CN109536475A - 处理纤维素材料的新颖蛋白 - Google Patents

处理纤维素材料的新颖蛋白 Download PDF

Info

Publication number
CN109536475A
CN109536475A CN201811170695.2A CN201811170695A CN109536475A CN 109536475 A CN109536475 A CN 109536475A CN 201811170695 A CN201811170695 A CN 201811170695A CN 109536475 A CN109536475 A CN 109536475A
Authority
CN
China
Prior art keywords
polypeptide
enzyme
sequence
seq
polynucleotides
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201811170695.2A
Other languages
English (en)
Inventor
苏珊娜·梅基宁
卡里·云图宁
亚历山大·科曼德
基姆·朗费尔德
亚里·韦赫曼佩雷
泰尔希·普拉宁
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Roal Oy
Original Assignee
Roal Oy
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Roal Oy filed Critical Roal Oy
Publication of CN109536475A publication Critical patent/CN109536475A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2434—Glucanases acting on beta-1,4-glucosidic bonds
    • C12N9/2437—Cellulases (3.2.1.4; 3.2.1.74; 3.2.1.91; 3.2.1.150)
    • D—TEXTILES; PAPER
    • D06—TREATMENT OF TEXTILES OR THE LIKE; LAUNDERING; FLEXIBLE MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • D06M—TREATMENT, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE IN CLASS D06, OF FIBRES, THREADS, YARNS, FABRICS, FEATHERS OR FIBROUS GOODS MADE FROM SUCH MATERIALS
    • D06M16/00—Biochemical treatment of fibres, threads, yarns, fabrics, or fibrous goods made from such materials, e.g. enzymatic
    • D06M16/003—Biochemical treatment of fibres, threads, yarns, fabrics, or fibrous goods made from such materials, e.g. enzymatic with enzymes or microorganisms
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K20/00—Accessory food factors for animal feeding-stuffs
    • A23K20/10—Organic substances
    • A23K20/142—Amino acids; Derivatives thereof
    • A23K20/147—Polymeric derivatives, e.g. peptides or proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K20/00—Accessory food factors for animal feeding-stuffs
    • A23K20/10—Organic substances
    • A23K20/189—Enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11D—DETERGENT COMPOSITIONS; USE OF SINGLE SUBSTANCES AS DETERGENTS; SOAP OR SOAP-MAKING; RESIN SOAPS; RECOVERY OF GLYCEROL
    • C11D3/00—Other compounding ingredients of detergent compositions covered in group C11D1/00
    • C11D3/16—Organic compounds
    • C11D3/38—Products with no well-defined composition, e.g. natural products
    • C11D3/386—Preparations containing enzymes, e.g. protease or amylase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11D—DETERGENT COMPOSITIONS; USE OF SINGLE SUBSTANCES AS DETERGENTS; SOAP OR SOAP-MAKING; RESIN SOAPS; RECOVERY OF GLYCEROL
    • C11D3/00—Other compounding ingredients of detergent compositions covered in group C11D1/00
    • C11D3/16—Organic compounds
    • C11D3/38—Products with no well-defined composition, e.g. natural products
    • C11D3/386—Preparations containing enzymes, e.g. protease or amylase
    • C11D3/38645—Preparations containing enzymes, e.g. protease or amylase containing cellulase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2434—Glucanases acting on beta-1,4-glucosidic bonds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/02—Monosaccharides
    • D—TEXTILES; PAPER
    • D06—TREATMENT OF TEXTILES OR THE LIKE; LAUNDERING; FLEXIBLE MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • D06P—DYEING OR PRINTING TEXTILES; DYEING LEATHER, FURS OR SOLID MACROMOLECULAR SUBSTANCES IN ANY FORM
    • D06P5/00—Other features in dyeing or printing textiles, or dyeing leather, furs, or solid macromolecular substances in any form
    • D06P5/15—Locally discharging the dyes
    • D06P5/158—Locally discharging the dyes with other compounds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11D—DETERGENT COMPOSITIONS; USE OF SINGLE SUBSTANCES AS DETERGENTS; SOAP OR SOAP-MAKING; RESIN SOAPS; RECOVERY OF GLYCEROL
    • C11D2111/00—Cleaning compositions characterised by the objects to be cleaned; Cleaning compositions characterised by non-standard cleaning or washing processes
    • C11D2111/10—Objects to be cleaned
    • C11D2111/14—Hard surfaces
    • C11D2111/20—Industrial or commercial equipment, e.g. reactors, tubes or engines
    • D—TEXTILES; PAPER
    • D06—TREATMENT OF TEXTILES OR THE LIKE; LAUNDERING; FLEXIBLE MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • D06M—TREATMENT, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE IN CLASS D06, OF FIBRES, THREADS, YARNS, FABRICS, FEATHERS OR FIBROUS GOODS MADE FROM SUCH MATERIALS
    • D06M2101/00—Chemical constitution of the fibres, threads, yarns, fabrics or fibrous goods made from such materials, to be treated
    • D06M2101/02—Natural fibres, other than mineral fibres
    • D06M2101/04—Vegetal fibres
    • D06M2101/06—Vegetal fibres cellulosic
    • D—TEXTILES; PAPER
    • D06—TREATMENT OF TEXTILES OR THE LIKE; LAUNDERING; FLEXIBLE MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • D06M—TREATMENT, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE IN CLASS D06, OF FIBRES, THREADS, YARNS, FABRICS, FEATHERS OR FIBROUS GOODS MADE FROM SUCH MATERIALS
    • D06M2200/00—Functionality of the treatment composition and/or properties imparted to the textile material
    • D06M2200/35—Abrasion, pilling or fibrillation resistance
    • D—TEXTILES; PAPER
    • D06—TREATMENT OF TEXTILES OR THE LIKE; LAUNDERING; FLEXIBLE MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • D06M—TREATMENT, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE IN CLASS D06, OF FIBRES, THREADS, YARNS, FABRICS, FEATHERS OR FIBROUS GOODS MADE FROM SUCH MATERIALS
    • D06M2200/00—Functionality of the treatment composition and/or properties imparted to the textile material
    • D06M2200/50—Modified hand or grip properties; Softening compositions
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
    • Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Textile Engineering (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Detergent Compositions (AREA)

Abstract

本发明涉及处理纤维素材料的新颖蛋白，更具体而言，本发明公开了新颖多肽和包含它们的酶制剂，所述多肽和酶制剂即使在升高的温度下也增强纤维素降解的效率。所述多肽通过重组技术制造，并且描述了它们的制备的方法。新颖多肽在处理生物质、和在生物燃料、淀粉、纺织品、清洁剂、纸浆和纸、食物、饲料或饮料工业中是有用的。它们也可以用在例如清洁洗碗机机器的内部或用于生物整理或生物打磨。新颖多肽在动物饲料中也是有用的。

Description

处理纤维素材料的新颖蛋白
本申请为国际申请日2013年5月24日、国际申请号PCT/FI2013/050568于2014年12月5日进入中国国家阶段、申请号201380029931.8、发明名称“处理纤维素材料的新颖蛋白”的分案申请。
导致本发明的工作已经收到来自欧盟第七框架计划FP7/2007-2-13在授予协议号码239341下提供的资金。
技术领域
本发明涉及新颖多肽和包含它们的酶制剂，所述多肽和酶制剂即使在升高的温度下也增强纤维素降解的效率。本发明也涉及多核苷酸、载体和包含所述多核苷酸的宿主细胞以及制造所述多肽的方法。另外，本发明涉及用所述新颖多肽或酶制剂处理纤维素材料的方法，其中纤维素材料的水解得到增强。所述新颖多肽在处理纤维素材料中是有用的。此外，所述新颖多肽可用在清洁剂组合物中、用在机器洗碗应用中或用于改进动物饲料的质量。
背景技术
矿物燃料的有限资源和从它们释放的增加的CO2的量和引起温室现象已经提出了使用生物质作为可再生的和清洁的能量源的需要。生物质资源可大体上分为基于农业的或基于林业的，包括来源于农业和木材工业的二级来源、废物来源和城市固体废物。一种有前途的可选技术是从木质纤维素材料生成生物燃料即(生物)乙醇。
在植物中的多数碳水化合物是木质纤维素的形式，木质纤维素基本上由纤维素、半纤维素和木质素组成。木质纤维素可以通过水解为可发酵的糖然后发酵而转化为生物乙醇和其他的化学产物。在传统的木质纤维素到乙醇的方法中，木质纤维素材料首先化学地或物理地进行预处理以制造更加易于水解的纤维素级分。所述纤维素级分然后被水解以得到糖，所述糖可被酵母菌或其他发酵微生物发酵成乙醇，并且蒸馏以得到纯的乙醇。木质素作为主要的共产物获得，可用作固体燃料。
从纤维素生物质和木质纤维素生物质制造生物燃料的一个障碍是细胞壁的坚固性和糖单体以难以接近的聚合物的形式存在，这需要大量的处理以使得糖单体能够被通常用于通过发酵制造乙醇的微生物所利用。酶水解被认为是用于将纤维素生物质转化成可发酵的糖的最有前途的技术。但是，酶水解仅仅用到在工业规模的有限的量，并且尤其当使用强木质化的材料例如木材或农业废物时该技术不尽理想。酶催化步骤的成本是该方法的一个主要的经济学因素。已经做出努力以改进纤维素材料的酶催化水解的效率(Badger2002)。
除了改进关于各个纤维素水解酶的性质外，通过影响纤维素酶对木质纤维素的活性以改进纤维素材料的酶催化降解也是有利的。优化纤维素酶混合物中组分和补充其他的协同性作用的酶将改进水解效率。
WO2005074647和WO2011035027公开了从太瑞斯梭孢壳霉(Thielaviaterrestris)分离的具有纤维素水解增强活性的多肽和其多核苷酸。WO2005074656公开了从金黄色嗜热子囊菌(Thermoascus aurantiacus)分离的具有纤维素水解增强活性的多肽及其多核苷酸。WO2007089290公开了从里氏木霉(Trichoderma reesei)分离的具有纤维素水解增强活性的多肽和其多核苷酸。WO2008140749涉及用纤维素水解酶组合物降解或转化含纤维素的材料的组合物和方法，所述纤维素水解酶组合物包括具有纤维素水解增强活性的里氏木霉多肽和选自具有内切葡聚糖酶活性或纤维二糖水解酶活性的CEL7、CEL12和CEL45多肽的一或多种组分。WO2009085868涉及从嗜热毁丝霉(Myceliophthorathermophila)分离的具有纤维素水解增强活性的多肽和其多核苷酸。WO2009033071涉及来自Chrysosporium lucknowense(现在重新鉴定为嗜热毁丝霉(Myceliophthorathermophile)；Visser等2011)的真菌酶，和涉及在多种其他过程中使用该酶和这样的酶的组合物的方法，所述过程包括洗衣服、清洁过程、生物精炼、脱墨和纸和纸浆的生物漂白、和废物流的处理。
然而，仍然存在对降解纤维素底物尤其是木质纤维素底物的新的有效的方法、和对能相当地改进纤维素酶混合物的水解效率并降低需要的酶剂量的新的纤维素酶增强因子的不断需要。也存在对多用途的和能给出更多灵活的方法构造的设计的方法的需要。此外，存在对既能在中等温度运作又能在高温运作的方法的需要，高温运作因此增加了反应速率并且使高的生物质一致性的使用能够产生高的糖和乙醇浓度。这个方法在能量和投资花费上可产生显著的节省。高温也降低了在水解期间污染的风险。本发明旨在满足这些需要的至少部分。
发明内容
本发明的目标是提供新颖多肽和包含它们的酶制剂，所述多肽和酶制剂即使在升高的温度下也增强纤维素降解的效率。本发明的目标尤其是提供多肽以改进木质纤维素底物的水解以制造乙醇。本发明的另一个目标是提供处理纤维素材料的方法，其中纤维素材料的水解得到增强，并且其中多用途的方法构造在各种条件下是可能的。
本发明的目标由从嗜热枝顶孢菌(Acremonium thermophilium)或白马兰诺菌(Melanocarpus albomyces)获得的GH家族61的新颖多肽实现。
本发明提供了GH61多肽，所述多肽包含与SEQ ID NO:23具有至少75％序列同一性的氨基酸序列、与SEQ ID NO:24具有至少78％序列同一性的氨基酸序列或与SEQ ID NO:25具有至少79％序列同一性的氨基酸序列、或其能够增强纤维素材料水解的片段或变体。
本发明也涉及选自如下的分离的多核苷酸：
a)包括如在SEQ ID NO:20、21或22所示的编码序列的多核苷酸；
b)编码权利要求1的多肽的多核苷酸；
c)编码由a)或b)的多核苷酸编码的多肽的片段的多核苷酸，其中所述片段能够增强纤维素材料的水解；和
d)包含与a)或b)的多核苷酸的核苷酸序列简并的核苷酸序列的多核苷酸；
或者这样的多核苷酸的互补链。
本发明也涉及载体，所述载体包含所述多核苷酸和包含所述载体的宿主细胞。具有保藏编号DSM 25497、DSM 25495和DSM 25499的大肠杆菌(Escherichia coli)菌株也包括在本发明内。
本发明的另一目标是提供制造所述GH61多肽的方法，所述方法包括步骤：用编码所述多肽的表达载体转化宿主细胞，和在允许所述多肽表达的条件下培养所述宿主细胞，和任选地回收和纯化所述多肽。
本发明的其他目标是包含至少一种新颖多肽的酶制剂和所述酶制剂和多肽用于生物质加工的用途、和在生物燃料、淀粉、纺织品、清洁剂、纸浆和纸、食物、饲料或饮料工业中的用途。在本发明的一个方面，所述多肽和包含所述多肽的酶制剂用于清洁洗碗机的内部。在另一个方面，本发明提供包含所述新颖多肽的动物饲料。
本发明也提供了用GH61多肽或包含所述多肽的酶制剂处理纤维素材料的方法，其中所述方法包括将纤维的材料/纤维素材料与所述多肽或包含所述多肽酶制剂反应。在本发明的优选方面，本发明的方法包括清洁洗碗机的内部。
本发明也提供了包含GH61多肽的清洁剂组合物。本发明还涉及用于改进清洁剂组合物的织物护理性质或纺织品清洁效果的方法，所述方法包括在清洁剂组合物中添加本发明的多肽。
本发明的特定的实施方案在从属权利要求中阐述。从接下来的附图、详细的描述和实施例中，本发明的其他目标、细节和优点将变得显而易见。
本发明的发明人发现所述新颖GH61多肽和本发明的方法提供了相当大的潜能以增加纤维素酶混合物的总的性能并且降低实现有效的木质纤维素底物水解所需要的蛋白装载。所述新颖GH61多肽可用于水解不同的纤维素材料，尤其与用于各种纤维素材料或木质纤维素材料的水解的酶组合使用。
本发明的发明人也发现所述新颖GH61多肽在宽广的温度范围是非常有效的，并且尽管它们在标准水解温度下具有高的纤维素水解增强活性，但它们在高温下也是非常有效的。这使它们对于在传统温度和升高的温度下实施的变化的纤维素底物水解方法是极其适合的。在传统的分步水解发酵法(SHF)中，酶水解的温度通常高于发酵的温度。在水解中使用热稳定酶提供了潜在的好处，例如在升高的温度下的较高的反应速率、由于酶的高的特异活性和稳定性而导致的酶装载的降低、关于方法构造的增加的灵活性和降低的污染风险。与嗜常温的酶相比，热稳定酶通常的稳健性也增加了工业方法中酶的可回收性。
另外，本发明的发明人惊讶地发现本发明的新颖GH61多肽在减少通常于洗碗机的过滤器中发现的纤维性纤维/纤维素纤维是有效的。
附图说明
接下来本发明将通过优选的实施方案参照附图更详细地加以描述。
图1示意性地显示了在里氏木霉中用于表达cel61基因的盒。cel61基因受里氏木霉cbh1/cel7A启动子(cbh1启动子)控制并且通过使用里氏木霉cbh1/cel7A终止子序列(cbh1终止子)保证转录的终止。amdS基因作为转化标记物被包含在里面。
图2显示了蒸气爆破的硬木用包含本发明的GH61蛋白的酶混合物进行水解的结果。具有12％干物质的硬木底物在37℃、45℃、50℃和55℃下用不同的酶混合物在2mg蛋白每克总固体的剂量进行水解。使用了包含GH61蛋白太瑞斯梭孢壳霉Tt_GH61E(混合物1_TT)、嗜热枝顶孢菌At_GH61(混合物1_AT)和白马兰诺菌Ma_GH61A(混合物1_MA)的酶混合物。酶混合物混合物1的详细的组成和包含测试的GH61蛋白的组合物在实施例5中加以描述。水解72小时后，从副本试管中采样并且通过HPLC定量，其中确定了葡萄糖的浓度。
图3显示了研磨的苹果/橘子/小麦纤维混合物用包含本发明的GH61蛋白的酶混合物进行水解的结果。测试在稀释的pH4.0的柠檬酸缓冲液中进行，所述柠檬酸缓冲液包含约0.5％(w/w)的丙二醇和等量的每一种纤维，具有4g每升的最终固体浓度。在25mg蛋白每克总固体的剂量添加酶到500ml的摇瓶中。基础的里氏木霉纤维素酶混合物(Roal Oy)用作对照。空白没有包含任何添加的酶。对于对照、含有72％(w/w)的里氏木霉纤维素酶混合物和28％(w/w)的GH61蛋白At_GH61或Ma_GH61A的混合物，展示它们在50℃水解60分钟后的纤维素重量的百分比。在图内包含了标准偏差。
序列表
SEQ ID NO:1来自嗜热枝顶孢菌ALKO4245 At_GH61蛋白的胰蛋白酶肽1669,824的序列。
SEQ ID NO:2来自嗜热枝顶孢菌ALKO4245 At_GH61蛋白的胰蛋白酶肽1763,938的序列。
SEQ ID NO:3来自嗜热枝顶孢菌ALKO4245 At_GH61蛋白的胰蛋白酶肽431.7752的序列。
SEQ ID NO:4来自嗜热枝顶孢菌ALKO4245 At_GH61蛋白的胰蛋白酶肽882.9711的序列。
SEQ ID NO:5来自嗜热枝顶孢菌ALKO4245 At_GH61蛋白的胰蛋白酶肽855.9166的序列。
SEQ ID NO:6来自白马兰诺菌ALKO4237 Ma_GH61B蛋白的氨基末端肽#4349的序列。
SEQ ID NO:7来自白马兰诺菌ALKO4237 Ma_GH61B蛋白的胰蛋白酶肽2130,813的序列。
SEQ ID NO:8来自白马兰诺菌ALKO4237 Ma_GH61B蛋白的胰蛋白酶肽1283,527的序列。
SEQ ID NO:9来自白马兰诺菌ALKO4237 Ma_GH61B蛋白的胰蛋白酶肽2131,948的序列。
SEQ ID NO:10来自白马兰诺菌ALKO4237 Ma_GH61B蛋白的胰蛋白酶肽4466,106的序列。
SEQ ID NO:11衍生自肽SEQ ID NO:5的寡核苷酸引物FIB54的序列。
SEQ ID NO:12衍生自肽SEQ ID NO:1的寡核苷酸引物FIB57的序列。
SEQ ID NO:13衍生自肽SEQ ID NO:6的寡核苷酸引物FIB99的序列。
SEQ ID NO:14衍生自肽SEQ ID NO:9的寡核苷酸引物FIB101的序列。
SEQ ID NO:15寡核苷酸引物FIB35的序列。
SEQ ID NO:16寡核苷酸引物FIB38的序列。
SEQ ID NO:17使用引物FIB54(SEQ ID NO:11)和FIB57(SEQ ID NO:12)和嗜热枝顶孢菌ALKO4245基因组DNA作为模板获得的PCR片段的序列。
SEQ ID NO:18使用引物FIB99(SEQ ID NO:13)和FIB101(SEQ ID NO:14)和白马兰诺菌ALKO4237基因组DNA作为模板获得的PCR片段的序列。
SEQ ID NO:19使用引物FIB35(SEQ ID NO:15)和FIB38(SEQ ID NO:16)和白马兰诺菌ALKO4237基因组DNA作为模板获得的PCR片段的序列。
SEQ ID NO:20全长嗜热枝顶孢菌ALKO4245 cel61基因At_cel61的核苷酸序列。
SEQ ID NO:21全长白马兰诺菌ALKO4237 cel61基因Ma_cel61a的核苷酸序列。
SEQ ID NO:22全长白马兰诺菌ALKO4237 cel61基因Ma_cel61b的核苷酸序列。
SEQ ID NO:23从全长嗜热枝顶孢菌ALKO4245 GH61蛋白(At_GH61)推导的氨基酸序列，包括从Met1到Gln328的氨基酸。
SEQ ID NO:24从全长白马兰诺菌ALKO4237 GH61蛋白(Ma_GH61A)推导的氨基酸序列，包括从Met1到Cys246的氨基酸。
SEQ ID NO:25从全长白马兰诺菌ALKO4237 GH61蛋白(Ma_GH61B)推导的氨基酸序列，包括从Met1到Cys225的氨基酸。
保藏
嗜热枝顶孢菌ALKO4245于2004年9月20号保藏在Upsalalaan 8，3584CT，Utrecht，Netherlands的荷兰微生物菌种保藏中心(Centraalbureau Voor Schimmelcultures)并且指定保藏编号CBS 116240。
白马兰诺菌ALKO4237于2012年3月2号保藏在Upsalalaan 8，3584 CT，Utrecht，Netherlands的荷兰微生物菌种保藏中心并且指定保藏编号CBS132099。ALKO4237菌株之前于1995年也已经保藏在Oosterstraat 1,3740AG BAARN，Netherlands的荷兰微生物菌种保藏中心，保藏编号CBS 685.95。
包含质粒pALK2992的大肠杆菌菌株RF9002于2011年12月15号保藏在Inhoffenstrasse7B,D-38124Braunschweig,Germany的德国微生物菌种保藏中心(Deutsche Ssmmlung von Mikroorganismen und Zellkulturen Gmbh(DSMZ))并且指定保藏编号DSM25494。
包含质粒pALK2993的大肠杆菌菌株RF9091于2011年12月15号保藏在Inhoffenstrasse7B,D-38124 Braunschweig,Germany的德国微生物菌种保藏中心(DSMZ)并且指定保藏编号DSM25495。
包含质粒pALK3374的大肠杆菌菌株RF9150于2011年12月15号保藏在Inhoffenstrasse7B,D-38124 Braunschweig,Germany的德国微生物菌种保藏中心(DSMZ)并且指定保藏编号DSM25496。
包含质粒pALK3375的大肠杆菌菌株RF9319于2011年12月15号保藏在Inhoffenstrasse7B,D-38124 Braunschweig,Germany的德国微生物菌种保藏中心(DSMZ)并且指定保藏编号DSM25497。
包含质粒pALK3378的大肠杆菌菌株RF9537于2011年12月15号保藏在Inhoffenstrasse7B,D-38124 Braunschweig,Germany的德国微生物菌种保藏中心(DSMZ)并且指定保藏编号DSM25498。
包含质粒pALK3379的大肠杆菌菌株RF9696于2011年12月15号保藏在Inhoffenstrasse7B,D-38124 Braunschweig,Germany的德国微生物菌种保藏中心(DSMZ)并且指定保藏编号DSM25499。
具体实施方式
纤维素是高等植物的主要结构成分。它为植物细胞提供了高抗张强度，帮助它们抵抗机械压力和渗透压。纤维素是β-1,4-葡聚糖，由通过β-1,4-糖苷键连接的萄萄糖残基的线性链组成。纤维二糖是纤维素的最小重复单元。纤维素在细胞壁中堆叠成不同方向的片层，其嵌入纤维素和木质素的基体中。半纤维素是碳水化合物聚合物的异质性类型，其主要包含不同的葡聚糖、木聚糖和甘露聚糖。半纤维素由线性骨架组成，其中β-1,4-连接残基被通常包含乙酰基、葡萄糖醛酸基、阿拉伯糖基及半乳糖基的短侧链取代。半纤维素可以与木质素化学交联。木质素是各种取代的对羟苯基丙烷单位的复杂交联聚合物，其为细胞壁提供强度以承受机械压力，同时可保护纤维素不受酶水解。
在此使用的”纤维素”或”纤维素材料”涉及包含纤维素、半纤维素和/或木质纤维素作为显著组分的任何材料。纤维素通常例如在植物的茎、叶、壳、荚、穗或树木的叶、分枝和木材中发现。纤维素材料可以是但不限于草本材料、农业残渣、林业残渣、城市固体废物、废纸、和纸浆和纸厂残渣。纤维素材料的实例包括来自例如棉、亚麻、大麻、黄麻的纺织纤维和人造纺织纤维如莫代尔纤维、纤维胶和莱赛尔纤维。纤维素材料的实例也包括纤维性或纤维质类型的残渣如在自动洗碗机的过滤器中发现的土。
“木质纤维素”是纤维素、半纤维素和木质素的组合。其物理性质坚硬、致密且不易受影响，是生物圈最丰富的生物化学材料。“木质纤维素材料”指包含木质纤维素的任何材料。这样的材料是例如：硬木和软木屑、木浆、锯末、及林业和木业废物；农业生物质如谷草、甜菜渣、玉米纤维、玉米秸秆和穗、甘蔗渣、茎、叶、壳、荚等；废品如城市固体废物、报纸和办公室废纸、例如谷物的研磨废物；专用能源作物(例如杨柳、杨树、柳枝稷或草芦等)。优选实例是玉米纤维、玉米秸秆、柳枝稷、谷草、甘蔗渣和木材衍生材料。
纤维素材料在自然界被很多不同的生物体包括细菌和真菌降解，所述细菌和真菌制造能够水解碳水化合物聚合物的酶。降解通常需要不同的纤维素酶按顺序作用或同时作用。包含底物的更复杂的纤维素的降解需要广泛的各种酶。对于降解过程，纤维素材料可以被直接使用或经过预处理之后，使用本领域已知的常规方法进行。
“纤维素水解酶”或”纤维素酶”是具有“纤维素水解活性”的酶，这表示它们能够将有纤维质的底物或其衍生物水解为较小的糖。因此纤维素水解酶包括纤维素酶和半纤维素酶二者。半纤维素酶如木聚糖酶和甘露聚糖酶是水解半纤维素的酶。在此使用的纤维素酶包括(1)切割内部的β-1,4-糖苷键的内切葡聚糖酶(EG、EC 3.2.1.4)；(2)从结晶的纤维素聚合物链的还原端或非还原端切割二糖纤维二糖的外切葡聚糖酶或纤维二糖水解酶(CBH、EC 3.2.1.176,EC 3.2.1.91)；(3)将纤维二糖和其他短的纤维低聚糖水解为葡萄糖的β-1,4-葡萄糖苷酶(BG、EC 3.2.1.21)。CAZY(碳水化合物活性酶)分类系统根据已经显示反映共同结构特征的序列相似性将糖基水解酶(GH)酶整理成家族。除此之外，纤维素酶可以根据它们的一级序列分类到不同的糖基水解酶家族，这通过分析家族的一些成员的三维结构而得到支持(Henrissat 1991，Henrissat和Bairoch 1993，1996)。
GH61多肽具有纤维素水解增强活性，指它们通过具有纤维素水解活性的酶的催化而“增强纤维素材料的水解”。换而言之，在GH61多肽存在下用纤维素水解酶糖化纤维素材料与在仅仅纤维素水解酶存在下相比，增加了纤维素材料的降解。纤维素材料可以是包含纤维素的任何材料。术语“家族61糖苷水解酶”或“家族GH61”或“GH61多肽”指根据Henrissat B.,1991,Biochem.J.280:309-316，和Henrissat B.,和Bairoch A.,1996,Biochem.J.316:695-696落在糖苷水解酶家族61(EC 3.2.1.4)的多肽。GH61蛋白也指作CEL61蛋白。
GH61蛋白包含不具有传统糖苷水解酶活性位点的核心结构域。此外，GH61蛋白可包含糖类结合模块/结构域，也称作纤维素结合结构域(CBM/CBD)，其可以位于核心结构域的N-或C-端。一般来讲，CBM介导了蛋白与晶体纤维素的结合，但是对功能活性具有很少影响或不具有影响。这两个结构域通常通过柔韧的和高度糖苷化的连接区连接。
本发明基于试图发现新颖GH61家族多肽的研究，所述多肽能增强纤维质底物的水解效率，并且所述多肽即使在升高的温度下也能够用于多用途的应用。得到了指作At_GH61、Ma_GH61A和Ma_GH61B的三种新颖的GH 61家族多肽(表1)。
表1.本发明的GH61基因和多肽
本发明的新颖GH61多肽能够从嗜热枝顶孢菌或白马兰诺菌获得。优选地，所述多肽能够从具有保藏为CBS 116240的菌株ALKO4245的性质的嗜热枝顶孢菌菌株或具有保藏为CBS 132099的菌株ALKO4237的性质的白马兰诺菌菌株获得。“能够从…获得”指它们可以从所述种类得到，但是没有排除从其他来源得到它们的可能性。换句话讲，它们可能来自任何生物体包括植物。优选地，它们来自微生物例如细菌或真菌。细菌可以例如来自选自芽胞杆菌属(Bacillus)、固氮螺菌属(Azospirillum)及链霉菌属(Streptomyces)的类属。更加优选地，该酶来自真菌(包括丝状真菌和酵母菌)，例如来自选自嗜热子囊菌属(Thermoascus)、枝顶孢菌属(Acremonium)、毛壳菌属(Chaetomium)、无毛毛壳菌属(Achaetomium)、梭孢壳菌属(Thielavia)、曲霉菌属(Aspergillus)、葡萄孢属(Botrytis)、金孢子菌属(Chrysosporium)、金钱菌属(Collybia)、层孔菌属(Fomes)、镰孢属(Fusarium)、腐质霉属(Humicola)、肉座菌属(Hypocrea)、香菇属(Lentinus)、马兰诺菌属(Melanocarpus)、毁丝霉属(Myceliophthora)、麦瑞菌属(Myriococcum)、脉孢菌属(Neurospora)、青霉菌属(Penicillium)、毛平革菌属(Phanerochaete)、射脉菌属(Phlebia)、侧耳属(Pleurotus)、柄孢壳属(Podospora)、多孔菌属(Polyporus)、丝核菌属(Rhizoctonia)、西塔利菌属(Scytalidium)、密孔菌属(Pycnoporus)、踝节菌属(Talaromyces)、栓菌属(Trametes)和木霉菌属(Trichoderma)。
本发明的新颖GH61多肽优选地包含与SEQ ID NO:23具有至少75％序列同一性的氨基酸序列、与SEQ ID NO:24具有至少78％序列同一性的氨基酸序列或与SEQ ID NO:25具有至少79％序列同一性的氨基酸序列、或其能够增强纤维素材料水解的片段或变体。根据本发明的一个实施方案，所述多肽与SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:25或其能够增强纤维素材料水解的片段或变体具有至少80、85、90、95、98或99％同一性。根据本发明的另一个实施方案，所述多肽与SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:25或其能够增强纤维素材料水解的片段或变体具有至少90％同一性、优选地具有95％同一性、并且最优选地具有至少98％同一性。
术语“同一性”在此指两个氨基酸序列从由相应基因编码的第一个氨基酸到最后一个氨基酸相互比较的总体同一性。通过使用在EBI(欧洲生物信息学研究所)http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/的EMBOSS Needle Needleman-Wunsch总体比对程序测量全长序列的同一性，参数如下：BLOSUM50、缝隙开口10.0、缝隙延伸0.5。算法在Needleman和Wunsch(1970)中描述。本领域的技术人员知道的事实是只有当比对所述序列的相应区域并且在每次比较中使用相同的参数时，使用Needleman-Wunsch算法的结果才是可比的。因此，例如包括CBM或信号序列的纤维素酶序列与缺少这些元件的序列之间的比较无法完成。
术语“增强纤维素材料水解的片段”指所限定序列的能够增强被具有纤维素水解活性的酶催化的纤维素材料的水解的任何片段。换句话讲，增强纤维素材料水解的片段可以是所限定序列的成熟蛋白部分，或者它可以仅仅是成熟蛋白部分的片段，只要它仍然具有增强纤维素材料水解的能力。出于本发明的目的，通过测量由包含GH61多肽的纤维素水解酶混合物与等量的不包含GH61多肽的纤维素水解酶混合物的蛋白装载相比较的水解纤维素材料的总葡萄糖浓度的增加来确定纤维素水解增强活性。
新颖多肽可以是所述多肽的变体。“变体”可以是自然发生的多肽例如作为在相同菌株、种类或属中的等位变种，它也可以通过突变产生。它可以包含氨基酸的取代、缺失或插入，但其仍然与上面限定的多肽以基本上相似的方式起作用，即它包含增强纤维素材料水解的片段。
GH61通常作为包含在蛋白分泌期间切除的信号序列的前多肽在细胞中制造。它们也可以在分泌期间在N-端和/或C-端进一步加工以得到成熟的、酶活性的蛋白。“增强纤维素材料水解的多肽”因此表示多肽可以是不成熟或成熟的形式，优选地它是成熟的形式即已经经过加工。此外，“成熟的形式”指已经从其融合结构的载体蛋白切下来的酶。
本发明的多肽优选是重组蛋白，可以以通常已知的方式制备。分离了GH61基因的多核苷酸片段，将该基因在强启动子下插入表达载体中，该载体被转化到合适的宿主细胞内并且该宿主细胞在激发该酶生产的条件下培养。在不同的宿主细胞体系中通过重组技术制造蛋白的方法在本领域是已知的(Sambrook等，2001；Coen，2001；Gellissen，2005)。优选该多肽作为被分泌到培养基中的细胞外蛋白而生产，从培养基中可以将它们容易地回收和分离。
重组多肽可以是融合多肽，其中另一个多肽融合在本发明多肽的N-端或C-端。制造融合多肽的技术在本领域是已知的，并且包括连接编码所述多肽的编码序列使得它们在框架中并且使得融合多肽的表达在相同启动子和终止子的控制之下。
本发明的GH61多肽可包含信号序列或没有信号序列和/或CBM而使用，或所述信号序列和/或CBM可来自上面提到的微生物或不同微生物的不同的酶，或以合成方式或重组方式并到上面蛋白的核心结构域。
本发明涉及新颖的多核苷酸，其包括SEQ ID NO:20、21、或22的核苷酸序列、或编码如上定义的新颖多肽的序列、包括其互补链。在此使用的“多核苷酸”指RNA和DNA两者，并且它可以是单链的或双链的。另外，因为遗传密码的结果，所述多核苷酸与上面限定的任何一个序列可以是简并的。这意味着不同的密码子可编码相同的氨基酸。
多核苷酸也可以是所述多核苷酸的片段，其包括至少24核苷酸例如至少25、30、40或50个核苷酸。根据本发明的一个实施方案，所述多核苷酸具有以SEQ ID NO 11、12、13、14、15或16给出的序列。
在本发明的上下文里面的是GH61多肽，其由在严紧条件下与包括在SEQ ID NO:20、21、或22中的多核苷酸序列或其亚序列杂交的核酸分子或多核苷酸序列所编码。在“高严紧性”条件下的杂交可以是在低于计算的完美杂交的熔解温度(Tm)20-25℃的温度下杂交，该Tm根据Bolton和McCarthy(1962)和在低盐浓度下的杂交后清洁计算。通常预杂交和杂交至少在65℃在6xSSC(或6xSSPE)、5xDenhardt's试剂、0.5％(w/v)的SDS、100μg/ml变性的、成碎片的鲑精DNA中进行。添加50％的甲酰胺使预杂交和杂交温度降低到42℃。高严紧性清洁在低的盐浓度下进行，例如在室温下在2xSSC-0.1％SDS(w/v)中进行，并且最终至少在65℃例如在68℃下在0.1xSSC-0.1％SDS(w/v)中进行。
根据本发明的另一实施方案，多核苷酸包含的基因与保藏编号为DSM 25497、DSM25495或DSM 25499的微生物包含的基因相似。
本发明涉及重组表达“载体”，其包括将编码如上表征的GH61多肽的多核苷酸可操作地连接到调控序列，该调控序列能在合适的宿主中指导编码所述GH61多肽的基因的表达。所述调控序列对于生产生物体可以是同源的或异源的，或者它们可以来自生物体，从该生物体中分离编码本发明GH61多肽的基因。表达载体还可以包括用于筛选转化株的标记物基因或筛选标记物可以在另一个载体构建物中通过共转化引入到宿主。
本发明还涉及生产“宿主”，其可以是任何同源的或异源的能够表达想要多肽的生物体。优选地所述宿主是微生物细胞，更加优选地是真菌。最优选地，所述宿主是丝状真菌。用于生产本发明多肽的优选的宿主是尤其来自木霉菌属或曲霉菌属的菌株。优选地，重组宿主被修饰以使其主要活性或其主要活性之一为表达和分泌本发明的纤维素水解酶或多肽。这可通过缺失编码主要的同源的分泌的酶例如木霉菌属的四种主要纤维素酶的基因和通过整合异源的基因到具有高表达和生产水平的基因座而完成。
本发明还涉及用于生产本发明的GH61多肽的方法，所述方法包括步骤：用编码所述多肽的表达载体转化宿主细胞，和在允许所述多肽表达的条件下培养该宿主细胞，和任选地回收和纯化所述多肽。生产培养基可以是适合于生长宿主生物体和包含有效表达的诱导剂的培养基。
本发明的多肽可以是分离的，这在本发明的上下文中可仅仅指细胞和细胞碎片已经从包含所述多肽的培养基中移除。所述多肽可方便地例如通过在耗尽培养基中添加阴离子聚合物和/或阳离子聚合物(凝聚剂)以增强细胞和细胞碎片的沉淀而分离。该培养基然后用无机过滤试剂和过滤器过滤以移除形成的沉淀。在此之后，滤液进一步用半渗透膜处理以移除过量的盐、糖和代谢产物。所述多肽也可通过结晶而纯化或浓缩。
通过本发明的方法可得到的新颖GH61多肽可以是酶制剂的组分。术语“酶制剂”指包含至少一种在此描述的新颖多肽的组合物。酶制剂中的多肽可以是重组GH61蛋白，其包含与SEQ ID NO:23具有至少75％序列同一性的氨基酸序列、与SEQ ID NO:24具有至少78％序列同一性的氨基酸序列或与SEQ ID NO:25具有至少79％序列同一性的氨基酸序列、或其能够增强纤维素材料水解的片段或变体。根据本发明的一个实施方案，所述酶制剂包含与SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:25具有至少80、85、90、95、98或99％同一性的多肽。
所述酶制剂还可包括至少一种酶，该酶选自纤维二糖水解酶；内切葡聚糖酶；β-葡糖苷酶；β-葡聚糖酶；木葡聚糖酶；木聚糖酶；β-木糖苷酶；纤维二糖脱氢酶；甘露聚糖酶；β-甘露糖苷酶；α-葡糖苷酸酶；乙酰木聚糖酯酶；α-阿拉伯呋喃糖苷酶；α-半乳糖苷酶；果胶酶；包括内切和外切-α-L-阿拉伯糖酶、内切和外切-半乳糖醛酶、内切果胶酶、果胶酸脂裂解酶、和果胶酯酶；酚酯酶；包括木质素过氧化物酶的木质素酶；锰依赖性过氧化物酶；过氧化氢生成酶；昆布多糖酶；壳聚糖酶；阿魏酸酯酶和具有或没有介体的漆酶。所述酶制剂可以包含这些酶的任意组合和本发明的GH61多肽，但是这些酶不受限于在此描述的那些。它们也可以例如是可商购的酶制剂。
除GH61多肽外，所述酶制剂优选地至少包括纤维二糖水解酶、内切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶和任选地木聚糖酶。GH61多肽和纤维素水解酶的不同的混合物可用于满足不同的方法条件。
除GH61蛋白外，本发明的酶制剂还可包含添加剂例如调解剂、稳定剂、缓冲液、防腐剂、表面活性剂和/或培养基组分。优选的添加剂是那些通常用在为特别应用准备的酶制剂中的添加剂。本发明的酶制剂也可包含金属和/或氧化还原活性辅因子。
所述酶制剂可以是液体、粉末或颗粒的形式。它可以是包含一种或多种纤维素水解酶的滤液。优选地，所述酶制剂是耗尽培养基。“耗尽培养基”指包含生产的酶/多肽的宿主培养基。优选地，宿主细胞在生产后从培养基中分离。酶制剂或组合物也可以是“整体培养肉汤”，其任选地在将生产宿主或微生物去活化之后无需任何生物质分离、下游加工或想要的纤维素水解酶的纯化而得到。在合并的生物方法中，所述酶组合物或所述酶组合物的至少一些酶可以由有发酵力的微生物生产。
所述酶制剂可包含以至少部分纯化及分离的形式的多肽。它可以甚至基本上由想要的多肽组成。含有或不含有宿主细胞的培养基可以不进一步纯化用作酶制剂，因为GH61蛋白可以被分泌到培养基中并且在耗尽培养基的环境条件下显示活性。
本发明提供了处理纤维素材料的方法，其中纤维素材料与有效量的GH61多肽或包含所述GH61多肽的酶制剂在纤维素水解酶存在下、在合适条件例如合适pH和温度下反应，并且允许反应继续充足的时间以使酶促反应发生。GH61多肽在酸性、中性或碱性pH范围增强了纤维素水解酶的活性。
本发明的GH61多肽能够在中等的到升高的温度下增强纤维素材料的水解。在本发明上下文的术语“中等温度”或“常规温度”指通常用在纤维素水解中的和对应于在这样的过程中使用的酶的最佳温度或热稳定性的温度。因此，该术语指从约30℃到45℃的温度范围。术语“升高的温度”或“高温”指从约45℃到70℃的温度范围。在这样的升高的温度范围内有活性的或稳定的酶也称作“热稳定的”或“嗜热的”酶。本发明的GH61多肽优选地用在介于约35℃和60℃的温度。它们更加优选地用在介于37℃和55℃的温度，最优选地用在介于45℃和55℃的温度。此外，这些温度对于本发明的GH61多肽用于改进清洁剂组合物的织物护理性能或纺织品清洁效果和另外用在生物整理和生物打磨是适合的。
GH61多肽尤其适合用于从木质纤维素材料中制造可发酵的糖。可发酵的糖然后被酵母菌发酵成乙醇并且用作燃料。它们也可用作中间体或原材料为化学工业加工例如在所谓的生物精炼中制造各种化学物和结构单元。任何本领域已知的包括预处理、酶促水解、发酵或其组合的方法可用在本发明的上下文中。目前的预处理包括机械的、化学的或热处理和其组合。材料可例如通过蒸气爆破或酸水解预处理。
根据本发明的一个实施方案，处理纤维素材料的方法包括通过使用本发明的GH61多肽或包含所述GH61多肽的酶制剂接触洗碗机的内部的至少部分而清洁洗碗机的内部。本发明的酶制剂可以直接放入机器的内部或可选地放入机器的分配牵引部或杯(dispensingdraw or cup)或放到洗碗机内部的需要移除纤维性的土的区域(例如过滤器)。清洁洗碗机机器的有用的方法例如在WO2011161459中描述。酶制剂也可以特定地用在洗碗机机器的那些上面有纤维性/纤维质的土沉积的区域。当洗碗机没有运行或当洗碗机进行装载的或未装载的清洗和/或漂洗循环时，该方法是手动适用的。此外，本发明的GH61多肽可用在洗碗机系统的所有清洁温度，甚至在高于55℃的温度。
GH61多肽可用于降解牢固的纤维性/纤维质的土，该纤维性/纤维质的土否则很难从洗碗机机器的内部例如从过滤器移除。可以被GH61多肽或包含所述多肽的酶制剂裂解的土包括谷物、水果和蔬菜。一些特定的实例包括苹果和橘子皮和小麦纤维。
新颖的GH61多肽、酶制剂和本发明的方法可用在任何涉及纤维素水解酶的过程中，例如生物质处理，和在生物燃料、淀粉、纺织品、清洁剂、纸浆和纸、食物、饲料或饮料工业中。它们可用于处理任何纤维素材料例如纺织材料、用在动物饲料的植物、或来自木材的机械的或化学的纸浆或二级纤维。它们也可以添加进清洁剂和其他的用于这样的应用的媒介中。GH61多肽也可以添加到废水中以降低固体例如淤泥的量。
本发明的GH61多肽可用作适合于衣服清洁剂和餐具清洁组合物包括自动的餐具清洁组合物的清洁剂添加剂。清洁剂指旨在辅助清洁或具有清洁性质的物质或材料。优选地本发明的GH61多肽可用在自动的洗碗机清洁组合物中，该组合物在洗碗机系统的所有清洁温度下都很好地工作，即使在高于55℃的温度。
本发明涉及清洁剂组合物，其包括本发明的GH61多肽或酶制剂和任选地一种或多种表面活性剂。优选地清洁剂组合物包含本发明的酶制剂，该酶制剂包括至少一种GH61多肽和选自蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、脂肪酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶、角质酶、果胶酶或具有或不具有介体的氧化酶的其他酶，以及选自稳定剂、缓冲液、表面活性剂、漂白剂、调解剂、抗腐蚀剂、增洁剂、防再污染剂、光学增亮剂、染料、颜料、腐蚀剂、研磨剂和防腐剂的合适的添加剂等。例如为了通过抗起球、抗磨损、颜色澄清和软化而改进织物护理性质，和为了改进纺织品清洁效果例如移除土，纤维素水解酶可用在清洁剂组合物中。
本发明的酶制剂可包含表面活性剂，该表面活性剂可以是阴离子的、非离子的、阳离子的、两性的或这些类型的混合物，尤其当用作清洁剂组合物时。例如在WO 94/07998、美国专利号5,443,750和美国专利号3,664,961中描述了有用的清洁剂组合物。
本发明也涉及增强用于洗碗机的清洁剂组合物的清洁能力的方法，该方法包括添加本发明的多肽或酶制剂到清洁剂组合物中。另外，本发明涉及改进清洁剂组合物的织物护理性质或纺织品清洁效果的方法，该方法包括添加本发明的多肽或酶制剂到清洁剂组合物中。
本发明的酶制剂可用在纺织材料例如织物和衣服的处理中。纺织材料可由包含纤维的天然纤维素或包含纤维的人造纤维素或它们的混合物、或合成纤维和包含纤维的纤维素的掺合物而制造。本发明的酶制剂尤其在生物整理中是有用的。“生物整理”指在纤维质纤维的受控水解中使用酶以修饰织物或纱线表面，其方式为阻止永久地起球、改进织物手感例如柔软性和光滑性、通过减少绒毛以弄干净表面结构而导致颜色的澄清、改进织物的悬垂性、改进吸湿性能并且其也可能改进可染色性。其他的使用还包括在牛仔布中的生物打磨中的使用。“生物打磨”指酶促的牛仔布整理工艺，其中纤维素酶已经代替了浮石或与浮石一起使用以给出织物其想要的“穿旧的”外观。控制的酶处理对衣服和机器产生较小的伤害并且消除了丢弃石头的需要。
本发明通过如下的非限制性实施例加以描述。随着技术的进步本发明的发明构思可以以各种方式应用，这对于本领域技术人员将是显而易见的。本发明和其实施方案没有受限于描述的实施例，而是可以在本发明的范围内变化。
实施例
实施例1.来自白马兰诺菌ALKO4237和嗜热枝顶孢菌ALKO4245的GH61蛋白的纯化
真菌株嗜热枝顶孢菌ALKO4245(CBS 116240)和白马兰诺菌ALKO4237(CBS132099)在+4℃下在马铃薯葡萄糖(PD)琼脂(Difco)中生长、维持和形成孢子。ALKO4237和ALKO4245菌株的PD斜面接种到复合培养基中，该培养基包含：18g/l Solka-纤维素(International Fiber Europe N.V.，比利时)、18g/l酒槽用过的谷物、9g/l刺槐豆胶、9g/l燕麦木聚糖、4.5g/l大豆粉、3g/l麦麸、2g/l CaCO3、4.5g/l(NH4)HPO4、1.5g/l KH2PO4、1.5g/l MgSO4x H2O、0.9g/l KNO3、0.5g/l NaCl和微量元素MnSO4、ZnSO4、CoCl2和FeSO4。培养基的pH在灭菌前用KOH调至6.5-7.5并且培养基在121℃高压灭菌15分钟。微生物在42℃下在摇床(250rpm)培养7-9天。细胞和固体通过离心从耗尽培养基中移除。耗尽培养基上清液在十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析。
培养上清液经纯化步骤以分离蛋白至级分。嗜热枝顶孢菌ALKO4245的培养上清液经纤维素-亲和纯化步骤以鉴定能够结合纤维素的蛋白。将1克的纤维素粉末AlphaCelTMBH300(International Fiber Europe N.V.，比利时)悬浮在40ml Milli-Q水中。将纤维素悬浮液搅动5分钟并且在2000×g离心5分钟。将小球悬浮在纯的Milli-Q水中并且将清洁步骤重复3次。将纤维素悬浮在3ml的Milli-Q水中并且将0.5ml纤维素悬浮液添加到10ml的耗尽培养上清液和10ml的20mM Hepes、75mM NaCl的pH 7的混合物中。将样品在冰上搅动30分钟并且在2000×g离心5分钟。将小球用40ml冷的20mM Hepes、75mM NaCl、pH 7的缓冲液洗3次。通过在60℃将样品用200μl的SDS-PAGE样品缓冲液孵育10分钟从纤维素中洗脱蛋白。在SDS-PAGE凝胶上分析洗脱的蛋白并且通过氨基酸测序鉴定蛋白条带(实施例2)。
一批410ml的白马兰诺菌ALKO4237培养上清液经0.44μm滤膜过滤(MILLEXHVMillipore，马萨诸塞州，美国)。43.6g的固体硫酸铵溶于样品中并且在冰上孵育30分钟。通过在10000×g、+4℃离心15分钟收集沉淀的蛋白。将小球溶于10ml的20mM Hepes(pH7.5)中。样品经0.44μm滤膜(MILLEX HVMillipore，马萨诸塞州，美国)过滤，并且加样到5mL的用20mM Hepes(pH 7.5)平衡的Q Sepharose FF柱子(GE Healthcare，英国)。收集流经的级分并且使用Macrosep 10K离心装置(PALL Life Sciences，纽约，美国)将其浓缩至2ml。样品进一步使用经20mM MES、100mM NaCl(pH 6.5)平衡的Superdex 26/60 75pg凝胶过滤柱分级。洗脱的级分在SDS-PAGE凝胶上分析，具有根据所公开的GH61序列计算的预期大小的蛋白条带通过氨基酸测序来鉴定(实施例2)。
实施例2.来自白马兰诺菌ALKO4237和嗜热枝顶孢菌ALKO4245的纯化蛋白的氨基酸测序
为了测定内部序列，从聚丙烯酰胺凝胶中切出考马斯亮蓝染色的条带并且基本上如Shevchenko等人(1996)所描述的对其进行“凝胶内”消化。在用胰蛋白酶消化(测序级修饰的胰蛋白酶，V5111，Promega，威斯康星州，美国)和质量确定之前，用二硫苏糖醇还原蛋白和用碘乙酰胺将蛋白烷基化。
使用连接至极限纳米液体色谱柱(LC-Packings，荷兰)的Q-TOF仪器(Micromass，曼彻斯特，英国)产生从头测序的电喷雾离子化飞行时间串联质谱，，该色谱柱基本上如前所描述(Poutanen等，2001)但使用150微米×1.0毫米的捕获柱(3微米，#222403，SGELtd，英国)用于肽预富集。
对于N-末端序列分析，SDS-PAGE分离的蛋白通过电印迹转移到聚偏二氟乙烯膜(ProBlott，Perkin Elmer Applied Biosystems Division，加利福尼亚州，美国)。在用考马斯亮蓝染色之后，将目标蛋白条带移除并且在Procise 494A蛋白测序仪(Perkin ElmerApplied Biosystems Division，加利福尼亚州，美国)上通过Edman降解进行N-末端序列分析。
对从纯化的蛋白中确定的肽序列进行了分析。来自嗜热枝顶孢菌ALKO4245的46kDa纯化蛋白的内部的肽与来自大孢粪壳菌(Sordaria macrospora)的公布的不具名的蛋白产品(保藏编号CBI52679)表现出相似性。蛋白CBI52679与糖苷水解酶家族61的蛋白相类似。因此来自嗜热枝顶孢菌的46kDa蛋白被命名为At_GH61。来自白马兰诺菌ALKO4237的22kDa纯化蛋白的N末端和内部肽与来自球毛壳菌(Chaetomium globosum)的公布的假定蛋白(保藏编号XP_001225931)表现出相似性。假定蛋白XP_001225931与GH61蛋白家族相类似。因此，来自白马兰诺菌的22kDa蛋白被命名为Ma_GH61B。从蛋白At_GH61(SEQ ID NO:1-5)和Ma_GH61B(SEQ ID NO:6-10)得到的内部和N-末端肽的序列示于表2中。
表2.从来自嗜热枝顶孢菌的纯化蛋白At_GH61和来自白马兰诺菌的纯化蛋白Ma_GH61B确定的内部肽序列
实施例3.来自嗜热枝顶孢菌ALKO4245和白马兰诺菌ALKO4237的cel61基因的克隆
标准的分子生物学方法被用在DNA的分离和酶处理(例如，质粒DNA的分离，DNA的消化以产生DNA片段)、用在大肠杆菌转化、测序等。所使用的基本方法要么是如由酶、试剂、试剂盒制造商所描述的，要么是如在标准的分子生物学手册例如Sambrook和Russell(2001)中所描述的。基因组DNA的分离如由Raeder和Broda(1985)详细描述的进行。
简并寡核苷酸基于从纯化的At_GH61和Ma_GH61B蛋白得到的肽的氨基酸序列(表2)而设计。简并寡核苷酸用于合成编码该蛋白的基因的探针。用作引物的简并寡核苷酸的序列(SEQ ID NO:11-14)示于表3中。
表3.寡核苷酸用作PCR引物以扩增来自嗜热枝顶孢菌ALKO4245和白马兰诺菌ALKO4237的cel61基因的探针
(a肽序列包括在表1中。
(bN＝A或G或T或C、Y＝T或C、R＝A或G、H＝A或T或C、D＝G或A或T；括号中的“s”＝有义链,括号中的“as”＝反义链。
使用嗜热枝顶孢菌ALKO4245基因组DNA作为模板，FIB54和FIB57(SEQ ID NO:11-12)的引物组合在PCR条件下制造了349bp的PCR产物，该PCR条件包含1x的Phusion GC缓冲液、0.25mM的dNTP、1μM的FIB54和FIB57引物(表3)、1-2个单位的Phusion DNA聚合酶(Finnzymes，芬兰)和0.5-3μg的ALKO4245基因组DNA每100μl反应体积。PCR反应的条件如下：在98℃初始变性1分钟，然后进行29次循环的98℃变性10秒，在52℃(±8℃梯度)退火30秒，在72℃延伸30秒，及在72℃最终延伸5分钟。得到的PCR产物具有基于公开的cel61序列计算得到的预期大小。将PCR产物从PCR反应混合物中分离和纯化并且按照制造商的说明书(Invitrogen，美国)克隆到4Blunt--载体中。插入片段通过测序表征。
使用白马兰诺菌ALKO4237基因组DNA作为模板，FIB99和FIB101(SEQ ID NO:13-14)的引物组合在PCR条件下制造了239bp的PCR产物，该PCR条件包含10mM的Tris-HCl(pH8.8)、50mM的KCl、0.1％的Triton X-100、1.5mM MgCl2、0.2mM的dNTP、1μM的FIB99和FIB101引物(表2)、2个单位的Dynazyme II DNA聚合酶(Finnzymes，芬兰)和0.5-3μg的ALKO4237基因组DNA每100μl反应体积(任选5％DMSO)。PCR反应的条件如下：在95℃初始变性5分钟，然后进行31次循环的95℃变性1分钟，在50℃(±8℃梯度)退火30秒，在72℃延伸1分钟，及在72℃最终延伸5分钟。得到的PCR产物具有基于公开的cel61序列计算得到的预期大小。将PCR产物从PCR反应混合物中分离和纯化并且按照制造商的说明书(Invitrogen，美国)克隆到4-TOPO--载体中。插入片段通过测序表征。
使用白马兰诺菌ALKO4237基因组DNA作为模板，FIB35和FIB38(SEQ ID NO:15-16)的引物组合在PCR条件下制造了860bp的PCR产物，该PCR条件包含1x的Phusion GC缓冲液、5％DMSO、0.25mM的dNTP、1μM的FIB35和FIB38引物(表2)、1-2个单位的Phusion DNA聚合酶(Finnzymes，芬兰)和0.5-3μg的ALKO4237基因组DNA每100μl反应体积。PCR反应的条件如下：在98℃下初始变性1分钟，然后进行29次循环的98℃变性10秒，在48℃(±8℃梯度)退火30秒，在72℃延伸30秒，并在72℃最终延伸5分钟。将PCR产物从PCR反应混合物中分离和纯化并且按照制造商的说明书(Invitrogen，美国)克隆到4Blunt--载体中。插入片段通过测序表征并且该核苷酸序列包含未知基因的部分编码区域。从该部分基因推导的氨基酸序列与公布来自球毛壳菌的假定蛋白(保藏编号XP_001219904)表现出相似性。该假定蛋白XP_001219904与GH61蛋白家族相似。因此该未知基因命名为Ma_cel61a。
获得的PCR片段如表4所示，其被选择用作克隆来自嗜热枝顶孢菌ALKO4245和白马兰诺菌ALKO4237菌株的全长基因的探针。
表4.被选择用于克隆来自菌株嗜热枝顶孢菌ALKO4245和白马兰诺菌ALKO4237的全长cel61基因的探针。显示了基因组模板DNA、PCR反应中使用的引物、获得的PCR片段的大小、包含探针片段的质粒的名称和探针序列的SEQ ID NO。
含有用于克隆编码At_GH61的全长基因的PCR扩增探针的质粒命名为pALK3374，并且包含这一质粒的大肠杆菌菌株RF9150被保藏到DSM保藏中心，保藏编号为DSM25496。含有PCR扩增的基因Ma_cel61a的探针的质粒命名为pALK2992，并且包含这一质粒的大肠杆菌菌株RF9002被保藏到DSM保藏中心，保藏编号为DSM25494。含有用于克隆编码Ma_GH61B的全长基因的PCR扩增探针的质粒命名为pALK3378，并且包含这一质粒的大肠杆菌菌株RF9537被保藏到DSM保藏中心，保藏编号为DSM25498。
嗜热枝顶孢菌ALKO4245和白马兰诺菌ALKO4237基因组DNA用几种限制性内切酶消化以进行DNA印迹(Southern blot)分析。用于杂交的探针是具有SEQ ID NO:17、SEQ IDNO:18和SEQ ID NO:19的PCR片段，所述片段通过EcoRI消化剪切或分别从质粒pALK3374、pALK2992和pALK3378PCR扩增得到。上面的探针通过使用洋地黄毒苷，根据供应商(Roche，德国)的说明书进行标记。在65℃进行杂交过夜。在杂交后滤膜在室温用2x SSC-0.1％SDS洗两次，每次5分钟，接下来在65℃用0.1x SSC-0.1％SDS洗两次，每次15分钟。
从嗜热枝顶孢菌ALKO4245的基因组DNA中，得到大约4.5kb的XbaI消化的片段。从白马兰诺菌ALKO4237的基因组DNA中，得到大约5kb的BamHI消化的片段，用来自质粒pALK2992的洋地黄毒苷标记的探针片段获得。相应地，用来自质粒pALK3378的洋地黄毒苷标记的探针片段从白马兰诺菌ALKO4237的基因组DNA得到约3.5kb的XhoI消化的片段。杂交的基因组DNA片段基于其大小从消化的基因组片段库中分离。基因组片段从琼脂糖凝胶中分离，并克隆到用XbaI、BamHI或XhoI剪切的pBluescript II KS+(Stratagene，加利福尼亚州，美国)载体中。连接混合物转化到大肠杆菌XL10-金细胞(Stratagene，加利福尼亚州，美国)并且涂布在含50～100μg/ml氨苄青霉素的LB(Luria-Bertani)平板上。在对应于上面描述的DNA印迹分析的杂交条件下，使用菌落杂交，以pALK3374、pALK2992和pALK3378插入片段作为探针，从大肠杆菌菌落中筛选阳性克隆。从板上收集到几个阳性克隆。通过限制性消化显示，它们含有预期大小的插入片段并且插入片段进一步用pALK3374、pALK2992及pALK3378的插入片段作为探针使用Southern杂交分析进行筛选。DNA印迹法在收集的克隆的插入片段上进行，杂交在68℃进行并用2x SSC-0.1％SDS在室温下洗两次，每次5分钟，接下来在68℃用0.1×SSC中-0.1％SDS洗两次，每次15分钟。
编码嗜热枝顶孢菌ALKO4245蛋白At_GH61的全长基因从4.5kb的XbaI插入片段测序并且包含该插入片段的质粒命名为pALK3375。包括质粒pALK3375的大肠杆菌菌株RF9319保藏到DSM保藏中性，保藏编号为DSM25497。编码嗜热枝顶孢菌ALKO4245蛋白At_GH61的基因被命名为At_cel61(SEQ ID NO：20)。相应地，编码白马兰诺菌ALKO4237Ma_GH61B的全长基因从3.5kb的XhoI插入片段测序并且包含该插入片段的质粒命名为pALK3379。包括质粒pALK3379的大肠杆菌菌株RF9696保藏到DSM保藏中心，保藏编号为DSM25499。编码白马兰诺菌ALKO4237蛋白Ma_GH61B的基因被命名为Ma_cel61b(SEQ ID NO：22)。全长基因Ma_cel61a(SEQ ID NO：21)从白马兰诺菌ALKO4237 5kb的BamHI插入片段测序并且包含该插入片段的质粒命名为pALK2993。在pALK2992插入片段(SEQ ID NO：18)发现的部分cel61序列被包括在从克隆获得的全长Ma_cel61a基因序列(SEQ ID NO：21)中。包括质粒pALK2993的大肠杆菌菌株RF9091保藏到DSM保藏中心，保藏编号为DSM25495。基因序列(SEQ ID NO:20-22)的相关信息总结于表5中。
表5.从嗜热枝顶孢菌ALKO4245和白马兰诺菌ALKO4237分离的cel61基因的总结。显示了具有或不具有内含子的基因长度和基因的SEQ ID NO。
(a包括了终止密码子。
(b没有包括终止密码子。
从基因At_cel61推导的氨基酸序列包括At_GH61肽的序列：1669,824(SEQ ID NO：1)、1763,938(SEQ ID NO：2)、431.7752(SEQ ID NO：3)、882.9711(序列ID NO：4)和855.9166(SEQ ID NO：5)(表2)。这证实了从克隆获得的基因At_cel61是编码纯化At_GH61蛋白的基因。从基因Ma_cel61b推导的氨基酸序列包括Ma_GH61B肽的序列：#4349(SEQ IDNO：6)、2130,813(SEQ ID NO：7)、1283,527(SEQ ID NO：8)、2131,948(SEQ ID NO：9)和4466,106(SEQ ID NO：10)(表2)。这证实了从克隆获得的基因Ma_cel61b是编码纯化Ma_GH61B蛋白的基因。推导的蛋白序列(SEQ ID NO:23-25)的相关信息总结于表6中。从基因序列Ma_cel61a推导的蛋白命名为Ma_GH61A。
表6.从来自嗜热枝顶孢菌ALKO4245和白马兰诺菌ALKO4237的cel61基因推导的氨基酸序列的总结。
a对信号序列的预测使用程序SignalP V3.0(Nielsen等，1997；Nielsen和Krogh，1998，Bendtsen等，2004)作出。
(b纤维素结合结构域(CBD)，指出了CBD区域的氨基酸[M1(Met#1)包含在编号中]。
(c没有包含预测的信号序列。所述预测使用克隆管理9程序作出。
从嗜热枝顶孢菌ALKO4245和白马兰诺菌ALKO4237推导的GH61序列与从数据库发现的序列之间的比较示于表7中。
表7.与从嗜热枝顶孢菌ALKO4245和白马兰诺菌ALKO4237推导的GH61氨基酸序列具有最高同一性的序列。对包括信号序列的全长氨基酸序列进行比对。在http:// www.ebi.ac.uk/Tools/sss/fasta/使用FASTA(EMBL-EBI,FASTA–蛋白相似性搜索，UniProt知识库和NRPL 1，BLOSUM50，缝隙开口-10，缝隙延伸-2)进行数据库搜索，并且在http:// www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/使用EMBOSS Needle(EMBL-EBI，EMBOSS-Needle–成对序列比对，BLOSUM50，缝隙开口10，缝隙延伸0.5)确定同一性的程度。
微生物和保藏编号 同一性(％)
At_GH61 100
太瑞斯梭孢壳霉,AEO68023 74.0
Ma_GH61A 100
WO2009085868,SEQ ID NO:2 77.6
Ma_GH61B 100
球毛壳菌,EAQ87022 78.2
嗜热毁丝霉,AEO61304 77.8
实施例4.里氏木霉中重组GH61蛋白的生产
构建表达质粒以在里氏木霉中生产来自嗜热枝顶孢菌ALKO4245和白马兰诺菌ALKO4237的重组GH61蛋白。重组cel61基因，包括其自身的信号序列，通过PCR被精确地融合到里氏木霉cbh1/cel7A启动子。通过PCR在终止密码子之后形成了BamHI位点以在里氏木霉cbh1/cel7A终止子的3′-端融合该基因。这在chb1终止子序列之前的构建物中没有留下原始的终止子。构巢曲霉(A.nidulans)amdS标记基因用于筛选如在Paloheimo等(2003)描述的转化体。线性表达盒(图1)在NotI消化后从载体骨架中分离得到。将At_cel61(6.8kb)、Ma_cel61a(6.2kb)和Ma_cel61b(6.1kb)的表达盒转化到里氏木霉原生质体中。使用的宿主菌株并不制造四种主要的里氏木霉纤维素酶(CBHI、CBHII、EGI、EGII)的任一种。转化按照在等(1987)加上Karhunen等(1993)描述的修改进行，选择乙酰胺作为唯一的氮源(amdS标记基因)。转化体在PD上形成孢子之前通过单一的分生孢子在筛选板上进行纯化。
转化体的GH61蛋白生产从摇瓶培养的培养上清液进行分析。转化体从PD斜面接种到含有50ml复合的乳糖基纤维素诱导培养基(Joutsjoki等，1993)的摇瓶中，该培养基用5％的KH2PO4缓冲。在30℃、250rpm下培养7天后分析GH61蛋白生产。重组蛋白的异源生产通过SDS-PAGE和接下来的考马斯染色进行分析。选择的转化体的基因型通过DNA印迹分析得到确认，其中包含了基因组消化物并且相应的表达盒用作探针。
选择最佳的生产转化体于实验室规模的生物反应器中进行培养以获得用于应用测试的材料，培养在28℃、在纤维素酶诱导复合培养基中、控制pH为5.5±0.2或6.0±0.2(NH3/H3PO4)培养3-4天。通过离心和经Seitz-K 150和EK滤膜(Pall SeitzSchenkFiltersystems GmbH,Bad Kreuznach，德国)过滤来回收上清液。
实施例5.用包含重组GH61蛋白的酶制剂水解硬木底物
将蒸气爆破的硬木悬浮在pH 4.8的0.05M柠檬酸钠缓冲液中。水解混合物的最终重量是1g，其中总固体浓度为12％(w/w)。底物在2ml的反应试管中使用不同的酶混合物在2mg蛋白每克总固体的剂量下进行水解。酶组分的蛋白含量使用Pierce BCA检测试剂盒、产品号23227(Thermo Scientific，马萨诸塞州，USA)测定，以牛血清白蛋白，产品号23209(Thermo Scientific,马萨诸塞州,USA)作为标准品。反应试管在调节在不同温度的来自GFL的线性摇动水浴1086中搅动。对于每一个样品点，从副本反应试管中取0.5ml的样品并且进行离心。将上清液煮沸20分钟以终止酶水解，并且对来自水解的反应产物进行分析。
不同纤维素酶的基本混合物使用如下的组分制备：
包含重组的嗜热枝顶孢菌ALKO4245 CBHI/Cel7A(WO2007071818)的CBHI/Cel7A制剂，
包含重组的嗜热枝顶孢菌ALKO4245 CBHII/Cel6A(WO2011080317)的CBHII/Cel6A制剂，
包含重组的金黄色嗜热子囊菌ALKO4242 EGII/Cel5A(WO2007071818)的EGII/Cel5A制剂，该金黄色嗜热子囊菌ALKO4242 EGII/Cel5A具有遗传学连接的里氏木霉EGII/Cel5A(WO2007071818)的CBM，
包含重组的里氏木霉EGI/Cel7B的Mesophilic EGI/Cel7B制剂，
包含嗜热枝顶孢菌ALKO4245β-葡萄糖苷酶/Cel3A(WO2007071818)的β-葡萄糖苷酶制剂，
包含金黄色嗜热子囊菌ALKO4242 Xyn10A木聚糖酶(WO2007071818)的木聚糖酶制剂。
所有的纤维素酶在没有纤维素酶背景的里氏木霉宿主菌株(缺失了编码四种主要纤维素酶CBHI/Cel7A、CBHII/Cel6A、EGI/Cel7B和EGII/Cel5A的基因)中异源地制造为单组分。在混合物中使用粗的培养上清液。酶组分按如下结合以制造基本混合物：61.1％的纤维二糖水解酶CBHI/Cel7A制剂，15.3％的纤维二糖水解酶CBHII/Cel6A制剂，10.2％的内切葡聚糖酶EGII/Cel5A制剂，8.2％的内切葡聚糖酶EGI/Cel7B制剂，3％的木聚糖酶Xyn10A制剂和2.2％的β-葡萄糖苷酶βG/Cel3A制剂。这个酶混合物指作混合物1。
为了测试GH61分子在水解中的性能，制备了三种单独的混合物组合物，所述混合物组合物包含90％的混合物1和10％的GH61组分：
包含嗜热枝顶孢菌At_GH61的GH61蛋白制剂。
包含Melancarpus albomyces Ma_GH61A的GH61酶制剂。
包含太瑞斯梭孢壳霉Tt_GH61E的GH61酶制剂，该Tt_GH61E是现有技术已知的GH61蛋白并且在Harris等(2010)描述，保藏编号ACE10234。
包含GH61蛋白At_GH61、Ma_GH61A和Tt_GH61E的混合物分别指作混合物1_AT、混合物1_MA和混合物1_TT。
对于所有的混合物，水解在37℃、45℃、50℃和55℃下进行。在水解72h后采集样品，通过HPLC定量并且确定葡萄糖的浓度(图2)。
结果显示，在所有测试温度(37℃、45℃、50℃和55℃)下，混合物1_AT和混合物1_MA与对照混合物1_TT相比均具有更好的性能。在55℃下混合物1_MA和混合物1_AT比对照混合物混合物1_TT表现的要好24％和16％。在50℃下发现使用混合物1_AT和混合物1_MA的从硬木底物释放的糖的量与使用对照混合物混合物1_TT的相比增加了27％和11％。在45℃下发现酶混合物1_AT和混合物1_MA比对照混合物混合物1_TT表现的要好24％和10％。在37℃下混合物1_AT和混合物1_MA比对照混合物混合物1_TT表现的要好48％和27％。
实施例6.用包含重组GH61蛋白的酶制剂从自动洗碗机过滤器移除纤维性的残余物。
在自动洗碗机里积累的纤维性的残余物的水解用从苹果、橘子和小麦研磨的纤维悬浮在500ml摇瓶里的稀的柠檬酸缓冲液(pH4.0，包含约0.5％的丙二醇)中测量。添加等量的每一种纤维，最终总固体浓度是4g每升。在25mg蛋白每克总固体的剂量添加酶。来自酶制剂的蛋白的量通过Bio-Rad蛋白测试(Bio-Rad Laboratories，Hercules，加里福尼亚州，美国)确定，使用牛丙种球蛋白(Bio-Rad Laboratories，Hercules，加里福尼亚州，美国)作为标准品。含有在稀的柠檬酸缓冲液中的纤维和酶的摇瓶在230rpm摇动下加热到50℃。在50℃孵育60分钟后，将溶液通过200μm网筛过滤，并且将在筛子上留下的纤维在50℃干燥至少20小时。称重干燥的纤维以测量纤维的重量损失。重量损失计算作空白重量的百分比。在缓冲液中只包含纤维的空白(没有酶)与其他样品相同地加以制备。
基本的里氏木霉纤维素酶混合物(Roal Oy，经典里氏木霉酶产品)用在比较中。只包含基本的里氏木霉纤维素酶混合物的酶混合物(对照)或包含72％(18mg)的里氏木霉纤维素酶混合物和28％(7mg)的At_GH61或Ma_GH61A的混合物用于测试GH61在水解中的性能。在没有纤维素酶背景(缺失了编码四种主要纤维素酶CBHI、CBHII、EGI和EGII的基因)的里氏木霉宿主菌株中GH61蛋白异源地制造为单组分。粗的培养上清液用在酶混合物中。
来自对照和包含GH61蛋白的样品的一式三份的样品的平均结果示于图3。通过部分地用嗜热枝顶孢菌At_GH61或白马兰诺菌Ma_GH61A蛋白代替基本的里氏木霉纤维素酶混合物，发现在筛子中剩下的纤维残余物的重量分别降低了11％和7％。因此，当增补有GH61蛋白At_GH61或Ma_GH61A的里氏木霉纤维素酶混合物时结果显示更好的性能。
参考文献
Badger PC.(2002)Ethanol from cellulose:a general review.In Trends innew crops and new uses.(从纤维素制备乙醇：关于新型农作物和新型应用的趋势的一般性综述)J.Janick和A.Whipkey(主编).ASHS出版社,Alexandria,VA,美国,p.17-21.
Bendtsen JD,Nielsen H,von Heijne G,和Brunak S.(2004)Improvedprediction of signal peptides:SignalP 3.0.(改进的信号肽的预测：SignalP 3.0)J.Mol.Biol.(分子生物学期刊)340:783-795.
Bolton ET,和McCarthy BJ.(1962)PNAS(美国科学院院报)84:1390如给出在Sambrook,Fritsch和Maniatis,Molecular Cloning(分子克隆),p.11.46(1989).
Coen DM.(2001)The polymerase chain reaction.(聚合酶链反应)AusubelFM.,Brent R.,Kingston RE.,More DD.,Seidman JG.,Smith K.和Struhl K.(主编)Current protocols in molecular biology.(分子生物学的当前方法)John Wiley&Sons.有限公司,Hoboken,美国.
Gellissen G.(主编)(2005)Production of recombinant proteins.Novelmicrobial and eukaryotic expression systems.(重组蛋白的生产：新型微生物和真核生物表达系统)Wiley-VCH Verlag Gmbh&Co.Weinheim,德国.
Harris PV,Welner D,McFarland KC,Re E,Navarro Poulsen J-C,Brown K,Salbo R,Ding H,Vlasenko E,Merino S,Xu F,Cherry J,Larsen SY,和Leggio LL.(2010)Stimulation of lignocellulosic biomass hydrolysis by proteins of glycosidehydrolase family 61:structure and function of a large,enigmatic family.(糖苷水解酶家族61的蛋白对木质纤维素生物质水解的刺激：一个大的神秘家族的结构和功能)Biochemistry(生物化学)49(15):3305–3316.
Henrissat B.(1991)A classification of glycosyl hydrolases based onamino acid sequence similarities.(基于氨基酸序列相似性的糖基水解酶的分类)Biochem.J.(生物化学期刊)280:309-316.
Henrissat B,和Bairoch A.(1993)New families in the classification ofglycosyl hydrolases based on amino acid sequence similarities.(在基于氨基酸序列相似性的分类中的新型家族)Biochem.J.(生物化学期刊)293:781-788.
Henrissat B,和Bairoch A.(1996).Updating the sequence-basedclassification of glycosyl hydrolases.(基于序列的糖基水解酶的分类的更新)Biochem.J.(生物化学期刊)316:695-696.
Joutsjoki VV,Torkkeli TK,和Nevalainen KMH.(1993)Transformation ofTrichoderma reesei with the Hormoconis resinae glucoamylase P(gamP)gene:production of a heterologous glucoamylase by Trichoderma reesei.(用Hormoconisresinae糖化酶P(gamP)基因转化里氏木霉：通过里氏木霉生产异源糖化酶)Curr.Genet.(当前遗传学)24:223-228.
Karhunen T,M,Nevalainen KMH,和Suominen PL.(1993)Highfrequency one-step gene replacement in Trichoderma reesei.I.Endoglucanase Ioverproduction.(在里氏木霉中的高频一步基因替代：I.内切葡聚糖酶I过生产)Mol.Gen.Genet.(分子基因遗传学)241:515-522.
Needleman S.和Wunsch C.(1970)A general method applicable to thesearch for similarities in the amino acid sequence of two proteins.(适用于查询两个蛋白的氨基酸序列相似性的一般性方法)Journal of Molecular Biology(分子生物学期刊)48,443-453.
Nielsen H,Engelbrecht J,Brunak S,和von Heijne G.(1997)Identificationof prokaryotic and eykaryotic signal peptides and predictionof their cleavagesites.(原核和真核信号肽的鉴定和它们的切割位点的预测)Protein.Eng.(蛋白工程学)10:1-6.
Nielsen H,和Krogh A.(1998)Prediction of signal peptides and signalanchors by a hidden Markov model.In:Proceedings of the Sixth InternationalConference on Intelligent Systems for Molecular Biology(ISMB 6),(通过隐藏的Markov模型预测信号肽和信号锚定物：关于分子生物学的智能系统的第六次国际会议(ISMB 6)的进展)AAAI出版社,Menlo Park,加利福尼亚,p.122-130.
Paloheimo M,A,Kallio J,和Suominen P.(2003)High-yieldproduction of a bacterial xylanase in the filamentous fungus Trichodermareesei requires a carrier polypeptide with an intact domain structure.(在丝状真菌里氏木霉中的细菌性木聚糖酶的高产率生产需要具有完整结构域结构的载体多肽)Appl.Env.Microbiol.(应用环境微生物学)69:7073-7082.
M,Nevalainen H,M,Salminen E,和Knowles J.(1987)Aversatile transformation system for the cellulolytic filamentous fungusTrichoderma reesei.(用于丝状真菌里氏木霉的水解纤维素的多用途转化系统)Gene(基因学)61:155-164.
Poutanen M,L,Ruohonen L,M,和Kalkkinen N.(2001)Use ofmatrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass mapping andnanospray liquidchromatography/electrospray ionization tandem massspectrometry sequence tag analysis for high sensitivity identification ofyeast proteins separated by two-dimensional gel electrophoresis.(基体辅助的激光解吸附/离子化飞行时间质谱测图和纳米喷雾液相色谱法/电喷雾离子化串联质谱序列标记分析用于由二维凝胶电泳分离的酵母蛋白的高灵敏性鉴定的使用)RapidCommun.Mass Spectrom.(快速柱质谱)15:1685-1692.
Raeder U,和Broda P.(1985)Rapid preparation of DNA from filamentousfungi.(从丝状真菌快速制备DNA)Lett.Appl.Microbiol.(应用微生物学快报)1:17-20.
Sambrook J,Fritsch EF,和Maniatis T.(1989)Molecular cloning,alaboratory manual.(分子克隆实验手册)Cold Spring Harbor Laboratory(冷泉港实验室),纽约,美国.
Sambrook J,和Russell DW.(2001)Molecular cloning,a laboratory manual.(分子克隆实验手册)Cold Spring Harbor Laboratory(冷泉港实验室),纽约,美国.
Shevchenko A,Wilm M,Vorm O,和Mann M.(1996)Mass spectrometricsequencing of proteins from silver-stained polyacrylamide gels.(来自银染色的聚丙烯酰胺凝胶的蛋白的质谱测序)Anal.Chem.(分析化学)68:850-858.
Visser H,Joosten V,Punt PJ,Gusakov AV,Olson PT,Joosten R,Bartels J,Visser J,Sinitsyn AP,Emalfarb MA,Verdoes JC,和Wery J.(2011)Development of amature fungal technology and production platform for industrial enzymes basedon the Myceliphthora thermophile isolate,reviously known as Chrysosporiumlucknowense C1.(基于之前被视为Chrysosporium lucknowense C1的Myceliphthorathermophile分离物的工业酶的成熟真菌技术和生产平台的发展)IndustrialBiotechology.(工业生物技术)7:214-223。
序列表
<110> 罗尔公司(Roal Oy)
<120> 处理纤维素材料的新颖蛋白(Novel proteins for the treatment ofcellulosic material)
<130> SPI185605-61
<160> 25
<170> BiSSAP 1.0
<210> 1
<211> 13
<212> PRT
<213> Acremonium thermophilum
<220>
<221> SOURCE
<222> 1..13
<223> /mol_type="protein"
/organism="Acremonium thermophilum"
<400> 1
Glu Asp Gly Tyr Asn Ser Gly Asn Trp Ala Thr Ser Lys
1 5 10
<210> 2
<211> 14
<212> PRT
<213> Acremonium thermophilum
<220>
<221> SOURCE
<222> 1..14
<223> /mol_type="protein"
/organism="Acremonium thermophilum"
<400> 2
Asp Asn Ala Leu Thr Asp Ser Gly Leu Gly Asn Trp Phe Lys
1 5 10
<210> 3
<211> 10
<212> PRT
<213> Acremonium thermophilum
<220>
<221> SOURCE
<222> 1..10
<223> /mol_type="protein"
/organism="Acremonium thermophilum"
<400> 3
Lys Gly Pro Thr Leu Ala Tyr Leu Lys Lys
1 5 10
<210> 4
<211> 19
<212> PRT
<213> Acremonium thermophilum
<220>
<221> SOURCE
<222> 1..19
<223> /mol_type="protein"
/organism="Acremonium thermophilum"
<400> 4
Lys Lys Val Asp Asn Ala Leu Thr Asp Ser Gly Ile Gly Gly Gly Trp
1 5 10 15
Phe Lys Ile
<210> 5
<211> 18
<212> PRT
<213> Acremonium thermophilum
<220>
<221> SOURCE
<222> 1..18
<223> /mol_type="protein"
/organism="Acremonium thermophilum"
<400> 5
Arg His Thr Leu Thr Ser Gly Pro Asp Asp Val Met Asp Ala Ser His
1 5 10 15
Lys Gly
<210> 6
<211> 23
<212> PRT
<213> Melanocarpus albomyces
<220>
<221> SOURCE
<222> 1..23
<223> /mol_type="protein"
/organism="Melanocarpus albomyces"
<400> 6
His Tyr Thr Leu Pro Arg Val Asn Ser Gly Ser Asp Trp Gln His Val
1 5 10 15
Arg Arg Ala Asp Asn Trp Gln
20
<210> 7
<211> 13
<212> PRT
<213> Melanocarpus albomyces
<220>
<221> SOURCE
<222> 1..13
<223> /mol_type="protein"
/organism="Melanocarpus albomyces"
<400> 7
Asn Gly Phe Val Gly Asp Val Asn Ser Pro Gln Leu Arg
1 5 10
<210> 8
<211> 11
<212> PRT
<213> Melanocarpus albomyces
<220>
<221> SOURCE
<222> 1..11
<223> /mol_type="protein"
/organism="Melanocarpus albomyces"
<400> 8
Val Asn Ser Gly Ser Asp Trp Gln His Val Arg
1 5 10
<210> 9
<211> 12
<212> PRT
<213> Melanocarpus albomyces
<220>
<221> SOURCE
<222> 1..12
<223> /mol_type="protein"
/organism="Melanocarpus albomyces"
<400> 9
Asn Ser Trp Gln Ala Asp Gly Ala Val Trp Phe Lys
1 5 10
<210> 10
<211> 11
<212> PRT
<213> Melanocarpus albomyces
<220>
<221> SOURCE
<222> 1..11
<223> /mol_type="protein"
/organism="Melanocarpus albomyces"
<400> 10
Pro Ser Asp Gly Gln Ser Ser Phe Gln Val Pro
1 5 10
<210> 11
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<222> 1..19
<223> /mol_type="DNA"
/note="primer"
/organism="Artificial Sequence"
<400> 11
ggnccngayg aygtnatgg 19
<210> 12
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<222> 1..15
<223> /mol_type="DNA"
/note="primer"
/organism="Artificial Sequence"
<400> 12
ngtngcccar ttncc 15
<210> 13
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<222> 1..17
<223> /mol_type="DNA"
/note="primer"
/organism="Artificial Sequence"
<400> 13
gngcngayaa ytggcar 17
<210> 14
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<222> 1..24
<223> /mol_type="DNA"
/note="primer"
/organism="Artificial Sequence"
<400> 14
yttraaccan acngcnccrt cngc 24
<210> 15
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<222> 1..18
<223> /mol_type="DNA"
/note="primer"
/organism="Artificial Sequence"
<400> 15
acngayatha ayggntgg 18
<210> 16
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<222> 1..23
<223> /mol_type="DNA"
/note="primer"
/organism="Artificial Sequence"
<400> 16
ggnarrttng gdatnccrtc rtt 23
<210> 17
<211> 349
<212> DNA
<213> Acremonium thermophilum
<220>
<221> source
<222> 1..349
<223> /mol_type="DNA"
/organism="Acremonium thermophilum"
<400> 17
ggccccgatg atgtgatgga tgctagccat aaaggtccca cactcgcgta tcttaaaaag 60
gtcgacaacg ccctgacgga cagtggtatt ggcggcggct ggtatgaggc tttttgaatt 120
tctcctgact ttgtccctcc acctgtctcc cattatctcc acatctccca atatttgagt 180
gtatatctct gctcgttgcc ctcgtatgga taagagggcg gagaatggag agagggaaaa 240
gaaggcatag cccatacaaa agagcgtaga cgagaccaag cgactaaaca acactttgag 300
caggttcaaa attcaggagg atggctacaa cagcggcaac tgggccacc 349
<210> 18
<211> 239
<212> DNA
<213> Melanocarpus albomyces
<220>
<221> source
<222> 1..239
<223> /mol_type="DNA"
/organism="Melanocarpus albomyces"
<400> 18
cttaaaccaa acagcgccat cggcctgcca cgagttgatg tcctggccgt cggggacgcg 60
ggcgaggtag aactgcatgg ggccggggtg gtagatgttg gggttgacgt ggtacgtgac 120
cgacgagccg gcagtcacgt tgagcgtctc gggggcgggc gagtggctgg actggaagca 180
gcggatctgg ggcgagtcga cgtcgccgac gaagccgttg tcctgccagt tatctgctc 239
<210> 19
<211> 860
<212> DNA
<213> Melanocarpus albomyces
<220>
<221> source
<222> 1..860
<223> /mol_type="DNA"
/organism="Melanocarpus albomyces"
<400> 19
ggaaagttgg gtatgccgtc gttccaatat gcccgcggcg ttgacatgcc cgggactaag 60
gggttcggtg tcattctcgg acgaactagc ggatctaggg gttggatgcc gagtgtcggt 120
cccctgtacc gatcgtgatg gacggttcct gggccgtata agtagtgagc gaggttccag 180
ctcctgtcac tggggcagca tcagcgcaac caagtttccc gtgcgacttg acgtcgaccc 240
aaagccacca tgaagctctc gctggcgtcc cttctggctg ccgccctctc tgtggagggg 300
cacgtcatct tccaggtgtg tctgcccagc tgaccggttt ccacgacgaa gacgatgaag 360
gtagctgacg ccagctgcag agactgtccg tgaacggcca ggaccaaggc gagctcaacg 420
gcctccgggc ccccaacaac aacaacccgg tgcaggatgt caacagccag aacatgatct 480
gcggccagcc cgggtatact tcgcagaccg ttatcgacgt ccagcccggc gacaggctgg 540
gagcgtggta tcaacatgtc attggaggac ctcaattccc tggtgacccg gacaacccga 600
tcgccgcctc gcacaagggc cccatcatgg tttaccttgc caaggtggac aacgccgcga 660
cggcgagctt gaacggcctg aaatggtatg cgattgcgag ccgagagacc atgctggatc 720
tccggtggtc aatactgtcg gcgttagcaa gagactgaca ggttaaatag gttcaagatc 780
tggcacgagg gctttgatac cagcacccgc acctgggccg ttgacaacct gatcaagaac 840
gacggcattc cgaacttacc 860
<210> 20
<211> 1472
<212> DNA
<213> Acremonium thermophilum
<220>
<221> source
<222> 1..1472
<223> /mol_type="DNA"
/organism="Acremonium thermophilum"
<400> 20
atgaagacct cgtccattct gacagcagcc tcggcggcaa cgttggcgtc tgctcatacg 60
attttcgtcc agcttcaatc cggaggcact acataccctg tgtcctacgc catccgtgat 120
ccgacgtacg acggtcctat tacagatgtg acgtcgaacg acctagcctg caacggtgga 180
ccgaatccga caactccatc cgacaagatc atcaatgttg ccgccggatc aaccgtgcag 240
gcaatttgga ggcacactct tacctcagga cccgacgatg tcatggatgc tagccataaa 300
ggtcccacac tcgcgtatct taaaaaggtc gacaacgccc tgacggacag tggtattggc 360
ggcggctggt atgaggcttt ttgaatttct cctgactttg tccctccacc tgtctcccat 420
tatctccaca tctcccaata tttgagtgta tatctctgct cgttgccctc gtatggataa 480
gagggcggag aatggagaga gggaaaagaa ggcatagccc atacaaaaga gcgtagacga 540
gaccaagcga ctaaacaaca ctttgagcag gttcaaaatt caggaggatg gctacaacag 600
cggcaactgg gccacttcaa aggttatcaa taacggtggc tttcagaaca ttactattcc 660
tcagtgcatt gccccgggtc agtatcttct ccgcgccgag atgattgccc tgcatggcgc 720
cagctccccg ggtggtgctc aactttatgt gagtattctt ggccctgaga acgtccagca 780
gccggataag catgccgttg cggccaagtg tagcccggcg atgtgctatg ccggacacgt 840
tccgtgttcg ggcgacaaag gctgatgtag atcgcatgct gcaaacagat ggaatgtgct 900
caaatcaaca tcacgggagg tagcggctcc gtgacgccta ccacgtacag cattcccgga 960
atttacaagg tgagaggcta agctccgcta tcaaacatca tcttgaccag gaaagttgga 1020
gtaactctcg aaacttcaag gcaaacgacc ccggactact tatcaacatt tactctatga 1080
cgccttcgag cacctacgtt atcccaggta aggcccagaa ccgtttttga ccacaaattc 1140
tctaagccct tatttccttt gcattggtca tgccgtatat ccaatatatt ttgccgacaa 1200
ataatacagg tcccgacccc ttcacgtgca gcgctggagg caataaccct cccccctcaa 1260
atccaaccac gacactcgtt actgtaacga cgaagacaac gactacatcg gccaagacca 1320
cgactccacc atcgaatccc accccaccat ctggtggttg cacagccgcg caatgggctc 1380
agtgtggcgg gattggcttc acgggatgca ccacatgtgc ttcaggttac acatgtaaga 1440
ccatgaatga ctactactct caatgccagt ga 1472
<210> 21
<211> 891
<212> DNA
<213> Melanocarpus albomyces
<220>
<221> source
<222> 1..891
<223> /mol_type="DNA"
/organism="Melanocarpus albomyces"
<400> 21
atgaagctct cgctggcgtc ccttctggct gccgccctct ctgtggaggg gcacgccatc 60
ttccaggtgt gtctgcccag ctgaccggtt tccacgacga agacgatgaa ggtagctgac 120
gccagctgca gagactgtcc gtgaacggcc aggaccaagg cgagctcaac ggcctccggg 180
cccccaacaa caacaacccg gtgcaggatg tcaacagcca gaacatgatc tgcggccagc 240
ccgggtatac ttcgcagacc gttatcgacg tccagcccgg cgacaggctg ggagcgtggt 300
atcaacatgt cattggagga cctcaattcc ctggtgaccc ggacaacccg atcgccgcct 360
cgcacaaggg ccccatcatg gtttaccttg ccaaggtgga caacgccgcg acggcgagct 420
tgaacggcct gaaatggtat gcgattgcga gccgagagac catgctggat ctccggtggt 480
caatactgtc ggcgttagca agagactgac aggttaaata ggttcaagat ctggcacgag 540
ggctttgata ccagcacccg cacctgggcc gttgacaacc tgatcaagaa cgacggctgg 600
gtgtatttcg atctgcccca gtgcatcgct ccgggccact atctcatgcg ggttgagctt 660
ctggctctgc actcggccgg catgcccggg caggctcagt tctacacctc gtgcgcccag 720
atcaacgtcg gcggctctgg gtcgttcacg ccgtcccaga ccgtgagcat tccgggcgtg 780
tacagcgcca acgacccggg catcctcatc aacatctatg gtgcgcaggg ccagcccgac 840
aacaacggcc agccgtacag catcccggga ccggagccga tcacgtgcta a 891
<210> 22
<211> 733
<212> DNA
<213> Melanocarpus albomyces
<220>
<221> source
<222> 1..733
<223> /mol_type="DNA"
/organism="Melanocarpus albomyces"
<400> 22
atgctgccca aggctgtcct cctgctggca gctggcctcg gggccagcgc ccactacacg 60
ctcccccgcg tcaacagcgg ctctgactgg cagcacgtcc gcagggccga caactggcag 120
gacaacggct tcgtcggcga cgtcaactcg ccccagatcc gctgcttcca gtccagccac 180
tcgcccgccc ccgagacgct caacgtgact gccggctcgt cggtcacgta ccacgtcaac 240
cccaacatct accaccccgg ccccatgcag ttctacctcg cccgcgtccc cgacggccag 300
gacatcaact cgtggcaggg cgagggtgcc gtgtggttca aggtctacca cgagcagccc 360
aactttggcc agcagctgac ctggcctagc aacggtacgg accgacaaaa tcgattcgag 420
aacagcgtgt gactgacccc ccgcaacagg ccagagctcg ttccaggtgc ccatcccgag 480
ctgcatccgg cccggctact acctgctccg cgccgagcac atcgccctgc acgtggccca 540
gagccagggc ggcgcgcagt tctacatctc gtgcgcccag ctcggcatca cgggcggcgg 600
caacaccgac ccgccgaaca aggtcgcctt ccccggcgcc tactcgccca ccgacccggg 660
tatcctgatc aacatcaact ggcccatccc gacctcgtac accaaccccg gccccccggt 720
cttcacctgc taa 733
<210> 23
<211> 328
<212> PRT
<213> Acremonium thermophilum
<220>
<221> SOURCE
<222> 1..328
<223> /mol_type="protein"
/organism="Acremonium thermophilum"
<400> 23
Met Lys Thr Ser Ser Ile Leu Thr Ala Ala Ser Ala Ala Thr Leu Ala
1 5 10 15
Ser Ala His Thr Ile Phe Val Gln Leu Gln Ser Gly Gly Thr Thr Tyr
20 25 30
Pro Val Ser Tyr Ala Ile Arg Asp Pro Thr Tyr Asp Gly Pro Ile Thr
35 40 45
Asp Val Thr Ser Asn Asp Leu Ala Cys Asn Gly Gly Pro Asn Pro Thr
50 55 60
Thr Pro Ser Asp Lys Ile Ile Asn Val Ala Ala Gly Ser Thr Val Gln
65 70 75 80
Ala Ile Trp Arg His Thr Leu Thr Ser Gly Pro Asp Asp Val Met Asp
85 90 95
Ala Ser His Lys Gly Pro Thr Leu Ala Tyr Leu Lys Lys Val Asp Asn
100 105 110
Ala Leu Thr Asp Ser Gly Ile Gly Gly Gly Trp Phe Lys Ile Gln Glu
115 120 125
Asp Gly Tyr Asn Ser Gly Asn Trp Ala Thr Ser Lys Val Ile Asn Asn
130 135 140
Gly Gly Phe Gln Asn Ile Thr Ile Pro Gln Cys Ile Ala Pro Gly Gln
145 150 155 160
Tyr Leu Leu Arg Ala Glu Met Ile Ala Leu His Gly Ala Ser Ser Pro
165 170 175
Gly Gly Ala Gln Leu Tyr Met Glu Cys Ala Gln Ile Asn Ile Thr Gly
180 185 190
Gly Ser Gly Ser Val Thr Pro Thr Thr Tyr Ser Ile Pro Gly Ile Tyr
195 200 205
Lys Glu Ser Trp Ser Asn Ser Arg Asn Phe Lys Ala Asn Asp Pro Gly
210 215 220
Leu Leu Ile Asn Ile Tyr Ser Met Thr Pro Ser Ser Thr Tyr Val Ile
225 230 235 240
Pro Gly Pro Asp Pro Phe Thr Cys Ser Ala Gly Gly Asn Asn Pro Pro
245 250 255
Pro Ser Asn Pro Thr Thr Thr Leu Val Thr Val Thr Thr Lys Thr Thr
260 265 270
Thr Thr Ser Ala Lys Thr Thr Thr Pro Pro Ser Asn Pro Thr Pro Pro
275 280 285
Ser Gly Gly Cys Thr Ala Ala Gln Trp Ala Gln Cys Gly Gly Ile Gly
290 295 300
Phe Thr Gly Cys Thr Thr Cys Ala Ser Gly Tyr Thr Cys Lys Thr Met
305 310 315 320
Asn Asp Tyr Tyr Ser Gln Cys Gln
325
<210> 24
<211> 246
<212> PRT
<213> Melanocarpus albomyces
<220>
<221> SOURCE
<222> 1..246
<223> /mol_type="protein"
/organism="Melanocarpus albomyces"
<400> 24
Met Lys Leu Ser Leu Ala Ser Leu Leu Ala Ala Ala Leu Ser Val Glu
1 5 10 15
Gly His Ala Ile Phe Gln Arg Leu Ser Val Asn Gly Gln Asp Gln Gly
20 25 30
Glu Leu Asn Gly Leu Arg Ala Pro Asn Asn Asn Asn Pro Val Gln Asp
35 40 45
Val Asn Ser Gln Asn Met Ile Cys Gly Gln Pro Gly Tyr Thr Ser Gln
50 55 60
Thr Val Ile Asp Val Gln Pro Gly Asp Arg Leu Gly Ala Trp Tyr Gln
65 70 75 80
His Val Ile Gly Gly Pro Gln Phe Pro Gly Asp Pro Asp Asn Pro Ile
85 90 95
Ala Ala Ser His Lys Gly Pro Ile Met Val Tyr Leu Ala Lys Val Asp
100 105 110
Asn Ala Ala Thr Ala Ser Leu Asn Gly Leu Lys Trp Phe Lys Ile Trp
115 120 125
His Glu Gly Phe Asp Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Val Asp Asn Leu
130 135 140
Ile Lys Asn Asp Gly Trp Val Tyr Phe Asp Leu Pro Gln Cys Ile Ala
145 150 155 160
Pro Gly His Tyr Leu Met Arg Val Glu Leu Leu Ala Leu His Ser Ala
165 170 175
Gly Met Pro Gly Gln Ala Gln Phe Tyr Thr Ser Cys Ala Gln Ile Asn
180 185 190
Val Gly Gly Ser Gly Ser Phe Thr Pro Ser Gln Thr Val Ser Ile Pro
195 200 205
Gly Val Tyr Ser Ala Asn Asp Pro Gly Ile Leu Ile Asn Ile Tyr Gly
210 215 220
Ala Gln Gly Gln Pro Asp Asn Asn Gly Gln Pro Tyr Ser Ile Pro Gly
225 230 235 240
Pro Glu Pro Ile Thr Cys
245
<210> 25
<211> 225
<212> PRT
<213> Melanocarpus albomyces
<220>
<221> SOURCE
<222> 1..225
<223> /mol_type="protein"
/organism="Melanocarpus albomyces"
<400> 25
Met Leu Pro Lys Ala Val Leu Leu Leu Ala Ala Gly Leu Gly Ala Ser
1 5 10 15
Ala His Tyr Thr Leu Pro Arg Val Asn Ser Gly Ser Asp Trp Gln His
20 25 30
Val Arg Arg Ala Asp Asn Trp Gln Asp Asn Gly Phe Val Gly Asp Val
35 40 45
Asn Ser Pro Gln Ile Arg Cys Phe Gln Ser Ser His Ser Pro Ala Pro
50 55 60
Glu Thr Leu Asn Val Thr Ala Gly Ser Ser Val Thr Tyr His Val Asn
65 70 75 80
Pro Asn Ile Tyr His Pro Gly Pro Met Gln Phe Tyr Leu Ala Arg Val
85 90 95
Pro Asp Gly Gln Asp Ile Asn Ser Trp Gln Gly Glu Gly Ala Val Trp
100 105 110
Phe Lys Val Tyr His Glu Gln Pro Asn Phe Gly Gln Gln Leu Thr Trp
115 120 125
Pro Ser Asn Gly Gln Ser Ser Phe Gln Val Pro Ile Pro Ser Cys Ile
130 135 140
Arg Pro Gly Tyr Tyr Leu Leu Arg Ala Glu His Ile Ala Leu His Val
145 150 155 160
Ala Gln Ser Gln Gly Gly Ala Gln Phe Tyr Ile Ser Cys Ala Gln Leu
165 170 175
Gly Ile Thr Gly Gly Gly Asn Thr Asp Pro Pro Asn Lys Val Ala Phe
180 185 190
Pro Gly Ala Tyr Ser Pro Thr Asp Pro Gly Ile Leu Ile Asn Ile Asn
195 200 205
Trp Pro Ile Pro Thr Ser Tyr Thr Asn Pro Gly Pro Pro Val Phe Thr
210 215 220
Cys
225

Claims (22)

1.GH61多肽，其包含与SEQ ID NO:24具有至少78％序列同一性的氨基酸序列、或其能够增强纤维素材料水解的片段或变体。
2.权利要求1的GH61多肽，其中所述多肽与SEQ ID NO:24或其能够增强纤维素材料水解的片段具有至少90％同一性、优选地具有至少95％同一性、更加优选地具有至少98％同一性。
3.权利要求1的GH61多肽，其中所述多肽能够从白马兰诺菌(Melanocarpusalbomyces)获得、优选地能够从白马兰诺菌CBS 132099获得。
4.分离的多核苷酸，其选自：
a)包含如在SEQ ID NO:21中所示的编码序列的多核苷酸；
b)编码权利要求1的多肽的多核苷酸；
c)编码由a)或b)的多核苷酸编码的多肽的片段的多核苷酸，其中所述片段能增强纤维素材料的水解；和
d)包含与a)或b)的多核苷酸序列的核苷酸序列简并的核苷酸序列的多核苷酸；
或这样的多核苷酸的互补链。
5.权利要求4的多核苷酸，其包含在具有DSM 25495的保藏编号的微生物中所含有的基因。
6.载体，其包含权利要求4或5的多核苷酸，所述多核苷酸可操作地连接到能够指导权利要求1的GH61多肽表达的调控序列上。
7.包含权利要求6的载体的宿主细胞。
8.制备权利要求1的GH61多肽的方法，所述方法包括步骤：
用编码所述多肽的表达载体转化宿主细胞，
在允许所述多肽表达的条件下培养宿主细胞，和
任选地回收和纯化所述多肽。
9.包含权利要求1至3任一项的GH61多肽的酶制剂。
10.权利要求9的酶制剂，其还包括至少一种酶，所述酶选自：纤维二糖水解酶；内切葡聚糖酶；β-葡糖苷酶；β-葡聚糖酶；木葡聚糖酶；木聚糖酶；β-木糖苷酶；纤维二糖脱氢酶；甘露聚糖酶；β-甘露糖苷酶；α-葡糖苷酸酶；乙酰木聚糖酯酶；α-阿拉伯呋喃糖苷酶；α-半乳糖苷酶；果胶酶；包括内切和外切-α-L-阿拉伯糖酶、内切和外切-半乳糖醛酶、内切果胶酶、果胶酸裂解酶、和果胶酯酶；酚酯酶；包括木质素过氧化物酶的木质素酶；锰依赖性过氧化物酶；过氧化氢生成酶；昆布多糖酶；壳聚糖酶；阿魏酸酯酶和具有或不具有介体的漆酶。
11.处理纤维素材料的方法，其中所述方法包括将纤维素材料与权利要求1至3任一项的GH61多肽或权利要求9或10的酶制剂反应。
12.权利要求11的方法，其中所述方法包括通过用权利要求1至3任一项的多肽或权利要求9或10的酶制剂与洗碗机内部的至少部分接触而清洁洗碗机的内部。
13.权利要求11的方法，其中所述纤维素材料是纺织材料、在动物饲料中使用的植物、或来自木材的纸浆或二级纤维。
14.权利要求1至3任一项的多肽或权利要求9或10的酶制剂用于处理生物质、和在生物燃料、淀粉、纺织品、清洁剂、纸浆和纸、食物、饲料或饮料工业中的应用。
15.权利要求14的应用，用于纺织材料例如织物或衣服或纱线的生物整理。
16.权利要求14的应用，用于牛仔布的生物打磨。
17.权利要求14的应用，用于清洁洗碗机机器的内部。
18.具有保藏编号DSM 25495的大肠杆菌(Escherichia coli)菌株。
19.清洁剂组合物，所述组合物包括权利要求1至3任一项的多肽或权利要求9或10的酶制剂。
20.权利要求19的清洁剂组合物，其中所述组合物是清洁洗碗机机器的组合物。
21.用于改进清洁剂组合物的织物护理性质或纺织品清洁效果的方法，所述方法包括在所述清洁剂组合物中添加权利要求1至3任一项的多肽或权利要求9或10的酶制剂。
22.动物饲料，其包括权利要求1至3任一项的多肽或权利要求9或10的酶制剂。
CN201811170695.2A 2012-06-07 2013-05-24 处理纤维素材料的新颖蛋白 Pending CN109536475A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FI20125623A FI124477B (en) 2012-06-07 2012-06-07 New proteins for the treatment of cellulose materials
FI20125623 2012-06-07
CN201380029931.8A CN104379736B (zh) 2012-06-07 2013-05-24 处理纤维素材料的新颖蛋白

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201380029931.8A Division CN104379736B (zh) 2012-06-07 2013-05-24 处理纤维素材料的新颖蛋白

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN109536475A true CN109536475A (zh) 2019-03-29

Family

ID=49711462

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201380029931.8A Expired - Fee Related CN104379736B (zh) 2012-06-07 2013-05-24 处理纤维素材料的新颖蛋白
CN201811170695.2A Pending CN109536475A (zh) 2012-06-07 2013-05-24 处理纤维素材料的新颖蛋白

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201380029931.8A Expired - Fee Related CN104379736B (zh) 2012-06-07 2013-05-24 处理纤维素材料的新颖蛋白

Country Status (9)

Country Link
EP (1) EP2859095B1 (zh)
CN (2) CN104379736B (zh)
AP (1) AP2014008095A0 (zh)
BR (1) BR112014030003A2 (zh)
CA (1) CA2872225C (zh)
DK (1) DK2859095T3 (zh)
FI (1) FI124477B (zh)
WO (1) WO2013182740A1 (zh)
ZA (1) ZA201408474B (zh)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20180171271A1 (en) * 2015-06-30 2018-06-21 Novozymes A/S Laundry detergent composition, method for washing and use of composition
CN107556369A (zh) * 2017-08-23 2018-01-09 天津国际生物医药联合研究院 一种抗原肽和用于检测肿瘤细胞的抗体制备方法及其应用
CN109486867B (zh) * 2018-10-30 2022-05-27 中国科学院天津工业生物技术研究所 复合纤维素酶系及其在淀粉燃料乙醇生产中的应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101384713A (zh) * 2005-12-22 2009-03-11 罗尔公司 纤维素材料的处理和用于其中的酶
WO2012061517A1 (en) * 2010-11-02 2012-05-10 Novozymes, Inc. Methods of pretreating cellulosic material with a gh61 polypeptide
WO2012068509A1 (en) * 2010-11-18 2012-05-24 Novozymes, Inc. Chimeric polypeptides having cellulolytic enhancing activity and polynucleotides encoding same

Family Cites Families (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3664961A (en) 1970-03-31 1972-05-23 Procter & Gamble Enzyme detergent composition containing coagglomerated perborate bleaching agent
US5443750A (en) 1991-01-16 1995-08-22 The Procter & Gamble Company Detergent compositions with high activity cellulase and softening clays
WO1994007998A1 (en) 1992-10-06 1994-04-14 Novo Nordisk A/S Cellulase variants
ES2391826T3 (es) 2004-01-30 2012-11-30 Novozymes, Inc. Polipéptidos con actividad de mejora celulolítica y polinucleótidos que los codifican
BRPI0507431B1 (pt) 2004-02-06 2021-07-27 Novozymes, Inc Célula hospedeira microbiana recombinante, construto de ácido nucleico, vetor de expressão recombinante, composição detergente, e, métodos para produzir o polipeptídeo gh61, para degradar um material celulósico e para produzir um produto de fermentação
KR20080069980A (ko) 2005-09-30 2008-07-29 노보자임스 인코포레이티드 셀룰로오스성 물질의 분해 또는 전환을 증진하는 방법
US8999696B2 (en) 2007-05-10 2015-04-07 Novozymes, Inc. Compositions and methods for enhancing the degradation or conversion of cellulose-containing material
WO2009033071A2 (en) 2007-09-07 2009-03-12 Dyadic International, Inc. Novel fungal enzymes
BRPI0822031A2 (pt) 2007-12-19 2017-06-13 Novozymes As polipeptídeo e polinicleotídeo isolados, construção de ácido nucleico, célula hospedeira recombinante, métodos para produzir o polipeptídeo, um mutante de uma célula precursora, uma proteína e um produto de fermentação, para inibir a expressão de um polipeptídeo, para degradar ou converter um material celulósico, e para fermentar um material celulósico, planta transgênica, parte de planta ou célula de planta, e, molécula de rna inibidora
US8569581B2 (en) 2009-09-17 2013-10-29 Novozymes, Inc Polypeptides having cellulolytic enhancing activity and polynucleotides encoding same
FI122937B (fi) 2009-12-30 2012-09-14 Roal Oy Menetelmä selluloosamateriaalin käsittelemiseksi sekä tässä käyttökelpoiset CBH II/Cel6A entsyymit
EP2553110B1 (en) * 2010-03-30 2017-05-17 Novozymes North America, Inc. Processes of producing a fermentation product
GB201010580D0 (en) 2010-06-23 2010-08-11 Reckitt Benckiser Nv Machine dishwashing compositions and methods
WO2012021410A1 (en) * 2010-08-12 2012-02-16 Novozymes, Inc. Compositions comprising a polypeptide having cellulolytic enhancing activity and a liquor and uses thereof
HUE033334T2 (en) * 2010-08-20 2017-11-28 Codexis Inc Use of glycoside hydrolase-61 proteins in cellulose processing
WO2012058293A1 (en) * 2010-10-26 2012-05-03 Novozymes North America, Inc. Methods of saccharifying sugarcane trash
CA2831954A1 (en) * 2011-04-04 2012-10-11 The Regents Of The University Of California Enhanced cellulose degradation

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101384713A (zh) * 2005-12-22 2009-03-11 罗尔公司 纤维素材料的处理和用于其中的酶
WO2012061517A1 (en) * 2010-11-02 2012-05-10 Novozymes, Inc. Methods of pretreating cellulosic material with a gh61 polypeptide
WO2012068509A1 (en) * 2010-11-18 2012-05-24 Novozymes, Inc. Chimeric polypeptides having cellulolytic enhancing activity and polynucleotides encoding same

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BI RREN, B. ET AL.: ""hypothetical protein CHGG_00683 [Chaetomium globosum CBS 48.51]"，Accession Number：XP_001219904.1", 《GENBANK》 *
RANDY M BERKA ET AL.: ""comparative genomic analysis of the thermophilic biomass-degrading fungi Myceliophthora thermophila and Thielavia terrestris"", 《NATURE BIOTECHNOLOGY》 *
曲音波: ""木质纤维素降解酶系的基础和技术研究进展"", 《山东大学学报（理学版）》 *

Also Published As

Publication number Publication date
EP2859095B1 (en) 2020-05-13
CN104379736A (zh) 2015-02-25
CA2872225C (en) 2021-07-20
ZA201408474B (en) 2015-12-23
BR112014030003A2 (pt) 2017-09-12
EP2859095A4 (en) 2016-06-15
EP2859095A1 (en) 2015-04-15
CN104379736B (zh) 2018-11-02
CA2872225A1 (en) 2013-12-12
WO2013182740A1 (en) 2013-12-12
AP2014008095A0 (en) 2014-12-31
FI20125623A (fi) 2013-12-08
FI124477B (en) 2014-09-15
DK2859095T3 (da) 2020-06-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102712917B (zh) 用于处理纤维素材料的方法和适用于该方法的cbhii/cel6a酶
FI124247B (en) Novel esterases in the treatment of cellulose and lignocellulosic materials
CN104245926B (zh) Gh61多肽变体以及编码其的多核苷酸
KR20140018890A (ko) 탈필링을 위한 셀룰라제 효소 혼합물 및 그것의 이용
CN108350443A (zh) 具有黄原胶降解活性的多肽以及编码它们的多核苷酸
CN103890172B (zh) 蛋白酶及其应用
CN104379736B (zh) 处理纤维素材料的新颖蛋白
CN104995296B (zh) 用于处理纤维素材料的改进的内切葡聚糖酶
US8975058B2 (en) Endoglucanases for treatment of cellulosic material
US20130177959A1 (en) Novel cbh1-eg1 fusion proteins and use thereof
US9458440B2 (en) Proteins for the treatment of cellulosic material
US20190002860A1 (en) Beta-glucosidase and uses thereof
CN108368530A (zh) β-葡糖苷酶及其用途
US20190002859A1 (en) Beta-glucosidase and uses thereof
US9434929B2 (en) Esterases useful in the treatment of cellulosic and lignocellulosic material
Tripathi et al. Current Advancements in Recombinant Technology for Industrial Cellulases: Part-I
Class et al. Patent application title: Treatment of Cellulosic Material and Enzymes Useful Therein Inventors: Jari Vehmaanperä (Klaukkala, FI) Jari Vehmaanperä (Klaukkala, FI) Marika Alapuranen (Rajamaki, FI) Terhi Puranen (Nurmijarvi, FI) Terhi Puranen (Nurmijarvi, FI) Matti Siika-Aho (Helsinki, FI) Jarno Kallio (Jarvenpaa, FI) Jarno Kallio (Jarvenpaa, FI) Satu Hooman (Espoo, FI) Sanni Voutilainen (Lohja, FI) Teemu Halonen (Espoo, FI) Liisa Viikari (Helsinki, FI) Assignees: Roal OY

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20190329