CN102712917B - 用于处理纤维素材料的方法和适用于该方法的cbhii/cel6a酶 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种从纤维素材料中生产糖类水解物的方法。该方法例如可用于从木质纤维材料制备供生产生物乙醇所用的可发酵糖。本发明描述了源自嗜热枝顶孢霉、黑果白丝菌、嗜热毛壳菌或埃默森篮状菌这四种丝状真菌的纤维素酶，通过重组技术获得的其酶制剂，以及所述的酶和酶制剂的应用。

Description

用于处理纤维素材料的方法和适用于该方法的CBHII/CEL6A酶

技术领域

本发明涉及一种采用真菌CBHII/Cel6A纤维二糖水解酶或含有所述酶的酶制剂来处理纤维素材料的方法。所述酶适用于各种工业用途，特别适用于生物燃料的生产，其中可有利地在中到高温的范围内从木质纤维材料中生产可发酵糖。本发明还涉及真菌CBHII/Cel6A多肽以及编码所述酶的独立的核酸分子、重组载体、生产所述酶的宿主细胞、含有所述酶的酶组合物，以及这些组合物的制备方法。本发明还涉及所述酶或酶组合物的各种应用，其中需要对纤维素或木质纤维材料进行酶转化。

背景技术

有限的化石燃料资源、由其释放出的越来越多的二氧化碳以及所引起的温室现象提出了使用生物质作为可再生和清洁能源的需求。一种有希望的替代技术是生物燃料的生产，如从纤维素材料中制备乙醇、丁醇或丙醇。在运输领域中，生物燃料暂时是唯一的选择，其能够将二氧化碳排放量减少一个数量级。乙醇可以用于现有的车辆和分布系统，因此不需要昂贵的基础设施投资。源自纤维素和木质纤维可再生原料的糖还可以用作用于可取代石油基化学品的各种化学产品的原料。

植物中的大多数碳水化合物以木质纤维素的形式存在，其实质上是由纤维素、半纤维素和木质素组成。在传统的由木质纤维素生产乙醇的方法中，木质纤维材料首先进行化学或物理的预处理，使用酸水解、蒸汽爆破、氨纤维膨胀、碱性湿态氧化或臭氧预处理，以使纤维素成分更易于酶解。然后，纤维素成分被水解后，获得可以通过酵母发酵成乙醇再蒸馏而获得纯乙醇的糖。木质素是作为可以用作固体燃料的主要副产品而获得的。在这种单独的水解和发酵(SHF)过程中，酶水解温度一般高于发酵温度。水解过程中使用耐热酶提供了潜在优点，如在高温体下的较高反应速率，由于较高的比活和酶寿命而减少酶的用量，增大了流程配置和更好的卫生方面的灵活性。

为使生物乙醇生产过程更加经济而进行了持续的研究。其中一种选择是同步糖化和发酵(SSF)法。其主要优点是降低酶水解的终产物抑制，并减少了投资成本。其挑战是寻找酶水解和发酵的有利条件，例如温度和pH值。在综合生物过程(CBP)中，外部添加的酶量可以通过利用能够产生一组木质纤维素酶的发酵生物质或生物乙醇而大大减少。

近年来，用于乙醇生产的微生物代谢工程已取得重大进展。除了酿酒酵母外，微生物如细菌属发酵单胞菌和大肠杆菌以及酵母如树干毕赤酵母、脆壁克鲁维酵母已经被确定可用于从纤维素中制备乙醇。在SSF法中，抑制剂和耐热性以及利用多种糖的能力都是发酵微生物的重要特性。已经开发的工程酵母菌除葡萄糖外还能够发酵戊糖、木糖和阿拉伯糖。嗜热微生物如解糖热厌氧杆菌或热纤梭菌已经用于在50～60℃的高温条件下将糖、包括木糖发酵成乙醇（嗜热SSF或TSSF）。这种发酵生物质也有用于CBP的潜力（Shaw等人，2008）。

酶水解被认为是用于将纤维素生物质转化为可发酵糖的最有前途的技术。然而，酶水解仅用于有限数量的工业规模，尤其是在使用高度木质化的材料如木材或农业废弃物时，该技术并不令人满意。已经进行了提高纤维素材料的酶水解效率的工作（Badger，2002；Kurabi等人，2005）。

WO2001060752（丹麦Forskningscenter）公开了一种将固体木质纤维素生物质转化为可燃性燃料产品的连续式方法。在用湿法氧化或蒸汽爆破进行预处理后，生物质被部分地分为纤维素、半纤维素和木质素，然后再使用一种或多种糖酶进行部分水解(EC3.2)。

WO2002024882（加拿大Iogen Bio-Products公司）涉及一种通过采用含有纤维素酶和利用灭活其纤维素接合域(CBD)获得的改性纤维二糖水解酶I(CBHI)的酶混合物对经预处理的木质纤维基质进行处理来将纤维素转化为葡萄糖的方法。US2004/0005674（美国Athenix公司）公开了可以直接用于木质纤维素基质的新型的酶混合物。协同酶混合物包含纤维素酶，以及诸如纤维素酶、木聚糖酶、木质酶、淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶或葡萄糖苷酸酶或其任何组合的辅助酶。纤维素酶被视为包括内切葡聚糖酶(EG)、β-葡萄糖苷酶(BG)和纤维二糖水解酶(CBH)。US20050164355（美国Novozymes Biotech公司）公开了一种采用一种或多种选自EG、BG和CBH的纤维素分解酶在至少一种表面活性剂存在的条件下降解纤维素材料的方法。也可以使用其他的酶，如半纤维素酶、酯酶、过氧化物酶、蛋白酶、漆酶或其混合物。

研究最多、应用最广泛的真菌来源的纤维素分解酶源自里氏木霉（无性型红褐肉座菌）。已有源自更不为人所知的真菌的纤维素酶被公开。

Hong等人（2003a和2003b）表征了耐热子囊菌的EG和CBHI及其用于酵母的生产。Tuohy等人（2002）公开了三种类型的纤维二糖水解酶，包括来自埃默森篮状菌的CBHI和CBHII。

将纤维二糖水解酶I(CBHI)、即糖基水解酶家族7中的成员用于纤维素材料的酶转化是公知的，例如见WO03/000941（丹麦Novozymes公司），其涉及从不同真菌获得的CBHI酶。WO2005074656（美国Novozymes公司）披露了源自如耐热子囊菌的具有纤维素分解活性的多肽。

WO2007071818（芬兰Roal公司）公开了通过酶转化以及含有所述酶的酶制剂从纤维素材料中制备糖水解产物的方法。所述方法中使用的酶包括耐热纤维二糖水解酶、内切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶，以及可选的源自耐热子囊菌、嗜热枝顶孢霉或嗜热毛壳菌的木聚糖酶。

在几种应用中已公开了纤维二糖水解酶II。WO2004056981（丹麦Novozymes公司）披露了具有纤维二糖水解酶II活性的多肽，编码该多肽的多聚核苷酸，以及用于制备多肽并将多肽用于实际应用、如生产乙醇的方法。所公开的全长DNA序列来自塔宾曲霉、嗜热毛壳菌、嗜热毁丝霉，以及梭孢壳属菌、嗜热枝顶包酶、囊状长毛盘菌、环纹束梗孢菌和樟绒枝霉。专利EP 1578964Bl（丹麦Novozymes公司）披露了嗜热毛壳菌CBHII和多肽的全长氨基酸序列，该多肽由核苷酸序列编码，并在严谨的条件下与编码所述酶的核苷酸序列的片段杂交。

CN1757709（中国山东农业大学）披露了嗜热毛壳酶CT2的嗜热CBHII酶的核苷酸序列及其在毕赤氏酵母菌菌体中的表达。这种酶能够转化废弃纤维材料。

WO2006074005（美国Genencor Int.公司）披露了红褐肉座菌（里氏木霉）CBHII/Cel6A酶的变异体。变异体酶是有用的，例如用于乙醇生产。

WO2007094852（美国Diversa公司和美国Verenium公司）披露了纤维素分解酶、编码该酶的核酸及其生产和使用方法。所述酶可以是内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、β-葡萄糖苷酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶、β-木糖苷酶、阿拉伯呋喃糖苷酶或寡聚酶。所述酶及酶混合物例如可用于制备燃料或生物乙醇。

WO2008095033（瑞士Syngenta公司和美国Verenium公司）披露了具有木质纤维素分解活性的酶，包括纤维二糖水解酶，其例如可用在制备燃料和加工生物质材料中。WO2009045627（美国Verenium公司）披露了采用具有木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性并且在提高pH值和温度条件下活性提高且稳定的酶类来分解半纤维素的方法。

WO2009089630（加拿大Logen Energy公司）披露了通过葡萄糖减少抑制并含有一个或多个氨基酸取代基的纤维素酶家族6的变异体。

WO2009059234（美国Novozymes公司）披露了生产在氧化还原活性金属离子中还原的纤维素材料的方法，其可用于降解或转化纤维素材料并制备发酵产物。实际应用披露了例如嗜热毛壳酶的CBHII的多肽。

WO2009085868（丹麦Novozymes公司）披露了编码酶的多肽、多聚核苷酸，以及用于制备发酵产品的方法，包括采用包含有所述多肽的纤维素分解酶组合物来糖化纤维素材料。这种纤维二糖水解酶可以来自里氏木霉、特异腐质霉、嗜热毁丝霉、太瑞斯梭壳孢霉和嗜热毛壳菌。WO2006074435和US2006218671（美国Novozymes公司）披露了太瑞斯梭壳孢霉Cel6A纤维二糖水解酶的核苷酸及氨基酸序列。US7220565（美国Novozymes公司）披露了具有提高的纤维素分解活性以及与嗜热毁丝霉CBHII的成熟氨基酸序列的一致性的多肽。

US20070238155和US20090280105（美国Genencor Int.公司）披露了含有来自Chrysosporium lucknowense的新型酶的酶组合物，例如含有属于糖基水解酶家族6的CBHIIa和CBHIIb酶。该酶组合物对于木质纤维材料的水解很有效。

Galagan等人(2003)披露了粗糙链孢菌OR74A的基因组序列，包括外切葡聚糖酶2前体的序列。Collins等人(2003)披露了埃默森篮状菌CBHII/Cel6A的编码序列。

生物燃料如可再生的运输燃料的市场预计在不久的将来将大大增涨。结果，人们对于使用替代性原料来生产生物燃料的兴趣日渐迅速增长。利用存在于植物和森林或市政垃圾中的纤维素生物质来发酵制备乙醇和其他醇成为补充化石燃料的燃料的一种有吸引力的途径。由纤维素和木质纤维素生物质制备生物燃料的一个障碍是细胞壁的坚固性和无法以聚合物的形式存在的糖单体，其需要大量的加工来使糖单体成为通常用来通过发酵生产酒精的微生物。因此，存在对于提高纤维素和木质纤维基质的降解效率的新方法，以及新酶和酶混合物的持续需求。特别是，需要那种能够攻击结晶纤维素材料的不同糖苷键并由此对不同的待处理材料进行几乎完全的水解的酶和酶混合物。亦即，需要这样的酶，其在高的处理温度下稳定，由此能够利用生物量的高度一致性，产生较高的糖和乙醇浓度。这种方法可以致使能源和投资成本大大节省。高温也减少了水解过程中污染的危险。本发明的目的是至少解决这些需求中的一部分。

发明内容

本发明的目的是提供用于提高纤维素水解效率的新型的酶和酶组合物。可以从嗜热枝顶孢霉、黑果白丝菌(Melanocarpus albomyces)、嗜热毛壳菌或埃默森篮状菌中获得的纤维二糖水解酶以及特别是纤维二糖水解酶II可用于水解和降解纤维素材料。所述酶在广泛的温度范围内在动力学上非常有效，并且尽管它们在高温下具有高活性，然而它们在标准水解温度下也非常高效。这使得它们极其适合于在常温和高温下进行的不同的纤维素基质水解过程。

本发明涉及一种采用CBHII/Cel6A多肽或含有所述多肽的酶制剂或产生所述多肽的发酵微生物来处理纤维素材料的方法，所述方法包括以下步骤：i)制备本发明的CBHII/Cel6A多肽或者含有所述多肽的酶制剂或者产生所述多肽的发酵微生物；ii)将纤维素材料与本发明的CBHII/Cel6A多肽或者含有所述多肽的酶制剂或者产生所述多肽的发酵微生物反应；以及iii)获得部分或完全水解的纤维素材料。在所述方法中使用的CBHII/Cel6A多肽具有纤维二糖水解酶活性，并且含有这样的氨基酸序列，其与SEQ IDNO:12的全长多肽具有至少76%的一致性，与SEQ ID NO:14的全长多肽具有至少76%的一致性，与SEQ ID NO:15的全长多肽具有至少95%的一致性，或者与SEQ ID NO:16的全长多肽具有至少91%的一致性。所述CBHII/Cel6A多肽也可以是具有类似特性如类似的底物特异性以及pH值和温度的依赖性或稳定性的片段或变异体。在所述方法中使用的CBHII/Cel6A纤维二糖水解酶是糖基水解酶家族6中的纤维二糖水解酶II酶，其兼具水解反应的保守折叠和立体化学结构。

适用于所述方法的CBHII/Cel6A纤维二糖水解酶可从枝顶孢霉属、黑果属、毛壳菌属或篮状菌属中获得，更优选地源自于嗜热枝顶孢霉、黑果白丝菌、嗜热毛壳菌或埃默森篮状菌，最优选地源自于保藏菌株嗜热枝顶孢霉CBS 116240、黑果白丝菌CBS 685.95、嗜热毛壳菌CBS 730.95或埃默森篮状菌DSM 2432。

适用于所述方法的CBHII/Cel6A纤维二糖水解酶能够在中到高温条件下水解不同的纤维素材料，特别是与另外的酶相结合而用于水解各种纤维素或木质纤维材料。

本发明的CBHII/Cel6A纤维二糖水解酶适用于各种用途，特别是用于生物燃料的生产。

本发明还涉及新型的CBHII/Cel6A纤维二糖水解酶，其具有纤维二糖水解酶活性，并且含有如下的氨基酸序列，其与SEQ ID NO:12的全长多肽具有至少76%的一致性，与SEQ ID NO:14的全长多肽具有至少76%的一致性，与SEQ ID NO:15的全长多肽具有至少95%的一致性，或者与SEQ ID NO:16的全长多肽具有至少91%的一致性。所述CBHII/Cel6A多肽也可以是具有类似特性如类似的底物特异性以及pH值和温度的依赖性或稳定性的片段或变异体。所述CBHII/Cel6A纤维二糖水解酶能够在中到高温的条件下水解纤维素材料。

所述酶由独立的核酸分子编码，该核酸分子含有编码本发明的多肽的多聚核苷酸序列。优选地，所述核酸含有如SEQ IDNO:11、SEQ IDNO:13、SEQ IDNO:9或SEQ IDNO:10所定义的多聚核苷酸序列或其子序列。

本发明的CBHII/Cel6A纤维二糖水解酶可以由独立的核酸分子编码，所述核酸分子在严谨的条件下杂交到SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8所含的多聚核苷酸序列或其子序列。

所述酶由保存于在登记号为DSM 22946的大肠杆菌中的质粒pALK2582、保存于在登记号为DSM 22945的大肠杆菌中的质粒pALK2581、保存于在登记号为DSM 22947的大肠杆菌中的质粒pALK2904或保存于在登记号为DSM23185的大肠杆菌中的质粒pALK3006中所包含的独立的多聚核苷酸来编码。

本发明中的CBHII/Cel6A纤维二糖水解酶可以从含有编码所述纤维二糖水解酶的核酸分子或核苷酸序列的重组表达载体中制备。所述纤维二糖水解酶多肽可以在异源宿主、优选微生物宿主内制备。

本发明还涉及一种独立的核酸分子，其包括编码真菌CBHII/Cel6A多肽的多聚核苷酸序列，其选自：

(a)一种编码多肽的核酸分子或多聚核苷酸序列，该多肽具有纤维二糖水解酶活性，并含有如SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16所列的全长氨基酸序列，或者是具有类似特性的其片段或变异体；

(b)一种编码多肽的核酸分子或多聚核苷酸序列，该多肽具有纤维二糖水解酶活性，并且与SEQ ID NO:12的全长氨基酸序列具有至少76%的一致性，与SEQ ID NO:14的全长氨基酸序列具有至少76%的一致性，与SEQ ID NO:15的全长氨基酸序列具有至少95%的一致性，或者与SEQ ID NO:16的全长氨基酸序列具有至少91%的一致性，或者是具有类似特性的其片段或变异体；

(c)一种核酸分子，其含有如SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:9或SEQID NO:10所列的多聚核苷酸序列的编码序列；

(d)一种核酸分子，其含有DSM 22946、DSM 22945、DSM 22947或DSM 23185所包含的多聚核苷酸序列的编码序列；

(e)一种核酸分子，其编码序列由于遗传密码的降解而与(c)～(d)中任一种核酸分子的编码序列不同；以及

(f)一种在严谨条件下杂交到DSM 22946、DSM 22945、DSM 22947或DSM 23185所包含的核酸分子上且编码多肽的核酸分子，该多肽具有纤维二糖水解酶活性，并且具有与SEQ ID NO:12的全长氨基酸序列具有至少76%的一致性，与SEQ ID NO:14的全长氨基酸序列具有至少76%的一致性，与SEQ ID NO:15的全长氨基酸序列具有至少95%的一致性，或者与SEQ ID NO:16的全长氨基酸序列具有至少91%的一致性的氨基酸序列，或者是具有类似特性的其片段或变异体。

本发明进一步涉及一种重组表达载体，其含有可操作地连接到能够在合适宿主中直接表达编码本发明的CBHII/Cel6A纤维二糖水解酶的基因以及产生所述CBHII/Cel6A纤维二糖水解酶的调控序列上的本发明的核酸分子或多聚核苷酸序列。

本发明还涉及含有上述重组表达载体的宿主细胞。优选地，所述宿主为微生物宿主，例如丝状真菌宿主。优选的宿主为木霉属、曲霉属、镰刀霉属、腐质霉属、金孢霉属、脉孢菌属、根霉属、青霉属和被孢酶属。更优选地是，所述宿主为木霉属或曲霉属，最为优选地是丝状真菌里氏木霉。

本发明涉及一种制备具有纤维二糖水解酶活性的本发明的多肽的方法，所述方法包括培养本发明的宿主细胞以及收集所述多肽的步骤。在本发明中还包括一种由本发明的核酸分子编码的具有纤维二糖水解酶活性的多肽，其通过上述方法获得。

本发明还涉及一种用于获得酶制剂的方法，其包括培养本发明的宿主细胞，以及制备全培养肉汤，或者从用过的培养基中分离细胞并获得上清液的步骤。在本发明中还包括一种通过上述方法获得的酶制剂。本发明还涉及一种酶制剂，其包括本发明的CBHII/Cel6A纤维二糖水解酶。

所述酶制剂可以进一步包括选自如下集合中的其它的酶：纤维二糖水解酶、内切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶、β-葡聚糖酶、木葡聚糖酶、木聚糖酶、β-木糖苷酶、甘露聚糖酶、β-甘露糖苷酶、α-葡萄糖苷酸酶、乙酰基木聚糖酯酶、α-阿拉伯呋喃糖苷酶、α-半乳糖苷酶、果胶酶、内切α-L-阿拉伯糖酶和外切α-L-阿拉伯糖酶、α-半乳糖苷酶、内切半乳糖醛酸酶和外切半乳糖醛酸酶、内切果胶裂解酶、果胶酸盐裂解酶和果胶（甲）酯酶、苯酚酯酶、包括过木质素过氧化物酶的木质酶、锰过氧化物酶、H₂O₂-生成酶以及有介体或无介体的漆酶。

所述酶制剂以全培养肉汤或用过的培养基的形式存在。它也可以液体、粉末或者颗粒的形式存在。

在本发明中还包括了本发明的CBHII/Cel6A多肽或酶制剂在制备生物燃料、洗涤剂、处理纤维、处理食物或饲料、纸浆和纸、饮料或任何涉及纤维素材料水解或改性用途中的应用。

特别是，所述CBHII/Cel6A多肽或含有所述多肽的酶制剂可用于制备生物燃料。

附图说明

图1示意性显示了在用于高效制备重组CBHII/Cel6A蛋白质的里氏木霉原生质体的转化过程中所使用的表达框。cbh2/cel6A基因在里氏木霉cbh1/cel7A启动子(p cbh1)的调控下，并且通过使用里氏木霉cbh1/cel7A终止子序列(t cbh1)来确保转录的终止。还包括作为转化标记的amdS基因。

图2显示了含有嗜热枝顶孢霉CBS 116240、黑果白丝菌CBS 685.95、嗜热毛壳菌CBS 730.95和埃默森篮状菌DSM 2432的重组CBHII/Cel6A纤维二糖水解酶的酶组合物(100μg蛋白的反应）的pH值依赖性的测定。在3-10的pH值范围内在50℃下对AvicelPh 101纤维素进行21h的水解。利用纤维二糖标准曲线通过对羟基苯甲酸酰肼(PAHBAH)法（Lever，1972）来测定还原性糖的生成。

图3显示了含有嗜热枝顶孢霉CBS 116240、黑果白丝菌CBS 685.95、嗜热毛壳菌CBS 730.95和埃默森篮状菌DSM 2432的重组CBHII/Cel6A纤维二糖水解酶的酶组合物（100μg蛋白的反应）的热稳定性的测定。在40-80℃的温度范围内在酶组合物的最佳pH值下对Avicel Ph 101纤维素进行21h的水解。利用纤维二糖标准曲线通过对羟基苯甲酸酰肼(PAHBAH)法（Lever，1972）来测定还原性糖的生成。

图4显示了采用含有本发明的CBHII/Cel6A纤维二糖水解酶的酶混合物对蒸汽爆破的硬木材料进行水解的结果。硬木底物在55℃和37℃下以每克总干物质5mg蛋白质的剂量采用不同的酶混合物进行水解。含有At_ALKO4245_Cel6A、Ma_ALKO4237_Cel6A或Ct_ALKO4265_Cel6A的嗜热酶混合物（混合物2）和嗜温酶混合物（混合物里氏木霉酶和混合物ACC）的组合物的详细说明见实施例4。水解72小时后从平行试验的摇瓶中取样，并用HPLC定量，测定葡萄糖和木糖的含量。从采用酶混合物所得的结果中减去以缓冲溶液替代酶样品的底物空白样的结果。就得到木糖和葡萄糖的总含量。

图4A显示了采用补加有At_ALKO4245_Cel6A（混合物2_AT）、Ma_ALKO4237_Cel6A（混合物2_MA）或Ct_ALKO4265_Cel6A（混合物2_CT）的嗜热酶混合物（混合物2）在55℃下对蒸汽爆破的硬木进行水解的结果。

图4B显示了采用补加有At_ALKO4245_Cel6A（混合物TR_AT）、Ma_ALKO4237_Cel6A（混合物TR_MA）或Ct_ALKO4265_Cel6A（混合物TR_CT）的嗜温酶混合物（混合物里氏木霉酶）在37℃下对蒸汽爆破的硬木进行水解的结果。

图4C显示了采用补加有At_ALKO4245_Cel6A（混合物ACC_AT）、Ma_ALKO4237_Cel6A（混合物ACC_MA）或Ct_ALKO4265_Cel6A（混合物ACC_CT）的嗜温酶混合物（混合物ACC）在37℃下对蒸汽爆破的硬木进行水解的结果。

图5显示了采用含有本发明的CBHII/Cel6A纤维二糖水解酶的酶混合物对蒸汽爆破的玉米棒材料进行水解的结果。玉米棒底物在55℃下以每克总干物质5mg蛋白质的剂量采用不同的酶混合物进行水解。含有本发明的At_ALKO4245_Cel6A多肽（混合物2_AT）的嗜热酶混合物（混合物2）的组合物的详细说明见实施例5。水解72小时后从平行试验的摇瓶中取样，并用HPLC定量，测定葡萄糖和木糖含量。从采用酶混合物所获得的结果中减去以缓冲溶液替代酶样品的底物空白样的结果。得到葡萄糖和木糖的总含量。

序列表

SEQ ID NO:1低聚核苷酸引物CBH_1S的序列

SEQ ID NO:2低聚核苷酸引物CBH_1AS的序列

SEQ ID NO:3低聚核苷酸引物CBH_8的序列

SEQ ID NO:4低聚核苷酸引物CBH_9的序列

SEQ ID NO:5低聚核苷酸引物Te_CBH_A的序列

SEQ ID NO:6低聚核苷酸引物Te_CBH_B的序列

SEQ ID NO:7采用引物CBH_1S和CBH_1AS从嗜热枝顶孢霉ALKO4245(CBS 116240)中获得的PCR片段的序列

SEQ ID NO:8采用引物CBH_1S和CBH_1AS从黑果白丝菌ALKO4237(CBS 685.95)中获得的PCR片段的序列。

SEQ ID NO:9嗜热毛壳菌ALKO4265(CBS 730.95)cbh2/cel6A基因的核苷酸序列。

SEQ ID NO:10埃默森篮状菌RF8069(DSM 2432)cbh2/cel6A基因的核苷酸序列。

SEQ ID NO:11嗜热枝顶孢霉ALKO4245(CBS 116240)cbh2/cel6A基因的核苷酸序列。

SEQ ID NO:12嗜热枝顶孢霉ALKO4245(CBS 116240)CBHII/Cel6A的推导氨基酸序列。

SEQ ID NO:13黑果白丝菌ALKO4237(CBS 685.95)cbh2/cel6A基因的核苷酸序列。

SEQ ID NO:14黑果白丝菌ALKO4237(CBS 685.95)CBHII/Cel6A的推导氨基酸序列。

SEQ ID NO:15嗜热毛壳菌ALKO4265(CBS 730.95)CBHII/Cel6A的推导氨基酸序列。

SEQ ID NO:16埃默森篮状菌RF8069(DSM 2432)CBHII/Cel6A的推导氨基酸序列。

菌种保藏

嗜热枝顶孢霉ALKO4245于2004年9月20日保存于位于荷兰Upsalalaan 8,3584CT,Utrecht的荷兰微生物菌种保藏中心(CBS)，登记号为CBS 116240。

嗜热毛壳菌ALKO4265于1995年11月8日保存于位于荷兰Oosterstraat 1,3742SKBAARN的荷兰微生物菌种保藏中心(CBS)，登记号为CBS 730.95。在当前的保存期终止后,样本将根据协议保存，以便在超过专利保护期限后仍可获得菌株。

黑果白丝菌ALKO4237于1995年10月11日保存于位于荷兰Oosterstraat 1,3740AG BAARN的荷兰微生物菌种保藏中心(CBS)，登记号为CBS 685.95。在当前的保存期终止后,样本将根据协议保存，以便在超过专利保护期限后仍可获得菌株。

包含质粒pALK2582的大肠杆菌菌株RF8175于2009年9月9日保存于位于德国Inhoffenstrasse 7B,D-38124Braunschweig的德国微生物菌种保藏中心(DSMZ)，登记号为DSM 22946。

包含质粒pALK2581的大肠杆菌菌株RF8174于2009年9月9日保存于位于德国Inhoffenstrasse 7B,D-38124Braunschweig的德国微生物菌种保藏中心(DSMZ)，登记号为DSM 22945。

包含质粒pALK2904的大肠杆菌菌株RF8214于2009年9月9日保存于位于德国Inhoffenstrasse 7B,D-38124Braunschweig的德国微生物菌种保藏中心(DSMZ)，登记号为DSM 22947。

包含质粒pAL 3006的大肠杆菌菌株RF8333于2009年12月10日保放于位于德国Inhoffenstrasse 7B,D-38124Braunschweig的德国微生物菌种保藏中心(DSMZ)，登记号为DSM 23185。

具体实施方式

本发明提供了一种利用CBHII/Cel6A纤维二糖水解酶多肽或含有所述多肽的酶组合物来处理纤维素材料的方法。本发明还提供了一种真菌CBHII/Cel6A纤维二糖水解酶多肽或含有所述CBHII/Cel6A多肽的酶组合物，所述多肽显示出广泛的底物特异性，并且能够在广泛的pH值和温度范围内稳定。其在中温和高温下均具有良好的性能。特别是，CBHII/Cel6A纤维二糖水解酶多肽在高达70℃的条件下、优选在40-60℃的温度范围内至少能够稳定21小时。多肽和含有所述多肽的酶组合物在要求高效水解纤维素是其主要成分之一的复合纤维素或木质纤维素材料的不同应用中都很理想。多肽和酶组合物例如可以用于水解纤维素材料，以便从高分子原料中制备糖单体，然后再通过微生物发酵以生产生物燃料。因此，本发明提供了用于生物燃料和其他实际应用的替代性的CBHII/Cel6A纤维二糖水解酶。真菌CBHII/Cel6A纤维二糖水解酶可以在高产真菌宿主中生产，可以有或没有下游加工，例如发酵液和菌丝的分离很容易进行，或者在发酵生物机体中制备。

本发明所用的用语“纤维素”或“纤维素材料”指含有纤维素作为主要组分的任何材料。纤维素是高等植物的主要结构组分。它为植物细胞提供高抗张强度，帮助它们抵抗机械应力和渗透压。纤维素是一种由通过β-l,4-糖苷键相连的葡萄糖残基的直链构成的β-l,4-葡聚糖。纤维二糖是纤维素的最小重复单元。纤维素材料的例子包括源自如棉、亚麻、大麻、黄麻的织物纤维，以及诸如莫代尔、粘胶、莱赛尔的人造纤维素纤维。

用语“纤维素”或“纤维素材料”也指含有纤维素作为主要组分的“木质纤维素”或“木质纤维材料”。

在细胞壁中，纤维素被包裹在不同走向的薄层中，其嵌入半纤维素、果胶质和/或苯酚丙醇单元的聚合物如木质素的基质中，以形成“木质纤维材料”或“木质纤维素”。木质纤维素的物理特性是硬而密，并且无法透过。含木质纤维素的材料例如包括：植物材料，如木材（包括硬木和软木）、硬木和软木碎片、木浆、木屑，以及林业和木材工业废弃物；草本作物、农业生物质（如谷类秸秆、糖用甜菜制浆、玉米纤维、玉米秸秆和玉米棒）、谷物β-葡聚糖、甘蔗渣、茎、叶、皮、壳等等；废品，如市政固体垃圾、报纸和废弃办公纸张、废纤维、造纸污泥、诸如谷物的磨粉废弃物；专用的能源作物（如柳树、杨树、柳枝稷或利甘草等）。

纤维素和木质纤维素材料在本质上可以被包括会产生能够水解糖类聚合物的酶的细菌和真菌的各种生物机体降解。降解通常需要多种酶发生作用，其通常按顺序地或同时地发生作用。纤维素到葡萄糖的生物转化一般需要三种主要类型的水解酶：(1)内切葡聚糖酶(EG)，其主要是在纤维素的非晶区域内切割内部β-l,4-糖苷键；(2)外切葡聚糖酶或纤维二糖水解酶(CBH)，其从晶状纤维素聚合物链的还原或非还原端切割二糖、纤维二糖；(3)β-1,4-葡萄糖苷酶(BG)，其将纤维二糖和其它短纤维寡糖水解成葡萄糖。葡萄糖和纤维二糖用作水解反应的终产品抑制剂。

“纤维素酶”或“纤维素分解酶”是一种具有“纤维素酶活性”或“纤维素分解酶活性”的酶，这意味着它能够水解纤维素材料。一种研究最多的纤维素酶体系是丝状真菌里氏木霉，其已知至少有2种CBH、8种EG和5种BG。

“木质纤维素水解酶”是具有“木质纤维素酶活性”或“木质纤维素水解活性”的酶，这意味着它们能够将木质纤维素材料如纤维素、半纤维素或其衍生物水解成分子量较小的糖类。

“β-葡聚糖”是混联(l→3),(l→4)-β-D-葡聚糖。它们通常存在于例如谷物中。

本发明所用的用语“β-葡聚糖酶”指能够至少部分地切割β-葡聚糖中的连接键的酶。

本发明所用的用语“纤维二糖水解酶”或“CBH”指能够从还原或非还原端切割诸如纤维素类的聚合物的1,4-β-D-糖苷键并主要产生纤维二糖的酶。它们也被称为外切葡聚糖酶，或1,4-β-D-葡聚糖纤维二糖水解酶，或纤维素1,4-β-纤维二糖糖苷酶。CBH具有由诸如催化域和N-或C-端纤维素结合域(CBD)类的非重复域所构成的模块式结构。还有一些本身缺乏CBD的纤维二糖水解酶。CBH可能还具有其他具有未知功能的域。不同的域通常通过甘氨酸、脯氨酸、丝氨酸或苏氨酸中所富含的O-糖基化连接桥或铰链肽连接在一起。

本发明所涉及“纤维二糖水解酶II”或“CBHII纤维二糖水解酶”或“CBHII/Cel6A纤维二糖水解酶”或“CBHII/Cel6A纤维素酶”或“CBHII/Cel6A多肽”或“CBHII/Cel6A酶”意指按照国际生物化学和分子生物学联盟（IUBMB；见http://www.iubmb.org）归类为EC 3.2.1.91的一种1,4-β-D-葡聚糖纤维二糖水解酶的酶。基于其结构的相似性，本发明的纤维二糖水解酶II或CBHII/Cel6A纤维二糖水解酶可以归入具有类似的氨基酸序列和三维结构的糖基水解酶家族6(GH6)中（Henrissat，1991；Henrissat和Bairoch，1993、1996；Henrissat等人，1998；也见http://www.cazy.org/farn/GH.html）。因为在序列和折叠相似性之间具有直接的关系，这一分类被认为比其专有的底物特异性更能反映出酶的结构特点，有助于揭示酶之间的进化关系，并提供一种方便的工具来获取机理信息。

本发明所用的用语“纤维二糖水解酶活性”或“CBH活性”指对纤维素、纤维三糖、纤维四糖或主要从聚合物链的还原端或非还原端释放纤维二糖的任何以β-1,4-链接的葡萄糖聚合物中的1,4-β-D-糖苷键具有水解活性。糖苷键的酶解是一种立体选择性过程，其中异头中心（CI碳）的构型既可反转也可保持。这两种构型包含一对位于待切割键的任一侧的羧酸残基。反转酶采用单置换机制，而保持酶涉及双置换反应（Sinnott,1990；Withers和Aebersold，1995）。水解的立体化学进程通常由质子NMR测定，其中α-和β-异头质子呈现出不同的化学位移（Withers等人，1986）。

本发明中所用的用语“纤维二糖水解酶II活性”或“CBHII/Cel6A活性”指对纤维素、纤维三糖、纤维四糖或主要从聚合物链的还原端或非还原端释放纤维二糖的任何以β-1,4-链接的葡萄糖聚合物中的1,4-β-D-糖苷键具有水解活性。CBHII/Cel6A纤维二糖水解酶的反应机理是构型反转型。

分析纤维素酶活性的方法已在文献有记载，例如可参考Ghose (1987),Tomme等人(1988)和van Tilbeurgh等人(1988)。总的纤维素酶活性通常以过滤纸降解活性(FPU)来测量。纤维二糖水解酶活性可以使用小分子、可溶性纤维糊精和其显色苷、如4-甲基伞形酮-β-D-苷进行分析。CBHII/Cel6A纤维二糖水解酶可以基于水解反应的结果来识别；CBHII/Cel6A酶不能切割小分子显色低聚糖的葡萄糖苷键（van Tilbeurgh等人，1988）。纤维二糖水解酶活性还可以基于诸如Avicel Ph 101类的微晶纤维素来分析，例如实施例3中所用。水解后形成的可溶性还原糖可以通过利用纤维二糖标准曲线的对羟基苯甲酸酰阱(PAHBAH)法（Lever，1972）、Somogyi-Nelson法（Somogyi，1952）、碱性铁氰化物法（Robyt和Whelan，1972）、2,2'-双辛可宁酸盐法（Waffenschmidt和Jaenicke，1987）或二硝基水杨酸(DNS)法（Miller，1959）来测量。其他纤维素底物例如包括Solkafloe纤维素或磷酸溶胀纤维素（Karlsson等人，2001）。

纤维二糖水解酶II还可以用蛋白质印迹或酶联免疫吸附试验检测法利用多克隆或单克隆抗体针对纯化CBHII/Cel6A蛋白进行识别。

用语“CBHII/Cel6A纤维二糖水解酶”意指纤维二糖水解酶II酶，其属于糖基水解酶家族6的成员，兼具水解反应的保守折叠和立体化学结构。

本发明上下文中的用语“中温”或“常规温度”指纤维素水解中的常用温度，其对应于这些过程中的酶的最佳温度或热稳定性。因此，该用语指30-45℃的温度范围。

术语“升温”或“高温”指45-70℃的温度范围。在短时间的水解过程中，酶在高达80℃下仍然可以有效地作用。在这种高温的范围内仍然具有活性或稳定性的酶也称为“耐热”或“嗜热”酶。

能够产生CBHII/Cel6A纤维二糖水解酶多肽或CBHII/Cel6A纤维二糖水解酶活性的微生物菌株可基于不同的底物进行筛选。首先，将所选的菌株在合适的培养基上培养。在制得足够量的目标纤维二糖水解酶后，将这种酶分离或纯化，对其特性进行更完全地表征。或者，将各种生物机体中的编码纤维二糖水解酶或CBHII/Cel6A纤维二糖水解酶的基因分离，并且由基因编码的氨基酸序列与在实施例1中所分离并表征的CBHII/Cel6A纤维二糖水解酶的氨基酸序列进行比较。

所制备的纤维二糖水解酶、特别是CBHII/Cel6A纤维二糖水解酶能够通过使用常规的酶化学方法如盐制备、超滤、离子交换色谱、亲和层析、凝胶过滤及疏水色谱法进行纯化。纯化过程可以通过蛋白质测定、酶活性分析以及通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳进行监测。可以对不同的温度和pH值以及分子质量及等电点的条件下的纯化酶的酶活性和稳定性进行测定。或者，本发明的CBHII/Cel6A纤维二糖水解酶的特性可以通过在重组宿主中制备酶、以及纯化和表征重组CBHII/Cel6A纤维二糖水解酶的酶来进行识别。此外，含有本发明的CBHII/Cel6A纤维二糖水解酶作为主要酶组分之一的重组酶制剂的特性可依照实施例3中所述的方法进行表征。

纯化后的CBHII/Cel6A纤维二糖水解酶的分子量可以通过质谱法或根据Laemmli(1970)基于SDS-PAGE测量。所述分子量也可以利用ExPASy服务器处的pI/MW工具（http://expasy.org/tools/pi_tool.html；Gasteiger等人，2003）从酶的氨基酸序列中预测。

CBHII/Cel6A纤维二糖水解酶的酶的温度依赖性或热稳定性可以在合适的缓冲液中在不同的温度下通过如实施例3所述地使用例如Avicel纤维素作为底物来测定，或通过使用文献中已描述的其它底物和缓冲体系来测定。pH依赖性和pH稳定性可以在合适的缓冲液中在不同的pH值下通过以下基于纤维素底物的活性进行测定。

pI（等电点）可通过在由聚丙烯酰胺、淀粉或琼脂糖制成的固定化pH梯度凝胶上的等电聚焦来确定，或者通过从氨基酸序列中估算pI、例如采用ExPASy服务器处的pI/MW工具（http://expasy.org/tools/pi_tool.html；Gasteiger等人，2003）来测定。

纯化的重组CBHII/Cel6A酶以及内部多肽的N-端可以根据Edman降解化学（Edman和Begg，1967）来测序，或者依照实施例1所述的方法或文献中所介绍的其它方法例如通过使用程序SignalP V3.0（Nielsen等人，1997；Nielsen和Krogh，1998；Bendtsen等人，2004）从氨基酸序列中预测分泌信号序列的切割位点来测序。

用语“全长”指从编码DNA序列中翻译的酶的形式，其以编码氨基酸序列中的第一个蛋氨酸的ATG起始密码子起始，并且终止于TGA、TAG或TAA终止密码子。

术语“成熟”指在去除信号序列（分泌信号肽或前肽）后含有酶活性或催化活性所需必须的氨基酸的酶的形式。对丝状真菌而言，它是指例如作为信号序列的N-端处理和其他的N-端处理以及翻译后的糖基化的结果而分泌到培养基中的形式。此外，成熟形式是指从融合构建体中的载体蛋白中切割下来的酶。

许多细菌及真菌纤维二糖水解酶以模块化酶的方式制备（Srisodsuk等人，1993；Suurnakki等人，2000）。除了表达纤维素分解活性的催化或核心域外，这些酶还可能含有一个或多个纤维素结合域(CBD)，也称为糖类结合域/模块(CBD/CBM)，其可位于催化域的N-端或C-端。CBD具有糖类结合活性，它们调控纤维素酶与晶状纤维之间的连接，但对于酶对可溶性底物的纤维素酶水解活性的影响很小或基本没有影响。这两个域通常通过一种灵活的和高度糖基化的连接桥或铰链域连接，这一点从SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16的氨基酸序列中可以明显看出。

本发明所用的用语“片段”意指SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16的全长多肽的N-端和/或C-端缺少一个或多个氨基酸残基的多肽，例如多肽的成熟形式或多肽的其他酶活性部分。该片段仍然具有全长CBHII/Cel6A纤维二糖水解酶所必要的催化活性或纤维二糖水解酶活性，以及基本上类似的特性如温度和pH值依赖性和稳定性及底物特异性。本发明所披露的SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID:15和SEQ ID NO:16中的多肽本身包含N-端CBD和连接桥。这些固有的连接桥或CBD区域例如可由来自木霉属或毛壳菌的CBD取代。本发明的CBHII/Cel6A酶在实际应用中也可以没有信号序列和/或CBD，或者信号序列和/或CBD也可以来自上述微生物或不同微生物的不同酶，或者以合成或重组的方式并入到上述酶的催化域中。

本发明中所用的用语“一致性”意指在具有大约相同氨基酸数量的相应序列区域内相互比较的两个氨基酸序列之间的一致性。例如，两个氨基酸序列的全长或成熟序列可以比较一致性。此外，两个氨基酸序列中的缺乏N-端CBD的全长或成熟序列可以比较一致性。因此，例如包括CBD和/或信号序列的CBHII/Cel6A序列与缺乏这些元素的序列的比较不在本发明的范围内。全长序列的一致性可通过例如使用ClustalW比对法（例如见www.ebi.ac.uk/Tools/Clustalw）采用如下矩阵进行测量：BLOSUM，Gap open:10，Gap extension:0.5，或者使用Clone Manager程序（版本9）（美国Cary的科学和教育软件），其包括功能“比较两个序列/全球/比较作为氨基酸的序列/BLOSUM62打分矩阵”，如实施例1所述。

待比较的两个分子的氨基酸序列可能在一个或多个位置上不同，但这不会改变该分子的生物学功能或结构。这种“变异体”可能会因为不同的宿主生物基体或突变体而在氨基酸序列中自然出现，例如作为同一株、种或属内的等位基因变异体，或者它们可通过特异性变异实现。它们可能包括氨基酸序列中的一个或多个位置上的氨基酸的取代、删除、合并或插入，但它们实质上仍然以与SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16所定义的酶本质上类似的方式发生作用，即它们含有具有纤维素分解活性的变异体。

本发明涉及一种用于处理纤维素材料的方法，包括用CBHII/Cel6A多肽或含有所述多肽的酶组合物或者以综合生物过程的方式来处理木质纤维材料，该纤维素材料可以采用产生所述多肽的发酵微生物进行处理，其中CBHII/Cel6A多肽呈现出纤维二糖水解活性，并且含有与SEQ ID NO:12的全长多肽至少具有76%一致性，与SEQ ID NO:14的全长多肽至少具有76%一致性，与SEQ ID NO:15的全长多肽至少具有95%一致性，或者与SEQ ID NO:16的全长多肽至少具有91%一致性的氨基酸序列，或者是具有类似特性的其片段或变异体。所述酶能够在中到高温条件下水解纤维素材料，包括木质纤维素。所述方法包括以下步骤：i)制备本发明的CBHII/Cel6A多肽或含有所述多肽的酶组合物或产生所述多肽的发酵微生物；ii)将纤维素材料与本发明的CBHII/Cel6A多肽或含有所述多肽的酶组合物或产生所述多肽的发酵微生物反应；以及iii)获得部分或完全水解的纤维素材料，包括水解的木质纤维材料。

用于处理或水解纤维素材料的CBHII/Cel6A纤维二糖水解酶的酶“可以得自于”任何一种包括植物在内的生物机体。CBHII/Cel6A酶优选源于例如细菌或真菌类的微生物。细菌可以例如选自芽孢杆菌、固氮螺菌属、链霉菌和假单胞菌属。更为优选的是，酶源自真菌（包括丝状真菌和酵母菌），例如源自基因，其选自：裂殖酵母、克鲁维酵母菌属、毕赤酵母属、酵母属、假丝酵母和耶氏酵母，或丝状真菌毛壳菌、枝顶孢酶、曲霉、短梗霉、葡萄孢菌、毛壳菌属、金孢霉属、隐球菌、金钱菌属、木蹄层孔菌、镰刀酶、腐殖霉属、肉座菌属、香菇属、稻瘟菌、白丝菌、毛霉菌、毁丝霉属、团丝核菌、厌气性真菌(Neocallimastix)、粗糙脉孢、拟青霉、青霉、黄孢原毛平革菌、射脉菌属、侧耳菌属、粪壳菌、多孔菌、密孔菌属、丝核菌属、裂褶菌、小柱孢属、篮状菌、嗜热子囊菌、梭孢壳菌属、白腐菌或木霉属。CBHII/Cel6A酶优选源自嗜热枝顶孢霉、黑果白丝菌、嗜热毛壳菌或埃默森篮状菌。

根据本发明的一个优选实施例，酶可以得自于作为CBS 116240保藏的且目前被归类为嗜热枝顶孢霉的丝状真菌株ALKO4245、作为CBS 685.95保藏的黑果白丝菌株ALKO4237、埃默森篮状菌株DSM 2432（申请人的菌种保藏编号为RF8069）或作为CBS 730.95保藏的嗜热毛壳菌株ALKO4237。

本发明的CBHII/Cel6A纤维二糖水解酶被标记为At_ALKO4245_Cel6A、Ma_ALKO4237_Cel6A、Ct_ALKO4265_Cel6A和Te_RF8069_Cel6A，CBHII/Cel6A纤维二糖水解酶源于嗜热枝顶孢霉CBS 116240株、黑果白丝菌CBS 685.95株、嗜热毛壳菌CBS 730.95株或埃默森篮状菌株DSM 2432株以及糖苷水解酶家族6的成员。

表1：本发明的CBHII/Cel6A纤维二糖水解酶

根据本发明的一个优选实施例，用于所述方法的真菌CBHII/Cel6A纤维二糖水解酶的酶是一种多肽，其具有纤维二糖水解酶活性，并包括具有SEQ ID NO:12的全长氨基酸序列、或者具有与SEQ ID NO:12的氨基酸序列至少具有76%一致性的氨基酸序列的At_ALKO4245_Cel6A的酶。该酶优选呈现出至少78%、80%或82%，优选至少84%、86%或88%，更为优选至少90%，甚至更为优选至少92%的一致性。仍然更为优选的是，该氨基酸序列呈现出与SEQ ID NO:12的氨基酸序列具有至少94%或至少96%或97%、更为优选至少98%、最为优选99%的一致性。两种酶的一致性在相应的序列域、即在CBHII/Cel6A纤维二糖水解酶的全长域内进行比较。

本发明的另一个优选实施例是可用于所述方法的真菌CBHII/Cel6A的纤维二糖水解酶的酶，其具有纤维二糖水解酶活性，并含有具有SEQ ID NO:14的全长氨基酸序列、或者具有与SEQ ID NO:14的氨基酸序列至少具有76%的一致性的氨基酸序列的Ma_ALKO4237_Cel6A的酶。该酶优选呈现出至少78%、80%或82%，优选至少84%、86%或88%，更为优选至少90%，甚至更为优选至少92%的一致性。仍然更为优选的是，氨基酸序列呈现出与SEQ ID NO:14的氨基酸序列具有至少94%或至少96%或97%、更为优选至少98%、最为优选99%的一致性。两种酶的一致性在相应的序列域、即在CBHII/Cel6A纤维二糖水解酶的全长域内进行比较。

本发明的另一个优选实施例是可用于所述方法的真菌CBHII/Cel6A的纤维二糖水解酶的酶，其具有纤维二糖水解酶活性，并含有具有SEQ ID NO:15的全长氨基酸序列、或者具有与SEQ ID NO:15的氨基酸序列至少具有95%的一致性的氨基酸序列的Ct_ALKO4265_Cel6A的酶。该酶优选呈现出与SEQ ID NO:15具有至少96%、优选至少97%、更优选至少98%、最优选至少99%的一致性的酶。两种酶的一致性在相应的序列域、即在CBHII/Cel6A纤维二糖水解酶的全长域内进行比较。

本发明的另一个优选实施例是可用于所述方法的真菌CBHII/Cel6A的纤维二糖水解酶的酶，其具有纤维二糖水解酶活性，并含有具有SEQ ID NO:16的全长氨基酸序列、或者具有与SEQ ID NO:16的氨基酸序列至少具有91%一致性的氨基酸序列的Te_RF8069_Cel6A的酶。该酶优选呈现出与SEQ ID NO:16具有至少92%、优选至少93%、更优选至少94%的一致性。仍然更为优选的是，氨基酸序列呈现出与SEQ ID NO:16的氨基酸序列具有至少95%或至少96%或97%、更为优选至少98%、最为优选99%的一致性。两种酶的一致性在相应的序列域、即在CBHII/Cel6A纤维二糖水解酶的全长域内进行比较。

当采用Avicel纤维素做为底物在50℃下进行21小时的试验时，本发明的真菌CBHII/Cel6A纤维二糖水解酶在至少为pH 3-10的很宽的pH范围内、并且更为优选的是至少为pH 3-7的pH范围内具有活性或稳定性，如实施例3所述。

特别是，At_ALKO4245_Cel6A在pH 3和pH 7之间、优选在pH 4和pH 6之间、并且更为优选的是在pH 4和pH 5之间具有活性。当采用Avicel纤维素为底物在50℃下进行21小时的试验时，At_ALKO4245_Cel6A在pH 5下具有最大活性。

Ma_ALKO4237_Cel6A在pH 3和pH 10之间、优选在pH 4和pH 8之间、更为优选的是在pH4和pH7之间、仍然更为优选的是在pH 4和pH 6之间，并且甚至更为优选的是在pH 4和pH 5之间具有活性。当采用Avicel纤维素为底物在50℃下进行21小时的试验时，Ma_ALKO4237_Cel6A在pH 4下具有最大活性。

Ct_ALKO4265_Cel6A在pH 3和pH 10之间、优选在pH 3和pH 8之间、更为优选的是在pH 3和pH 7之间、仍然更为优选的是在pH 4和pH 7之间、并且甚至更为优选的是在pH 4和pH 6之间具有活性。当采用Avicel纤维素为底物在50℃下进行21小时的试验时，Ct_ALKO4265_Cel6A在pH 5下具有最大活性。

Te_RF8089_Cel6A在pH 3和pH 7之间，优选在pH 3和pH 6之间，并且更为优选的是在pH 4和pH 6之间具有活性。当采用Avicel纤维素为底物在50℃下进行21小时的试验时，Te_RF8089_Cel6A在pH 4下具有最大活性。

本发明的酶在一个很宽的温度范围内可有效地降解纤维素或木质纤维素材料。当采用Avicel纤维素为底物在酶的最佳pH值下进行试验时，在40℃到70℃之间的温度范围内，本发明中的CBHII/Cel6A纤维二糖水解酶具有活性或稳定性达21小时，如实施例3所述。

At_ALKO4245_Cel6A纤维二糖水解酶在40℃到70℃之间、优选40℃到60℃之间、并且更为优选的是50℃到60℃之间具有活性。当采用Avicel纤维素为底物且保温培养期为21小时时，At_ALKO4245_Cel6A在最佳pH值下在60℃下具有最大活性。

Ma_ALKO4237_Cel6A纤维二糖水解酶在40℃到60℃之间的温度范围内具有活性。当采用Avicel纤维素为底物、在最佳pH值下且保温培养期为21小时时，该酶在50℃下表现出最大活性。Ct_ALKO4265_Cel6A纤维二糖水解酶在40℃到70℃之间的温度范围内，优选在50-60℃范围内具有活性。当采用Avicel纤维素为底物且保温培养期为21小时时，所述酶在最佳pH值下的最大活性是在60℃下。Te_RF8089_Cel6A纤维二糖水解酶在40℃到70℃之间、优选在40℃到60℃之间、更为优选的是在50℃到60℃之间具有活性。当采用Avicel纤维素为底物且在最佳pH值下培养21小时时，所述酶在60℃具有最大活性。

目前在纤维素材料的水解及用于例如生物乙醇应用的可发酵糖的生产中所使用的纤维素酶主要来自已充分研究的微生物，如丝状真菌里氏木霉（例如产品系列，美国Genencor Int.公司）。纤维素酶通常在30-45℃温度范围内使用。本发明的CBHII/Cel6A纤维二糖水解酶在这些温度条件下也很有效，但此外，它们甚至在高达70℃的温度下，如40到70℃（例如40℃到70℃之间或40℃到60℃之间或50℃到60℃之间）仍然能够极好地工作，如实施例3所述。对于较短的水解时间，酶组合物可以在高达80℃的条件下工作。对于全面水解来说需要较长的培养时间，因此一般常使用较低的温度。这使得本发明的CBHII/Cel6A纤维二糖水解酶在常规或中等的温度下以及在高温下均能极好地适用于不同纤维素底物的水解过程。

在实施例4和5中阐述了对各种纤维素材料、如硬木和玉米棒子等进行的试验。从图4可以看出，补加了真菌CBHII/Cel6A纤维二糖水解酶At_ALKO4245_Cel6A、Ma_ALKO4237_Cel6A或Ct_ALKO4265_Cel6A的酶混合物在蒸汽爆破硬木的水解过程中的性能远胜于无补加的酶混合物。在55℃下进行的试验中（图4A），可以看出通过在混合物2中补加At_ALKO4245_Cel6A、Ma_ALKO4237_Cel6A或Ct_ALKO4265_Cel6A，从硬木底物中释放的糖类物质的量分别增加了12%、14%和26%。可以看出，嗜热枝顶孢霉ALKO4245酶是所研究的性能最佳的CBHII/Cel6A。无论是添加到最先进的木酶混合物（混合物里氏木霉酶）中（图4B）还是添加到市售产品（混合物ACC）中（图4C），At_ALKO4245_Cel6A在37℃条件下都呈现出增强的水解性。

对于蒸汽爆破的玉米棒子也得到了类似的结果（图5）。嗜热酶混合物2中补加了本发明的At_ALKO4245_Cel6A酶。水解72小时后葡萄糖和木糖的总含量明显高于没有进行这种补加的情况。

根据本发明的一个优选实施例，用于处理纤维素和木质纤维材料（例如包括半纤维素、果胶质和木质素的木质纤维材料）的方法包括将一种或多种本发明的CBHII/Cel6A纤维二糖水解酶用作含有至少一种能够水解所述材料的另外的酶的“酶组合物”或“酶制剂”。所述另外的酶可以选自纤维二糖水解酶、内切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶、β-葡聚糖酶、木葡聚糖酶、木聚糖酶、β-木糖苷酶、甘露聚糖酶、β-甘露糖苷酶、α-葡萄糖苷酸酶、乙酰基木聚糖酯酶、α-阿拉伯呋喃糖苷酶、α-半乳糖苷酶、果胶酶，内切α-L-阿拉伯糖酶和外切α-L-阿拉伯糖酶、α-半乳糖苷酶、内切半乳糖醛酸酶和外切半乳糖醛酸酶、内切果胶裂解酶、果胶酸盐裂解酶和果胶（甲）酯酶、苯酚酯酶、包括过木质素过氧化物酶的木质酶、锰过氧化物酶、H₂O₂-生成酶，以及有介体或无介体的漆酶。

所述酶制剂或组合物含有至少一个上文定义的酶。它可能包含至少部分纯化和独立形式的酶。它甚至基本上可以由所需的酶或多种酶组成。或者，所述制剂可以是包含一种或多种所需酶的用过的培养基或滤液。所述酶制剂优选为用过的培养基。“用过的培养基”是指含有所制备的酶的宿主的培养基。优选地，在制备完成后从所述培养基中分离出宿主细胞。酶制剂或组合物也可以是可选地在产物宿主或微生物死亡后所得的“全培养肉汤”，无需对所需的纤维素分解酶进行进一步的下游加工或纯化。在“综合生物过程”中，酶组合物或酶组合物中的至少一些酶可以通过发酵微生物制备。

本发明中的“分离纯化的多肽”仅意味着从包含多肽的培养基中去除了细胞和细胞碎片。多肽很容易被分离纯化，例如，通过向用过的培养基中加入阴离子和/或阳离子聚合物来促进细胞、细胞碎片或一些具有不需要的侧活性的酶析出。所述培养基再使用无机过滤剂和过滤器过滤，以去除所形成的沉淀物。此后，滤液进一步用半透膜处理，以去除过量的盐、糖和代谢产物。

除了酶活性外，所述制剂可以包含添加剂，诸如调控剂、稳定剂、缓冲液、防腐剂、表面活性剂和/或培养基组分。添加剂优选为在针对特定应用的酶制剂中所常用的那些。酶制剂可以是液体、粉末或颗粒的形式。

根据本发明的一个实施例，酶制剂含有CBH、EG和BG，可选地还有与本发明的CBHII/Cel6A纤维二糖水解酶相结合的半纤维素降解酶。不同的酶混合物和组合物可适用于不同的底物材料和工艺条件。例如，如果在高温下进行降解过程，则选择耐热性酶。

“半纤维素”是主要含有不同的葡聚糖、木聚糖和甘露聚糖的不同类型多糖的混合物。半纤维素由具有β-1,4-链接的以通常包含乙酰基酸、4-O-葡萄糖醛酸、L-阿拉伯糖和半乳糖基的短侧链取代的残基的线性主链组成。半纤维素可与木质素和纤维素化学交联。“木聚糖降解酶”或“木聚糖酶”包括外切水解酶和内切水解酶，如外切1,4-β-D-木聚糖酶(EC 3.2.1.8)或外切1,4-β-D-木糖苷酶(EC 3.2.1.37)，其将半纤维素分解为木糖。葡甘露聚糖和半乳甘露聚糖通过外切1,4-β-甘露聚糖酶(EC 3.2.1.78)和β-甘露糖苷酶(EC 3.2.1.25)水解，产生β-D-甘露糖。能够去除侧链取代基的酶包括可与主链降解酶协同作用的α-葡萄糖苷酸酶、乙酰基木聚糖酯酶、α-阿拉伯呋喃糖苷酶和α-半乳糖苷酶（Biely等人，1997；Sundberg和Poutanen，1991；Stalbrand等人，1995）。

参与“果胶质”降解的酶包括内切-和外切-α-L-阿拉伯糖酶和α-半乳糖苷酶、内切-和外切-半乳糖醛酸酶、内切果胶酸酯裂解酶和果胶（甲）酯酶（Del Canizo等人，1994）。

“木质素”是一种具有不同取代的p-羟基苯基丙烷单元的复杂的交联聚合物。其水解需要木质素过氧化物酶、苯酚酯酶、锰过氧化物酶、H₂O₂-生成酶和漆酶（Cullen和Kersten，2004）。

酶组合物中的酶可以同时地或按顺序地添加到木质纤维材料中。

根据本发明的一个优选实施例，所述方法适用于各种含有纤维素、木质纤维素和β-葡聚糖的材料，例如：植物材料，如木材（包括硬木和软木）、硬木和软木碎片、木浆、木屑，以及林业和木材工业废弃物；草本作物、农业生物质（如谷类秸秆、糖用甜菜制浆、玉米纤维、玉米秸秆和玉米棒）、谷物β-葡聚糖、甘蔗渣、茎、叶、皮、壳等等；废品，如市政固体垃圾、报纸和废弃办公纸张、废纤维、造纸污泥、诸如谷物的磨粉废弃物；专用的能源作物（如柳树、杨树、柳枝稷或利甘草等）

根据本发明的一个实施例，所述方法适用于从纤维素材料中生产生物燃料，如乙醇、丙醇和丁醇等等。

在本发明的上下文中所述的方法中，用于水解纤维素材料的CBHII/Cel6A多肽来自于嗜热枝顶孢霉CBS 116240株，并具有SEQ ID NO:12的氨基酸序列、或者与SEQ IDNO:12的氨基酸序列至少具有78%、80%、82%、84%、86%、88%、90%、92%、94%、96%、97%、98%或99%的一致性的氨基酸序列，或者是具有纤维二糖水解酶活性的其片段或变异体。

本发明还涉及一种真菌CBHII/Cel6A多肽，其具有纤维二糖水解酶活性，并且含有与SEQ ID NO:12的全长多肽具有至少76%的一致性，与SEQ ID NO:14的全长多肽具有至少76%的一致性，与SEQ ID NO:15的全长多肽具有至少95%的一致性，或者与SEQ ID NO:16的全长多肽具有至少91%的一致性的氨基酸序列，或者具有类似特性的其片段或变异体。

CBHII/Cel6A多肽可以来自于丝状真菌枝顶孢霉属、黑果属、毛壳菌属或篮状菌属。优选包括嗜热枝顶孢霉、黑果白丝菌、嗜热毛壳菌或埃默森篮状菌。

根据本发明的一个优选实施例，所述酶可以得自于作为CBS 116240保藏的且目前被归类为嗜热枝顶孢霉的丝状真菌株ALKO4245、作为CBS 685.95保藏的黑果白丝菌株ALKO4237、作为CBS 730.95保藏的嗜热毛壳菌株ALKO4265或埃默森篮状菌株DSM 2432（申请人的菌种保藏编号为RF8069）。

根据本发明一个优选实施例，真菌CBHII/Cel6A纤维二糖水解酶是一种多肽，其具有纤维二糖水解酶活性，并且含有具有SEQ ID NO:12的全长氨基酸序列的At_ALKO4245_Cel6A的酶。

本发明另一个优选实施例是一种真菌CBHII/Cel6A水解酶，其具有纤维二糖水解酶活性，并且含有具有SEQ ID NO:14的全长氨基酸序列的Ma_ALKO4237_Cel6A的酶。

本发明的又一优选实施例是一种真菌CBHII/Cel6A水解酶，其具有纤维二糖水解酶活性，并且含有具有SEQ ID NO:15的全长氨基酸序列的Ct_ALKO4265_Cel6A的酶。

本发明的再一优选实施例是一种真菌CBHII/Cel6A水解酶，具有纤维二糖水解酶活性，并且含有具有SEQ ID NO:16的全长氨基酸序列的Te_RF8069_Cel6A的酶。

根据本发明的一个实施例，CBHII/Cel6A纤维二糖水解酶能够在中到高温下水解纤维素材料。当采用Avicel Ph101纤维素为底物并在酶的最佳pH值下进行试验时，甚至在高达70℃的温度下，例如40℃到70℃之间（如40℃到60℃之间或50℃到60℃之间），本发明的CBHII/Cel6A纤维二糖水解酶具有活性或稳定性，如实施例3所述。对于较短的水解时间，酶组合物可以在高达80℃的条件下工作。对于全面水解来说需要较长的培养时间，因此一般常使用较低的温度。这使得本发明的CBHII/Cel6A纤维二糖水解酶在常规或中等的温度下以及在要求酶的热稳定性的高温条件下均能极好地适用于不同的纤维素底物的水解过程。

根据本发明的一个优选实施例，真菌CBHII/Cel6A由含有多聚核苷酸序列的独立的核酸分子编码，其编码含有由SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15或SEQID NO:16表征的氨基酸序列的多肽。因此，本发明的范围包括了含有特征为SEQ ID NO:12的At_ALKO4245_Cel6A酶、特征为SEQ ID NO:14的Ma_ALKO4237_Cel6A酶、特征为ID NO:15的Ct_ALKO4265_Cel6A酶或特征为SEQ ID NO:16的Te_RF8069_Cel6A酶的全长形式的氨基酸序列的CBHII/Cel6A纤维二糖水解酶或多肽。

另外，本发明的范围包括了由编码CBHII/Cel6A多肽的核酸分子编码的多肽，其具有纤维二糖水解酶活性，并且与SEQ ID NO:12的全长氨基酸序列具有至少76%的一致性、与SEQ ID NO:14的全长氨基酸序列具有至少76%的一致性、与SEQ ID NO:15的全长氨基酸序列具有至少95%的一致性或者与SEQ ID NO:16的全长氨基酸序列具有至少91%的一致性。两种酶的一致性在相应的序列域内，即在CBHII/Cel6A多肽的全长区域内进行比较。

本发明的范围包括了一种多肽序列，其由编码多肽片段的核酸分子进行编码，所述多肽片段在SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16的全长多肽的N-端或C-端处缺乏一个或多个氨基酸残基。所述片段还具有全长CBHII/Cel6A纤维二糖水解酶的必要的催化活性和纤维二糖水解酶活性，以及实质上类似的特性，如温度和pH值依赖性以及底物特异性。所述片段例如可以是一种缺乏分泌信号序列或糖类结合域或CBD的酶。

还包括CBHII/Cel6A纤维二糖水解酶的天然或合成的变异体，其具有与SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16所定义的多肽类似的特性。所述变异体可以由在氨基酸序列的一个或多个位置上进行删除、取代、插入、添加或组合产生。

本发明一个优选实施例是一种CBHII/Cel6A纤维二糖水解酶，其由含有SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10的多聚核苷酸序列或其子序列的独立的核酸分子编码。

在本发明的上下文中还包括一种CBHII/Cel6A纤维二糖水解酶，该酶由在严谨条件下杂交到SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10所包括的多聚核苷酸序列或其子序列的核酸分子或多聚核苷酸序列进行编码。并且，优选的实施例是一种采用PCR（诸如SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8中所包含的PCR片段）制作的探针进行杂交的核酸分子或多聚核苷酸序列编码的多肽。

可采用标准分子生物学方法来分离宿主生物机体的cDNA或基因组DNA，例如在分子生物学手册（如Sambrook和Russell，2001）中所介绍的方法。在本发明中，编码CBHII/Cel6A纤维二糖水解酶的cDNA或基因组基因可采用DNA探针进行分离，所述DNA探针基于纯化CBHII/Cel6A酶的N-端或胰蛋白酶多肽的氨基酸序列制作。或者，所述探针可基于已知的同源纤维二糖水解酶的核苷酸或氨基酸序列来进行设计。CBHII/Cel6A克隆也可以基于含有酶的特异性底物的板的活性进行筛选，或者通过采用CBHII/Cel6A纤维二糖水解酶的特异性抗体进行筛选。

用诸如由超过100-200个核苷酸组成的SEQ ID NO:7的DNA探针的杂交通常在“高严谨”条件下进行，即在比所计算的进行完美水解的解链温度(Tm)低20-25℃的条件下进行水解，所述Tm根据Bolton和McCarthy（1962）和低盐浓度下的杂交后漂洗进行计算。通常，预杂交及杂交在至少65℃下在6xSSC（或6xSSPE）、5xDenhardt的试剂、0.5%(w/v)SDS、100μg/ml变性且碎片化的鲑鱼精子DNA中进行。加入50%甲酰胺将预杂交及杂交温度降低至42℃。在低盐浓度下进行高严谨性漂洗，例如在室温下在2xSSC-0.1%SDS(w/v)中，并且最终在至少65℃、如68℃下在0.1xSSC-0.1%SDS(w/v)中进行。

在本发明中，At_ALKO4245_cel6A、Ma_ALKO4237_cel6A、Ct_ALKO4265_cel6A和Te_RF8069_cel6A基因使用一种采用严谨杂交条件通过PCR制作的探针进行分离，如实施例1所述。基因组cbh2/cel6A基因通过采用基于公开的核苷酸序列设计的寡核苷酸引物来进行分离，或者采用基于先前已知的CBHII/Cel6A蛋白质的氨基酸序列的比对所设计的降解寡核苷酸引物来进行分离。

根据本发明的一个优选实施例，真菌CBHII/Cel6A纤维二糖水解酶由独立的核酸分子编码，所述独立的核酸分子含有编码SEQ ID NO:12的At_ALKO4245_Cel6A酶的全长形式的SEQ ID NO:11的核苷酸序列。本发明的另一优选实施例包括一种由独立的核酸分子编码的真菌CBHII/Cel6A纤维二糖水解酶，该独立的核酸分子含有SEQ ID NO:13的核苷酸序列，其编码具有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的Ma_ALKO4237_Cel6A酶的全长形式。本发明的又一优选实施例包括一种由独立的核酸分子编码的真菌CBHII/Cel6A纤维二糖水解酶，该独立的核酸分子含有SEQ ID NO:9的核苷酸序列，其编码具有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的Ct_ALKO4265_Cel6A酶的全长形式。本发明的又一优选实施例包括一种由独立的核酸分子编码的真菌CBHII/Cel6A纤维二糖水解酶，该独立的核酸分子含有SEQ ID NO:10的核苷酸序列，其编码具有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的Te_RF8069_Cel6A酶的全长形式。

根据本发明的一个优选实施例，真菌CBHII/Cel6A纤维二糖水解酶由保存于登记号为DSM 22946的大肠杆菌RF8175中的质粒pALK2582、保存于登记号为DSM 22945的大肠杆菌RF8174中的质粒pALK2581、保存于登记号为DSM 22947的大肠杆菌RF8214中的质粒pALK2904或保存于登记号为DSM 23185的大肠杆菌RF8333中的质粒pALK3006编码。

在本发明的一个优选实施例中，CBHII/Cel6A纤维二糖水解酶从含有核酸分子的重组表达载体中制备，所述核酸分子以上述表征的方式编码真菌CBHII/Cel6A纤维二糖水解酶，可操作地连接到能在合适的宿主中直接表达编码所述CBHII/Cel6A纤维二糖水解酶的基因的调控序列。所述重组表达载体的构建以及所述载体的应用详见实施例2。

用于制备真菌CBHII/Cel6A纤维二糖水解酶的合适宿主是同源或异源宿主，例如包括细菌、酵母菌和真菌的微生物宿主。丝状真菌如木霉属、曲霉属、镰刀霉属、腐质霉属、金孢霉属、脉孢菌属、酒曲菌属、青霉属或被孢酶属是优选的生产宿主，这是因为其易于下游加工和酶产物的收集。合适的宿主包括诸如里氏木霉、黑曲霉、米曲霉、酱油曲霉、泡盛曲霉或日本曲霉型株，镰刀霉菌或尖孢镰刀菌，特异腐质霉或柔毛腐质霉，链孢霉和C.luchiowense，其中的一些作为酶生产宿主生物机体列入在例如商品酶AMFEP（2007）中（http://www.amfep.org/list.html）。更为优选的是，该酶在木霉属或曲霉属的丝状真菌宿主内制备，如里氏木酶、黑曲霉、米曲霉或泡盛曲霉。根据本发明的最优选的实施例，真菌CBHII/Cel6A纤维二糖水解酶在里氏木霉中制备。

根据本发明的优选实施例，所述CBHII/Cel6A多肽是源自嗜热枝顶孢霉CBS 116240并具有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的At_ALKO4245_Cel6A。

本发明还涉及一种独立的核酸分子，其含有编码真菌CBHII/Cel6A纤维二糖水解酶的多聚核苷酸序列，其选自：

(a)一种编码多肽的核酸分子或多聚核苷酸序列，所述多肽具有纤维二糖水解酶活性，并含有如SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16所列的全长氨基酸序列，或者具有类似特性的其片段或变异体。

(b)一种编码多肽的核酸分子或多聚核苷酸序列，所述多肽具有纤维二糖水解酶活性，并且与SEQ ID NO:12的全长氨基酸序列具有至少76%的一致性，与SEQ ID NO:14的全长氨基酸序列具有至少76%的一致性，与SEQ ID NO:15的全长氨基酸序列具有至少95%的一致性，或者与SEQ ID NO:16的全长氨基酸序列具有至少91%的一致性，或者是具有类似特性的其片段或变异体。

(c)一种核酸分子，其含有如SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10所列的多聚核苷酸序列的编码序列；

(d)一种核酸分子，其含有DSM 22946、DSM 22945、DSM 22947或DSM 23185所包含的多聚核苷酸序列的编码序列；

(e)一种核酸分子，其编码序列由于遗传密码的降解而与(c)～(d)中任意一种核酸分子的编码序列不同；以及

(f)一种在严谨条件下杂交到DSM 22946、DSM 22945、DSM 22947或DSM 23185或其序列所包含的核酸分子上的核酸分子，所述核酸分子编码多肽，所述多肽具有纤维二糖水解酶活性，并且具有与SEQ ID NO:12的全长氨基酸序列具有至少76%的一致性，与SEQ ID NO:14的全长氨基酸序列具有至少76%的一致性，与SEQ ID NO:15的全长氨基酸序列具有至少95%的一致性，或者与SEQ ID NO:16的全长氨基酸序列具有至少91%的一致性的氨基酸序列，或者是具有类似特性的其片段或变异体。

本发明的核酸分子可能是RNA或DNA，其中DNA可构成基因组DNA或cDNA。

可采用标准分子生物学方法来对编码本发明的真菌CBHII/Cel6A纤维二糖水解酶的多聚核苷酸序列进行分离和酶处理，包括分离基因组编和质粒DNA、消化DNA以制备DNA片段、测序、大肠杆菌的转换等。基本方法见标准分子生物学手册，如Sambrook和Russell，2001。

编码At_ALKO4245_Cel6A、Ma_ALKO4237_Cel6A、Ct_ALKO4265_Cel6A和Te_RF8069_Cel6A多肽的At_ALKO4245_cel6A、Ma_ALKO4237_cel6A、Ct_ALKO4265_cel6A和Te_RF8069_cel6A基因的分离如实施例1所述。简单来说，采用通过用简并寡核苷酸引物（SEQ ID NO:l和SEQ ID NO:2）获得的1032bp PCR片段（SEQ ID NO:7）和831bp PCR片段（SEQ ID NO:8）来在4Blunt-载体内从嗜热枝顶孢霉ALKO4245中分离At_ALKO4245_cel6A基因，并从黑果白丝菌ALKO4237中分离Ma_ALKO4237_cel6A基因。全长嗜热枝顶孢霉cel6A基因包含于存放在保藏于DSMZ菌种保藏中心登记号为DSM 22946的大肠杆菌中的质粒pALK2582内。全长黑果白丝菌cel6A基因包含于存放在保藏于DSMZ菌种保藏中心登记号为DSM 22945的大肠杆菌中的质粒pALK2581内。

如实施例1所述，使用SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4引物对来分离Ct_ALKO4265_cel6A，使用SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6引物对来分离Te_RF8069_cel6A。包含来自嗜热毛壳菌ALKO4265和埃默森篮状菌RF8069的全长cel6A基因的PCR片段分别包含于存放在DSMZ菌种保藏中心登记号为DSM 22947和DSM 23185的大肠杆菌中的质粒pALK2904和pALK3006中。

如实施例1所述，从DNA序列中分析CBHII/Cel6A纤维二糖水解酶的推导氨基酸序列。

编码自嗜热枝顶孢霉CBHII/Cel6A纤维二糖水解酶(SEQ ID NO:12)的At_ALKO4245_cel6A(SEQ ID NO:11)基因的长度是1830bp（包括终止子）。已经发现，四个假定的内含子具有79、72、117和126bp的长度。因此，At_ALKO4245_cel6A的编码区是1434bp（不包括终止子），而所推导的蛋白质序列由包括18种氨基酸的预测信号序列在内的478种氨基酸构成（SignalP V3.0；Nielsen等人，1997；Nielsen和Krogh，1998和Bendtsen等人，2004）。当采用NCBI的BLAST程序（版本2.2.9）进行分析时，所推导的氨基酸序列与已公布的CBHII/Cel6A序列同源（Altschul等人，1990）。所预测的不包括信号序列在内的成熟酶的分子质量是48918Da，而预测的pI是4.82。这些预测使用ExPASy服务器处的计算pI/MW工具进行（Gasteiger等人，2003）。全长At_ALKO4245_Cel6A序列与同源序列的相应区域的一致性值是采用包括功能“比较两个序列/全球/比较作为氨基酸的序列/BLOSUM62打分矩阵”的Clone Manager程序（版本9）来得到。在表6中显示了与本发明中其他CBHII/Cel6A纤维二糖水解酶的一致性的该值(%)。在表7和表8中显示了与已公布CBHII/Cel6A氨基酸序列的一致性。

本发明的At_ALKO4245_Cel6A表现出与太瑞斯梭壳孢霉NRRL 8126（美国Novozymes公司的专利US 7,220,565中的SEQ ID NO:2以及丹麦Novozymes公司的WO2009085868中的SEQ ID NO:49）的全长多肽、柄孢霉DSM 980（EMBL登记号XP_001903170）的未命名蛋白质产品以及粗糙链孢菌OR74A（XM_955677）的推导内切葡聚糖酶2前体具有最高同源性。与太瑞斯梭壳孢霉在全长多肽内的一致性是75%。与柄孢霉和粗糙链孢菌的一致性为69%。

编码自黑果白丝菌CBHII/Cel6A纤维二糖水解酶(SEQ ID NO:14)的Ma_ALKO4237_cel6A(SEQ ID NO:13)基因的长度是1607bp（包括终止子）。已经发现，两个假定的内含子具有93和95bp的长度。因此，Ma_ALKO4237_cel6A的编码区是1416bp（不包括终止子），而所推导的蛋白质序列由包括17种氨基酸的预测信号序列在内的472种氨基酸构成（SignalP V3.0；Nielsen等人，1997；Nielsen和Krogh，1998和Bendtsen等人，2004）。所预测的不包括信号序列在内的成熟酶的分子质量是48627Da，而预测的pI是4.50。这些预测使用ExPASy服务器处的计算pI/MW工具进行（Gasteiger等人，2003）。本发明的Ma_ALKO4237_Cel6A显示出与如WO2008095033（美国Syngenta公司）的氨基酸序列SEQ ID NO:413所公开的未表征生物机体的全长多肽具有高度同源性(72%)，与太瑞斯梭壳孢霉NRRL 8126（WO2009085868中的SEQ ID NO:49，丹麦Novozymes公司）CBHII多肽具有高度同源性(71%)，与球毛壳菌CBS 148.151（EMBL登记号XP001226029）的假定蛋白CHGG_10762具有高度同源性（75%一致性）。

编码嗜热毛壳菌CBHII/Cel6A纤维二糖水解酶(SEQ ID NO:15)的Ct_ALKO4265_cel6A(SEQ ID NO:9)基因的长度是1757bp（包括终止子）。已经发现，三个假定的内含子具有77、196和56bp的长度。因此，Ct_ALKO4265_cel6A的编码区是1425bp（不包括终止子），而所推导的蛋白质序列由包括17种氨基酸的预测信号序列在内的475种氨基酸构成（SignalP V3.0；Nielsen等人，1997；Nielsen和Krogh，1998和Bendtsen等人，2004）。所预测的不包括信号序列在内的成熟酶的分子质量是49408Da，而预测的pI是5.31。本发明的Ct_ALKO4265_cel6A显示出与嗜热毛壳菌CT2（EMBL登记号AY861348；CN1757709，山东农业大学，中国）的家族6的推导纤维二糖水解酶、与具有纤维二糖水解酶II活性的嗜热毛壳菌CGMCC0859（EP1578964B1中的SEQID NO:2，丹麦Novozymes公司）的多肽，以及与美国Novozymes公司的WO2009059234中的SEQ ID NO:36（序列表中的氨基酸序列）或SEQ ID NO:46（说明书中的氨基酸序列）或SEQ ID NO:45（说明书中的核苷酸序列）的嗜热毛壳菌CBHII具有高度同源性。在全长氨基酸序列内的一致性是94%。

编码自埃默森篮状菌CBHII/Cel6A纤维二糖水解酶(SEQ ID NO:16)的Te_RF8069_cel6A(SEQ ID NO:10)基因的长度是1754bp（包括终止子）。已经发现，七个假定的内含子具有50、44、52、56、53、59和60bp的长度。因此，Te_RF8069_cel6A的编码区是1377bp（不包括终止子），而所推导的蛋白质序列由包括19种氨基酸的预测信号序列在内的459种氨基酸构成（SignalP V3.0；Nielsen等人，1997；Nielsen和Krogh，1998和Bendtsen等人，2004）。所预测的不包括信号序列在内的成熟酶的分子质量是46618Da，而预测的pI是4.27。本发明的Te_RF8069_cel6A显示出与埃默森篮状菌的多肽（专利WO2006074005的图3A-C中的Q8N1B5，美国Novozymes公司）以及与埃默森篮状菌（AY075018）的纤维二糖水解酶II具有高度同源性。在全长氨基酸序列内的一致性是90%。

因此，在本发明的范围内包括一种独立的多聚核苷酸序列或独立的核酸分子，其编码CBHII/Cel6A纤维二糖水解酶或多肽，其含有由SEQ ID NO:12表征的At_ALKO4245_Cel6A酶、由SEQ ID NO:14表征的Ma_ALKO4237_Cel6A酶、由SEQID NO:15表征的Ct_ALKO4265_Cel6A或由SEQ ID NO:16表征的Te_RF8069_Cel6A的全长形式的氨基酸序列。

此外，在本发明的范围内还包括编码CBHII/Cel6A多肽的核酸分子或多聚核苷酸序列，该多肽具有纤维二糖水解酶活性，以及与SEQ ID NO:12的全长氨基酸序列具有至少76%，优选至少78%、80%、82%、84%、86%、88%、90%、92%、94%、96%或97%，更优选至少98%，最优选99%的一致性。两种酶的一致性在相应的序列域内、即在CBHII/Cel6A多肽的全长区域内进行比较。

在本发明另一个优选实施例中，真菌CBHII/Cel6A纤维二糖水解酶显示出与SEQ IDNO:14的全长氨基酸序列具有至少76%，优选至少78%、80%、82%、84%、86%、88%、90%、92%、94%、96%或97%，更优选至少98%，最优选99%的一致性。

进一步来说，优选的CBHII/Cel6A纤维二糖水解酶显示出与SEQ ID NO:15的全长氨基酸序列具有至少95%、优选至少96%或至少97%，更优选至少98%的一致性，最优选是至少99%的一致性。

另一个优选的CBHII/Cel6a多肽显示出与SEQ ID NO:16的全长氨基酸序列具有至少91%、优选至少92%、93%、94%、95%、96%或97%，更优选至少98%，最优选99%的一致性。

在本发明的范围内，包括一种独立的核酸分子，其含有编码多肽的多核苷酸序列，该多肽具有本发明的全长CBHII/Cel6A纤维二糖水解酶的氨基酸序列，以及具有纤维二糖水解酶活性和与全长多肽类似特性的本发明的片段或天然的或合成的变异体。这种片段例如可以是一种缺乏分泌信号序列或碳水化合物结合域或CBD的酶。

在本发明的一个优选的实施例中，包括一种独立的核酸分子，其含有SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10中所包含的多聚核苷酸序列的“编码序列”或其子序列。根据本发明的一个优选的实施例，所述多肽由具有包含用于At_ALKO4245_Cel6A酶的编码序列的核苷酸序列SEQ ID NO:11的核酸分子编码。表述“编码序列”指从翻译起始子(ATG)开始和在翻译终止子（TAA,TAG或TGA）处终止且还可能含有内含子域的核苷酸序列。翻译的全长多肽通常从蛋氨酸开始。

根据本发明的另一个优选的实施例，独立的核酸分子含有存放于登记号为DSM22946的大肠杆菌RF8175中的质子pALK2582、存放于登记号为DSM 22945的大肠杆菌RF8174中的质子pALK2581、存放于登记号为DSM 22947的大肠杆菌RF8214中的质子pALK2904或者存放于登记号为DSM 23185的大肠杆菌RF8333中的质子pALK3006中的多聚核苷酸序列的编码序列，所述多聚核苷酸序列分别编码所述At_ALKO4245_Cel6A、Ma_ALKO4237_Cel6A、Ct_ALKO4265_Cel6A和Te_RF8069_Cel6A纤维二糖水解酶。

本发明的核酸分子也可以是如上表征的核苷酸序列的类似物。“简并”是指如下的核苷酸序列的类似物，其在一个或多个核苷酸或密码子内不同，但编码本发明的重组CBHII/Cel6A。

核酸分子也可以是在严谨条件下杂交到存放于登记号分别为DSM 22946、DSM22945、DSM 22947或DSM 23185的大肠杆菌内的质粒pALK2582、pALK2581、pALK2904或pALK3006所包含的多核苷酸序列或其子序列上并编码多肽的核酸分子或多聚核苷酸序列，该多肽具有纤维二糖水解酶活性，以及在相应的序列区域内显示出与SEQ ID NO:12所列全长氨基酸序列具有至少76%的一致性、与SEQ ID NO:14的全长氨基酸序列具有至少76%的一致性、与SEQ ID NO:15的全长氨基酸序列具有至少95%的一致性以及与SEQ ID NO:16的全长氨基酸序列具有至少91%的一致性的氨基酸序列。杂交DNA可以源自属于枝顶孢霉属、黑果属、毛壳菌属或篮状菌属的真菌，或者来源于另外的真菌种属。

根据本发明的一个优选的实施例，真菌CBHII/Cel6A纤维二糖水解酶由独立的核酸分子编码，其含有编码SEQ ID NO:12的全长形式的At_ALKO4245_Cel6A酶的SEQ IDNO:11的核苷酸序列。

本发明还涉及一种重组表达载体或重组表达构建体，其可以用来在一种合适的原核或真核宿主中繁殖或表达编码所选CBHII/Cel6A纤维二糖水解酶的核酸分子或多聚核苷酸序列。重组表达载体含有DNA或核酸序列，其使CBHII/Cel6A多肽的编码序列或基因在合适的宿主中的表达和分泌可以方便或直接进行，如启动子、增强子、终止子（包括转录和翻译终止信号）以及操作性连接到编码所述多肽的多聚核苷酸序列的信号序列。所述表达载体可以进一步含有用于选择转化菌株的标记基因，或者通过共转化将选择性标记导入到另一个载体构建体内的宿主中。所述调控序列可与生产型生物机体同源或异源，或者它们可来自其中编码CBHII/Cel6A多肽的基因被分离的生物机体中。

用于在丝状真菌宿主中表达本发明的CBHII/Cel6A的启动子例子有米曲霉TAKA淀粉酶、碱性蛋白酶ALP和磷酸丙糖异构酶、米黑根毛霉脂肪酶、黑曲霉或泡盛曲霉糖化酶(glaA)、尖孢镰刀菌胰蛋白酶样蛋白酶、Chrysosporium lucknowense纤维二糖水解酶1启动子、里氏木霉纤维二糖水解酶I(Cel7A)等。

在酵母中，例如酿酒酵母烯醇酶(ENO-1)、半乳糖激酶(GAL1)、醇脱氢酶(ADH2)和3-磷酸甘油酸激酶的启动子可用于提供表达。

用于在细菌宿主中直接转录本发明的CBHII/Cel6A多肽的启动子序列的例子有大肠杆菌的乳糖操纵子的启动子、天蓝链霉菌琼脂酶dagA的启动子、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)的启动子、嗜热脂肪淀粉酶基因(amyM)的启动子、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因的启动子，等等。

适用的终止剂包括上文中提到的基因或任何以其它方式表征的终止剂序列。

适用的转换或选择标记包括可以补足宿主中的缺陷或在宿主中添加新的功能如酶活性的那些，例如来自枯草杆菌或地衣芽孢杆菌或曲霉amdS和niaD的dal基因。选择还可以基于赋予抗生素抗性如氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素、四环素、脉霉素或潮霉素抗性的标记。

本发明CBHII/Cel6A优选进行胞外生产。因此，重组载体含有促进在所选宿主中的分泌的序列。在重组表达载体中可包含本发明的CBHII/Cel6A纤维二糖水解酶的信号序列或前序列或前导肽，或者，自然信号序列可由另一种能够促进在所选宿主中的表达的信号序列替换。因此，所选择的信号序列可以与表达宿主同源或异源。

适用的信号序列的例子是那些真菌或酵母生物机体，例如来自完美表达基因的信号序列。这种信号序列是在文献中公知的。

重组载体还可包括促进载体整合到宿主染色体DNA中以获得稳定表达的序列。所述载体也可以是融合构建体，并含有编码载体多肽的序列，其使用与目标蛋白质的编码序列相同的编码序列进行基因融合，提高了多肽在异源宿主有物机体内的分泌，或促进了制备后的蛋白质纯化。这样的载体例如包括通过天然宿主大量生产的蛋白质，如里氏木霉中的纤维素酶或曲霉中的葡糖淀粉酶。所述载体多肽也可以是分泌型蛋白质的完整区域，如CBD。载体蛋白和目标蛋白可在分泌后以融合的方式保留，或者在宿主中的蛋白导出过程中通过蛋白水解处理被分离，或者在分泌到上清液后采用化学或生物化学法进行分离。

本发明的At_ALKO4245_Cel6A、Ma_ALKO4237_Cel6A、Ct_ALKO4265_Cel6A和Te_RF8069_Cel6A纤维二糖水解酶采用其自身源自里氏木霉cbh1(cel7A)启动子的信号序列表达，如实施例2所述。用于转化里氏木霉宿主的表达构建体还包括cbh1终止子和amdS标记，以用来从未转化的细胞中选择转化子。

本发明还涉及含有如上所述的重组表达载体的宿主细胞。适合用于生产真菌CBHII/Cel6A纤维二糖水解酶的宿主是同源或异源宿主，例如包括细菌、酵母菌和真菌的微生物宿主。还可以是植物或哺乳动物细胞中的生产系统。

丝状真菌如木霉属、曲霉属、镰刀霉属、腐质霉属、金孢霉属、脉孢菌属、酒曲菌属、青霉属或被孢酶属是优选的生产宿主，这是因为其易于下游加工和酶产物的收集。合适的表达和生产宿主系统，例如为丝状真菌宿主里氏木酶所开发的生产系统（EP244234），或者曲霉生产系统，如米曲霉或黑曲霉（WO 9708325、US 5,843,745、US5,770,418）、泡盛曲霉、酱油曲霉和日本曲霉型株，或者为镰刀酶所开发的生产系统，如尖镰孢菌（Malardier等人，1989）或镰孢霉，以及为粗糙链孢菌、米黑根毛霉、白被孢霉菌、H.lanuginosa或特异腐质霉或为Chrysosporium lucknowense所开发的生产系统（US 6,573,086）。所开发的适用于酵母菌的生产系统是为酵母属、裂殖酵母属或毕赤酵母开发的系统。所开发的适用于细菌的生产系统是为芽孢杆菌（如枯草芽孢杆菌、益生芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌）、为大肠杆菌或为放线菌链霉菌开发的生产系统。本发明的CBHII/Cel6A纤维二糖水解酶优选在丝状真菌宿主木霉菌或曲霉菌，如里氏木霉、黑曲霉、米曲霉、酱油曲霉、泡盛曲霉或日本曲霉型株中制备。根据本发明的一个优选实施例，真菌CBHII/Cel6A纤维二糖水解酶在里氏木霉中制备。

生产宿主细胞可以与本发明的CBHII/Cel6A纤维二糖水解酶同源或异源。重组宿主优选被修饰为以其主要活性或其主要活性之一的方式来表达和分泌纤维素分解酶。这可以通过删除主要同源分泌型基因、如木霉的四个主要纤维素酶，以及通过将异源基因定位到已被修饰为确保高表达和生产水平的位置进行。例如，由于可以通过灭活或去除一个或多个宿主纤维二糖水解酶来去除所述纤维二糖水解酶，例如通过删除编码这种同质或同源纤维二糖水解酶的基因，因此所述宿主可以不要求同质纤维二糖水解酶。

本发明还涉及一种用于制备具有纤维二糖水解酶活性的CBHII/Cel6A多肽的方法，所述方法包括培养用于在适当的条件下携带本发明的CBHII/Cel6A纤维二糖水解酶的重组表达载体的天然或重组宿主细胞，以及可选地分离所述酶的步骤。生产培养基可以是适合于孵育宿主生物机体并含有用于高效表达的诱导剂的培养基。合适的培养基是文献中公知的。

本发明涉及一种具有纤维二糖水解活性的多肽，所述多肽由本发明的核酸分子编码，并采用上述方法获得。

本发明还涉及一种获取含有具有纤维二糖水解酶活性的CBHII/Cel6A多肽的酶制剂的方法，所述方法包括培养携带本发明的表达载体的宿主细胞以及制备全培养肉汤，或从用过的培养基分离细胞以及获得具有纤维二糖水解酶活性的上清液的步骤。

本发明还涉及一种酶制剂，其含有上述特征的CBHII/Cel6A酶。酶制剂或组合物具有纤维二糖水解酶活性，并可以根据本发明所述的方法获得。

在本发明中还包括一种酶制剂，其包括本发明的真菌CBHII/Cel6A纤维二糖水解酶。

所述酶制剂还可包括除本发明中的CBHII/Cel6A纤维二糖水解酶之外的不同类型的酶，例如，另外的纤维素酶，包括纤维二糖水解酶、内切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶、β-葡聚糖酶、淀粉酶、脂肪酶、角质酶、蛋白酶、木聚糖酶、β-木糖苷酶、甘露聚糖酶、β-甘露糖苷酶、α-葡萄糖苷酸酶、乙酰基木聚糖酯酶、α-阿拉伯呋喃糖苷酶、α-半乳糖苷酶、果胶酶，内切α-L-阿拉伯糖酶和外切α-L-阿拉伯糖酶、α-半乳糖苷酶、内切半乳糖醛酸酶和外切半乳糖醛酸酶、内切果胶裂解酶、果胶酸盐裂解酶和果胶（甲）酯酶、苯酚酯酶、包括过木质素过氧化物酶的木质酶、锰过氧化物酶、H₂O₂-生成酶，和/或氧化酶，如漆酶或有介体或无介体的过氧化物酶。这些酶期望用于通过除去存在于处理材料中的碳水化合物、蛋白质和油或脂肪的处理来提高本发明的CBHII/Cel6A酶的性能。所述酶可以是天然的，或是由宿主株生产的重组酶，或者在可生产工艺之后加入到培养上清液中。所述酶或酶制剂可以含有这些酶的任意组合物。所述CBHII/Cel6A纤维二糖水解酶可以与市售酶制剂组合使用。

根据本发明，水解纤维素材料所需的酶可以酶有效量同时地（例如以酶混合物的形式）或按顺序地、或作为同步糖化和发酵(SSF)法的一部分而加入，或者这些酶可在综合生物过程中通过发酵微生物产生。

所述酶制剂或组合物可以包含至少部分的纯化和分离形式的酶。它甚至基本上可以由所需的酶或多种酶组成。或者，所述制剂可以是包含一种或多种所需酶的全培养肉汤或用过的培养基或滤液。在综合生物过程中，所述酶可以由该过程所使用的发酵微生物产生。除了酶活性外，所述制剂可以包含添加剂，诸如调控剂、稳定剂、缓冲液、防腐剂、表面活性剂和/或培养基组分。

添加剂优选为在针对特定应用的酶制剂中所常用的那些。表面活性剂可用于乳化油脂和润湿表面。表面活性剂可以是非离子的，包括半极性和/或阴离子和/或阳离子和/或两性离子。可在酶制剂中加入缓冲液以改变pH值或影响其它组分的性能或稳定性。适用的稳定剂包括多元醇（如丙二醇或丙三醇），糖或糖醇、乳酸、硼酸或硼酸衍生物、肽等。漂白剂用于氧化和降解有机物。适用的化学漂白系统的例子有H₂O₂源，如过硼酸或过碳酸盐，其含有或不含有高酸漂白活化剂，如四乙酰乙二胺，或者过氧酸，如酰胺、酰亚胺或砜类。化学氧化剂可通过用氧化酶如漆酶或过氧化物酶来部分地或完全地取代。许多漆酶在缺乏调控剂条件下不起作用。促净剂或络合剂包括诸如沸石、二磷酸盐、三磷酸盐、碳酸盐、柠檬酸等的物质。酶制剂还可包括一种或多种聚合物，如羧甲基纤维素、聚(乙二醇)、聚(乙烯醇)、聚(乙烯吡咯烷酮)等。也可以添加柔软剂、碱性物质、用于预防其他组分腐败的防腐剂、磨料以及改善发泡和粘度特性的物质。

根据本发明的一个优选实施例，所述酶制剂以用过的培养基、液体、粉末或颗粒的形式存在。优选地，所述酶制剂是用过的培养基。

本发明还涉及本发明的真菌CBHII/Cel6A纤维二糖水解酶在需要水解或改性纤维素材料中的各种用途。这些用途包括以常规方式使用纤维素酶的任何实际应用，比如在燃料、纺织、洗涤剂、纸浆和纸、食品、饲料或饮料工业中。将本发明的真菌CBHII/Cel6A纤维二糖水解酶加入到含有其他纤维素降解酶（如纤维二糖水解酶I、内切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶）的酶制剂中能极大地促进水解，并导致高分子纤维素主链几乎完全水解成葡萄糖单体。具有CBHII/Cel6A作用的主产物是由两个葡萄糖单元构成的纤维二糖。

一个优选的实施例是本发明的方法在要求CBHII/Cel6A纤维二糖水解酶在中等/常规或高温下具有稳定性、即要求嗜热或热稳定酶的用途中的应用。众所周知，高温可以促进存在于纤维素或木质纤维材料中的晶状纤维的水解，因而减少水解所需的酶量或缩短所需的水解时间。而且，由于在高温条件下木质纤维素基质的粘度被降低，耐热酶使得能在更大的固体负载下进行操作，节约了投资成本。

另一个优选实施例涉及本发明的CBHII/Cel6A多肽或含有所述多肽的酶制剂在水解纤维素材料以制备包括乙醇、丙醇、丁醇等的生物燃料中的应用。在生物燃料的生产中，本发明的CBHII/Cel6A纤维二糖水解酶就像其他纤维素分解酶那样特别适用于从高分子纤维素材料中生产葡萄糖单体，其之后可被酵母菌株发酵为乙醇并用作燃料。

木质纤维材料可以在酶水解前进行预处理，以破坏纤维素基质的纤维结构，并使纤维素组分更易于被纤维素分解酶分解。现有的预处理方法包括机械、化学或热加工及其组合的方式。所述材料例如可通过蒸汽爆破或酸解进行预处理。糖化加工即生产糖单体以及通过酵母菌株的发酵可在同一反应器中单独地或同时地进行。本发明的CBHII/Cel6A纤维二糖水解酶相比于现售商品酶的一个突出优点是在高温条件下稳定，即耐热。众所周知，纤维素或木质纤维材料的水解在高温条件下增强，可以更有效地产生糖单体。

使用本发明的CBHII/Cel6A多肽导致了高的生物量一致性，可用来产生高浓度的糖和乙醇。这种方法可显著节省能源和投资成本。高温也减少了水解过程中污染的危险。

糖水解产物也可以作为其他非微生物过程如高值糖或各种聚合加工过程的浓缩、分离和纯化的原料。

葡萄糖单体也可用作用于生产各种化学品或用于化工业工艺的基础（如所谓的生物炼制中）的中间体或原料。

在纸浆和造纸工业中，多肽可用于改进纤维素纤维，例如用于处理牛皮纸浆、机械纸浆或再生纸。

在纺织工业中，CBHII/Cel6A纤维二糖水解酶在软化和/或提高棉织物的触感，以及代替石洗来去除靛蓝染料的实际应用中获得了应用。

在饲料工业中，本发明的CBHII/Cel6A纤维二糖水解酶可用于降解存在于供给料中的纤维素或半纤维素材料。

在洗涤剂工业中，CBHII/Cel6A纤维二糖水解酶可用于手工或机械式洗衣或洗碗的用于去除纤维素污渍的组合物中。

本发明通过以下非限制性实施例来进行说明。从实验结果中可以看出，本发明的真菌CBHII/Cel6A纤维二糖水解酶完全能够满足需要对存在于不同原料中的纤维素材料进行高效水解的不同工业的不同需求。

实施例1.纤维二糖水解酶2(cbh2)基因的克隆

在大肠杆菌转化、测序等过程中，使用标准分子生物学方法对DNA进行分离及酶处理（例如分离质粒DNA、消化DNA以产生DNA片段）。所用的基本方法既可以采用根据酶、试剂或试剂盒制造商所介绍的方法，也可以根据标准分子生物学手册如Sambrook和Russell（2001）所介绍的方法。Raeder和Broda（1985）详细介绍了基因组DNA的分离。

根据以前关于菌株产生热稳定纤维素酶的研究发现（WO2007071818；Maheshwari等人，2000；Murray等人，2003；Miettinen-Oinonen等人，2004）而选择了4种来自Roal Oy保藏中心的嗜热真菌菌株进行克隆。用于克隆来自嗜热枝顶孢霉ALKO4245和黑果白丝菌ALKO4237的cbh2基因的探针通过PCR合成。基于以前公布的纤维二糖水解酶II(CBHII)蛋白的氨基酸序列的比对来设计简并寡核苷酸。用于克隆来自嗜热毛壳菌ALKO4265和埃默森篮状菌RF8069菌株的Cbh2基因的同源引物序列是从已公布的核苷酸序列（AY861348；DQ020255；CQ838150；Murray等人，2003；AY075018；AF439936）中获得的。表2列出了这些引物序列(SEQ ID NO:1~6）。

表2.寡核苷酸用作PCR引物来扩增探针用于筛选来自嗜热枝顶孢霉ALKO4245和黑果白丝菌ALKO4237的cbh2基因，以及扩增来自嗜热毛壳菌ALKO4265和

埃默森篮状菌RF8069的全长cbh2基因。

(a:R=A或G，N=A或G或T或C，Y=T或C；圆括号内的"s"＝正义链，圆括号内的"as"＝反义链。

在该反应中，以基因组DNA为模板，采用表2中所列引物通过PCR对所述探针进行扩增。嗜热枝顶孢霉ALKO4245和黑果白丝菌ALKO4237的PCR混合物包含10mMTris-HCl，pH 8.8，50mM KC1，0.1%Triton X-100，1.5mM MgCl2，0.2mM dNTPs，每种引物5μΜ，以及1-2个单位的Dynazyme EXT DNA聚合酶（芬兰的Finnzymes公司）和0.5-1μg相应的基因组DNA。PCR反应的条件如下：在95℃下进行5min预变性，接着在95℃下进行30个循环，每个循环1min，在60℃下退火1min（降温梯度±5℃）、在72℃下延伸2min，最后在72℃下延伸10min。对于源自嗜热毛壳菌ALKO4265和埃默森篮状菌RF8069株的cbh2基因的PCR克隆，其反应分别包含1x Phusion GC和1xPhusion HF缓冲液，0.2mM dNTPs，每种引物5μΜ，1-2个单位的Phusion DNA聚合酶（芬兰的Finnzymes公司）和0.5-1μg相应的基因组DNA。PCR反应条件如下：在98℃下进行3min预变性，接着在98℃下进行30个循环，每个循环30s，在55℃下退火30s（降温梯度±5℃）、在72℃下延伸1-2min，最后在72℃下延伸10min。

表2中所列引物制品产生具有预期分子量的特异性DNA产物（根据基于已公布的cbh2序列进行的计算）。根据制造商的操作指南（美国Invitrogen公司），从PCR反应混合物中分离及纯化DNA产物，并克隆到4Blunt-载体。插入片段通过测序和进行DNA印迹杂交到利用几种限制性内切酶进行消化的基因组DNA上来进行表征。表3示出了被选定用作从嗜热枝顶孢霉ALKO4245和黑果白丝菌ALKO4237株中克隆的基因的探针的PCR片段。此外，表中列有包含来自嗜热毛壳菌ALKO4265和埃默森篮状菌RF8069株的全长cbh2基因的PCR片段。

表3.PCR反应中所使用的引物，选定用于筛选来自嗜热枝顶孢霉ALKO4245和黑果白丝菌ALKO4237的cbh2基因的探针，以及含有来自嗜热毛壳菌ALKO4265和埃默森篮状菌RF8069的全

长cbh2基因的DNA片段。显示了基因组模板DNA和包含探针片段的质粒名称。

从所有这些PCR片段推导的氨基酸序列与已公布的CBHII/Cel6A序列（BLAST程序，版本2.2.9，美国国家生物技术信息中心；Altschul等人，1990）具有同源性。pALK2904质粒(SEQ ID NO:9)中的1757bp PCR片段和pALK3006质粒(SEQ ID NO:10)中的1788bp PCR片段分别包含来自嗜热毛壳菌ALKO4265和埃默森篮状菌RF8069的全长cbh2/cel6A基因。编码嗜热毛壳菌ALKO4265的基因被命名为Ct_ALKO4265_cel6A，而编码埃默森篮状菌RF8069的基因被命名为Te_RF8069_cel6A。大肠杆菌菌株RF8214(=pALK2904)和RF8333(=pALK3006)保存于DSM菌种库，其登记号分别DSM 22947和DSM 23185。

嗜热枝顶孢霉ALKO4245和黑果白丝菌ALKO4237基因组DNA采用几种限制性内切酶消化来进行南方印迹分析。用于杂交的探针是1032bp(SEQ ID NO：7)和831bp(SEQ ID NO:8)的EcoRI片段，分别切自质粒pALK2580和pALK2576。上述探针根据供应商的操作指南（德国Roche公司）通过使用异羟基洋地黄毒甙元进行标记。在68℃下进行整夜杂交。在杂交后，过滤器在室温下使用2xSSC-0.1%SDS漂洗2x5min，再在68℃下使用0.1xSSC-0.1%SDS漂洗2x15min。

从来自嗜热枝顶孢霉ALKO4245的基因组DNA中，大约8kb的XbaI-消化的片段采用来自pALK2580的异羟基洋地黄毒甙元标记的1032bp EcoRI片段作为探针进行杂交。类似地，大约4.5kb的BamHI-消化的片段采用来自黑果白丝菌ALKO4237基因组的pALK2576的异羟基洋地黄毒甙元标记的831bp EcoRI片段作为探针进行杂交。杂交基因组DNA片段基于其分子量从消化的基因组片段池中分离。从琼脂糖凝胶中分离出基因组片段，将其克隆到pBluescript II KS+（美国Stratagene公司）载体，该载体用XbaI（嗜热枝顶孢霉ALKO4245）或BamHI（黑果白丝菌ALKO4237）切割。接合混合物被转化为大肠杆菌XL10-Gold细胞（Stratagene公司），并涂覆到包含50-100μg/ml氨苄西林的LB(Luria-Bertani)平板上。在与上述南方DNA印迹分析相对应的杂交条件下（但用65℃的杂交温度替换68℃），以pALK2580和pALK2576插入片段为探针采用克隆杂交法来筛选大肠杆菌克隆以用于阳性克隆。从平板上收集几个阳性克隆。可以看出，它们通过限制性消化而包含了预期分子量的插入子。编码嗜热枝顶孢霉ALKO4245CBHII/Cel6A(At_ALKO4245_Cel6A,SEQ ID NO:11)的全长基因从7kb XbaI插入子测序，而包含这种插入子的质粒命名为pALK2582。包含质粒pALK2582的大肠杆菌菌株RF8175被保存于DSM菌种库，登记号为DSM 22946。编码嗜热枝顶孢霉ALKO4245蛋白的基因命名为At_ALKO4245_cel6A。类似地，编码黑果白丝菌ALKO4237CBHII/Cel6A(Ma_ALKO4237_Cel6A,SEQ ID NO:12)的全长基因从5kbBamHI插入子中测序，包含这种插入子的质粒命名为pALK2581。包含质粒pALK2581的大肠杆菌菌株RF8174保存于DSM菌种库，登记号为DSM 22945。编码黑果白丝菌ALKO4237的基因命名为Ma_ALKO4237_cel6A。关于基因和推导蛋白质序列(SEQ ID NO:9~16)的信息的概要分别在表4和表5中列出。

表4.从嗜热枝顶孢霉ALKO4245、黑果白丝菌ALKO4237、嗜热毛壳菌ALKO4265和埃默森篮状菌RF8069中分离出的cbh2/cel6A基因的概要

(a包括终止密码子。

(b不包括终止密码子。

表5.从来自嗜热枝顶孢霉ALKO4245、黑果白丝菌ALKO4237、嗜热毛壳菌ALKO4265和埃默森篮状菌RF8069的cbh2/cel6A基因序列中推导出的氨基酸序列的概要

(a使用程序SignalP V3.0（Nielsen等人，1997；Nielsen和Krogh，1998；Bendtsen等人，2004）对信号序列进行预测；使用神经网络获得NN值。

(b纤维素酶结合域(CBD)，标明CBD区域的氨基酸[编号中包括M1(Met#1)]。

(c未包括预测的信号序列。在ExPASy服务器处使用计算pI/MW工具来预测（Gasteiger等人，2003）。

表6显示了从嗜热枝顶孢霉ALKO4245、黑果白丝菌ALKO4237、嗜热毛壳菌ALKO4265和埃默森篮状菌DSM 2432(RF8069)中推导出的CB HII/Cel6A序列的相互比较。采用包括功能“比较两个序列/全球/比较作为氨基酸的序列/BLOSUM62打分矩阵”的Clone Manager程序（版本9）来确定一致性程度。

表6.从嗜热枝顶孢霉ALKO4245、黑果白丝菌ALKO4237、嗜热毛壳菌ALKO4265和埃默森篮状菌RF8069中推导出的CBHII/Cel6A氨基酸序列的比对中获得的一致性值(％)。对包括信号序列的全长氨基酸序列进行比对。采用包括功能“比较两个序列/全球/比较作为氨基酸的序列/BLOSUM62打分矩阵”的Clone Manager 9程序来确定一致性程度。

将从嗜热枝顶孢霉ALKO4245、黑果白丝菌ALKO4237、嗜热毛壳菌ALKO4265和埃默森篮状菌RF8069中推导出的CBHII/Cel6A序列与从资料库中找到的序列进行比较，结果见表7和表8。

表7.相对于从嗜热枝顶孢霉ALKO4245、黑果白丝菌ALKO4237、嗜热毛壳菌ALKO4265和埃默森篮状菌RF8069中推导出的CBHII/Cel6A氨基酸序列具有最大一致性的序列。对包括信号序列的全长氨基酸序列进行比对。采用BLAST（tblastn,nr/nt资料库）进行资料库搜索，并采用包括功能“比较两个序列/全球/比较作为氨基酸的序列/BLOSUM62打分矩阵”的Clone Manager 9程序来确定一致性程度。

表8.相对于从嗜热枝顶孢霉ALKO4245、黑果白丝菌ALKO4237、嗜热毛壳菌ALKO4265和埃默森篮状菌RF8069中推导出的CBHII/Cel6A氨基酸序列具有最大一致性的专利序列。对包括信号序列的全长氨基酸序列进行比对。采用BLAST对化学文摘服务社(CAS)登记系统及专利蛋白序列NCBI资料库进行搜索，并采用包括功能“比较两个序列/全球/比较作为氨基酸的序列/BLOSUM62打分矩阵”的Clone Manager 9程序来确定一致性程度。

*)WO200959234的说明书中引用了SEQ ID NO:45(DNA)或SEQ ID NO:6(蛋白质)。WO200959234的序列表引用了SEQ ID NO:35(DNA)或SEQ ID NO:36(蛋白质)。

实施例2.里氏木霉中的重组CBHII/Cel6A蛋白质的生产

构建表达质粒，用于从里氏木霉中的嗜热枝顶孢霉ALKO4245、黑果白丝菌ALKO4237、嗜热毛壳菌ALKO4265和埃默森篮状菌RF8069中制备重组CBHII/Cel6A蛋白质。表9中列出了所构建的表达质粒。重组cbh2/cel6A基因（包括其自身的信号序列）通过PCR恰好融合于里氏木霉cbh1/cel7A启动子。利用里氏木霉cbh1/cel7A终止子确保转录终止，采用构巢曲霉amdS标记基因用于转录选择，如Paloheimo等人（2003）所介绍。在EcoRI或EcoRI-SpeI消化后，从载体主链中分离线性表达框（图1），并转化成里氏木霉原生质体。所使用的宿主菌株不会产生四个主要里氏木霉纤维素酶(CBHI,CBHII,EGI,EGII)中的任何一种。选择乙酰胺作为专有氮源（amdS标记基因），依照Penttila等人（1987年）介绍方法进行转换，依照Karhunen等人（1993年）所述的方法进行改性。在其在PD上出现芽孢之前，在选择平板上通过单孢菌株对转化株进行纯化。

表9.构建表达框来从生产从里氏木霉中的嗜热枝顶孢霉ALKO4245、黑果白丝菌ALKO4237、嗜热毛壳菌ALKO4265和埃默森篮状菌RF8069中制备CBHII/Cel6A重组蛋白。表达框的总体结构如图1所示。所克隆的cbh2/cel6h基因恰好融合到里氏木霉cbh1/cel7A启动子。

纤维二糖水解酶Ⅱ蛋白	表达质粒	表达框(a	终止子(b
				At_ALKO4245_Cel6A	pALK2906	9.4kb EcoRI	125bp(XbaI)
Ma_ALKO4237_Cel6A	pALK2901	9.3kb EcoRI-SpeI	258bp(DraIII)
				Ct_ALKO4265_Ce16A	pALK2903	9.2kb EcoRI
Te_RF8069_Cel6A	pALK3010	7.9kb EcoRI

(a用于里氏木霉转化的表达框通过使用EcoRI或EcoRI-SpeI消化从载体主链中分离。

(b在包含于表达框中的克隆重组基因的终止密码子之后的核苷酸数目。构建表达框所用的位于基因组基因片段的3’端处的限制性位点显示在括号中。通过EcoRI将Ct_ALKO4265_cel6A基因片段从3’端切离（存在于4Blunt-载体的位点）。相应地，通过BamHI将Te_RF8069_cel6A基因片段从3’端切离（在PCR中的终止密码子后出现的位点）。这使得没有原始Ct_ALKO4265_cel6A或Te_RF8069_cel6A终止子遗留于cbh1终止子序列之前的构造体中。

转化子中CBHII/Cel6A产物从摇瓶栽培养过程中的培养上清液进行分析。转化子从PD斜面被接种到含有50毫升的用5%KH₂PO₄缓冲的复合乳糖基纤维素酶诱导培养基（Joutsjoki等人，1993）的摇瓶中。转化子的CBHII/Cel6A蛋白质产物从其在30℃、250rpm下孵育7天后的培养上清液中进行分析。重组蛋白的异源产物通过SDS-PAGE及随后的考马斯染色进行分析。所选转化子的基因型通过利用其中包括几个基因组消化的南部印迹分析来进行鉴定，并且其各自的表达框被用作探针。

产量最高的转化子被选出在实验室规模的生物反应器中进行培养。转化子在实验室生物反应器中于28℃下在纤维素酶诱导复合培养基中控制pH值4.4±0.2(NΗ₃/H₃ΡΟ₄)培养3-4天来获得用于实际应用试验的材料。用离心法收集上清液，并通过Seitz-K150和EK过滤器（德国Bad Kreuznach的Pall SeitzSchenk Filtersystems公司）过滤。

实施例3.通过重组CBHII/Cel6A酶水解晶状纤维素(Avicel)

采用晶状纤维素(Avicel)为底物表征了重组CBHII/Cel6A酶制剂的pH依赖性和热稳定性。源自嗜热枝顶孢霉ALKO4245、黑果白丝菌ALKO4237、嗜热毛壳菌ALKO4265和埃默森篮状菌RF8069的重组CBHII/Cel6A蛋白质的pH依赖性和热稳定性分别在3.0-10.0的pH范围内和40-80℃的温度范围内测定。晶状纤维素（Ph 101,Avicel；瑞士Bucsh的Fluka公司）水解分析在2.0ml的刻度管中于50mM、pH6.0的乙酸钠中进行。为了确定最佳pH值，在50℃下将pH范围为3-10的底物溶液（50mg/ml乙酸钠，pH 6.0，Avicel）与酶制剂一起振荡（100μg蛋白的反应），反应混合物的最终体积为650μl。水解持续进行21小时，并通过添加包含9份体积的94%乙醇和1份体积的1M甘氨酸(pH 11)的326μl终止试剂终止反应。溶液通过Millex GV130.22μm过滤装置（美国马萨诸塞州Billerica的Millipore公司）过滤。上清液中的可溶性还原糖的生成通过对羟基苯甲酸酰阱(PAHBAH)法（Lever，1972）利用纤维二糖标准曲线（200-1200μΜ纤维二糖）来测定。将新配制的0.1M的PAHBAH（美国密苏里州St.Louis的Sigma-Aldrich公司）溶于0.5M NaOH所形成的溶液(200μl)添加到300μl的滤后样品中，煮沸10分钟，之后将该溶液冷却到室温。采用Multiskan EX（美国马萨诸塞州Franklin的ThermoLabsystems公司）测量平行样品在405nm处的吸收率。类似地，重组CBHII/Cel6A蛋白的热稳定性通过在最佳pH值下在40-80℃温度范围内对Avicel底物溶液进行21小时反应来测定。结果表明，对于埃默森篮状菌RF8069的CBHII/Cel6A和黑果白丝菌ALKO4237的CBHII/Cel6A来说，最佳pH值为4.0，而嗜热毛壳菌ALKO4265和嗜热枝顶孢霉ALKO4245酶的最佳pH值为5.0（图2）。实际上，与黑果白丝菌ALKO4237蛋白相比较，嗜热枝顶孢霉ALKO4245、嗜热毛壳菌ALKO4265和埃默森篮状菌RF8069的CBHII/Cel6A的热稳定性较高（图3）。

实施例4.用含有重组CBHII/Cel6A纤维二糖水解酶的酶制剂来水解硬木底物

将蒸汽爆破的硬木悬浮在0.05M的乙酸钠缓冲溶液中，pH值4.8。水解混合物的最终重量是20g，其中总固含量是2%(w/w)。所述底物在50ml摇瓶中以每克总干物质5mg蛋白质的剂量采用不同的酶混合物进行水解。酶组分和混合物中蛋白质的含量采用Pierce BCA检测试剂盒（Thermo Scientific公司，产品编号23227）以牛血清白蛋白（Thermo Scientific公司，产品编号23209）作为标准品进行测定。摇瓶在被调整到不同温度的线性振动水浴中摇振。对每个采样点，从平行试验的摇瓶中取1毫升的样品，并煮沸10分钟来终止酶水解，离心处理，分析上清液的水解反应产物。以与其他样品相同的方式制备只含有底物的空白样（仅加入缓冲溶液代替酶）。

分别用不同的Cel6A/CBHII替换物制备三个单独的混合制品（嗜热混合物2、嗜温混合物ACC和嗜温混合物里氏木霉酶）。

热稳定的纤维素酶的混合物使用下列组分配制：

包含具有里氏木霉CBHI/Cel7A的传代CBD的耐热子囊菌ALKO4242Cel7A的嗜热Cel7A/CBHI制剂（WO2007071818）。

包含嗜热枝顶孢霉ALKO4245Cel45A内切葡聚糖酶的嗜热内切葡聚糖酶制剂（At EG_40/Cel45A，WO2007071818）。

包含耐热子囊菌ALKO4242β-葡萄糖苷酶的嗜热β-葡萄糖苷酶制剂（TaβG_81/Cel3A，WO2007071818）。

包含Nonomurea flexuosa Xyn11A的嗜热木聚糖酶制剂（AM24，WO2005100557，芬兰AB Enzymes Oy公司）。

所有的纤维素酶均在具有无纤维素酶的背景（编码四种主要纤维素酶Cel7A/CBHI、Cel6A/CBHII、Cel7B/EGI和Cel5A/EGII的基因被删除了）的里氏木酶宿主菌株内作为单一组分进行异源制备。粗培养上清液用于该混合物。酶组合物按照以下方式配制（每10毫升混合物）：CBHI/Cel7A制剂330毫克(71.2%)、内切葡聚糖酶制剂105毫克(22.7%)、β-葡萄糖苷酶制剂7.5毫克(1.6%)和木聚糖酶制剂21毫克(4.5%)。用自来水将混合物的体积稀释到10ml。该混合物中的蛋白质终浓度为46.35mg/ml。这种酶混合物被命名为混合物2。

为了用混合物2来试验Cel6A/CBHII的水解性能，混合物2中的15%（49.5毫克）的CBHI/Cel7A组分分别用Ma_ALKO4237_Cel6A（混合物2_MA）、Ct_ALKO4265_Cel6A（混合物2_CT）或At_ALKO4245_Cel6A（混合物2_AT）替换。

最新型的混合物按照以下方式配制（每10毫升混合物）：CE（Roal Oy公司，一种经典里氏木霉的酶制剂）470mg(94%)、β-葡萄糖苷酶制剂（At βG_101/Cel3A，WO2007071818）20mg(4%)，以及木聚糖酶制剂（Ta XYN_30，WO2007071818）10mg(2%)。用自来水将混合物的体积稀释到10ml。该混合物中的蛋白质终浓度为50mg/ml。此酶混合物被命名为混合物里氏木霉酶。At βG_101/Cel3A和Ta XYN_30酶在无纤维素酶背景的里氏木霉宿主菌株内作为单一组分进行异源制备。

为了用混合物里氏木霉酶来试验Cel6A/CBHII的水解性能，将混合物里氏木霉酶中的15%(70.5mg)的CE组分分别用Ma_ALKO4237_Cel6A（混合物TR_MA）、Ct_ALKO4265_Cel6A（混合物TR_CT）或At_ALKO4245_Cel6A（混合物TR_AT）来替换。

从商用1000（Genencor International/Danisco A/S）中制备混合物ACC：1000 400mg蛋白质(100%)。用自来水将混合物的体积稀释到10ml。该混合物中的蛋白质终浓度为40mg/ml。

为了用混合物ACC来试验Cel6A/CBHII的水解性能，混合物ACC中的15%(60mg)的1000组分分别用Ma_ALKO4237_Cel6A（混合物ACC_MA）、Ct_ALKO4265_Cel6A（混合物ACC_CT）或At_ALKO4245_Cel6A（混合物ACC_AT）来替换。

对于混合物2组合，水解在55℃下进行，而混合物里氏木霉酶和混合物ACC水解试验的温度为37℃。水解72小时后取样，采用HPLC定量，并测定葡萄糖和木糖含量。从采用酶的样品中减去底物空白样品的结果，葡萄糖和木糖的总含量如图4A-C所示。

结果清楚地显示，在55℃下，含有耐热Cel6A/CBHII酶的混合物2的性能更好。通过在混合物2中分别补充Ma_ALKO4237_Cel6A、Ct_ALKO4265_Cel6A或At_ALKO4245_Cel6A酶，硬木底物所释放的糖量分别增加了12%、14%和26%。发现嗜热枝顶孢霉ALKO4245酶是这里研究的性能最佳的Cel6A/CBHII（图4A）。不管是添加最新型的木霉混合物（混合物里氏木霉酶）（图4B）还是市售产品（混合物ACC）（图4C），At_ALKO4245_Cel6A在37℃下均表现出增强的水解。

实施例5.使用含有重组CBHII/Cel6A纤维二糖水解酶的酶制剂来水解玉米棒子

将蒸汽爆破的玉米棒子悬浮在0.05M的乙酸钠缓冲溶液中，pH值4.8。水解混合物的最终重量是20g，其中总固含量是2%(w/w)。所述底物在50ml摇瓶中以每克总干物质5mg蛋白质的剂量采用不同的酶混合物进行水解。酶组分和混合物中蛋白质的含量采用Pierce BCA检测试剂盒（Thermo Scientific公司，产品编号23227）以牛血清白蛋白（Thermo Scientific公司，产品编号23209）作为标准品进行测定。摇瓶在调节到55℃的线性振动水浴中摇振。对每个采样点，从平行试验的摇瓶中取1毫升的样品，并煮沸10分钟来终止酶水解，离心处理，分析上清液的水解反应产物。以与其他样品相同的方式制备只含有底物的空白样（仅加入缓冲溶液代替酶）。

使用下列组分配制热稳定的纤维素酶的混合物：

包含具有里氏木霉CBHI/Cel7A的传代CBD的耐热子囊菌ALKO4242Cel7A的嗜热Cel7A/CBHI制剂（WO2007071818）。

包含嗜热枝顶孢霉ALKO4245Cel45A内切葡聚糖酶的嗜热内切葡聚糖酶制剂（At EG_40/Cel45A，WO2007071818）。

包含耐热子囊菌ALKO4242β-葡萄糖苷酶的嗜热β-葡萄糖苷酶制剂（TaβG_81/Cel3A，WO2007071818）。

包含Nonomurea flexuosa Xyn11A的嗜热木聚糖酶制剂（AM24，WO2005100557，芬兰AB Enzymes Oy公司）。

所有的纤维素酶均在具有无纤维素酶的背景（编码四种主要纤维素酶Cel7A/CBHI、Cel6A/CBHII、Cel7B/EGI和Cel5A/EGII的基因被删除了）的里氏木酶宿主菌株内作为单一组分进行异源制备。粗培养上清液用于该混合物。酶组合物按照以下方式配制（每10毫升混合物）：CBHI/Cel7A制剂330毫克(71.2%)、内切葡聚糖酶制剂105毫克(22.7%)、β-葡萄糖苷酶制剂7.5毫克(1.6%)和木聚糖酶制剂21毫克(4.5%)。用自来水将混合物的体积稀释到10ml。该混合物中的蛋白质终浓度为46.35mg/ml。这种酶混合物被命名为混合物2。

为了用混合物2来试验At_ALKO4245_Cel6A的水解性能，将混合物2中的15%（49.5毫克）的CBHI/Cel7A组分分别用At_ALKO4245_Cel6A（混合物2_AT）替换。

水解72小时后取样，采用HPLC定量，并测定葡萄糖和木糖浓度。从采用酶的样品中减去底物空白样的结果，葡萄糖和木糖的总含量如图5所示。

与实施例4类似，结果清楚地显示，对于玉米棒子来说，含有At_ALKO4245_Cel6A酶的混合物2在55℃下具有更好的性能。

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Claims (27)

1.一种采用CBHII/Cel6A多肽或含有所述多肽的酶制剂来处理纤维素材料的方法，其中所述CBHII/Cel6A多肽具有纤维二糖水解酶活性，并且其氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示，所述方法包括以下步骤：

i)制备所述CBHII/Cel6A多肽或者含有所述多肽的酶制剂或者产生所述多肽的发酵微生物；

ii)使纤维素材料与所述CBHII/Cel6A多肽或者含有所述多肽的酶制剂或者产生所述多肽的发酵微生物反应；以及

iii)获得部分或完全水解的纤维素材料。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述CBHII/Cel6A多肽能够在中温到高温下水解纤维素材料。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述纤维素材料用酶组合物来处理，所述酶组合物包括所述CBHII/Cel6A多肽以及至少一种能够水解所述纤维素材料的其它的酶，所述其它的酶选自非CBHII/Cel6A纤维二糖水解酶、内切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶、β-葡聚糖酶、木葡聚糖酶、木聚糖酶、β-木糖苷酶、甘露聚糖酶、β-甘露糖苷酶、α-葡萄糖醛酸酶、乙酰基木聚糖酯酶、α-阿拉伯呋喃糖苷酶、α-半乳糖苷酶、果胶酶、内切半乳糖醛酸酶和外切半乳糖醛酸酶、内切果胶裂解酶、果胶酸盐裂解酶和果胶(甲)酯酶以及木质酶。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述木质酶选自于木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶以及有介体或无介体的漆酶。

5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于：所述酶同时地或者按顺序地加入到纤维素材料中。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述纤维素材料选自植物材料、农业生物质、废弃产品和专用能源作物。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述CBHII/Cel6A多肽适用于制备生物燃料。

8.一种真菌CBHII/Cel6A多肽，其中所述多肽具有纤维二糖水解酶活性，并且其氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示。

9.一种分离纯化的核酸分子，其由编码真菌CBHII/Cel6A多肽的多聚核苷酸序列构成，其选自：

(a)一种核酸分子，其由编码多肽的多聚核苷酸序列构成，所述多肽具有纤维二糖水解酶活性，并且其氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示；

(b)一种核酸分子，其编码序列为如SEQ ID NO:11所示的多聚核苷酸序列；

(c)一种核酸分子，其编码序列为如保藏于德国微生物菌种保藏中心、登记号为DSM 22946的大肠杆菌菌株DSM 22946所包含的多聚核苷酸序列；

(d)一种核酸分子，其编码序列由于遗传密码的简并性而与(b)～(c)中任意一种核酸分子的编码序列不同；以及

(e)一种在严谨条件下杂交到所述DSM 22946所包含的核酸分子上的核酸分子，所述核酸分子编码多肽，所述多肽具有纤维二糖水解酶活性，并且其氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示。

10.一种重组表达载体，含有操作性链接到能够在合适的宿主中直接表达所述CBHII/Cel6A纤维二糖水解酶基因并产生所述CBHII/Cel6A纤维二糖水解酶的调控序列上的根据权利要求9所述的核酸分子。

11.一种含有根据权利要求10所述的重组表达载体的宿主细胞。

12.根据权利要求11所述的宿主细胞，其特征在于：所述宿主为微生物宿主。

13.根据权利要求11或12所述的宿主细胞，其特征在于：所述宿主为丝状真菌。

14.根据权利要求11或12所述的宿主细胞，其特征在于：所述宿主为木霉属、曲霉属、镰刀霉属、腐质霉属、金孢霉属、脉孢菌属、根霉属、青霉属或被孢酶属。

15.根据权利要求14所述的宿主细胞，其特征在于：所述宿主为木霉属或曲霉属。

16.根据权利要求15所述的宿主细胞，其特征在于：所述宿主为里氏木霉。

17.根据权利要求11或12所述的宿主细胞，其特征在于：所述宿主为发酵微生物。

18.一种制造具有纤维二糖水解酶活性的多肽的方法，所述方法包括步骤：培养根据权利要求11到17中任意一项所述的宿主细胞，以及收集所述多肽。

19.一种用于获得酶制剂的方法，包括步骤：培养根据权利要求11到17中任意一项所述的宿主细胞，以及制备全营养培养肉汤，或者从用过的培养基中分离出所述细胞，以及获得上清液。

20.一种根据权利要求19所述的方法获得的酶制剂。

21.一种酶制剂，包括根据权利要求8所述的CBHII/Cel6A多肽。

22.根据权利要求20或21所述的酶制剂，其特征在于：所述制剂包括其他的酶，所述其他的酶选自非CBHII/Cel6A纤维二糖水解酶、内切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶、β-葡聚糖酶、木葡聚糖酶、木聚糖酶、β-木糖苷酶、甘露聚糖酶、β-甘露糖苷酶、α-葡萄糖醛酸酶、乙酰基木聚糖酯酶、α-阿拉伯呋喃糖苷酶、α-半乳糖苷酶、果胶酶、内切半乳糖醛酸酶和外切半乳糖醛酸酶、内切果胶裂解酶、果胶酸盐裂解酶和果胶(甲)酯酶以及木质酶。

23.根据权利要求22所述的酶制剂，其特征在于，所述木质酶选自于木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶以及有介体或无介体的漆酶。

24.根据权利要求20或21所述的酶制剂，其特征在于：所述酶制剂以全营养培养肉汤、用过的培养基、液体、粉末或者颗粒的形式存在。

25.根据权利要求8所述的CBHII/Cel6A多肽或者根据权利要求20到24中任意一项所述的酶制剂在任何涉及纤维素材料水解或改性的用途中的应用。

26.根据权利要求8所述的CBHII/Cel6A多肽或者根据权利要求20到24中任意一项所述的酶制剂在制备生物燃料、处理纤维、处理食物或饲料中的应用。

27.根据权利要求8所述的CBHII/Cel6A多肽或者根据权利要求20到24中任意一项所述的酶制剂在洗涤剂、纸浆和纸、饮料中的应用。