CN101736062B

CN101736062B - 一种重组猪α干扰素标准品的制备方法

Info

Publication number: CN101736062B
Application number: CN2009101856564A
Authority: CN
Inventors: 王明丽; 赵俊
Original assignee: Individual
Current assignee: ANHUI JIUCHUAN BIOTECHNOLOGY Co Ltd; Wuhu Phil Biological Products Industry Research Institute Co Ltd
Priority date: 2009-11-27
Filing date: 2009-11-27
Publication date: 2012-11-07
Anticipated expiration: 2029-11-27
Also published as: CN101736062A

Abstract

本发明公开了一种重组猪α干扰素标准品的制备方法，将重组猪α型干扰素的重组菌进行发酵、诱导表达并提取总蛋白，用两步法纯化后得到标准品。本发明制备的重组猪α型干扰素生物学活性参考标准品可用于重组猪α型干扰素特性鉴别和效价测定，以此为标准可使不同批次及同一批次不同次测定的重组猪α型干扰素效价结果更为可信。

Description

一种重组猪α干扰素标准品的制备方法

技术领域

本发明涉及一种标准品的制备方法，具体是一种重组猪α干扰素标准品的制备方法。

背景技术

畜牧业是我国国民经济重要支柱产业之一，养殖方式从传统的粗放经营向高密度、集约化养殖高速发展。但是伴随高密度、集约化的养殖高速发展，病毒性疾病已经成为限制畜禽产业快速发展的第一大障碍。据不完全统计，我国每年因各种病毒性疾病引起畜禽死亡率高达15％-20％，经济损失达数十亿元。与此同时，我国加入WTO后，市场对畜禽产品的需求逐渐从数量型转向质量型，对畜禽产品的质量要求达到前所未有的程度，因畜禽病害、药物残留、以及不符合卫生标准的畜禽类食品不仅影响我国畜牧业发展、产品出口创汇，甚至威胁到人的身体健康。

猪病毒性疾病是当前严重制约猪养殖业健康发展的主要传染病。全年均有发生，如猪病毒性腹泻、流行性感冒等。这些动物一旦感染发病，则有起病急，临床症状严重，极易传播扩散，以及病死率和死亡率均较高的特点，给养殖业造成巨大经济损失；更为重要的是，猪与人类密切接触，某些人畜共患病还给人类健康带来潜在威胁。

干扰素(interferon，IFN)是病毒感染诱导机体产生的一种具有广谱抗病毒、抗肿瘤和具有免疫调节作用的蛋白质，于1957年Issacs和Lindeman首先发现，它是一类多功能的细胞因子，与细胞受体结合后，可诱导机体产生特异的蛋白质和酶类，主要通过抑制病毒基因转录和降解病毒RNA来抑制病毒的生长繁殖及发挥抗肿瘤的活性。按照干扰素的产生细胞、生化特征及在机体免疫方面所发挥的作用不同，分为α、β、γ三类，其中α型干扰素在机体内能发挥广谱、高效抗病毒作用机制是抑制病毒蛋白质的合成，并能选择性地作用于受感染细胞，而对正常宿主细胞无作用或作用微弱，在临床上得到广泛的应用。

由于干扰素具有良好的抗病毒、抗肿瘤及免疫调节功能，而对正常宿主细胞无影响，因此被认为是当今应用前景最为广阔的生物制剂之一。为了有效预防和控制人畜共患病，减少病毒性疾病对养猪业带来的损失，本实验室已经构建了可高效表达具有生物学活性的重组猪α干扰素(rpoIFN-α)的重组菌。

对于生物制品来说，其质量评价的有效性指标多采用生物学方法，如动物法和细胞法等进行检测。这些方法本身变异性较大，因此标准品是生产中必不可少的组成部分，在生物制品标准化、质量控制和效力评价中标准品是药品质量评价的标尺，起着非常重要的作用。然而目前国际国内均没有rpoIFN-α的标准品，这给实际研究工作带来很多不便。

发明内容

本发明提供了一种重组猪α干扰素标准品的制备方法，所制备的重组猪α干扰素标准品纯度高，对胰蛋白酶极为敏感，对酸稳定，可用于重组猪α型干扰素特性鉴别和效价测定。

本发明的技术方案为：

一种重组猪α干扰素标准品的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)、重组猪α型干扰素工程菌的发酵及蛋白提取：

将重组猪α型干扰素工程菌接种于含有氨苄青霉素的固体LB培养基上，保持温度为35-38℃，培养过夜；

重组猪α型干扰素工程菌表达质粒为pET-32(a)，装入猪α干扰素基因；基因工程宿主菌为大肠杆菌BL21(DE3)；序列是：

TGAAAGTGAAAAGAAGCATGACGGCAAGTGGACGATTGGAATTCATGTGTGACCTGCCTCAGACCCACAGCCTGGCTCACACCAGGGCCCTGAGGCTCCTGGCACAAATGAGGAGAATCTCTCCCTTCTCCTGCCTGGACCACAGAAGGGACTTTGGATCCCCTCATGAGGCTTTTGGGGGCAACCAGGTCCAGAAGGCTCAAGCCATGGCTCTGGTGCATGAGATGCTCCAGCAGACCTTCCAGCTCTTCAGCACAGAGGGCTCGGCTGCTGCCTGGGATGAGAGCCTCCTGCACCAGTTCTGCACTGGACTGGATCAGCAGCTCAGGGACCTGGAAGCCTGTGTCATGCAGGAGGCGGGGCTGGAAGGGACGCCCCTGCTGGAGGAGGACTCCATCCTGGCTGTGAGGAAATACTTCCACAGACTCACCCTCTATCTGCAAGAGAAGAGCTACAGCCCCTGTGCCTGGGAGATCGTCAGGGCAGAAGTCATGAGAGTCTTCTCTTCCTCCACAAGCCTGCAAGACAGACTCAGGAAGAAGGAGTGAAAGCTTAATCTCCAGAGGATCGCCGGGAACCGAGGACGAGTTCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAAATCGGCCCAACGCGCGGGGGAGAGGGCGGTTTTGCGTATTTGAGCGCTCTTTCCCGCTTCCCTTCGCTTCACTGACTTCGGCTGCCGGCTT

然后将培养得到的阳性克隆菌接种至含有氨苄青霉素的固体LB培养基上，摇床振荡培养，培养温度为35-38℃，时间为17-20小时；

将摇床振荡培养得到的菌液接种至LB培养基中再次进行摇床振荡培养，菌种与LB培养基的体积比为1∶80-100，培养温度为35-38℃，时间为17-20小时；

将再次进行摇床振荡后得到菌种接种至含有LB培养基的发酵罐内进行发酵，发酵罐内的溶氧量为25-35％，温度为35-38℃，PH值为7-8；

对发酵后的菌种进行检测，当OD₆₀₀达到0.6-0.8时，在菌种中加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷进行诱导，温度为30-35℃，时间为5小时；

将诱导后的菌种进行离心、缓冲液重悬、细胞破碎，再次离心取上清液，即重组猪α型干扰素；

(2)、重组猪α型干扰素的纯化：

亲和层析纯化：将重组猪α型干扰素经过层析柱上样、洗杂，梯度洗脱，收集洗脱后的蛋白吸收峰；

分子筛层析纯化：将洗脱后的蛋白吸收峰经分子筛层析柱上样，洗脱，收集洗脱后的蛋白吸收峰，即重组猪α干扰素标准品；

所述的重组猪α干扰素标准品的制备方法，其特征在于：具体步骤为：

(1)、重组猪α型干扰素工程菌的发酵及蛋白提取：

将重组猪α型干扰素工程菌种于含有氨苄青霉素的固体LB培养基上，37℃培养过夜；

然后将培养得到的阳性克隆接种至3ml含有氨苄青霉素的LB培养基中，37℃摇床震荡培养18h，转速为220r/min；

非阳性克隆菌不能在含有氨苄青霉素的LB培养基上生长，只有阳性克隆菌能在含有氨苄青霉素的LB培养基上生长；

将摇床振荡培养得到的菌液接种至200ml LB培养基中置37℃摇床，转速为220r/min，震荡培养18h，作为发酵种子，菌液与LB培养基的体积比为1∶100。

将再次进行摇床振荡后得到菌种接种至含有LB培养基的发酵罐内进行发酵，设置温度为37℃、溶氧为30％、转速为270r/min、pH为7.4，菌种与LB培养基的体积比为1∶100；

当OD₆₀₀达到0.6-0.8时，在菌种中加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷至终浓度为1mmol/L进行诱导，调温度至32℃，诱导表达5h；

诱导结束后收集发酵液，清洗罐体；

将发酵液4℃条件下4000r/min离心10min，收集菌体，用200ml磷酸缓冲液重悬；然后将重悬后菌液在1000bar压力下高压细胞破碎、4℃条件下12000r/min离心10min，收集上清。

(2)、重组猪α型干扰素的纯化：

亲和层析纯化重组猪α型干扰素：

清洗：用双蒸水清洗系统管道和层析柱；

平衡：用3-5个柱体积的Binding Buffer 1平衡层析柱；

上样：将用0.22μm孔径滤膜过滤处理过的样品过层析柱；

洗杂：用2个柱体积以上的Binding Buffer 1溶液过层析柱，该溶液组成为：20mM Na₂HPO₄，0.5M NaCl，调节pH至7.4，洗去未与层析柱结合的杂蛋白，直到检测不到蛋白吸收峰；

洗脱：用Elution Buffer，该溶液组成为：20mM Na₂HPO₄，0.5M NaCl 0.5M咪唑，pH7.4，梯度洗脱，之后继续100％梯度洗脱20ml；收集：洗脱过程中用自动收集器收集洗脱下来蛋白吸收峰；

洗柱：用双蒸水清洗层析柱；

保存：用20％乙醇过层析柱；

分子筛层析进一步纯化重组猪α型干扰素：

清洗：用双蒸水清洗系统管道和分子筛层析柱；

平衡：用2-3个柱体积的Binding Buffer 2，该溶液组成为：50mM Na₂HPO₄，0.15M NaCl，调节pH至7.0，平衡分子筛层析柱；上样：4℃条件下将上述亲和层析收集的样品12000r/min离心10min，按柱体积的1％上样通过层析柱；

洗脱：用Binding Buffer 2洗脱；

收集：洗脱过程中收集洗脱下来蛋白吸收峰；

洗柱：用双蒸水清洗柱子；

保存：用20％乙醇过柱。

重组猪α型干扰素标准品鉴定方案如下：

1)SDS-PAGE和HPLC鉴定在95％以上；

2)N端氨基酸测序使用Edman降解法，在测序之前先用肠激酶将重组干扰素酶切，再电泳并转到PVDF膜上，立春红染色后将干扰素部分的蛋白条带剪下进行测序，N-末端氨基酸序列从第十个氨基酸开始为CDLPQTHSLAHTRALR；

3)在Hep-2/VSV系统上以北京生物制品所制备的重组人α型干扰素(rhIFN-α)国家标准品对其效价经行标定，其效价为≥1.0×10⁴～1.0×10⁵IU/ml；4)Lowry法检测蛋白浓度，其蛋白含量为0.4mg/ml。

重组猪α型干扰素标准品其理化特征是：猪α干扰素单克隆抗体可中和重组猪α干扰素标准品的生物学活性，证明该重组蛋白确实为猪α干扰素；对胰蛋白酶极为敏感，但对酸和热较为稳定，在56℃保温1h，活性仍保留在50％。

本发明制备的制备的重组猪α型干扰素生物学活性标准品效价为≥1.0×10⁴-1.0×10⁵IU/ml；SDS-PAGE纯度≥95％；HPLC纯度为≥95％；相对分子量为35KD±5％；N-末端氨基酸序列从第十个氨基酸开始为CDLPQTHSLAHTRALR；猪α干扰素单克隆抗体可中和重组猪α干扰素标准品生物学活性，证明该重组蛋白确实为猪α干扰素；对胰蛋白酶极为敏感，但对酸(pH2.0)和56℃30min非常稳定，在56℃保温1h，活性仍保存在50％左右，主要理化性质与北京生物制品所研制的重组人干扰素α2b标准品类似。可用作重组猪α型干扰素效价测定的参考标准。

具体实施方式

重组猪α干扰素标准品的制备方法：

1、重组猪α型干扰素工程菌的发酵及蛋白提取：

非阳性克隆菌不能在含有氨苄青霉素的LB培养基上生长，只有阳性克隆菌能在含有氨苄青霉素的LB培养基上生长。LB培养基是一种用于培养基因工程受体菌(大肠杆菌)的常用培养基。LB解释为Luria-Bertani培养基，应用最广泛和最普通的细菌基础培养基，有时又称为普通培养基。它含有酵母提取物、蛋白胨和NaCl。

诱导结束后收集发酵液，清洗罐体；

2、重组猪α型干扰素的纯化：

(1)、亲和层析纯化重组猪α型干扰素：

清洗：用双蒸水清洗系统管道和层析柱，流速为5ml/min；

平衡：用3-5个柱体积的Binding Buffer 1平衡层析柱，流速为2ml/min；

上样：将用0.22μm孔径滤膜过滤处理过的样品过层析柱，流速为1ml/min；

洗杂：用2个柱体积以上的Binding Buffer 1(20mM Na₂HPO₄(3.5814)，0.5M NaCl(14.61)，pH7.4)过层析柱，洗去未与层析柱结合的杂蛋白，直到检测不到蛋白吸收峰，流速1ml/min；

洗脱：用Elution Buffer(20mM Na₂HPO₄(3.5814)，0.5M NaCl(14.61)0.5M咪唑(17.02)，pH7.4)梯度洗脱，0％-100％40ml，之后继续100％梯度洗脱20ml，流速1ml/min；

收集：洗脱过程中用自动收集器收集洗脱下来蛋白吸收峰；

洗柱：用双蒸水清洗层析柱，流速为5ml/min；

保存：用20％乙醇过层析柱，流速为5ml/min；

(2)、分子筛层析进一步纯化重组猪α型干扰素：

清洗：用双蒸水清洗系统管道和分子筛层析柱，流速为0.5ml/min；

平衡：用2-3个柱体积的Binding Buffer 2(50mM Na₂HPO₄(8.908)，0.15M NaCl(4.383)，pH7.0)平衡分子筛层析柱，流速为0.5ml/min；

上样：4℃条件下将上述亲和层析收集的样品12000r/min离心10min，按柱体积的1％上样通过层析柱，流速为0.5ml/min；

洗脱：用Binding Buffer 2以0.5ml/min的流速洗脱；

收集：洗脱过程中收集洗脱下来蛋白吸收峰；

洗柱：用双蒸水清洗柱子，流速0.5ml/min；

保存：用20％乙醇过柱，流速为0.5ml/min。

3、蛋白质含量测定：

对上述纯化前后的猪α干扰素样品用Lowry法检测蛋白浓度，其蛋白含量为0.4mg/ml。

4、SDS-PAGE进行纯度鉴定：

对蛋白表达条件优化及工程菌发酵得到的蛋白样品进行SDS-PAGE鉴定纯度及分子量：

按照分子克隆试验指南进行制备5％的浓缩胶和的12％分离胶；

灌胶：按照仪器使用说明安装好垂直板SDS聚丙烯酞胺凝胶电泳装置，迅速在两层玻璃板间灌入分离胶，并在胶面上用少量蒸馏水覆盖；待分离胶完全聚合后，倒出表面的蒸馏水，以少量1×SDS-PAGE缓冲液(25mmol Tris-Cl pH8.0，250mmol甘氨酸，0.1％SDS)冲洗表面。以滤纸吸去凝胶表面液体，迅速加入适量浓缩胶并插入梳齿，室温静置，待浓缩胶聚合完全后拔出梳齿；

上样：以10μl低分子量蛋白标准作为电泳分子量指示，取样品10μl与等体积上样缓冲液混合(4％SDS，20％甘油，10％β-琉基乙醇，125mmol/L Tris-HClpH6.8，0.1溴酚蓝)，100℃煮沸5分钟，短暂离心后以微量加样器依次上样；

电泳：将适量1×SDS-PAGE缓冲液(25mmol Tris-Cl pH8.0，250mmol甘氨酸，0.1％SDS)倒入电泳槽，连接好电源。电泳条件为恒压方式，电压调为8V/cm，待样品进入分离胶后，升至15V/cm，当指示剂抵达分离胶底部时关闭电源；

固定、染色及脱色：取下凝胶，以5倍体积的考马斯亮蓝R-250染色液(0.25g考马斯亮蓝溶解于100ml甲醇/冰醋酸溶液中，甲醇∶水∶冰醋酸＝45∶45∶10)浸泡凝胶，室温下缓慢摇动4小时。回收染色液，以脱色液(45％甲醇，10％冰醋酸)浸泡凝胶，缓慢摇动脱色，其间更换脱色液3次，待凝胶背景清晰后，观察结果；

SDS-PAGE鉴定其纯度≥95％。

5、HPLC纯度鉴定

纯化后的rpoIFN-α做HPLC纯度鉴定：

清洗：用双蒸水洗去纯化系统管道中的保存液，再用2-3个柱体积的双蒸水清洗分子筛层析柱，流速为0.5ml/min；

平衡：用2-3个柱体积的0.1％TFA水溶液平衡分子筛层析柱，流速为1ml/min；

上样：将样品脱盐处理后上样50μl；

洗脱：线性梯度洗脱：0-70min 0～70％0.1％TFA乙腈溶液；

洗柱：用双蒸水清洗柱子，流速1ml/min；

保存：用20％乙醇过柱，流速为1ml/min；

结果：经HPLC鉴定纯化后的rpoIFN-α其纯度≥95％。

6、N-端氨基酸序列测定：

N-端氨基酸序列测定的作用是确证纯化的目的蛋白就是重组猪α型干扰素；

酶切：取纯化后的rpoIFN-α200μg，加4单位重组肠激酶，与酶切缓冲液中4℃条件下酶切16小时；

SDS-PAGE电泳：取酶切产物进行SDS-PAGE电泳，上样前先将配置好的聚丙烯酰胺凝胶装到垂直电泳仪上，用50V恒压空跑30min；

转膜：将蛋白电转到PVDF膜上，电转缓冲液用CAPS缓冲液；

立春红染色：将PVDF(聚偏氟乙烯)膜放到立春红染液中染色，待看到蛋白条带后拿出，用水洗去背景颜色；

将目的条带剪下放于Eppendorf管中，-20℃保存，用Edman降解法进行N端氨基酸测序；

N-末端氨基酸序列从第十个氨基酸开始为CDLPQTHSLAHTRALR，确证纯化的目的蛋白就是重组猪α型干扰素。

7、效价滴定

rhIFN-α标准参考品：购自北京中国药品生物制品研究所，干扰素α国家标准品，批号：97/04，下称标化干扰素；

细胞：人喉癌传代细胞(Hep-2)株；

病毒：攻击病毒为水疱性口炎病毒(VSV)；

方法：采用微量细胞病变抑制法；

测定干扰素抗病毒活性，以实际测得的效价即干扰素的工作单位表示。工作单位经修正后以国际单位表示，必须有标化国际单位的IFN同时滴定，测定的标化干扰素国际单位除以标化单位即可得到一系数，将此系数乘以工作单位；

二倍递增系列稀释待检重组猪α干扰素：根据需要横排做：10个稀释度(1∶2.......1∶1024)；第11孔为病毒对照；第12孔为细胞对照，若竖排做：为6个稀释度(1∶2......1∶64)；第7孔病毒对照，第8孔细胞对照，亦可用四倍递增系列稀释IFN；每个批号IFN需作复孔；标化干扰素以同上方法稀释10孔或6孔。10％牛血清RPMI 1640液作为IFN稀释液，每个稀释度每孔100μl可在96孔板上用100μl加样器直接稀释，最终每孔100μl。病毒对照和细胞对照不加干扰素；

制备Hep-2细胞悬液：Hep-2为处于对数生长期，即传代后18～24h已形成单层，镜下观察时，细胞透亮，立体感强；

用pH7.4PBS洗涤细胞二次，倒去PBS加入3～5mlVTP消化液室温作用3min后→倒去VTP→静透5min→待细胞从玻璃瓶表面滑下，加入10％小牛血清RPMI1640培养液，调整细胞数为1-3×10⁵/ml，每孔100μl与不同稀释度rIFN混合。病毒对照，细胞对照孔均加100μl细胞悬液。混匀后将该96孔板置5％CO₂37℃孵箱培养16-18h，(IFN在细胞上诱导抗病毒蛋白的时间控制在16-18h若要快速亦不能少于6h)；

VSV攻击：IFN与细胞共孵育16-18h后，倒去96孔板的液体加入配制合适浓度的VSV 100μl/孔(预先滴定VSV TCID₅₀，以24h可使Hep-2细胞完全破碎的TCID₅₀为合适浓度)；

结果观察与分析：

通常VSV攻击后24h，镜检病毒对照孔细胞破碎达100％而细胞对照正常时，即可用结晶紫染色，水洗后肉眼观察记录，细胞完整良好呈紫色如细胞对照孔，干扰素保护孔均呈紫色(一)100％病变细胞为细胞全脱落故无色，如病毒对照孔和无干扰素保护的孔均无色(100％CPE++++)举例如下：

表1.某批重组猪α干扰素标准品结果以“+”“-”记号记

录形式

表2.50％保护细胞的干扰素稀释度计算(Reed Muench计算)

50％保护为2⁷，即1∶128，即本rIFN的工作单位(U)为128U；

工作单位修正以国际单位(IU)表示：

每次设立有标化国际单位的IFN同时测定，若标化的IFN为7500IU，而本次实验滴定标化干扰素的工作单位为2000U，以下面公式算出系数，乘以实际滴定的每个样本工作单位，即为该rIFN国际单位。

所以每次滴定干扰素必需加上标化干扰素，使所测干扰素的工作单位加以修正，并以国际单位(IU)表示；

经过测试，制备的重组猪α干扰素标准品效价达到≥1.0×10⁴～1.0×10⁵IU/ml。

8、重组猪α干扰素蛋白理化性状检测：

材料与方法：

对照参比品为rhIFN-α标准参考品：购自北京中国药品生物制品研究所，干扰素α国家标准品，批号：97/04，下称标化干扰素；

猪α干扰素单克隆抗体：购自ABcam公司；

细胞：用于抗病毒活性测定的细胞：人喉癌传代细胞(Hep-2)株；

干扰素效价测定：采用微量板染色法进行。攻击病毒为水疱性口炎病毒(VSV)；

结果：

抗胰蛋白酶水解实验：用胰蛋白酶溶液重新溶解重组猪α干扰素标准品(猪α干扰素效价稀释为10000IU/ml，胰蛋白酶的终浓度2.5μg/ml)。37℃作用1h，加入含10％小牛血清的DMEM营养液，稀释并中止胰蛋白酶的作用，而后依照微量板测定方法测定其干扰素活性，对照为未经胰蛋白酶处理的同批标准品。结果经胰蛋白酶作用1h的干扰素样品的活性损失在95％以上，表明重组猪α干扰标准品素对胰蛋白酶不耐受(表3)，符合蛋白质的生物学特性；

表3重组猪α干扰素标准品对胰蛋白酶耐受性测定结果^*

*0.25％胰蛋白酶，37℃作用1h

热稳定性实验：取三批重组猪α干扰素标准品2ml(浓度为0.4mg/ml)，分别于0.5h、1h和2h取样，4℃保存，统一测其生物学活性。以同批未经加热处理的样品为对照测定其干扰素活性。结果，经上述3种时间在56℃加热处理后的干扰素仍分别保留58.68％、51.55％和24.15％的活性，说明重组猪α干扰素标准品具有较好的热稳定性(详见表2)；

表4重组猪α干扰素标准品的热稳定性测定结果^*

*测定样品原效价5×10⁴单位/ml，水浴温度56℃。

酸稳定性实验：用2.5mol/L HCL分别将重组猪α干扰素标准品以及标准参比品(北京生物制品所产品)调至pH2.0，而后置4℃。分别于24h、48h和96h取样，以同批未经酸灭活的干扰素样品为对照，测定其IFN活性；结果见表3。三种样品在pH2.0作用24h时，用NaOH将pH值调回后，测定效价，干扰素活性几乎未受破坏；

表5pH2.0处理重组猪α干扰素标准品的测定结果^*

*用2.5mol/L HCl调IFN样品pH至2.0，4℃处理不同时间后测定3份平行标本测定的平均结果

与抗猪干扰素抗体的中和实验：将从ABcam公司购买的抗猪α干扰素单克隆抗体，与重组猪α干扰素混合后，37℃水浴作用1h后测定效价，结果被检的活性损失在95％以上，表明抗猪α干扰素单克隆抗体可中和重组猪α干扰素标准品的生物学活性(表4)；

表6重组猪α干扰素标准品对抗猪干扰素抗体的中和实验测定结果^*

*抗猪α干扰素单克隆抗体，37℃作用1h

结果判断：

我们用ABcam公司购买的猪α干扰素单克隆抗体对重组猪α干扰素标准品进行了中和试验，结果证明，该重组蛋白确实为猪α干扰素；并证实该IFN对胰蛋白酶极为敏感，但对酸和热较为稳定。在56℃保温1h，活性仍保留在50％，主要理化性质与北京生物制品所研制的重组人干扰素α2b标准品类似。

Claims

1.一种重组猪α干扰素标准品的制备方法，其特征在于：具体步骤为：

(1)、重组猪α型干扰素工程菌的发酵及蛋白提取：

重组猪α型干扰素工程菌表达质粒为pET-32a，装入猪α干扰素基因；基因工程宿主菌为大肠杆菌BL21(DE3)；序列是：

将摇床振荡培养得到的菌液接种至200ml LB培养基中置37℃摇床，转速为220r/min，震荡培养18h，作为发酵种子，菌液与LB培养基的体积比为1∶100；

诱导结束后收集发酵液，清洗罐体；

将发酵液4℃条件下4000r/min离心10min，收集菌体，用200ml磷酸缓冲液重悬；然后将重悬后菌液在1000bar压力下高压细胞破碎、4℃条件下12000r/min离心10min，收集上清；

(2)、重组猪α型干扰素的纯化：

亲和层析纯化重组猪α型干扰素：

清洗：用双蒸水清洗系统管道和层析柱；

平衡：用3-5个柱体积的Binding Buffer 1平衡层析柱，该溶液组成为：20mM Na₂HPO₄，0.5M NaCl，调节pH至7.4；

上样：将用0.22μm孔径滤膜过滤处理过的样品过层析柱；

洗杂：用2个柱体积以上的Binding Buffer 1溶液过层析柱，洗去未与层析柱结合的杂蛋白，直到检测不到蛋白吸收峰；

洗脱：用Elution Buffer，该溶液组成为：20mM Na₂HPO₄，0.5M NaCl 0.5M咪唑，pH7.4，梯度洗脱，之后继续100％梯度洗脱20ml；

收集：洗脱过程中用自动收集器收集洗脱下来蛋白吸收峰；

洗柱：用双蒸水清洗层析柱；

保存：用20％乙醇过层析柱；

分子筛层析进一步纯化重组猪α型干扰素：

清洗：用双蒸水清洗系统管道和分子筛层析柱；

平衡：用2-3个柱体积的Binding Buffer 2，该溶液组成为：50mM Na₂HPO₄，0.15M NaCl，调节pH至7.0，平衡分子筛层析柱；

上样：4℃条件下将上述亲和层析收集的样品12000r/min离心10min，按柱体积的1％上样通过层析柱；

洗脱：用Binding Buffer 2洗脱；

收集：洗脱过程中收集洗脱下来蛋白吸收峰；

洗柱：用双蒸水清洗柱子；

保存：用20％乙醇过柱。