PL203054B1 - Kompozycja zawierająca enzym i zastosowanie enzymu w terapii infekcji przewodu pokarmowego - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Wynalazek dotyczy kompozycji, która zawiera enzym oraz zastosowania enzymów jako czynników przeciwko zakażeniom w kontekście leczenia lub obniżania zagrożenia zakażeniami przewodu pokarmowego.

Raport z 1998 roku „Revision of the World Population Estimates and Projections” Departamentu Spraw Ekonomicznych i Społecznych Narodów Zjednoczonych przewidywał, że populacja świata osiągnie 6 miliardów w roku 1999. Raport podał także, że wzrost liczebności populacji z 5 do 6 miliardów trwał tylko 12 lat w porównaniu z okresem 123 lat potrzebnym do uzyskania wzrostu od 1 do 2 miliardów. Do poł owy 21 wieku przewidywana populacja b ę dzie liczył a od 7,3 do 10,7 miliarda. Tak znaczny wzrost populacji w ostatniej dekadzie jest częściowo skutkiem wzrostu produkcji żywności, co wynika ze stosowania nowej technologii i intensywnych praktyk produkcji żywności. Aby nadążyć za wzrostem konieczny będzie dalszy wzrost skuteczności produkcji żywności.

Jedno podejście, które usprawniło produkcję mięsa zwierzęcego, obejmuje szeroko stosowane wykorzystywanie związków chemicznych i antybiotyków w paszach zwierzęcych. Rozprzestrzenianie się zakażeń na dużą skalę jest bardzo szybkie w fermach przy zatłoczonych warunkach produkcji. Szeroko rozpowszechnione choroby kontroluje się przez profilaktyczne i terapeutyczne stosowanie tych substancji. Na przykład, częstą praktyką jest włączanie związków chemicznych do pasz dla zwierząt aby kontrolować zakażenia kokcydiami (np. salinomycyna, monensyna, roksarson (3-nitron), halchinol, karbadox i olakwindox) jak i antybiotyki przeciw mikroorganizmom (np. bacytracyna, wirginiamycyna, tylozyna, tetracyklina, chlorotetracyklina, penicylina, oleandomycyna, nowobiocyna, linkomycyna, bambermycyny, apramycyna, spiramycyna, erytromycyna, neomycyna i inne). Dobrze wiadomo, że taka praktyka promuje wzrost i poprawia konwersję paszy.

Wzrost oporności przeciw wielu antybiotykom wśród patogenów ludzkich takich jak Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenza, Neisseria gonorrheaae i Mycobacterium tuberculosis spowodowało obawę, że oporność na antybiotyki rozwinięta przez mikroorganizmy związane ze zwierzętami gospodarskimi mogłaby przenieść się do ludzkich patogenów przez przenoszone czynniki lekooporności. Są dowody, że zwierzęta karmione antybiotykami są źródłem bakterii z transferowalnymi czynnikami oporności (Hooge, Feedstuffs 71(20):59, 1999). Choć antybiotyki stosowane u zwierząt i ludzi są różne, istnieją podobieństwa mechanizmów, które mogłyby powodować oporność krzyżową. W pewnym przypadku flawochinony są dopuszczone do kontroli zakażeń E. coli (kolibakcyloza) u niektórych zwierząt i są także stosowane w lekach dla ludzi (Hooge). Niedawno FDA/CVM zaproponowało wycofanie zezwolenia na stosowanie fluorochinolonu enrofloksacyny u drobiu ze wzglę du na rozwój Campylobacter opornego na fluorochinolon i przeniesienie go do ludzi (Murhead, S. Feedstuffs 72(45):1-4, 2000).

Istnieją też obawy wśród przemysłu produkującego mięso, że utrata wydajności i możliwe wznowienie chorób zwierząt mogłoby wystąpić, jeśli będzie zakazane stosowanie antybiotyków i związków dział ają cych przeciw mikroorganizmom. Na przykł ad, Szwecja w 1986 r. zakazał a stosowania antybiotyków w paszy i zachorowalność zwierząt wzrosła. Towarzyszyło temu zwiększone stosowanie antybiotyków terapeutycznych, które spowodowało ogólny wzrost stosowania antybiotyków i zwię kszył o koszt produkcji mię sa zwierzę cego (Smith, Feedstuffs 1(13):1, 1999). W grudniu 1998 Rada Ministrów EU zdecydowała o zawieszeniu stosowania sześciu związków przeciw mikroorganizmom, które miały formalne zezwolenie jako nie wymagające recept w promotorach wzrostu w paszy (Official Journal of the European Communities 29.12.98, Regulacja Rady Nr 2821/98 dotycząca Dyrektywy 70/524). Dwa dodatki oparte na chinoksalinie były też zakazane w sierpniu 1999 ze względu na obawę wystąpienia jej pozostałości w mięsie. Efektem tych działań jest zwiększona częstość stanów uprzednio suprymowanych obejmując nekrotyczne zapalenie jelit u brojlerów, zapalenie jelit powodowane przez Clostridium perfringens u świń odstawionych od piersi, dyzenteria i biegunka powodowana przez krętki u świń i biegunka związana z E. coli (Miller, United States Animal Health Association, 1999, Proceedings: „Antibiotic Usages in Food Animal Production and Resistance-European Perspective”).

Rocznie notuje się 30000 zgonów ludzi spowodowanych przez zakażenia szpitalne wywołane przez oporne patogeny ale o wiele mniej notuje się zgonów powodowanych przez patogeny zawarte w ż ywnoś ci. Ż aden ze zgonów powodowanych przez patogeny z pokarmu nie był łączony z opornością na antybiotyk (Smith, powyżej). Tak więc nie jest jasne czy stosowanie antybiotyków przez przemysły produkujące żywność miało udział w problemie patogenów opornych na leki zakażeń szpitalnych u ludzi. Innym problemem jest brak nowych antybiotyków do leczenia zakażeń opornymi

PL 203 054 B1 patogenami (Henry, C.M., Chemical and Engineering News, 6 marca 2000, str.41-58). Może to oznaczać, że gdy rozwijają się znaczące patogeny oporne na antybiotyk może nie być już nowych antybiotyków do zwalczenia zakażenia. Wydaje się, że trudności przy opracowywaniu antybiotyków, wielkość rynku i zagadnienie zawiłych przepisów spowodowały, że wielkie firmy farmaceutyczne skupiły swoje prace nad badaniami i wdrożeniami odległymi od opracowywania antybiotyków, szczególnie tych do stosowania u zwierząt. Nowe proponowane przepisy rejestracji leku do stosowania u zwierząt są tak trudne, że powodują hamowanie rozwoju (Smith). Istnieje jednak kilka małych firm biorących udział w opracowywaniu nowych antybiotyków (Henry).

W niektórych populacjach zwierząt zakażenie już jest pandemiczne. Na przykład kokcydioza ptaków jest chorobą, która jest tylko ograniczana ale nie jest tak naprawdę kontrolowana. Zasadniczo wszystkie stada są zakażone i substancje chemiczne przeciw kokcydiozie są często rotowane w paszy, aby kontrolować szkody i ograniczać rozwój opornych szczepów. Kokcydioza kosztuje producentów drobiu 350 milionów dolarów rocznie w stratach i wydatkach na leki antybiotykowe takie jak salinomycyna (Suszkiw, USDA Agricultural Research Service News, 28.10.1997). Szacowano, że do 1999 w Stanach Zjednoczonych bę dzie wydawane rocznie okoł o 114 min USD na kocydiostatyki (Frost i Sullivan, U.S. Pharmaceutical Products for Food Animals, Raport 5245-54, 1995).

Istnieje ewidentna potrzeba znalezienia nowych i bardziej skutecznych sposobów kontroli zakażeń w przewodzie pokarmowym zwierząt hodowlanych z zastosowaniem praktyk hodowli intensywnej. Ta potrzeba jest oparta na wymogu uzyskania lepszej efektywności produkcji aby nadążać za szybko rosnącą populacją na świecie. Polepszona kontrola zakażeń przewodu pokarmowego gwarantuje szybsze tempo wzrostu i ulepszoną wydajność paszy. Istnieje też potrzeba alternatywy dla stosowania antybiotyków w produkcji zwierzęcej aby odpowiedzieć na obawy dotyczące możliwego rozwoju oporności na antybiotyki u patogenów ludzkich.

Nie ma zagrożenia stymulacji ewolucji opornych patogennych mikroorganizmów, które stanowią problem dla zdrowia ludzkiego gdy stosuje się terapię opartą na enzymach, która działa inaczej niż wszystkie antybiotyki. Ponieważ enzymy są białkami, to nie ma opcji żeby niebezpieczne reszty chemiczne były włączane do produktów mięsnych, jak zdarza się z niektórymi antybiotykami i substancjami chemicznymi działającymi przeciw kokcydiozie (American Feed Control Officials Inc., Official Publication, 1999, „Drugs and Feed Additives, Section 30.0 Enzymes” str. 206-217, ISBN 1-878341-10-3).

Przedmiotem wynalazku jest kompozycja zawierająca enzym, wybrany spośród fosfolipazy C specyficznej dla fosfatydyloinozytolu i fosfolipazy D specyficznej dla fosfatydyloinozytolu i dopuszczalny fizjologicznie nośnik dla tego enzymu, w odpowiedniej postaci do podawania kompozycji doustnie.

Kompozycję stanowi pasza a enzym stanowi jedyny czynnik przeciw zakażeniom. Enzym stanowi fosfolipaza C specyficzna dla fosfatydyloinozytolu lub fosfolipaza D specyficzna dla fosfatydyloinozytolu.

Kompozycja zawiera ponadto stabilizator, nośnik węglowodanowy lub środek konserwujący, przy czym stabilizator jest buforem, węglowodanem lub glikolem a nośnik węglowodanowy jest wybrany z grupy złożonej z ksylozy, fruktozy, glukozy, sorbitolu i maltotriozy, przy czym ten nośnik jest pokarmem, do którego dodany jest enzym, natomiast środek konserwujący jest wybrany z grupy złożonej z propyloparabenu, sorbatu sodu, sorbatu potasu i askorbinianu palmitylu. Pokarm jest karmą dla zwierząt złożoną z materiału ziarna, źródła białka, witamin, aminokwasów i minerałów, w którym materiał ziarna stanowi kukurydza, sorgo, pszenica, jęczmień lub owies a źródło białka stanowi fasola lub groch.

Kompozycja według wynalazku korzystnie jest w formie stałej lub płynnej a enzym jest zawarty w tabletce lub otoczce z ż elatyny i jest przygotowany ze szczepu Bacillus cereus, w szczególnoś ci ATCC 7004 lub ATCC 6464. Enzym jest uzyskany przez ekspresję zrekombinowanego DNA w organizmie gospodarza.

Organizm gospodarza korzystnie stanowi szczep Bacillus megaterium, gdzie enzym jest obecny w iloś ci 200 IU/kg - 4000 IU/kg karmy.

Przedmiotem wynalazku jest także zastosowanie enzymu wybranego spośród fosfolipazy C specyficznej dla fosfatydyloinozytolu i fosfolipazy D specyficznej dla fosfatydyloinozytolu do wytwarzania formy dawki doustnej leku do leczenia lub redukcji ryzyka infekcji przewodu pokarmowego.

Zastosowany enzym stanowi jedyny podawany czynnik przeciw zakażeniom powodowanym przez patogen będący pierwotniakiem, bakterią, drożdżami, wirusem lub grzybem a w szczególności przez patogen będący pierwotniakiem z rodzaju Eimeria lub Cryptosporidium lub z rodzaju Clostridium. Enzym uzyskiwany jest ze szczepu Bacillus cereus, szczepu ATCC 7004 lub ATCC 6464 poprzez ekspresję zrekombinowanego DNA w organizmie gospodarza takiego jak szczep Bacillus megaterium.

PL 203 054 B1

Korzystnie fosfolipazę stanowi fosfolipaza C specyficzna dla fosfatydyloinozytolu lub fosfolipaza D specyficzna dla fosfatydyloinozytolu.

Przedmiotem wynalazku jest też inna kompozycja zawierająca endo-1,4-e-D-mannanazę i dopuszczalny fizjologicznie nośnik dla tego enzymu, charakteryzująca się tym, że kompozycja ma odpowiednią postać do podawania doustnie i kompozycja zawiera enzym, który stanowi jedyny czynnik przeciw zakażeniom a enzym jest w ilości skutecznej do leczenia lub obniżenia ryzyka infekcji przewodu pokarmowego. Nośnik stanowi pożywienie, do którego dodany jest enzym. Pokarm jest karmą dla zwierząt złożoną z materiału ziarna, źródła białka, witamin, aminokwasów i minerałów. Materiał ziarna stanowi kukurydza, sorgo, pszenica, jęczmień lub owies a źródłem białka jest fasola lub groch.

Kompozycja według wynalazku jest w formie stałej lub płynnej a enzym jest zawarty w tabletce lub w otoczce z żelatyny.

Endo-1,4-e-D-mannanaza produkowana przez Bacillus lentus określany jako ATCC 55045.

Kompozycja zawiera także stabilizator, nośnik węglowodanowy lub środek konserwujący, przy czym stabilizator jest buforem, węglowodanem lub glikolem a nośnik węglowodanowy jest wybrany z grupy złożonej z ksylozy, fruktozy, glukozy, sorbitolu i maltotriozy, natomiast środek konserwujący jest wybrany z grupy złożonej z propyloparabenu, sorbatu sodu, sorbatu potasu i askorbinianu palmitylu.

Zastosowanie enzymu endo-1,4-e-D-mannanazy jako jedynego czynnika przeciw zakażeniom, do wytwarzania formy doustnej dawki leku do leczenia lub obniżenia ryzyka infekcji przewodu pokarmowego jest jeszcze jednym z przedmiotów wynalazku.

Enzym ma zastosowanie w przypadku zakażenia, które jest powodowane przez patogen będący pierwotniakiem, bakterią, drożdżami, wirusem lub grzybem, gdzie patogen będący pierwotniakiem pochodzi z rodzaju Eimeria lub z rodzaju Cryptosporidium a patogen bakteryjny pochodzi z rodzaju Clostridium.

Enzym jest wytwarzany przez szczep Bacillus lentus, przy czym enzym jest uzyskany przez ekspresję zrekombinowanego DNA w organizmie gospodarza, którym jest szczep Bacillus megaterium. Endo-1,4-e-D-mannanaza wytwarzana przez szczep Bacillus lentus oznaczony jako ATCC 55045.

Celem wynalazku jest dostarczenie terapii enzymatycznej dla zmniejszenia efektu zakażeń przewodu pokarmowego. Innym celem tego wynalazku jest dostarczenie mechanizmu zmniejszenia efektu zakażeń przewodu pokarmowego przez interferencję z wiązaniem patogenów do komórek przewodu pokarmowego.

Jeszcze innym celem tego wynalazku jest nowe podejście do zwiększenia przyrostu wagi i konwersji paszy względem zwierząt, które są zakażone patogenami, które powodują zakażenia lub nekrotyczne zapalenie jelit.

Kolejnym celem tego wynalazku jest dostarczenie formy dawki odpowiedniej do podawania doustnie, która jest skuteczna w poprawianiu stanu zdrowia osobnika zakażonego lub zagrożonego zakażeniem przez patogenny mikroorganizm.

W uzyskiwaniu tych i innych celów zgodnie z jednym aspektem tego wynalazku jest dostarczona kompozycja zawierająca enzym, który rozcina wiązanie powodując uwolnienie z powierzchni komórki białka lub węglowodanu, enzym nie jest endo-1,4-e-D-mannanazą i fizjologicznie dopuszczalny nośnik dla enzymu, gdzie kompozycja jest w formie odpowiedniej do podawania doustnie i nie zawiera czynnika przeciw zakażeniom innego niż enzym. W jednym wykonaniu ten enzym przecina wiązanie, co powoduje uwolnienie białka z powierzchni komórki.

W korzystnym wykonaniu enzym włączony do kompozycji jest sfingomielinazą lub fosfolipazą, szczególnie fosfolipaza typu C lub typu D. W innym korzystnym wykonaniu enzym jest wybrany z grupy złożonej z esteraz, cerebrozydaz i karbohydraz, które przecinają wiązanie, co powoduje uwolnienie białka lub węglowodanu z powierzchni komórki. W innym wykonaniu enzym jest przygotowany ze szczepu Bacillus cereus, korzystnie ATCC 7004 lub ATCC 6464. Alternatywnie enzym jest uzyskany przez ekspresję zrekombinowanego DNA kodującego enzym w Bacillus megaterium. W innym wykonaniu enzym jest zawarty w kapsułce z żelatyny i jest obecny w kompozycji jako 200 IU/kg - 4000 IU/kg paszy.

Zgodnie z innym aspektem wynalazku dostarczona jest kompozycja zawierająca wymienione składniki (i) i (ii), charakteryzująca się tym, że dopuszczalny fizjologicznie nośnik jest pokarmem, do którego jest włączony enzym. Tak więc kompozycja może być paszą zwierzęcą, która nie zawiera innego czynnika przeciw zakażeniom poza enzymem. Kompozycja paszy zwierzęcej według wynalazku dalej obejmuje materiał ziarna, taki jak kukurydza, sorgo, pszenica, jęczmień lub owies, źródło białka takie jak fasola lub groch i witaminy, aminokwasy i minerały.

PL 203 054 B1

Zgodnie z innym z aspektów wynalazek dostarcza kompozycję opisaną powyżej, która jest w formie dawki stał ej lub płynnej.

Dalej opisano zastosowanie enzymu do uzyskania dawki do leczenia lub obniżenia ryzyka zakażenia przewodu pokarmowego przez podanie doustnie osobnikowi cierpiącemu lub zagrożonemu zakażeniem skutecznej ilości enzymu, który przecina wiązanie, co powoduje uwolnienie białka lub węglowodanu z powierzchni komórki, przy czym enzym ten nie jest endo-1,4-e-D-mannanazą. Dodatkowo podawanie nie obejmuje podania czynnika przeciw zakażeniom innego niż sam enzym. Zakażenie może być powodowane przez patogen będący pierwotniakiem takim jak Eimeria i Cryptosporidium, bakterią taką jak Clostridium, grzybem lub drożdżami.

Ponadto ujawniona jest kompozycja zawierająca enzym, który przecina wiązanie, które powoduje uwolnienie białka lub węglowodanu z powierzchni komórkowej i fizjologicznie dopuszczalny nośnik dla enzymu, a kompozycja jest w formie odpowiedniej do podawania doustnego i nie zawiera czynnika przeciw zakażeniom innego niż sam enzym.

Szczegółowy opis i specyficzne przykłady wskazują korzystne wykonania i są podane wyłącznie jako ilustracja ponieważ różne zmiany i modyfikacje w obrębie istoty i zakresu wynalazku są ewidentne dla specjalistów i pożyteczne dla osób dobrze znających uprzedni stan wiedzy.

Figura 1 przedstawia aktywność przeciw kryptosporidiom zrekombinowanego enzymu PI-PLC wyprodukowanego przez szczep Bacillus megaterium.

Wykryto, że enzymy pewnej klasy, charakteryzowane przez zdolność cięcia wiązania, co powoduje uwolnienie białka lub węglowodanu z powierzchni komórki wykazują znaczącą aktywność antybiotyku, po podaniu doustnym, skuteczną, na przykład, w leczeniu zakażeń przewodu pokarmowego. Klasa enzymów obejmuje, ale nie jest ograniczona do sfingomielinazy i fosfolipazy typu C i D i enzymy o podobnej specyficzności cięcia. Przykładowe dla tej klasy są więc enzymy, które tną i uwalniają glikoproteiny lub węglowodany, które są zakotwiczone w błonie poprzez połączenie z fosfatydyloinozytolem. Tak więc enzym fosfolipaza C specyficzna dla fosfatydyloinozytolu (E.C. 3.1.4.10) znana też w skrócie jako PI-PLC lub 1-fosfatydyloinozytolo fosfodiesteraza jest członkiem tej klasy. Innym przykładem jest fosfolipaza D specyficzna w stosunku do glikozylofosfatydyloinozytolu lub GPI-PLD. Low i Prasad, Proc. Natl. Acad. Sci. 85:980-984, 1988.

Enzymy GPI-PLD i PI-PLC były opisane ze źródeł eukariotycznych. (Low, „Degradation of glycosylphosphatidylinositol anchors by specific phospholipases” rozdział 2, str. 35-63, w Molecular and Cell Biology of Membrane Proteins: Glycolipid anchors of cell-surface proteins, A.J. Turner (red.), Ellis Horwood, New York, 1990; Low i Prasad, Proc. Natl. Acad. Sci. 85:980-984, 1988; Essen i wsp., Nature 380:595-602, 1996; i Essen i wsp., Biochemistry 36:2753-27 62, 1997. PI-PLC była opisana ze źródeł prokariotycznych, w tym zewnątrzkomórkowa produkcja dokonana przez bakterie. Wśród znanych bakteryjnych źródeł PI-PLC są Bacillus cereus (Stein i Logan, J. Bacteriol. 85:369-381, 1963; Stein i Logan, J. Bacteriol. 90:69-81, 1965; Ikezawa i wsp. Biochimica et Biophysica Acta 450:154-164, 1976; Griffith i wsp., Methods in Enzymology 197:493-502, 1991; Volwerk i wsp., J. Cell Biochem. 39:315-325, 1989; i Kuppe i wsp., J. Bacteriol. 171:6077-6083, 1989), Bacillus thuringiensis (Ikezawa i Taguchi, Methods in Enzymology 71:731-741, 1981; japoński dokument patentowy JP 55034039), Staphylococcus aureus (Low i Finean, Biochem. J. 162:235-240, 1977) i Clostridium novyi (Tagucji i Ikezawa, Arch. Biochem. Biophys. 186:196-201, 1978).

Opracowano ulepszone techniki oznaczania enzymu PI-PLC w oparciu o substrat fluorescencyjny (Hendrickson i wsp., Biochemistry 31:12169-12172, 1992; Hendrickson, Anal. Biochem. 219:1-8, 1994; Hendrickson i wsp., Bioorg. Med. Chem. Letters 1:619-622, 1991).

Bez stosowania się definitywnie do jakiejkolwiek teorii obecni wynalazcy podkreślają, że enzym PI-PLC ma zdolność do cięcia fosfatydyloinozytolowych kotwic białek błony powierzchniowej i innych glikozylofosfatydyloinozytoli (Low, powyżej; Low i Saltiel, Science 239:268-275, 1988. Na przykład, wariantowe glikoproteiny powierzchniowe i inne białka powierzchniowe i węglowodany kilku pasożytniczych pierwotniaków są zakotwiczone przez glikozylo fosfatydyloinozytolowe lipidy (kotwice GPI) i są wrażliwe na trawienie PI-PLC i uwalnianie. Przykładowe gatunki należą do rodzajów Schisostoma, Toxoplasma, Plasmodium, Trypanosoma i Leishmania (Low, powyżej) jak i Eimeria, Babesia, Theileria, Giardia, Leptomonas i Entameba (McConville i Ferguson, Biochemical J. 294:305-324, 1993; Pearce i Sher, J. Immunol. 142:979-988. 1989; Sauma i wsp. Mol. Med. Biochem. Parasitol. 46:73-80, 1991; Hawn i Strand, Mol. Med. Biochem. Parasitol. 59:73-82, 1993).

Ten mechanizm kotwiczący dla składników powierzchni komórki wydaje się być uniwersalny dla komórek eukariotycznych, od drożdży do ssaków. Obecność kotwic GPI u Giardia lamblia, uważanej

PL 203 054 B1 za bardzo prymitywnego eukarionta, sugeruje, że ten rodzaj kotwicy rozwinął się wcześnie u eukariontów. Z tym rozumieniem zgodne jest odkrycie u archeobakterii nowego fosfoglicerolipidu GlcNa1-6-mio-inozytolo-P-dialkiloglicerolu (Nishikara i wsp. J. Biol. Chem. 267:12432-12435, 1992), który jest podstawą bardziej złożonych eukariotycznych struktur GPI, które wyewoluowały. U protozoa system kotwiczący GPI jest stosowany w większym stopniu niż u wyższych eukariontów, i są dowody, że struktury zakotwiczone GPI są ważne dla przeżycia pasożytów u gospodarzy owadów i ssaków (McConville i Ferguson). Na przykład, częste zrzucanie wariantowych glikoprotein powierzchniowych może być mechanizmem unikania ataku przez układ odpornościowy.

Pierwotniak Eimeria tenella zawiera struktury zakotwiczone fosfatydyloinozytolem podobne do glikoproteiny/glikolipidu Trypanosoma brucei. Uważa się, że są one ważne dla przyłączania do błony i nastę pnie dla zakaż enia (Gurnett i wsp. Mol. Med. Biochem. Parasitol. 41:177-186, 1990). Struktury Eimeria są cięte przez lipazę trypanosoma i PI-PLC Bacillus thuringensis (Burnett). Traktowanie pasożytów in vivo PI-PLC, jeśli okaże się możliwe, by prawdopodobnie pomogło układowi odpornościowemu gospodarza i by interferowało z przyłączeniem i zakażeniem przez patogeny wchodzące do przewodu pokarmowego. Gatunki Eimeria są szeroko rozpowszechnionym i kosztownym problemem dla przemysłu drobiarskiego. Inny pasożyt, pierwotniak Cryptosporidium parvum jest szeroko rozpowszechniony i powoduje ostrą chorobę biegunkową u ludzi i wielu zwierząt. Przewiduje się, że białko sporozoitu GP15/45/60 jest białkiem związanym z GPI na podstawie sekwencji DNA i monoklonalne przeciwciała reagujące na to białko sporozoitu hamują zakażenie (Strong W.B. i wsp., Infection and Immunity, 68:4117-4134, 2000; Cevallos, A.M. i wsp. Infection and Immunity 68:4108-4116, 2000). Tak więc C. parvum jest jeszcze jednym patogenem do ewentualnego leczenia PI-PLC.

Prokariotyczne bakterie nie zawierają glikoprotein i węglowodanów zakotwiczonych przez fosfatydyloinozytol (Mconville i Ferguson) ale PI-PLC by mogło nadal zmniejszać zakażenia przez bakterie przez interferencję w procesie przyłączania. Patogenna E. coli i szereg innych dobrze znanych patogennych Enterobacteriaceae wyrażają bakteryjną adhezynę FimH, 29 kD lektynę wiążącą mannozę prezentowaną na dystalnym końcu fimbrii (Abraham i wsp., Nature 336:682-684, 1988). Wykazano, że ta adhezyna wiąże się do CD48 komórek tucznych, cząsteczki zakotwiczonej GPI (Malaviya i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:8110-8115, 1999). Trawienie in vitro PI-PLC zmniejszało wiązanie zmutowanego zakotwiczonej GPI receptora toksyny dyfterytu (z Corynebacterium diptheriae) na komórkach mysich NIH3T3 (Lanzrein i wsp., EMBO J. 15:725-734, 1996). Dodatkowo toksyna alfa Clostridium septicum i akrolizyna Aeromonas hydrophila są przyłączone obie do powierzchni komórki za pomocą C-końcowej kotwicy GPI i mogą być usunięte z powierzchni komórki przez traktowanie PI-PLC (Gordon i wsp., J. Biol. Chem. 272:27274-27280, 1999).

Mechanizm zmniejszania przez PI-PLC efektu zakażenia przez bakterie dotyczy uwalniania miejsca wiązania CD48 z komórek tucznych. Także wiązanie FimH do komórek tucznych wywołuje reakcję zapalną. Tak więc zgodnie z tym wynalazkiem zmniejszanie ilości miejsc wiążących powinno też zmniejszać zapalenie, które mogłoby się stawać nadmierne i szkodliwe dla zdrowia jelita, jako że odpowiedź zapalna obejmuje uwalnianie czynnika martwicy guzów α (Malaviya). Tak więc przez ten mechanizm zmniejszania zapalenia i podstawowy mechanizm wydzielania czynnika martwicy guzów, traktowanie fosfolipaza, według wynalazku, mogłoby łagodzić objawy charakteryzujące stany takie jak stan jelita drażliwego, zapalenie jelita i choroba Cohna (van Deventer S.J., Ann. Rheum. Dis. 8(1):1114-1120 (listopad 1999).

Obecny wynalazek powinien być skuteczny także przeciwko zapaleniom wirusowym poprzez rozbijanie wiązań między cząsteczkami wirusa i komórkami, które ten wirus zakażałby in vivo.

W ś wietle stwierdzenia przez wynalazców skutecznoś ci podawania doustnego jest interesują ce, że wstępne traktowanie wirusa grypy fosfolipaza C, powodujące uwolnienie około 50% fosfolipidu wirusa, dało w efekcie znaczące zmniejszenie zakaźności w zarodkach kurczęcia (Mizutani i wsp., Nature 204:781-782, 1964). Przeciwnie, wstępne traktowanie hodowanych fibroblastów zarodka kurczęcia fosfolipazą C, izolowaną z Clostridium perfringens, znacząco zahamowało następne zakażenie komórek wirusem Semliki Forest (Friedman i Pastan, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 59:1371-1378, 1968). Podczas gdy stan wiedzy nie stwierdzał terapeutycznego znaczenia tych zjawisk, patrząc wstecz są one zgodne z jednym mechanizmem uważanym za podstawę obecnego wynalazku a mianowicie cięciem ligandu patogenu na powierzchni i/lub jego odpowiedniego receptora w membranie komórkowej, zaburzając interakcję, która jest potrzebna do zakażenia.

Inny sposób gdzie obecny wynalazek może być skuteczny w zapobieganiu zakażeniu wywołanym przez wirus jest sposób przez znoszenie wiązania wirusowych białek zakotwiczonych GPI do

PL 203 054 B1 wrażliwych komórek. Przykładem białka wirusa zakotwiczonego GPI, które jest wrażliwe na trawienie PI-PLC jest wirus dengi NS1 (niestrukturalne białko 1) (Jacobs i wsp., FASEB J. 14:1603-1610, 2000). Jest kilka przykładów białek zakotwiczonych GPI gospodarza, które są miejscami wiązania dla wirusów. Te przykłady obejmują ludzkie echowirusy 6, 7, 12 i 21 i enterowirus 70, które wiążą zakotwiczone GPI CD55 (czynnik przyspieszający rozkład, delay-accelerating factor DAF) (Clarkson i wsp., J. Virology 69:5497-5501, 1995; Bergelson i wsp. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:6245-6248, 1994; i Karnauchow i wsp., J. Virology 70:5143-5152, 1996). Zakażenie parwowirusem psa (CPV) moż e być blokowane in vitro przez wstępne traktowanie komórek kota PI-PLC (Barbis i Parrish, Brazilian J. Med. Biol. Res. 27:401-407, 1994).

Niektóre receptory powierzchni komórki o przypuszczalnym znaczeniu dla inicjowania zakażeń są przyłączone do membran za pomocą innych mechanizmów niż kotwice GPI. Obejmują one struktury takie jak estry cholesterolu (Rostand i Esko, J. Biol. Chem. 268:24053-24059, 1993), niefosforylowane glikosfingolipidy (Karlsson, Ann. Rev. Biochem. 58:309-350, 1989) i inne fosfolipidy takie jak fosfatydyloetanoloamina i fosfatydyloseryna (Sylvester, Infect. Immun. 64:4060-4066, 1996).

Tak więc z podanych powyżej przyczyn adresowanie takich struktur odpowiednimi esterazami, cerebrozydazami, karbohydrazami i fosfolipazami aktywnymi aby uwalniać te struktury z powierzchni komórek powinno mieć korzystne efekty, po podaniu doustnym zgodnie z wynalazkiem aby leczyć zakażenia przewodu pokarmowego.

Ze względu na uniwersalną naturę białek i węglowodanów powierzchniowych wiązanych fosfatydyloinozytolem u eukariontów, metodologia terapeutyczna wynalazku obejmująca podanie enzymu, ostro lub profilaktycznie aby przeciąć zakotwiczające wiązanie dla takich białek i/lub węglowodanów błon komórkowych znajdzie szerokie zastosowanie w kontroli zakażeń przewodu pokarmowego wywołanych pierwotniakami, bakteriami, grzybami i wirusami. W tym celu kluczowym aspektem wynalazku jest wykazanie, że enzym, który nie tylko jest czynny w cięciu składników powierzchni komórek może być podany doustnie jako czynnik działający przeciw zakażeniu i być skuteczny in vivo. W szczególności, skoro odpowiedni reprezentatywny enzym PI-PLC jest dostępny od lat 1960-tych, to podejście nie było uprzednio sugerowane.

Innym aspektem obecnego wynalazku jest zastosowanie opisanego enzymu jako skutecznego czynnika przeciw zakażeniu w preparatach paszy dla zwierząt. Preparaty paszy, które zawierają endo-1,4-β-D-mannanazę są znane i niektóre doniesienia proponowały dla mannanazy aktywność przeciw grzybom (WO 00/21381 (PCT/EP99/07835) i Kudo i wsp., Experientia 48:227-282, 1992). W tych przypadkach mannanaza jest łączona z rozpoznawanym antybiotykiem, choć prospekt stosowania enzymu w paszy wolnej od antybiotyków był ogólnie dyskutowany (Adams, Feed Mix (Special 2000), 16-18).

Tak więc w jednym aspekcie obecny wynalazek dotyczy kompozycji, w tym kompozycji paszowych, które zawierają enzym, charakteryzowany przez powyższą aktywność tnącą, którym nie jest mannanaza lub bardziej szczegółowo nie jest endo-1,4-e-D-mannanaza w odróżnieniu na przykład od enzymu skierowanego na mannan, o innej specyficzności cięcia, jak opisano w Enzyme nomenclature 1992 (Academic Press) (wpisy 3.2.1.77, 3.2.1.78, 3.2.1.101, 3.2.1.106, 3.2.1.130 i 3.2.1.137). Dalej rozważa się kompozycję, która zawiera taki enzym, w tym mannanazę, ale który nie zawiera innego czynnika przeciw zakażeniom.

Tak więc zgodnie z obecnym wynalazkiem, preparat enzymów zewnątrzkomórkowych uzyskany z Bacillus cereus i standaryzowany pod kątem zawartości PI-PLC może być stosowany do uzyskania bardzo znacznej poprawy w przyroście wagi i konwersji paszy w obecności zakażenia. Ten wynik jest nieoczekiwany, jako że B. cereus jest oportunistycznym patogenem, który powszechnie powoduje wywołane przez pokarm zapalenie jelit i wewnętrzne zapalenie oka spowodowane przez B. cereus.

Wczesne badania doniosły, że wstrzyknięcie zewnątrzkomórkowego enzymu B. anthracis lub B. cereus do królików powoduje fosfazemię a nawet śmierć (na przykład Stein i Logan, J. Bacteriol. 85:369381, 1963). Jest zadziwiające więc, że enzym zewnątrzkomórkowy z patogenu, który powoduje zapalenie jelit, miałby uboczny efekt leczniczy, według tego wynalazku, w stosunku do choroby powodowanej przez zakażenie bakteryjne.

Bacillus cereus produkuje szereg zewnątrzkomórkowych enzymów aktywnych w stosunku do błony i toksyn cytolitycznych, w tym PI-PLC i cereolizynę AB, złożoną z fosfolipazy C i sfingomielinazy (Gilmore, J. Bacteriol. 171:744-753, 1989). W wymienionym preparacie enzymu uważa się, że składnikiem czynnym jest zewnątrzkomórkowa fosfolipaza C specyficzna dla fosfatydyloinozytolu (E.C. 3.1.4.10) produkowana przez B. cereus. Traktowanie enzymem według wynalazku działało skutecznie jako kokcydiostatyk

PL 203 054 B1 i antybiotyk. Tak więc jest skutecznym i żywotnym przemysłowo podejściem do leczenia zakażeń przewodu pokarmowego szczególnie zważywszy, że obecnie stosowane substancje są zakazane.

Enzymy jeśli nie są powlekane są podatne na nieodwracalną inaktywację przez płyny żołądkowe. Patent US 4,079,125 opisuje polepszone powlekane enzymatyczne kompozycje jelitowe do podawania ssakom pozbawionym enzymów.

Zadziwiająco dodanie PI-PLC do paszy zwierzęcej bez powlekania powoduje skuteczną terapię patogennych zakażeń.

Kompozycje enzymatyczne według wynalazku są korzystnie formułowane jako suszone, stałe lub płynne kompozycje doustne. Takie kompozycje będą obejmowały stabilizatory, takie jak bufor, węglowodan i/lub glikol. Suszone, stabilne przy przechowywaniu formuły enzymów, które są odpowiednie według wynalazku do włączania do tabletek lub kapsułek, na przykład mogą być przygotowane przez liofilizację, suszenie rozpyłowe w suszarce fluidalnej z nośnikiem biernym lub węglowodanowym lub przez stosowanie technik parowania w połączeniem ze stabilizatorami tworzącymi szkło (Franks i wsp.Biopharm.4:38-55,1991). Inne podejście obejmuje strącanie solą, na przykład strącanie siarczanem amonu lub rozpuszczalnikiem, jak acetonem do tworzenia proszku, po czym następuje suszenie i mieszanie z nośnikiem.

Niektóre węglowodany, szczególnie monosacharydy, disacharydy i niższe oligosacharydy są ważnymi węglowodanami tworzącymi szkło. Przykładowymi węglowodanami do stosowania jako nośniki są ksyloza, fruktoza, glukoza, sorbitol i maltotrioza, między innymi, jak opisał Franks. Wybór nośnika węglowodanowego jest oparty na kompatybilności z enzymem, niską skłonnością hydroskopową i korzystną krzywą zeszklenia. Stabilizator trehaloza jest szczególnie odpowiedni do produkcji biologicznych związków stabilnych w temperaturze otoczenia (patent US 4,891,319; Roser, Biopharm. 4(8)47-53, 1991; Colaco i wsp., BioTechnology 10:1007-1011, 1992; Aldridge, Genetic Engineering News, 15 marzec 1995, 10-11).

Enzymy dla obecnego wynalazku mogą być formułowane jako płyny, na przykład z sorbitolem lub z glicerolem, by zmniejszyć aktywność wody i stabilizować białko. Takie roztwory są typowo sterylnie sączone przed ich zastosowaniem farmaceutycznym.

Jak zanotowano uprzednio, obecny wynalazek dotyczy, w jednym aspekcie, dostarczania enzymu jako komponentu paszy lub pokarmu. Pasze są głównie złożone z ziarna, źródła białka, witamin, aminokwasów i minerałów. Ziarno typowo obejmuje kukurydzę, sorgo, pszenicę, jęczmień lub owies. Źródłem białka mogą być na przykład fasola lub groch. Przykładowe minerały, aminokwasy i witaminy obejmują B12, kwas pantotenowy, niacynę, ryboflawinę, K, DL-metioninę, L-lizynę, chlorek choliny, kwas foliowy, fosforan dwuwapniowy, siarczan magnezu, siarczan potasu, węglan wapnia, chlorek sodu, selenin sodu, tlenek manganawy, jodan wapna, tlenek miedzi, tlenek cynku i D-aktywowany sterol zwierzęcy.

Do stosowania w paszach formuła płynna enzymu może być przygotowana ze słoną wodą (np. NaCl, 15-18% waga/waga) lub syropem aby obniżyć aktywność wody i zapobiec wzrostowi mikroorganizmów w stężonym produkcie. Inne konserwanty do paszy takie jak benzoesan sodowy, propyloparaben, sorbat sodu lub potasu i palmitynian askorbylu są przykładami dopuszczonych chemicznych konserwantów, które mogą być też stosowane do zapobiegania potencjalnemu zepsuciu przez wzrost mikroorganizmów w produkcie (Association of American Feed Control Officials, Inc., Official publication 2000, część 18 „Chemical Preservatives” str. 215-217, ISBN 1-878341-11-1). Te konserwanty mogą być stosowane do pasz przez następcze granulowanie z dużym rozcieńczeniem przez zautomatyzowaną technologię rozpylania (Fodge i wsp., Feedstuffs, 29 września, 1997). Takie płynne preparaty mogą zawierać stabilizujące węglowodany takie jak sorbitol lub glicerol, jeśli są one kompatybilne. Materiały, które są pożądanymi składnikami paszy takie jak inne enzymy lub witaminy, które są termolabilne mogą być włączone dla zwiększenia skuteczności.

W przypadkach gdzie pasza jest stosowana w postaci niegranulowanej papki (tzn. nie poddawana obróbce termicznej) enzymy według wynalazku mogą być dostarczone w postaci suchego koncentratu, do dodania do mieszacza paszy. Takie suche koncentraty enzymów najpierw przygotowuje się przez zatężenie płynnego preparatu enzymu stosując 10 kDA NMWC lub inny odpowiedni ultrafiltr, aby uzyskać wysoki procent zawartości enzymu a następnie przez zmieszanie z bardzo suchym nośnikiem, takim jak kaszka kukurydziana, kaszka sojowa lub nawet biernym materiałem lub nierozpuszczalną solą dopuszczalną do stosowania w paszy (Official Publication, American Feed Control Officials, część 582 „Substances generally considered as safe in animal feeds”).

PL 203 054 B1

Istnieje szereg technik dostępnych do generacji enzymów dostatecznie stabilnych aby tolerowały proces granulowania w fabrykach paszy z zachowaniem dostatecznej aktywności w niższych temperaturach by funkcjonować w przewodzie pokarmowym. Dobrze wiadomo, że modyfikacja struktury białek przede wszystkim przez zmianę kodującej sekwencji DNA lub wtórnie przez modyfikacje chemiczne, może czynić enzymy bardziej stabilnymi w stosunku do inaktywacji. Taką ilustracją pod tym względem jest stosowanie chemicznego krzyżowego łączenia kryształów enzymów (Collins i wsp. Organie Process Research and Development 2(6)400-406, 1998). Inne podejście do zwiększania stabilności enzymów dla obecnego wynalazku pociąga za sobą zmianę aminokwasów przez mutagenezę genu, który koduje enzym lub uzyskanie genów lub części genów do tasowania (Crameri i wsp., Nature 391:288-291, 1998; Arnold, Naturę Biotechnol. 16:617-618, 1998 b, Zhao i wsp. Nature Biotechnol. 16:258-235, 1998; Zhao i Arnold, Protein Eng. 12:47-53, 1999). Mutacja i selekcja pod kątem „sterowanej ewolucji” enzymów z pożądanymi właściwościami jest też możliwa, dla przykładu: Giver i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:12809-12813, 1998; Liao i wsp. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:576-580, 1986; Cherry i wsp., Nature Biotechnol. 17:379-384, 1999.

Niektóre modyfikacje białek, w tym glikozylacja, PEGylacja i sukcynylacja mogą także zwiększać stabilność i zmieniać optimum pH, cechy, które mogłyby być optymalizowane dla enzymu do stosowania w wynalazku. Tak więc znane protokoły mogłyby być stosowane do produkowania zmodyfikowanych enzymów, do testowania, według przykładów, do oceny przydatności w metodologii terapii według wynalazku.

Skuteczny sposób produkcji PI-PLC wynikał z klonowania genu B. cereus u B. megaterium. System ekspresji (Rygus i Hillen, Appl. Microbiol. Bacteriol. 35:594-599,1991) wykorzystuje elementy regulonu ksylozy Bacillus megaterium (Rygus i wsp., Arch. Microbiol. 155:535-542, 1991) i był dostępny w handlu od firmy NIO101 Corp. (Vista, Kalifornia). Stworzono fuzję między sekwencją kodującą lider genu PI-PLC z pierwszymi trzema aminokwasami genu xyl A B. megaterium, w plazmidzie stabilizowanym opornością na tetracyklinę i regulowanym przez represor odpowiadający na ksylozę. Szczepy tego typu ze zamplifikowaną ekspresją dostarczają możliwy sposób produkcji handlowo użytecznych ilości PI-PLC do włączania do paszy zwierzęcej według wynalazku.

Niektóre izolaty Bacillus cereus produkują antybiotyki takie jak tunikamycyna (Kamohashira i wsp. Agric. Biol. Chem. 52:859-861, 1988). Inny izolat Bacillus cereus (ATCC 53522) jest opisany w patentach US 4,877,738 i US 5,049,379 jako czynnik biokontroli do zapobiegania zgorzeli siewek i gnicia korzeni u roślin. Uważa się, że ten efekt jest wynikiem działania dwóch antybiotyków określanych jako „zwittermycyna” 396 daltonowy liniowy aminopoliol, i „antybiotyk B”, aminoglikozyd. W przykładach podanych szczegółowo poniżej, możliwość udziału tych dwóch antybiotyków wyeliminowano przez wykluczenie możliwych antybiotyków o niskiej masie cząsteczkowej z preparatu enzymu.

W szczególności, skoncentrowano wolny od komórek bulion fermentacyjny za pomoc ą membrany, usuwając białka o masie cząsteczkowej 10 kDA. Koncentrat zawierający białka większe od 10 kDA zastosowano do dalszej obróbki. Antybiotyki o niskiej masie cząsteczkowej tak jak opisane przez Handelsman, przechodziłyby przez ten filtr. Co więcej, stosowano strącanie siarczanem amonu aby strącić białka o wysokiej masie cząsteczkowej pozostawiając materiały o niskiej masie cząsteczkowej w roztworze. Po ponownym rozpuszczaniu preparatu strą conego siarczanem amonu powstał y roztwór enzymu dializowano wobec, jeszcze jednej procedury, która usuwa antybiotyki o niskiej masie cząsteczkowej. Na końcu białko strącono drugi raz, ponownie siarczanem amonu, aby usunąć ewentualne pozostające niskocząsteczkowe związki do roztworu.

Kombinowane stosowanie tych czterech procedur silnie przemawia przeciwko opcji, że obserwowany efekt antybiotykowy jest wynikiem działania antybiotyku o niskiej masie cząsteczkowej wyprodukowanego przez ATCC 6464 lub ATCC 7004. Badano też bulion fermentacyjny z testowym szczepem E. coli, pod kątem obecności antybiotyku ale nie wykryto żadnej aktywności antybiotyku.

Obecny wynalazek jest opisany poniżej przez odniesienie do ilustrujących przykładów.

P r z y k ł a d 1

Przygotowanie zamrożonych kultur wyjściowych Bacillus cereus ATCC 6464 i ATCC 7004.

Fiolki ze zliofilizowanymi komórkami z ATCC otwarto i zaszczepiono do podłoża do zaszczepiania złożonego z Amberferm 4015 (Red Star) 10 g/l, Amberex 695 (Red Star) 5 g/l i chlorku sodu 5 g/l pH 7,0 i hodowano w 30°C. Pierwotną kulturę rozsiano na płytkach z bulionem LB i powstałą pojedynczą kolonią zaszczepiano ponownie 20 ml podłoża do zaszczepień w 250 ml, kolba z wypukłościami (Bellco) i hodowano z wytrząsaniem w 30°C. Gdy gęstość kultury osiągnęła odczyt OD600 1,5 dodano sterylny glicerol do około 10% obj/obj i fiolki zawierające 1,8 ml hodowli zamrożono w -80°C.

PL 203 054 B1

P r z y k ł a d 2

Wzrost izolatów ATCC 6464 i ATCC 7004 Bacillus cereus dla produkcji specyficznej dla fosfatydyloinozytolu fosfolipazy C

Dwa fermentory Biostat C po 30 litrów każdy zaopatrzono w podłoże o następującym składzie w wodzie wodociągowej: Nutrient Broth No. 2 (Oxoid) 25 g/l Trypton (Difco) 10 g/l ekstrakt drożdżowy (Difco) 10 g/l, i Mazu DP10P, Mod 11 czynnik przeciw-pienny (BASF) 0,1 ml na litr. Wstępna objętość partii była 9,5 l i bulion sterylizowany w 121°C przez 40 minut. Pierwotne pH doprowadzono do 7,0 amoniakiem gazowym po sterylizacji.

Hodowle do zaszczepienia przygotowano w 500 ml tego samego podłoża w 4 l kolbie z wypukłościami do wytrząsania z połączeniem do aspiratora (Bellco) z przyłączonymi rurkami silikonowymi z połączeniami do zaszczepienia. Kolby sterylizowano w autoklawie w 121°C przez 50 minut przed zaszczepieniem 1,8 ml zamrożonej hodowli przygotowanej z przesyłki ATTC (Przykład 1). Hodowle inokulacyjne hodowano w 30°C przez 5,5 godziny z wytrząsaniem, przy 200 obr/min, w inkubatorze z kontrolowanym środowiskiem z wytrząsaniem (model NBS G-25). Przed zaszczepieniem hodowla ATCC 7004 miała OD650 1,53 i pH 6,58. Hodowla ATCC 6464 miała OD600 1,28 i pH 6,79.

Hodowle 500 ml zaszczepiano do fermentorów 30 l i hodowano w następujących warunkach: temperatura 30°C, 600 obrotów/min do mieszania, przepływ powietrza 10 litrów na minutę i ciśnienie 0,05 MPa (0,5 bara). OD600 hodowli był 0,81. Po sześciu godzinach fermentację przerywano przy końcowym OD600 22,1 (ATCC 7004) i OD600 24,2 (ATCC 6464). Fermentacje prowadzono bez kontroli pH i ostateczne pH było 8,17 (ATCC7004) i pH 8,13 (ATCC 6464). Bulion usuwano z fermentorów i schłodzono do 8°C przed dalszą obróbką.

Fermentory puszczono drugi raz stosując w zasadzie identyczną procedurę z obydwoma izolatami ATCC Bacillus cereus. W tym przypadku kultury do zaszczepienia stosowano po sześciu godzinach z OD600 2,86 (ATCC 7004) i OD600 1,98 (ATCC 6464) i pH 6,69 (ATCC7004) i pH 6,65 (ATCC 6464). Główne fermentacje prowadzono przez 6,5 godziny z końcowym OD600 35,9 (ATCC 7004) i OD600 33,6 (ATCC 6464). Końcowe pH wynosiło 8,38 (ATCC 7004) i pH 8,47 (ATCC 6464) w czasie schłodzenia.

P r z y k ł a d 3

Usunięcie komórek przez sączenie i zatężenie enzymu PI-PLC

Komórki usunięto i płukano z każdego z czterech partii fermentora opisanych w Przykładzie 2, stosując dwa filtry A/G Technology (UFP-500-K-gA) 3 mm wklęsłe włókno, odcięcie masy cząsteczkowej 500000 (500 kDA NMWC) połączone koniec z końcem. Schłodzony bulion pompowano przez filtry pompą perystaltyczną przy około 2 litrach na minutę z recyklizacją z powrotem do pojemnika. Permeat zawierający enzym zbierano w pojemniku chłodzonym w lodzie. Wstępna objętość bulionu zawierającego komórki około 9 litrów był zatężony do około 2 litrów w momencie kiedy rozpoczęto punktową diafiltrację 10 mM Tris-HCl pH 8,5. Po zebraniu łącznie około 14 litrów permeatu zakończono płukanie komórek.

Permeat 500 kDA (około 14 litrów z każdego fermentora) zatężono z dwoma filtrami A/G Technology (UFP-10-C-4XTCA)

0,5 mm wklęsłe włókno odcięcie masy cząsteczkowej 10000 (10 kDa) połączone koniec z końcem. Stosowano tę samą metodę pompowania z recyklizacją koncentratu poza tym, że odrzucono permeat. Ostateczny koncentrat z objętością około 500 ml z każdego fermentora zostawiano do następnego etapu.

P r z y k ł a d 4

Dalsze oczyszczanie i zatężanie enzymu PI-PLC

Koncentrat ultrafiltratu 10 kDA (Przykład 3) pochodzący z każdej fermentacji Bacillus cereus doprowadzono do 80% nasycenia siarczanem amonu i mieszano w lodzie przez 60 minut. Roztwór wirowano przez 15 minut przy 6000 obr/min w roztworze GSA Sorvall. Supernatant odrzucono i osad rozpuszczono w minimalnej objętości 10 mM Tris-HCl, 0,2 mM EDTA (pH 7,5) i następnie dializowano w zimnie w tym samym buforze.

Białko w każdym koncentracie mierzono stosując oznaczenie z wiązaniem barwnika (BioRad) i mierzono poziom PI-PLC (Hendrickson i wsp., Bioorg. Med. Chem. Letters 1:619-622, 1991) stosując metodą detekcji opartą na HPLC i substrat fluorescencyjny (Molecular Probes, Inc., P-3764, 1-pyrenobutylo mioinozytolo-1-fosforan, sól litowa). Tabela 1 podsumowuje dane z oznaczeń i przewiduje przybliżoną czystość enzymu w każdym z czterech preparatów. Preparaty enzymów przechowywano w formie zamrożonej w -20°C do dalszej obróbki.

PL 203 054 B1

T a b e l a 1.

Podsumowanie analizy surowego preparatu enzymów PI-PLC

Preparat enzymu	Numer szczepu ATCC	Białko mg/l	Aktywność specyficzna U/mg1	Całkowite białko w preparacie mg	Oszacowana czystość %2	Całkowite PL-PLC czyste mg
1	7004	1,86	1,75	325	2,92	9,49
2	6464	1,44	0,52	345	0,867	2,99
3	7004	1,35	4,42	208	7,36	15,3
4	6464	2,06	1,72	256	1,95	5,00

¹ U = unit = jednostka = 1 mikromol/minutę ² W oparciu o zał o ż enie, ż e 100% czyste biał ko ma aktywność specyficzną 60 U/mg (Hendrickson, powyż ej)

P r z y k ł a d 5

Łączenie i zatężanie preparatów enzymów przed zastosowaniem do paszy zwierzęcej

Preparaty enzymatyczne 1, 2, 3 i 4 połączono z całkowitą objętością 675 ml. Powoli dodano siarczan amonu (492 g) i roztwór mieszano w lodzie przez kilka minut. Roztwór wirowano żeby zebrać osad. Frakcję osadu rozpuszczono w minimalnej objętości 20 mM buforu fosforanowego (pH 7,0).

Powstały roztwór był 70,9 ml z gęstością 1,057 gram/ml. Stężenie białka zmierzono jako około 1,13 U/mg z oszacowaną czystością PI-PLC 1,88%. Roztwór zamrożono w -20°C w całości i rozmrażano i stosowano do jednorodnego traktowania 90,72 kg (200 funtów) karmy dla kurczą t.

P r z y k ł a d 6

Klonowanie i ekspresja genu PI-PLC w Bacillus megaterium

Gen kodujący fosfolipazę C specyficzną dla fosfatydyloinozytolu (PI-PLC) zsekwencjonowano (Kuppe i wsp. J. Bacteriol. 171:6077-6083, 1989). Stosując technologię PCR sklonowano gen PI-PLC z chromosomalnego DNA Bacillus cereus (ATCC 6464). Zastosowano wektor ekspresyjny pMEGA (BIO 101, Vista, CA) dla Bacillus megaterium. Zaprojektowano dwa startery, a mianowicie 5'-GATCAGT-AATAAGAAGTTAATTTTG-3' (starter 1) i 5'-CGGATCCATATTGTTGGTTATTGG-3' (starter 2) z miejscem Spel w starterze 1 i miejscem BamHI w starterze 2.

Zamplifikowany za pomocą PCR gen PI-PLC zligowano do miejsca Spel-BamHI pMEGA i otrzymano plazmid pCG682. Białko PI-PLC było w fuzji z pierwszymi trzema aminokwasami produktu genu xylA w miejscu Spel wektora ekspresyjnego. Ekspresja genu PI-PLC była pod regulacją promotora xylA. Stosowano fermentację w kolbie Erlenmayera do pożywek do oceny produkcji specyficznej dla fosfatydyloinozytolu fosfolipazy C w Bacillus megaterium. Bulion LB z 10 μΐ/ml tetracykliny (20 ml) zaszczepiono 0,2 ml kultury wyjściowej i inkubowano w wytrząsarce w 37°C przy 250 obr/min. Przy OD600 około 0,5 dodano 5 g/l D(+) ksylozy do indukcji promotora xylA. Po trzech godzinach supernatant zebrano za pomocą wirowania. Aktywność specyficznej dla fosfatydyloinozytolu fosfolipazy C mierzono za pomocą metody fluorescencyjnego substratu (Hendrickson i wsp., Biochemistry 31:12169-12172, 1992; Hendrickson, Anal. Biochem. 219:1-8.1994) stosując substrat 1-pyrenobutylo-mio-inozytolofosforanowy (Molecular Probes, Eugene, OR) i detekcję za pomocą HPLC.

T a b e l a 2. Pomiar ekspresji PI-PLC

Materiał badany	Dodatek ksylozy	Aktywność właściwa (jednostka/mg białka)
1	2	3
Frakcje lizatu komórkowego
B. megaterium/pCG682	-	0
B. megaterium/pCG682	+	0,436
B. megaterium/pCG682	-	0
B. megaterium/pCG682	+	0,365

PL 203 054 B1 cd. tabeli 2

1	2	3
Frakcje bulionu fermentacyjnego
B. megaterium/pCG682	-	0
B. megaterium/pCG682	+	4,087
B. megaterium/pCG682	-	0
B. megaterium/pCG682	+	4,56

Dane te wykazują, że większość PI-PLC jest zewnątrzkomórkowa i że ekspresja zachodzi tylko po dodaniu D(+) ksylozy (Tabela 2).

Szacuje się, że ten zrekombinowany szczep ma przynajmniej 15 razy wyższą produktywność (mg/l/OD) od przeciętnego szczepu dzikiego wyhodowanego w Przykładzie 2.

P r z y k ł a d 7

Fermentacja B. megaterium do produkcji PI-PLC

B. megaterium/pCG682 opisany w Przykładzie 6 zastosowano do produkcji PI-PLC za pomocą fermentacji. Podłoże (PM) do stadiów zaszczepienia i fermentacji zawierało 20 g/l Amberferm 4015 (Universal Flavors Bionutrients, Indianapolis, IN), 10 g/l Amberex 695 yeast extract (Universal Flavors Bionutrients, Indianapolis, IN), 10 g/l NZ Case Plus (Quest International, Hoffman Estates, IL.), 2,0 g/l K2HPO4,

0,1 g/l MgSO₄-7H₂O i 2,0 g/l glukozy na początku i 12,5 mg/l tetracykliny, pH doprowadzono do 7,5.

Stadium zaszczepiania (500 ml w 2,8 l kolbie z wypukłościami) rozpoczynano przez zaszczepienie z zamrożonej fiolki do zaszczepiania i wytrząsanie przy 250 obr/min w 30°C. Fiolki do zaszczepień przygotowano przez dodanie pojedynczej kolonii hodowanej na płytce agaru LB do 20 ml PM w 250 ml kolbie do wytrząsania. Po hodowli do około 1,0 OD600 w 30°C, dodano 50% sterylnego glicerolu, zmieszano i roztwór rozmieszczono w 2 ml sterylnych fiolkach plastykowych i zamrożono w -60°C.

500 ml kolby do zaszczepień stosowano po hodowli do około 1,2 do 1,8 OD600 nm po 9 godzinach wytrząsania. Dwie kolby użyto do zaszczepienia 60 l fermentora wypełnionego 50 l tego samego podłoża sterylizowanego parą. Tetracyklinę sączono sterylnie (0,2 mikronowy filtr) jako roztwór 1% w 40% etanolu i dodano po sterylizacji i schłodzeniu do 30°C.

W fermentorach dodano 0,1 ml/l środka przeciw pienieniu Mazu DF10PMOD11 (BASF, Gurnee, IL) we wstępnej partii i dodawano w miarę potrzeby aby kontrolować pianę w czasie fermentacji.

Warunki operacji dla pierwszego fermentora stadium zaszczepiania były następujące: ciśnienie od 3,447 kPa do 17,236 kPa (0,5 do 2,5 psig), temperatura 30°C ± 0,5°C; wytrząsanie 200 do 450 obr/min, wlot powietrza 25 do 50 SLPM, rozpuszczony tlen >25%. pH kontrolowano od 6,9 do 8,1 stosując 21,25% H3PO4 lub 5N NaOH. Gdy OD600 osiągnęło 8-10 zawartość użyto do zaszczepienia 600 l fermentora zawierającego 425 l tej samej pożywki.

Warunki operacji 600 l fermentora produkcyjnego były następujące: ciśnienie od 3,447 kPa do 17,236 kPa (0,5 do 2,5 psig), temperatura 30°C ± 0,5°C; wytrząsanie 100 do 300 obr/min, wlot powietrza 250 do 500 SLPM, rozpuszczony tlen >25%. pH kontrolowano od 6,9 do 8,1 stosując 21,25% H3PO4 lub 5N NaOH. Gdy wstępna glukoza była wyczerpana po 5 godzinach i OD600 około 17, rozpoczęto dodawanie ksylozy (sterylizowanej przez autoklawowanie w 121°C przez 20 minut i złożonej z 10 kg D-(+)ksylozy i 10 litrów wody). D-ksylozę uzyskano od Varsal Instruments, New Jersey. Podawanie rozpoczęto od 25 ml/minutę i trzymano przez 1,5 godziny a następnie zwiększano do 43 ml/minutę. Drugie tempo utrzymywano aż do zużycia 22,5 litra dodawanej ksylozy. Rozpuszczony tlen utrzymywano przez zwiększanie wlotu powietrza przez przyrosty 50 SLPM do 500 SLPM. Po osiągnięciu przepływu powietrza 500 SLPM, zwiększano obroty na minutę. Fermentację skończono po 20 godzinach. Po 17 godzinach akumulowało 7440 U/l (jednostka według definicji w Przykładzie 4).

Bulion fermentacyjny zbierano stosując Pall Filtron C10 Skid i cztery moduły CellFlo Microgon (0,2 nm pora membrany, 1 mm średnicy włókna z 3,3 m²). Permeat membrany 0,2 μm zatężono stosując LT100 Filtron Skid z membraną ultrafiltracyjną AG/Technologies Size 85 10K. Ostateczny koncentrat miał 10 litrów objętości i został zamrożony w temperaturze -20°C.

P r z y k ł a d 8

Bulion fermentacyjny Bacillus cereus nie zawiera aktywności antybiotykowej

Fermentację z Bacillus cereus (ATCC 7004) przeprowadzono według sposobu opisanego w Przykładzie 2 poza tym, że wstępną objętość zwiększono do 20 litrów. Test badania antybiotyku

PL 203 054 B1 przeprowadzono z E. coli MG1655 jako szczepem testowym z ostatecznym bulionem fermentacyjnym lub częściowo oczyszczonym PI-PLC przygotowanym według sposobu opisanego w Przykładach 3-5. Test przeprowadzono jako oznaczenie płytek cylindrycznych (Brantner, Pharmacie 52(1):34-40, 1997). Brak strefy przejaśnienia wskazującej na aktywność antybiotyków obserwowano wokół cylindrów zawierających próbki enzymów.

P r z y k ł a d 9

Oznaczenie PI-PLC z fluorescencyjnym oznaczeniem na płytkach mikrotytracyjnych

Opracowano poprawiony test biochemiczny na PI-PLC w stosunku do metody Hendricksona i wsp. (powyżej) stosowanego w Przykładzie 4. Substrat sól N-metylomorfolinowa 4-metyloumbeliferylo-mio-inozytolo-1-fosforanu uzyskano od Biosynth (Naperville, Illinois). Reakcje monitorowano w czytniku mikropłytek Fluorscan II uzyskanym od MTX Lab Systems (Vienna, Virginia). Do oznaczeń bulionu fermentacyjnego lub koncentratów enzymów przeprowadzono, w czarnych plastikowych płytkach mikrotytracyjnych, reakcje po 200 μΐ złożone z 10 mM Tris-Cl, 0,16% deoksycholan, 0,8 mM sól N-metylomorfolinowa 4-metyloumbeliferylo-mio-inozytolo-1-fosforanu i rozcieńczony enzym w pH 8,0. Jeśli jest to potrzebne rozcieńczenia enzymów przygotowuje się w 0,1% roztworze BSA w wodzie. Reakcje śledzono w 37°C przez 30 minut w odstępach co 2 minuty aby obserwować uwalnianie metyloumbeliferonu z substratu ze wzbudzeniem przy 350 nm i emisji przy 450 nm.

Korelacja jednostek fluorescencji do mikromoli metyloumbeliferonu jest stosowana do wyliczania jednostek (mikromoli na minutę) tworzonych na ilość dodanego roztworu enzymu. Reakcja w pH 8,0 jest kompromisem pomiędzy pH optymalnym dla enzymu i pH dla maksymalnej fluorescencji metyloumbeliferonu (pH 10). Także przy pH 9,0 i powyżej tempo nie enzymatycznego uwalniania metyloumbeliferonu staje się znaczące. W tym oznaczeniu aktywność specyficzna (jednostek/mg) jest około 39,3 razy wyższa niż gdy się stosuje oznaczenie Hendrickson i wsp. (powyżej). W celu badania skuteczności w doświadczeniach z karmieniem zwierząt, jednostki mierzone stosując to oznaczenie przekształcano na ekwiwalentną jednostkę Hendricksona aby ułatwić porównanie z pierwszymi testami zanim zastosowano to oznaczenie.

P r z y k ł a d 10

Oznaczenie PI-PLC dodanego w skutecznych dawkach w paszach zwierzęcych

Opracowano bardziej czuły wariant oznaczenia PI-PLC opartego na soli N-metylomorfolinowej 4-metyloumbeliferylo-mio-inozytolo-1-fosforanu (Przykład 9) aby zmierzyć enzym po dodaniu do paszy zwierzęcej, który obejmuje jedno pH do oznaczenia i inne pH do pomiaru fluorescencji. Enzym ekstrahowano z materiałów do testowania paszy przez zważenie 4 g paszy i dodanie do 20 ml 10 mM Tris HCl (pH 7,5) z 0,1% deoksycholanem aby uzyskać 20 g/l paszy. Zawiesinę wytrząsano w wytrząsarce NBS G-25 (New Brunswick Scientific) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej przy 250 obr/min. Zawiesinę wirowano przy 13000 obr/min w mikrowirówce IEC Micromax z 1,5 ml probówkami wirówkowymi. Odpowiednie rozcieńczenia ekstraktów przygotowano w 0,1% BSA (bydlęca albumina surowicza). Próbki ekstrahowane z pasz z zastosowaniem 10 U/funt (=0,45359 kg) nie były rozcieńczane. Pierwszy etap reakcji - probówki przygotowywano następująco. Standardy przy rozcieńczeniu 1:100 lub 1:200 0,12 U/ml PI-PLC (jednostka zdefiniowana jak w Przykładzie 4) i należy też włączyć próbę ślepą. Próbki reakcji powinny być przykryte folią aby chronić substrat przed światłem.

μί Tris-HCl, 0,10 M, pH 6,0 μΐ deoksycholan (0,8%) μl substratu PI-PLC (4 mM)

100 μl enzymu

200 μl/probówkę całkowitej reakcji w 25°C

Brano dwa punkty czasowe (30 min i 60 min) przez usunięcie po 0,10 ml każdej reakcji. Próbki grzano w 65°C przez 15 minut aby zahamować reakcję enzymu i chłodzono w lodzie. W końcu próbki wirowano w 12000 obr/min w mikrowirówce przez 5 minut.

Odczyt fluorymetryczny - 120 μl 0,10 M buforu Tris (pH 8,0) buforu Tris dodano do studzienki mikrotytracyjnej w czarnej płytce plastikowej a następnie dodano 80 μl próbki reakcyjnej przez odczytem jak opisano w Przykładzie 7. Poziomy kontroli tła odjęto. Obliczono tempo produkcji jednostek fluorescencji na minutę. Jednostki fluorescencji przekształcono na mikromole produktu reakcji i wyliczono jednostki enzymatyczne wyekstrahowane na oryginalny funt paszy.

PL 203 054 B1

P r z y k ł a d 11

Próby karmienia kurcząt z prowokacją patogenem

I. Próba I karmienia kurcząt brojlerów

Przeprowadzono pierwszą próbę karmienia jednodniowych kurcząt brojlerów płci męskiej. Typowa jednorodna dieta kurcząt „karmy startowej”: zaprojektowana do spełniania lub przekraczania Nutrient Requirements for Poultry (wymagania składników odżywczych dla drobiu) National Research Council (wydanie 9, 1994) była przygotowana i podawana w formie papki. Kurczęta dzielono na klatki 30,5 cm x 61 cm (12 cali x 24 cale), miejsca do dyspozycji na podłodze, w czterech grupach doświadczalnych z każdą grupą doświadczalną powtórzoną cztery razy i z sześcioma ptakami na powtórzenie klatki (Tabela 3). Wodę i karmę dostarczano ad libitum w czasie 21 dniowego trwania testu. Zrandomizowany projekt bloku stosowano do przypisania kurcząt do klatek i klatek do grup terapeutycznych. Wszystkie klatki, karmniki i nawadniacze sanityzowano przed rozpoczęciem testu. Oświetlenie żarówkami było ciągłe (24 godziny dziennie). Masy ciała określano w dniu 1 i 21. Spożycie paszy mierzono w 21 dniu.

W dniu 5 wszystkie kurczęta zakażano 200000 oocyst Eimeria acervulina na ptaka przez zgłębnik doustny. W dniu 7 wszystkie ptaki zakażano dodatkowo 500000 Clostridium perfringens przez dostarczaną wodę. W kontroli negatywnej (T1) nie było leczenia zakażenia. W kontroli dodatniej (T2) dodawano kocydiostatyk i antybiotyk do paszy. To była terapia przeciwko kokcydiozie Sacox (salinomycyna przy 60 g/tonę) i antybiotyk BMD-50 (50 g/tonę). Dla grup doświadczalnych T3 i T4 pasza traktowana enzymem typu dzikiego PI-PLC (około 0,34 gramów PI-PLC na czystej zasadzie) była stosowana na początku dnia piątego w czasie doustnego zgłębnikowania Eimeria acervulina. Cała karma była przygotowywana w jednej jednorodnej partii, następnie dzielona pod kątem dodania antybiotyków (grupa testowa T2) lub enzymu (grupy testowe T3 i T4). Wyniki ważenia ptaków są przedstawione w Tabeli 4 i wyliczenia pasza/przyrost są przedstawione w Tabeli 5.

T a b e l a 3.

Próba karmienia kurcząt brojlerów I

Grupa testowa	Opis testu	Materiał testowy	Powtórzenia	Kurcząt na powtórzenie
T1	Kontrola negatywna	Brak	4	6
T2	Kontrola pozytywna	Terapia kocydiostatykiem i salinomycyną	4	6
T3	PI-PLC typ dziki	0,34 g enzymu/tonę (czystego)	4	6
T4	PI-PLC typ dziki	0,34 g enzymu/tonę (czystego)	4	6

T a b e l a 4.

Średnia masa ciała (g) po 21 dniach

Rep	Terapia
T1	T2	T3	T4
1	323,00	341,67	377,83	366,67
2	326,67	321,33	383,83	361,17
3	299,33	337,33	378,83	361,33
4	211,67	254,00	374,33	403,40
Średnia	290,17	313,58	373,14	373,14
STAT	b	b	A	A
S. D.	46,52	35,22	3,40	17,61
C. V.	16,03	11,23	0,90	4,72

PL 203 054 B1

T a b e l a 5.

Średnia konwersja paszy (0-21 dni) po korekcie na masę martwych ptaków

Rep	Terapia
T1	T2	T3	T4
1	1,486	1,569	1,407	1,445
2	1,562	1,532	1,423	1,421
3	1,524	1,562	1,432	1,406 1,406
4	1,760	1,462	1,438	1,404
Średnia	1,583	1,531	1,425	1,419
STAT	b	b	A	A
S. D.	0,11	0,04	0,01	0,02
CV.	6,68	2,78	0,82	1,17

W obu uprzednich Tabelach średnie w rzędzie bez wspólnej litery są znacząco różne (p<0,05), według testu Duncana dla istotności.

II. Próba karmienia kurcząt brojlerów II

Przeprowadzono drugą próbę karmienia jednodniowych kurcząt brojlerów płci męskiej. Podstawowe diety zaprojektowano by przekraczały Nutrient Requirements for Poultry (wymagania składników odżywczych dla drobiu) National Research Council (wydanie 9, 1994) i przygotowano je w formie papki by zapewnić jednorodność. Badania przeprowadzono w randomizowanych klatkach bateryjnych na zasadzie ślepej aby przetestować efekt PI-PLC przygotowanego z naturalnego źródła, Bacillus cereus (PI-PLC typu dzikiego) lub zrekombinowanego Bacillus megaterium na wynikach brojlerów płci męskiej hodowanych do wieku 21 dni. Naturalne źródło zawiera także inne enzymy zewnątrzkomórkowe ale PI-PLC przygotowane z Bacillus megaterium jest wysoce oczyszczone i było dalej oczyszczane za pomocą ultrasączenia stosując membranę NMWC 30 kDa. Ptaki poddano prowokacji w 8 dniu życia kokcydiami ptasimi (200000 oocyst E. acervulina na ptaka w wodzie pitnej) i w wieku 10 dni Clostridium perfringens (100000 na ptaka w wodzie pitnej). Każda z dziewięciu terapii (Tabela 6) miała 10 powtórzeń lub klatek. Każda klatka zawierała 6 szczepionych (zapalenie płuc Newcastle, choroba Mareka) samców broilerów Cobb x Cobb z rozmieszczeniem 0,0371 m² (0,40 stóp kwadratowych) na ptaka. Martwe ptaki, o ile były obecne, nie były zastępowane po 8 dniu. Karmę podawano w postaci papki na zasadzie ad libitum przez cały czas trwania testu (dzień 0 do dnia 21).

Wspólna i nie poddana terapii dieta podstawowa papkowa nie zawierająca antybiotyków była podawana wszystkim ptakom od dnia 0 do 7. Następnie podawano dziewięć diet eksperymentalnych w formie papki od 8-21 dnia. Podstawowa pasza była typową pożywką starterową dla broilerów zawierającą 22% surowego białka, z ME (zawartością metabolizowalnej energii) 12922,44 kJ/kg (1400 kcal/funt).

T a b e l a 6.

Karmienie kurcząt brojlerów próba II

Terapia	Testowana próba	Zakażenie/ prowokacja1
1	2	3
T1	BRAK	+
T2	Disalicylan metylenu bacytracyny (BMD, 50 g/tonę) i salinomycyna (Sacox, 60 g/tonę)	+
T3	Zrekombinowany PI-PLC (3 U/funt) produkowany przez Bacillus megaterium	+

PL 203 054 B1 cd. tabeli 6

1	2	3
T4	Zrekombinowany PI-PLC (10 U/funt) produkowany przez Bacillus megaterium	+
T5	Zrekombinowany PI-PLC (30 U/funt) produkowany przez Bacillus megaterium	+
T6	Zrekombinowany PI-PLC (90 U/funt) produkowany przez Bacillus megaterium	+
T7	PI-PLC (10 U/funt) i inne zewnątrzkomórkowe enzymy z Bacillus cereus	+
T8	BRAK	BRAK
T9	Zrekombinowany PI-PLC (90 U/funt) produkowany przez Bacillus megaterium	BRAK

¹ podano 200000 oocyst E. acervulina na ptaka z wodą pitną w wieku 7 dni i w wieku 10 dni z 100000 bakterii Clostridium perfringens na ptaka z wodą pitną

T a b e l a 7.

Karmienie kurcząt brojlerów próba II

Terapia	1	2	3	4	5	6	7	8	9
Zakażenie	+	+	+	+	+	+	+	-	-
Lekarstwa	-	+	-	-	-		-	-	-
Typ PI-PLC			Rec1	Rec1	Rec1	Rec1	Wt2		Rec1
Docelowe U/funt	-	-	3	10	30	90	10	-	90
Średnie mierzone U/funt	0,36	0,32	0, 323	0,71	1,74	5,96	2,46	0,12	5,94
Przyrost wagi dzień 8-21	309,72	333,83	323,24	324,78	320,64	328,29	298,98	326,12	338,8
	cd	ab	bc	ab	be	ab	D	Ab	a
Kowersja paszy dzień 8-21 (poprawiona)	1,859	1,642	1,702	1,732	1,699	1,739	1,876	1,651	1,650
	c	a	ab	b	ab	b	C	A	a
Średni wynik uszkodzeń jelit	1,447	0,833	1,120	1,133	0,842	0,808	1,267	0,983	0,847
	d	A	bc	bc	a	a	Cd	ab	a

¹ Zrekombinowany PI-PLC produkowany przez Bacillus megaterium ² PI-PLC typu dzikiego produkowany przez Bacillus cereus ³ Poziom dodania PI-PLC był zbyt niski by mógł być wydajnie ekstrahowany i mierzony w tym eksperymencie i pojawiał się jako poziom tła

W pierwszej próbie gdy zakażenie bakteryjne podawano przez wodę pitną (Przykład 11-1) na podstawie wszystkich kryteriów PI-PLC typu dzikiego produkowane przez Bacillus cereus działało równie dobrze lub lepiej od terapii Salinomycyna + BMD (Tabela 4-5). W późniejszym teście przedstawionym powyżej ze zrekombinowanym PI-PLC (Przykład 1I-II, Tabela 7), PI-PLC dodawany w różnych stężeniach wykazywał efekt zależny od dawki na obniżenie uszkodzeń jelita i konwersji paszy (T3-T6) i zwiększenie przyrostu wagi. Dodatkowo terapia zrekombinowanym PI-PLC przy 198 U/kg (90 U/funt) w nieobecności terapii Salinomycyna + BMD obniżało wynik uszkodzeń jelita i miało dodatni wpływ na konwersję paszy i przyrost wagi. PI-PLC typu dzikiego z Bacillus cereus nie działał równie skutecznie jak jego zrekombinowany odpowiednik w tym samym stężeniu 22 U/kg (10 U/funt) w tym teście.

PL 203 054 B1

III. Próba karmienie kurcząt brojlerów III z enzymami, PI-PLC i endo-1,4-e-D-mannanazą

Przeprowadzono badania w randomizowanych klatkach bateryjnych Petersime, aby zbadać wpływ PI-PLC i endo-1,4-e-D-mannanazy (Patent US 5,429,828) na wyniki brojlerów płci męskiej), hodowanych do wieku 21 dni. Ptaki prowokowano w wieku 8 dni ptasimi kokcydiami (75000 oocyst E. acervulina i 1250 oocyst E. maxima na ptaka za pomocą zgłębnika doustnego) i w wieku 11, 12 i 13 dni z Clostridium perfringens (zgłębnik doustny codziennie 1 ml bulionu świeżej hodowli mającej 10⁸ cfu/ml). Każda terapia (tabela 8) była złożona z 8 powtórzeń lub klatek i każda klatka miała 14 szczepionych na chorobę Mareka samców brojlerów Cobb x Cobb (zmniejszone do 10 w dniu 14 bo usunięto 4 ptaki z każdej klatki i sprawdzono pod kątem uszkodzeń) z rozmieszczeniem 0,0334 m² (0,36 stóp kwadratowych) na ptaka. Martwe ptaki usuwano z klatek gdy je zauważano i nie były one zastępowane. Paszę podawano w formie papki na zasadzie ad libitum w czasie trwania całego testu (dzień 0 do dnia 21).

Diety podawano w formie papki od 0-21 dni. Podstawowa pasza była typową paszą starterową dla brojlerów zawierającą 22% surowego białka z ME 12922,44 kJ/kg (1400 kcal/funt).

T a b e l a 8.

Eksperymentalna terapia - próba karmienia kurcząt brojlerów III

Terapia	Leki1	Prowokacja zakażeniem3	PI-PLC	Mannanaza2
1	+	-	-	-
2	+	-	-	100 MU/T
3	-	-	-	-
4	-	+	-	100 MU/T
5	-	+	PI-PLC (10 U/funt) produkowany przez Bacillus cereus	-
6	-	+	Zrekombinowany PI-PLC (30 U/funt) produkowany przez Bacillus megaterium	-
7	-	+	Zrekombinowany PI-PLC (10 U/ funt) produkowany przez Bacillus megaterium	100 MU/T
8	-	+	Zrekombinowany PI-PLC (30 U/funt) produkowany przez Bacillus megaterium	100 MU/T
9	+	+	-	-
10	+	+	Zrekombinowany PI-PLC (30 U/funt) produkowany przez Bacillus megaterium

¹ Dieta zawierała disalycylan metylenu bacytracyny (BMD, 50 g/tonę) i salinomycynę (Sacox. 60 g/tonę).

² 100 MU/T równa się 100 x 10⁶ jednostek aktywności na tonę paszy.

³ Ptaki prowokowano w wieku 8 dni 75000 oocyst E. acervulina i 1250 oocyst E. maxima na ptaka przez zgłębnik doustny i w wieku 11, 12 i 13 dni Clostridium perfringens za pomocą zgłębnika doustnego codziennie świeżą hodowlą z bulionu mającą 10⁸ cfu/ml.

Konwersję paszy dopasowywano do różnic między średnimi masami ptaków dla celów porównywania terapii. Zakażenia pogarszały AF/G (konwersja paszy dopasowana do wagi) o około 23% (0,147 jednostek AF/G). Zastosowanie salinomycyny i BMD całkowicie przywracało AF/G do normalnego poziomu ale te dwa związki chemiczne nie były lepsze niż kombinacja β-mannanazy i PI-PLC w zmniejszaniu uszkodzeń jelita powodowanych przez zakażenie. Sto milionów (100 MU) jednostek β-mannanazy na tonę albo samej albo w kombinacji z PI-PLC częściowo znosiło szkodliwe konsekwencje zakażenia, co było widać przy 65% do 70% poprawie redukcji AF/G obecnej w zakażonej kontroli (T3 w porównaniu z T1). β-mannanaza wydawała się obniżać wynik uszkodzeń jelita powodowany przez E. acervulina bardziej niż E. maxima. Częściowe przywrócenie AF/G uzyskiwano w zakażonych ptakach traktowanych PI-PLC w paszy ale przezwyciężono tylko 33-41% pogorszenia. Jednak obie klasy PI-PLC obniżały wynik uszkodzeń jelitowych powodowany przez oba gatunki Eimeria. Dla E. maxima obniżenie było znaczące statystycznie. Wyniki przedstawiono w Tabeli 9.

PL 203 054 B1

IV. Próba karmienia kurcząt brojlerów IV

Badania przeprowadzono w randomizowanych klatkach bateryjnych Petersime w celu testowania efektów PI-PLC, mannanazy (Patent US 5,429,828) i grzybowego enzymu mannanazy na wyniki samców brojlerów hodowanych do wieku 21 dni. Ptaki prowokowano w wieku 8 dni kokcydiami (75000 oocyst E. acervulina i 1250 oocyst E. maxima na ptaka za pomocą zgłębnika doustnego i w wieku 11, 12 i 13 dni Clostridia perfringens (zgłębnik doustny codziennie świeżą kulturą bulionu mająca 10⁸ cfu/ml). Każda z terapii miała 8 powtórzeń lub klatek. Każda klatka miała na początku 14 szczepionych na chorobę Mareka samców brojlerów Cobb x Cobb (zmniejszone do 10 w dniu 14 gdy usunięto 4 ptaki do zliczania uszkodzeń) z rozmieszczeniem 0,0334 m² (0,36 stóp kwadratowych) na ptaka. Ptaków nie zastępowano. Pasza i woda były podawane ad libitum w czasie całego testu (dzień 1 do dnia 21). Diety podawano w formie papki

PL 203 054 B1 w dniach 0-21. Podstawowa pasza dla terapii 1 do 16 była typową paszą starterową dla broilerów kukurydza/soja zawierającą 22% surowego białka z ME 12922,44 kJ/kg (1400 kcal/funt).

Wyniki podsumowane w Tabeli 10 poniżej wykazują powtarzalne korzyści dodania albo PI-PLC albo mannanazy do pasz kurcząt brojlerów zakażonych dwoma gatunkami kokcydiów ptasich i Clostridium perfringens powodując poprawę w zarówno przyroście masy i konwersji paszy. Co jest ważne, te badania wykazują, że albo PI-PLC albo mannanaza gdy są połączone z salinomycyną ale bez antybiotyku BMD (Testy 6 i 5) przywracają stan do zasadniczo poziomu niezakażonych testów (Nr 1 i 2). To dostarcza dowodu na rolę przeciwbakteryjną. W tym przypadku PI-PLC/salinomycyna dały nieco lepsze efekty niż mannanaza i były lepsze nawet niż obecna praktyka w USA podawania kombinacji BMD i salinomycyny zakażonym stadom (Test 4).

T a b e l a 10.

Próba karmienia brojlerów IV

Test	I'	E2	M3	Uszkodzenia	Konwersja paszy	Przyrost masy	Żywa waga
E.acer.	E.max.
Górny	Środ- kowy	Dzień 0-21	Dzień 8-21	Dzień 0-21	Dzień 8-21	Dzień 21
1	-	-	-	0,00	0,00	1,652	1,694	0,527	0,427	0,565
2	-	-	B/S	0,00	0,00	1,612	1,656	0,546	0,437	0,583
3	+	-	-	2,44	2,31	1,813	1,909	0,394	0,296	0,432
10	+	-	B	2,25	1,94	1,707	1,770	0,453	0,352	0,490
7	+	-	S	1,00	1,09	1,709	1,719	0,458	0,368	0,496
4	+	-	B/S	0,59	1,63	1,585	1,671	0,509	0,397	0,547
16	+	PI- PLC	-	2,25	1,50	1,701	1,778	0,451	0,347	0,486
9	+	PI- PLC	B	2,03	1,34	1,760	1,844	0,445	0,342	0,482
6	+	PI- PLC	S	1,06	1,28	1,584	1,613	0,526	0,419	0,564
12	+	Man.	-	1,94	1,34	1,803	1,849	0,433	0,338	0,483
13	+	Man. 5x	-	2,13	2,00	1,740	1,813	0,437	0,339	0,471
8	+	Man.	B	2,09	1,34	1,707	1,772	0,448	0,348	0,486
5	+	Man.	S	0,97	1,09	1,652	1,688	0,500	0,397	0,538
11	+	Man.	B/S	0,78	1,16	1,622	1,666	0,502	0,390	0,540

' I=Infekcja: prowokacja w wieku 8 dni 75000 oocyst E. acervulina i 1250 oocyst E. maxima na ptaka zgłębnikiem doustnym, w wieku 11, 12 i 13 dni Clostridium perfringens zgłębnikiem doustnym 1 ml świeżej hodowli w bulionie mającej 10⁸cfui/ml.

² E=Enzymy: PI-PLC = zrekombinowany PI-PLC produkowany przez B. megaterium dodany 30 U/funt. Jednostki zdefiniowano jak w Przykładzie 4;

Man.=endo-1,4-p-D-mannanaza B. lentus (Patent US 5,429,828) dodana przy 121 MU/tonę (miliony jednostek ChemGen/tonę) lub 5x przy 506 MU/tonę.

³ M=terapia (B=BMD 50g/tonę); S=Salinomycyna(60 g/tonę).

P r z y k ł a d 12

Określenie efektów enzymów na żywotność i inwazję komórkową przez sporozoity Eimeria acervulina i Eimeria tenella in vitro

Sporozoity Eimeria acervulina lub sporozoity Eimeria tenella i hodowane komórki noworodków chomika (BHK) przygotowano za pomocą opublikowanych sposobów (Augustine, Avian and Poultry

PL 203 054 B1

Biology Reviews 11:113-122, 2000). Dla wstępnego traktowania komórek na kultury komórek nakładano rozcieńczenia enzymów jak opisano w Tabeli 11 i badano w nich zmiany morfologiczne od 5 do 45 minut po nałożeniu. Po 45 minutach pojedyncze warstwy płukano dwukrotnie, następnie zakażano nietraktowanymi sporozoitami E. acervulina lub E. tenella. Dla aplikacji w czasie zakażenia sporozoity zawieszano w odpowiednim rozcieńczeniu enzymu i natychmiast zaszczepiano do hodowli komórek. Po 45 minutach inkubacji hodowle utrwalano i barwiono i określano ilościowo inwazję.

Robiono obserwację szukając zmian w morfologii sporozoitów lub komórek spowodowaną przez traktowanie enzymem. Przy poziomach enzymu stosowanych w tych eksperymentach nie zaobserwowano zmian morfologicznych. Inwazja sporozoitów komórek hodowlanych mierzono po dwóch metodach terapii enzymami, jak i bez terapii enzymami, przez barwienie histologiczne i procedury mikroskopii (Augustine).

Dane w Tabeli 11 przedstawiają znaczące obniżenie inwazji sporozoitami zarówno ze sporozoitami E. acervulina lub E. tenella. Zarówno stosunkowo nieczysty enzym PI-PLC produkowany w bulionie zewnątrzkomórkowym zrekombinowanego B. cereus i wysoce oczyszczony zrekombinowany PI-PLC produkowany w bulionie zewnątrzkomórkowym zrekombinowanego B. megaterium dawały statystycznie znaczące zmniejszenie inwazji w większości eksperymentów. Nawet przy dawce w przybliżeniu jedna druga preparatu PI-PLC typu dzikiego, zrekombinowany preparat PI-PLC był nadal aktywny. Tak więc wstępne traktowanie komórek enzymem i wypłukiwanie enzymu było równie skuteczne jak dodawanie enzymu równocześnie w czasie zakażenia. Jednak w oparciu o doświadczenia z ekstrahowaniem enzymu z paszy, dwa etapy płukania nie usuwały całego enzymu.

Preparat enzymu z endo-1,4-e-mannanazy także powodował statystycznie znaczącą redukcję inwazji w dwóch doświadczeniach gdzie komórki traktowano wstępnie enzymem przed zakażeniem. Te dodatnie wyniki obejmowały jeden eksperyment z każdym typem patogenu. Tak więc mannanaza także dawała równie dobre efekty jak preparat PI-PLC B. cereus aby zmniejszyć inwazję sporozoitów in vitro.

T a b e l a 11.

Inwazja in vitro komórek BHK przez sporozoity Eimeria acervulina lub Eimeria tenella z i bez terapii enzymami

Enzymy i stężenia	Pretraktowanie komórek enzymami a następnie płukanie	Stosowanie enzymu w czasie zakażenia
sporozoity E. acervulina	Test 1	Test 2	Test 1	Test 2
Kontrola	22 ± 1a	33 ± 4a	50 ± 4a	35 ± 7a
PI-PLC z B. cereus1 0,0403 U/ml	15 ± 1a	26 ± 1a	33 ± 3b	25 ± 2ab
PI-PLC ze zrekombinowanej B. megateriaum2 0,261 U/ml	14 ± 1a	22 ± 1b	16 ± 2c	18 ± 1bc
PI-PLC ze zrekombinowanej B. megaterium2 0,0261 U/ml	18 ± 1a	26 ± 1b	36 ± 3b	9 ± 2c
endo-1,4-p-D-mannanaza3 5100 U/ml	16 ± 1b	29 ± 2ab	NDa	ND
sporozoity E. acervulina	Test 1	Test 2	Test 1	Test 2
Kontrola	44 ± 2a	26 ± 4a	63 ± 5a	42 ± 4a
PI-PLC z B. cereus1 0,0403 U/ml	38 ± 2b	21 ± 2a	52 ± 13ab	37 ± 2ab
PI-PLC ze zrekombinowanej B. megateriaum2 0,261 U/ml	30 ± 1c	15 ± 0a	28 ± 2b	39 ± 4ab
PI-PLC ze zrekombinowanej B. megateriaum' 0,0261 U/ml	ND	17 ± 1a	18 ± 1c	29 ± 1b
endo-1,4-p-D-mannanaza3 5100 U/ml	35 ± 1b	19 ± 5a	46 ± 6ab	ND

Zliczenia inwazji są podane jako średnia ± odchylenie standardowe od średniej mierzone z 1-3 szkiełek nakrywkowych/aberację (komórki BHK hodowano na szkiełkach nakrywkowych wstawionych do szalek do hodowli). Średnie w obrębie grup testowych z innymi wskaźnikami różnią się znacząco (P < lub = 0,05).

¹ Zewnątrzkomórkowy enzym z B. cereus dializowany w soli fizjologicznej buforowanej fosforanem, jednostki standaryzowane do sposobu z Przykładu 4 ² Zewnątrzkomórkowy enzym ze zrekombinowanej B. megaterium dializowany w soli fizjologicznej buforowanej fosforanem, jednostki standaryzowane do sposobu z Przykładu 4 ³ Mannanaza uzyskana z B. lentus jak opisano w Patencie USA 5,429,828 i dializowany w soli fizjologicznej buforowanej fosforanem, jednostki jak zdefiniowano oznaczeniem redukującym cukier ChemGen Corp.

⁴ ND= nie oznaczano

PL 203 054 B1

P r z y k ł a d 13

Ocena in vitro PI-PLC na zakażenia Cryptosporidium

Enzym PI-PLC oceniano pod kątem aktywności przeciw kryptosporidiom i toksyczności w stężeniach w zakresie od 0,001-30 U/ml stosując 4 dniowe komórki nerki Madin-Darby (MDCK). Jednostki enzymatyczne definiowano według sposobu w Przykładzie 4 ale mierzono jak w Przykładzie 9. Preparat enzymatyczny stosowany ze zrekombinowanego Bacillus megaterium. Traktowanie zainicjowano 3 godziny po zakażeniu i kontynuowano przez 48 godzin.

Immunooznaczenie z chemiluminescencją. Przed zakażeniem oocysty wypłukano i zawieszono w bazie DMEM z 0,75% taurocholanem sodu i inkubowano 10 min w 37°C (You i wsp., FEMS Microbiol. Letters 136:251-256, 1996; You i wsp., J. Antimicrobial. Chemother. 41:293-296, 1998). Mieszaninę do ekscystacji rozcieńczano podłożem Ultraculture, szybko dystrybuowano na płytkach zawierających komórki MDCK przy konfluencji 100% i utrzymywano w podłożu Ultraculture przez 4 dni. Inokulum inkubowano przez 3 godziny przed płukaniem PBS i zastąpiono świeżym podłożem Ultraculture z lub bez testowanego enzymu. Płytki inkubowano w 37°C w atmosferze powietrza z 5% CO2 przez 48 godz. Kultury płukano PBS i utrwalono w płynie Bouina.

Utrwalone płytki płukano buforem TBST (20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, 0,05% Tween-20) i blokowano 1% BSA-TBST (bufor TBST zawierający 1% bydlęcą albuminę surowiczą) przez 30 min w 25°C z delikatnym wytrząsaniem. Surowice królika przeciwko Cryptosporidium parvum (rozcieńczenie 1:200) nałożono na płytki i inkubowano 1 godz. Po przepłukaniu TBST próbki kolejno inkubowano ze znakowaną biotyną kozią przeciw króliczej IgG i znakowaną streptawidyną peroksydazą z chrzanu (rozcieńczenie robocze 1:1000, KPL Inc., Gaithersburg, MD). Wzmagany Luminol (4-jodofenol i nadtlenek wodoru, Aldrich Chemical Co. Inc., Milwaukee, WI) stosowano jako substrat. Płytki czytano Luminometrem ML3000 (Dynatech Lab, Chantilly, VA) i określono względne jednostki świetlne (RLU). Średnie RLU wyliczono z 4 powtórzonych studzienek i wszystkie eksperymenty powtarzano przynajmniej dwa razy.

Oznaczenie toksyczności

Enzym testowano stosując oznaczenie handlowe redukcji tetrazolu (CellTiter 06; Promega Corp., Madison, WI, USA). Pokrótce każde stężenie enzymu wskazane poniżej wprowadzono do 96-studzienkowych płytek zawierających konfluentne pojedyncze warstwy komórek MDCK. Każde rozcieńczenie oceniano w trzech powtórzeniach. Enzym inkubowano na pojedynczych warstwach w 37°C i 5% CO2. Po 48 godzinach płytki wywoływano przez 1 godz i czytano w czytniku płytek ELISA przy 490 nm. Wyniki zapisywano i analizowano. Procent toksyczności wyliczono przed odjęcie średniego OD kontroli na podłożu bez enzymu od średniego OD z enzymem i następnie dzielono przez OD podłoża i mnożono przez 100.

Wartości cytotoksyczności przypisywano jak wskazano w następującej tabeli.

Toksyczność % Wynik

0-5% 0

6-25% 1

26-50% 2

51-75% 3

76-100% 4

Znaczącą toksyczność zaobserwowano przy 3 U/ml lub z wyższymi stężeniami enzymu. Nie zaobserwowano znaczącej toksyczności z tym enzymem w zakresie 0,1-1 U/ml (Tabela 12). Tak więc przeprowadzono zestaw doświadczeń w tym zakresie stężeń (1,0 U/ml lub mniej) aby określić aktywność enzymu i specyficzność enzymu. W pierwszym eksperymencie komórki MDCK zakażono ekscystowanymi sporozoitami. Po 3-godzinnym okresie inkubacji, pojedynczą warstwę komórek przepłukano i dodano enzym w różnych stężeniach przez 48 godzin. Jak przedstawiono w Tabeli 13, enzym wykazywał aktywność przeciwko kryptosporydiom w zakresie 0,01-1 U/ml in vitro.

Uzyskano około 50% inhibicji przy stężeniu 0,1 U/ml (Figura 1)

PL 203 054 B1

T a b e l a 12.

Toksyczność zrekombinowanego PI-PLC przygotowanego w B. megaterium w stosunku do pojedynczych warstw hodowli komórek MDCK

Stężenie	% Toksyczności (95% CL)	Wynik toksyczności
10 U/ml	83	4
3	57	3
1	13	1
0,3	11	1
0,1	10	1

T a b e l a 13.

Aktywność zrekombinowanego enzymu PI-PLC w stosunku do hodowli komórek

MDCK zakażonych C. parvum

Terapia	Jednostek/ml	Procent hamowania	Średnia liczba Cryptosporidium na studzienkę	95% CL
Po zakażeniu 3 godz	1	77,36	285,28	0,01
	0,3	77,26	286,5	0,04
	0,1	52,74	595,53	0,18
	0,03	27,62	912,15	0,22
	0,01	7,33	1167,78	0,09
Zakażone	-	0	1260,18	0,09
Niezakażone	-	100	0	0,02

Przeprowadzono drugi zestaw eksperymentów aby ocenić specyficzność enzymu. Sporozoity poddano działaniu enzymu w różnych stężeniach przez 45 minut i krótko przepłukano. Poddane traktowaniu sporozoity następnie użyto do zakażenia nietraktowanych komórek gospodarza i pozwolono na rozwój i rozmnażanie przez 48 godzin. W oddzielnym eksperymencie inkubowano komórki gospodarza z enzymem w różnych stężeniach, płukano i zakażano nietraktowanymi sporozoitami. Jak przedstawiono poniżej (Tabela 14) traktowanie albo sporozoitu albo komórek gospodarza enzymem daje częściową inhibicję. Inhibicja zależna od dawki nie była obserwowana w tym zakresie stężeń. Może to wynikać z krótkiego okresu inkubacji enzymu z komórkami gospodarza lub pasożyta (45 minut) lub częściowego/niecałkowitego odcięcia receptorów gospodarza/pasożyta. Dodatkowo inne receptory gospodarza/pasożyta prawdopodobnie biorą udział w zakażeniu i są odpowiedzialne za wzrost obserwowany w komórkach gospodarza.

T a b e l a 14.

Traktowanie sporozoitów lub komórek MDCK przed infekcją i wpływ na zakaźność C. parvum.

Terapia	PI-PLC jedn./ml	Procent hamowania	Średnia liczba Cryptosporidium na studzienkę	95% CL
1	2	3	4	5
Sporozoit traktowany przed zakażeniem	1	67,27	412,40	0,02
	0,3	65,64	433,04	0,06
	0,1	57,40	536,80	0,03
	0,03	58,13	527,59	0,03
	0,01	56,98	542,15	0,01

PL 203 054 B1 cd. tabeli 14

1	2	3	4	5
Komórki gospodarza traktowane przed zakażeniem	1	68,76	393,64	0,12
	0,3	50,07	629,24	0,26
	0,1	63,82	455,88	0,19
	0,03	58,53	522,66	0,12
	0,01	56,84	543,85	0,10
Zakażone		0	1260,18	0,09
Niezakażone		100	0	0,02

P r z y k ł a d 14.

Ocena in vivo PI-PLC dla zakażenia Cryptosporidium

Oceniano aktywność enzymu przeciwko kryptosporidiom stosując model myszy SCID z upośledzonym układem odporności. Pokrótce przygotowano inokula oocyst przez płukanie oczyszczonych oocyst (przechowywanych < 6 miesięcy) 0,1% BSA< PBS (pH 7,2) aby usunąć dwuchromian potasu. Myszy SCID (4-5 tygodniowe) zakażono 10⁶ oocyst (szczep IOWA) i traktowano jak podano poniżej. Zebrano próbki kału od myszy, oczyszczono na nieciągłych gradientach sacharozy i oceniono pod kątem obciążenia pasożytami za pomocą cytometrii przepływowej jak opisano (Arrowwood i wsp., J. Parasitol. 81:404-409, 1995).

T a b e l a 15.

Procedura traktowania dla eksperymentów terapeutycznych

Grupa myszy	A	B	C
Liczba myszy	10	10	10
Dawka inokulum	106	106	106
Związek	PI-PLC	PI-PLC	Placebo
Dawka (mg/kg)	90 U/ml	30 U/ml	PBS
Droga	podane w karmie	podane w karmie	podane w karmie
Częstość	Ad lib	Ad lib	Ad lib

Granulowaną karmę dla myszy powleczono albo 66,1 U/kg albo 198,4 U/kg (30 albo 90 U/funt) PI-PLC w PBS lub PBS. Wszystkie myszy karmiono ad libitum. Próbki kału i wagi zbierano dwa razy w tygodniu. Konsumpcję karmy mierzono codziennie. Myszy poddawano eutanazji przez wstrzyknięcie każdej 0,2 ml 100 mg/ml ketaminy, 100 mg/ml ksylazyny i 0,9% NaCl.

Średnia pasza konsumowana dziennie przez mysz i średnie masy myszy są przedstawione w Tabeli 16. Nie stwierdzono statystycznie znaczących różnic w spożyciu pożywienia lub wagi w ciągu okresu 3 tygodni.

T a b e l a 16.

Konsumpcja karmy i przyrost masy myszy.

	Grupy eksperymentalne	Karma (g) konsumowana/mysz/dzień	Masa (g)
1	2	3	4
Dzień 3		AVG	AVG
	A (90 U/funt)	7,56	16,67
	B (30 U/funt)	6,13	17,055
	C (kontrola PBS)	5,46	16,88

PL 203 054 B1 cd. tabeli 16

1	2	3	4
Dzień 7		AVG	AVG
	A	8,31	16,95
	B	8,51	16,91
	C	7,27	16,89
Dzień 10		AVG	AVG
	A	8,55	17,29
	B	7,93	17,08
	C	7,11	16,97
Dzień 14		AVG	AVG
	A	7,78	17,43
	B	8,06	17,62
	C	7,55	17,38
Dzień 17		AVG	AVG
	A	8,52	17,64
	B	8,53	17,84
	C	7,79	17,59
Dzień 21		AVG	AVG
	A	7,89	18,25
	B	8,22	18,62
	C	8,51	18,14
Dzień 24		AVG	AVG
	A	9,79	18,2
	B	8,3	18,63
	C	8,22	18,33

AVG = średnia

Skuteczność w 3 tygodnie po zakażeniu. Zbierano próbki kału 3, 4 i 4,5 tygodni po zakażeniu i mierzono ilość Cryptosporidium w 100 mikrolitrowych próbkach pobranych od myszy SCID w grupach traktowanych i kontrolnych, Tabela 17.

Jak przedstawiono, myszy traktowane enzymem wykazywały obniżenie obciążenia pasożytem. W grupach traktowanych obserwowano obciążenia pasożytem (34-54%). Niektóre z tych obniżeń były znaczące statystycznie gdy je oszacowano stosując analizę statystyczną ANOVA (pokazana poniżej i zaznaczona symbolem). Enzym wykazuje potencjał jako czynnik terapeutyczny przeciwko kryptosporidiom. Wyższe dawki enzymu lub lepsze dostarczanie enzymu w miejscu zakażenia mogłoby zwiększyć jego skuteczność i może być przedmiotem następnych doświadczeń.

PL 203 054 B1

T a b e l a 17.

Skuteczność PI-PLC in vivo w obniżaniu ilości Cryptosporidium w kale

Grupa trakto- wania	Dawka enzymu (U/funt)	Obciążenie pasożytem (oocyst/100 μ!) (SD) Dzień 21	Procent Inhibicji	Obciążenie pasożytem (oocyst/100 μ!) (SD) Dzień 28	Procent Inhibicji	Obciążenie pasożytem (oocyst/100 μ!) (SD) Dzień 31	Procent Inhibicji
PI-PLC	90	22,7(11,4)	44,0	26,3(14)*	48,9	87,5(52,9)	34,0
PI-PLC	30	16,2(4,7)	52,0	23,4(11)*	54, 6	74,3(89,7)+	40,0
PBS (kon trola)	-	33,5(162)	-	50,4(29)	-	132,1(89,)	-

* wartości P był y znaczące przy 0,05 lub mniej +wartość P była 0,08 lub mniejsza

P r z y k ł a d 15.

Sprawdzenie enzymu w karmach stosowanych do testów wzrostowych

Oznaczenie PI-PLC wyekstrahowanego z karm stosowanych w powyższych próbach ze zwierzętami przeprowadzono jak opisano w Przykładzie 10. Wyniki podsumowano w Tabelach 18-19.

T a b e l a 18.

Badanie Cryptosporidium w karmie myszy

Terapia	Kontrola	30 U/ funt	90 U/funt
Docelowe U/funt	0	30	90
Typ PI-PLC	-	Rekombinant z B. megaterium	Rekombinant z B. megaterium
Partia PI-PLCNr	-	45-46 SF	45-46 SF
Oznaczone U/funt wyekstrahowane	0	22,8	66,1
% docelowego wyekstrahowane	-	76,0	73,4

Skuteczność ekstrakcji z karmy wahała się znacząco od typu karmy. Ekstrakcja z karmy myszy wykazywała wydajność 73,4 do 76 procent (Tabela 18). Trzy różne preparaty karmy kurcząt przygotowane w trzech różnych miejscach starannie naładowano 99,2 lub 396,8 U/kg (45 lub 180 U/funt) zrekombinowanego PI-PLC i natychmiast ekstrahowano i oznaczano stosując procedurę oznaczenia Przykładu 9 jako poziomy ładowania w zakresie metody ciągłego oznaczania Przykładu 9 (Tabela 19).

T a b e l a 19

Testowane wydajności ekstrakcji z różnych źródeł karmy dla kurcząt i mąki kukurydzianej

	Źródło karmy dla kurcząt
	Źródło 1	Źródło 2	Źródło 3	Mąka kukurydziana
Poziom ładowania jednostki/funt	180	45	180	45	180	45	180	45
Wyekstrahowane jednostki/funt	128	9,3	53,2	3,66	82,7	8,46	134,4	33
% wyekstrah. dodanych jednostek	71,1	20,7	29,6	8,1	45,9	18,8	74,7	73,3

PL 203 054 B1

Widać, że wydajność ekstrakcji z mąki kukurydzianej jest podobna do ekstrakcji z karmy myszy. Jednak ekstrakcja z niektórych próbek karmy kurcząt była słaba w tym eksperymencie i także w innych.

W teście jak przedstawiono w Tabeli 20 ekstrahowalny enzym wynosił około 30-45% teoretycznej PI-PLC podczas gdy β-mannanaza była łatwo ekstrahowalna i wydajność wynosiła około 100%.

Około 45% było najlepszym poziomem ekstrakcji widzianym z tą karmą z testem ekstynkcji widzianym powyżej. Tak więc wyniki oznaczenia dla U/funt ekstrahowanych dla karmy w teście z Tabeli 20 są w zakresie oczekiwanym dla stosowanego ładowania.

T a b e l a 20.

Sprawdzenie naładowania enzymem w próbie karmienia kurcząt brojlerów III

Terapia Nr	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
Infekcja	-	-	+	+	+	+	+	+	+	+
Leczenie	+	+	-	-	-	-	-	-	+	+
Docelowe jedn./funt	0	0	0	0	10	30	10	30	0	30
Typ PI-PLC	-	-	-	-	WT	Rec	Rec	Rec	-	Rec
Oznaczenia jednostek/funt PI-PLC
Średnia jedn/funt	0,94	0,76	0,79	0,7	3, 08	11,48	4,56	10, 18		9,49
Procent docelowego	-	-	-	-	30,75	38,27	45,57	33,93		31,64
Docelowe Mjedn./tonę	-	100	-	100	-	-	100	100	-	-
Hemicel Mannanaza	-	+	-	+	-	-	+	+	-	-
Oznaczenia jednostek/funt Mannanazy
Mjedn./tonę	-	124,9	-	135,5	-	-	153,5	172,0	-	-
Procent docelowego	-	124,9	-	135,5	-	-	153,5	172,0	-	-

Choć podano pewne reprezentatywne wykonania i szczegóły w celu ilustracji wynalazku, będzie ewidentne dla specjalistów, że różne zmiany i modyfikacje mogą być w nim zrobione bez oddalania się od zakresu wynalazku.

Claims (53)

1. Kompozycja zawierająca (i) enzym, wybrany spośród fosfolipazy C specyficznej dla fosfatydyloinozytolu i fosfolipazy D specyficznej dla fosfatydyloinozytolu, i (ii) dopuszczalny fizjologicznie nośnik dla tego enzymu, w postaci odpowiedniej do podawania kompozycji doustnie.

2. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że jest paszą.

3. Kompozycja według zastrz. 1 albo 2, znamienna tym, że enzym stanowi jedyny czynnik przeciw zakażeniom.

4. Kompozycja zastrz. 1, znamienna tym, że enzym stanowi fosfolipaza C specyficzna dla fosfatydyloinozytolu.

5. Kompozycja zastrz. 1, znamienna tym, że enzym stanowi fosfolipaza D specyficzna dla fosfatydyloinozytolu.

6. Kompozycja według zastrz. 1-5, znamienna tym, że zawiera stabilizator, nośnik węglowodanowy lub środek konserwujący.

PL 203 054 B1

7. Kompozycja według zastrz. 6, znamienna tym, że stabilizator jest buforem, węglowodanem lub glikolem.

8. Kompozycja według zastrz. 6, znamienna tym, że nośnik węglowodanowy jest wybrany z grupy obejmującej ksylozę, fruktozę, glukozę, sorbitol i maltotriozę.

9. Kompozycja według zastrz. 6, znamienna tym, że środek konserwujący jest wybrany z grupy obejmującej propyloparaben, sorbat sodu, sorbat potasu i askorbinian palmitylu.

10. Kompozycja według zastrz. 1-9, znamienna tym, że nośnik jest pokarmem, do którego dodany jest enzym.

11. Kompozycja według zastrz. 1-10, znamienna tym, że pokarm jest karmą dla zwierząt złożoną z materiału ziarna, źródła białka, witamin, aminokwasów i minerałów.

12. Kompozycja według zastrz. 11, znamienna tym, że materiał ziarna stanowi kukurydza, sorgo, pszenica, jęczmień lub owies.

13. Kompozycja według zastrz. 11, znamienna tym, że źródło białka stanowi fasola lub groch.

14. Kompozycja według zastrz. 1-9, znamienna tym, że jest w formie stałej lub płynnej.

15. Kompozycja według zastrz. 1-9, znamienna tym, że enzym jest zawarty w tabletce lub otoczce z żelatyny.

16. Kompozycja według zastrz. 1-15, znamienna tym, że enzym jest przygotowany ze szczepu Bacillus cereus.

17. Kompozycja według zastrz. 16, znamienna tym, że szczep Bacillus cereus jest ATCC 7004 lub ATCC 6464.

18. Kompozycja według zastrz. 1-15, znamienna tym, że enzym jest uzyskany poprzez ekspresję zrekombinowanego DNA w organizmie gospodarza.

19. Kompozycja według zastrz. 18, znamienna tym, że organizm gospodarza stanowi szczep Bacillus megaterium.

20. Kompozycja według zastrz. 2, znamienna tym, że enzym jest obecny w ilości 200 IU/kg - 4000 IU/kg karmy.

21. Zastosowanie enzymu wybranego spośród fosfolipazy C specyficznej dla fosfatydyloinozytolu i fosfolipazy D specyficznej dla fosfatydyloinozytolu do wytwarzania formy dawki doustnej leku do leczenia lub obniżenia ryzyka infekcji w przewodzie pokarmowym.

22. Zastosowanie według zastrz. 21, znamienne tym, że enzym stanowi jedyny podawany czynnik przeciw zakażeniom.

23. Zastosowanie według zastrz. 21, znamienne tym, że zakażenie jest powodowane przez patogen taki jak pierwotniak, bakteria, drożdże, wirus lub grzyb.

24. Zastosowanie według zastrz. 23, znamienne tym, że zakażenie jest spowodowane przez patogen będący pierwotniakiem z rodzaju Eimeria.

25. Zastosowanie według zastrz. 23, znamienne tym, że zakażenie jest spowodowane przez patogen będący pierwotniakiem z rodzaju Cryptosporidium.

26. Zastosowanie według zastrz. 23, znamienne tym, że zakażenie jest spowodowane przez patogen bakteryjny z rodzaju Clostridium.

27. Zastosowanie według zastrz. 22-26, znamienne tym, że enzym uzyskany jest ze szczepu Bacillus cereus.

28. Zastosowanie według zastrz. 27, znamienne tym, że szczep Bacillus cereus jest szczepem ATCC 7004 lub ATCC 6464.

29. Zastosowanie według zastrz. 21-26, znamienne tym, że enzym jest uzyskany poprzez ekspresję zrekombinowanego DNA w organizmie gospodarza.

30. Zastosowanie według zastrz. 29, znamienne tym, że organizm gospodarza jest ze szczepu Bacillus megaterium.

31. Zastosowanie według zastrz. 21-30, znamienne tym, że fosfolipazę stanowi fosfolipaza C specyficzna dla fosfatydyloinozytolu.

32. Zastosowanie według zastrz. 21-30, znamienne tym, że fosfolipazę stanowi fosfolipaza D specyficzna dla fosfatydyloinozytolu.

33. Kompozycja zawierająca (i) endo-1,4-e-D-mannanazę i (ii) dopuszczalny fizjologicznie nośnik dla tego enzymu, znamienna tym, że kompozycja ma odpowiednią postać do podawania doustnie i kompozycja zawiera enzym, który stanowi jedyny czynnik

PL 203 054 B1 przeciw zakażeniom a zawartość enzymu stanowi ilość skuteczną do leczenia lub obniżenia ryzyka infekcji przewodu pokarmowego.

34. Kompozycja według zastrz. 33, znamienna tym, że do nośnika, który stanowi pożywienie, dodany jest enzym.

35. Kompozycja według zastrz. 34, znamienna tym, że pokarm jest karmą dla zwierząt złożoną z materiału ziarna, źródła białka, witamin, aminokwasów i minerałów.

36. Kompozycja według zastrz. 35, znamienna tym, że materiał ziarna stanowi kukurydza, sorgo, pszenica, jęczmień lub owies.

37. Kompozycja według zastrz. 35, znamienna tym, że źródłem białka jest fasola lub groch.

38. Kompozycja według zastrz. 33, znamienna tym, że jest w formie stałej lub płynnej.

39. Kompozycja według zastrz. 33, znamienna tym, że enzym jest zawarty w tabletce lub w otoczce z żelatyny.

40. Kompozycja według zastrz. 33, znamienna tym, że endo-1,4-e-D-mannanaza produkowana przez Bacillus lentus określany jako ATCC 55045.

41. Kompozycja według zastrz. 33-40, znamienna tym, że kompozycja zawiera także stabilizator, nośnik węglowodanowy lub środek konserwujący.

42. Kompozycja według zastrz. 41, znamienna tym, że stabilizator jest buforem, węglowodanem lub glikolem.

43. Kompozycja według zastrz. 41, znamienna tym, że nośnik węglowodanowy jest wybrany z grupy złożonej z ksylozy, fruktozy, glukozy, sorbitolu i maltotriozy.

44. Kompozycja według zastrz. 41, znamienna tym, że środek konserwujący jest wybrany z grupy obejmującej propyloparaben, sorbat sodu, sorbat potasu i askorbinian palmitylu.

45. Zastosowanie enzymu, endo-1,4-e-D-mannanazy, jako jedynego czynnika przeciw zakażeniom, do wytwarzania formy doustnej dawki leku do leczenia lub obniżenia ryzyka infekcji przewodu pokarmowego.

46. Zastosowanie według zastrz. 45, znamienne tym, że zakażenie jest powodowane przez patogen będący pierwotniakiem, bakterią, drożdżami, wirusem lub grzybem.

47. Zastosowanie według zastrz. 46, znamienne tym, że zakażenie jest spowodowane przez patogen będący pierwotniakiem z rodzaju Eimeria.

48. Zastosowanie według zastrz. 46, znamienne tym, że zakażenie jest spowodowane przez patogen będący pierwotniakiem z rodzaju Cryptosporidium.

49. Zastosowanie według zastrz. 46, znamienne tym, że zakażenie jest powodowane przez patogen bakteryjny z rodzaju Clostridium.

50. Zastosowanie według zastrz. 45-49, znamienne tym, że enzym jest wytwarzany przez szczep Bacillus lentus.

51. Zastosowanie według zastrz. 45-49, znamienne tym, że enzym jest uzyskany poprzez ekspresję zrekombinowanego DNA w organizmie gospodarza.

52. Zastosowanie według zastrz. 51, znamienne tym, że organizm gospodarza stanowi szczep

Bacillus megaterium.

53. Zastosowanie według zastrz. 45, znamienne tym, że endo-1,4-e-D-mannanaza jest wytwarzana przez szczep Bacillus lentus oznaczony jako ATCC 55045.