CN110734490A - 重组人金属硫蛋白ⅲ纯品的制备方法 - Google Patents

Abstract

一种重组人金属硫蛋白Ⅲ纯品的制备方法，属于基因工程重组蛋白质纯化技术领域。步骤：制备融合蛋白溶液；制备上清液Ⅱ；制备酶切液；制备MT‑III蛋白的粗品液；制备含MT‑III蛋白的半成品溶液；收集巯基峰洗脱液；将巯基峰洗脱液进行超滤除盐，然后冷冻干燥成冻干粉，得到重组人金属硫蛋白Ⅲ纯品。优点：在获得高纯度重组人金属硫蛋白Ⅲ的同时，避免使用昂贵的GST亲和层析介质，降低制备成本；既可促进金属硫蛋白空间结构的正确折叠，防止金属硫蛋白片段聚合析出；使得获得的重组人金属硫蛋白III纯度及稳定性更好。

Description

重组人金属硫蛋白Ⅲ纯品的制备方法

技术领域

本发明属于基因工程重组蛋白质纯化技术领域，具体涉及一种重组人金属硫蛋白Ⅲ纯品的制备方法。

背景技术

金属硫蛋白（英文名称为：Metallothionein；英文缩写为：MT）是一类富含半胱氨酸且分子量较小的蛋白质，MT家族蛋白结构非常保守，由60-61个氨基酸组成，其中30%左右为半胱氨酸（Cys），不含二硫键、芳香族氨基酸和组氨酸。而金属硫蛋白III（简称MT-III），最初是在研究人中枢神经病变机理时发现的一种神经生长抑制因子（NGF），后研究证实其与金属硫蛋白家族蛋白高度同源，因此命名为金属硫蛋白III。MT-III分布主要限于中枢神经系统，主要分布于星形胶质细胞（集中于细胞体和突起中），其次为神经元细胞，也有报道称少量分布于生殖细胞、小肠、胃、肾和嗅觉皮质细胞中。近些年对金属硫蛋白的生物学功能研究日益深入，发现其与多种疾病的发生发展过程相关，并发挥重要作用。而研究证明MT-III蛋白与老年痴呆等神经系统疾病发病机理有关，成为近年来的研究热点。

MT除了参与某些疾病的发生过程外，在体内还可以参与微量金属元素如Zn、Cu和Co的运输、储存和代谢；参与体内重金属如Hg、Cd和Pb等的解毒；参与抗辐射，其清除自由基，特别是羟基自由基的能力，比SOD强100多倍。

目前市场上的MT多数是从动物肝脏（如兔肝）中提取的，获得的产物多为MT-I和MT-II的混合物，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）检测产品多为弥散或聚合状态，产品成分单一性较差，并且动物组织提取的蛋白在用于人体时，存在生物安全性问题，同时产业化的生产需要大量动物作为生产原料，生态友好性较差。目前，各国特别是欧盟对于动物组织提取的产品接受程度不高，越来越多的研究组织通过基因工程的技术来实现MT蛋白的产业化生产，通过基因重组可以异源表达人源蛋白，生物安全性较高，产品纯度高单一性好，一定程度上解决了动物源蛋白所带来的问题。

在目前基因工程蛋白研究中，对重组蛋白的纯化大多是依赖于特异标签（如GST标签、His标签等），采用亲和层析的技术来实现目标蛋白的分离，而亲和层析的处理量有限且填料介质价格昂贵，从而限制了产品的产业化放大生产。

针对上述现状，本发明在构建重组人金属硫蛋白III（GST-MT-III）大肠杆菌表达菌株，通过发酵获得GST-MT-III融合表达蛋白菌体的基础上，找到了一种避免使用昂贵的GST亲和层析介质的纯化方法，用于MT-III蛋白纯品的制备，并且获得了诸如均一性好、纯度高的产品，同时大幅度降低了MT-III蛋白的纯化制备成本，使其大规模工业化生产成为现实。下面将要介绍的技术方案便是在这种背景下产生的。

发明内容

本发明的任务在于提供一种重组人金属硫蛋白Ⅲ纯品的制备方法，该方法有助于避免使用昂贵的GST亲和层析柱而得以显著降低纯化制备成本并且获得高质量的重组人金属硫蛋白Ⅲ纯品。

本发明的任务是这样来完成的，一种重组人金属硫蛋白Ⅲ纯品的制备方法，包括以下步骤：

A) 制备融合蛋白溶液，先将重组人金属硫蛋白III发酵菌体重悬于缓冲液Ⅰ，再进行超声破碎，而后离心分离，收集上清液Ⅰ，得到含有GST-MT-III的融合蛋白溶液；

B) 制备融合蛋白GST-MT-III粗品，用硫酸铵对由步骤A）得到的上清液Ⅰ进行分级沉淀并且控制分级沉淀的工艺参数，得到融合蛋白GST-MT-III粗品；

C) 制备上清液Ⅱ，先将由步骤B）得到的融合蛋白GST-MT-III粗品重悬于缓冲液Ⅱ中，得到重悬液，并用pH调节剂调节重悬液的pH值，再离心分离以除去不溶的杂蛋白，得到上清液Ⅱ；

D) 制备酶切液，先用超滤膜对由步骤C）得到的上清液Ⅱ进行超滤并浓缩，得到浓缩液，再调节浓缩液的pH值，而后加入硫酸锌和凝血酶并搅拌反应，得到酶切液；

E) 制备MT-III蛋白的粗品液，先对由步骤D）得到的酶切液加热使杂质蛋白热变性沉淀，离心分离，得到MT-III蛋白的粗品液；

F) 制备含MT-III蛋白的半成品溶液，对由步骤E）得到的MT-III蛋白的粗品液的电导率进行调整，直至其电导率与缓冲液Ⅲ的电导率相当，得到调整电导率后的MT-III蛋白的粗品液，然后将调整电导率后的MT-III蛋白的粗品液上样于经预先平衡好的疏水层析柱，收集穿透液，得到含MT-III蛋白的半成品溶液；

G) 收集巯基峰洗脱液，用超滤膜对由步骤F）得到的MT-III蛋白的半成品溶液进行超滤脱盐，然后上样于平衡好的阴离子交换层析柱，再由缓冲液Ⅳ与缓冲液Ⅴ进行梯度洗脱，分瓶收集，得到巯基峰洗脱液；

H) 制备成品，先将由步骤G）得到的巯基峰洗脱液进行超滤除盐，然后冷冻干燥成冻干粉，得到重组人金属硫蛋白Ⅲ纯品。

在本发明的一个具体的实施例中，步骤A）中所述的缓冲液Ⅰ与所述的重组人金属硫蛋白Ⅲ发酵菌体的体积质量比为2～5∶1。

在本发明的另一个具体的实施例中，所述的缓冲液Ⅰ为pH值为5-9的磷酸盐缓冲液、Tris-Hcl缓冲液以及TEA缓冲液中的一种或多种。

在本发明的又一个具体的实施例中，步骤B）中所述的用硫酸铵对所述上清液Ⅰ进行分级沉淀包括一级沉淀和二级沉淀，所述的控制分级沉淀的工艺参数是指控制一级沉淀的工艺参数和控制二级沉淀的工艺参数。

在本发明的再一个具体的实施例中，所述的控制一级沉淀的工艺参数为：先对所述的上清液Ⅰ的温度调节，再在搅拌状态下缓慢加入固体硫酸铵，至硫酸铵的百分饱和度为20-50%，待硫酸铵完全溶解后，静置，得到一级沉淀物；所述的控制二级沉淀的工艺参数为：先对所述的一级沉淀物离心分离，收集上层清液，再对上层清液的温度调节，而后在搅拌状态下缓慢加入固体硫酸铵，将所述的上层清液中硫酸铵的百分饱和度提高至60-90%，待硫酸铵完全溶解后再次静置，得到二级沉淀物，再经离心分离。

在本发明的还有一个具体的实施例中，对所述上清液Ⅰ的温度进行调节是将上清液Ⅰ的温度调节至20-40℃，所述静置是在20-40℃下静置60-100min；所述的对上层清液的温度调节是将上层清液的温度调节为20-40℃，所述的再次静置是在20-40℃下静置10-15h。

在本发明的更而一个具体的实施例中，步骤C）中所述的缓冲液Ⅱ为pH值为6-9的磷酸盐缓冲液、Tris-Hcl缓冲液以及TEA缓冲液中的一种或多种；所述的用pH调节剂对重悬液的pH值进行调节是指用1mol/L的Tris水溶液将重悬液的pH值调节至6-9。

在本发明的进而一个具体的实施例中，步骤D）中所述的用超滤膜对上清液Ⅱ进行超滤是指用5-20K截留分子量的超滤膜对上清液Ⅱ超滤，所述浓缩是将经超滤后的上清液Ⅱ体积浓缩2-5倍；所述的调节浓缩液的pH值是采用1mol/L的Tris将浓缩液的pH值调节至6-9；所述加入硫酸锌的加入量为使所述酶切液中硫酸锌的最终浓度达到0.05-0.2mmol/L；所述的凝血酶是指用于特异性剪切GST标签的酶，凝血酶的加入量为每100g所述重组人金属硫蛋白III菌体中加入10000U；所述搅拌反应是在温度为20-25℃并且以50-100rpm的速度搅拌反应14-18h。

在本发明的又更而一个具体的实施例中，步骤E）中所述的对酶切液加热的温度为50-80℃，加热时间为3-10min； 步骤F）中所述的对由步骤E）得到的MT-III蛋白的粗品液的电导率进行调整是使用硫酸铵作为试剂对电导率进行调整；所述的缓冲液Ⅲ为pH为6-9并且含有1mol/L硫酸铵的磷酸盐缓冲液、Tris-Hcl缓冲液以及TEA缓冲液中的一种或多种；所述的疏水层析柱为苯基-琼脂糖凝胶层析柱。

在本发明的又进而一个具体的实施例中，步骤G）中所述的超滤膜为截留分子量在1～3K的超滤膜，所述的缓冲液Ⅳ为pH6-9的磷酸盐缓冲液、Tris-Hcl缓冲液以及TEA缓冲液中的一种或多种；所述的阴离子交换层析柱为DEAE琼脂糖凝胶层析柱；所述的缓冲液Ⅴ为pH值为6-9并且含有终浓度为0.4mol/L的Nacl的磷酸盐缓冲液、Tris-Hcl缓冲液以及TEA缓冲液中的一种或多种；所述的巯基峰洗脱液的体积为3-5倍于所述DEAE琼脂糖凝胶柱层析柱的体积；所述的梯度洗脱是指由二元梯度泵对由步骤F）中所述的缓冲液Ⅳ与缓冲液Ⅴ进行梯度混合洗脱，梯度比例变化为：在2-5个柱体积洗脱时间内，缓冲液Ⅳ的比例从100%到0%，而缓冲液Ⅴ的比例从0%到100%；步骤H）中所述的超滤除盐是采用3-5k的截留分子量超滤膜超滤脱盐。

本发明提供的技术方案的技术效果在于：由于采用了硫酸铵分级沉淀、疏水层析柱层析以及阴离子交换层析柱不同的分离纯化组合，因而在得以获得高纯度重组人金属硫蛋白Ⅲ的同时，避免使用昂贵的GST亲和层析介质，显著地降低了制备成本；酶切反应中，由于空间结构折叠正确的金属硫蛋白分子内部需要螯合大量的金属离子，该金属离子通常为锌，因而加入硫酸锌，在金属硫蛋白形成空间结构初期提供一定量的锌是十分必要的也是十分有益的，加入硫酸锌既可促进金属硫蛋白空间结构的正确折叠，并且有效地防止金属硫蛋白片段聚合析出；疏水层析柱的使用可以有效的分离并除去一些杂蛋白以及空间构象不正确的蛋白片段，因空间结构折叠正确的金属硫蛋白由于内部螯合了大量的金属离子，其空间结构具有一定的刚性，即便在高盐环境下其疏水基团亦不易与疏水层析介质相互作用，即不会挂在柱上而从穿透液中流出，相反空间结构折叠不正确的则吸附在柱上，从而使得获得的重组人金属硫蛋白III纯度及稳定性更好。

附图说明

图1为本发明方法得到的重组人金属硫蛋白Ⅲ纯品经小分子蛋白SDS-PAGE电泳检测的结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对该发明进行进一步详细的说明，以下实施例是对本发明的解释，本发明并不限于以下实施例。

实施例1：

A)制备融合蛋白溶液，先将从中国江苏省苏州市华研医用科技有限公司生产的并且在本申请提出以前在市场销售的重组人金属硫蛋白III发酵菌体重悬于缓冲液Ⅰ，再进行超声破碎，而后离心分离，收集上清液Ⅰ，得到含有GST-MT-III的融合蛋白溶液，本步骤中所述的缓冲液Ⅰ与所述重组人金属硫蛋白Ⅲ发酵菌体两者的体积质量比为2∶1，所述缓冲液Ⅰ为pH值为7的一倍磷酸盐缓冲液（1×PBS）；

B)制备融合蛋白GST-MT-III粗品，用硫酸铵对由步骤A）得到的上清液Ⅰ进行分级沉淀并且控制分级沉淀的工艺参数，得到融合蛋白GST-MT-III粗品，在本步骤中，前述的用硫酸铵对前述上清液Ⅰ进行分级沉淀包括一级沉淀和二级沉淀，所述的控制分级沉淀的工艺参数是指控制一级沉淀的工艺参数和控制二级沉淀的工艺参数，所述控制一级沉淀的工艺参数为：先对上清液Ⅰ的温度调节至30℃，再在搅拌状态下加入固体硫酸铵，直至硫酸铵的百分饱和度为50%，待硫酸铵完全溶解后，在20℃下静置100min，得到一级沉淀物，所述控制二级沉淀的工艺参数为：先对一级沉淀物离心分离，收集上层清液，再对上层清液的温度调节至20℃，而后在搅拌状态下缓慢加入固体硫酸铵，直至上层清液中硫酸铵的百分饱和度提高至90%，待硫酸铵完全溶解后再次在30℃下静置12h；

C)制备上清液Ⅱ，先将由步骤B）得到的融合蛋白GST-MT-III粗品重悬于缓冲液Ⅱ中，得到重悬液，并用pH调节剂调节重悬液的pH值，再离心分离以除去不溶的杂蛋白，得到上清液Ⅱ，本步骤中所述的缓冲液Ⅱ为pH值为7.5的Tris-Hcl缓冲液，所述的用pH调节剂对重悬液的pH值进行调节是指用1mol/L的Tris水溶液将重悬液的pH值调节至6；

D)制备酶切液，先用超滤膜对由步骤C）得到的上清液Ⅱ用5K截留分子量超滤膜超滤并浓缩，该浓缩是将超滤后的上清液Ⅱ的体积浓缩至上清液Ⅱ的体积的5倍，得到浓缩液，也就是说浓缩液的体积为上清液Ⅱ的体积的5倍，再调节浓缩液的pH值，具体是采用1mol/L的Tris将浓缩液的pH值调节至6，而后加入硫酸锌和凝血酶并在20℃、100rpm的速度搅拌反应18h，得到酶切液，本步骤中所述的硫酸锌的加入量为使所述的酶切液中硫酸锌的最终浓度达到0.05mol/L，所述的凝血酶是指用于特异性剪切GST标签的酶，并且该凝血酶的加入量为每100g所述重组人金属硫蛋白III菌体中加入10000U；；

E)制备MT-III蛋白的粗品液，先对由步骤D）得到的酶切液加热至65℃并且加热时间为6min，使酶切液中的杂质蛋白热变性沉淀，离心分离，得到MT-III蛋白的粗品液；

F)制备含MT-III蛋白的半成品溶液，对由步骤E）得到的MT-III蛋白的粗品液的电导率进行调整，具体是使用硫酸铵作为试剂对电导率进行调整至与缓冲液Ⅲ的电导率相当，得到调整电导率后的MT-III蛋白的粗品液，然后将调整电导率后的MT-III蛋白的粗品液上样于经预先平衡好的疏水层析柱，收集穿透液，得到含MT-III蛋白的半成品溶液，本步骤中所述的缓冲液Ⅲ为pH为9并且含有1mol/L硫酸铵的磷酸盐缓冲液，所述的疏水层析柱为苯基-琼脂糖凝胶层析柱；

G)收集巯基峰洗脱液，用截留分子量在1K的超滤膜对由步骤F）得到的MT-III蛋白的半成品溶液进行超滤脱盐，然后上样于平衡好的阴离子交换层析柱，再由缓冲液Ⅳ与缓冲液Ⅴ进行梯度洗脱，分瓶收集，得到巯基峰洗脱液，本步骤中所述的缓冲液Ⅳ为pH6的TEA缓冲液，所述的阴离子交换层析柱为DEAE琼脂糖凝胶层析柱，所述的缓冲液Ⅴ为pH值为9并且含有终浓度为0.4mol/L的Nacl的磷酸盐缓冲液，所述的巯基峰洗脱液的体积为3倍于所述DEAE琼脂糖凝胶柱层析柱的体积，所述的梯度洗脱是指由二元梯度泵对由步骤F）中所述的缓冲液Ⅳ与缓冲液Ⅴ进行梯度混合洗脱，梯度比例变化为：在2-5个柱体积洗脱时间内，缓冲液Ⅳ的比例从100%到0%（即零），而缓冲液Ⅴ的比例从0%（即零）到100%；

H)制备成品，先将由步骤G）得到的巯基峰洗脱液使用3K的截留分子量超滤膜进行超滤除盐，然后冷冻干燥成冻干粉，得到重组人金属硫蛋白Ⅲ纯品，SDS-PAGE检测纯度大于95%，二聚体含量小于5%。

实施例2：

A)制备融合蛋白溶液，先将从中国江苏省苏州市华研医用科技有限公司生产的并且在本申请提出以前在市场销售的重组人金属硫蛋白III发酵菌体重悬于缓冲液Ⅰ，再进行超声破碎，而后离心分离，收集上清液Ⅰ，得到含有GST-MT-III的融合蛋白溶液，本步骤中所述的缓冲液Ⅰ与所述重组人金属硫蛋白Ⅲ发酵菌体两者的体积质量比为3.5∶1，所述缓冲液Ⅰ为pH值为9的Tris-Hcl缓冲液；

B)制备融合蛋白GST-MT-III粗品，用硫酸铵对由步骤A）得到的上清液Ⅰ进行分级沉淀并且控制分级沉淀的工艺参数，得到融合蛋白GST-MT-III粗品，在本步骤中，前述的用硫酸铵对前述上清液Ⅰ进行分级沉淀包括一级沉淀和二级沉淀，所述的控制分级沉淀的工艺参数是指控制一级沉淀的工艺参数和控制二级沉淀的工艺参数，所述控制一级沉淀的工艺参数为：先对上清液Ⅰ的温度调节至20℃，再在搅拌状态下加入固体硫酸铵，直至硫酸铵的百分饱和度为35%，待硫酸铵完全溶解后，在40℃下静置60min，得到一级沉淀物，所述控制二级沉淀的工艺参数为：先对一级沉淀物离心分离，收集上层清液，再对上层清液的温度调节至40℃，而后在搅拌状态下缓慢加入固体硫酸铵，直至上层清液中硫酸铵的百分饱和度提高至60%，待硫酸铵完全溶解后再次在20℃下静置15h；

C)制备上清液Ⅱ，先将由步骤B）得到的融合蛋白GST-MT-III粗品重悬于缓冲液Ⅱ中，得到重悬液，并用pH调节剂调节重悬液的pH值，再离心分离以除去不溶的杂蛋白，得到上清液Ⅱ，本步骤中所述的缓冲液Ⅱ为pH值为6的Tris-Hcl与TEA相混合的缓冲液，所述的用pH调节剂对重悬液的pH值进行调节是指用1mol/L的Tris水溶液将重悬液的pH值调节至9；

D)制备酶切液，先用超滤膜对由步骤C）得到的上清液Ⅱ用30K截留分子量超滤膜超滤并浓缩，该浓缩是将超滤后的上清液Ⅱ的体积浓缩至上清液Ⅱ的体积的2倍，得到浓缩液，也就是说浓缩液的体积为上清液Ⅱ的体积的2倍，再调节浓缩液的pH值，具体是采用1mol/L的Tris将浓缩液的pH值调节至7.5，而后加入硫酸锌和凝血酶并在22℃、75rpm的速度搅拌反应16h，得到酶切液，本步骤中所述的硫酸锌的加入量为使所述的酶切液中硫酸锌的最终浓度达到0.1mol/L，所述的凝血酶是指用于特异性剪切GST标签的酶，并且该凝血酶的加入量为每100g所述重组人金属硫蛋白III菌体中加入10000U；；

E)制备MT-III蛋白的粗品液，先对由步骤D）得到的酶切液加热至50℃并且加热时间为10min，使酶切液中的杂质蛋白热变性沉淀，离心分离，得到MT-III蛋白的粗品液；

F)制备含MT-III蛋白的半成品溶液，对由步骤E）得到的MT-III蛋白的粗品液的电导率进行调整，具体是使用硫酸铵作为试剂对电导率进行调整至与缓冲液Ⅲ的电导率相当，得到调整电导率后的MT-III蛋白的粗品液，然后将调整电导率后的MT-III蛋白的粗品液上样于经预先平衡好的疏水层析柱，收集穿透液，得到含MT-III蛋白的半成品溶液，本步骤中所述的缓冲液Ⅲ为pH为7.5并且含有1mol/L硫酸铵的磷酸盐缓冲液与Tris-Hcl缓冲液的混合物，所述的疏水层析柱为苯基-琼脂糖凝胶层析柱；

G)收集巯基峰洗脱液，用截留分子量在2K的超滤膜对由步骤F）得到的MT-III蛋白的半成品溶液进行超滤脱盐，然后上样于平衡好的阴离子交换层析柱，再由缓冲液Ⅳ与缓冲液Ⅴ进行梯度洗脱，分瓶收集，得到巯基峰洗脱液，本步骤中所述的缓冲液Ⅳ为pH7.5的Tris-Hcl缓冲液、TEA缓冲液以及磷酸盐缓冲液的混合物，所述的阴离子交换层析柱为DEAE琼脂糖凝胶层析柱，所述的缓冲液Ⅴ为pH值为6并且含有终浓度为0.4mol/L的Nacl的TEA缓冲液与磷酸盐缓冲液的混合物，所述的巯基峰洗脱液的体积为5倍于所述DEAE琼脂糖凝胶柱层析柱的体积，所述的梯度洗脱是指由二元梯度泵对由步骤F）中所述的缓冲液Ⅳ与缓冲液Ⅴ进行梯度混合洗脱，梯度比例变化为：在2-5个柱体积洗脱时间内，缓冲液Ⅳ的比例从100%到0%（即零），而缓冲液Ⅴ的比例从0%（即零）到100%；

H)制备成品，先将由步骤G）得到的巯基峰洗脱液使用5K的截留分子量超滤膜进行超滤除盐，然后冷冻干燥成冻干粉，得到重组人金属硫蛋白Ⅲ纯品，SDS-PAGE检测纯度大于95%，二聚体含量小于5%。

实施例3：

A)制备融合蛋白溶液，先将从中国江苏省苏州市华研医用科技有限公司生产的并且在本申请提出以前在市场销售的重组人金属硫蛋白III发酵菌体重悬于缓冲液Ⅰ，再进行超声破碎，而后离心分离，收集上清液Ⅰ，得到含有GST-MT-III的融合蛋白溶液，本步骤中所述的缓冲液Ⅰ与所述重组人金属硫蛋白Ⅲ发酵菌体两者的体积质量比为5∶1，所述缓冲液Ⅰ为pH值为5的TEA缓冲液；

B)制备融合蛋白GST-MT-III粗品，用硫酸铵对由步骤A）得到的上清液Ⅰ进行分级沉淀并且控制分级沉淀的工艺参数，得到融合蛋白GST-MT-III粗品，在本步骤中，前述的用硫酸铵对前述上清液Ⅰ进行分级沉淀包括一级沉淀和二级沉淀，所述的控制分级沉淀的工艺参数是指控制一级沉淀的工艺参数和控制二级沉淀的工艺参数，所述控制一级沉淀的工艺参数为：先对上清液Ⅰ的温度调节至40℃，再在搅拌状态下加入固体硫酸铵，直至硫酸铵的百分饱和度为20%，待硫酸铵完全溶解后，在30℃下静置80min，得到一级沉淀物，所述控制二级沉淀的工艺参数为：先对一级沉淀物离心分离，收集上层清液，再对上层清液的温度调节至30℃，而后在搅拌状态下缓慢加入固体硫酸铵，直至上层清液中硫酸铵的百分饱和度提高至75%，待硫酸铵完全溶解后再次在40℃下静置10h；

C)制备上清液Ⅱ，先将由步骤B）得到的融合蛋白GST-MT-III粗品重悬于缓冲液Ⅱ中，得到重悬液，并用pH调节剂调节重悬液的pH值，再离心分离以除去不溶的杂蛋白，得到上清液Ⅱ，本步骤中所述的缓冲液Ⅱ为pH值为9的一倍磷酸盐缓冲液（1XPBS），所述的用pH调节剂对重悬液的pH值进行调节是指用1mol/L的Tris水溶液将重悬液的pH值调节至7.5；

D)制备酶切液，先用超滤膜对由步骤C）得到的上清液Ⅱ用12K截留分子量超滤膜超滤并浓缩，该浓缩是将超滤后的上清液Ⅱ的体积浓缩至上清液Ⅱ的体积的3.5倍，得到浓缩液，也就是说浓缩液的体积为上清液Ⅱ的体积的3.5倍，再调节浓缩液的pH值，具体是采用1mol/L的Tris将浓缩液的pH值调节至9，而后加入硫酸锌和凝血酶并在25℃、50rpm的速度搅拌反应14h，得到酶切液，本步骤中所述的硫酸锌的加入量为使所述的酶切液中硫酸锌的最终浓度达到0.2mol/L，所述的凝血酶是指用于特异性剪切GST标签的酶，并且该凝血酶的加入量为每100g所述重组人金属硫蛋白III菌体中加入10000U；；

E)制备MT-III蛋白的粗品液，先对由步骤D）得到的酶切液加热至80℃并且加热时间为3min，使酶切液中的杂质蛋白热变性沉淀，离心分离，得到MT-III蛋白的粗品液；

F)制备含MT-III蛋白的半成品溶液，对由步骤E）得到的MT-III蛋白的粗品液的电导率进行调整，具体是使用硫酸铵作为试剂对电导率进行调整至与缓冲液Ⅲ的电导率相当，得到调整电导率后的MT-III蛋白的粗品液，然后将调整电导率后的MT-III蛋白的粗品液上样于经预先平衡好的疏水层析柱，收集穿透液，得到含MT-III蛋白的半成品溶液，本步骤中所述的缓冲液Ⅲ为pH为6并且含有1mol/L硫酸铵的TEA缓冲液，所述的疏水层析柱为苯基-琼脂糖凝胶层析柱；

G)收集巯基峰洗脱液，用截留分子量在3K的超滤膜对由步骤F）得到的MT-III蛋白的半成品溶液进行超滤脱盐，然后上样于平衡好的阴离子交换层析柱，再由缓冲液Ⅳ与缓冲液Ⅴ进行梯度洗脱，分瓶收集，得到巯基峰洗脱液，本步骤中所述的缓冲液Ⅳ为pH9的磷酸盐缓冲液，所述的阴离子交换层析柱为DEAE琼脂糖凝胶层析柱，所述的缓冲液Ⅴ为pH值为7.5并且含有终浓度为0.4mol/L的Nacl的Tris-Hcl缓冲液与TEA缓冲液的混合物，所述的巯基峰洗脱液的体积为4倍于所述DEAE琼脂糖凝胶柱层析柱的体积，所述的梯度洗脱是指由二元梯度泵对由步骤F）中所述的缓冲液Ⅳ与缓冲液Ⅴ进行梯度混合洗脱，梯度比例变化为：在2-5个柱体积洗脱时间内，缓冲液Ⅳ的比例从100%到0%（即零），而缓冲液Ⅴ的比例从0%（即零）到100%；

H)制备成品，先将由步骤G）得到的巯基峰洗脱液使用4K的截留分子量超滤膜进行超滤除盐，然后冷冻干燥成冻干粉，得到重组人金属硫蛋白Ⅲ纯品，SDS-PAGE检测纯度大于95%，二聚体含量小于5%。

请参见图1，图1揭示了由上述实施例1至3得到的重组人金属硫蛋白III纯品经小分子蛋白SDS-PAGE电泳检测结果，图1中的1表示金属硫蛋白III纯品冻干粉；图1中的M表示超低分子量蛋白marker，并且由图1所示：MT-III蛋白分子量大小为6.9KDa左右，其二聚体分子量在14KDa左右，由SDS-PAGE检测结果印证了由本发明方法得到的重组人金属硫蛋白III纯品SDS-PAGE纯度大于95%。

Claims (10)

1.一种重组人金属硫蛋白Ⅲ纯品的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

A) 制备融合蛋白溶液，先将重组人金属硫蛋白III发酵菌体重悬于缓冲液Ⅰ，再进行超声破碎，而后离心分离，收集上清液Ⅰ，得到含有GST-MT-III的融合蛋白溶液；

B) 制备融合蛋白GST-MT-III粗品，用硫酸铵对由步骤A）得到的上清液Ⅰ进行分级沉淀并且控制分级沉淀的工艺参数，得到融合蛋白GST-MT-III粗品；

C) 制备上清液Ⅱ，先将由步骤B）得到的融合蛋白GST-MT-III粗品重悬于缓冲液Ⅱ中，得到重悬液，并用pH调节剂调节重悬液的pH值，再离心分离以除去不溶的杂蛋白，得到上清液Ⅱ；

D) 制备酶切液，先用超滤膜对由步骤C）得到的上清液Ⅱ进行超滤并浓缩，得到浓缩液，再调节浓缩液的pH值，而后加入硫酸锌和凝血酶并搅拌反应，得到酶切液；

E) 制备MT-III蛋白的粗品液，先对由步骤D）得到的酶切液加热使杂质蛋白热变性沉淀，离心分离，得到MT-III蛋白的粗品液；

F) 制备含MT-III蛋白的半成品溶液，对由步骤E）得到的MT-III蛋白的粗品液的电导率进行调整，直至其电导率与缓冲液Ⅲ的电导率相当，得到调整电导率后的MT-III蛋白的粗品液，然后将调整电导率后的MT-III蛋白的粗品液上样于经预先平衡好的疏水层析柱，收集穿透液，得到含MT-III蛋白的半成品溶液；

G) 收集巯基峰洗脱液，用超滤膜对由步骤F）得到的MT-III蛋白的半成品溶液进行超滤脱盐，然后上样于平衡好的阴离子交换层析柱，再由缓冲液Ⅳ与缓冲液Ⅴ进行梯度洗脱，分瓶收集，得到巯基峰洗脱液；

H) 制备成品，先将由步骤G）得到的巯基峰洗脱液进行超滤除盐，然后冷冻干燥成冻干粉，得到重组人金属硫蛋白Ⅲ纯品。

2.根据权利要求1所述的重组人金属硫蛋白Ⅲ纯品的制备方法，其特征在于步骤A）中所述的缓冲液Ⅰ与所述的重组人金属硫蛋白Ⅲ发酵菌体的体积质量比为2～5∶1。

3.根据权利要求1或2所述的重组人金属硫蛋白Ⅲ纯品的制备方法，其特征在于所述的缓冲液Ⅰ为pH值为5-9的磷酸盐缓冲液、Tris-Hcl缓冲液以及TEA缓冲液中的一种或多种。

4.根据权利要求1所述的重组人金属硫蛋白Ⅲ纯品的制备方法，其特征在于步骤B）中所述的用硫酸铵对所述上清液Ⅰ进行分级沉淀包括一级沉淀和二级沉淀，所述的控制分级沉淀的工艺参数是指控制一级沉淀的工艺参数和控制二级沉淀的工艺参数。

5.根据权利要求4所述的重组人金属硫蛋白Ⅲ纯品的制备方法，其特征在于所述的控制一级沉淀的工艺参数为：先对所述的上清液Ⅰ的温度调节，再在搅拌状态下缓慢加入固体硫酸铵，至硫酸铵的百分饱和度为20-50%，待硫酸铵完全溶解后，静置，得到一级沉淀物；所述的控制二级沉淀的工艺参数为：先对所述的一级沉淀物离心分离，收集上层清液，再对上层清液的温度调节，而后在搅拌状态下缓慢加入固体硫酸铵，将所述的上层清液中硫酸铵的百分饱和度提高至60-90%，待硫酸铵完全溶解后再次静置，得到二级沉淀物，再经离心分离。

6.根据权利要求5所述的重组人金属硫蛋白Ⅲ纯品的制备方法，其特征在于对所述上清液Ⅰ的温度进行调节是将上清液Ⅰ的温度调节至20-40℃，所述静置是在20-40℃下静置60-100min；所述的对上层清液的温度调节是将上层清液的温度调节为20-40℃，所述的再次静置是在20-40℃下静置10-15h。

7.根据权利要求1所述的重组人金属硫蛋白Ⅲ纯品的制备方法，其特征在于步骤C）中所述的缓冲液Ⅱ为pH值为6-9的磷酸盐缓冲液、Tris-Hcl缓冲液以及TEA缓冲液中的一种或多种；所述的用pH调节剂对重悬液的pH值进行调节是指用1mol/L的Tris水溶液将重悬液的pH值调节至6-9。

8.根据权利要求1所述的重组人金属硫蛋白Ⅲ纯品的制备方法，其特征在于步骤D）中所述的用超滤膜对上清液Ⅱ进行超滤是指用5-20K截留分子量的超滤膜对上清液Ⅱ超滤，所述浓缩是将经超滤后的上清液Ⅱ体积浓缩2-5倍；所述的调节浓缩液的pH值是采用1mol/L的Tris将浓缩液的pH值调节至6-9；所述加入硫酸锌的加入量为使所述酶切液中硫酸锌的最终浓度达到0.05-0.2mmol/L；所述的凝血酶是指用于特异性剪切GST标签的酶，凝血酶的加入量为每100g所述重组人金属硫蛋白III菌体中加入10000U；所述搅拌反应是在温度为20-25℃并且以50-100rpm的速度搅拌反应14-18h。

9.根据权利要求1所述的重组人金属硫蛋白Ⅲ纯品的制备方法，其特征在于步骤E）中所述的对酶切液加热的温度为50-80℃，加热时间为3-10min； 步骤F）中所述的对由步骤E）得到的MT-III蛋白的粗品液的电导率进行调整是使用硫酸铵作为试剂对电导率进行调整；所述的缓冲液Ⅲ为pH为6-9并且含有1mol/L硫酸铵的磷酸盐缓冲液、Tris-Hcl缓冲液以及TEA缓冲液中的一种或多种；所述的疏水层析柱为苯基-琼脂糖凝胶层析柱。

10.根据权利要求1所述的重组人金属硫蛋白Ⅲ纯品的制备方法，其特征在于步骤G）中所述的超滤膜为截留分子量在1～3K的超滤膜，所述的缓冲液Ⅳ为pH6-9的磷酸盐缓冲液、Tris-Hcl缓冲液以及TEA缓冲液中的一种或多种；所述的阴离子交换层析柱为DEAE琼脂糖凝胶层析柱；所述的缓冲液Ⅴ为pH值为6-9并且含有终浓度为0.4mol/L的Nacl的磷酸盐缓冲液、Tris-Hcl缓冲液以及TEA缓冲液中的一种或多种；所述的巯基峰洗脱液的体积为3-5倍于所述DEAE琼脂糖凝胶柱层析柱的体积；所述的梯度洗脱是指由二元梯度泵对由步骤F）中所述的缓冲液Ⅳ与缓冲液Ⅴ进行梯度混合洗脱，梯度比例变化为：在2-5个柱体积洗脱时间内，缓冲液Ⅳ的比例从100%到0%，而缓冲液Ⅴ的比例从0%到100%；步骤H）中所述的超滤除盐是采用3-5k的截留分子量超滤膜超滤脱盐。

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