CN104395454A - 改善的真菌选择 - Google Patents
改善的真菌选择 Download PDFInfo
- Publication number
- CN104395454A CN104395454A CN201380028411.5A CN201380028411A CN104395454A CN 104395454 A CN104395454 A CN 104395454A CN 201380028411 A CN201380028411 A CN 201380028411A CN 104395454 A CN104395454 A CN 104395454A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- seq
- polynucleotide
- intron
- nucleotide
- gene
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 241000233866 Fungi Species 0.000 title claims description 46
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims abstract description 165
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims abstract description 165
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims abstract description 165
- 108020004422 Riboswitch Proteins 0.000 claims abstract description 72
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 71
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 71
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 71
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 70
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 70
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 claims abstract description 53
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 47
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims abstract description 31
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 157
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 81
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims description 59
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 claims description 47
- 210000001324 spliceosome Anatomy 0.000 claims description 42
- 240000006439 Aspergillus oryzae Species 0.000 claims description 28
- 235000002247 Aspergillus oryzae Nutrition 0.000 claims description 28
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 25
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 25
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 claims description 25
- 241000534944 Thia Species 0.000 claims description 23
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 claims description 20
- 108090001060 Lipase Proteins 0.000 claims description 18
- 102000004882 Lipase Human genes 0.000 claims description 18
- 239000004367 Lipase Substances 0.000 claims description 18
- 235000019421 lipase Nutrition 0.000 claims description 18
- 108010059892 Cellulase Proteins 0.000 claims description 15
- 101150095344 niaD gene Proteins 0.000 claims description 15
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 14
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 claims description 13
- 239000004382 Amylase Substances 0.000 claims description 12
- 108010065511 Amylases Proteins 0.000 claims description 12
- 102000013142 Amylases Human genes 0.000 claims description 12
- 241000235648 Pichia Species 0.000 claims description 12
- 235000019418 amylase Nutrition 0.000 claims description 12
- 101150026857 ctpJ gene Proteins 0.000 claims description 11
- 230000010354 integration Effects 0.000 claims description 11
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 claims description 10
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 claims description 10
- 241000223218 Fusarium Species 0.000 claims description 9
- 108090000913 Nitrate Reductases Proteins 0.000 claims description 9
- 229930029653 phosphoenolpyruvate Natural products 0.000 claims description 9
- DTBNBXWJWCWCIK-UHFFFAOYSA-N phosphoenolpyruvic acid Chemical compound OC(=O)C(=C)OP(O)(O)=O DTBNBXWJWCWCIK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 claims description 9
- UHPMCKVQTMMPCG-UHFFFAOYSA-N 5,8-dihydroxy-2-methoxy-6-methyl-7-(2-oxopropyl)naphthalene-1,4-dione Chemical compound CC1=C(CC(C)=O)C(O)=C2C(=O)C(OC)=CC(=O)C2=C1O UHPMCKVQTMMPCG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 108010008885 Cellulose 1,4-beta-Cellobiosidase Proteins 0.000 claims description 8
- 108010073178 Glucan 1,4-alpha-Glucosidase Proteins 0.000 claims description 8
- 108010025915 Nitrite Reductases Proteins 0.000 claims description 8
- 241000223259 Trichoderma Species 0.000 claims description 8
- 241000123346 Chrysosporium Species 0.000 claims description 7
- 102100022624 Glucoamylase Human genes 0.000 claims description 7
- 108010029541 Laccase Proteins 0.000 claims description 7
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 claims description 7
- 108010051210 beta-Fructofuranosidase Proteins 0.000 claims description 7
- 108010047754 beta-Glucosidase Proteins 0.000 claims description 7
- 102000006995 beta-Glucosidase Human genes 0.000 claims description 7
- 229940106157 cellulase Drugs 0.000 claims description 7
- 235000011073 invertase Nutrition 0.000 claims description 7
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 claims description 7
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 108010011619 6-Phytase Proteins 0.000 claims description 6
- 241001019659 Acremonium <Plectosphaerellaceae> Species 0.000 claims description 6
- 102000004400 Aminopeptidases Human genes 0.000 claims description 6
- 108090000915 Aminopeptidases Proteins 0.000 claims description 6
- 241000223651 Aureobasidium Species 0.000 claims description 6
- 241000222120 Candida <Saccharomycetales> Species 0.000 claims description 6
- 108010006303 Carboxypeptidases Proteins 0.000 claims description 6
- 102000005367 Carboxypeptidases Human genes 0.000 claims description 6
- 102000016938 Catalase Human genes 0.000 claims description 6
- 108010053835 Catalase Proteins 0.000 claims description 6
- 108010031396 Catechol oxidase Proteins 0.000 claims description 6
- 102000030523 Catechol oxidase Human genes 0.000 claims description 6
- 108010022172 Chitinases Proteins 0.000 claims description 6
- 102000012286 Chitinases Human genes 0.000 claims description 6
- 241000222511 Coprinus Species 0.000 claims description 6
- 241000222356 Coriolus Species 0.000 claims description 6
- 241001337994 Cryptococcus <scale insect> Species 0.000 claims description 6
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 claims description 6
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 claims description 6
- 101100404840 Emericella nidulans (strain FGSC A4 / ATCC 38163 / CBS 112.46 / NRRL 194 / M139) niiA gene Proteins 0.000 claims description 6
- 101000925662 Enterobacteria phage PRD1 Endolysin Proteins 0.000 claims description 6
- 108090000371 Esterases Proteins 0.000 claims description 6
- 241000223198 Humicola Species 0.000 claims description 6
- 102000004195 Isomerases Human genes 0.000 claims description 6
- 108090000769 Isomerases Proteins 0.000 claims description 6
- 241000235649 Kluyveromyces Species 0.000 claims description 6
- 241001138401 Kluyveromyces lactis Species 0.000 claims description 6
- 241000235087 Lachancea kluyveri Species 0.000 claims description 6
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 claims description 6
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 claims description 6
- 108090000856 Lyases Proteins 0.000 claims description 6
- 102000004317 Lyases Human genes 0.000 claims description 6
- 102100024295 Maltase-glucoamylase Human genes 0.000 claims description 6
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 claims description 6
- 108010054377 Mannosidases Proteins 0.000 claims description 6
- 102000001696 Mannosidases Human genes 0.000 claims description 6
- 241000235395 Mucor Species 0.000 claims description 6
- 241000226677 Myceliophthora Species 0.000 claims description 6
- 241000221960 Neurospora Species 0.000 claims description 6
- 101710157860 Oxydoreductase Proteins 0.000 claims description 6
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 241001236817 Paecilomyces <Clavicipitaceae> Species 0.000 claims description 6
- 241000228143 Penicillium Species 0.000 claims description 6
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 claims description 6
- 241000222350 Pleurotus Species 0.000 claims description 6
- 235000003534 Saccharomyces carlsbergensis Nutrition 0.000 claims description 6
- 235000001006 Saccharomyces cerevisiae var diastaticus Nutrition 0.000 claims description 6
- 244000206963 Saccharomyces cerevisiae var. diastaticus Species 0.000 claims description 6
- 241001123227 Saccharomyces pastorianus Species 0.000 claims description 6
- 241000222480 Schizophyllum Species 0.000 claims description 6
- 241000235346 Schizosaccharomyces Species 0.000 claims description 6
- 241000228341 Talaromyces Species 0.000 claims description 6
- 241001494489 Thielavia Species 0.000 claims description 6
- 241001149964 Tolypocladium Species 0.000 claims description 6
- 241000222354 Trametes Species 0.000 claims description 6
- 108060008539 Transglutaminase Proteins 0.000 claims description 6
- 241000235015 Yarrowia lipolytica Species 0.000 claims description 6
- 108010030291 alpha-Galactosidase Proteins 0.000 claims description 6
- 102000005840 alpha-Galactosidase Human genes 0.000 claims description 6
- 108010028144 alpha-Glucosidases Proteins 0.000 claims description 6
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 claims description 6
- 108010089934 carbohydrase Proteins 0.000 claims description 6
- 108010026195 glycanase Proteins 0.000 claims description 6
- 230000009643 growth defect Effects 0.000 claims description 6
- 239000001814 pectin Substances 0.000 claims description 6
- 229920001277 pectin Polymers 0.000 claims description 6
- 235000010987 pectin Nutrition 0.000 claims description 6
- 229940072417 peroxidase Drugs 0.000 claims description 6
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 claims description 6
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 claims description 6
- 229940085127 phytase Drugs 0.000 claims description 6
- 102000003601 transglutaminase Human genes 0.000 claims description 6
- 241000235349 Ascomycota Species 0.000 claims description 5
- -1 acuN Proteins 0.000 claims description 5
- 230000004110 gluconeogenesis Effects 0.000 claims description 5
- 239000000779 smoke Substances 0.000 claims description 5
- 241000146399 Ceriporiopsis Species 0.000 claims description 4
- 241000235379 Piromyces Species 0.000 claims description 4
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 claims description 4
- 241000204893 Saccharomyces douglasii Species 0.000 claims description 4
- 101150075165 acuK gene Proteins 0.000 claims description 4
- 229940081969 saccharomyces cerevisiae Drugs 0.000 claims description 4
- 241000222490 Bjerkandera Species 0.000 claims description 2
- 241001344133 Magnaporthe Species 0.000 claims description 2
- 241000233892 Neocallimastix Species 0.000 claims description 2
- 241000222385 Phanerochaete Species 0.000 claims description 2
- 241000222395 Phlebia Species 0.000 claims description 2
- 241001407717 Saccharomyces norbensis Species 0.000 claims description 2
- 241000228178 Thermoascus Species 0.000 claims description 2
- 241000235013 Yarrowia Species 0.000 claims description 2
- 108010000165 exo-1,3-alpha-glucanase Proteins 0.000 claims description 2
- 241000209094 Oryza Species 0.000 claims 3
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 claims 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 7
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 abstract description 3
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 abstract 1
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 50
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 31
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 18
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 18
- 101150023800 thiA gene Proteins 0.000 description 18
- 101150029215 thiC gene Proteins 0.000 description 18
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 16
- 101150054232 pyrG gene Proteins 0.000 description 15
- 241000351920 Aspergillus nidulans Species 0.000 description 14
- 241000499912 Trichoderma reesei Species 0.000 description 14
- 239000000463 material Substances 0.000 description 12
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 12
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 12
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 11
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 11
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 11
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 11
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 11
- 239000000047 product Substances 0.000 description 11
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 10
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 9
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 9
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 8
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 8
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 8
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 7
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 7
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 7
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 6
- 241000223221 Fusarium oxysporum Species 0.000 description 6
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 6
- 241000235403 Rhizomucor miehei Species 0.000 description 6
- 239000002585 base Substances 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- 230000008859 change Effects 0.000 description 6
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 6
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 6
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 6
- 241000228245 Aspergillus niger Species 0.000 description 5
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 5
- 241001480714 Humicola insolens Species 0.000 description 5
- 108090000637 alpha-Amylases Proteins 0.000 description 5
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 5
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 5
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 5
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 5
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 5
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 5
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 5
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 5
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 5
- YXVCLPJQTZXJLH-UHFFFAOYSA-N thiamine(1+) diphosphate chloride Chemical compound [Cl-].CC1=C(CCOP(O)(=O)OP(O)(O)=O)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N YXVCLPJQTZXJLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 5
- 101000757144 Aspergillus niger Glucoamylase Proteins 0.000 description 4
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000567178 Fusarium venenatum Species 0.000 description 4
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 4
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 4
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 4
- 241000223258 Thermomyces lanuginosus Species 0.000 description 4
- 108700015934 Triose-phosphate isomerases Proteins 0.000 description 4
- 108010048241 acetamidase Proteins 0.000 description 4
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 4
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 4
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 4
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 4
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 4
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 4
- 102100034044 All-trans-retinol dehydrogenase [NAD(+)] ADH1B Human genes 0.000 description 3
- 101710193111 All-trans-retinol dehydrogenase [NAD(+)] ADH4 Proteins 0.000 description 3
- 108010037870 Anthranilate Synthase Proteins 0.000 description 3
- 102000035101 Aspartic proteases Human genes 0.000 description 3
- 108091005502 Aspartic proteases Proteins 0.000 description 3
- 241001513093 Aspergillus awamori Species 0.000 description 3
- 108700020228 Aspergillus oryzae THIA Proteins 0.000 description 3
- 101100473177 Caenorhabditis elegans ribo-1 gene Proteins 0.000 description 3
- 108090000489 Carboxy-Lyases Proteins 0.000 description 3
- 241000221779 Fusarium sambucinum Species 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 3
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 3
- IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N WHWLQLKPGQPMY Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C1=CNC=N1 IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 102000004139 alpha-Amylases Human genes 0.000 description 3
- 229940024171 alpha-amylase Drugs 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 3
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 3
- 102000006602 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 3
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 3
- 235000019626 lipase activity Nutrition 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 3
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 3
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 3
- 102000007698 Alcohol dehydrogenase Human genes 0.000 description 2
- 108010021809 Alcohol dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- 101100163849 Arabidopsis thaliana ARS1 gene Proteins 0.000 description 2
- 102000004452 Arginase Human genes 0.000 description 2
- 108700024123 Arginases Proteins 0.000 description 2
- 241001225321 Aspergillus fumigatus Species 0.000 description 2
- 241001480052 Aspergillus japonicus Species 0.000 description 2
- 101000690713 Aspergillus niger Alpha-glucosidase Proteins 0.000 description 2
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 2
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 2
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 2
- 241000985909 Chrysosporium keratinophilum Species 0.000 description 2
- 241001674001 Chrysosporium tropicum Species 0.000 description 2
- 244000251987 Coprinus macrorhizus Species 0.000 description 2
- 235000001673 Coprinus macrorhizus Nutrition 0.000 description 2
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 2
- 101150015836 ENO1 gene Proteins 0.000 description 2
- 101710121765 Endo-1,4-beta-xylanase Proteins 0.000 description 2
- 102000010911 Enzyme Precursors Human genes 0.000 description 2
- 108010062466 Enzyme Precursors Proteins 0.000 description 2
- 241000567163 Fusarium cerealis Species 0.000 description 2
- 241000223195 Fusarium graminearum Species 0.000 description 2
- 241000146406 Fusarium heterosporum Species 0.000 description 2
- 102000048120 Galactokinases Human genes 0.000 description 2
- 108700023157 Galactokinases Proteins 0.000 description 2
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N L-arginine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- 229930064664 L-arginine Natural products 0.000 description 2
- 235000014852 L-arginine Nutrition 0.000 description 2
- 108090000157 Metallothionein Proteins 0.000 description 2
- 241000223660 Morethia Species 0.000 description 2
- 229910002651 NO3 Inorganic materials 0.000 description 2
- NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N Nitrate Chemical compound [O-][N+]([O-])=O NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000233654 Oomycetes Species 0.000 description 2
- 241000222393 Phanerochaete chrysosporium Species 0.000 description 2
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 2
- 101100097319 Schizosaccharomyces pombe (strain 972 / ATCC 24843) ala1 gene Proteins 0.000 description 2
- 241000187391 Streptomyces hygroscopicus Species 0.000 description 2
- 241001540751 Talaromyces ruber Species 0.000 description 2
- 241001313536 Thermothelomyces thermophila Species 0.000 description 2
- 241001495429 Thielavia terrestris Species 0.000 description 2
- 241000222355 Trametes versicolor Species 0.000 description 2
- 102000005924 Triose-Phosphate Isomerase Human genes 0.000 description 2
- DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N Uridine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 101150078331 ama-1 gene Proteins 0.000 description 2
- 229940091771 aspergillus fumigatus Drugs 0.000 description 2
- 230000037358 bacterial metabolism Effects 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 239000013024 dilution buffer Substances 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 229910001385 heavy metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000008676 import Effects 0.000 description 2
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 2
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 2
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 description 2
- 239000002023 wood Substances 0.000 description 2
- 210000002268 wool Anatomy 0.000 description 2
- DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N (2R)-6-amino-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2R,3S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S,3S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[2-[[2-[[2-[(2-amino-1-hydroxyethylidene)amino]-3-carboxy-1-hydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1,5-dihydroxy-5-iminopentylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]hexanoic acid Chemical compound C[C@@H]([C@@H](C(=N[C@@H](CS)C(=N[C@@H](C)C(=N[C@@H](CO)C(=NCC(=N[C@@H](CCC(=N)O)C(=NC(CS)C(=N[C@H]([C@H](C)O)C(=N[C@H](CS)C(=N[C@H](CO)C(=NCC(=N[C@H](CS)C(=NCC(=N[C@H](CCCCN)C(=O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)N=C([C@H](CS)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](C)N=C(CN=C([C@H](CO)N=C([C@H](CS)N=C(CN=C(C(CS)N=C(C(CC(=O)O)N=C(CN)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N 0.000 description 1
- RJQXEHRFVKJLJO-UHFFFAOYSA-N (4-nitrophenyl) pentanoate Chemical class CCCCC(=O)OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 RJQXEHRFVKJLJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FQVLRGLGWNWPSS-BXBUPLCLSA-N (4r,7s,10s,13s,16r)-16-acetamido-13-(1h-imidazol-5-ylmethyl)-10-methyl-6,9,12,15-tetraoxo-7-propan-2-yl-1,2-dithia-5,8,11,14-tetrazacycloheptadecane-4-carboxamide Chemical compound N1C(=O)[C@@H](NC(C)=O)CSSC[C@@H](C(N)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H]1CC1=CN=CN1 FQVLRGLGWNWPSS-BXBUPLCLSA-N 0.000 description 1
- 101150104118 ANS1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100510736 Actinidia chinensis var. chinensis LDOX gene Proteins 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 241000220433 Albizia Species 0.000 description 1
- 102100034035 Alcohol dehydrogenase 1A Human genes 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 241000892910 Aspergillus foetidus Species 0.000 description 1
- 101900127796 Aspergillus oryzae Glucoamylase Proteins 0.000 description 1
- 101900318521 Aspergillus oryzae Triosephosphate isomerase Proteins 0.000 description 1
- 108700003918 Bacillus Thuringiensis insecticidal crystal Proteins 0.000 description 1
- 241000221198 Basidiomycota Species 0.000 description 1
- 241000222478 Bjerkandera adusta Species 0.000 description 1
- 101100327917 Caenorhabditis elegans chup-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010084185 Cellulases Proteins 0.000 description 1
- 102000005575 Cellulases Human genes 0.000 description 1
- 102100037633 Centrin-3 Human genes 0.000 description 1
- 241001466517 Ceriporiopsis aneirina Species 0.000 description 1
- 241001646018 Ceriporiopsis gilvescens Species 0.000 description 1
- 241001277875 Ceriporiopsis rivulosa Species 0.000 description 1
- 241000524302 Ceriporiopsis subrufa Species 0.000 description 1
- 229920002101 Chitin Polymers 0.000 description 1
- 229920001661 Chitosan Polymers 0.000 description 1
- 208000036086 Chromosome Duplication Diseases 0.000 description 1
- 241001674013 Chrysosporium lucknowense Species 0.000 description 1
- 241001556045 Chrysosporium merdarium Species 0.000 description 1
- 241000080524 Chrysosporium queenslandicum Species 0.000 description 1
- 241000355696 Chrysosporium zonatum Species 0.000 description 1
- 241000233652 Chytridiomycota Species 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 1
- 241001290175 Coriolopsis trogii Species 0.000 description 1
- 241001362614 Crassa Species 0.000 description 1
- 241001559589 Cullen Species 0.000 description 1
- 102000018832 Cytochromes Human genes 0.000 description 1
- 108010052832 Cytochromes Proteins 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 241000145614 Fusarium bactridioides Species 0.000 description 1
- 241000223194 Fusarium culmorum Species 0.000 description 1
- 241001112697 Fusarium reticulatum Species 0.000 description 1
- 241001014439 Fusarium sarcochroum Species 0.000 description 1
- 241000223192 Fusarium sporotrichioides Species 0.000 description 1
- 241001465753 Fusarium torulosum Species 0.000 description 1
- 101150108358 GLAA gene Proteins 0.000 description 1
- 241000146398 Gelatoporia subvermispora Species 0.000 description 1
- 241000726221 Gemma Species 0.000 description 1
- 101100080316 Geobacillus stearothermophilus nprT gene Proteins 0.000 description 1
- 101000892220 Geobacillus thermodenitrificans (strain NG80-2) Long-chain-alcohol dehydrogenase 1 Proteins 0.000 description 1
- 101100295959 Halobacterium salinarum (strain ATCC 700922 / JCM 11081 / NRC-1) arcB gene Proteins 0.000 description 1
- 101000780443 Homo sapiens Alcohol dehydrogenase 1A Proteins 0.000 description 1
- 101000880522 Homo sapiens Centrin-3 Proteins 0.000 description 1
- 101000882901 Homo sapiens Claudin-2 Proteins 0.000 description 1
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 1
- 102000003792 Metallothionein Human genes 0.000 description 1
- 241000221961 Neurospora crassa Species 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 102000007981 Ornithine carbamoyltransferase Human genes 0.000 description 1
- 101710198224 Ornithine carbamoyltransferase, mitochondrial Proteins 0.000 description 1
- 102100037214 Orotidine 5'-phosphate decarboxylase Human genes 0.000 description 1
- 108010055012 Orotidine-5'-phosphate decarboxylase Proteins 0.000 description 1
- 241000222397 Phlebia radiata Species 0.000 description 1
- 244000252132 Pleurotus eryngii Species 0.000 description 1
- 235000001681 Pleurotus eryngii Nutrition 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 102000001253 Protein Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 101900354623 Saccharomyces cerevisiae Galactokinase Proteins 0.000 description 1
- 101900084120 Saccharomyces cerevisiae Triosephosphate isomerase Proteins 0.000 description 1
- 241000235343 Saccharomycetales Species 0.000 description 1
- 101100370749 Streptomyces coelicolor (strain ATCC BAA-471 / A3(2) / M145) trpC1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000004523 Sulfate Adenylyltransferase Human genes 0.000 description 1
- 108010022348 Sulfate adenylyltransferase Proteins 0.000 description 1
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005864 Sulphur Substances 0.000 description 1
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 description 1
- 241000222357 Trametes hirsuta Species 0.000 description 1
- 241000217816 Trametes villosa Species 0.000 description 1
- 241000223260 Trichoderma harzianum Species 0.000 description 1
- 241000378866 Trichoderma koningii Species 0.000 description 1
- 241000223262 Trichoderma longibrachiatum Species 0.000 description 1
- 241000223261 Trichoderma viride Species 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 241000409279 Xerochrysium dermatitidis Species 0.000 description 1
- 241000758405 Zoopagomycotina Species 0.000 description 1
- 101150044535 agaA gene Proteins 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- 238000012870 ammonium sulfate precipitation Methods 0.000 description 1
- 101150009206 aprE gene Proteins 0.000 description 1
- 101150008194 argB gene Proteins 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000009697 arginine Nutrition 0.000 description 1
- 210000001367 artery Anatomy 0.000 description 1
- 210000004507 artificial chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 101150036080 at gene Proteins 0.000 description 1
- 238000005844 autocatalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 101150103518 bar gene Proteins 0.000 description 1
- DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N beta-L-uridine Natural products O[C@H]1[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N 0.000 description 1
- 239000003139 biocide Substances 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 1
- 238000011098 chromatofocusing Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000011978 dissolution method Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 108010091371 endoglucanase 1 Proteins 0.000 description 1
- 108010091384 endoglucanase 2 Proteins 0.000 description 1
- 108010092413 endoglucanase V Proteins 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 108010010662 galactose epimerase Proteins 0.000 description 1
- 239000010437 gem Substances 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 210000004209 hair Anatomy 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 238000009655 industrial fermentation Methods 0.000 description 1
- 229910017053 inorganic salt Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001573 invertase Substances 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 101150039489 lysZ gene Proteins 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N nitrogen group Chemical group [N] QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JTJMJGYZQZDUJJ-UHFFFAOYSA-N phencyclidine Chemical compound C1CCCCN1C1(C=2C=CC=CC=2)CCCCC1 JTJMJGYZQZDUJJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010082527 phosphinothricin N-acetyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 230000001124 posttranscriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 1
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 1
- 108060006633 protein kinase Proteins 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000014493 regulation of gene expression Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 238000012807 shake-flask culturing Methods 0.000 description 1
- 101150091813 shfl gene Proteins 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- AWUCVROLDVIAJX-GSVOUGTGSA-N sn-glycerol 3-phosphate Chemical compound OC[C@@H](O)COP(O)(O)=O AWUCVROLDVIAJX-GSVOUGTGSA-N 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000010563 solid-state fermentation Methods 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000005507 spraying Methods 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 238000005728 strengthening Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 1
- 230000001228 trophic effect Effects 0.000 description 1
- 101150016309 trpC gene Proteins 0.000 description 1
- DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N uracil arabinoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940045145 uridine Drugs 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
- C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/67—General methods for enhancing the expression
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
- C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
- C12N15/815—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts for yeasts other than Saccharomyces
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
- C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
- C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
- C12N9/0044—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on other nitrogen compounds as donors (1.7)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
- C12N9/20—Triglyceride splitting, e.g. by means of lipase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/88—Lyases (4.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y107/00—Oxidoreductases acting on other nitrogenous compounds as donors (1.7)
- C12Y107/01—Oxidoreductases acting on other nitrogenous compounds as donors (1.7) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.7.1)
- C12Y107/01003—Nitrate reductase (NADPH) (1.7.1.3)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y107/00—Oxidoreductases acting on other nitrogenous compounds as donors (1.7)
- C12Y107/01—Oxidoreductases acting on other nitrogenous compounds as donors (1.7) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.7.1)
- C12Y107/01004—Nitrite reductase [NAD(P)H] (1.7.1.4)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y402/00—Carbon-oxygen lyases (4.2)
- C12Y402/01—Hydro-lyases (4.2.1)
- C12Y402/01011—Phosphopyruvate hydratase (4.2.1.11), i.e. enolase
Abstract
本发明涉及构建重组真菌宿主细胞的方法，该重组真菌宿主细胞包括一个或多个拷贝的整合在其基因组中的多核苷酸构建体，所述方法包括：用包括编码选择性标记物的第一多核苷酸和编码目标多肽的第二多核苷酸的整合型多核苷酸构建体对真菌宿主细胞进行转化，其中第一多核苷酸、其5’非翻译区和/或与其可操作地连接的核糖开关包括在其分支位点和其受体位点之间具有5个核苷酸或更少的剪接体内含子；以及适合的多核苷酸构建体，生成的真菌宿主细胞及制造方法。
Description
对序列表的引用
本申请含有计算机可读形式的序列表，在此将其并入作为参考。
发明领域
本发明涉及构建重组真菌宿主细胞的方法，该重组真菌宿主细胞包括一个或多个拷贝的整合在其基因组中的多核苷酸构建体，所述方法包括：用包括编码选择性标记物的第一多核苷酸和编码目标多肽的第二多核苷酸的整合型多核苷酸构建体对真菌宿主细胞进行转化，其中第一多核苷酸、其5’非翻译区和/或与其可操作地连接的核糖开关包括在其分支位点和其受体位点之间具有5个核苷酸或更少的剪接体内含子；以及适合的多核苷酸构建体，生成的真菌宿主细胞及制造方法。
背景技术
为了多肽的高产量工业制造，生物技术工业要求提供无抗生素抗性标记物的微生物菌株，其包括若干染色体整合的目标基因的拷贝。抗生素标记物基因传统上已用作选择携带多个拷贝的标记物基因和伴随的编码工业上关注的多肽的表达盒的菌株的手段。由于在拷贝数和最终的产物产率之间常有直接关联，通过增加微生物制造菌株中的拷贝数对表达盒进行扩增是所需要的。在过去20年，使用抗生素选择标记物的扩增方法已经广泛用于许多宿主菌株，不考虑单个表达盒的表达水平，其已被证明是在相对短期内开发高产率制造菌株的非常有效的方式。
之前已在芽孢杆菌(Bacillus)中显示，从残缺的(crippled)低水平启动子表达的编码半乳糖差向异构酶的基因可以用作串联扩增的产物基因拷贝的位点特异性基因组整合的选择性标记物(WO2001/90393；Novozmes A/S)。但是，对于真菌宿主细胞尚未描述有类似系统。
核糖开关是mRNA分子的一部分，其可以与靶标小分子直接结合而不涉及蛋白质。靶标小分子的结合将会影响mRNA的翻译[Nudler E,Mironov AS(2004)."The riboswitch control of bacterial metabolism"(细菌新陈代谢的核糖开关控制).Trends Biochem Sci 29(1):11–7；Vitreschak AG,Rodionov DA,Mironov AA,Gelfand MS(2004)."Riboswitches:the oldest mechanism for the regulation of geneexpression？"(核糖开关：基因表达调节的最古老机制？).Trends Genet20(1):44–50；Tucker BJ,Breaker RR(2005)."Riboswitches as versatilegene control elements"(作为通用的基因控制元件的核糖开关).CurrOpin Struct Biol 15(3):342–8；Batey RT(2006)."Structures of regulatoryelements in mRNAs".(mRNA中调节元件的结构)Curr Opin Struct Biol16(3):299–306]。
在丝状真菌细胞米曲霉(Aspergillus oryzae)中，thiA和nmtA基因的表达受核糖开关调节，该核糖开关结合硫胺素焦磷酸(TPP)，并控制可变剪接(alternative splicing)，以有条件地产生上游可读框(ORF)，从而影响下游基因的表达。米曲霉thiA核糖开关含有核内的前mRNA内含子——剪接体内含子，其参与促进可变剪接。
在构巢曲霉(Aspergillus nidulans)中已发现有另一种丝状真菌核糖开关，其中agaA基因受mRNA精氨酸结合的调节，从而促进可变剪接[Borsuk,P.等人(2007).”L-Arginine influences the structure andfunction of arginase mRNA in Aspergillus nidulans”.(L-精氨酸影响构巢曲霉中精氨酸酶mRNA的结构和功能)Biol Chem.388:135-144]。
为了满足目前对于无抗生素标记物的重组真菌生产宿主菌的需求，我们找寻了产生多拷贝宿主菌的可能的可选方式。
发明内容
发明人发现，通过改变位于下游基因5’非翻译区的剪接体内含子中分支位点和受体位点之间的核苷酸的数目，可以对剪接效率进行调节，以提供出人意料的大范围的下游基因表达。野生型内含子中核苷酸的数目为6，发明人连续去除每个核苷酸，直至分支位点和受体位点实际上重合一个核苷酸。内含子变体文库提供了惊异的下游基因表达水平范围，从正常表达到极低的表达水平，如下文实施例所述。发明人预计，对于位于基因编码序列内的剪接内含子来说也是该情况。
在要整合到真菌宿主细胞基因组中的多核苷酸构建体中包括选择性标记物这一背景意义下，低表达水平尤其引人关注，因为它们使得对转化的细胞进行选择成为可能，其中多核苷酸构建体已经以多个串联扩增的拷贝整合到基因组中。这一选择成为可能，是因为当在选择性压力下进行培养时，具有许多拷贝的以充分低的水平表达的选择性标记物的那些细胞将会相对于拷贝较少的细胞而言具有生长优势。整合型构建体中的表达盒将与选择性标记物一起扩增，从而确保产物的产率较高。
而且，发明人在此研究的特定剪接体内含子位于所谓的核糖开关——米曲霉的thiA核糖开关中，其中其通常参与该基因的前mRNA的可变剪接，从而取决于是否有细胞需要的足够的硫胺素(更准确地说，硫胺素-焦磷酸，TPP)调节其表达水平。尽管在此产生的内含子变体表现出出人意料地很宽的表达水平范围，发明人发现，向包括本发明内含子变体的宿主细胞中加入TPP经由thiA核糖开关的作用更进一步地抑制了表达水平——在一些情形中低于检出水平。
因此，在第一方面，本发明涉及构建重组真菌宿主细胞的方法，该重组真菌宿主细胞包括一个或多个拷贝的整合在其基因组中的多核苷酸构建体，所述方法包括：
a)提供用整合型多核苷酸构建体转化的真菌宿主细胞，该构建体包括编码选择性标记物的第一多核苷酸和编码目标多肽的第二多核苷酸，其中该第一多核苷酸、其5’非翻译区和/或与其可操作地连接的核糖开关包括在其分支位点和其受体位点之间的具有5个核苷酸或更少的剪接体内含子；
b)在有益于表达该选择性标记物的条件下培养转化的真菌宿主细胞；以及
c)分离包括一个或多个拷贝的整合在其基因组中的多核苷酸构建体的重组真菌宿主细胞。
在第二方面，本发明涉及适合于转化到真菌宿主细胞中并整合到所述细胞的基因组中的多核苷酸构建体，所述构建体包括：
a)编码选择性标记物的第一多核苷酸，其中该第一多核苷酸、其5’非翻译区和/或与其可操作地连接的核糖开关包括在其分支位点和其受体位点之间的具有5个核苷酸或更少的剪接体内含子；和
b)编码目标多肽的第二多核苷酸。
在第三方面，本发明涉及包括一个或多个拷贝的整合在其基因组中的多核苷酸构建体的重组真菌宿主细胞，所述构建体包括：
a)编码选择性标记物的第一多核苷酸，其中该第一多核苷酸、其5’非翻译区和/或与其可操作地连接的核糖开关包括在其分支位点和其受体位点之间的具有5个核苷酸或更少的剪接体内含子；和
b)编码目标多肽的第二多核苷酸。
在最后方面，本发明涉及生产目标多肽的方法，包括：
a)培养根据第三方面所述的重组真菌宿主细胞；和任选地
b)回收多肽。
附图说明
图1显示了下文实施例的质粒pCOls1086的概观示意图。
图2显示了下文实施例的质粒pCOls1124的概观示意图。
图3显示了下文实施例的质粒pCOls1118的概观示意图。
图4显示了下文实施例的质粒pCOls1126的概观示意图。
图5显示了剪接体内含子RNA加工的一般图示，以及制造为在thiA核糖开关内含子中在内含子分支位点“ctaac”(阴影部分)和内含子受体位点“tag”(阴影部分)之间具有不同距离的8种不同的构建体。两个位点之间的碱基数目在2-6bp之间变化，一构建体的受体位点与分支位点重合并形成其一部分，产生序列“ctaacag”，其中分支位点是“ctaac”，受体位点是“cag”。后一变体命名为“内含子(-1)”。其他命名为“内含子(0)”、“内含子(1)”、“内含子(2)”、“内含子(3)”、“内含子(4)”、“内含子(5)”，最后是“内含子(6)”，其为野生型序列(图5)，如下表所示：
| ctaacagaTGATAGTCATTG | 内含子(6) | SEQ ID NO:33 |
| ctaactgagatagTTGATTG | 内含子(5) | SEQ ID NO:34 |
| ctaactgaatagTCTGATTG | 内含子(4) | SEQ ID NO:35 |
| ctaactgatagTGATGATTG | 内含子(3) | SEQ ID NO:36 |
| ctaacgatagTTGATGATTG | 内含子(2) | SEQ ID NO:37 |
| ctaacatagTCTGATGATTG | 内含子(1) | SEQ ID NO:38 |
| ctaactagTCATGATGATTG | 内含子(0) | SEQ ID NO:39 |
| ctaacagatgatccTCATTG | 内含子(-1) | SEQ ID NO:40 |
图6显示了下文实施例4中Southern印迹的照片；条带1是用BstEII消化的Lambda标记物DNA；条带2是用pCOls1175转化的菌株，条带3是背景菌株。
具体实施方式
定义
cDNA：术语“cDNA”是指可以通过逆转录由从真核或原核细胞得到的成熟的、已剪接的mRNA分子制备而来的DNA分子。cDNA缺少可存在于对应基因组DNA中的内含子序列。最初的初级RNA转录物是mRNA的前体，其在呈现为成熟的、已剪接的mRNA之前，通过一系列包括剪接在内的步骤进行加工。
编码序列：术语“编码序列”是指直接指定多肽的氨基酸序列的多核苷酸。编码序列的边界通常由开放阅读框决定，开放阅读框以起始密码子如ATG、GTG或TTG开始并以终止密码子如TAA、TAG或TGA结束。编码序列可以是基因组DNA、cDNA、合成的DNA或其组合。
控制序列：术语“控制序列”是指对于编码本发明成熟多肽的多核苷酸的表达为必需的核酸序列。各个控制序列对于编码多肽的多核苷酸可以是内生的(native)(即，来自相同基因)或外来的(foreign)(即，来自不同基因)，或者对于彼此是内生或外来的。这些控制序列包括但不限于，前导序列、多腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列和转录终止子。最小程度地，控制序列包括启动子以及转录和翻译终止信号。出于引入特定的限制性酶切位点以促进控制序列与编码多肽的多核苷酸的编码区连接的目的，控制序列可设有接头(linker)。
表达：术语“表达”包括多肽生产中所涉及的任何步骤，包括但不限于：转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰以及分泌。
表达载体：术语“表达载体”是指包括编码多肽的多核苷酸、并与用于其表达的控制序列可操作地连接的线性或环状DNA分子。
宿主细胞：术语“宿主细胞”是指对于用包含本发明多核苷酸的核酸构建体或表达载体进行的转化、转染、转导等是易感的(susceptible)任何细胞类型。术语“宿主细胞”包括由于在复制过程中发生突变而与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。
分离的：术语“分离的”是指处于非天然出现的形式或环境中的物质。分离的物质的非限制性实例包括：(1)任何非天然出现的物质；(2)包括但不限于任何酶、变体、核酸、蛋白、肽或辅助因子的任何物质，其至少部分地从与其天然相关的一种或多种或所有天然出现的成分中移出；(3)相对于天然出现的物质有人工修饰的任何物质；或者(4)通过增加物质相对于与其天然相关的其他组分的含量(例如，多个拷贝的物质编码基因；使用比与编码物质的基因天然相关的启动子更强的启动子)而修饰的任意物质。分离的物质可以存在于发酵液样本中。
核酸构建体：术语“核酸构建体”是指从天然存在的基因中分离的、或以自然中不会另外出现的方式被修饰成包含核酸片段的、或合成的单链或双链的核酸分子，其包含一个或多个控制序列。
可操作地连接：术语“可操作地连接”是指如下的构造，其中控制序列相对于多核苷酸的编码序列安置在合适位置处，从而控制序列引导编码序列的表达。
序列同一性：两个氨基酸序列之间或者两个核苷酸序列之间的相关性通过参数“序列同一性”来描述。
出于本发明的目的，使用在EMBOSS软件包(EMBOSS:TheEuropean Molecular Biology Open Software Suite(欧洲分子生物学开放软件包),Rice等人,2000,Trends Genet.16:276-277)(优选5.0.0版本或更新)的Needle程序中执行的Needleman-Wunsch算法(Needlemanand Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443-453)来确定两个氨基酸序列之间的序列同一性。使用的可选参数：空位开放罚分为10，空位扩展罚分为0.5，以及EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)替代矩阵。标记为“最长同一性”(使用-nobrief选项获得)的Needle输出用作百分比同一性，计算如下：
(相同残基×100)/(比对长度-比对中的空位总数)
出于本发明的目的，使用在EMBOSS软件包(EMBOSS:TheEuropean Molecular Biology Open Software Suite(欧洲分子生物学开放软件包),Rice等人,2000，同上)(优选5.0.0版本或更新)的Needle程序中执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman and Wunsch,1970，同上)来确定两个脱氧核糖核苷酸序列之间的序列同一性。使用的可选参数：空位开放罚分为10，空位扩展罚分为0.5，以及EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版本)替代矩阵。标记为“最长同一性”(使用-nobrief选项获得)的Needle输出用作百分比同一性，计算如下：
(相同脱氧核苷酸×100)/(比对长度-比对中的空位总数)
子序列：术语“子序列”是指从成熟多肽编码序列的5’和/或3’端缺失一个或多个(例如，若干个)核苷酸的多核苷酸；其中子序列编码具有酶活性的片段。
剪接体内含子：术语“剪接体内含子”是另一用于核内前mRNA内含子的术语，其特征是位于内含子和外显子之间的边界处的特定内含子序列。当剪接反应启动时，这些序列由剪接体RNA分子识别。此外，它们含有分支位点——靠近内含子3’端的特定核苷酸序列，其在剪接过程中变得与内含子的5’端受体位点共价连接，产生分支的内含子。除这三种短的保守元件以外，核内前mRNA内含子序列是高度可变的。
内含子分支位点：在本发明上下文中，内含子分支位点由核苷酸序列“CTRAY”界定，其中R＝A或G，Y＝C或T，特别是“CTAAC”。
内含子受体位点：内含子受体位点常常特征在于两个核苷酸AG，但是直接上游的核苷酸可以很好地影响剪接效率，因此在本发明上下文中，内含子受体位点定义为：XAG，其中X＝G或A或T或C。
发明详述
一种构建重组真菌宿主细胞的方法，所述重组真菌宿主细胞包括一个或多个拷贝的整合在其基因组中的多核苷酸构建体，所述方法包括：
a)提供用整合型多核苷酸构建体转化的真菌宿主细胞，该构建体包括编码选择性标记物的第一多核苷酸和编码目标多肽的第二多核苷酸，其中该第一多核苷酸、其5’非翻译区和/或与其可操作地连接的核糖开关包括在其分支位点和其受体位点之间的具有5个核苷酸或更少的剪接体内含子；
b)在有益于表达该选择性标记物的条件下培养转化的真菌宿主细胞；以及
c)分离包括一个或多个拷贝的整合在其基因组中的多核苷酸构建体的重组真菌宿主细胞；优选两个或更多个拷贝；甚至更优选三个或更多个拷贝，最优选四个或更多个拷贝。
在第一方面的优选实施方式中，步骤(a)中的真菌宿主细胞具有生长缺陷，并且整合型多核苷酸构建体在整合到所述宿主细胞的基因组中时弥补该生长缺陷。这使得在步骤(a)和(b)之间可以有任选的容易的选择真菌细胞的第二步骤，其中多核苷酸构建体的基因组整合已经以至少一个拷贝成功。
关于适当的生长缺陷，优选地，步骤(a)中的真菌宿主细胞缺乏功能性的硝酸还原酶或亚硝酸还原酶，并且所述整合型多核苷酸构建体分别包括编码功能性硝酸还原酶的补偿基因，例如niaD，或编码功能性亚硝酸还原酶的基因，例如niiA；或者步骤(a)中的真菌宿主细胞缺乏功能性的烯醇化酶，并且所述整合型多核苷酸构建体包括编码功能性烯醇化酶的补偿基因，例如acuN。
其他适合的缺陷涉及在葡糖异生碳源上生长的真菌细胞所需的功能。例如，优选地，步骤(a)的真菌宿主具有无活性的acuK或acuM基因，并且整合型多核苷酸构建体分别包括补偿的功能性acuK或acuM基因[Hynes M.等人.Transcriptional Control of Gluconeogenesis inAspergillus nidulans(构巢曲霉中葡糖异生的转录控制),Genetics 176:139–150(May 2007)]。
优选地，在转化之后整合型多核苷酸构建体通过非同源重组而随机整合在基因组中。
但是，常常优选程度更高的控制，其中步骤(a)中的整合型多核苷酸构建体在一侧或两侧是大小和与真菌宿主细胞基因组中的特异性基因座的序列同源性充足的同源框，从而使得在转化之后该整合型多核苷酸构建体能够通过同源重组而位点特异性地整合到基因组中。方便地，真菌宿主中的特异性基因座是已通过例如部分缺失而失活的相同基因，以产生生长缺陷。多核苷酸构建体的同源框则可以是同一基因的完整拷贝或其部分，使得通过同源框与基因组无活性基因之间的同源重组进行的成功的至少一拷贝多核苷酸构建体的位点特异性整合导致基因组中功能性基因的恢复，或者被相同基因的功能性形式(version)代替。
优选地，剪接体内含子在其分支位点和其受体位点之间具有4个核苷酸或更少；优选3个核苷酸或更少；更优选2个核苷酸或更少；甚至更优选1个核苷酸；再更优选剪接体内含子在其分支位点和其受体位点之间具有0个核苷酸，最优选剪接体内含子的分支位点和受体位点重合至少一个核苷酸。另外可选地，优选地，剪接体内含子包括选自以下内含子核苷酸序列的核苷酸序列：SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ IDNO:38、SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:40。
我们已经提到，发明人使用来自米曲霉thiA核糖开关的剪接体内含子实施了第一方面的方法，并显示这使得能够对下游基因的表达水平进行程度更大的控制。因此，在第一方面的方法的优选实施方式中，整合型多核苷酸构建体的第一多核苷酸具有与其可操作地连接的核糖开关；优选地核糖开关来自米曲霉中的thiA或nmtA基因。
优选地，整合型多核苷酸构建体的第一多核苷酸编码选择性标记物乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶或PyrG。
在本发明的优选实施方式中，整合型多核苷酸构建体的第二多核苷酸编码的目标多肽包括酶；优选为水解酶、异构酶、连接酶、裂解酶、氧化还原酶或转移酶，例如氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、几丁质酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、内切葡聚糖酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、变聚糖酶(mutanase)、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、木聚糖酶或β-木糖苷酶。
核酸构建体
本发明的第二方面涉及适合于转化到真菌宿主细胞中并整合到所述细胞的基因组中的多核苷酸构建体，所述构建体包括：编码选择性标记物的第一多核苷酸和编码目标多肽的第二多核苷酸，其中该第一多核苷酸、其5’非翻译区和/或与其可操作地连接的核糖开关包括在其分支位点和其受体位点之间的具有5个核苷酸或更少的剪接体内含子。
在第二方面的优选实施方式中，多核苷酸构建体包括编码功能性硝酸还原酶的基因，例如niaD，编码功能性亚硝酸还原酶的基因，例如niiA，或编码功能性烯醇化酶的基因，例如acuN。
在第二方面的优选实施方式中，多核苷酸构建体在一侧或两侧是大小和与真菌宿主细胞基因组中的特异性基因座的序列同源性充足的同源框，从而使得在转化之后该整合型多核苷酸构建体能够通过同源重组而位点特异性地整合到基因组中。
优选地，剪接体内含子在其分支位点和其受体位点之间具有4个核苷酸或更少；优选3个核苷酸或更少；更优选2个核苷酸或更少；甚至更优选1个核苷酸；再更优选剪接体内含子在其分支位点和其受体位点之间具有0个核苷酸，最优选剪接体内含子的分支位点和受体位点重合至少一个核苷酸。或者另外可选地，剪接体内含子包括选自以下内含子核苷酸序列的核苷酸序列：SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ IDNO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:40。
在优选的实施方式中，位于本发明的整合型多核苷酸构建体中的第一多核苷酸具有与其可操作地连接的核糖开关；优选地核糖开关来自米曲霉中的thiA或nmtA基因。
优选地，整合型多核苷酸构建体的第一多核苷酸编码选择性标记物乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶或PyrG。
优选地，整合型多核苷酸构建体的第二多核苷酸编码的目标多肽包括酶；优选为水解酶、异构酶、连接酶、裂解酶、氧化还原酶或转移酶，例如氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、几丁质酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、内切葡聚糖酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、变聚糖酶、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、木聚糖酶或β-木糖苷酶。
本发明还涉及包括与一个或多个控制序列可操作地连接的本发明的第一和/或第二多核苷酸的核酸构建体，上述控制序列在与该控制序列相容的条件下引导编码序列在合适的宿主细胞中的表达。
可以通过多种方式操纵多核苷酸，以提供多肽的表达。依赖于表达载体，在将多核苷酸插入到载体之前对其进行操纵可以是合意的或必需的。使用重组DNA方法修饰多核苷酸的技术是本领域公知的。
控制序列可以是启动子，其是由宿主细胞识别用于编码本发明多肽的多核苷酸的表达的多核苷酸。启动子含有介导多肽表达的转录控制序列。启动子可以是任何在宿主细胞中表现出转录活性的多核苷酸，包括突变的、截短的和杂合的启动子，并且可以从与宿主细胞同源或异源的编码细胞外或细胞内多肽的基因获得。
用于引导本发明的核酸构建体在丝状真菌宿主细胞中转录的合适启动子的实例是从以下物质的基因获得的启动子：从构巢曲霉(Aspergillus nidulans)乙酰胺酶、黑曲霉(Aspergillus niger)中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉(Aspergillusawamori)葡糖淀粉酶(glaA)、米曲霉(Aspergillus oryzae)TAKA淀粉酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉磷酸丙糖异构酶、尖孢镰孢(Fusariumoxysporum)胰酶样蛋白酶(WO 96/00787)、Fusarium venenatum淀粉葡糖苷酶(WO 00/56900)、Fusarium venenatum Daria(WO 00/56900)、Fusarium venenatum Quinn(WO 00/56900)、米黑根毛霉(Rhizomucormiehei)脂肪酶、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、里氏木霉(Trichodermareesei)β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶IV、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉β-木糖苷酶，以及NA2-tpi启动子(曲霉中性α-淀粉酶基因的修饰启动子，其中非翻译前导被曲霉磷酸丙糖异构酶基因的非翻译前导替代；非限制性实例包括来自黑曲霉中性α-淀粉酶基因的修饰启动子，其中非翻译前导被构巢曲霉或米曲霉的磷酸丙糖异构酶基因的非翻译前导替代)；及其突变的、截短的和杂合的启动子。
在酵母宿主中，可用的启动子获自酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)烯醇化酶(ENO-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH1，ADH2/GAP)、酿酒酵母磷酸丙糖异构酶(TPI)、酿酒酵母金属硫蛋白(CUP1)和酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶的基因。其它可用于酵母宿主细胞的启动子由Romanos等人,1992,Yeast 8:423-488描述。
控制序列也可以是转录终止子，其被宿主细胞识别以终止转录。终止子与编码多肽的多核苷酸的3’端可操作地连接。在宿主细胞中起作用的任何终止子均可用于本发明。
用于丝状真菌宿主细胞的优选终止子获自构巢曲霉邻氨基苯甲酸合成酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶和尖孢镰孢胰酶样蛋白酶的基因。
用于酵母宿主细胞的优选终止子获自酿酒酵母烯醇化酶、酿酒酵母细胞色素C(CYC1)和酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶的基因。其他可用于酵母宿主细胞的终止子在Romanos等,1992(同上)中有过描述。
控制序列也可以是在启动子下游和基因的编码序列上游的增加基因表达的mRNA稳定序列(mRNA stabilizer)区域。
合适的mRNA稳定序列区域的实例获自苏云金芽孢杆菌cryIIIA基因(WO 94/25612)和枯草芽孢杆菌SP82基因(Hue等人,1995,Journalof Bacteriology 177:3465-3471)。
控制序列也可以是前导序列，即对由宿主细胞翻译较为重要的mRNA非翻译区。前导序列可操作地连接到编码多肽的多核苷酸的5’端。任何在宿主细胞中起作用的前导序列均可以使用。
用于丝状真菌宿主细胞的优选前导序列得自米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉磷酸丙糖异构酶的基因。
用于酵母宿主细胞的合适前导序列得自酿酒酵母烯醇化酶(ENO-1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α因子和酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)的基因。
控制序列也可以是多腺苷酸化序列，即可操作地连接至多核苷酸的3’端的序列，在转录时其被宿主细胞识别为向转录mRNA添加多腺苷酸残基的信号。在宿主细胞中起作用的任何多腺苷酸化序列均可以使用。
用于丝状真菌宿主细胞的优选多腺苷酸化序列得自构巢曲霉邻氨基苯甲酸合成酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶和尖孢镰孢胰酶样蛋白酶的基因。
用于酵母宿主细胞的有用多腺苷酸化序列记载于Guo and Sherman,1995,Mol.Cellular Biol.15:5983-5990。
控制序列也可以是编码与多肽N端连接的信号肽并引导多肽进入细胞分泌通路的信号肽编码区。多核苷酸的编码序列的5’端可以固有地包含在翻译阅读框中与编码多肽的编码序列片段自然连接的信号肽编码序列。或者，编码序列的5’端可以包含对于编码序列为外来的信号肽编码序列。在编码序列不天然包含信号肽编码序列时，外来信号肽编码序列可能是需要的。或者，为增强多肽的分泌，外来信号肽编码序列可以简单地取代天然信号肽编码序列。然而，任何引导所表达的多肽进入宿主细胞的分泌通路的信号肽编码序列均可以使用。
用于丝状真菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是得自黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉TAKA淀粉酶、特异腐质霉(Humicola insolens)纤维素酶、特异腐质霉内切葡聚糖酶V、柔毛腐质霉(Humicola lanuginosa)脂肪酶和米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶的基因的信号肽编码序列。
用于酵母宿主细胞的可用信号肽得自酿酒酵母α因子和酿酒酵母转化酶的基因。其他可用的信号肽编码序列记载于Romanos等人,1992,同上。
控制序列也可以是编码位于多肽N端的前肽的前肽编码序列。得到的多肽称为酶原或多肽原(或在一些情况下为酵素原)。多肽原一般是失活的且可以通过从多肽原到前肽的催化或自催化切割而转化为活性多肽。前肽编码序列可以得自枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、嗜热毁丝菌(Myceliophthorathermophila)漆酶(WO 95/33836)、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶和酿酒酵母α因子的基因。
在信号肽序列和前肽序列均存在时，前肽序列紧邻多肽的N端且信号肽序列紧邻前肽序列的N端。
也可能需要添加调控多肽相对于宿主细胞生长的表达的调控序列。调控系统的实例是响应于化学或物理刺激引起基因表达的开启和关闭的那些，包括调控化合物的存在。原核系统中的调控系统包含lac、tac、和trp操纵子系统。在酵母中，可以使用ADH2系统或GAL1系统。在丝状真菌中，可以使用黑曲霉葡糖淀粉酶启动子、米曲霉TAKAα-淀粉酶启动子和米曲霉葡糖淀粉酶启动子。调控序列的其他实例是使得基因扩增的那些。在真核系统中，调控序列包括在甲氨蝶呤的存在下扩增的二氢叶酸还原酶基因、以及在重金属的存在下扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况下，编码多肽的多核苷酸将可操作地与调控序列连接。
表达载体
本发明还涉及包含本发明多核苷酸、启动子以及转录和翻译终止信号的重组表达载体。各种核苷酸和控制序列可以连接在一起，以产生可以包含一个或多个便利限制性位点的重组表达载体，该限制性位点使得可以在位点插入或替换编码多肽的多核苷酸。或者，可以通过插入多核苷酸或包含多核苷酸的核酸构建体到合适的表达载体中来表达多核苷酸。在构建表达载体的过程中，编码序列位于载体中，从而编码序列与合适的表达用控制序列可操作地连接。
重组表达载体可以是任何可以方便地进行重组DNA程序并可引起多核苷酸表达的载体(例如，质粒或病毒)。载体的选择通常取决于载体与载体将要导入的宿主细胞的相容性。载体可以是线性或闭合的环状质粒。
载体可以是自主复制型载体，即作为染色体外实体而存在且其复制独立于染色体复制的载体，例如，质粒、染色体外元件、微型染色体或人工染色体。载体可以包含确保自我复制的任何元件(means)。或者，载体可以是，在导入宿主细胞时整合到基因组中并与其整合的染色体一起复制的载体。此外，可以使用单个载体或质粒，或使用共同包含将要导入宿主细胞基因组中的总DNA的两个或更多个载体或质粒，或使用转座子。
载体优选包含一个或多个允许方便地选择转化细胞、转染细胞、转导细胞等细胞的选择性标记物。选择性标记物是如下的基因，其产物提供对生物灭杀剂的抗性或病毒抗性、重金属抗性、相对于营养缺陷型的原养型等。
用于丝状真菌宿主细胞的选择性标记物包括但不限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(膦丝菌素乙酰转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)、pyrG(乳清酸核苷-5'-磷酸脱羧酶)、sC(硫酸腺苷酰转移酶)和trpC(邻氨基苯甲酸合成酶)以及其等同物。优选用在曲霉属细胞中的是构巢曲霉或米曲霉amdS和pyrG基因和吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)bar基因。
优选载体包含有使得载体整合到宿主细胞的基因组中或使载体在细胞中独立于基因组而自主复制的元件。
对于整合入宿主细胞基因组，载体可以依赖于编码多肽的多核苷酸序列或经同源重组或非同源重组整合入基因组的载体的任何其他元件。或者，载体可以含有用于引导经由同源重组在染色体的精确位置整合入宿主细胞基因组的其他多核苷酸。为增加在精确位置整合的可能性，整合元件应当包含足量的核酸，例如100～10,000个碱基对、400～10,000个碱基对、以及800～10,000个碱基对，其与相应的靶序列具有高度的序列同一性，以增强同源重组的可能性。整合元件可以是与宿主细胞基因组中的靶序列同源的任何序列。此外，整合元件可以是非编码的多核苷酸或编码的多核苷酸。另一方面，载体可以通过非同源重组而整合到宿主细胞的基因组中。
对于自主复制，载体还可以包含使载体能在被考虑的宿主细胞中自主复制的复制起点。复制起点可以是在细胞中起作用的介导自主复制的任何质粒复制子。术语“复制起点”或“质粒复制子”是指使质粒或载体能在体内复制的多核苷酸。
用在酵母宿主细胞中的复制起点的实例是2微米复制起点ARS1，ARS4，ARS1与CEN3的组合，以及ARS4与CEN6的组合。
可用于丝状真菌细胞的复制起点的实例是AMA1和ANS1(Gems等人，1991,Gene 98:61-67；Cullen等人，1987,Nucleic Acids Res.15:9163-9175；WO 00/24883)。AMA1基因的分离以及包含该基因的质粒或载体的构建可以根据WO 00/24883中公开的方法实现。
多于一个拷贝的本发明多核苷酸可以插入到宿主细胞中，以增加多肽产生。多核苷酸拷贝数的增加可以通过将至少一个额外拷贝的序列整合入宿主细胞基因组中而得到；或者通过包含可扩增选择标记物基因与多核苷酸而获得，这样，可以通过在合适选择剂的存在下培养细胞来选择含有扩增拷贝的选择标记物基因的细胞，由此选择含有额外拷贝的多核苷酸的细胞。
用来连接上述元件以构建本发明的重组表达载体的步骤为本领域技术人员所熟知(参见，例如，Sambrook等人,1989，同上)。
宿主细胞
本发明的第三方面涉及一种重组真菌宿主细胞，其包括一个或多个拷贝的整合在其基因组中的多核苷酸构建体，所述构建体包括：编码选择性标记物的第一多核苷酸和编码目标多肽的第二多核苷酸，其中该第一多核苷酸、其5’非翻译区和/或与其可操作地连接的核糖开关包括在其分支位点和其受体位点之间的具有5个核苷酸或更少的剪接体内含子。
在第三方面的优选实施方式中，真菌宿主细胞包括两个或更多个拷贝的整合在其基因组中的多核苷酸构建体；甚至更优选三个或更多个拷贝、最优选四个或更多个拷贝的整合在其基因组中的多核苷酸构建体。
优选地，整合型多核苷酸构建体已通过非同源重组而随机整合到基因组中，或者其已通过同源重组而位点特异性地整合到基因组中；优选整合到编码硝酸还原酶或亚硝酸还原酶的基因中；更优选整合到葡糖异生需要的基因中；最优选整合到niaD、niiA、acuN、acuK或acuM基因座中。
在优选的实施方式中，剪接体内含子在其分支位点和其受体位点之间具有4个核苷酸或更少；优选3个核苷酸或更少；更优选2个核苷酸或更少；甚至更优选1个核苷酸；再更优选剪接体内含子在其分支位点和其受体位点之间具有0个核苷酸，最优选剪接体内含子的分支位点和受体位点重合至少一个核苷酸。
在第三方面的另一优选实施方式中，剪接体内含子包括选自以下内含子核苷酸序列的核苷酸序列：SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ IDNO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:40。
优选地，整合型多核苷酸构建体的第一多核苷酸具有与其可操作地连接的核糖开关；优选核糖开关源自米曲霉中的thiA或nmtA基因；甚至更优选核糖开关包括米曲霉中的thiA或nmtA基因的核糖开关；最优选核糖开关由米曲霉中的thiA或nmtA基因的核糖开关组成。
另外优选地，整合型多核苷酸构建体的第一多核苷酸编码选择性标记物乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶或PyrG。
第三方面的另一优选实施方式在于，整合型多核苷酸构建体的第二多核苷酸编码的目标多肽包括酶；优选为水解酶、异构酶、连接酶、裂解酶、氧化还原酶或转移酶，例如氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、几丁质酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、内切葡聚糖酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、变聚糖酶、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、木聚糖酶或β-木糖苷酶。
优选地，本发明的多核苷酸构建体的第二多核苷酸与一个或多个引导本发明多肽生产的控制序列可操作地连接。将包含多核苷酸的构建体或载体导入到宿主细胞中，从而使构建体或载体保持为染色体整合子或作为前述的自我复制染色体外载体。术语“宿主细胞”包括因复制过程中发生的突变而与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。对于宿主细胞的选择将在很大程度上取决于编码多肽的基因及其来源。
宿主细胞可以是任何可用于本发明多肽的重组生产中的细胞，例如，真菌细胞。
本文所用的“真菌”包括子囊菌门、担子菌门、壶菌门和接合菌门以及卵菌门和所有有丝分裂真菌(如Hawksworth等人,In,Ainsworthand Bisby’s Dictionary of The Fungi,8th edition,1995,CAB International,University Press,Cambridge,UK所定义)。
真菌宿主细胞可以是酵母细胞。本文所用的“酵母”包括产子囊酵母(内孢霉目)、产担子酵母和属于半知菌的酵母(芽孢纲)。由于酵母的分类在未来可能会变化，出于本发明的目的，酵母应当如Biologyand Activities of Yeast(Skinner,Passmore,and Davenport,editors,Soc.App.Bacteriol.Symposium Series No.9,1980)中记载般进行定义。
酵母宿主细胞可以是念珠菌属(Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)、克鲁维酵母菌属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)或耶氏酵母属(Yarrowia)细胞，例如，乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、卡氏酵母(Saccharomyces carlsbergensis)、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)、Saccharomycesdouglasii、克鲁弗酵母(Saccharomyces kluyveri)、诺地酵母(Saccharomyces norbensis)、卵形酵母(Saccharomyces oviformis)或解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)细胞。
真菌宿主细胞可以是丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括真菌门和卵菌门亚门的所有丝状形式(如Hawksworth等人,1995，同上所定义)。丝状真菌通常的特征在于，由几丁质、纤维素、葡聚糖、壳聚糖、甘露聚糖和其他复合多糖组成的菌丝体壁。营养生长是通过菌丝伸长，碳分解代谢是专性需氧的。相反，酵母例如酿酒酵母的营养生长是通过单细胞菌体的出芽，碳分解可以是发酵性的。
丝状真菌宿主细胞可以是枝顶孢属(Acremonium)、曲霉属(Aspergillus)、短梗霉属(Aureobasidium)、烟管菌属(Bjerkandera)、拟蜡菌属(Ceriporiopsis)、金孢子菌属(Chrysosporium)、鬼伞属(Coprinus)、革盖菌属(Coriolus)、隐球菌属(Cryptococcus)、Filibasidium、镰孢霉属(Fusarium)、腐质霉属(Humicola)、稻瘟菌属(Magnaporthe)、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、新美鞭菌属(Neocallimastix)、脉孢菌属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属(Penicillium)、平革菌属(Phanerochaete)、白腐菌属(Phlebia)、Piromyces、侧耳属(Pleurotus)、裂褶菌属(Schizophyllum)、踝节菌属(Talaromyces)、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)、栓菌属(Trametes)或木霉属(Trichoderma)细胞。
例如，丝状真菌宿主细胞可以是泡盛曲霉、臭曲霉(Aspergillusfoetidus)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、日本曲霉(Aspergillusjaponicus)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉、米曲霉、烟管菌(Bjerkandera adusta)、干拟蜡菌(Ceriporiopsis aneirina)、Ceriporiopsis caregiea、浅黄拟蜡孔菌(Ceriporiopsis gilvescens)、Ceriporiopsis pannocinta、Ceriporiopsis rivulosa、Ceriporiopsis subrufa、虫拟蜡菌(Ceriporiopsis subvermispora)、Chrysosporium inops、嗜角质金孢子菌(Chrysosporium keratinophilum)、Chrysosporium lucknowense、Chrysosporium merdarium、Chrysosporium pannicola、Chrysosporiumqueenslandicum、热带金孢子菌(Chrysosporium tropicum)、Chrysosporium zonatum、灰盖鬼伞(Coprinus cinereus)、毛云芝菌(Coriolus hirsutus)、Fusarium bactridioides、Fusarium cerealis、Fusarium crookwellense、黄色镰孢菌(Fusarium culmorum)、禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)、禾赤镰孢(Fusarium graminum)、异孢镰孢(Fusarium heterosporum)、合欢木镰孢(Fusarium negundi)、尖孢镰孢菌(Fusarium oxysporum)、多枝镰孢(Fusarium reticulatum)、粉红镰孢(Fusarium roseum)、接骨木镰孢(Fusarium sambucinum)、肤色镰孢(Fusarium sarcochroum)、拟枝孢镰孢菌(Fusariumsporotrichioides)、硫色镰孢(Fusarium sulphureum)、Fusariumtorulosum、拟丝孢镰孢(Fusarium trichothecioides)、Fusariumvenenatum、特异腐质霉(Humicola insolens)、柔毛腐质霉(Humicolalanuginosa)、米黑毛霉(Mucor miehei)、嗜热毁丝霉(Myceliophthorathermophila)、粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)、产紫青霉(Penicilliumpurpurogenum)、黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、脉射侧菌(Phlebia radiata)、白腐菌(Pleurotus eryngii)、太瑞斯梭孢壳霉(Thielavia terrestris)、长绒毛栓菌(Trametes villosa)、变色栓菌(Trametes versicolor)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、康宁木霉(Trichoderma koningii)、长梗木霉(Trichoderma longibrachiatum)、里氏木霉(Trichoderma reesei)或绿色木霉(Trichoderma viride)细胞。
真菌细胞可以通过涉及原生质体形成、原生质体转化和细胞壁再生的方法以本质上已知的方式进行转化。合适的用于曲霉属和木霉属宿主细胞的转化的方法记载在EP 238023、Yelton等人,1984,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:1470-1474以及Christensen等人,1988,Bio/Technology 6:1419-1422中。用于转化镰孢菌属物种的适当方法记载于Malardier等人,1989,Gene 78:147-156和WO 96/00787。酵母可以使用由Becker and Guarente,In Abelson,J.N.and Simon,M.I.,editors,Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology,Methods in Enzymology,Volume 194,pp 182-187,Academic Press,Inc.,New York；Ito等人,1983,J.Bacteriol.153:163；以及Hinnen等人,1978,Proc.Natl.Acad.Sci.USA75:1920记载的方法来转化。
制造方法
本发明还涉及生产目标多肽的方法，其包括：培养根据第三方面所述的重组真菌宿主细胞；和任选地回收多肽。
使用本领域已知的方法在适合于生产多肽的营养介质中培养宿主细胞。例如，可通过在合适的介质中并在允许多肽表达和/或分离的条件下进行摇瓶培养、或在实验室或工业发酵罐中进行小规模或大规模发酵(包括连续发酵、分批发酵、分批补料发酵或固态发酵)来培养细胞。使用本领域已知的步骤在包含碳源和氮源以及无机盐的合适营养介质中进行培养。合适的介质可从商业供应商获得或可以根据公开的组成来制备(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)。如果多肽被分泌到营养介质中，则可以直接从介质回收多肽。如果多肽未被分泌出去，则可以从细胞裂解物中进行回收。
可以使用领域内已知的特定用于多肽的方法来检测多肽。这些检测方法包括但不局限于特异性抗体的使用、酶产物的形成、或酶底物的消失。例如，酶的测定可用来判定多肽的活性。
可使用本领域已知的方法来回收多肽。例如，可通过常规的步骤从营养介质回收多肽，该步骤包括但不局限于收集、离心、过滤、萃取、喷雾干燥、蒸发或沉淀。
可通过本领域已知的多种方法提纯多肽来获得基本纯的多肽，该方法包括但不局限于层析法(例如，离子交换、亲和性、疏水性、层析聚焦、和尺寸排阻)、电泳法(例如，制备式等电聚焦)、差别溶解法(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE、或萃取(参见例如，ProteinPurification,Janson和Ryden,编者,VCH Publishers,New York,1989)。
在可替代的方面，不回收多肽，而是使用表达多肽的本发明的宿主细胞作为多肽的来源。
实施例
材料和方法
菌株在固体琼脂上和在液体培养基中的生长
转化之后，所有菌株均已在30℃下在板上生长。当使用液体培养基时，孵育在30℃在振荡下以180rpm进行。
脂肪酶测定
·稀释缓冲液：
·50mM Tris pH 7.5
·10mM CaCl2
·0.1％Triton x-100
·底物储备溶液：117μl对硝基苯基戊酸酯(sigma N4377)溶解于10ml甲醇中
·底物：10ml稀释缓冲液添加100μl底物储备溶液。
10μl样品添加1ml底物，通过测量405nm处的吸光度来跟踪产物形成。
蔗糖培养基
1M蔗糖
0.18μM Na2B4O7
2.3μM CuSO4
4.7μM FeSO4
4.7μM MnSO4
3.6μM Na2MoO4
45μM ZnSO4
7mM KCl
4.3mM MgSO4
11.2mM KH2PO4
融合克隆
融合克隆(in-fusion cloning)使用Clontech Laboratories,Inc.提供的In-Fusion克隆试剂盒和手册进行。
实施例1：建立内含子文库
使用以下引物对来自米曲霉的thiA启动子及其5’非翻译区(UTR)核糖开关进行扩增：
P722(SEQ ID NO:1)：atctcgagctcgcgaaagcttttcggtaaatacactatcacacac；和
P723(SEQ ID NO:2)：gagctcctcatggtggatccactagtgcatgccaagttgcaatgactatcatctg。
使用Clontech In-Fusion试剂盒将产生的1338bp片段融合克隆至来自载体pCOls207(SEQ ID NO:21)的7718bp HindIII/BamHI片段。产生的载体命名为pCOls1086，并显示于图1。
将质粒pJaL1262(完整序列示于SEQ ID NO:22)用SphI/AfeI切割，并提纯产生的4840bp片段。
将质粒pCOls1086用NheI切割，用Klenow补平末端，并再用SphI和KasI切割。提纯产生的4677bp片段，并将其与来自pJaL1262的4840bp片段连接，产生的载体命名为pCOls1123。
使用以下引物从米曲霉A1560的染色体DNA扩增米曲霉的pyrG基因：
P766(SEQ ID NO:3)：gtcattgcaacttggccaacatgtcttccaagtcgc；和
P767(SEQ ID NO:4)：accatgattacgccgcattagtgataccccactctaag。
将PCR产物融合克隆至已经用SphI线性化的载体pCOls1123中。产生的载体命名为pCOls1124，并图示于图2中。
使用pCOls1124作为模板，并使用如下引物制造SOE-PCR产物：
P722(SEQ ID NO:1)：atctcgagctcgcgaaagcttttcggtaaatacactatcacacac
P769(SEQ ID NO:5)：ccgcggcaagttgcaatgactatcatctg
P771(SEQ ID NO:6)：aattcgaaggcctcccatcaccatcaccatcactaag
P503(SEQ ID NO:7)：acatgatcatataaccaattgccctcatccccatcctttaac
将图3所示的质粒pCOls1118(完整序列示于SEQ ID NO:23)用HindIII和SalI切割。将产生的6762bp片段与已用HindIII和SalI切割的SOE-PCR产物连接。产生的质粒命名为pCOls1126，并示于图4中。
生成8种在thiA核糖开关的内含子分支位点“ctaac”(图5，阴影部分)和内含子受体位点“tag”(图5，下划线)之间具有不同距离的不同构建体。两个位点之间的碱基数目在2-6bp之间变化，一构建体的受体位点与分支位点重合并形成其一部分，产生序列“ctaacag”，其中分支位点是“ctaac”，受体位点是“cag”。后一变体命名为“内含子(-1)”。其他命名为“内含子(0)”、“内含子(1)”、“内含子(2)”、“内含子(3)”、“内含子(4)”、“内含子(5)”，最后是“内含子(6)”，其为野生型序列(图5)。
在野生型序列内含子(6)中的同一读框中有两个终止密码子“TGATAG”(图5)。经决定，在变异构建体中在同一读框中与野生型序列相同保持至少两个终止密码子，以避免从未知上游基因发生任何连读(readthrough)。这一点通过除了仅从分支位点和受体位点之间去除一核苷酸以外还对序列稍加修饰而实现。因此，序列不完全相同，但预计与缩短分支位点和受体位点之间的距离相比较，这不会对构建体的剪接效率有任何显著影响。
使用正向引物P782(SEQ ID NO:8)：ccttgatactctgtgagcgct；和以下的反向引物(每构建体一种)通过对质粒pCOls1124中核糖开关的PCR而产生构建体：
P783(SEQ ID NO：9)：gagctcctcatggggccgcggcaatgactatcatctgttagccattccatcaacagg
P784(SEQ ID NO：10)：gagctcctcatggggccgcggcaatcaactatctcagttagccattccatcaacagg
P785(SEQ ID NO：11)：gagctcctcatggggccgcggcaatcagactattcagttagccattccatcaacagg
P786(SEQ ID NO：12)：gagctcctcatggggccgcggcaatcatcactatcagttagccattccatcaacagg
P787(SEQ ID NO：13)：gagctcctcatggggccgcggcaatcatcaactatcgttagccattccatcaacagg
P788(SEQ ID NO：14)：gagctcctcatggggccgcggcaatcatcagactatgttagccattccatcaacagg
P789(SEQ ID NO：15)：gagctcctcatggggccgcggcaatcatcatgactagttagccattccatcaacagg
P792(SEQ ID NO：16)：gagctcctcatggggccgcggcaatgaggatcatctgttagccattccatcaacagg
将PCR构建体各自融合克隆至来自质粒pCOls1126的7661bpHindIII/SacII片段中。下表1给出了用于产生可变内含子(示于图5中)的引物总览和产生的质粒的名称。
表1
| 内含子变体 | 反向引物 | 产生的质粒 |
| 内含子(6) | SEQ ID NO:9 | pCOls1135 |
| 内含子(5) | SEQ ID NO:10 | pCOls1136 |
| 内含子(4) | SEQ ID NO:11 | pCOls1137 |
| 内含子(3) | SEQ ID NO:12 | pCOls1138 |
| 内含子(2) | SEQ ID NO:13 | pCOls1139 |
| 内含子(1) | SEQ ID NO:14 | pCOls1140 |
| 内含子(0) | SEQ ID NO:15 | pCOls1141 |
| 内含子(-1) | SEQ ID NO:16 | pCOls1148 |
实施例2：使用内含子变体调节标记物表达
将所有核糖开关内含子变体与pCOls1126的脂肪酶报道基因融合。将产生的构建体在niaD基因座处以一个拷贝融合在niaD基因部分缺失的米曲霉菌株中，其通过单独的引入构建体而修复，从而能够依赖硝酸盐作为唯一的氮源生长。
让转化体在蔗糖培养基中生长3天，如上文详述在上清液上测量脂肪酶活性。测得的脂肪酶活性总结于下表2中：
表2
| 内含子变体 | 相对报道基因活性 | 野生型的％ |
| 内含子(6) | 0,244 | 100 |
| 内含子(5) | 0,231 | 95 |
| 内含子(4) | 0,178 | 73 |
| 内含子(3) | 0,066 | 27 |
| 内含子(2) | 0,018 | 7 |
| 内含子(1) | 0,010 | 4 |
| 内含子(0) | 0,006 | 2,5 |
| 内含子(-1) | 0,000 | 0 |
从这些结果推断，可以产生系列具有不同内含子剪接效率的含有内含子的5-UTR，提供下游可操作地连接的基因的表达水平范围。当剪接效率降低时，一部分的表达的mRNA将会含有内含子序列，导致翻译起始，翻译在内含子内立即终止，防止下游基因产物的翻译，如表2中以脂肪酶活性所示。
实施例3：内含子核糖开关变体可被硫胺素阻遏
分别在不补充或补充硫胺素(10uM盐酸硫胺素)的情况下将4种thiA核糖开关内含子变体菌株：(6)、(3)、(0)和(-1)在蔗糖培养基中生长48小时。对样品进行脂肪酶活性的分析——如已经示出的，结果示于下表3中。
我们未能从内含子(0)和内含子(-1)测定任何活性(“UD”)，但内含子(6)中的野生型序列实际上随着加入硫胺素被遏制了几乎100个因子，如所预计那样，内含子(3)由于在该变体中分支位点和受体位点的距离缩短，在降低上被遏制了几乎10个因子。
表3
| 内含子变体 | -盐酸硫胺素 | +盐酸硫胺素 |
| 内含子(6) | 100 | 1.6 |
| 内含子(3) | 8.3 | 1.4 |
| 内含子(0) | UD | UD |
| 内含子(-1) | UD | UD |
实施例4：使用内含子变体选择具有高拷贝数整合基因的转化菌株
该实施例说明了内含子变体的用途以及其控制选择性标记物(而不是表达报道基因)的表达的硫胺素阻遏，以获得具有高基因拷贝数标记物基因的转化体。标记物基因与包括要以高水平表达的目标基因的表达盒连接；表达盒将与标记物基因一起复制，从而也增加其拷贝数。
将野生型thiA核糖开关内含子(6)和3种内含子变体内含子(3)、内含子(0)和内含子(-1)克隆到来自米曲霉的pyrG基因的前面。将构建体与脂肪酶表达盒融合。表达盒的表达将用作基因拷贝数的基准(benchmark)。
通过使用引物对P722/P769和P775/767对pCOls1124(图2)进行SOE-PCR，产生质粒pCOls1130：
P722(SEQ ID NO:1)：atctcgagctcgcgaaagcttttcggtaaatacactatcacacac
P769(SEQ ID NO:5)：ccgcggcaagttgcaatgactatcatctg
P775(SEQ ID NO:17)：gatagtcattgcaacttgccgcggcaccatgtcttccaagtcgcaattgac
P767(SEQ ID NO:18)：accatgattacgccgcattagtgataccccactctaag
然后使用引物对P722/P767进行SOE-PCR，产生的片段用HindIII/BsiWI切割，并将其与来自pCOls1124的8389bp HindIII/BsiWI片段连接。产生的质粒命名为pCOls1130。
构建4种与pyrG融合的内含子变体构建体
将质粒pCOls1130用HindIII/SacII切割，并提纯9406bp片段。
将质粒pCOls1135、pCOls1138、pCOls1141和pCOls1148(参见表1)均用HindIII/SacII切割，将1286bp片段与来自pCOls1130的9406bp片段连接。产生的质粒根据下表4命名。
表4
| 内含子变体 | 质粒 |
| 内含子(6) | pCOls1172 |
| 内含子(3) | pCOls1173 |
| 内含子(0) | pCOls1174 |
| 内含子(-1) | pCOls1175 |
将四种质粒pCOls1172、pCOls1173、pCOls1174和pCOls1175均各自转化到米曲霉菌株中，该菌株具有pyrG缺失，并具有可通过在niaD基因座处整合质粒而修复的部分niaD基因。将转化混合物铺在含有3种不同培养基的板上：
A)蔗糖培养基+10mM NaNO3+20mM尿苷
B)蔗糖培养基+10mM NaNO3
C)蔗糖培养基+10mM NaNO3+10μM盐酸硫胺素
对不同板上的转化体进行计数，结果示于下表5中。
表5
在其中需要pyrG表达的培养基B和培养基C上，我们发现转化体生长不同。我们将一些转化体分类为大的，这些是健康的并以与野生型菌株相同的速度生长的转化体。其他转化体生长要慢得多。
对于内含子(3)和内含子(0)，培养基C上转化体的数目要低于培养基B上的数目，说明具有阻遏pyrG基因表达的硫胺素效应。我们推断，在pyrG标记物的前面使用内含子(3)、内含子(0)和内含子(-1)时，需要多于一拷贝的pyrG基因，以使得细胞生长。
我们发现，用内含子(0)和内含子(-1)构建体得到的所谓的大克隆含有非常高拷贝数的表达构建体。这一点通过Southern印迹分析确定，将染色体DNA用AatII和AfeI消化，然后使用niaD整合片段的一部分作为探针(参见图6)。在图6中，可以看出背景菌株具有一个结合探针的片段，而用pCOls1175转化的菌株则表现出探针与含有插入位点侧翼序列以及整个表达构建体的片段的结合，这显示出强度非常高的谱带，表明有许多拷贝的表达构建体。
实施例5：串联的核糖开关提供更宽范围的硫胺素阻遏
如果细胞内的硫胺素浓度允许一定程度上的TPP结合位点占据，特定基因前的多个thiA核糖开关将会增加信使RNA在核糖开关之一完整的情况下进入细胞质的可能性。因此，在高的硫胺素浓度下，两个或更多个thiA核糖开关应当有利于可操作地连接的下游编码序列的硫胺素阻遏的增加。
以合成法构建一个或两个拷贝的thiA核糖开关，并将其置于pCOls1126的thiA核糖开关之后、脂肪酶报道基因之前(图4)，产生质粒pCOls1142(2个核糖开关)和pCOls1143(3个核糖开关)。
核糖开关的5’-端是SEQ ID NO:19：ccgctcccacacaattctct。
核糖开关的3’-端是SEQ ID NO:20：tcattgcaacttg。
将构建体以一个拷贝在niaD基因座处整合到米曲霉中，产生表7所示的菌株。
表7
| 菌株 | 质粒 | 核糖开关拷贝 | 报道基因活性 |
| Ribo1 | pCOls1126 | 1 | 100％ |
| Ribo2 | pCOls1142 | 2 | 48％ |
| Ribo3 | pCOls1143 | 3 | 32％ |
表7中的三种菌株在蔗糖培养基中在不添加硫胺素的情况下在30℃下生长48小时。取样，并如上所述进行脂肪酶报道基因活性分析。
与Ribo1菌株相比较，在表7中来自Ribo2菌株的活性仅仅为48％，Ribo3菌株仅仅产生Ribo1菌株中所测得活性的32％。这些结果说明，在指定的基因前存在两个或更多个thiA核糖开关将会相应地降低其表达。
在向培养基中添加1μM硫胺素的情况下我们还进行了类似的实验，但是Ribo2和Ribo3菌株的表达水平低于我们的脂肪酶检测的检出水平。这表明，比起仅仅使用一个核糖开关，使用这些串联构建体表现出很高的阻遏程度和更宽的阻遏范围。
实施例6：开放读框内的核糖开关内含子克服任何核糖体再起始问题
我们已经观察到，将任何核糖开关构建体置于pyrG标记物之前，在预计给出完全阻遏的硫胺素浓度下，我们仍然总能得到若干转化体。我们认为，这是由于没有在内含子中存在的任何ATG密码子处起始的情况下核糖开关内含子发生核糖体连读，或者是由于pyrG起始密码子处的再起始事件。
为了使pyrG标记物的表达达到更低的水平，可以将核糖开关内含子移到pyrG开放读框内。这将防止在内含子尚未剪接出时形成功能性的pyrG表达产物。
实施例7：生成合成内含子文库
由来自米曲霉thiA基因的核糖开关中第二内含子的给体位点、分支位点和受体位点的共有序列构建合成的内含子。合成内含子含有两个非常有效的翻译起始位点，二者均具有非常好的kozak序列，并且是在不同的框中。内含子内的这两个开放读框终止于内含子分支位点之前。而且，内含子含有六个其他翻译起始位点，上述其他翻译起始位点具有效率较低的kozak，从而对于错过(missed)上游翻译起始位点的核糖体的翻译起始贡献较少。将修饰的内含子与序列“tgtacattgattaattgacaccATG”(SEQ ID NO:24)融合，上述序列在所有三个读框中均含有终止密码子，其将会阻碍核糖体从内含子内的翻译起始位点翻译。而且，SEQ ID NO:24在3’-端含有kozak和实施例中使用的脂肪酶报道基因的翻译起始密码子。
通过改变分支位点“ctaac”序列和剪接受体位点“tag”之间的距离，产生8种不同的合成内含子变体。在第八个序列内含子(-1)中，剪接受体位点三联体“tag”的第一个碱基缺失，使得分支位点和受体位点融合成序列“ctaacag”，其中受体位点是分支位点的一部分。参见表8，八种内含子变体总览。
将所有8种内含子变体均克隆在pCOls1126中存在的报道基因构建体中，其位于脂肪酶报道基因的剪接分支位点和翻译起始密码子之间。将产生的构建体分别以一个拷贝在niaD基因座处整合到niaD基因部分缺失的米曲霉菌株中，其通过分别引入的构建体修复，从而能够在作为唯一氮源的硝酸盐上生长。证实各个构建体均仅以一个拷贝存在，以排除拷贝数对结果的影响。
表8
| 剪接位点变体 | 菌株 | SEQ ID NO |
| ctaacagttgatagtgtacattgattaattgacaccATG | 内含子(6) | SEQ ID NO:25 |
| ctaacgttgatagtgtacattgattaattgacaccATG | 内含子(5) | SEQ ID NO:26 |
| ctaacttgatagtgtacattgattaattgacaccATG | 内含子(4) | SEQ ID NO:27 |
| ctaactgatagtgtacattgattaattgacaccATG | 内含子(3) | SEQ ID NO:28 |
| ctaacgatagtgtacattgattaattgacaccATG | 内含子(2) | SEQ ID NO:29 |
| ctaacatagtgtacattgattaattgacaccATG | 内含子(1) | SEQ ID NO:30 |
| ctaactagtgtacattgattaattgacaccATG | 内含子(0) | SEQ ID NO:31 |
| ctaacagtgtacattgattaattgacaccATG | 内含子(-1) | SEQ ID NO:32 |
由于有效的剪接需要在分支位点和剪接受体位点之间有一定间隔，间隔较小的构建体报道基因的表达较少，这是因为翻译将会在非剪接(non-spliced)内含子内的翻译起始位点处开始，并在到达脂肪酶报道基因之前终止。因此，改变分支位点和受体位点之间的间隔是改变基因表达的有效方式。在该实施例中，当使用thiA启动子和thiA核糖开关时，甚至可以通过改变硫胺素的外部提供而得到额外的变化。但是，内源的硫胺素浓度将会在不同生长时期变化，影响硫胺素阻遏而预期剪接效率是恒定的。因此，通过使用剪接位点变体，而不是使用诱导型或阻遏型启动子，可以获得对基因表达的恒定调节。这在要求恒定、精确的基因表达水平时是非常重要的。
Claims (34)
1.一种构建重组真菌宿主细胞的方法，所述重组真菌宿主细胞包括一个或多个拷贝的整合在其基因组中的多核苷酸构建体，所述方法包括：
a)提供用整合型多核苷酸构建体转化的真菌宿主细胞，所述构建体包括编码选择性标记物的第一多核苷酸和编码目标多肽的第二多核苷酸，其中所述第一多核苷酸、其5’非翻译区和/或与其可操作地连接的核糖开关包括在其分支位点和其受体位点之间的具有5个核苷酸或更少的剪接体内含子；
b)在有益于表达所述选择性标记物的条件下培养转化的真菌宿主细胞；以及
c)分离包括一个或多个拷贝的整合在其基因组中的多核苷酸构建体的重组真菌宿主细胞；优选两个或更多个拷贝；甚至更优选三个或更多个拷贝，最优选四个或更多个拷贝。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述真菌宿主细胞是丝状真菌宿主细胞；优选为枝顶孢属(Acremonium)、曲霉属(Aspergillus)、短梗霉属(Aureobasidium)、烟管菌属(Bjerkandera)、拟蜡菌属(Ceriporiopsis)、金孢子菌属(Chrysosporium)、鬼伞属(Coprinus)、革盖菌属(Coriolus)、隐球菌属(Cryptococcus)、Filibasidium、镰孢霉属(Fusarium)、腐质霉属(Humicola)、稻瘟菌属(Magnaporthe)、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、新美鞭菌属(Neocallimastix)、脉孢菌属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属(Penicillium)、平革菌属(Phanerochaete)、白腐菌属(Phlebia)、Piromyces、侧耳属(Pleurotus)、裂褶菌属(Schizophyllum)、踝节菌属(Talaromyces)、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)、栓菌属(Trametes)或木霉属(Trichoderma)细胞。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述真菌宿主细胞是酵母宿主细胞；优选为念珠菌属(Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)、克鲁维酵母菌属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)或耶氏酵母属(Yarrowia)细胞，例如，乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、卡氏酵母(Saccharomyces carlsbergensis)、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)、Saccharomycesdouglasii、克鲁弗酵母(Saccharomyces kluyveri)、诺地酵母(Saccharomyces norbensis)、卵形酵母(Saccharomyces oviformis)或解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)细胞。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中步骤(a)中的所述真菌宿主细胞具有生长缺陷，并且所述整合型多核苷酸构建体在整合到所述宿主细胞的基因组中时弥补所述生长缺陷。
5.根据权利要求4所述的方法，其中步骤(a)中的所述真菌宿主细胞缺乏功能性的硝酸还原酶或亚硝酸还原酶，并且所述整合型多核苷酸构建体分别包括编码功能性硝酸还原酶的基因，例如niaD，或编码功能性亚硝酸还原酶的基因，例如niiA；或者步骤(a)中的所述真菌宿主细胞缺乏功能性烯醇化酶，并且所述整合型多核苷酸构建体包括编码功能性烯醇化酶的基因，例如acuN。
6.根据权利要求4所述的方法，其中在转化之后所述整合型多核苷酸构建体通过非同源重组而随机整合在基因组中。
7.根据权利要求4所述的方法，其中步骤(a)中的所述整合型多核苷酸构建体在一侧或两侧是大小和与所述真菌宿主细胞基因组中的特异性基因座的序列同源性充足的同源框，从而使得在转化之后所述整合型多核苷酸构建体能够通过同源重组而位点特异性地整合到所述基因组中。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述剪接体内含子在其分支位点和其受体位点之间具有4个核苷酸或更少；优选3个核苷酸或更少；更优选2个核苷酸或更少；甚至更优选1个核苷酸；再更优选所述剪接体内含子在其分支位点和其受体位点之间具有0个核苷酸，最优选所述剪接体内含子的所述分支位点和所述受体位点重合至少一个核苷酸。
9.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述剪接体内含子包括选自以下内含子核苷酸序列的核苷酸序列：SEQ ID NO:24、SEQID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ IDNO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:40。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述整合型多核苷酸构建体的所述第一多核苷酸具有与其可操作地连接的核糖开关；优选所述核糖开关源自米曲霉(Aspergillus oryzae)中的thiA或nmtA基因。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述整合型多核苷酸构建体的所述第一多核苷酸编码选择性标记物乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶或PyrG。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其中由所述整合型多核苷酸构建体的所述第二多核苷酸编码的目标多肽包括酶；优选为水解酶、异构酶、连接酶、裂解酶、氧化还原酶或转移酶，例如氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、几丁质酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、内切葡聚糖酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、变聚糖酶(mutanase)、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、木聚糖酶或β-木糖苷酶。
13.一种适合于转化到真菌宿主细胞中并整合到所述细胞的基因组中的多核苷酸构建体，所述构建体包括：
a)编码选择性标记物的第一多核苷酸，其中所述第一多核苷酸、其5’非翻译区和/或与其可操作地连接的核糖开关包括在其分支位点和其受体位点之间的具有5个核苷酸或更少的剪接体内含子；和
b)编码目标多肽的第二多核苷酸。
14.根据权利要求13所述的多核苷酸构建体，其中所述真菌宿主细胞是丝状真菌宿主细胞；优选为枝顶孢属、曲霉属、短梗霉属、烟管菌属、拟蜡菌属、金孢子菌属、鬼伞属、革盖菌属、隐球菌属、Filibasidium、镰孢霉属、腐质霉属、稻瘟菌属、毛霉属、毁丝霉属、新美鞭菌属、脉孢菌属、拟青霉属、青霉属、平革菌属、白腐菌属、Piromyces、侧耳属、裂褶菌属、踝节菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、弯颈霉属、栓菌属或木霉属细胞。
15.根据权利要求13所述的多核苷酸构建体，其中所述真菌宿主细胞是酵母宿主细胞；优选为念珠菌属、汉逊酵母属、克鲁维酵母菌属、毕赤酵母属、酵母属、裂殖酵母属或耶氏酵母属细胞，例如，乳酸克鲁维酵母、卡氏酵母、酿酒酵母、糖化酵母、Saccharomycesdouglasii、克鲁弗酵母、诺地酵母、卵形酵母或解脂耶氏酵母细胞。
16.根据权利要求13-15中任一项所述的多核苷酸构建体，其包括编码功能性硝酸还原酶的基因，例如niaD，编码功能性亚硝酸还原酶的基因，例如niiA，或编码功能性烯醇化酶的基因，例如acuN。
17.根据权利要求13-16中任一项所述的多核苷酸构建体，其在一侧或两侧是大小和与所述真菌宿主细胞基因组中的特异性基因座的序列同源性充足的同源框，从而使得在转化之后所述整合型多核苷酸构建体能够通过同源重组而位点特异性地整合到所述基因组中。
18.根据权利要求13-17中任一项所述的多核苷酸构建体，其中所述剪接体内含子在其分支位点和其受体位点之间具有4个核苷酸或更少；优选3个核苷酸或更少；更优选2个核苷酸或更少；甚至更优选1个核苷酸；再更优选所述剪接体内含子在其分支位点和其受体位点之间具有0个核苷酸，最优选所述剪接体内含子的所述分支位点和所述受体位点重合至少一个核苷酸。
19.根据权利要求13-18中任一项所述的多核苷酸构建体，其中所述剪接体内含子包括选自以下内含子核苷酸序列的核苷酸序列：SEQID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ IDNO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:40。
20.根据权利要求13-19中任一项所述的多核苷酸构建体，其中所述第一多核苷酸具有与其可操作地连接的核糖开关；优选所述核糖开关源自米曲霉中的thiA或nmtA基因。
21.根据权利要求13-20中任一项所述的多核苷酸构建体，其中所述整合型多核苷酸构建体的所述第一多核苷酸编码选择性标记物乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶或PyrG。
22.根据权利要求13-21中任一项所述的多核苷酸构建体，其中由所述整合型多核苷酸构建体的所述第二多核苷酸编码的目标多肽包括酶；优选为水解酶、异构酶、连接酶、裂解酶、氧化还原酶或转移酶，例如氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、几丁质酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、内切葡聚糖酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、变聚糖酶、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、木聚糖酶或β-木糖苷酶。
23.一种重组真菌宿主细胞，其包括一个或多个拷贝的整合在其基因组中的多核苷酸构建体，所述构建体包括：
a)编码选择性标记物的第一多核苷酸，其中所述第一多核苷酸、其5’非翻译区和/或与其可操作地连接的核糖开关包括在其分支位点和其受体位点之间的具有5个核苷酸或更少的剪接体内含子；和
b)编码目标多肽的第二多核苷酸。
24.根据权利要求23所述的重组真菌宿主细胞，其包括两个或更多个拷贝的整合在其基因组中的多核苷酸构建体；甚至更优选三个或更多个拷贝、最优选四个或更多个拷贝的整合在其基因组中的多核苷酸构建体。
25.根据权利要求23或24所述的重组真菌宿主细胞，其为丝状真菌宿主细胞；优选为枝顶孢属、曲霉属、短梗霉属、烟管菌属、拟蜡菌属、金孢子菌属、鬼伞属、革盖菌属、隐球菌属、Filibasidium、镰孢霉属、腐质霉属、稻瘟菌属、毛霉属、毁丝霉属、新美鞭菌属、脉孢菌属、拟青霉属、青霉属、平革菌属、白腐菌属、Piromyces、侧耳属、裂褶菌属、踝节菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、弯颈霉属、栓菌属或木霉属细胞。
26.根据权利要求23或24所述的重组真菌宿主细胞，其为酵母宿主细胞；优选为念珠菌属、汉逊酵母属、克鲁维酵母菌属、毕赤酵母属、酵母属、裂殖酵母属或耶氏酵母属细胞，例如，乳酸克鲁维酵母、卡氏酵母、酿酒酵母、糖化酵母、Saccharomyces douglasii、克鲁弗酵母、诺地酵母、卵形酵母或解脂耶氏酵母细胞。
27.根据权利要求23-26中任一项所述的重组真菌宿主细胞，其中整合型多核苷酸构建体通过非同源重组而随机整合到基因组中。
28.根据权利要求23-26中任一项所述的重组真菌宿主细胞，其中所述整合型多核苷酸构建体通过同源重组而位点特异性地整合到基因组中；优选整合到编码硝酸还原酶或亚硝酸还原酶的基因中；更优选整合到葡糖异生所需的基因中；最优选整合到niaD、niiA、acuN、acuK或acuM基因座中。
29.根据权利要求23-28中任一项所述的重组真菌宿主细胞，其中所述剪接体内含子在其分支位点和其受体位点之间具有4个核苷酸或更少；优选3个核苷酸或更少；更优选2个核苷酸或更少；甚至更优选1个核苷酸；再更优选所述剪接体内含子在其分支位点和其受体位点之间具有0个核苷酸，最优选所述剪接体内含子的所述分支位点和所述受体位点重合至少一个核苷酸。
30.根据权利要求23-28中任一项所述的重组真菌宿主细胞，其中所述剪接体内含子包括选自以下内含子核苷酸序列的核苷酸序列：SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ IDNO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:40。
31.根据权利要求23-30中任一项所述的重组真菌宿主细胞，其中所述整合型多核苷酸构建体的所述第一多核苷酸具有与其可操作地连接的核糖开关；优选所述核糖开关源自米曲霉中的thiA或nmtA基因；甚至更优选所述核糖开关包括米曲霉中的thiA或nmtA基因的核糖开关；最优选所述核糖开关由米曲霉中的thiA或nmtA基因的核糖开关组成。
32.根据权利要求23-31中任一项所述的重组真菌宿主细胞，其中所述整合型多核苷酸构建体的所述第一多核苷酸编码选择性标记物乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶或PyrG。
33.根据权利要求23-32中任一项所述的重组真菌宿主细胞，其中由所述整合型多核苷酸构建体的所述第二多核苷酸编码的目标多肽包括酶；优选为水解酶、异构酶、连接酶、裂解酶、氧化还原酶或转移酶，例如氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、几丁质酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、内切葡聚糖酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、变聚糖酶、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、木聚糖酶或β-木糖苷酶。
34.一种生产目标多肽的方法，包括：
a)培养根据权利要求23-33中任一项所述的重组真菌宿主细胞；和任选地
b)回收所述多肽。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP12170260 | 2012-05-31 | ||
| EP12170260.9 | 2012-05-31 | ||
| PCT/EP2013/061052 WO2013178674A1 (en) | 2012-05-31 | 2013-05-29 | Improved selection in fungi |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN104395454A true CN104395454A (zh) | 2015-03-04 |
| CN104395454B CN104395454B (zh) | 2021-11-30 |
Family
ID=48539153
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201380028411.5A Active CN104395454B (zh) | 2012-05-31 | 2013-05-29 | 改善的真菌选择 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US9487767B2 (zh) |
| EP (2) | EP3327113B1 (zh) |
| JP (1) | JP6449763B2 (zh) |
| CN (1) | CN104395454B (zh) |
| BR (1) | BR112014029252B8 (zh) |
| DK (1) | DK3327113T3 (zh) |
| WO (1) | WO2013178674A1 (zh) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107429220A (zh) * | 2015-03-27 | 2017-12-01 | 嘉吉公司 | 经葡糖淀粉酶修饰的酵母菌株和用于产生生物产物的方法 |
| CN108949579A (zh) * | 2018-04-19 | 2018-12-07 | 中国科学技术大学 | 嗜热子囊菌基因表达系统 |
| CN110592149A (zh) * | 2019-07-16 | 2019-12-20 | 甘肃省科学院生物研究所 | 一种梨囊鞭菌发酵秸秆生产乳酸的新方法和应用 |
| CN114292761A (zh) * | 2021-12-02 | 2022-04-08 | 南京工业大学 | 一株黑曲霉基因工程菌及构建方法与应用 |
| US11421212B2 (en) | 2016-08-05 | 2022-08-23 | Cargill, Incorporated | Engineered yeast strains with signal sequence-modified glucoamylase polypeptides and enhanced ethanol production |
Families Citing this family (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106062276B (zh) | 2014-03-05 | 2019-06-11 | 诺维信公司 | 用于将材料功能化并且进行连接的组合物和方法 |
| BR112016020374A2 (pt) | 2014-03-05 | 2018-01-23 | Novozymes As | formulação, e, métodos para potenciar o crescimento de plantas e para formular um ou mais agentes agricolamente benéficos |
| EP3114219A1 (en) | 2014-03-05 | 2017-01-11 | Novozymes A/S | Compositions and methods for improving properties of non-cellulosic textile materials with xyloglucan endotransglycosylase |
| EP3113609B1 (en) | 2014-03-05 | 2019-07-31 | Novozymes A/S | Methods for improving post-harvest properties of agricultural crops |
| EP3114272A1 (en) | 2014-03-05 | 2017-01-11 | Novozymes A/S | Compositions and methods for improving properties of cellulosic textile materials with xyloglucan endotransglycosylase |
| CN106795504A (zh) | 2014-08-20 | 2017-05-31 | 诺维信公司 | 木葡聚糖内糖基转移酶变体以及编码其的多核苷酸 |
| US10781428B2 (en) | 2014-12-02 | 2020-09-22 | Novozymes A/S | Laccase variants and polynucleotides encoding same |
| AU2016215454B2 (en) | 2015-02-02 | 2022-05-19 | Meiragtx Uk Ii Limited | Regulation of gene expression by aptamer-mediated modulation of alternative splicing |
| WO2016174258A1 (en) | 2015-04-29 | 2016-11-03 | Boehringer Ingelheim Rcv Gmbh & Co Kg | Means and methods for protein production |
| FI3494229T3 (fi) * | 2016-08-03 | 2024-01-29 | Meiragtx Uk Ii Ltd | Suuren suorituskyvyn solupohjainen seulonta aptameereille |
| JP7210577B2 (ja) * | 2018-06-15 | 2023-01-23 | キッコーマン株式会社 | セレノネインの製造方法 |
| US20210301285A1 (en) | 2018-08-02 | 2021-09-30 | Novozymes A/S | Preparation of Combinatorial Libraries of DNA Constructs |
| WO2020127198A1 (en) | 2018-12-21 | 2020-06-25 | Novozymes A/S | Tandem protein expression |
| EP4004211A1 (en) | 2019-07-25 | 2022-06-01 | Novozymes A/S | Filamentous fungal expression system |
| US11479779B2 (en) | 2020-07-31 | 2022-10-25 | Zymergen Inc. | Systems and methods for high-throughput automated strain generation for non-sporulating fungi |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2007259787A (ja) * | 2006-03-29 | 2007-10-11 | Hakutsuru Shuzo Kk | 遺伝子発現制御ポリヌクレオチド |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DK122686D0 (da) | 1986-03-17 | 1986-03-17 | Novo Industri As | Fremstilling af proteiner |
| FR2704860B1 (fr) | 1993-05-05 | 1995-07-13 | Pasteur Institut | Sequences de nucleotides du locus cryiiia pour le controle de l'expression de sequences d'adn dans un hote cellulaire. |
| DK0765394T3 (da) | 1994-06-03 | 2001-12-10 | Novozymes As | Oprensede Myceliopthora-laccaser og nukleinsyrer der koder for disse |
| AU2705895A (en) | 1994-06-30 | 1996-01-25 | Novo Nordisk Biotech, Inc. | Non-toxic, non-toxigenic, non-pathogenic fusarium expression system and promoters and terminators for use therein |
| US5958727A (en) | 1996-09-13 | 1999-09-28 | Novo Nordisk Biotech, Inc | Methods for modifying the production of a polypeptide |
| AU6188599A (en) | 1998-10-26 | 2000-05-15 | Novozymes A/S | Constructing and screening a dna library of interest in filamentous fungal cells |
| CN100532561C (zh) | 1999-03-22 | 2009-08-26 | 诺沃奇梅兹有限公司 | 新的葡糖淀粉酶及编码它的核酸序列 |
| US6762040B2 (en) * | 2000-05-24 | 2004-07-13 | Novozymes A/S | Method for increasing gene copy number in a host cell and resulting host cell |
| GB201107768D0 (en) | 2011-05-10 | 2011-06-22 | Univ Manchester | Riboswitches |
-
2013
- 2013-05-29 EP EP17200169.5A patent/EP3327113B1/en active Active
- 2013-05-29 DK DK17200169.5T patent/DK3327113T3/da active
- 2013-05-29 WO PCT/EP2013/061052 patent/WO2013178674A1/en active Application Filing
- 2013-05-29 EP EP13726188.9A patent/EP2855659A1/en not_active Withdrawn
- 2013-05-29 CN CN201380028411.5A patent/CN104395454B/zh active Active
- 2013-05-29 JP JP2015514483A patent/JP6449763B2/ja active Active
- 2013-05-29 US US14/403,355 patent/US9487767B2/en active Active
- 2013-05-29 BR BR112014029252A patent/BR112014029252B8/pt active Search and Examination
-
2016
- 2016-10-18 US US15/296,433 patent/US10351861B2/en active Active
-
2018
- 2018-06-26 US US16/018,726 patent/US10351863B2/en active Active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2007259787A (ja) * | 2006-03-29 | 2007-10-11 | Hakutsuru Shuzo Kk | 遺伝子発現制御ポリヌクレオチド |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| ALESSANDRA CELLINI等: "Yeast pre-messenger RNA splicing efficiency depends on critical spacing requirements between the branch point and 3" splice site", 《THE EMBO JOURNAL》 * |
| APRIL BRYS 和 BEATE SCHWER: "Requirement for SLU7 in yeast pre-mRNA splicing is dictated by the distance between the branchpoint and the 3" splice site", 《RNA》 * |
| TAKAFUMI KUBODERA等: "Thiamine-regulated gene expression of Aspergillus oryzae thiA requires splicing of the intron containing a riboswitch-like domain in the 5’-UTR.", 《FEBS LETTERS》 * |
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107429220A (zh) * | 2015-03-27 | 2017-12-01 | 嘉吉公司 | 经葡糖淀粉酶修饰的酵母菌株和用于产生生物产物的方法 |
| US11421212B2 (en) | 2016-08-05 | 2022-08-23 | Cargill, Incorporated | Engineered yeast strains with signal sequence-modified glucoamylase polypeptides and enhanced ethanol production |
| CN108949579A (zh) * | 2018-04-19 | 2018-12-07 | 中国科学技术大学 | 嗜热子囊菌基因表达系统 |
| CN108949579B (zh) * | 2018-04-19 | 2021-10-01 | 中国科学技术大学 | 嗜热子囊菌基因表达系统 |
| CN110592149A (zh) * | 2019-07-16 | 2019-12-20 | 甘肃省科学院生物研究所 | 一种梨囊鞭菌发酵秸秆生产乳酸的新方法和应用 |
| CN110592149B (zh) * | 2019-07-16 | 2020-07-14 | 甘肃省科学院生物研究所 | 一种梨囊鞭菌发酵秸秆生产乳酸的新方法和应用 |
| CN114292761A (zh) * | 2021-12-02 | 2022-04-08 | 南京工业大学 | 一株黑曲霉基因工程菌及构建方法与应用 |
| CN114292761B (zh) * | 2021-12-02 | 2023-11-03 | 南京工业大学 | 一株黑曲霉基因工程菌及构建方法与应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DK3327113T3 (da) | 2021-09-13 |
| US20180298394A1 (en) | 2018-10-18 |
| EP3327113A2 (en) | 2018-05-30 |
| EP2855659A1 (en) | 2015-04-08 |
| JP2015517816A (ja) | 2015-06-25 |
| US20170029830A1 (en) | 2017-02-02 |
| EP3327113A3 (en) | 2018-08-08 |
| US9487767B2 (en) | 2016-11-08 |
| EP3327113B1 (en) | 2021-08-18 |
| BR112014029252A2 (pt) | 2017-07-18 |
| WO2013178674A1 (en) | 2013-12-05 |
| CN104395454B (zh) | 2021-11-30 |
| US10351863B2 (en) | 2019-07-16 |
| BR112014029252B8 (pt) | 2022-01-25 |
| US10351861B2 (en) | 2019-07-16 |
| US20150175981A1 (en) | 2015-06-25 |
| BR112014029252B1 (pt) | 2021-10-19 |
| JP6449763B2 (ja) | 2019-01-09 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US10351863B2 (en) | Selection in fungi | |
| US9850501B2 (en) | Simultaneous site-specific integrations of multiple gene-copies | |
| US11046736B2 (en) | Filamentous fungal host | |
| US20140113304A1 (en) | Bi-Directional Cytosine Deaminase-Encoding Selection Marker | |
| US20160152993A1 (en) | Promoters for Expressing Genes in a Fungal cell | |
| CN108779155A (zh) | RlmA灭活的丝状真菌宿主细胞 | |
| EP3898985B1 (en) | Tandem protein expression | |
| US20220267783A1 (en) | Filamentous fungal expression system | |
| WO2018167153A1 (en) | Improved filamentous fungal host cell | |
| US11667922B2 (en) | Fungal chaperone proteins | |
| CN103339259B (zh) | 用于在真菌细胞中表达基因的启动子 | |
| DK2585591T3 (en) | Polynucleotides with leader sequence function | |
| EP4237430A1 (en) | Leader peptides and polynucleotides encoding the same |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |