CN106062276B - 用于将材料功能化并且进行连接的组合物和方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于使用组合物将材料功能化、将材料连接、或产生复合的材料的方法，这些组合物包括(a)木葡聚糖内糖基转移酶、聚合木葡聚糖、和功能化的木葡聚糖低聚物；(b)木葡聚糖内糖基转移酶、用化学基团功能化的聚合木葡聚糖、和功能化的木葡聚糖低聚物；(c)木葡聚糖内糖基转移酶、用化学基团功能化的聚合木葡聚糖、和木葡聚糖低聚物；(d)木葡聚糖内糖基转移酶、聚合木葡聚糖、和木葡聚糖低聚物；(e)木葡聚糖内糖基转移酶和用化学基团功能化的聚合木葡聚糖；(f)木葡聚糖内糖基转移酶和聚合木葡聚糖；(g)木葡聚糖内糖基转移酶和功能化的木葡聚糖低聚物；(h)木葡聚糖内糖基转移酶和木葡聚糖低聚物，或(i)不具有木葡聚糖内糖基转移酶的(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、或(h)的组合物。本发明还涉及通过这样的方法获得的材料。

Description

用于将材料功能化并且进行连接的组合物和方法

序列表的引用

本申请包括计算机可读形式的序列表，将其通过引用结合在此。

发明背景

发明领域

本发明涉及用于用于将材料功能化并且进行连接的组合物和方法。

相关领域描述

木葡聚糖内糖基转移酶(XET)是一种催化木葡聚糖(植物细胞壁的结构多糖)的内切-转糖基作用的酶。该酶存在于大多数植物中，并且具体地是陆生植物。已经从双子叶植物和单子叶植物中提取出XET。

木葡聚糖存在于棉布、纸、或木纤维中(哈亚西(Hayashi)，等人，1988，碳水化合物研究(Carbohydrate Research)181:273-277)使得牢固氢键合到纤维素(卡皮塔(Carpita)和吉比特(Gibeaut)，1993，植物杂志(The Plant Journal)3:1-30)。向包含木葡聚糖的各种纤维素材料添加木葡聚糖内糖基转移酶改变了在纤维素纤维之间的木葡聚糖介导的相互连接，改进纤维素材料的强度，并且维持纤维素结构，同时允许该纤维素纤维在力的作用下相对于彼此运动。

WO 97/23683披露了一种通过使用木葡聚糖内糖基转移酶，赋予纤维素材料(如织物或纸和纸浆产品)改进的强度和/或形状保持和/或抗皱性质的方法。WO 2001/07556披露了洗衣和/或织物和/或颜色护理组合物，该组合物包含与多糖和/或寡糖组合的木葡聚糖内糖基转移酶，用于针对织物来刷新和/或恢复改进的拉伸强度、增强的抗皱、抗起球和抗缩水特性。

希望将功能化的以及表面功能化的材料用于广泛的各种应用中，例如建筑材料、纺织品、塑料、食品、或包装。在本领域中，对于开发廉价、稳健和/或柔性的具有以下表面的材料存在需要，这些表面具有针对各种化学的、放射学的或生物学的化合物的亲和性或化学反应性，这些材料可以用于这些化合物的诊断、处置、清洁、隔离或生物修复。

在本领域中，对于以下方面存在需要：通过共混天然聚合物和合成聚合物开发复合的材料；产生用于经由聚合物本身抑或经由具有改进的关联特性的功能化填料来改进合成聚合物和天然聚合物之间的关联的方法；将矿物质或金属与聚合物连接；并且向柔性的、薄的、或易于成形的材料赋予导电性、磁特性、光学特性、物理特性、机械特性、或化学特性。

本发明提供了用于将材料功能化并且进行连接的组合物和方法。

发明概述

本发明涉及用于功能化材料的方法，这些方法包括在导致一种包括用化学基团功能化的聚合木葡聚糖的经修饰的材料的条件下，用选自下组的组合物处理该材料，该组由以下各项组成：(a)组合物，包括木葡聚糖内糖基转移酶、聚合木葡聚糖、和包含化学基团的功能化的木葡聚糖低聚物；(b)组合物，包括木葡聚糖内糖基转移酶、用化学基团功能化的聚合木葡聚糖、和包含化学基团的功能化的木葡聚糖低聚物；(c)组合物，包括木葡聚糖内糖基转移酶、用化学基团功能化的聚合木葡聚糖、和木葡聚糖低聚物；(d)组合物，包括木葡聚糖内糖基转移酶、聚合木葡聚糖、和木葡聚糖低聚物；(e)组合物，包括木葡聚糖内糖基转移酶和用化学基团功能化的聚合木葡聚糖；(f)组合物，包括木葡聚糖内糖基转移酶和聚合木葡聚糖；(g)组合物，包括木葡聚糖内糖基转移酶和包含化学基团的功能化的木葡聚糖低聚物；(h)组合物，包括木葡聚糖内糖基转移酶和木葡聚糖低聚物，以及(i)不具有木葡聚糖内糖基转移酶的(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、或(h)的组合物，其中该经修饰的材料与未经修饰的材料相比具有改进的特性。

本发明还涉及用于连接材料的方法，这些方法包括在产生两种或更多种材料之间的连接形成的条件下，用组合物处理该两种或更多种材料，该组合物选自下组，该组由以下各项组成：(a)组合物，包括木葡聚糖内糖基转移酶、聚合木葡聚糖、和包含化学基团的功能化的木葡聚糖低聚物；(b)组合物，包括木葡聚糖内糖基转移酶、用化学基团功能化的聚合木葡聚糖、和包含化学基团的功能化的木葡聚糖低聚物；(c)组合物，包括木葡聚糖内糖基转移酶、用化学基团功能化的聚合木葡聚糖、和木葡聚糖低聚物；(d)组合物，包括木葡聚糖内糖基转移酶、聚合木葡聚糖、和木葡聚糖低聚物；(e)组合物，包括木葡聚糖内糖基转移酶和用化学基团功能化的聚合木葡聚糖；(f)组合物，包括木葡聚糖内糖基转移酶和聚合木葡聚糖；(g)组合物，包括木葡聚糖内糖基转移酶和包含化学基团的功能化的木葡聚糖低聚物；(h)组合物，包括木葡聚糖内糖基转移酶和木葡聚糖低聚物，以及(i)不具有木葡聚糖内糖基转移酶的(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、或(h)的组合物。

本发明还涉及用于产生复合的材料的方法，这些方法包括在产生两种或更多种材料之间的关联的条件下，用组合物处理该两种或更多种材料，该组合物选自下组，该组由以下各项组成：(a)组合物，包括木葡聚糖内糖基转移酶、聚合木葡聚糖、和包含化学基团的功能化的木葡聚糖低聚物；(b)组合物，包括木葡聚糖内糖基转移酶、用化学基团功能化的聚合木葡聚糖、和包含化学基团的功能化的木葡聚糖低聚物；(c)组合物，包括木葡聚糖内糖基转移酶、用化学基团功能化的聚合木葡聚糖、和木葡聚糖低聚物；(d)组合物，包括木葡聚糖内糖基转移酶、聚合木葡聚糖、和木葡聚糖低聚物；(e)组合物，包括木葡聚糖内糖基转移酶和用化学基团功能化的聚合木葡聚糖；(f)组合物，包括木葡聚糖内糖基转移酶和聚合木葡聚糖；(g)组合物，包括木葡聚糖内糖基转移酶和包含化学基团的功能化的木葡聚糖低聚物；(h)组合物，包括木葡聚糖内糖基转移酶和木葡聚糖低聚物，以及(i)不具有木葡聚糖内糖基转移酶的(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、或(h)的组合物。

本发明还涉及通过此类方法获得的功能化的、连接的、或复合的材料。

本发明还涉及功能化的材料，这些材料包括(a)聚合木葡聚糖和包含化学基团的功能化的木葡聚糖低聚物；(b)用化学基团功能化的聚合木葡聚糖和包含化学基团的功能化的木葡聚糖低聚物；(c)用化学基团功能化的聚合木葡聚糖和木葡聚糖低聚物；(d)聚合木葡聚糖和木葡聚糖低聚物；(e)用化学基团功能化的聚合木葡聚糖；(f)聚合木葡聚糖；(g)包含化学基团的功能化的木葡聚糖低聚物；或(h)木葡聚糖低聚物。

本发明还涉及连接的材料，这些材料包括(a)聚合木葡聚糖和包含化学基团的功能化的木葡聚糖低聚物；(b)用化学基团功能化的聚合木葡聚糖和包含化学基团的功能化的木葡聚糖低聚物；(c)用化学基团功能化的聚合木葡聚糖和木葡聚糖低聚物；(d)聚合木葡聚糖和木葡聚糖低聚物；(e)用化学基团功能化的聚合木葡聚糖；(f)聚合木葡聚糖；(g)包含化学基团的功能化的木葡聚糖低聚物；或(h)木葡聚糖低聚物。

本发明还涉及复合的材料，这些材料包括(a)聚合木葡聚糖和包含化学基团的功能化的木葡聚糖低聚物；(b)用化学基团功能化的聚合木葡聚糖和包含化学基团的功能化的木葡聚糖低聚物；(c)用化学基团功能化的聚合木葡聚糖和木葡聚糖低聚物；(d)聚合木葡聚糖和木葡聚糖低聚物；(e)用化学基团功能化的聚合木葡聚糖；(f)聚合木葡聚糖；(g)包含化学基团的功能化的木葡聚糖低聚物；或(h)木葡聚糖低聚物。

本发明进一步涉及选自下组的组合物，该组由以下各项组成：(a)组合物，包括木葡聚糖内糖基转移酶、聚合木葡聚糖、和包含化学基团的功能化的木葡聚糖低聚物；(b)组合物，包括木葡聚糖内糖基转移酶、用化学基团功能化的聚合木葡聚糖、和包含化学基团的功能化的木葡聚糖低聚物；(c)组合物，包括木葡聚糖内糖基转移酶、用化学基团功能化的聚合木葡聚糖、和木葡聚糖低聚物；(d)组合物，包括木葡聚糖内糖基转移酶、聚合木葡聚糖、和木葡聚糖低聚物；(e)组合物，包括木葡聚糖内糖基转移酶和用化学基团功能化的聚合木葡聚糖；(f)组合物，包括木葡聚糖内糖基转移酶和聚合木葡聚糖；(g)组合物，包括木葡聚糖内糖基转移酶和包含化学基团的功能化的木葡聚糖低聚物；(h)组合物，包括木葡聚糖内糖基转移酶和木葡聚糖低聚物，以及(i)不具有木葡聚糖内糖基转移酶的(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、或(h)的组合物。

附图简述

图1示出了pDLHD0012的限制性图谱。

图2示出了pMMar27的限制性图谱。

图3示出了pEvFz1的限制性图谱。

图4示出了pDLHD0006的限制性图谱。

图5示出了pDLHD0039的限制性图谱。

图6示出在手抄纸组合物中红豆木葡聚糖内糖基转移酶16(VaXET16)修饰的高岭土对填料保持的作用。

图7示出相对于在没有高岭土的情况下进行的对照孵育而言，在与渐增质量的高岭土一起孵育之后，与固相关联的荧光素异硫氰酸酯标记的木葡聚糖(FITC-XG)荧光的增加。图7A示出在1天孵育之后的高岭土滴定；图7B示出在2天孵育之后的高岭土滴定；并且图7C示出在5天孵育之后的高岭土滴定。

图8示出各种高岭土制品的上清液的荧光光谱。图8A示出在没有FITC-XG的情况下孵育的各种高岭土浓度的上清液的荧光光谱。图8B示出与FITC-XG一起孵育的各种高岭土浓度的上清液的荧光光谱。图8C示出与FITC-XG和VaXET16一起孵育的各种浓度的高岭土的上清液的荧光光谱。

图9示出使用共聚焦显微镜，结合至高岭土的FITC-XG。图9A示出未与FITC-XG一起孵育的高岭土的共聚焦显微镜图像。图9B示出与FITC-XG一起孵育的高岭土的共聚焦显微镜图像。图9C示出与FITC-XG和VaXET16一起孵育的高岭土的共聚焦显微镜图像。这些小图是透射和荧光发射图像的叠加。

图10示出在与木葡聚糖或者木葡聚糖和VaXET16一起孵育之后，对于高岭土的物理特性的作用。图10A示出离心之后包含(1)高岭土，(2)与木葡聚糖一起孵育的高岭土，以及(3)与木葡聚糖和VaXET16一起孵育的高岭土的50ml锥形管的照片。图10B示出在与(1)高岭土，(2)与木葡聚糖一起孵育的高岭土，以及(3)与木葡聚糖和VaXET16一起孵育的高岭土接触之后的聚苯乙烯血清移液管的照片。图10C示出广泛洗涤并且重悬浮于水中之后包含(1)高岭土，(2)与木葡聚糖一起孵育的高岭土，以及(3)与木葡聚糖和VaXET16一起孵育的高岭土的50ml锥形管的照片。

图11示出在不同的时间FITC-XG TiO₂-结合反应和对照孵育物的上清液的荧光强度。空心圆：TiO₂，不具有FITC-XG；方形：TiO₂，具有FITC-XG；菱形：TiO₂，具有FITC-XG和拟南芥木葡聚糖内糖基转移酶14(AtXET14)；三角形：FITC-XG，不具有TiO₂。

图12示出与FITC-标记的二氧化硅和VaXET16、木葡聚糖、木葡聚糖低聚物或如指示的组合一起孵育的各种测试织物的荧光图像。

图13示出与FITC-标记的二氧化硅和VaXET16、木葡聚糖、木葡聚糖低聚物或如指示的组合一起孵育的各种测试织物的平均荧光强度。

定义

如在此使用的，单数形式“一个”、“一种”和“该”旨在也包括复数形式，除非上下文清楚地另外指明。

复合的材料：术语“复合的材料”意指已经通过以一种方式组合2种或更多种组成材料而产生的材料，其中每种组成材料保持了该材料的特性，并且最终复合的材料具有不同于组成材料的特性的特性。复合的材料的实例是混凝土、金属(钢筋)强化混凝土、木塑复合建筑材料、木复合的材料、玻璃或碳纤维强化塑料、颗粒板、以及金属陶瓷复合的材料。

功能化的木葡聚糖低聚物：术语“功能化的木葡聚糖低聚物”意指短链木葡聚糖寡糖，包括单个或多个的重复单元的木葡聚糖，其已经通过掺入化学基团来修饰。该木葡聚糖低聚物分子量优选地是1至3kDa，对应于1至3个重复木葡聚糖单元。该化学基团可以是感兴趣的化合物或反应性基团，如醛基团、氨基基团、芳香族基团、羧基基团、卤素基团、羟基基团、酮基团、腈基团、硝基基团、巯基基团、或磺酸盐基团。掺入的反应性基团可以用感兴趣的化合物进行衍生化，或可以用于配合金属阳离子和/或结合与这些反应性基团相互作用(例如，共价地、疏水地、静电地等)的其他化学实体。该衍生化可以直接在包括反应性基团的功能化的木葡聚糖低聚物上进行，或者在将包括反应性基团的功能化木葡聚糖低聚物掺入聚合木葡聚糖后进行。可替代地，该木葡聚糖低聚物可以通过使用包含于该化合物中的反应性基团直接合并化合物来功能化，该反应性基团是，例如，醛基团、氨基基团、芳香族基团、羧基基团、卤素基团、羟基基团、酮基团、腈基团、硝基基团、巯基基团、或磺酸盐基团。在此可互换使用术语“功能化的木葡聚糖低聚物”和“包括化学基团的、功能化的木葡聚糖低聚物”。

连接的材料：术语“连接的材料”意指以一种将材料连接或桥连在一起的方式通过木葡聚糖连接的、通过木葡聚糖交联的、或用木葡聚糖包覆在上面的两种或更多种材料。在一个实施例中，在材料之间的连接是经由与该两种或更多种材料形成共价或非共价关联的木葡聚糖或木葡聚糖衍生物发生的。在一个实施例中，在材料之间的连接是经由与一种或多种材料形成共价或非共价关联的木葡聚糖发生的，该木葡聚糖共价连接至一种化学基团或材料。在另一个实施例中，连接的材料通过相同材料的两个或更多个分子之间的木葡聚糖关联被截留或捕获。在另一个实施例中，通过木葡聚糖内糖基转移酶的活性，在材料之间的连接被优化、强化、或在数目上增加。

聚合木葡聚糖：术语“聚合木葡聚糖”意指包含不止一个重复单元的木葡聚糖(例如，多个重复单元的木葡聚糖)的短、中或长链木葡聚糖寡糖或多糖。最优化地，聚合木葡聚糖包含50-200kDa数均分子量的木葡聚糖，对应于50-200个重复单元。木葡聚糖的重复基序由以下构成：四个β-(1-4)-D-吡喃葡萄糖残基的骨架，其中三个在O-6处具有单个α-D-吡喃木糖残基。这些木糖残基中的一些在O-2处是β-D-吡喃半乳糖基化的，并且这些半乳糖残基中的一些在O-2处是α-L-吡喃海藻糖基化的。术语“木葡聚糖”在此被理解为意指聚合木葡聚糖。

用化学基团功能化的聚合木葡聚糖：术语“用化学基团功能化的聚合木葡聚糖”意指通过合并化学基团修饰的聚合木葡聚糖。聚合木葡聚糖是包含不止一个重复单元的木葡聚糖(例如，多个重复单元的木葡聚糖)的短、中或长链木葡聚糖寡糖或多糖。聚合木葡聚糖包含50-200kDa数均分子量的木葡聚糖，对应于50-200个重复单元。木葡聚糖的重复基序由以下构成：四个β-(1-4)-D-吡喃葡萄糖残基的骨架，其中三个在O-6处具有单个α-D-吡喃木糖残基。该化学基团可以是感兴趣的化合物或反应性基团，如醛基团、氨基基团、芳香族基团、羧基基团、卤素基团、羟基基团、酮基团、腈基团、硝基基团、巯基基团、或磺酸盐基团。可以通过在木葡聚糖内糖基转移酶的存在下，将聚合木葡聚糖与功能化的木葡聚糖低聚物反应，来将化学基团掺入聚合木葡聚糖。然后可以将掺入的化学性基团与感兴趣的化合物衍生化。该衍生化可以直接在包括反应性基团的功能化的聚合木葡聚糖上进行，或者在将包括反应性基团的功能化木葡聚糖低聚物掺入聚合木葡聚糖后进行。可替代地，该聚合木葡聚糖可以通过使用包含于该化合物中的反应性基团直接合并化合物来功能化，该反应性基团，例如，醛基团、氨基基团、芳香族基团、羧基基团、卤素基团、羟基基团、酮基团、腈基团、硝基基团、巯基基团、或磺酸盐基团。

木葡聚糖内糖基转移酶：术语“木葡聚糖内糖基转移酶”意指木葡聚糖：木葡聚糖内糖基转移酶(EC 2.4.1.207)，该酶催化木葡聚糖骨架中β-(1→4)键的裂解，并且转移该木葡聚糖基区段到受体非还原末端葡萄糖残基的O-4上，该受体可以是木葡聚糖或木葡聚糖的寡糖。木葡聚糖内糖基转移酶又称木葡聚糖内糖基转移酶/水解酶或内切木葡聚糖转移酶。一些木聚糖内糖基转移酶可以具有不同活性，这些活性包括木葡聚糖和甘露聚糖内糖基转移酶活性。例如，来自成熟的木瓜水果的木聚糖内糖基转移酶可以使用杂木聚糖，如小麦阿拉伯糖基木聚糖、桦木葡糖醛酸木聚糖、及其他作为供体分子。这些木聚糖可能与木葡聚糖发挥类似的作用，同时成本便宜很多，因为它们可以，例如，从纸浆厂废液和/或未来生物质生物炼制中提取。

通过本领域中的那些技术人员，使用任何以下方法，可以评估木葡聚糖内糖基转移酶活性。当在木葡聚糖内糖基转移酶的存在下用摩尔过量的木葡聚糖低聚物孵育时，木葡聚糖聚合物的平均分子量的减少可以通过液相层析(苏鲁瓦(Sulova)等人，2003，植物生理生化(Plant Physiol.Biochem.)41:431-437)或通过乙醇沉淀(山中(Yaanaka)等人，2000，食品胶体(Food Hydrocolloids)14:125-128)，随后通过重量或纤维素结合分析(弗里(Fry)等人，1992，生物化学杂志(Biochem.J.)282:821-828)来确定，或可以在碱性条件下通过与碘结合在比色上来进行评估(苏鲁瓦(Sulova)等人，1995，分析生物化学(Analytical Biochemistry)229:80-85)。在木葡聚糖内糖基转移酶的存在下，通过用木葡聚糖孵育功能化的低聚物，将功能化的木葡聚糖低聚物掺入到木葡聚糖聚合物中可以，例如，通过用木葡聚糖和木葡聚糖内糖基转移酶孵育放射性标记的木葡聚糖低聚物，随后进行滤纸结合和滤纸放射性的测量来评估，或者荧光或光功能化的木聚糖低聚物的掺入可以类似地，通过监测荧光或比色分析滤纸进行评估。

木葡聚糖低聚物：术语“木葡聚糖低聚物”意指短链木葡聚糖寡糖，包括单个或多个重复单元的木葡聚糖。最优化地，该木葡聚糖低聚物分子量将是1至3kDa，对应于1至3个重复木葡聚糖单元。

本发明详细说明

本发明涉及用于功能化材料的方法，这些方法包括在导致一种包括用化学基团功能化的聚合木葡聚糖的经修饰的材料的条件下，用选自下组的组合物处理该材料，该组由以下各项组成：(a)组合物，包括木葡聚糖内糖基转移酶、聚合木葡聚糖、和包含化学基团的功能化的木葡聚糖低聚物；(b)组合物，包括木葡聚糖内糖基转移酶、用化学基团功能化的聚合木葡聚糖、和包含化学基团的功能化的木葡聚糖低聚物；(c)组合物，包括木葡聚糖内糖基转移酶、用化学基团功能化的聚合木葡聚糖、和木葡聚糖低聚物；(d)组合物，包括木葡聚糖内糖基转移酶、聚合木葡聚糖、和木葡聚糖低聚物；(e)组合物，包括木葡聚糖内糖基转移酶和用化学基团功能化的聚合木葡聚糖；(f)组合物，包括木葡聚糖内糖基转移酶和聚合木葡聚糖；(g)组合物，包括木葡聚糖内糖基转移酶和包含化学基团的功能化的木葡聚糖低聚物；(h)组合物，包括木葡聚糖内糖基转移酶和木葡聚糖低聚物，以及(i)不具有木葡聚糖内糖基转移酶的(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、或(h)的组合物，其中该经修饰的材料与未经修饰的材料相比具有改进的特性。

本发明还涉及用于连接材料的方法，这些方法包括在产生两种或更多种材料之间的连接形成的条件下，用组合物处理该两种或更多种材料，该组合物选自下组，该组由以下各项组成：(a)组合物，包括木葡聚糖内糖基转移酶、聚合木葡聚糖、和包含化学基团的功能化的木葡聚糖低聚物；(b)组合物，包括木葡聚糖内糖基转移酶、用化学基团功能化的聚合木葡聚糖、和包含化学基团的功能化的木葡聚糖低聚物；(c)组合物，包括木葡聚糖内糖基转移酶、用化学基团功能化的聚合木葡聚糖、和木葡聚糖低聚物；(d)组合物，包括木葡聚糖内糖基转移酶、聚合木葡聚糖、和木葡聚糖低聚物；(e)组合物，包括木葡聚糖内糖基转移酶和用化学基团功能化的聚合木葡聚糖；(f)组合物，包括木葡聚糖内糖基转移酶和聚合木葡聚糖；(g)组合物，包括木葡聚糖内糖基转移酶和包含化学基团的功能化的木葡聚糖低聚物；(h)组合物，包括木葡聚糖内糖基转移酶和木葡聚糖低聚物，以及(i)不具有木葡聚糖内糖基转移酶的(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、或(h)的组合物。

本发明还涉及用于产生复合的材料的方法，这些方法包括在产生两种或更多种材料之间的关联的条件下，用组合物处理该两种或更多种材料，该组合物选自下组，该组由以下各项组成：(a)组合物，包括木葡聚糖内糖基转移酶、聚合木葡聚糖、和包含化学基团的功能化的木葡聚糖低聚物；(b)组合物，包括木葡聚糖内糖基转移酶、用化学基团功能化的聚合木葡聚糖、和包含化学基团的功能化的木葡聚糖低聚物；(c)组合物，包括木葡聚糖内糖基转移酶、用化学基团功能化的聚合木葡聚糖、和木葡聚糖低聚物；(d)组合物，包括木葡聚糖内糖基转移酶、聚合木葡聚糖、和木葡聚糖低聚物；(e)组合物，包括木葡聚糖内糖基转移酶和用化学基团功能化的聚合木葡聚糖；(f)组合物，包括木葡聚糖内糖基转移酶和聚合木葡聚糖；(g)组合物，包括木葡聚糖内糖基转移酶和包含化学基团的功能化的木葡聚糖低聚物；(h)组合物，包括木葡聚糖内糖基转移酶和木葡聚糖低聚物，或(i)不具有木葡聚糖内糖基转移酶的(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、或(h)的组合物。

本发明还涉及通过此类方法获得的功能化的、连接的、或复合的材料。

本发明还涉及功能化的、连接的、或复合的材料，这些材料包括(a)聚合木葡聚糖和包含化学基团的功能化的木葡聚糖低聚物；(b)用化学基团功能化的聚合木葡聚糖和包含化学基团的功能化的木葡聚糖低聚物；(c)用化学基团功能化的聚合木葡聚糖和木葡聚糖低聚物；(d)聚合木葡聚糖和木葡聚糖低聚物；(e)用化学基团功能化的聚合木葡聚糖；(f)聚合木葡聚糖；(g)包含化学基团的功能化的木葡聚糖低聚物；或(h)木葡聚糖低聚物。

本发明进一步涉及选自下组的组合物，该组由以下各项组成：(a)组合物，包括木葡聚糖内糖基转移酶、聚合木葡聚糖、和包含化学基团的功能化的木葡聚糖低聚物；(b)组合物，包括木葡聚糖内糖基转移酶、用化学基团功能化的聚合木葡聚糖、和包含化学基团的功能化的木葡聚糖低聚物；(c)组合物，包括木葡聚糖内糖基转移酶、用化学基团功能化的聚合木葡聚糖、和木葡聚糖低聚物；(d)组合物，包括木葡聚糖内糖基转移酶、聚合木葡聚糖、和木葡聚糖低聚物；(e)组合物，包括木葡聚糖内糖基转移酶和用化学基团功能化的聚合木葡聚糖；(f)组合物，包括木葡聚糖内糖基转移酶和聚合木葡聚糖；(g)组合物，包括木葡聚糖内糖基转移酶和包含化学基团的功能化的木葡聚糖低聚物；(h)组合物，包括木葡聚糖内糖基转移酶和木葡聚糖低聚物，以及(i)不具有木葡聚糖内糖基转移酶的(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、或(h)的组合物。

在一个实施例中，该组合物包括木葡聚糖内糖基转移酶，聚合木葡聚糖，和包括化学基团的、功能化的木葡聚糖低聚物。在另一个实施例中，该组合物包括木葡聚糖内糖基转移酶，用化学基团功能化的聚合木葡聚糖，和包括化学基团的、功能化的木葡聚糖低聚物。在另一个实施例中，该组合物包括木葡聚糖内糖基转移酶、用化学基团功能化的聚合木葡聚糖、和木葡聚糖低聚物。在另一个实施例中，该组合物包括木葡聚糖内糖基转移酶、聚合木葡聚糖、和木葡聚糖低聚物。在另一个实施例中，该组合物包括木葡聚糖内糖基转移酶和用化学基团功能化的聚合木葡聚糖。在另一个实施例中，该组合物包括木葡聚糖内糖基转移酶和聚合木葡聚糖。在另一个实施例中，该组合物包括木葡聚糖内糖基转移酶和包括化学基团的、功能化的木葡聚糖低聚物。在另一个实施例中，该组合物包括木葡聚糖内糖基转移酶和木葡聚糖低聚物。

在另一个实施例中，该组合物包括聚合木葡聚糖和包括化学基团的、功能化的木葡聚糖低聚物。在另一个实施例中，该组合物包括用化学基团功能化的聚合木葡聚糖、和包括化学基团的、功能化的木葡聚糖低聚物。在另一个实施例中，该组合物包括用化学基团功能化的聚合木葡聚糖、和木葡聚糖低聚物。在另一个实施例中，该组合物包括聚合木葡聚糖和木葡聚糖低聚物。在另一个实施例中，该组合物包括用化学基团功能化的聚合木葡聚糖。在另一个实施例中，该组合物包括聚合木葡聚糖。在另一个实施例中，该组合物包括含有化学基团的、功能化的木葡聚糖低聚物。在另一个实施例中，该组合物包括木葡聚糖低聚物。

本领域中熟知的是功能化的材料和表面功能化的材料是高度希望的以用于在广泛的产业中使用并且用于广泛应用。作为实例，对木料或木材、建筑材料、纺织品、塑料、食品、或包装等的抗微生物的、抗真菌的、和/或抗昆虫(杀昆虫)的功能化是高度希望的。在一个具体的相关实例中，在本领域高度希望的是开发廉价、稳健和/或柔性的具有针对各种化学的、放射学的或生物学化合物的亲和性或化学反应性的表面，以用于这些化合物的诊断、处置、清洁、隔离、或生物修复(例如，作为诊断或清洁擦布、或在更大规模上用于工业或环境清洁，其中该功能化的材料可以特异性地化学中和特定化合物或吸附它们，或者作为有抗性的自清洁式的或中和的表面)。

本领域中还熟知存在将矿物质与聚合物连接的需要。聚合物可以是合成的(例如，聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚四氟乙烯、聚乙烯、聚对苯二甲酸乙二酯等)或天然的(例如纤维素、纤维素衍生物、几丁质、蚕丝、碳纤维)。矿物质可以是有效的抗微生物剂，其为聚合物复合的材料赋予抗微生物特征(例如在抗微生物织物的生产中)。矿物质还可以赋予对紫外光的抗性，由此提供具有对日光损害的抗性的聚合物(例如，漆，聚氨酯，密封剂，清漆，树脂，乙烯基墙板、储室或乙烯基户外玩具等)。在本领域中还存在向柔性的、薄的或易于成形的材料(例如，有光活性的织物，柔性的电视、智能手机和电脑显示器等)赋予特定导电性、磁特性、或特定光学特性的期望。在LED、OLED和触摸屏等的合成中，矿物质与塑料聚合物关联或夹于塑料聚合物之间。因此，在本领域中对于用矿物质将塑料表面功能化以增强或改进这些物品的制造工艺存在需要。

本领域中还熟知对于通过例如将天然聚合物和合成聚合物进行共混来开发复合的材料存在需要。实例包括建筑材料(例如复合木料或甲板材料)以及织物和纺织品共混物(例如棉-人造丝、聚酯-棉等)。在这些组分材料之间增强的关联或连接可以增强拉伸强度或其他物理特性，允许有更好成本效益的共混比率，并且改进制造工艺或降低制造工艺的成本(例如，通过消除或减少共混或连接试剂和化学品的需要)。还对于产生用于经由聚合物本身抑或经由具有改进的关联特性的功能化填料来改进合成聚合物和天然聚合物之间的关联(例如，乳胶或水基漆与木材或与油基漆的关联)的方法存在需要。在纺织品和服装制造中，已知包括合成聚合物(例如，尼龙、聚酯等)的纺织品感觉上不太自然，并且在本领域中对于在例如合成的纺织品运动装中产生更自然的或像棉的感觉、以及更像棉的性能存在需要。例如聚酯和棉或天然聚合物(例如木葡聚糖)的增强的共混可以用于产生所希望的性能和感觉上的改进。

在一方面，该功能化可以提供任何功能上有用的化学部分。在另一方面，该连接可以提供任何功能上有用的复合物。

材料的功能化可以在任何有用的介质中进行。在一个实施例中，该介质是水性介质。在另一个实施例中，该介质是部分水性的介质。在另一方面，该介质是浆液。在另一方面，该介质是水性浆液。在另一方面，该介质是非水性浆液。在另一方面，该介质是部分水性的浆液。在另一方面，该介质是蜡质悬浮液。在另一方面，该介质是乳液。

此外，可以采用木葡聚糖酶、内切-β-1-4葡聚糖酶、纤维素酶、或其组合和木葡聚糖内糖基转移酶以便允许如所希望的酶促去除功能化和重新引入功能化。将该随后去功能化的材料通过添加用化学基团功能化的聚合木葡聚糖或功能化的木葡聚糖低聚物和木葡聚糖内糖基转移酶来进行再功能化。

在组合物中，该木葡聚糖内糖基转移酶优选地以约0.1nM至约1mM，例如，约10nM至约100μM或约0.5μM至约5μM存在。

该聚合木葡聚糖或用化学基团功能化的聚合木葡聚糖优选地是以约10mg至约1g/g组合物，例如，约100mg至约950mg或约500mg至约900mg/g组合物存在。

当在没有聚合木葡聚糖或用化学基团功能化的聚合木葡聚糖的情况下，该木葡聚糖低聚物或功能化的木葡聚糖低聚物存在时，该木葡聚糖低聚物或功能化的木葡聚糖低聚物优选地以约10mg至约1g/g组合物，例如，约100mg至约950mg或约500mg至约900mg/g组合物存在。

当有聚合木葡聚糖或用化学基团功能化的聚合木葡聚糖的情况下存在时，该木葡聚糖低聚物或功能化的木葡聚糖低聚物在有木葡聚糖低聚物的情况下优选地是以木葡聚糖低聚物或功能化的木葡聚糖低聚物与聚合木葡聚糖或用化学基团功能化的聚合木葡聚糖约50:1至约0.5:1摩尔比，例如，木葡聚糖低聚物或功能化的木葡聚糖低聚物与聚合木葡聚糖或用化学基团功能化的聚合木葡聚糖约10:1至约1:1或约5:1至约1:1摩尔比存在。

该聚合木葡聚糖或用化学基团功能化的聚合木葡聚糖优选地是以约1mg至约1g/g材料，例如，约10mg至约100mg或约20mg至约50mg/g材料存在。

当在没有聚合木葡聚糖或用化学基团功能化的聚合木葡聚糖的情况下，该木葡聚糖低聚物或功能化的木葡聚糖低聚物存在时，该木葡聚糖低聚物或功能化的木葡聚糖低聚物优选地以约1mg至约1g/g材料，例如，约10mg至约100mg或约20mg至约50mg/g材料存在。

当有聚合木葡聚糖或用化学基团功能化的聚合木葡聚糖的情况下存在时，该木葡聚糖低聚物或功能化的木葡聚糖低聚物优选地是以约50:1至约0.5:1，例如，木葡聚糖低聚物或功能化的木葡聚糖低聚物与聚合木葡聚糖或用化学基团功能化的聚合木葡聚糖约10:1至约1:1或约5:1至约1:1摩尔比存在。

该木葡聚糖内糖基转移酶优选地是以约0.1nM至约1mM，例如，约10nM至约100μM或约0.5μM至约5μM存在。

掺入材料中的聚合木葡聚糖、用化学基团功能化的聚合木葡聚糖、木葡聚糖低聚物、或包括化学基团的、功能化的木葡聚糖低聚物的浓度为约0.01g至约500mg/g材料，例如，约0.1g至约50mg或约1至约5mg/g材料。

材料

在本发明的方法中，该材料可以是任何材料。该材料可以是纤维素材料(例如，纸、板、纸浆、棉、羊毛、纱、黄麻、纤维素生物质和木质纤维素生物质)。在一个实施例中，该纤维素材料由纯化的或半纯化的纤维素(例如滤纸、棉)构成。在另一个实施例中，该纤维素材料由未纯化的、粗的或富集的纤维素(例如生物质、木质纤维素)构成。在另一个实施例中，该纤维素材料是纤维素的衍生物(例如乙酸纤维素、羧甲基纤维素、人造丝、纤维胶、以及硝酸纤维素漆)。

该材料还可以是天然的非纤维素聚合物(例如琥珀、虫胶)。

该材料还可以是合成聚合物(例如聚苯乙烯、聚乙烯、聚对苯二甲酸乙二酯、聚氯乙烯、聚丙烯、聚丙烯腈、聚四氟乙烯、聚氨酯、丙烯酸、乳胶、氨纶、尼龙、聚丙烯酰胺、聚丙烯酸、聚乳酸、以及硅酮)。在一个实施例中，该合成聚合物形成为织物或纺织品。在另一个实施例中，该合成聚合物用作塑料。在另一个实施例中，该合成聚合物是热固性材料。在另一个实施例中，该合成聚合物是塑化剂。

该材料还可以是同聚物、共聚物、或杂聚物(例如，ABS塑料、SBR、丁腈橡胶、苯乙烯-异戊二烯-苯乙烯、苯乙烯-丁二烯、乙烯-乙酸乙烯酯)。

该矿物质还可以是如下矿物质(例如，高岭土、二氧化硅、氧化钛(IV)、金红石、锐钛矿、氧化铝、氢氧化铝、氧化铁、硫化铁、磁铁矿、黄铁矿、赤铁矿、铁素体、硫复铁矿、碳酸钙、方解石、霰石、石英、锆石、橄榄石、斜方辉石、电气石、蓝晶石、钠长石、钙长石、斜辉石、正长石、石膏、红柱石、滑石、萤石、磷灰石、正长石、黄玉、刚玉、钻石、锡、氧化锡、锑、氧化锑、铍、钴、铜、长石、镓、铟、铅、锂、锰、云母、钼、镍、珍珠岩、铂系金属、磷和磷酸盐岩、钾碱、稀土元素、钽、钨、钒、沸石、锌和氧化锌、以及氧化铟锡)。在一个实施例中，如开采或提取的来使用这些矿物质。在另一个实施例中，对这些矿物质以本领域技术员熟悉的方式进行精制或纯化。在一个优选实施例中，这些矿物质是提供与木葡聚糖或功能化的木葡聚糖更高的亲和性关联的金属氢氧化物或金属氧化物。在另一个实施例中，对矿物质的金属晶格或晶格进行掺杂以向该材料提供另外的特征。

改进的特性

根据本发明的方法对材料进行处理赋予材料改进的特性。

该改进的特性可以是包括但不限于以下项的一种或多种改进：抗腐蚀性，耐腐性，抗衰性，抗氧化性，阻燃性或耐化学性，UV抗性，增强的色彩特性改进的染料或颜色吸收或保持，特异性亲和性，特异性化学反应性，杀真菌或抑真菌特性，除草或抑草特性，杀细菌或抑细菌特性，杀微生物或抑制微生物特性非特异性亲和性，针对特定化学品、化学基团、毒素、金属、盐、离子、多肽或所希望的包括生物学的、放射学的、化学等的分析物的化学反应性或亲和性或者对这些物质的抗性，增强的防水性，耐气候性，增强的拉伸强度，耐撕裂性，改变的或改进的光学特性，传导特性，热特性，酶活性，非酶催化活性，共混或关联特性，抗皱性，抗堆积性，抗缩性，表面特性，疏水性，亲水性，感觉，质地，或手感特性，磁特性，流变学，以及组成特性。

在一方面，该改进的特性是抗腐蚀性。在另一方面，该改进的特性是耐腐性。在另一方面，该改进的特性是抗衰性。在另一方面，该改进的特性是抗氧化性。在另一方面，该改进的特性是阻燃性。在另一方面，该改进的特性是耐化学性。在另一方面，该改进的特性是UV抗性。在另一方面，该改进的特性是增强的色彩特性。在另一方面，该改进的特性是改进的染料或颜色吸收或保持。在另一方面，该改进的特性是特异性亲和性。在另一方面，该改进的特性是特异性化学反应性。在另一方面，该改进的特性是杀真菌或抑真菌特性。在另一方面，该改进的特性是除草或抑草特性。在另一方面，该改进的特性是杀细菌或抑细菌特性。在另一方面，该改进的特性是杀微生物或抑制微生物特性。在另一方面，该改进的特性是非特异性亲和性。在另一方面，该改进的特性是针对特定化学品、化学基团、毒素、金属、盐、离子、多肽或所希望的分析物的化学反应性或亲和性，或者对这些物质的抗性。在另一方面，该改进的特性是增强的防水性。在另一方面，该改进的特性是耐气候性。在另一方面，该改进的特性是增强的拉伸强度。在另一方面，该改进的特性是耐撕裂性。在另一方面，该改进的特性是改变的或改进的光学特性。在另一方面，该改进的特性是传导特性。在另一方面，该改进的特性是热特性。在另一方面，该改进的特性是酶活性。在另一方面，该改进的特性是非酶催化活性。在另一方面，该改进的特性是共混或关联特性。在另一方面，该改进的特性是抗皱性。在另一方面，该改进的特性是抗堆积性。在另一方面，该改进的特性是抗缩性。在另一方面，该改进的特性是表面特性。在另一方面，该改进的特性是疏水性。在另一方面，该改进的特性是亲水性。在另一方面，该改进的特性是感觉。在另一方面，该改进的特性是质地。在另一方面，该改进的特性是手感特性。在另一方面，该改进的特性是磁特性。在另一方面，该改进的特性是流变学。在另一方面，该改进的特性是组成特性。

聚合木葡聚糖

在本发明的方法中，该聚合木葡聚糖可以是任何木葡聚糖。在一方面，该聚合木葡聚糖获得自自然来源。在另一方面，该聚合木葡聚糖是通过由本领域技术人员所使用的任何手段从组分碳水化物、UDP-或GDP-碳水化合物、或卤化的碳水化合物来合成的。在另一方面，聚合木葡聚糖的自然来源是罗望子或罗望子内核粉末、旱金莲属、或旱金莲属植物具体地旱金莲。该聚合木葡聚糖的自然来源可以是各种双子叶植物的种子，这些双子叶植物如孪叶豆(Hymenaea courbaril)，豆科-云实亚科，其包括Cynometreae、Amherstieae、和Sclerolobieae属。该聚合木葡聚糖的自然来源还可以是报春花目、番荔枝科、沼花科、蜜花科、胡麻科、和旱金莲科或山牵牛亚科的植物的种子。该聚合木葡聚糖的自然来源还可以是风仙花科、爵床科、亚麻科、毛茛科、无患子科、和山榄科或豆科蝶形花亚科的非胚乳成员的植物的种子。在另一方面，该聚合木葡聚糖的自然来源是双子叶植物的初生细胞壁。在另一方面，该聚合木葡聚糖的自然来源可以是非禾本科的单子叶植物的初生细胞壁。

该自然来源聚合木葡聚糖可以通过大量的沸水或热水提取，或通过本领域技术人员已知的其他方法来提取。在一方面，可以随后将该聚合木葡聚糖进行纯化，例如，通过在80％乙醇中沉淀。在另一方面，该聚合木葡聚糖是一种粗的或富集制品，例如，罗望子内核粉末。在另一方面，该合成的木葡聚糖可以通过自动化碳水化物合成来产生(西贝格(Seeberger)，化学通讯(Chem.Commun.)，2003，1115-1121)，或通过酶促聚合，例如，使用糖苷合成酶(斯派杜特(Spaduit)等人，2011，美国化学会志(J.Am.Chem.Soc.)133:10892-10900)。

在一方面，聚合木葡聚糖的平均分子量范围从约2kDa至约500kDa，例如，约2kDa至约400kDa、约3kDa至约300kDa、约3kDa至约200kDa、约5kDa至约100kDa、约5kDa至约75kDa、约7.5kDa至约50kDa、或约10kDa至约30kDa。在另一方面，重复单元的数量是约2至约500，例如，约2至约400、约3至约300、约3至约200、约5至约100、约7.5至约50、或约10至约30。在另一方面，重复单位是根据弗里(Fry)等人(植物生理学(Physiologia Plantarum)89:1-3,1993)的命名原则的G、X、L、F、S、T和J亚单元的任何组合。在另一方面，重复单元是为双子叶植物和非禾本的单子叶植物所共有的海藻糖化的或非海藻糖化的XXXG型聚合木葡聚糖。在另一方面，该聚合木葡聚糖是O-乙酰化的。在另一方面，该聚合木葡聚糖不是O-乙酰化的。在另一方面，该聚合木葡聚糖的侧链可以包含末端海藻糖基残基。在另一方面，该聚合木葡聚糖的侧链可以包含末端阿拉伯糖基残基。在另一方面，该聚合木葡聚糖的侧链可以包含末端木糖残基。

出于本发明的目的，在此引用的术语木葡聚糖是指聚合木葡聚糖。

木葡聚糖低聚物

在本发明的方法中，该木葡聚糖低聚物可以是任何木葡聚糖低聚物。该木葡聚糖低聚物可以通过将来自任何来源的聚合木葡聚糖降解或水解来获得。该木葡聚糖低聚物可以通过聚合木葡聚糖的酶促降解来获得，例如，通过用木葡聚糖酶或葡聚糖内切酶(内切-β-1-4-葡聚糖酶)定量或部分消化。该木葡聚糖低聚物可以从组分碳水化物、UDP-或GDP-碳水化合物、或卤化的碳水化合物通过本领域技术人员通常使用的任何手段来合成。

在一方面，木葡聚糖低聚物的平均分子量范围从0.5kDa至约500kDa，例如，约1kDa至约20kDa、约1kDa至约10kDa、或约1kDa至约3kDa。在另一方面，重复单元的数量是约1至约500，例如，约1至约20、约1至约10、或约1至约3。在本发明的方法中，该木葡聚糖低聚物最优地是尽可能短的(即，1个重复单位，或分子量约1kDa)来使每克的溶解的木葡聚糖低聚物的解度和溶液摩尔浓度最大化，同时针对木葡聚糖内糖基转移酶活性保持底物特异性。在另一方面，该木葡聚糖低聚物包括根据弗里(Fry)等人，(植物生理学(PhysiologiaPlantarum)89:1-3,1993)的命名原则的G(β-D吡喃葡萄糖基-)、X(α-D-吡喃木糖基-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖基-)、L(β-D-吡喃半乳糖基-(1→2)-α-D-吡喃木糖基-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖基-)、F(α-L-海藻糖-吡喃糖基-(1→2)-β-D-吡喃半乳糖基-(1→2)-α-D-吡喃木糖基-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖基-)、S(α-L-海藻阿拉伯糖基-(1→2)-α-D-吡喃木糖基-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖基-)、T(α-L-阿拉伯-海藻糖基-(1→3)-α-L-海藻阿拉伯糖基-(1→2)-α-D-吡喃木糖基-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖基-)、和J(α-L-吡喃半乳糖基-(1→2)-β-D-吡喃半乳糖基-(1→2)-α-D-吡喃木糖基-(1→6)-β-D-葡萄-吡喃糖基-)亚单元的任何组合。在另一方面，该木葡聚糖低聚糖是为双子叶植物和非禾本的单子叶植物所共有的XXXG七糖。在另一方面，该木葡聚糖低聚物是O-乙酰化的。在另一方面，该木葡聚糖低聚物非是O-乙酰化的。在另一方面，该木葡聚糖低聚物的侧链可以包含末端海藻糖基残基。在另一方面，该木葡聚糖低聚物的侧链可以包含末端阿拉伯糖基残基。在另一方面，该木葡聚糖低聚物的侧链可以包含末端木糖残基。

木葡聚糖低聚物和聚合木葡聚糖的功能化

该木葡聚糖低聚物可以通过掺入本领域中技术人员已知的任何化学基团来进行功能化。该化学基团可以是感兴趣的化合物或反应性基团，如醛基团、氨基基团、芳香族基团、羧基基团、卤素基团、羟基基团、酮基团、腈基团、硝基基团、巯基基团、或磺酸盐基团。

在一方面，该化学基团可以是醛基基团。

在另一方面，该化学基团是氨基基团。可以通过还原氨化，将该氨基基团掺入到聚合木葡聚糖中。可替代地，氨基基团可以是脂肪胺或芳香胺(例如，苯胺)。该脂肪胺可以是伯、仲、或叔胺。伯、仲、或叔胺分别是结合到一个、两个和三个碳的氮。在一方面，该伯胺是C₁-C₈，例如，乙胺。在另一方面，仲胺中的每个碳是C₁-C₈，例如，二乙胺。在另一方面，叔胺中的每个碳是C₁-C₈，例如，三乙胺。

在另一方面，该化学基团是芳香族基团。该芳香族基团可以是芳烃基团、芳基卤基团、酚基基团、苯胺基团、重氮基基团、或杂环基团。

在另一方面，该化学基团是羧基基团。该羧基基团可以是酰基卤、酰胺、羧酸、酯、或硫酯。

在另一方面，该化学基团是卤素基团。该卤素基团可以是氟、氯、溴、或碘。

在另一方面，该化学基团是羟基基团。

在另一方面，该化学基团是酮基基团。

在另一方面，该化学基团是腈基基团。

在另一方面，该化学基团是硝基基团。

在另一方面，该化学基团是巯基基团。

在另一方面，该化学基团是磺酸盐基团。

该化学反应性基团本身可以是赋予材料改进的特性的化学基团。

通过以此方式掺入化学反应性基团，本领域中的技术人员可以进一步用将向材料赋予希望的物理或化学特性的化合物(例如，大分子)使掺入的反应性基团衍生化。例如，掺入的化学基团可以与给予所希望性质的化合物反应来通过共价键将该基团掺入到木葡聚糖低聚物中。可替代地，该化学基团可以按可逆或不可逆方法结合到给予所希望性质的化合物上，并且通过非共价结合掺入该化合物。该衍生化可以直接在功能化的木葡聚糖低聚物上进行，或者在将功能化木葡聚糖低聚物掺入聚合木葡聚糖后进行。

可替代地，该木葡聚糖低聚物可以通过直接掺入赋予材料希望的物理或化学特性的化合物来进行功能化，该掺入是通过使用包含于化合物中的反应性基团或被掺入到该化合物中的反应性基团，如以上描述的任何基团来进行。

另一方面，该聚合木葡聚糖可以通过掺入以上描述的反应性化学基团来直接功能化。通过将反应性化学基团直接掺入聚合木葡聚糖，本领域中技术人员可以进一步用将赋予材料希望的物理或化学特性的化合物使掺入的反应性基团衍生化。通过直接将化合物掺入聚合木葡聚糖中，还可以将所希望的物理或化学性质直接赋予到材料中。

在一方面，该功能化是通过使木葡聚糖低聚物或聚合木葡聚糖的还原末端羟基反应来进行。在另一方面，除末端葡萄糖的位置4处的非还原羟基以外，可以使非还原羟基基团进行反应。在另一方面，除末端葡萄糖的位置4处的非还原羟基以外，可以使还原末端羟基和非还原羟基进行反应。

该化学官能团可以通过酶促修饰该木葡聚糖低聚物或聚合木葡聚糖，或通过非酶促化学反应来添加。在一方面，使用酶促修饰来添加化学官能团。在酶促修饰的一个实施例中，该酶促功能化是对酮或羧化物的氧化，例如，通过半乳糖氧化酶。在酶促修饰的另一个实施例中，酶促功能化是通过AA9家族氧化酶对酮或羧化物的氧化(前身为糖原水解酶家族61酶)。

在另一方面，该化学官能团是通过非酶促化学反应来添加的。在非酶促化学反应的一个实施例中，该反应是通过如通过罗伊(Roy)，等人，1984，加拿大化学杂志(Can.J.Chem.)62:270-275，或达尔帕萨多(Dalpathado)，等人，2005，分析和生物分析化学(Anal.Bioanal.Chem.)，381:1130-1137描述的碳水化合物的还原末端的还原氨化来掺入反应性氨基基团。在非酶促化学反应的另一个实施例中，该反应是通过将还原端羟基氧化成酮来掺入反应性酮基基团，例如，通过铜(II)。在非酶促化学反应的另一个实施例中，该反应是通过(2,2,6,6-四甲基-哌啶-1-基)氧基(TEMPO)、或其氧代铵盐，将非还原端羟基基团(例如，葡萄糖或半乳糖的非糖苷键位置6羟基)氧化，以产生如在(布拉吉(Bragd)等人，2002，碳水化合物聚合物(Carbohydrate Polymers)49:397-406，或布里顿(Breton)等人，2007，欧洲有机化学杂志(Eur.J.Org.Chem.)10:1567-1570)中所描述的醛或羧酸。

木葡聚糖低聚物或聚合木葡聚糖可以通过与包含不止一个(即，双功能的或多功能的)化学官能团的化合物化学反应来进行功能化，该化合物包括直接与木葡聚糖低聚物或聚合木葡聚糖反应的至少一个化学官能团。在一方面，该双功能化学基团是包含伯胺和第二化学官能团的烃。该第二官能团可以是任何以上描述的其他基团。在一些方面中，这两种官能团通过本领域中熟知的各种长度的烃链(接头)来分离。

木葡聚糖低聚物或聚合木葡聚糖可以用感兴趣的化合物通过逐步或协同反应来进行功能化，其中该木葡聚糖低聚物或聚合木葡聚糖是如以上所述进行功能化的，并且该化合物对其引入的功能具有反应性。在由功能化的木葡聚糖低聚物偶联的一方面中，通过还原氨化，将氨基基团首先掺入木葡聚糖低聚物中，并且随后将反应性羰基连接到所引入的氨基基团上。在由氨基修饰的木葡聚糖低聚物偶联的一方面中，该第二偶联步骤通过将N-羟基琥珀酰亚胺基(NHS)酯或亚氨酸酯偶联到引入的氨基基团，来掺入化学基团、化合物或高分子。在一个优选的实施例中，随后该偶联到氨基基团的NHS酯是单或双功能交联试剂的组分。在偶联到功能化的木葡聚糖或木葡聚糖低聚物上的另一方面，该第一反应步骤包括用巯基基团的功能化，通过在升高的温度下在还原剂的存在下用烷基硫代氨(NH₂-(CH₂)_n-SH)的还原氨化(马吉德(Magid)等人，1996，有机化学杂志(J.Org.Chem.)61:3849-3862)，或通过自由基偶合(王(Wang)等人，2009，Arkivoc xiv:171-180)，随后通过将马来酰亚胺基团反应成巯基。在一些方面中，如本领域中充分描述的，将该给予所希望性质的化合物中的反应性基团通过适当长度的烃链从其余化合物中分离出来。

可以通过直接反应或通过与木葡聚糖反应的化合物反应用来功能化聚合木葡聚糖或木葡聚糖低聚物的感兴趣的化合物的非限制性实例包括肽、多肽、蛋白、疏水基团、亲水基团、阻燃剂、染料、修色剂、特异性亲和标记物、非特异性亲和标记物、金属、金属氧化物、金属硫化物、矿物质、杀真菌剂、除草剂、杀微生物剂或抑制微生物剂、和非共价键分子。

在一方面，该化合物是肽。该肽可以是抗微生物肽，设计来降低过敏和免疫原性的“自体肽”、环肽、谷胱甘肽、或信号肽(如，速激肽、血管活性肠肽、胰多肽相关的肽、降钙素肽、脂肽、环脂肽、或其他肽)。

在另一方面，该化合物是多肽。该多肽可以是非催化活性的蛋白(即，结构或结合蛋白)、或催化活性的蛋白(即，酶)。该多肽可以是酶、抗体、或抗体酶。

在另一方面，该化合物是包括疏水基团的化合物。该疏水基团可以是聚氨酯、聚四氟乙烯、或聚偏氟乙烯。

在另一方面，该化合物是包括亲水基团的化合物。该亲水基团可以是甲基丙烯酸酯、甲基丙烯酰胺、或聚丙烯酸酯。

在另一方面，该化合物是阻燃剂。该阻燃剂可以是氢氧化铝或氢氧化镁。该阻燃剂还可以是包括有机卤素基团或有机磷基团的化合物。

在另一方面，该化合物是染料或颜料。

在另一方面，该化合物是特异性亲和标记物。该特异性亲和标记物可以是生物素、阿维丁、螯合基团、冠醚、血红素基团、非反应性底物类似物、抗体、靶抗原、或凝集素。

在另一方面，该化合物是非特异性亲和标记物。该非特异性亲和标记物可以是聚阳离子基团、聚阴离子基团、磁性颗粒(例如，磁铁矿)、疏水基团、脂肪族基团、金属、金属氧化物、金属硫化物、或分子筛。

在另一方面，该化合物是杀真菌剂。该杀真菌剂可以是包括如下的化合物：二羧酰亚胺基团(如烯菌酮)、苯基吡咯基团(如咯菌腈)、氯苯基基团(如五氯硝苯)、氯硝基苯(如二氯硝基苯胺)、三二唑(triadiazole)基团(如土菌灵)、二硫代氨基甲酸酯基团(如代森锰锌或二甲基二硫代氨基甲酸酯)、或无机分子(如铜或硫)。在另一方面，该杀真菌剂是细菌或细菌孢子如芽胞杆菌属或芽胞杆菌属孢子。

在另一方面，该化合物是除草剂。该除草剂可以是草甘磷、合成的植物激素(如包括如下的化合物：2,4-二氯苯氧乙酸基团、2,4,5-三氯苯氧乙酸基团、2-甲基-4-氯苯氧乙酸基团、2-(2-甲基-4-氯苯氧基)丙酸基团、2-(2,4-二氯苯氧基)丙酸基团、或(2,4-二氯苯氧基)丁酸基团)、或包括三嗪基团的化合物(如莠去津(2-氯-4-(乙氨基)-6-异丙氨基)-s-三嗪)。

在另一方面，该化合物是杀菌或抑菌化合物。该杀菌或抑菌化合物可以是铜或铜合金(如黄铜、青铜、白铜、或铜镍锌合金)、磺酰胺基团(如磺胺甲噁唑、磺胺索嘧啶、磺胺醋酰或磺胺哒嗪)、银或有机银基团、TiO₂、ZnO₂、抗微生物肽、或壳聚糖。

在另一方面，该化合物是非共价接头分子。

在另一方面，该化合物是修色剂。该修色剂可以是染料、荧光增白剂、修色剂、或媒染剂(例如，矾、铬矾)。

在另一方面，该化合物是金属。

在另一方面，该化合物是半导体。该半导体可以是有机半导体、二元或三元化合物、或半导体元件。

在另一方面，该化合物是抗UV化合物。该抗UV化合物可以是锌或ZnO₂、高岭土、铝、氧化铝、或其他抗UV化合物。

在另一方面，该化合物是抗氧化剂化合物。该抗氧化剂化合物可以是抗坏血酸盐、锰、碘化物、视黄醇、类萜、生育酚、类黄酮或其他抗氧化剂酚或多酚或其他抗氧化剂化合物。

功能化的材料和复合的材料的制备

在本发明的方法中，可以从任何材料制备功能化的材料。该材料可以通过在产生经修饰的材料的条件下用如下各项处理该材料来进行功能化：(a)组合物，包括木葡聚糖内糖基转移酶、聚合木葡聚糖、和包含化学基团的功能化的木葡聚糖低聚物；(b)组合物，包括木葡聚糖内糖基转移酶、用化学基团功能化的聚合木葡聚糖、和包含化学基团的功能化的木葡聚糖低聚物；(c)组合物，包括木葡聚糖内糖基转移酶、用化学基团功能化的聚合木葡聚糖、和木葡聚糖低聚物；(d)组合物，包括木葡聚糖内糖基转移酶、聚合木葡聚糖、和木葡聚糖低聚物；(e)组合物，包括木葡聚糖内糖基转移酶和用化学基团功能化的聚合木葡聚糖；(f)组合物，包括木葡聚糖内糖基转移酶和聚合木葡聚糖；(g)组合物，包括木葡聚糖内糖基转移酶和包含化学基团的功能化的木葡聚糖低聚物；(h)组合物，包括木葡聚糖内糖基转移酶和木葡聚糖低聚物，或(i)不具有木葡聚糖内糖基转移酶的(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、或(h)的组合物，其中该经修饰的材料与未经修饰的材料相比具有改进的特性。

一种连接的或复合的材料可以通过在产生两种或更多种材料之间的关联的条件下，用组合物处理该两种或更多种材料来制备，该组合物包括木葡聚糖内糖基转移酶、聚合木葡聚糖、以及包含化学基团的功能化的木葡聚糖低聚物。一种连接的或复合的材料还可以通过在产生两种或更多种材料之间的关联的条件下，用组合物处理该两种或更多种材料来制备，该组合物包括木葡聚糖内糖基转移酶、用化学基团功能化的聚合木葡聚糖、以及包含化学基团的功能化的木葡聚糖低聚物。一种连接的或复合的材料还可以通过在产生两种或更多种材料之间的关联的条件下，用组合物处理该两种或更多种材料来制备，该组合物包括木葡聚糖内糖基转移酶、用化学基团功能化的聚合木葡聚糖、以及木葡聚糖低聚物。一种连接的或复合的材料还可以通过在产生两种或更多种材料之间的关联的条件下，用组合物处理该两种或更多种材料来制备，该组合物包括木葡聚糖内糖基转移酶、聚合木葡聚糖、以及木葡聚糖低聚物。一种连接的或复合的材料还可以通过在产生两种或更多种材料之间的关联的条件下，用组合物处理该两种或更多种材料来制备，该组合物包括木葡聚糖内糖基转移酶以及用化学基团功能化的聚合木葡聚糖。一种连接的或复合的材料还可以通过在产生两种或更多种材料之间的关联的条件下，用组合物处理该两种或更多种材料来制备，该组合物包括木葡聚糖内糖基转移酶以及聚合木葡聚糖。一种连接的或复合的材料还可以通过在产生两种或更多种材料之间的关联的条件下，用组合物处理该两种或更多种材料来制备，该组合物包括木葡聚糖内糖基转移酶、以及包含化学基团的功能化的木葡聚糖低聚物。一种连接的或复合的材料还可以通过在产生两种或更多种材料之间的关联的条件下，用组合物处理该两种或更多种材料来制备，该组合物包括木葡聚糖内糖基转移酶以及木葡聚糖低聚物。

这些方法是通过(但不限于)增强的二氧化硅(SiO₂)或二氧化钛(TiO₂)与塑料的关联以允许组成材料的直接结合来举例说明。在本发明的方法中，可以将二氧化钛的浆液孵育在pH控制溶液中，即，缓冲溶液(例如柠檬酸钠)从pH 3至pH 9，例如，从pH 4至pH 8或从pH 5至pH 7，以从约1g/L至约10kg/L的浓度，例如，约10g/L至约1g/L或约40g/L至约100g/L包含木葡聚糖内糖基转移酶以及聚合木葡聚糖，具有或不具有功能化的木葡聚糖低聚物。该木葡聚糖内糖基转移酶可以是以约0.1nM至约1mM，例如，约10nM至约100μM或约0.5μM至约5μM存在。在一方面，该木葡聚糖内糖基转移酶是以320pg至约32mg的酶/g组成矿物质材料，例如，约160μg至约4mg的酶/g组成矿物质材料的浓度存在。当存在时，在有聚合木葡聚糖的情况下，该功能化的木葡聚糖低聚物可以按功能化的木葡聚糖低聚物与聚合木葡聚糖的约50:1至约0.5:1摩尔比，例如，功能化的木葡聚糖低聚物与聚合木葡聚糖的约10:1至约1:1或约5:1至约1:1摩尔比存在。该聚合木葡聚糖可以以约1mg/g组成矿物质材料至约1g/g组成矿物质材料，例如，约10mg至约100mg/g组成矿物质材料或者约20mg至约50mg/g组成矿物质材料存在。第二或另外的组成矿物质可以是基体成分、皮肤成分、核心成分、层压材料成分、树脂成分或强化组成材料。在此的非限制性实例中，第二组成材料是聚苯乙烯。在一个方面，在木葡聚糖内糖基转移酶的存在下将聚苯乙烯与聚合木葡聚糖-修饰的TiO₂或SiO₂孵育在缓冲溶液中。在另一方面，将聚苯乙烯添加至具有上述聚合木葡聚糖和木葡聚糖内糖基转移酶的TiO₂或SiO₂孵育物。在另一方面，在聚合木葡聚糖-修饰的TiO₂或SiO₂的存在下，在高于玻璃转变温度将聚苯乙烯进行加热，成形并且允许冷却。在另一方面，在添加TiO₂或SiO₂之前使聚苯乙烯成形。在复合物中TiO₂与聚苯乙烯的质量比可以是从约0.0001至1，例如约0.01至0.5或约0.1至约0.3。该孵育可以持续一段足够的时间，以便实现所希望的关联程度，例如，约瞬时至约72小时，约15分钟至约48小时，约30分钟至约24小时，或约1至约3小时。在一方面，该组成矿物质材料是从木葡聚糖内糖基转移酶和非结合的聚合木葡聚糖或功能化的木葡聚糖低聚物，通过例如在水中洗涤来进行分离。在本发明的另一方面，然后将该组成矿物质材料进行干燥。

在本发明的一方面，在组成材料的功能化之前将该聚合木葡聚糖进行功能化。可以将聚合木葡聚糖连同木葡聚糖内糖基转移酶以及功能化的木葡聚糖低聚物孵育在pH控制溶液中，产生用化学基团功能化的聚合木葡聚糖。然后可以通过本领域中已知的任何方法，但如乙醇沉淀举例说明的，将用化学基团功能化的聚合木葡聚糖与功能化的木葡聚糖低聚物分离。例如，可以将该反应混合物在80％(v/v)乙醇中孵育约1分钟至约24小时，例如，30分钟至20小时或12至15小时，在适当的速度下离心适当的时间长度，以使沉淀的、用化学基团功能化的聚合木葡聚糖成球粒(例如，在适当的2000x g下30分钟)，并且倒出该上清液。然后任选地将用化学基团功能化的聚合木葡聚糖进行干燥。在本发明的这个方面，然后将用化学基团功能化的聚合木葡聚糖与木葡聚糖内糖基转移酶和填料材料进行孵育。

木葡聚糖内糖基转移酶的来源

可以使用在适合于本发明方法的pH和温度下具有适合酶活性的任何木葡聚糖内糖基转移酶。优选的是，在广泛的pH和温度范围内，该木葡聚糖内糖基转移酶是有活性的。在实施例中，该木葡聚糖内糖基转移酶具有在约3至约10范围内的pH最佳值。在另一个实施例中，该木葡聚糖内糖基转移酶具有在约4.5至约8.5范围内的pH最佳值。在另一个实施例中，该木葡聚糖内糖基转移酶具有小于或等于约5℃的冷变性温度或约100℃或更高的熔解温度。在另一个实施例中，该木葡聚糖内糖基转移酶具有小于或等于20℃的冷变性温度或大于等于约75℃的熔解温度。

所使用的木葡聚糖内糖基转移酶的来源在本发明中并不是关键。因此，该木葡聚糖内糖基转移酶可以从任何来源，如植物、微生物、或动物来获得。

在一个实施例中，该木葡聚糖内糖基转移酶从植物来源中获得。木葡聚糖内糖基转移酶可以从豆科(同义词：豆科(Leguminosae和Papilionaceae))的子叶中获得，优选地菜豆属，具体地，绿豆。优选的单子叶植物是非禾本科的单子叶植物和百合的单子叶植物。木葡聚糖内糖基转移酶还可以从苔藓和苔类中来提取，如在弗里(Fry)等人，1992，生物化学杂志(Biochem.J.)282:821-828中所描述的。例如，该木葡聚糖内糖基转移酶可以从子叶中获得，即，双子叶植物或单子叶植物，具体地而言选自下组的双子叶植物，该组由以下各项组成：赤小豆、卡诺拉、花椰菜、棉、白杨或杂种白杨、马铃薯、油菜、大豆、向日葵、阿拉伯芥、烟草、和番茄，或选自下组的单子叶植物，该组由以下各项组成：小麦、水稻、玉米和甘蔗。参见，例如，WO 2003/033813和WO 97/23683。

在另一个实施例中，该木葡聚糖内糖基转移酶获得自拟南芥(GENESEQP:AOE11231、GENESEQP:AOE93420、GENESEQP:BAL03414、GENESEQP:BAL03622、或GENESEQP:AWK95154)；番木瓜(GENESEQP:AZR75725)；黄瓜(GENESEQP:AZV66490)；野胡萝卜(GENESEQP:AZV66139)；草地羊茅(GENESEQP:AZR80321)；大豆(GENESEQP:AWK95154或GENESEQP:AYF92062)；大麦(GENESEQP:AZR85056，GENESEQP:AQY12558，GENESEQP:AQY12559，或GENESEQP:AWK95180)；番茄(GENESEQP:ATZ45232)；蒺藜状苜蓿(GENESEQP:ATZ48025)；稻(GENESEQP:ATZ42485，GENESEQP:ATZ57524，或GENESEQP:AZR76430)；欧洲山杨(GENESEQP:AWK95036)；矮慈姑(GENESEQP:AZV66468)；双色高粱(GENESEQP:BAO79623或GENESEQP:BAO79007)；红豆(GENESEQP:ATZ61320)；或玉蜀黍(GENESEQP:AWK94916)。

在另一个实施例中，该木葡聚糖内糖基转移酶是具有水解和转糖基活性的木葡聚糖内糖基转移酶/水解酶(XTH)。在一个优选的实施例中，该转糖基作用与水解速率的比例是至少10^-2至10⁷，例如，10^-1至10⁶或10至1000。

木葡聚糖内糖基转移酶的产生

木葡聚糖内糖基转移酶可以从植物中提取。用于从植物中提取木葡聚糖内糖基转移酶的适合的方法描述于弗雷(Fry)等人，1992，生物化学杂志(Biochem.J.)282:821-828；苏鲁瓦(Sulova)等人，1998，生物化学杂志(Biochem.J.)330:1475-1480；苏鲁瓦(Sulova)等人，1995，分析生物化学(Anal.Biochem.)229:80-85；WO 95/13384；WO 97/23683；或EP562 836中。

木葡聚糖内糖基转移酶还可以是通过培养包含来自植物、微生物、或动物的适当的遗传信息的经转化宿主生物体来生产。通过本领域中已知的方法制备并培养转化体。

用于分离或克隆基因的技术是本领域中已知的并且包括从基因组DNA或cDNA、或其组合进行分离。来自基因组DNA的基因的克隆可以例如通过使用聚合酶链反应(PCR)或用以对具有共有的结构特征的克隆的DNA片段进行检测的表达库抗体筛选来实现。参见例如，伊尼斯(Innis)等人，1990，PCR：方法和应用指南(PCR：A Guide to Methods andApplication)，学术出版社(Academic Press)，纽约。可以使用其他核酸扩增程序例如连接酶链式反应(LCR)、连接激活转录(LAT)和基于多核苷酸的扩增(NASBA)。

核酸构建体可以构成包括一种编码木葡聚糖内糖基转移酶、可操作地连接至一个或多个控制序列的基因，该一个或多个控制序列在与这些控制序列相容的条件下指导该编码序列在一种适合的宿主细胞中的表达。可以用许多方式操作所述基因以便于木葡聚糖内糖基转移酶的表达。取决于表达载体，在基因插入载体之前对其进行操纵可以是令人希望的或必需的。用于利用重组DNA方法修饰多核苷酸的技术是本领域熟知的。

该控制序列可以是启动子，即，被宿主细胞识别以对编码木葡聚糖内糖基转移酶的多核苷酸进行表达的多核苷酸。启动子包含介导木葡聚糖内糖基转移酶的表达的转录控制序列。该启动子可以是在宿主细胞中显示出转录活性的任何多核苷酸，包括突变型、截短型及杂合型启动子，并且可以由编码与该宿主细胞同源或异源的细胞外或细胞内多肽的基因获得。

用于在细菌宿主细胞中指导核酸构建体的转录的合适启动子的实例是从以下基因中获得的启动子：解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、嗜热脂肪芽孢杆菌麦芽糖淀粉酶基因(amyM)、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因、苏云金芽孢杆菌cryIIIA基因(阿盖塞(Agaisse)和勒尔克吕(Lereclus)，1994，分子微生物学(MolecularMicrobiology)13:97-107)、大肠杆菌lac操纵子、大肠杆菌trc启动子(埃贡(Egon)等人，1988，基因(Gene)69:301-315)、天蓝链霉菌琼脂水解酶基因(dagA)、以及原核β-内酰胺酶基因(维拉-卡马洛夫(Villa-Kamaroff)等人，1978，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)75:3727-3731)以及tac启动子(德波尔(DeBoer)等人，1983，美国国家科学院院刊80:21-25)。其他启动子描述在吉尔伯特(Gilbert)等人，1980，科学美国人(Scientific American)242:74-94的“来自重组细菌的有用蛋白质(Useful proteinsfrom recombinant bacteria)”；以及在萨姆布鲁克(Sambrook)等人，1989，同上。串联启动子的实例披露在WO 99/43835中。

在丝状真菌宿主细胞中，用于指导核酸构建体的转录的合适启动子的实例是获得自以下各项的基因的启动子：构巢曲霉乙酰胺酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡萄糖淀粉酶(glaA)、米曲霉TAKA淀粉酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、尖镰孢胰蛋白酶-样蛋白酶(WO 96/00787)、镶片镰孢菌淀粉葡糖苷酶(WO 00/56900)、镶片镰孢菌Daria(达莉亚)(WO 00/56900)、镶片镰孢菌Quinn(奎恩)(WO 00/56900)、米黑根毛霉脂肪酶、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉木聚糖酶III、里氏木霉β-木糖苷酶，以及里氏木霉翻译延伸因子，连同NA2-tpi启动子(来自编码中性α-淀粉酶的曲霉属基因的修饰的启动子，其中已经用来自编码丙糖磷酸异构酶的曲霉属基因的未翻译的前导子替换未翻译的前导子；非限制性实例包括来自编码中性α-淀粉酶的黑曲霉基因的修饰的启动子，其中已经用来自编码丙糖磷酸异构酶的构巢曲霉或米曲霉基因的未翻译的前导子替换未翻译的前导子)；及其突变型、截短型及杂合型启动子。其他启动子在美国专利号6,011,147中描述。

在酵母宿主中，有用的启动子从以下的基因获得：酿酒酵母烯醇酶(ENO-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH1、ADH2/GAP)、酿酒酵母丙糖磷酸异构酶(TPI)、酿酒酵母金属硫蛋白(CUP1)、以及和酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。罗马诺斯(Romanos)等人，1992，酵母(Yeast)8:423-488描述了酵母宿主细胞的其他有用的启动子。

控制序列还可以是由宿主细胞识别以终止转录的转录终止子。该终止子可操作地连接至编码木葡聚糖内糖基转移酶的多核苷酸的3’-末端。在该宿主细胞中起作用的任何终止子都可以用于本发明中。

用于细菌宿主细胞的优选终止子是从克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprH)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(amyL)以及大肠杆菌核糖体RNA(rrnB)的基因获得。

丝状真菌宿主细胞的优选终止子是从以下各项的基因中获得的：构巢曲霉乙酰胺酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合成酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡萄糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶、尖孢镰刀菌胰蛋白酶样蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉木聚糖酶III、里氏木霉β-木糖苷酶、以及里氏木霉翻译延伸因子。

用于酵母宿主细胞的优选终止子是从以下各项的基因获得：酿酒酵母烯醇酶、酿酒酵母细胞色素C(CYC1)以及酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶。用于酵母宿主细胞的其他有用的终止子由罗马诺斯(Romanos)等人，1992，同上。

该控制序列还可以是在启动子下游并且在基因编码序列上游的mRNA稳定子区，它增加该基因的表达。

适合的mRNA稳定子区的实例是从以下获得的：苏云金杆菌cryIIIA基因(WO 94/25612)和枯草芽孢杆菌SP82基因(化(Hue)等人，1995，细菌学杂志(Journal ofBacteriology)177:3465-3471)。

该控制序列还可以是前导子，一种对宿主细胞翻译很重要的非翻译mRNA区域。该前导子可操作地连接至编码木葡聚糖内糖基转移酶的多核苷酸的5’-末端。可以使用在宿主细胞中起作用的任何前导序列。

用于丝状真菌宿主细胞的优选前导序列是从米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶的基因获得。

适用于酵母宿主细胞的前导序列从以下各项的基因获得：酿酒酵母烯醇酶(ENO-1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α因子、以及酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)。

控制序列还可以是一种聚腺苷酸化序列，可操作地连接至该多核苷酸的3’-末端并且当转录时由宿主细胞识别为将聚腺苷酸残基添加至所转录的mRNA的信号的序列。可以使用在宿主细胞中起作用的任何多腺苷酸化序列。

用于丝状真菌宿主细胞的优选聚腺苷酸化序列是从以下各项的基因获得：构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶以及尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶。

对于酵母宿主细胞有用的聚腺苷酸化序列在郭(Guo)和谢尔曼(Sherman)，1995，分子细胞生物学(Mol.Cellular Biol.)15:5983-5990中得以描述。

控制序列也可以是编码与木葡聚糖内糖基转移酶的N-末端连接并指导多肽进入细胞的分泌通路的信号肽的信号肽编码区。多核苷酸的编码序列的5’-端可以固有地包含在翻译阅读框中与编码多肽的编码序列的区段天然地连接的信号肽编码序列。可替代地，编码序列的5’-端可以包含对于该编码序列而言是外源的信号肽编码序列。在编码序列不天然地包含信号肽编码序列的情况下，可能需要外源信号肽编码序列。可替代地，外源信号肽编码序列可简单地替换天然的信号肽编码序列以便增强该多肽的分泌。然而，可以使用指导所表达多肽进入宿主细胞的分泌通路的任何信号肽编码序列。

用于细菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是从以下各项的基因获得的信号肽编码序列：芽孢杆菌属NCIB 11837产麦芽糖淀粉酶、地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶、地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶、嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT、nprS、nprM)以及枯草芽孢杆菌prsA。西蒙纳(Simonen)和帕尔瓦(Palva)，1993，微生物学评论(Microbiological Reviews)57:109-137描述了另外的信号肽。

用于丝状真菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是获得自以下各项的基因的信号肽编码序列：黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉TAKA淀粉酶、特异腐质霉纤维素酶、特异腐质霉内切葡聚糖酶V、柔毛腐质霉脂肪酶以及米黑毛霉天冬氨酸蛋白酶。

对于酵母宿主细胞有用的信号肽获得自以下项的基因：酿酒酵母α-因子和酿酒酵母转化酶。罗马诺斯(Romanos)等人，1992，见上文，描述了其他有用的信号肽编码序列。

控制序列还可以是编码位于一个木葡聚糖内糖基转移酶的N-末端的前肽的一种前肽编码序列。生成的多肽被称为前体酶(proenzyme)或多肽原(或在一些情况下被称为酶原(zymogen))。多肽原通常是无活性的并且可以通过催化切割或自身催化切割来自多肽原的前肽而转化为活性多肽。前肽编码序列可以从以下各项的基因获得：枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、嗜热毁丝霉漆酶(WO 95/33836)、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、以及酿酒酵母α-因子。

在信号肽序列和前肽序列二者都存在的情况下，该前肽序列定位成紧邻木葡聚糖内糖基转移酶的N-末端并且该信号肽序列定位成紧邻该前肽序列的N-末端。

不同的核苷酸和控制序列可以连接在一起以产生重组表达载体，该重组表达载体可以包括一个或多个便利的限制酶切位点以允许在这些位点处插入或取代编码该木葡聚糖内糖基转移酶的多核苷酸。可替代地，该多核苷酸可以通过将该多核苷酸或包括该多核苷酸的核酸构建体插入供表达的适当载体中来进行表达。在产生该表达载体时，该编码序列是位于该载体中，这样使得该编码序列与该供表达的适当控制序列可操作地连接。

重组表达载体可以是任何载体(例如，质粒或病毒)，其能够方便地进行重组DNA程序，并且能够引起多核苷酸的表达。载体的选择将典型地取决于该载体与有待引入该载体的宿主细胞的相容性。该载体可以是线性的或闭合的环状质粒。

该载体可以是自主复制载体，即，作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如，质粒、染色体外元件、微染色体或人工染色体。该载体可包含任何用以保证自我复制的要素。可替代地，该载体可以是这样一种载体，当它被引入该宿主细胞中时，被整合到基因组中并且与其中已整合了它的一个或多个染色体一起复制。此外，可以使用单一载体或质粒或两个或更多个载体或质粒(这些载体或质粒共同含有待引入宿主细胞的基因组中的总DNA)或转座子。

该载体优选包含允许方便地选择转化细胞、转染细胞、转导细胞等细胞的一个或多个选择性标记。选择性标记是这样一种基因，该基因的产物提供了杀生物剂抗性或病毒抗性、重金属抗性、营养缺陷型的原养型等。

细菌性选择性标记的实例是地衣芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌dal基因，或赋予抗生素抗性(例如氨苄青霉素、氯霉素、卡那霉素、新霉素、大观霉素或四环素抗性)的标记。用于酵母宿主细胞的适合的标记包括但不限于ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1、以及URA3。用于在丝状真菌宿主细胞中使用的选择性标记包括但不限于，adeA(磷酸核糖酰氨基咪唑-琥珀羧胺合酶)、adeB(磷酸核糖酰-氨基咪唑合酶)、amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(草丁膦乙酰转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)、pyrG(乳清酸核苷-5'磷酸脱羧酶)、sC(硫酸腺苷基转移酶)、以及trpC(邻氨基苯甲酸合酶)、连同其等效物。优选在曲霉属细胞中使用的是构巢曲霉或米曲霉amdS和pyrG基因以及吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)bar基因。优选在木霉属细胞中使用的是adeA、adeB、amdS、hph以及pyrG基因。

选择性标记可以是如在WO 2010/039889中描述的双选择性标记系统。在一个方面中，双选择性标记是hph-tk双选择性标记系统。

载体优选含有允许载体整合到宿主细胞的基因组中或载体在细胞中独立于基因组自主复制的一个或多个元件。

对于整合到该宿主细胞基因组中，该载体可以依靠编码该木葡聚糖内糖基转移酶的多核苷酸序列或用于通过同源或非同源重组整合到该基因组中的该载体的任何其他元件。可替代地，该载体可以包含用于指导通过同源重组而整合到宿主细胞基因组中的一个或多个染色体中的一个或多个精确位置的另外的多核苷酸。为了增加在精确位置整合的可能性，这些整合的元件应包含足够数量的核酸，例如100至10,000个碱基对、400至10,000个碱基对、以及800至10,000个碱基对，这些碱基对与对应的靶序列具有高度的序列一致性以提高同源重组的可能性。这些整合元件可以是与宿主细胞的基因组内的靶序列同源的任何序列。此外，这些整合元件可以是非编码多核苷酸或编码多核苷酸。另一方面，该载体可以通过非同源重组整合到宿主细胞的基因组中。

对于自主复制，该载体可以进一步包括使该载体能够在所讨论的宿主细胞中自主复制的复制起点。复制起点可以是在细胞中起作用的介导自主复制的任何质粒复制子。术语“复制起点(origin of replication)”或“质粒复制子(plasmid replicator)”意指使得质粒或载体可在体内复制的多核苷酸。

细菌复制起点的实例是允许在大肠杆菌中复制的质粒pBR322、pUC19、pACYC177、以及pACYC184的复制起点，以及允许在芽孢杆菌属中复制的质粒pUB110、pE194、pTA1060、以及pAMβ1的复制起点。

用于在酵母宿主细胞中使用的复制起点的实例是2微米复制起点ARS1、ARS4、ARS1与CEN3的组合以及ARS4与CEN6的组合。

在丝状真菌细胞内有用的复制起点的实例是AMA1和ANS1(格姆斯(Gems)等人，1991，基因(Gene)98:61-67；卡伦(Cullen)等人，1987，核酸研究(Nucleic Acids Res.)15:9163-9175；WO 00/24883)。AMA1基因的分离和包括该基因的质粒或载体的构建可以根据披露于WO 00/24883中的方法完成。

可以向宿主细胞中插入多于一个拷贝的多核苷酸，以增加木葡聚糖内糖基转移酶的产量。通过将序列的至少一个另外的拷贝整合到宿主细胞基因组中或者通过包括与该多核苷酸一起的可扩增的选择性标记基因可以获得多核苷酸的增加的拷贝数目，其中通过在适当的选择性试剂的存在下培养细胞可以选择包含选择性标记基因的经扩增的拷贝的细胞，以及由此该多核苷酸的另外的拷贝。

用于连接以上所描述的元件以构建重组表达载体的程序是本领域的普通技术人员熟知的(参见，例如，萨姆布鲁克(Sambrook)等人，1989，见上文)。

宿主细胞可以是在重组产生木葡聚糖内糖基转移酶中有用的任何细胞，例如原核细胞或真核细胞。

原核宿主细胞可以是任何革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。革兰氏阳性细菌包括，但不限于芽孢杆菌属、梭菌属、肠球菌属、土芽孢杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属、大洋芽孢杆菌属(Oceanobacillus)、葡萄球菌属、链球菌属和链霉菌属。革兰氏阴性细菌包括但不限于：弯曲杆菌属、大肠杆菌、黄杆菌属、梭杆菌属、螺杆菌属、泥杆菌属、奈瑟球菌属、假单胞菌属、沙门氏菌属、以及脲原体属。

细菌宿主细胞可以是任何芽孢杆菌属细胞，包括但不限于：嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚硬芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌以及苏云金杆菌细胞。

细菌宿主细胞还可以是任何链霉菌属细胞，包括但不限于：不产色链霉菌、除虫链霉菌、天蓝链霉菌、灰色链霉菌、以及浅青紫链霉菌细胞。

将DNA引入芽孢杆菌属细胞中可通过以下来实现：原生质体转化(参见例如，张(Chang)和科恩(Cohen)，1979，分子遗传学与基因组学(Mol.Gen.Genet.)168:111-115)、感受态细胞转化(参见例如，杨格(Young)和斯皮宰曾(Spizizen)，1961，细菌学杂志(J.Bacteriol.)81:823-829；或杜拜努(Dubnau)以及大卫杜夫-阿贝尔森(Davidoff-Abelson)，1971，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)56:209-221)、电穿孔(参见例如，茂川(Shigekawa)和道尔(Dower)，1988，生物技术(Biotechniques)6:742-751)、或者接合(参见例如，克勒(Koehler)和索恩(Thorne)，1987，细菌学杂志169:5271-5278)。将DNA引入大肠杆菌细胞中可通过以下来实现：原生质体转化(参见例如，哈纳汗(Hanahan)，1983，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)166:557-580)或电穿孔(参见例如，道尔(Dower)等人，1988，核酸研究(Nucleic Acids Res.)16:6127-6145)。将DNA引入链霉菌属细胞中可通过以下来实现：原生质体转化、电穿孔(参见例如，贡(Gong)等人，2004，叶线形微生物学(FoliaMicrobiol.)(Praha(布拉格))49:399-405)、接合(参见例如，马佐迪耶(Mazodier)等人，1989，细菌学杂志(J.Bacteriol.)171:3583-3585)、或转导(参见例如，伯克(Burke)等人，2001，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)98:6289-6294)。将DNA引入假单孢菌属细胞中可通过以下来实现：电穿孔(参见例如，蔡(Choi)等人，2006，微生物学方法杂志(J.Microbiol.Methods)64:391-397)或接合(参见例如，皮内多(Pinedo)和斯梅茨(Smets)，2005，应用与环境微生物学(Appl.Environ.Microbiol.)71:51-57)。将DNA引入链球菌属细胞中可通过以下来实现：天然感受态(参见，例如，佩里(Perry)和藏满(Kuramitsu)，1981，感染与免疫(Infect.Immun.)32:1295-1297)、原生质体转化(参见，例如，凯特(Catt)和乔力克(Jollick)，1991，微生物学(Microbios)68:189-207)、电穿孔(参见，例如，巴克利(Buckley)等人，1999，应用与环境微生物学(Appl.Environ.Microbiol.)65:3800-3804)、或者接合(参见，例如，克莱威尔(Clewell)，1981，微生物学评论(Microbiol.Rev.)45:409-436)。然而，可以使用本领域已知的用于将DNA引入宿主细胞中的任何方法。

宿主细胞还可以是真核细胞，如哺乳动物、昆虫、植物、或真菌细胞。

宿主细胞可以是真菌细胞。如在此使用的“真菌”包括子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)、以及接合菌门(Zygomycota)、连同卵菌门(Oomycota)和全部有丝分裂孢子真菌(如由霍克斯沃思(Hawksworth)等人在安斯沃思和拜斯比真菌词典(Ainsworth and Bisby’s Dictionary of The Fungi)，第8版，1995，国际应用生物科学中心(CAB International)，大学出版社(University Press)，英国剑桥(Cambridge，UK)中进行定义的)。

该真菌宿主细胞可以是酵母细胞。如在此所使用的“酵母”包括产子囊酵母(酵母目)、产担子酵母及属于不完全真菌的酵母(芽生菌目)。由于酵母的分类在将来可能有变化，出于本发明的目的，酵母应如酵母生物学和活动性(Biology and Activities ofYeast)(斯金纳(Skinner)、帕斯莫尔(Passmore)、以及达文波特(Davenport)编辑，应用细菌学学会讨论会(Soc.App.Bacteriol.Symposium)系列第9期，1980)所述地进行定义。

酵母宿主细胞可以是假丝酵母属、汉逊酵母属、克鲁弗酵母属、毕赤酵母属、酵母属、裂殖酵母属、或耶氏酵母属细胞，如乳酸克鲁弗酵母(Kluyveromyces lactis)、卡尔酵母、酿酒酵母、糖化酵母、道格拉氏酵母、克鲁弗酵母、诺地酵母、卵形酵母、或解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)细胞。

真菌宿主细胞可以是丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括真菌门(Eumycota)和卵菌门的亚门(如由霍克斯沃思(Hawksworth)等人，1995，见上文所定义)的所有丝状形式。丝状真菌通常的特征在于由壳多糖、纤维素、葡聚糖、壳聚糖、甘露聚糖、以及其他复杂多糖构成的菌丝体壁。营养生长是通过菌丝延伸，而碳分解代谢是专性需氧的。相反，酵母(如酿酒酵母)的营养生长是通过单细胞菌体的出芽(budding)，而碳分解代谢可以是发酵的。

丝状真菌宿主细胞可以是枝顶孢霉属、曲霉属、短梗霉属、烟管霉属(Bjerkandera)、拟腊菌属、金孢子菌属、鬼伞属、革盖菌属(Coriolus)、隐球菌属、线黑粉菌科(Filibasidium)、镰孢属、腐质霉属、梨孢菌属(Magnaporthe)、毛霉属、毁丝霉属、新美鞭菌属、链孢菌属、拟青霉属、青霉属、平革菌属、射脉菌属(Phlebia)、瘤胃壶菌属、侧耳属(Pleurotus)、裂褶菌属、篮状菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、弯颈霉属、栓菌属(Trametes)或木霉属细胞。

例如，丝状真菌宿主细胞可以是泡盛曲霉、臭曲霉、烟曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、黑刺烟管菌(Bjerkandera adusta)、干拟蜡菌(Ceriporiopsisaneirina)、卡内基拟蜡菌(Ceriporiopsis caregiea)、浅黄拟蜡孔菌(Ceriporiopsisgilvescens)、潘诺希塔拟蜡菌(Ceriporiopsis pannocinta)、环带拟蜡菌(Ceriporiopsisrivulosa)、微红拟蜡菌(Ceriporiopsis subrufa)、虫拟蜡菌(Ceriporiopsissubvermispora)、狭边金孢子菌(Chrysosporium inops)、嗜角质金孢子菌、卢克诺文思金孢子菌(Chrysosporium lucknowense)、粪状金孢子菌(Chrysosporium merdarium)、租金孢子菌、昆士兰金孢子菌(Chrysosporium queenslandicum)、热带金孢子菌、褐薄金孢子菌(Chrysosporium zonatum)、灰盖鬼伞(Coprinus cinereus)、毛革盖菌(Coriolushirsutus)、杆孢状镰孢、谷类镰孢、库威镰孢、大刀镰孢、禾谷镰孢、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖镰孢、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟分枝孢镰孢、硫色镰孢、圆镰孢、拟丝孢镰孢、镶片镰孢、特异腐质霉、柔毛腐质霉、米黑毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙链孢菌、产紫青霉、黄孢平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、射脉菌(Phlebia radiata)、刺芹侧耳(Pleurotus eryngii)、土生梭孢壳霉、长域毛栓菌(Trametes villosa)、变色栓菌(Trametes versicolor)、哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉、或绿色木霉细胞。

可以通过涉及原生质体形成、原生质体转化以及以本身已知的一种方式进行细胞壁再生的一个过程来转化真菌细胞。用于转化曲霉属和木霉属宿主细胞的适合程序描述于EP 238023、约尔顿(Yelton)等人，1984，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)81:1470-1474以及克里斯滕森(Christensen)等人，1988，生物/技术(Bio/Technology)6:1419-1422中。用于转化镰刀菌属物种的适合方法由马拉迪尔(Malardier)等人，1989，基因(Gene)78:147-156、以及WO 96/00787描述。可以使用由如以下文献描述的程序转化酵母：贝克尔(Becker)和瓜伦特(Guarente)，在阿贝尔森(Abelson)，J.N.和西蒙(Simon)，M.I.编，酵母遗传学与分子生物学指南，酶学方法(Guide to Yeast Genetics and MolecularBiology,Methods in Enzymology)，第194卷，第182-187页，学术出版社有限公司(Academic Press,Inc.)，纽约；伊藤(Ito)等人，1983，细菌学杂志(J.Bacteriol.)153:163；以及哈尼恩(Hinnen)等人，1978，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)75:1920。

所述宿主细胞使用本领域已知的方法在适合于产生所述木葡聚糖内糖基转移酶的营养培养基中培养。例如，可以通过摇瓶培养，或者在适合的培养基中并在允许该木葡聚糖内糖基转移酶表达和/或分离的条件下在实验室或工业发酵罐中进行小规模或大规模发酵(包括连续发酵、分批发酵、分批给料发酵或固态发酵)来培养该细胞。该培养是使用本领域中已知的程序，在适合的营养培养基中发生，该培养基包含碳源和氮源及无机盐。适合的培养基可从商业供应商获得或可以根据公开的组成(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)制备。如果木葡聚糖内糖基转移酶分泌到该营养培养基中，那么可直接从培养基中回收多肽。如果该木葡聚糖内糖基转移酶不被分泌，则可以从细胞裂解物中回收该物质。

可以使用特异性针对这些多肽的本领域已知的方法来检测该木葡聚糖内糖基转移酶。这些检测方法包括但不限于特异性抗体的使用、酶产物的形成或酶底物的消失。例如，可以使用酶测定来确定该多肽的活性。

可以使用本领域中已知的方法回收该木葡聚糖内糖基转移酶。例如，该多肽可以通过常规程序，包括但不限于，收集、离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀，从该营养培养基回收。在一个方面，回收包含多肽的整个发酵液。在一个优选方面，木葡聚糖内糖基转移酶产率可以通过随后在缓冲液或在缓冲洗涤剂溶液中洗涤细胞碎片以提取生物质相关的多肽来改进。

可以通过本领域中已知的多种程序来纯化该木葡聚糖内糖基转移酶以获得基本上纯的多肽，这些程序包括但不限于：色谱法(例如，离子交换色谱、亲和色谱、疏水作用色谱、复合型色谱、反相色谱、层析聚焦色谱、以及尺寸排阻色谱)、电泳程序(例如，制备型等电点聚焦)、差别溶解度(例如，硫酸铵沉淀)、PAGE、膜过滤或提取(参见例如，蛋白纯化(Protein Purification)，詹森(Janson)和赖登(Ryden)编辑，VCH出版社(VCHPublishers)，纽约，1989)。在一个优选方面，木葡聚糖内糖基转移酶可以通过用木葡聚糖形成共价酰基酶中间体，随后与微晶纤维素沉淀或吸附到纤维素膜上进行纯化。然后通过添加木葡聚糖低聚物来解析共价中间体来影响多肽的释放(苏鲁瓦(Sulova)和法卡斯(Farkas)，1999，蛋白表达与纯化(Protein Expression and Purification)16(2):231-235，和斯蒂尔(Steele)和弗里(Fry)，1999，生物化学杂志(Biochemical Journal)340:207-211)。

通过以下实施例进一步对本发明进行描述，但不应将其理解为对本发明范围的限制。

实例

培养基和溶液

COVE琼脂平板由以下各项构成：342.3g的蔗糖、252.54g的CsCl、59.1g的乙酰胺、520mg的KCl、520mg的MgSO₄·7H₂O、1.52g的KH₂PO₄、0.04mg的Na₂B₄O₇·10H₂O、0.4mg的CuSO₄-5H₂O、1.2mg的FeSO₄·7H₂O、0.7mg的MnSO₄·2H₂O、0.8mg的Na₂MoO₄·2H₂O、10mg的ZnSO₄·7H₂O、25g的纯净琼脂、以及加至1升的去离子水。

LB培养基由以下各项构成：10g的胰蛋白胨、5g的酵母提取物、5g的NaCl、以及去离子水补足至1升。

LB板由以下各项构成：10g的胰蛋白胨、5g的酵母提取物、5g的NaCl、15g的细菌琼脂(bacteriological agar)、以及加至1升的去离子水。

基本培养基琼脂板由以下各项构成：342.3g的蔗糖、10g的葡萄糖、4g的MgSO₄·7H₂0、6g的NaNO₃、0.52g的KCl、1.52g的KH₂PO₄、0.04mg的Na₂B₄O₇·10H₂O、0.4mg的CuSO₄·5H₂O、1.2mg的FeSO₄·7H₂O、0.7mg的MnSO₄·2H₂O、0.8mg的Na₂MoO₄·2H₂O、10mg的ZnSO₄·7H₂O、500mg的柠檬酸、4mg的D-生物素、20g的纯净琼脂、以及加至1升的去离子水。

合成的、缺少尿苷的确定成分培养基由18mg的腺嘌呤半硫酸盐、76mg的丙氨酸、76mg的精氨酸盐酸盐、76mg的天冬酰胺一水合物、76mg的天门冬氨酸、76mg的半胱氨酸盐酸盐一水合物、76mg的谷氨酸单钠盐、76mg的谷氨酰胺、76mg的甘氨酸、76mg的组氨酸、myo-76mg的肌醇、76mg的异亮氨酸、380mg的亮氨酸、76mg的赖氨酸单盐酸盐、76mg的蛋氨酸、8mg的对-氨基苯甲酸钾盐、76mg的苯丙氨酸、76mg的脯氨酸、76mg的丝氨酸、76mg的苏氨酸、76mg的色氨酸、76mg的酪氨酸二钠盐、76mg的缬氨酸、以及加至1升的去离子水。

TAE缓冲液由以下各项构成：4.84g的Tris碱、1.14ml的冰醋酸、2ml的0.5M EDTA(pH 8.0)、以及补足至1升的去离子水。

TBE缓冲液由以下各项构成：10.8g的Tris碱、5.5g的硼酸、4ml的0.5M EDTA(pH8.0)、以及补足至1升的去离子水。

2XYT加氨比西林板由以下构成：16g的胰蛋白胨、10g的酵母提取物、5g的氯化钠、15g的细菌琼脂(Bacto agar)、以及去离子水补足至1升。在高压蒸汽处理的培养基回火到55℃后，添加1ml的100mg/ml的氨比西林。

YP+2％葡萄糖培养基由10g的酵母提取物、20g的蛋白胨、20g的葡萄糖、以及补足至1升的去离子水构成。

YP+2％麦芽糊精培养基由10g的酵母提取物、20g的蛋白胨、20g的麦芽糊精、以及补足至1升的去离子水构成。

实例1：红豆木葡聚糖内糖基转移酶16的制备

根据以下描述的方案，红豆木葡聚糖内糖基转移酶16(VaXET16；SEQ ID NO:1[天然DNA序列]、SEQ ID NO:2[合成DNA序列]、和SEQ ID NO:3[推导的氨基酸序列]；还称为XTH1)重组产生于米曲霉MT3568中。米曲霉MT3568是米曲霉JaL355的amdS(乙酰胺酶)破坏的基因衍生物(WO 2002/40694)，其中通过用pyrG基因破坏米曲霉amdS基因恢复pyrG营养缺陷型。

构建载体pDLHD0012以在米曲霉中多拷贝表达VaXET16基因。使用大引物克隆，通过合并如下两种DNA片段来产生质粒pDLHD0012：包含VaXET16ORF和与载体pBM120具有同源性的侧翼序列(US 20090253171)的片段1，和由载体pBM120的反向PCR扩增子组成的片段2。

使用以下所示的引物613788(正义)和引物613983(反义)扩增片段1。这些引物被设计成包含与载体pBM120同源的序列的侧翼区(小写)，用于PCR片段之间的无连接克隆。

引物613788(正义)：

ttcctcaatcctctatatacacaactggccATGGGCTCGTCCCTCTGGAC(SEQ ID NO:7)

引物613983(反义)：

tgtcagtcacctctagttaattaGATGTCCCTATCGCGTGTACACTCG(SEQ ID NO:8)

片段1在反应中通过PCR来扩增，该反应由10ng的包括在Sac I和Kpn I位点之间所克隆的VaXET16合成基因(SEQ ID NO:3[合成DNA序列])的载体pMA、0.5μl的聚合酶(新英格兰生物实验室公司，伊普斯威奇，马萨诸塞州，美国)、20pmol的引物613788、20pmol的引物613983、1μl的10mM dNTP、10μl的5XHF缓冲液(新英格兰生物实验室公司，伊普斯威奇，马萨诸塞州，美国)、和35.5μl的水构成。在 (Eppendorf AG公司，汉堡，德国)中孵育该反应，程序为1个循环，在98℃下，持续30秒；以及30个循环，每个循环在98℃持续10秒，60℃持续10秒，以及72℃持续30秒。将得到的0.9kb PCR产物(片段1)用1μl的Dpn I(普洛麦格公司(Promega)，菲奇堡，威斯康辛州、美国)进行处理，以去除质粒模板DNA。将该Dpn I直接添加到PCR管中，良好混合，并且在37℃下孵育60分钟，并且然后根据制造商的说明，使用PCR纯化试剂盒(凯杰公司(QIAGEN Inc.)，巴伦西亚，加利福尼亚州，美国)进行柱纯化。

使用以下所示的引物613786(正义)和613787(反义)扩增片段2。

613786(正义)：

taattaactagaggtgactgacacctggc(SEQ ID NO:9)

613787(反义)：

catggccagttgtgtatatagaggattgagg(SEQ ID NO:10)

片段2在反应中通过PCR来扩增，该反应由10ng的质粒pBM120、0.5μl的DNA聚合酶、20pmol的引物613786、20pmol的引物613787、1μl的10mM dNTP、10μl的5XHF缓冲液、和35.5μl的水构成。在 中孵育该反应，程序为1个循环，在98℃下，持续30秒；以及30个循环，每个循环在98℃持续10秒，60℃持续10秒，以及72℃持续4分钟。将得到的6.9kb PCR产物(片段2)用1μl的Dpn I进行处理，以去除质粒模板DNA。将该Dpn I直接添加到PCR管中，良好混合，并且在37℃下孵育60分钟，并且然后根据制造商的说明，使用PCR纯化试剂盒进行柱纯化。

使用大引物克隆，使用以下程序来合并两个PCR片段。将片段1和2通过PCR在反应中合并，该反应由5μl的各自纯化的PCR产物、0.5μl的DNA聚合酶、1μl的10mMdNTP、10μl的5XHF缓冲液、和28.5μl的水构成。在 中孵育该反应，程序为1个循环，在98℃下，持续30秒；以及40个循环，每个循环在98℃持续10秒，60℃持续10秒，以及72℃持续4分钟。然后，根据制造商的说明，将2μl得到的PCR产物DNA转化到大肠杆菌ONETOP10电转化感受态细胞(生命技术公司，格兰德岛，纽约，美国)中。将5μl的转化细胞散布于每ml补充有100μg氨比西林的LB板上，并且在37℃下孵育过夜。将单个转化体挑入每ml补充有100μg的氨比西林的3ml的LB培养基中，并且在37℃下在250rpm的振荡下生长过夜。使用旋转迷你制备型试剂盒(凯杰公司(QIAGEN Inc.)，巴伦西亚，加利福尼亚州，美国)，将质粒DNA从菌落中进行纯化。将使用3130XL遗传分析仪(应用生物系统公司(Applied Biosystems)，福斯特城，加利福尼亚州，美国)的DNA测序用来确认最终质粒pDLHD0012中两种片段中的每种的存在(图1)。

根据以下方案，将米曲霉菌株MT3568用包括VaXET16基因的质粒pDLHD0012进行转化。将约2-5x 10⁷孢子的米曲霉菌株MT3568接种于500ml摇瓶中的100ml的YP+2％葡萄糖培养基中，并且在28℃和110rpm下孵育过夜。将10ml的过夜培养物在125ml无菌真空滤器中过滤，并且将菌丝用50ml的0.7M KCl-20mM CaCl₂洗涤两次。将剩余液体通过真空过滤去除，留下垫在滤器上。将菌丝体再悬浮于10ml的0.7M KCl-20mM CaCl₂中，并且转移至无菌125ml摇瓶中，该摇瓶包含20mg的200G(诺维信瑞士股份公司(NovozymesSwitzerland AG)，Neumatt，瑞士)/ml和0.2mg的几丁质酶(西格玛奥德里奇，圣路易斯，密苏里州，美国)/ml(在10ml的0.7M KCl-20mM CaCl₂中)。将该混合物在37℃和100rpm下孵育30-90分钟，直到从菌丝体中产生原生质体。将该原生质体混合物通过衬有(Calbiochem公司，圣迭哥，加利福尼亚州，美国)的无菌漏斗进行过滤，到无菌50毫升塑料离心管中，以除去菌丝体碎片。将在中的碎片彻底地用0.7M KCl-20mM CaCl₂进行洗涤并且在2500rpm(537x g)下，在20℃-23℃下，离心10分钟。去除该上清液，并且将原生质体球粒再悬浮于20ml的1M山梨醇-10mM Tris-HCl(pH6.5)-10mM CaCl₂中。将该步骤重复两次，并且将最终的原生质体球粒再悬浮于1M山梨醇-10mM Tris-HCl(pH6.5)-10mM CaCl₂中，以获得2x 10⁷/ml的最终原生质体浓度。

将2微克的pDLHD0012添加至无菌的2ml塑料离心管的底部。然后将100μl的原生质体添加至管中，随后添加在10mM Tris-HCl(pH6.5)-10mM CaCl₂中的300μl的60％PEG-4000。将该管手动地缓和地混合，并且在37℃下孵育30分钟。将添加2ml的1M山梨糖醇-10mMTris-HCl(pH 6.5)-10mM CaCl₂添加到每个转化中，并且将该混合物转染到150mm COVE琼脂板上。将转化板在34℃下孵育直到菌落出现。

挑选21个转化体菌落到新鲜的COVE琼脂平板，并且在34℃下培养4天，直到转化体形成孢子。新鲜孢子转染到48孔深孔板，这些板包含2ml的YP+2％麦芽糊精，覆盖有可透气密封件，并且在没有振荡下在34℃下生长4天。在4天生长后，将培养基的样品针对木葡聚糖内糖基转移酶活性使用碘染色测定并且针对木葡聚糖内糖基转移酶表达通过SDS-PAGE来测定。

根据以下方案，针对木葡聚糖内糖基转移酶活性进行碘染色测定。在96孔板中，将5μl培养液添加到5μl的木葡聚糖(麦格酶公司，布雷，英国)(5mg/ml在水中)、20μl的木葡聚糖低聚物(麦格酶公司，布雷，英国)(5mg/ml在水中)、和10μl的400mM柠檬酸钠pH 5.5的混合物中。将反应混合物在37℃下孵育30分钟，用包含14％(w/v)Na₂SO₄、0.2％KI、100mM HCl、和1％碘(I₂)的200μl溶液进行淬灭，在黑暗中孵育30分钟，并且然后在620nm的酶标仪中测量吸光度。该测定证实了来自若干转化体的木葡聚糖内糖基转移酶的存在。

使用8％-16％无染色SDS-PAGE凝胶(伯乐实验室有限公司，赫拉克勒斯，加利福尼亚州，美国)进行SDS-PAGE，并且使用以下设置，将该凝胶用无染色成像仪(伯乐实验室有限公司，赫拉克勒斯，加利福尼亚州，美国)成像：5分钟活化，自动成像曝光(强条带)，高亮饱和像素＝ON，颜色＝考马斯酸性染料，和带检测、分子量分析和报告禁用。SDS-PAGE分析指示出若干转化体表达与VaXET16对应的约32kDa蛋白。

实例2：构建作为酵母表达质粒载体的质粒pMMar27

构建质粒pMMar27，用于表达酵母中的土生梭孢壳霉Cel6A纤维二糖水解酶II。该质粒产生自酵母表达载体的谱系：质粒pMMar27构建自质粒pBM175b；质粒pBM175b构建自质粒pBM143b(WO 2008/008950)和质粒pJLin201；并且质粒pJLin201构建自pBM143b。

除紧邻pBM143b中疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶变体基因的下游的Xba I位点突变为独特的NheI位点以外，质粒pJLin201与pBM143b相同。使用II XL定点诱变试剂盒(Stratagenee公司，拉荷亚，加州，美国)将pBM143b中的Xba I序列(TCTAGA)变为Nhe I序列(gCTAGc)。以下示出了用来突变该位点的引物。

引物999551(正义)：

5’-ACATGTCTTTGATAAgCTAGcGGGCCGCATCATGTA-3’(SEQ ID NO:11)

引物999552(反义)：

5’-TACATGATGCGGCCCgCTAGcTTATCAAAGACATGT-3’(SEQ ID NO:12)

小写代表突变的核苷酸。

最终体积为50μl的扩增反应由以下各项构成：125ng的以上每种引物、20ng的pBM143b、1X反应缓冲液(Stratagene公司，拉荷亚，加利福尼亚州，美国)、3μl的(Stratagene公司，拉荷亚，加利福尼亚州，美国)、1μl的dNTP混合物、以及1μl的2.5单元/ml Pfu Ultra HF DNA聚合酶。使用 热循环程序进行该反应，程序为1个循环，在95℃下，持续1分钟；18个循环，每个循环在95℃下持续50秒，60℃持续50秒，和68℃持续6分钟6秒；以及1个循环，在68℃下，持续7分钟。在PCR后，将该管置于冰上2分钟。向扩增反应中直接添加一微升的Dpn I，并且在37℃下孵育1小时。根据制造商的说明，使用2μl体积的DpnI消化的反应来转化大肠杆菌XL10-高效感受态细胞(Stratagene公司，拉荷亚，加利福尼亚州，美国)。在2XYT加氨比西林板上对大肠杆菌转化体进行选择。使用9600，将质粒DNA从转化体中的若干分离。通过限制性酶切和测序分析来确认具有所希望的Nhe I变化的一个质粒，并且指定为质粒pJLin201。为了消除由定点突变引入的可能的PCR错误，通过将含Nhe I位点的片段克隆回质粒pBM143b中来构建质粒pBM175b。简言之，将质粒pJLin201用Nde I和Mlu I进行消化，并且将得到的片段克隆到之前用相同的酶使用快速连接试剂盒(罗氏诊断公司(Roche Diagnostics Corporation)，印第安纳波利斯，印第安纳州，美国)消化的pBM143b中。然后，将7μl的Nde I/Mlu I消化的pJLin201片段和1μl的消化的pBM143b与2μl的5X DNA稀释液(罗氏诊断公司，印第安纳波利斯，印第安纳州，美国)、10μl的2XT4DNA连接缓冲液(罗氏诊断公司，印第安纳波利斯，印第安纳州，美国)、和1μl的T4DNA连接酶(罗氏诊断公司，印第安纳波利斯，印第安纳州，美国)进行混合，并且在室温下孵育15分钟。将2微升的连接转化到XL1-蓝亚克隆-级感受态细胞(Stratagene公司，拉荷亚，加利福尼亚州，美国)细胞并且散布于2XYT加氨比西林板上。使用9600从若干转化体中纯化质粒DNA，并使用3130XL遗传分析仪通过DNA测序进行分析，以鉴定含有所希望的构巢曲菌pyrG插入物的质粒。将一个具有预期的DNA序列的质粒指定为pBM175b。

质粒pMMar27构建自pBM175b和具有设计用于插入所消化pBM175b的突出端的土生梭孢壳霉Cel6A纤维二糖水解酶II的扩增的基因。在CUP I启动子的控制下包含疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶变体基因的质粒pBM175b包含独特的Hind III和Nhe I位点，来去除脂肪酶基因。将质粒pBM175用这些限制性内切酶进行消化，以去除脂肪酶基因。在消化后，将空载体通过使用TBE缓冲液的1.0％琼脂糖凝胶电泳进行分离，其中将大约5,215bp的片段从凝胶切离，并且使用凝胶提取试剂盒进行提取。连接反应(20μl)由1X缓冲液(BD生物科学公司(BD Biosciences)，帕洛阿尔托(Palo Alto)，加州，美国)，1X BSA(BD生物科学公司，帕洛阿尔托(Palo Alto)，加州，美国)，1μl IN-酶(1:10稀释)(BD生物科学公司，帕洛阿尔托(Palo Alto)，加州，美国)，用HindIII和Nhe I消化的99ng pBM175b，和36ng的纯化的土生梭孢壳霉Cel6A纤维二糖水解酶IIPCR产物。将反应液于室温保温30分钟。将2μl体积的IN-反应转化到大肠杆菌XL10-高效感受态细胞中。在补充有每ml 100μg的氨比西林的LB平板上选择转化体。挑选一种菌落，其包含插入pBM175b载体替代脂肪酶基因产生pMMar27的土生梭孢壳霉Cel6A(图2)。所选择的质粒在从起始密码子的位置228处包含PCR错误，TCT代替TCC，但是导致中的土生梭孢壳霉Cel6A纤维二糖水解酶II的沉默变化。

实例3：pEvFz1表达载体的构建

表达载体pEvFz1是通过修饰pBM120a(美国专利8,263,824)来进行构建，以包括NA2/NA2-tpi启动子、黑曲霉淀粉葡糖苷酶终止子序列(AMG终止子)、和作为选择性标志物的构巢曲霉乳清酸核苷-5’磷酸脱羧酶基因(pyrG)。

通过该将构巢曲霉pyrG基因从pAlLo2(WO 2004/099228)克隆到pBM120a中来产生质粒pEvFz1。将质粒pBM120a和pAlLo2用Nsi I在37℃下消化过夜。将所得4176bp线性pBM120a载体片段和来自pAlLo2的1479bp pyrG基因插入片段各自使用TAE缓冲液通过0.7％琼脂糖凝胶电泳纯化，从凝胶切离，并使用凝胶提取试剂盒进行提取。

使用QUICK LIGATION^TM试剂盒(新英格兰生物实验室，贝弗利，马萨诸塞州，美国)将1479bp pyrG基因插入片段连接至Nsi I消化的pBM120a片段。连接反应由以下构成：1XQUICK LIGATION^TM反应缓冲液(新英格兰生物实验室，贝弗利，马萨诸塞州，美国)、50ng的Nsi I消化的pBM120a载体、54ng的1479bp Nsi I消化的pyrG基因插入物、以及1μl的T4DNA连接酶，总体积为20μl。将连接混合物在37℃下孵育15分钟，随后在50℃下孵育15分钟，并且放置在冰上。

将1μl的连接混合物转化到ONETOP10化学感受大肠杆菌细胞中。在2XYT加氨比西林板上对转化体进行选择。使用9600从若干转化体中纯化质粒DNA，并使用3130XL遗传分析仪通过DNA测序进行分析，以鉴定含有所希望的构巢曲菌pyrG插入物的质粒。将一个具有预期的DNA序列的质粒指定为pEvFz1(图3)。

实例4：构建作为酵母/大肠杆菌/米曲霉穿梭载体的质粒pDLHD0006

使用酵母重组克隆，将质粒pDLHD0006构建为基本载体，以使得米曲霉表达盒文库建立。通过使用酵母重组克隆合并三种DNA片段来产生质粒pDLHD0006：包含大肠杆菌pUC复制起点、大肠杆菌β-内酰胺酶(ampR)选择性标志物、URA3酵母选择性标志物、和来自pMMar27(实例2)的酵母2微米复制起点的片段1；包含10amyR/NA2-tpi启动子(来自基因的启动子，这些基因编码黑曲霉中性α-淀粉酶和米曲霉丙糖磷酸异构酶并且包括针对米曲霉amyR转录因子的10个重复结合位点)、疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶开放阅读框(ORF)、和来自pJaL1262(WO 2013/178674)的黑曲霉葡糖糖化酶终止子的片段2；和来自pEvFz1(实例3)的包含构巢曲霉pyrG选择标志物的片段3。

使用以下所示的引物613017(正义)和613018(反义)扩增片段1。设计引物613017包含与片段3(小写)具有序列同源性的侧翼区，并且设计引物613018包含与片段2(小写)具有序列同源性的侧翼区以使得酵母在这三个PCR片段之间重组克隆。

引物613017(正义)：

ttaatcgccttgcagcacaCCGCTTCCTCGCTCACTGACTC(SEQ ID NO:13)

613018(反义)：

acaataaccctgataaatgcGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTC(SEQ ID NO:14)

片段1在反应中通过PCR来扩增，该反应由10ng的质粒pMMar27、0.5μl的DNA聚合酶(新英格兰生物实验室公司，伊普斯威奇，马萨诸塞州，美国)、20pmol的引物613017、20pmol的引物613018、1μl的10mM dNTP、10μl的5XHF缓冲液、和35.5μl的水构成。在中孵育该反应，程序为1个循环，在98℃下，持续30秒；以及30个循环，每个循环在98℃持续10秒，60℃持续10秒，以及72℃持续1.5分钟。将得到的4.1kb PCR产物(片段1)直接使用用于与以下片段2和3的酵母重组。

使用以下所示的引物613019(正义)和613020(反义)扩增片段2。设计引物613019包含与片段1(小写)具有序列同源性的侧翼区，并且设计引物613020包含与片段3(小写)具有序列同源性的侧翼区以使得酵母在这三个PCR片段之间重组克隆。

613019(正义)：

agatagggttgagtgttgttccGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGG(SEQ ID NO:15)

613020(反义)：

ttctacacgaaggaaagagGAGGAGAGAGTTGAACCTGGACG(SEQ ID NO:16)

片段2在反应中通过PCR来扩增，该反应由10ng的质粒pJaL1262、0.5μl的DNA聚合酶、20pmol的引物613019、20pmol的引物613020、1μl的10mM dNTP、10μl的5XHF缓冲液、和35.5μl的水构成。在 中孵育该反应，程序为1个循环，在98℃下，持续30秒；30个循环，每个循环在98℃持续10秒，60℃持续10秒，以及72℃持续2分钟；以及20℃保持。将得到的4.5kb PCR产物(片段2)直接使用用于与以上片段1和以下片段3的酵母重组。

使用以下所示的引物613022(正义)和613021(反义)扩增片段3。设计引物613021包含与片段2(小写)具有序列同源性的侧翼区，并且设计引物613022包含与片段1(小写)具有序列同源性的侧翼区以使得酵母在这三个PCR片段之间重组克隆。

613022(正义)：

aggttcaactctctcctcCTCTTTCCTTCGTGTAGAAGACCAGACAG(SEQ ID NO:17)

613021(反义)：

tcagtgagcgaggaagcggTGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGG(SEQ ID NO:18)

片段3在反应中通过PCR来扩增，该反应由10ng的质粒pEvFz1(实例3)、0.5μl的DNA聚合酶、20pmol的引物613021、20pmol的引物613022、1μl的10mM dNTP、10μl的5XHF缓冲液、和35.5μl的水构成。在中孵育该反应，程序为1个循环，在98℃下，持续30秒；30个循环，每个循环在98℃持续10秒，60℃持续10秒，以及72℃持续2分钟；以及20℃保持。将得到的1.7kb PCR产物(片段3)直接使用用于与以上片段1和2的酵母重组。

使用基于酵母同源性的重组克隆，使用以下程序来合并三个PCR片段。将三种PCR片段的每种的20μl等分试样与来自鲑鱼睾丸的100μg的单链脱氧核糖核酸(西格玛奥德里奇，圣路易斯，密苏里州，美国)、100μl的菌株YNG318的感受态酵母细胞(酿酒酵母ATCC208973)、和600μl的PLATE缓冲液(西格玛奥德里奇，圣路易斯，密苏里州，美国)合并，并且混合。将反应在30℃下以200rpm振荡孵育30分钟。然后将该反应在42℃下在没有振荡的情况下继续15分钟。将这些细胞通过在5,000x g下离心1分钟进行沉淀，并且弃去上清液。将细胞球粒悬浮于200μl的高压蒸汽处理的水中，并且分在两个包含合成的所定义的培养基缺少尿苷的琼脂平板，并且在30℃下孵育3天。将这些酵母菌落使用1ml的高压蒸汽处理的水从板中分离。将这些细胞通过在13,000x g下离心30秒进行沉淀，并且将100μl等分试样的玻璃珠添加到该管中。将细胞和珠混合物悬浮在250μl的P1缓冲液(凯杰公司，巴伦西亚，加利福尼亚州，美国)中，并且然后涡旋1分钟来裂解这些细胞。使用旋转迷你制备型试剂盒纯化质粒DNA。根据制造商的说明，然后将3μl等分试样的质粒DNA转化到大肠杆菌ONETOP10电转化感受态细胞中。将五十μl的转化细胞散布于每ml补充有100μg氨比西林的LB板上，并且在37℃下孵育过夜。将转化体各自挑入每ml补充有100μg的氨比西林的3ml的LB培养基中，并且在37℃下在250rpm的振荡下生长过夜。使用旋转迷你制备型试剂盒从菌落中纯化质粒DNA。将使用3130XL遗传分析仪的DNA测序用来确认指定为pDLHD0006的最终质粒中三种片段中的每种的存在(图4)。

实例5：拟南芥木葡聚糖内糖基转移酶14的制备

根据以下描述的方案，拟南芥木葡聚糖内糖基转移酶(AtXET14；SEQ ID NO:4[天然DNA序列]、SEQ ID NO:5[合成DNA序列]、和SEQ ID NO:6[推导的氨基酸序列])重组产生于米曲霉JaL355(WO 2008/138835)。

构建载体pDLHD0039以在米曲霉中多拷贝表达AtXET14基因。使用无限制性克隆，通过合并两种DNA片段来产生质粒pDLHD0039：包含AtXET14ORF和与载体pDLHD0006具有同源性的侧翼序列(实例4)的片段1，和由载体pDLHD0006的反向PCR扩增子组成的片段2。

使用以下所示引物AtXET14F(正义)和AtXET14R(反义)来扩增片段1，这些引物被设计包含与载体pDLHD0006(小写)具有序列同源性的侧翼区，用于在PCR片段之间的物连接克隆。

引物AtXET14F(正义)：

ttcctcaatcctctatatacacaactggccATGGCCTGTTTCGCAACCAAACAG(SEQ ID NO:19)

AtXET14R(反义)：

agctcgctagagtcgacctaGAGTTTACATTCCTTGGGGAGACCCTG(SEQ ID NO:20)

片段1在反应中通过PCR来扩增，该反应由10ng的包括在Sac I和Kpn I位点之间所克隆的AtXET14合成DNA序列的载体pMA、0.5μl的聚合酶(新英格兰生物实验室公司，伊普斯威奇，马萨诸塞州，美国)、20pmol的引物AtXET14F、20pmol的引物AtXET14R、1μl的10mM dNTP、10μl的5XHF缓冲液、和35.5μl的水构成。在 中孵育该反应，程序为1个循环，在98℃下，持续30秒；以及30个循环，每个循环在98℃持续10秒，60℃持续10秒，以及72℃持续30秒。将得到的0.9kb PCR产物(片段1)用1μl的Dpn I进行处理，以去除质粒模板DNA。将该DpnI直接添加到PCR管中，良好混合，并且在37℃下孵育60分钟，并且然后使用PCR纯化试剂盒进行柱纯化。

使用以下所示的引物614604(正义)和613247(反义)扩增片段2。

614604(正义)：

taggtcgactctagcgagctcgagatc(SEQ ID NO:21)

613247(反义)：

catggccagttgtgtatatagaggattgaggaaggaagag(SEQ ID NO:22)

片段2在反应中通过PCR来扩增，该反应由10ng的质粒pDLHD0006、0.5μl的DNA聚合酶、20pmol的引物614604、20pmol的引物613247、1μl的10mM dNTP、10μl的5XHF缓冲液、和35.5μl的水构成。在 中孵育该反应，程序为1个循环，在98℃下，持续30秒；以及30个循环，每个循环在98℃持续10秒，60℃持续10秒，以及72℃持续4分钟。将得到的7.3kb PCR产物(片段2)用1μl的Dpn I进行处理，以去除质粒模板DNA。将该Dpn I直接添加到PCR管中，良好混合，并且在37℃下孵育60分钟，并且然后使用PCR纯化试剂盒进行柱纯化。

根据制造商的说明书，使用无缝克隆和装配套件(英杰公司(Invitrogen)，卡尔斯巴德，加利福尼亚州，美国)来合并两种PCR片段。然后将3μl得到的反应产物DNA转化到大肠杆菌ONETOP10电转化感受态细胞中。将5μl的转化细胞散布于每ml补充有100μg氨比西林的LB板上，并且在37℃下孵育过夜。将单个转化体菌落挑入每ml补充有100μg的氨比西林的3ml的LB培养基中，并且在37℃下在250rpm的振荡下生长过夜。根据制造商的说明，使用旋转迷你制备型试剂盒从菌落中纯化质粒DNA。将使用3130XL遗传分析仪的DNA测序用来确认最终质粒pDLHD0039中两种片段中的每种的存在(图5)。

根据以下方案，将米曲霉菌株JaL355用包括AtXET14基因的质粒pDLHD0039进行转化。将约2-5x 10⁷孢子的米曲霉JaL355接种于500ml摇瓶中的100ml的YP+2％葡萄糖+10mM尿苷中，并且在28℃和110rpm下孵育过夜。将10ml的过夜培养物在125ml无菌真空滤器中过滤，并且将菌丝用50ml的0.7M KCl-20mM CaCl₂洗涤两次。将剩余液体通过真空过滤去除，留下垫在滤器上。将菌丝体再悬浮于10ml的0.7M KCl-20mM CaCl₂中，并且转移至无菌125ml摇瓶中，该摇瓶包含20mg的200G/ml和0.2mg的几丁质酶在10ml的0.7M KCl-20mM CaCl₂中。将该混合物在37℃和100rpm下孵育30-90分钟，直到从菌丝体中产生原生质体。将该原生质体混合物通过衬有的无菌漏斗进行过滤，到无菌50毫升塑料离心管中，以除去菌丝体碎片。将在中的碎片彻底地用0.7M KCl-20mM CaCl₂进行洗涤并且在2500rpm(537x g)下，在20℃-23℃下，离心10分钟。去除该上清液，并且将原生质体球粒再悬浮于20ml的1M山梨醇-10mM Tris-HCl(pH 6.5)-10mM CaCl₂中。将该步骤重复两次，并且将最终的原生质体球粒再悬浮于1M山梨醇-10mMTris-HCl(pH 6.5)-10mM CaCl₂中，以获得2x 10⁷/ml的最终原生质体浓度。

将2微克的pDLHD0039添加至无菌的2ml塑料离心管的底部。然后将100μl的原生质体添加至管中，随后添加在10mM Tris-HCl(pH6.5)-10mM CaCl₂中的300μl的60％PEG-4000。将该管手动地缓和地混合，并且在37℃下孵育30分钟。将添加2ml的1M山梨糖醇-10mMTris-HCl(pH 6.5)-10mM CaCl₂添加到每个转化中，并且将该混合物转染到150mm基本培养基琼脂板上。将转化板在34℃下孵育直到菌落出现。

挑选35个转化体菌落到新鲜的基本培养基琼脂平板，并且在34℃下培养4天，直到菌株形成孢子。新鲜孢子转染到48孔深孔板，这些板包含2ml的YP+2％麦芽糊精，覆盖有可透气密封件，并且在没有振荡下在28℃下生长4天。在4天生长后，将培养基针对木葡聚糖内糖基转移酶活性并且针对木葡聚糖内糖基转移酶表达通过SDS-PAGE来测定。

使用实例1中描述的碘染色测定，来测量木葡聚糖内糖基转移酶活性。该测定证实了若干转化体中木葡聚糖内糖基转移酶活性的存在。

按在实施例1中的描述进行SDS-PAGE。SDS-PAGE分析指示出若干转化体表达与AtXET14对应的约32kDa蛋白。

实例6：荧光素异硫氰酸酯标记的木葡聚糖的产生

根据由周(Zhou)等人，2006，生物催化与生物转化(Biocatalysis andBiotransformation)24:107-120所描述的程序，通过木葡聚糖低聚物(XGO)的还原端的还原氨化，随后在100mM碳酸氢钠(pH 9.0)在室温下将XGO的氨基基团结合到荧光素异硫氰酸酯异构体I(西格玛奥德里奇，圣路易斯，密苏里州，美国)24小时，来产生荧光素异硫氰酸酯标记的木葡聚糖低聚物(FITC-XGO)。将结合反应产物在真空中浓缩干燥，溶解于0.5ml的去离子水，并且通过硅胶层析进行纯化，该硅胶层析用从100:0:0.04至70:30:1梯度的乙腈:水:乙酸作为流动相进行洗脱。通过蒸发该缓冲液、溶解于D₂O(西格玛奥德里奇，圣路易斯，密苏里州，美国)，并且使用Varian 400MHz MercuryVx(安捷伦(Agilent)，圣克拉拉，加利福尼亚州，美国)通过¹H NMR分析来确认纯度和产物同一性。在-20℃下在黑暗中，储存干燥的FITC-XGO，并且在解冻过程中干燥。

彻底混合24ml的10mg的罗望子木葡聚糖(麦格酶公司，布雷，英国)/ml的去离子水、217μl的7.9mg的FITC-XGO/ml的去离子水、1.2ml的400mM柠檬酸钠(pH 5.5)、和600μl的1.4mg的VaXET16/ml的20mM柠檬酸钠(pH 5.5)，并且在室温下孵育过夜。在过夜孵育后，通过添加冰冷的乙醇至终体积110ml来沉淀FITC-XG，彻底混合，并且在4℃下整夜孵育。用水洗涤沉淀的FITC-XG，并且然后转移到圆底烧瓶(Erlenmeyer bulb)中。通过使用EZ-2Elite蒸发器(SP Scientific/Genevac公司，斯通里奇，纽约，美国)蒸发4小时来去除残余的水和乙醇。将干燥的样品溶解于水中，并且用去离子水将体积调整到48ml，以产生，在所希望的100kDa的平均分子量下，5mg/ml的最终FITC-XG浓度。

实例7：针对木葡聚糖内糖基转移活性的荧光偏振测定

使用以下测定来评估木葡聚糖内糖基转移活性。如在实例6中所描述的制备200μl的反应，该反应包含1mg的罗望子木葡聚糖/ml、0.01mg/ml FITC-XGO，并且将10μl的适当稀释的XET在25℃下在不透明96孔微量滴定板中的20mM柠檬酸钠(pH 5.5)中孵育10分钟。在这个时间段，以顶级阅读方向，用490nm的激发波长、520nm的发射波长、激发路径中495截止滤波器、高精度(100次读取)、和中光电倍增管的灵敏度，使用M5酶标仪(分子器件公司(Molecular Devices)，森尼维耳市，加利福尼亚州，美国)连续监测荧光偏振。将荧光XGO以XET依赖性掺入非荧光木葡聚糖(XG)中导致随着时间增加荧光偏振。使用偏振时间进程曲线的线性区域的斜率来确定该活性。

实例8：红豆木葡聚糖内糖基转移酶16的纯化

使用0.22μm滤器(密理博(Millipore)，贝德福德，马萨诸塞州，美国)过滤红豆的粗发酵液的1升溶液，并且在4℃下储存滤液。将细胞碎片在悬浮于1升的0.25％X-100(4-(1,1,3,3-四甲基丁基)苯基-聚乙二醇；西格玛奥德里奇，圣路易斯，密苏里州，美国)-20mM柠檬酸钠(pH 5.5)中，在室温下孵育至少30分钟，并且然后使用0.22μm滤器进行过滤。汇集包含红豆木葡聚糖内糖基转移酶16(VaXET16)的滤液，并且使用配备有10kDa的分子量截留膜的200切向流浓缩器(密理博，贝德福德，马萨诸塞州，美国)来浓缩至在500和1500ml之间的体积。

将浓缩的滤液装载到150ml Q大珠柱(GE医疗生命科学集团(GEHealthcare Lifesciences)，皮斯卡塔韦，新泽西州，美国)上，用20mM柠檬酸钠(pH 5.5)进行预平衡，并且用相同缓冲液等度洗脱。将洗脱液装载到75ml PhenylHP柱(GE医疗生命科学集团，皮斯卡塔韦，新泽西州，美国)上，该柱在20％乙二醇-20mM柠檬酸钠(pH 5.5)中进行预平衡。使用从20％至50％的70％乙二醇在20mM柠檬酸钠(pH 5.5)的线性梯度经4柱体积洗脱VaXET16。

使用BCA测定(皮尔斯，罗克福德，伊利诺伊，美国)以96孔板格式，以牛血清白蛋白(皮尔斯，罗克福德，伊利诺伊，美国)作为蛋白标准品，在0和2mg/ml之间的浓度下，量化纯化的VaXET16，并且确定为1.40mg/ml。通过约32kDa的单个条带的存在，使用8％-16％梯度无染色SDS-PAGE凝胶来确认VaXET16同质性，并且用无染色成像仪使用以下设置来将凝胶成像：5分钟活化，自动成像曝光(强条带)，高亮饱和像素＝ON，颜色＝考马斯酸性染料，和带检测、分子量分析和报告禁用。

通过荧光偏振测量荧光素异硫氰酸酯标记的木葡聚糖低聚物掺入到罗望子木葡聚糖(麦格酶公司，布雷，英国)中的比例来确定纯化的VaXET16的活性(如实例7中所描述的)。该表观活性为18.5±1.2P s^-1mg^-1。

针对背景酶活性，使用以下所示的标准测定测试纯化的VaXET16制品，这些背景酶活性包括木聚糖酶，淀粉酶，纤维素酶，β-葡糖苷酶，蛋白酶，淀粉葡糖苷酶，和脂肪酶。

使用小麦阿拉伯糖基木聚糖作为底物在pH 6.0和50℃下测定木聚糖酶活性。在405nm下通过添加包含PHBAH的碱性溶液来进行比色评估木聚糖水解。一个FXU(S)定义为使用(诺维信公司)作为标准品的木聚糖内切酶活性。

使用淀粉作为底物在pH 2.5和37℃下测定淀粉酶活性。通过添加碘溶液在600nm下比色测量剩余淀粉来评估淀粉水解。一个FAU(A)定义为使用酸性真菌α-淀粉酶(可从诺维信公司获得)作为标准品的酸性α-淀粉酶活性。

使用(4,6-亚乙基(G7)-对硝基苯基(G1)-α,D-麦芽七糖苷(4,6-亚乙基-G7-pNP)作为底物，在pH 7和37℃下，测定淀粉酶活性。该底物水解产生对硝基酚，并且在405nm下进行比色评估。一个FAU(F)定义为使用(诺维信公司)作为标准品的真菌α-淀粉酶单位。

使用羧甲基纤维素(CMC)作为底物在pH 5.0和50℃下测定纤维素酶活性。在405nm下通过添加包含对羟基苯甲酸酰肼(PHBAH)的碱性溶液来进行比色评估CMC水解。一个CNU(B)定义为使用NS22084酶(诺维信公司)作为标准品的纤维素酶活性。

使用纤维二糖作为底物在pH 5.0和50℃下测定β-葡糖苷酶活性。使用偶联的酶测定，用己糖激酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，将葡萄糖转化为6-磷酸葡萄糖酸酯，随后在340nm下将NAD还原为NADH，评估从纤维二糖生产葡萄糖。一个CBU(B)定义为使用纤维二糖酶作为标准品每分钟释放2微摩尔葡萄糖的酶的量。

使用蛋白酶检测试剂盒(绿色荧光)(生命技术公司，格兰德岛，纽约，美国)，以酪蛋白为底物，在pH 6或9和环境温度下，进行蛋白酶测定。一个KMTU定义为关于每分钟产生1微摩尔的对硝基苯胺的酶的量的千微生物胰蛋白酶单位。

使用麦芽糖作为底物在pH 4.3和37℃下测定淀粉转葡糖苷酶活性。使用偶联的酶测定，用己糖激酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，将葡萄糖转化为6-磷酸葡萄糖酸酯，随后在340nm下将NAD还原为NADH，评估麦芽糖至葡萄糖的转化。一个AGU定义为使用(诺维信公司)作为标准品的淀粉转葡糖苷酶单位。

在pH 7和环境温度下进行4-甲基伞形酮β-D-乳糖苷(MUL)测定，并且在360nm激发和465nm发射下进行荧光测量。

使用4-硝基苯基丁酸酯(pNP-butyrate)作为底物，在pH 7.5和环境温度下，测定脂肪酶活性。在对硝基酚释放后，在405nm下测定pNP-丁酸酯水解。一个LU定义为使用(诺维信公司)作为标准品释放1微摩尔的可滴定的丁酸的酶的量。

实例9：拟南芥木葡聚糖内糖基转移酶14的纯化

除以下内容以外，如针对实例8中VaXET16所描述的进行拟南芥木葡聚糖内糖基转移酶14(AtXET14)的纯化和定量：使用从40％至90％的70％乙二醇在20mM柠檬酸钠(pH5.5)中的线性梯度经4个柱体积进行从苯基HP柱的洗脱。

通过约32kDa的单个条带的存在，使用8％-16％无染色SDS-PAGE凝胶来确认AtXET14同质性，并且用无染色成像仪使用以下设置来将凝胶成像：5分钟活化，自动成像曝光(强条带)，高亮饱和像素＝ON，颜色＝考马斯酸性染料，和带检测、分子量分析和报告禁用。

使用BCA测定以96孔板格式，以牛血清白蛋白作为蛋白标准品，在0和2mg/ml之间的浓度下，量化纯化的AtXET14，并且确定为1.49mg/ml。

如实例7中所述确定纯化的AtXET14的活性。该表观活性为34.7±0.9P s^-1mg^-1。

针对背景活性，使用以下所示的标准测定测试纯化的AtXET14制品，这些背景酶活性包括木聚糖酶，淀粉酶，纤维素酶，β-葡糖苷酶，蛋白酶，淀粉葡糖苷酶，和脂肪酶。标准测定描述于实例8中。

实例10：在手抄纸组合物中红豆木葡聚糖内糖基转移酶16修饰的高岭土对填料保持的作用

用自来水制备0.3％(w/w)的漂白桉树牛皮纸纤维(BEKP)的浆液。为了制备单一手抄纸，将800ml的包含烘干重2.4克纤维的浆液转移到1升塑料烧杯。将水(对照)或高岭土浆液的等分部分添加至搅拌器中。通过将2g的高岭土(西格玛奥得里奇，圣路易斯，密苏里州，美国)悬浮于50ml的去离子水中、或50ml的20mM柠檬酸盐(pH 5.5)中、或包含125mg罗望子核粉末木葡聚糖(具有或不具有1μM VaXET16)的50ml的20mM柠檬酸盐(pH 5.5)中来产生高岭土浆液。配给未修饰的和修饰的高岭土浆液以递送相对于样品中的纤维而言10％当量(即烘干重0.24克高岭土/样品)。然后将样品通过叶轮在低速下混合30秒。就在混合之后，立即将每个样品转移到标准手抄纸模型的半满定纸框中。然后将定纸框完全填满、搅拌、并且沥干以形成纸张。根据TAPPI标准程序T-205sp-95“形成手抄纸以用于纸浆的物理测试(Forming Handsheets for Physical Testing of Pulp)”，将每个纸张横伏、压制、并且干燥。从表1中所列的试验组中的每一个制备制备八个纸张。

根据TAPPI标准T-211om-02“在木材、纸浆、纸以及纸板中的灰分：在525℃燃烧(Ash in wood,pulp,paper and paperboard:combustion at 525℃)”，将来自每个组的三个纸张用于确定灰分含量。根据TAPPI标准T-220sp-96“纸浆手抄纸的物理测试(PhysicalTesting of Pulp Handsheets)”，确定来自每一组的其余五个纸张的物理强度特性。

表1：试验描述

填料保持结果呈现于图6中。虽然高岭土与木葡聚糖之间的相互作用导致填料在BEKP的成形网中的显著保持，但是在高岭土的存在下通过VaXET16修饰木葡聚糖产生具有甚至更高保持度的材料。结果表明在XET和木葡聚糖的存在下高岭土的修饰产生在纤维网(例如纸和板)中具有显著改进的保持的填料。

增加的矿物质填料的保持是所希望的，以降低成本并赋予纸和板特定的光学特性和性能特性。然而，矿物质妨碍了对于构建最终产物中的强度而言至关重要的纤维到纤维的结合。因此，通常存在包含上限。物理测试结果指示，即使具有高岭土的显著改进的保持，手抄纸的强度特性仍未受显著影响(图6)。

表2列出了手抄纸的如上所述地进行测试的物理特性。对于大部分特性，变化是小的，尽管当与木葡聚糖和VaXET16一起孵育时保持在手抄纸中的高岭土有大的增加。这些数据指示，木葡聚糖，并且特别是木葡聚糖与VaXET16，可以用于在不使用絮凝剂或其他保持助剂的情况下增加高岭土填料在纸中的保持，同时保持产生的纸的物理特性。

表2.从120g/m²手抄纸获得的物理测试和灰分含量数据，这些手抄纸是在不同高岭土浆液的不存在或存在下从漂白的桉树纤维制备。注释：当适用时，将高岭土相对于干纤维以10％(w/w)配给。

TEA是指抗张能量吸收。TI是指抗张指数。

实例11：荧光素异硫氰酸酯标记的木葡聚糖与高岭土的结合

为了测试并定量高岭土由木葡聚糖的结合，将荧光素异硫氰酸酯标记的木葡聚糖(FITC-XG)用作报告物，并且在高岭土的存在或不存在下在孵育之后测量残余的溶液荧光。如实例6中所述产生FITC-XG。如实例8中所述纯化红豆XET16。

在密封的1.1ml 96-深孔板(爱思进公司(Axygen)，联合市(Union City)，加利福尼亚州(CA)，美国)中进行500μl的结合反应。在具有或不具有1μM VaXET16，并且在具有或不具有1mg的FITC-XG/ml的50mM柠檬酸钠(pH 5.5)的情况下，在25℃抑或37℃，在40摇床培养箱(新不伦瑞克科技(New Brunswick Scientific)，恩菲尔德(Enfield)，康涅狄格州(CT)，美国)中，以0至20mg/ml的量将高岭土(西格玛奥德里奇，圣路易斯，密苏里州，美国)进行孵育，持续长达5天。将板用ALPS 3000板密封剂(赛默科学(Thermo Scientific)，沃尔瑟姆(Waltham)，马萨诸塞州(MA)，美国)密封，并且然后包裹在铝箔中以在孵育期间保持荧光。

在孵育持续1、2、和5天之后，使用LEGEND^TM RT Plus离心机(赛默科学，沃尔瑟姆，马萨诸塞州，美国)将深孔板在3000rpm离心5分钟，以使具有任何关联的FITC-XG的高岭土成球粒，并且以下述方式测量上清液的荧光强度。将每种上清液的200μl等分试样移除并且转移到Costar 9017平底微量滴定板(科宁(Corning)，图克斯伯里(Tewksbury)，马萨诸塞州(MA)，美国)。使用M5酶标仪，以底读取格式、488nm激发波长、520nm发射波长、以及495nm的截止滤波器，在高精度模式(100个读数)下以及中等光电倍增管灵敏度设置下测量荧光强度。使用与强度测量所述的相同的样品和激发设置，测量从500到625nm的波长下的发射，测量荧光光谱。

在测量荧光强度之后，将每个样品等分部分返回到其原始反应中。将板重新密封，重新包裹在箔中，并且放回到培养箱中以继续结合反应。

图7示出相对于在没有高岭土的情况下进行的对照孵育，随着渐增质量的高岭土，被吸收到高岭土上的FITC-XG荧光增加。图7A示出在1天孵育之后的高岭土滴定；图7B示出在2天孵育之后的高岭土滴定；并且图7C示出在5天孵育之后的高岭土滴定。随着渐增质量的高岭土，观察到在上清液相中的降低的荧光强度和被吸收到高岭土上的更高的荧光。类似地，在VaXET16的存在下，随着在反应中高岭土的量增加，与高岭土关联的荧光的量增加。在高岭土的浓度非常低时，溶液相荧光增加而不是减少，产生小于零的表观吸收荧光。

为了确认荧光强度确实增加，测量了荧光光谱并示出于图8中。图8A示出在没有FITC-XG的情况下孵育的各种高岭土浓度的上清液的荧光光谱。图8B示出与FITC-XG一起孵育的各种高岭土浓度的上清液的荧光光谱。图8C示出与FITC-XG和VaXET16一起孵育的各种浓度的高岭土的上清液的荧光光谱。

在不存在VaXET16的情况下，从500到520nm观察到高发射强度，这归因于木葡聚糖的聚集引起的激发辐射的散射。在存在VaXET16的情况下，当高岭土不存在时观察到类似的光散射峰。然而，当高岭土存在时，在500和520nm之间的发射强度大幅降低，指示没有光散射。这些结果指示溶液中的平均粒度远远更小；由此在高岭土的存在下通过VaXET16来分散木葡聚糖聚集体。在两种情况中，木葡聚糖结合至高岭土，用多糖使得高岭土功能化。相比于当VaXET16不存在时，当VaXET16存在时，在高岭土的存在下木葡聚糖显现更多分散。

实例12：通过共聚焦显微镜，荧光素异硫氰酸酯标记的木葡聚糖与高岭土的结合

将实例11中描述的反应混合物根据以下程序通过激光扫描共聚焦显微镜进行分析。将每个反应的300μl的等分试样移除，转移到96-孔0.45微米PVDF滤板(密理博(Millipore)，比勒利卡(Billerica)，马萨诸塞州(MA)，美国)中，并且使用LEGEND^TM RTPlus离心机在3000rpm离心10分钟。将滞留物通过重悬浮于300μl的去离子水中洗涤三次，充分混合，并且然后如上进行离心。然后将洗涤的高岭土滞留物重悬浮于300μl的去离子水中，并且转移到微量离心管中。将样品储存于4℃直到分析。将大约20μl各样品施加到飞世尔菲尼斯特高级版(FisherFinest Premium)3”x 1”x 1mm显微镜载玻片(飞世尔科技公司(Fisher Scientific,Inc.)，匹兹堡(Pittsburg)，宾夕法尼亚州(PA)，美国)上，并且用飞世尔牌(Fisherbrand)22x 22-1.5显微镜盖玻片(飞世尔科技公司，匹兹堡，宾夕法尼亚州，美国)覆盖，之后使用清澈指甲油将盖玻片密封到载玻片上。

使用奥林巴斯(Olympus)FV1000激光扫描共聚焦显微镜(奥林巴斯公司(Olympus)，森特瓦利(Center Valley)，宾夕法尼亚州，美国)用10X气隙物镜，将从与高岭土结合的FITC-XG产生的荧光进行成像。使用氩离子激光的488nm线进行激发，并且通过整合入射在光电倍增管检测器上通过发射单色仪的从500到520nm的强度来检测发射强度。对于所有图像，光电倍增管(PMT)电压设置是678，并且偏移量设置为3。使用FIJI(NIH，贝塞斯达(Bethesda)，马里兰州(MD)，美国)和(迈斯沃克，纳蒂克，马萨诸塞州，美国)进行扫描后的图像分析。

图9A示出未与FITC-XG一起孵育的高岭土的、将荧光发射与透射叠加在一起的共聚焦显微镜图像。从该图像未观察到实质性的荧光强度。平均像素强度是56.69±23.92。

图9B示出与FITC-XG一起孵育的高岭土的、将荧光发射与透射叠加在一起的共聚焦显微镜图像。平均像素强度是211.49±159.37。

图9C示出与FITC-XG和VaXET16一起孵育的高岭土的、将荧光发射与透射叠加在一起的共聚焦显微镜图像。平均像素强度是185.26±161.28。

比较这3个图像，观察到明显区别。未与FITC-XG一起孵育的高岭土具有仅略高于背景的荧光强度，并且和与FITC-XG或FITC-XG和VaXET16一起孵育的高岭土相比具有显著更小的荧光强度。在与或未与FITC-XG一起孵育的样品之间，高岭土的流变学也明显不同。在未与FITC-XG一起孵育时高岭土均匀地分散并且显现在该放大水平上是均匀的。反之，在FITC-XG或FITC-XG和VaXET16的存在下，高岭土显现丛集或聚集，并且观察到亮的荧光斑点。由于在显微镜检之前对样品进行了广泛洗涤，荧光斑点从结合到高岭土上的FITC-XG产生，并且这些图像指示FITC-木葡聚糖已经改变了高岭土的流变学。

实例13：在与木葡聚糖或者木葡聚糖和红豆木葡聚糖内糖基转移酶16一起孵育之后，对高岭土物理特性的作用

在100ml的玻璃瓶中，将5g高岭土在具有或不具有2.38mg/ml罗望子种子木葡聚糖并且在具有或不具有1.1μM VaXET16的情况下在20mM柠檬酸钠(pH 5.5)中孵育。将这些样品充分混合，然后水平地放置于40摇床培养箱中，并且在25℃在150rpm的振荡下孵育过夜。在孵育之后，将样品剧烈混合并且然后等分到两个50ml Centristar锥形管(科宁，图克斯伯里，马萨诸塞州，美国)中。将等分试样使用LEGEND^TM RT Plus离心机在3200rpm离心40分钟。将高岭土球粒重悬浮并且储存在4℃，或者将上清液轻轻倒出，并且将高岭土球粒重悬浮于大约50ml的去离子水中。将重悬浮的样品在150rpm的振荡下在25℃孵育过夜，离心，轻轻倒出，并且重悬浮于50ml的去离子水中，并且在150rpm的振荡下孵育过夜再两次，总计3次洗涤。

图10A示出离心之后包含(1)高岭土，(2)与木葡聚糖一起孵育的高岭土，以及(3)与木葡聚糖和VaXET16一起孵育的高岭土的50ml锥形管的照片。在离心期间用木葡聚糖或者木葡聚糖和VaXET16处理的高岭土完全呈球粒，而未处理的高岭土仍然部分悬浮。这些结果指示用木葡聚糖处理的高岭土粒子的质量增加或其密度降低；两者均指示木葡聚糖与高岭土关联，并且可能协助将高岭土粒子结合在一起。

图10B示出在与(1)高岭土，(2)与木葡聚糖一起孵育的高岭土，以及(3)与木葡聚糖和VaXET16一起孵育的高岭土接触之后的聚苯乙烯血清移液管的照片。用木葡聚糖或用木葡聚糖和VaXET16处理的高岭土附着至聚苯乙烯。这些结果指示木葡聚糖协助高岭土粒子与塑料的结合。

图10C示出广泛洗涤并且重悬浮于水中之后包含(1)高岭土，(2)与木葡聚糖一起孵育的高岭土，以及(3)与木葡聚糖和VaXET16一起孵育的高岭土的50ml锥形管的照片。用木葡聚糖或用木葡聚糖和VaXET16处理的、并且然后经广泛洗涤并且离心的高岭土当施加至旋涡混合器时并未完全重悬浮。高岭土的大粒子显现丛聚或聚集在一起并且迅速沉淀。这些结果指示，即使在广泛洗涤之后，木葡聚糖仍然结合至高岭土粒子，并且当通过离心压缩粒子时，木葡聚糖将高岭土粒子结合在一起。这些观察与实例12中描述的共聚焦显微镜数据是一致的，高岭土当与木葡聚糖或木葡聚糖和VaXET16一起孵育时丛集或聚集。另外，数据指示高岭土与木葡聚糖或木葡聚糖和VaXET16的孵育增加了高岭土与表面或其他物质如聚苯乙烯的附着。

实例14：荧光素异硫氰酸酯-标记的木葡聚糖结合至氧化钛(IV)

为了测试并定量氧化钛(IV)由木葡聚糖的结合，使用FITC-XG作为报告物，并且在存在抑或不存在氧化钛(IV)的情况下在孵育之后测量残余的溶液荧光。如实例6中所述产生FITC-XG。如实例9中所述纯化拟南芥XET14。如实例11中所描述的评估结合，但下列情况除外。通过将1g的氧化钛(IV)(金红石和锐钛矿的混合物，粒度<100nm)(西格玛奥德里奇，圣路易斯，密苏里州，美国)悬浮于10ml的20mM柠檬酸钠(pH 5.5)中产生10％浆液。将该浆液通过倒置重悬浮并且将200μl用移液管移取到每个结合反应中。在20mM柠檬酸钠中的500μl的TiO₂-结合反应包含TiO₂、以及1mg/ml FITC-XG或1mg/ml FITC-XG与1μM AtXET14。对照反应包含TiO₂(不具有FITC-XG和AtXET14)；或者包含FITC-XG，不具有TiO₂。将样品用移液管充分混合并且然后在环境条件下孵育48小时。在指示的时间处，将1.1ml 96-深孔板在3000rpm(约2200x g)离心15分钟，将各上清液的100μl等分试样移除，并且如实例11中所述测量荧光强度。将等分试样返回到它们的对应的反应孔中，将孔用移液管充分混合，并且将板重新密封。

图11示出在不同的时间TiO₂-结合反应和对照孵育物的上清液的荧光强度。空心圆：TiO₂，不具有FITC-XG；方形：TiO₂，具有FITC-XG；菱形：TiO₂，具有FITC-XG和AtXET14；三角形：FITC-XG，不具有TiO₂。从绘图中明显的是在FITC-XG结合至TiO₂并且从溶液中移除时，与FITC-XG或FITC-XG和AtXET14一起孵育的TiO₂的上清液的荧光强度随着时间急剧降低。相反地，FITC-XG荧光并不降低，并且TiO₂具有从背景不可区别的荧光强度。这些数据指示FITC-XG结合至TiO₂。

实例15：木葡聚糖和木葡聚糖内糖基转移酶介导的二氧化硅与多纤维织物的结合

使用以下方案评估荧光标记的硅石(FITC-二氧化硅；Corpuscular公司，冷泉，纽约州，美国)与多纤维织物(金布尔大通生命科学和研究产品有限责任公司(Kimble ChaseLife Science and Research Products LLC))的结合。将多纤维织物切成约1厘米宽的条。在Costar#3524，48孔细胞培养板(科宁，图克斯伯里，马萨诸塞州，美国)中，卷曲多纤维织物条并且添加到1.5ml包含20mM磷酸盐缓冲液(pH 7)中，该缓冲液有或没有2.5％(w/v)荧光二氧化硅，有或没有1.25mg/ml罗望子木葡聚糖(麦格酶公司，爱尔兰)，有或没有6μg/ml木葡聚糖低聚物，有或没有0.3μM VaXET16。将这些板包裹在箔中，并且在25℃40摇床培养箱中,在220rpm振荡下孵育4小时。

在孵育后，从孔中去除多纤维织物条，并且用去离子水冲洗约30秒。然后将多纤维织物条置于新Costar#3524，48孔细胞培养板中，并且用1.5ml的20mM磷酸盐(pH 7)孵育72小时。

针对荧光，使用Gel Doc^TM EZ图像仪(伯乐实验室有限公司，赫拉克勒斯，加利福尼亚州，美国)，用Image Lab 3.0版软件(伯乐实验室有限公司，赫拉克勒斯，加利福尼亚州，美国)以绿色设置分析多纤维织物条。将这些多纤维条暴露0.02秒，并且获得TIFF图像。使用ImageJ 1.47n软件(美国国家卫生研究院)确定各织物的强度直方图。

然后在15ml聚丙烯离心管(科宁，图克斯伯里，马萨诸塞州，美国)中，将多纤维织物测试条在10ml包含针对敏感性皮肤的20μl(宝洁，美国)的去离子水中在37℃下洗涤30分钟。在洗涤后，将这些条用去离子水彻底冲洗。如上所述的针对荧光分析这些条。

在FITC-SiO₂的存在下，在各种条件下所孵育的测试织物的横纤维上观察到了荧光强度。当将该SiO₂用木葡聚糖或具体地木葡聚糖和VaXET16孵育时，若干织物还表现出强烈的荧光，其包括腈纶(克丽斯伦)、聚对苯二甲酸乙二酯(达克纶54和64)、尼龙6.6、蚕丝、粘胶人造丝和羊毛。木葡聚糖低聚物的存在不利于结合，并且添加木葡聚糖低聚物到木葡聚糖和VaXET16，可能以VaXET16依赖性方式通过减少木葡聚糖的聚合度而减少了结合的量。

图12显示出，在用标准衣物洗涤剂另外洗涤后的各种处理的测试织物的荧光图像；指示出了处理和织物组分。图13显示出在洗涤剂中洗涤之后，各织物处理的平均荧光强度。针对棉布、腈纶(克丽斯伦)、聚对苯二甲酸乙二酯(达克纶54和64)、尼龙6.6、腈纶(奥纶75)、蚕丝、聚丙烯、粘胶人造丝、和羊毛，通过木葡聚糖或木葡聚糖和VaXET16来提高与织物结合的SiO₂荧光的量。腈纶和聚对苯二甲酸乙二酯显示出结合的最大的VaXET16依赖性提高。这些数据指示出，木葡聚糖和具体地木葡聚糖与VaXET16可以功能化各种具有SiO₂的非纤维素织物。

本发明通过以下编号的段落来进一步说明：

[1]一种用于功能化材料的方法，该方法包括在产生经修饰的材料的条件下用组合物处理该材料，该组合物选自下组，该组由以下各项组成：(a)组合物，包括木葡聚糖内糖基转移酶、聚合木葡聚糖、和包含化学基团的功能化的木葡聚糖低聚物；(b)组合物，包括木葡聚糖内糖基转移酶、用化学基团功能化的聚合木葡聚糖、和包含化学基团的功能化的木葡聚糖低聚物；(c)组合物，包括木葡聚糖内糖基转移酶、用化学基团功能化的聚合木葡聚糖、和木葡聚糖低聚物；(d)组合物，包括木葡聚糖内糖基转移酶、聚合木葡聚糖、和木葡聚糖低聚物；(e)组合物，包括木葡聚糖内糖基转移酶和用化学基团功能化的聚合木葡聚糖；(f)组合物，包括木葡聚糖内糖基转移酶和聚合木葡聚糖；(g)组合物，包括木葡聚糖内糖基转移酶和包含化学基团的功能化的木葡聚糖低聚物；(h)组合物，包括木葡聚糖内糖基转移酶和木葡聚糖低聚物，以及(i)不具有木葡聚糖内糖基转移酶的(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、或(h)的组合物，其中该经修饰的材料与未经修饰的材料相比具有改进的特性。

[2]一种用于连接材料的方法，该方法包括在产生包括用一种化学基团功能化的聚合木葡聚糖的经修饰的材料的条件下、在产生两种或更多种材料之间的连接的条件下，用组合物处理该两种或更多种材料，该组合物选自下组，该组由以下各项组成：(a)组合物，包括木葡聚糖内糖基转移酶、聚合木葡聚糖、和包含化学基团的功能化的木葡聚糖低聚物；(b)组合物，包括木葡聚糖内糖基转移酶、用化学基团功能化的聚合木葡聚糖、和包含化学基团的功能化的木葡聚糖低聚物；(c)组合物，包括木葡聚糖内糖基转移酶、用化学基团功能化的聚合木葡聚糖、和木葡聚糖低聚物；(d)组合物，包括木葡聚糖内糖基转移酶、聚合木葡聚糖、和木葡聚糖低聚物；(e)组合物，包括木葡聚糖内糖基转移酶和用化学基团功能化的聚合木葡聚糖；(f)组合物，包括木葡聚糖内糖基转移酶和聚合木葡聚糖；(g)组合物，包括木葡聚糖内糖基转移酶和包含化学基团的功能化的木葡聚糖低聚物；(h)组合物，包括木葡聚糖内糖基转移酶和木葡聚糖低聚物，以及(i)不具有木葡聚糖内糖基转移酶的(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、或(h)的组合物。

[3]一种用于产生复合的材料的方法，该方法包括在产生包括用一种化学基团功能化的聚合木葡聚糖的经修饰的材料的条件下、在产生两种或更多种材料之间的关联的条件下，用组合物处理该两种或更多种材料，该组合物选自下组，该组由以下各项组成：(a)组合物，包括木葡聚糖内糖基转移酶、聚合木葡聚糖、和包含化学基团的功能化的木葡聚糖低聚物；(b)组合物，包括木葡聚糖内糖基转移酶、用化学基团功能化的聚合木葡聚糖、和包含化学基团的功能化的木葡聚糖低聚物；(c)组合物，包括木葡聚糖内糖基转移酶、用化学基团功能化的聚合木葡聚糖、和木葡聚糖低聚物；(d)组合物，包括木葡聚糖内糖基转移酶、聚合木葡聚糖、和木葡聚糖低聚物；(e)组合物，包括木葡聚糖内糖基转移酶和用化学基团功能化的聚合木葡聚糖；(f)组合物，包括木葡聚糖内糖基转移酶和聚合木葡聚糖；(g)组合物，包括木葡聚糖内糖基转移酶和包含化学基团的功能化的木葡聚糖低聚物；(h)组合物，包括木葡聚糖内糖基转移酶和木葡聚糖低聚物，以及(i)不具有木葡聚糖内糖基转移酶的(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、或(h)的组合物。

[4]如段落1-3中任一项所述的方法，其中该一种或多种材料选自下组，该组由以下各项组成：纤维素、纤维素材料、木质纤维素材料、修饰的纤维素材料、以及纤维素衍生材料。

[5]如段落1-3中任一项所述的方法，其中该一种或多种材料选自下组，该组由以下各项组成：纸、板、纸浆、棉、羊毛、纱、黄麻、纤维素生物质、木质纤维素生物质、滤纸、乙酸纤维素、羧甲基纤维素、人造丝、纤维胶、硝酸纤维素漆、木材、薄木片、单板层积材(LVL)、木层压板、纸板、定向刨花板(OSB)、木屑压合板、以及胶合板。

[6]如段落1-3中任一项所述的方法，其中该一种或多种材料是非纤维素天然聚合物。

[7]如段落6所述的方法，其中该非纤维素天然聚合物选自下组，该组由以下各项组成：虫胶、琥珀、木质素、以及半纤维素。

[8]如段落1-3中任一项所述的方法，其中该一种或多种材料是合成聚合物。

[9]如段落8所述的方法，其中该合成聚合物选自下组，该组由以下各项组成：聚苯乙烯、聚乙烯、聚对苯二甲酸乙二酯、聚氯乙烯、聚丙烯、聚丙烯腈、聚四氟乙烯、聚氨酯、丙烯酸、乳胶、氨纶、尼龙、聚丙烯酰胺、聚丙烯酸、聚乳酸、硅酮、弹性聚合物、丙烯腈丁二烯苯乙烯(ABS)、苯乙烯-丁二烯橡胶(SBR)、丁腈橡胶、苯乙烯-异戊二烯-苯乙烯、苯乙烯-丁二烯、以及乙烯-乙酸乙烯酯。

[10]如段落1-3中任一项所述的方法，其中该一种或多种材料是矿物质。

[11]如段落10所述的方法，其中该矿物质选自下组，该组由以下各项组成：高岭土、二氧化硅、氧化钛(IV)、金红石、锐钛矿、氧化铝、氢氧化铝、氧化铁、硫化铁、磁铁矿、黄铁矿、赤铁矿、铁素体、硫复铁矿、碳酸钙、方解石、霰石、石英、锆石、橄榄石、斜方辉石、电气石、蓝晶石、钠长石、钙长石、斜辉石、正长石、石膏、红柱石、滑石、萤石、磷灰石、正长石、黄玉、刚玉、钻石、锡、氧化锡、锑、氧化锑、铍、钴、铜、长石、镓、铟、铅、锂、锰、云母、钼、镍、珍珠岩、铂系金属、磷和磷酸盐岩、钾碱、稀土元素、钽、钨、钒、沸石、锌和氧化锌、以及氧化铟锡。

[12]如段落1-11中任一项所述的方法，其中在处理该材料之前将该聚合木葡聚糖功能化。

[13]如段落1-11中任一项所述的方法，其中在处理该材料时将该聚合木葡聚糖功能化。

[14]如段落1-11中任一项所述的方法，其中在处理该材料之后将该聚合木葡聚糖功能化。

[15]如段落1和4-14中任一项所述的方法，其中该功能化的材料随后通过添加木葡聚糖酶、内切-β-1-4葡聚糖酶、纤维素酶、或其组合进行去功能化。

[17]如段落15所述的方法，其中将该随后去功能化的材料通过添加用化学基团功能化的聚合木葡聚糖或功能化的木葡聚糖低聚物以及木葡聚糖内糖基转移酶来进行再功能化。

[17]如段落2-16所述的方法，其中这些连接的或复合的材料是通过将一种或多种材料与木葡聚糖和/或木葡聚糖内糖基转移酶进行关联、接着随后在有或没有木葡聚糖以及有或没有木葡聚糖内糖基转移酶的情况下添加另外的材料来逐步连接的。

[18]如段落2-17所述的方法，其中将连接的或复合的材料随后通过添加木葡聚糖酶、内切-β-1-4葡聚糖酶、纤维素酶、或其组合进行去连接。

[19]如段落2-18所述的方法，其中将这些随后进行去连接的材料随后通过添加木葡聚糖或用化学基团功能化的聚合木葡聚糖以及木葡聚糖内糖基转移酶进行再连接。

[20]如段落1-19中任一项所述的方法，其中该改进的特性是选自下组的一种或多种改进，该组由以下各项组成：抗腐蚀性，耐腐性，抗衰性，抗氧化性，阻燃性或耐化学性，UV抗性，增强的色彩特性改进的染料或颜色吸收或保持，特异性亲和性，特异性化学反应性，杀真菌或抑真菌特性，除草或抑草特性，杀细菌或抑细菌特性，杀微生物或抑制微生物特性非特异性亲和性，针对特定化学品、化学基团、毒素、金属、盐、离子、多肽或所希望的包括生物学的、放射学的、化学等的分析物的化学反应性或亲和性或者对这些物质的抗性，增强的防水性，耐气候性，增强的拉伸强度，耐撕裂性，改变的或改进的光学特性，传导特性，热特性，酶活性，共混或关联特性，抗皱性，抗堆积性，抗缩性，表面特性，疏水性，亲水性，感觉，质地，或手感特性，磁特性，流变学，以及组成特性。

[21]如段落1-20中任一项所述的方法，其中该聚合木葡聚糖或该用化学基团功能化的聚合木葡聚糖的平均分子量范围从2kDa至约500kDa。

[24]如段落1-21中任一项所述的方法，其中该木葡聚糖低聚物或该功能化的木葡聚糖低聚物的平均分子量范围是从0.5kDa至约500kDa。

[23]如段落1-22中任一项所述的方法，其中该木葡聚糖内糖基转移酶以约0.1nM至约1mM的浓度存在。

[24]如段落1-23中任一项所述的方法，其中该聚合木葡聚糖或该用化学基团功能化的聚合木葡聚糖以约1mg/g材料至约1g/g材料存在。

[25]如段落1-24中任一项所述的方法，其中该木葡聚糖低聚物或该功能化的木葡聚糖低聚物与该聚合木葡聚糖一起以木葡聚糖低聚物或功能化的木葡聚糖低聚物与聚合木葡聚糖的约50:1摩尔比至约0.5:1摩尔比存在。

[26]如段落1-25中任一项所述的方法，其中掺入到该材料中的该聚合木葡聚糖、该用化学基团功能化的聚合木葡聚糖、该木葡聚糖低聚物、或该包括化学基团的、功能化的木葡聚糖低聚物的浓度是约0.01g至约500mg/g材料。

[27]如段落1-26中任一项所述的方法，其中在不具有该聚合木葡聚糖或该用化学基团功能化的聚合木葡聚糖的情况下该木葡聚糖低聚物或该功能化的木葡聚糖低聚物是以约1mg/g该材料至约1g/g该材料存在。

[28]如段落1-27中任一项所述的方法，其中该化学基团是感兴趣的化合物或选自下组的反应性基团，该组由以下各项组成：醛基团、氨基基团、芳香族基团、羧基基团、卤素基团、羟基基团、酮基团、腈基团、硝基基团、巯基基团、以及磺酸盐基团。

[29]如段落1-28中任一项所述的方法，其中该木葡聚糖内糖基转移酶获得自植物或微生物。

[30]如段落29所述的方法，其中该植物选自下组，该组由以下各项组成：双子叶植物和单子叶植物。

[31]如段落30所述的方法，其中该双子叶植物选自下组，该组由以下各项组成：赤小豆、花椰菜、棉、白杨或杂种白杨、马铃薯、油菜、大豆、向日葵、阿拉伯芥、烟草、和番茄。

[32]如段落31所述的方法，其中该单子叶植物选自下组，该组由以下各项组成：小麦、水稻、玉米和甘蔗。

[33]如段落1-32中任一项所述的方法，其中该木葡聚糖内糖基转移酶是通过有氧培养包含来自植物的适当的遗传信息的经转化宿主生物体来生产的。

[34]一种通过如段落1和4-33中任一项所述的方法获得的功能化材料。

[35]一种通过如段落2-33中任一项所述的方法获得的连接的或复合的材料。

[36]一种功能化的、连接的、或复合的材料，包括用化学基团功能化的聚合木葡聚糖。

[37]一种功能化的、连接的、或复合的材料，包括聚合木葡聚糖。

[38]如段落36或37所述的功能化的、连接的、或复合的材料，进一步包括木葡聚糖低聚物、包含化学基团的功能化的木葡聚糖低聚物、或其组合。

[39]一种功能化的、连接的、或复合的材料，包括一种包含化学基团的功能化的木葡聚糖低聚物。

[40]一种功能化的、连接的、或复合的材料，包括木葡聚糖低聚物。

[41]如段落39或40所述的功能化的、连接的、或复合的材料，进一步包括聚合木葡聚糖、用化学基团功能化的聚合木葡聚糖、或其组合。

[42]一种选自下组的组合物，该组由以下各项组成：(a)一种包括木葡聚糖内糖基转移酶、聚合木葡聚糖、和包括化学基团的、功能化的木葡聚糖低聚物的组合物；(b)组合物，包括木葡聚糖内糖基转移酶、用化学基团功能化的聚合木葡聚糖、和包含化学基团的功能化的木葡聚糖低聚物；(c)组合物，包括木葡聚糖内糖基转移酶、用化学基团功能化的聚合木葡聚糖、和木葡聚糖低聚物；(d)组合物，包括木葡聚糖内糖基转移酶、聚合木葡聚糖、和木葡聚糖低聚物；(e)组合物，包括木葡聚糖内糖基转移酶和用化学基团功能化的聚合木葡聚糖；(f)组合物，包括木葡聚糖内糖基转移酶和聚合木葡聚糖；(g)组合物，包括木葡聚糖内糖基转移酶和包含化学基团的功能化的木葡聚糖低聚物；以及(h)组合物，包括木葡聚糖内糖基转移酶和木葡聚糖低聚物。

在此描述并且要求的这些发明不限于在此披露的具体方面的范围，因为这些方面旨在作为这些发明若干方面的说明。预期任何等效方面都处于这些发明的范围内。实际上，除在此所示和描述的那些之外，对于本领域普通技术人员而言这些发明的不同修改将从前述描述变得清楚。这类修改也旨在落入所附权利要求书的范围内。在发生冲突的情况下，以包括定义的本披露为准。

Claims (35)

1.一种用于将材料连接的方法，该方法包括在产生包含用化学基团功能化的聚合木葡聚糖的经修饰的材料的条件下、在产生两种或更多种材料之间的连接的条件下，用组合物处理该两种或更多种材料，该组合物选自下组，该组由以下各项组成：(a)组合物，包括木葡聚糖内糖基转移酶、聚合木葡聚糖、和包含化学基团的功能化的木葡聚糖低聚物；(b)组合物，包括木葡聚糖内糖基转移酶、用化学基团功能化的聚合木葡聚糖、和包含化学基团的功能化的木葡聚糖低聚物；(c)组合物，包括木葡聚糖内糖基转移酶、用化学基团功能化的聚合木葡聚糖、和木葡聚糖低聚物；(d)组合物，包括木葡聚糖内糖基转移酶、聚合木葡聚糖、和木葡聚糖低聚物；(e)组合物，包括木葡聚糖内糖基转移酶和用化学基团功能化的聚合木葡聚糖；(f)组合物，包括木葡聚糖内糖基转移酶和聚合木葡聚糖；(g)组合物，包括木葡聚糖内糖基转移酶和包含化学基团的功能化的木葡聚糖低聚物；以及(h)组合物，包括木葡聚糖内糖基转移酶和木葡聚糖低聚物，其中所述材料选自非纤维素天然聚合物、合成聚合物和矿物质，

其中这些连接的材料是通过将一种或多种材料与木葡聚糖和/或木葡聚糖内糖基转移酶进行关联、接着随后在有或没有木葡聚糖以及有或没有木葡聚糖内糖基转移酶的情况下添加另外的材料来逐步连接的。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述非纤维素天然聚合物选自虫胶、琥珀、木质素、以及半纤维素。

3.如权利要求1所述的方法，其中所述合成聚合物选自聚苯乙烯、聚乙烯、聚对苯二甲酸乙二酯、聚氯乙烯、聚丙烯、聚丙烯腈、聚四氟乙烯、聚氨酯、丙烯酸、乳胶、氨纶、尼龙、聚丙烯酰胺、聚丙烯酸、聚乳酸、硅酮、弹性聚合物、丙烯腈丁二烯苯乙烯(ABS)、苯乙烯-丁二烯橡胶(SBR)、丁腈橡胶、苯乙烯-异戊二烯-苯乙烯、苯乙烯-丁二烯、以及乙烯-乙酸乙烯酯。

4.如权利要求1所述的方法，其中所述矿物质选自高岭土、二氧化硅、氧化钛(IV)、金红石、锐钛矿、氧化铝、氢氧化铝、氧化铁、硫化铁、磁铁矿、黄铁矿、赤铁矿、铁素体、硫复铁矿、碳酸钙、方解石、霰石、石英、锆石、橄榄石、斜方辉石、电气石、蓝晶石、钠长石、钙长石、斜辉石、正长石、石膏、红柱石、滑石、萤石、磷灰石、正长石、黄玉、刚玉、钻石、锡、氧化锡、锑、氧化锑、铍、钴、铜、长石、镓、铟、铅、锂、锰、云母、钼、镍、珍珠岩、铂系金属、磷和磷酸盐岩、钾碱、稀土元素、钽、钨、钒、沸石、锌和氧化锌、以及氧化铟锡。

5.如权利要求1所述的方法，其中该聚合木葡聚糖是在处理该材料之前、在处理该材料时、或在处理该材料后被功能化。

6.如权利要求1所述的方法，其中在处理该材料之前将该聚合木葡聚糖功能化。

7.如权利要求1所述的方法，其中在处理该材料之后将该聚合木葡聚糖功能化。

8.如权利要求1所述的方法，其中将这些连接的材料随后通过添加木葡聚糖酶、内切-β-1-4葡聚糖酶、纤维素酶、或其组合进行去连接。

9.如权利要求1所述的方法，其中将这些随后去连接的材料通过添加木葡聚糖或用化学基团功能化的聚合木葡聚糖、以及木葡聚糖内糖基转移酶进行再连接。

10.如权利要求1所述的方法，其中该聚合木葡聚糖或该用化学基团功能化的聚合木葡聚糖的平均分子量范围是从2kDa至500kDa。

11.如权利要求1所述的方法，其中该木葡聚糖低聚物或该功能化的木葡聚糖低聚物的平均分子量范围是从0.5kDa至500kDa。

12.如权利要求1所述的方法，其中该木葡聚糖内糖基转移酶以0.1nM至1mM的浓度存在。

13.如权利要求1所述的方法，其中该聚合木葡聚糖或该用化学基团功能化的聚合木葡聚糖以1mg/g该材料至1g/g该材料存在。

14.如权利要求1所述的方法，其中在有该聚合木葡聚糖的情况下，该木葡聚糖低聚物或该功能化的木葡聚糖低聚物以木葡聚糖低聚物或功能化的木葡聚糖低聚物与聚合木葡聚糖的50:1摩尔比至0.5:1摩尔比存在。

15.如权利要求1所述的方法，其中掺入到该材料中的该聚合木葡聚糖、该用化学基团功能化的聚合木葡聚糖、该木葡聚糖低聚物、或该包括化学基团的功能化的木葡聚糖低聚物的浓度是0.01g/g材料至500mg/g材料。

16.如权利要求1所述的方法，其中在没有该聚合木葡聚糖或该用化学基团功能化的聚合木葡聚糖的情况下，该木葡聚糖低聚物或该功能化的木葡聚糖低聚物以1mg/g该材料至1g/g该材料存在。

17.如权利要求1所述的方法，其中该化学基团选自：醛基团、氨基基团、芳香族基团、羧基基团、卤素基团、羟基基团、酮基团、腈基团、硝基基团、巯基基团、以及磺酸盐基团。

18.如权利要求1所述的方法，其中所述木葡聚糖内糖基转移酶获得自植物或微生物。

19.如权利要求18所述的方法，其中所述植物选自双子叶植物和单子叶植物。

20.如权利要求19所述的方法，其中所述双子叶植物选自赤小豆、花椰菜、棉、白杨、马铃薯、油菜、大豆、向日葵、阿拉伯芥、烟草、和番茄。

21.如权利要求19所述的方法，其中所述单子叶植物选自小麦、水稻、玉米和甘蔗。

22.如权利要求1所述的方法，其中所述木葡聚糖内糖基转移酶是通过有氧培养包含来自植物的适当的遗传信息的经转化宿主生物体来生产的。

23.一种通过如权利要求1-22中任一项所述的方法获得的连接的材料。

24.一种连接的材料，其通过如权利要求1-22中任一项所述的方法获得，包括聚合木葡聚糖、用化学基团功能化的聚合木葡聚糖、或其组合，其中所述材料选自非纤维素天然聚合物、合成聚合物和矿物质。

25.根据权利要求24所述的连接的材料，进一步包括木葡聚糖低聚物、包含化学基团的功能化的木葡聚糖低聚物、或其组合。

26.一种连接的材料，其通过如权利要求1-22中任一项所述的方法获得，包括聚合木葡聚糖，其中所述材料选自非纤维素天然聚合物、合成聚合物和矿物质。

27.根据权利要求26所述的连接的材料，进一步包括木葡聚糖低聚物、包含化学基团的功能化的木葡聚糖低聚物、或其组合。

28.一种连接的材料，其通过如权利要求1-22中任一项所述的方法获得，包括用化学基团功能化的聚合木葡聚糖，其中所述材料选自非纤维素天然聚合物、合成聚合物和矿物质。

29.如权利要求28所述的连接的材料，进一步包括木葡聚糖低聚物、包含化学基团的功能化的木葡聚糖低聚物、或其组合。

30.一种连接的材料，其通过如权利要求1-22中任一项所述的方法获得，包括木葡聚糖低聚物、包含化学基团的功能化的木葡聚糖低聚物、或其组合，其中所述材料选自非纤维素天然聚合物、合成聚合物和矿物质。

31.根据权利要求30所述的连接的材料，进一步包括聚合木葡聚糖、用化学基团功能化的聚合木葡聚糖、或其组合。

32.一种连接的材料，其通过如权利要求1-22中任一项所述的方法获得，包括木葡聚糖低聚物，其中所述材料选自非纤维素天然聚合物、合成聚合物和矿物质。

33.根据权利要求32所述的连接的材料，进一步包括聚合木葡聚糖、用化学基团功能化的聚合木葡聚糖、或其组合。

34.一种连接的材料，其通过如权利要求1-22中任一项所述的方法获得，包括一种包含化学基团的功能化的木葡聚糖低聚物，其中所述材料选自非纤维素天然聚合物、合成聚合物和矿物质。

35.如权利要求34所述的连接的材料，进一步包括聚合木葡聚糖、用化学基团功能化的聚合木葡聚糖、或其组合。