CN105802989A - 毕赤酵母表达重组蛋白的载体、基因、方法及应用 - Google Patents
毕赤酵母表达重组蛋白的载体、基因、方法及应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN105802989A CN105802989A CN201410854294.4A CN201410854294A CN105802989A CN 105802989 A CN105802989 A CN 105802989A CN 201410854294 A CN201410854294 A CN 201410854294A CN 105802989 A CN105802989 A CN 105802989A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- nucleotide sequence
- recombinant
- vector
- peptide
- protein
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 79
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 title claims abstract description 41
- 239000013598 vector Substances 0.000 title claims abstract description 29
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 21
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 title abstract description 13
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 title abstract description 13
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 62
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 28
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 28
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 claims abstract description 26
- 101800001707 Spacer peptide Proteins 0.000 claims abstract description 18
- 101000605522 Homo sapiens Kallikrein-1 Proteins 0.000 claims abstract description 17
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 31
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 claims description 16
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims description 8
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims description 8
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 6
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims description 5
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 claims description 5
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 claims description 4
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 claims description 4
- IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N WHWLQLKPGQPMY Chemical group C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C1=CNC=N1 IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N 0.000 claims description 4
- 241000228245 Aspergillus niger Species 0.000 claims description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 2
- 102000004139 alpha-Amylases Human genes 0.000 claims description 2
- 108090000637 alpha-Amylases Proteins 0.000 claims description 2
- 229940024171 alpha-amylase Drugs 0.000 claims description 2
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims description 2
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 claims 1
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 claims 1
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 abstract description 33
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 abstract description 4
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 abstract description 4
- 238000013461 design Methods 0.000 abstract description 2
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 abstract 1
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 45
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 36
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 32
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 27
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 21
- 239000000047 product Substances 0.000 description 21
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 17
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 17
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 17
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 15
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 15
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 13
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 13
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 12
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 12
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 11
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 11
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 11
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 10
- 241001052560 Thallis Species 0.000 description 9
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 9
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 9
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 9
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 8
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 8
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 8
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 8
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 7
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 7
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 7
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 7
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 6
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 6
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 6
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 6
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 6
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 6
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 6
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 5
- 125000000729 N-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 5
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 5
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 5
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 5
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 4
- 102000001399 Kallikrein Human genes 0.000 description 4
- 108060005987 Kallikrein Proteins 0.000 description 4
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 108010084455 Zeocin Proteins 0.000 description 4
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 4
- 229910052925 anhydrite Inorganic materials 0.000 description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 4
- OSGAYBCDTDRGGQ-UHFFFAOYSA-L calcium sulfate Chemical compound [Ca+2].[O-]S([O-])(=O)=O OSGAYBCDTDRGGQ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 4
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 4
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N phleomycin D1 Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC[C@@H](N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCCCNC(N)=N)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 4
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 3
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 3
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 3
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 3
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 3
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 3
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 3
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 3
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 3
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 3
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- 230000010473 stable expression Effects 0.000 description 3
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 3
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000737684 Homo sapiens Chymotrypsin-like elastase family member 1 Proteins 0.000 description 2
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 description 2
- 229910004619 Na2MoO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 2
- 239000006167 equilibration buffer Substances 0.000 description 2
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 2
- BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L iron(2+) sulfate (anhydrous) Chemical compound [Fe+2].[O-]S([O-])(=O)=O BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229910000359 iron(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L manganese(II) sulfate Chemical compound [Mn+2].[O-]S([O-])(=O)=O SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229910000357 manganese(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 2
- -1 phenylthiohydantoin amino acid Chemical class 0.000 description 2
- 229910052939 potassium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 239000011684 sodium molybdate Substances 0.000 description 2
- TVXXNOYZHKPKGW-UHFFFAOYSA-N sodium molybdate (anhydrous) Chemical compound [Na+].[Na+].[O-][Mo]([O-])(=O)=O TVXXNOYZHKPKGW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N sulfuric acid Substances OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000011592 zinc chloride Substances 0.000 description 2
- DJGACOXTAHQLTD-UHFFFAOYSA-N 2-amino-n-(2-amino-2-oxoethyl)acetamide Chemical compound NCC(=O)NCC(N)=O DJGACOXTAHQLTD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 101001091365 Homo sapiens Plasma kallikrein Proteins 0.000 description 1
- 102000010631 Kininogens Human genes 0.000 description 1
- 108010077861 Kininogens Proteins 0.000 description 1
- 102000002397 Kinins Human genes 0.000 description 1
- 108010093008 Kinins Proteins 0.000 description 1
- 241000218657 Picea Species 0.000 description 1
- 241000235648 Pichia Species 0.000 description 1
- 101100241858 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) OAC1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000012479 Serine Proteases Human genes 0.000 description 1
- 108010022999 Serine Proteases Proteins 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010092464 Urate Oxidase Proteins 0.000 description 1
- 102000003990 Urokinase-type plasminogen activator Human genes 0.000 description 1
- 108090000435 Urokinase-type plasminogen activator Proteins 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011114 ammonium hydroxide Nutrition 0.000 description 1
- 239000007433 bsm medium Substances 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004019 gradient elution chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 238000010829 isocratic elution Methods 0.000 description 1
- 229940039088 kininogenase Drugs 0.000 description 1
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 1
- 101150092906 pmt1 gene Proteins 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 230000001323 posttranslational effect Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000009465 prokaryotic expression Effects 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 239000012521 purified sample Substances 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000010008 shearing Methods 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 229960005356 urokinase Drugs 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明公开了一种在毕赤酵母中表达重组蛋白的载体、基因及表达方法，尤其适用于对人组织激肽释放酶的重组表达。本发明的载体上含有编码间隔短肽的核苷酸序列，所述的间隔短肽的氨基酸序列为1-10个EA或EEAEAEAEPK，同时，上述所述载体在间隔短肽核苷酸序列5，端连接有信号肽核苷酸序列。这使得在毕赤酵母中表达的目的基因比原来不加入间隔短肽时表达量提高，所述信号肽和间隔短肽在设计和使用时可以加在载体上，也可以加在目的蛋白的核苷酸序列上；同时在间隔短肽后再增加前肽使得所表达的hK1的N端结构与天然hK1一致，且目的蛋白经毕赤酵母系统表达后具有较高的生物学活性。
Description
技术领域
本发明属于生物工程基因领域，涉及在毕赤酵母中表达重组蛋白的载体、基因、方法及应用。
背景技术
毕赤酵母系统是近年来发展很快的真核表达系统，与原核表达系统相比，它可以对表达的蛋白质进行翻译后加工、折叠和修饰，得到具有正确空间结构和较高生物学活性的重组蛋白。此外，毕赤酵母系统还具有发酵方法成熟、发酵密度高、培养简单廉价、外源蛋白可分泌表达、目的蛋白产量高，背景蛋白少、易于目的蛋白纯化等优点。近年来，许多重组蛋白已在毕赤酵母中实现了高效表达，达到克级水平，但仍有多种蛋白表达量较低，提高毕赤酵母外源蛋白表达量成为降低工业化生产成本的关键。
激肽释放酶(也称为激肽原酶)是一种丝氨酸蛋白酶，能使激肽原释放出激肽，它具有很高的生理活性，在人体组织中起着十分重要的生理作用。申请人尝试以毕赤酵母表达一般外源蛋白的方法对人激肽释放酶1(hK1)进行表达，却基本没有表达。
为此，申请人进行了各种尝试，包括在菌株、培养条件、发酵等条件逐渐成熟的情况下，构建高表达的载体以提高外源基因表达量，如信号肽的加入及更改，在信号肽序列和目的蛋白序列之间插入几个氨基酸的间隔短肽。通过各种努力，申请人实现了该蛋白在毕赤酵母中的高量表达。
然而，申请人却意外的发现，在利用毕赤酵母表达蛋白酶类药物时，在分泌信号序列和目的蛋白N端之间加入间隔短肽，往往使得目的蛋白N端序列剪切不完全，在N端氨基酸前残留若干间隔短肽对应的氨基酸，使得所表达蛋白与天然蛋白序列不一致，同时影响所表达蛋白活性。然而，重组蛋白，尤其是治疗性蛋白酶类药物，N端结构正确是所有研究工作可以顺利进行的最重要前提之一；如果重组蛋白类药物N端结构不正确，在后期药品注册申报中将根本不可能通过审核。
发明内容
为了克服上述现有技术的不足，本发明提供了一种在在毕赤酵母中表达重组蛋白的载体、基因及表达方法。具体如下：
本发明的第一个目的是提供一种载体，所述载体上含有编码间隔短肽的核苷酸序列，所述的间隔短肽的氨基酸序列为1-10个EA或EEAEAEAEPK，优选的，为1-5个EA。编码1-5个EA的核苷酸序列分别如SEQIDNO.1-5所示，编码EEAEAEAEPK的核苷酸序列如SEQIDNO.6所示。
优选地，上述载体在间隔短肽核苷酸序列3，端连接有编码目的蛋白前肽的核苷酸序列，优选的，所述前肽的核苷酸序列如SEQIDNO.21所示。
优选的，上述所述载体在间隔短肽核苷酸序列5，端连接有信号肽核苷酸序列，所述的信号肽为黑曲霉α-淀粉酶信号肽、人血清白蛋白信号肽、酿酒酵母α-factor信号肽及蛋白自身信号肽，更优选的，为人血清白蛋白信号肽和酿酒酵母α-factor信号肽。
更优选的，所述的载体为pAO815，pPIC9，pPIC9K，pPIC3.5，pPIC3.5K，pPICZαA、B、C或pGAPZαA、B、C，更优选为pPIC3.5K，pPICZαA或pGAPZαA。
优选的，所述载体可用于重组酶类蛋白的表达，包括：重组人组织激肽释放酶(rhK1)、重组人血浆激肽释放酶(rhPK1)、重组人弹性蛋白酶1(rhCELA1)、重组人尿酸酶(rhUOX)、重组人尿激酶(rhUK)，更优选的，为重组人组织激肽释放酶(rhK1)和重组人弹性蛋白酶1(rhCELA1)。
本发明的另一个目的是提供一种含有间隔短肽的人组织激肽释放酶(hK1)的融合蛋白，所述间隔短肽在人组织激肽释放酶(hK1)的N端，所述的间隔短肽为1-10个EA或EEAEAEAEPK，优选的，为1-5个EA和EEAEAEAEPK。
优选的，上述融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.7-12所示。
更优选的，上述融合蛋白中，在人组织激肽释放酶和间隔短肽之间还有如SEQIDNO.20所示的前肽。
更优选的，编码上述融合蛋白的核苷酸序列如SEQIDNO.13-18所示。
更优选的，编码上述融合蛋白的核苷酸序列，在人组织激肽释放酶和间隔短肽的基因序列之间还有如SEQIDNO.21所示的前肽的基因序列。
本发明的另一个目的是提供一种包含上述所述核苷酸序列的载体。优选的，所述的载体为pAO815，pPIC9，pPIC9K，pPIC3.5，pPIC3.5K，pPICZαA、B、C，pPICZA、B、C，pGAPZαA、B、C，更优选为pPIC3.5K，pPICZαA或pGAPZαA。
本发明的另一个目的是提供一种包含上述所述载体的毕赤酵母菌株。优选的，所述毕赤酵母菌株为SMD1168、GS115、KM71、X-33或KM71H，更优选为GS115或X-33菌株。
本发明的另一个目的是提供一种N端结构正确的重组人组织激肽释放酶的表达方法，所述方法包含下述步骤：
A.构建含有编码上述信号肽、间隔短肽、前肽和目的蛋白的基因的载体；
B.将步骤A的载体线性化后转入毕赤酵母菌株中，并在合适的条件下培养；
C.回收纯化目的蛋白。
上述所述载体优选为pPIC3.5K，pPICZαA和pGAPZαA。
上述所述毕赤酵母菌株优选为GS115或X33菌株。
本发明的另一个目的是提供一种N端结构正确的重组人组织激肽释放酶的纯化方法，包括以下步骤：
1、发酵液的除杂预处理
将按上述表达方法得到的重组蛋白的发酵液，低温离心收集上清，缓慢加入(NH)2SO4固体粉末并不断搅拌，使其在上清中终浓度为1.2M，pH6.0，0.45μm滤膜过滤。
2、疏水层析
平衡缓冲液为20mM磷酸盐，1.2M(NH)2SO4，pH6.0，洗脱缓冲液为20mM磷酸盐，pH6.0。逐渐提高洗脱缓冲液的比例进行等度洗脱，并收集各个洗脱峰。
3、亲和层析
合并疏水层析收集的含有目的蛋白的样品峰，调节pH7.5，平衡缓冲液为20mM磷酸盐，0.5MNaClpH7.5，洗脱缓冲液为0.5MNaCl，10mMHCl，pH2.0。洗脱后收集各洗脱峰，过滤除菌，即得到纯化后重组蛋白。
本发明的技术效果主要有：
本发明的信号肽和插入的间隔短肽使得在毕赤酵母中表达的目的基因比原来不加入间隔短肽时表达量提高，所述信号肽和间隔短肽在设计和使用时可以加在载体上，也可以加在目的蛋白的核苷酸序列上；同时在间隔短肽后再增加前肽使得所表达的hK1的N端结构与天然hK1一致，且目的蛋白经毕赤酵母系统表达后具有较高的生物学活性。
附图说明
图1为重组hK1不同表达质粒构建过程图。
图1-a为重组hK1表达质粒pPICZα-1EA-rhK1构建过程图；图1-b为重组hK1表达质粒pPICZα-1EA-pro-rhK1构建过程图。
图2为不同毕赤酵母X-33菌株小量诱导SDS-PAGE凝胶电泳鉴定图，图中箭头所指即为重组hK1蛋白。
图2-a为含有前肽和不同的连接短肽的毕赤酵母X-33菌株表达一周后，菌液上清SDS-PAGE凝胶电泳图。其中，泳道1为10-250KD范围的预染蛋白上样Marker。泳道2-7分别为表达质粒依次为pPICZα-1EA-pro-rhK1，pPICZα-2EA-pro-rhK1，pPICZα-3EA-pro-rhK1，pPICZα-4EA-pro-rhK1，pPICZα-5EA-pro-rhK1，pPICZα-EEA-pro-rhK1电转到X-33宿主工程菌筛选获得的阳性单克隆宿主工程菌株培养菌液上清。
图2-b为不含前肽含有不同的连接短肽的毕赤酵母X-33菌株表达一周后，菌液上清SDS-PAGE凝胶电泳图。其中，泳道1为10-250KD范围的预染蛋白上样Marker。泳道2-7是表达质粒依次为pPICZα-1EA-rhK1，pPICZα-2EA-rhK1，pPICZα-3EA-rhK1，pPICZα-4EA-rhK1，pPICZα-5EA-rhK1，pPICZα-EEA-rhK1电转到X-33宿主工程菌中筛选获得的阳性单克隆宿主工程菌株培养菌液上清。
图3为表达载体为pPICZα-1EA-pro-rhK1的筛选获得的重组工程菌株X-33发酵液经AKTATMavant150两步纯化色谱图
其中，图3-a为表达载体为pPICZα-1EA-pro-rhK1的筛选获得的重组工程菌株X-33发酵液经AKTATMavant150疏水纯化色谱图。峰3为分子量较高的重组hK1蛋白，峰4为分子量较低的重组hK1蛋白。
图3-b为表达载体为pPICZα-1EA-pro-rhK1的筛选获得的重组工程菌株X-33发酵液经AKTATMavant150第二步对疏水层析收集到的样品进行亲和层析色谱图。其中所示单一样品峰即为重组hK1蛋白。
图4为表达载体为pPICZα-1EA-pro-rhK1的筛选获得的重组工程菌株X-33发酵液经AKTATMavant150两步纯化后，对收集管进行SDS-PAGE凝胶电泳鉴定图。
其中，图4-a为重组hK1发酵液经AKTATMavant150疏水层析纯化后SDS-PAGE电泳图。图中箭头所指即为重组hK1蛋白。泳道1是10-250KD范围的预染蛋白上样Marker；泳道2-14是不同收集管中的样品。
图4-b为重组hK1蛋白疏水层析收集获得的样品经AKTATMavant150亲和层析纯化后对收集管进行SDS-PAGE凝胶电泳鉴定图，图中箭头所指即为重组hK1蛋白。
其中，泳道1是10-250KD范围的预染蛋白上样Marker；泳道2-4是不同收集管中的样品。
图5为表达载体为pPICZα-1EA-pro-rhK1筛选获得的工程菌株X-33表达的重组hK1经过二步纯化后进行纯度鉴定的高效液相色谱图
其中图5-a为重组hK1样品经过C18反相色谱柱(ZorbaxSB-C184.6×250)梯度洗脱色谱图；
图5-b为安捷伦高效液相色谱仪工作站CHEM32对洗脱色谱图进行面积百分比计算报告，可知重组hK1蛋白的面积百分比占据整个色谱峰面积99.6％。
图6-a，6-b，6-c为苯乙内酰硫氨基酸(PTH-AA)混合标准品和重组hK1蛋白N端分析色谱图
其中，图6-a为苯乙内酰硫氨基酸(PTH-AA)混合标准品(163-12271，Wako)色谱图；
图6-b为表达载体为pPICZα-1EA-rhK1筛选获得的工程菌株X-33表达重组hK1蛋白N端氨基酸残基分析色谱图。5个谱图表示进行5个循环测试后，N端氨基酸所对应的测序谱图，依次为NH2-Ile-Val-Gly-Gly-Trp和NH2-Glu-Ala-Ile-Val-Gly，含有没有完全剪切干净的外源氨基酸；
图6-c为表达载体为pPICZα-1EA-pro-rhK1筛选获得的工程菌株X-33表达重组hK1蛋白N端氨基酸残基分析色谱图。5个谱图表示进行5个循环测试后，N端氨基酸所对应的测序谱图，依次为NH2-Ile-Val-Gly-Gly-Trp，与天然序列完全一致。
图7为发酵过程中重组毕赤酵母工程菌株菌体生长曲线图。
其中，图7-a为发酵过程中重组毕赤酵母工程菌株菌体湿重曲线变化图，曲线显示在甘油流加培养期菌体生长良好，进入对数生长期后，菌体湿重最高达到497g/L，在进入蛋白甲醇诱导表达阶段后，菌体湿重不再增加，进入蛋白稳定表达阶段，直至最后下罐。
图7-b为发酵过程中重组毕赤酵母工程菌株菌体OD600值曲线变化图，曲线显示在甘油流加培养期菌体生长良好，进入对数生长期后，菌体OD600值最高达到308，在进入蛋白甲醇诱导表达阶段后，菌体OD600值不再增加，进入蛋白稳定表达阶段，直至最后下罐。
图8为发酵过程中，实时取样在光学显微镜下观察重组毕赤酵母菌株形态图。图中显示酵母生长状态良好，没有杂菌存在。
图9为发酵过程中重组毕赤酵母工程菌株表达产物的SDS-PAGE凝胶电泳分析图，图中箭头所指即为重组hK1蛋白。
其中，泳道1是10-250KD范围的预染蛋白上样Marker；泳道2为流加甲醇诱导12小时表达产物，泳道3为流加甲醇诱导24小时表达产物，泳道4为流加甲醇诱导36小时表达产物，泳道5为流加甲醇诱导48小时表达产物，泳道6为流加甲醇诱导60小时表达产物，泳道7为流加甲醇诱导72小时表达产物，泳道8为流加甲醇诱导84小时表达产物。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，应理解，引用实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1.不同重组hK1表达载体构建
1.2不含前肽、含有前肽的重组hK1表达载体构建
发明人根据GenBank已公开的人激肽释放酶1(Homosapienskallikrein1)的cDNA序列(GenBank登录号：BC005313)和已公开的人激肽释放酶1(Homosapienskallikrein)的氨基酸序列(GenBank登录号：AAA59455.1)，对该基因进行密码子优化后得到本发明的重组hK1基因(SEQIDNO.19)，构建到pUC57质粒(购自南京金斯瑞科技有限公司)中，得到一种长期保存质粒，记为pUC57-rhK1质粒。
以pUC57-rhK1质粒为模板，上、下游引物分别引入XhoI和NotI酶切位点，在紧接着XhoI酶切位点后分别插入重组hK1前肽序列(SEQIDNO.21)，进行PCR扩增，所用引物序列如下：
不含有前肽的重组hK1上游扩增引物(SEQIDNO.22)
P1:CCGCTCGAGAAGAGAGAAGCTATCGTCGGTGGATGGGAA
含有前肽的重组hK1上游扩增引物(SEQIDNO.23)
P2:CCGCTCGAGAAGAGAGAAGCTCCTCCTATTCAATCTAGAATCGTCGGTGGATGGGAA
通用下游扩增引物(SEQIDNO.24)
P3:AAGGAAAAAAGCGGCCGCCTAACTATTTTCAGCGAT
反应总体积50μL，其中浓度为10μmol/L引物各加2.5μL，浓度为10mmol/L的dNTP加1μL，所用DNA聚合酶Q5超保真DNA聚合酶(M0491S，购自NewEnglandBiolabs公司)，2U/μL。反应条件为98℃10s、55℃30s、72℃30s，30个循环后，产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳分析，产物大小与预期大小(760bp左右)一致。将得到的基因产物用DNA凝胶回收试剂盒纯化。纯化后，用XhoI(#R0146S,购自NewEnglandBiolabs公司)和NotI(#R0189S,购自NewEnglandBiolabs公司)双酶切，用T4连接酶连接到pPICZαA(V19520，购自Invitrogen)质粒中，转化到Top10感受态细胞中，在含有Zeocin的LB平板中37℃培养过夜。第二天筛选阳性克隆菌测序，比对，与预期序列完全一致，即得到不含前肽、含有前肽的重组hK1表达载体，分别记为pPICZα-rhK1，pPICZα-pro-rhK1。
1.2不含前肽且含有不同间隔短肽的重组hK1表达载体构建
发明人根据步骤1.1中构建的pPICZα-rhK1质粒为模板，上、下游引物分别引入XhoI和NotI酶切位点，在紧接着XhoI酶切位点后插入不同间隔短肽EA，进行PCR扩增，所用引物序列如下：
含有1个间隔短肽EA的重组hK1的上游扩增引物(SEQIDNO.25)
P4:CCGCTCGAGAAGAGAGAAGCTATCGTCGGTGGATGGGAA
含有2个重复间隔短肽EA的重组hK1的上游扩增引物(SEQIDNO.26)
P5:CCGCTCGAGAAGAGAGAGGCTGAAGCTATCGTCGGTGGATGGGAA
含有3个重复间隔短肽EA的重组hK1的上游扩增引物(SEQIDNO.27)
P6:CCGCTCGAGAAGAGAGAAGCTGAGGCTGAAGCTATCGTCGGTGGATGGGAA含有4个重复间隔短肽EA的重组hK1的上游扩增引物(SEQIDNO.28)
P7:CCGCTCGAGAAGAGAGAGGCTGAAGCTGAGGCTGAAGCTATCGTCGGTGGATGGGAA
含有5个重复间隔短肽EA的重组hK1的上游扩增引物(SEQIDNO.29)
P8:CCGCTCGAGAAGAGAGAAGCTGAGGCTGAAGCTGAGGCTGAAGCTATCGTCGGTGGATGGGAA
含有间隔短肽EEAEAEAEPK的重组hK1的上游扩增引物(SEQIDNO.30)
P9:CCGCTCGAGAAGAGAGAAGAAGCTGAAGCTGAAGCTGAACCAAAGATCGTCGGTGGATGGGAA
通用下游扩增引物(SEQIDNO.24)
P3:AAGGAAAAAAGCGGCCGCCTAACTATTTTCAGCGAT
反应总体积50μL，其中浓度为10μmol/L引物各加2.5μL，浓度为10mmol/L的dNTP加1μL，所用DNA聚合酶Q5超保真DNA聚合酶，2U/μL。反应条件为98℃10s、55℃30s、72℃30s，30个循环后，经1.0％琼脂糖凝胶电泳分析，产物大小与预期大小(760bp左右)一致。将得到的基因产物用DNA凝胶回收试剂盒纯化。纯化后，用XhoI和NotI双酶切，再用T4连接酶连接到pPICZαA质粒中，转化到Top10感受态细胞中，在含有Zeocin的LB平板中37℃过夜培养。第二天将筛选得到的阳性克隆菌株测序，比对，与预期序列完全一致，即得到不含前肽且含有不同间隔短肽的重组hK1表达载体，分别记为pPICZα-1EA-rhK1(质粒构建如图1-a所示)，pPICZα-2EA-rhK1，pPICZα-3EA-rhK1，pPICZα-4EA-rhK1，pPICZα-5EA-rhK1，pPICZα-EEA-rhK1。
1.3含有不同间隔短肽和前肽的重组hK1表达载体构建
发明人根据步骤1.1中构建的pPICZα-pro-rhK1质粒为模板，上、下游引物分别引入XhoI和NotI酶切位点，在紧接着XhoI酶切位点后插入不同间隔短肽EA，进行PCR扩增，所用引物序列如下：
含有1个间隔短肽EA的重组hK1的上游扩增引物(SEQIDNO.31)
P10:CCGCTCGAGAAGAGAGAAGCTCCTCCTATTCAATCTAGA
含有2个重复间隔短肽EA的重组hK1的上游扩增引物(SEQIDNO.32)
P11:CCGCTCGAGAAGAGAGAGGCTGAAGCTCCTCCTATTCAATCTAGA
含有3个重复间隔短肽EA的重组hK1的上游扩增引物(SEQIDNO.33)
P12:CCGCTCGAGAAGAGAGAAGCTGAGGCTGAAGCTCCTCCTATTCAATCTAGA
含有4个重复间隔短肽EA的重组hK1的上游扩增引物(SEQIDNO.34)
P13:CCGCTCGAGAAGAGAGAGGCTGAAGCTGAGGCTGAAGCTCCTCCTATTCAATCTAGA
含有5个重复间隔短肽EA的重组hK1的上游扩增引物(SEQIDNO.35)
P14:CCGCTCGAGAAGAGAGAAGCTGAGGCTGAAGCTGAGGCTGAAGCTCCTCCTATTCAATCTAGA
含有间隔短肽EEAEAEAEPK的重组hK1的上游扩增引物(SEQIDNO.36)
P15:CCGCTCGAGAAGAGAGAAGAAGCTGAAGCTGAAGCTGAACCAAAGCCTCCTATTCAATCTAGA
通用下游扩增引物(SEQIDNO.24)
P3:AAGGAAAAAAGCGGCCGCCTAACTATTTTCAGCGAT
反应总体积50μL，其中浓度为10μmol/L引物各加2.5μL，浓度为10mmol/L的dNTP加1μL，所用DNA聚合酶Q5超保真DNA聚合酶，2U/μL。反应条件为98℃10s、55℃30s、72℃30s，30个循环后，经1.0％琼脂糖凝胶电泳分析，产物大小与预期大小(760bp左右)一致。将得到的基因产物用DNA凝胶回收试剂盒纯化。纯化后，用XhoI和NotI双酶切，再用T4连接酶连接到pPICZαA质粒中，转化到Top10感受态细胞中，在含有Zeocin的LB平板中37℃过夜培养。第二天将筛选获得的阳性克隆菌测序，比对，与预期序列完全一致，即得到含有不同间隔短肽和前肽的重组hK1表达载体，分别记为pPICZα-1EA-pro-rhK1(质粒构建如图1-b所示)，pPICZα-2EA-pro-rhK1，pPICZα-3EA-pro-rhK1，pPICZα-4EA-pro-rhK1，pPICZα-5EA-pro-rhK1，pPICZα-EEA-pro-rhK1。
实施例2.不同的重组hK1工程菌株的诱导表达
2.1重组hK1工程菌株筛选
按EasySelectPichiaExpressionKit提供的方法将X-33，GS115菌株(C18000，购自Invitrogen)制备成电转染感受态细胞。分别将实施例1中的不同形式的表达载体用SacI(#R0156S,购自NewEnglandBiolabs公司)限制性内切酶线性化，并通过乙醇沉淀的方法将线性化载体纯化，电转化上述线性化载体于毕赤酵母X-33和GS115感受态细胞中，涂布含有不同浓度的Zeocin(R250-01，购自Invitrogen公司)的YPD固体培养基(酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L，琼脂糖15g/L)中，30℃培养3-5天，就有阳性单克隆重组菌株生成。
2.2重组菌株诱导鉴定
挑取步骤2.1中获得的不同的高表达单克隆重组菌株于5mLBMGY培养基(酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，K2HPO43g/L，KH2PO411.8g/L，YNB13.4g/L，生物素4×10-4g/L，甘油10g/L)中，于50mL无菌离心管中30℃，220rpm培养，至OD600＝2.0-6.0时，取1mL保存菌种，并将剩余菌液重悬后转移到5mLBMMY培养基(酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，K2HPO43g/L，KH2PO411.8g/L，YNB13.4g/L，生物素4×10-4g/L，甲醇5mL/L)中小量诱导表达，每隔24h补加甲醇至终浓度为1％(v/v)。一周后，离心收集菌液上清，图2-a，2-b不为同的形式的重组hK1表达载体筛选获得的重组菌株的SDS-PAGE凝胶电泳图。
2.3重组hK1工程菌株扩大诱导表达
分别挑取步骤2.2中获得的不同的重组hK1基因工程菌株接种于改良发酵BSM培养基(甘油40g/L，H3PO49mL/L，CaSO4·2H2O0.3g/L，K2SO46.07g/L，MgSO4·7H2O4.97g/L，KOH1.38g/L)中，并用浓氨水调节培养基至pH＝6.0。48小时后，待菌体密度生长到OD＝2～6，每隔24小时补加甲醇至终浓度为1.0％(v/v)，2mL/LPMT1微量盐(CuSO46.0g/L，KI0.8g/L，MnSO4·H2O3.0g/L，Na2MoO4·2H2O0.2g/L，H3BO30.2g/L，CaSO4·2H2O0.5g/L，ZnCl220g/L，FeSO4·7H2O65g/L，Biotin0.2g/L，浓硫酸5mL/L)溶液。一周后，收集发酵培养液。
实施例3.不同的重组hK1工程菌株发酵液纯化
由于重组毕赤酵母菌株表达hK1有两条不同的条带，据研究该两条带均为重组hK1，它们的区别就是糖基化修饰程度不同，且高低比列约为3:7，该两条带蛋白活性相差不大，考虑到毕赤酵母甲醇酵母分泌的重组hK1蛋白中，其糖分主要由甘露糖组成，因此纯化低分子量条带用于后续实验。
本专利主要采用疏水层析和亲和层析两步分离纯化重组hK1发酵液，柱子分别选择为HiTrapPhenylHP和HiTrapBenzamidineFF，具体步骤如下：
3.1发酵液的除杂预处理
按实施例2步骤2.3中表达方法得到不同的重组hK1重组菌株发酵液上清，12000rpm，15min低温离心收集上清，缓慢加入NH)2SO4固体粉末，并不断地搅拌，使(NH)2SO4在上清中终浓度为1.2M，调节pH6.0，0.45μm滤膜过滤。
3.2疏水层析
运用全自动智能蛋白纯化系统(AKTAavant150，购自GEhealcare)UNICORN6.1操作软件中DOE方法对预处理获得的重组hK1发酵液进行优化HiTrapPhenylHP纯化工艺，最终确定为平衡缓冲液为20mM磷酸盐，1.2M(NH)2SO4，pH6.0，洗脱缓冲液为20mM磷酸盐，pH6.0。按照15％-30％-45％-50％-100％逐步提高洗脱缓冲液的比例进行洗脱，收集各个洗脱峰，结果见图3-a，通过SDS-PAGE电泳确定纯度后合并符合要求的收集管，进行第二步纯化。
3.3亲和层析
合并疏水层析收集的含有目的蛋白的(峰4)样品峰，调节pH7.5，平衡缓冲液为20mM磷酸盐，0.5MNaCl，pH7.5，洗脱缓冲液为0.5MNaCl，10mMHCl，pH2.0。洗脱后收集各洗脱峰，结果如图3-b，SDS-PAGE鉴定(如图4-a、4-b所示)后合并纯度大于95％的洗脱峰，过滤除菌，即得到纯化后重组hK1蛋白。
实施例4不同的重组hK1蛋白N端氨基酸序列分析
4.1重组hK1样品纯度鉴定
本试验主要采用基于ZorbaxSB-C18反向色谱柱梯度洗脱的方法，分析实施例3获得的重组hK1纯化样品，利用安捷伦高效液相色谱系统(Agilent1260HPLC)对样品进行纯度分析，结果由图5-a，5-b所示，纯化获得的样品纯度达到99％以上，说明实施例3的纯化工艺完全可行。
4.2重组hK1蛋白N端氨基酸序列分析
本试验主要采用基于经典的Edman降解法的N端序列分析，利用岛津全自动蛋白质多肽测序仪(PPSQ-31A，SHIMADZU)对实施例3中纯化获得的rhK1样品的N端氨基酸序列进行分析，结果由表1所示，当表达载体分别为pPICZα-1EA-rhK1，pPICZα-2EA-rhK1，pPICZα-3EA-rhK1，pPICZα-4EA-rhK1，pPICZα-5EA-rhK1，PICZα-EEA-rhK1时，筛选获得的重组hK1菌株表达重组hK1样品的N端氨基酸残基测序结果均为和EAIVGGW和IVGGW的混合物(见图6-b)，这表明利用此种分子构建策略在毕赤酵母系统中表达的重组hK1蛋白其N端序列在信号肽剪切不完全；当表达载体分别为pPICZα-1EA-pro-rhK1，pPICZα-2EA-pro-rhK1，pPICZα-3EA-pro-rhK1，pPICZα-4EA-pro-rhK1，pPICZα-5EA-pro-rhK1，PICZα-EEA-pro-rhK1的时候，筛选获得的重组hK1菌株表达重组hK1样品N端氨基酸残基测序结果均为IVGGW(见图6-c)。按上述实验方案经多次实验所得结果见表1。这表明利用此种分子构建策略在毕赤酵母系统中表达的重组hK1蛋白其N端序列与天然序列完全一致。
表1N端氨基酸残基序列分析
4.3重组hK1蛋白生物活性鉴定
首先将反应缓冲液(50mmol/LTris-HCl，100mmol/LNaCl，10mmol/LCaCl2，pH＝8.0)将标准品猪激肽释放酶(购于千红制药的猪激肽释放酶纯品，NO.3712030700)，稀释5个浓度梯度10U/mL，5U/mL，2.5U/mL，1.25U/mL，0.625U/mL，底物为D-Val-Leu-Argp-nitroanilide(购自Sigma-Aldrich公司)，使用时用反应缓冲液稀释至0.2mmol/L。样品用反应缓冲液稀释适当倍数，于96孔板中先每孔加稀释好的底物80μL，然后立即加入稀释好的标准品80μl及各样品，SynergyH1GEN酶标仪(购自BioTek公司)37℃，405nm处进行吸光度检测，1min检测一次，连续检测15min。实验结果见表1，当表达载体分别为pPICZα-1EA-rhK1，pPICZα-2EA-rhK1，pPICZα-3EA-rhK1，pPICZα-4EA-rhK1，pPICZα-5EA-rhK1，PICZα-EEA-rhK1时，筛选获得的重组hK1菌株表达重组hK1样品活性为150IU左右；当表达载体分别为pPICZα-1EA-pro-rhK1，pPICZα-2EA-pro-rhK1，pPICZα-3EA-pro-rhK1，pPICZα-4EA-pro-rhK1，pPICZα-5EA-pro-rhK1，PICZα-EEA-pro-rhK1的时候，筛选获得的重组hK1菌株表达重组hK1样品活性为750IU/mg左右。因此，申请人在解决间隔短肽添加后有剪切不完全的技术问题的同时，也意外的实现了重组hK1表达产物活性有很大提高的技术效果。申请人分析，这是由于在毕赤酵母系统中表达的重组hK1蛋白活性与N端剪切正确有密切关系。
实施例5重组hK1工程菌株中试发酵
5.1种子液的培养
将保存于-80℃冰箱的N端氨基酸剪切正确的重组hK1工程甘油菌株划线于YPD平板中，置于30℃培养箱中培养，直至长出单菌落；挑一个单菌落接入10mL的BMGY液体培养基中，30℃，250rpm摇瓶中培养12～18h，得到一级种子液；将培养好的一级种子液以l:100比例再次接种于500mL的BMGY培养基中30℃，200r/min，振荡培养12～18h，至OD600≈6.0，镜检正常就得到二级种子液准备上罐接种用。
5.2高密度发酵条件确定
配制10L的改良发酵BSM培养基(甘油40g/L，H3PO49mL/L，CaSO4·2H2O0.3g/L，K2SO46.07g/L，MgSO4·7H2O4.97g/L，KOH1.38g/L)和1LPMT1微量盐溶液(CuSO46.0g/L，KI0.8g/L，MnSO4·H2O3.0g/L，Na2MoO4·2H2O0.2g/L，H3BO30.2g/L，CaSO4·2H2O0.5g/L，ZnCl220g/L，FeSO4·7H2O65g/L，Biotin0.2g/L，浓硫酸5mL/L)溶液，并将改良发酵BSM培养基于赛多利斯Cplus生物反应器中进行在线灭菌，灭菌后用浓氨水调节培养基至pH＝6.0，并将步骤5.1中500mL二级种子液接种于该培养基中。发酵培养初始条件为：30℃，搅拌转速为：300rpm，pH＝6.0±0.2，添加PMT1微量盐溶液，培养过程中调节搅拌(300～1000rpm)和通空气量(1～3v/v.m)保持溶氧30～100％，当溶氧有一个明显的跃升时，即表明细胞消耗完初始甘油，此时开始流加50％的甘油，当菌体湿重达到400g/L左右，结束甘油流加。然后保持1h高溶氧水平，使细胞代谢残余甘油和甘油代谢副产物。继而开始流加甲醇诱导目的蛋白表达，发酵过程中维持DO不低于20％，温度30℃，pH＝6.0±0.2进行诱导表达。由图7可知，在甘油流加培养过程中，菌体生长良好，很快进入对数生长期，菌体湿重最高达到497g/L，发酵液OD600值最高达到308。在进入蛋白甲醇诱导表达阶段后，菌体湿重和发酵液OD600值不再增加，重组毕赤酵母菌株进入蛋白稳定表达阶段。在整个诱导表达其间，每隔12小时进行取样，并实时取样进行染色镜检，观察重组毕赤酵母菌株的发酵情况和是否发生染菌，并用SDS-PAGE分析表达量，图8为光学显微镜下观察重组毕赤酵母菌株形态，从图中可以发现，重组毕赤酵母生长状态良好，没有观察到杂菌的存在。图9为整个发酵过程中流加甲醇诱导电泳图。经过计算，同摇瓶中相比，重组hK1的酶活达到了600IU/mg以上，发酵液中表达产物达到了1.35g/L以上。申请人分析，采用本专利中的优化方法获得的重组菌株，完全能够产业化扩大生产。
Claims (10)
1.一种载体，所述载体上含有编码间隔短肽的核苷酸序列，所述的间隔短肽为1-10个EA或EEAEAEAEPK。
2.如权利要求1所述的载体，所述的间隔短肽为1-5个EA或EEAEAEAEPK，其编码1-5个EA的核苷酸序列分别如SEQIDNO.1-5所示，编码EEAEAEAEPK的核苷酸序列如SEQIDNO.6所示。
3.如权利要求1所述的载体，所述载体在间隔短肽的核苷酸序列3，端连接有编码目的蛋白前肽的核苷酸序列，所述前肽的核苷酸序列如SEQIDNO.21所示。
4.如权利要求1所述的载体，所述载体在间隔短肽核苷酸序列5，端连接有信号肽核苷酸序列，所述的信号肽为黑曲霉α-淀粉酶信号肽、人血清白蛋白信号肽、酿酒酵母α-factor信号肽及蛋白自身信号肽，所述信号肽优选为人血清白蛋白信号肽和酿酒酵母α-factor信号肽，所述载体为pAO815，pPIC9，pPIC9K，pPIC3.5，pPIC3.5K，pPICZαA、B、C或pGAPZαA、B、C。
5.权利要求1-4中任一项所述的载体在毕赤酵母中表达人组织激肽释放酶的应用。
6.一种在N端含有间隔短肽的人组织激肽释放酶的融合蛋白，所述的间隔短肽为1-5个EA或EEAEAEAEPK。
7.如权利要求6所述的融合蛋白，在人组织激肽释放酶和间隔短肽之间还有如SEQIDNO.20所示的前肽。
8.编码如权利要求6所述的融合蛋白的核苷酸序列，所述核苷酸序列如SEQIDNO.13-18所示。
9.如权利要求8所述的核苷酸序列，其特征在于，在人组织激肽释放酶和间隔短肽的核苷酸序列之间还有如SEQIDNO.21所示的前肽的核苷酸序列。
10.一种N端结构正确的重组人组织激肽释放酶的表达方法，所述方法包含下述步骤：
A.构建含有如权利要求9所述核苷酸序列的载体；
B.将步骤A的载体线性化后转入毕赤酵母菌株中，并在合适的条件下培养；
C.回收纯化目的蛋白。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410854294.4A CN105802989B (zh) | 2014-12-31 | 2014-12-31 | 毕赤酵母表达重组蛋白的载体、基因、方法及应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410854294.4A CN105802989B (zh) | 2014-12-31 | 2014-12-31 | 毕赤酵母表达重组蛋白的载体、基因、方法及应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN105802989A true CN105802989A (zh) | 2016-07-27 |
| CN105802989B CN105802989B (zh) | 2020-05-19 |
Family
ID=56464960
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201410854294.4A Active CN105802989B (zh) | 2014-12-31 | 2014-12-31 | 毕赤酵母表达重组蛋白的载体、基因、方法及应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN105802989B (zh) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108148114A (zh) * | 2017-12-08 | 2018-06-12 | 珠海冀百康生物科技有限公司 | 一种提高重组小分子蛋白表达量的串联前导肽及方法 |
| CN111041033A (zh) * | 2018-10-12 | 2020-04-21 | 江苏众红生物工程创药研究院有限公司 | 重组人生长激素及其真核系统表达方法 |
| CN116057071A (zh) * | 2021-08-09 | 2023-05-02 | 长春钻智制药有限公司 | 重组灵芝免疫调节蛋白新突变体及其应用 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1969041A (zh) * | 2004-06-14 | 2007-05-23 | 诺维信公司 | 用于生产多肽的信号肽 |
| CN102816819A (zh) * | 2012-08-13 | 2012-12-12 | 山东阿华生物药业有限公司 | 提高人胰岛素前体融合蛋白酶切转换成b30缺苏氨酸人胰岛素产率的方法 |
| CN105111304A (zh) * | 2015-09-30 | 2015-12-02 | 山东阿华生物药业有限公司 | 重组人胰岛素前体的纯化和酶切转换方法 |
-
2014
- 2014-12-31 CN CN201410854294.4A patent/CN105802989B/zh active Active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1969041A (zh) * | 2004-06-14 | 2007-05-23 | 诺维信公司 | 用于生产多肽的信号肽 |
| CN102816819A (zh) * | 2012-08-13 | 2012-12-12 | 山东阿华生物药业有限公司 | 提高人胰岛素前体融合蛋白酶切转换成b30缺苏氨酸人胰岛素产率的方法 |
| CN105111304A (zh) * | 2015-09-30 | 2015-12-02 | 山东阿华生物药业有限公司 | 重组人胰岛素前体的纯化和酶切转换方法 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| EVANS,B.A.等: "GenBank: AAA59455.1", 《GENBANK》 * |
| 史莹飞 等: "人胰岛素原密码子的优化及其在毕赤酵母中的表达", 《厦门大学学报（自然科学版）》 * |
| 熊爱生 等: "信号肽序列对毕赤酵母表达外源蛋白质的影响", 《生物化学与生物物理学报》 * |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108148114A (zh) * | 2017-12-08 | 2018-06-12 | 珠海冀百康生物科技有限公司 | 一种提高重组小分子蛋白表达量的串联前导肽及方法 |
| CN108148114B (zh) * | 2017-12-08 | 2020-05-15 | 珠海冀百康生物科技有限公司 | 一种提高重组小分子蛋白表达量的串联前导肽及方法 |
| CN111041033A (zh) * | 2018-10-12 | 2020-04-21 | 江苏众红生物工程创药研究院有限公司 | 重组人生长激素及其真核系统表达方法 |
| CN111041033B (zh) * | 2018-10-12 | 2022-04-05 | 江苏众红生物工程创药研究院有限公司 | 重组人生长激素及其真核系统表达方法 |
| CN116057071A (zh) * | 2021-08-09 | 2023-05-02 | 长春钻智制药有限公司 | 重组灵芝免疫调节蛋白新突变体及其应用 |
| CN116057071B (zh) * | 2021-08-09 | 2023-10-10 | 长春钻智制药有限公司 | 重组灵芝免疫调节蛋白新突变体及其应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN105802989B (zh) | 2020-05-19 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CA2903568C (en) | Constitutive promoter | |
| US11359191B2 (en) | Variant recombinant dermatophagoides pteronyssinus type 1 allergen protein and its preparation method and application | |
| CN108350447B (zh) | 启动子变体 | |
| CN108265058B (zh) | 一种重组粉尘螨1类变应原蛋白及其制备方法和应用 | |
| CA2849856A1 (en) | Regulatable promoter | |
| CN102839165A (zh) | 基因突变型重组蛋白酶k及其工业化生产方法 | |
| US11236137B2 (en) | Recombinant Dermatophagoides farinae type 2 allergen protein and its preparation method and application | |
| CN104232611B (zh) | 一种重组布氏白僵菌蛋白酶k及其工业化生产与纯化方法 | |
| CN105802989B (zh) | 毕赤酵母表达重组蛋白的载体、基因、方法及应用 | |
| CN106939315B (zh) | 一种草酸脱羧酶的制备方法及应用 | |
| US11319353B2 (en) | Recombinant Dermatophagoides pteronyssinus type 2 allergen protein and its preparation method and application | |
| CN111909916B (zh) | 一种来源于南极磷虾的双链特异性核酸酶及其制备方法 | |
| CN104561063A (zh) | 一种牛肠激酶的cDNA片段、高效表达重组质粒及其基因工程菌和表达方法 | |
| JP4491588B2 (ja) | キラー蛋白質の精製方法 | |
| CN110819609B (zh) | 一种热稳定性提高的突变脂肪酶及其制备方法与应用 | |
| US10351857B2 (en) | Marine bacterial gene LfliZ and use | |
| CN116622784B (zh) | 一种大麻二酚酸合成酶的应用 | |
| CN117247911B (zh) | 大肠杆菌dna连接酶突变体及其在毕赤酵母中表达纯化方法 | |
| CN108949579A (zh) | 嗜热子囊菌基因表达系统 | |
| US20220389474A1 (en) | Microbial host cells for the production of heterologous cyanuric acid hydrolases and biuret hydrolases | |
| WO2024170890A1 (en) | Engineered eukaryotic cell | |
| CN114085822A (zh) | 一种NGS核心酶Klenow片段的诱导纯化及质控方法 | |
| WO2024170891A1 (en) | Engineered eukaryotic cell | |
| CN118240675A (zh) | 一种高效合成β-乳球蛋白的酵母菌及其蛋白制备方法与应用 | |
| CN115851808A (zh) | 表达耐盐蛋白酶的重组质粒、酵母工程菌及其发酵培养基和应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| CB02 | Change of applicant information |
Address after: 213125 Jiangsu city of Changzhou Province Cloud River New District No. 518 Changzhou Qianhong biochemical pharmaceutical biological all red Applicant after: ZonHon Biopharma Institute Inc. Applicant after: Changzhou Gensun Institute of Biomedicine Co., Ltd. Address before: 213022 the Yellow River Middle Road, Xinbei District, Jiangsu, China, No. 132, No. Applicant before: ZonHon Biopharma Institute Inc. Applicant before: Changzhou Gensun Institute of Biomedicine Co., Ltd. |
|
| COR | Change of bibliographic data | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| CB02 | Change of applicant information |
Address after: 213125, Yunhe Road, Xinbei District, Jiangsu, Changzhou, 518 Applicant after: ZonHon Biopharma Institute Inc. Applicant after: Changzhou Gensun Institute of Biomedicine Co., Ltd. Address before: 213125 Jiangsu city of Changzhou Province Cloud River New District No. 518 Changzhou Qianhong biochemical pharmaceutical biological all red Applicant before: ZonHon Biopharma Institute Inc. Applicant before: Changzhou Gensun Institute of Biomedicine Co., Ltd. |
|
| CB02 | Change of applicant information | ||
| CB02 | Change of applicant information | ||
| CB02 | Change of applicant information |
Address after: 213125 No. 518 Yunhe Road, Xinbei District, Changzhou City, Jiangsu Province Applicant after: ZonHon Biopharma Institute Inc. Applicant after: Jiangsu Jingsen Biomedical New Materials Technology Co., Ltd. Address before: 213125 No. 518 Yunhe Road, Xinbei District, Changzhou City, Jiangsu Province Applicant before: ZonHon Biopharma Institute Inc. Applicant before: Changzhou Gensun Institute of Biomedicine Co., Ltd. |
|
| TA01 | Transfer of patent application right | ||
| TA01 | Transfer of patent application right |
Effective date of registration: 20190701 Address after: 213125 No. 518 Yunhe Road, Xinbei District, Changzhou City, Jiangsu Province Applicant after: ZonHon Biopharma Institute Inc. Address before: 213125 No. 518 Yunhe Road, Xinbei District, Changzhou City, Jiangsu Province Applicant before: ZonHon Biopharma Institute Inc. Applicant before: Jiangsu Jingsen Biomedical New Materials Technology Co., Ltd. |
|
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |