CN109234290A

CN109234290A - 甘蓝型油菜BnKAT2基因及其启动子和应用

Info

Publication number: CN109234290A
Application number: CN201811389662.7A
Authority: CN
Inventors: 梁颖; 张崟; 董世青; 钱伟; 曲存民; 万华方
Original assignee: Southwest University
Current assignee: Southwest University
Priority date: 2018-11-21
Filing date: 2018-11-21
Publication date: 2019-01-18
Anticipated expiration: 2038-11-21
Also published as: CN109234290B

Abstract

本发明涉及甘蓝型油菜BnKAT2基因及其启动子和应用，其中BnKAT2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，该基因能显著增加植株株高，增加主花序有效长度和主花序角果数，同时显著增多植株单株总角果数，从而增加单株产量；BnKAT2基因启动子序列如SEQ ID NO.6所示，该序列具有启动活性，能够调控下游目的基因表达，进一步研究该启动子的功能对研究花生长方面有重要的价值。

Description

甘蓝型油菜BnKAT2基因及其启动子和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及甘蓝型油菜BnKAT2基因，还涉及BnKAT2基因的启动子和应用。

背景技术

油菜(Brassica napus.L)是一种重要的油料作物(马霓等，2010)，是十字花科芸苔属，在世界范围内广泛种植。在中国，《种子法》第74条：“主要农作物是指稻、小麦、玉米、棉花、大豆以及国务院农业行政主管部门和省、自治区、直辖市人民政府农业行政主管部门各自分别确定的其他1～2种农作物”。而农业部第51号令规定：油菜、马铃薯为主要农作物。故“油菜”排列第6位农作物。根据农业部种植业司统计资料，我国有五大油料作物：油菜、花生、芝麻、胡麻(油用亚麻)、向日葵(周振亚，2012)。

在我国，油菜年均种植面积约为1.1亿亩，年均总产量237亿斤，平均亩产220斤左右，我国油菜产业每年可生产约450万吨菜籽油(陆军花，2016)，菜籽油占国产油料作物产油量的57.2％(王汉中，2010)，我国油菜的总面积和总产量均居世界首位(柳寒，2011)。油菜在食用油产业上具有举足轻重的地位，推动了国民经济的发展，提高了人民的生活水平。此外，油菜还是生物燃料最主要的原料。

发展油菜生产具有重要的意义，第一、是提高城乡居民生活水平的需要。我国每年消费食用植物油2300万吨，自产不到1000万吨(菜油约450万吨)，自给率40％多，供需矛盾十分突出。第二、是优化种植业结构的组成部分。刘学军在《中国油菜市场分析》(1998)中指出，一个国家，合理的种植业结构，应该是禾谷类作物的总面积为油料作物总面积的2.6倍以下(刘学军，1998)。而我国1995年是3.7倍，1996年为4.0倍，1997年为3.9倍，1998年为3.8倍。近三年,2005年是3.4倍，2006年是3.5倍，2007年是4.2倍。第三、是开发利用冬闲田，增加农户收入的重要措施。油菜是唯一的冬季油料作物，不与主要农作物争地，适合于长江流域广大地区种植。据估计，长江流域有9000多万亩冬闲田(吴春彭，2011)，如果这些冬闲田都种植冬油菜，既可改善种植业结构，又不影响大宗农作物的种植面积，还可增加农户的收入。第四、是支援工业建设，实现工业现代化的保证。因为油菜有以下的用途：(1)用于橡胶工业的添加剂，增加橡胶的稳定性，防止老化和变形；(2)用于金属表面的润滑剂和防蚀剂，如铁路车辆、舰艇、轮船；铸钢脱膜、钢板淬火等；(3)鞣制皮革，用以提高皮革的韧性和柔软性；(4)制作油漆、肥皂、油墨、尼龙丝等的原料；(5)用作毛纺工业上的漂、洗、染等的化学剂。第五、是发展加工业和畜牧业的原料保证。如油脂加工，我国每年食用植物油消费量2300万吨(陈鸿雁，2008)，而国内食用植物油脂产量约1000万吨，原料不足只有靠进口补充。精细化工，通过深加工，菜饼中可提取植酸、单宁、磷脂、复合氨基酸等精细化工产品，提高附加值。食用蛋白质，通过深加工，菜籽饼粕可获得蛋白质含量为60％的食用浓缩蛋白，或蛋白质含量为90％以上的食用分离蛋白；通过脱毒获得蛋白质含量为15～30％的无毒精饲料。饲料加工，我国饲料饼粕消费约3000万吨，但产量不到2000万吨，需进口1000多万吨。

目前，广泛种植栽培于世界上的三大油菜类型中，比较白菜型油菜(Brassicacampestris L.)、芥菜型油菜(Brassica juncea L.)，甘蓝型油菜(Brassim napus L.)(田飞等，2012)因其具有相对较高含油量、高籽粒产量、较强抗逆性而在我国长江中下游流域大量种植。所以，目前大部分的研究重点都放在了探索甘蓝型油菜的分子生物学基础，培育其高产高效优质新品种。

因为甘蓝型油菜在我国作为长江中下流域冬季作物，秋播春收，与水稻、玉米等夏季粮食作物种植时间不相矛盾，所以生产面积发展潜力较大。然而，近几年来油菜生产面积不升反降，主要有以下几方面的原因：(1)油菜生产机械化程度低；(2)农村劳动力缺乏；(3)在长江流域分别有可利用冬闲耕地和滩涂荒地600万hm²和200万hm²，开发利用程度远远不够，丰富的冬闲田资源被浪费(官春云，2011)；(4)油菜单产较低，生产效益差。而第四点也是限制油菜生产发展的主要原因。此外，油菜产业还为饲料产业提供600多万吨的高蛋白饲用饼粕。但是，目前国内植物油消费量已超过2500万吨，我国自产不足1100万吨，每年需进口补充1400万吨(彭柳，2016)。多方面的因素使我国食用油的供需越来越不平衡，我国食用油进口量已超过60％，自给率不足40％(董彦彬，2010)，大量进口的因素导致这是我国的一个很严重的食品安全隐患，因而提高油菜产量是非常迫切的重要问题，提高油菜产量当然也是油菜育种的永恒话题。

综上所述，我国需要尽量开发利用冬闲田资源，通过适度增加种植面积和提高单产来提高我国油菜总产量。而如何提高单产，究竟是哪些因子影响了产量的变化，这些问题就又显得尤为重要。我们需要通过一定的技术手段一步一步的找到问题的答案，油菜很多重要的与产量相关的性状为数量性状，遗传背景很复杂，基因的表达也易受环境的影响，运用传统的育种方法就会效率太低，加之传统的育种方法周期长、工作量大，所以目前研究的热点和重点放在发掘影响产量的基因，并进而通过基因工程技术的方法来提高油菜的产量，当然，培育高产，优质的品种也是油菜育种上的一个主要的目标。

众所周知，单株油菜经济产量与每株有效角果数、每角粒数和千粒重三个因素有关，其中有效角果数又分为主序角果数、一次分枝角果数与二次分枝角果数。而决定油菜经济产量的三个因素之间存在相互制约的关系。因此研究油菜经济产量特性可以从上述几个因素来进行，不同的生态环境、品种类型、基因表达水平、农艺措施、地理条件等都会影响以上几个因素，本试验中重点抓住基因表达这一关键性因素，从分子水平进行研究，以期能清楚油菜BNKAT2的具体基因功能。近年来，油菜的种植随着农业机械化的发展，已经从常规密度人工种植的方法渐渐转向了机械化密植油菜的生产过程。所以如何提高油菜产量也转为机械化密植油菜的产量如何提高。冯娟等(2006)认为随着密度的增加，机械撒播油菜单株生产力、单株角果数均减少，并且差异达显著水平。但是密度对机械撒播油菜每角粒数、千粒重的影响不显著。所以，通过一定的生物技术手段来提高油菜单株角果数，可以克服机械密植油菜因为密度增大而产量减小的问题。此外，机械化密植油菜还有单株分枝数较少的特点，这样就使得主序角果数在提高经济产量中的角色显得尤为重要。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供甘蓝型油菜BnKAT2基因，本发明的目的之二在于提供含有所述甘蓝型油菜BnKAT2基因的重组表达载体；本发明的目的之三在于提供甘蓝型油菜BnKAT2基因的启动子；本发明的目的之四在于提供所述甘蓝型油菜BnKAT2基因在提高主花序角果数中的应用；本发明的目的之五在于提供所述甘蓝型油菜BnKAT2基因在促进单株产量中的应用；本发明的目的之六在于提供甘蓝型油菜BnKAT2基因在增高主花序和植株的高度中的应用。

为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：

1、甘蓝型油菜BnKAT2基因，所述甘蓝型油菜BnKAT2基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示。

2、含有所述甘蓝型油菜BnKAT2基因的重组表达载体。

优选的，所述重组表达载体由SEQ ID NO.3所示序列连入pEarleyGate101载体的35S promoter下游。

3、甘蓝型油菜BnKAT2基因的启动子，所述启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.6第1124～2068位所示。

4、所述甘蓝型油菜BnKAT2基因在提高主花序角果数中的应用。

5、所述甘蓝型油菜BnKAT2基因在促进单株产量中的应用。

6、所述甘蓝型油菜BnKAT2基因在增高主花序和植株的高度中的应用。

本发明的有益效果在于：本发明提供了甘蓝型油菜BnKAT2基因和启动子，BnKAT2基因可显著增加植株株高，增加主花序有效长度和主花序角果数，同时显著增多植株单株总角果数，从而增加单株产量。BnKAT2基因启动子序列包括CAAT-box、TATA-box等核心启动子元件，以及G-Box、GATA-motif、CATT-motif等多种与光诱导相关的顺式元件，TC-richrepeats、WΜN-motif、HSE和MBSII等与胁迫相关的元件。另外，包括调控胚乳基因表达的瞬时作用元件Skn-1_motif、GCN4_motif以及调控分生组织表达的顺式作用元件CAT-box，845bp的启动子序列具有活性，使用瞬时表达法注射本氏烟草染色成功。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1为pCAMBIA1305.1-BnKAT2 promoter-2162bp、pMDC162-BnKAT2-Promoter-845bpGUS染色结果(A：pCAMBIA1305.1-BnKAT2 promoter-845bp、B：pMDC162-BnKAT2-Promoter-2128bp、C：对照(右))。

图2为BnKAT2高保真酶PCR扩增结果。

图3为拟南芥Bar基因检测电泳图(A：编号为9、21、22、27的植株DNA水平的鉴定没有扩增出条带；编号为10、14、17、24、26、28、31的植株所扩增出的条带很弱，均视为假阳性。编号为1、2、3、4、5、6、7、8、12、13、15、16、17、18、19、25、32、33、34、36、37、41的植株DNA水平鉴定出的条带清晰且亮，在本研究中继续对这些株系做后续的表达量分析；B：编号为51、52、55、59、62、66、67、72的植株DNA水平鉴定出的条带清晰且亮，在本研究中继续对这些株系做后续的表达量分析)。

图4为拟南芥F35S3ND+OVBnKAT2R检测电泳图(A：编号为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、13、14、15、16、17、18、19、21、22、24、25、26、27、28、31、32、33、34、36、37、39、41、42的植株DNA水平鉴定；B：编号为51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73的植株DNA水平鉴定)。

图5为拟南芥过表达株系cDNA质量检测(以编号为1、2、3、4、5、6、7、8、12、15、16、13、39、51、52、55、58、59、62、66、67、72的cDNA扩增结果)。

图6为不同拟南芥转基因株系与AtCol中BnKAT2的相对表达量(A：以编号为62、51、72、58、59、39、55、67、52和66BnKAT2的相对表达量；B：以编号为12、8、7、1、2、16、41、6、5、18、33、25、36、4、37、34和32BnKAT2的相对表达量)。

图7为部分T3代拟南芥转基因株系与野生型对比图(A：编号55号植株与野生型植株对比图；B：编号62号植株与野生型植株对比图；C：编号60号植株与野生型植株对比图；D：编号72号植株与野生型植株对比图)。

图8为T3代拟南芥转基因株系株高、角果数等表型分析(A：株高与主花序有效长性状考察；B：侧枝数性状考察；C：主花序角果数性状考察；D：侧枝与总角果数性状考察，注：*表示转基因株系与野生型存在显著差异，**表示存在极显著差异)。

具体实施方式

下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。

实施例1、BnKAT2基因的克隆

根据NCBI网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)和Brassica napus GenomeBrowser网站(http://www.genoscope.cns.fr/brassicanapus/)上已有物种的BnKAT2基因序列设计特异引物，具体为FBnKAT2：5′-atgtcaatctcttgcactagaaacttcttt-3′(SEQ IDNO.1)；

RBnKAT2：5′-tcaagagtctatgctttcaagctcac-3′(SEQ ID NO.2)；

以甘蓝型油菜叶片总cDNA为模板，扩增甘蓝型油菜BnKAT2基因的开放读码框(open reading frame，ORF)，PCR程序为：98℃变性30s；98℃变性10s，58℃退火10s，72℃延伸1min30s，35个循环；72℃延伸10min。PCR产物用EasyPure Quick Gel Extraction Kit胶回收试剂盒回收，并连接到PMD18-T载体(TaKaRa公司)中。将构建好的PMD18-T-BnKAT2重组载体转化大肠杆菌DH5α感受态，待LB琼脂培养基上的菌斑长至直径2mm左右时，挑取12个单菌落，37℃，250rpm摇菌12小时之后，加100μL该菌液到10mL LB培养基中(含氨苄抗生素，工作浓度为20μg/mL)，继续摇菌，手提质粒，并酶切，酶切正确的质粒送公司测序验证，同时保存菌液，以1：1的比例加入50％的甘油后于-80℃超低温冰箱保存。

提取质粒后，将满足条件的质粒进行酶切，进行进一步的验证。对酶切正确的质粒送去至华大公司测序，测序结果如SEQ ID NO.3所示。

测序结果使用Brassica napus Genome Browser网站上提供的序列为模板在MEGA5.0软件上进行序列比对，并且利用MEGA5.0，采用neighbor-joining法构建系统进化树。系统进化树显示，BnKAT2与白菜Bra013296首先聚在一起，形成芸薹属BnKAT2第一个分支。据此推测，甘蓝型油菜BnKAT2基因来自物种白菜Bra013296，二者之间遗传距离很短，最具同源性。同时，使用MEGA5软件对BnKAT2与Bra013296序列进行比对，结果显示，以上两个基因编码区差异率仅为1.74％，只有36个碱基不同，而且，仅有13个氨基酸不同，差异率为1.89％，二者同源性极高。以上数据说明BnKAT2基因在进化过程中极为保守。进化树同时也显示：BnKAT2与AT4G18290(拟南芥中的KAT2)属于垂直同源基因，经MEGA5软件比对后显示：BnKAT2与AT4G18290的编码区差异率为15.2％，氨基酸序列差异率为16.1％，二者一致率均为80％以上。而所推测的该基因家族的其他成员中有的与白菜在进化上更近，有的则与甘蓝在进化上更近。

除此之外，本研究还通过甘蓝型油菜基因组数据库比对和蛋白结构域预测，发现BnaA08g08710D、BnaC01g10730D、BnaC03g62660D、BnaA06g360 90D、BnaA09g17910D、BnaC09g19230D、BnaA09g40820D均有KHA和CNMP BINDI NG结构域且与BnKAT2核酸序列有80％的一致性，推测以上基因与BnKAT2属于同源基因。在后续的研究工作中，可以分别克隆出来，加以研究验证。

实施例2、甘蓝型油菜BnKAT2启动子的克隆

根据Brassica napus Genome Browser上提供的甘蓝型油菜BnKAT2基因上游序列，以甘蓝型油菜的基因组DNA为模板，扩增开放读码框(ORF)上游约2000bp的启动子序列BnKAT2-Promoter-2128bp以及ORF框上游845bp的启动子序列BnKAT2-Promoter-845bp。

克隆约2000bp大小的启动子所使用的引物序列如下：

BnKAT2-PromoterF:5′-gagctcccatcgataaacctgtatatg-3′(SEQ ID NO.4)；

BnKAT2-PromoterR:5′-ggatccggaaacttgtgacaagtatcac-3′(SEQ ID NO.5)。

将克隆出的启动子序列通过加A尾，连接到pGEM-T载体，转化大肠杆菌DH5α感受态、挑斑、摇菌、菌液检测，使用BnKAT2-PromoterR与BnKAT2-PromoterF引物组合，菌检结果显示，除部分杂带外，其它条带均略高于2000bp。并将阳性克隆菌株取100μl送华大基因公司测序，测序成功后再继续进行双酶切，并连接到pCAMBIA1305.1载体上，成功构建了pCAMBIA1305.1-BnKAT2 promoter载体，也即BnKAT2 promoter成功被克隆，其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

克隆约850bp大小的启动子序列所使用的引物序列如下：

BnKAT2-sPromoterF:5′-cacccgatgcttatgactaacctgagtc-3′(SEQ ID NO.7)；BnKAT2-PromoterR:5′-ggatccggaaacttgtgacaagtatcac-3′(SEQ ID NO.8)。使用PrimeSTAR Max Premix进行PCR，PCR反应程序为：98℃变性30s；98℃变性10s，55℃退火15s，72℃延伸10min，35个循环；72℃延伸10min。连接到入门载体pENTR/D-TOPO上，转化大肠杆菌DH5α感受态、挑斑、摇菌，使用M13F+BnKAT2-PromoterR引物进行菌液检测，并将阳性克隆菌株取100μl送华大基因公司测序，其核苷酸序列如SEQ ID NO.6中第1124～2068位所示。测序成功后再继续LR重组反应，连接到pMDC162载体上。使用BnKAT2-sPromoterF+RNOS5ND引物，RNOS5ND引物序列为：5’-tgccaaatgtttgaacgatcggg-3’(SEQ ID NO.9)以及BnKAT2-sPromoterF+BnKAT2-PromoterR菌检，菌检成功之后，进行测序验证。

然后使用Gateway的方法构建了pMDC162-BnKAT2-sPromoter-845bp载体，首先使用高保真酶且引物组合BnKAT2-PromoterR+BnKAT2-sPromoterF扩增出该序列，之后将该序列连接到入门载体pENTR-D-TOPO进行测序，测序成功之后，进行LR反应，连接到pMDC162上，菌检验证正确后，挑选菌液测序，测序序列与模板序列一致性为99.4％。故而本研究成功构建了pMDC162-BnKAT2-Promoter-845bp载体，也即BnKAT2-Promoter-845bp成功被克隆。

启动子序列采用PlantCARE网站(网址：http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)数据库进行分析(表1)。结果显示，甘蓝型油菜BnKAT2基因启动子中含有核心元件CAAT-box、TATA-box等核心启动子元件，以及G-Box、GATA-motif、CATT-motif等多种与光诱导相关的顺式元件，此外，TC-rich repeats、WΜN-motif、HSE和MBSII等是与胁迫相关的元件。还有一些激素应答元件，如AuxRR-core、GARE-motif等。

表1、甘蓝型油菜BnKAT2基因启动子元件分析

注：表中，CAAT-box出现了27次，处在不同的位置并来自于不同的物种，上表中只罗列了其中一个CAAT-box的具体信息。TATA-box出现了67次，处在不同的位置并来自于不同的物种，上表中只罗列了其中一个来自于拟南芥的TATA-box的具体信息。

通过表1观察到，甘蓝型油菜BnKAT2基因启动子顺式作用元件中包括参与胚乳表达调控、参与分生组织表达调控等。而我们通过GWAS技术得到的该基因与主序角果数有关。而该基因在拟南芥中过表达后，有明显的角果数增加的迹象，但角果数小而不饱满。推测：这些表型与该启动子中的GCN4_motif等参与胚乳表达调控以及CAT-box等参与分生组织表达调控的顺式作用(表1中加粗区域)元件有密切关系。此外还含有核心元件CAAT-box、TATA-box以及多种与光响应相关的元件CATT-motif，G-Box，G-box，GATA-motif等，推测BnKAT2可能与光信号响应有关。据此也侧面证实了我们在GWAS中的推测：BnKAT2基因对高光敏感，所以只在云南环境下筛选到其与主序角果数有关。BnKAT2基因启动子还含有响应受伤的元件WΜN-motif以及响应一些压力(HSE、TC-rich repeats)、热(HSE)、低温(LTR)等外界因素的元件，推测BnKAT2基因在抗一些非生物胁迫中可能发挥着作用。此外，该启动子序列还含有circadian等调控生理节奏的元件，暗示BnKAT2基因可能与生长发育也有一定的关系。当然还会有一些未知作用的元件，这些元件对于植物的生长发育、抗逆境胁迫等的机理还需要进一步的研究。

利用pCAMBIA1305.1-BnKAT2 promoter-2162bp、pMDC162-BnKAT2-Promoter-845bp两个载体采用农杆菌介导法，瞬时表达GUS染色法，利用针管注射方式，注射进入本氏烟草(王晓改，2016)。结果显示：pCAMBIA1305.1-BnKAT2 promoter-2128bp没有显示染色，而pMDC162-BnKAT2-Promoter-845bp显示染色成功(图1)。结果表明2000bp以上的长序列导进烟草中，可能导致烟草系统识别困难，进而启动子无法起作用，而小于1000bp的短序列较容易被烟草系统识别，从而使启动子起作用。上述结果验证了845bp的启动子区域是有功能的，该研究为后续工作继续缩短序列，筛选启动子核心功能区域奠定基础。

上述结果是2128bp的启动子序列没有染色，845bp的启动子序列染色成功。导致长启动子序列没有染色成功的原因可能有两个，一是较之短序列，长序列更难整合到烟草基因组中，导致染色失败。二是2000bp以上的长序列导进烟草中，可能导致烟草系统识别困难，进而启动子无法起作用，而小于1000bp的短序列较容易被烟草系统识别，从而使启动子起作用。

实施例3、BnKAT2超表达拟南芥和油菜转基因植株的获取

A、利用GateWay重组技术构建BnKAT2超量表达载体

pENTR/D-TOPO-BnKAT2载体构建

首先，以之前构建好pMD18-T-BnKAT2为模板，引物如下：

OVBnKAT2F：5′-caccatgtcaatctcttgcactagaaacttctttg-3′(SEQ ID NO.10)(下划线为gateway重组法构建载体要求加的序列)

OVBnKAT2R：′-agagtctatgctttcaagctcactg-3′(SEQ ID NO.11)(要求没有终止密码子)；

使用PrimeSTAR Max Premix(2×)DNA polymerase高保真酶扩增BnKAT2，PCR反应体系如表2所示：

表2、PCR反应体系

PCR程序为：98℃变性30s；98℃变性10s，58℃退火10s，72℃延伸1min 30s，35个循环；72℃延伸10min，扩增结果如图2所示。PCR产物用EasyPure Quick Gel Extraction Kit胶回收试剂盒回收。

用Invitrogen公司的pENTR/D-TOPO Cloning Kit进行入门载体的构建。具体方法如下：

(1)在4μL胶回收PCR产物中，加入1μL盐溶液，混合均匀。

(2)加2.5μl混合液于新的EP管中，加入0.5μl TOPO载体，混合均匀。

(3)室温孵育15min。

(4)使用E.coli感受态细胞做转化。

然后，转化大肠杆菌DH5α感受态，此处热激使用42℃30s。挑斑，摇菌3小时后，使用M13F+OVBnKAT2R与OVBnKAT2F+M13R两对引物进行菌液PCR，之后选择阳性菌液送华大基因测序，测序采用M13F+M13R引物组合测通，保存测序正确的阳性克隆菌液，测序结果与模板序列一致性为99.9％，显示目的片段已经顺利连到入门载体pENTR-D-TOPO上。

GateWay重组技术构建pEarlyGate101-BnKAT2超量表达载体

根据测序结果，摇菌提取质粒pENTR/D-TOPO-BnKAT2，使用MluI酶对该质粒进行酶切，胶回收目的片段。

胶回收的目的片段与pEarleyGate101载体进行LR反应，即重组反应。在100μl离心管中混合如表3所示试剂：

表3.目的片段与pEarleyGate101载体进行重组反应

轻柔混匀后，室温2小时，之后向LR体系中加入0.5μL Proteinase K溶液，37℃敷育10min。

然后将重组质粒(重组反应后的质粒命名为pEarlyGate101-BnKAT2)转化大肠杆菌DH5α，对单克隆菌液进行PCR鉴定。将阳性克隆送到华大基因测序，使用35S通用引物正向测通，保存测序正确的菌液，测序序列与模板序列一致性为99.9％，故而本研究成功构建了pEarlyGate101-BnKAT2超量表达载体。

B、转化根癌农杆菌GV3101

提取阳性大肠杆菌菌株的质粒(pEarlyGate101-BnKAT2)，转化根癌农杆菌GV3101，抗Kan、Str和Rif的菌落用F35S3ND+OVBnKAT2R、OVBnKAT2F+RPA 3ND两对引物组合进行PCR鉴定，将阳性菌株于-80℃超低温冰箱中保存为工程菌株。

F35S3ND引物序列如下：5′-ggaagttcatttcatttggagag-3′(SEQ ID NO.12)；

RPA 3ND引物序列如下：5′-gctgcataattctcggggcagca-3′(SEQ ID NO.13)。

转化农杆菌的步骤为：

(1)取1管GV3101感受态(100μL)于冰盒上解冻；

(2)加入5～10μL重组质粒，轻柔混匀；

(3)冰浴5min；

(4)浸没于液氮中冷激8min；

(5)37℃水浴热激5min；

(6)加入1mL室温的YEB blank的培养基后，于28℃，180rpm振荡培养3-5小时进行复苏；

(7)复苏结束后，于5000rpm,室温离心5min；

(8)吸去900μL上清，余下的100μL用于重悬菌体，涂于YEB+Kan(100)+Str(25)+Rif(40)固体平板上；

(9)28℃倒置培养2天左右，直至长出直径约1～2mm的菌落；

(10)选定2个菌落，挑取每个菌落接种于750μL的LB+Kan(100)+Str(25)+Rif(40)的液体培养基中，在28℃，250rpm振荡培养约2天到对数期；

(11)加2mL的农杆菌转化液于30mL的LB+Kan(100)+Str(25)+Rif(40)的液体培养基中，大摇24小时后用于后续研究。

C、浸花法浸染拟南芥植株

大摇后的pEarlyGate101-BnKAT2农杆菌菌液，使OD₆₀₀为1.0-2.0。将菌液转移至50mL离心管中，7000rpm，5min，弃上清，加2倍体积的浸染液。

将配好的浸染液置于直径12cm的培养皿，浸染哥伦比亚型野生拟南芥(AtCol)植株(剪去开过的花絮)。首先将拟南芥植株全部的花均放入浸染液中浸染15s，约浸染64棵拟南芥，然后将浸染后的拟南芥横放于白色方框中，框中加入少许的水，使植株处于一个湿润的环境，最后将白色方框置于黑暗的环境中24小时，之后将拟南芥植株正常培养，将其枝条借助竹签束成捆，不影响其成长，放于光强为10000Lx，15.6℃的培养箱中，待成熟后收种子(王静，2016)。

筛选之前浸染AtCol获得的种子，一共种了3个塑胶方盘，使用Basta喷施后成功筛选出了60株T1代转基因植株，筛选率约为0.029％(60/3×700)，这60株过表达转基因植株编号为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、24、25、26、27、28、31、32、33、34、36、37、38、39、40、41、42、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73，将这60棵植株种植于红色小花盆(棵/盆)中。

D、筛选转基因植株

将浸花后的拟南芥成熟后收的种子直播于土中，于光强为10000Lx，15.6℃的培养箱中培养，待拟南芥长出两片真叶后，开始喷施1/2MS+Basta(50mg/mL)，喷施36小时后观察叶片的表型，叶片发黄，继而萎蔫的植株为阴性植株，叶片正常，未受胁迫的植株初步筛选为阳性苗，对这些初步筛选出的阳性苗再做后续的进一步鉴定。

提取拟南芥DNA的具体流程：

(1)将筛选出的植株做好标记(编号为1-70)，剪取40mg左右拟南芥的叶片置于2mLEP管(事先装好小钢珠)中；

(2)使用高通量样品粉碎仪，将叶片打碎，之后迅速加入400μL Edward Buffer涡旋15s，13400rpm离心5min；

(3)吸取300μL上清于新的1.5mL EP管中，加300μL异丙醇后，室温放置10min，之后12000rpm离心5min，弃上清。

(4)加入800μL 70％乙醇，清洗沉淀；12000rpm离心2min，弃上清，敞口放置EP管，直到乙醇蒸发干净，加入50μL ddH₂O，放于-20℃冰箱保存DNA(赵锋锋，2016)。

PCR鉴定：

检测所筛选出的植株是否为阳性，使用Bar-F+Bar-R、F35S 3ND+OVBnKAT2R两对引物组合进行PCR鉴定。

以Bar-F和Bar-R为引物，

Bar-F：5′-cgacatccgccgtgccaccga-3′(SEQ ID NO.14)；

Bar-R：5′-tagatctcggtgacgggcagg-3′(SEQ ID NO.15)；

PCR程序为：95℃预变性2min30s；95℃变性30s，56℃退火30s，其中，使用Bar-F+Bar-R这对引物，72℃延伸1min，其余两对引物延伸2min，均为35个循环；72℃延伸10min。PCR反应结束后，在体系中加入4μL 6×loading buffer，然后加10μL PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，看是否有符合大小的条带出现，PCR检测结果如下图3所示。使用F35S 3ND+OVBnKAT2R引物检测结果如图4所示。

图4中A显示，编号为9、21、22的植株DNA水平的鉴定没有扩增出条带；而编号为16、32的植株所扩增出的条带大小不太正确，编号为26的植株有一条很亮的杂带。而剩余编号的植株DNA水平鉴定出的条带清晰且亮，在本研究中继续对这些株系做后续的表达量分析。

图4中B显示，编号为51、53、56、58、63、64、66、67、68、69、70、71、73的植株DNA水平鉴定出的条带清晰且亮，而其他编号的植株条带弱或者没有条带，在本研究中均视为假阳性。结合Bar基因检测的结果，选择编号为51、52、55、58、59、62、66、67、72的株系继续做后续的表达量分析。

上述结果表明，对其中至少有一对引物有正确条带的株系继续做基因表达量方面的检测，即使用荧光定量PCR做检测。

E、荧光定量PCR检测不同拟南芥转基因株系BnKAT2的表达情况

首先使用RNAprep pure Plant Kit(天根公司)提取不同拟南芥转基因株系RNA，然后运用PrimeScript^TMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)反转录试剂盒(TaKaRa公司)反转成cDNA。

使用F26S：5′-cacaatgataggaagagccgac-3′(SEQ ID NO.16)；R26S：5′-caagggaacgggcttggcagaatc-3′(SEQ ID NO.17)做PCR来检测cDNA的质量，电泳图如图5所示。

不同拟南芥转基因株系与AtCol中BnKAT2的相对表达量，结果如图6所示。

采用浸花法筛选到31株BnKAT2过表达阳性植株，将其编号，对其进行定量PCR检测，并对其后代阳性株系进行表型性状的考察，结果如图7所示，其表型如图8所示，分析转基因与野生型拟南芥考种数据可以发现，相比于野生型拟南芥，BnKAT2过表达转基因拟南芥植株显著增高，主花序有效长度显著增加(图8，A)，侧枝数增多(图8，B)，主花序角果数显著增多(图8，C)等性状，并且转基因植株单株总角果数显著增多(图8，D)。

上述结果表明，BnKAT2的过量表达可以使拟南芥主花序与单株总角果数增加，同时使植株高度增高。而在甘蓝型油菜中的定量结果又推测BnKAT2可能正调控主花序角果数。综上所述，推测在甘蓝型油菜中，BnKAT2的过量表达可能会使主花序角果数增多，促进单株产量的增加，同时会增高主花序和植株的高度。

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 西南大学

<120> 甘蓝型油菜BnKAT2基因及其启动子和应用

<160> 17

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgtcaatct cttgcactag aaacttcttt 30

<210> 2

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tcaagagtct atgctttcaa gctcac 26

<210> 3

<211> 2055

<212> DNA

<213> 甘蓝型油菜(Brassica napus.L)

<400> 3

atgtcaatct cttgcactag aaacttcttt gaaagattct gcgtcgaaga atacaatatg 60

gacgcaagaa aacacagcag tttcctctct gctgatctct tgccatctct tggagcaaga 120

attaaccaat caaccaagct tcgcaaacac ataatctctc cttttgatcc acgtttcagg 180

gcatgggaga tgtggctggt cattcttgtc atttactcgg cttggatttg tccttttgaa 240

tttgcattca ttacctacaa gaaagacgca ctattcatag tagacaacat tgtcaatggc 300

ttctttgcta ttgacattgt tctcaccttc ttcgttgcct atctagacag ccactcttat 360

cttcttgtcg acaatcctaa gaaaatagct ataaggtacc tttctacttg gtttgccttt 420

gatgtctgct ccacagctcc attccagtca ctgagtcttc tcttcaacta caatggaagc 480

gaaataggat tcagagttct tagcatgctc aggctctggc gtctcagacg agttagctca 540

ctgtttgcaa ggcttgagaa agacatccgc ttcaactact tctggacacg ttgcacaaag 600

ctcatttcag ttacactctt tgcagtgcat tgtgctggat gcttcaacta cctcatagca 660

gaacaatatc ctgatccaag aaaaacatgg ataggagctg tgtacccaaa tttcaaggag 720

gcaagcctat ggagcagata tgtaactgct ctttactggt ctattacaac attaacaaca 780

acaggatatg gagacttaca tgctgagaat cctagagaaa tgttgtttga tgtcttttac 840

atgctcttca acttgggatt cacatcctac ctaattggta acatgaccaa cctagttgtt 900

cactggacta gccgcaccag aacctttaga gatactgtta gagctgcttc ggagtttgca 960

tcaagaaacc aactcccacc aaacatacaa gaccagatgt tatcacacat ttgcttgaag 1020

ttcaagacag aaggtctgaa acagcaggag actttgaatg gtctgcctaa agcgatccgg 1080

tcaagcattg caaactatct attcctccat atccttcaga aggtctatct ctttgaagga 1140

gtttctcgca acttcctctt tcagttggtt tcagatattg atgctgagta cttcccaccc 1200

agagaagatg tgattctaca gaacgaagct cctactgacc tttacattct agtctcaggg 1260

gcagtggatt ttactgctta cattgacggt gaaaatcagg ttcaaggaaa atcagtagtt 1320

ggggatgcat ttggagagat tgctgtttta tgctctacac cacagccttt cacagttagg 1380

acaactgaac tatctcaaat actacgggta agcaaaaaat ctctcatgag tgctatgaga 1440

gctcatgttg aagatgggcg tatcataatg aacaaccttt tcatgaaact tagagggcaa 1500

cagtcaatag caattgatga tgcaaacaac caaccagaac cagacttcct cctccagaag 1560

tggcttagtg gtggtccaaa gagaggagaa ggtaacgcca gtggtcaagg aaaggggcac 1620

aaatatttac aaataaatga ttcagagagt attgatttgg agtcaaccag aagaactcaa 1680

gaacataggg ttgagataga agaaggggga aaagaaaaca aagatattaa tgggaagagt 1740

tgttctcatg cagatctcac ttcatttaag tttccttcat atccatattg caaattcagt 1800

aaacaagaag ctgctaagcc ggaagatagg agagttacca tccacttgaa gtcgcagggg 1860

aaagatttgt cgaagctcat aatcttacct gcttccatgg aagatcttat gagacttgca 1920

ggtgaaaaat ttggagatag aagctttaca atggtcacca gtgctgaaaa cgcagagatt 1980

gatgacgtaa atgtcattag agatggtgat catctgtatt tttacatcag tgagcttgaa 2040

agcatagact cttga 2055

<210> 4

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gagctcccat cgataaacct gtatatg 27

<210> 5

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ggatccggaa acttgtgaca agtatcac 28

<210> 8

<211> 2128

<212> DNA

<213> 甘蓝型油菜(Brassica napus.L)

<400> 8

ccatcgataa acctgtatat ggatgctacg ttactctaat tatgacaaca atgatttatc 60

gtaaaactac gaggccaaaa cggaaacgta aagggatttt aatcagatat ccttttagat 120

aatatgaaac aaacgaaaaa attgtgttat tatttgatat cacaaagcta aaactaataa 180

gtttgggggg gggggggggg gggggggtta aattaagaag ccgccgtgcc ggttatatct 240

gtagaaaata tcgtttagat ttaaggattt ctcactcaaa tgctatgtca cctaatctgg 300

gttctgactc caagactgtg tttcccattt gaaaagtaac gacaaaaatt attgaagaac 360

ttggacccaa tgccactttt tgcatgtgca agatttaaca gagtcttgac agagtggtta 420

gtgagtggat ttatatccct taacgataat taattagcta gttgaacagc agaaaggctt 480

agctagtgaa gaactaagtc atttgaacca tgaaggtttt tgttaagtcg tatcaaacat 540

ttgaaaccaa gtttgggtaa cccatcaaaa atattttaat cgcacagcca actagccaga 600

tacaaaatag tttattttgt tgtaagattt ttagaattaa aacgaagaaa aatcacaaca 660

acaacacgaa cacgaatata tccggaaaca aaattgtcta tattgcttat taaataaaga 720

caaaacagca aatagttttt cagagaatgc aatcagtatc atgtgaaaca tatctgaatt 780

ctttatgtat tttattgtat gtatctgtat cacataattt aactatataa actaacacta 840

taatagaatt ggatgaaact caaaagcaat ttgcaagaaa ataatatata atttttaaaa 900

aataaacgat gattattata aatattattt tggaaaattt ccttaattga gaaaacatta 960

tcactgaact acatgatttg attgttgctg cttcattctg tttccactat ataatctcta 1020

atgtgaaaca gagttcgtag cctgctttta atatctaaat tagcgtattt gttctttaca 1080

tgtcgtgtca gattctctga ttagatgttt tttttgtgtg tctattgcat gattagatgt 1140

ttacgcgtaa ttagggattt attttctaat aaaaaaataa aattctatat caaagcataa 1200

atctagaagt aaaaagttta atcgatgctt atgactaacc tgagtcaaaa gcaagaaatc 1260

actgatgtgg gaacctgtca ctggtccact tgtcatcatt acacatgagc tgcccatgta 1320

agagaatctt tagaacttgt cttcttctgt ggttagtccc tcaccctgta aaccgttcaa 1380

catgttacca agagtaatca actaaaagaa gtgtttgaaa atgcacagag taaagtattt 1440

tattagatac ttaacgaata ctactagcat ttgtattttt atctttttcg gccataaaaa 1500

ttctattctg accatctttt ttcccttacc tggtccattt cttgattcct gtatgtatgt 1560

atatatattg gcctccaatt gctaagtaaa tggatattcc accatagtca caatctcatc 1620

aagtagaaac tccattaaca agattgcgtc ctctttctcc ttctccttct tctctcaaat 1680

tttcaaatct ttacttcctg tcaaaagaag aaactccaaa gcatttttgc tgtaaaatct 1740

caatgtctgc cacttaaata tatagtactt gttaactttt cttcctccaa acgtaccaac 1800

actactccgt tcttataatt tcacattcat aatcatttct tgtgtaagcc ttcttgtggg 1860

ttcttgcagc attaatggtg cactgagtct gtgtaaagta gttaaaccac ctttccctgc 1920

aaaataaaaa ttcgtttttt tactctcttt ttcagaaaac gttaagacat gggtcaggtc 1980

aagttgatgt agtaaaggtc agaaccaacg tgagagagag aaagaaaaaa aaaagttcgt 2040

tagcttgtga tacttgtcac aagtttcctc actatattta taactacctt gctgaagaga 2100

aaaccctcaa aacttcaaaa caaagaag 2128

<210> 6

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cacccgatgc ttatgactaa cctgagtc 28

<210> 7

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ggatccggaa acttgtgaca agtatcac 28

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

tgccaaatgt ttgaacgatc ggg 23

<210> 10

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

caccatgtca atctcttgca ctagaaactt ctttg 35

<210> 11

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

agagtctatg ctttcaagct cactg 25

<210> 12

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ggaagttcat ttcatttgga gag 23

<210> 13

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

gctgcataat tctcggggca gca 23

<210> 14

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

cgacatccgc cgtgccaccg a 21

<210> 15

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

tagatctcgg tgacgggcag g 21

<210> 16

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

cacaatgata ggaagagccg ac 22

<210> 17

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

caagggaacg ggcttggcag aatc 24

Claims

1.甘蓝型油菜BnKAT2基因，其特征在于：所述甘蓝型油菜BnKAT2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

2.含有权利要求1所述甘蓝型油菜BnKAT2基因的重组表达载体。

3.根据权利要求2所述的重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体由SEQ IDNO.3所示序列连入pEarleyGate101载体的35S promoter下游。

4.甘蓝型油菜BnKAT2基因的启动子，其特征在于：所述启动子的核苷酸序列如SEQ IDNO.6第1124～2068位所示。

5.权利要求1所述甘蓝型油菜BnKAT2基因在提高主花序角果数中的应用。

6.权利要求1所述甘蓝型油菜BnKAT2基因在促进单株产量中的应用。

7.权利要求1所述甘蓝型油菜BnKAT2基因在增高主花序和植株的高度中的应用。