CN106318925A - 利用枯草芽孢杆菌高效表达pi‑plc基因的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种利用枯草芽孢杆菌高效表达磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C(PI‑PLC)基因的方法，所述方法包括：将SEQ ID No：1所示序列与pBE980a质粒连接，构建得到重组表达载体转化至大肠杆菌EPI400中，筛选阳性克隆转化至枯草芽孢杆菌中，获得重组基因工程菌进行诱导培养，于培养液中获得转化后的磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C。本发明构建了磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C(PI‑PLC)的枯草芽孢杆菌表达系统，成功实现了PI‑PLC基因在枯草芽孢杆菌中的异源高表达，为后续PI‑PLC的批量生产奠定了基础。

Description

利用枯草芽孢杆菌高效表达PI-PLC基因的方法

(一)技术领域

本发明涉及利用枯草芽孢杆菌高效表达磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C(PI-PLC)基因的方法。

(二)背景技术

磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C(PI-PLC)的种类很多，在细菌、原生动物、酵母、霉菌、植物、昆虫和哺乳动物中均存在。在各个领域均有应用：医药领域，主要作为疫苗用于预防各种病原菌的感染；食品领域，多用于面包烘培、奶制品加工、保健食品等；工业领域，主要用于油脂精炼、磷脂改性、动物饲料添加剂等。

鸡球虫病发病率高(50～70％)，致死率高(50～80％)，严重危害养殖业，每年因球虫病造成的损失高达数十亿美元。现有鸡球虫病防治，主要依靠化学药物，但存在耐药性、药物残留等不足，若采用接种疫苗方式进行防治，又存在风险较大、且研发困难的不足，而采用抗生素或中草药，也存在耐药性的问题，且效果一般。因此，亟需寻找一种新的抗球虫药物替代化学药物来有效控制鸡球虫病。

细菌PI-PLC可裂解细胞膜表面糖基锚定蛋白，从而影响细胞膜表面上糖蛋白及碳水化合物的释放，而球虫等大多数致病性寄生虫细胞膜表面抗原都是通过糖基锚定在细胞上的，PI-PLC能切断锚定蛋白中肌醇磷脂与细胞膜的连接，使寄生虫丧失入侵宿主细胞和在宿主细胞内增殖的能力，因此PI-PLC显示出显著的抗球虫感染特性。

PI-PLC的抗球虫机理为新型抗球虫药的开发提供了理论基础。PI-PLC降低了球虫因耐药性加剧而爆发的风险，避免养殖业因球虫病复 发而造成的重大损失。PI-PLC广泛分布于动植物以及微生物的体内，本身就参与机体细胞的代谢和信息交流，不存在产生耐药性及药物残留等问题。具有安全、无毒害作用。通过微生物异源表达，可以大量生产PI-PLC，降低抗球虫药的使用成本。

(三)发明内容

本发明目的是提供利用枯草芽孢杆菌高效表达磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C(PI-PLC)基因的方法。

本发明采用的技术方案是：

一种利用枯草芽孢杆菌高效表达磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C(PI-PLC)基因的方法，所述方法包括：将SEQ ID No：1所示序列与pBE980a质粒连接，构建得到重组表达载体转化至大肠杆菌EPI400中，筛选阳性克隆转化至枯草芽孢杆菌中，获得重组基因工程菌进行诱导培养，于培养液中获得转化后的磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C。

SEQ ID No：1序列如下：

5’-gcgtcaagcgtgaacgaactggaaaattggagcaaatggatgcaaccgattcctgattcaatcccgcttgcgcgtattagcatccctggcacgcatgactctggaacatttaaattgcaaaacccgatcaaacaggtttggggcatgacacaagaatacgattttcgttatcagatggaccatggtgctcggatttttgatatcagaggccgcttaacggatgacaatacaatcgttttgcatcatggaccgttgtacttgtacgtgacgttgcatgaatttatcaacgaagcgaaacagtttttgaaagataacccttcagaaacaatcatcatgagcttgaaaaaagaatacgaagatatgaaaggcgctgaagactctttttcttccacgtttgagaaaaaatactttgtcgatcctatctttctgaaaacagaaggaaacatcaaacttggagacgccagaggtaaaattgtactgcttaaacgctattctggttccaacgaaccgggcggatacaacaacttttactggcctgataacgaaacgtttacaacgacagtgaatcaaaacgcaaatgttacagtgcaggataaatacaaagtctcctacgacgaaaaagtaaaaagcatcaaagatacgatggacgaaacaatgaataactctgaagatctgaaccatctttacatcaactttacgtcactttcaagcggtggcacagcttggaattctccgtattactatgcctcctacatcaaccctgaaatcgcaaactacatcaaacagaaaaatccggcacgcgtcggatgggtaatccaggattatattaatgaaaaatggagcccgttactgtatcaagaagtcatcagagcaaataaatccttaatcaaagaataa-3’。

最终表达的序列如下：

gcgtcaagcgtgaacgaactggaaaattggagcaaatggatgcaaccgattcctgattcaatcccgcttgcgcgtattagcatccctggcacgcatgactctggaacatttaaattgcaaaacccgatcaaacaggtttggggcatgacacaagaatacgattttcgttatcagatggaccatggtgctcggatttttgatatcagaggccgcttaacggatgacaatacaatcgttttgcatcatggaccgttgtacttgtacgtgacgttgcatgaatttatcaacgaagcgaaacagtttttgaaagataacccttcagaaacaatcatcatgagcttgaaaaaagaatacgaagatatgaaaggcgctgaagactctttttcttccacgtttgagaaaaaatactttgtcgatcctatctttctgaaaacagaaggaaacatcaaacttggagacgccagaggtaaaattgtactgcttaaacgctattctggttccaacgaaccgggcggatacaacaacttttactggcctgataacgaaacgtttacaacgacagtgaatcaaaacgcaaatgttacagtgcaggataaatacaaagtctcctacgacgaaaaagtaaaaagcatcaaagatacgatggacgaaacaatgaataactctgaagatctgaaccatctttacatcaactttacgtcactttcaagcggtggcacagcttggaattctccgtattactatgcctcctacatcaaccctgaaatcgcaaactacatcaaacagaaaaatccggcacgcgtcggatgggtaatccaggattatattaatgaaaaatggagcccgttactgtatcaagaagtcatcagagcaaataaatccttaatcaaagaataa

其编码的氨基酸序列为：

assvnelenwskwmqpipdsiplarisipgthdsgtfklqnpikqvwgmtqeydfryqmdhgarifdirgrltddntivlhhgplylyvtlhefineakqflkdnpsetiimslkkeyedmkgaedsfsstfekkyfvdpiflktegniklgdargkivllkrysgsnepggynnfywpdnetftttvnqnanvtvqdkykvsydekvksikdtmdetmnnsedlnhlyinftslssggtawnspyyyasyinpeianyikqknparvgwviqdyinekwspllyqevirankslike(其中下划线所示为载体上的信号肽)

具体的，所述方法如下：

(1)表达载体构建：以SEQ ID No：2所示PI-PLC基因为模板，以P1/P2为引物进行PCR扩增：

引物P1：5’-GCCAAGCTTGCGTCAAGCGTGAAC GAACTGGAAAATTGG-3’；

引物P2：5’-GCCGGATCCTTACCCATCCGACGCGTGCCGGATTTTTCTGTT-3’；

(2)步骤(1)酶切、回收的目的基因与pBE980a质粒连接，得到重组表达载体pBE980a PI-PLC；

(3)重组表达载体pBE980a PI-PLC转入大肠杆菌EPI400感受态细胞，筛选获得阳性克隆；EPI400电转感受态细胞可以显著降低各种常见的载体的拷贝数,这样就可以更容易地克隆不稳定的DNA序列。EPI400感受态细胞在制备质粒时需要加入L-阿拉伯糖进行诱导，接菌培养时按照2mmol/L的浓度加入L-阿拉伯糖。

(4)步骤(3)阳性克隆电转化至枯草芽孢杆菌感受态细胞，筛选阳性克隆，获得重组基因工程菌；

(5)重组基因工程菌在含有10ug/ml卡那霉素的LB液体培养基中培养48h以上，于培养基上清液获得PI-PLC。

所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌WB600或枯草芽孢杆菌WB800。

SEQ ID No.2序列如下：

5’-ATGTCTAACAAAAAACTTATCCTGAAATTATTTATCTGCTCCACAATCTTTATTACATTTGTCTTTGCTCTGCATGACAAACGGGTGGTTGCAGCGTCAAGCGTGAACGAACTGGAAAATTGGAGCAAATGGATGCAACCGATTCCTGATTCAATCCCGCTTGCGCGTATTAGCATCCCTGGCACGCATGACTCTGGAACATTTAAATTGCAAAACCCGATCAAACAGGTTTGGGGCATGACACAAGAATACGATTTTCGTTATCAGATGGACCATGGTGCTCGGATTTTTGATATCAGAGGCCGCTTAACGGATGACAATACAATCGTTTTGCATCATGGACCGTTGTACTTGTACGTGACGTTGCATGAATTTATCAACGAAGCGAAACAGTTTTTGAAAGATAACCCTTCAGAAACAATCATCATGAGCTTGAAAAAAGAATACGAAGATATGAAAGGCGCTGAAGACTCTTTTTCTTCCACGTTTGAGAAAAAATACTTTGTCGATCCTATCTTTCTGAAAACAGAAGGAAACATCAAACTTGGAGACGCCAGAGGTAAAATTGTACTGCTTAAACGCTATTCTGGTTCCAACGAACCGGGCGGATACAACAACTTTTACTGGCCTGATAACGAAACGTTTACAACGACAGTGAATCAAAACGCAAATGTTACAGTGCAGGATAAATACAAAGTCTCCTACGACGAAAAAGTAAAAAGCATCAAAGATACGATGGACGAAACAATGAATAACTCTGAAGATCTGAACCATCTTTACATCAACTTTACGTCACTTTCAAGCGGTGGCACAGCTTGGAATTCTCCGTATTACTATGCCTCCTACATCAACCCTGAAATCGCAAACTACATCAAACAGAAAAATCCGGCACGCGTCGGATGGGTAATCCAGGATTATATTAATGAAAAATGGAGCCCGTTACTGTATCAAGAAGTCATCAGAGCAAATAAATCCTTAATCAAAGAATAA-3’。

其编码的氨基酸序列：

assvnelenwskwmqpipdsiplarisipgthdsgtfklqnpikqvwgmtqeydfryqmdhgarifdirgrltddntivlhhgplylyvtlhefineakqflkdnpsetiimslkkeyedmkgaedsfsstfekkyfvdpiflktegniklgdargkivllkrysgsnepggynnfywpdnetftttvnqnanvtvqdkykvsydekvksikdtmdetmnnsedlnhlyinftslssggtawnspyyyasyinpeianyikqknparvgwviqdyinekwspllyqevirankslike(下划线部分为去除的31个前导肽)

上述基因为从NCBI数据库中得到的一段蜡状芽胞杆菌PI-PLC基因(Genbank:M30809.1)，根据大肠杆菌密码子的偏好性，在保证氨基酸序列不变的前提下，优化设计并合成的PI-PLC目的基因，该基因可在大肠杆菌中的异源高表达，且重组蛋白显示磷脂酶活性较高，由于条件致病菌大肠杆菌可能会导致动物感染治病，不是一种安全的表达宿主菌，不能直接喂养动物，未批注用于饲料，无法产业化生产，因此有必要建立起的能够产业化生产的表达系统。

在基因工程中，枯草芽孢杆菌是广泛使用的表达系统，它没有致病性、是国家批准可以使用的宿主菌，并且具有很强的向胞外分泌蛋白能力，但异源蛋白的表达往往很低，为实现PI-PLC基因在枯草芽孢杆菌中的异源高表达，发明人进行了多次尝试，前后历时一年多，最终发现采用大肠杆菌EPI400(其他大肠杆菌表达不了)，且去掉PI-PLC基因的31个前导肽，利用特定载体pBE980a上(为穿梭质粒，可以在大肠杆菌和芽孢杆菌中复制)的序列进行胞外分泌表达，才能获得正确的克隆。

本发明的有益效果主要体现在：本发明构建了磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C(PI-PLC)的枯草芽孢杆菌稳定表达系统，成功实现了PI-PLC基因在枯草芽孢杆菌中的异源高表达，为后续PI-PLC的批量生产奠定了基础。

(四)附图说明

图1为质粒pBE980a图谱；

图2为重组质粒pBE980a PI-PLC图谱；

图3为PI-PLC酶活性检测结果。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：

1、PI-PLC基因的优化与合成

从NCBI数据库中得到的一段蜡状芽胞杆菌PI-PLC基因(Genbank:M30809.1)，根据大肠杆菌密码子的偏好性，在保证氨基酸序列不变的前提下，优化设计并合成的PI-PLC目的基因(SEQ ID No.2)，由杭州擎科梓熙生物技术有限公司合成。

2、目的基因片段的获得与鉴定

具体步骤：以SEQ ID No：2所示PI-PLC基因为模板，以P1/P2为引物进行PCR扩增：

引物P1：5’-GCCAAGCTTGCGTCAAGCGTGAAC GAACTGGAAAATTGG-3’；

引物P2：5’-GCCGGATCCTTACCCATCCGACGCGTGCCGGATTTTTCTGTT-3’；以合成基因PI-PLC为模板，以p1/p2为引物进行PCR扩增。

PCR扩增体系为：模板1μL，上下游引物各1μL，2×super HIFI-MIXⅡ25μL，灭菌的双蒸水20μL。

PCR扩增条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸60s，32个循环后72℃延伸10min。

PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳分析鉴定。

3、重组质粒pBE980a PI-PLC的构建

具体步骤：基因PI-PLC经过PCR获得了含有HindIII和BamHI粘性 末端的产物(SEQID No.1)，通过与含有相同粘性末端的载体质粒pBE980a(由中科院天津生物技术研究所宋诙老师馈赠，质粒图谱见图1)连接，获得重组质粒pBE980a PI-PLC(图谱参见图2)。

4、重组质粒pBE980a PI-PLC在大肠杆菌中的克隆

具体步骤：提取正确的重组质粒pBE980a PI-PLC，转到表达宿主菌大肠杆菌EPI400电转感受态细胞(F-mcrAΔ(mrr-hsdRMS-mcrBC)Φ80dlacZΔM15ΔlacX74recA1endA1araD139Δ(ara,leu)7697galU galKλ-rpsL(StrR)nupG trfA tonApcnB4dhfr，购自Epicentre Biotechnologies公司)，挑选单克隆，进行测序分析，测序结果显示为阳性克隆。

5、转化到枯草芽孢杆菌

感受态细胞制备：分别取枯草芽孢杆菌WB600(购于BioVector质粒载体菌种细胞基因保藏中心)和枯草芽孢杆菌WB800(购于BioVector质粒载体菌种细胞基因保藏中心)单菌落接种于5mL LB培养基中200rpm/min振荡培养过夜。将活化好的单菌落接种于生长培养基中(LB+0.5M山梨醇)中，过夜培养。将菌种按1/16的接种量接种于生长培养基(LB+0.5M山梨醇)，37℃摇床振荡培养至OD600nm在0.85～0.95左右。用冰水浴冷却培养物10min，于4℃，5000rpm，离心5min收集菌体。反复用冰冷的电击缓冲液(0.5M山梨醇，0.5M甘露醇，10％甘油)洗涤细胞收集物4次。用原培养液1/40体积的电击缓冲液重新悬浮细胞收集物，40微升的分装一个EP管中，放入-80℃保存。

分别取枯草芽孢杆菌WB600和枯草芽孢杆菌WB800感受态细胞40ulmL，加入1～2μL重组质粒，进行电转化：电击条件2.0KV，1mm，电击1次。电击完毕后取出杯子立即加入1mlRM(LB+0.5M山梨醇+0.38M甘露醇)，37℃，200rpm，复苏3h后，涂板。37℃，过夜培养。 挑选阳性克隆进行质粒提取，测序正确，获得重组基因工程菌。

6、诱导培养：

重组基因工程菌在含有10ug/ml卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，200rpm，振荡培养48h，于培养基上清液获得PI-PLC。

7、PI-PLC酶活性检测：

PI-PLC水解磷酸肌醇磷酸二酯键，产生的不溶于水的二酰基甘油，在平板上显示乳白色晕圈。取10mL含有PIPLC表达载体的重组菌菌液，在PI-李斯特氏菌显色平板点样，并以同样方法取枯草芽孢杆菌WB600和WB800作为对照，37℃温育12h。观察结果，如果重组蛋白有酶活性，会在PI-李斯特氏菌显色平板显示乳白色晕圈，反之没有活性。结果参见图3。

8、酶联反应定量测定菌液中PI-PLC的含量

具体步骤：

①待测样品的处理：将诱导表达后的重组菌菌液，置于冰上超声波破碎至澄清8000r/min离心10min，收集上清；

②标准品的稀释：试剂盒提供原倍PI-PLC标准品一支，按照下列图表在1.5mL离心管中进行稀释。

③加样：分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同)、标准孔、待测样品孔。在酶标包被板上标准品准确加样50μL， 待测样品孔中先加样品稀释液40μL，然后再加待测样品10μL(样品最终稀释度为5倍)。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。

④温育：用封板膜封板后置37℃温育30min。

⑤配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用。

⑥洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30s后弃去，如此重复5次，拍干。

⑦加酶：每孔加入酶标试剂50μL，空白孔除外。

⑧温育：操作同3。

⑨洗涤：操作同5。

⑩显色：每孔先加入显色剂A 50μL，再加入显色剂B 50μL，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15min。

终止：每孔加终止液50μL，终止反应(此时蓝色立转黄色)。

测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)。测定应在加终止液后15min以内进行。

计算以标准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。

结果参见图3，显示按上述方法诱导枯草芽孢杆菌表达PI-PLC，最终测得诱导后培养液(上清液)中PI-PLC的浓度为9.4mg/L。

Claims (3)

1.一种利用枯草芽孢杆菌高效表达磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C(PI-PLC)基因的方法，所述方法包括：将SEQ ID No：1所示序列与pBE980a质粒连接，构建得到重组表达载体转化至大肠杆菌EPI400中，筛选阳性克隆转化至枯草芽孢杆菌中，获得重组基因工程菌进行诱导培养，于培养液中获得转化后的磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法如下：

(1)表达载体构建：以SEQ ID No：2所示PI-PLC基因为模板，以P1/P2为引物进行PCR扩增：

引物P1：5’-GCCAAGCTTGCGTCAAGCGTGAAC GAACTGGAAAATTGG-3’；

引物P2：5’-GCCGGATCCTTACCCATCCGACGCGTGCCGGATTTTTCTGTT-3’；

(2)步骤(1)酶切、回收的目的基因与pBE980a质粒连接，得到重组表达载体pBE980aPI-PLC；

(3)重组表达载体pBE980a PI-PLC转入大肠杆菌EPI400感受态细胞，筛选获得阳性克隆；

(4)步骤(3)阳性克隆电转化至枯草芽孢杆菌感受态细胞，筛选阳性克隆，获得重组基因工程菌；

(5)重组基因工程菌在含有10ug/ml卡那霉素的LB液体培养基中培养48h以上，于培养基上清液获得PI-PLC。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌WB600或枯草芽孢杆菌WB800。