CN108949579A - 嗜热子囊菌基因表达系统 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种嗜热子囊菌乳清酸核苷‑5’‑磷酸脱羧酶基因(pyrG)缺陷型菌株，其保藏号为CGMCC.13375。本发明还提供包含所述缺陷型菌株的嗜热子囊菌基因表达系统以及相应的目的基因的转化和表达方法，以及编码与所述pyrG缺陷型菌株相对应的乳清酸核苷‑5’‑磷酸脱羧酶的分离的核酸。

Description

嗜热子囊菌基因表达系统
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地说，本发明涉及通过紫外诱变方法，筛选出一株乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶基因(pyrG)突变的尿嘧啶营养缺陷型的嗜热子囊菌菌株，并且涉及利用所述菌株的嗜热子囊菌基因表达系统。
背景技术
嗜热子囊菌(Thermoascus aurantiacus)是子囊菌类的耐热真菌。最早于1907年由Hugo Miehe在自发生热的干草垛中分离得到。嗜热子囊菌的孢子呈亮橘黄色椭球形，一般认为没有无性繁殖阶段。报导的嗜热子囊菌孢子萌发的最佳和最高温度分别为47.5℃和60℃左右。相应的菌丝生长的最适和最高温度则较低，分别在40-45℃和55℃。孢子萌发和菌丝生长的下限温度则分别为32.5℃-35℃和20℃-25℃。另外孢子萌发率会受菌株培养年龄的些微影响。
嗜热子囊菌是一种能够高表达耐热纤维素酶的子囊菌纲真菌，可以生产一大批工业上有应用价值的酶类。这些耐热酶出色的高温稳定性和变性剂耐受性赋予其很好的工业潜力。而且嗜热子囊菌在以源自农林业废弃物，木质纤维素类生物质为基础的培养条件下可有效生长。在此类低成本的常见材料上的出色适应性使其在工业上生产纤维素酶时具有重大优势。在木质纤维素类生物质精炼方面，相对于化学转化在温度压力要求上也都温和许多。耐热酶因其在工业条件下的应用优势：(1)大量转化反应可以在更高温度下进行以降低体系粘度；(2)污染风险降低； (3)酶可以在室温有效保存而不失活。但是由于特异培养的生长速率低，大量生产商用耐热生物酶仍旧是一个经济上的挑战。所以要充分发掘它的生物技术潜能，特别是在分子和基因层面上，还有很多工作需要完成。其中很重要的一个障碍就是嗜热子囊菌还没有建立转化和遗传操作系统。因此建立一个有效的丝状真菌遗传操作系统具有重要价值。
当前丝状真菌中使用的转化方法主要有：⑴原生质体-PEG转化法；⑵农杆菌介导的转化；⑶电击转化法；⑷醋酸锂转化法；⑸脂质体转化法；⑹基因枪法等(Dhawale等1984,Chakraborty等1991,Hazell等2000, Michielse等2008,Yin等2012,Chai等2013)。
若要进一步开发嗜热子囊菌的工业潜力，在分子和遗传方面还有许多工作要做。但是该菌种始终没有有效可用的遗传操作系统。本发明通过紫外诱变的方法构建了稳定遗传的嗜热子囊菌pyrG缺陷型菌株。使用蜗牛酶处理菌丝成功地获得了具有再生活力的原生质体，克隆了可作为选择标签的该菌自身的pyrG基因、纤维二糖水解酶和内切葡萄糖苷酶的启动子，并成功的建立了嗜热子囊菌的高效转化系统并表达了外源基因。
发明内容
本发明目的是为了在嗜热子囊菌(Thermoascus aurantiacus)中构建一个外源基因的表达系统，这个系统包括宿主菌乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶基因(pyrG)突变的尿嘧啶营养缺陷型菌株TA3(于2016年12月22 日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号：CGMCC.13375)，外源基因在该菌株的原生质体-PEG转化方法，转化子的筛选方法，即利用克隆得到的pyrG基因作为选择标签转化入该诱变株使得其恢复合成尿嘧啶的能力来筛选转化子。构建了外源基因表达的质粒及启动子系统。
本发明成功得到一株乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶基因(pyrG)突变的尿嘧啶营养缺陷型菌株作为宿主菌，克隆了对应的pyrG基因作为转化的选择标签，克隆了纤维二糖水解酶和内切葡聚糖酶的启动子用于表达外源基因，并且建立了基因转化方法，通过淀粉酶AoAMY基因的重组表达验证了该转化系统及表达外源基因的有效性。
本发明使用紫外诱变的方法，将野生型嗜热子囊菌NBRC 9748经紫外照射后使用含有5-氟乳清酸(5-FOA)的培养基筛选，顺利取得乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶基因(pyrG)突变的尿嘧啶营养缺陷型菌株TA3。本发明还构建了该菌株的原生质体-PEG转化法，并成功的将从野生型菌株中克隆得到的pyrG基因作为选择标签转化入该诱变株使得其营养缺陷型突变得到恢复。在将外源淀粉酶基因Aoamy(Wang等2014)与纤维二糖水解酶(CBH)或内切葡萄糖苷酶(EG)的启动子(Pegp和Pcbhp)相融合，插入到带有乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶pyrG完整基因的质粒中，转化到尿嘧啶营养缺陷型菌株中，成功得到了表达该外源淀粉酶基因的菌株。
目前为止嗜热子囊菌中的遗传操作体系未见报道。本实验通过紫外诱变实验在含有5’-FOA平板上筛选到一株尿嘧啶营养缺陷型菌株TA3，通过TAIL-PCR首次获取了嗜热子囊菌pyrG基因序列，并克隆了该基因，构建了pGEM-pyrG载体。克隆了纤维二糖水解酶(Pcbhp)和内切葡萄糖苷酶的启动子(Pegp)，并建立了原生质体-PEG介导转化法通过原生质体 -PEG转化法将构建载体转入嗜热子囊菌pyrG突变株TA3中，成功表达了淀粉酶基因Aoamy。这是世界第一个嗜热子囊菌的外源基因表达系统。
更具体地，本发明提供以下各项：
1.一种嗜热子囊菌乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶基因(pyrG)缺陷型菌株，其保藏号为CGMCC.13375。
2.一种嗜热子囊菌基因表达系统，所述表达系统包含1的菌株作为宿主菌。
3.2的表达系统，所述表达系统还包含用于转化所述宿主菌的载有目的基因的载体，所述载体例如是质粒。
4.3的表达系统，其中所述载体包含与1的pyrG缺陷型菌株对应的 pyrG基因作为转化的选择标签。
5.4的表达系统，其中所述pyrG基因的序列如SEQ ID NO.1所示。
6.3的表达系统，其中所述载体在所述目的基因上游还包含启动子，所述启动子为纤维二糖水解酶(CBH)或内切葡萄糖苷酶(EG)的启动子。
7.6的表达系统，其中CBH启动子的核酸序列如SEQ ID NO.3所示， EG启动子的核酸序列如SEQ ID NO.2所示。
8.一种分离的核酸，所述核酸编码嗜热子囊菌乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶，所述核酸的核酸序列如SEQ ID NO.1所示。
9.一种用载有目的基因的外源核酸载体转化1的菌株的方法，所述方法包括以下步骤：
用蜗牛酶处理所述菌株的菌丝以制备具有再生活力的原生质体；
向获得的原生质体加入所述外源核酸载体并孵育；以及
在加入所述外源核酸载体并孵育后，加入PEG溶液(例如PEG4000 溶液)并孵育。
10.一种利用1的菌株作为宿主菌表达目的基因的方法，所述方法包括：
通过9的方法将目的基因转化到所述宿主菌中；以及
对转化到所述宿主菌中的所述目的基因进行诱导表达。
附图说明
图1.根据本发明的实施方案的示意图。
图2.pyrG基因缺陷型菌株的筛选A：嗜热子囊菌野生型及营养缺陷型在察氏培养基中加入0.01％尿嘧啶培养6天生长状况对比；B：嗜热子囊菌野生型及营养缺陷型在察氏培养基培养6天生长状况对比。尿嘧啶营养缺陷型菌株TA2和TA3在无尿嘧啶培养基上不能生长。
图3.透明圈法测定淀粉酶活性。1,2：TA3的诱导上清液和细胞裂解液(对照)；3：EGP-S-Aoamy-Tcbh-pyrG的菌株的诱导培养上清；4： EGP-Aoamy-Tcbh-pyrG菌株菌体裂解液；5：CBHP-S-Aoamy-Tcbh-pyrG 菌株的诱导培养上清；6：CBHP-Aoamy-Tcbh-pyrG转化子菌体裂解液。
具体实施方式
试剂和菌株：本发明中的所有试剂均是市场购买的试剂级以上试剂。其中葡萄糖，酵母基本氮源(YNB)，胶回收试剂盒以及限制性内切酶均购自于上海生工生物工程公司。PrimeSTAR HS DNA聚合酶，T4 ligase连接酶购自于大连宝生物公司。大肠杆菌Escherichia coli XL10 gold(美国加利福尼亚州Stratagene公司)菌株作为DNA操作时使用的宿主菌，包含100μg/mL氨苄青霉素的Luria-Bertani(LB)培养基用于培养E.coli。YG培养基用于嗜热子囊菌TA3转化前培养。MEA培养基用于嗜热子囊菌的诱导前培养。诱导培养基用于嗜热子囊菌外源基因的诱导表达。质粒 YEGAp-AoAMY(Wang等2014)和pUC19/cbh1(Hong等2003)由本实验室保存。pGEM-T easy购自Promega(北京)。
所用培养基配方如下：
YG培养基
酵母提取物0.5％
葡萄糖1％
尿嘧啶0.01％
MEA培养基
麦芽提取物 2％
葡萄糖 2％
蛋白胨 0.1％
固体培养基加入1.5％琼脂
诱导培养基
微晶纤维素1％
玉米浆1％
磷酸钾0.5％
氯化钠0.2％
CaCl2·2H2O 0.1g/L，
MgCl2·7H2O 0.5g/L，
MgSO4·7H2O 0.0002g/L，
MnCl2·4H2O 0.008g/L，
FeCl2·7H2O 0.001g/L
CuSO4·5H2O 0.006g/L
CoCl2·6H2O 0.0002g/L
pH5.0
本发明的示例实施方案涉及但不限于以下内容：
1)pyrG基因缺陷型菌株的筛选
野生型嗜热子囊菌NBRC 9748经紫外诱变后，在含有0.3％(W/V)5-氟乳清酸(5-FOA)和0.01％(W/V)尿嘧啶的察氏培养基上进行乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶基因(pyrG)突变的尿嘧啶营养缺陷型菌株的筛选。得到嗜热子囊菌(Thermoascus aurantiacus)尿嘧啶营养缺陷型菌株TA3(于 2016年12月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 (CGMCC，北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏号：CGMCC.13375)。本发明后续操作选择TA3突变株作为实验平台菌株。
2)外源基因的表达
(1)pyrG基因的克隆
以野生型嗜热子囊菌基因组为模板，使用pyrG基因的兼并引物 (pyrG-F3，pyrG-R2，见表1)进行PCR扩增，获得的产物进行测序鉴为 400bp的与pyrG基因有同源性的片段。根据测序结果设计引物pyrG-R4，然后再以pyrG-F2和pyrG-R4为引物进行PCR扩增。同样获得了400bp的片段序列。将其与第一次的片段拼接后获得了全长为600bp的片段序列。然后根据此序列进行热不对称交错PCR(TAIL-PCR)获得了pyrG基因的全长序列(GenBankKX270229，SEQ ID NO.1)。
(2)pyrG基因表达载体的构建
将(1)中获取的pyrG基因全长序列插入到pGEM-T easy载体中，得到质粒pGEM-pyrG。
(3)内切葡萄糖苷酶启动子EG-P-S基因的克隆
同样采用TAIL-PCR方法，采用的引物为EG-P-R1，R2，R3和R4，获得了多个片段，再将获得的DNA序列信息整合后，获得了内切葡萄糖苷酶 EG启动子(Pegp)的初步序列信息。然后依据此信息，设计了引物EG-P-F和 EG-P-R，并采用扩增pyrG基因DNA一样的方法和条件，成功扩增出含有 1289bp的EG启动子DNA序列并经过TA克隆得到质粒pGEM/Pegp，Pegp的序列保存到Genbank，序列号KX270231(SEQ ID NO.2)。根据内切葡萄糖苷酶的ORF(eg1)序列(GenBank:AY055121.1)(Hong等2003)结合本发明新克隆的启动子序列设计引物EGP-s-R，利用嗜热子囊菌基因组为模板，以EG-P-F和EGP-s-R为引物扩增出Pegp-s序列(Pegp的序列加上信号肽序列 atgaagctcg gctctctcgt gctcgctctc agcgcacgta ggcttacactgtcggcccctctcgcagaca gaaagcagga gaccaagcgt(SEQ ID NO.4))，经过TA克隆得到质粒pGEM/Pegp-s。另外，纤维二糖水解酶启动子的序列如SEQ ID NO.3所示。
(4)外源基因表达载体的构建
以EGP-F、EGP-R或EGP-s-R；CBHP-F、CBHP-R或CBHP-s-R； CBHP-Aoamy-F、CBHP-s-Aoamy-F、EGP-Aoamy-F、EGP-s-Aoamy-F和 Aoamy-R；Aoamy-CBH-T-F和CBH-T-R为引物对(参见表1)，分别以(3) 中pGEM/Pegp-s、pUC19/cbh1(Hong等2003)、YEGAp-AoAMY(Wang等2014)质粒为模板使用PrimeSTAR HS DNA聚合酶(大连宝生物)，分别扩增出启动子Pegp、Pegp-s、Pcbhp和Pcbhp-s，淀粉酶基因编码区Aoamy，终止子Tcbh 的DNA片段。然后将Pcbhp、Pcbhp-s、Pegp或Pegp-s分别与Aoamy、Tcbh 进行融合PCR后与经限制性内切酶PstI线性化的pGEM-pyrG载体进行连接，得到相应的表达载体pGEM/Pcbhp-Aoamy-Tcbh-pyrG、 pGEM/Pcbhp-s-Aoamy-Tcbh-pyrG、pGEM/Pegp-Aoamy-Tcbh-pyrG和 pGEM/Pegp-s-Aoamy-Tcbh-pyrG。
(5)原生质体-PEG转化法的构建和转化
使用70mg/mL蜗牛酶(上海生工生物工程股份有限公司)处理4日龄 TA3菌丝制备具有再生活力的原生质体，每200μL原生质体中加入0.5μg 步骤(4)中构建的质粒，于4℃孵育20min后加入1mL 60％PEG4000溶液，在4℃孵育25min后离心除去上清液，加入1mL复苏液在37℃下复苏15小时。复苏后3000g离心2min，移除上清，使用200μL STC溶液重悬并涂布于察氏培养基平板上进行筛选。长出的菌落即为阳性菌落。
(6)转化子的诱导表达
将筛选得到的阳性克隆挑取单菌落于MEA培养基(麦芽提取物2％，葡萄糖2％，蛋白胨0.1％)中，回收菌体，置于诱导培养基中诱导外源淀粉酶基因的表达。诱导3-4天后分别对培养上清和裂解的细胞分别进行分泌和胞内淀粉酶的活性测定(图1，表2)。
实施例1 pyrG基因缺陷型菌株的筛选
将野生型嗜热子囊菌NBRC 9748接种于MEA培养基，在37℃培养箱中培养7天，使用5mL生理盐水冲洗3次得到孢子悬液。使用血球计数板计数并将浓度调至1×106个/mL。然后取10mL置于灭菌的空培养皿中，将培养皿放置于距20W紫外灯30cm处照射5分钟。将经紫外照射后的孢子悬液涂布于含有0.3％5’-氟乳清酸(5’-FOA)和0.01％尿嘧啶的察氏培养基上进行乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶基因(pyrG)缺陷型菌株的筛选，得到尿嘧啶营养缺陷型菌株TA2和TA3(图2)，选择TA3进行了菌种保藏并用于随后的表达系统的构建。
察氏培养基
实施例2载体的构建及转化
(1)pyrG基因的扩增及表达载体的构建
根据丝状真菌的pyrG氨基酸保守序列DRKFIDI和PPTSSTAT设计兼并引物Ta-pyrG-F2、Ta-pyrG-F3和Ta-pyrG-R2(见表1)，以嗜热子囊菌的基因组为模板，以上述引物进行不同引物对之间的PCR，由引物pyrG-F3 和pyrG-R2扩增测序得到400bp的pyrG片段。根据得到的基因片段设计引物进行TAIL-PCR分别获得其5’和3’端DNA序列并拼接出1921bp的TA-pyrG 基因全长序列。
具体操作为：
(i)pyrG基因片段的克隆
以嗜热子囊菌的基因组DNA为模板进行的PCR体系
PCR程序：
将获得的PCR片段按上海生工的胶回收试剂盒说明书进行凝胶回收，然后按promega的T载体使用说明书，将扩增的片段连入pGEM-T easy载体，挑取单克隆进行测序，获得一段与其他物种pyrG有一定相似性的 400bp片段，初步定为pyrG的片段。同时以Ta-pyrG-F2和依据获得的400bp 片段设计的特异性引物Ta-pyrG-R4为引物按同样条件PCR扩增得到了另一段400bp的基因片段。这两个片段序列拼接后得到一段600bp的pyrG 基因片段序列。根据此DNA片段序列设计出3’端(Ta-pyrG-F4，F5，F6) 和5’端(Ta-pyrG-R5，R6)引物进行热不对称交错PCR(TAIL-PCR)(Liu 等2007)来获取两端未知序列。其中使用的任意兼并引物(arbitrary degenerate primers)分别为AD1，AD2，AD3和AD4，其中用于第二和第三轮TAIL-PCR的引物的任意兼并引物为AC1(Liu等2007)。扩增得到的片段经过测序鉴定后组装成为一个1921bp的基因片段。
具体TAIL-PCR反应程序为(以5’端扩增为例)：
第一轮TAIL-PCR
反应条件：
然后以第一轮TAIL-PCR产物为模板进行第二轮PCR
反应条件：
以第二轮TAIL-PCR产物为模板进行第三轮PCR
反应条件：
通过三轮PCR，以AD1为引物出发的反应，最终由AC1和pyrG-R6 扩增出800bp的片段。测序显示与其他物种pyrG有同源性，是pyrG的一部分。然后进行pyrG基因3’端序列的扩增,方法与条件与5’端序列扩增一样,只是将基因特异引物换成Ta-pryG-F4，F5，F6。最终通过AD2-
AC1和Ta-pyrG-F5为引物的PCR获得800bp的产物，测序结果显示可能是pyrG的部分序列。将获得的所有片段序列进行拼接后获得一个 1921bp的序列。依据此序列设计引物TA-pyrG-F和TA-pyrG-R，以基因组DNA为模板，扩增pyrG基因。
PCR体系为：
PCR反应程序为：
成功获得约1921bp DNA片段，按pGEM-Teasy的说明书进行TA克隆，将pyrG插入到pGEM-T easy得到质粒pGEM/pyrG并测序，测序结果显示为包含ORF在内的一个与真菌pyrG高度同源的基因，序列已保存在 GenBank，序列号KX270229。
(ii)EGp-s启动子的扩增
同样采用TAIL-PCR方法，方法和条件与pyrG基因克隆中相同，只是采用的引物为EG-P-R1，R2，R3和R4(表1)。通过TAIL-PCR的方法，使用EG-P-R3与AD1(AC1)和AD3(AC1)为引物对分别扩增出 900bp和750bp的PegP片段；使用EG-P-R4和AD1(AC1)为引物对扩增出850bp的片段。在将获得的DNA序列信息整合后，获得了EG启动子的初步序列信息。然后依据此信息，设计引物EG-P-F和EG-P-R(表1)，并采用扩增pyrG基因DNA一样的方法和条件，成功扩增出含有1289bp 的EG的启动子DNA，并按照pGEM-Teasy的说明书经过TA克隆得到质粒pGEM/Pegp，测序获得的序列保存到Genbank，序列号KX270231。根据内切葡萄糖苷酶eg1的ORF序列(GenBank:AY055121.1)(Hong等2003) 设计引物EGP-s-R，利用嗜热子囊菌基因组为模板，以EG-P-F和EGP-s-R 为引物扩增出EG启动子及信号肽(EGP-s)的序列的DNA，经过TA克隆得到质粒pGEM/Pegp-s.
(iii)载体pGEM/Pcbhp-Aoamy-Tcbh-pyrG、 pGEM/Pcbhp-s-Aoamy-Tcbh-pyrG、pGEM/Pegp-Aoamy-Tcbh-pyrG和 pGEM/Pegp-s-Aoamy-Tcbh-pyrG的构建
以pGEM/Pegp-Aoamy-Tcbh-pyrG载体构建为例，首先将启动子Pegp、淀粉酶基因Aoamy和终止子Tcbh分别从(ii)构建的质粒pGEM/Pegp-s，质粒YEGAp-AoAMY(Wang等2014)和质粒pUC19/cbh(Hong等2003)中扩增出来，然后将启动子Pegp与淀粉酶基因AoAMY融合，最后将整个表达框 Pegp-AoAMY-Tcbh融合出来后插入到质粒pGEM-pyrG，构建成表达质粒载体pGEM/Pegp-Aoamy-Tcbh-pyrG。具体操作如下：
①Pegp的PCR扩增体系
PCR程序
使用promega的PCR clean试剂盒，按说明书纯化扩增的片段。
②Aoamy的PCR扩增体系
PCR程序
使用promega的PCR clean试剂盒，按说明书纯化扩增的片段。
③Tcbh的PCR扩增体系
PCR程序
使用promega的PCR clean试剂盒，按说明书纯化扩增的片段。
④Pegp与Aoamy基因的融合
PCR程序
使用promega的PCR clean试剂盒，按说明书纯化扩增的片段。
⑤Pegp-Aoamy与Tcbh基因的融合
PCR程序
使用promega的PCR clean试剂盒，按说明书纯化扩增的片段。
⑥pGEM-pyrG的线性化及Pegp-Aoamy-Tcbh的酶切
⑦Pegp-Aoamy-Tcbh与pGEM-pyrG的连接
将融合PCR产物用PstI酶切后与经PstI线性化后的pGEM/pyrG质粒进行连接并转化E.coli XL10gold，将得到的质粒 pGEM/Pegp-Aoamy-Tcbh-pyrG。
然后使用同样的方法分别以(ii)中的pGEM/Pegp-s和 pGEM/Aoamy(Wang等2014)质粒为模板使用PrimeSTAR HS DNA聚合酶 (大连宝生物)，以EGP-F和EGP-s-R,EGP-s-Aoamy-F和Aoamy-R为引物对(表1)，分别扩增出Pegp-s和Aoamy、基因。然后将Pegp-s分别与Aoamy、 Tcbh进行融合后插入到pGEM-pyrG载体的PstI位点，得到分泌表达载体 pGEM/Pegp-s-Aoamy-Tcbh-pyrG。
采用纤维二糖水解酶(CBH)启动子(Pcbh)表达淀粉酶的载体的构建方法与使用内切葡萄糖苷酶启动子(Pegp)的方法相同。分别以 pUC19/cbh1(Hong等2003)、pGEM/Aoamy(Wang等2014)质粒为模板使用 PrimeSTAR HS DNA聚合酶(大连宝生物)，以CBHP-F与CBHP-R或 CBHP-s-R；CBHP-Aoamy-F、CBHP-s-Aoamy-F和Aoamy-R为引物对(表1)，分别扩增出Pcbhp、Pcbhp-s和Aoamy基因DNA片段。然后将Pcbhp或Pcbhp-s 分别与Aoamy、Tcbh进行融合P后插入到pGEM-pyrG载体的PstI位点，得到胞内淀粉酶表达载体pGEM/Pcbhp-Aoamy-Tcbh-pyrG和淀粉酶分泌表达载体pGEM/Pcbhp-s-Aoamy-Tcbh-pyrG。
(2)构建载体转入TA3菌株中
⑴试剂的准备
1.PEG溶液
2.溶壁溶液
NaCl 0.7M
CaCl2 0.4M
PH调节至 5.8
3.复苏液
酵母提取物 0.5％
葡萄糖 2％
山梨醇 1.2M
4.STC溶液
⑵原生质体的制备
a)将TA3孢子接种于YG培养基中在48℃下培养96小时(接种量1 ×107个孢子)。
b)将培养的菌株移入50mL离心管中，于2000×g离心2分钟收集菌体，加入10mLSTC溶液清洗，再次于2000×g离心2分钟，弃尽上清。
c)吸干水分称重，按照体积质量比2:1加入酶解溶液(蜗牛酶溶于Lytic 溶液，终浓度70mg/mL，含5mM DTT)。
d)在37℃下，于250rpm摇床中酶解6小时。
⑶CaCl2-PEG诱导转化
a)取上述酶解产物，于2000g离心2min，移除上清。
b)使用4mL STC溶液重悬，500×g离心2min，分离原生质和菌丝残留，收集3mL上清于离心管中。
c)另加入3mL STC溶液，2000×g离心2min，再次收集3mL上清。
d)将收集的上清于2000×g离心2min。
e)每管使用200μL STC溶液重悬，加入0.5μg质粒 (pGEM/Pegp-Aoamy-Tcbh-pyrG、pGEM/Pegp-s-Aoamy-Tcbh-pyrG、 pGEM/Pcbhp-Aoamy-Tcbh-pyrG和pGEM/Pcbhp-s-Aoamy-Tcbh-pyrG)，4℃孵育20min。
f)加入1mL PEG诱导溶液，迅速颠倒10次混匀，4℃孵育25min。
g)3000×g离心2min，弃尽上清，加入1mL复苏液重悬，37℃复苏 15小时。
h)3000×g离心2min，200μl STC溶液重悬，涂布于察氏培养基平板上筛选。得到对应的转菌株CBHP-Aoamy-Tcbh-pyrG、 CBHPS-Aoamy-Tcbh-pyrG、EGP-Aoamy-Tcbh-pyrG和EGPS-Aoamy-Tcbh-pyrG。
实施例3淀粉酶基因的诱导表达
将CBHP-Aoamy-Tcbh-pyrG、CBHPS-Aoamy-Tcbh-pyrG、 EGP-Aoamy-Tcbh-pyrG、EGPS-Aoamy-Tcbh-pyrG菌株分别接种于100 mLMEA培养基中(250mL锥形瓶)，在50℃,200rpm振荡培养3天后5000 ×g离心回收菌丝并转接入100mL诱导培养基中。在50℃,200rpm振荡诱导培养4天后，分泌表达的(有信号肽)收集培养上清液，胞内表达的回收菌丝，重悬与8mL裂解缓冲液中，并在130W的超声破碎仪中破碎 10min(破碎2秒，暂停4秒)，破碎后于4℃离心机中在12000g下离心10min。上清作为酶液保存。在含有1％可溶性淀粉的琼脂平板上的平板上打孔，然后分别取胞外分泌表达的上清和胞内表达的破碎液50μl添加到孔中，在 37℃培养箱中保温12h后，添加1％I2-KI碘液。同时，根据Wilson的淀粉酶测定方法(Wilson等1982)进行淀粉酶活性的定量测定。结果证明无论是分泌还是胞内，淀粉酶都成功表达，有明显的淀粉酶活力(图2，表2)。
表1.本实验中用到的引物
表2.淀粉酶活性测定。
*表中序号与图3中序号对应。
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Claims (10)

1.一种嗜热子囊菌乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶基因(pyrG)缺陷型菌株，其保藏号为CGMCC.13375。
2.一种嗜热子囊菌基因表达系统，所述表达系统包含权利要求1的菌株作为宿主菌。
3.权利要求2的表达系统，所述表达系统还包含用于转化所述宿主菌的载有目的基因的载体，所述载体例如是质粒。
4.权利要求3的表达系统，其中所述载体包含与权利要求1的pyrG缺陷型菌株对应的pyrG基因作为转化的选择标签。
5.权利要求4的表达系统，其中所述pyrG基因的序列如SEQ ID NO.1所示。
6.权利要求3的表达系统，其中所述载体在所述目的基因上游还包含启动子，所述启动子为纤维二糖水解酶(CBH)或内切葡萄糖苷酶(EG)的启动子。
7.权利要求6的表达系统，其中CBH启动子的核酸序列如SEQ ID NO.3所示，EG启动子的核酸序列如SEQ ID NO.2所示。
8.一种分离的核酸，所述核酸编码嗜热子囊菌乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶，所述核酸的核酸序列如SEQ ID NO.1所示。
9.一种用载有目的基因的外源核酸载体转化权利要求1的菌株的方法，所述方法包括以下步骤：
用蜗牛酶处理所述菌株的菌丝以制备具有再生活力的原生质体；
向获得的原生质体加入所述外源核酸载体并孵育；以及
在加入所述外源核酸载体并孵育后，加入PEG溶液(例如PEG4000溶液)并孵育。
10.一种利用权利要求1的菌株作为宿主菌表达目的基因的方法，所述方法包括：
通过权利要求9的方法将目的基因转化到所述宿主菌中；以及
对转化到所述宿主菌中的所述目的基因进行诱导表达。
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