SK287956B6 - Composition comprising enzymes and use this enzymes - Google Patents

Abstract

Enzymes of a particular class, characterized by the ability to cleave a linkage that effects release of a cell-surface protein or carbohydrate, which does not contain an anti-infection agent, display significant anti-infectious activity. Upon oral administration, these enzymes are effective, for example, in the treatment of digestive tract infections in humans and in animals. In the latter, there are benefits of significantly improved growth rate, feed efficiency, and overall health.

Description

Oblasť techniky

Predkladaný vynález sa týka prostriedkov obsahujúcich enzýmy a spôsobov použitia enzýmov ako antiinfekčných činidiel, v súvislosti s liečbou alebo znížením rizika infekcií tráviaceho traktu.

Doterajší stav techniky

V r. 1998 v Revision of the World Population Estimates and Projections predpokladala the United Nations Department of Economic and Social Affairs Population Division, že svetová populácia dosiahne v roku 1999 6 miliárd. Správa tiež predpokladala, že zvýšenie populácie z 5 na 6 miliárd bude trvať len 12 rokov v porovnaní so zvýšením z 1 na 2 miliardy, ktoré trvalo 123 rokov. V polovici 21. storočia sa predpokladá populácia medzi 7,3 a 10,7 miliardami. Vzostup populácie v poslednej dekáde je čiastočne spôsobený úspechmi v produkcii potravín v dôsledku aplikácií technológií a intenzifikácie produkcie potravín. Pre ďalší rast populácie budú potrebné ešte účinnejšie pokroky v produkcii potravín.

Jeden spôsob na zefektívnenie produkcie mäsa zahrnuje používanie antimikrobiálnych zlúčenín a antibiotík v krmive pre zvieratá. Vo veľkých farmách je šírenie infekcie v podmienkach stád veľmi rýchle. Rôzne ochorenia sú preto kontrolované profylaktickým alebo terapeutickým používaním týchto substancií. Napríklad je bežné používanie chemických činidiel v potrave na kontrolu kokcídiových infekcií (tu sa používa napríklad salinomycín, monensín, roxarson (3-nitro), halquinol, carbadox a olaquindox), rovnako ako antimikrobiálne antibiotiká (napríklad bacitracín, virginiamycín, tylozín, tetracyklín, chlórtetracyklín, penicilín, oleandomycín, novobiocín, linkomycín, bambermycíny, apramycín, spiramycín, erytromycín, neomycín a ďalšie). Je dobre známe, že tieto postupy podporujú rast a zlepšujú premenu krmiva.

Nárast mnohonásobnej antibiotickej rezistencie pri ľudských patogénoch, ako je Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenza, Neisseria gonorrhoeae a Mycobacterium tuberculosis, budí obavy, že rezistencia na antibiotiká vzniknutá pri mikróboch asociovaných so zvieratami na farmách, môže migrovať na ľudské patogény prostredníctvom prenosných faktorov liekovej rezistencie. Existujú dôkazy, že zvieratá kŕmené antibiotikami sú zdrojom baktérií s prenosnými faktormi rezistencie. Pozri Hooge, Feedstuffs 71 (20): 59, 1999. Aj keď sú antibiotiká používané u zvierat a u človeka obvykle odlišné, majú podobné mechanizmy účinku, čo môže viesť ku skríženej rezistencii. V jednom prípade sú fluórchinolóny schválené na liečbu infekcií E. coli (colibacilózy) u niektorých zvierat tiež používané v humánnej medicíne, pozri Hooge. Nedávno FDA/CVM navrhol odobratie schválenia na použitie fluórchinolónu enrofloxacínu u hydiny z dôvodu vzniku kampylobakteru rezistentného na fluórchinolón a jeho prenosu na človeka. Pozri Murhead, S. Feedstuffs 72 (45): 1 - 4, 2000.

V oblasti mäsového priemyslu tiež panuje obava zo zníženia ziskov a návratu zvieracích chorôb po zákaze používania antibiotík a antimikrobiálnych činidiel v potrave. V roku 1986 napríklad Švédsko zakázalo používanie antibiotík v krmive a zvýšil sa počet ochorení zvierat. Toto bolo sprevádzané zvýšeným používaním terapeutických antibiotík, čo viedlo k celkovému zvýšeniu používania antibiotík, rovnako ako ku zvýšeniu nákladov na produkciu mäsa. Pozri Smith, Feedstuffs 71 (13): 1, 1999. V decembri 1998 Rada ministrov EU rozhodla zakázať používanie šiestich antimikrobiálnych činidiel, ktoré boli formálne schválené ako činidlá podporujúce rast pridávané do krmiva (Official Journal of the European Communities 29. 12. 98, Council Regulation No. 282 1/98 conceming Directive 70/524). V auguste 1999 boli tiež zakázané dve prísady na báze chinoxalínu v dôsledku zvyškov v mäse. Dôsledkom týchto zákazov bolo tiež zvýšenie prevalencie ochorení formálne považovaných za vyhubené, vrátane nekrotickej enteritídy u brojlerov, enteritídy spôsobenej Clostridium perfringens u odstavených prasiat, dyzentérie prasiat a spirochetovej hnačky a E. coli - asociovanej hnačky. Pozri Miller, United States Animal Health Association, 1999 Proceedings „Antibiotic Usages in Food Animal Production and Resistance-European Perspective.“

Udáva sa 30 000 ľudských úmrtí za rok spôsobených nosokomiálnymi infekciami rezistentnými patogénmi, ale omnoho menej úmrtí na infekcie patogénmi z potravy. Žiadne z úmrtí na potravinové patogény nie je spojené s rezistenciou na antibiotiká (pozri Smith). Tak nie je jasné, či používanie antibiotík pri produkcii mäsa prispieva k problému nosokomiálnych infekcií rezistentnými patogénmi u človeka. Ďalším problémom je chýbanie nových antibiotík na liečbu infekcií spôsobených rezistentnými patogénmi. Pozri Henry, C. M., Chemical and Engineering News, 6. 3. 2000, str. 41 - 58. To môže znamenať, že keď sa vyvinie patogén významne rezistentný na antibiotiká, nemusí byť žiadne antibiotikum na liečbu infekcie k dispozícii. Ťažkosti pri vývoji nových antibiotík, veľkosť trhu a regulačné nariadenia spôsobili, že väčšina farmaceutických firiem presunula svoj záujem preč od vývoja nových antibiotík, predovšetkým na použitie u zvierat. Nové navrhnuté pravidlá pre registráciu liečiv na použitie u zvierat sú tak zložité, že bol vývoj takých liekov zastavený. Pozri Smith. Predsa len existuje niekoľko malých spoločností zaoberajúcich sa vývojom nových antibiotík (Henry, pozri skôr).

V niektorých zvieracích populáciách je infekcia už pandemická. Napríklad vtáčia kokcidióza je ochorenie, ktoré je len zvládané, nie pod skutočnou kontrolou. Prakticky všetky kŕdle sú infikované a chemické činidlá proti kokcidióze sú bežne striedavo pridávané do potravy, aby sa kontrolovalo poškodenie a obmedzil vznik rezistentných kmeňov. Kokcidióza stojí producentov hydiny ročne 350 miliónov dolárov na stratách a nákladoch na lieky, ako je salinomycín. Pozri Suszkiw, USDA Agricultural Research Service News, Október 28, 1997. V roku 1999 sa predpokladalo, že lieky proti kokcidióze budú stáť v USA približne 114 miliónov dolárov. Pozri Frost & Sullivan, US. Pharmaceutical Products for Food Animals, Report 5245 - 54, 1995.

Existuje jasná potreba nových a účinnejších spôsobov liečby infekcií tráviaceho traktu u zvierat, ktoré sú chované v intenzifikovaných chovoch. Táto potreba je založená na potrebe dosiahnutia lepšej účinnosti produkcie pre potreby rýchlo rastúcej svetovej populácie. Lepšia kontrola črevných infekcií garantuje rýchlejší rast a lepšiu účinnosť kŕmenia. Existuje tiež potreba alternatívy na používanie antibiotík pri produkcii zvierat, ktorá by riešila možný problém vzniku antibiotickej rezistencie pri ľudských patogénoch.

Pri použití liečby na báze enzýmov, ktorá pôsobí inak než všetky antibiotiká, neexistuje riziko stimulácie vývoja rezistentných patogénnych mikroorganizmov, ktoré by mohli byť problémom pre človeka. Pretože enzýmy sú proteiny, neexistuje možnosť, že by boli nebezpečné chemické rezíduá inkorporované v mäsových výrobkoch, ako je to pri niektorých antibiotikách a činidlách proti kokcidióze. Pozri American Feed Control Officials Inc., Official Publication, 1999, „Drugs and Feed Additives, Section 30.0 Enzymes,“ str. 206 - 217, ISBN 1-878341-10-3.

Podstata vynálezu

Preto je predmetom predkladaného vynálezu poskytnúť enzymatickú liečbu na zníženie dopadu infekcií tráviaceho traktu.

Ďalším predmetom predkladaného vynálezu je poskytnúť mechanizmus zníženia dopadu infekcií tráviaceho traktu, kde uvedený mechanizmus interferuje s väzbou patogénov na bunky tráviaceho traktu.

Ešte ďalším predmetom vynálezu je spôsob zvýšenia prírastku hmotnosti a konverzie krmiva u zvierat, ktoré sú infikované patogénnu spôsobujúcimi infekcie alebo nekrotizujúcu enteritídu.

Ďalším predmetom predkladaného vynálezu je poskytnúť dávkovú formu vhodnú na orálne podanie, ktorá je účinná pre zlepšenie stavu jedinca infikovaného mikrobiálnym patogénom alebo rizikového z hľadiska takej infekcie.

Na splnenie týchto a ďalších predmetov vynález poskytuje prostriedok obsahujúci (i) enzým vybraný z fosfatidylinozitol-špecifickej fosfolipázy C a fosfatidylinozitol-špecifickej fosfolipázy D, a (ii) fyziologicky prijateľný nosič pre uvedený enzým, kde uvedený prostriedok je vo forme vhodnej na orálne podanie.

Vo výhodnom uskutočnení je enzým obsiahnutý v prostriedku pripravený z kmeňa Bacillus cereus, výhodne ATCC 7004 alebo ATCC 6464. Alternatívne je enzým získaný expresiou rekombinantnej DNA kódujúcej enzým v Bacillus megaterium. V inom uskutočnení je enzým obsiahnutý v obale želatínovej kapsuly a je v prostriedku prítomný v dávke 200 IU/kg až 4000 IU/kg krmiva.

V inom aspekte predkladaný vynález poskytuje prostriedok obsahujúci uvedené zložky (i) a (ii), kde fyziologicky prijateľným nosičom je krmivo, do ktorého je enzým inkorporovaný. Tak môže byť prostriedkom zvieracie krmivo, ktoré neobsahuje žiadne iné anti-infekčné činidlo než enzým. Prostriedok vo forme zvieracieho krmiva podľa predkladaného vynálezu ďalej obsahuje zrnitý materiál, ako je kukurica, cirok, pšenica, jačmeň alebo ovos, zdroj proteínu, ako sú fazuľa alebo hrach, a vitamíny, aminokyseliny a minerály.

V ešte ďalších aspektoch predkladaný vynález poskytuje prostriedok, ako bol opísaný, ktorý je v pevnej alebo kvapalnej dávkovej forme.

Ďalej predkladaný vynález poskytuje použitie enzýmu vybraného z fosfatidylinozitol-špecifickej fosfolipázy C a fosfatidylinozitol-špecifickej fosfolipázy D na výrobu orálnej dávkovej formy liečiva na liečenie alebo zmiernenie rizika infekcie tráviaceho traktu. Ďalej spôsob nezahrnuje podanie iného anti-infekčného činidla než enzýmu. Infekcia môže byť spôsobená prvokmi, ako je Eimeria a Cryptosporidium, baktériami, ako je Clostridium, patogénmi hubami alebo kvasinkami.

Ďalej vynález poskytuje prostriedok obsahujúci (i) endo-l,4-D-mannanázu a (ii) fyziologicky prijateľný nosič pre enzým, kde prostriedok je vo forme vhodnej na orálne podanie a neobsahuje anti-infekčné činidlo iné než uvedený enzým, kde uvedený prostriedok obsahuje uvedený enzým v množstve účinnom na liečenie alebo zmiernenie rizika infekcie tráviaceho traktu.

Ďalej predkladaný vynález poskytuje použitie endo-l,4-D-mannanázy, kde uvedený enzým nie je podávaný s antimikrobiálne účinným množstvom iného antiinfekčného činidla, na výrobu orálnej dávkovej formy liečiva na liečenie alebo zmiernenie rizika infekcie tráviaceho traktu.

Ďalšie predmety, vlastnosti a výhody predkladaného vynálezu budú jasné z nasledujúceho podrobného opisu. Podrobný opis a príklady uskutočnenia ukazujú konkrétne výhodné uskutočnenia, ale sú uvedené len na ilustráciu, pretože odborníkom sú zrejmé rôzne modifikácie a variácie predkladaného vynálezu. Ďalej, príklady demonštrujú princíp predkladaného vynálezu, ale neilustrujú použitie predkladaného vynálezu na všetky príklady infekcií, kde by ich odborník pokladal za použiteľné.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Obr. 1 ukazuje anti-kryptosporidiálnu aktivitu rekombinantného PI-PLC enzýmu produkovaného kmeňom Bacillus megaterium.

Podrobný opis vynálezu

Bolo zistené, že enzýmy určitej triedy, charakterizované schopnosťou štiepiť väzbu, ktorá uvoľňuje proteíny alebo karbohydráty bunkového povrchu, vykazujú po orálnom podaní významnú antibiotickú aktivitu, ktorá je účinná napríklad pri liečbe infekcií tráviaceho traktu. Medzi také triedy enzýmov patria napríklad sfingomyelinázy a fosfolipázy typu C a D a enzýmy podobnej špecificity. Príklady tejto triedy sú preto enzýmy, ktoré uvoľňujú glykoproteíny alebo karbohydráty, ktoré sú zakotvené v membráne väzbou na fosfatidylinozitol. Preto je enzým fosfatidylinozitol-špecifická fosfolipáza C (E. C. 3.1.4.10), tiež známy pod skratkou PI-PLC alebo ako 1-fosfatidylinozitol-fosfodiesteráza, členom tejto triedy. Iným príkladom je glykozylfosfatidylinozitol-špecifická fosfolipáza D, alebo GPI-PLD. Low a Prasad, Proc. Natl. Acad. Sci. 85: 980 až 984, 1988.

GPI-PLD a PI-PLC enzýmy boli opísané z eukaryotických zdrojov. Pozri Low, „Degradation of glykosylfosfatidylinositol anchors by specific fosfolipases“, kapitola 2, str. 35 - 63, v MOLECULAR AND CELL BIOLOGY OF MEMBRÁNE PROTEINS: GLYKOLIPID ANCHORS OF CELL-SURFACE PROTEINS, A. J. Tumer (ed.), Ellis Horwood, New York, 1990; Low a Prasad, Proc. Natl. Acad. Sci. 85: 980 - 984, 1988; Essen et al., Náture 380: 595 - 602, 1996; a Essen et al., Biochemistry 36: 2753 - 2762, 1997. PI-PLC boli opísané z prokaryotických zdrojov, vrátane extracelulárnej produkcie baktériami. Medzi známe bakteriálne zdroje PI-PLC patrí Bacillus cereus (Stein a Logan, J. Bacteriol. 85: 369 - 381, 1963; Stein a Logan, J. Bacteriol. 90: 69 - 81, 1965; Ikezawa et al., Biochimica et Biophysica Acta 450: 154 - 164, 1976; Griffith et al., Methods in Enzymology 197: 493 - 502, 1991; Volwerk et al., J. Celí. Biochem. 39: 315 - 325, 1989; a Kuppe et al., J. Bacteriol. 171: 6077 - 6083, 1989), Bacillus thuringiensis (Ikezawa a Taguchi, Methods in Enzymology 71: 73 1 - 741, 1981; Japonská patentová prihláška JP 55034039), Staphylococcus aureus (Low a Finean, Biochem J. 162: 235 - 240, 1977) a Clostridium novyi (Taguchi a Ikezawa, Árch. Biochem. Biophys. 186: 196-201, 1978).

Vylepšené enzýmové testovacie techniky pre PI-PLC enzým sú založené na fluorescenčnom substráte. Pozri Hendrickson el al., Biochemistry 31: 12169 - 12172, 1992; Hendrickson, Anál. Biochem. 219: 1 - 8, 1994; Hendrickson etal., Bioorg. Med Chem. Letters. 1: 619 - 622, 1991.

Bez definitívnej väzby na akúkoľvek teóriu pôvodcovia vynálezu predpokladajú, že enzým PI-PLC môže štiepiť fosfatidylinozitol-glykolipidové zakotvenie proteínov bunkového povrchu a iných glykozyl-fosfatidylinozitolov. Pozri Low; Low a Saltiel, Science 239: 268 - 275, 1988. Napríklad rôzne povrchové glykoproteíny a iné povrchové proteíny a karbohydráty niekoľkých jednobunkových parazitov sú zakotvené glykozyl-fosfatidylinozitolovými lipidmi (GPI zakotvenie) a sú senzitívne na štiepenie a uvoľňovanie s PI-PLC. Ilustratívne druhy prináležia k rodu Schistosoma, Toxoplasma, Plasmodium, Trypanosoma a Leishmania (Low, pozri skôr), rovnako ako Eimeria, Babesia, Theileria, Giardia, Leptomonas a Entamoeba. Pozri McConville a Ferguson, Biochemical J. 294: 305 - 324, 1993; Pearce a Sher, J. Immunol. 142: 979 - 984, 1989; Sauma et al., Mol. Med. Biochem, Parasitol. 46: 73 - 80, 1991; Hawn a Strand, Mol. Med Biochem. Parasitol. 59: 73 - 82,1993.

Tento mechanizmus zakotvenia zložiek bunkového povrchu sa zdá byť univerzálny pre eukaryotické bunky v rozsahu od kvasiniek k cicavcom. Prítomnosť GPI zakotvenia u Giardia lamblia, ktorá je považovaná za veľmi primitívny eukaryotický organizmus, naznačuje, že sa tento typ zakotvenia skoro vyvinul pri eukaryotoch. V súlade s týmto predpokladom je objav nového fosfoglycerolipidu GlcNal-6-myo-inozitol-P-dialkylglycerolu pri archaebaktériách (Nishihara et al., J. Biol. Chem. 267: 12432 - 12435, 1992), kde táto zlúčenina je základom pre komplexnejšie eukaryotické GPI kotvové štruktúry, ktoré sa vyvinuli neskoršie. U protozoí je GPI kotvový systém využívaný viac než u vyšších eukaryotov a existujú dôkazy, že štruktúry zakotvené cez GPI sú významné z hľadiska prežívania parazitov v hmyzích a cicavčích hostiteľoch. (McConville a Ferguson). Napríklad početná prítomnosť rôznych povrchových glykoproteínov môže byť mechanizmom brániacim útoku imunitného systému.

Prvok Eimeria tenella obsahuje fosfatidylinozitolom zakotvené štruktúry podobné glykoproteínu/glykolipidu Trypanosoma brucei. Tieto štruktúry sa považujú za významné pre väzbu na membránu a následnú infekciu. Pozri Gumett et al., Mol. Med. Biochem. Parasitol. 41: 177 - 186, 1990. Štruktúry Eimeria sú štiepené lipázou trypanozóm a s Bacillus thuringiensis PI-PLC (Gumett, pozri skôr). In vivo spracovanie parazitov s PI-PLC, pokiaľ bude uskutočniteľné, pravdepodobne pomôže imunitnému systému hostiteľa a bude interferovať s väzbou a infekciou patogénov vstupujúcich do organizmu tráviacim traktom. Druhy Eimeria sú rozšíreným a nákladným problémom v hydinárskom priemysle. Iný protozoámy parazit, Cryptosporidium parvum, je značne rozšírený a spôsobuje akútne hnačkové ochorenia u človeka a mnohých zvierat. Sporozoitový proteín, GP15/45/60, je zrejme podľa DNA sekvencie GPI-viazaný proteín, a monoklonálne protilátky proti tomuto proteínu inhibujú infekciu (Strong, W. B., et al., Infection and Immunity 68: 41 17 - 4134, 2000; Cevallos, A. M., et al., Infection and Immunity 68: 41084116, 2000). Preto je C. parvum ďalším patogénom potenciálne liečiteľným s Pl-PLC.

Prokaryotické baktérie neobsahujú povrchové glykoproteíny a karbohydráty zakotvené fosfatidylinozitolom (McConvilIe a Ferguson, pozri skôr), ale PI-PLC môže stále ešte redukovať bakteriálne infekcie interferenciou s procesom naviazania. Patogénne E. coli a mnoho ďalších dobre známych patogénnych Enterobacteriaceae exprimujú bakteriálny adhezín FimH, 29 kD lektín viažuci manózu, ktorý je prítomný na distálnom konci fimbrií. Abraham et al., Náture 336: 682 - 684, 1988. Bolo preukázané, že tento adhezín sa viaže na CD48 žírnych buniek, t. j. na molekulu zakotvenú GPI. Pozri Malaviya et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 8110 - 8115, 1999. In vitro štiepenie s PI-PLC redukuje väzbu mutantného GPI-zakotveného receptora pre difterický toxín (z Corynebacterium diphtheria) na myšie NIH3T3 bunky. Pozri Lanzrein et al., EMBO J. 15: 725 - 734, 1996. Ďalej, alfa toxín od Clostridium septicum a aerolyzín od Aeromonas hydrophila sú oba naviazané na bunkový povrch cez C-terminálne GPI-zakotvenie a môžu byť odstránené z povrchu buniek pomocou PI-PLC. Pozri Gordon et al., J. Biol. Chem. 274: 27274 - 27280,1999.

Mechanizmus účinku PI-PLC pri redukcii účinnosti bakteriálnej infekcie súvisí s uvoľnením väzbového miesta pre CD48 zo žírnych buniek hostiteľa. Tiež väzba FimH na žírne bunky spúšťa zápalovú reakciu. Podľa predkladaného vynálezu môže teda zníženie počtu väzbových miest tiež redukovať zápal, ktorý môže byť nadmerný a škodlivý pre črevné tkanivo samotné, pretože zápalová reakcia zahrnuje uvoľňovanie faktora nekrózy nádorov a (Malaviya, pozri skôr). Tak môže cez mechanizmus redukcie zápalu a súvisiacu sekréciu faktora nekrózy nádorov spracovanie fosfolipázou podľa predkladaného vynálezu zmierniť príznaky charakterizujúce ochorenia, ako je syndróm dráždivého čreva, kolitída a Crohnova choroba. Pozri van Deventer. S. J., Ann. Rheum. Dis. 58 (1): 1114 -1120 (november 1999).

Predkladaný vynález môže byť tiež účinný in vivo proti vírusovým infekciám, tým, že narušuje väzbu medzi vírusom a bunkou, ktorú vírus infikuje. Vo svetle objavov podľa predkladaného vynálezu týkajúcich sa účinnosti orálneho podania je zaujímavé, že spracovanie vírusu chrípky fosfolipázou C, spôsobujúce uvoľnenie približne 50 % vírusového fosfolipidu, vedie k významnému zníženiu infektivity v kuracích embryách. Pozri Mizutani et al.. Náture 204: 781 - 782,1964. Naopak, spracovanie kultivovaných fibroblastov z kuracích embryí fosfolipázou C, izolovanou z Clostridium perfringens, významne znižuje následnú infekciu buniek Semliki Forest vírusom. Pozri Friedman a Pastan, Proc. Natl. Acad Sci. USA 59: 1371 - 1378, 1968. Hoci sa v odbore neprikladá týmto javom žiadny terapeutický význam, sú v súlade s jedným mechanizmom, ktorý je podkladom predkladaného vynálezu, konkrétne so štiepením ligandu na povrchu patogénu a/alebo jeho príslušného receptora na bunkovej membráne, čo narušuje interakciu, ktorá je nevyhnutná pre infekciu.

Iným spôsobom, ako môže byť predkladaný vynález účinný v prevencii vírusovej infekcie, je narušenie väzby vírusových GPI-zakotvených proteínov na citlivé bunky. Príkladom GPI-zakotveného proteínu, ktorý je senzitívny na PI-PLC štiepenie, je Dengue Virus NS1 (nonštrukturálny proteín 1). Pozri Jacobs et al., FASEBJ 14: 1603 - 1610, 2000. Existuje niekoľko príkladov GPI-zakotvených proteínov hostiteľských buniek, ktoré sú väzbovými miestami pre vírus. Týmito príkladmi sú ľudské Echovírusy 6,7,12 a 21 a Enterovírus 70, ktoré sa viažu na GPI-zakotvený CD55 (faktor akcelerujúci rozklad, DAF). Pozri Clarkson et al, J. Virology 69: 5497 - 5501, 1995; Bergeison, et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 91: 6245 - 6248, 1994; a Karnauchow, et al., J. Virology 70: 5143 - 5152, 1996. Infekcia psím parvovírusom (CPV) môže byť blokovaná in vitro predchádzajúcim ošetrením mačacích buniek s Pl-PLC. Pozri Barbis a Parrish, Brazilian J. Med. Biol. Res. 27: 401 -407,1994.

Niektoré bunkové povrchové receptory, údajne dôležité pre inicializáciu infekcie, sú naviazané na membrány mechanizmami inými, než sú GPI zakotvenia. Medzi také mechanizmy patria štruktúry, ako sú estery cholesterolu (Rostand a Esko, J. Biol. Chem. 268: 24053 - 24059, 1993), nefosforylované glykosfingolipidy (Karlsson, Ann Rev. Biochem 58: 309 - 350, 1989) a iné fosfolipidy, ako je fosfatidyletanolamín a fosfatidylserín. Pozri Sylvester, Infect. Immun. 64: 4060 - 4066, 1996.

Z uvedených dôvodov môže byť cielené ovplyvnenie takých štruktúr vhodnými esterázami, cerebrozidázami, karbohydrázami a fosfolipázami aktívnymi v uvoľňovaní takých štruktúr z povrchu buniek výhodné, pri orálnom podaní podľa predkladaného vynálezu, na liečbu infekcií tráviaceho traktu.

V dôsledku univerzálneho charakteru povrchových proteínov a karbohydrátov naviazaných na fosfatidylinozitol u eukaryotov, má terapeutický spôsob podľa predkladaného vynálezu, zahrnujúci podanie enzýmu, akútne alebo profylaktický, pre štiepenie zakotvení takých povrchových proteínov a/alebo karbohydrátov bunkového povrchu, rozsiahle použitie pri liečbe protozoámych, bakteriálnych, mykotických a vírusových infekcií tráviaceho traktu. Z tohto hľadiska je kľúčovým aspektom predkladaného vynálezu preukázanie toho, že enzým, ktorý je aktívny v štiepení povrchových zložiek bunkového povrchu, môže byť podaný orálne ako antiinfekčné činidlo a je účinný in vivo. Významné je to, že hoci je vhodný reprezentatívny enzým, PI-PLC, dostupný od roku 1960, nebol dosiaľ taký spôsob navrhnutý.

Iným aspektom predkladaného vynálezu je použitie enzýmu, ako bol opísaný, ako účinného anti-infekčného činidla pri príprave zvieracieho krmiva, kde toto činidlo môže liečiť alebo zmierniť riziko infekcií tráviaceho traktu u zvierat, ktoré konzumujú toto krmivo. Krmivá obsahujúce endo-l,4-P-D-mannanázu sú známe a niektoré práce prisudzujú mannanáze antimykotickú aktivitu. Pozri WO 00/21381 (PCT/EP99/07835) a Kudo et. al., Experentia 48: 227 - 261, 1992. V týchto prípadoch je mannanáza kombinovaná so známym antibiotikom, hoci bol všeobecne opísaný úmysel použitia enzýmu v krmive neobsahujúcom antibiotikum. Adams, Feed Mix (Special 2000), str. 16-18.

V jednom aspekte sa teda vynález týka prostriedku obsahujúceho (i) endo-l,4-D-mannanázu a (ii) fyziologicky prijateľný nosič pre uvedený enzým, kde uvedený prostriedok je vo forme vhodnej na orálne podanie a je bez iného antiinfekčného činidla, než je uvedený enzým, pričom prostriedok obsahuje uvedený enzým v množstve účinnom na liečenie alebo zmiernenie rizika infekcie tráviaceho traktu.

Tak môžu byť podľa predkladaného vynálezu extraceluláme enzýmové prípravky, získané od Bacillus cereus a štandardizované na obsah PI-PLC, použité na významné zlepšenie prírastkov hmotnosti a konverzie krmiva v prítomnosti infekcie. Toto je prekvapivé, pretože B. cereus je oportunistický patogén, ktorý často spôsobuje potravinovú gastroenteritídu a B. cerews-endoftalmitídu.

Skoršie práce opisujú, že injekcia extracelulámeho enzýmu z B. anthracis alebo B. cereus králikom spôsobuje fosfazémiu a prípadne smrť. Napríklad pozri Stein a Logan, J. Bacteriol. 85: 369 - 381, 1963. Preto je prekvapujúce, že extracelulámy enzým od patogénu, ktorý spôsobuje gastroenteritídu, môže mať kuratívny efekt v súvislosti s ochoreniami spôsobenými bakteriálnou infekciou.

Bacillus cereus vyrába mnoho enzýmov aktívnych na extracelulámej membráne a cytolytických toxínov, vrátane PI-PLC a Cereolyzínu AB, ktorý sa skladá z fosfolipázy C a sfingomyelinázy. Pozri Gilmore, J. Bacteriol. 171: 744 - 753, 1989. V uvedenom enzýmovom prípravku je ako aktívna zložka obsiahnutá fosfatidylinozitol-špecifická fosfolipáza C [napr. 3.1.4.10], produkovaná B. cereus. Enzýmová liečba podľa predkladaného vynálezu funguje rovnako účinne ako kokcidiostatická a antibiotická liečba. Preto je táto liečba účinným a komerčne životaschopným prístupom k liečbe infekcií tráviaceho traktu, predovšetkým vtedy, keď sú v súčasnosti používané substancie zakázané.

Pokiaľ nie sú potiahnuté, môžu byť enzýmy ireverzibilné inaktivované žalúdočnou tekutinou. US patent č. 4 079 125 opisuje vylepšené prostriedky obsahujúce enzým s enterálnym poťahom určené pre cicavce s deficitom enzýmu. Prekvapujúco vedie pridanie PI-PLC do zvieracieho krmiva bez poťahu k účinnej liečbe patogénnej infekcie.

Enzýmové prostriedky podľa predkladaného vynálezu sú pripravené ako sušené, pevné alebo kvapalné orálne prostriedky. Také prostriedky obvykle obsahujú stabilizačné činidlá, ako sú pufre, karbohydráty a/alebo glykoly. Sušené prostriedky obsahujúce enzým so stabilným obsahom, vhodné, podľa predkladaného vynálezu, pre inkorporáciu v tabletách alebo kapsulách, môžu byť pripravené lyofilizáciou, sušením postrekom v sušičke s fluidným lôžkom s inertným alebo karbohydrátovým nosičom, alebo s použitím odpaľovacích techník spoločne so stabilizačnými činidlami vytvárajúcimi sklovinu. Pozri Franks et al., Biopharm. 4: 38 - 55, 1991. Iným spôsobom je použitie zrážania solí, napríklad zrážanie síranom amónnym alebo rozpúšťadlom, ako je napríklad acetón (na prípravu prášku), a potom sušenie a zmiešanie s nosičom.

Niektoré karbohydráty, predovšetkým monosacharidy, disacharidy a nižšie oligosacharidy, sú významnými karbohydrátmi vytvárajúcimi sklovinu. Príklady karbohydrátov použiteľných ako nosiče sú xylóza, fruktóza, glukóza, sorbitol a maltotrióza, ako sú opísané vo Franks pozri skôr. Výber karbohydrátového nosiča je založený na kompatibilite s enzýmom, nízkej hygroskopickej tendencii a výhodnej krivke prechodu na sklovinu. Stabilizačné činidlo trehalóza je predovšetkým vhodné na prípravu biologických činidiel stabilných pri teplote miestnosti. Pozri U. S. patent č. 4 891 319; Roser, Biopharm. 4 (8): 47 - 53, 1991; Colaco et al., Bio/Technology 10: 1007 - 1011,1992; Aldridge, Genetic Engineering News, 15. 3. 1995, str. 10 -11.

Enzýmy pre predkladaný vynález môžu byť pripravené v kvapalnej forme, napríklad ako sirupy so sorbitolom alebo glycerolom, s cieľom zníženia aktivity vo vode a na stabilizovanie proteínu. Také roztoky sú obvykle pred farmaceutickým použitím sterilné prefiltrované.

Ako bolo uvedené týka sa predkladaný vynález v jednom aspekte podania enzýmu ako zložky krmiva. Krmivo sa skladá obvykle hlavne zo zrnitého materiálu, zdroja proteínov, vitamínov, aminokyselín a minerálov. Zrnitým materiálom je obvykle kukurica, cirok, pšenica, jačmeň alebo ovos. Zdrojom proteínov môžu byť napríklad fazuľa alebo hrach. Príkladom minerálov, aminokyselín a vitamínov sú B₁₂, A, kyselina pantoténová, niacín, riboflavín, K, DL-metionín, L-lyzín, cholín-chlorid, kyselina listová, fosforečnan vápenatý, magnézium-sulfonát, síran draselný, uhličitan sodný, chlorid sodný, selenitan sodný, oxid manganičitý, jodid vápenatý, oxid meďnatý, oxid zinočnatý a D-aktivovaný živočíšny sterol.

Na použitie v krmive môže byť kvapalný prostriedok obsahujúci enzým pripravený so soľou (napríklad NaCl, 15 - 18 % hmotn./hmotn.) alebo sirupom na zníženie aktivity vo vode a na prevenciu rastu mikróbov v koncentrovanom produkte. Ďalšie konzervačné činidlá, ako je nátrium-benzoát, propylparaben, nátrium alebo kálium-sorbát a askorbyl-palmitát, sú príklady schválených chemických konzervačných činidiel, ktoré môžu byť tiež použité na prevenciu rastu mikroorganizmov v produkte. Pozri Association of American Feed Control Officials, Inc., Offícial Publícation 2000, Part 18, „Chemical Preservatives“ str. 215 - 217, ISBN 1-878341-11-1. Tieto konzervačné činidlá môžu byť zapracované do krmiva po peletizácii s použitím automatizovanej postrekovej technológie s veľkým riedením činidiel. Pozri Fodge et al., Feedstuffs, 29. 9. 1997. Také kvapalné prípravky môžu obsahovať stabilizačné karbohydráty, ako je sorbitol alebo glycerol, pokiaľ sú kompatibilné. Materiály, ktoré sú žiaducimi zložkami krmiva, ako sú iné enzýmy a vitamíny, môžu byť obsiahnuté kvôli zvýšeniu účinnosti.

V prípadoch, že je krmivo použité v nepeletovanej forme (t. j. bez tepelného spracovania), môžu byť enzýmy podľa predkladaného vynálezu pripravené vo forme suchého koncentrátu určeného na pridanie do miešacieho zariadenia na prípravu krmiva. Také suché enzýmové koncentráty sa pripravia najprv zahustením kvapalného enzýmového prostriedku s použitím 10 Kd NMWC alebo iného vhodného ultrafiltra, pri ktorom sa dosiahne vysoké percento obsahu enzýmu, a potom zmiesením s veľmi suchým nosičom, ako sú kukuričné zrná, sójové zrná alebo inertný materiál, alebo nerozpustná soľ, ktoré sú schválené na použitie v krmive. Pozri Offícial Publícation, American Feed Contral Officials, Part 582, „Substances generally regarded as safe in animal feeds.“

Existuje mnoho techník na prípravu enzýmov dostatočne stabilných pre tolerovanie procesu peletovania v niektorých mlecích zariadeniach pre krmivo, za zachovania dostatočnej aktivity pri nízkych teplotách, takže sú tieto enzýmy potom funkčné v tráviacom trakte. Je známe, že modifikáciou proteínovej štruktúry, primárne v dôsledku zmien kódujúcej DNA sekvencie, alebo sekundárne v dôsledku chemických modifikácií, je možné dosiahnuť vyššiu stabilitu enzýmov proti inaktivácii. Jednou ilustráciou takej modifikácie je použitie chemického zosietenia kryštálov enzýmov. Pozri Collins et al., Organic Process Research and Development 2 (6): 400 - 406, 1998. Iným prístupom pre zvýšenie stability enzýmu pre predkladaný vynález je zmena aminokyselín mutagenézou génu, ktorý kóduje daný enzým, alebo získanie génov alebo častí génov na výrobu nových génov. Pozri Crameri et al., Náture 391: 288 - 291, 1998; Arnold, Náture Biotechnol. 16: 617 - 618, 1998b; Zhao et al., Náture Biotechnol. 16: 258 - 235, 1998; Zhao a Arnold, Protein Eng. 12: 47 - 53, 1999. Je tiež možná mutácia a selekcia pre „riadenú evolúciu“ enzýmov s požadovanými vlastnosťami. Pozri napríklad Giver et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 12809 - 12813, 1998; Liao et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 83: 576 - 580,1986; Cherry et al., Náture Biotechnol. 17: 379 - 384,1999.

Niektoré proteínové modifikácie, vrátane glykozylácie, PEGylácie a sukcinylácie, môžu tiež zvyšovať stabilitu a meniť optimálne pH, čo sú charakteristiky, ktoré môžu byť optimalizované pre enzým, ktorý má byť použitý v predkladanom vynáleze. Preto môžu byť použité známe protokoly na prípravu modifikovaných enzýmov, ktoré sa potom testujú podľa uvedených príkladov na vhodnosť k použitiu v spôsoboch podľa predkladaného vynálezu.

Účinnou metódou pre produkciu PI-PLC je klonovanie génu B. cereus do B. megaterium. Expresný systém (Rygus a Hillen, Appl. Microbiol. Bacteriol. 35: 594 - 599, 1991) využíva elementy z Bacillus megaterium xylózového regulonu (Rygus et al., Árch. Microbiol. 155: 535 - 542, 1991), a je komerčne dostupný od BIO101 Corp. (Vista, Califomia). Bola pripravená fúzia medzi PI- PLC génovou vedúcou kódujúcou sekvenciou a prvými tromi aminokyselinami B. megaterium xylA génu, a táto fúzia bola pripravená v plazmide stabilizovanom tetracyklínovou rezistenciou a regulovanom represorom reagujúcim na xylózu. Kmene tohto typu, s amplifikovaňou expresiou, poskytujú vhodné prostriedky na produkciu komerčne použiteľných množstiev PI-PLC, ktorý by bol potom inkorporovaný do zvieracieho krmiva spôsobom podľa predkladaného vynálezu.

Niektoré izoláty Bacillus cereus produkujú antibiotiká, ako je tunicamycín. Pozri Kainogashira et al., Agric. Biol. Chem. 52: 859 - 861, 1988. iný izolát Bacillus cereus (ATCC 53522) je opísaný v U. S. patentoch č. 4 877 738 a č. 5 049 379, ako biologické kontrolné činidlo na prevenciu hniloby a hnitia koreňov rastlín. Predpokladá sa, že tento efekt je dôsledkom účinku dvoch antibiotík, označených ako „Zwittermicin“, čo je 396 Da lineárny aminopolyol, a „Antibiotikum B“, čo je aminoglykozid. V príkladoch uvedených ďalej je účinok týchto dvoch antibiotík eliminovaný tým, že sa možné antibiotiká s nízkou molekulovou hmotnosťou vylúčili z enzýmového prostriedku.

Konkrétne, bezbunkové fermentačné médium sa zahustilo pomocou membrány s limitom priepustnosti 10 Kd. Koncentrát, obsahujúci proteíny väčšie než 10 Kd, sa použil na ďalšie spracovanie. Antibiotiká s malou molekulovou hmotnosťou, ako sú antibiotiká opísané v Handelsman, prechádzajú týmto filtrom. Ďalej sa zrážanie síranom amónnym použilo na vyzrážanie proteínov s vysokou molekulovou hmotnosťou, čo zanechá materiál s nízkou molekulovou hmotnosťou v roztoku. Po opätovnom rozpustení materiálu vyzrážaného síranom amónnym sa získaný roztok enzýmu dialyzuje proti pufru, čo je ďalšie spracovanie, ktoré odstráni antibiotiká s nízkou molekulovou hmotnosťou. Nakoniec sa protein po druhý raz vyzráža, opäť síranom amónnym, na odstránenie akejkoľvek ďalšej zlúčeniny s nízkou molekulovou hmotnosťou z roztoku.

Kombinované použitie týchto spracovaní silne eliminuje možnosť, že pozorované antibiotické účinky sú spôsobené antibiotikami s nízkou molekulovou hmotnosťou, ako sú antibiotiká produkované ATCC 6464 alebo ATCC 7004. Fermentačné médium sa tiež testovalo, s použitím testovacieho kmeňa E. coli, na prítomnosť antibiotík, ale nebola detegovaná žiadna antibiotická aktivita.

Predkladaný vynález je ďalej opísaný na nasledujúcich ilustratívnych príkladoch.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1: Príprava zmrazených zásobných kultúr Bacillus cereus ATCC 6464 a ATCC 7004

Fioly s lyofilizovanými bunkami z ATCC sa otvorili a naočkovali sa do očkovacieho média zloženého z Amberferm 4015 (Red Star) 10 g/1, Amberex 695 (Red Star) 5 g/1 a chloridu sodného 5 g/1, pH 7,0, a uskutočnila sa kultivácia pri 30 °C. Iniciálna kultúra sa naočkovala na LB Broth agarové platne a získané jednotlivé kolónie sa naočkovali späť do 20 ml očkovacieho média v 250 ml banke s priehradkou (Bellco) a uskutočnila sa kultivácia za trepania pri 30 °C. Keď hustota kultúry dosiahla OD₆₀o 1,5, pridal sa sterilný glycerol na asi 10 % obj./obj. a fioly obsahujúce 1,8 ml kultúry sa zmrazili pri -80 °C.

Príklad 2: Kultivácia ATCC 6464 a ATCC 7004 izolátov Bacillus cereus pre produkciu fosfatidylinozitol-špecifickej fosfolipázy C

Dva Biostat C fermentory, každý s objemom 30 litrov, sa naplnili médiom nasledujúceho zloženia, vo vodovodnej vode: Nutrient Broth č. 2 (Oxoid) v koncentrácii 25 g/1, Trypton (Difco) v koncentrácii 10 g/1, kvasinkový extrakt (Difco) v koncentrácii 10 g/1 a Mazu DPIOP Modli protipenivé činidlo (BASF) v koncentrácii 0,1 ml/1. Počiatočný objem vsádzky bol 9,5 1 a médium sa sterilizovalo pri 121 °C počas 40 minút. Iniciálne pH sa upravilo po sterilizácii plynným amoniakom na 7,0.

Očkovacie kultúry sa pripravili v 500 ml rovnakého média v 4-litrových trepacích bankách vybavených priehradkou napojených na aspirátor (Bellco) s napojenými silikónovými hadicami s konektormi pre inokuláciu. Banky sa sterilizovali v autokláve pri 121 °C počas 50 minút pred inokuláciou 1,8 ml zmrazenej zásobnej kultúry pripravenej z ATTC zásielky (príklad 1). Očkovacie kultúry sa kultivovali pri 30 °C počas 5,5 hodiny s trepaním pri 200 otáčkach za minútu v inkubačnej trepačke s riadeným prostredím. (NBS model G-25). Pred naočkovaním mala ATCC 7004 kultúra OD₆₀₀ 1,53 a pH 6,58. ATCC 6464 kultúra mala OD₆₀₀ 1,28 a pH 6,79.

500 ml očkovacích kultúr sa naočkovalo do 30 1 fermentorov a uskutočnila sa fermentácia za nasledujúcich podmienok: teplota 30 °C, miešanie 600 otáčok za minútu, prietok vzduchu 10 1/min. a tlak 0,5 Baru. OD₆₀o iniciálnej kultúry bolo 0,81. Po 6 hodinách sa fermentácia ukončila s konečným OD₆₀o 22,1 (ATCC 7004) a OD₆₀o 24,2 (ATCC 6464). Fermentácia sa uskutočňovala bez riadenia pH a konečné pH bolo 8,17 (ATCC 7004) a pH 8,13 (ATCC 6464). Médium sa odstránilo z fermentorov a pred ďalším spracovaním sa ochladilo na teplotu 8 °C.

Fermentácia sa uskutočnila po druhý raz s použitím v podstate identického postupu s oboma ATCC izolátmi Bacillus cereus. V tomto prípade sa očkovacie kultúry použili v šiestich hodinách s OD₆₀o 2,86 (ATCC 7004) a OD₆₀o 1,98 (ATCC 6464), a pH 6,69 (ATCC 7004) a pH 6,65 (ATCC 6464). Hlavné fermentácie sa uskutočňovali počas 6,5 hodín s OD₆₀o 35,9 (ATCC 7004) a OD₆₀o 33,6 (ATCC 6464). Konečné pH bolo 8,38 (ATCC 7004) a pH 8,47 (ATCC 6464) v čase ochladenia.

Príklad 3: Odstránenie buniek filtráciou a zahustenie PI-PLC enzýmu

Bunky sa odstránili a premyli sa z každej zo štyroch fermentačných vsádzok opísaných v príklade 2 s použitím dvoch AIG Technology (UFP-500-K-6A) 3 mm filtrov z dutých vlákien s limitom priepustnosti 500 000 (500 Kd NMWC) naviazaných na seba koncami. Ochladené médium sa pumpovalo cez filtre a pomocou peristaltickej pumpy rýchlosťou približne 2 litre za minútu s recykláciou späť do zásobníka. Permeát obsahujúci enzým sa odoberal do zásobníka chladeného na ľade. Počiatočný objem média obsahujúceho bunky, ktorý bol približne 9 litrov, sa zahustil na približne 2 litre, a potom sa začala diafíltrácia s použitím 10 mM Tris-HCl, pH 8,5. Po získaní celkového objemu permeátu približne 14 litrov sa premývanie buniek ukončilo.

500 Kd permeát (približne 14 litrov z každého fermentora) sa zahustil s použitím dvoch A/G Technology (UFP-10-C-4XTCA) 0,5 mm filtrov z dutých vlákien s limitom priepustnosti 10 000 (10 Kd), ktoré boli na seba naviazané koncami. Použilo sa rovnaké pumpovanie s recykláciou koncentrátu s tou výnimkou, že permeát sa odstraňoval. Finálny koncentrát s objemom približne 500 ml z každého fermentora sa uschoval na ďalšie spracovanie.

Príklad 4: Ďalšie prečistenie a zahustenie PI-PLC enzýmu

Kd ultrafiltračný koncentrát (príklad 3) získaný z každej fermentácie Bacillus cereus, sa upravil na 80 % saturáciu síranom amónnym a miešal sa na ľade počas 60 minút. Roztok sa odstred’oval počas 15 minút pri 6 000 otáčkach za minútu na Sorvall GSA rotore. Supematant sa odstránil a zrazenina sa rozpustila v minimálnom objeme 10 mM Tris-HCl, 0,2 mM EDTA (pH 7,5) a potom sa dialyzovala za studená proti rovnakému pufru.

Proteín v každom koncentráte sa meral s použitím testu väzby farbiva (BioRad) a stanovila sa koncentrácia PI-PLC (Hendrickson et al., Bioorg. Med. Chem. Letters 1: 619 - 622, 1991) s použitím detekčnej metódy na báze HPLC a fluorescenčného substrátu (Molecular Probes, Inc., P-3 764, 1-pyrénbutyl-myoinozitol-l-fosfát, lítna soľ). Tabuľka 1 zhrňuje dáta z tohto testu a určuje približnú čistotu a celkový obsah enzýmu pre každú čistú bázu získanú pre každý zo štyroch prípravkov. Enzýmové prípravky boli uskladnené pri -20 °C do ďalšieho spracovania.

Tabuľka 1 Súhrn analýzy prípravkov surového enzýmu PI-PLC

Enzým. prípravok	ATCC kmeň č.	Proteín mg/1	Špecif. aktivita U/ml1	Celkom mg proteínu v prípravku	Predpokl. čistota2	Celkom mg PI-PLC na čistú bázu
1	7004	1,86	1,75	325	2,92	9,49
2	6464	1,44	0,52	345	0,867	2,99
3	7004	1,35	4,42	208	7,36	15,3
4	6464	2,06	1,72	256	1,95	5,00

U = jednotka = 1 mikromol/minútu.

² podľa predpokladu, že 100 % čistý proteín má špecifickú aktivitu 60 U/mg (Hendrickson, pozri skôr).

Príklad 5: Zlúčenie a zahustenie enzýmových prípravkov pred aplikáciou do zvieracieho krmiva

Enzýmové prostriedky 1,2, 3 a 4 sa zlúčia, pričom sa získa celkový objem 675 ml. Pomaly sa pridá síran amónny (492 g) a roztok sa mieša na ľade počas niekoľkých minút. Roztok sa odstredí za vzniku pelety. Peleta sa rozpustí v minimálnom množstve 20 mM fosfátového pufra (pH 7,0).

Získaný roztok mal objem 70,9 ml a hustotu 1,057 g/cm². Koncentrácia proteínu bola približne 25,5 mg/ml. Aktivita PI-PLC bola približne 1,13 U/mg s čistotou PI-PLC 1,88 %). Roztok sa zmrazil pri -20 °C a potom sa rozmrazil a použil sa uniformné na spracovanie 200 libier (90,8 kg) kuracieho krmiva.

Príklad 6: Klonovanie a expresia Bacillus cereus PI-PLC génu v Bacillus megaterium

Bol sekvencovaný gén kódujúci fosfatidylinozitol-špecifickú fosfolipázu C (PI-PLC). Pozri Kuppe et at., J. Bacteriol. 171: 6077 - 6083, 1989. S použitím PCR technológie bol PI-PLC gén klonovaný z Bacillus cereus (ATCC 6464) chromozomálnej DNA. Použil sa expresný vektor pMEGA (BIO 101, Vista, CA), pre Bacillus megaterium. Dva PCR priméry, konkrétne 5OACTAGTAATAAGAAGTTAATTTTG-3’ (primér 1) a 5’-CGGGATCCATATTGGTTGGTTATTGG-3’ (primér 2) sa navrhli so Spel miestom v priméri-1 a BamHI miestom v priméri 2.

PCR-amplifikovaný PI-PLC gén sa potom ligoval do pMEGA Spel-BamHI miesta za zisku plazmidu pCG682. PI-PLC proteín sa fúzoval s prvými troma aminokyselinami xyl A génového produktu v Spel mieste expresného vektora. Expresia PI-PLC génu bola pod kontrolou xylA promótora. Fermentácia v banke za trepania bola použitá na hodnotenie produkcie fosfatidylinozitol-špecifickej fosfolipázy C v Bacillus megaterium. LB médium s 10 pg/ml tetracyklínu (20 ml) sa naočkovalo 0,2 ml očkovacej kultúry a uskutočnila sa inkubácia pri 37 °C za trepania pri 250 otáčkach za minútu. Pri OD₆₀₀ približne 0,5 sa pridalo 5 g/1 D(+)xylózy pre indukciu xylA promótora. Po 3 hodinách sa supematant získal odstredením. Aktivita fosfatidylinozitol-špecifickej fosfolipázy C sa merala metódou fluorescenčného substrátu (Hendrickson, et at., Biochemistry 31: 12169 - 12172,1992; Hendrickson, Anál. Biochem. 219: 1 -8, 1994), s použitím 1-pyrénbutylmyo-inozitol-1-fosfátového substrátu (Molecular Probes, Eugen, OR) a pomocou HPLC detekcie.

Tabuľka 2 Meranie expresie PI-PLC

Testovaný materiál	pridanie xylózy	Špecifická aktivita (jednotky/mg proteínu)
Frakcie bunkového lyzátu
B. megaterium/pCG682	-	0
B. megaterium! pGG682	+	0,436
B. megaterium/pCG682	-	0
B. megaterium/pCG682	+	0,365
Frakcie fermentačného média
B. megaterium/pCG682	-	0

Testovaný materiál	pridanie xylózy	Špecifická aktivita (jednotky/mg proteínu)
B. megaterium/pCG682	+	4,087
B. megaterium/pCG682	-	0
B. megaterium/pCG682	+	4,56

Tieto dáta ukazujú, že väčšina Pl-PLC bola extraceluláma a že expresia prebiehala len po pridaní D(+)xylózy (tabuľka 2). Predpokladá sa, že tento rekombinantný kmeň má aspoň 15-násobok produktivity (mg/l/OD) priemerného prirodzeného kmeňa, ktorý je kultivovaný spôsobom podľa príkladu 2.

Príklad 7: Fermentácia B. megaterium pre produkciu PI-PLC

B. megaterium/pCG682 opísaný v príklade 6 sa použil na produkciu PI-PLC fermentáciou. Médium (PM) na očkovanie a fermentáciu obsahovalo 20 g/1 Amberferm 4015 (Universal Flavors Bionutrients, Indianapolis, IN), 10 g/1 Amberex 695 kvasinkového extraktu (Universal Flavors Bionutrients, Indianapolis, IN), 10 g/1 NZ Čase Plus (Quest International, Hoffman Estates, IL), 2,0 g/1 K₂HPO₄, 0,1 g/1 MgSO₄.7 H₂O a 2,0 g/1 glukózy iniciálne a 12,5 mg/1 tetracyklínu. pH bolo upravené na 7,5.

Inokulačné štádium (500 ml v 2,8-1 banke s priehradkou) sa začalo naočkovaním z inokulačnej zásobnej banky a uskutočnilo sa trepanie pri 250 otáčkach za minútu pri 30 °C. Inokulačné banky sa pripravili pridaním jedinej kolónie kultivovanej na LB agarovej platni do 20 ml PM v 250 ml trepacej banke. Po kultivácii - raste na približne 1,0 OD₆₀o pri 30 °C sa pridalo 5 ml 50 % sterilného glycerolu, zmes sa premiešala a roztok sa rozdelil do 2 ml plastových sterilných skúmaviek a zmrazil sa pri -60 °C.

500 ml očkovacie banky sa použili po raste na približne 1,2 až 1,8 OD₆₀o nm po 9 hodinách trepania. Dve banky sa použili pre inokuláciu 60 1 fermentora naplneného 50 1 rovnakého média sterilizovaného parou. Tetracyklín sa sterilné prefiltroval (0,2 mikrónový filter) ako 1 % roztok v 40 % etanole a pridal sa po sterilizácii a ochladení na 30 °C. Vo fermentoroch sa 0,1 ml/1 Mazu DF10PMOD11 antipenivého činidla (BASF, Gumee, IL) tiež pridalo do počiatočnej vsádzky a počas fermentácie sa pridávalo toto činidlo podľa potreby kvôli prevencii penenia. Podmienky pre prvú fermentáciu boli nasledujúce: podtlak 0,5 až 2,5 psig; teplota 30 °C ±0,5 °C; trepanie 200 až 450 otáčok za minútu; prívod vzduchu 25 až 50 SLPM; rozpustený kyslík - 25 %. pH sa upravovalo na 6,9 až 8,1 s použitím 21,25 % H₃PO₄ alebo 5N NaOH. Keď OD₆₀o dosiahlo 8-10, boli obsahy použité pre naočkovanie 600 1 fermentora obsahujúceho 425 1 rovnakého média.

Podmienky pre 600 1 fermentáciu boli nasledujúce: podtlak 0,5 až 2,5 psig; teplota 30 °C ±0,5 °C; trepanie 100 až 300 otáčok za minútu; prívod vzduchu 250 až 500 SLPM; rozpustený kyslík - > 25 %. pH sa upravovalo na 6,9 až 8,1 s použitím 21,25 % H₃PO₄ alebo 5N NaOH. Keď sa po 5 hodinách vyčerpala počiatočná glukóza a OD₆₀₀ bolo približne 17, pridalo sa xylózové médium (pre-sterilizované autoklávovaním pri 121 °C počas 20 minút) skladajúce sa z 10 kg D-(+)-xylózy a 10 litrov vody). D-xylóza sa získala od Varsal Instruments, New Jersey. Médium sa pridávalo spočiatku rýchlosťou 25 ml/minútu počas 1,5-hodiny, a potom sa rýchlosť zvýšila na 43 ml/minútu. Táto druhá rýchlosť sa udržiavala do tej doby, než bolo spotrebovaných všetkých 22,5 litrov xylózového média. Percento rozpusteného kyslíka sa udržiavalo pomocou zvyšovania prívodu vzduchu po 50 SLPM až do 500 SLPM. Keď bol prívod vzduchu 500 SLPM, tak sa zvýšila rýchlosť odstreďovania. Fermentácia sa ukončila po 20 hodinách. Po 17 hodinách sa akumulovalo 7440 U/l (jednotiek definovaných v príklade 4).

Fermentačné médium sa odoberalo s použitím Pall Filtron CIO Skid a štyroch CellFlo Microgon modulov (0,2 gm póry membrány, vlákna s priemerom 1 mm s 3,3 m². Permeát z 0,2 gm membrány sa zahustil s použitím LT100 Pall Filtron Skid AG/Technologies Size 85 10K ultrafiltračnou membránou. Výsledný koncentrát mal objem 10 litrov a bol zmrazený pri -20 °C.

Príklad 8: Bacillus cereus fermentačné médium neobsahuje antibiotickú aktivitu

Fermentácia s Bacillus cereus (ATCC 7004) sa uskutočnila spôsobom opísaným v príklade 2 s tou výnimkou, že počiatočný objem bol zvýšený na 20 litrov. Test na prítomnosť antibiotík sa uskutočnil s E. coli MG1655 ako testovacím kmeňom a s výsledným fermentačným médiom alebo s čiastočne prečisteným PI-PLC pripraveným spôsobom podľa príkladov 3-5. Test sa uskutočnil ako test na doske obsahujúcej kolieska enzýmu. Pozri Brantner, Pharmazie 52 (1): 34 - 40, 1997. Neboli pozorované žiadne zóny prejasnenia okolo koliesok obsahujúcich vzorky enzýmu, čo ukazuje na neprítomnosť antibiotickej aktivity.

Príklad 9: PI-PLC test s fluorescenčným testom na mikrotitračnej platni

Bol vyvinutý lepší biochemický test na PI-PLC, než je test podľa Hendrickson et at. použitý v príklade 4. Substrát 4-metylumbelliferyl-myo-inozitol-l-fosfátu, N-metyl-morfolínová soľ, sa získal od Biosynth (Napervilie, Illinois). Reakcie sa sledovali na Flouroscan II čítačke fluorescencie na mikrotitračných platniach, získanej od MTX Lab Systems (Vienna, Virginia). Na testovanie fermentačného média alebo enzýmových koncentrátov sa reakcie 200 gl uskutočnili v čiernych mikrotitračných plastových platniach zložených z mM Tris-Cl, 0,16 % deoxycholátu, 0,8 mM 4-metylumbelliferyl-myo-inozitol-l -fosfátu, N-metylmorfolínovej soli, a riedeného enzýmu pri pH 8,0. Pokiaľ to bolo potrebné, tak sa riedenia enzýmu uskutočnili v 0,1 % roztoku BSA vo vode. Reakcie sa sledovali pri 37 °C počas 30 minút s odčítaním v 2-minútových intervaloch za sledovania uvoľňovania metylumbelliferónu zo substrátu s excitáciou pri 350 nm a emisiou pri 450 nm.

Korelácia jednotiek fluorescencie na mikromóly metylumbelliferónu sa použila pre výpočet vzniknutých jednotiek (mikromólov za minútu) na dávku pridaného roztoku enzýmu. Reakcia pri pH 8,0 je kompromisom medzi pH optimálnym pre enzým a pH pre maximálnu fluorescenciu metylumbelliferónu (pH 10). Pri pH 9,0 a vyššom sa rýchlosť neenzymatického uvoľňovania metylumbelliferónu stala signifikantnou. Za týchto podmienok je špecifická aktivita (U/mg) približne 39,3-krát vyššia než pri použití metódy podľa Hendricksona et al. Pre účinnosť testovania v pokusoch so zvieracím krmivom sa jednotky zmerané s použitím tohto testu konvertovali na ekvivalent Hendricksonových jednotiek na uľahčenie porovnania s testami použitými pred týmto testom.

Príklad 10: Test PI-PLC pridaného v účinných dávkach do zvieracieho krmiva

Senzitívnejší variant testu na PI-PLC na báze 4-metylumbelliferyl-myoinozitol-l-fosfátu, N-metyl-morfolínovej soli (príklad 9) bol navrhnutý na meranie enzýmu po pridaní do zvieracieho krmiva, a tento variant použitia zahrnuje jedno pH pre test a druhé pH na meranie fluorescencie. Enzým sa extrahoval z testovaného krmiva odvážením 4 g krmiva a pridaním týchto 4 g do 20 ml 10 mM Tris-Cl (pH 7,5) s 0,1 % deoxycholátom, čím sa získalo 20 g/1 krmiva. Kaša sa potom trepala v NBS G-25 miešacom zariadení (New Brunswick Scientific) počas 1 hodiny pri teplote miestnosti a 250 otáčkach za minútu. Kaša sa odstredila pri 13,000 otáčkach za minútu na IEC Micromax mikroodstredivke s 1,5 ml mikrocentrifugačnými skúmavkami. Vhodné riedenia extraktu sa pripravili v 0,1 % BSA (hovädzom sérovom albumíne). Vzorky extrahované z krmiva s použitím 10 U/0,454 kg sa neriedili.

Prvý stupeň reakcie: Pripravili sa nasledujúce skúmavky: Štandardy pri riedení 1 : 100 alebo 1 : 200 0,12 U/ml PI-PLC (jednotky podľa príkladu 4) a kontrolné roztoky neobsahujúce enzým. Reakčné zmesi sa zakryli fóliou kvôli chráneniu pred svetlom.

μΐ Tris-HCl, 0,10 M, pH 6,0 40 μΐ deoxycholátu (0,8 %) μΐ PI-PLC substrátu (4 mM)

100 μΐ enzýmu

200 μΐ/skúmavku = celkový objem pri 25 °C

V dvoch dobách (30 minút a 60 minút) sa odobralo 0,10 ml každej reakčnej zmesi. Alikvóty sa zahrievali pri 65 °C počas 15 minút na ukončenie reakcie enzýmu a potom sa ochladili na ľade. Nakoniec sa vzorky odstredili pri 12,000 otáčkach za minútu na mikroodstredivke počas 5 minút.

Odčítanie na fluorometri - 120 μΐ 0,10 M Tris pufra (pH 8,0) sa pridalo do mikrotitračnej jamky v čiernej plastovej platni a potom sa pridalo 80 μΐ reakčnej zmesi, ako je opísané v príklade 7. Odčítali sa kontrolné hodnoty pre pozadie. Vypočítala sa rýchlosť produkcie fluorescenčných jednotiek za minútu. Jednotky fluorescencie sa konvertovali na mikromóly produktu reakcie a vypočítali sa enzýmové jednotky extrahované na pôvodných 0,454 kg krmiva.

Príklad 11: Pokusy s kŕmením kurčiat a s expozíciou patogénu

I. Pokus 1 s kŕmením brojlerov

Prvý pokus s kŕmením sa uskutočnil s kuracími brojlermi samčekmi vo veku jeden deň. Pripravilo sa typické uniformné kuracie krmivo označené ako „štartovacie krmivo“, ktoré bolo vyrobené tak, aby spĺňalo alebo prevyšovalo National Research Counciľs NUTRIENT REQUIREMENTS FOR POULTRY (9. vydanie, 1994), a toto sa podávalo vo forme kŕmnej zmesi. Kurčatá sa rozdelili do boxov (30,48 x 60,96 cm) do štyroch terapeutických skupín, kde v každej skupine boli štyri ďalšie skupiny so 6 kurčatami na box (tabuľka 3). Voda a krmivo sa podávali ad libitum počas 21 denného testovacieho obdobia. Rozdelenie kurčiat do skupín a boxov bolo náhodné. Všetky boxy, kŕmidlá a zásobníky na vodu boli pred testom dezinfikované. Svetlo bolo kontinuálne (24 hodín denne) zo žiarivkových lámp. Telesná hmotnosť sa hodnotila len v 1. dni a v 21. dni. Spotreba krmiva sa merala v 21. dni.

V 5. dni sa všetky kurčatá infikovali 200,000 oocystami Eimeria acervulina na kurča orálnym podaním tekutiny. V 7. dni boli všetky kurčatá ďalej infikované 500,000 Clostridium perfringens prostredníctvom dodania vody. V negatívnej kontrole (TI) nebola žiadna liečba infekcie. V pozitívnej kontrole (T2) sa do krmiva pridalo kokcídiostatikum a antibiotikum. Išlo o kokcídiostatikum Sacox (salinomycín v dávke 60 g/tonu) a antibiotikum BMD-50 (50 g/tonu). Pre liečené skupiny T3 a T4 sa krmivo ošetrené prirodzeným PIPLC enzýmom (približne 0,34 gramov PI-PLC na čistý základ krmiva) podávalo od 5. dňa, t. j. od orálneho podania Eimeria acervulina. Všetky krmivá boli pripravené v jednej vsádzke a potom bola táto vsádzka rozdelená pre pridanie antibiotika (testovacia skupina T2) alebo enzýmu (testovacie skupiny T3 a T4). Výsledky analýzy hmotnosti kurčiat sú uvedené v tabuľke 4 a výpočty pomeru krmivo/prírastok hmotnosti sú uvedené v tabuľke 5.

Tabuľka 3 Experimentálna liečba v pokuse 1 kŕmenia brojlerov

Testovacia skupina	Opis testu	Testovaný materiál	Replikácie	Kurčatá na replikáciu
TI	negatívna kontrola	žiadny	4	6
T2	pozitívna kontrola	kokcídiostatikum a salinomycín	4	6
T3	PI-PLC, prirodzený	0,34 g enzýmu/tonu (čistá báza)	4	6
T4	PI-PLC, prirodzený	0,34 g enzýmu/tonu (čistá báza)	4	6

Tabuľka 4 Priemerná telesná hmotnosť (g) na 21. deň

Repl.	Liečba
TI	T2	T3	T4
1	323,00	341,67	377,83	366,67
2	326,67	321,33	383,83	361,17
3	299,33	337,33	378,83	361,33
4	211,67	254,00	374,33	403,40
Priemer	290,17	313,58	378,71	373,14
STAT	b	b	a	a
S. D.	46,52	35,22	3,40	17,61
C. V.	16,03	11,23	0,90	4,72

Tabuľka 5 Priemerná konverzia krmiva (0-21 dní) korigovaná na váhu mortality kurčiat

Repl.	Liečba
TI	T2	T3	T4
1	1,486	1,569	1,407	1,445
2	1,562	1,532	1,423	1,421
3	1,524	1,562	1,432	1,406
4	1,760	1,462	1,438	1,404
Priemer	1,583	1,531	1,425	1,419
STAT	b	b	a	a
S. D.	0,11	0,04	0,01	0,02
C. V.	6,68	2,78	0,82	1,17

V oboch predchádzajúcich tabuľkách sú priemery v riadkoch bez spoločného písmena štatisticky významne odlišné (p < 0,05), podľa Duncanovho testu signifikancie.

II. Pokus 2 s kŕmením brojlerov

Druhý pokus s kŕmením sa uskutočnil s kuracími brojlermi samčekmi vo veku jeden deň. Základné krmivo bolo navrhnuté tak, aby spĺňalo alebo presahovalo National Research Counciľs Nutrient Requirements for Poultry (9. vydanie, 1994) a pripravilo sa vo forme kŕmnej zmesi kvôli zaisteniu uniformity. Test bol usku25 točnený v randomizovaných skupinách boxov, zaslepene, a testoval sa vplyv PI-PLC vyrobeného z prirodzeného zdroja Bacillus cereus (prirodzený typ PI-PLC), alebo z rekombinantného Bacillus megaterium, na stav brojlerov v 21. dňoch veku. Prirodzený zdroj tiež obsahuje iné enzýmy, ale PI-PLC pripravený z Bacillus megaterium je vysoko prečistený a bol ďalej prečistený ultrafiltráciou s použitím 30-Kd NMWC membrány. Kurčatá bola infikované vo 8. dni veku vtáčou kokcídiou (200 000 oocýst E. acervulina na kurča, vo vode) a v 10. dni veku s Clostridium perfringens (100 000 na kurča, vo vode). Každý z 9 typov liečby (tabuľka 6) bol uskutočnený 10-krát alebo na 10 boxoch. Každý box obsahoval 6 vakcinovaných (Newcasíle-Bronchitis, Mareks) Cobb x Cobb brojlerov s priestorom 12,192 cm²/vtáka. Mŕtve vtáky, pokiaľ boli také, sa nenahradzovali po 8. dni. Krmivo sa podávalo vo forme kŕmnej zmesi ad libitum počas celého testu (deň 0 až deň 21).

Bežná a nespracovaná bazálna kŕmna zmes neobsahujúca antibiotiká sa podávala všetkým vtákom odo 5 dňa 0 do dňa 7. Potom sa odo dňa 8 do dňa 21 podávalo deväť spracovaných krmív vo forme kŕmnej zmesi. Bazálne štartovacie krmivo pre brojlery obvykle obsahuje 22 % surového proteínu, s obsahom ME (metabolizovateľnej energie) 1 400 kcal/0,454 kg.

Tabuľka 6 Experimentálne s	pracovanie krmiva pre brojlery v pokuse 2
Spracovanie	Testovaná zložka	Infekcia1
TI	žiadna	+
T2	Bacitracín-metylén-salicylát (BMD 50 g/tonu) a Salinomycín (Sacox, 60 g/tonu)	+
T3	Rekombinantný PI-PLC (3 U/lb) produkovaný Bacillus megaterium	+
T4	Rekombinantný PI-PLC (10 U/lb) produkovaný Bacillus megaterium	+
T5	Rekombinantný PI-PLC (30 U/lb) produkovaný Bacillus megaterium	+
T6	Rekombinantný PI-PLC (90 U/lb) produkovaný Bacillus megaterium	+
T7	PI-PLC (10 U/lb) a ďalšie extraceluláme enzýmy z Bacillus megaterium	+
T8	žiadna	žiadna
T9	Rekombinantný PI-PLC (90 U/lb) produkovaný Bacillus megaterium	žiadna

¹ 200 000 oocýst E. acervulina sa podalo na kurča vo vode v 7. dni a v 10. dni sa podalo 100 000 baktérií

Clostridium perfringens na kurča vo vode.

Tabuľka 7 Pokus 2 s kŕmením brojlerov

liečba	1	2	3	4	5	6	7	8	9
infekcia	+	+	+	+	+	+	+	-	-
medikácia	-	+	-	-	-	-	-	-	-
PI-PLC Typ			Rec1	Rec’	Rec1	Rec1	Wt2		Rec1
cieľ U/lb	-	-	3	10	30	90	10	-	90
Priem, namerané U/lb	0,36	0,32	0,323	0,71	1,74	5,96	2,46	0,12	5,94
hmotn. príras. v dňoch 8-21	309,72	333,83	323,24	324,78	320,64	328,29	298,98	326,12	338,8
	cd	ab	bc	ab	bc	ab	D	Ab	a
konverzia krmiva v dňoch 8-21 (korigovaná)	1,859	1,642	1,702	1,732	1,699	1,739	1,876	1,651	1,650
	C	a	ab	b	ab	b	C	A	a
priemerné skóre črevných lézií	1,447	0,833	1,120	1,133	0,842	0,808	1,267	0,983	0,847
	d	A	bc	bc	a	a	Cd	ab	a

¹ Rekombinantný PI-PLC produkovaný Bacillus megaterium.

² Prirodzený PI-PLC z Bacillus cereus.

³ Dávka PI-PLC bola príliš nízka pre efektívnu extrakciu a meranie v tomto pokuse a javila sa ako základná hodnota pozadia.

V prvom pokuse, kde sa bakteriálna infekcia podala vo vode na napájanie (príklad 11 -I), bola vo všetkých 20 kritériách liečba prirodzeným PI-PLC produkovaným Bacillus cereus rovnako dobrá alebo lepšia než liečba Salinomycínom + BMD (tabuľky 4 - 5). V druhom teste s rekombinantným PI-PLC (príklad 11-11, tabuľka 7), kde bol PI-PLC pridaný v rôznych koncentráciách, bol zistený od dávky závislý účinok na zníženie skóre črevných lézií a na konverziu krmiva (T3-T6) a zvýšenie prírastku hmotnosti. Ďalej liečba rekombinantným PI-PLC, v dávke 90 U/0,454 kg, pri absencii liečby so Salinomycínom + BMD, znižovala skóre črevných lé13 zií a mala pozitívny efekt na konverziu krmiva a prírastok hmotnosti. Prirodzený PI-PLC z Bacillus cereus neúčinkoval v tomto teste tak dobre ako rekombinantný PI-PLC pri rovnakej koncentrácii (10 U/lb (0,454 kg)).

III. Pokus III s kŕmením brojlerov s enzýmami PI-PLC a endo-l,4-P-D-mannanázou

Pokus sa uskutočnil v randomizovaných Petersime boxoch na testovanie vplyvu PI-PLC a endo-l,4-P-D-mannanázy (U. S. Patent 5 429 828) na stav brojlerov v 21. dni veku. Vtáky boli infikované v 8. dni veku vtáčou kokcídiou (75 000 E. acervulina oocýst a 1,250 E. maxima oocýst na vtáka orálne v nápoji) a v 11., 12. a 13. dni veku s Clostridium perfringens (orálne v nápoji každý deň 1 ml čerstvého kultivačného média obsahujúceho 10⁸ cfu/ml). Každá terapia (tabuľka 8) sa skladala z 8 uskutočnení alebo boxov a v každom boxe bolo umiestnených 14 Mareks-vakcinovaných, Cobb x Cobb brojlerov (počet bol znížený na 10 v deň 14, pretože 4 vtáky boli odobraté z každého boxu a boli skórované na lézie) s priestorom na vtáka 10,97 cm². Mŕtve vtáky sa odstraňovali z boxov pri zistení a nenahradzovali sa. Krmivo sa podávalo vo forme kŕmnej zmesi ad libitum počas celého testu (deň 0 až deň 21).

Krmivo sa podávalo vo forme kŕmnej zmesi odo dňa 0 do dňa 21 veku. Bazálne krmivo bolo typické štartovacie krmivo pre brojlery obsahujúce 22 % surového proteínu s ME 1400 kcal/lb (0,454 kg).

Tabuľka 8 Experimentálna liečba v pokuse kŕmenia brojlerov III

Liečba	Medikácia1	Infekcia3	PI-PLC	Mannanáza2
1	+	-	-	-
2	+	-	-	100 MU/T
3	-	+	-	-
4	-	+	-	100 MU/T
5	-	+	Prirodzený PI-PLC (10 U/lb) produkovaný Bacillus cereus	-
6	-	+	Rekombinantný PI-PLC (30 U/lb) produkovaný Bacillus megaterium	-
7	-	+	Rekombinantný PI-PLC (10 U/lb) produkovaný Bacillus megaterium	100 MU/T
8	-	+	Rekombinantný PI-PLC (30 U/lb) produkovaný Bacillus megaterium	100 MU/T
9	+	+	-	-
10	+	+	Rekombinantný PI-PLC (30 U/lb) produkovaný Bacillus megaterium	-

¹ Krmivo obsahujúce bacitracín-metylén-disalicylát (BMD, 50 g/t) a salinomycín (Sacox, 60 g/t).

²100 MU/t sa rovná 100 x 10⁶ jednotkám na tonu krmiva ³ Vtáky boli infikované vo 8. deň veku vtáčou kokcídiou so 75 000 E. acervulina oocýst a 1,250 E. maxima oocýst na vtáka orálne v nápoji a v deň 11, 12 a 13 veku s Clostridium perfringens orálne v nápoji každý deň s 1 ml čerstvého kultivačného média obsahujúceho 10⁸ cfú/ml.

Konverzia krmiva sa upravila z hľadiska rozdielov v priemernej hmotnosti vtákov na účely porovnania liečby. Infekcia zhoršovala AF/G (konverziu krmiva korigovanú na hmotnosť) o približne 23 % (0,147 AF/G jednotiek). Použitie salinomycínu a BMD úplne obnovilo AF/G na normálne hodnoty, ale tieto dve chemické činidlá nebola lepšie než kombinácia β-mannanázy a PI-PLC v redukcii črevných lézií spôsobených infekciou. 100 MU β-mannanázy na tonu buď samostatne, alebo v kombinácii s PI-PLC čiastočne ruší škodlivé následky infekcie, ako je zrejmé zo 65 % až 70 % zlepšenia AF/G vzhľadom na infikované kontroly (pozri T3 vs Tl). β-mannanáza znižovala skóre črevných lézií spôsobených E. acervulina viac než lézií spôsobených E. maxima. Čiastočné obnovenie AF/G bolo dosiahnuté pri infikovaných kurčatách liečených PI-PLC v krmive, ale bolo odstránených len 33 - 41 % zhoršení. Predsa však obe triedy PI-PLC znižovali skóre črevných lézií spôsobených oboma druhmi Eimeria. V prípade E. maxima bola redukcia lézií štatisticky významná. Výsledky sú uvedené v tabuľke 9.

Tabuľka 9 Pokus s kŕmením brojlerov III s PI-PLC a endo-l,4^-D-mannázou pri infekcii kurčiat s E. acervulina, E. maxima a C. perfringens

Opis liečby

Spotreba knriiva

Konv. krmiva

Hmotn. prírastok

ž. hm.

Skóre lézií

Hm.

1'

M1

β-mannanáza

PI-PLC

deň 0-21

deň 8-21

deň 0-21

deň 8-21

deň 0-21

deň 8-21

deň 21

E. acer.

E. max.

F/G3 v. liečba I

1

nie

áno

nie

nie

1 l,178ab

8,866a

l,433dc

l,446d

0,659a

0,540a

0,70 la

0,00c

0,00c

1,433

2

nie

áno

100 MU/t

nie

1 l,230a

8,841a

l,402c

l,424d

0,678a

0,548a

0,720a

0,00c

0,00c

1,416

3

áno

nie

nie

nie

10,497to

8,155*

l,669a

l,704a

0,538d

0,429c

0,579“

l,38a

1,56“

1,579

Opis liečby

Spotreba krmiva

Konv. krmiva

Hmotn. prírastok

ž. hm.

Skóre lézií

Hm.

I1

M1

β-mannanáza

PI-PLC

deň 0-21

deň 8-21

deň 0-21

deň 8-21

deň 0-21

deň 8-21

deň 21

E. acer.

E. max.

F/G3 v. liečba I

4

áno

nie

100 MU/t

nie

10,787abc

8,435al*

l,501cd

l,536c

0,61 U

0,490*

0,652**

1,16ab

l,44ab

1,465

5

áno

nie

nie

1 x Rec 10 U/lb

10,456cd

8,228abc

1,56ο**

l,591b

0,594c

0,477*

0,635c

l,34a

1,19**

1,512

6

áno

nie

nie

3x Rec 30 U/lb

10,266d

7,982c

l,572b

l,621ab

0,597c

0,483*

0,638c

1,16ab

1,13cd

1,526

7

áno

nie

100 MU/t

lx Rec 10 U/lb

10,533abc

8,227“**

1,514**

l,536c

0,598c

0,482*

0,639c

l,09b

1,25**

1,469

8

áno

nie

100 MU/t

3x Rec 30 U/lb

10,496to

8,156**

1,516**

1,562**

0,601c

0,478b

0,643c

l,25ab

l,38abc

1,474

9

áno

áno

nie

nie

1 l,060abc

8,658ab

l,423c

l,447d

0,650a

0,522’

0,692a

l,03b

0,88d

1,416

10

áno

áno

nie

3xRec 30 U/lb

10,666abc

8,359abc

l,430c

l,444d

0,647ab

0,526a

0,688ab

l,03b

l,13cd

1,420

¹1 = infekcia ² M = medikácia (Salinomycín 60 g/t) a BMD (50 g/t)) ³ AF/G = hmotnosť upravená na konverziu krmiva (ošetrenie 1 lb_deft2i - ošetrenie X lb_deň2i)/3 + (spotrebované krmivo/prírastok hmotnosti_(deň o - 21 >)

PI-PLC jednotky sú podľa príkladu 4.

Hemicell MU = milión jednotiek Chem Gen.

IV. Pokus IV s kŕmením brojlerov

Pokus sa uskutočnil v randomizovaných Petersime boxoch na testovanie vplyvu PI-PLC, mannanázy (U. S. Patent 5 429 828) a mykotickej mannanázy na stav brojlerov v 21. dni veku. Vtáky boli infikované v 8. dni veku kokcídiou (75 000 E. acervulina oocýst a 1,250 E. maxima oocýst na vtáka orálne v nápoji) a v 11. 12. a 13. dni veku s Clostridium perfringens (orálne v nápoji každý deň 1 ml čerstvého kultivačného média obsahujúceho 10⁸ cfu/ml). Každá terapia (tabuľka 8) sa skladala z 8 uskutočnení (replikách) alebo boxov a v každom boxe bolo umiestnených 14 Mareks-vakcínovaných, Cobb x Cobb brojlerov (počet bol znížený na 10 v deň 14, pretože 4 vtáky boli odobraté z každého boxu a boli skórované na lézie) s priestorom na vtáka 10,97 cm². Vtáky sa nenahradzovali. Krmivo a voda sa podávali ad libitum počas celého testu (deň 0 až deň 21). Krmivo sa podávalo vo forme kŕmnej zmesi odo dňa 0 do dňa 21 veku. Bazálne krmivo bolo typické kukuričné/sójové štartovacie krmivo pre brojlery obsahujúce 22 % surového proteínu s ME 1400 kcal/lb (0,454 kg).

Výsledky zhrnuté v tabuľke 10 ukazujú reprodukovateľný prínos pridania buď PI-PLC, alebo mannanázy do krmiva brojlerov infikovaných dvoma druhmi vtáčej kokcídie a Clostridium perfringens, kde toto pridanie viedlo k zlepšeniu tak v prírastku hmotnosti, ako aj v konverzii krmiva. Dôležité je, že táto štúdia ukázala, že PI-PLC alebo mannanáza, v kombinácii so salinomycínom, ale bez antibiotika BMD (testy 6 a 5) obnovuje stav kurčiat prakticky na stav neinfikovaných jedincov (č. 1 a 2). Toto je dôkazom antibakteriálneho účinku. V tomto prípade účinkoval PI-PLC/Salinomycín o niečo lepšie než mannanáza a lepšie než súčasné pridávanie kombinácie BMD a salinomycínu pri liečbe infikovaných kŕdľov (test 4).

Tabuľka 10 Pokus IV s kŕmením brojlerov

Test	ŕ	E2		skóre lézií	konverzia krmiva	hmotn. prírastok	živá hmotnosť
E. acer.	E. max.
vrchné	stredné	deň 0-21	deň 8-21	deň 0-21	deň 8-21	deň 21
1	-	-	-	0,00	0,00	1,652	1,694	0,527	0,427	0,565
2	-	-	B/S	0,00	0,00	1,612	1,656	0,546	0,437	0,583
3	+	-	-	2,44	2,31	1,813	1,909	0,394	0,296	0,432
10	+	-	B	2,25	1,94	1,707	1,770	0,453	0,352	0,490
7	+	-	S	1,00	1,09	1,709	1,719	0,458	0,368	0,496
4	+	-	B/S	0,59	1,63	1,585	1,671	0,509	0,397	0,547
16	+	PI-PLC	-	2,25	1,50	1,701	1,778	0,451	0,347	0,486
9	+	PI-PLC	B	2,03	1,34	1,760	1,844	0,445	0,342	0,482
6	+	PI-PLC	S	1,06	1,28	1,584	1,613	0,526	0,419	0,564
12	+	Man.	-	1,94	1,34	1,803	1,849	0,433	0,338	0,483
13		Man. 5x	-	2,13	2,00	1,740	1,813	0,437	0,339	0,471
8	+	Man.	B	2,09	1,34	1,707	1,772	0,448	0,348	0,486

Test	1'	E2	M3	skóre lézií	konverzia krmiva	hmotn. prírastok	živá hmotnosť
E. acer.	E. max.
vrchné	stredné	deň 0-21	deň 8-21	deň 0 - 21	deň 8-21	deň 21
5	+	Man.	S	0,97	1,09	1,652	1,688	0,500	0,397	0,538
11	+	Man.	B/S	0,78	1,16	1,622	1,666	0,502	0,390 0,540

¹1 = Infekcia: infikovaní vo 8. dni veku so 75 000 oocýst E. acervulina a 1250 oocýst E. maxima na vtáka orálne v nápoji a v 11., 12. a 13. dni veku s Clostridium perfringens orálne v nápoji každý deň 1 ml čerstvého kultivačného média obsahujúceho 10⁸ cfu/ml.

² E = Enzýmy: PI-PLC = rekombinantný PI-PLC produkovaný B. megaterium pridaný v dávke 30 U/lb. Jednotky sú definované ako v príklade 4; Man. = B. lentus endo-l,4-P-D-mannanáza (U. S. Patent 5429828) pridaná v dávke 121 MU/tonu (milióny ChemGen jednotiek/tonu), alebo 5 x pri 506 MU/tonu.

³ M = Medikácia (B = BMD pri 50 g/tonu); S = Salinomycín (v dávke 60 g/tonu).

Príklad 12: Stanovenie vplyvu enzýmov na životaschopnosť a bunkovú inváziu sporozoitov Eimeria acervulina a Eimeria tenella in vitro

Sporozoity Eimeria acervulina alebo sporozoity Eimeria tenella a kultúra fetálnych buniek obličky škrečka sa pripravili publikovanými metódami. Pozri Augustíne, Avian a Poultry Biology Reviews 11: 113 - 122, 2000. Na ošetrenie buniek sa bunkové kultúry prevrstvili riedeniami enzýmov podľa tabuľky 11a testovali sa na morfologické zmeny počas 5 až 45 minút po prevrstvení. Po 45 minútach sa monovrstvové kultúry dvakrát premyli a potom sa naočkovali neošetrenými sporozoitmi E. acervulina alebo E. tenella. Pre aplikáciu počas infekcie sa sporozoity suspendovali vo vhodnom riedení enzýmu a naočkovali sa ihneď do bunkovej kultúry. Po 45 minútach inkubácie sa kultúry fixovali, farbili sa a kvantifikovala sa invázia.

Pozorovali sa zmeny morfológie sporozoitov alebo buniek počas liečby enzýmom. Pri koncentráciách enzýmov použitých v týchto pokusoch neboli zaznamenané morfologické zmeny. Invázia sporozoitov do kultivovaných buniek sa merala po dvoch spôsoboch ošetrenia buniek enzýmom, rovnako ako bez ošetrenia enzýmom, histologickým farbením a mikroskopicky. Pozri Augustíne.

Dáta v tabuľke 11 ukazujú signifikantnú redukciu invázie sporozoitov tak pre E. acervulina, ako aj pre E. tenella. Oba relatívne málo prečistené prípravky PI-PLC enzýmu z extracelulámeho média B. cereus, a vysoko prečistený rekombinantný PI-PLC produkovaný v rekombinantnom B. megaterium, viedli ku štatisticky významnej redukcii invázie vo väčšine pokusov. I pri dávke približne jednej polovice prirodzeného prípravku z PI-PLC bol rekombinantný PI-PLC prostriedok stále aktívny. Tak bolo predliečenie buniek enzýmom a vymytie enzýmu rovnako účinné ako pridanie enzýmu súčasne počas infekcie. Ale podľa pokusov s extrakciou enzýmu z krmiva nevedú dva kroky premytia pravdepodobne k odstráneniu všetkého enzýmu.

Enzýmový prostriedok s endo-l,4-3-D-mannanázou tiež spôsoboval štatisticky signifikantnú redukciu invázie vo dvoch pokusoch, kedy boli bunky predliečené enzýmom pred infekciou. Tieto pozitívne výsledky boli dosiahnuté v jednom pokuse s každým typom patogénu. Tak účinkuje mannanáza rovnako dobre ako B. cereus PI-PLC prípravok pri redukcii invázie sporozoitov in vitro.

Tabuľka 11 In vitro invázia BHK buniek sporozoitmi Eimeria acervulina alebo Eimeria tenella s a bez ošetrenia enzýmom

Enzýmy a koncentrácie	Predliečenie buniek enzýmom nasledované premytím	Aplikácia enzýmu počas infekcie
E. acervulina sporozoity	Test 1	Test 2	Test 1	Test 2
Kontrola	22 ±la	33 ±4a	50Ϊ4	35 ±7a
PI-PLC z B. cereus' 0,0403 U/mL	15 ±lb	26+lab	33 ±3b	25 ±2ab
PI-PLC ϊ rekombinantného B. megaterium2 0,261 U/mL	14±lb	22 ±lb	16±2C	m1*
PI-PLC z rekombinantného B. megaterium2 0.0261 U/mL	18±lab	26 V”	36±3b	9±2C
endo-1,4-P-D-mannanáza3 5100 U/mL	16±lb	29 +2ab	ND5	ND
E. tenella sporozoity	Test 1	Test 2	Test 1	Test 2
Kontrola	44 ±2a	26 ±4“	63 ±5“	42 ±4a
PI-PLCz B. cereus' 0,0403 U/mL	38 ±2b	21 ±2a	52 ± 13ab	37 ±2ab
PI-PLC z rekombinatného B. megaterium2 0,261 U/mL	30±lc	15 ±0a	28 ±2b	39 ±4ab
PI-PLC z rekombinantného B. megaterium2 0,0261 U/mL	ND	17 ± la	18±lc	29 ±lb
endo-1,4-P-D-mannanáza3 5100 U/mL	35 ±lb	19 ±5a	46 ±6ab	ND

Počty invázií sú udávané ako priemer ± štandardná odchýlka z priemeru meraného z 1 - 3 krycích sklíčok/aberácii (BHK bunky boli kultivované na krycích sklíčkach vložených do kultivačných diskov). Priemery v testovaných skupinách s rôznymi indexami sa štatisticky významne líšia (P < alebo = 0,05).

¹ Extracelulámy enzým z B. cereus dialyzovaný vo fosfátom pufrovanom salinickom roztoku, jednotky štandardizované spôsobom podľa príkladu 4.

² Extracelulámy enzým z rekombinantného B. megaterium dialyzovaný vo fosfátom pufrovanom salinickom³ Mannanáza získaná z Bacillus lentus spôsobom podľa U. S. Patentu 5429828 a dialyzovaná do fosfátom pufrovaného salinického roztoku, jednotky sú definované podľa ChemGen Corp. testu redukcie sacharidov.

⁴ ND = nestanovené.

Príklad 13: Hodnotenie PI-PLC pri infekcii s Cryptosporidium in vitro

Enzým PI-PLC sa hodnotil na anti-kryptosporidiovú aktivitu a toxicitu pri koncentráciách v rozmedzí od 0,001 s 30 U/ml a test sa uskutočnil na 4-denných Madin-Darby bunkách psej obličky (MDCK). Enzýmové jednotky boli definované rovnako ako v príklade 4, ale merané boli podľa príkladu 9. Použitým enzýmovým prostriedkom bol prostriedok z rekombinantného Bacillus megaterium. Liečba bola začatá 3 hodiny po infekcii a pokračovala počas 48 hodín.

Chemiluminiscenčný imunotest

Pred infekciou sa oocysty premyli a resuspendovali sa v DMEM báze s 0,75 % taurocholátom sodným a inkubovali sa počas 10 minút pri 37 °C (You et al., FEMS Microbiol. Letters 136: 251 - 256, 1996; You et al., J. Antimicrobial. Chemother. 41: 293 - 296, 1998). Excystačná zmes sa nariedila Ultraculture médiom, rýchlo sa preniesla na platne obsahujúce MDCK bunky, pri 100 % konfluencii, a udržovala sa v Ultraculture médiu počas 4 dní. Inokulum sa inkubovalo s bunkami počas 3 hodín pred premytím s PBS a nahradením čerstvým Ultraculture médiom s alebo bez testovaného enzýmu. Platne sa inkubovali pri 37 °C, v 5 % atmosfére CO₂, počas 48 hodín. Kultúry sa premyli s PBS a fixovali sa Bouinovým roztokom.

Fixované platne sa premyli TBST pufrom (20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, 0,05 % Tween 20) a blokovali sa 1 % BSA-TBST (TBST pufer obsahujúci 1 % hovädzí sérový albumín) počas 30 minút pri 25 °C za mierneho trepania. Králičie anti-Cryptosporidium parvum sérum (riedenie 1 : 200) sa aplikovalo na platne a uskutočnila sa inkubácia počas 1 hodiny. Po premytí TBST sa vzorky sekvenčne inkubovali s kozou protilátkou proti králičiemu IgG značenou biotínom a streptavidínom značenou chrenovou peroxidázou (pracovné riedenie, 1 : 1000, KPL Inc., Gaithersburg, MD). Obohatený luminol(4-jódfenol a peroxid vodíka, Aldrich Chemical Co. Inc., Milwaukee, WI) sa použil ako substrát. Platne sa odčítali s použitím ML3000 Luminometer (Dynatech Lab., Chantilly, VA) a určili sa relatívne svetelné jednotky (RLU). Priemery RLU sa vypočítali zo 4 jamiek a všetky pokusy sa opakovali aspoň dvakrát.

Test toxicity

Enzým sa testoval s použitím komerčného testu redukcie tetrazóliového farbiva (CellTiter 96; Promega Corp., Madison, WI, USA). Stručne, každá koncentrácia enzýmu uvedená ďalej sa vniesla do 96-jamkovej platne obsahujúcej konfluentnú monovrstvu MDCK buniek. Každé riedenie sa hodnotilo v trojitom uskutočnení. Enzým sa inkuboval na monovrstvách pri 37 °C a 5 % CO₂. Po 48 hodinách sa platne vyvíjali počas 1 hodiny a odčítali sa v ELISA čítačke platní pri 490 nm. Výsledky boli zaznamenané a analyzované. Percento toxicity sa vypočítalo odčítaním priemernej OD kontrolného média bez enzýmu od priemernej OD s enzýmom a potom delením OD média a násobením 100. Skóre cytotoxicity bolo nasledujúce:

Toxicita %_Skóre

- 5 % 0

- 25 % 1

- 50 % 2

51-75% 3

-100 % 4

Signifikantná toxicita bola pozorovaná pre 3 U/ml alebo vyššie koncentrácie enzýmu. Žiadna významná toxicita nebola pozorovaná pre tento enzým v rozmedzí 0,1-1 U/ml (tabuľka 12). Preto bola séria pokusov s týmto rozmedzím koncentrácie (1,0 U/ml alebo nižšie) uskutočnená na stanovenie aktivity enzýmu a špecificity enzýmu. V prvom pokuse boli MDCK bunky infikované excystovanými sporozoitmi. Po 3-hodinovej inkubácii sa monovrstva buniek premyla a enzým sa pridal v rôznych koncentráciách na 48 hodín. Ako je uvedené v tabuľke 13, vykazoval enzým anti-kryptosporoidálnu aktivitu v rozmedzí 0,01-1 U/ml in vitro. Približne 50 % inhibícia bola dosiahnutá pri koncentrácii 0,1 U/ml (obr. 1).

Tabuľka 12 Toxicita rekombinantného PI-PLC pripraveného v B. megaterium pre monovrstvu MDCK buniek

Koncentrácia	% Toxicity (95 % CL)	Skóre toxicity
10 U/ml	83	4
3	57	3
1	13	1
0,3	11	1
0,1	10	1

Tabuľka 13 Aktivita rekombinantného PI-PLC enzýmu v bunkových kultúrach MDCK buniek infikovaných

Liečba	U/ml	Percentuálna inhibícia	Priemerný počet Cryptosporidií na jamku mikrotitračnej platne	95 % CL
Po infekcii počas 3 hodín	1	77,36	285,28	0,01
	0,3	77,26	286,5	0,04
	0,1	52,74	595,53	0,18
	0,03	27,62	912,15	0,22
	0,01	7,33	1 167,78	0,09
Infikované	-	0	1 260,18	0,09
Neinfikované	-	100	0	0,02

Druhá séria pokusov sa uskutočnila na hodnotenie specificity enzýmu. Sporozoity sa ošetrili enzýmom v rôznych koncentráciách počas 45 minút a krátko sa premyli. Ošetrené sporozoity sa potom ponechali, aby infikovali neošetrené hostiteľské bunky a nechali sa vyvíjať a množiť počas 48 hodín. V samostatnom pokuse sa hostiteľské bunky inkubovali s rôznymi koncentráciami enzýmu, premyli sa a infikovali sa neošetrenými sporozoitmi. Ako je uvedené ďalej (tabuľka 14), ošetrenie sporozoitov alebo hostiteľských buniek enzýmom viedlo k čiastočnej inhibícii. Dávková závislosť pre inhibíciu nebola pri týchto koncentráciách pozorovaná. To môže byť spôsobené krátkou inkubačnou dobou enzýmu s hostiteľskými bunkami alebo s parazitom (45 minút) alebo čiastočným, alebo nekompletným štiepením receptorov hostiteľa/parazita. Ďalej, na infekcii sa zrejme podieľajú iné receptory hostiteľa/parazita, ktoré môžu byť príčinou rastu pozorovaného v hostiteľských bunkách.

Tabuľka 14 Ošetrenie sporozoitov alebo MDCK buniek pred infekciou a vplyv ošetrenia na infektivitu C. parvum

Liečba	PI-PLC U/ml	% inhibície	Priemerný počet Cryptosporidií na jamku mikrotitračnej platne	95 % CL
Sporozoity ošetrené pred infekciou	1	67,27	412,40	0,02
	0,3	65,64	433,04	0,06
	0,1	57,40	536,80	0,03
	0,03	58,13	527,59	0,03
	0,01	56,98	542,15	0,01
Hostiteľské bunky ošetrené pred infekciou	1	68,76	393,64	0,12
	0,3	50,07	629,24	0,26
	0,1	63,82	455,88	0,19
	0,03	58,53	522,66	0,12
	0,01	56,84	543,85	0,10
Infikované		0	1260,18	0,09
Neinfikované		100	0	0,02

Príklad 14: Hodnotenie PI-PLC pri infekcii s Cryptosporidium in vivo

Enzým sa hodnotil na antikryptosporidiovú účinnosť s použitím myšieho modelu imunodeficitných SC1D myší. Stručne, inokulum oocýst sa pripravilo premytím prečistených oocýst (skladovaných <6 mesiacov) s 0,1 % BSA, PBS (pH 7,2) na odstránenie dvojchrómanu draselného. SCIĎ myši (vo veku 4-5 týždňov) sa infikovali 10⁶ oocystami (IOWA kmeň) a liečili sa uvedeným spôsobom. Od myší sa odoberali vzorky stolice, prečistili sa cez diskontinuálnu sacharózu a testovali sa na obsah parazitov pomocou prietokovej cytometrie, ako bolo opísané. Pozri Arrowwood et al., J. Parasitol. 81: 404 - 409,1995.

Tabuľka 15 Liečebné režimy pre terapeutické pokusy_

Skupina myší	A	B	C
Počet myší	10	10	10
Inokulačná dávka	10	10	10
Zlúčenina	PI-PLC	PI-PLC	Placebo
Dávka (mg/kg)	90 U/ml	30 U/ml	PBS
Spôsob podania	v krmive	v krmive	v krmive
Frekvencia	Ad lib	Ad lib	Ad lib

Granulované myšie krmivo sa potiahlo buď s 30, alebo 90 U/lb (0,434 kg) PI-PLC v PBS alebo PBS. Všetky myši sa kŕmili ad libitum. Myšiam sa podávalo krmivo ihneď po injekcii. Vzorky stolice a hmotnosť sa odoberali a určovali dvakrát v týždni. Spotreba krmiva sa merala denne. Myši sa usmrtili injekciou 0,2 cm³

100 mg/ml Ketamínu, 100 mg/ml Xylazínu a 0,9 % NaCl).

Priemerné množstvo potravy skonzumovanej na deň a myš a priemerné hmotnosti myší sú uvedené v tabuľke 16. Počas 3-týždenného obdobia neboli pozorované štatisticky významné rozdiely v spotrebe krmiva či hmotnosti.

Tabuľka 16 Spotreba krmiva a prírastok hmotnosti pri myšiach__

	Skupiny ošetrenia	Skonzumované krmivo (g) myš/deň	Hmotnosť (g)
Deň 3		AVG	AVG
	A (90U/lb)	7,56	16,67
	B (30U/lb)	6,13	17,055
	C (PBS kontrola)	5,46	16,88
Deň 7		AVG	AVG
	A	8,31	16,95
	B	8,51	16,91
	C	7,27	16,89
Deň 10		AVG	AVG
	A	8,55	17,29
	B	7,93	17,08
	C	7,11	16,97
Deň 14		AVG	AVG
	A	7,78	17,43
	B	8,06	17,62
	C	7,55	17,38
Deň 17		AVG	AVG
	A	8,52	17,64
	B	8,53	17,84
	C	7,79	17,59
Deň 21		AVG	AVG
	A	7,89	18,25
	B	8,22	18,62
	C	8,51	18,14
Deň 24		AVG	AVG
	A	9,79	18,2
	B	8,3	18,63
	C	8,22	18,33

Účinnosť po 3 týždňoch po infekcii. Vzorky stolice sa odobrali po 3, 4 a 4, 5 týždňoch po infekcii a počet Cryptosporidií sa meral pri SCID myšiach a pri kontrolných skupinách, ako je uvedené v tabuľke 17. Ako je uvedené, myši liečené enzýmom vykazovali zníženie počtu parazitov. V liečených skupinách bol pozorovaný obsah parazitov (34 - 54 %). Niektoré z týchto znížení boli štatisticky významné pri hodnotení s použitím ANOVA štatistickej analýzy (ako je uvedené ďalej a označené symbolmi). Enzým mal potenciál ako antikryptosporoidálne terapeutické činidlo. Vyššie dávky enzýmu alebo lepšie dodanie enzýmu do miesta infekcie môže zvýšiť jeho účinnosť a toto môže byť predmetom ďalších pokusov.

Tabuľka 17 Účinnosť PI-PLC in vivo na redukciu Cryptosporidium v stolici

Terapeut. skupina	Dávka enzýmu (U/lb)	Obsah parazitov (oocysty/100 μΐ) (SD) Deň 21	% inhibície	Obsah parazitov (oocysty/100 μΐ (SD) Deň 28	% inhibície	Obsah parazitov (oocysty/100 μΐ) (SD) Deň 31	% inhibície
PI-PLC	90	22,7(11,4)	44,0	26,3 (14)	48,9	87,5 (52,9)	34,0
PI-PLC	30	16,2 (4,7)	52,0	23,4(11)	54,6	74, 3 (89,7)+	40,0
PBS (kontrolaň	-	33,5 (16,2)	-	50,4 (29)	-	132,1 (89.)	-

hodnoty P boli štatisticky významné pri 0,05 alebo menej ⁺ hodnota P bola 0,08 alebo menšia

Príklad 15: Overenie enzýmu v krmive použitom pri testovaní rastu

Test na PI-PLC extrahovaný z krmiva použitého v uvedených testoch so zvieratami sa uskutočnil spôsobom opísaným v príklade 10. Výsledky sú zhrnuté v tabuľkách 18 - 19.

Tabuľka 18 Cryptosporidiový test, myšie krmivo

Liečba	Kontrola	30 U/lb	90 U/lb
cieľová hodnota U/lb	0	30	90
Typ PI-PLC	-	Rekombinantný z B. megaterium	Rekombinantný z B. megaterium
PI-PLC šarže č.	-	45 - 46 SF	45 - 46 SF
Extrahované U/lb	0	22,8	66,1
% extrahovaného z cieľového	-	76,0	73,4

¹⁰

Účinnosť extrakcie z krmiva sa významne líši podľa typu krmiva. Extrakcia z myšieho krmiva má 73,4 až 76 % účinnosť (tabuľka 18). Do troch rôznych prípravkov kuracieho krmiva vyrobených na troch rôznych miestach bolo opatrne pridané 45 alebo 180 U/lb rekombinantného PI-PLC, a potom bol PI-PLC ihneď extrahovaný a testovaný s použitím spôsobu podľa príkladu 9 na to, či je obsah PI-PLC v krmive v rozmedzí testovacieho spôsobu podľa príkladu 9 (tabuľka 19).

Tabuľka 19 Testovanie účinnosti extrakcie z rôznych kuracích krmív a kukuričnej múčky

	Zdroj kuracieho krmiva
Zdroj 1	Zdroj 2	Zdroj 3	kukuričná múčka
Vložené množst. U/lb	180	45	180	45	180	45	180	45
Extrahované U/lb	128	9,3	53,2	3,66	82,7	8,46	134,4	33
% extrahovaných pridaných jednotiek	71,1	20,7	29,6	8,1	45,9	18,8	74,7	73,3

Je vidieť, že účinnosť extrakcie z kukuričnej múčky je podobná účinnosti extrakcie z myšieho krmiva. 20 Predsa však, extrakcia z niektorých vzoriek kuracieho krmiva bola v tomto pokuse - a tiež v ďalších pokusoch - o niečo horšia.

V teste uvedenom v tabuľke 20 bol podiel extrahovateľného enzýmu približne 30 - 45 % teoretického obsahu PI-PLC, zatiaľ čo β-mannanáza bola ľahko extrahovateľná s výťažkom približne 100 %. Približne 45 %-ná extrakcia bola najlepšou extrakciou z tohto krmiva v uvedenom teste extrakcie. Tak sú výsledky tes25 tu pre extrahované jednotky/0,454 kg krmiva uvedené v tabuľke 20 v rozmedzí očakávanom pre použitý obsah.

Tabuľka 20 Overenie obsahu enzýmu v krmive z pokusu 111 kŕmenia brojlerov

Liečba č.	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
Infekcia	-	-	+	+	+	+	+	+	+	+
Meditácia	+	+	-	-	-	-	-	-	+	+
Cieľ U/lb	0	0	0	0	10	30	10	30	0	30
Typ PI-PLC	-	-	-	-	WT	Rec	Rec	Rec	-	Rec
Testy s U/lb PI-PLC
Priemer U/lb	0,94	0,76	0,79	0,7	3,08	11,48	4,56	10,18		9,49
% cieľa	-	-	-	-	30,75	38,27	45,57	33,93		31,64
cieľ MU/tonu	-	100	-	100	-	-	100	100	-	-
Hemicell. mannanáza	-	+	-	+	-	-	+	+	-	-
Testy s MU/tonu mannanázy
MU/tonu	-	124,9	-	135,5	-	-	153,5	172,0	-	-
% cieľa	-	124,9	-	135,5	-	-	153,5	172,0	-	-

Aj keď boli opísané určité uskutočnenia a podrobnosti predkladaného vynálezu, bude odborníkom v odbore jasné, že existujú rôzne zmeny a modifikácie vynálezu, ktoré patria do jeho rozsahu.

Claims (10)

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Prostriedok, vyznačujúci sa tým, že obsahuje (i) enzým vybraný z fosfatidylinozitolšpecifickej fosfolipázy C a fosfatidylinozitol-špecifickej fosfolipázy D, a (ii) fyziologicky prijateľný nosič pre uvedený enzým, kde uvedený prostriedok je vo forme vhodnej na orálne podanie.

2 8. Použitie podľa nároku 27, kde uvedený kmeň Bacillus cereus je ATCC 7004 alebo ATCC 6464.

29. Použitie podľa ktoréhokoľvek z nárokov 21 až 26, kde uvedený enzým je získaný expresiou rekombinantnej DNA v hostiteľskom organizme.

2 7. Použitie podľa ktoréhokoľvek z nárokov 21 až 26, kde uvedený enzým je pripravený z kmeňa Bacillus cereus.

2 2. Použitie podľa nároku 21, kde toto použitie je bez podania anti-infekčného činidla iného než uvedený enzým.

23. Použitie podľa nároku 21, kde uvedená infekcia je spôsobená protozoámym, bakteriálnym, kvasinkovým, vírusovým alebo mykotickým patogénom.

24. Použitie podľa nároku 23, kde uvedená infekcia je spôsobená protozoámym patogénom rodu Eimeria.

25. Použitie podľa nároku 23, kde uvedená infekcia je spôsobená protozoámym patogénom rodu Cryptosporidium.

26. Použitie podľa nároku 23, kde uvedená infekcia je spôsobená bakteriálnym patogénom rodu Clostridium.

2. Prostriedok podľa nároku 1, v y z n a č u j ú c i sa tým, že ide o krmivo.

3 9. Prostriedok podľa nároku 33, vyznačujúci sa tým, že uvedený enzým je obsiahnutý v tablete alebo obale želatínovej kapsuly.

40. Prostriedok podľa nároku 33, vyznačujúci sa tým, že uvedenou endo-l,4-D-mannanázou je endo-l,4-D-mannanáza produkovaná Bacillus lentus s označením ATCC 55045.

41. Prostriedok podľa ktoréhokoľvek z nárokov 33až 40, vyznačujúci sa tým, že ďalej zahrnuje stabilizátor, karbohydrátový nosič alebo konzervačnú prísadu.

42. Prostriedok podľa nároku 41, vyznačujúci sa tým, že stabilizátorom je pufer, karbohydrát alebo glykol.

43. Prostriedok podľa nároku 41, vyznačujúci sa tým, že karbohydrátový nosič je vybraný zo skupiny pozostávajúcej z xylózy, fruktózy, glukózy, sorbitolu a maltotriózy.

44. Prostriedok podľa nároku 41, vyznačujúci sa tým, že konzervačná prísada je vybraná zo skupiny pozostávajúcej z propylparabénu, sorbátu sodného, sorbátu draselného a askorbylpalmitátu.

45. Použitie endo-l,4-D-mannanázy, kde tento enzým je podávaný bez antimikrobiálne účinného množstva iného antiinfekčného činidla, na výrobu orálnej dávkovej formy liečiva na liečenie alebo zmiernenie rizika infekcie tráviaceho traktu.

46. Použitie podľa nároku 45, kde uvedená infekcia je spôsobená protozoámym, bakteriálnym, kvasinkovým, vírusovým alebo mykotickým patogénom.

47. Použitie podľa nároku 46, kde uvedená infekcia je spôsobená protozoámym patogénom rodu Eimeria.

48. Použitie podľa nároku 46, kde uvedená infekcia je spôsobená protozoámym patogénom rodu Cryptosporidium.

49. Použitie podľa nároku 46, kde uvedená infekcia je spôsobená bakteriálnym patogénom rodu Clostridium.

5

50. Použitie podľa ktoréhokoľvek z nárokov 45 až 49, kde uvedený enzým je pripravený z kmeňa Bacillus lentus.

51. Použitie podľa ktoréhokoľvek z nárokov 45 až 49, kde uvedený enzým je získaný expresiou rekombinantnej DNA v hostiteľskom organizme.

3 8. Prostriedok podľa nároku 33, vyznačujúci sa tým, že uvedený prostriedok je v pevnej alebo kvapalnej forme.

3 6. Prostriedok podľa nároku 35, vyznačujúci sa tým, že uvedený zrnitý materiál je kukurica, cirok, pšenica, jačmeň alebo ovos.

37. Prostriedok podľa nároku 35, vyznačujúci sa tým, že zdrojom proteínov sú fazuľa alebo hrach.

3 5. Prostriedok podľa nároku 34, vyznačujúci sa tým, že uvedená požívatina je krmivo pre zvieratá zložené zo zrnitého materiálu, zdroja proteínov, vitamínov, aminokyselín a minerálov.

3 3. Prostriedok, vyznačujúci sa tým, že obsahuje (i) endo-l,4-D-mannanázu a (ii) fyziologicky prijateľný nosič pre uvedený enzým, kde uvedený prostriedok je vo forme vhodnej na orálne podanie a je bez iného antiinfekčného činidla, než je uvedený enzým, pričom prostriedok obsahuje uvedený enzým v množstve účinnom na liečenie alebo zmiernenie rizika infekcie tráviaceho traktu.

34. Prostriedok podľa nároku 33, vyznačujúci sa tým, že uvedeným nosičom je požívatina, do ktorej je uvedený enzým zapracovaný.

3 2. Použitie podľa ktoréhokoľvek z nárokov 21 až 30, kde enzýmom je fosfatidylinozitol-špecifická fosfolipáza D.

3 0. Použitie podľa nároku 29, kde uvedený hostiteľský organizmus je z kmeňa Bacillus megaterium.

31. Použitie podľa ktoréhokoľvek z nárokov 21 až 30, kde enzýmom je fosfatidylinozitol-špecifická fosfolipáza C.

3. Prostriedok podľa nároku 1 alebo 2, vyznačujúci sa tým, že je bez iného antiinfekčného činidla, nezje uvedený enzým.

4. Prostriedok nároku 1, vyznačujúci sa tým, že uvedený enzým je fosfatidylinozitolšpecifická fosfolipáza C.

5 2. Použitie podľa nároku 51, kde uvedený hostiteľský organizmus je z kmeňa Bacillus megaterium.

5. Prostriedok podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že uvedený enzým je fosfatidylinozitol-špecifická fosfolipáza D.

6. Prostriedok podľa ktoréhokoľvek z nárokov laž 5, vyznačujúci sa tým, že ďalej zahrnuje stabilizátor, karbohydrátový nosič alebo konzervačnú prísadu.

7. Prostriedok podľa nároku 6, vyznačujúci sa tým, že stabilizátorom je pufer, karbohydrát alebo glykol.

8. Prostriedok podľa nároku 6, vyznačujúci sa tým, že karbohydrátový nosič je vybraný zo skupiny pozostávajúcej zo xylózy, fruktózy, glukózy, sorbitolu a maltotriózy.

9. Prostriedok podľa nároku 6, vyznačujúci sa tým, že konzervačná prísada je vybraná zo skupiny pozostávajúcej z propylparabénu, sorbátu sodného, sorbátu draselného a askorbylpalmitátu.

10. Prostriedok podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 9, vyznačujúci sa tým, že uvedený nosič je požívatina, do ktorej je uvedený enzým zapracovaný.

11. Prostriedok podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 10, vyznačujúci sa tým, že uvedená požívatina je krmivo pre zvieratá zložené zo zrnitého materiálu, zdroja proteínov, vitamínov, aminokyselín a minerálov.

12. Prostriedok podľa nároku 11, vyznačujúci sa tým, že uvedený zrnitý materiál je kukurica, cirok, pšenica, jačmeň alebo ovos.

13. Prostriedok podľa nároku 11, vyznačujúci sa tým, že zdrojom proteínov sú fazuľa alebo hrach.

14. Prostriedok podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 9, vyznačujúci sa tým, že uvedený prostriedok je v pevnej alebo kvapalnej forme.

15. Prostriedok podľa ktoréhokoľvek z nárokov laž 9, vyznačujúci sa tým, že uvedený enzým je obsiahnutý v tablete alebo obale želatínovej kapsuly.

16. Prostriedok podľa ktoréhokoľvek z nárokov laž 15, vyznačujúci sa tým, že uvedený enzým je pripravený z kmeňa Bacillus cereus.

17. Prostriedok podľa nároku 16, vyznačujúci sa tým, že uvedený kmeň Bacillus cereus je ATCC 7004 alebo ATCC 6464.

18. Prostriedok ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 15, vyznačujúci sa tým, že uvedený enzým je získaný expresiou rekombinantnej DNA v hostiteľskom organizme.

19. Prostriedok podľa nároku 18, vyznačujúci sa tým, že uvedený hostiteľský organizmus je z kmeňa Bacillus megaterium.

20. Prostriedok podľa nároku 2, vyznačujúci sa tým, že uvedený enzým je prítomný v dávke 200 IU/kg až 4 000 IU/kg krmiva.

21. Použitie enzýmu vybraného z fosfatidylinozitol-špecifickej fosfolipázy C a fosfatidylinozitol-špecifickej fosfolipázy D na výrobu orálnej dávkovej formy liečiva na liečenie alebo zmiernenie rizika infekcie tráviaceho traktu.

10 53. Použitie podľa nároku 45, kde uvedenou endo-l,4-P-D-mannanázou je endo-l,4-p-D-mannanáza produkovaná Bacillus lentus s označením ATCC 55045.