CN1205753A - 木葡聚糖内切转糖苷酶(xet)的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及提供具有改进的强度和/或形状保持性能和/或抗皱性能的纤维质原料如织物制品或纸和纸浆制品的方法,该方法包括在含水介质中将该纤维质原料与木葡聚糖内切转糖苷酶(XET)接触。

Description

木葡聚糖内切转糖苷酶(XET)的应用
本发明涉及提供具有改进的强度和/或形状保持性能和/或抗皱性能的纤维质原料的方法。
现在，实际上所有等级的纸、纸板等都是从含水纸浆生产的。一般地，使纸浆悬浮于水，与各种添加剂混合后通过一套设备，在其中纸、纸板等被加工成形、压榨和干燥。不管利用的是机械生产的纸浆、半化学法生产的纸浆、未漂白的化学纸浆还是从回收的纤维制品制得的纸浆(即从回收的纸、破布等制备的纸浆)，常需加入各种补强剂于纸浆中以得到具有适当强度的终产品。至于用作包装等的纸和纸板，干和湿条件下的抗张强度和撕裂强度是头等重要的；此外，值得注意的是某些等级的纸板(例如所谓的未漂白纸板，它用于制作供包装、运输等的波纹纸板盒)，原料的抗压强度通常也是一个重要因素。
在现今使用的补强剂中，有一些不合乎环境要求的物质需要用更合乎环境要求的原料来代替。需指出的这类物质实例如表氯醇、脲甲醛、蜜胺甲醛。
工业上还探寻环境许可的方法以提高棉纺织品的强度和/或形状保持性能和/或抗皱性能。现在应用的有各种交联技术：
*DMU技术，其中应用二甲脲和一种催化剂，该技术的缺点在于释放甲醛；
*DMDHEU技术，其中应用二羟甲基二羟基亚乙基脲和一种催化剂；该技术的缺点在于释放出一些甲醛和使纤维质原料变硬；
*BTCA技术，其中应用丁烷四甲酸和一种催化剂；该技术的缺点在于形成的酯耐久性低以及该方法费用高。
因此，工业上需要探寻更合乎环境要求的方法来提高各种纤维质原料的强度和/或形状保持性能和/或抗皱性能；所述方法应优选同时给出高耐久性的产品。
意外地发现，有可能创造一种酶促方法来提高纤维质原料的强度性能，因此：
本发明涉及提供具有改进的强度和/或形状保持性能和/或抗皱性能的纤维质原料的方法，该方法包括在含水介质中将该纤维质原料与木葡聚糖内切转糖苷酶(xyloglucan endotransglycosylase，XET)接触。纤维质原料
按本发明，纤维质原料是全部地或部分地由纤维素构成的任意原料。
这类原料的实例有纸和纸浆制品以及纤维织物。
在本发明的上下文中，纤维织物是本领域已知的任意含纤维素的织物，例如棉、粘胶丝、人造丝、苎麻、亚麻、Tencel，或其混合物，或任意这些纤维的混合物，或任意这些纤维与合成纤维或羊毛的混合物例如下列混合物：棉和弹力纤维(弹力斜纹粗棉布)，Tencel和羊毛，粘胶丝和聚酯，棉和聚酯，以及棉和羊毛。
本发明上下文中的纸或纸浆制品可以是任意含木质素的原料，特别是任意木质素改性的制品如粒子板(particle boards)、纤维板或纸。木葡聚糖内切转糖苷酶(XET)
已知木葡聚糖内切转糖苷酶(XET)是一种得自植物的酶。Stephen C.Fry等在 Biochem.J(1992) 282，p.821-828中提出XET能分解并重新接合微纤丝间的木葡聚糖链，于是XET能引起植物细胞膨胀所需的壁松弛。
有人建议将XET用于调节植物的形态，参见EP 562 836 p.21.27-28。
人们认为XET存在于所有植物中，特别是所有陆地植物中。业已从双子叶植物、单子叶植物，特别是禾本科单子叶植物和百合科单子叶植物提取出XET，还从藓类植物和苔类植物提取出XET，可参见Biochem.J(1992) 282，p.823。
XET可得自实施例1(菜花)和实施例5(绿色蕃茄)中所述的植物，或者可如同 Biochem.J(1992) 282，p.821-828中所述那样获得。
XET也可通过需氧培养含有得自所述植物的适当遗传信息的已转化宿主生物体来生产，例如曲霉属(Aspergillus)，特别是米曲霉(A.oryzae)或黑曲霉(A.niger)。这类转化体可通过本领域已知方法制备和培养，例如，该XET基因可如EP 562 836中公开的那样获得，其公开的内容并入本文作参考，而包括XET DNA构建物的宿主细胞可按下列方法获得：
该宿主细胞优选是真核细胞，特别是真菌细胞如酵母或丝状真菌细胞或细菌细胞。具体地说，该细胞可能属于木霉菌属(Trichoderma)菌种，优选是Trichoderma harzianum或Trichoderma reesei，或曲霉属菌种，最优选是米曲霉或黑曲霉。真菌细胞可用这种方法转化，即原生质体形成和这些原生质体的转化，接着按本来已知的方式再生细胞壁。曲霉属作为宿主微生物的应用描述于EP 238 023(NovoNordisk A/S)，其内容并入本文作参考。该宿主细胞可以是酵母细胞，例如酵母(Saccharomyces)株，特别是酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、克鲁弗酵母(Saccharomyces kluyveri)或葡萄汁酵母(Saccharomyces uvarum)，裂殖酵母种(Schizosaccharomycessp.)的株，如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)，汉逊酵母种(Hansenula sp.)、毕赤氏酵母种(Pichia sp.)、Yarrowia sp.的株，例如Yarrowia lipolytica，或克鲁维酵母菌种(Kluyveromycessp.)，如乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)。
合适的宿主细菌实例有革兰氏阳性菌例如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、环状芽孢杆菌(Bacilluscirculans)、灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)、巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)、苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)、或浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)或鼠灰链霉菌(Streptomycesmurinus)，或者革兰氏阴性菌如大肠杆菌(E.coli)。该细菌的转化例如可通过原生质体转化或应用感受态细胞按本来已知的方法而实现。
按本发明，XET酶优选得自双子叶植物或单子叶植物，特别是选自菜花、大豆、蕃茄、马铃薯、油菜、向日葵、棉花和烟草的双子叶植物，或选自小麦、稻、玉米和甘蔗的单子叶植物。
按本发明，我们应用如下事实，即木葡聚糖存在于棉纤维中，参考文献见 Carbohydrate Research  181，1988，p.273-277，以及木葡聚糖能对纤维素产生强氢键，参考文献见 The Plant Journal  3，1993，p.1-30，于是通过将XET酶加入纤维质原料，就能增大木葡聚糖介导的纤维素纤维之间互连键的量。因此我们创造了作为前述化学法的替代方法的、环境允许的改进各种纤维质原料的强度和/或形状保持性能和/或抗皱性能的酶促方法。XET活性的测定
XET活性按Fry等在 Biochem.J.(1992) 282，p.821-828中所述的方法测定。
将20μl酶溶液加入20μl 0.25％木葡聚糖(MegaZyme，Australia)于50mM pH为6的乙酸钠缓冲液中。
加入8μl氚化的木葡聚糖低聚物([3H]XG9，得自C.Fry)，在30℃下进行反应达1小时。用缓冲剂代替该酶溶液而得空白样。加入50μl 40％乙酸终止反应。将反应混合物倾到滤纸(Whatman No3MM)上，再在60℃下干燥30分钟。将该滤纸在流动的去离子水中洗涤1小时，再在60℃下干燥30分钟。将该滤纸转至闪烁小瓶，加入5ml闪烁体(OptiPhase HiSafe，Wallac)并通过闪烁计数法分析3H。工业应用
按本发明，通过用该XET酶处理后可得到具有改进的强度性能和/或改进的形状保持性能和/或改进的抗皱性能的纤维质原料。该XET酶具有重排和连接木葡聚糖分子的能力，所述木葡聚糖分子与纤维素纤维氢键连接于是实现上述特征。
强度性能可应用本领域已知的任意方法测定，例如示于实施例3和4中的方法。
形状保持性能可用本领域已知的任意方法测定，例如公开于theATCC Test Method 88C-1992中的，“Retention of Creases in Fabricsafter Repeated Home Laundering”，该试验旨在估测反复家洗后的织物中熨烫折痕耐久性。
抗皱性能可用本领域已知的任意方法测定，例如公开于the ATCCTest Method 128-1994中的，“Wrinkle Recovery of Fabrics：Appearance Method”，该方法是测定引起皱褶后织物的外观表现。
在本专利申请的实施例2中我们阐述了棉织物含木葡聚糖，在实施例3中我们证实有可能增大棉织物的相对强度。
在本专利申请的实施例6中我们证实了XET处理可赋予纤维质原料耐久压烫性。遗憾的是我们没有证实抗皱性能的实施例，不过耐久压烫和抗皱性能多少有点相似。
为了增强XET酶的效果，在某些情况下在纤维质原料中加入木葡聚糖可能有好处，这样酶能将更多的纤维质原料连接在一起。实施例4示出在加XET酶之前将木葡聚糖加入棉织物的结果。
在自然界中XET酶在植物中起作用，所以该酶能在含水环境中起作用。
本发明的方法能在水中进行，或者可在水中在下列某些组分存在下进行，例如缓冲剂和/或润湿剂和/或稳定剂和/或聚合物和/或减小水活性的有机组分如DMSO。
合适的缓冲剂可以是磷酸盐、硼酸盐、柠檬酸盐，乙酸盐，己二酸盐，三乙醇胺，单乙醇胺，二乙醇胺，碳酸盐(特别是碱金属或碱土金属盐，具体是碳酸钠或钾，或是铵盐和HCl盐)，二胺，特别是乙二胺，咪唑，Tris或氨基酸缓冲剂。
润湿剂起改善纤维质原料润湿性的作用。该润湿剂优选是非离子型表面活性剂。
该稳定剂可以是稳定XET酶的试剂。
按本发明，在含水介质中XET的浓度可以是每g纤维质原料中0.01-1000μg酶蛋白，优选为每g纤维质原料中0.1-100μg酶蛋白。
通常，合适的做法是将反应介质(含纤维质原料和XET酶)保温至少数分钟。从1分钟至20小时的保温时间通常将是合适的，从30分钟至10小时的保温时间通常是优选的。
本发明的方法中反应介质的温度适当地可在10-50℃的范围内，它适合于所述XET酶。洗涤剂
为了改进纤维织物的强度和/或形状保持性能和/或抗皱性能，该XET酶可作为洗涤剂组合物的组分或者可作为漂洗助剂的组分或者可作为柔软剂的组分。
该洗涤剂可呈任意方便的形式，例如粉末、颗粒或液体。
该洗涤剂一般包括表面活性剂，它可以是阴离子型、非离子型、阳离子型、两性的或这些类型的混合物。该洗涤剂通常含5-30％阴离子型表面活性剂例如线型烷基苯磺酸盐(LAS)、α-烯烃磺酸盐(AOS)、脂肪醇乙氧基硫酸盐(AES)或皂。它还可含3-20％非离子型表面活性剂如壬基酚乙氧基化物或脂肪醇乙氧基化物。
该洗涤剂可含1-40％的洗涤剂助洗剂例如沸石、磷酸盐、膦酸盐、柠檬酸盐、NTA、EDTA或DTPA，或者可以是未复配洗涤剂(即基本上不含助洗剂)。它还可含其它惯常的洗涤剂组分，例如织物调节剂、泡沫促进剂、杀菌剂、荧光增白剂和香料。
液体洗涤剂可以是含水的，一般含20-70％水和0-20％有机溶剂。
pH(在洗涤剂水溶液中测定的)一般是中性或碱性，例如7-10。
该洗涤剂组合物通常包括除XET酶以外的其它酶以改进清洗性能和/或利于织物保养。这类酶包括蛋白酶、脂肪酶、角质酶、淀粉酶、纤维素酶、木葡聚糖酶、过氧化物酶和氧化酶(例如漆酶)。
本发明通过下述实施例而被进一步阐述，但不能认为这些实施例以任何方式限制所要求的本发明的范围。实施例1从菜花提取XET
将250g菜花置于750ml 50mM MES、400mM NaCl pH为6.2的缓冲液中均化。加入18.75g PVPP(聚乙烯基聚吡咯烷酮)并连续搅拌10分钟。过滤该浆料，在10000xg下离心30分钟。在上清液中加入(NH4)2SO4ad 80％(516g/l)，搅拌该混合物直至(NH4)2SO4溶解。继续搅拌20分钟。在18000xg下离心30分钟后将沉淀物悬浮于25mM MES(pH5.8)，并以1∶1加入饱和(NH4)2SO4。20分钟后，在18000xg下离心该悬浮液30分钟，将沉淀物溶于50ml 25mM MES(pH5.8)，再对5l 25mM MES(pH5.8)渗析一夜。更换该缓冲液继续渗析1小时。将渗析后的样品以2ml/min加入在25mM MES(pH5.8)中校正过的5ml HiTrapSP阳离子交换柱(Pharmacia)，在2倍于柱体积的相同缓冲液中洗涤该柱。用2体积的25mM MES 500mM NaCl(pH5.8)洗脱结合的蛋白质。汇集含XET活性的级分，以0.5ml/min加入在25mM MES 35％(NH4)2SO4(pH5.8)中校正过的4ml OcthylSepharose(Pharmacia)柱。在2倍于柱体积的相同缓冲液和2体积的25mM MES 20％(NH4)2SO4(pH5.8)中洗涤该柱。用3体积的25mMMES 40％乙二醇(pH5.8)洗脱结合的蛋白质。汇集含XET活性的级分得总体积为10ml，按前述方法测得其中XET的浓度约为1μg/ml。
汇集的级分不含纤维素酶活性(在得自MegaZyme的AZCL-HE-纤维素上测定的)，无木葡聚糖酶活性(在得自MegaZyme的AZCL-木葡聚糖上测定的)且无纤维素二水解酶(cellobiohydrolase)活性(由酸溶胀微晶纤维素(Avicel)形成还原糖来测定)。实施例2XET介导的将〔 3 HXG9〕掺入棉织物
将0.05g棉织物加入600μl 50mM乙酸钠(pH6.0)、16μl〔3HXG9〕和40μl如实施例1中所述得到的菜花XET溶液。
在30℃下保温一夜。将棉织物在流水中洗涤1小时，再在65℃下干燥30分钟。将该片织物转至闪烁小瓶，按所述方法分析3H。准备两个空白样，其中一个用缓冲剂代替XET溶液，而另一个则通过煮沸20分钟将XET溶液灭活。每分钟数目(CPM)见表1：
表1：木葡聚糖低聚物在棉织物中的掺入
    CPM
    无XET     23
    灭活的XET     24
    XET     149
表1中的结果表明，棉织物含木葡聚糖，该木聚糖上可通过XET的作用连接其它木葡聚糖分子。实施例3织物强度的测定
如下实施例阐述了木葡聚糖内切转糖苷酶(XET)赋予纤维素织物改进的强度性能的能力。用如实施例1中所述得自菜花的XET进行试验。
在25℃下，将纺织的100％棉的小块布样(4片，大小为1.5cm×4.0cm)与约50ng XET在40ml 50mM Tris缓冲液(pH5.8)中保温3小时。作为对比的空白试验中未加XET。
保温后，将小布样在去离子水中小心地漂洗，再切成1.0cm×3.0cm大小以避免在局部无捻丝端测定。
漂洗后，在测定湿抗张强度之前将小布样在去离子水中保持15分钟。
在夹具距离为2.5cm时用INSTRON Model 5564测定小布样(长度方向)的抗张强度。
结果列于下表2中：
    样品     相对湿抗张强度，平均值
    空白(只有缓冲剂)     100％
    XET     107.5％
实施例4纤维素织物与木葡聚糖一起保温
如下实施例阐述了：将纤维素织物与木葡聚糖一起保温后再用木葡聚糖内切转糖苷酶(XET)处理可作为一种赋予纤维素织物改进的强度性能的替代方法。
用如实施例1中所述得自菜花的XET进行试验。
将纺织的100％棉的小块布样(8片，大小为1.5cm×4.0cm)浸泡在25℃下100ml含下列物质的去离子水中达15分钟：0.50g/l得自罗望子籽的木葡聚糖(木葡聚糖(Amyloid)，Lot TXG90901，得自MegaZyme，Australia)。从木葡聚糖溶液中取出小布样。趁湿将其中的4片与约50ng XET于40ml 50mM Tris缓冲液(pH5.8)在25℃下保温3小时，而余下的4片则在不存在XET的40ml Tris缓冲液(pH5.8)中保温(空白样)。
保温后，将小布样在去离子水中小心地漂洗，再切成1.0cm×3.0cm大小以避免在局部无捻丝端测定。漂洗后，在测定湿抗张强度之前将小布样于去离子水中保持15分钟。在夹具距离为2.5cm时用INSTRON Model 5564测定小布样(长度方向)的湿抗张强度。
结果列于下表3中：
    样品     相对湿抗张强度，平均值
    空白(只有缓冲剂)     100％
    XET     115.9％
实施例5从绿蕃茄提取XET
将10kg绿蕃茄都切成两半，除去籽后立即在液氮中冷冻。将所得7.2kg冷冻的蕃茄悬浮于含1％聚乙烯基聚吡咯烷酮的10.8kg 0.1M磷酸钠缓冲液(pH7.2)。将该悬浮液在0℃下的磨中边冷却边均化。在0℃下搅拌该浆状物达1小时后过滤得13.7kg滤液。将温度保持在3℃以下。加入8.3kg硫酸铵，在0℃下搅拌该溶液达45min。通过离心回收沉淀的原料。将沉淀物溶于2l 0.2M乙酸钠(pH5.7)得总体积为7.4l。然后添加1.2l饱和硫酸铵溶液。在3℃下搅拌15min后通过离心回收沉淀的原料。将沉淀物溶于500ml 0.2M乙酸钠缓冲液(pH5.7)，再对相同的缓冲液在3℃下渗析一夜。渗析管是得自Sigma的D0655，截断值为12000Da。离心渗析管的内含物，得600ml XET溶液。
通过XET分析确证XET活性，再通过在pH6.0时用得自Megazyme，Australia的AZCL-HE-纤维素和AZCL-木葡聚糖测试而确证没有纤维素酶活性和木葡聚糖酶活性。
将蕃茄XET溶液用于测试对棉织物的耐久压烫整理效果(实施例6)和测试对纸的增强作用(实施例7)。实施例6应用XET的耐久压烫
将4片白色机织织物(6cm×140cm)用0.05％Termamyl 300L的溶液(由Novo Nordisk生产)在60℃下脱浆10分钟。将该织物在水中漂洗10分钟。将织物转至4个盛蒸馏水的浅盘，在其中的两个中另加入0.1％木葡聚糖(罗望子胶，Lot TXG 90901，得自MegaZyme，Australia)。浸泡1小时后从溶液中取出布片，在水中漂洗10分钟。
将每片布折叠6回后放入盛有0.2M乙酸钠缓冲液(pH5.5)的浅盘中。在两个浅盘中加入10ml含得自绿蕃茄(见实施例5)的XET的溶液。用缓冲液将体积调节至总体积为150ml。在每片折叠的小布样上面施加一重力(2.5kg)使之对折叠的织物产生均匀的压力。在室温(约25℃)的暗室中保温24小时后，将织物在洗衣机中以短周期40℃程序用水漂洗。使小布片干燥平整直至第二天早上。目测织物的折痕。显然XET处理可赋予耐久压烫，因为只有XET处理过的布片保持了压烫褶皱：
    XET     木葡聚糖     目视观测
    无     无     无折痕
    有     无     在折叠处有清楚的折痕
    无     有     在折叠处可能有些折痕
    有     有     在折叠处有清楚的折痕
结论：XET处理过的织物有能容易用目视观测的折痕。对折痕来说，添加木葡聚糖是不必要的，但加入木葡聚糖有显示折痕的倾向。实施例7应用XET增强纸
在PFI纸张模具中制作松树TMP纸浆的手抄纸(130g/m2)。然后在纸页压榨器中以400kPa的压力将纸张压榨5分钟。压榨后，将湿纸张置于网上再浸入不同的溶液。所有情况下纸张都浸渍30分钟，溶液的温度为25℃。
所述不同的溶液如下所示：对照：浸入水中木葡聚糖内切转糖苷酶：浸入XET的溶液(得自实施例5该酶贮存液的6.67％溶液。每张纸吸收约1.8g酶溶液，它相当于每克纤维干物质0.45g酶溶液。)
浸渍后，将纸张置于纸页压榨器中在400kPa的压力下压榨15分钟。压榨后，在室温下使纸张干燥一夜。
按SCAN标准SCAN-P7和SCAN-P16测定纸张的厚度和拉伸指数。
从这些实验发现，加入XET可增大纸张的抗张强度：
处理 抗张强度(kNm/kg)
对照 4.12-4.57
XET 8.95-8.40

Claims (12)

1.提供具有改进的强度和/或形状保持性能和/或抗皱性能的纤维质原料的方法，该方法包括在含水介质中将该纤维质原料与木葡聚糖内切转糖苷酶(XET)接触。
2.权利要求1的方法，其中该纤维质原料是纤维织物或纸和纸浆制品。
3.权利要求1的方法，其中该XET酶可得自植物。
4.权利要求3的方法，其中该植物选自双子叶植物和单子叶植物。
5.权利要求4的方法，其中所述双子叶植物选自菜花、大豆、蕃茄、马铃薯、油菜、向日葵、棉花和烟草。
6.权利要求4的方法，其中所述单子叶植物选自小麦、稻、玉米和甘蔗。
7.权利要求1的方法，其中该XET酶是通过需氧培养含有适当的植物遗传信息的已转化宿主生物体而生产的。
8.权利要求1的方法，其中XET的浓度相当于每g纤维质原料0.01-1000μg酶蛋白，特别是每g纤维质原料0.1-100μg酶蛋白。
9.权利要求1的方法，其中的含水介质还含有木葡聚糖。
10.通过权利要求1-9中任一项的方法而得到的纤维质原料。
11.木葡聚糖内切转糖苷酶在改进纤维质原料的强度性能方面的应用。
12.包括木葡聚糖内切转糖苷酶(XET)和表面活性剂的洗涤剂组合物。
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