CN1433319A - 用于感染的酶疗法 - Google Patents

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Abstract

一类特殊的酶，所述酶的特征在于切割影响细胞表面蛋白或糖类释放的键的能力，不含抗感染药的所述酶显示出显著的抗感染活性。口服后，这些酶例如有效治疗人和动物的消化道感染。在后一情况下，有显著提高生长率、饲料转化率并且改善总体健康状况的益处。

Description

用于感染的酶疗法
                      发明领域
本发明涉及包含酶的组合物以及用所述酶作为抗感染药在治疗消化道感染或降低消化道感染危险方面的方法。
                      发明背景
在联合国经济和社会事务部人口处(the United Nations Departmentof Economic and Social Affairs Population Division)的1998年世界人口估计和计划修订本(Revision of the World Population Estimates andProjections)中，预计世界人口将于1999年达到60亿。报告还说明，世界人口从50亿增加到60亿仅用了12年，相比之下，世界人口从10亿增加到20亿却用了123年。到21世纪中期，计划人口会在73亿至107亿之间。最近十年间显著的人口增长部分是由于应用技术和集约化粮食生产措施导致的粮食生产的有效增加所致。对于将来的增长，需要粮食生产更有效的增加跟上增长。
一种使动物性食品生产更为有效的方法涉及在动物饲料中广泛使用抗微生物化学药品和抗生素。在大规模农场内，感染的传播在密集型生产条件下非常迅速。因此，通过预防性和治疗性应用这些物质来控制流行性疾病。例如，通常的做法是在动物饲料中掺入防治球虫感染的化学药品(例如，沙利霉素、莫能星、罗沙胂(3-硝基)、哈喹诺、卡巴多司和奥喹多司)以及抗微生物的抗生素(例如，杆菌肽、维吉霉素、泰洛星、四环素、金霉素、青霉素、竹桃霉素、新生霉素、林可霉素、班贝霉素、安普霉素、螺旋霉素、红霉素、新霉素等等)。众所周知这种做法可促进生长并提高饲料转化率。
在诸如金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、流感嗜血菌(Haemophilus influenza)、淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhoeae)和结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)的人类病原体中，多重抗生素抗性的增加已产生这样的担心：与家畜相关的微生物中发生的抗生素抗性可以通过可转移抗药性因子迁移至人类病原体中。有证据说明，喂以抗生素的动物是带有可转移抗药性因子的细菌源。参见Hooge，Feedstuffs 71(20)：59，1999。虽然动物和人类所用的抗生素一般不同，但是在可能产生交叉抗性的机理方面有相似性。在一种情况下，氟喹诺酮(fluroquinolone)被批准用以防治某些动物的大肠杆菌感染(大肠杆菌病)并且也用于人类医药中。Hooge，参见上文。最近，由于发生氟喹诺酮抗性弯曲杆菌并且转移到人，因此FDA/CVM已经建议取消在家禽中使用氟喹诺酮恩氟沙星的批准。参见Murhead，S. Feedstuffs72(45)：1-4，2000。
如果在饲料中禁止使用抗生素和抗微生物药，则肉品生产业也担心会造成损失并可能发生动物病的死灰复燃。例如，在1986年，瑞典禁止使用饲用抗生素后，动物病增加。这伴随增加使用治疗性抗生素，导致抗生素使用总体增加以及肉畜生产成本增加。参见Smith，Feedstuffs 71(13)：1，1999。1998年12月，欧洲部长级会议(EU Council ofMinisters)决定暂停使用正式批准为饲料生长促进剂非处方药中的六种抗微生物药(Official Journal of the European Communities29.12.98，Council Regulation No.2821/98 concerning Directive70/524)。由于人们担心肉制品中的残留物，两种基于喹喔啉的添加剂也于1999年8月被禁止使用。这些做法的结果是增加了包括以下正式消除病症的流行：肉用仔鸡坏死性肠炎；断奶仔猪中由于产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringens)引起的肠炎；猪痢疾和螺旋体性腹泻；和大肠杆菌相关腹泻。参见Miller，United States Animal Health Association，1999Proceedings“食品动物生产中的抗生素使用和抗性—欧洲前景(Antibiotic Usages in Food Animal Production and Resistance-EuropeanPerspective)”。
每年有30,000人由于在医院内感染抗性病原体而死亡，但是由于经食物传播的病原体引起的死亡却少得多。由经食物传播的病原体引起的死亡中没有一例与抗生素抗性有关(参见Smith，参见上文)。因而，并不清楚肉品生产业使用抗生素是否对人类医院内感染抗药性病原体的问题产生影响。另一担心是缺乏治疗抗性病原体感染的新型抗生素。参见Henry，C.M.，Chemical and Engineering News，2000年3月6日，第41-58页。这可能意味着，当发生重大抗生素抗性病原体时，可能没有有效治疗所述感染的新型抗生素。开发抗生素的困难、市场大小以及管理问题似乎都使大的制药公司不将其R&D集中到抗生素研制、尤其是用于动物的抗生素研制。对于注册动物用药物的新提出的规定如此之难，使得会停止研制动物用药物。参见Smith，参见上文。然而，已有数个小公司参与新型抗生素的研制(Henry，参见上文)。
在某些动物群体中，传染病已经大流行。例如，禽球虫病就是一种只能处理，而没有得到真正控制的疾病。事实上所有禽群都被感染，并且通常在饲料中轮换使用抗球虫病化学药品，以控制损失，限制抗性株的发生。球虫病使家禽生产者每年因损失和花在抗生素药物(例如沙利霉素)上的药品费用达$3.5亿。参见Suszkiw，USDA AgriculturalResearch Service News，1997年10月28日。截止1999年，据估计美国每年花费约$1.1亿用在抗球虫药上。参见Frost和Sullivan，U.S.Pharmaceutical Products for Food Animals，Report 5245-54，1995。
显然需要发现新的更为有效的方法，以防治采用集约农业技术培育的动物的消化道感染。这种需求基于获得更高生产效率，以便跟上快速膨胀的世界人口的需要。肠传染病防治的改进保证较快的生长率并提高饲料转化率。家畜生产中也需要代替抗生素的替代物，以解决人们担心人类病原体中可能发生抗生素抗性的问题。
当采用以不同于所有抗生素的方式操作的基于酶的疗法时，没有刺激抗性致病微生物(它们给人类健康带来问题)进化的危险。由于酶是蛋白质，因此不可能在肉制品中掺入危险性化学残留物，用某些抗生素和抗球虫病化学药品会发生这种情况。参见American Feed ContolOfficials Inc.，Official Publication，1999，“药物和饲料添加剂(Drugs andFeed Additives)，Section 30.0 Enzymes，”第206-217页，ISBN 1-878341-10-3。
                       发明概述
因此，本发明的一个目的是提供降低消化道感染影响的酶疗法。
本发明的另一个目的是提供通过干扰病原体与消化道细胞的结合降低消化道感染影响的机制。
就感染引起感染或坏死性肠炎的病原体的动物而论，本发明的又一个目的是提供提高增重和饲料转化率的方法。
本发明的再一个目的是提供一种适合于口服的剂型，所述剂型有效改善被微生物病原体感染或有被微生物病原体感染危险的受治疗者的病症。
在达到这些目的和其它目的的同时，按照本发明的一个方面，还提供一种包含以下组分的组合物：(i)一种切割影响细胞表面蛋白或糖类释放的键的酶，所述酶不是内-1，4--D-甘露聚糖酶，和(ii)一种所述酶的生理上可接受的载体，其中所述组合物为适合于口服的形式并且不含除所述酶以外的抗感染药。在一个实施方案中，所述酶切割影响细胞表面蛋白释放的键。
在一个优选的实施方案中，所述组合物中包括的酶是鞘磷脂酶或磷脂酶、尤其是C型或D型磷脂酶。在另一个优选的实施方案中，所述选自切割影响细胞表面蛋白或糖类释放的键的酯酶、脑苷脂酶和糖酶。在另一个实施方案中，由蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)菌株、优选ATCC 7004或ATCC 6464制备所述酶。或者，通过在巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)中表达编码所述酶的重组DNA获得所述酶。在另一个实施方案中，所述酶包含在明胶胶囊壳内，并且在所述组合物中用量为200IU/Kg-4000IU/Kg饲料。
按照本发明的另一方面，提供具有上述组分(i)和(ii)的组合物，其中所述生理上可接受的载体是在其中掺入所述酶的饲料。因此，所述组合物可以是不含除所述酶以外的其它抗感染药的动物饲料。本发明的动物饲料组合物还包含谷类物料(例如玉米、高粱、小麦、大麦或燕麦)、蛋白质源(例如菜豆或豌豆)和维生素、氨基酸和矿物质。
按照本发明的再一方面，本发明提供如上所述的为固体或液体剂型的组合物。
还提供治疗消化道感染或降低消化道感染危险的方法，所述方法包括给予患有所述感染或有患所述感染危险的受治疗者口服有效量的切割影响细胞表面蛋白或糖类释放的键的酶。其中所述酶不是内-1，4--D-甘露聚糖酶。另外，所述方法不包括给予除所述酶本身以外的抗感染药。所述感染可以由原生动物(例如艾美耳球虫属(Eimeria)和隐孢子虫属(Cryptosporidium))、细菌(例如梭菌属(Clostridium))、真菌或酵母病原体引起。
甚至还提供包含以下组分的组合物：(i)一种切割影响细胞表面蛋白或糖类释放的键的酶和(ii)一种所述酶的生理上可接受的载体，其中所述组合物为适合于口服的形式并且不含除所述酶以外的抗感染药。
还提供治疗消化道感染或降低消化道感染危险的方法，所述方法包括给予患有所述感染或有患所述感染危险的受治疗者口服有效量的切割影响细胞表面蛋白或糖类释放的键的酶，其中所述方法不包括与所述酶一起给予抗微生物有效量的另外的抗感染药。
根据以下详细描述，本发明的其它目的、特征和优点将变得显而易见。虽然指出了优选实施方案，但所给出的详细描述和具体实施例仅用于说明，因为根据该详细描述，在本发明的精神和范围内的各种变化和修改对于本领域技术人员是显而易见的。此外，所述实施例证明了本发明的原理，但不能期望具体描述本发明对于显然对本领域技术人员有用的所有的感染实施例的应用。
                       附图简述
图1显示由巨大芽孢杆菌菌株产生的重组PI-PLC酶的抗隐孢子虫活性。
                       发明详述
已经发现一类特定的酶在口服给药后显示出显著的抗生素活性，所述酶的特征在于切割影响细胞表面蛋白或糖类释放的键的能力，所述酶例如在治疗消化道感染时有效。所述酶类包括但不限于鞘磷脂酶和C型磷脂酶和D型磷脂酶以及有类似切割特异性的酶。因此，该类酶的示例是切割和释放通过连接于磷脂酰肌醇的键而锚定膜的糖蛋白或糖类的酶。因此，磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C(E.C.3.1.4.10)(也简称为PI-PLC或1-磷脂酰肌醇磷酸二酯酶)是该类中的一个成员。另一个实例是糖基-磷脂酰肌醇特异性磷脂酶D或GPI-PLD。Low和Prasad，Proc.Natl.Acad.Sci.85：980-984，1988。
已经描述了来源于真核生物的GPI-PLD和PI-PLC酶。参见Low，“通过特异性磷脂酶降解糖基-磷脂酰肌醇锚着点(Degradation ofglycosyl-phosphatidylinositol anchors by specific phospholipases)”，第二章，第35-63页，载于MOLECULAR AND CELL BIOLOGY OFMEMBRANE PROTEINS：GLYCOLIPID ANCHORS OF CELL-SURFACE PROTEINS，A.J.Turner(编辑)，Ellis Horwood，New York，1990；Low和Prasad，Proc.Natl.Acad Sci.85：980-984，1988；Essen等，Nature 380：595-602，1996和Essen等，Biochemistry 36：2753-2762，1997。已经描述了来源于原核生物的PI-PLC，包括由细菌胞外产生的PI-PLC。在PI-PLC已知的细菌源中有蜡样芽孢杆菌(Stein和Logan，J.Bacteriol.85：369-381，1963；Stein和Logan，J.Bacteriol.90：69-81，1965；Ikezawa等，Biochimica et Biophysica Acta 450：154-164，1976；Griffith等，Methods in Enzymology 197：493-502，1991；Volwerk等，J.Cell.Biochem.39：315-325，1989；和Kuppe等，J.Bacteriol.171：6077-6083，1989)、苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)(Ikezawa和Taguchi，Methods inEnzymology 71：731-741，1981；日本专利文件JP 55034039)、金黄色葡萄球菌(Low和Finean，Biochem J.162：235-240，1977)和诺氏梭菌(Clostridium novyi)(Taguchi和Ikezawa，Arch.Biochem.Biophys.186：196-201，1978)。
已经基于荧光底物设计出PI-PLC酶的改进酶测定技术。参见Hendrickson等，Biochemistry.31：12169-12172，1992；Hendrickson，Anal.Biochem.219：1-8，1994；Hendrickson等，Bioorg.Med. Chem.Letters.1：619-622，1991。
虽然不明确归于任何理论，但本发明强调PI-PLC酶有切割细胞表面蛋白的磷脂酰肌醇糖脂锚着点和其它糖基磷脂酰肌醇的能力。参见Low，参见上文；Low和Saltiel，Science 239：268-275，1988。例如，几种原生动物寄生虫的变异型表面糖蛋白和其它表面蛋白以及糖类被糖基-磷脂酰肌醇磷脂(GPI锚着点)锚定，并且对PI-PLC消化和释放敏感。说明性的物种属于血吸虫属(Schistosoma)、弓形体属(Toxoplasma)、疟原虫属(Plasmodium)、锥虫属(Trypanosoma)和利什曼原虫属(Leishmania)(Low，参见上文)以及艾美耳球虫属(Eimeria)、巴贝虫属(Babesia)、泰累尔梨虫属(Theileria)、贾第鞭毛虫属(Giardia)、细滴虫属(Leptomonas)和内阿米巴属(Entamoeba)。参见McConville和Ferguson，Biochemical J.294：305-324，1993；Pearce和Sher，J.Immunol.142：979-984，1989；Sauma等，Mol.Med.Biochem.Parasitol.46：73-80，1991；Hawn和Strand，Mol.Med.Biochem.Parasitol.59：73-82，1993。
看来细胞表面组分的这种锚定机制对于范围从酵母到哺乳动物的真核细胞而言是普遍存在的。被认为是非常原始的真核生物—兰氏贾第鞭毛虫(Giardia lamblia)体内存在GPI锚着点，表明这种锚着点很早在真核生物中进化。与这一了解相一致的是在古细菌中发现了一种新型甘油磷脂GlcNal-6-肌醇-P-二烷基甘油(Nishihara等，J.Biol.Chem.267：12432-12435)，它是已进化的更为复杂的真核生物GPI锚着点结构的基础。在原生动物中，使用GPI锚定系统比在高等真核生物中更为大量，有证据说明GPI-锚定结构对于寄生物在昆虫和哺乳动物宿主体内存活很重要(McConville和Ferguson，参见上文)。例如，变异型表面糖蛋白的频繁脱落可能是避免免疫系统攻击的机制。
原生动物柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)含有与布氏锥虫(Trypanosoma brucei)的糖蛋白/糖脂类似的磷脂酰肌醇锚定结构。认为这些结构对于膜附着以及后续感染很重要。参见Gurnett等，Mol.Med.Biochem.Parasitol.41：177-186，1990。艾美耳球虫属结构被锥虫脂酶和苏云金芽孢杆菌PI-PLC切割(Gurnett，参见上文)。用PI-PLC体内治疗寄生虫，如果证明切实可行的话，可能有助于宿主免疫系统并且干扰进入消化道的病原体的附着和感染。艾美耳球虫分布广，并且是养禽业费用大的问题。另一种原生动物寄生虫微小隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)分布广，并且在人类和许多动物中引起急性腹泻性疾病。基于DNA序列，预测子孢子蛋白GP15/45/60为GPI联蛋白，并且与该子孢子蛋白反应的单克隆抗体抑制感染(Strong，W.B.等，Infection and Immunity 68：4117-4134，2000；Cevallos，A.M.等，Infection and Immunity 68：4108-4116，2000)。因此，微小隐孢子虫是另一种可用PI-PLC潜在治疗的病原体。
原核细菌不含被磷脂酰肌醇锚定的表面糖蛋白和糖类(McConville和Ferguson，参见上文)，但是PI-PLC仍可能通过干扰附着过程来降低细菌感染。致病大肠杆菌和许多其它熟知的致病肠杆菌科(Enterobacteriaceae)表达细菌粘附素FimH，一种存在于菌毛远端的29kD甘露糖结合凝集素。Abraham等，Nature 336：682-684，1988。已经显示这种粘附素与肥大细胞的CD48，即GPI锚着分子结合。参见Malaviya等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96：8110-8115，1999。用PI-PLC体外消化，降低了突变型GPI锚着白喉毒素(来自白喉棒杆菌(Corynebacterium diphtheria))受体与鼠类NIH3T3细胞的结合。参见Lanzrein等，EMBO J.15：725-734，1996。另外，败毒梭菌(Clostridiumsepticum)α毒素和嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)气单胞菌溶素均借助于C末端GPI锚着点附着于细胞表面，并且可以通过用PI-PLC处理而从细胞表面去除。参见Gordon等，J.Biol.Chem.274：27274-27280，1999。
PI-PLC降低细菌感染影响的机制涉及从宿主肥大细胞释放CD48结合部位。此外，FimH与肥大细胞结合触发炎症反应。因而按照本发明，由于炎症反应涉及肿瘤坏死因子α的释放，因此减少结合部位也应该减少可能极度损害肠健康本身的炎症(Malaviya，参见上文)。因此，通过这种减少炎症和构成肿瘤坏死因子分泌的基础的机制，按照本发明进行磷脂酶处理，应该缓解特征性病症(例如过敏性肠综合征、结肠炎和局限性回肠炎)的症状。参见van Deventer，S.J.，Ann.Rheum.Dis.58(1)：I114-I120(1999年11月)。
针对病毒性感染，本发明也应该有效，由于它破坏病毒粒子和该病毒将体内感染的细胞之间的结合。根据本发明人的发现，本文中描述的口服给药是有效的，有趣的是，用磷脂酶C预处理流感病毒，引起约50％病毒磷脂的释放，导致显著减少鸡胚内的感染性。参见Mizutani等，Nature 204：781-782，1964。相反，用从产气荚膜梭菌中分离的磷脂酶C预处理培养的鸡胚成纤维细胞，显著抑制西门利启森林甲病毒(Semliki Forest Virus)对细胞的后续感染。参见Friedman和Pastan，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 59：1371-1378，1968。虽然当时本领域并没有认识到这些现象中的治疗意义，但事后认识到，它们与认为构成本发明基础的一种机制相一致，即病原体-表面配体和/或其相关的细胞膜受体的切割，中断了感染所必需的相互作用。
本发明在预防病毒性感染方面可能有效的另一种方式是消除了病毒GPI锚定蛋白与易感细胞的结合。对PI-PLC消化敏感的病毒GPI锚定蛋白的一个实例是登革病毒(Dengue Virus)NS1(非结构蛋白1)。参见Jacobs等，FASEB J14：1603-1610，2000。有多个作为病毒结合部位的宿主细胞GPI锚定蛋白的实例。这些实例包括结合GPI锚定CD55(衰变加速因子，DAF)的人艾可病毒(Echovirus)6、7、12和21以及肠道病毒(Enterovirus)70。参见Clarkson等，J.Virology 69：5497-5501，1995；Bergelson等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：6245-6248，1994；和Kamauchow等，J.Virology 70：5143-5152，1996。犬细小病毒(CanineParvovirus)(CPV)感染可以通过用PI-PLC预处理猫细胞来体外阻断。参见Barbis和Parrish，Brazilian J.Med.Biol.Res.27：401-407，1994。
推定对起始感染重要的某些细胞表面受体通过非GPI锚着点的机制附着于膜上。这些包括以下结构：例如胆固醇酯(Rostand和Esko，J.Biol.Chem.268：24053-24059，1993)、非磷酸化鞘糖脂(Karlsson，Ann Rev.Biochem 58：309-350，1989)和诸如磷脂酰乙醇胺和磷脂酰丝氨酸的其它磷脂。参见Sylvester，Infect.Immun.64：4060-4066，1996。
因此，由于上述原因，在按照本发明口服给药后，用对从细胞表面释放这些结构有活性的合适酯酶、脑苷脂酶、糖酶和磷脂酶靶向这样的结构，应该对治疗消化道感染具有有益的效应。
鉴于真核生物中的磷脂酰肌醇连接的表面蛋白的普遍性，需要给予酶来急性或预防性切下这种细胞表面蛋白和/或糖类的锚定键的本发明的治疗方法，，将发现可广泛应用于控制消化道的原生动物、细菌、真菌和病毒感染。为此，本发明的一个关键方面是证实可以口服给予作为抗感染药的一种酶，所述酶不仅在切除细胞表面组分中有活性，而且在体内也有效。值得注意的是，自1960年起一直就可以利用合适的代表性酶PI-PLC，但是迄今为止本方法还没有被提出过。
本发明的另一方面是应用如上所述的酶作为动物饲料制剂中的有效抗感染药，所述酶治疗消耗所述饲料的动物的消化道感染或降低所述消化道感染的危险。含有内-1，4--D-甘露聚糖酶的饲料制剂是已知的，并且有些报道已经提出甘露聚糖酶的抗真菌活性。参见WO00/21381(PCT/EP99/07835)和Kudo等，Experentia 48：227-281，1992。虽然已经广泛地讨论了在不含抗生素的饲料中酶应用的前景，但是在这些情况下，都是将甘露聚糖酶与已知的抗生素混合。Adams，Feed Mix(2000年特刊)，第16-18页。
因此，在本发明的一个方面，本发明涉及含有特征为上述切割活性的酶的组合物，包括饲料组合物，所述酶不是甘露聚糖酶，或更准确地说不是内-1，4--D-甘露聚糖酶，与例如针对甘露聚糖的酶的区别在于具有不同的切割特异性，如在ENZYME NOMENCLATURE 1992(Academic Press)(参见条目3.2.1.77、3.2.1.78、3.2.1.101、3.2.1.106、3.2.1.130和3.2.1.137)中所述。此外，本发明考虑了含有这种酶(包括甘露聚糖酶)、但不含其它抗感染药的组合物。
因此，按照本发明，可以用得自蜡样芽孢杆菌并将PI-PLC含量标准化的胞外酶制剂，在感染存在时在增重和饲料转化率方面产生非常显著的改善。这种结果是出乎人们所料的，因为蜡样芽孢杆菌是通常引起食物传染性胃肠炎和蜡样芽孢杆菌眼内炎的机会致病菌。
早期研究报道：将炭疽芽孢杆菌(B.anthracis)胞外酶或蜡样芽孢杆菌胞外酶注射到兔子体内，引起磷酸酶血症，甚至死亡。例如，参见Stein和Logan，J.Bacteriol.85：369-381，1963。因此，令人惊奇的是，按照本发明，对于由细菌性感染引起的疾病来说，得自引起胃肠炎的病原体的胞外酶会具有治疗效应。
蜡样芽孢杆菌合成各种各样的由磷脂酶C和鞘磷脂酶组成的胞外膜活性酶和溶细胞毒素，包括PI-PLC和蜡溶素(Cereolysin)AB。参见Gilmore，J.Bacteriol.171：744-753，1989。在上述酶制剂中，由蜡样芽孢杆菌产生的胞外磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C[E.C.3.1.4.10]被认为是一种有效成分。本发明的酶疗法有效地作为抑球虫剂和抗生素起作用。因此，本发明的疗法特别是在禁止目前使用的物质时是一种治疗消化道感染的有效的商业上有前途的方法。
如果不包衣，酶能够由于胃内的胃液而不可逆失活。美国专利第4,079,125号描述了改进的可供缺乏酶的哺乳动物摄入的包肠衣的含酶组合物。令人惊奇的是，将没有包衣的PI-PLC加入到动物饲料中导致有效治疗病原体性感染。
按照本发明的酶组合物最好配制为干燥的固体或液体口服组合物。这种组合物一般会包括稳定剂，例如缓冲剂、糖类和/或甘醇。按照本发明，适合于在片剂或胶囊中掺入的干燥的贮存稳定的酶制剂如下制备：例如可以通过冻干法，在含有惰性或糖载体的流化床干燥器中进行喷雾干燥，或利用结合成玻璃稳定剂的蒸发技术。参见Franks等，Biopharm.4：38-55，1991。另一种方法包括盐沉淀(例如硫酸铵沉淀)或溶剂沉淀(如用丙酮)，形成粉末，随后干燥并与载体混合。
某些糖类、特别是单糖、二糖和低聚寡糖是重要的成玻璃糖类。用作载体的示例性糖其中有木糖、果糖、葡萄糖、山梨糖醇和麦芽三糖，如Franks所述，参见上文。基于与所述酶的相容性、低吸湿倾向和有利的玻璃化转变曲线，选择糖载体。稳定剂海藻糖特别适用于生产环境温度稳定的生物制品。参见美国专利第4,891,319号；Roser，Biopharm.4(8)：47-53，1991；Colaco等，Bio/Technology 10：1007-1011，1992；Aldridge，Genetic Engineering News，1995年3月15日，第10-11页。
本发明的酶可以配制为液体，例如作为含有降低水活度并且稳定所述蛋白的山梨糖醇或甘油的糖浆。这种溶液通常在制药应用之前进行过滤除菌。
如上所述，一方面，本发明涉及作为饲料或食料组分的酶的传递。饲料主要由谷类物料、蛋白质源、维生素、氨基酸和矿物质构成。所述谷类物料通常包括玉米、高粱、小麦、大麦或燕麦。所述蛋白质源可以是例如菜豆或豌豆。示例性矿物质、氨基酸和维生素包括B12、A、泛酸、烟酸、核黄素、K、DL-甲硫氨酸、L-赖氨酸、氯化胆碱、叶酸、磷酸二钙、磺酸镁、硫酸钾、碳酸钙、氯化钠、亚硒酸钠、一氧化锰、碘酸钙、一氧化铜、氧化锌和D-活化的动物甾醇。
供饲料中使用，可以用盐水(例如，NaCl，15-18％ w/w)或降低浓缩产品中水活度并防止微生物生长的糖浆制备液体酶制剂。诸如苯甲酸钠、对羟基苯甲酸丙酯、山梨酸钠或山梨酸钾、以及棕榈酸抗坏血酸酯的其它饲料用防腐剂都是经批准的化学防腐剂的实例，所述防腐剂也可以用来防止制品中由于微生物生长引起的潜在变质。参见Association of American Feed Control Officials，Inc.，Official Publication2000，第18部分，“化学防腐剂”，第215-217页，ISBN 1-878341-11-1。这些防腐剂可以用自动喷雾技术通过制粒后大量稀释而应用于饲料。参见Fodge等，Feedstuffs，1997年9月29日。如果相容的话，这种液体制剂可以含有稳定性糖类，例如山梨糖醇或甘油。为提高转化率，可以包括作为饲料所需组分的材料，例如其它酶或热不稳定的维生素。
在饲料以非颗粒的粉料形式(即不经热处理)使用的情况下，本发明的酶可以作为干浓缩物提供，以供在饲料混合器中添加。这种干酶浓缩物如下制备：首先采用10Kd NMWC或其它合适的超滤器浓缩液体酶制剂，以达到高百分率的酶含量，然后与非常干的载体例如粗玉米粉、粗大豆粉或甚至批准用于饲料的惰性物质或不溶性盐掺混。参见Official Publication，American Feed Control Officials，参见上文，第582部分，“动物饲料中一般认为安全的物质”。
有多种技术可用来产生足以耐受某些饲料碾磨机制粒过程、同时在较低温度下保持足够的活性以在消化道内起作用的稳定的酶。众所周知修饰蛋白质结构，主要通过改变编码DNA序列，或者其次，通过化学修饰，可以使酶更稳定，以抵抗失活。在该方面的一个说明是应用酶晶体的化学交联。参见Collins等，Organic Process Research andDevelopment2(6)：400-406，1998。增加本发明酶稳定性的另一种方法需要通过诱变编码目的酶的基因来改变氨基酸，或获得可供改组的基因或基因的一部分。参见Crameri等，Nature 391：288-291，1998；Arnold，Nature Biotechnol.16：617-618，1998b；Zhao等，Nature Biotechnol.16：258-235，1998；Zhao和Arnold，Protein Eng.12：47-53，1999。突变和选择以使具有所需特性的酶“定向进化”也是切实可行的。例如，参见Giver等，Proc.Natl.Acad. Sci.USA 95：12809-12813，1998；Liao等，Proc.Nat’l. Acad. Sci.USA 83：576-580，1986；Cherry等，NatureBiotechnol.17：379-384，1999。
某些蛋白质的修饰(包括糖基化、PEG化(PEGylation)和琥珀酰化)也可以增强稳定性并改变最适pH，这些是可以使本发明中所用酶最优化的特征。因此，已知的方法可以在这方面用来制备经修饰的酶，以供按照实施例进行测试，以估计本发明疗法的适应性。
用于生产PI-PLC的一种有效方法是将蜡样芽孢杆菌基因克隆到巨大芽孢杆菌中。表达系统(Rygus和Hillen，Appl.Microbiol.Bacteriol.35：594-599，1991)利用得自巨大芽孢杆菌木糖调节子的元件(Rygus等，Arch.Microbiol.155：535-542，1991)，并可在市场上从BIO101 Corp.(Vista，California)获得。在用四环素抗性稳定化质粒中，在PI-PLC基因前导编码序列和巨大芽孢杆菌xylA基因的前三个氨基酸之间产生融合体，所述融合体受木糖效应阻抑蛋白调节。具有增强表达的该类型的菌株为生产按照本发明掺入到动物饲料中的商业上有用量的PI-PLC提供了一种切实可行的方法。
某些蜡样芽孢杆菌分离株产生诸如衣霉素的抗生素。参见Kamogashira等，Agric.Biol.Chem.52：859-861，1988。蜡样芽孢杆菌的另一分离株(ATCC 53522)在美国专利第4,877,738号和第5,049,379号中被描述为预防植物猝倒病和根腐病的生物防治药。认为这种作用是由于以下两种抗生素的作用引起的：名为“Zwittermicin”，一种396道尔顿线性氨基多元醇；和“抗生素B”，一种氨基糖苷。在下文详述的实施例中，通过排除酶制剂中可能的低分子量抗生素，消除涉及这两种抗生素的可能性。
具体地说，借助于一种10Kd分子量截止膜，浓缩无细胞发酵肉汤。含有大于10Kd的蛋白质的浓缩物用于进一步加工。诸如Handelsman描述的小分子量抗生素(参见上文)会通过该滤膜。而且，利用硫酸铵沉淀法沉淀溶液中的高分子量蛋白质，留下低分子量物质。将硫酸铵沉淀物重新溶解后，所得酶溶液对缓冲液透析，再一次处理以去除低分子量抗生素。最后，将所述蛋白质再用硫酸铵第二次沉淀，以去除溶液中任何余下的低分子量化合物。
这四种处理法的联合应用非常不利于下述的可能性：所观察到的抗生素效应是由于ATCC 6464或ATCC 7004产生的低分子量抗生素引起的。也用大肠杆菌试验菌株，测试发酵肉汤中存在的抗生素，但未检测到抗生素的活性。
参照以下说明性实施例，下文进一步描述了本发明。实施例1蜡样芽孢杆菌ATCC 6464和ATCC 7004冷冻储备培养物的制备
打开得自ATCC的装有冻干细胞的管形瓶，将冻干细胞接种到由10g/L Amberferm 4015(Red Star)、5g/L Amberex 695(Red Star)和5g/L氯化钠、pH 7.0构成的种子培养基中，于30℃生长。将原始培养物在LB肉汤琼脂板上划线接种，然后将所得单菌落接种到装有20mL种子培养基的250mL带挡板的摇瓶(Bellco)中，于30℃振荡培养。当培养物密度达到OD600读数为1.5时，加入无菌甘油至约10％ v/v，将装有1.8mL培养物的管形瓶于-80℃冷冻。实施例2培养蜡样芽孢杆菌ATCC 6464和ATCC 7004分离株用以生产磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C
两个Biostat C发酵罐(每个30升)，分批装入自来水中的以下物质组成的培养基：25g/L2号营养肉汤(Oxoid)，10g/L胰蛋白胨(Difco)，10g/L酵母提取物(Difco)和0.1mL/L Mazu DP10P Mod11消泡剂(BASF)。原始批料体积为9.5L，肉汤于121℃灭菌40分钟。灭菌后，将初始pH用氨气调至7.0。
在含500mL相同培养基的4升带挡板的摇瓶中，制备种子培养物用于接种，所述摇瓶带有抽气器连接件(Bellco)以及与连接件连接的硅氧烷管。将摇瓶在高压灭菌器中于121℃灭菌50分钟，然后用由ATTC寄出的样品(shipment)制备的1.8mL冷冻储用培养物(实施例1)接种前。将种子摇瓶培养物在可控环境震荡培养器(NBS G-25型)中以200RPM于30℃振摇培养5.5小时。接种前，ATCC 7004培养物的OD600为1.53，pH为6.58。ATCC 6464培养物的OD600为1.28，pH为6.79。
将500mL种子培养物接种到30-L发酵罐中并在以下条件下进行操作：温度30℃，混合RPM 600，气流10升/分钟，压力0.5巴。原始培养物的OD600为0.81。在6小时时，终止发酵，ATCC 7004的终OD600为22.1，ATCC 6464的终OD600为24.2。在不控制pH下进行发酵，ATCC 7004的终pH为8.17，ATCC 6464的终pH为8.13。进一步加工之前，从发酵罐中取出肉汤，将其冷却至8℃。
实际上用与所述两种ATCC蜡样芽孢杆菌分离株相同的方法，所述发酵罐再进行第二次发酵。在这种情况下，使用第6小时的种子培养物，OD600为2.86(ATCC7004)，OD600为1.98(ATCC 6464)，pH为6.69(ATCC 7004)，pH为6.65(ATCC 6464)。主发酵进行6.5小时，终OD600为35.9(ATCC 7004)，终OD600为33.6(ATCC 6464)。冷藏时的终pH为8.38(ATCC 7004)，终pH为8.47(ATCC 6464)。实施例3通过过滤去除细胞以及PI-PLC酶的浓缩
采用两个首尾相连的A/G Technology(UFP-500-K-6A)3mm中空纤维500,000分子量截止(500Kd NMWC)滤器，从4个发酵罐批料中每个批料取出并洗涤细胞。用蠕动泵以约2升/分钟，通过滤膜泵出冷却的肉汤，再循环回贮存器。将含所述酶的透过液收集到冰上冷却的贮存器中。将含细胞的肉汤原始体积约9升浓缩至约2升，此时用10mM Tris-HCl，pH8.5开始渗滤。在收集总体积约14升透过液后，终止细胞洗涤。
用两个首尾相连的A/G Technology(UFP-10-C-4XTCA)0.5mm中空纤维10,000分子量截止滤器(10Kd)，浓缩500Kd透过液(每个发酵罐约14升)。使用浓缩物再循环的相同泵送方法，只是弃去透过液。将得自每个发酵罐体积约500mL的终浓缩物用于下一个加工步骤。实施例4PI-PLC酶的进一步纯化和浓缩
将得自每种蜡样芽孢杆菌发酵的10Kd超滤浓缩物(实施例3)用硫酸铵调至80％饱和度，在冰上混合60分钟。将溶液在Sorvall GSA转子中以6000RPM离心15分钟。弃去上清液，将沉淀溶于最小体积的10mM Tris-HCl、0.2mM EDTA(pH 7.5)中，然后对同样缓冲液冷透析。
采用染料结合测定(BioRad)测量每种浓缩物中的蛋白质，采用基于HPLC的检测方法和荧光底物(Molecular Probes，Inc.，P-3764，1-芘丁基肌醇-1-磷酸，锂盐)，测定PI-PLC的水平(Hendrickson等，Bioorg.Med.Chem.Letters 1：619-622，1991)。下表1总结了测定数据，并根据对4种制剂中的每种制剂所得的纯度，预测了大致纯度和总酶量。酶制剂于-20℃冻藏待进一步加工。
                  表1.PI-PLC粗酶制剂的分析汇总
酶制剂   ATCC菌株编号  蛋白质mg/L   比活U/mg1  制剂中总蛋白(mg)   估计的纯度2％    按纯量计算的总PI-PLC(mg)
    1   7004   1.86   1.75   325    2.92     9.49
    2   6464   1.44   0.52   345    0.867     2.99
    3   7004   1.35   4.42   208    7.36     15.3
    4   6464   2.06   1.72   256    1.95     5.00
1U＝单位＝1微摩尔/分种。
2基于假定100％纯蛋白质的比活为60U/mg(Hendrickson，参见上文)。实施例5酶制剂应用于动物饲料之前的合并和浓缩
合并所述酶制剂1、2、3和4，总体积为675mL。缓慢加入硫酸铵(492g)，然后将溶液在冰上混合几分钟。将溶液离心，收集沉淀。将沉淀部分溶于最小量的20mM磷酸缓冲液(pH7.0)中。
所得溶液为70.9mL，密度1.057克/cc。测定的蛋白质浓度约为25.5mg/mL。测定的PI-PLC活性约为1.13U/mg，PI-PLC的估计纯度为1.88％。将全部溶液于-20℃冻藏，解冻后用于均匀处理200磅鸡饲料。实施例6蜡样芽孢杆菌PI-PLC基因的克隆和在巨大芽孢杆菌中表达
已经对编码磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C(PI-PLC)的基因进行了测序。参见Kuppe等，J.Bacteriol.171：6077-6083，1989。采用PCR技术，从蜡样芽孢杆菌(ATCC 6464)染色体DNA中克隆PI-PLC基因。使用巨大芽孢杆菌表达载体pMEGA(BIO 101，Vista，CA)。设计两种引物，即5’-GACTAGTAATAAGAAGTTAATTTTG-3’(引物1)和5’-CGGGATCCATATTGTTGGTTATTGG-3’(引物2)，其中引物-1中有一个SpeI位点，引物-2中有一个BamHI位点。
将经PCR扩增的PI-PLC基因连接到pMEGA的SpeI-BamHI位点中，产生质粒pCG682。在所述表达载体中的SpeI位点上，将PI-PLC蛋白与xylA基因产物的前三个氨基酸融合。PI-PLC基因的表达在xylA启动子的调节下进行。用摇瓶发酵评价巨大芽孢杆菌中磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C的产量。用0.2mL种子培养物接种含有10μg/ml四环素的LB肉汤(20mL)，于37℃在250rpm的摇床上培养。在OD600约为0.5时，加入5g/L D-(+)-木糖，以诱导xylA启动子。3小时后，通过离心收获上清液。根据荧光底物方法(Hendrickson等，Biochemistry 31：12169-12172，1992；Hendrickson，Anal.Biochem.219：1-8，1994)，使用1-芘丁基肌醇-1-磷酸底物(Molecular Probes，Eugene，OR)，并通过HPLC检测，测定磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C的活性。
                      表2.PI-PLC表达的测量
       试验材料    木糖添加   比活(单位/mg蛋白质)
细胞裂解液部分
  巨大芽孢杆菌/pCG682       -            0
  巨大芽孢杆菌/pCG682       +          0.436
  巨大芽孢杆菌/pCG682       -            0
  巨大芽孢杆菌/pCG682       +          0.365
发酵肉汤部分
  巨大芽孢杆菌/pCG682       -            0
  巨大芽孢杆菌/pCG682       +          4.087
  巨大芽孢杆菌/pCG682       -            0
  巨大芽孢杆菌/pCG682       +           4.56
这些数据说明，大多数PI-PLC位于胞外，并且仅在加入D(+)木糖后才表达(表2)。估计该重组菌株的生产率是(mg/L/OD)普通野生型菌株(如实施例2中培养的菌株)的生产力的至少15倍。实施例7用于PI-PLC生产的巨大芽孢杆菌的发酵
用实施例6中描述的巨大芽孢杆菌/pCG682通过发酵生产PI-PLC。用于种子和发酵阶段的培养基(PM)含有20g/L Amberferm 4015(Universal Flavors Bionutrients，Indianapolis，IN)、10g/L Amberex 695酵母提取物(Universal Flavors Bionutrients，Indianapolis，IN)、10g/L NZCase Plus(Quest International，Hoffman Estates，IL)、2.0g/L K2HPO4、0.1g/L MgSO4·7H2O和2.0g/L葡萄糖(最初(initially))以及12.5mg/L四环素。将pH调至7.5。
通过用冷冻种子管形瓶接种，以250RPM于30℃振摇，起始种子阶段(含500mL的2.8-L带挡板的摇瓶)。通过将在LB琼脂平板上生长的单菌落加到含20mL PM的250mL摇瓶中，制备种子管形瓶。于30℃生长至约1.0 OD600后，加入5mL 50％无菌甘油，混合，将溶液分装到2mL无菌塑料管形瓶中，于-60℃冷冻。
震荡培养9小时后，在生长至约1.2-1.8 OD600后，使用500mL种子瓶。用两个种子瓶接种装有50-L经蒸汽灭菌的相同培养基的60-L发酵罐。将四环素作为在40％乙醇中的1％溶液过滤除菌(0.2微米滤膜)，并且在除菌并冷却至30℃后加入。在发酵罐中，也在原始批料中添加0.1mL/L Mazu DF10PMOD11消泡剂(BASF，Gurnee，IL)，并且在发酵期间按需添加所述消泡剂以控制泡沫。第一发酵罐种子阶段的操作条件如下：压力0.5-2.5psig；温度30℃±0.5℃；搅拌200-450RPM；空气喷射25-50SLPM；溶解氧≥25％。用21.25％ H3PO4或5N NaOH将pH控制在6.9-8.1。当O.D600达到8-10时，用所述内容物接种装有425L相同培养基的600-L发酵罐。
600-L生产发酵罐的操作条件如下：压力0.5-2.5psig；温度30℃±0.5℃；搅拌100-300RPM；空气喷射250-500SLPM；溶解氧≥25％。用21.25％ H3PO4或5N NaOH将pH控制在6.9-8.1。当在5小时以及O.D600约为17耗尽原始葡萄糖时，开始送入木糖(经高压灭菌器于121℃预灭菌20分钟，由10 kgD-(+)-木糖和10升水组成)。D-木糖得自Varsal Instruments，New Jersey。所述送料最初以25mL/分钟开始，保持1.5小时，然后增加至43mL/分钟。第二速率保持到已经消耗所有加入的22.5升木糖。通过将喷射空气以50SLPM增加到高达500SLPM，以保持所述溶解氧。一旦气流为500SLPM时，则增加RPM。在20小时终止发酵。到17小时，累积7440U/L(按照实施例4定义的单位)。
采用Pall Filtron C10 Skid和4个CellFlo Microgon组件(0.2μm膜孔，直径1mm纤维，3.3m2)收获发酵肉汤。采用带有AG/TechnologiesSize 85 10K超滤膜的LT100 Pall Filtron Skid，浓缩0.2μm膜透过液。终浓缩物为10升体积，于-20℃冷冻。实施例8蜡样芽孢杆菌发酵肉汤不含抗生素活性
按照实施例2中所述方法进行蜡样芽孢杆菌(ATCC 7004)的发酵，只是初始体积增加至20升。用按照实施例3-5中所述方法制备的终发酵肉汤或部分纯化的PI-PLC，用大肠杆菌MG1655作为测试菌株进行抗生素存在的试验。根据杯蝶测定进行所述试验。参见Brantner，Pharmazie 52(1)：34-40，1997。在含有所述酶样品的杯周围没有观察到指示抗生素活性的透明带。实施例9用微量滴定板荧光测定分析PI-PLC
根据实施例4中所用的Hendrickson等(参见上文)的方法，开发PI-PLC的改进生化试验。底物4-甲基伞形基肌醇-1-磷酸N-甲基-吗啉盐得自Biosynth(Naperville，Illinois)。用Flouroscan II荧光微量滴定板读数器(得自MTX Lab Systems(Vienna，Virginia))监测反应。对于发酵肉汤或酶浓缩物的测定，在由10mM Tris-Cl、0.16％脱氧胆酸盐、0.8mM4-甲基伞形基肌醇-1-磷酸N-甲基-吗啉盐和经稀释的酶、pH8.0构成的黑色塑料微量滴定板上，进行200μL反应。如有需要将酶稀释液制成0.1％ BSA水溶液。于37℃跟踪反应达30分钟，以2分钟间隔读数，以观察从所述底物中释放的甲基伞形酮，激发在350nm，发射在450nm。
用荧光单位与甲基伞形酮的微摩尔关系计算每次所添加的酶溶液的量所生成的单位(微摩尔/分钟)。在pH8.0下反应是兼顾酶的最适pH和甲基伞形酮最大荧光的pH(pH10)。另外，在pH9.0和pH9.0以上，非酶促释放甲基伞形酮的速率变得显著。在该测定条件下，比活(单位/mg)比采用Hendrickson等(参见上文)的方法高约39.3倍。为了在动物饲养实验中测试功效，将采用该测定测量的单位换算成等同的Hendrickson单位，以利于与在运用该测定之前的最初试验进行比较。实施例10测定动物饲料中以有效量加入的PI-PLC
为了测定加入到动物饲料后的酶，包括用于所述测定的一个pH和测量荧光的另一个pH，设想了基于4-甲基伞形基肌醇-1-磷酸N-甲基-吗啉盐的PI-PLC测定(实施例9)的一个更为灵敏的变量。通过称量4g饲料，将其加到20mL含有0.1％脱氧胆酸的10mM Tris-Cl(pH7.5)中，制得20g/L饲料，从饲料试验材料中提取所述酶。浆料在NBS G-25摇床(New Brunswich Scientific)中在室温下以250RPM振摇1小时。将料浆在IEC Micromax微量离心机中用1.5mL微量离心管以13,000RPM离心。用0.1％ BSA(牛血清白蛋白)制备提取物的适当稀释液。从以10U/磅应用的饲料的提取的样品不进行稀释。
第一反应步骤--各管如下建立。也应该包括以1∶100或1∶200稀释的0.12U/mL PI-PLC(按照实施例4定义的单位)的标准品和空白。样品反应物应包箔避光，以保护所述底物。
20μL Tris-HCl，0.10M，pH6.0
40μL脱氧胆酸盐(0.8％)
40μLPI-PLC底物(4mM)
100μL酶
200μL/管的总反应物，25℃
在两个时间点(30分钟和60分钟)，每个反应取出0.1mL反应物。等份样品于65℃加热15分钟，以终止酶反应，然后在冰上冷却。最后，将样品在微量离心机中以12,000RPM离心5分钟。
荧光计读数--将120μL 0.10M Tris缓冲液(pH8.0)的Tris缓冲液加到黑色塑料板内的微量滴定孔中，然后按照实施例7中所述方法读数之前，加入80μL反应样品。减去本底对照水平。计算每分种荧光单位产生的速率。将荧光单位换算成反应产物的微摩尔数，计算每磅原始饲料提取的酶单位。实施例11用病原体攻击的鸡饲养试验
I.肉用仔鸡饲养试验I
用1日龄雄性肉用仔鸡开始进行第一组饲养试验。制备“幼雏饲料”的典型统一鸡饲料日粮，设计用以达到或超过the National ResearchCouncil’s NUTRIENT REQUIREMENTS FOR POULTRY(第9版，1994)，并以粉料饲喂。把鸡按4个处理组分别装进鸡笼(每只鸡占鸡舍面积12英寸×24英寸)中，每个处理组重复4次，每个鸡笼重复有6只鸡(表3)。全部21天试验期不限量供应水和饲料。用随机化区组设计将鸡指定到鸡笼以及将鸡笼指定到处理组。在试验开始之前，对所有的鸡笼、饲槽和饮水器进行消毒。用白炽灯连续光照(每天24小时)。然后在第1天和第21天测定体重。在第21天测量饲料消耗量。
第5天，通过经口管饲法，所有的鸡用200,000个堆型艾美耳球虫(Eimeria acervulina)卵囊/只鸡感染。第7天，通过饮用水，所有的鸡还用500,000个产气荚膜梭菌感染。在阴性对照(T1)中，没有进行感染治疗。在阳性对照(T2)中，在饲料中添加一种抗球虫药和一种抗生素。这是抗球虫病治疗药物Sacox(沙利霉素，60g/吨)和抗生素BMD-50(50g/吨)。对于治疗组T3和T4，从第5天开始，在经口管饲堆型艾美耳球虫的时候，使用野生型PI-PLC酶处理的饲料(按纯量计算约0.34克PI-PLC)。所有饲料都制成统一批料，然后分别用于添加抗生素(试验组T2)或酶(试验组T3和T4)。鸡体重分析结果示于表4中，饲料/增重计算示于表5中。
               表3.肉用仔鸡饲养试验I的实验疗法
试验组#   试验描述      试验材料   重复  鸡的只数/重复
   T1   阴性对照 无     4       6
   T2   阳性对照 抗球虫药和沙利霉素治疗     4       6
   T3    PI-PLC野生型 0.34g酶/吨(按纯量计算)     4       6
   T4    PI-PLC野生型 0.34g酶/吨(按纯量计算)     4       6
                       表4.第21天的平均体重(g)
重复                          处理
     T1      T2      T3      T4
1    323.00    341.67    377.83    366.67
2    326.67    321.33    383.83    361.17
3    299.33    337.33    378.83    361.33
4    211.67    254.00    374.33    403.40
平均值    290.17    313.58    378.71    373.14
统计学      b       b      a      a
S.D.    46.52     35.22     3.40     17.61
C.V.    16.03     11.23     0.90     4.72
         表5.活鸡体重校正的平均饲料转化率(0-21天)
重复                          处理
     T1      T2      T3      T4
1     1.486    1.569     1.407     1.445
2     1.562    1.532     1.423     1.421
3     1.524    1.562     1.432     1.406
4     1.760    1.462     1.438     1.404
平均值     1.583    1.531     1.425     1.419
统计学       b      b       a      a
S.D.     0.11     0.04      0.01     0.02
C.V.     6.68     2.78      0.82     1.17
在前面的两个表中，在一行中字母不同的平均值根据Duncan显著性检验有显著性差异(p＜0.05)。
II.肉用仔鸡饲养试验II
用1日龄雄性肉用仔鸡开始进行第二组饲养试验。设计的基础日粮超过the National Research Council’s Nutrient Requirements for Poultry(第9版，1994)，并以粉料制备以确保均一性。为了测试从天然来源蜡样芽孢杆菌制备的PI-PLC(野生型PI-PLC)或重组巨大芽孢杆菌制备的PI-PLC，对饲养至21日龄的雄性肉用仔鸡生产性能的影响，在盲法基础上，对随机化多层鸡笼进行研究。所述天然来源也含有其它胞外酶，但高度纯化由巨大芽孢杆菌制备的PI-PLC，然后用30KdNMWC膜通过超滤将其进一步纯化。鸡在8日龄时用禽球虫(200,000个堆型艾美耳球虫卵囊/只鸡，通过饮用水)攻击，在10日龄时用产气荚膜梭菌(100,000个/只鸡，通过饮用水)攻击。9个治疗组中的每个组(表6)具有10个重复或鸡笼。每个鸡笼装有6只疫苗接种的(新城疫-支气管炎混合疫苗(Newcastle-Bronchitis)，Mareks)Cobb×Cobb雄性肉用仔鸡，面积为0.40平方英尺/只鸡。死鸡(如果存在的话)在第8天后不用补充。在全部试验的试验期(第0天至第21天)，不限量饲喂粉状饲料。
所有的鸡从第0天至第7天饲喂不含抗生素的普通未经处理的基础粉状日粮。此后，从8-21日龄饲喂9种经处理的粉状日粮。基础饲料是含22％粗蛋白质和1400kcal/lb ME(代谢能含量)的典型肉用仔鸡幼雏饲料。
            表6.肉用仔鸡饲养试验II的实验疗法
   处理                试验项目  感染攻击1
    T1                   无     +
    T2    双水杨酸亚甲酯杆菌肽(BMD，50g/吨)和沙利霉素(Sacox，60g/吨     +
    T3     用巨大芽孢杆菌生产的重组PI-PLC(3U/lb)     +
    T4    用巨大芽孢杆菌生产的重组PI-PLC(10U/lb)     +
    T5    用巨大芽孢杆菌生产的重组PI-PLC(30U/1b)     +
    T6    用巨大芽孢杆菌生产的重组PI-PLC(90U/lb)     +
    T7   得自蜡样芽孢杆菌的PI-PLC(10U/lb)和其它胞外酶     +
    T8                   无     无
    T9     用巨大芽孢杆菌生产的重组PI-PLC(90U/lb)     无
1每只鸡在7日龄时通过饮用水龄给予200,000个堆型艾美耳球虫卵囊，然后每只鸡在10日龄时通过饮用水给予100,000个产气荚膜梭菌细菌。
                               表7.肉用仔鸡饲养试验II
      处理     1     2     3     4     5     6     7     8     9
      感染     +     +     +     +     +     +     +     -     -
      给药     -     +     -     -     -     -     -     -     -
   PI-PLC类型    Rec1    Rec1    Rec1    Rec1    Wt2    Rec1
     靶U/lb     -     -     3     10     30     90     10     -     90
   测量的平均U/lb   0.36    0.32    0.323    0.71    1.74    5.96    2.46    0.12    5.94
   第8-21天增重   309.72   333.83    324.24   324.78   320.64   328.29   298.98    326.12    338.8
    cd     ab     bc     ab     bc     ab     D     Ab     a
   第8-21天饲料转化率(校正的)    1.859    1.642    1.702   1.732    1.699    1.739   1.876    1.651    1.650
    c     a     ab     b     ab     b     C     A     a
   平均肠损害分值    1.447    0.833    1.120   1.133    0.842    0.808    1.267    0.983    0.847
    d     A     bc     bc     a     a     Cd     ab     a
1用巨大芽孢杆菌生产的重组PI-PLC。2得自蜡样芽孢杆菌的野生型PI-PLC。3PI-PLC的添加水平太低使得不能有效地提取并在该实验中测量到，似乎可作为自然本底值
在第一组试验中，当通过饮用水给予细菌感染(实施例11-I)时，根据所有标准，用蜡样芽孢杆菌生产的野生型PI-PLC也起作用，或优于沙利霉素+BMD疗法(表4-5)。在以上显示的使用重组PI-PLC的后一试验(实施例11-II，表7)中，以不同浓度加入的PI-PLC在降低肠损害分值和饲料转化率(T3-T6)和提高增重方面显示依赖于剂量的效应。另外，用90U/lb重组PI-PLC治疗，不用沙利霉素+BMD治疗，降低肠损害分值，并对饲料转化率和增重有正效应。得自蜡样芽孢杆菌的野生型PI-PLC在本试验中不能象相同浓度(10U/lb)的其重组对应物一样有效地起作用。
III.用酶PI-PLC和内-1，4--D-甘露聚糖酶的肉用仔鸡饲养试验III
为了测试PI-PLC和内-1，4--D-甘露聚糖酶(美国专利5,429,828)对饲养至21日龄的雄性肉用仔鸡生产性能的影响，用随机化Petersime多层鸡笼进行研究。鸡在8日龄时用禽球虫(75,000个堆型艾美耳球虫卵囊/只鸡和1,250个巨型艾美耳球虫(E.maxima)卵囊/只鸡，通过经口管饲法)攻击，并且在11、12和13日龄时用产气荚膜梭菌(每天经口管饲1mL含有108cfu/mL的新鲜培养肉汤)攻击。每个处理(表8)由8个重复或鸡笼构成，每个鸡笼关养14只马立克氏(Mareks)疫苗接种的Cobb×Cobb雄性肉用仔鸡(在第14天减至10只，由于从每个鸡笼取出了4只鸡用于损害评分所致)，面积为0.36平方英尺/只鸡。当死鸡被检测后，将其从鸡笼中取出，而不用补充。在全部试验的试验期(第0天至第21天)，不限量饲喂粉状饲料。
从0-21日龄饲喂粉状日粮。基础饲料是含22％粗蛋白质和1400kcal/lb ME的典型肉用仔鸡幼雏饲料。
               表8.肉用仔鸡饲养试验III的实验疗法
  处理   给药1   感染攻击3          PI-PLC    甘露聚糖酶2
    1     +       -             -        -
    2     +       -             -     100MU/T
    3     -       +             -        -
    4     -       +             -     100MU/T
    5     -       +   用蜡样芽孢杆菌生产的野生型PI-PLC(10U/lb) -
    6     -       +   用巨大芽孢杆菌生产的重组PI-PLC(30U/lb)        -
    7     -       +   用巨大芽孢杆菌生产的重组PI-PLC(10U/lb)     100MU/T
    8     -       +   用巨大芽孢杆菌生产的重组PI-PLC(30U/lb)     100MU/T
    9     +       +             -        -
   10     +       +   用巨大芽孢杆菌生产的重组PI-PLC(30U/lb)        -
1所述日粮含有双水杨酸亚甲酯杆菌肽(BMD，50g/吨)和沙利霉素(Sacox，60g/吨)。2100MU/T相当于每吨饲料的活性为100×106单位。3鸡在8日龄时用75,000个堆型艾美耳球虫卵囊/只鸡和1,250个巨型艾美耳球虫卵囊/只鸡通过经口管饲法攻击，并且在11、12和13日龄时用产气荚膜梭菌通过每天经口管饲含有108cfu/mL的新鲜肉汤培养物攻击。
为了比较所述疗法，根据平均鸡体重的差异调节饲料转化率。感染使AF/G(重量调节的饲料转化率)恶化约23％(0.147AF/G单位)。使用沙利霉素和BMD使AF/G完全恢复到正常水平，但在降低由感染引起的肠损害方面，这两种化学药品不比-甘露聚糖酶和PI-PLC的组合好。每吨100×106(100MU)单位-甘露聚糖酶或者单独使用或者与PI-PLC联合使用，部分克服了感染的有害结果，正如受感染对照所给出的AF/G降低方面65％-70％改善所证明的(参见T3对T1)。看来-甘露聚糖酶对由堆型艾美耳球虫引起的肠损害分值的降低大于对由巨型艾美耳球虫引起的肠损害分值的降低。用所述饲料中的PI-PLC治疗的受感染鸡达到AF/G的部分恢复，但仅33-41％的所述恶化得以克服。然而，两种PI-PLC均降低由任一艾美耳球虫引起的肠损害分值。在巨型艾美耳球虫的情况下，损害降低有统计学显著性。结果示于表9中。表9.用PI-PLC和内-1，4--D-甘露聚糖酶饲喂用堆型艾美耳球虫、巨
型艾美耳球虫和产气荚膜梭菌感染的鸡的肉用仔鸡饲养试验III
            处理描述          饲料消耗量         饲料转化率            增重     活重          损害分值
  I1   M2  β-甘露聚糖酶  PI-PLC     第0-21天     第8-21天    第0-21天    第8-21天    第0-21天    第8-21天    第0-21天       E.acer.      E.max.    重量AF/G3对处理1
  1   无   有    无    无    11.178ab     8.866a   1.433dc    1.446d    0.659a    0.540a    0.701a    0.00c   0.00c    1.433
  2   无   有    100MU/吨    无    11.230a     8.841a   1.402c    1.424d    0.678a    0.548a    0.720a    0.00c   0.00c    1.416
  3   有   无    无    无    10.497bcd     8.155bc   1.669a    1.704a    0.538d    0.429c    0.579d    1.38a   1.56a    1.579
  4   有   无    100MU/吨    无    10.787abc     8.435abc   1.501cd    1.536c    0.611bc    0.490b    0.652bc    1.16ab   1.44ab    1.465
  5   有   无    无  1X Rec10U/lb    10.456cd     8.228abc   1.560bc    1.591bc    0.594c    0.477b    0.653c    1.34a   1.19bc    1.512
  6   有   无    无  3X Rec30U/lb    10.266d     7.982c   1.572b    1.621ab    0.597c    0.483b    0.638c    1.16ab   1.13cd    1.526
  7   有   无   100MU/吨  1X Rec10U/1b    10.533abc     8.227abc   1.514bc    1.536c    0.598c    0.482b    0.639c    1.09b   1.25bc    1.469
  8   有   无   100MU/吨  3X Rec30U/lb    10.496bcd     8.156bc   1.516bc    1.562bc    0.601c    0.478b    0.643c    1.25ab   1.38abc    1.474
  9   有   有    无    无    11.060abc     8.685ab   1.423c    1.447d    0.650a    0.522a    0.692a    1.03b   0.88d    1.416
  10   有   有    无  3X Rec30U/lb    10.666abc     8.359abc   1.430c    1.444d    0.647ab    0.526a    0.688ab    1.03b   1.13cd    1.420
  1I＝感染。2M＝给药(沙利霉素(60g/吨)和BMD(50g/吨))。3AF/G＝重量调节的饲料转化率(处理1lbs第21天-处理Xlbs第21天)/3+(消耗的饲料/增重第0.21天)。PI-PLC单位为基于实施例4的单位。Hemicell MU＝百万个ChemGen单位。
IV.肉用仔鸡饲养试验IV
为了测试PI-PLC、甘露聚糖酶(美国专利5,429,828)和真菌甘露聚糖酶对饲养至21日龄的雄性肉用仔鸡生产性能的影响，在随机化Petersime多层鸡笼中进行研究。鸡在8日龄时用球虫(75,000个堆型艾美耳球虫卵囊/只鸡和1,250个巨型艾美耳球虫卵囊/只鸡，通过经口管饲法)攻击，并且在11、12和13日龄时用产气荚膜梭菌(每天经口管饲含有108cfu/mL的新鲜肉汤培养物)攻击。每个处理有8个重复或鸡笼。每个鸡笼最初关养14只马立克氏疫苗接种的Cobb×Cobb雄性肉用仔鸡(在第14天减至10只，由于取出4只鸡用以损害评分所致)，面积为0.36平方英尺/只鸡。不用补充鸡。在全部试验的试验期(第0天至第21天)，不限量饲喂饲料和水。从0-21日龄饲喂粉状日粮。治疗组1-16的基础饲料是含22％粗蛋白质和1400kcal/lb ME的典型玉米/大豆肉用仔鸡幼雏饲料。
下表10中概述的结果证明了将或者PI-PLC或者甘露聚糖酶加入到用两种禽球虫和产气荚膜梭菌感染的肉用仔鸡的饲料中的可再生产性收益，导致既提高增重又提高饲料转化率。重要的是，本研究说明，或者PI-PLC或者甘露聚糖酶，当与沙利霉素联合使用，但不与抗生素BMD联合使用(试验5和6)时，将生产性能基本上恢复至未感染试验(编号1和2)的水平。这提供了抗细菌作用的证据。在这种情况下，PI-PLC/沙利霉素的作用稍微优于甘露聚糖酶，甚至优于美国目前实施的联合加入BMD和沙利霉素用于受感染禽群的作用(试验4)。
                                        表10.肉用仔鸡饲养试验IV
试验 I1 E2 M3         损害分值         饲料转化率            增重     活重
  E.acer.     E.max.
    上      中    第0-21天    第8-21天    第0-21天    第8-21天    第21天
   1   -     -      -    0.00     0.00     1.652     1.694     0.527     0.427    0.565
   2   -     -     B/S    0.00     0.00     1.612     1.656     0.546     0.437    0.583
   3   +     -      -    2.44     2.31     1.813     1.909     0.394     0.296    0.432
   10   +     -      B    2.25     1.94     1.707     1.770     0.453     0.352    0.490
   7   +     -      S    1.00     1.09     1.709     1.719     0.458     0.368    0.496
   4   +     -     B/S    0.59     1.63     1.585     1.671     0.509     0.397    0.547
   16   +   PI-PLC      -    2.25     1.50     1.701     1.778     0.451     0.347    0.486
   9   +   PI-PLC      B    2.03     1.34     1.760     1.844     0.445     0.342    0.482
   6   +   PI-PLC      S    1.06     1.28     1.584     1.613     0.526     0.419    0.564
   12   +     Man.      -    1.97     1.34     1.803     1.849     0.433     0.338    0.483
   13   +     Man.5x      -    2.13     2.00     1.740     1.813     0.437     0.339    0.471
   8   +     Man.      B    2.09     1.34     1.707     1.772     0.448     0.348    0.486
   5   +     Man.      S    0.97     1.09     1.652     1.688     0.500     0.397    0.538
   11   +     Man.     B/S    0.78     1.16     1.622     1.666     0.502     0.390    0.540
1I＝感染：在8日龄时通过经口管饲法用75,000个堆型艾美耳球虫卵囊/只鸡和1,250个巨型艾美耳球虫卵囊/只鸡攻击，并且在11、12和13日龄时用产气荚膜梭菌通过经口管饲1mL含有108cfu/mL的新鲜肉汤培养物攻击。2E＝酶：PI-PLC＝用巨大芽孢杆菌生产的重组PI-PLC，以30U/lb(如实施例4中所定义的单位)加入；Man.＝迟缓芽孢杆菌(B.lentus)内-1，4--D-甘露聚糖酶(美国专利5,429,828)，以121MU/吨(百万个ChemGen单位/吨)或5x的506MU/吨加入。3M＝给药(B＝BMD(50g/吨)；S＝沙利霉素(60g/吨))。实施例12测定在体外外酶对活力和被堆型艾美耳球虫子孢子和柔嫩艾美耳球虫子孢子细胞侵袭的影响
通过公开的方法，制备堆型艾美耳球虫子孢子或柔嫩艾美耳球虫子孢子和培养的幼仓鼠肾(BHK)细胞。参见Augustine，Avian andPoultry Biology Reviews 11：113-122，2000。对于细胞的预处理，细胞培养物用按照表11中所述酶的稀释液覆盖，并于覆盖后5-45分钟检查形态变异。45分钟后，将单层培养物洗涤两次，然后用未处理的堆型艾美耳球虫子孢子或柔嫩艾美耳球虫子孢子接种。对于感染期间的施用，将子孢子悬浮于所述酶的适当稀释液中，立即接种到细胞培养物中。孵育45分钟后，将培养物固定，染色，然后对侵袭进行定量。
进行观察，以寻找子孢子或细胞由于酶处理引起的大体形态学方面的变异。在这些实验中所用的酶水平上，没有观察到形态变异。在两种酶处理方法后以及不进行酶处理，通过组织染色法和显微镜检术方法，测量培养细胞的子孢子侵袭。参见Augustine，参见上文。
表11中的数据显示，显著降低堆型艾美耳球虫或柔嫩艾美耳球虫子孢子侵袭的子孢子侵袭。得自蜡样芽孢杆菌胞外肉汤的相对不纯的PI-PLC酶制剂和在重组巨大芽孢杆菌肉汤中产生的非常纯的重组PI-PLC都在大多数实验中导致在统计学上显著降低侵袭。甚至在剂量约为蜡样芽孢杆菌野生型PI-PLC制剂的一半时，重组PI-PLC制剂仍有活性。因此，用所述酶预处理细胞，然后洗去所述酶，与在感染期间同时加入所述酶一样有效。然而，根据从饲料中提取的酶的经验，所述两个洗涤步骤可能没有去除所有的所述酶。
在感染前用酶预处理所述细胞的两个实验中，含有内-1，4--D-甘露聚糖酶的酶制剂也引起在统计学上显著地降低侵袭。这些阳性结果包括用各种类型的病原体进行的一组实验。因此，甘露聚糖酶也如蜡样芽孢杆菌PI-PLC制剂一样好地降低子孢子的体外侵袭。
表11.用和不用酶处理的堆型艾美耳球虫子孢子或柔嫩艾美耳球虫
            子孢子对BHK细胞的体外侵袭
          酶和浓度       细胞用酶预处理后洗涤       在感染期间应用酶
堆型艾美耳球虫子孢子     试验1     试验2    试验1    试验2
对照     22±1a     33±4a    50±4a    35±7a
得自蜡样芽孢杆菌的PI-PLC10.0403U/ml     15±1b     26±1ab    33±3b    25±2ab
得自重组巨大芽孢杆菌的PI-PLC20.261U/ml     14±1b     22±1b    16±2c    18±1bc
得自重组巨大芽孢杆菌的PI-PLC20.0261U/ml     18±1ab     26±1ab    36±3b     9±2c
内-1，4--D-甘露聚糖酶35100U/ml     16±1b     29±2ab     ND4      ND
柔嫩艾美耳球虫子孢子     试验1     试验2    试验1     试验2
对照     44±2a     26±4a    63±5a     42±4a
得自蜡样芽孢杆菌的PI-PLC10.0403U/ml     38±2b     21±2a   52±13ab     37±2ab
得自重组巨大芽孢杆菌的PI-PLC20.261U/ml     30±1c     15±0a    28±2b     39±4ab
得自重组巨大芽孢杆菌的PI-PLC20.0261U/ml       ND     17±1a    18±1c     29±1b
内-1，4--D-甘露聚糖酶35100U/ml     35±1b     19±5a   46±6ab       ND
侵袭计数以从1-3盖玻片/畸变测量的均数的均数±标准误报道(BHK细胞在培养皿内插入的盖玻片上生长)。具有不同上标的试组内的均数差异显著(P＜0.5或P＝0.5)1得自蜡样芽孢杆菌的胞外酶在磷酸缓冲盐水中透析，将单位按实施例4的方法标准化。2得自重组巨大芽孢杆菌的胞外酶在磷酸缓冲盐水中透析，将单位按实施例4的方法标准化。3得自迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)的甘露聚糖酶(美国专利5,429,828中所述)并且在磷酸缓冲盐水中透析，单位按照the ChemGen Corp.还原糖测定进行定义。4ND＝未测定的实施例13体外评价用于隐孢子虫属感染的PI-PLC
评价酶PI-PLC在浓度范围.001-30U/ml下的抗隐孢子虫活性和毒性，采用4日龄Madin-Darby犬肾(MDCK)细胞来进行。酶单位按照实施例4的方法定义，但按照实施例9的所述方法测定。所用的酶制剂来自重组巨大芽孢杆菌。感染后3小时开始处理，然后继续处理至48小时。
化学发光免疫测定。感染前，洗涤卵囊，然后将其悬浮于含有0.75％牛磺胆酸钠的DMEM基质中，于37℃孵育10分钟(You等，FEMSMicrobiol.Letters 136：251-256，1996；You等，J.Antimicrobial.Chemother.41：293-296，1998)。脱囊混合物用Ultraculture培养基稀释，迅速在含有100％铺满的MDCK细胞的平板内分散，在Ultraculture培养基中保持4天。在用PBS洗涤之前，将所述接种物与所述细胞一起孵育3小时，然后更换含有或不含试验酶的新鲜Ultraculture培养基。将平板在5％ CO2空气氛围下于37℃孵育48小时。培养物用PBS洗涤，然后用布安氏液固定。
固定平板用TBST缓冲液(20mM Tris-HCl(pH7.5)，150mM NaCl，0.05％ Tween-20)洗涤，然后用1％ BSA-TBST(含有1％牛血清白蛋白的TBST缓冲液)于25℃温和振摇下封闭30分钟。将兔抗微小隐孢子虫血清(1∶200稀释度)加样到所述平板内，然后孵育1小时。用TBST洗涤后，将样品依次与生物素标记的山羊抗兔IgG和辣根过氧化物酶标记的链霉抗生物素蛋白(工作稀释度，1∶1000，KPL Inc.，Gaithersburg，MD)一起孵育。增强鲁米诺(4-碘苯酚和过氧化氢，Aldrich Chemical Co.Inc.，Milwaukee，WI)用作底物。用ML3000发光计(Dynatech Lab.，Chantilly，VA)对平板读数，并且测定相对光单位(RLU)。用4个重复孔计算出RLU的均数，所有实验至少两个重复。
毒性分析。采用市售四氮唑染料还原测定(CellTiter 96；PromegaCorp.，Madison，WI，USA)对所述酶进行试验。简而言之，将下述各种酶浓度加到含有铺满MDCK细胞单层的96孔板内。每种稀释度用三个复份来评估。将酶在单层上于37℃和5％ CO2下孵育。在48小时时，将平板显色1小时，用ELISA板读出器于490nm读数。记录并分析结果。毒性百分率如下计算：将含有所述酶的平均OD减去不含所述酶的培养基对照的平均OD，然后除以所述培养基的OD，再乘以100。细胞毒性分值如下表所示进行指定。
                  毒性％    分值
                  0-5％       0
                  6-25％      1
                  26-50％     2
                  51-75％     3
                  76-100％    4
用3U/ml或更高浓度的所述酶观察到显著性毒性。所述酶在0.1-1U/ml范围内没有观察到显著性毒性(表12)。因此，在该浓度范围(1.0U/ml或更低)内进行一组实验，以测定所述酶的活性和所述酶的特异性。在第一组实验中，用脱囊子孢子感染MDCK细胞。孵育3小时后，洗涤细胞单层，以各种浓度添加所述酶，孵育48小时。如表13所示，所述酶在0.01-1U/ml范围内证明有抗隐孢子虫活性。在浓度1U/ml时达到约50％抑制(图1)。
  表12.用巨大芽孢杆菌制备的重组PI-PLC对
         MDCK单层细胞培养物的毒性
     浓度  毒性(95％CL)％   毒性分值
    10U/ml        83      4
      3        57      3
      1        13      1
     0.3        11      1
     0.1        10      1
          表13.重组PI-PLC酶对微小隐孢子虫感染的MDCK细胞
                          培养物的活性
    处理  单位/ml     抑制百分率  微量滴定板每孔隐孢子虫的平均数    95％CL
 感染3小时后     1    77.36      285.28     0.01
   0.3    77.26      286.5     0.04
   0.1    52.74      595.53     0.18
   0.03    27.62      912.15     0.22
   0.01    7.33      1167.78     0.09
   感染的     -      0      1260.18     0.09
  未感染的     -    100         0     0.02
进行第二组实验以评价酶的特异性。子孢子用各种浓度的所述酶处理45分钟，然后简单地洗涤。然后让经处理的子孢子感染未处理的宿主细胞，让其发育和繁殖48小时。在一个独立的实验中，将宿主细胞与各种浓度的所述酶一起孵育，洗涤，然后用未处理的子孢子感染。如下所示(表14)，用所述酶处理子孢子或宿主细胞导致部分抑制。在该浓度范围内没有观察到依赖于剂量的抑制。这可能是由于所述酶与宿主细胞或寄生虫细胞的孵育时间较短(45分钟)或者部分或不完全切割宿主/寄生虫受体所致。另外，其它宿主/寄生虫受体可能参与感染并且引起在所述宿主细胞内观察到的生长。
                     表14.子孢子或MDCK细胞的感染前处理
                        和对微小隐孢子虫感染性的影响
        处理   PI-PLC单位/ml    抑制百分率   微量滴定板每孔隐孢子虫的平均数   95％CL
  感染前处理的子孢子      1     67.27       412.40     0.02
    0.3     65.64       433.04     0.06
    0.1     57.40       536.80     0.03
    0.03     58.13       527.59     0.03
    0.01     56.98       542.15     0.01
 感染前处理的宿主细胞      1     68.76       393.64     0.12
    0.3     50.07       629.24     0.26
    0.1     63.82       455.88     0.19
    0.03     58.53       522.66     0.12
    0.01     56.84       543.85     0.10
       感染的      0       1260.18     0.09
      未感染的     100          0     0.02
实施例14体内评价用于隐孢子虫属感染的PI-PLC
采用免疫缺陷型SCID小鼠模型，评价所述酶的抗隐孢子虫功效。简而言之，通过用0.1％ BSA、PBS(pH 7.2)洗涤纯化卵囊(贮存＜6个月)，以去除重铬酸钾，制备卵囊接种物。SCID小鼠(4-5周龄)用106卵囊(IOWA品系)感染，然后如下所述进行处理。从所述小鼠收集粪便样品，通过不连续蔗糖纯化，如先前所述通过流式细胞术评价寄生虫荷载。参见Arrowwood等，J.Parasitol.81：404-409，1995。
                  表15.治疗性实验的治疗方案
   小鼠组别 A B C
    小鼠数 10 10 10
  接种物剂量 106 106 106
    化合物 PI-PLC PI-PLC 安慰剂
  剂量(mg/Kg) 90U/ml 30U/ml PBS
     途径 混入饲料给予 混入饲料给予 混入饲料给予
     频率 任意 任意 任意
小鼠颗粒饲料用或者含30U/lb或者含90U/lb PI-PLC的PBS或者PBS涂覆。所有小鼠不限量供食。感染后，小鼠立即接受饲料。每周收集两次粪便样品并称重。每天测量饲料的消耗量。通过注射各0.2cc的100mg/ml氯胺酮、100mg/ml赛拉嗪和0.9％ NaCl，让小鼠安乐死。
每只小鼠每天消耗的平均饲料和平均小鼠体重示于表16中。在3周内没有观察到饲料消耗量或体重的统计学显著性差异。
                 表16.小鼠的饲料消耗量和增重
     处理组  每只小鼠每天消耗的饲料(g)    体重(g)
   第3天           AVG     AVG
    A(90U/lb)           7.56     16.67
    B(30U/lb)           6.13     17.055
   C(PBS对照)           5.46     16.88
   第7天           AVG     AVG
       A           8.31     16.95
       B           8.51     16.91
       C           7.27     16.89
   第10天           AVG     AVG
       A           8.55     17.29
       B           7.93     17.08
       C           7.11     16.97
   第14天           AVG     AVG
       A           7.78     17.43
       B           8.06     17.62
       C           7.55     17.38
   第17天           AVG     AVG
       A           8.52     17.64
       B           8.53     17.84
       C           7.79     17.59
   第21天           AVG     AVG
       A           7.89     18.25
       B           8.22     18.62
       C           8.51     18.14
   第24天           AVG     AVG
       A           9.79     18.2
       B           8.3     18.63
       C           8.22     18.33
在感染后3周的功效。如表17所示，感染后3周、4周和4.5周收集来自处理组和对照组SCID小鼠的粪便样品，并且测定100微升样品内的隐孢子虫计数。如所示，用所述酶处理的小鼠证明寄生虫荷载降低。在处理组观察到寄生虫荷载(34-54％)。当采用ANOVA统计学分析评价时，这些降低中的某些有统计学显著性(以下所示并且符号标注)。所述酶表现出作为抗隐孢子虫治疗药物的潜力。较高剂量的所述酶或将所述酶更好地传递到感染部位可能增加其功效，并且可能在未来的实验得以论述。
                           表17.PI-PLC在体内降低粪便内隐孢子虫的功效
处理组     酶剂量(U/lb)     寄生虫荷载(卵囊/100μl)(SD)第21天   抑制百分率    寄生虫荷载(卵囊/100μl)(SD)第28天   抑制百分率    寄生虫荷载(卵囊/100μl)(SD)第31天   抑制百分率
 PI-PLC     90     22.7(11.4)   44.0    26.3(14)*   48.9     87.5(52.9)   34.0
 PI-PLC     30      16.2(4.7)   52.0    23.4(11)*   54.6     74.3(89.7)+   40.0
  PBS(对照)     -      33.5(16.2)     -    50.4(29)     -     132.1(89.)     -
*P值为显著性，0.05或更低。+P值为0.08或更低。实施例15证实生长试验所用的酶
如实施例10所述，分析从用于上述动物试验的饲料中提取的PI-PLC。结果概述于表18-19中。
              表18.隐孢子虫研究，小鼠饲料
处理   对照       30U/lb      90U/lb
靶U/lb     0         30        90
PI-PLC类型     -  得自巨大芽孢杆菌的重组体  得自巨大芽孢杆菌的重组体
PI-PLC批号     -      45-46SF      45-46SF
提取的分析物U/lb     0        22.8       66.1
提取的靶％     -        76.0       73.4
从饲料中提取的效率随饲料类型显著变化。从小鼠饲料的提取显示出73.4％-76％效率(表18)。总在三个不同地点制备的鸡饲料的三种不同的制剂中小心加入45U/lb或180U/lb重组PI-PLC，由于所述负荷水平在实施例9的连续分析方法的范围内，因此采用实施例9的分析方法立即对其进行提取和测定(表19)。
                                         表19
                       从不同来源的鸡饲料和玉米粉提取的效率试验
                                  鸡饲料的来源
       来源1       来源2       来源3       来源4
    负荷水平单位/Lb     180    45   180   45   180   45   180    45
 所提取的单位/lb     128    9.3   53.2   3.66   82.7   8.46   134.4    33
 所提取的加入单位的百分率     71.1    20.7   29.6   8.1   45.9   18.8   74.7    73.3
可以看出，从玉米粉提取的效率与从小鼠饲料提取的效率相似。然而，在本实验以及其它实验中，某些鸡饲料样品的提取较差。
在如表20所示的试验中，可提取的酶约为理论PI-PLC的30-45％，而β-甘露聚糖酶较容易提取，得率约为100％。用上述所示的提取试验，约45％提取是用上述饲料观察到的提取的最佳水平。因而，表20试验的饲料提取的U/lb的分析结果在所用负荷的预期范围内。
                                 表20.对肉用仔鸡饲养试验III的酶负荷的验证
处理编号     1     2     3     4     5     6     7     8    9    10
感染     -     -     +     +     +     +     +     +    +    +
给药     +     +     -     -     -     -     -     -    +    +
靶单位/lb     0     0     0     0    10     30    10    30    0    0
PI-PLC类型     -     -     -     -    WT    Rec    Rec    Rec    -   Rec
                                   PI-PLC的分析单位/lb
平均单位/lb   0.94   0.76   0.79    0.7   3.08   11.48   4.56   10.18   9.49
靶百分率     -     -     -     -   30.75   38.27   45.57   33.93   31.46
靶MU/吨     -    100     -    100     -     -    100    100    -     -
Hemicell甘露聚糖酶     -     +     -     +     -     -     +     +    -     -
                                  甘露聚糖酶的分析MU/吨
MU/吨     -  124.9     -   135.5     -     -   153.5   172.0    -     -
靶百分率     -  124.9     -   135.5     -     -   153.5   172.0    -     -
为了说明本发明，已经描述了某些代表性实施方案和细节，但显而易见的是，本领域技术人员可以在不偏离本发明范围的情况下在其中进行各种变化和修改。

Claims (61)

1.一种组合物，所述组合物包含(i)一种切割影响细胞表面蛋白或糖类释放的键的酶，所述酶不是内-1，4--D-甘露聚糖酶，和(ii)一种所述酶的生理上可接受的载体，其中所述组合物为适合于口服的形式。
2.权利要求1的组合物，其中所述酶切割影响细胞表面蛋白释放的键。
3.权利要求1的组合物，其中所述组合物不含除所述酶以外的抗感染药。
4.权利要求1的组合物，其中所述组合物是一种饲料。
5.权利要求4的组合物，其中所述饲料组合物不含除所述酶以外的抗感染药。
6.权利要求1的组合物，其中所述酶选自鞘磷脂酶和磷脂酶。
7.权利要求6的组合物，其中所述酶是C型磷脂酶或D型磷脂酶。
8.权利要求7的组合物，其中所述酶是磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C。
9.权利要求1的组合物，其中所述酶选自切割影响细胞表面蛋白或糖类释放的键的酯酶、脑苷脂酶和糖酶。
10.权利要求1-9中任一项的组合物，其中所述载体是一种在其中掺入所述酶的食料。
11.权利要求10的组合物，其中所述食料是一种由谷类物料、蛋白质源、维生素、氨基酸和矿物质组成的动物饲料。
12.权利要求11的组合物，其中所述谷类物料是玉米、高粱、小麦、大麦或燕麦。
13.权利要求11的组合物，其中所述蛋白质源是菜豆或豌豆。
14.权利要求1-9中任一项的组合物，其中所述组合物为固体制剂或液体制剂。
15.权利要求1-9中任一项的组合物，其中所述酶包含在明胶胶囊壳内。
16.权利要求1的组合物，其中所述酶从蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)菌株制备。
17.权利要求16的组合物，其中所述蜡样芽孢杆菌菌株是ATCC7004或ATCC6464。
18.权利要求1的组合物，其中所述酶通过重组DNA在宿主生物中表达来获得。
19.权利要求18的组合物，其中所述宿主生物来自巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)菌株。
20.权利要求1的组合物，其中所述酶用量为200IU/Kg-4000IU/Kg饲料。
21.一种治疗消化道感染或降低消化道感染危险的方法，所述方法包括口服给予患有所述感染或有患所述感染危险的受治疗者有效量的切割影响细胞表面蛋白或糖类释放的键的酶，其中所述酶不是内-1，4--D-甘露聚糖酶。
22.权利要求21的方法，其中所述酶切割影响细胞表面蛋白释放的键。
23.权利要求21的方法，其中所述方法不包括给予除所述酶以外的抗感染药。
24.权利要求21的方法，其中所述感染由原生动物、细菌、酵母或真菌病原体引起。
25.权利要求24的方法，其中所述感染由艾美耳球虫属(Eimeria)的原生动物病原体引起。
26.权利要求24的方法，其中所述感染由隐孢子虫属(Cryptosporidium)的原生动物病原体引起。
27.权利要求24的方法，其中所述感染由梭菌属(Clostridium)的细菌病原体引起。
28.权利要求21的方法，所述方法包括口服给予所述受治疗者来自蜡样芽孢杆菌菌株的一种胞外酶制剂。
29.权利要求28的方法，其中所述蜡样芽孢杆菌菌株是ATCC7004或ATCC 6464。
30.权利要求21的方法，其中所述酶通过重组DNA在宿主生物中表达来获得。
31.权利要求30的方法，其中所述宿主生物来自巨大芽孢杆菌菌株。
32.一种组合物，所述组合物包含(i)一种切割影响细胞表面蛋白或糖类释放的键的酶和(ii)一种所述酶的生理上可接受的载体，其中所述组合物为适合于口服的形式，并且所述组合物不含除所述酶以外的抗感染药。
33.权利要求32的组合物，其中所述载体是一种在其中掺入所述酶的食料。
34.权利要求33的组合物，其中所述食料是一种由谷类物料、蛋白质源、维生素、氨基酸和矿物质组成的动物饲料。
35.权利要求34的组合物，其中所述谷类物料是玉米、高粱、小麦、大麦或燕麦。
36.权利要求34的组合物，其中所述蛋白质源是菜豆或豌豆。
37.权利要求32的组合物，其中所述组合物为固体制剂或液体制剂。
38.权利要求32的组合物，其中所述酶包含在明胶胶囊壳内。
39.权利要求32的组合物，其中所述酶是一种半纤维素酶。
40.权利要求39的组合物，其中所述半纤维素酶是甘露聚糖酶。
41.权利要求40的组合物，其中所述甘露聚糖酶是名为ATCC55045的迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)产生的内-1，4-β-D-甘露聚糖酶。
42.权利要求32的组合物，其中所述酶选自鞘磷脂酶和磷脂酶。
43.权利要求42的组合物，其中所述酶是C型磷脂酶或D型磷脂酶。
44.权利要求43的组合物，其中所述酶是磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C。
45.权利要求32的组合物，其中所述酶选自切割影响细胞表面蛋白或糖类释放的键的酯酶、脑苷脂酶和糖酶。
46.一种治疗消化道感染或降低消化道感染危险的方法，所述方法包括口服给予患有所述感染或有患所述感染危险的受治疗者有效量的切割影响细胞表面蛋白或糖类释放的键的酶，其中所述方法不包括与所述酶一起给予抗微生物有效量的另一抗感染药。
47.权利要求46的方法，其中所述感染由原生动物、细菌、酵母或真菌病原体引起。
48.权利要求47的方法，其中所述感染由艾美耳球虫属的原生动物病原体引起。
49.权利要求47的方法，其中所述感染由隐孢子虫属的原生动物病原体引起。
50.权利要求47的方法，其中所述感染由梭菌属的细菌病原体引起。
51.权利要求46的方法，所述方法包括口服给予所述受治疗者来自蜡样芽孢杆菌菌株的一种胞外酶制剂。
52.权利要求51的方法，其中所述蜡样芽孢杆菌菌株是ATCC7004或ATCC 6464。
53.权利要求46的方法，其中所述酶通过重组DNA在宿主生物中表达来获得。
54.权利要求53的方法，其中所述宿主生物来自巨大芽孢杆菌菌株。
55.权利要求46的方法，其中所述酶是一种半纤维素酶。
56.权利要求55的方法，其中所述半纤维素酶是甘露聚糖酶。
57.权利要求56的方法，其中所述甘露聚糖酶是名为ATCC55045的迟缓芽孢杆菌产生的内-1，4-β-D-甘露聚糖酶。
58.一种口服剂型的切割影响细胞表面蛋白或糖类释放的键的酶的应用，用来治疗消化道感染或降低消化道感染危险，其中所述酶不是内-1，4--D-甘露聚糖酶。
59.一种切割影响细胞表面蛋白或糖类释放的键的酶的应用，用来生产治疗消化道感染或降低消化道感染危险的口服剂型的药物，其中所述酶不是内-1，4--D-甘露聚糖酶。
60.一种口服剂型的切割影响细胞表面蛋白或糖类释放的键的酶的应用，用来治疗消化道感染或降低消化道感染危险，其中所述酶不与抗微生物有效量的另一抗感染药一起给予。
61.一种切割影响细胞表面蛋白或糖类释放的键的酶的应用，用来生产治疗消化道感染或降低消化道感染危险的口服剂型的药物，其中所述酶不与抗微生物有效量的另一抗感染药一起给予。
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