al., Infection and Immunity 68: 4108-4116, 2000). De ese modo, C. parvum es otro patógeno potencialmente tratable con PI-PLC.
Las bacterias procarióticas no contienen glicoproteínas superficiales y carbohidratos anclados por fosfatidilnositol (McConville y Ferguson, más arriba), pero PI-PLC aún podrá reducir las infecciones bacterianas al interferir con el proceso de unión. E. coli patógenas y un número de otras Enterobacteriaceae patógenas bien conocidas expresan adhesina bacteriana FimH, una lectina de unión a manosa de 29 kD representada en el extremo distal de fimbrias. Abraham et al., Nature 336: 682-684, 1988. Esta adhesina ha demostrado unirse a CD48 de las células mastoides, una molécula de anclaje GPI. Véase Malaviya et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EEUU 96:81108115, 1999. La digestión in vitro con PI-PLC redujo la unión de un receptor de toxina de difteria de anclaje GPI mutante (de Corynebacterium diphtheria) a células murinas NIH3T3. Véase Lanzrein et al., EMBO J. 15:725-734, 1996. Además, la toxina alfa de Clostridium septicum y la aerolisina de Aeromonas hydrophila están ambas unidas a la superficie celular por medio de un anclaje GPI del extremo terminal C y puede eliminarse de la superficie celular mediante el tratamiento con PI-PLC. Véase Gordon et al., J. Biol. Chem. 274:27274-27280, 1999.
Un mecanismo para que PI-PLC reduzca el efecto de la infección bacteriana se refiera a la liberación del sitio de unión a CD48 de las células mastoides huésped. También la unión de FimH a las células mastoides acciona una respuesta de inflamación. En conformidad con la presente invención, por ello, reducir los sitios de unión también debería reducir la inflamación, que podría volverse excesiva y perjudicial para la misma salud intestinal, ya que la respuesta a la inflamación incluye la liberación del factor α de necrosis tumoral (Malaviya, más arriba). De ese modo, a través de este mecanismo de reducción de inflamación y la secreción subyacente del factor de necrosis tumoral, un tratamiento con fosfolipasa, conforme a la presente invención, aliviaría síntomas que caracterizan afecciones tales como síndrome de intestino irritable, colitis y Enfermedad de Crohn. Véase van Deventer. Si., Ann. Rheum. Dis. 58(1):1114-1120 (noviembre de 1999).
También contra las infecciones virales, la presente invención debería ser efectiva, por su ruptura de la unión entre las partículas virales y las células que el virus infectaría in vivo. A la luz del descubrimiento de los presentes inventores de la eficacia de la administración oral, descrita en la presente memoria, es interesante que el pretratamiento del virus influenza con fosfolipasa C, que causa la liberación de aproximadamente el 50% de los fosfolípidos del virus, dio como resultado una reducción importante en la infectividad en embriones de pollitos. Véase Mizutani et al., Nature 204:781-782, 1964. A la inversa, el pretratamiento de fibroblastos de embriones de pollitos cultivados con fosfolipasa C, aislada de Clostridium perfringens, inhibió marcadamente la infección posterior de las células por el Virus Semliki Forest. Véase Friedman and Pastan, Proc. Natl. Acad. Sci. EEUU 59:1371-1378, 1968. Si bien la técnica no percibió ninguna importancia terapéutica en estos fenómenos, en retrospectiva, son consistentes con un mecanismo pensado para sustentar la presente invención, a saber, la escisión de un ligando de superficie de patógenos y/o su receptor de membrana celular análogo, que perturba la interacción que es necesaria para la infección.
Otro modo donde la presente invención puede ser efectiva en la prevención de infección viral es al eliminar la unión de las proteínas de anclaje GPI virales a las células susceptibles. Un ejemplo de una proteína de anclaje GPI viral que es sensible a la digestión de PI-PLC es el Virus Dengue NS1 (proteína 1 no estructural). Véase Jacobs et al., FASEB J 14:1603-1610, 2000. Existen varios ejemplos de proteínas de anclaje GPI de células huésped que son sitios de unión para virus. Estos ejemplos incluyen Echovirus humano 6,7,12 y 21 y Enterovirus 70 que unen CD55 de anclaje GPI (factor de decaimiento-aceleración, DAF). Véase Clarkson et al., J. Virology 69: 5497-5501, 1995; Bergelson, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EEUU 91: 6245-6248, 1994; y Karnauchow, et al., J. Virology 70: 5143-5152, 1996. Las infecciones con Parvovirus Canino (CPV) pueden bloquearse in vitro mediante el pretratamiento de células felinas con PI-PLC. Véase Barbis y Parrish, Brazilian J. Med. Biol. Res. 27: 401-407, 1994.
Algunos receptores de superficie celular, de importancia putativa para iniciar infecciones, están unidos a las membranas mediante mecanismos distintos de anclajes GPI. Estos incluyen estructuras tales como ésteres de colesterol (Rostand y Esko, J. Biol. Chem. 268:24053-24059, 1993), los glicosfingolípidos no fosforilados (Karlsson, Ann Rev. Biochem 58: 309-350, 1989) y otros fosfolípidos tales como fosfatidiletanolamina y fosfatidilserina. Véase Sylvester, Infect. Immun. 64:4060-4066, 1996.
Por las razones establecidas más arriba, por ello, el reconocimiento de dichas estructuras con esterasas, cerebrosidasas, carbohidrasas y fosfolipasas apropiadas activas para liberar estas estructuras de las superficies celulares, debería tener efectos beneficiosos, en la administración oral en conformidad con la presente invención, para tratar infecciones del tracto digestivo.
En virtud de la naturaleza universal de las proteínas superficiales unidas al fosfatidilnositol y carbohidratos en eucariotas, la metodología terapéutica de la presente invención, que supone la administración de enzimas, en forma aguda profiláctica, para escindir una unión de anclaje para dichas proteínas de superficie celular y/o carbohidratos, encontrará amplia aplicación en el manejo de infecciones por protozoos, bacterianas, fúngicas y virales del tracto digestivo. Para este fin, un aspecto clave de la presente invención es la demostración de que una enzima, que no solamente es activa en la escisión de los componentes de superficie celular, puede administrarse por vía oral como un agente anti-infeccioso y puede ser efectiva in vivo. Notablemente, si bien una enzima apropiada representativa, PI-PLC, ha estado disponible desde 1960, este abordaje no ha sido sugerido hasta ahora.
Otro aspecto de la presente descripción es el uso de una enzima, según lo descrito más arriba, como un agente anti-infeccioso efectivo en preparaciones alimenticias para animales, que trata o disminuye el riesgo de infecciones del tracto digestivo en animales que consumen el alimento. Las preparaciones alimenticias que contienen una endo-1,4-D-mananasa son conocidas, y algunos informes han propuesto una actividad antifúngica para mananasa. Véase WO 00/21381 (PCTIEP99/07835) y Kudo et al., Experentia 48:227-281, 1992. En estos casos, la mananasa se combina con un antibiótico reconocido, aunque en general se ha debatido la posibilidad del uso de la enzima en alimento libre de antibióticos. Adams, Feed Mix (Special 2000), en las páginas 16 -18.
En uno de sus aspectos, por ello, la presente invención se refiere a composiciones según lo definido en la reivindicación 33.
De ese modo, en conformidad con la presente descripción una preparación de enzimas extracelulares, obtenidas de Bacillus cereus y estandarizada para el contenido de PI-PLC, puede utilizarse para provocar una mejora muy importante en la ganancia de peso y conversión alimenticia en presencia de una infección. Este resultado es inesperado debido a que B. cereus es un patógeno oportunista que comúnmente causa gastroenteritis y endoftalmitis por B. cereus transmitidas por alimento.
Estudios recientes informaron que la inyección de enzimas extracelulares de B. anthracis o B. cereus en conejos causa fosfasemia y aún la muerte. Por ejemplo, véase Stein y Logan, J. Bacteriol. 85:369-381, 1963. Es sorprendente, por ello, que una enzima extracelular de un patógeno que causa gastroenteritis tendría un efecto curativo, en conformidad con la presente invención, con relación a la enfermedad causada por una infección bacteriana.
Bacillus cereus elabora una variedad de enzimas activas de membrana extracelular y toxinas citolíticas, que incluyen PI-PLC y Cereolisina AB, compuesta de fosfolipasa C y spingomielinasa. Véase Gilmore, J. Bacteriol. 171:744-753, 1989. En la preparación de la enzima antes mencionada, se piensa que una fosfolipasa C específica para fosfatidilnositol extracelular [E.C. 3.1.4.10], producida por B. cereus, es un principio activo. El tratamiento enzimático de la presente invención funcionó efectivamente como un coccidiostato y antibiótico. Por ello, es un abordaje efectivo y comercialmente viable para el tratamiento de infecciones del tracto digestivo particularmente ya que las sustancias utilizadas actualmente están prohibidas.
Si no se recubren, las enzimas son capaces de la inactivación irreversible por fluidos gástricos del estómago. La Patente Estadounidense N° 4.079.125 describe composiciones mejoradas que contienen enzimas con cubiertas entéricas para la ingestión por mamíferos deficientes en enzimas. Sorprendentemente, la adición de PIPLC al alimento para animales sin recubrir da como resultado el tratamiento efectivo de infecciones patógenas.
Las composiciones enzimáticas conforme a la presente descripción preferiblemente se formulan como composiciones orales líquidas o sólidas, secas. Dichas composiciones en general incluirán estabilizantes, tales como un tampón, un carbohidrato y/o un glicol. Las formulaciones enzimáticas estables en almacenamiento, secas que son apropiadas, conforme a la presente invención, para la incorporación en comprimidos o cápsulas, por ejemplo, pueden prepararse mediante liofilización, secado con pulverizador en secadora de lecho fluidizado con un vehículo de carbohidrato o inerte, o mediante técnicas de evaporación en conjunción con estabilizantes formadores de vidrio. Véase Franks et al., Biopharm. 4:38-55, 1991. Otro abordaje incluye la precipitación con sales, por ejemplo, precipitado con sulfato de amonio o precipitado con disolvente, como con acetona para la formación de polvo, seguido por el secado y mezclado con un vehículo.
Ciertos carbohidratos, particularmente monosacáridos, disacáridos y oligosacáridos inferiores son importantes carbohidratos formadores de vidrio. Los carbohidratos de ejemplo para el uso como vehículos son xilosa, fructosa, glucosa, sorbitol y maltotriosa, entre otros, según lo descrito por Franks, más arriba. La elección de un vehículo de carbohidrato se basa en la compatibilidad con la enzima, tendencia hidroscópica baja, y una curva de transición vítrea favorable. El estabilizante trehalosa es particularmente apropiado para generar productos biológicos estables a temperatura ambiente. Véase la Patente Estadounidense N° 4.891.319; Roser, Biopharm. 4 (8):47-53, 1991; Colaco et al., Bio/Technology 10:1007-1011, 1992; Aldridge, Genetic Engineering News, 15 de marzo de 1995, páginas 10-11.
Las enzimas para la presente descripción pueden formularse como líquidos, por ejemplo, como jarabes con sorbitol o glicerol parea reducir la actividad de agua y estabilizar la proteína. Dichas soluciones típicamente son filtradas en procedimiento estéril, previo al uso farmacéutico.
Según lo observado previamente, la presente descripción trata, en un aspecto, el suministro de una enzima como componente de un alimento o producto alimenticio. Los alimentos están compuestos principalmente de material de grano, una fuente de proteína, vitaminas, aminoácidos y minerales. El material de grano típicamente incluye maíz, sorgo, trigo, cebada o avenas. La fuente de proteínas puede ser porotos o guisantes, por ejemplo. Los minerales, aminoácidos y vitaminas de ejemplo incluyen B12, A, ácido patoténico, niacina, riboflavina, K, DL-metionina, L-lisina, cloruro de colina, ácido fólico, fosfato de dicalcio, sulfonato de magnesio, sulfato de potasio, carbonato de calcio, cloruro de sodio, selenita de sodio, óxido de manganeso, yodato de calcio, óxido de cobre, óxido de zinc, y esterol animal D-activado.
Para el uso en alimentos, una formulación enzimática líquida puede prepararse con agua con sal (por ejemplo, NaCl, 15-18% p/p), o jarabe para reducir la actividad de agua y evitar el crecimiento microbiano en el producto concentrado. Otros conservantes para alimento tales como benzoato de sodio, propilparabeno, sorbato de potasio o sodio, y palmitato de ascorbilo son ejemplos de conservantes químicos aprobados que también pueden utilizarse para evitar la descomposición potencial por el crecimiento microbiano en el producto. Véase Association of American Feed Control Officials, Inc., Official Publication 2000, Parte 18, "Chemical Preservatives" páginas 215-217, ISBN 1-878341-11-1. Estos conservantes pueden aplicarse a alimentos post-peletizando con una gran dilución mediante tecnología de pulverización automática. Véase Fodge et al., Feedstuffs, 29 de septiembre de 1997. Dichas preparaciones líquidas pueden contener carbohidratos estabilizantes tales como sorbitol o glicerol, si es compatible. Los materiales que son componentes deseados del alimento, tales como otras enzimas o vitaminas que son lábiles al calor, pueden incluirse para un incremento en la eficacia.
En los casos donde el alimento se utiliza en una forma de puré no peletizado (es decir, no tratada con calor), las enzimas para la presente invención pueden proporcionarse como un concentrado seco, para la adición al mezclador de alimento. Dichos concentrados enzimáticos secos se preparan primero mediante concentración de la preparación enzimática líquida, con un 10 Kd NMWC u otro ultrafiltro apropiado, para lograr un alto porcentaje de contenido enzimático, y después mediante el mezclado con un vehículo muy seco, tal como sémola de maíz, sémola de soja o aún un material inerte o sal insoluble que esté aprobada para el uso en alimentos. Véase Official Publication, American Feed Control Officials, más arriba, Parte 582, "Substances generally regarded as safe in feed for animals."
Existe un número de técnicas disponibles para generar enzimas suficientemente estables para tolerar el proceso de peletizado en algunos molinos de alimentos, reteniendo al mismo tiempo actividad suficiente, a temperaturas inferiores, para funcionar en el tracto digestivo. Es bien conocido que la modificación de la estructura proteica, básicamente a través del cambio de la secuencia de ADN codificante o, secundariamente, a través de la modificación química puede hacer las enzimas más estables contra la inactivación. Una ilustración en este sentido es el uso de reticulación química de cristales enzimáticos. Véase Collins et al., Organic Process Research and Development 2(6):400-406, 1998. Otro abordaje para incrementar la estabilidad de la enzima para la presente invención supone cambiar los aminoácidos por mutagénesis del gen que codifica la enzima de interés, u obtener genes o partes de genes para entremezclar. Véase Crameri et al., Nature 391:288-291, 1998; Arnold, Nature Biotechnol. 16:617-618, 1998b; Zhao et al., Nature Biotechnol. 16:258-235, 1998; Zhao y Arnold, Protein Eng. 12:47-53, 1999. La mutación y selección para "evolución dirigida" de enzimas con las propiedades deseadas también es viable. Por ejemplo, véase Giver et al., Proc. Nall Acad. Sci. EEUU 95:12809-12813,1998; Liao et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. EEUU 83:576-580, 1986; Cherry et al., Nature Biotechnol. 17:379-384, 1999.
Ciertas modificaciones proteicas, que incluyen glicosilación, PEGilación y succinilación, también pueden potenciar la estabilidad y alterar el pH óptimo, características que podrían optimizarse para que la enzima sea utilizada en la presente invención. De ese modo, podrían emplearse protocolos conocidos en este sentido para fabricar enzima modificada, para ensayar, conforme a los ejemplos, medir la adecuación en la metodología de tratamiento inventiva.
Un método efectivo para la producción de PI-PLC surgió de la clonación del gen de B. cereus en B. megaterium. El sistema de expresión (Rygus y Hillen, Appl. Microbiol. Bacteriol. 35:594-599, 1991) hace uso de elementos del regulón de xilosa de Bacillus megaterium (Rygus et al., Arch. Microbiol. 155:535-542, 1991), y estaba disponible comercialmente en BIO101 Corp. (Vista, California). Se creó una fusión entre la secuencia codificante líder del gen PI-PLC y los primeros tres aminoácidos del gen xylA de B. megaterium, en un plásmido estabilizado con resistencia a la tetraciclina y regulado por un represor sensible a la xilosa. Las cepas de este tipo, con expresión amplificada, proporcionan un medio viable para producir cantidades comercialmente útiles de PI-PLC, para incorporar en el alimento para animales en conformidad con la presente invención.
Algunos aislamientos de Bacillus cereus producen antibióticos tales como tunicamicina. Véase Kamogashira et al., Agric. Biol. Chem. 52:859-861, 1988. Otro aislamiento de Bacillus cereus (ATCC 53522) se describe en las Patentes Estadounidenses N° 4.877.738 y N° 5.049.379 como un agente de biocontrol para evitar la putrefacción de semillas y la putrefacción de raíces en plantas. Se cree que este efecto resulta de la acción de dos antibióticos, denominados "Zwittermicina", un aminopoliol lineal de 396 Dalton, y "Antibiótico B," un aminoglicósido. En los ejemplos detallados más abajo, la posibilidad de incluir estos dos antibióticos se eliminó al excluir los posibles antibióticos de bajo peso molecular de la preparación enzimática.
En particular, un caldo de fermentación libre de células se concentró por medio de una membrana con un corte de peso molecular de 10 Kd. El concentrado, que contenía proteína mayor que 10 Kd, se utilizó para procesamiento adicional. Los antibióticos de peso molecular pequeño, tales como aquellos descritos por Handelsman, más arriba, pasarían a través de este filtro. Además, se empleó precipitación con sulfato de amonio para precipitar las proteínas de alto peso molecular, dejado los materiales de bajo peso molecular en la solución. Después de que el precipitado con sulfato de amonio se re-disolviera, la solución enzimática resultante se dializó contra tampón, aún otro tratamiento que elimina los antibióticos de bajo peso molecular. Finalmente, la proteína se precipitó una segunda vez, nuevamente con sulfato de amonio, para trasladar cualquier compuesto de bajo peso molecular remanente a la solución.
El uso combinado de estos cuatro tratamientos debilita fuertemente la posibilidad de que el efecto del antibiótico observado se deba a un antibiótico de bajo peso molecular, producido por ATCC 6464 o ATCC 7004. El caldo de fermentación también se ensayó con una cepa de ensayo de E. coli en cuanto a la presencia de antibiótico pero no se detectó ninguna actividad de antibiótico.
La presente invención además se describe más abajo por referencia a los siguientes ejemplos ilustrativos.
EJEMPLO 1 Preparación de cultivos de stock congelado de Bacillus cereus ATCC 6464 y ATCC 7004
Se abrieron viales con células liofilizadas de ATCC y se inocularon en un medio de sembrado compuesto por Amberferm 4015 (Red Star) 10 g/L, Amberex 695 (Red Star) 5 g/L, y cloruro de sodio 5 g/L, pH 7,0 y se cultivaron a 30°C. El cultivo inicial se estrió en placas de agar de Caldo LB y una colonia única resultante se inoculó de nuevo en 20 ml de medio de sembrado en un frasco con deflectores de 250 ml (Bellco) y se cultivó con agitación a 30°C. Cuando la densidad del cultivo alcanzó la lectura de DO600 de 1,5, se añadió glicerol estéril hasta aproximadamente 10% v/v y los viales que contenían 1,8 ml de cultivo se congelaron a -80°C.
EJEMPLO 2 Crecimiento de aislamientos de ATCC 6464 y ATCC 7004 de Bacillus cereus para la producción de fosfolipasa C específica para fosfatidilinositol
Dos fermentadores Biostat C, de 30 litros cada uno, se lotearon con medio de la siguiente composición, en agua de grifo: Caldo Nutritivo N° 2 (Oxoid) a 25 g/L, Triptona (Difco) a 10 g/L, extracto de levadura (Difco) a 10 g/L, y antiespuma Mazu DP10P Mod11 (BASF) a 0,1 ml por litro. El volumen de lote inicial fue 9,5 L y el caldo se esterilizó a 121°C durante 40 minutos. El pH inicial se ajustó hasta 7,0 con gas de amoníaco después de la esterilización.
Los cultivos de siembra se prepararon en 500 ml del mismo medio en frascos con agitación con deflectores de 4 litros con conexión al aspirador (Bellco) con tubos de silicona acoplados con conectores para inoculación. Los frascos se esterilizaron en un autoclave a 121°C durante 50 minutos previo a la inoculación con 1,8 ml de cultivo de stock congelado preparado del envío de ATTC (EJEMPLO 1). Los cultivos de frascos de siembra se cultivaron a 30°C durante 5,5 horas con agitación a 200 RPM en un agitador incubador de ambiente controlado (NBS modelo G-25). Previo a la inoculación el cultivo de ATCC 7004 tenía una DO600 de 1,53 y pH 6,58. El cultivo de ATCC 6464 tenía DO600 de 1,28 y pH 6,79.
Los cultivos de siembra de 500 ml se inocularon en los fermentadores de 30 litros y se operaron en las siguientes condiciones: temperatura 30°C, mezclado 600 RPM, flujo de aire 10 litros por minuto, y presión 50.000 Pa (0,5 Bar). La DO600 del cultivo inicial fue 0,81. A las seis horas, la fermentación se interrumpió con DO600 final de 22,1 (ATCC 7004) y DO600 de 24,2 (ATCC 6464). Las fermentaciones se hicieron correr sin control de pH y el pH final fue 8,17 (ATCC 7004) y pH 8,13 (ATCC 6464). Se eliminó el caldo de los fermentadores y se enfrió hasta 8°C previo al procesamiento adicional.
Los fermentadores se hicieron correr una segunda vez con un procedimiento virtualmente idéntico con ambos aislamientos de Bacillus cereus de ATCC. En este caso los cultivos de siembra se utilizaron a las seis horas con DO600 de 2,86 (ATCC 7004) y DO600 de 1,98 (ATCC 6464), y un pH de 6,69 (ATCC 7004) y pH 6,65 (ATCC 6464). Las fermentaciones principales se hicieron correr durante 6,5 horas con DO600 de 35,9 (ATCC 7004) y DO600 de 33,6 (ATCC 6464). El pH final fue 8,38 (ATCC 7004) y pH 8,47 (ATCC 6464) en el momento del enfriamiento.
EJEMPLO 3 Eliminación de células por filtración y concentración de enzima PI-PLC
Las células se eliminaron y se lavaron de cada uno de los cuatro lotes del
fermentador descritos en el EJEMPLO 2 con dos filtros de corte (500 Kd NMWC) de peso molecular 500.000 de fibra hueca de 3mm (UFP-500-K-6A) A/G Technology conectados extremo con extremo. El caldo enfriado se bombeó a través de los filtros con una bomba peristáltica a aproximadamente 2 litros por minuto con reciclado de 5 vuelta al depósito de retención. El filtrado que contenía la enzima se recolectó en un depósito enfriado en hielo. El volumen inicial de caldo que contenía células de aproximadamente 9 litros se concentró hasta aproximadamente 2 litros en cuyo punto se inició la diafiltración con Tris-HCl 10 mM, pH 8,5. Después de que se recolectó un volumen total de aproximadamente 14 litros de filtrado, se terminó el lavado de células. 10 El filtrado de 500 Kd (aproximadamente 14 litros de cada fermentador) se concentró con dos filtros de corte de peso molecular 10.000 de fibra hueca de 0,5 mm (UFP-10-C-4XTCA) de AG/Technology (10 Kd) conectados extremo con extremo. Se utilizó el mismo método de bombeo con reciclado del concentrado excepto que el filtrado se descartó. El concentrado final con un volumen de aproximadamente 500 ml
15 de cada fermentador se guardó para la siguiente etapa de procesamiento.
EJEMPLO 4 Purificación y concentración adicional de la enzima PI-PLC
El concentrado del ultrafiltro de 10 Kd (EJEMPLO 3) obtenido de cada
fermentación de Bacillus cereus se ajustó hasta saturación de 80% con sulfato de
amonio y se mezcló en hielo durante 60 minutos. La solución se centrifugó durante 15
20 minutos a 6000 RPM en un rotor Sorvall GSA. El sobrenadante se descartó, y el precipitado se disolvió en un volumen mínimo de Tris-HCl 10 mM, EDTA 0,2 mM (pH 7,5) y después se dializó en el frío contra el mismo tampón.
La proteína en cada concentrado se midió con un ensayo de unión a colorante (BioRad) y el nivel de PI-PLC se midió (Hendrickson et al., Bioorg. Med. Chem. Letters 25 1:619-622, 1991) mediante un método de detección en base a HPLC y un sustrato fluorescente (Molecular Probes, Inc., P-3764, mio-inositol-l-fosfato de 1-pirenebutilo, sal de litio). La Tabla 1 más abajo resume los datos del ensayo y prevé la pureza aproximada y enzima total en forma pura obtenida de cada una de las cuatro preparaciones. Las preparaciones enzimáticas se almacenaron congeladas a -20°C
30 hasta procesamiento adicional. Tabla 1. Resumen del análisis de las preparaciones enzimáticas crudas de PI-PLC
Preparación enzimática
Número de cepa de ATCC Proteína mg/L Actividad específica U/mg1 mg Totales de proteína en la preparación % de Pureza estimado2 mg Totales de PI-PLC en forma pura
1
7004 1,86 1,75 325 2,92 9,49
2
6464 1,44 0,52 345 0,867 2,99
3
7004 1,35 4,42 208 7,36 15,3
4
6464 2,06 1,72 256 1,95 5,00
1 U= unidad = 1 micromol/minuto. 2En base al supuesto de que la proteína 100% pura posee una actividad específica de 60 U/mg (Hendrickson, más arriba).
5 EJEMPLO 5 Combinación y concentración de las preparaciones enzimáticas previo a la aplicación al alimento para animales
Las preparaciones enzimáticas 1, 2, 3 y 4 se combinaron con un volumen total de 675 ml. Se añadió lentamente sulfato de amonio (492 g) y la solución se mezcló en hielo durante varios minutos. La solución se centrifugó para recolectar el precipitado.
10 La fracción de pélets se disolvió en una cantidad mínima de tampón de fosfato 20 mM (pH 7,0). La solución resultante fue de 70,9 ml con una densidad de 1,057 gramos/cc. La concentración de proteína se midió en aproximadamente 25,5 mg/ml. La actividad de PI-PLC se midió en aproximadamente 1,13 U/mg con una pureza estimada de PI-PLC
15 de 1,88%. La solución se congeló a -20°C en su totalidad, y se descongeló y utilizó para tratar uniformemente 90,72 kg (200 libras) de alimento para pollos. EJEMPLO 6 Clonación y expresión del gen de PI-PLC de Bacillus cereus en Bacillus megaterium La codificación génica para fosfolipasa C específica de fosfatidilnositol (PI-PLC)
20 se ha secuenciado. Véase Kuppe et al., J. Bacteriol. 171:6077-6083, 1989. Mediante tecnología de PCR, el gen PI-PLC se clonó a partir de ADN cromosómico de Bacillus cereus (ATCC 6464). Se utilizó un vector de expresión, pMEGA (BIO 101, Vista, CA), para Bacillus megaterium. Se diseñaron dos cebadores de PCR, a saber, 5'GACTAGTAATAAGAAGTTAATTTTG-3' (cebador 1) y 5'
25 CGGGATCCATATTGTTGGTTATTGG-3' (cebador 2) con un sitio Spel en el cebador 1 y un sitio BamHI en el cebador 2. El gen de PI-PLC amplificado por PCR se ligó al sitio pMEGA SpeI-BamHI y produjo un plásmido pCG682. La proteína PI-PLC se fusionó con los primero tres aminoácidos del producto génico xylA en el sitio SpeI en el vector de expresión. La
30 expresión del gen PI-PLC fue bajo la regulación del promotor xylA. Se utilizó una fermentación en frasco con agitación para evaluar la producción de fosfolipasa C específica para fosfatidilnositol en Bacillus megaterium. El caldo LB con tetraciclina 10 µg/ml (20 ml) se inoculó con 0,2 ml de cultivo de siembra y se incubó en un agitador a 37°C a 250 rpm. En la DO600 de aproximadamente 0,5, se añadieron 5 g/L de D-(+)xilosa para inducir el promotor xylA. Después de tres horas, se cosechó el sobrenadante mediante centrifugación. La actividad de la fosfolipasa C específica para fosfatidilnositol se midió mediante un método de sustrato fluorescente (Hendrickson, et al., Biochemistry 31: 12169-12172, 1992; Hendrickson, Anal. Biochem. 219: 1-8, 1994), con sustrato de 1-pirenobutil-mio-inositol-1-fosfato (Molecular Probes, Eugene, OR) y mediante detección por HPLC.
Tabla 2. Medición de la expresión de PI-PLC
Material de ensayo
Adición de Xilosa Actividad específica (unidad/mg de proteína
Fracciones de lisado celular
B. megaterium/pCG682
- 0
B. megaterium/pCG682
+ 0,436
B. megaterium/pCG682
- 0
B. megaterium/pCG682
+ 0,365
Fracciones de caldo de fermentación
B. megaterium/pCG682
- 0
B. megaterium/pCG682
+ 4,087
B. megaterium/pCG682
- 0
B. megaterium/pCG682
+ 4,56
10 Estos datos muestran que la mayor parte de PI-PLC es extracelular y que la expresión se produce solamente después de la adición de D(+)xilosa (Tabla 2). Se estima que esta cepa recombinante tiene al menos 15 veces las productividad (mg/L/DO) de la cepa salvaje promedio, según lo cultivado en el EJEMPLO 2.
EJEMPLO 7 Fermentación de B. megaterium para la producción de PI15 PLC
El B. megaterium/pCG682 descrito en el Ejemplo 6 se utilizó para la producción de PI-PLC mediante fermentación. El medio (PM) para las etapas de siembra y fermentación contenía 20 g/L de Amberferm 4015 (Universal Flavors Bionutrients, Indianapolis, IN), 10 g/L de extracto de levadura Amberex 695 (Universal Flavors
20 Bionutrients, Indianapolis, IN), 10 g/L de NZ Case Plus (Quest International, Hoffman Estates, IL), 2,0 g/L de K2HPO4, 0,1 g/L de MgSO4 7H2O y 2,0 g/L de glucosa inicialmente y 12,5 mg/L de tetraciclina. El pH se ajustó hasta 7,5.
La etapa de siembra (500 ml en un frasco con deflectores de 2,8 litros) se inició mediante la inoculación a partir de un vial de siembra congelado y con agitación a 250 RPM a 30°C. Los viales de siembra se prepararon mediante la adición de una única colonia cultivada en una placa con agar LB en 20 ml de PM en un frasco con agitación de 250 ml. Después del crecimiento hasta aproximadamente 1,0 DO600 a 30°C, se añadieron 5 ml de glicerol estéril al 50%, se mezcló y la solución se distribuyó en viales estériles de plástico de 2 ml y se congelaron a -60°C.
Los frascos de siembra de 500 ml se utilizaron después del crecimiento hasta aproximadamente 1,2 a 1,8 DO600 nm después de 9 horas de agitación. Se utilizaron dos frascos para sembrar un fermentador de 60 litros llenado con 50 litros del mismo medio esterilizado con vapor. Se sometió a filtrado estéril la tetraciclina (filtro de 0,2 micrones) como una solución al 1% en etanol al 40% y se añadió después de la esterilización y enfriamiento hasta 30°C. En los fermentadores, también se añadió 0,1 ml/L de antiespuma Mazu DF10PMOD11 (BASF, Gurnee, IL) en el lote inicial y se añadió según lo necesario para controlar la espuma durante las fermentaciones. Las condiciones de operación para la etapa de sembrado del primer fermentador fueron las siguientes: presión 3447,38 a 17236,89 Pa (0,5 a 2,5 psig); temperatura 30°C ± 0,5°C; agitación 200 a 450 RPM; inyección de aire 25 a 50 SLPM; oxígeno disuelto 25%. El pH se controló en 6,9 a 8,1 mediante H3PO4 21,25% o NaOH 5N. Cuando la DO600 alcanzó 8-10, se utilizaron los contenidos para sembrar un fermentador de 600 L que contenía 425 L de mismo medio.
Las condiciones de operación para el fermentador de producción de 600 L fueron las siguientes: presión 3447,38 a 17236,89 Pa (0,5 a 2,5 psig); temperatura 30°C ± 0,5°C; agitación 100 a 300 RPM; inyección de aire 250 a 500 SLPM; oxígeno disuelto 25%. El pH se controló en 6,9 a 8,1 mediante H3PO4 21,25% o NaOH 5N. Cuando la glucosa inicial se agotó a las 5 horas y la DO600 de aproximadamente 17, se inició la alimentación con xilosa (pre-esterilizada por autoclave a 121°C durante 20 minutos y compuesta por 10 kg de D-(+)-xilosa y 10 litros de agua). La D-Xilosa se obtuvo de Varsal Instruments, Nueva Jersey. La alimentación comenzó inicialmente a 25 ml/minuto y se mantuvo durante 1,5 hora, después se incrementó a 43 ml/minuto. La segunda velocidad se mantuvo hasta que todos los 22,5 litros de la alimentación de xilosa se hayan consumido. El oxígeno disuelto se mantuvo a través del aumento del aire de inyección en incrementos de 50 SLPM hasta 500 SLPM. Una vez que el flujo de aire estaba en 500 SLPM, se incrementaron después las RPM. Se finalizó la fermentación a las 20 horas. A las 17 horas, se habían acumulado 7440 U/L (unidades según lo definido por el Ejemplo 4).
El caldo de fermentación se cosechó con un Pall Filtron C10 Skid y cuatro módulos CeliFlo Microgon (poro de membrana de 0,2 μm, fibras de 1 mm de diámetro con 3,3 m2). El filtrado de membrana de 0,2 μm se concentró mediante un LT100 Pall Filtron Skid con una membrana de ultrafiltración 10K Tamaño 85 de A/G Technologies. El concentrado final era de un volumen de 10 litros y se congeló a -20 °C.
EJEMPLO 8 El caldo de fermentación de Bacillus cereus no contenía actividad antibiótica
Se condujo la fermentación con Bacillus cereus (ATCC 7004) conforme al método descrito en el EJEMPLO 2 excepto que el volumen inicial se incrementó hasta 20 litros. Se condujo un ensayo para la presencia de antibiótico con E. coli MG1655 como cepa de ensayo con el caldo de fermentación final o PI-PLC parcialmente purificada preparada conforme al método descrito en los EJEMPLOS 3-5. Se condujo el ensayo como un ensayo de placa con cilindros. Véase Brantner, Pharmazie 52(1):34-40, 1997. No se observó ninguna zona clara que indicara actividad de antibióticos alrededor de los cilindros que contenían las muestras enzimáticas.
EJEMPLO 9 Ensayo de PI-PLC con ensayo de fluorescencia con placa de microtitulación
Se desarrolló un ensayo bioquímico mejorado para PI-PLC sobre el método de Hendrickson et al. (más arriba) utilizado en el Ejemplo 4. Se obtuvo el sustrato 4metilumbelliferil-mio-inositol-1-fosfato, sal de N-metil-morfolina de Biosynth (Naperville, Illinois). Las reacciones se monitorearon en un lector de placa de microtitulación con fluorescencia Flouroscan II obtenido de MTX Lab Systems (Vienna, Virginia). Para los ensayos de caldo de fermentación o concentrados de enzimas, se realizaron reacciones de 200 µl en placas de microtitulación de plástico negro compuestas por Tris-Cl 10mM, desoxicolato 0,16%, 4-metilumbelliferil-mio-inositol-1-fosfato 0,8 mM, sal de N-metil-morfolina, y enzima diluida a pH 8,0. Las diluciones de enzimas si se necesitan se realizan en solución de BSA 0,1% en agua. La reacción se siguió a 37°C durante 30 minutos mediante lecturas en intervalos de 2 minutos para observar la liberación de metilumbelliferona del sustrato con excitación a 350 nm y emisión a 450 nm.
Se utiliza la correlación de unidades de fluorescencia en micromoles de metilumbelliferona para calcular las unidades (micromoles por minuto) formadas por cantidad de solución enzimática añadida. La reacción a pH 8,0 es un compromiso entre el pH óptimo para la enzima y el pH para la máxima fluorescencia de metilumbelliferona (pH 10). También, a pH 9,0 y superior, la velocidad de liberación no enzimática de la metilumbelliferona se vuelve significativa. En esta condición de ensayo, la actividad específica (unidades/mg) es aproximadamente 39,3 veces mayor que cuando se utiliza el método de Hendrickson et al. (más arriba). Para los fines de ensayo de eficacia en los experimentos de alimentación para animales, las unidades medidas con este ensayo se convirtieron en la Unidad de Hendrickson equivalente para facilitar la comparación con los primeros ensayos antes de que se utilizara este ensayo
EJEMPLO 10 Ensayo de PI-PLC añadido a dosis efectivas en alimentos para animales
Se planeó una variación más sensible del ensayo de PI-PLC basado en 4metilumbelliferil mio-inositol-1-fosfato, sal de N-metil-morfolina, (Ejemplo 9) para medir la enzima después de la adición de alimento para animales que incluye un pH para ensayo y otro pH para medir la fluorescencia. Se extrajo la enzima de los materiales de ensayo de alimento pesando 4 g de alimento y añadiéndolo a 20 ml de Tris-Cl 10mM (pH 7,5) con desoxicolato 0,1% para preparar 20 g/L de alimento. La suspensión se agitó en un agitador NBS G-25 (New Brunswick Scientific) durante 1 hora a temperatura ambiente a 250 RPM. La suspensión se centrifugó a 13.000 RPM en una microcentrifugadora IEC Micromax con tubos de microcentrífuga de 1,5 ml. Las diluciones apropiadas de los extractos se realizaron en BSA (albúmina de suero bovino) 0,1%. Las muestras extraídas de los alimentos con la aplicación de 10 U/lb no se diluyeron.
Etapa de primera reacción –Los tubos se montaron de la siguiente manera. También deben incluirse patrones en dilución 1:100 o 1:200 de 0,12 U/ml de PI-PLC (unidad definida como en el Ejemplo 4) y también debe incluirse un ensayo en blanco. Las reacciones de las muestras deben cubrirse con láminas para proteger el sustrato de la luz.
20 µl de Tris-HCl, 0,10 M, pH 6,0
40 µl de Desoxicolato (0,8%)
40 µl de sustrato de PI-PLC (4 mM)
100 µl de enzima _____________
200 µl /tubo de Reactivo Total a 250C
Se tomaron dos puntos de tiempo (30 min y 60 min) por la eliminación de 0,10 ml de cada reacción. Se calentaron las alícuotas a 65°C durante 15 minutos para interrumpir la reacción enzimática y se enfriaron en hielo. Finalmente, las muestras se centrifugaron a 12.000 RPM en una microcentrifugadora durante 5 minutos.
Lectura del fluorómetro -120 µl de tampón Tris 0,10M (pH 8,0) se añadió tampón Tris a un pocillo de microtitulación en una placa de plástico negro, después se añadieron 80 µl de la muestra de reacción antes de realizar la lectura según lo descrito en el Ejemplo 7. Se restaron los niveles de control de fondo. Se calculó una velocidad de producción de unidades de fluorescencia por minuto. Las unidades de fluorescencia se convirtieron en micromoles de producto de reacción y se calcularon las unidades enzimáticas extraídas por libra original de alimento.
EJEMPLO 11 Ensayos de alimentación de pollos con prueba de provocación con patógenos
1. Ensayo I de alimentación de pollos parrilleros
Se realizó un primer ensayo de alimentación comenzando con pollos parrilleros machos de un día. Se preparó una dieta alimenticia uniforme típica de pollos de "alimento iniciador," diseñada para cumplir con o exceder los REQUERIMIENTOS DE NUTRIENTES PARA AVES DE CORRAL del Consejo Nacional de Investigación (9° edición, 1994), y se suministró en forma de puré. Los pollos se dividieron en jaulas (espacio de piso de 12 pulgadas x 24 pulgadas) en cuatro grupos de tratamiento con cada grupo de tratamiento repetido cuatro veces y seis aves por repetición de jaula (TABLA 3). Se proporcionaron alimento y agua ad libitum a lo largo de todo el período de ensayo de 21 días. Se utilizó un diseño en bloque aleatorizado para asignar los pollos a jaulas y las jaulas a los grupos de tratamiento. Todas las jaulas, alimentadores y bebederos se sanitizaron previo al comienzo del ensayo. La iluminación era continua (24 horas por día) con lámparas incandescentes. Se determinaron los pesos corporales el día 1 y día 21. El consumo de alimento se midió el día 21.
El día 5, todos los pollos se infectaron con 200.000 oocistos por ave de Eimeria acervulina por cebadura oral. El día 7, todas las aves se infectaron además con
500.000 Clostridium perfringens a través del suministro de agua. En el control negativo (T1) no hubo ningún tratamiento por infección. En el control positivo (T2) se añadieron un coccidiostato y antibiótico al alimento. Esto fue el tratamiento anti-coccidiosis Sacox (salinomicina en 60 g/ton) y el antibiótico BMD-50 (50 g/ton). Para los grupos de tratamiento, T3 yT4, se utilizó alimento tratado con la enzima PI-PLC de tipo salvaje (aproximadamente 0,34 gramos PI-PLC en forma pura) comenzando el día cinco en el momento de la cebadura oral con Eimeria acervulina. Todo el alimento se preparó en un lote uniforme, después se dividió para la adición de antibiótico (Grupo de ensayo T2) o enzima (Grupos de ensayo T3 y T4). Los resultados del análisis del peso de las aves se presentan en la Tabla 4 y los cálculos alimento/ganancia se presentan en la Tabla 5.
Tabla 3. Tratamiento experimental para el Ensayo I de alimentación de pollos parrilleros
Grupo de ensayo #
Descripción del ensayo Material de ensayo Réplicas Pollos por réplica
T1
Control Negativo Ninguno 4 6
T2
Control Positivo Tratamiento con coccidiostato y salinomicina 4 6
T3
PI-PLC tipo salvaje 0,34g de enzima/ton (forma pura) 4 6
T4
PI-PLC tipo salvaje 0,34g de enzima/ton (forma pura) 4 6
Tabla 4. Peso corporal promedio (g) a los 21 días
Tratamiento
Réplica
T1 T2 T3 T4
1
323,00 341,67 377,83 366,67
2
326,67 321,33 383,83 361,17
3
299,33 337,33 378,83 361,33
4
211,67 254,00 374,33 403,40
Media
290,17 313,58 378,71 373,14
STAT
b b a a
S.D.
46,52 35,22 3,40 17,61
C.V.
16,03 11,23 0,90 4,72
Tabla 5. Conversión de alimentación promedio (0-21 días) corregida para peso de mortalidad de aves
Tratamiento
Réplica
T1 T2 T3 T4
1
1,486 1,569 1,407 1,445
2
1,562 1,532 1,423 1,421
3
1,524 1,562 1,432 1,406
4
1,760 1,462 1,438 1,404
Media
1,583 1,531 1,425 1,419
STAT
b b a a
S.D.
0,11 0,04 0,01 0,02
C.V.
6,68 2,78 0,82 1,17
En ambas tablas anteriores, las medias en una fila sin una letra común son significativamente diferentes (P<0,05), según el ensayo para significación de Duncan.
II. Ensayo II de alimentación de pollos parrilleros
Se condujo un segundo ensayo de alimentación comenzando con pollos
5 parrilleros macho de 1 día. Las dietas basales se diseñaron para exceder los Requerimientos de Nutrientes para Aves de Corral del Consejo Nacional de Investigación (9° Ed., 1994) y se prepararon en forma de puré para asegurar uniformidad. El estudio se realizó en jaulas con batería aleatorizada, en forma ciega, para ensayar el efecto de PI-PLC hecho a partir de la fuente natural, Bacillus cereus
10 (PI-PLC de tipo salvaje), o un Bacillus megaterium recombinante en el desempeño de parrilleros machos criados hasta 21 días de edad. La fuente natural también contiene otras enzimas extracelulares pero la PI-PLC preparada a partir de Bacillus megaterium es altamente purificada y además se purificó mediante ultrafiltración con una membrana de 30 Kd de NMWC. Las aves se sometieron a una prueba de
15 provocación a los 8 días de edad con coccidia aviar (200.000 oocistos de E. acervulina por ave a través del agua de bebida) y a los 10 días de edad con Clostridium perfringens (100.000 por ave a través del agua de bebida). Cada uno de los nueve tratamientos (Tabla 6) tuvo 10 réplicas o jaulas. Cada jaula contenía 6 parrilleros macho Cobb x Cobb vacunados (Newcastle-Bronchitis, Mareks) con un espacio de
20 0,037 m2/ave (0,40 pies2/ave). Las aves muertas, si estaban presentes, no se reemplazaron después del 8° día. El alimento se suministró en forma de puré en forma ad libitum a lo largo de todo el período de ensayo completo (día 0 a día 21). Se suministró una dieta de puré basal no tratada y común, que no contenía antibióticos, a todas las aves desde el día 0 a 7. Desde ese momento, se
25 suministraron nueve dietas tratadas, en forma de mezcla, desde 8-21 días de edad. La alimentación basal era un alimento iniciador típico para parrilleros que contenía 22% de proteína cruda, con un ME (contenido de energía metabolizable) de 3086,44 kcal/kg (1400 kcal/lb).
Tabla 6. Tratamiento experimental para el Ensayo II de alimentación de 30 pollos parrilleros
Tratamiento
Artículo de ensayo Prueba de provocación con infección1
T1
Ninguno +
T2
Bacitracina metilendisalicilato (BMD, 50g/ton) y Salinomicina (Sacox, 60 g/ton) +
T3
PI-PLC Recombinante (3 U/Ib) producida +
por Bacillus megaterium
T4
PI-PLC Recombinante (10 U/lb) producida por Bacillus megaterium +
T5
PI-PLC Recombinante (30 U/lb) producida por Bacillus megaterium +
T6
PI-PLC Recombinante (90 U/lb) producida por Bacillus megaterium +
T7
P1-PLC (10 U/lb) y otras enzimas extracelulares de Bacillus cereus +
T8
Ninguno Ninguno
T9
PI-PLC Recombinante (90 U/lb) producida por Bacillus megaterium Ninguno
1Se administraron 200.000 oocistos de E. acervulina por ave a través del agua de bebida a los 7 días, y a los 10 días de edad con 100.000 bacterias de Clostridium perfringens por ave a través del agua de bebida.
Tabla 7. Ensayo II de alimentación de pollo parrilleros
1 PI-PLC Recombinante producida por Bacillus megaterium.
Tratamiento
1 2 3 4 5 6 7 8 9
Infección
+ + + + + + + - -
Medicación
- + - - - - - - -
Tipo de PI-PLC
Rec1 Rec1 Rec1 Rec1 Wt2 Rec1
U/lb Objetivo
- - 3 10 30 90 10 - 90
U/lb medido en el ave
0,36 0,32 0,323 0,71 1,74 5,96 2,46 0,12 5,94
Ganancia de peso a los 821días
309,72 333,83 323,24 324,78 320,64 328,29 298,98 326,12 338,8
cd
ab bc ab bc ab D Ab a
Conversión alimenticia a los 8-21días (Corregida)
1,859 1,642 1,702 1,732 1,699 1,739 1,876 1,651 1,650
c
a ab b ab b C A a
Puntaje de lesión intestinal promedio
1,447 0,833 1,120 1,133 0,842 0,808 1,267 0,983 0,847
d
A bc bc a a Cd ab a
2 PI-PLC de tipo salvaje de Bacillus cereus. 3El nivel de adición de P1-PLC es demasiado bajo para que sea extraído y medido efectivamente en este experimento y apareció cono nivel de fondo.
En el primer ensayo cuando la infección bacteriana se administró a través del agua de bebida (Ejemplo 11-I,), por todos los criterios la PI-PLC de tipo salvaje producida por Bacillus cereus funcionó tan bien como o mejor que el tratamiento con Salinomicina + BMD (Tablas 4-5). En un ensayo posterior mostrado más arriba con PI-PLC recombinante (Ejemplo 11-II, Tabla 7), PI-PLC añadida en concentraciones variables, mostró un efecto dependiente de la dosis en la reducción del puntaje de lesión intestinal y conversión alimenticia (T3-T6) e incremento de ganancia de peso. Además, el tratamiento con PI-PLC recombinante, en 90 U/lb, en ausencia del tratamiento con Salinomicina + BMD, redujo el puntaje de lesión intestinal y tuvo un efecto positivo en la conversión alimenticia y ganancia de peso. PI-PLC de tipo salvaje de Bacillus cereus no funcionó tan efectivamente como su contraparte recombinante en la misma concentración (10U/lb) en este ensayo.
III. Ensayo III de alimentación de pollos parrilleros con enzimas, PI-PLC y endo-1,4--D-mananasa
Se condujo un estudio en jaulas con batería Petersime aleatorizado para ensayar el efecto de PI-PLC y endo-1,4--D-mananasa (Patente Estadounidense N° 5.429.828) en el desempeño de parrilleros macho criados hasta los 21 días de edad. Las aves se sometieron a prueba de provocación a los 8 días de edad con coccidia aviar (75.000 de oocistos de E acervulina y 1.250 oocistos de E. maxima por ave por cebadura oral) y a los 11, 12, y 13 días de edad con Clostridium peifringens (cebadura oral cada día con 1 ml de caldo de cultivo fresco con 108 ufc/ml). Cada tratamiento (Tabla 8) consistió en 8 réplicas o jaulas y cada jaula albergó 14 parrilleros macho Cobb x Cobb vacunados contra la enfermedad de Marek (reducidos a 10 el día 14 ya que se eliminaron 4 aves de cada jaula y se calificaron en cuanto a lesiones) con un espaciado de 0,033 m2/ave (0,36 pies2/ave). Las aves muertas se eliminaron de las jaulas cuando se detectaron y no se reemplazaron. El alimento se suministró en forma de PURÉ ad libitum a lo largo de todo el período de ensayo completo (día 0 a día 21).
Las dietas se suministraron en forma de PURÉ desde los 0-21 días de edad. La alimentación basal era un alimento iniciador típico para parrilleros que contenía 22% de proteína cruda, con un ME de 3086,44 kcal/kg (1400 kcal/lb).
Tabla 8. Tratamientos experimentales con Ensayo III de alimentación de pollos parrilleros
Tratamiento
Medicación1 Prueba de provocación con infección3 PI-PLC Mananasa2
1
+ - - -
2
+ - - 100 MU/T
3
- + _ -
4
- + - 100 MU/T
5
- + PI-PLC de tipo salvaje (10 U/lb) producida por Bacillus cereus -
6
- + PI-PLC recombinante (30 U/lb) producida por Bacillus megaterium -
7
- + PI-PLC recombinante (10 1J/lb) producida por Bacillus megaterium 100 MU/T
8
- + PI-PLC recombinante (30 U/Ib) producida por Bacillus megaterium 100 MU/T
9
+ + - -
10
+ + PI-PLC recombinante (30 U/Ib) producida por Bacillus megaterium -
1La dieta contenía bacitracina metilendisalicilato (BMD, 50 g/ton) y salinomicina (Sacox. 60 g/ton). 2100 MU/T es igual a100 x 106 unidades de actividad por tonelada de alimento.
5 3 Las aves se sometieron a prueba de provocación a los 8 días de edad con 75.000 oocistos de
E. acervulina y 1.250 oocistos de E. maxima por ave por cebadura oral y a los 11, 12, y 13 días de edad con Clostridium perfringens por cebadura oral cada día con un de caldo de cultivo fresco que tenía 108 ufc/ml.
10 Las conversiones de alimentos se ajustaron en cuanto a las diferencias en pesos de ave promedio para los fines de comparar los tratamientos. La infección empeoró la AF/G (conversión alimenticia ajustada por peso) en aproximadamente 23% (0,147 unidades AF/G). El uso de salinomicina y BMD restauró completamente los niveles de AF/G a niveles normales, pero estos dos productos químicos no fueron
mejores que la combinación de mananasa y PI-PLC en la reducción de las lesiones intestinales causadas por infección. Cien millones (100 MU) de unidades de mananasa por tonelada sola o en combinación con PI-PLC superaron parcialmente las consecuencias nocivas de la infección según lo evidenciado por el 65% a 70% de 5 mejora en la reducción de AF/G presente en el control infectado (véase T3 v. Ti). La manasa pareció reducir el puntaje de lesión intestinal causado por E. acervulina más que E. maxima. La restauración parcial de AF/G se alcanzó en las aves infectadas tratadas con PI-PLC en el alimento, pero solamente se superó el 33-41% del empeoramiento. Sin embargo, ambas clases de PI-PLC redujeron el puntaje de lesión
10 intestinal causado por cualquiera de las especies de Eimeria. En el caso de E. maxima, la reducción de la lesión fue estadísticamente significativa. Los resultados se muestran en la Tabla 9.
Tabla 9. Ensayo III de alimentación de pollos parrilleros con PI-PLC y endo-1,4--D-mananasa suministradas a pollos infectados con 15 E. acervulina, E. maxima y C perfringens
Descripción del
Consumo de Conversión Ganancia de Peso Puntaje
tratamiento
alimento alimenticia peso con de
vida
lesiones
I1
M2 βmananasa PIPLC Día 0-21 Día 821 Día 021 Día 821 Día 021 Día 821 Día 21 E. acer E. max AF/G3 Peso v.
Trata
miento
1
No Sí No No 11,178ab 8,866a 1,433 dc 1,446 d 0,659a 0,540 a 0,701a 0,00c 0,00c 1,433
2
No Sí 100 No 11,230a 8,841a 1,402 1,424 0,678 0,548 0,720a 0,00c 0,00c 1,416
MU/ton
c d a a
3
Sí No No No 10,497abc 8,155abc 1,669 1,704 0,538 0,429 0,579d 1,38a 1,56a 1,579
a
a
d c
4
Sí No 100 MU/ton No 10,787'cd 8,435abc 1,501c d 1,536 b 0,611 bc` 0,490 6 0,652bc` 1,16ab 1,44ab 1,465
5
Sí No No 1X Rec 10,456`cd 8,228abc 1,560 bc 1,591 bc` 0,594c 0,477 b 0,635c 1,34a 1,19bc ` 1,512
10
U/lb
6
Sí No No 3X Rec 30 U/lb 10,266d 7,982c 1,572 b 1,621a b 0,597c 0,483 b 0,638c 1,16ab 1,13cd 1,526
7
Sí No 100 MU/ton IX Rec 10 U/lb 10,533'abc 8,227abc 1,514 bc 1,536c 0,598c 0,482 b 0,639c 1,09b' 1,25bc 1,469
8
Sí No 100 MU/ton 3X Rec 30 U/lb 10,496bcd 8,156bc 1,516 bc 1,562 bc 0,601c 0,478 b 0,643c 1,25ab 1,38ab c 1,474
9
Sí Sí No No 11,060abc 8,658ab 1,423c 1,447 d 0,650a 0,522a 0,692a 1,03b 0,88d 1,416
1 0
Sí Sí No 3X Rec 30 U/lb 10,666abc 8,359abc 1,430c 1,444 d 0,647a b 0,526a 0,688ab 1,03b 1,13cd 1,420
1I Infección.
2M=Medicación (Salinomicina (60 g/ton) yBMD (50 g/ton)).
3AF/G= conversión alimenticia ajustadaal peso (Tratamiento 1 Ibsdía 21 -Tratamiento X Ibsdía 21)/3) + (alimento consumido/ganancia de peso (día 0-21) ).
Unidades PI-PLC son unidades en base al Ejemplo 4.
Hemicell MU = millón de unidades ChemGen
IV. Ensayo IV de alimentación de pollos parrilleros
El estudio se realizó en jaulas Petersime aleatorizadas para ensayar el efecto de PI-PLC, mananasa (Patente Estadounidense N° 5.429.828) y enzima mananasa 5 fúngica en el desempeño de parrilleros machos criados hasta los 21 días de edad. Las aves se sometieron a prueba de provocación a los 8 días de edad con coccidia
(75.000 oocistos de E acervulina y 1.250 oocistos de E. maxima por ave por cebadura oral, y a los 11, 12, y 13 días de edad con Clostridium perfringens (cebadura oral cada día con cultivo de caldo fresco que tenía 108 ufc/ml). Cada uno de los tratamientos
10 tenía 8 réplicas o jaulas. Cada jaula inicialmente albergó 14 parrilleros macho Cobb x Cobb vacunados contra enfermedad de Marek, (reducidos a 10 el día 14 ya que 4 aves fueron eliminadas por puntaje de lesión) con un espacio de 0,033 m2/ave (0,36 pies2/ave). Las aves no fueron reemplazadas. El alimento y agua se suministraron ad libitum a lo largo de todo el período de ensayo completo (Día 0 a Día 21). Las dietas se suministraron como PURÉ desde 0-21 días de edad. El alimento basal para los tratamientos 1 a 16 fue alimento iniciador para parrilleros típico de maíz/soja que contenía 22% de proteína cruda, con un ME de 3086,44 kcal/kg (1400 kcal/lb).
Los resultados resumidos en la Tabla 10 más abajo demuestran el beneficio
5 reproducible de adicionar PI-PLC o mananasa en los alimentos para pollos parrilleros infectados con dos especies de coccidia aviar y Clostridium perfringens lo que causó mejora en la ganancia de peso y la conversión alimenticia. De manera importante, este estudio muestra que PI-PLC o mananasa cuando se combinan con salinomicina, pero sin el antibiótico BMD (Ensayos 6 y 5) restauran el desempeño básicamente al nivel de
10 los ensayos no infectados (N° 1 y 2). Esto proporciona evidencia de la función antibacteriana. En este caso, PI-PLC/Salinomicina se desempeñaron algo mejor que la mananasa, y aún superaron el resultado de la práctica actual en los EE.UU. de adición de combinación de BMD y salinomicina para los grupos de animales infectados (Test 4).
15 Tabla 10. Ensayo IV de alimentación de pollo parrilleros
Ensayo
I1 E2 M3 Puntaje de lesiones Conversión alimenticia Ganancia de peso Peso con vida
E. acer.
E. max.
Superior
Medio Día 0-21 Día 8-21 Día 0-21 Día 8-21 Día 21
1
- - - 0,00 0,00 1,652 1,694 0,527 0,427 0,565
2
- - B/S 0,00 0,00 1,612 1,656 0,546 0,437 0,583
3
+ - - 2,44 2,31 1,813 1,909 0,394 0,296 0,432
10
+ - B 2,25 1,94 1,707 1,770 0,453 0,352 0,490
7
+ - S 1,00 1,09 1,709 1,719 0,458 0,368 0,496
4
+ - B/S 0,59 1,63 1,585 1,671 0,509 0,397 0,547
16
+ PI-PLC - 2,25 1,50 1,701 1,778 0,451 0,347 0,486
9
+ PI-PLC B 2,03 1,34 1,760 1,844 0,445 0,342 0,482
6
+ PI-PLC S 1,06 1,28 1,584 1,613 0,526 0,419 0,564
12
+ Man. - 1,94 1,34 1,803 1,849 0,433 0,338 0,483
13
+ Man. 5x - 2,13 2,00 1,740 1,813 0,437 0,339 0,471
8
+ Man. B 2,09 1,34 1,707 1,772 0,448 0,348 0,486
5
+ Man. S 0,97 1,09 1,652 1,688 0,500 0,397 0,538
11
+ Man. B/S 0,78 1,16 1,622 1,666 0,502 0,390 0,540
1I=Infección: sometidos a prueba de provocación a los 8 días de edad con 75.000 oocistos de E. acervulina y 1.250 oocistos de E. maxima por ave por cebadura oral, y a los 11, 12, y 13 días de edad con Clostridium perfringens por cebadura oral con 1 ml de cultivo de caldo fresco
que tenía 108 ufc/ml. 2E=Enzimas: PI-PLC = PI-PLC recombinante producida por B. megaterium añadida en 30 U/lb, unidades definidas como en el Ejemplo 4; Man.= B. lentus endo-1,4--D-mananasa (Patente Estadounidense N° 5.429.828) añadido en 121 MU/ton (millones de ChemGen unidades/tonelada), o 5x en 506 MU/ton. 3M=Medicación (B=BMD en 50g/ton); S= Salinomicina(en 60 g/ton).
EJEMPLO 12 Determinación del efecto de las enzimas en la viabilidad e invasión celular por esporozoitos de Eimeria acervulina y Eimeria tenella in vitro
Los esporozoitos de Eimeria acervulina o esporozoitos de Eimeria tenella y células de riñón de hámster bebé cultivadas (BHK) se prepararon mediante los métodos publicados. Véase Augustine, Avian and Poultry Biology Reviews 11:113-122, 2000. Para el pretratamiento de células, los cultivos celulares se superpusieron con diluciones enzimáticas según lo descrito en la Tabla 11, y se examinaron en cuanto a los cambios morfológicos de 5 a 45 minutos posterior a la superposición. Después de 45 minutos, los cultivos de monocapa se lavaron dos veces, después se inocularon con esporozoitos de E. acervulina o E. tenella no tratados. Para la aplicación durante la infección, los esporozoitos se suspendieron en la dilución apropiada de la enzima y se inocularon inmediatamente en los cultivos celulares. Después de la incubación de 45 minutos, los cultivos se fijaron, sometieron a tinción, y se cuantificó la invasión.
Se realizaron las observaciones mirando los cambios en la morfología macroscópica de los esporozoitos o células debido al tratamiento enzimático. En los niveles enzimáticos utilizados en estos experimentos, no se observó ningún cambio morfológico. La invasión de esporozoitos de las células cultivadas se midió después de los dos métodos de tratamiento enzimático, así como sin tratamiento enzimático, mediante procedimientos de tinción histológica y microscopía. Véase Augustine, más arriba.
Los datos en la Tabla 11 muestran reducciones importantes en la invasión de esporozoitos con ambas invasiones de esporozoitos de E. acervulina o E. tenella. Tanto la preparación de la enzima PI-PLC relativamente impura de caldo extracelular de B. cereus, y la PI-PLC recombinante altamente pura producida en caldo de B. megaterium recombinante dieron como resultado una reducción estadísticamente importante de la invasión en la mayoría de los experimentos. Aún en aproximadamente media dosis de preparación de PI-PLC de tipo salvaje de B. cereus, la preparación de PI-PLC recombinante aún estaba activa. De ese modo, el pretratamiento de las células con enzima y lavado de la enzima fue tan efectivo como añadir la enzima concurrentemente durante la infección. Sin embargo, en base a la experiencia con la extracción enzimática del alimento, las dos etapas de lavado posiblemente no eliminan la totalidad de la enzima.
Una preparación enzimática con endo-1,4--D-mananasa también causó una
5 reducción estadísticamente importante de la invasión en dos experimentos donde las células fueron pre-tratadas con enzima antes de la infección. Estos resultados positivos incluyeron un experimento con cada tipo de patógeno. Por ello, la mananasa también se desempeñó tan bien como la preparación de PI-PLC de B. cereus para reducir la invasión de esporozoitos in vitro.
10 Tabla 11. Invasión in vitro de células BHK por esporozoitos de Eimeria acervulina o Eimeria tenella con y sin tratamientos enzimáticos.
Enzimas y Concentraciones
Pretratamiento de células con enzima seguido por lavado Aplicación enzimática durante la infección
Esporozoitos de E. acervulina
Ensayo 1 Ensayo 2 Ensayo 1 Ensayo 2
Control
22±1a 33±4a 50+4a 35±7a
PI-PLC de B. cereus1 0,0403 U/ml
15 ± 1b 26 ± 1ab 33 ± 3b 25 ± 2ab
PI-PLC de B. megaterium2 recombinante a 0,261 U/ml
14 ± 1b 22 ± 1b 16 ± 2 c 18 ± 1bc
PI-PLC de B. megaterium2 recombinante 0,0261 U/ml
18 ± 1ab 26 ± 1ab 36 ± 3b 9 ± 2 c
Endo-1, 4--D-mananasa3 5100 U/ml
16 ± 1b 29 ± 2 ab ND 4 ND
Esporozoitos de E. tenella
Ensayo 1 Ensayo 2 Ensayo 1 Ensayo 2
Control
44±2 a 26±4 a 63 ± 5 a 42 ± 4 a
PI-PLC de B. cereus1 0,0403 U/ml
38±2b 21 ± 2a 52 + 13 ab 37 ± 2 ab
PI-PLC de B. megaterium2 recombinante a 0,261 U/ml
30 ± 1 c 15± 0a 28 ± 2 b 39 ± 4 ab
PI-PLC de B. megaterium2 recombinante 0,0261 U/ml
ND 17 ± 1 a 18 ± 1 c 29 ±1 b
Endo-1, 4--D-mananasa3 5100 U/ml
35 ± 1b 19 ± 5 a 46 ± 6 ab ND
Los recuentos de invasión se informaron como media ± error estándar de la media medida de 1-3 cubreobjetos/aberración (las células BHK se cultivaron en 15 cubreobjetos insertados en placas de cultivo). Las medias dentro de los grupos de
ensayo con diferentes exponentes difieren significativamente (P < o = 0,05).
1Enzima extracelular de B. cereus dializada en solución salina tamponada con fosfato, unidades estandarizadas con el método del Ejemplo 4.
2Enzima extracelular de B. megaterium recombinante dializada en solución salina tamponada con fosfato, unidades estandarizadas con el método del Ejemplo 4.
3Mananasa obtenida de Bacillus lentus según lo descrito en la Patente Estadounidense 5.429.828 y dializada en solución salina tamponada con fosfato, las unidades son según lo definido por el ensayo de azúcares reductores de ChemGen Corp..
4ND= no determinado.
EJEMPLO 13 Evaluación in vitro de PI-PLC para la infección con Cryptosporidium
La enzima PI-PLC se evaluó en cuanto a la actividad anti-criptosporidial y toxicidad en concentraciones que variaban de 0,001-30 U/ml, que se realizaron con células de riñón de canino Madin-Darby de 4 días (MDCK). Las unidades enzimáticas se definieron mediante el método en el Ejemplo 4 pero se midieron como en el Ejemplo 9. La preparación enzimática utilizada fue de Bacillus megaterium recombinante. El tratamiento se inició 3 horas después de la infección y se continuó a lo largo de 48 horas.
Inmunoensayo de quimioluminescencia. Antes de la infección, los oocistos se lavaron y se resuspendieron en base de DMEM con taurocolato de sodio 0,75% y se incubaron durante 10 minutos a 370C (You et al., FEMS Microbiol. Letters 136:251256, 1996; You et al., J. Antimicrobial. Chemother. 41:293-296, 1998). La mezcla de exquistación se diluyó con medio Ultraculture, se dispensó rápidamente en placas que contenían células MDCK, en 100% de confluencia, y se mantuvo en medio Ultraculture durante 4 días. El inóculo se incubó con las células durante 3 horas antes del lavado con PBS y se reemplazó con medio Ultraculture fresco con o sin la enzima de ensayo. Las placas se incubaron a 37°C, en una atmósfera de aire con CO2 al 5% durante 48 horas. Los cultivos se lavaron con PBS y se fijaron con solución de Bouin.
Las placas fijadas se lavaron con tampón de TBST (Tris-HCI 20 mM (pH 7,5), NaCl 150 mM, Tween-20 0,05%) y se bloquearon con BSA-TBST 1% (tampón de TBST que contenía albúmina de suero bovino 1%) durante 30 minutos a 25°C con agitación suave. Se aplicó suero anti-Cryptosporidium parvum de conejo (dilución 1:200) a las placas y se incubaron durante 1 hora. Después del lavado con TBST, las muestras se incubaron secuencialmente con IgG anti-conejo de cabra marcada con biotina y estreptavidina marcada con peroxidasa de rábano picante (dilución de trabajo, 1:1000, KPL Inc., Gaithersburg, MD). Se utilizó Luminol potenciado (4iodofenol y peróxido de hidrógeno, Aldrich Chemical Co. Inc., Milwaukee, WI) como sustrato. Se leyeron las placas con un Luminómetro ML3000 (Dynatech Lab., Chantilly, VA) y se determinaron las unidades de luz relativa (RLU). Se calcularon las medias de RLU a partir de 4 pocillos replicados y todos los experimentos se repitieron al menos dos veces.
Ensayo de toxicidad. La enzima se analizó con un ensayo de reducción de colorante de tetrazolio comercial (CellTiter 96; Promega Corp., Madison, WI, EEUU). En resumen, cada concentración enzimática indicada más abajo se introdujo en placas de 96 pocillos que contenían monocapas de células MDCK confluentes. Se evaluó cada dilución por triplicado. La enzima se incubó en las monocapas a 37°C y CO2 5%. A las 48 horas, las placas se desarrollaron durante 1 hora y se leyeron en el lector de placas de ELISA a 490 nm. Se registraron los resultados y se analizaron. La toxicidad porcentual se calculó mediante la resta de la DO media del control de medio sin la enzima de la DO media con la enzima y después se dividió por la DO del medio y se multiplicó por 100. Los puntajes de citotoxicidad se asignaron según lo indicado en la
siguiente tabla.
% de Toxicidad
Puntaje
0-5%
0
6-25%
1
26-50%
2
51-75%
3
76-100%
4
Se observó toxicidad significativa con 3U/ml o con mayor concentración de la enzima. No se observó ninguna toxicidad significativa con esta enzima en el intervalo de 0,1-1 U/ml (Tabla 12). Por ello, se realizó un grupo de experimentos en este intervalo de concentración (1,0 U/ml o menor) para determinar la actividad y especificidad de la enzima. En el primer experimento, las células MDCK se infectaron con esporozoitos exquistados. Después de un período de incubación de 3 horas, La monocapa celular se lavó y la enzima se añadió en diferentes concentraciones durante un período de 48 horas. Según lo mostrado en la Tabla 13, la enzima demostró actividad anti-criptosporidial en el intervalo de 0,01-1 U/ml in vitro. Se logró aproximadamente 50% de inhibición en una concentración de 0,1 U/ml (Figura 1).
Tabla 12. Toxicidad de PI-PLC recombinante preparada en
B. megaterium para cultivos celulares monocapa de MDCK
imagen1
10 U/ ml
83 4
3
57
3
1
13
1
0,3
11 1
0,1
10 1

Tabla 13. Actividad de la enzima PI-PLC recombinante con cultivos celulares de MDCK infectados con C. parvum
Tratamiento
Unidad/ml Inhibición porcentual Número medio de Cryptosporidium por pocillo de placa de microtitulación 95% CL
Posterior a la infección durante 3 horas
1 77,36 285,28 0,01
0,3
77,26 286,5 0,04
0,1
52,74 595,53 0,18
0,03
27,62 912,15 0,22
0,01
7,33 1167,78 0,09
Infectado
- 0 1260,18 0,09
No infectado
- 100 0 0,02
5
Se llevó a cabo un segundo grupo de experimentos para evaluar la especificidad enzimática. Se trataron los esporozoitos con la enzima en diversas concentraciones durante 45 minutos y se lavaron por corto tiempo. Después se permitió que los esporozoitos tratados infectaran células huésped no tratadas y se
10 desarrollaran y se reprodujeran durante 48 horas. En un experimento separado, se incubaron las células huésped con la enzima en diferentes concentraciones, se lavaron y se infectaron con esporozoitos no tratados. Según lo mostrado más abajo (Tabla 14), el tratamiento del esporozoito o células huésped con la enzima da como resultado la inhibición parcial. No se observó una inhibición dependiente de la dosis en
15 este intervalo de concentración. Esto puede deberse al corto período de incubación de la enzima con células huésped o de parásitos (45 minutos) o la escisión incompleta
o parcial de los receptores de parásitos/huésped. Adicionalmente, probablemente están involucrados otros receptores de parásitos/huésped en la infección y explican el crecimiento observado en las células huésped.

Tabla 14. Tratamiento pre-infección de esporozoitos o células MDCK y el efecto en la infectividad de C parvum
Tratamiento
PI-PLC Unidad/ml Inhibición porcentual Número medio de Cryptosporidium por pocillo de placa de microtitulación 95% CL
Esporozoito tratado antes de la infección
1 67,27 412,40 0,02
0,3
65,64 433,04 0,06
0,1
57,40 536,80 0,03
0,03
58,13 527,59
0,03
0,01
56,98 542,15
0,01
Células huésped tratadas antes de la infección
1 68,76 393,64 0,12
0,3
50,07 629,24 0,26
0,1
63,82 455,88 0,19
0,03
58,53 522,66 0,12
0,01
56,84 543,85 0,10
Infectadas
0 1260,18 0,09
No infectadas
100 0 0,02
5
EJEMPLO 14 Evaluación in vivo de PI-PLC para la infección con Cryptosporidium
La enzima se evaluó en cuanto a la eficacia anticriptosporidial con un modelo de ratón SCID inmunodeficiente. Brevemente, se prepararon inóculos de oocistos 10 mediante el lavado de oocistos purificados (almacenados <6 meses) con BSA 0,1%, PBS (pH 7,2) para eliminar dicromato de potasio. Los ratones SCID (de 4-5 semanas) se infectaron con 106 oocistos (cepa IOWA) y se trataron según lo indicado más abajo. Se recolectaron muestras fecales de los ratones, se purificaron a través de sacarosa discontinua y se evaluaron en cuanto a carga de parásitos mediante citometría de flujo 15 según lo descrito previamente. Véase Arrowwood et al.,J. Parasitol. 81:404-409, 1995.

Tabla 15. Régimen de tratamiento para experimentos terapéuticos
Grupo de ratones
A B C
Número de ratones
10 10 10
Dosis de inóculo
106 106 106
Compuesto
PI-PLC PI-PLC Placebo
Dosis (mg/kg)
90 U/mI 30 U/ml PBS
Vía
Administrado en alimento Administrado en alimento Administrado en alimento
Frecuencia
Ad lib Ad lib Ad lib
El alimento para ratón granulado se recubrió con 30 o 90 U/lb de PI-PLC en PBS o PBS. Todos los ratones se alimentaron ad libitum. Los ratones recibieron
5 alimento inmediatamente después de la infección. Se recolectaron muestras fecales y pesos dos veces por semana. El consumo de alimento se midió diariamente. Los ratones se eutanizaron inyectándole a cada uno 0,2 cc quetamina 100 mg/ml, xilazina 100 mg/ml y NaCl 0,9%.
El alimento promedio consumido por día por ratón y los pesos promedio de los
10 ratones se muestran en la Tabla 16. No se observó ninguna diferencia estadísticamente significativa en el consumo de alimento o peso en el período de 3 semanas. Tabla 16. Consumo de alimento y ganancia de peso de los ratones
Grupos de tratamiento
Alimento (g) consumido/ratón/día Peso (g)
Día 3
AVG AVG
A (90U/lb)
7,56 16,67
B(30U/Ib)
6,13 17,055
C(PBS control)
5,46 16,88
Día 7
AVG AVG
A
8,31 16,95
B
8,51 16,91
C
7,27 16,89
Día 10
AVG AVG
A
8,55 17,29
B
7,93 17,08
C
7,11 16,97
Día 14
AVG AVG
A
7,78 17,43
B
8,06 17,62
C
7,55 17,38
Día 17
AVG AVG
A
8,52 17,64
B
8,53 17,84
C
7,79 17,59
Día 21
AVG AVG
A
7,89 18,25
B
8,22 18,62
C
8,51 18,14
Día 24
AVG AVG
A
9,79 18,2
B
8,3 18,63
C
8,22 18,33
Eficacia a las 3 semanas posteriores a la infección. Se recolectaron muestras de heces a las 3, 4 y 4,5 semanas posteriores a la infección y se midieron los recuentos de Cryptosporidium en las muestras de 100 microlitros de los ratones
5 SCID en los grupos tratados y de control según lo mostrado en la Tabla 17. Según lo mostrado, los ratones tratados con la enzima demostraron una reducción en la carga de parásitos. Se observaron cargas de parásitos (34-54%) en los grupos tratados. Algunas de estas reducciones fueron estadísticamente significativa cuando se evaluaron a través de análisis estadístico ANOVA (mostrado más abajo y marcado con
10 un símbolo). La enzima demuestra potencial como un agente terapéutico anticriptosporidial. Mayores dosis de la enzima o el mejor suministro de la enzima al sitio de infección podrían incrementar su eficacia y puede tratarse en futuros experimentos. Tabla 17. Eficacia de PI-PLC in vivo para reducir Cryptosporidium en heces
Grupo de tratamiento
Dosis enzimática (U/Ib) Carga de parásitos (oocistos/100µl) (SD) Día 21 Inhibición porcentual Carga de parásitos (oocistos/100µl) (SD) Día 28 Inhibición porcentual Carga de parásitos (oocistos/100µl) (SD) Día 31 Inhibición porcentual
PI-PLC
90 22,7(11,4) 44,0 26,3 (14)* 48,9 87,5(52,9) 34,0
PI-PLC
30 16,2 (4,7) 52,0 23,4 (11)* 54,6 74,3(89,7)+ 40,0
PBS (control)
- 33,5 (16,2) - 50,4 (29) - 132,1(89,) -
*Los valores P fueron significativa a 0,05 o menor. +El valor P fue 0,08 o menor.
EJEMPLO 15 Verificación de la enzima en los alimentos utilizados en los ensayos de crecimiento
Se condujo un ensayo de PI-PLC extraído de los alimentos utilizados en los
ensayos en animales anteriores según lo descrito en el Ejemplo 10. Los resultados se
resumieron en las Tablas 18-19.

Tabla 18. Estudio de Cryptosporidium, alimento para ratón
Tratamiento
Control 30 U/Ib 90 U/lb
U/lb Objetivo
0 30 90
Tipo de PI-PLC
- Recombinante de B. megaterium Recombinante de B. megaterium
PI-PLC Lote N°
- 45-46 SF 45-46 SF
Ensayos U/lb Extraído
0 22,8 66,1
% de Extraído Objetivo
- 76,0 73,4
10 La eficacia de la extracción del alimento varió considerablemente con el tipo de alimento. La extracción fuera del alimento para ratón mostró 73,4 a 76 por ciento de eficiencia (Tabla 18). Se cargaron cuidadosamente tres diferentes preparaciones de alimento para pollos fabricadas en tres sitios diferentes con 45 o 180 U/lb de PI-PLC
15 recombinante, después se extrajeron inmediatamente y se ensayaron con el procedimiento de ensayo del Ejemplo 9 ya que el nivel de carga está en el intervalo del método de ensayo continuo del Ejemplo 9 (Tabla 19). Tabla 19. Ensayo de eficiencia de extracción de diferentes fuentes de alimento para pollos y harina de maíz
Fuente de alimento para pollos
Fuente 1
Fuente 2 Fuente 3 Harina de maíz
Nivel de carga Unidades/lb
180 45 180 45 180 45 180 45
Unidades/lb extraídas
128 9,3 53,2 3,66 82,7 8,46 134,4 33
% de Unidades añadidas extraídas
71,1 20,7 29,6 8,1 45,9 18,8 74,7 73,3
Puede observarse que la eficiencia de extracción de la harina de maíz es similar a la extracción del alimento para ratón. Sin embargo, la extracción de algunas muestras de alimento para pollos fue baja en este experimento, y también en otros.
5 En el ensayo según lo mostrado en la Tabla 20, la enzima extraíble fue aproximadamente 30-45% del PI-PLC teórico mientras que la β-mananasa fue fácilmente extraíble y el rendimiento fue aproximadamente del 100%. Aproximadamente el 45% de extracción fue el mejor nivel de extracción observado con este alimento con el ensayo de extracción mostrado más arriba. De ese modo, los
10 resultados del ensayo por U/lb extraído para los alimentos del ensayo de la Tabla 20 están en el intervalo esperado para la carga utilizada. Tabla 20. Verificación de la carga enzimática en el Ensayo III de alimentación de pollos parrilleros
Tratamiento No.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Infección
- - + + + + + + + +
Medicación
+ + _ _ _ _ + +
Unidad/lb objetivo
0 0 0 0 10 30 10 30 0 30
Tipo de PI-PLC
- - - - Tipo Reco Reco Reco - Reco
salva
mbina mbina mbina mbin
je
nte nte nte ante
Ensayos Unidad/lb de PIPLC
Unidad/lb Promedio
0,94 0,76 0,79 0,7 3,08 11,48 4,56 10,18 9,49
Objetivo porcentual
- - - - 30,75 38,27 45,57 33,93 31,64
MU/ton objetivo
- 100 - 100 - - 100 100 - -
Mananasa Hemicell
- + - + - - + + - -
Ensayos MU/ton de Mananasa
MU/ton
- 124,9 - 135,5 - 153,5 172,0 - -
Objetivo porcentual
- 124,9 - 135,5 - - 153,5 172,0 - -
Si bien se han mostrado ciertas realizaciones representativas y detalles a fin de ilustrar la invención, será evidente para aquellos expertos en la técnica que pueden realizarse diversos cambios y modificaciones en la presente memora sin apartarse del ámbito de la invención.

Claims (53)

1.
Una composición que comprende (i) una enzima seleccionada de una fosfolipasa C específica de fosfatidilnositol y una fosfolipasa D específica de fosfatidilnositol, y (ii) un vehículo fisiológicamente aceptable para dicha enzima, en donde dicha composición está en una forma apropiada para la administración oral.
2.
Composición según la reivindicación 1, en donde dicha composición es un alimento.
3.
Composición según las reivindicaciones 1 o 2, en donde dicha composición contiene ningún agente anti-infeccioso distinto de dicha enzima.
4.
Composición según la reivindicación 1, en donde dicha enzima es una fosfolipasa C específica para fosfatidilnositol.
5.
Composición según la reivindicación 1, en donde dicha enzima es una fosfolipasa D específica para fosfatidilnositol.
6.
Composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde dicha composición además comprende un estabilizante, un vehículo de carbohidrato o un conservante.
7.
Composición según la reivindicación 6, en donde dicho estabilizante es un tampón, un carbohidrato o un glicol.
8.
Composición según la reivindicación 6, en donde dicho vehículo de carbohidrato se selecciona del grupo que consiste en xilosa, fructosa, glucosa, sorbitol y maltotriosa.
9.
Composición según la reivindicación 6, en donde dicho conservante se selecciona del grupo que consiste en propilparabeno, sorbato de sodio, sorbato de potasio y ascorbil palmitato.
10.
Composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en donde dicho vehículo es un producto alimenticio en el que dicha enzima está incorporada.
11.
Composición según la reivindicación 10, en donde dicho producto alimenticio es un alimento para animales compuesto por material de grano, una fuente de proteína, vitaminas, aminoácidos y minerales.
12.
Composición según la reivindicación 11, en donde dicho material de grano es maíz, sorgo, trigo, cebada o avenas.
13.
Composición según la reivindicación 11, en donde la fuente de proteína es judías o guisantes.
14.
Composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en donde dicha composición está en una formulación sólida o líquida.
15.
Composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en donde dicha enzima está contenida en un comprimido o una cubierta de cápsula de gelatina.
16.
Composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1-15, en donde dicha enzima se prepara a partir de una cepa de Bacillus cereus.
17.
Composición según la reivindicación 16, en donde dicha cepa de Bacillus cereus es ATCC 7004 o ATCC 6464.
18.
Composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1-15, en donde dicha enzima se obtiene por la expresión de un ADN recombinante en un organismo huésped.
19.
Composición según la reivindicación 18, en donde dicho organismo huésped es de una cepa de Bacillus megaterium.
20.
Composición según la reivindicación 2, en donde dicha enzima está presente en 200 UI/kg-4000 UI/kg de alimento.
21.
Uso de una enzima seleccionada de una fosfolipasa C específica de fosfatidilnositol y una fosfolipasa D específica de fosfatidilnositol, para la fabricación de una forma de dosificación oral de un medicamento para tratar o reducir el riesgo de infección del tracto digestivo.
22.
Uso según la reivindicación 21, caracterizado porque dicho uso no incluye administrar un agente anti-infeccioso distinto de dicha enzima.
23.
Uso según la reivindicación 21, caracterizado porque dicha infección es causada por un patógeno protozoo, bacteriano, levadura, viral o fúngico.
24.
Uso según la reivindicación 23, caracterizado porque dicha infección es causada por un patógeno protozoo del género Eimeria.
25.
Uso según la reivindicación 23, caracterizado porque dicha infección es causada por un patógeno protozoo del género Cryptosporidium.
26.
Uso según la reivindicación 23, caracterizado porque dicha infección es causada por un patógeno bacteriano del género Clostridium.
27.
Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 21-26, caracterizado porque dicha enzima se prepara a partir de una cepa de Bacillus cereus.
28.
Uso según la reivindicación 27, caracterizado porque dicho Bacillus cereus es ATCC 7004 o ATCC 6464.
29.
El uso según una cualquiera de las reivindicaciones 21-26, caracterizado porque dicha enzima se obtiene por la expresión de un ADN recombinante en un organismo huésped.
30. Uso según la reivindicación 29, caracterizado porque dicho organismo
huésped procede de una cepa de Bacillus megaterium.
31.
El uso según una cualquiera de las reivindicaciones 21-30, caracterizado porque dicha enzima es una fosfolipasa C específica para fosfatidilnositol.
32.
El uso según una cualquiera de las reivindicaciones 21-30, caracterizado porque dicha enzima es una fosfolipasa D específica para fosfatidilnositol.
33.
Una composición que comprende (i) una endo-1,4-D-mananasa y (ii) un vehículo fisiológicamente aceptable para dicha enzima, en donde dicha composición está en una forma apropiada para la administración oral y no contiene un agente antiinfeccioso distinto de dicha enzima, y en donde dicha composición comprende dicha enzima en una cantidad efectiva para tratar o reducir el riesgo de infección del tracto digestivo.
34.
Composición según la reivindicación 33, en donde dicho vehículo es un producto alimenticio en el que dicha enzima está incorporada.
35.
Composición según la reivindicación 34, en donde dicho producto alimenticio es un alimento para animales compuesto por material de grano, una fuente de proteína, vitaminas, aminoácidos y minerales.
36.
Composición según la reivindicación 35, en donde dicho material de grano es maíz, sorgo, trigo, cebada o avenas.
37.
Composición según la reivindicación 35, en donde dicha fuente de proteína es judías o guisantes.
38.
Composición según la reivindicación 33, en donde dicha composición está en una formulación sólida o líquida.
39.
Composición según la reivindicación 33, en donde dicha enzima está contenida en un comprimido o cubierta de cápsula de gelatina.
40.
Composición según la reivindicación 33, en donde dicha endo-1,4-Dmananasa es aquella producida por Bacillus lentus designada como ATCC 55045.
41.
La composición según una cualquiera de las reivindicaciones 33-40, en donde dicha composición además comprende un estabilizante, un vehículo de carbohidrato o un conservante.
42.
Composición según la reivindicación 41, en donde dicho estabilizante es un tampón, un carbohidrato o un glicol.
43.
Composición según la reivindicación 41, en donde dicho vehículo de carbohidrato se selecciona del grupo que consiste en xilosa, fructosa, glucosa, sorbitol y maltotriosa.
44.
Composición según la reivindicación 41, en donde dicho conservante se selecciona del grupo que consiste en propilparabeno, sorbato de sodio, sorbato de potasio y ascorbil palmitato.
45.
Uso de una endo-1,4-D-mananasa, en donde dicha enzima no se administra con una cantidad antimicrobianamente efectiva de otro agente antiinfeccioso, para la fabricación de una forma de dosificación oral de un medicamento para tratar o reducir el riesgo de infección del tracto digestivo.
46.
Uso según la reivindicación 45, caracterizado porque dicha infección es causada por un patógeno protozoo, bacteriano, levadura, viral o fúngico.
47.
Uso según la reivindicación 46, caracterizado porque dicha infección es causada por un patógeno protozoo del género Eimeria.
48.
Uso según la reivindicación 46, caracterizado porque dicha infección es causada por un patógeno protozoo del género Cryptosporidium.
49.
Uso según la reivindicación 46, caracterizado porque dicha infección es causada por un patógeno bacteriano del género Clostridium.
50.
Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 45-49, caracterizado porque dicha enzima se prepara a partir de una cepa Bacillus lentus.
51.
Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 45-49, caracterizado porque dicha enzima se obtiene por la expresión de un ADN recombinante en un organismo huésped.
52.
Uso según la reivindicación 51, caracterizado porque dicho organismo huésped es de una cepa de Bacillus megaterium.
53.
Uso según la reivindicación 45, caracterizado porque dicha endo-1,4-βD-mananasa es aquella producida por Bacillus lentus designada como ATCC 55045.
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