CN102321631B - 人工合成鸡干扰素基因序列及其重组工程菌的构建与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及“人工合成鸡干扰素基因序列及其重组工程菌的构建与应用”，属于生物技术领域。本发明对采用人工合成的序列如SEQ ID NO1或SEQ ID NO2，以酿酒酵母作为宿主菌株，得到了重组工程菌，经PCR、酶切、测序、SDS-PAGE、ELISA和CPE检测结果表明：ChIFN-α和ChIFN-γ基因均能在宿主菌株中胞内表达，并表达蛋白具有明显的生物学活性。实验表明，本发明将酿酒酵母作为生物反应器生产鸡干扰素药用蛋白，不仅可以极大降低干扰素生产成本，而且可以在提供优质蛋白的同时达到改善机体免疫功能的目的，为利用酵母添加剂防治动物疫病奠定基础。

Description

人工合成鸡干扰素基因序列及其重组工程菌的构建与应用

技术领域

本发明涉及生物程领域，特别是涉及人工合成的鸡干扰素基因序列，一种以酿酒酵母作为受体菌而得到的重组工程菌，其能进行胞内表达生产动物干扰素。

背景技术

酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是一种良好的营养与保健饲料添加剂，其营养丰富，富含B族维生素、矿物质、消化酶、促生长因子和较齐全的氨基酸。使用酵母添加剂可以提高饲料蛋白含量，刺激有益菌生长，提高机体免疫力，促进营养物质消化吸收和动物生长发育。同时，酿酒酵母也是最早用于基因工程的酵母菌株，是真核生物生物学研究的模式生物，其表达蛋白能有效保持生物学活性，利用酿酒酵母表达系统，人类已经获得一些重要药用蛋白。

鸡α干扰素(ChIFN-α)和鸡γ干扰素(ChIFN-γ)具有高效广谱的抗病毒、免疫调节、抗肿瘤细胞增殖、提高抗逆性和促进生长等多种重要生理功用，是养禽业用来防治鸡新城疫、传染性支气管炎、传染性喉气管炎、传染性法氏囊、减蛋综合征等多种鸡病毒性传染病的重要药物。尽管干扰素的临床价值极高，但是目前因生产的高昂成本却制约着其在畜牧业中的广泛应用。

发明内容

针对上述领域中的缺陷，本发明提供一种人工合成的鸡干扰素基因序列，并提供以酿酒酵母作为受体菌而得到的重组工程菌，利用酿酒酵母作为受体菌胞内表达鸡干扰素，酵母发酵产量大，产物不需分离纯化，直接饲喂含有鸡干扰素的酵母饲料重组菌株，可以实现畜牧业中干扰素的低成本供给问题，在提供鸡体营养物质的同时达到提高其免疫力的目的，避免了疫苗注射等繁琐管理和饲喂抗生素等药物带来的畜产品药物残留问题。

一种人工合成的鸡干扰素基因YEChIFNR，其核苷酸序列如SEQ ID NO1所示。

一种人工合成的鸡干扰素基因YEChIFNG，其核苷酸序列如SEQ ID NO2所示。

一种重组表达载体，具有上述人工合成的鸡干扰素基因YEChIFNR，或YEChIFNG，其骨架载体为pYES2/CT。

一种重组工程菌，具有上述人工合成的鸡干扰素基因YEChIFNR，或YEChIFNG，所述受体菌为酿酒酵母菌株INVSc1。

上述重组工程菌生产药用蛋白鸡干扰素的方法，包括如下步骤：

(1)、酵母菌的培养：保种的重组工程菌接种于SC选择培养基上，于30℃，200r/min过夜震荡培养；

(2)、酵母菌的诱导表达培养：当过夜培养的新鲜菌液OD₆₀₀＝0.3-0.5时，离心收集菌体并用含半乳糖的液体诱导培养基重悬，并于30℃、200r/min振荡培养。

所述诱导培养的条件为：诱导12h，重组菌液发酵pH值为3.8-4.0，2.5％的半乳糖浓度。

所述步骤还包括保种的重组工程菌的制备方法，将重组工程菌在YPD筛选培养基培养，菌落PCR筛选，挑取阳性克隆单菌落，SC选择培养基，30℃振荡过夜培养保种。

所述步骤还包括菌体细胞的裂解，所述步骤(2)的酵母菌培养到对数生长期时，取出转速1500rpm/min离心5min收集菌体，灭菌水重悬菌体细胞之后，10000r/min离心30s，得菌体细胞用裂解缓冲液重悬。

所述菌体细胞裂解前液氮冷冻后置-80℃保存备用，裂解缓冲液重悬的OD₆₀₀＝50-100。

所述SC选择培养基为：0.8％Ura缺陷培养基粉+2％葡萄糖；所述YPD筛选培养基为：2％胰蛋白胨+1％酵母提取物，2％葡萄糖+60mg/l Amp(氨苄青霉素)；所述诱导培养基为0.8％Ura(尿嘧啶)缺陷培养基粉+2％半乳糖+1％棉子糖或者2％葡萄糖。

本研究通过构建鸡干扰素基因ChIFN的酿酒酵母表达载体，并通过电击法将其转化酵母菌株INVSc1，对重组菌株的pH值、诱导时间和诱导剂浓度等诱导条件进行优化，并对重组蛋白及其生物学活性进行进检测和分析，证明功能基因已在受体菌中获得正确翻译表达，重组ChIFN-α和ChIFN-γ蛋白具有抗病毒活性，为开发具有抗病功能的饲料微生物添加剂奠定了基础。本研究对探索禽流感等病毒性疾病的防治新途径和保证家禽的安全生产具有积极的意义。

本发明通过酿酒酵母生物反应器表达生产动物药用蛋白，极大地降低生产成本，在给动物提供优质蛋白的同时提高机体免疫力。

本发明的总体的技术方案：包括下列步骤：

A、表达载体构建：对目的基因进行核苷酸密码子偏好性改造，利用基因直接合成方法，获得待表达蛋白质编码基因片段，将得到的基因片段克隆到表达质粒中，鉴定后通过电击法转入酿酒酵母菌株。

B、表达质粒及重组菌株鉴定：分别利用PCR、酶切、测序和表型诱导筛选，进行构建质粒和重组菌株的筛选鉴定。

C、重组蛋白检测：使用SDS-PAGE和ELISA检测重组蛋白及其表达量。

D、酵母菌的培养：保种的基因工程酵母菌株接种于SC选择培养基上，于30℃倒置培养至单菌落长出后，挑取活化后的单菌落于YPD酵母菌完全液体培养基中过夜培养。

E、酵母菌的诱导表达培养：当过夜培养的新鲜菌液OD₆₀₀＝0.4时，1500*g离心5min，收集菌体并用同样体积的含半乳糖诱导剂的液体诱导培养基重悬，并于30℃、200r/min振荡培养。

F、诱导时间确定：新鲜菌液在添加诱导剂后的不同时间点分别测定重组蛋白数量，确定半乳糖添加量。

G、发酵pH值的确定：新鲜菌液在添加诱导剂后的不同时间点分别测定菌液的pH值，并检测重组蛋白数量，确定重组酵母发酵的最适pH。

H、诱导剂添加量的优化：新鲜菌液在添加诱导剂后的不同时间点分别测定重组蛋白数量，确定半乳糖添加量。

I、重组蛋白活性检测：使用CPE试验和利用IBDV-CEF系统检测重组鸡干扰素的抗病毒活性。

本发明通过电击法将经过改造的鸡干扰素编码基因ChIFN-α和ChIFN-γ导入饲料酿酒酵母菌株中，使其能够作为生物反应器生产药用蛋白鸡干扰素。发明人利用INVSc1酿酒酵母菌株作为受体菌，经基因工程改造后得到鸡干扰素重组基因工程菌株，经PCR、酶切鉴定、测序、SDS-PAGE、ELISA和CPE检测，结果表明：ChIFN-α和ChIFN-γ基因整合到受体菌染色体基因组中，并得到正确的翻译表达，重组菌株成功表达具有生物学活性的ChIFN蛋白。

酵母微生物发酵容易，产量大，自身具有营养和保健价值，与现有生产技术相比较，本发明将酿酒酵母作为生物反应器生产鸡干扰素药用蛋白，不仅可以极大降低干扰素生产成本，而且可以在提供优质蛋白的同时达到改善机体免疫功能的目的。

附图说明

图1为酵母表达载体pYE-IFNR的物理图谱，利用氨苄青霉素(Amp)基因和URA3(尿嘧啶合成酶)营养缺陷标记基因和作为筛选和标记基因。

图2酵母表达载体pYE-IFNG的物理图谱，利用氨苄青霉素(Amp)基因和URA3(尿嘧啶合成酶)营养缺陷标记基因和作为筛选和标记基因。

图3为YEChIFNR基因的菌落PCR检测，PCR扩增获得的条带大小为582，与目标片段大小一致。其中M为DL2000DNA marker，1-5为不同Amp抗性菌株。

图4为重组质粒pYE-IFNR酶切鉴定，使用Xho I/Kpn I双酶切pYE-IFNR质粒后，得到的片段与目标片段大小一致。其中M为DNA marker，1-8为不同样品。

图5为YEChIFNG基因的菌落PCR检测，PCR扩增获得的条带大小为459，与目标片段大小一致。其中M₁和M₂为DNA marker，1-16为不同Amp抗性菌株。

图6为重组质粒pYE-IFNg酶切鉴定，使用Xho I/Kpn I双酶切pYE-IFNR质粒后，得到的片段与目标片段大小一致。其中M为DNA marker，1-4为不同样品。

图7为YEChIFNR基因测序图谱，与设计合成的序列一致。

图8为YEChIFNG基因测序图谱，与设计合成的序列一致。

图9为重组ChIFN的诱导表达SDS-PAGE电泳图，其中M：标准分子量蛋白，1-4为不同重组菌株，表达蛋白分子量约在29-44kDa之间。

图10为重组ChIFN-α的含量检测，利用ELISA技术对不同转化菌株中重组ChIFN-α的含量进行检测，y轴为A450吸光值读数，x轴为13株不同转化菌株。

图11为重组ChIFN-γ的含量检测，利用ELISA技术对不同转化菌株中重组ChIFN-α的含量进行检测，y轴为A450吸光值读数，x轴为13株不同转化菌株。

图12为不同诱导时间的重组ChIFN-α蛋白含量，利用ELISA技术对诱导剂处理不同时间的重组ChIFN-α的含量进行检测。

图13为重组菌株发酵pH值检测图，利用ELISA技术对获得最高表达量的表达蛋白进行检测，判断最适pH在3.9左右。

图14为不同诱导剂浓度诱导获得的重组蛋白SDS-PAGE电泳图，其中M为标准分子量蛋白，1为不携带质粒的对照菌株；2-6分别半乳糖浓度：1％、1.5％、2％、2.5％和3％。

图15为重组ChINF-α对IBDV攻毒的CEF细胞抑制观察显微图片，其中a为阳性对照，b为阴性对照，c为10^-6稀释，d为10^-5稀释。

图16为重组ChINF-γ对IBDV攻毒的CEF细胞抑制观察显微图片，其中a为阳性对照，b为阴性对照，c为10^-5稀释，d为10^-4稀释。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明。

SC选择培养基为：0.8％Ura缺陷培养基粉，2％葡萄糖

YPD筛选培养基为：2％胰蛋白胨，1％酵母提取物，2％葡萄糖(固体培养基加2％的琼脂粉)，60mg/l Amp。

诱导培养基为：0.8％Ura缺陷培养基粉，2％半乳糖，1％棉子糖；

或者0.8％Ura缺陷培养基粉，2％半乳糖，2％葡萄糖

(一)材料和方法

1.质粒和菌株

酿酒酵母表达质粒pYES2/CT和酿酒酵母菌菌株INVSc1均购自Invitrogen公司；大肠杆菌菌株DH5α为贵州省农业生物工程重点实验室保存，为通用菌株，可以对公众发放。

2.酿酒酵母表达载体构建

根据NCBI登录的干扰素基因ChIFN-α(GenBank accession No.U07868)和ChIFN-γ(GenBank accession No.U27465)的序列和酿酒酵母偏好性密码子(http://www.kazusa.or.jp/codon/)进行核酸序列改造，设计合成YEChIFNR和YEChIFNG基因，序列中添加KpnI和XhoI限制性酶切位点及保护碱基。

设计并合成以下全长引物：

P_YER L：5’-ATGGCTGTTCCAGCTTCTCCAC-3’

P_YER R：5’-TCAAGTTCTAGTGTTACCAGTCAAGT-3’

P_YEG L：5’-ATGACTTGTCAAACTTACAACTTGTTTG-3’

P_YEG R：5’-TCAACAGTTACATCTTCTTTGAGATTGAG-3’

使用KpnI/XhoI分别双酶切质粒pYES2/CT和PCR扩增产物，电泳回收目的基因小片段和载体质粒大片段，用T4DNA连接酶连接，构建酵母GAL1启动子驱动的YEChIFNR和YEChIFNG酵母表达载体pYE-IFNR和pYE-IFNG。将连接产物pYE-IFNR和pYE-IFNG转化E.coli感受态细胞。用含Amp的LB培养基和菌落PCR筛选阳性克隆，提取pYE-IFNR和pYE-IFNG质粒进行酶切和测序鉴定。

酶切反应体系为：Xho I 0.5-110μL；Kpn I 0.5-110μL；10×M Buffer 1-210μL；质粒4-810μL；最后加水至总体积10μL。PCR反应体系为：10×PCR Buffer 2μL；dNTP 1.6μL；上下游引物分别0.5μL；rTaq 0.2μL；模板DNA 0.1μL；最后加水至总体积20μL。PCR反应条件为：94℃5min，1cycle；94℃30sec，57℃30sec，72℃30sec，30cycles；72℃8min，1cycle。

3.GAL1启动子驱动的功能蛋白基因遗传转化酵母菌株

将获得的pYE-IFNR和pYE-IFNG酵母表达载体通过电击法转化酿酒酵母INVSc1菌株，YPD筛选培养基培养和菌落PCR筛选重组子INVSc1/pYE-IFNR和INVSc1/pYE-IFNG，挑取阳性克隆单菌落，SC液体选择培养基30℃振荡过夜培养保种。

4.重组蛋白的诱导表达及裂解

(1)挑取转重组酵母工程菌单菌落于15mLSC选择培养基中30℃、200r/min过夜震荡培养，待OD₆₀₀值达0.4时计算菌体数量，并将培养菌液于1500*g离心5min收集菌体。

(2)菌体中加入诱导培养基50mL，于30℃、200r/min振荡培养，到对数生长期时，取出转速1500rpm/min离心5min收集菌体。

(3)用500μl灭菌水重悬菌体细胞之后，10000r/min离心30s。

(4)菌体细胞液氮冷冻后置-80℃保存备用。

(5)将超低温保存的菌体细胞(1.5ml离心沉淀物)用约500μl裂解缓冲液(用量使OD₆₀₀＝50-100)重悬。

(6)加入等体积的酸洗玻璃珠(0.4-0.6mm)，涡旋振荡30s，冰浴30s。

(7)重复4次以上裂解过程。

(8)10000r/min离心裂解溶液10min。

(9)将上清移入新离心管中，冰上保存备用。

5.重组蛋白的SDS-PAGE电泳检测

(1)样品处理

蛋白样品上样前先加入等体积的2×SDS-PAGE样品处理液，在沸水浴中煮10min，10000r/min离心2min后取上清液上样。

(2)制胶

清洗电泳玻板：将玻璃板、样品梳用洗涤剂洗净，用自来水冲洗后，再用ddH₂O冲洗数次，晾干。

安装制胶模具：打开制胶模具，先安装凹型玻板，将两块胶条放在玻板两边，再小心安装另一块矩型玻板，两块胶条、玻板保存底端对齐。

胶溶液配制：按下列配方分别配制10％的分离胶9mL和5％的浓缩胶3mL。

灌胶：将混匀的分离胶沿玻板壁缓缓加入两块玻板之间至梳子下1cm，上面覆盖一层灭菌去离子水，静置20-30min后，看到凝胶与水层之间出现明显界面时，倒掉上层的水，用滤纸吸干残留部分，将混匀的浓缩胶沿玻板壁缓缓加入在分离胶上面至低玻璃线，然后插上梳子，静置20-30min。

(3)电泳

采用浓缩胶120V，分离胶200V恒压电泳，至前沿1-2cm时停止。

(4)染色脱色

剥胶后，蒸馏水洗胶片两次，浸入染色液(考马斯亮蓝R-250)染色4-5h或过夜。染色后用蒸馏水洗涤，再用脱色液脱色，中途换3-4次脱色液(间隔1h)，在脱色摇床中脱色过夜或脱色至背景清晰透明，照相分析。

6.高效表达菌株筛选

使用美国RB公司的chook IFN-α(γ)ELISAkit测定重组干扰素蛋白含量，以标准品不同浓度为横坐标，A₄₅₀nm吸光值为纵坐标绘制标准曲线，根据所得曲线方程计算目标蛋白浓度。

(1)ELISA检测

按照试剂盒说明书操作制定标准曲线和测定样品A450吸光值。

(2)酵母总蛋白测定

按照Bradford法制备标准曲线，并测定样品A₅₉₅的光密度值，根据所得曲线方程计算样品总蛋白含量，进一步计算表达蛋白占重组酵母菌体蛋白的比例。

7.表达体系优化

(1)诱导时间对酵母表达的影响

测定SC培养基过夜培养的INVSc1/pYE-IFNR和INVSc1/pYE-IFNG菌液的OD₆₀₀值，计算并加入相应体积的菌液使得接种后50ml诱导培养基的OD₆₀₀值为0.4。在0、4、6、8、12、16、20、24h时各取5ml菌液测定其OD₆₀₀和pH值。根据个时间点取样的菌液OD₆₀₀值，计算加入裂解液(50mM的磷酸缓冲盐溶液pH7.4、1mM EDTA、5％甘油、1mM PMSF)的体积，使得重悬酵母菌液体OD₆₀₀值为100，裂解菌体提取酵母总蛋白，进行SDS-PAGE电泳，观察诱导表达的重组蛋白各时间段表达情况。半乳糖诱导剂诱导不同时间处理后的宿主菌体提取的酵母蛋白进行酶联免疫检测，试验设置重复2次，取平均值进行标准曲线绘制和重组蛋白含量计算。

(2)pH值对酵母表达的影响

新鲜菌液在添加诱导剂后的0、4、6、8、12、16、20和24h时，分别测定发酵菌液的pH值，并裂解菌体提取酵母总蛋白，通过SDS-PAGE和ELISA检测重组蛋白数量，以确定重组酵母发酵的最适pH。

(3)半乳糖浓度的优化

确定最佳培养时间之后，以1％、1.5％、2％、2.5％、3％五个半乳糖诱导表达浓度梯度来进行诱导浓度优化。不同半乳糖浓度培养基培养INVSc1/pYE-IFNR和INVSc1/pYE-IFNG，30℃振荡培养12h，裂解菌体提取酵母总蛋白，进行SDS-PAGE电泳，观察不同诱导浓度重组蛋白表达情况。

8.重组蛋白的生物学活性检测

(1)样品制备

1)诱导INVSc1/pYE-IFNR和INVSc1/pYE-IFNG表达重组IFN蛋白。

2)菌液4℃、3000rpm离心10min。

3)弃上清，用蒸馏水将菌体洗出移至冰浴研钵中。

4)加石英砂研磨，每研磨10min，放入-20℃冰箱冻存10min，重复3-4次。

5)将研磨好的菌液移入烧杯中，按体积计算称取相应质量的硫酸铵使菌液饱和，硫酸铵少量多次加入，边加边搅拌，完全溶解后，4℃冰箱沉淀过夜。

6)将硫酸铵沉淀后的上清弃去，将蛋白移入透析袋封好放入蒸馏水中，置于4℃冰箱透析，每30min换水，直至滴奈氏试剂后水中不析出黄色或红棕色沉淀。

7)取出透析袋中蛋白溶液放入培养皿中，-80℃冷冻2h后进行冷冻干燥，制得干粉置-80℃保存备用。

(2)细胞病变抑制试验

通过传染性法囊病毒(IBDV)-鸡胚成纤维细胞系(DF-1细胞)系统，研究重组干扰素对攻毒后的DF-1细胞产生的保护作用。

鸡胚处理。取9日龄的SPF鸡胚，在蛋壳气室部用5％碘酒和75％酒精消毒后，击破蛋壳和蛋壳膜，取出鸡胚置于无菌平皿内，剪去头、脚、翅和内脏，然后转入三角瓶中将组织剪成1-2mm³大小碎块。用Hanks液洗涤组织碎块2次。

蛋白酶消化。将37℃预热的0.25％胰蛋白酶溶液(pH7.8)加入装有鸡胚的三角瓶中(10mL/鸡胚组织块)。将三角瓶于37℃水浴约20min，每隔几分钟轻轻摇晃一次。当组织块变松散后，取出三角瓶静置1-2min，吸去胰蛋白酶液，加Hanks液约20ml，轻轻摇匀后吸出弃去以洗去残余的胰蛋白酶。按每个鸡胚10ml加入生长液，用粗口吸管轻轻吹打组织块分散细胞。组织液静置1-2min组织块下沉后，吸出细胞悬液转入灭菌烧杯中，并用灭菌纱布过滤细胞悬液除去组织块。

细胞培养。用生长液将组织液稀释成每mL含20-40万细胞的悬液。将细胞悬液分装到细胞培养瓶，制备鸡胚成纤维(CEF)单层细胞。培养瓶置37℃温箱内静置培养。开始两周每天换培养基，以后每周换两次培养基。出现污染的细胞弃去。

传代培养。轻轻摇动细胞培养瓶数次，悬浮起细胞表面碎片后倒出，用Hanks液洗涤2次。加入0.25％胰蛋白酶液5mL消化细胞，37℃消化细胞8-15min倾去酶液，加入营养液并轻轻吹打数次分散细胞。细胞组织液1,000rpm/min离心5min，除去含酶溶液。用培养液悬浮细胞沉淀后分装到新灭菌培养瓶中。37℃温箱静置培养1-2天至单层细胞长成。

样品对DF-1细胞的毒性实验。将样品(5mg)分别用含2％胎牛血清的DMEM培养液5ml稀释(稀释后药物浓度为1mg/ml)后，再用孔径为0.22μm滤器过滤除菌置于4℃冰箱备用；将此除菌后的15种药物按1/2、1/4、1/8、1/16作4倍稀释(稀释液为2％胎牛血清培养液)，分别接种于生长单层的1日龄的DF-1细胞的96孔细胞培养板上，每种浓度重复3孔(每孔100μl)，然后置于含5％CO2的37℃恒温培养箱中培养，在倒置显微镜下连续观察7天细胞的CPE情况。

IBDV的半数细胞感染量(TC1D₅₀)的测定。将病毒液作10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5......10^-10稀释(稀释液为2％胎牛血清的DMEM培养液)后，分别接种于生长单层的DF-1细胞的96孔细胞培养板上，每种浓度重复8孔(每孔100μl)，然后置于含5％CO2的37℃恒温培养箱中培养，在倒置显微镜下连续观察7天细胞的CPE情况。

重组IFN抗IBDV的测定。将已无菌处理的8种样品(1mg/ml)用含2％胎牛血清培养液稀释成10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8后备用，取100ul分别接种于生长单层DF-1细胞的96孔细胞培养板上，每种浓度重复4孔(每孔100μl)，然后置于含5％CO2的37℃恒温培养箱中培养18h，后倾去重组干扰素，用PBS液洗涤2次，然后加入100TCID₅₀的IBDV100μl，同时设阳性对照和只加病毒的阴性对照，再将此96孔板置含5％CO2的37℃恒温培养箱中培养，待病毒对照孔细胞75％出现病变时，将抑制50％细胞病变的干扰素的最高稀释度定为1个干扰素单位。

(二)结果

1.表达载体构建

鸡α干扰素和γ干扰素基因的酵母表达载体物理图谱见图1和图2。通过菌落PCR、Xho I/Kpn I双酶切以及测序鉴定，得到条带与预期片段一致(见图3、图4、图5、图6)，获得构建正确的酵母表达载体pYE-IFNR和pYE-IFNG(见图7、图8。

2.重组酵母及其表达蛋白

通过电击法将目的基因遗传转化酵母菌株INVSc1，获得能表达目的蛋白的重组菌株，重组α干扰素和γ干扰素蛋白的分子量在29-44KDa之间(见图9)，在不同菌株内，重组蛋白含量不一致(见图10、图11)，其中，最高的重组ChIFN-α蛋白的含量为43.55pg/ml，占菌体总蛋白的2.4×10^-4％；最高的重组ChIFN-γ蛋白的含量为86pg/ml，占菌体总蛋白的6.02×10^-3％。

3.重组酵母的发酵条件

利用SDS-PAGE及ELISA技术对诱导时间、pH值及诱导剂浓度进行研究，发现诱导12h时可以获得最高的重组蛋白含量77.42ng/l(见图12)。适合的重组菌液发酵pH值为3.9左右(见图13)。而采用2.5％的半乳糖浓度进行诱导，获得的重组α干扰素蛋白表达量最高(见图14)。

4.获得具有生物学活性的重组鸡干扰素蛋白

ELISA检测结果表明，重组蛋白能被鸡α干扰素和鸡γ干扰素特异性抗体识别。利用IBDV-CEF体系，通过细胞病变抑制实验对重组酵母细胞提取物进行检测，发现两种重组蛋白均对病毒IBDV攻毒后的鸡胚细胞具有保护作用，表现出对该病毒的抑制活性(见图15、图16)。其中，重组ChIFN-α的抗IBDV活性为1×10⁵IU/mg，而重组ChIFN-γ的抗IBDV活性为1×10⁴IU/mg。

发明者将鸡干扰素基因ChIFN-α和ChIFN-γ遗传转化酿酒酵母，获得具有抗病毒活性的表达蛋白及其宿主菌株，这为具有药用价值的功能酵母添加剂的创制奠定了基础，为动物疫病的防治提供了新的思路。

Claims (8)

1.一种人工合成的鸡干扰素基因YEChIFNR，其核苷酸序列如SEQ ID NO1所示。

2.一种重组表达载体，具有权利要求1所述的人工合成的鸡干扰素基因YEChIFNR，其骨架载体为pYES2/CT。

3.一种重组工程菌，具有权利要求1所述的人工合成的鸡干扰素基因YEChIFNR，所述受体菌为酿酒酵母菌株INVSc1。

4.权利要求3所述的重组工程菌生产药用蛋白鸡干扰素的方法，包括如下步骤：

（1）、酵母菌的培养：保种的重组工程菌接种于SC选择培养基上，于30℃，200r/min过夜震荡培养；

（2）、酵母菌的诱导表达培养：当过夜培养的新鲜菌液OD₆₀₀=0.3-0.5时，离心收集菌体并用含半乳糖的液体诱导培养基重悬，并于30℃、200r/min振荡培养。

5.根据权利要求4所述的方法，所述步骤（2）的培养条件为：诱导12h，重组菌液发酵pH值为3.8-4.0，2.5%的半乳糖浓度。

6.根据权利要求4所述的方法，所述步骤还包括保种的重组工程菌的制备方法，将重组工程菌在YPD筛选培养基培养，菌落PCR筛选，挑取阳性克隆单菌落，于SC选择培养基中30℃振荡过夜培养保种，所述YPD筛选培养基为：2%胰蛋白胨+1%酵母提取物+2%葡萄糖+60mg/l Amp。

7.根据权利要求6所述的方法，所述SC选择培养基为：0.8%Ura缺陷培养基粉+2%葡萄糖；所述诱导培养基为0.8%Ura缺陷培养基粉+2%半乳糖+1%棉子糖或者2%葡萄糖。

8.根据权利要求4所述的方法，所述步骤（2）的酵母菌培养到对数生长期时，取出转速1500r/min离心5min收集菌体，灭菌水重悬菌体细胞之后，10000r/min离心30s，得菌体细胞用裂解缓冲液重悬。

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