MX2007008050A - Polipeptidos que tienen actividad de celobiohidrolasa y polinucleotidos que codifican para los mismos. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se refiere a los polipeptidos aislados que tienen actividad de celobiohidrolasa y a los polinucleotidos aislados que codifican para los polipeptidos. La invencion tambien se refiere a las construcciones de acido nucleico, los vectores y las celulas hospederas que comprende polinucleotidos, asi como los metodos para producir y utilizar los polipeptidos.

Description

POLIPEPTIDOS QUE TIENEN ACTIVIDAD DE CELOBIOHIDROLASA Y POLINUCLEOTIDOS QUE CODIFICAN PARA LOS MISMOS CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a los polipéptidos aislados que tienen actividad de celobiohidrolasa y los polinucleótidos aislados que codifican para los polipéptidos. La invención también se refiere a las construcciones de ácido nucleico, los vectores, y las células hospederas que comprenden los polinucleótidos a-sí como los métodos para producir y utilizar los polipéptidos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La celulosa es un polímero del azúcar simple glucosa covalentemente enlazado por enlaces beta-1,4. Muchos microorganismos producen enzimas que hidrolizan los glucanos beta-enlazados. Estas enzimas incluyen endoglucanasas, celobiohidrolasas, y beta-glucosidasas . Las endoglucanasas digieren el polímero de celulosa en sitios aleatorios, abriéndolo para ser atacado por las celobiohidrolasas. Las celobiohidrolasas liberan secuencialmente moléculas de celobioea deede los extremos del polímero de celulosa. La celobiohidrolasa I es una actividad de celobiohidrolasa de 1, 4-D-glucano (E.C. 3.2.1.91) que cataliza la hidrólisis de los enlaces 1, 4-beta-D-glucosídicos en la celulosa, la REF.: 183693 celotetriosa, o cualquier otro polímero que contenga la glucosa beta-1, 4-enlazada, liberando celobiosa de los extremos reductores de la cadena. La celobiohidrolasa II es una actividad de celobiohidrolasa de 1, 4-D-glucano (E.C. 3.2.1.91) que cataliza la hidrólisis de los enlaces 1,4-beta-D-glucosídicos en la celulosa, celotetriosa, o cualquier polímero que contenga glucosa beta-1, 4-enlazada, liberando celobiosa de los extr-emos no reductores de la cadena. La celobiosa es un dímero de glucosa beta-1, 4-enlazado soluble en agua. Las beta-glucosidasas hidrolizan la celobiosa hasta glucosa. La celobiosa es un dímero de glucosa beta-1, 4-enlazado, soluble en agua. Las beta-glucosidasas hidrolizan la celobiosa hasta glucosa. La conversión de los materiales de alimentación celulósicos en etanol tiene las ventajas de la fácil disponibilidad de grandes cantidades de material de alimentación, el deseo de evitar la quema o rellenar en campo los materiales, y la limpieza del combustible de etanol. La madera, los residuos agrícolas, las cosechas herbáceas, y los desechos sólidos municipales han sido considerados como materiales de alimentación para la producción de etanol. Estos materiales consisten principalmente de celulosa, hemicelulosa, y lignina. Una vez que la celulosa es convertida a glucosa, la glucosa es fácilmente fermentada por levaduras en etanol.

El documento WO 04/56981 describe una celobiohidrolasa II de Chaetomium thermophilum. Un objetivo de la presente invención es proporcionar los polipéptidos que tienen actividad de celobiohidrolasa y polinucleótidos que codifican para los polipéptidos .

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a los polipéptidos aislados que tienen actividad de celobiohidrolaea seleccionados del grupo que consiste de: (a) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80% de identidad con el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2; (b) un polipéptido que es codificado por una secuencia nucleotídica que se hibrida bajo condiciones de exigencia al menos media alta, con (i) la secuencia de la SEQ ID NO: 1 que codifica para el polipéptido maduro, (ii) la secuencia genómica de ácido desoxirribonucleico (ADN) genómica que comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 1 qu-e codifica para el polipéptido maduro, o (iii) una hebra complementaria de (i) o (ii) ; y (c) una variante que comprende una sustitución, supresión y/o inserción conservadora de uno o más aminoácidos del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2.

La presente invención también se refiere a los polinucleótidoe aielados que codifican para los polipéptidos que tienen actividad de celobiohidrolasa, seleccionados del grupo que consiste de: (a) un polinucleótido que codifica para un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menoe 80% de identidad con el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2; (b) un polinucleótido que tiene al menoe 6-0% de identidad con la eecuencia de la SEQ ID NO: 1 que codifica para el polipéptido maduro; y (c) un polinucleótido que ee hibrida bajo condiciones al menos de exigencia media alta con (i) la secuencia de la SEQ ID NO: 1 que codifica para el polipéptido maduro, (ii) la secuencia genómica de ADN que comprende la eecuencia de la SEQ ID NO: 1 que codifica para el polipéptido maduro, o (iii) una hebra complementaria de (i) o (ii) . En un aepecto preferido, el polipéptído maduro es de los aminoácidos 18 al 481 de la SEQ ID NO: 2. En otro aspecto preferido, la secuencia que codifica para el polipéptido maduro es los nucleótidos 52 al 1443 de la SEQ ID NO: 1. La preeente invención también se refiere a las construcciones de ácido nucleico, vectores de expresión recombinantes, y células hospederas recombinantes que comprenden loe polinucleótidoe . La preeente invención también se refiere a los métodos para producir tal polipéptido que tiene actividad de celobiohidrolasa que comprende: (a) el cultivo de una célula hospedera recombinante que comprende una construcción de ácido nucleico que comprende un polinucleótido -que codifica para el polipéptido bajo condiciones conducentes a la producción del polipéptido; y (b) la recuperación del polipéptido. La presente invención también se refiere a los métodos para utilizar los polipéptidos que tienen actividad de celobiohidrolasa en detergentes y en la conversión de la celulosa a la glucosa. La presente invención se refiere además a las construcciones de ácido nucleico que comprenden un gen que codifica para una proteína, en donde el gen está operablemente enlazado a una eecuencia nucleotídica que codifica para un péptido de eeñal que comprende o que consiste de los aminoácidos 1 al 17 de la SEQ ID NO: 2, en donde el gen es extraño para la secuencia nucleotídica.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Las Figuras ÍA y IB muestran la secuencia de cADN y la eecuencia de aminoácidoe deducida de una celobiohidrolasa (Cel6A) de Thielavia ter res tris NRRL 8126 (-SEQ ID NOs: 1 y 2, respectivamente). La Figura 2 muestra un mapa de restricción de pAILol . La Figura 3 muestra un mapa de restricción de pBANelO. La Figura 4 muestra un mapa de restricción de pAILo2. La Figura 5 muestra un mapa de restricción de pAILo21. La Figura 6 muestra la hidrólisis de PASC a glucosa por la Celobiohidrolasa Cel6A proveniente de Thielavia terrestris o Humicola insoiens . La ß-glucosidasa de Aspergillus oryzae fue incluida en el ensayo para convertir la celobiosa a glucosa. La Figura 7 muestra un mapa de restricción de pCW076. La Figura 8 muestra un mapa de restricción de PCW085.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Definiciones Actividad de celobiohidrolasa: El término "actividad de celobiohidrolasa" es definido en la presente como una actividad de celobiohidrolasa 1, 4-D-glucano (E.C. 3.2.1.91) que cataliza la hidrólisis de los enlaces 1,4-beta- D-glucosídicos en celulosa, celotetriosa, o cualquier otro polímero que contenga glucosa beta-1, 4-enlazada, liberando celobiosa de los extremos de la cadena. Para los propósitos de la presente invención, la actividad de celobiohidrolasa es determinada por la liberación de azúcar reductor soluble en agua a partir de la celulosa como se mide por el método PHBAH de Lever et al., 1972, Anal . Biochem. 47: 273-279. Una distinción entre el modo de ataque de exoglucanasa de una celobiohidrolaea y el modo de ataque de endoglucanasa es realizado por una medición similar de liberación de azúcar reductora a partir de la celulosa sustituida tal como la carboximetilcelulosa o la hidroxietilcelulosa (Ghose, 1987, Puro & Appl . Chem. 59: 257-268). Una celobiohidrolasa verdadera tendrá una proporción muy alta de actividad eobre la celuloea no euetituida versus la eustituida (Bailey et al., 1993, Biotechnol . Appl . Biochem. 17: 65-76). Los polipéptidos de la presente invención tienen al menos 20%, preferentemente al menos 40%, más preferentemente al menos 50%, más preferentemente al menos 60%, más preferentemente al menos 70%, más preferentemente al menos 80%, aún más preferentemente al menos 90%, lo más preferentemente al menos 95%, y todavía lo más preferentemente al menos 100% de la actividad de celobiohidrolasa del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2.

Familia 6 de glucósido-hidrolasa o Familia 6H6 : El término "Familia 6 glucósido-hidrolaea" o "Familia GH6" o "Cel6" ee definido en la preeente como un polipéptido que cae en la Familia 6 de glucóeido-hidrolaea de acuerdo a Henrieeat B., 1991, A classification of glycoeyl hydrolaeee based on amino-acid sequence similarities, Biochem. J. 280: 309-316,'y Henriesat y Bairoch, 1996, Updating the sequence-baeed classification of glycosyl hydrolases, Biochem. J. 316: 695-696. Polipéptido aislado: El término "polipéptido aislado" como se utiliza en la presente se refiere a un polipéptido que está al menos 20% puro, preferentemente al menos 40% puro, más preferentemente al menos 60% puro, aún más preferentemente al menos 80% puro, lo más preferentemente al menos 90% puro, y todavía lo más preferentemente al menos 95% puro, como se determina mediante SDS-PAGE. Polipéptido sustancialmente puro: El término "polipéptido suetancialmente puro" denota en la preeente una preparación polipeptídica que contiene a lo más 10%, preferentemente a lo más 8%, más preferentemente a lo más 6%, más preferentemente a lo más 5%, más preferentemente a lo más 4%, más preferentemente a lo más 3%, aún más preferentemente a lo más 2%, lo más preferentemente a lo más 1%, y todavía lo más preferentemente a lo más 0.5% en peso de otro material polipeptídico con el cual éste está asociado de manera nativa. Por lo tanto, se prefiere que el polipéptido suetancialmente puro ee al menoe 92% puro, preferentemente al menoe 94% puro, más preferentemente al menos 95% puro, más preferentemente al menos 96% puro, más preferentemente al menos 96% puro, más preferentemente al menos 97% puro, más preferentemente al menos 98% puro, aún más preferentemente al menos 99%, lo más preferentemente al menos 99.5% puro, y todavía lo más preferentemente 100% puro en peeo del material polipeptídico total presente en la preparación. Los polipéptidos de la presente invención están preferentemente en una forma euetancialmente pura. En particular, se prefiere que los polipéptidos estén en "forma suetancialmente pura", por ejemplo, que la preparación polipeptídica está esencialmente libre de otro material polipeptídico con el cual éste está asociado de manera nativa. Esto puede ser logrado, por ejemplo, mediante la preparación del polipéptido por medio de métodos recombinantes bien conocidos o mediante método clásicos de purificación. En la presente, el término "polipéptido sustancialmente puro" es sinónimo con los términos "polipéptido aislado" y "polipéptido en forma aielada". Polipéptido maduro: El término "polipéptido maduro" ee definido en la preeente como un polipéptido que tiene actividad de celobiohidrolasa que está en su forma final después de la traducción y cualesquiera odificacionee poet-traduccionalee, tales como el procesamiento N-terminal, el truncamiento C-terminal, la glucosilación, etc. Identidad: El parentesco entre dos secuencias de aminoácidos o entre dos secuencias nucleotídicas es descrito por el parámetro "identidad". Para fines de la presente invención, el grado de identidad entre dos secuencias de aminoácidos es determinado por el método de Clustal (Higgins, 1989, CABIOS 5: 151-153) utilizando el software LASERGENE"1* MEGALIGN11 (DNASTAR, Inc., Madison, Wl) con una tabla de peso de residuo PAM250 y los siguientes parámetros de alineación múltiples: Penalidad por espacio vacío de 10 y penalidad por longitud de espacio vacío de 10. Los parámetros de alineación de apareamiento son Ktuplo=l, penalidad por espacio vacío=3, ventanas=5, y diagonalee=5. Para loe propóeitoe de la presente invención, el grado de identidad entre dos secuenciae nucleotídicas es determinado por el método de Wilbur-Lipman (Wilbur y Lipman, 1983, Proceedings of the National Academy of Science USA 80: 726-730) utilizando el software LASERGENE™ MEGALIGN™ (DNASTAR, Inc., Madison, Wl) con una tabla de identidad y los siguientes parámetros de alineación múltiples: Penalidad por espacio vacío de 10 y penalidad por longitud de espacio vacío de 10. Los parámetros de alineación de apareamiento son Ktuplo=3, penalidad por espacio vacío=3, y ventanas=20. Secuencia homologa: El término "secuencia homologa" es definido en la presente como una proteína predicha que da un valor E (o calificación de expectativa) de menos de 0.001 en una búsqueda tfasty (Pearson, W.R., 1999, en Bioinforma tics Methods and Protocols, S. Misener y S. A. Krawetz, ed. , pp. 185-219) con la celobiohidrolasa de Thielavia terreetris de la preeente invención. Fragmento polipeptídico: El término "fragmento polipeptídico" es definido en la presente como un polipéptido que tiene uno o más aminoácidos suprimidos del extremo amino y/o carboxilo del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2; o una secuencia homologa del mismo; en donde el fragmento tiene actividad de celobiohidrolasa. En un aspecto preferido, un fragmento contiene al menos 390 residuoe de aminoácidoe, máe preferentemente al menoe 415 residuos de aminoácidos, y lo más preferentemente al menos 440 residuos de aminoácidos del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2 o una secuencia homologa del mismo. Subsecuencia: El término "subeecuencia" es definido en la presente como una secuencia nucleotídica que tiene uno o más nucleótidos suprimidos del extremo 5 ' y/o 3 ' de la secuencia que codifica para el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 1; o una secuencia homologa del mismo; en donde la subsecuencia codifica para un fragmento polipeptídico que tiene actividad de celobiohidrolasa. En un aepecto preferido, una eubeecuencia contiene al menoe 1170 nucleótidoe, máe preferentemente al menoe 1245 nucleótidos, y lo más preferentemente al menoe 1320 nucleótidoe de la secuencia que codifica para el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: l o una secuencia homologa del mismo. Variante alélica: El término "variante alélica" denota en la presente cualquiera de dos o más formas alternativas de un gen que ocupa el mismo locus cromosómico. La variación alélica surge naturalmente a travée de la mutación, y puede dar como resultado el polimorfismo dentro de poblaciones. Las mutaciones génicas pueden ser silenciosas (sin cambio en el polipéptido codificado) o pueden codificar para polipéptidos que tienen secuencias alteradas de aminoácidos. Una variante alélica de un polipéptido es un polipéptido codificado por una variante alélica de un gen. Polinucleótido aislado: El término "polinucleótido aislado" como se utiliza en la presente se refiere a un polinucleótido que está al menos 20% puro, preferentemente al menos 40% puro, más preferentemente al menos 60% puro, aún más preferentemente al menos 80% puro, lo más preferentemente al menos 90% puro, y todavía lo más preferentemente al menos 95% puro, como se determina mediante electroforesie en agaroea.

Polinucleótido sustancialmente puro: El término "polinucleótido sustancialmente puro" como se utiliza en la presente se refiere a una preparación de polinucleótido libre de otros nucleótidos extraños o no deseados y en una forma adecuada para el uso dentro sietemae de producción de proteínae manipuladoe por ingeniería genética. De este modo, un polinucleótido sustancialmente puro contiene a lo más 10%, preferentemente a lo más 8%, más preferentemente a lo más 6%, máe preferentemente a lo máe 5%, más preferentemente a lo más 4%, más preferentemente a lo más 3%, aún más preferentemente a lo más 2%, lo más preferentemente a lo más 1%, y todavía lo más preferentemente a lo más 0.5% en peso de otro polinucleótido material con el cual éete está asociado de manera nativa. Un polinucleótido sustancialmente puro puede no obstante, incluir regiones 5' y 3" no traducidas de origen natural, tales como promotores y terminadores. Se prefiere que el polinucleótido sustancialmente puro sea al menos 90% puro, preferentemente al menos 92% puro, más preferentemente al menos 94% puro, más preferentemente al menos 95% puro, máe preferentemente al menoe 96% puro, máe preferentemente al menos 97% puro, aún más preferentemente al menos 98% puro, lo más preferentemente al menos 99%, y todavía lo más preferentemente al menos 99.5% puro en peso. Los polinucleótidos de la presente invención están preferentemente en una forma suetancialmente pura. En particular, se prefiere que loe polinucleótidos descritos en la presente estén en "forma esencialmente pura", por ejemplo, que la preparación del polinucleótido esté esencialmente libre de otro material polinucleotídico con el cual éste está asociado de manera nativa. En la preeente, el término "polinucleótido eustancialmente puro" es sinónimo con los términos "polinucleótido aislado" y "polinucleótido en forma aislada" . Los polinucleótidos pueden ser genómicos, cADN, ARN, semisintéticos, de origen sintético, o cualquier combinación de los mismos. Secuencia que codifica para el polipéptido maduro: El término "secuencia que codifica para el polipéptido maduro" ee definido en la presente como una secuencia nucleotídica que codifica para un polipéptido maduro que tiene actividad de celobiohidrolasa. cADN: El término "cADN" es definido en la presente como una molécula de ADN que puede ser preparada mediante transcripción inversa a partir de una molécula mARN (ácido ribonucleico mensajero) empalmada, madura obtenida a partir de una célula eucariótica. El cADN carece de las secuenciae de intrón que están usualmente presentes en el ADN genómico correspondiente. El transcrito de ARN primario, inicial es un precursor para el mRNA que es proceeado a través de una serie de pasoe antee de aparecer como un mARN empalmado, maduro. Eetoe pasos incluyen la eliminación de las secuenciae de intrón mediante un proceso llamado empalme. El cADN derivado del mRNA carece, por lo tanto, de cualesquiera secuenciae de intrón. Construcción de ácido nucleico: El término "conetrucción de ácido nucleico" como ee utiliza en la presente se refiere a una molécula de ácido nucleico, ya sea de una sola hebra o de doble hebra, que ee aislada de un gen de origen natural o que es modificada para contener segmentoe de ácidos nucleicos, de una manera que de otro modo no existiría en la naturaleza. El término construcción de ácido nucleico es sinónimo con el término "cásete de expresión" cuando la construcción de ácido nucleico contiene las secuenciae de control requeridae para la expresión de una eecuencia de codificación de la presente invención. Secuencia de control: El término "secuencias de control" se define en la preeente para incluir todos los componentes, que son necesarios o ventajosos para la expresión de un polinucleótido que codifica para un polipéptido de la presente invención. Cada secuencia de control puede ser nativa o extraña para la secuencia nucleotídica que codifica para el polipéptido o nativa o extraña una con la otra. Talee eecuenciae de control incluyen, pero no eetán limitadae a, una eecuencia guía, de poliadenilación, secuencia de propéptido, promotor, secuencia de péptido de señal, y terminador de la transcripción. A un mínimo, lae eecuenciae de control incluyen un promotor, y eeñalee de detención de la transcripción y de la traducción. Las secuencias de control pueden ser proporcionadas con ligadores para finee de introducir eitios de restricción específicos que facilitan la ligadura de las secuenciae de control con la región de codificación de la eecuencia nucleotídica que codifica para un polipéptido. Operablemente enlazado: El término "operablemente enlazado" denota en la preeente una configuración en la cual una eecuencia de control eetá colocada en una poeición apropiada con relación a la secuencia de codificación de la secuencia polinucleotídica tal que la secuencia de control dirige la expresión de la secuencia de codificación de un polipéptido. Secuencia de codificación: Cuando se utiliza en la presente el término "eecuencia de codificación" significa una secuencia nucleotídica, la cual especifica directamente la secuencia de aminoácidos de su producto proteico. Los límites de la secuencia de codificación son en general determinados por una estructura de lectura abierta, la cual usualmente comienza con el codón de inicio ATG o codones de inicio alternativos talee como GTG y TTG y extremos con un codón de paro o detención tal como TAA, TAG, y TGA. La secuencia de codificación puede ser una secuencia de ADN, cADN, o una secuencia nucleotídica recombinante.

Expresión: El término "expresión" incluye cualquier paso involucrado en la producción del polipéptido que incluye, pero no está limitado a, transcripción, modificación post-transcripcional, traducción, modificación post-traduccional, y secreción. Vector de expresión: El término "vector de expresión" ee definido en la presente como una molécula de ADN lineal o circular que comprende un polinucleótido que codifica para un polipéptido de la invención, y que está operablemente enlazado a los nucleótidos adicionales que proporcionan su expresión. Célula hospedera: El término "célula hoepedera", como se utiliza en la presente, incluye cualquier tipo celular que sea susceptible a transformación, transfección, transducción, y similares con una construcción de ácido nucleico o vector de expresión que comprende un polinucleótido de la presente invención. Modificación: El término "modificación" significa en la presente cualquier modificación química del polipéptido que consiste del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2; o una secuencia homologa del miemo; aeí como la manipulación genética de ADN que codifica para tal polipéptido. La modificación puede eer sustituciones, supresiones y/o insercionee de uno o más aminoácidos, así co o reemplazos de una o más cadenas laterales de aminoácidoe.

Variante artificial: Cuando se utiliza en la presente, el término "variante artificial" significa un polipéptido que tiene actividad de celobiohidrolasa producida por un organismo que expreea una secuencia nucleotídica modificada de la secuencia que codifica para el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 1; o una secuencia homologa del mismo. La secuencia nucleotídica modificada es obtenida a través de intervención humana mediante modificación de la secuencia nucleotídica descrita en SEQ ID NO: 1; o una secuencia homologa de la misma. Polipéptidos que tienen actividad de celobiohidrolaßa En un primer aepecto, la presente invención se refiere a los polipéptido aisladoe que comprenden una secuencia de aminoácidos que tiene un grado de identidad al polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2, de al menos 60%, preferentemente al menos 65%, más preferentemente al menos 70%, más preferentemente al menoe 75%, más preferentemente al menos 80%, más preferentemente al menos 85%, aún más preferentemente al menoe 90%, lo más preferentemente al menos 95%, y todavía lo más preferentemente al menos 97%, 98%, o 99%, que tienen actividad de celobiohidrolaea (de aquí en adelante denominadoe los "polipéptidos homólogos"). En un aspecto preferido, los polipéptidos homólogos tienen una secuencia de aminoácidos que difiere por diez aminoácidos, preferentemente por cinco aminoácidos, más preferentemente por cuatro aminoácidos, aún más preferentemente por tres aminoácidos, lo más preferentemente por dos aminoácidos, y todavía lo más preferentemente por un aminoácido del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2. Un polipéptido de la presente invención comprende preferentemente la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 o una variante alélica del mismo; o un fragmento del mismo que tiene actividad de celobiohidrolasa. En un aspecto preferido, un polipéptido comprende la secuencia de aminoácidoe de la SEQ ID NO: 2. En otro aspecto preferido, un polipéptido comprende el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2. En otro aspecto preferido, un polipéptido comprende los aminoácidos 18 al 481 de la SEQ ID NO: 2, o una variante alélica del mismo; o un fragmento del mismo que tiene actividad de celobiohidrolasa. En otro aspecto preferido, un polipéptido comprende los aminoácidos 18 al 481 de la SEQ ID NO: 2. En otro aspecto preferido, un polipéptido consiste de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 o una variante alélica del mismo; o un fragmento del mismo que tiene actividad de celobiohidrolasa. En otro aspecto preferido, un polipéptido consiste de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2. En otro aspecto preferido, un polipéptido consiste del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2. En otro aspecto preferido, un polipéptido consiste de los aminoácidos 18 al 481 de la SEQ ID NO: 2 o una variante alélica del mismo; o un fragmento del miemo que tiene actividad de celobiohidrolaea. En otro aspecto preferido, un polipéptido consiste de los aminoácidos 18 al 481 de la SEQ ID NO: 2. En un segundo aspecto, la presente invención se refiere a los polipéptidos aisladoe que tienen actividad de celobiohidrolaea que eon codificadoe por los polinucleótidos que se hibridan bajo condiciones de muy baja exigencia o severidad, preferentemente condicionee de baja eeveridad, más preferentemente condicionee de eeveridad media, más preferentemente condiciones de severidad media a alta, aún más preferentemente condiciones de alta severidad, y lo más preferentemente condiciones de muy alta severidad con (i) la secuencia que codifica para el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 1, (ii) la secuencia de ADN genómico que comprende la secuencia que codifica para el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 1, (iii) una subsecuencia de (i) o (ii) , o (iv) una hebra complementaria de (i), (ii) , o (iii) (J. Sambrook, E. F. Fritsch, y T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual , 2a edición, Cold Spring Harbor, New York) . Una subsecuencia de la secuencia que codifica para el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 1 contiene al menos 100 nucleótidos contiguos o preferentemente al menos 200 nucleótidos contiguos. Además, la subsecuencia puede codificar para un fragmento polipeptídico que tiene actividad de celobiohidrolasa. En un aspecto preferido, la secuencia que codifica para el polipéptido maduro es los nucleótidos 52 al 1443 de la SEQ ID NO: 1. La secuencia nucleotídica de la SEQ ID NO: 1; o una subsecuencia de la iema; así como la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2; o un fragmento de la misma; puede ser utilizada para diseñar una sonda de ácido nucleico para identificar y clonar el ADN que codifica para los polipéptidos que tienen actividad de celobiohidrolasa a partir de las cepas de diferentee géneros o especie de acuerdo a los métodos bien conocidos en la técnica. En particular, tales sondas pueden ser utilizadas para la hibridación con el ADN genómico o cADN del género o especie de interés, siguiendo los procedimientos de transferencia de Southern estándares, con el fin de identificar y aislar el gen correspondiente en éstoe. Tales sondae pueden ser considerablemente más cortas que la secuencia entera, pero deben ser al menos de 14, preferentemente al menos de 25, más preferentemente al menos de 35, y lo más preferentemente al menos de 70 nucleótidos de longitud. No obstante, se prefiere que la sonda de ácido nucleico sea al menos de 100 nucleótidos de longitud. Por ejemplo, la sonda de ácido nucleico pueden ser al menos de 200 nucleótidos, preferentemente al menos de 300 nucleótidoe, más preferentemente al menos de 400 nucleótidos, o lo más preferentemente al menos 500 nucleótidos de longitud. Sondas aún más largas pueden ser utilizadas, por ejemplo, sondas de ácido nucleico que son al menos de 600 nucleótidos, preferentemente al menos de 700 nucleótidoe, más preferentemente al menos de 800 nucleótidos, o lo más preferentemente al menos de 900 nucleótidoe de longitud. Las sondas de ADN y ARN pueden ser utilizadas. Las sondas son típicamente marcadas para detectar el gen correspondiente (por ejemplo, con 32P, 3H, 35S, biotina, o avidina) . Tales sondae son abarcadas por la presente invención. Una biblioteca de ADN genómico o cADN preparada a partir de otros organismos tales, puede ser por lo tanto seleccionada para el ADN que ee hibrida con lae eondas descritas anteriormente y que codifica para un polipéptido que tiene actividad de celobiohidrolasa. El ADN genómico u otro ADN proveniente de otros organismos tales puede ser separado mediante electroforesis en gel de agarosa o de poliacrilamida, u otras técnicas de separación. El ADN proveniente de las bibliotecas o el ADN separado pueden ser transferidos a e inmovilizados sobre nitrocelulosa u otro material portador adecuado. Con el fin de identificar un clon o ADN que sea homólogo con la SEQ ID NO: 1; o una subsecuencia de la misma; el material portador es utilizado en una transferencia de Southern (Southern blot) . Para fines de la presente invención, la hibridación indica que la secuencia nucleotídica se hibrida a una sonda marcada de ácido nucleico correepondiente a la eecuencia que codifica para el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 1, la eecuencia de ADN genómico que comprende la eecuencia que codifica para el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 1; su hebra complementaria; o una subeecuencia de la miema; bajo condiciones de severidad muy baja a muy alta. Las moléculas a las cuales se hibrida la sonda de ácido nucleico bajo estas condiciones pueden eer detectadae utilizando, por ejemplo, Película de rayos X. En un aspecto preferido, la sonda de ácido nucleico es la secuencia que codifica para el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 1. En otro aspecto preferido, la sonda de ácido nucleico es de loe nucleótidos 52 al 1443 de la SEQ ID NO: 1. En otro aspecto preferido, la sonda de ácido nucleico es una secuencia polinucleotídica que codifica para el polipéptido de la SEQ ID NO: 2, o una subsecuencia de la misma. En otro aspecto preferido, la sonda de ácido nucleico ee la SEQ ID NO: 1. En otro aepecto preferido, la eonda de ácido nucleico ee la eecuencia polinucleotídica contenida en el plásmido pTterdA que está contenido en E coli NRRL B-30802, en donde la secuencia polinucleotídica de la misma codifica para un polipéptido que tiene actividad de celobiohidrolasa. En otro aspecto preferido, la sonda de ácido nucleico es la región que codifica para el polipéptido maduro contenida en el plásmido pTter6A que está contenido en E. coli NRRL B-30802.

Para sondae largae de al menos 100 nucleótidos de longitud, son definidas las condiciones de muy baja a muy alta severidad o exigencia, como la prehibridación y la hibridación a 42°C en 5X SSPE, 0.3% de SDS, 200 µg/ml de ADN cortado y desnaturalizado de esperma de salmón, y ya sea formamida al 25% para las severidades muy bajas y bajas, 35% de formamida para severidadee mediae y medias altas, o 50% de formamida para severidadee altas y muy altas, siguiendo procedimientos de transferencia de Southern estándares por 12 a 24 horas óptimamente. Para sondas largas de al menos 100 nucleótidos de longitud, el material portador es finalmente lavado tres veces por 15 minutos utilizando 2X SSC, 0.2% de SDS preferentemente al menoe a 45°C (eeveridad muy baja), más preferentemente al menos a 50°C (severidad baja) , máe preferentemente al menoe a 55°C (eeveridad media) , máe preferentemente al menos a 60°C (severidad media-alta) , aún más preferentemente al menos a 65°C (severidad alta) , y lo más preferentemente al menos a 70°C (severidad muy alta) . Para sondas cortas que son de aproximadamente 15 nucleótidos a aproximadamente 70 nucleótidos de longitud, las condiciones de severidad o exigencia son definidas como la prehibridación, hibridación, y lavado post-hibridación aproximadamente a 5°C hasta aproximadamente 10°C por debajo de la Tm calculada, utilizando el cálculo de acuerdo a Bolton y McCarthy (1962, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 48:1390) en cloruro de eodio 0.9 M, Tris-HCl 0.09 M pH 7.6, EDTA 6 mM, 0.5% de NP-40, solución de Denhardt IX, pirofosfato de sodio 1 mM, fosfato monobásico de sodio 1 mM, ATP 0.1 mM, y 0.2 mg de ARN de levadura por mililitro siguiendo procedimientos de transferencia de Southern estándares por 12 a 24 horas óptimamente. Para sondas cortas que son de aproximadamente 15 nucleótidos a aproximadamente 70 nucleótidoe de longitud, el material portador ee lavado una vez en 6X SCC más 0.1% de SDS por 15 minutos y dos veces por 15 minutos utilizando 6X SSC a 5°C hasta 10°C por debajo de la Tm calculada. En un tercer aspecto, la presente invención se refiere a las variantee artificialee que comprenden una eustitución, supreeión y/o ineerción coneervadora de uno o máe aminoácidos del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2, o una secuencia homologa de la misma. Preferentemente, loe cambios de aminoácidos de una naturaleza menor, que son sustituciones o inserciones conservadoras de aminoácidos que no afectan significativamente el plegamiento y/o la actividad de la proteína; supresiones pequeñas, típicamente de uno a aproximadamente 30 aminoácidos; extensionee amino- o carboxilo-terminalee pequeñae, talee como un residuo de metionina amino-terminal; un péptido ligador pequeño de hasta aproximadamente 20-25 residuoe; o una extensión pequeña que facilita la purificación mediante cambio de la carga neta u otra función, tal como un tramo de poli-histidina, un epitopo antigénico o un dominio de enlace. Los ejemplos de eustituciones coneervadorae están dentro del grupo de aminoácidos básicoe (arginina, lieina e hietidina) , aminoácidos ácidos (ácido glutámico y ácido aspártico) , aminoácidos polares (glutamina y asparagina) , aminoácidos hidrofóbicos (leucina, isoleucina y valina) , aminoácidos aromáticos (fenilalanina, triptofano y tirosina), y aminoácidoe pequeñoe (glicina, alanina, eerina, treonina y metionina) . Lae sustituciones de aminoácidos que no alteran en general la actividad específica son conocidae en la técnica y eon deecritae, por ejemplo, por H. Neurath y R.L. Hill, 1979, En, The Proteins, Academic Preee, New York. Los intercambios que ocurren máe comúnmente son Ala/Ser, Val/lie, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/lie, Leu/Val, Ala/Glu, y Asp/Gly. Ademáe de los 20 aminoácidos estándares, los aminoácidos no estándares (tales como 4-hidroxiprolina, 6-N-metil-lisina, ácido 2-aminoisobutírico, isovalina, y alfa-metileerina) pueden eer eubstituidos por residuos de aminoácidos de un polipéptido de tipo silvestre. Un número limitado de aminoácidos no conservadoree , aminoácidos que no son codificados por el código genético, y aminoácidos no naturalee pueden eer substituidoe por residuos de aminoácidos. Los "aminoácidos no naturales" han sido modificados despuée de la eínteeis de proteínas, y/o tienen una estructura química en su o sus cadenae laterales diferente de aquella de los aminoácidos estándares. Los aminoácidos no naturales pueden ser químicamente eintetizadoe, y preferentemente, son comercialmente disponibles, e incluyen ácido pipecólico, ácido tiazolidincarboxílico, deshidroprolina, 3- y 4-metilprolina, y 3, 3-dimetilprolina. Alternativamente, loe cambioe de aminoácidos son de una naturaleza tal que eon alteradae las propiedades físico-químicae de los polipéptidos. Por ejemplo, los cambios de aminoácidos pueden mejorar la estabilidad térmica del polipéptido, alterar la especificidad de suetrato, cambiar el pH óptimo, y similares. Los aminoácidos esencialee en el polipéptido progenitor pueden ser identificados de acuerdo a procedimientos conocidos en la materia, tales como la mutagénesis dirigida al sitio o la mutagénesis de exploración de alanina (Cunningham y Wells, 1989, Science 244: 1081-1085) . En la última técnica, son introducidas mutaciones simples de alanina en cada residuo en la molécula, y las moléculas mutantes resultantes son probadas para la actividad biológica (por ejemplo, actividad de celobiohidrolasa) para identificar los residuoe de aminoácidos que son críticos para la actividad de la molécula. Ver también, Hilton et al., 1996, J. Biol . Chem . 271: 4699-4708. El sitio activo de la enzima u otra interacción biológica puede también ser determinado mediante análisis físico de la estructura, como se determina mediante técnicas tales como la resonancia magnética nuclear, cristalografía, difracción de electrones, o marcación de fotoafinidad, en conjunto con la mutación de los aminoácidos putativos del sitio de contacto. Ver, por ejemplo, de Vos et al., 1992, Science 255: 306-312; Smith et al., 1992, J-. Mol . Biol . 224: 899-904; Wlodaver et al., 1992, FEBS Lett. 309: 59-64. Las identidades de los aminoácidos eeencialee pueden también ser inferidas a partir de análisis de las identidades con polipéptidos que están relacionados a un polipéptido de acuerdo a la invención. Las sustituciones de aminoácidos simples o múltiples pueden ser realizadas y probadas utilizando métodos conocidos de mutagénesie, recombinación, y/o mezclado (revoltura) , eeguido por un procedimiento de selección relevante, talee como aquelloe deecritos por Reidhaar-Oleon y Sauer, 1988, Science 241: 53-57; Bowie y Sauer, 1989, Proc . Nati . Acad . Sci . USA 86: 2152-2156; WO 95/17413; o WO 95/22625. Otros métodos que pueden ser utilizados incluyen la PCR propensa a errores, visualización de fagos (por ejemplo, Lowman et al., 1991, Biochem. 30: 10832-10837; Patente de los Eetadoe Unidoe No. 5,223,409; WO 92/06204), y mutagéneeis dirigida a la región (Derbyshire et al., 1986, Gen 46: 145; Ner et al., 1988, ADN 7: 127). Los métodos de mutagéneeie/entremezclado (revoltura) pueden eer combinados con los métodos de eelección automatizada de alto rendimiento para detectar la actividad de loe polipéptidos mutagenizados, clonados, expresados por las células hospederas (Ness et al., 1999, Nature Biotechnology 17: 893-896). Las moléculas de ADN mutagenizadas que codifican para los polipéptidos activos pueden ser recuperadas de las células hospederas y rápidamente secuenciadae utilizando métodos estándaree conocidoe en la materia. Eetoe métodoe permiten la rápida determinación de la importancia de loe reeiduoe de aminoácidos individuales en un polipéptido de interée, y pueden eer aplicadoe a los polipéptidos de estructura desconocida. El número total de sustituciones, supresiones y/o inserciones de aminoácidoe del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2, tales como los aminoácidos 18 al 481 de la SEQ ID NO: 2, es 10, preferentemente 9, más preferentemente 8, más preferentemente 7 , más preferentemente a lo más í , más preferentemente 5, más preferentemente 4, aún más preferentemente 3 , lo más preferentemente 2 , y todavía lo más preferentemente 1.

Fuentes de polipéptidos que tienen actividad de celobiohidrolasa Un polipéptido de la presente invención puede ser obtenido a partir de microorganismos de cualquier género. Para fines de la preeente invención, el término "obtenido de" como ee utiliza en la presente, en conexión con una fuente dada significará que el polipéptido codificado por una secuencia nucleotídica es producido por la fuente o por una cepa en la cual ha sido insertada la eecuencia nucleotídica proveniente de la fuente. En un aepecto preferido, el polipéptido obtenido de una fuente dada ee secretado extracelularmente . Un polipéptido de la presente invención puede ser un polipéptido bacteriano. Por ejemplo, el polipéptido puede ser un polipéptido de bacteria gram positiva tal como un polipéptido de Bacillus que tiene actividad de celobiohidrolasa, por ejemplo, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus coagulans, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformie, Bacillus megaterium, Bacillus stearothermophilus , Bacillus subtilis, o el polipéptido de Bacillus thuringiensis que tiene actividad de celobiohidrolasa; o un polipéptido de = repto/nyces que tiene actividad de celobiohidrolasa, por ejemplo, un polipéptido de Streptomyces lividans o Streptomyces murinue que tiene actividad de celobiohidrolaea; o un polipéptido de bacteria gram negativa que tiene actividad de celobiohidrolaea, por ejemplo, un polipéptido de E. coli o de Pseudomonas sp. que tiene actividad de celobiohidrolasa. Un polipéptido de la presente invención puede también ser un polipéptido fúngico, y más preferentemente un polipéptido de levadura tal como un polipéptido de Candida, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizoeaccharcmycee , o Yarrowia que tiene actividad de celobiohidrolasa; o más preferentemente un polipéptido de hongo filamentoso tal como un polipéptido de Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Cryptococcus, Filibasidium, Fusarium, Humicola, Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces , Penicillium, Piromyces, Schizophyllum, Talaromyces, Thermoaecus, Thielavia, Tolypocladium, o Trichoderma que tiene actividad de celobiohidrolasa. En un aspecto preferido, el polipéptido es un polipéptido de Saccharomycee carlsbergensie , Saccharomyces cerevieiae, Saccharomycee diastaticus, Saccharomycee douglaeii , Saccharomycee kluyveri , Saccharomycee norbeneie, o Saccharomycee oviformie que tiene actividad de celobiohidrolaea . En otro aepecto preferido, el polipéptido es un polipéptido de Aepergillue aculeatue, Aepergillue awamori , Aepergillus fumigatue, Aspergillus foetidus, Aepergillue japonicus, Aepergillue nidulane, Aepergillue niger, Aepergillue oryzae, Fuearium bactridioidee , Fuearium cerealie, Fuearium crookwellenee, Fuearium culmorum, Fusarium graminearum, Fuearium graminum, Fuearium heterosporum, Fusarium negundi , Fuearium oxyeporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roeeum, Fuearium eambucinum, Fuearium earcochroum, Fuearium eporotrichioidee , Fusarium eulphureum, Fusarium toruloeum, Fuearium trichothecioidee, Fuearium venenatum, Humicola ineolene, Humicola lanuginoea, Mucor miehei , Myceliophthora thermophila, Neuroepora craeea, Penicillium purpurogenum, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reeeei, o Trichoderma viride que tiene actividad de celobiohidrolasa. En otro aspecto preferido, el polipéptido es un polipéptido de Thielavia achromatica, Thielavia albomycee, Thielavia albopiloea, Thielavia australeineis , Thielavia fimeti , Thielavia microspora, Thielavia oviepora, Thielavia peruviana, Thielavia spededonium, Thielavia setosa, Thielavia eubthermophila, Thielavia terrestrie, Thielavia terrícola, Thielavia thermophila, Thielavfa variospora, o Thielavia wareingii que tiene actividad de celobiohidrolasa. En un aspecto más preferido, el polipéptido es un polipéptido de Thielavia terreetrie, y lo más preferentemente Thielavia terreetrie NRRL 8126, por ejemplo, el polipéptido de la SEQ ID NO: 2, o el polipéptido maduro del mismo.

Se entenderá que para las especies anteriormente mencionadas la invención abarca loe eetados perfectos e imperfectos, y otros equivalentes taxonómicos, por ejemplo, anamorfos, no obstante del nombre de la especie por el cual éstoe eon conocidoe. Aquelloe expertoe en la técnica reconocerán fácilmente la identidad de los equivalentes apropiados . Las cepas de estas especies son fácilmente accesibles para el público en un número de colecciones de cultivos, tales como the American Type Culture Collection (ATCC) , Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM) , Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS) , y Agricultural Reeearch Service Patent Culture Collection, Northern Regional Reeearch Center (NRRL) . Ademáe, talee polipéptidoe pueden ser identificados y obtenidos de otras fuentes, incluyendo los microorganismos aislados de la naturaleza (por ejemplo, del suelo, de las compostas, del agua, etc.) utilizando las sondae anteriormente mencionadae. Lae técnicae para aielar microorganiemos de habitats naturalee eon bien conocidoe en la materia. El polinucleótido puede eer entonces obtenido mediante selección similar de una biblioteca genómica o de cADN de tal microorganismo. Una vez que ha sido detectada una secuencia polinucleotídica que codifica para un polipéptido con la o las eondas, el polinucleótido puede eer aislado o clonado mediante la utilización de técnicas que son bien conocidas por aquellos de experiencia ordinaria en la técnica (ver, por ejemplo, Sambrook et al., 1989, supra). Los polipéptidos de la presente invención también incluyen polipéptidos fusionados o polipéptidos de fusión escindiblee en loe cualee otro polipéptido ee fueionado al extremo N o al extremo C del polipéptido o el fragmento del mismo. Un polipéptido fusionado es producido mediante la fusión de una secuencia nucleotídica (o una porción del mismo) que codifica para otro polipéptido para una secuencia nucleotídica (o una porción de la misma) de la presente invención. Las técnicas para producir polipéptidoe de fusión son conocidas en la materia, e incluyen las ligaduras de las secuenciae de codificación que codifican para los polipéptidos de modo que éstos están en la estructura y esa expresión del polipéptido fusionado está bajo el control del mismo o de los mismos promotores y el terminador.

Polinucleótidos La presente invención también se refiere a los polinucleótidos aislados que comprenden o que consisten de una secuencia nucleotídica que codifica para un polipéptido de la presente invención que tiene actividad de celobiohidrolasa . En un aspecto preferido, la eecuencia nucleotídica comprende o consiete de la SEQ ID NO: 1. En otro aspecto más preferido, la secuencia nucleotídica comprende o consiete de la eecuencia contenida en el pláemido pTter6A que está contenido en E. coli NRRL B-30802. En otro aspecto preferido, la secuencia nucleotídica comprende o consiete de la región que codifica para el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 1. En otro aspecto preferido, la secuencia nucleotídica comprende o consiste de los nucleótidos 52 al 1443 de la SEQ ID NO : 1. En otro aspecto más preferido, la secuencia nucleotídica comprende o consiste de la región que codifica para el polipéptido maduro, contenida en el plásmido pTter6A que está contenido en E coli NRRL B-30802. La presente invención también abarca las secuenciae nucleotídicas que codifican para un polipéptido que comprende o que consiste de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 o el polipéptido maduro de la misma, que difieren de la SEQ ID NO: 1 o de la secuencia que codifica para el polipéptido maduro de la misma, en virtud de la degeneración del código genético . La presente invención también se refiere a las subsecuenciae de la SEQ ID NO: 1 que codifican para fragmentoe de la SEQ ID NO: 2 que tienen actividad de celobiohidrolaea . La presente invención también se refiere a los polinucleótidos mutantes que comprenden o que consisten de al menos una mutación en la secuencia de la SEQ ID NO: 1 en la cual la secuencia nucleotídica mutante codifica para el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2. En un aspecto preferido, el polipéptido maduro son los aminoácidos 18 al 481 de la SEQ ID NO: 2. Las técnicae utilizadae para aislar o clonar un polinucleótido que codifica para un polipéptido son conocidas en la técnica e incluyen el aislamiento del ADN genómico, la preparación del cADN, o una combinación de los mismos. La clonación de los polinucleótidos de la presente invención a partir de tal ADN genómico puede ser efectuada, por ejemplo, mediante el uso la reacción en cadena de polimerasa (PCR) bien conocida o la selección de anticuerpo de bibliotecas de expresión para detectar loe fragmentos de ADN clonados con características estructuralee compartidae . Ver, por ejemplo, Innis et al., 1990, PCR: A Guide to Methode y Application, Academic Prese, New York. Otroe procedimientos de amplificación de ácido nucleico talee como reacción en cadena de ligaea (LCR) , la tranecripción activada ligada (LAT) y la amplificación baeada en secuencia de nucleótidos (NASBA) pueden ser utilizados. Los polinucleótidos pueden ser clonadoe a partir de una cepa de Thielavia, u otro organiemo relacionado, y de eete modo, por ejemplo, puede ser una variante alélica o de especie de la región que codifica para el polipéptido de la secuencia nucleotídica. La presente invención también se refiere a los polinucleótidos que comprenden o que consisten de secuencias nucleotídicas que tienen un grado de identidad a la secuencia de la SEQ ID NO: 1 que codifica para el polipéptido maduro de al menos 60%, preferentemente al menos 65%, más preferentemente al menos 70%, máe preferentemente al menos 75%, más preferentemente al menos 80%, más preferentemente al menos 85%, más preferentemente al menos 90%, aún más preferentemente al menos 95%, y lo más preferentemente al menos 97% de identidad, que codifican para un polipéptido activo. En un aspecto preferido, la secuencia que codifica para el polipéptido maduro es de los nucleótidos 52 al 1443 de la SEQ ID NO : 1. La modificación de una secuencia nucleotídica que codifica para un polipéptido de la presente invención puede ser necesaria para la síntesis de los polipéptidos suetancialmente similares al polipéptido. El término "sustancialmente similar" al polipéptido se refiere a las formas de origen no natural del polipéptido. Estos polipéptidos pueden diferir de alguna manera manipulada por ingeniería a partir del polipéptido aislado de su fuente nativa, por ejemplo, las variantes artificiales que difieren en la actividad específica, en termoestabilidad, en pH óptimo, o eimilaree. La eecuencia variante puede eer construida con base en la secuencia nucleotídica presentada como la región de la SEQ ID NO: 1 que codifica para el polipéptido, por ejemplo, una subsecuencia de la misma, y/o por introducción de suetituciones de nucleótidos que no dan origen a otra secuencia de aminoácidoe del polipéptido codificado por la secuencia nucleotídica, pero que corresponden al uso de codón del organismo hospedero destinado para la producción de la enzima, o por introducción de sustituciones de nucleótidos que pueden dar origen a una diferente secuencia de aminoácidos. Para una descripción general de la suetitución de nucleótidoe, ver, por ejemplo, Ford et al., 1991, Protein Expreeeion y Purification 2 : 95-107. Será aparente para aquellos expertos en la técnica que tales sustitucionee pueden ser realizadae fuera de las regiones críticas para la función de la molécula y todavía dar como resultado un polipéptido activo. Los residuos de aminoácidos esenciales para la actividad del polipéptido codificado por un polinucleótido aislado de la invención, y por lo tanto preferentemente no sujetos a suetitución, pueden eer identificados de acuerdo a procedimientoe conocidos en la materia, tales como la mutagénesis dirigida al sitio o la mutagénesis de exploración de alanina (ver, por ejemplo, Cunningham y Wells, 1989, supra). En la última técnica, son introducidas mutaciones en cada residuo positivamente cargado en la molécula, y las moléculas mutantes resultantes son probadae para la actividad de celobiohidrolasa para identificar los reeiduos de aminoácidos que son críticos para la actividad de la molécula. Los sitioe de interacción sustrato-enzima pueden ser también determinados mediante análisie de la estructura tridimensional como se determina mediante técnicas tales como el análisie de resonancia magnética nuclear, cristalografía o marcación de fotoafinidad (ver, por ejemplo, de Vos et al., 1992, supra; Smith et al., 1992, eupra; Wlodaver et al., 1992, supra). La presente invención también se refiere a loe polinucleótidoe aieladoe que codifican para un polipéptido de la presente invención, que ee hibridan bajo condicionee de muy baja exigencia o severidad, preferentemente condiciones de baja severidad, más preferentemente condiciones de severidad media, más preferentemente condiciones de severidad media a alta, aún más preferentemente condiciones de alta severidad, y lo más preferentemente condiciones de muy alta severidad con (i) la eecuencia de la SEQ ID NO: 1 que codifica para el polipéptido maduro, (ii) la secuencia de ADN genómico que comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 1 que codifica para el polipéptido maduro, o (iii) una hebra complementaria de (i) o (ii) ; o variantee alélicas y subeecuencias de las mismas (Sambrook et al., 1989, eupra), como ee definen en la preeente. En un aepecto preferido, la secuencia de la SEQ ID NO: 1 que codifica para el polipéptido maduro es de los nucleótidos 52 al 1443.

La presente invención también se refiere a los polinucleótidoe aislados obtenidos por (a) la hibridación de una población de ADN bajo condiciones de severidad muy baja, baja, media, media-alta, alta o muy alta con (i) la secuencia de la SEQ ID NO: 1 que codifica para el polipéptido maduro, (ii) la secuencia de ADN genómico que comprende la eecuencia de la SEQ ID NO: 1 que codifica para el polipéptido maduro, o (iii) una hebra complementaria de (i) o (ii) ; y (b) el aielamiento del polinucleótido de hibridación, que codifica para un polipéptido que tiene actividad de celobiohidrolasa. En un aspecto preferido, la secuencia de la SEQ ID NO: 1 que codifica para el polipéptido maduro es de loe nucleótidoe 52 al 1443.

Construcciones de ácido nucleico La presente invención también se refiere a las construcciones de ácido nucleico que comprenden un polinucleótido aislado de la presente invención operablemente enlazado a una o más secuenciae de control que dirigen la expresión de la secuencia de codificación en una célula hospedera adecuada bajo condiciones compatibles con las secuenciae de control. Un polinucleótido aielado que codifica para un polipéptido de la preeente invención puede ser manipulado en una variedad de formas para proporcionar la expresión del polipéptido. La manipulación de la secuencia polinucleotídica antes de su inserción dentro de un vector puede ser deseable o necesaria dependiendo del vector de expresión. Las técnicas para modificar las secuencias polinucleotídicas utilizando métodos de ADN recombinante son bien conocidas en la materia. La eecuencia de control puede ser una secuencia promotora apropiada, una eecuencia nucleotídica que ee reconocida por una célula hospedera para la expresión de un polinucleótido que codifica para un polipéptido de la presente invención. La secuencia promotora contiene las secuencias de control transcripcionales que son mediadoras de la expresión del polipéptido. El promotor puede ser cualquier secuencia nucleotídica que muestre actividad transcripcional en la célula hospedera de elección, incluyendo promotoree mutantes, truncadoe e híbridos, y puede eer obtenida a partir de genee que codifican para los polipéptidos extracelulares o intracelulares ya sea homólogos o heterólogos a la célula hospedera. Los Ejemplos de promotores adecuados para dirigir la transcripción de las construccionee de ácido nucleico de la preeente invención, especialmente en una célula hospedera bacteriana, son los promotores obtenidos a partir del operón lac de E. coli , el gen de agarasa de Streptomyces coelicolor { dagA) , El gen de la levansucrasa { sacB) de Bacillue eubtilie , el gen de la alfa-amilasa (amy ) de Bacillue licheniformis, el gen de la amilasa maltogénica { amyM) de Bacillue etearothermophilus, el gen de la alfa-amilasa (amyQ) de Bacillus amyloliquefaciene, el gen de la penicilinasa {penP) de Bacillue licheniformie, los genes xylA y xylB de Bacillus subtilie, y el gen procariótico de la beta-lactamasa (Villa-Kamaroff et al, 1978, Proceedinge of the National Academy of Sciencee USA 75: 3727-3731), así como el promotor tac (DeBoer et al., 1983, Proceedinge of the National Academy of Sciencee USA 80: 21-25). Los promotores adicionales son descritos en "Useful proteins from recombinante bacteria" en Scientific American, 1980, 242: 74-94; y en Sambrook et al., 1989, supra. Los ejemplos de promotores adecuados para dirigir la transcripción de las construccionee de ácido nucleico de la presente invención en una célula hospedera de hongo filamentoso, son promotores obtenidos a partir de los genes para la amilasa TAKA de Aepergillue oryzae, la proteinasa aspártica de Rhizomucor miehei , la alfa-amilaea neutra de Aepergillue niger, la alfa-amilaea estable al ácido de Aepergillue niger, la glucoamilasa (glaA) de Aepergillue niger o Aepergillus awamori , la lipasa de Rhizomucor miehei , la proteasa alcalina de Aepergillue oryzae, la triosa-fosfato-isomeraea de Aepergillue oryzae, la acetamidasa de Aepergillue nidulans, la amiloglucosidasa de Fusarium venenatum (WO 00/56900) , Daría de Fusariiun venenatiup (WO 00/56900), Quinn de Fusarium venenatum (WO 00/56900), la proteasa similar a tripsina de Fusarium oxyeporum (WO 96/00787), la beta-glucosidadas de Trichoderma reeeei , la celobiohidrolaea I de Trichoderma reeeei , la celobiohidrolaea II de Trichoderma reeeei , la endoglucanaea I de Trichoderma reeeei , la endoglucanaea II de Trichoderma reesei , la endoglucanaea III de Trichoderma reeeei , la endoglucanasa IV de Trichoderma reeeei , la endoglucanasa V de Trichoderma reeeei , la xilanasa I de Trichoderma reesei , la xilanasa II de Trichoderma reesei , la beta-xiloeidaea de Trichoderma reeeei , así como el promotor NA2-tpi (un híbrido de los promotores de los genee para la alfa-amilasa neutra de Aepergillue niger y la triosa-foefato-ieomerasa de Aepergillue oryzae) ; y los promotores mutantes, truncados e híbridos de los mismos. En un hospedero tipo levadura, son obtenidos promotores útiles a partir de los genes para la enolasa (ENO-1) de Saccharomycee cerevieiae, la galactocinasa (GAL1) de Saccharomycee cerevieiae, alcohol deshidrogenasa/gliceraldehído-3-fosfato-deshidrogenasa (ADH1, ADH2/GAP) de Saccharomyces cerevieiae, trioea-fosfato-isomerasa (TPI) de Saccharomycee cerevieiae, metalotioneína (CUP1) de Saccharomycee cerevieiae, y la 3-fosfoglicerato-cinasa de Saccharomycee cerevieiae. Otros promotores útiles para las células hospederae de levadura eon deecritas por Romanos et al., 1992, Yeast 8: 423-488. La secuencia de control puede también ser una secuencia adecuada terminadora de la transcripción, una secuencia reconocida por una célula hospedera para terminar la transcripción. La secuencia terminadora está operablemente enlazada al extremo 3 ' de la secuencia nucleotídica que codifica para el polipéptido. Cualquier terminador que sea funcional en la célula hospedera de elección puede ser utilizado en la presente invención. Los terminadores preferidos para células hospederas de hongos filamentosos son obtenidos a partir de los genes para la amilasa TAKA de Aepergillue oryzae, Glucoamilasa de Aepergillue niger, la antranilato-eintaea de Aepergillue nidulane, la alfa-glucosidasa de Aepergillue niger, y la proteasa similar a tripsina de Fuearium oxyeporum. Los terminadores preferidos para lae células hospederas de levadura son obtenidoe de loe genes para la enolaea de Saccharomycee cerevieiae, el citocromo C (CYC1) de Saccharomycee cerevieiae, y la gliceraldehído-3-fosfato-deehidrogenaea de Saccharomycee cerevieiae . Otros terminadores útiles para las células hospederas de levadura son descritos por Romanos et al., 1992, supra. La secuencia de control puede también ser una secuencia guía adecuada, una región no traducida de un mRNA que es importante para la traducción por la célula hospedera. La secuencia guía está operablemente enlazada al extremo 5 ' de la secuencia nucleotídica que codifica para el polipéptido. Cualquier secuencia guía que sea funcional en la célula hospedera de elección puede ser utilizada en la presente invención. Las guías preferidas para las células hospederas de hongos filamentosos son obtenidas a partir de los genes para la amilasa TAKA de Aepergillue oryzae y triosa-fosfato-ieomeraea de Aepergillue nidulane . Las guías adecuadas para las células hospederas de levadura eon obtenidas de los genes para la enolasa (ENO-1) de Saccharomycee cerevieiae, la 3-fosfoglicerato-cinaea de Saccharomycee cerevieiae, el Factor alfa de Saccharomycee cerevieiae, y la alcohol deehidrogenaea/gliceraldehído-3-fosfato-deshidrogenasa (ADH2/GAP) de Saccharomycee cerevisiae. La secuencia de control puede también ser una secuencia de poliadenilación, una secuencia operablemente enlazada al extremo 3' de la secuencia nucleotídica y la cual, cuando es transcrita, es reconocida por la célula hospedera como una señal para agregar residuoe de poliadenoeina al mARN transcrito. Cualquier secuencia de poliadenilación que sea funcional en la célula hospedera de elección puede ser utilizada en la presente invención.

Las secuenciae de poliadenilación para las células hospederae de hongoe filamentoeoe eon obtenidas a partir de los genes para la amilaea TAKA de Aspergillus oryzae, la glucoamilaea de Aepergillue niger, la antranilato-sintasa de Aepergillue nidulane, la proteaea eimilar a tripeina de Fuearium oxyeporum, y la alfa-glucosidasa de Aspergillus niger. Las Secuencias de poliadenilación útiles para las células hospederas de levadura son deecritae por -Guo y Sherman, 1995, Molecular Cellular Biology 15: 5983-5990. La secuencia de control puede también ser una región que codifica para el péptido de señal que codifica para una secuencia de aminoácidos enlazada al extremo amino de un polipéptido y que dirige el polipéptido codificado hacia la vía secretora de la célula. El extremo 5' de la secuencia de codificación de la secuencia nucleotídica puede contener inherentemente una región que codifica para el péptido de señal, naturalmente enlazada en la estructura de lectura de traducción con el segmento de la región de codificación que codifica para el polipéptido secretado. Alternativamente, el extremo 5' de la eecuencia de codificación puede contener una región que codifica para el péptido de eeñal, que ee extraña para la eecuencia de codificación. La región que codifica para el péptido de eeñal, extraña puede eer requerida donde la secuencia de codificación no contiene de manera natural una región que codifica para el péptido de señal. Alternativamente, la región que codifica para el péptido de señal, extraña puede simplemente reemplazar la región que codifica para el péptido de señal, natural, con el fin de aumentar la secreción del polipéptido. No obstante, cualquier región que codifique para el péptido de señal que dirija al polipéptido expresado hacia la vía secretora de una célula hospedera de elección, por ejemplo, secretada hacia un medio de cultivo, puede ser utilizada en la presente invención. Las regiones que codifican para el péptido de señal efectivas, para las células hospederas bacterianas, son las regiones que codifican para el péptido de señal obtenidas a partir de los genes para la amilasa maltogénica de Bacillus NCIB 11837, la alfa-amilasa de Bacillus etearothermophilue, la subtilisina de Bacillue licheniformis, la beta-lactamasa de Bacillue licheniformie, lae proteasae neutrae {nprT, nprS, nprM) de Bacillue etearothermophilue, y prsA de Bacillus eubtilie . Los péptidos de eeñal adicionalee eon descritos por Simonen y Palva, 1993, Microbiological Reviews 57: 109-137. Las regiones que codifican para el péptido de señal, efectivas para las células hospederas de hongos filamentosos son las regiones que codifican para el péptido de señal obtenidas a partir de los genes para la amilasa TAKA de Aepergillus oryzae, la amilasa neutra de Aepergillue niger, la glucoamilasa de Aspergillus niger, la proteinasa aspártica de Rhizomucor miehei , la celulaea de Humicola ineolens, la endoglucanaea V de Humicola insoiens, y la lipaea de Humicola lanuginosa . En un aepecto preferido, el péptido de eeñal es de los aminoácidos 1 al 17 de la SEQ ID NO: 2. En otro aspecto preferido, la región que codifica para el péptido de señal es de los nucleótidos 1 al 51 de la SEQ ID NO: 1 que codifican para los aminoácidos 1 al 17 de la SEQ ID NO: 2. Los péptidos de señal útiles para las células hospederas de levadura son obtenidos a partir de los genes para el factor alfa de Saccharomyces cerevisiae y la invertasa de Saccharomycee cerevieiae . Otras regiones útiles que codifican para el péptido de señal son deecritae por Romanos et al., 1992, supra. La secuencia de control puede también ser una región que codifica para el propéptido, que codifica para una secuencia de aminoácidos colocada en el extremo amino de un polipéptido. El polipéptido resultante es conocido como una proenzima o propolipéptido (o un zimógeno en algunos casoe) . Un propolipéptido ee en general inactivo y puede eer convertido a polipéptido activo maduro mediante eecieión catalítica o autocatalítica del propéptido a partir del propolipéptido. La región que codifica para el propéptido puede ser obtenida a partir de los genes para la proteasa alcalina { aprE) de Bacillue eubtilie, la proteasa neutra {nprT) de Bacillue eubtilis, el factor alfa de Saccharomyces cerevisiae, la proteinasa aspártica de Rhizomucor miehei , y la lacasa de Myceliophthora thermophila (WO 95/33836) . El péptido de señal y lae regiones del propéptido están preeentee en el extremo amino de un polipéptido, la región del propéptido está colocado junto al extremo amino de un polipéptido y la región del péptido de señal está colocada junto al extremo amino de la región del propéptido. Puede también ser deseable agregar secuencias reguladoras que permiten la regulación de la expresión del polipéptido con relación al crecimiento de la célula hospedera. Los ejemplos de sietemae reguladoree eon aquellos que provocan que la expresión del gen sea encendida o apagada en respuesta a un estímulo químico o fíeico, incluyendo la presencia de un compuesto regulador. Los sistemas reguladores en los sietemas procarióticos incluyen los sistemae operadoree lac, tac, y trp. En levadura, el eietema ADH2 o el eistema GALl pueden ser utilizados. En hongos filamentosos, el promotor de alfa-amilasa TAKA, el promotor de la glucoamilasa de Aepergillue niger, y el promotor de la glucoamilasa de Aepergillus oryzae pueden ser utilizados como secuencias reguladoras. Otros ejemplos de secuenciae reguladorae eon aquellos que permiten la amplificación del gen. En sietemas eucarióticoe, éetoe incluyen el gen de la hidrofolato-reductasa que está amplificado en presencia de metotrexato, y los genes de metalotioneína que eon amplificadoe con metalee pesados . En estoe casos, la secuencia nucleotídica que codifica para el polipéptido estaría operablemente enlazada con la secuencia reguladora.

Vectores de expresión La presente invención también se refiere a los vectores de expreeión recombinantes que comprenden un polinucleótido de la presente invención, un promotor, y las señalee de detención de la tranecripción y de la traducción. Loe diversos ácidos nucleicoe y eecuencias de control descritoe en la preeente pueden eer unidos entre eí para producir un vector de expreeión recombinante que puede incluir uno o más sitios de restricción convenientes para permitir la inserción o sustitución de la secuencia nucleotídica que codifica para el polipéptido en tales sitioe. Alternativamente, una eecuencia nucleotídica de la presente invención puede ser expresada por la inserción de la eecuencia nucleotídica o una construcción de ácido nucleico que comprende la secuencia dentro de un vector apropiado para la expresión. En la creación del vector de expresión, la secuencia de codificación eetá localizada en el vector de modo que la eecuencia de codificación ee operablemente enlazada con las secuencias de control apropiadas para la expresión. El vector de expresión recombinante puede ser cualquier vector (por ejemplo, un plásmido o virus) el cual puede ser convenientemente sometido a procedimientos de ADN recombinante y dar origen a la expresión de la secuencia nucleotídica. La elección del vector dependerá típicamente de la compatibilidad del vector con la -célula hospedera dentro de la cual va a ser introducido el vector. Los vectores pueden ser pláemidoe lineales o circulares cerrados. El vector puede ser un vector de replicación autónoma, por ejemplo, un vector que existe como una entidad extracromosómica, la replicación del cual es independiente de la replicación cromosómica, por ejemplo, un plásmido, un elemento extracromosómico, un minicromoeoma, o un cromosoma artificial. El vector puede contener cualquier medio para asegurar la auto-replicación. Alternativamente, el vector puede ser uno el cual, cuando es introducido dentro de la célula hospedera, es integrado dentro del genoma y replicado junco con el o los cromosomae dentro de loe cuales éste ha sido integrado. Además, un vector o plásmido simple o dos o más vectores o plásmidos los cualee conjuntamente contienen el ADN total que va a ser introducido dentro del genoma de la célula hospedera, o un transposón, pueden ser también utilizados.

Los vectores de la presente invención contienen preferentemente uno o más marcadores seleccionables que permiten la selección fácil de las células transformadae, tranefectadae, traneducidas, o similares. Un marcador seleccionable es un gen, el producto del cual proporciona reeistencia viral o biocida, resistencia a metales pesados, prototrofía a auxótrofos, y similares. Los ejemplos de marcadores bacterianos seleccionables son los genes dal de Bacillue eubtilie o Bacillue licheniformie, o marcadoree que confieren resietencia a antibióticos tales como resistencia a la ampicilina, a la kanamicina, al cloranfenicol, o a la tetraciclina. Los marcadores adecuados para lae células hospederas de levadura eon ADE2 , HIS3, LEU2, LYS2 , MET3 , TRPl, y URA3. Los marcadores seleccionablee para el ueo en una célula hospedera de hongo filamentoso incluyen, pero no están limitados a, amdS (acetamidasa) , argB (ornitina-carbamoiltransferasa) , bar (fosffinotricina-acetiltransferasa) , hph (higromicina-fosfotransferasa) , niaD (nitrato-reductaea) , pyrG (orotidina-5 ' -foefato-deecarboxilaea) , eC (eulfato-adenoltraneferaea) , y trpC (antranilato-eintaea) , aeí como equivalentee de las mismas. Preferidoe para el uso en una célula de Aepergillus son los genes amdS y pyrG de Aepergillue nidulane o Aepergillue oryzae y el gen bar de Streptomycee hygroecopicue .

Los vectores de la presente invención contienen preferentemente uno o varios elementos que permiten la integración del vector dentro del genoma de la célula hospedera o de la replicación autónoma del vector en la célula independiente del genoma. Para la integración dentro del genoma de la célula hospedera, el vector puede confiar en la secuencia polinucleotídica que codifica para el polipéptido o cualquier otro elemento del vector para la integración dentro del genoma por recombinación homologa o no homologa. Alternativamente, el vector puede contener secuencias nucleotídicas adicionales para dirigir la integración por recombinación homologa dentro del genoma de la célula hospedera en uno o varios eitioe precisos en el o los cromosomas. Para incrementar la probabilidad de integración en un sitio preciso, los elementos integracionales deben contener preferentemente un número suficiente de ácidos nucleicos, tales como 100 a 10,000 pares de bases, preferentemente 400 a 10,000 pares de basee, y lo más preferentemente 800 a 10,000 pares de bases, que tienen un alto grado de identidad con la secuencia objetivo correspondiente para aumentar la probabilidad de recombinación homologa. Los elementos integracionales pueden ser cualquier eecuencia que eea homologa con la eecuencia objetivo en el genoma de la célula hoepedera. Ademáe, los elementoe integracionalee pueden eer eecuencias nucleotídicas de no codificación o de codificación. Por otra parte, el vector puede ser integrado dentro del genoma de la célula hospedera por recombinación no homologa. Para la replicación autónoma, el vector puede comprender además un origen de replicación que hace posible que el vector se replique autónomamente en la célula hospedera en cueetión. El origen de replicación puede eer cualquier replicador pláemido que eea mediador de la replicación autónoma que funcione en una célula. El término "origen de replicación" o "replicador plásmido" es definido en la presente como una secuencia nucleotídica que hace posible que un plásmido o vector se replique in vivo . Los ejemplos de orígenes bacterianos de replicación son los orígenes de replicación de los pláemidoe pBR322, pUC19, pACYC177, y pACYC184 que permiten la replicación en E coli , y pUBllO, pE194, pTA10.60, y pAMßl que permiten la replicación en Bacillue . Loe ejemplos de orígenes de replicación para el uso en una célula hospedera de levadura son el origen de replicación de 2 micrómetros, ARSI, ARS4, la combinación de ARSI y CEN3 , y la combinación de ARS4 y CEN6. Los ejemplos de orígenes de replicación útiles en una célula de hongo filamentoso son AMAl y ANSÍ (Geme et al., 1991, Gen 98: €1-67; Cullen et al., 1987, Nucleic Acide Reeearch 15: 9163-9175; WO 00/24883). El aislamiento del gen AMAl y la construcción de plásmidoe o vectores que comprenden el gen puede ser logrado de acuerdo a loe métodos deecritoe en WO 00/24883. Más de una copia de un polinucleótido de la presente invención puede ser insertada dentro de la célula hospedera para incrementar la producción del producto génico. Un incremento en el número de copias del polinucleótido puede ser obtenido mediante la integración de al menos una copia adicional de la secuencia dentro del genoma de la célula hospedera o mediante la inclusión de un gen marcador seleccionable amplificado con el polinucleótido donde las células que contienen copiae amplificadae del gen marcador eeleccionable , y con esto copias adicionales del polinucleótido, pueden ser seleccionadas mediante cultivo de las célulae en preeencia del agente seleccionable apropiado . Los procedimientos utilizados para ligar los elementos descritos anteriormente para construir los vectores de expresión recombinantes de la presente invención, son bien conocidos para una persona experta en la técnica (ver, por ejemplo, Sambrook et al., 1989, supra).

Células hospederas La presente invención también se refiere a las células hospederas recombinantes, que comprenden un polinucleótido de la presente invención, que son ventajosamente utilizadas en la producción recombinante de los polipéptidos . Un vector que comprende un polinucleótido de la presente invención es introducido dentro de una célula hospedera, de modo que el vector es mantenido como un integrante cromosómico o como un vector extra-cromosómico de auto-replicación como ee deecribe al principio. El término "célula hoepedera" abarca cualquier progenie de una célula progenitora que no sea idéntica a la célula progenitora debido a lae mutacionee que ocurren durante la replicación. La elección de una célula hoepedera, a un alto grado, dependerá del gen que codifica para el polipéptido y su fuente. La célula hoepedera puede eer un microorganiemo unicelular, por ejemplo, un procariote, o un microorganiemo no unicelular, por ejemplo, un eucariote. Los microorganismos unicelulares útiles son células bacterianas tales como bacterias gram positivae que incluyen, pero no eetán limitadae a, una célula de Bacillus, por ejemplo, Bacillue alkalophilus, Bacillue amyloliquefaciene, Bacillue brevie, Bacillue circulane, Bacillue clausii , Bacillue coagulane, Bacillue lautus, Bacillue lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillue etearothermophilue , Bacillue eubtilie, y Bacillue thuringieneie; o una célula de Streptomyces, por ejemplo, Streptomycee lividane y Streptomyces murinus, o bacterias gram negativas talee como E. coli y Pseudomonas sp. En un aepecto preferido, la célula hoepedera bacteriana es una célula de Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus etearothermophilue, o Bacillue e?btilis. En otro aepecto preferido, la célula de Bacillus ee un Bacillus alcalofílico. La introducción de un vector dentro de una célula hoepedera bacteriana puede ser, por ejemplo, efectuada mediante transformación de protoplaetoe (ver, por ejemplo, Chang y Cohén, 1979, Molecular General Oenetice 168: 111-115), utilizando célulae competentee (ver, por ejemplo, Young y Spizizen, 1961, Journal of Bacteriology 81: 823-829, o Dubnau y Davidoff-Abelson, 1971, Journal of Molecular Biology 56: 209-221), electroporación (ver, por ejemplo, Shigekawa y Dower, 1988, Bioteciinigues 6: 742-751), o conjugación (ver, por ejemplo, Koehler y Thorne, 1987, Journal of Bacteriology 169: 5771-5278) . La célula hospedera puede también ser un eucariote, tal como una célula de mamífero, de insecto, de planta, o de hongo . En un aspecto preferido, la célula hospedera es una célula de hongo. "Hongo" como se utiliza en la preeente, incluye los phyla Ascomycota, Basidiomycota, Chytridiomycota, y Zygomycota (como ee define por Hawksworth et al., en, Aineworth and Bisby 's Dictionary of The Fungí , 8a edición, 1995, CAB International, University Prese, Cambridge, UK) así como los Oomycota (como se cita en Hawksworth et al., 1995, supra, página 171) y todos los hongos mitospóricos (Hawkeworth et al., 1995, eupra). En un aepecto más preferido, la célula hospedera fúngica es una célula de levadura. "Levadura" como se utiliza en la presente incluye levadura ascosporogena (Endomycetales) , levadura basidiosporogena, y levaduras que pertenecen a los hongos imperfectos (Blastomycetoe) . Ya que la claeificación de levadura puede cambiar en el futuro, para loe propósitos de esta invención, la levadura será definida como ee describe en Biology and Activities of Yeaet (Skinner, F.A., Paeemore, S.M., y Davenport, R.R., ede, Soc. App. Bacteriol. Sympoeium Series No. 9, 1980). En un aspecto aún más preferido, célula hospedera de levadura es una célula de Candida, Haneenula, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomycee, o Yarrowia . En un aspecto más preferido, la célula hospedera de levadura es una célula de Saccharomycee carlebergeneie , Saccharomycee cerevieiae, Saccharomycee diaetaticue, Saccharomycee douglaeii, Saccharomycee kluyveri, Saccharomycee norbeneie, o Saccharomyces oviformis . En otro aspecto más preferido, la célula hospedera de levadura es una célula de Kluyveromycee lactis . En otro aspecto más preferido, la célula hospedera de levadura es una célula de Yarrowia lipolytica . En otro aspecto máe preferido, la célula hoepedera fúngica es una célula de hongo filamentoso. Los "hongos filamentosos" incluyen todas las formas filamentosas de la subdivieión Eumycota y Oomycota (como se define por Hawksworth et al., 1995, supra). Los hongos filamentosos son en general caracterizados por una pared micelilal compuesta de quitina, celulosa, glucano, quitosano, mañano, y otros polisacáridoe complejos. El desarrollo vegetativo es mediante alargamiento de las hifas y el catabolismo de carbono ee obligadamente aeróbico. En contraste, el crecimiento vegetativo por lae levaduras tales como Saccharomycee cerevieiae es mediante gemación de un tallo unicelular y el catabolismo de carbono puede ser fermentativo . En un aspecto aún más preferido, la célula hospedera de hongo filamentoso ee una célula de Acremonium, Aepergillue, Aureobaeidium, Bjerkandera, Ceriporiopeie, Coprinue, Coriolus, Cryptococcus, Filibaeidium, Fuearium, Humicola, Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Phanerochaete , Phlebia, Piromyces, Pleurotue, Schizophyllum, Talaro ycee, Thermoaecue, Thielavia, Tolypocladium, Trametee, o Trichoderma . En un aspecto más preferido, la célula hospedera de hongo filamentoso es una célula de Aspergillus awamori , Aepergillue fumigatue, Aepergillue foetidue, Aspergillus japonicue, Aepergillue nidulane, Aepergillue ni-ger o Aepergillue oryzae . En otro aspecto más preferido, la célula hoepedera de hongo filamentoso ee una célula de Fuearium bactridioidee, Fuearium cerealie, Fusarium crookwellense, Fuearium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fuearium heteroeporum, Fuearium negundi , Fuearium oxyeporum, Fuearium reticulatum, Fuearium roeeum, Fuearium eambucinum, Fuearium earcochroum, Fuearium eporotrichioidee , Fuearium sulp ureum, Fuearium toruloeum, Fuearium trichothecioidee, o Fuearium venenatum. En otro aspecto más preferido, la célula hospedera de hongo filamentoso es una célula de Bjerkandera adusta, Ceriporiopeie aneirina, Ceriporiopsis aneirina, Ceriporiopsis caregiea, Ceriporiopeie gilveecens, Ceriporiopsis pannocinta, Ceriporiopsis rivulosa, Ceriporiopeis eubrufa, Ceriporiopeie eubvermispora, Coprinus cinereue, Coriolue hirsutus, Humicola ineolens, Humicola lanuginoea, Mucor miehei , Myceliophthora thermophila, Neuroepora crassa, Penicillium purpurogenum, Phanerochaete chryeosporium, Phlebia radiata, Pleurotue eryngii, Thielavia terrestris, Trametes villosa, Trametee vereicolor, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii , Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei , o Trichoderma viride . Las células de hongo pueden ser transformadae mediante un proceeo que involucra la formación de protoplaetos, transformación de los protoplastos, y regeneración de la pared celular de una manera conocida per se . Los procedimientos adecuados para la transformación de células hospederae de Aepergillue y Trichoderma se describen en la Patente Europea EP-238,023 y Yelton et al., 1984, Proceedinge of the National Academy of Sciencee USA 81: 1470-1474. Los métodoe adecuadoe para transformar especies de Fuearium se describen por Malardier et al., 1989, Gen 78: 147-156, y WO 96/00787. Las levaduras pueden ser transformadas utilizando los procedimientos descritoe por Becker y Guarente, en Abeleon, J.N. y Simón, M.I., editores, Guide to Levadura Cenetice y Molecular Biology, Methode in Enzymology, Volumen 194, p. 182-187, Academic Press, Inc., New York; Ito et al., 1983, Journal of Bacteriology 153: 163; y Hinnen et al., 1978, Proceedinge of the National Academy of Sciencee USA 75: 1920.

Métodos de Producción La presente invención también se refiere a los métodos para producir un polipéptido de la presente invención, que comprende: (a) cultivar una célula, que en su forma de tipo silveetre ee capaz de producir el polipéptido, bajo condiciones conducentes a la producción del polipéptido; y (b) la recuperación del polipéptido. En un aepecto preferido, la célula ee del género Thielavia . En un aepecto máe preferido, la célula ee Thielavia terreetrie . La preeente invención también ee refiere a loe métodos para producir un polipéptido de la presente invención, que comprende: (a) cultivar una célula hospedera bajo condiciones conducentes a la producción del polipéptido; y (b) la recuperación del polipéptido. La presente invención también ee refiere a los métodos para producir un polipéptido de la preeente invención, que comprende: (a) cultivar una célula hoepedera bajo condiciones conducentes a la producción del polipéptido, en donde la célula hospedera comprende una secuencia nucleotídica mutante que comprende al menos una mutación en la secuencia de la SEQ ID NO: 1 que codifica para el polipéptido maduro, en donde la secuencia nucleotídica mutante codifica para un polipéptido que comprende o consiete del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2, y (b) la recuperación del polipéptido. En un aepecto preferido, el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2 es de los aminoácidos 18 al 481. En los métodos de producción de la presente invención, las células eon cultivadae en un medio nutritivo adecuado para la producción del polipéptido utilizando métodoe bien conocidoe en la técnica. Por ejemplo, la célula puede eer cultivada mediante cultivo en matraz de agitación, y la fermentación a pequeña eecala o a gran eecala (incluyendo fermentacionee continuas, por lotes, de lote alimentado o en estado sólido) en fermentadoree de laboratorio o induetrialee, realizado en un medio adecuado y bajo condiciones que permiten que el polipéptido sea expresado y/o aielado. El cultivo tiene lugar en un medio nutritivo adecuado que comprende fuentes de carbono y nitrógeno y salee inorgánicae, utilizando procedimientoe conocidoe en la materia. Loe medioe adecuados son disponiblee de proveedoree comerciales o pueden ser preparados de acuerdo a las composiciones publicadas (por ejemplo, en catálogos de the American Type Culture Collection) . Si el polipéptido es secretado hacia el medio nutritivo, el polipéptido puede ser recuperado directamente del medio. Si el polipéptido es no es secretado hacia el medio, éste puede ser recuperado de los lisadoe celulares. Loe polipéptidoe pueden eer detectados utilizando métodos conocidos en la técnica que son específicos para los polipéptidos. Eetos métodos de detección pueden incluir el uso de anticuerpos específicos, la formación de un producto enzimático, o la deeaparición de un eubstrato enzimático.

Por ejemplo, un ensayo enzimático puede ser utilizado para determinar la actividad del polipéptido como se describe en la presente. El polipéptido resultante puede ser recuperado utilizando métodoe conocidoe en la técnica. Por ejemplo, el polipéptido puede ser recuperado del medio nutritivo mediante procedimientos convencionales que incluyen, pero no eetán limitados a, centrifugación, filtración, extracción, secado por rocío, evaporación o precipitación. Los polipéptidos de la presente invención pueden ser purificados mediante una variedad de procedimientos conocidos en la técnica que incluyen, pero no están limitados a, cromatografía (por ejemplo, de intercambio iónico, de afinidad, hidrofóbica, de cromatoenfoque, y de exclusión de tamaño) , procedimientos electroforéticos <por ejemplo, enfoque isoeléctrico preparativo) , solubilidad diferencial (por ejemplo, precipitación con sulfato de amonio) , SDS-PAGE, o extracción (ver, por ejemplo, Protein Purificación, J.-C.

Janson y Lars Ryden, editores, VCH Publishers, New York, 1989) para obtener polipéptidos sustancialmente puros.

Plantas La presente invención también ee refiere a una planta transgénica, parte de planta, o célula vegetal que ha sido traneformada con una eecuencia nucleotídica que codifica para un polipéptido que tiene actividad de celobiohidrolasa de la presente invención para expresar así y producir el polipéptido en cantidades recuperables. El polipéptido puede ser recuperado a partir de la planta o parte de la planta . Alternativamente, la planta o parte de la planta que contiene el polipéptido recombinante puede ser utilizada como tal para mejorar la calidad de un alimento o comida, por ejemplo, mejorar el valor nutricional, la aceptabilidad al paladar, y las propiedades reológicas, o para destruir un factor antinutritivo. La planta transgénica puede ser dicotiledónea (una dicot) o monocotiledónea (una monocot) . Los ejemplos de plantae monocotiledóneae eon paetos, tales como pasto de las praderas (pasto azul, Poa) , pasto de forraje tal como Festuca, Lolium, pasto templado, tal como Agrostis, y cereales, por ejemplo, trigo, avena, centeno, cebada, arroz, sorgo y maíz. Los ejemplos de plantas dicotiledóneas son tabaco, leguminosae, talee como lupino, papa, remolacha azucarera, chícharo, frijol y frijol de eoya, y plantas cruciferas (la familia Braseicaceae) , tal como coliflor, semilla de colea, y organiemo modelo eetrechamente relacionado a Arabidopeie thaliana . Loe ejemplos de partes de plantas son el tallo, callo, hojas, raíz, frutos, semillas, y tubérculoe, así como loe tejidoe individualee que comprenden eetas partes, por ejemplo, la epidermie, el meeófilo, el parénquima, loe tejidoe vasculares, los meristemos. Loe compartimientoe específicos de la célula vegetal, tales como los cloroplastos, apoplastos, mitocondriae, vacuolas, peroxisomae y citoplasma son también consideradoe como una parte de la planta. Ademáe, cualquier célula vegetal, de cualquier origen tisular, es considerada como una parte de una planta. De igual modo, las partes de plantas tales como tejidos específicoe y célulae aieladae para facilitar la utilización de la invención, son también coneideradas como partes de plantas, por ejemplo, embriones, endospermas, aleurona y recubrimientos de eemillae. También ee incluyen dentro del alcance de la preeente invención la progenie de talee plantas, partes de plantas, y células vegetales. La planta transgénica o célula vegetal que expresa un polipéptido de la presente invención puede ser construida de acuerdo con los métodos conocidos en la técnica . En resumen, la planta o célula vegetal ee conetruida mediante la incorporación de una o más construccionee de expreeión que codifican para un polipéptido de la preeente invención dentro del genoma de la planta hoepedera o el genoma del cloroplasto, y la propagación de la planta o célula vegetal modificada, resultante, en una planta transgénica o en una célula vegetal tranegénica. Lae conetrucción de expreeión ee convenientemente una conetrucción de ácido nucleico que comprende un polinucleótido que codifica para un polipéptido de la preeente invención operablemente enlazado con lae eecuenciae reguladorae apropiadas requeridas para la expresión de la secuencia nucleotídica en la planta o en la parte de la planta de elección. Además, la construcción de expresión puede comprender un marcador seleccionable útil para identificar las células hospederas dentro de las cuales ha sido integrada la construcción de expresión, y las secuencias de ADN necesarias para la introducción de la construcción dentro de la planta en cuestión (lo último depende del método de introducción de ADN que va a ser utilizado) . La elección de las eecuenciae reguladoras, tales como las secuencias promotoras y terminadoras y opcionalmente las secuencias de señal o de tránsito es determinada, por ejemplo, con base en cuándo, dónde, y cómo se desea expresar el polipéptido. Por ejemplo, la expresión del gen que codifica para un polipéptido de la presente invención puede ser conetitutiva o inducible, o puede eer eepecífica del desarrollo, de la etapa o del tejido, y el producto génico puede ser dirigido a un tejido específico o parte de planta específica tales como las semillas o las hojas. Las secuencias reguladoras son, por ejemplo, descritas por Tague €8 et al., 1988, Plant Physiology 86: 506. Para la expresión constitutiva, el 35S-CaMV, la ubiquitina 1 de maíz, y el promotor de actina 1 de arroz pueden ser utilizadoe (Franck et al., 1980, Cell 21: 285-294, Chrieteneen et al., 1992, Plant Mo . Biol . 18: 675-689; Zhang et al., 1991, Plant Cell 3: 1155-1165). Loe promotoree específicos de órganos pueden ser, por ejemplo, un promotor proveniente de los tejidos tipo pileta de almacenamiento tales como semillae, tubérculoe de papa y frutas (Edwards & Coruzzi, 1990, Ann. Rev. Genet . 24: 275-303), o tejidos de pileta metabólica tales como merietemos (Ito et al., 1994, Plant Mol . Biol . 24: 863-878), un promotor específico de semilla tal como el promotor de glutelina, prolamina, globulina, o albúmina proveniente del arroz (Wu et al., 1998, Plant y Cell Phyeiology 39: 885-889), un promotor de Vicia faba de la legumina B4 y el gen de la proteína de semilla desconocida de Vicia faba (Conrad et al., 1998, Journal of Plant Phyeiology 152: 708-711), un promotor proveniente de una proteína de cuerpo aceitoso de semilla (Chen et al., 1998, Plant y Cell Phyeiology 39: 935-941), el promotor napA de proteína de almacenamiento proveniente de Braeeica napue, o cualguier otro promotor específico de semilla conocido en la técnica, por ejemplo, como se deecribe en el documento WO 91/14772. Ademáe, el promotor puede ser un promotor específico de hoja tal como promotor rbbce proveniente del arroz o del tomate (Kyozuka et aL, 1993, Plant Phyeiology 102: 991-1000), el promotor del gen de la adenina-metiltransferasa del virue chorella (Mitra y Higgine, 1994, Plant Molecular Biology 26: 85-93), o el promotor del gen aldP de arroz (Kagaya et al., 1995, Molecular and General Genetice 248: 668-674), o un promotor inducible por heridas tal como el promotor pin2 de papa (Xu et al., 1993, Plant Molecular Biology 22: 573-588). De igual modo, el promotor puede ser inducible por tratamientos abióticos tales como temperatura, sequía, o alteraciones en la salinidad o inducido por sustancias exógenamente aplicadas que activan el promotor, por ejemplo, etanol, estrógenos, hormonas vegetales tales como etileno, ácido abscíeico, y ácido giberélico, y metales pesadoe. Un elemento aumentador promotor puede también ser utilizado para lograr una expresión más de un polipéptido de la presente invención en la planta. Por ejemplo, el elemento aumentador promotor puede eer un intrón que es colocado entre el promotor y la eecuencia nucleotídica que codifica para un polipéptido de la presente invención. Por ejemplo, Xu et al., 1993, supra, describe el ueo del primer intrón del gen de la actina 1 de arroz para aumentar la expresión. El gen marcador seleccionable y cualesquiera otras partes de la construcción de expresión pueden ser elegidos de aquellos disponibles en la técnica.

La construcción de ácido nucleico ee incorporada dentro del genoma de la planta de acuerdo a técnicas convencionales conocidas en la materia, incluyendo transformación mediada por Agrobacterium, traneformación mediada por virus, microinyección, bombardeo de partículas, transformación biolística, y electroporación (Gaseer et al., 1990, Science 244: 1293; Potrykus, 1990, Bio/Technology 8: 535; Shimamoto et al., 1989, Nature 338: 274). Actualmente, la transferencia de gen mediada por Agrobacterium tumefaciene es el método de elección para generar dicotiledóneas transgénicas (para una revisión, ver Hooykas y Schilperoort, 1992, Plant Molecular Biology 19: 15-38) y puede ser también utilizada para transformar monocotiledóneas, aunque son frecuentemente utilizados otros métodos de transformación para estae plantae. Actualmente, el método de elección para generar monocotiledóneas transgénicas es el bombardeo de partículas (partículas microscópicae de oro o de tungeteno recubiertae con el ADN traneformante) de la célula embrionaria o embriones en desarrollo (Christou, 1992, Plant Journal 2: 275-281; Shimamoto, 1994, Current Opinión Biotechnology 5: 158-162; Vaeil et al., 1992, Bio/Technology 10: 667-674). Un método alternativo para la traneformación de monocotiledóneae eetá baeado en la traneformación de protoplaetos como se describe por Omirulleh et al., 1993, Plant Molecular Biology 21: 415- 428. Deepuée de la traneformación, loe transformantes que han incorporado la construcción de expresión, son seleccionados y regenerados dentro de plantae completas de acuerdo a métodos bien conocidos en la materia. A menudo el procedimiento de transformación es diseñado para la eliminación selectiva de genes de selección, ya sea durante regeneración o en las eiguientee generaciones mediante el uso, por ejemplo, de co-transformación con dos construcciones de T-ADN separadas o la extirpación específica de sitioe del gen de selección por una recombinasa específica. La presente invención también se refiere a los métodos para producir un polipéptido de la presente invención que comprende: (a) cultivar una planta transgénica o una célula vegetal que comprende un polinucleótido que codifica para un polipéptido que tiene actividad de celobiohidrolasa de la presente invención, bajo condiciones que conducen a la producción del polipéptido; y (b) la recuperación del polipéptido.

Eliminación o Reducción de la Actividad de Celobiohidrolasa La presente invención también se refiere a los métodos para producir un mutante de una célula progenitora, que comprende la fractura o supresión de una secuencia polinucleotídica, o una porción de la misma, que codifica para un polipéptido de la presente invención, que da como resultado que la célula mutante produzca menos del polipéptido que la célula progenitora, cuando se cultiva bajo las mismae condiciones. La célula mutante puede ser construida mediante reducción o eliminación de la expresión de una secuencia nucleotídica que codifica para un polipéptido de la presente invención, utilizando métodos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, insercionee, fracturas, reemplazos, o supreeionee. En un aepecto preferido, la eecuencia nucleotídica ee inactivada. La eecuencia nucleotídica que va a ser modificada o inactivada puede ser, por ejemplo, la región de codificación o una parte de la miema esencial para la actividad, o un elemento regulador requerido para la expresión de la región de codificación. Un ejemplo de tal secuencia reguladora o de control puede ser una secuencia promotora o una parte funcional de la misma, por ejemplo, una parte que es suficiente para afectar la expreeión de la eecuencia nucleotídica. Otrae eecuenciae de control para la poeible modificación incluyen, pero no eetán limitadas a, una secuencia guía, una secuencia de poliadenilación, una eecuencia de propéptido, una eecuencia de péptido de señal, el terminador de la transcripción, y el activador transcripcional . La modificación o la inactivación de la secuencia nucleotídica puede ser realizada al someter la célula progenitora a mutagénesis y seleccionando las células mutantes en las cuales expresión de la secuencia nucleotídica ha sido reducida o eliminada. La mutagénesie, que puede eer eepecífica o aleatoria, puede eer realizada, por ejemplo, mediante el ueo de un agente de mutagenización física o química adecuado, mediante el uso de un oligonucleótido adecuado, o al someter la eecuencia de ADN a mutagénesis generada por PCR. Además, la mutagénesis puede ser realizada mediante el uso de cualquier combinación de estoe agentes de mutagenización. Los ejemploe de un agente de mutagenización física o química adecuados para el presente propósito incluyen radiación ultravioleta (UV) , hidroxilamina, N-metil-N' -nitro-N-nitrosoguanidina (MNNG) , O-metilhidroxilamina, ácido nitroeo, eulfonato de etilmetano (EMS) , bisulfito de sodio, ácido fórmico, y análogos de nucleótidos. Cuando tales agentes son utilizados, la mutagénesis es típicamente realizada al incubar la célula progenitora que va a ser mutagenizada en presencia del agente de mutagenización de elección, bajo condiciones adecuadas, y clasificando y/o seleccionando las células mutantes que muestran expresión reducida o ausencia de expresión del gen. La modificación o la inactivación de la secuencia nucleotídica puede ser lograda mediante introducción, eustitución o eliminación de uno o más nucleótidos en el gen o un elemento regulador requerido para la transcripción o traducción del mismo. Por ejemplo, los nucleótidos pueden ser insertados o eliminados para dar como resultado la introducción de un codón de detención, la eliminación del codón de inicio, o un cambio en la estructura abierta. Tal modificación o inactivación puede ser llevada a cabo mediante mutagénesie dirigida al eitio o mutagéneeie generada por PCR, de acuerdo a los métodos conocidos en la materia . Aunque en principio, la modificación puede ser realizada in vivo, por ejemplo, directamente sobre la célula que expresa la secuencia nucleotídica que va a eer modificada, ee prefiere que la modificación sea realizada in vi tro como se ejemplifica más adelante. Un ejemplo de una manera conveniente para eliminar o reducir la expresión de una secuencia nucleotídica por una célula, está basada en técnicas de reemplazo de genes, supreeión de genes, o perturbación de genes. Por ejemplo, en el método de perturbación o desintegración de genes, una secuencia de ácido nucleico correspondiente a la secuencia nucleotídica endógena es mutagenizada in vi tro para producir una secuencia de ácido nucleico defectuosa que es luego transformada en la célula progenitora para producir un gen defectuoso. Mediante recombinación homologa, la secuencia de ácido nucleico defectuosa reemplaza la secuencia nucleotídica endógena . Puede ser deeeable que la secuencia nucleotídica defectuosa también codifique para un marcador que puede ser utilizado para la selección de transformantes en los cuales ha sido modificada o destruida la secuencia nucleotídica. En un aspecto particularmente preferido, la secuencia nucleotídica es perturbada con un marcador seleccionable, tales como aquellos descritos en la presente. Alternativamente, la modificación o inactivación de la secuencia nucleotídica puede ser realizada mediante técnicas establecidae antieentido o de ARNi utilizando una secuencia complementaria a la secuencia nucleotídica. Más específicamente, la expresión de la secuencia nucleotídica por una célula puede ser reducida o eliminada mediante la introducción de una secuencia complementaria a la secuencia nucleotídica del gen que puede ser transcrito en la célula, y es capaz de hibridarse al ARNm producido en la célula. Bajo condiciones que permiten que la secuencia nucleotídica complementaria antisentido ee hibride al ARNm, la cantidad de proteína traducida ee de este modo reducida o eliminada. La presente invención se refiere además a una célula mutante de una célula progenitora que comprende una perturbación o supresión de una secuencia nucleotídica que codifica para el polipéptido o una secuencia de control de la misma, que da como resultado que la célula mutante produzca menos del polipéptido o nada del polipéptido en comparación a la célula progenitora. Lae célulae mutantes deficientes en el polipéptido creadas aeí eon particularmente útiles como células hospederae para la expresión de polipéptidos homólogos y/o heterólogos. Por lo tanto, la preeente invención ee refiere ademáe a loe métodoe para producir un polipéptido homólogo o heterólogo que comprende: (a) el cultivo de la célula mutante bajo condiciones que conducen a la producción del polipéptido; y (b) la recuperación del polipéptido. El término "polipéptidos heterólogos" es definido en la presente como los polipéptidos que no son nativos para la célula hospedera, la proteína nativa en la cual han eido realizadas las modificaciones para alterar la secuencia nativa, o una proteína nativa cuya expresión es cuantitativamente alterada como resultado de una manipulación de la célula hospedera por técnicas de ácido nucleico recombinantes. En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a un método para producir un producto proteico esencialmente libre de actividad de celobiohidrolasa mediante fermentación de una célula que produce un polipéptido de la presente invención, así como el producto proteico de interés, mediante la adición de una cantidad efectiva de un agente capaz de inhibir la actividad de celobiohidrolasa la caldo de fermentación antes, durante o después de que ha sido completada la fermentación, recuperando el producto de interés del caldo de fermentación y opcionalmente sometiendo el producto recuperado a purificación adicional. En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a un método para producir un producto proteico eeencialmente libre de actividad de celobiohidrolaea mediante el cultivo de la célula bajo condiciones que permiten la expresión del producto, eometiendo el caldo de cultivo reeultante a un tratamiento combinado de pH y temperatura para reducir aeí la actividad de celobiohidrolasa, suetancialmente, y recuperar el producto del caldo de cultivo. Alternativamente, el tratamiento combinado de pH y temperatura puede ser combinado sobre una preparación enzimática recuperada del caldo de cultivo. El tratamiento combinado de pH y tratamiento temperatura puede eer utilizado opcionalmente en combinación con un tratamiento con un inhibidor de celobiohidrolaea. De acuerdo con este aspecto de la invención, es posible remover al menos 60%, preferentemente al menos 75%, más preferentemente al menos 85%, todavía más preferentemente al menos 95%, y lo más preferentemente al menos 99% de la actividad de celobiohidrolasa. La eliminación completa de la actividad de celobiohidrolasa puede ser obtenida mediante el uso de este método. El tratamiento combinado de pH y temperatura es llevado a cabo preferentemente a un pH en el intervalo de 2 a 4 ó 9 a 11, y una temperatura en el intervalo de al menoe 70-808C por un periodo de tiempo euficiente para alcanzar el efecto deeeado, donde típicamente 30 a -60 minutoe eon suficientes . Los métodos utilizados para el cultivo y purificación del producto de interés pueden ser realizados mediante métodos conocidos en la técnica. Los métodos de la presente invención para producir un producto esencialmente libre de celobiohidrolasa es de interés particular en la producción de polipéptidoe eucarióticoe, en particular proteínas fúngicas talee como enzimas . La enzima puede eer seleccionada, por ejemplo, de una enzima amilolítica, enzima lipolítica, enzima proteolítica, enzima celulítica, oxidorreductasa, o enzima que degrada la pared de las células vegetales. Los ejemplos de tales enzimas incluyen una aminopeptidasa, amilasa, amiloglucosidaea, carbohidraea, carboxipeptidaea, catalasa, celulasa, quitinasa, cutinasa, ciclodextrina-glucoeiltraneferaea, deeoxirribonucleasa, esterasa, galactosidaea, beta-galactoeidaea, glucoamilaea, glucosa-oxidaea, glucoeidaea, haloperoxidaea, hemicelulasa, invertasa, isomerasa, lacasa, ligasa, lipasa, liasa, manoeidaea, oxidaea, enzima pectinolítica, peroxidasa, fitaea, fenoloxidaea, polifenoloxidaea, enzima proteolítica, ribonucleaea, transferaea, transglutaminasa, o xilanasa. Las células deficientes en celobiohidrolasa pueden ser también utilizadas para expresar las células heterólogae de interés farmacéutico, tales como hormonas, factoree de crecimiento, receptoree, y eimilaree. Se entenderá que el término "polipéptidoe eucarióticoe" incluyen no eolamente loe polipéptidoe nativoe, sino también aquellos polipéptidoe, por ejemplo, lae enzimas, que han sido modificadoe mediante euetitucionee, eupreeionee o adiciones de aminoácidos, u otras modificaciones tales como para aumentar la actividad, la termoestabilidad, la tolerancia al pH y eimilaree. En un aepecto adicional, la preeente invención ee refiere a un producto proteico eeencialmente libre de actividad de celobiohidrolaea que ee producido mediante un método de la preeente invención.

Composiciones La presente invención también se refiere a lae compoeicionee que comprenden un polipéptido de la presente invención. Preferentemente, las composiciones son enriquecidas en tal polipéptido. El término "enriquecido" indica que la actividad de celobiohidrolaea de la compoeición ha eido incrementada, por ejemplo, con un factor de enriquecimiento de al menoe 1.1. La compoeición puede comprender un polipéptido de la presente invención como el componente enzimático mayor, por ejemplo, una composición de un eolo componente. Alternativamente, la composición puede comprender múltiples actividades enzimáticas, tales como una aminopeptidasa, amilasa, carbohidrasa, carboxipeptidasa, catalaea, celulasa, quitinaea, cutinaea, ciclodextrina-glucosiltransferasa, desoxirribonucleasa, esteraea, alfa-galactoeidasa, beta-galactosidasa, glucoamilasa, alfa-glucosidasa, beta-glucoeidaea, haloperoxidaea, invertaea, lacasa, lipasa, manosidasa, oxidasa, enzima pectinolítica, peptidoglutaminasa, peroxidasa, fitasa, polif noloxidasa, enzima proteolítica, ribonucleasa, transglutaminaea, o xilanasa. La o las enzimas adicionales pueden ser producidas por ejemplo por un microorganismo que pertenece al género Aepergillue , preferentemente Aepergillue aculeatue, Aepergillue awamori , Aepergillue fumigatus, Aepergillue foetidue, Aepergillus japonicus, Aepergillue nidulane, Aepergillue niger, o Aepergillue oryzae; Fuearium, preferentemente Fuearium bactridioidee , Fuearium cerealie, Fuearium crookwellense, Fuearium culmorum, Fuearium graminearum, Fuearium graminum, Fuearium heteroeporum, Fuearium negundi , Fuearium oxyeporum, Fusarium reticulatum, Fuearium roeeum, Fuearium eambucinum, Fuearium sarcochroum, Fusarium sulphureum, Fuearium toruloeeum, Fuearium trichothecioidee , o Fuearium venenatum; Humicola, preferentemente Humicola ineolene o Humicola lanuginoea; o Trichoderma, preferentemente Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii , Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reeeei , o Trichoderma viride . Lae composiciones polipeptídicas pueden ser preparadas de acuerdo con los métodos conocidos en la técnica, y pueden estar en la forma de un líquido o una compoeición anhidra. Por ejemplo, la compoeición del polipéptido puede eetar en la forma de un granulado o un microgranulado. El polipéptido que va a ser incluido en la composición puede ser estabilizado de acuerdo con métodos conocidos en la materia. Los ejemplos se dan más adelante de los usos preferidos de las compoeicionee polipeptídicae de la invención. La dosis de la compoeición del polipéptido de la invención y otras condiciones bajo las cuales se utiliza la composición pueden ser determinadas con base en los métodos conocidos en la técnica.

Usos La preeente invención está también dirigida a los siguientee métodoe para utilizar loe polipéptidoe que tienen actividad de celobiohidrolaea o lae composiciones de la misma .

Degradación de la biomasa a los monosacáridos, disacáridos, y polisacáridos Los polipéptidos que tienen actividad de celobiohidrolasa y lae célulae hospederas de la presente invención pueden ser utilizadas en la producción de monoeacáridoe, disacáridos, y polisacáridos, como materiales de alimentación químicos o de fermentación a partir de la biomasa para la producción de etanoles, pláeticoe u otroe productoe o intermediarioe . Los polipéptidos que tienen actividad de celobiohidrolasa pueden estar en la forma de un caldo de fermentación crudo con o sin las células removidas o en la forma de una preparación enzimática semi-purificada o purificada. Alternativamente, una célula hospedera de la presente invención puede ser utilizada como una fuente del polipéptido en un proceso de fermentación con la biomasa. La biomasa puede incluir, pero no está limitada a, recursos de madera, desechos sólidos municipales, papel de desecho y residuoe de coeechae (ver por ejemplo, Wiselogel et al., 1995, en Handbook on Bioethanol (Charles E. Wyman, editor), pp.105- 118, Taylor y Francis, Washington D.C.; Wyman, 1994, Bioreeource Technology 50: 3-16; Lynd, 1990, Applied Biochemietry and Biotechnology 24/25: 695-719; Mosier et al., 1999, Recent Progreee in Bioconvereion of Lignocelluloeice , in Advancee in Biochemical Engineer ing Biotechnology, T. Scheper, managing editor, Volumen 65, pp.23-40, Springer-Verlag, Nueva York). El polisacárido predominante en la pared celular primaria de la biomasa es la celulosa, el segundo más abundante es la hemicelulosa, y el tercero ee la pectina. La pared celular eecundaria, producida después de que la célula ha dejado de crecer, también contiene polisacáridos y es reforzada a través de lignina polimérica covalentemente reticulada a la hemiceluloea. La celuloea es un homopolímero de anhidrocelobiosa y de este modo un beta- (1, 4) -D-glucano lineal, mientras que lae hemicelulosas incluyen una variedad de compuestos, tales como xilanos, xiloglucanos, arabinoxilanos, y mananos, en estructuras ramificadas complejae con un espectro de sustituyentes. Aunque es en general polimorfa, la celulosa es encontrada en el tejido vegetal principalmente como una matriz crietalina insoluble de cadena de glucano paralelas. Las hemiceluloeae usualmente se enlazan con puentes de hidrógeno a la celulosa, así como a otras hemicelulosae, lo cual ayuda a estabilizar la matriz de la pared celular. Tres clases principales de gluco idrolasas son utilizadas para romper la biomasa celulósica: (1) Las endo-1, 4-beta-glucanasas" o 1,4-beta—D-glucan-4-glucanohidrolasas (EC 3.2.1.4), lae cualee actúan aleatoriamente sobre suetratoe de 1, 4-beta-glucano eolublee e insolubles. (2) Las "exo-1, 4-beta-D-glucanasas" que incluyen las 1, 4-beta-D-glucan-glucohidrolaeae (EC 3.2.1.74), las cuales liberan de D-glucosa a partir de los 1,4-beta-D-glucanoe e hidrolizan la D-celobioea lentamente, y las celobiohidrolasas (1, 4-beta-D-glucan-celobiohidrolasas, EC 3.2.1.91), que liberan la D-celobiosa a partir de los 1,4-beta-glucanoe . (3) Lae "beta-D-glucosidasas" o lae beta-D-glucósido-glucohidrolasae (EC 3.2.1.21), que actúan para liberar lae unidades de D-glucosa a partir de la celobiosa y las celodextrinas solubles, así como una gama de glucósidos. Estas tres clases de enzimas funcionan conjuntamente de manera sinérgica, dando como resultado la descristalización eficiente y la hidrólisie de la celulosa nativa a partir de la biomasa, para producir azúcares reductores . Los polipéptidos que tienen actividad de celobiohidrolasa de la presente invención pueden ser utilizados en conjunto con las enzimas anteriormente anotadas para degradar adicionalmente el componente de celulosa del suetrato de biomaea (ver por ejemplo, Brigham et al, 1995, en Handbook on Bioethanol (Charlee E. Wyman, editor), pp.119-141, Taylor y Francie, Waehington D.C.; Lee, 1997, Journal of Biotechnology 56: 1-24). El etanol puede eer producido mediante degradación enzimática de la biomasa y conversión de los sacáridos liberados a etanol . Este tipo de etanol ee a menudo denominado como bioetanol o biocombuetible. Este puede ser utilizado como un aditivo de combustible o extensor en mezclas de menos de 1% y hasta 100% (un sustituto de combustible) .

Composiciones Detergentes Los polipéptidoe que tienen actividad de celobiohidrolaea de la presente invención pueden ser agregados a y de este modo se vuelven un componente de una composición detergente. La composición detergente de la presente invención puede ser, por ejemplo formulada como una composición detergente para lavandería a mano o a máquina, incluyendo una composición aditiva de lavandería adecuada para el pretratamiento de telas teñidas, y una composición suavizante de telas agregada al enjuague, o ser formulada como una composición detergente para el uso en operaciones de limpieza de superficies duras domésticas, generales o para ser formulada para operaciones de lavado de traetos a mano o a máquina. En un aspecto específico, la presente invención proporciona un aditivo para detergente que comprende la enzima de la invención. El aditivo para detergente aeí como la composición detergente puede comprender una o más de otras enzimas tales como proteasa, lipasa, cutinasa, una amilasa, carbohidrasa, celulasa, pectinasa, mananasa, arabinasa, galactanaea, xilanasa, oxidasa, por ejemplo, una lacasa, y/o peroxidasa . En general, las propiedades de la o las enzimas elegidas debe ser compatible con el detergente, (por ejemplo, pH-óptimo, compatibilidad con otros ingredientes enzimáticos y no enzimáticos, etc.), y la o las enzimas deben estar presentes en cantidades efectivas. Proteasas : Las proteasas adecuadas incluyen aquellas de origen animal, vegetal o microbiano. Se prefiere el origen microbiano. Los mutantes modificados químicamente o manipulados por ingeniería de proteínas, son también incluidos. La proteasa puede ser una proteasa de serina o una metaloproteasa, preferentemente una proteasa microbiana alcalina o una proteasa similar a la tripsina. Los ejemplos de proteasas alcalinas son las subtilieinae, especialmente aquellas derivadas de Bacillue, por ejemplo, la subtilisina Novo, subtilisina Carlsberg, subtilisina 309, subtilisina 147 y subtilisina 168 (descrita en WO 89/06279) . Los ejemplos de proteasas eimilares a la tripsina eon la tripeina (por ejemplo, de origen porcino o bovino) y la proteasa de Fusarium descrita en WO 89/06270 y WO 94/25583. Los ejemplos de proteasas útiles son las variantes descritae en loe documentoe WO 92/19729, WO 98/20115, WO 98/20116, y WO 98/34946, eepecialmente las variantes con suetitucionee en una o más de las siguientee posicionee: 27, 36, 57, 76, 87, 97, 101, 104, 120, 123, 167, 170, 194, 206, 218, 222, 224, 235 y 274. Lae enzimae proteaeae comercialmente dieponiblee, preferidas incluyen Alcalaee", Savinaee*1, Primase101, Duralase", Esperaee", y Kannaee" (Novozymee A/S) , Maxatase"11, Maxacal**, Maxapem11*, Properase*, Purafect", Purafect OxP*, FN2MR, y FNS1® (Genencor International Inc.). Lipasas : Las lipasae adecuadas incluyen aquellas de origen bacteriano o fúngico. Los mutantes químicamente modificados o manipulados por ingeniería de proteínas son incluidos. Los ejemplos de lipasae útilee incluyen lipasas de Humicola (sinónimo Thermomycee) , por ejemplo, de H. lanuginoea { T. lanuginosus) como se describe en las patentes Europeas EP 258 068 y EP 305 216 o de H. ineolene como se describe en WO 96/13580, una lipasa de Peeudomonae, por ejemplo, de P. alcaligenee o P. peeudoalcaligenee (patente Europea EP 218 272), P. cepacia (patente Europea EP 331 376), P. stutzeri (patente Británica GB 1,372,034), P. fluoreecene, Pseudomonas sp . cepa SD 705 (WO 95/06720 y WO 96/27002), P. wisconeineneie (WO 96/12012), una lipasa de Bacillue, por ejemplo, de B. eubtilis (Dartois et al., 1993, Biochemica et Biophyeica Acta , 1131: 253-360), B. etearothermophilue (patente Japonesa JP 64/744992) o B . pumilue (WO 91/16422) . Otros ejemplos son las variantes de lipasa tales como aquellas descritae en loe documentoe WO 92/05249, WO 94/01541, patentee Europeae EP 407 225, EP 260 105, documentoe WO 95/35381, WO 96/00292, WO 95/30744, WO 94/25578, WO 95/14783, WO 95/22615, WO 97/04079 y WO 97/07202. Lae enzimae lipasae comercialmente disponibles, preferidas incluyen Lipolase*11 y Lipolase Ultra11* (Novozymes A/S) . Amilasas : Las amilasas adecuadas (alfa y/o beta) incluyen aquellae de origen bacteriano o fúngico. Son incluidoe los mutantes químicamente modificados o manipulados por ingeniería de proteínas. Las amilaeas incluyen, por ejemplo, alfa-amilasae obtenidae de Bacillue, por ejemplo, una cepa especial de Bacillue licheniformie, descrita con más detalle en la patente Británica GB 1,296,839. Los ejemplos de amilasas útiles son las variantes descritae en loe documentoe WO 94/02597, WO 94/18314, WO 96/23873, y WO 97/43424, especialmente las variantes con sustituciones en una o más de las siguientee poeicionee: 15, 23, 105, 106, 124, 128, 133, 154, 156, 181, 188, 190, 197, 202, 208, 209, 243, 264, 304, 305, 391, 408, y 444. Las amilasas comercialmente disponibles son Duramyl"*, Termamyl"*, Fungamyl"* y BAN"* (Novozymes A/S) , Rapidase"* y Purastar"* (Genencor International Inc.). Celulasae: Las celulasae adecuadas incluyen aquellas de origen bacteriano o fúngico. Se incluyen los mutantes modificados químicamente o manipulados por ingeniería de proteínas. Las celulasas adecuadas incluyen las celulasae provenientes de los géneros Bacillue, Peeudomonae, Humicola, Fuearium, Thielavia, Acremonium, por ejemplo, las celulasae fúngicas producidas a partir de Humicola ineolene, Myceliophthora thermophila y Fuearium oxysporu-t? descritas en las Patentee de los Estados Unidos Nos. 4,435,307, 5,648,263, 5,691,178, y 5,776,757 y en el documento WO 89/09259. Las celulaeae eepecialmente adecuadae eon las celulasas alcalinas o neutras que tienen beneficios de cuidado del color. Los ejemplos de tales celulasas son celulasas descritas en los documentos EP 0 495 257, EP 0 531 372, WO 96/11262, WO 96/29397, WO 98/08940. Otros ejemplos son las variantes de celulasa tales como aquellas descritas en los documentos WO 94/07998, EP 0 531 315, Patente de loe Estados Unidos No. 5,457,046, Patente de los Estados Unidos No. 5,686,593, Patente de los Estados Unidos No. 5,763,254, WO 95/24471, WO 98/12307 y PCT/DK98/0029 . Las celulasae comercialmente disponibles incluyen Celluzyme"*, y Carezyme"* (Novozymes A/S) , Clazinase"*, y Puradax HA** (Genencor International Inc.), y KAC-dOOÍB)"* (Kao Corporation) . Peroxidasas/Oxidasas : Las peroxidasas/oxidasas adecuadas incluyen aquellas de origen vegetal, bacterial o fúngico. Los mutantes químicamente modificados o manipulados por ingeniería de proteínas son incluidos. Los ejemplos de peroxidasas útiles incluyen las peroxidasas de Coprinus, por ejemplo, de C. cinereus, y variantes de las mismas, tales como aquellas deecritae en WO 93/24618, WO 95/10602, y WO 98/15257. Una peroxidaea comercialmente disponible incluye Guardzyme** (Novozymes A/S) . La o las enzimas detergentes pueden ser incluidas en una composición detergente mediante la adición de aditivos separados que contienen una o más enzimas, o por la adición de un aditivo combinado que contiene todas estas enzimas. Un aditivo para detergente de la invención, por ejemplo, un aditivo separado o un aditivo combinado, pueden ser formulados, por ejemplo, como un granulado, líquido, suspeneión, etc. Las formulaciones de aditivos para detergente preferidas son granulados, en particular, granuladoe que no forman polvoe, líquidoe, en particular líquidos estabilizadoe o suepeneiones . Los granulados que no producen polvos, pueden ser producidos, por ejemplo, como se describe en las Patentes de los Estados Unidos Noe. 4,106,991 y 4,661,452 y pueden ser opcionalmente recubiertos mediante métodos conocidos en la materia. Los ejemplos de materiales de recubrimiento cerosos eon los productos de poli (óxido de etileno) (polietilenglicol, PEG) con pesoe molaree medioe de 1000 a 20000; nonilfenoloe etoxiladoe que tiene de 16 a 50 unidades óxido de etileno; los alcoholes grasos etoxilados en los cuales el alcohol contiene de 12 a 20 átomoe de carbono y en los cuales exieten 15 a 80 unidades óxido de etileno; alcoholee grasos; ácidos grasoe; y mono- di- y triglicéridoe de ácidoe grasos. Los ejemplos de materiales de recubrimiento formadores de película, adecuados para la aplicación mediante técnicas en lecho fluido ee dan en la patente Británica GB 1483591. Lae preparacionee de enzimae líquidas pueden, por ejemplo, ser estabilizadae mediante la adición de un poliol tal como propilenglicol, un azúcar o alcohol de azúcar, ácido láctico o ácido bórico, de acuerdo a los métodos establecidos. Las enzimas protegidas pueden ser preparadas de acuerdo al método descrito en la patente Europea EP 238,216. La composición detergente de la invención puede estar en cualquier forma conveniente, por ejemplo, una barra, una tableta, un polvo, un granulo, una pasta o un líquido. Un detergente líquido puede ser acuoso, conteniendo típicamente hasta 70% de agua y 0-30% de solvente orgánico, o no acuoso.

La compoeición detergente comprende uno o máe surfactantes, que pueden eer no iónicoe, incluyendo semi-polaree y/o aniónicoe y/o catiónicos y/o anfotéricos. Los surfactantee están típicamente presentes a un nivel de 0.1% a 60% en peso. Cuando se incluye en éste, el detergente contendrá usualmente de aproximadamente 1% a aproximadamente 40% de un surfactante aniónico tal como el alquilbenceneulfonato lineal, alfa-olefineulfonato, alquil-eulfato (eulfato de alcohol graeo) , etoxieulfato de alcohol, alcansulfonato secundario, éster metílico del ácido alfa-sulfo-graso, ácido alquil- o alquenilsuccínico, o jabón. Cuando ee incluye en éste, el detergente contendrá usualmente de aproximadamente 0.2% a aproximadamente 40% de un eurfactante no iónico tal como etoxilato de alcohol, etoxilato de nonilfenol, alquilpoliglucósido, alquildimetilaminoóxido, monoetanolamida de ácido graso etoxilado, monoetanolamida de ácido graso, amida de ácido polihidroxi-alquil-graso, o derivadoe de N-acil-N-alquilo de glucoeamina ( "glucamidae" ) . El detergente puede contener de 0-65% de un aditivo de detergente o agente formador de complejoe tales como zeolita, difosfato, trifosfato, foefonato, carbonato, citrato, ácido nitrilotriacético, ácido etilendiaminotetraacético, ácido dietilentriaminopentaacético, ácido alquil- o alquenileuccínico, silicatos eolublee, o eilicatoe en capae (por ejemplo, SKS-6 de Hoechst) . El detergente puede comprender uno o más polímeros . Los ejemplos son carboximetilceluloea, poli (vinilpirrolidona) , poli (etilenglicol) , poli (alcohol vinílico), poli (vinilpiridin-N-óxido) , poli (vinilimidazol) , policarboxilatoe tales como poliacrilatos, copolímeros de ácido maleico/acrílico, y copolímeros de metacrilato de laurilo/ácido acrílico. El detergente puede contener un sistema blanqueador que puede comprender una fuente de H202, tal como perborato o percarbonato, que puede ser combinado con un activador de blanqueo formador de perácido, tal como tetraacetiletilendiamina o nonanoiloxibencensulfonato. Alternativamente, el eietema blanqueador puede comprenden peroxiácidoe de, por ejemplo, del tipo amida, imida, o eulfona. La o las enzimas de la composición detergente de la invención pueden ser estabilizadae utilizando agentes estabilizadores convencionales, por ejemplo, un poliol tal como propilenglicol o glicerol, un azúcar o alcohol de azúcar, ácido láctico, ácido bórico, o derivado de ácido bórico, por ejemplo, un éster de borato aromático, o un derivado de ácido fenilborónico tal como el ácido 4- formilfenilborónico, y la composición puede ser formulada como se describe, por ejemplo, en los documentos WO 92/19709 y WO 92/19708. El detergente puede también contener otros ingredientes detergentes convencionales tales como, por ejemplo, acondicionadoree de telae que incluyen arcillas, reforzadores de espuma, supresores de jabonadura, agentes anti-corrosión, agentes suspensores de suciedad, agentes anti-redeposición de suciedad, colorantes, bactericidae, abrillantadores ópticos, hidrótropos, inhibidores del manchado o perfumes . En las composiciones detergentes cualquier enzima, en particular la enzima de la invención, puede ser agregada en una cantidad correspondiente a 0.01-100 mg de proteína enzimática por litro de licor de lavado, preferentemente 0.05-5 mg de proteína enzimática por litro de licor de lavador, en particular 0.1-1 mg de proteína enzimática por litro de licor de lavado. La enzima de la invención puede ser incorporada adicionalmente en las formulaciones detergentes descritas en WO 97/07202, la cual se incorpora por referencia en la presente.

Otros usos Los polipéptidos que tienen una actividad de celobiohidrolasa de la presente invención pueden también ser utilizados en combinación con otras glucohidrolasas y enzimas relacionadas, como se describe en la presente, en el tratamiento de materiales textiles tales como agentes de biopulido y para reducir la formación de pelusa, de borra, modificación de la textura, y lavado con piedras (N. K. Lange, en P. Suominen, T. Reinikainen (Eds.), Trichoderma reesei Cellulases and Other Hydrolaees , Foundation for Biotechnical and Industrial Fermentation Reeearch, Heleinki, 1993, pp . 263-272). Ademáe, loe polipéptidoe descritos pueden ser también utilizados en combinación con otras glucohidrolasae y enzimas relacionadas, como se describe en la presente, en el procesamiento de madera para la formación de biopulpa o de descortezado, fabricación de papel para la modificación de fibras, blanqueo y reducción de costos de energía por refinación, tratamiento de agua blanca, importante para el reciclamiento de agua de desecho, reciclamiento de fibras de lignocelulosa tales como el procesamiento de desentintado y de fibras secundarias, y la utilización de residuos de madera (S.D, Mansfield y A.R. Esteghlalian en S.D, Mansfield y J.N. Saddler (Eds.), Appl i ca tions of Enzimas to Lignocell ul oeice, ACS Symposium Seriee 855, Waehington, D.C., 2003, pp . 2-29).

Péptido de Señal La preeente invención también ee refiere a las construccionee de ácido nucleico que comprenden un gen que codifica para una proteína operablemente enlazado a una eecuencia nucleotídica que codifica para un péptido de eeñal que comprende o que consiste de aminoácidos 1 al 17 de la SEQ ID No : 2 , en donde el gen es extraño para la secuencia nucleotídica. En un aepecto preferido, la eecuencia nucleotídica comprende loe nucleótidoe 1 al 51 de la SEQ ID No: 1. En otro aspecto preferido, la secuencia nucleotídica consiste de los nucleótidos 1 al 51 de la SEQ ID No : 1. La presente invención también se refiere a los vectores de expresión recombinantes y a las células hospederae recombinantee que comprende tales construcciones de ácido nucleico. La presente invención también se refiere a métodos para producir una proteína que comprende (a) el cultivo de tal célula hospedera recombinante bajo condiciones adecuadas para la producción de la proteína; y (b) la recuperación de la proteína. La proteína puede ser nativa o heteróloga para una célula hospedera. El término "proteína" no se entiende en la presente que ee refiera a una longitud eepecífica del producto codificado y, por lo tanto, abarca los péptidos, oligopéptidos, y proteínas. El término "proteína" también abarca dos o más polipéptidos combinadoe para formar el producto codificado. Lae proteínas también incluyen polipéptidos híbridos que comprenden una combinación de secuencias polipeptídicae parcialee o completas obtenidas a partir de al menos doe diferentee proteínae, en donde una o más pueden ser heterólogas o nativas para la célula hospedera. Las proteínas incluyen ademáe las variaciones alélicas de origen natural y manipuladas por ingeniería genética de las proteínae anteriormente mencionadas, y proteínas híbridas. Preferentemente, la proteína es una hormona o una variante de la misma, enzima, receptor o porción del mismo, anticuerpo o porción del mismo, o reportero. En un aspecto más preferido, la proteína es una oxidorreductasa, transferasa, hidrolasa, liasa, isomeraea, o ligaea. En un aepecto aún máe preferido, la proteína ee una aminopeptidasa, amilasa, carbohidrasa, carboxipeptidasa, catalasa, celulasa, quitinaea, cutinasa, ciclodextrina-glucosiltransferasa, desoxirribonucleasa, eeterasa, alfa-galactosidasa, beta-galactosidasa, glucoamilasa, alfa-glucosidasa, beta-glucoeidaea, invertaea, lacasa, otra lipasa, manosidasa, mutanaea, oxidaea, enzima pectinolítica, peroxidaea, fi aea, polifenoloxidaea, enzima proteolítica, ribonucleasa, transglutaminaea o xilanasa. El gen puede eer obtenido a partir de cualquier fuente procariótica, eucariótica, u otra fuente. La preeente invención ee deecrita además por los siguientes ejemplos, los cuales no deben eer coneideradoe como limitantes del alcance de la invención.

Ejemplos Materiales Los productoe químicoe utilizadoe como amortiguadoree y euetratoe fueron productoe comercialee de al menoe grado reactivo. Loe geles de SDS-PAGE, el amortiguador de carga, y el amortiguador de corrida fueron de Invitrogen/Novex (Carisbad, CA) . La tripsina modificada grado secuenciamiento fue de Princeton Separations (Aldelphia, NJ) . Las tinciones de proteína con azul de comasie G250 de BioSafe fueron de BioRad Laboratories (Hercules, CA) .

Cepas Se utilizó la cepa Jal250 de Aepergil l us oryzae (WO 99/61651) para la expresión del polipéptido de Thi el avia terree trie que tiene actividad de celobiohidrolaea. Thi elavia terree trie NRRL cepa 8126 fue utilizada como la fuente del gen para la proteína de la familia 6A.

Medios Placae de PDA estuvieron compuestas por litro de 39 gramos de agar de dextrosa de papa. El medio NNCYP estuvo compuesto por litro de 5.0 g de nitrato de amonio, 0.5 g de sulfato de magnesio heptahidratado, 0.3 g of cloruro de calcio, 2.5 g de ácido cítrico, 1,0 g de Bacto Peptona, 5.0 g de extracto de levadura, 1 ml de solución de metales en traza COVE y suficiente K2HP04 para lograr un pH final de aproximadamente 5.4. El medio NNCYPmod estuvo compuesto por litro de 1.0 g de cloruro de sodio, 5.0 g de nitrato de amonio, 0.2 g de sulfato de magnesio heptahidratado, 0.2 g de cloruro de calcio, 2.0 g de ácido cítrico, 1.0 g de Bacto Peptone, 5.0 g de extracto de levadura, 1 ml de solución de metales en traza COVE, y suficiente K2HP04 para lograr el pH final de aproximadamente 5.4. La solución de metalee en trazae de COVE estuvo compuesta por litro de 0.04 g of Na2BO7«10H2O, 0.4 g de CuS0 »5H20, 1.2 g de FeS04«7H20, 0.7 g de MnS0«H20, 0.8 g de Na2Mo02«2H20, y 10 g de ZnS04«7H20. Las placas de LB estuvieron compuestae por litro de 10 g de triptona, 5 g de extracto de levadura, 5 g de cloruro de sodio, y 15 g de Bacto Agar. El medio MDU2BP estuvo compuesto por litro de 45 g de maltoea, 1 g de eulfato de magneeio heptahidratado, 1 g de cloruro de eodio, 2 g de K2HS0 , 12 g de KH2P0 , 2 g de urea, y 500 µl de metales en trazas AMG; el pH fue ajuetado a 5.0 y luego se estilizó por filtración con una unidad de filtración de 0.22 µm. Los metales en trazas AMG estuvieron compuestos por litro de 14.3 g de ZnS0 »7H20, 2.5 g de CuS04»5H20, 0.5 g de NiCl2»6H20, 13.8 g de FeS0»7H20, 8.5 g de MnS04»7H20, y 3 g de ácido cítrico. El medio SOC estuvo compueeto de 2% triptona, 0.5% de extracto de levadura, cloruro de sodio 10 mM, cloruro de potasio 2.5 mM, cloruro de magnesio 10 mM y sulfato de magnesio 10 mM; se esterilizó mediante calentamiento en autoclave y luego se esterilizó por filtración y ee agregó a glucoea 20 mM. El medio de congelamiento estuvo compuesto de 60% de SOC y 40% de glicerol. Las placas del medio 2X YT estuvo compuesto por litro de 16 g de triptona, 10 g de extracto de levadura, 5 g de cloruro de sodio, y 15 g de Bacto agar, y se esterilizó mediante autoclave. El medio YP estuvo compuesto por litro de 10 g de extracto de levadura y 20 g de Bactopeptona (Difco) . El medio inductor de celulasa (CIM) estuvo compuesto por litro de 20 g de celulosa, 10 g de sólidoe de infusión de maíz, 1.45 g de (NH4)2S04, 2.08 g de KH2P04, 0.28 g de CaCl2, 0.42 g de MgS0 «7H20, y 0.42 ml de solución de metales en trazas . La solución de metales en trazas estuvo compuesta por litro de 216 g de FeCl3«6H20, 58 g de ZnS0 «7H20, 27 g of MnS0 »H20, 10 g de CuS04«5H20, 2.4 g de H3B03, y 336 g de ácido cítrico .

Ejemplo 1: Secuenciamiento del péptido mediante espectrometría de masa en tándem de un polipéptido que codifica para una celobiohidrolasa de la Familia 6 proveniente de Thielavia terreetris NRRL 8126 Tres tapones de agarosa provenientes de una placa fresca de Thielavia terreetrie NRRL 8126 desarrollada sobre PDA se inocularon dentro de 100 ml de medio NNCYP suplementado con 1.5% de glucosa y se incubó por 25 horas a 42°C y 200 rpm sobre un agitador orbital. Se utilizaron cincuenta ml de este cultivo para inocular 1.8 litros del medio NNCYP euplementado con 0.4% de glucosa y 52 g de celulosa en polvo por litro y se incubó a 42°C. El pH fue controlado 5.0 por la adición de hidróxido de amonio al 15% o ácido fosfórico 5 N como fuera necesario. Las fermentaciones fueron corridas a 42°C con oxígeno disuelto mínimo al 25% a 1.0 WM del flujo de aire y una agitación de 1100 rpm. El medio de alimentación fue distribuido dentro de un recipiente de fermentación de 2 litros a las 0 horas, a una velocidad de alimentación de 6.0 -8.0 g/hora por 120 horas. Los cultivos combinados fueron centrifugados a 3000 x g por 10 minutos y el sobrenadante fue filtrado a través de una unidad de filtración desechable con un prefiltro de fibra de vidrio (Nalgene, Rochester NY) . El filtrado fue enfriado a 4°C para almacenamiento. Una alícuota de 0.3 ml del filtrado fue precipitada con ácido tricloroacético al 10% (TCA) -80% de acetona por 20 minutos sobre hielo. La suspensión fue centrifugada por 10 minutos a 13,000 x g. El sobrenadante fue removido y la pella de proteína remanente fue enjuagada con acetona. La pella de proteína fue disuelta en 30 µl de dodecil-sulfato de litio IX (LDS) , amortiguador de carga de SDS-PAGE con ditiotreitol 50 mM (DTT) y se calentó a 8B°C por 10 minutos. Una muestra de 15 µl fue separada mediante SDS-PAGE utilizando un gel en gradiente de 7 cm de 4-12% de NuPAGE Bis-Tris SDS-PAGE y amortiguador de corrida de ácido 2-(N-morfolino) etaneulfónico (MES). El SDS-PAGE fue corrido bajo condicionee reductoras de acuerdo al protocolo recomendado por el fabricante (Invitrogen, Carisbad, CA) . El gel fue removido del cásete y enjuagado 3 veces con agua desionizada por al menos 5 minutos cada vez y teñido con tinción de comasie Bio-Safe (BioRad Laboratories, Herculee, CA) por 1 hora seguido por el desteñido con agua doblemente destilada por máe de 30 minutoe. Lae bandae de proteína observadas a aproximadamente a 66 kDa y 73 kDa fueron extirpadas y reducidas con 50 µl de DTT 10 mM en bicarbonato de amonio 100 mM por 30 minutos. Deepuée de la reducción, lae piezae de gel fueron alquiladae con 50 µl de yodoacetamida 55 mM, en bicarbonato de amonio 100 mM por 20 minutos. Las piezas de gel secas se dejaron rehidratar en una solución de digestión con tripeina (6 ng/µl de tripeina grado eecuenciamiento en bicarbonato de amonio 50 mM) por 30 minutoe a temperatura ambiente, eeguido por una digeetión de 8 horas a 40fiC. Cada uno de los pasos de reacción descritos fue seguido por numerosos lavados y pre-lavados con las eolucionee deseadas . Cincuenta µl de acetonitrilo se utilizaron para deshidratar las piezas de gel entre las reacciones y éstae fueron eecadae al aire entre loe pasos. Los péptidos fueron extraídoe doe veces con ácido fórmico al 1%/acetonitrilo al 2% en grado agua HPLC por 30 minutos. Las solucionee de extracción de péptidoe fueron traneferidae a una placa de microtitulación de 96 pozoe tipo PCR que había sido enfriada a 10-15°C. Las placas de microtitulación que contenían las soluciones peptídicas recuperadas fueron selladae para prevenir la evaporación y almacenadas a 4°C haeta que pudo ser realizado el análisis de espectrometría de masa. Para el secuenciamiento de péptidos de novo mediante espectrometría de masa en tándem, se utilizó un Q- Tof micro"*, un espectrómetro de masa de tiempo de vuelo cuadrupolar, ortogonal híbrido (Waters Micromase® MS Technologiee, Milford, MA) para el análisis de LC/MS/MS. El Q-Tof micro"* fue ajustado con un capilar Ultímate"* y el sietema de HPLC de nano-flujo que había eido acoplado con un micro automueetrador FAMOS y un dispositivo de cambio de columna Switchos II (LCPackinge, San Francisco) para concentrar y desalar las muestras . Las muestras fueron cargadas sobre una columna de protección (300 µm ID X 5 cm, C18 pepmap) ajustada en el bucle de inyección y lavada con 0.1% de ácido fórmico en agua a 40 µl/minuto por 2 minutos utilizando la bomba Switchos II. Los péptidos fueron separados sobre una columna capilar fusionada de nanoflujo de 75 µm de diámetro interno x 15 cm, C18, 3 µm, de 100 Á PepMap"* (LC Packings, San Francisco) a una velocidad de flujo de 175 ni/minuto a partir de un flujo dividido de 175 µl/minuto utilizando un calibrador NAN-75 (Dionex, Sunnyvale, CA) . Un gradiente de elusión por paso de 5% a 80% de acetonitrilo en 0.1% de ácido fórmico se aplicó en un intervalo de 45 minutos. El eluyente de la columna fue monitorizado a 215 nm e introducido dentro del Q-Tof micro"* a través de una fuente de iones de electrorrocío ajustada con la interfaz de nanorrocío. El Q-Tof micro"* es completamente controlado por microprocesador utilizando el software Maselynx"* vereión 3.5 (Watere Micromaee® MS Technologies, Milford, MA) . Fueron adquiridos los datos en el modo de exploración de supervisión y a partir de un intervalo de masa de m/z 400 a 1990 con loe criterioe de cambio para MS hasta MS/MS para incluir una intensidad de iones mayor de 10.0 cuentas por segundo y estados de carga de +2, +3, y +4. Los espectroe del análieie de hasta 4 especies co-eluyentes con un tiempo de exploración de 1.9 eegundoe y tiempo inter-exploración de 0.1 segundos, pudieron ser obtenidos. Un voltaje cónico de 65 voltios fue típicamente utilizado y la energía de colisión fue programada para ser variada de acuerdo al estado de masa y de carga del péptido de elusión, y en el intervalo de 10-60 voltios. Los espectros adquiridos fueron combinados, suavizados y centrados de una manera automática y se generó una lista de picos. Esta lista de picos fue buscada contra bases de datos públicas y privadas, seleccionadae utilizando el eoftware Protein Lynx"* de Global Server 1.1 (Watere Micromass® MS Technologies, Milford, MA) . Los resultados provenientes de las búequedae de ProteinLynx"* fueron evaluadoe y lae proteínas no identificadas fueron analizadas posteriormente mediante la evaluación de los espectros de MS/MS de cada ion de interés y la secuencia de novo fue determinada mediante identificación de las seriee de iones y, y b y las diferencias de masa concordantes al aminoácido apropiado. Las secuencias peptídicas obtenidas del eecuenciamiento de novo mediante eepectrometría de masa, fueron obtenidas de varios iones múltiplemente cargados para la banda de gel del polipéptido de aproximadamente 73 kDa. Un ion peptídico tríptico doblemente cargado de 574.25 m/z de la secuencia fue determinado como Val-Pro-Ser- [Phe o Met oxidado] -Gln-Trp- [lie o Leu] -Asp-Arg (aminoácidos 163 al 171 de la SEQ ID No: 2). Un segundo ion peptídico tríptico doblemente cargado de 982.42 fue determinado como Gly-Ala-Aen-Pro-Pro-Tyr-Ala-Gly- [lie o Leu] -[Phe o Met oxidado] -Val-Val-Tyr-Aep- [Leu o lie] -Pro-Asp-Arg (aminoácidos 193 al 210 de la SEQ ID No: 2) . Fue también digerida en gel una banda de proteína de 60 kDA, con tripsina, y los péptidos resultantes fueron recuperados. Un ion peptídico doblemente cargado de 1159.02 fue eecuenciado de novo y se determinó que era [lie o Leu] -[lie o Leu] -[Phe o Met oxidado] -Val- [lie o Leu] -Glu-Pro-Asp-Ser- [Leu o lie] -Ala-Asn-Met-Val-Thr-Asn- [Leu o lie] -Asn-Val-Ala-Lys (aminoácidos 250 al 270 de la SEQ ID No: 2) .

Ejemplo 2: Construcción de biblioteca de cADNf de marcadores de secuencia expresados (EST) Una alícuota de dos ml proveniente de un cultivo líquido de 24 horas (50 ml de NNCYPmod más 1% de glucosa en un matraz de 250 ml, 45aC, 200 rpm) de Thielavia terreetrie NRRL 8126 se utilizó para eembrar un matraz de 500 ml que contenía 100 ml de medio NNCYPmod euplementado con 2% de Sigmacell-20. El cultivo fue incubado a 45ßC, 200 rpm por 3 díae. Loe micelioe fueron cosechados mediante filtración a travée de un embudo Buchner con un prefiltro de fibra de vidrio (Nalgene, Rocheeter NY) , lavado dos veces con Tris-HCl 10 M - EDTA 1 mM, pH 8 (TE) , y congelados rápidamente en nitrógeno líquido. El ARN total fue aislado utilizando el siguiente método. Los micelios congelados de Thielavia terreetrie NRRL 8126 fueron triturados en un molino de café eléctrico. El material triturado fue mezclado 1:1 v/v con 20 ml de Fenazol (Ambion, Inc., Austin, TX) en un tubo Falcon de 50 ml . Una vez que los micelios fueron suspendidoe, éetoe fueron extraídoe con cloroformo y tres veces con una mezcla de fenol-cloroformo-alcohol isoamílico 25:24:1 v/v/v. A partir de la fase acuosa resultante, el ARN fue precipitado mediante la adición de 1/10 en el volumen de acetato de sodio 3 M, pH 5.2 y 1.25 volúmenes de ieopropanol. El ARN precipitado fue recuperado mediante centrifugación a 12,000 x g por 30 minutos a 4°C. La pella final fue lavada con etanol frío al 70%, secada al aire, y resuependida en 500 ml de agua tratada con dietilpirocarbonato (DEPC-agua) . La calidad y la cantidad del ARN purificado fue evaluada con un Bioanalizador Agilent 2100 (Agilent Technologiee, Inc., Palo Alto, CA) . El mARN poliadenilado fue aislado a partir de 360 µg del ARN total con la ayuda del equipo Poli (A) Purist Magnetic Kit (Ambion, Inc., Austin, TX) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Para crear la biblioteca de cADN, se empleó el equipo cloneMiner"* (Invitrogen, Carisbad, CA) para construir una biblioteca direccional que no requiere el uso de clonación con enzimae de reetricción, con lo cual se reduce el numero de clones quiméricos y la desviación de tamaño. Para aeegurar la eínteeis exitosa del cADN, se realizaron dos reacciones en paralelo con dos diferentes concentraciones de mRNA (2.2 y 4.4 µg de poli (A) + mRNA). Las muestras de mRNA fueron mezcladas con un cebador de Biotina-attB2-01igo (dt) (CloneMiner™ Kit, Invitrogen, Carlebad, CA) , un amortiguador de primera hebra IX (Invitrogen, Carisbad, CA) , 2 µl de ditiotreitol (DTT) 0.1 M, mezcla 10 mM de dATP, dTTP, dGTP, y dCTP, y agua hasta un volumen final de 18 y 16 µl, respectivamente. Las mezclas de reacción fueron mezcladas cuidadosamente y luego se agregaron 2 y 4 µl de transcriptaea inversa Superecript"* y ee incubaron a 45°C por 60 minutoe para sintetizar la primera hebra complementaria. Para la síntesis de segunda hebra, a cada reacción de primera hebra se agregaron 30 µl del amortiguador de segunda hebra 5X (Invitrogen, Carisbad, CA) , 3 µl de una mezcla 10 mM de dATP, dTTP, dGTP, y dCTP, 10 unidades de la ADN-ligasa de E. coli , 40 unidades de la ADN-polimeraea I de E. coli , y 2 unidades de la ARNaea H de E. coli , en un volumen total de 150 µl. Lae mezclae fueron luego incubadas a 16aC por dos horas. Despuée de la incubación de doe horae ee agregaron 2 µl de la AND-polimerasa T4 a cada reacción y se incubó a 16SC por 5 minutos para crear un cADN de extremo romo. Las reacciones de cADN fueron extraídas con una mezcla de fenol-cloroformo-isoamílico 25:24:1 v/v/v, y precipitadas en presencia de 20 µg de glucógeno, 120 µl de acetato de amonio 5 M, y 660 µl de etanol. Después de la centrifugación a 12,000 x g por 30 minutos a 4°C, los botones de cADN fueron lavados con etanol frío al 70%, secados a vacío por 2-3 minutos, y resuspendidos en 18 µl de DEPC-agua. A cada muestra de cADN resuspendida, se agregaron 10 µl del amortiguador adaptador 5X, 10 µg del adaptador de attBl (provisto con el equipo; la secuencia de doble hebra mostrada más adelante), 7 µl de DTT 0.1 M, y 5 unidades de la ADN ligasa T4. 5 ' -TCGTCGGGGACAACTTTGTACAAAAAAGTTGG-3 ' (SEQ ID No: 3) 3'-CCCCTGTTGAAACATGTTTTTTCAACCp-5 ' (SEQ ID No : 4) Lae reaccionee de ligadura fueron incubadae toda la noche a 16°C. Loe adaptadoree en exceeo fueron removidos mediante cromatografía de exclusión de tamaño en 1 ml de la resina Sphacryl"* S-500 HR (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) . Las fracciones de la columna fueron recolectadas de acuerdo a las instruccionee del equipo, y las fracciones 3 a la 14 fueron analizadas con un Bioanalizador Agilent para determinar la fracción a la cual los adaptadores attBl comenzaron a eluir. Este análisis mostró que los adaptadores comenzaron a eluir alrededor de la fracción 10 u 11. Para la primera biblioteca, las fraccionee 6 a la 11 fueron combinadae y para la eegunda biblioteca, ee combinaron lae fraccionee 4-11. La clonación del cADN fue realizada mediante recombinación de ADN homologa de acuerdo al protocolo Gateway Syetem protocol (Invitrogen, Carisbad, CA) utilizando BP Clonase"* (Invitrogen, Carisbad, CA) como la recombinasa. Cada reacción de recombinación con BP Clonase"* contenía aproximadamente 70 ng del cADN flanqueado por attB, 250 ng de pDONR"*222, 2 µl del amortiguador 5X BP Clonase"*, 2 µl de TE, y 3 µl de BP Clonase"*. Las reaccionee de recombinación fueron incubadae a 25°C toda la noche. Lae reacciones de recombinación de BP inactivadas por calor fueron divididas por 6 alícuotas y sometidas a electroporesie dentro de celdae ElectroMax"* de DH10B (Invitrogen, Carlebad, CA) eobre un puleador BioRad Gen Pulser II (BioRad, Hercules, CA) con los siguientes parámetros: voltaje: 2.0 kV, Resistencia: 200 O Capacidad 25 µF. Las células sometidas a electroporesie fueron reeuependidae en 1 ml de medio SOC e incubadae a 37°C por 60 minutoe con agitación constante (200 rpm) . Despuée del periodo de incubación, las células transformadae fueron combinadas y mezcladas 1:1 con medio de congelamiento. Se retiró una alícuota de 200 µl para la titulación de la biblioteca y luego el resto de cada biblioteca fue repartido en alícuotas en criofrascoe de 1.8 ml (Wheaton Science Producte, Millville, NJ) y ee almacenaron congeladae a -80ßC. Cuatro diluciones en serie de cada biblioteca fueron preparadas: 1/100, 1/1000, 1/104, 1/105. A partir de cada dilución se eembraron en placa 100 µl eobre placas LB de 150 mm suplementadas con 50 µg de kanamicina por mililitro y se incubaron a 37°C toda la noche. El número de colonias sobre cada placa de dilución fue contado y utilizado para calcular el número total de transformantes en cada biblioteca. La primera biblioteca mostró que tenía 5.4 millonee de clones independientes y la segunda biblioteca mostró tener 9 millones de clones independientes.

Ejemplo 3: Preparación de plantilla y secuenciamiento de nucleótidos de los clones de cADN Alícuotas provenientes de ambas bibliotecas fueron sembradas y mezcladas en placas eobre placae LB de 25 x 25 cm suplementadae con 50 µg de kanamicina por mililitro. Los clones individuales fueron acomodados sobre placas de 96 pozos que contenían 100 µl de LB suplementado con 50 µg de kanamicina por mililitro con la ayuda de un robot Genetix QPix (Genetix Inc., Boeton, MA) . Cuarenta y cinco placae de 96 pozoe fueron obtenidae para un total de 4320 clonee individualee. Lae placae fueron incubadae toda la noche a 37°C con agitación a 200 rpm. Deepuée de la incubación, se agregaron a cada pozo 100 µl de gliceril estéril al 50%. Los transformantee fueron replicadoe con la ayuda de una herramienta de 96 eepigas (Boekel, Feasterville, PA) en placae de microcultivo de 96 pozoe, de pozo profundo, eecundaria (Advanced Genetic Technologies Corporation, Gaithersburg, MD) que contenían 1 ml de Caldo Magnificent Broth"* (MacConnell Research, San Diego, CA) euplementado con 50 µg de kanamicina por mililitro en cada pozo. Las placas de microtitulación primarias fueron almacenadas congeladas a -80aC. Las placas profundas secundariae fueron incubadae a 37 aC toda la noche con agitación vigoroea (300 rpm) sobre un agitador rotatorio. Para prevenir el derrame y la contaminación cruzada, y para permitir suficiente aeración, cada placa de cultivo secundaria fue cubierta con una almohadilla de polipropileno (Advanced Genetic Technologies Corporation, Gaithersburg, MD) y una cubierta de plástico para recipiente de microtitulación. El AND plásmido fue preparado con un MWG Robot-Smart 384 (MWG Biotech Inc., High Point, NC) y los equipoe Montage Plasmid Miniprep Kits (Millipore, Billerica, MA) .

Lae reaccionee de eecuenciamiento fueron realizadas utilizando la química del terminador Big-Dye"* (Applied Biosyeteme, Inc., Foeter City, CA) (Gieeecke et al., 1992, Journal of Virology Methode 38: 47-60) y un cebador de eecuenciamiento delantero M13 (-20) : 5'-GTAAAACGACGGCCAG-S' (SEQ ID NO: 5) Lae reaccionee de secuenciamiento fueron realizadas en un formato de 384 pozos con un Robot-Smart 384 (MWG Biotech Inc., High Point, NC) así como la eliminación del terminador con los equipos de limpieza de secuenciamiento Millipore MultiScreen Seq384 (Millipore, Billerica, MA) . Las reacciones contenían 6 µl del ADN plásmido y 4 µl de la mezcla maeetra de eecuenciamiento que contenía 1 µl del amortiguador de eecuenciamiento 5X (Millipore, Billerica, MA) , 1 µl del terminador Byg-Dye"* (Applied Bioeystems, Inc., Foeter City, CA) , 1.6 pmoles del cebador delantero M13 y 1 µl de agua. El secuenciamiento del ADN de un solo paso fue realizado con un secuenciador de ADN automático ABI PRISM modelo 3700 (Applied Biosyeteme, Foster City, CA) .

Ejemplo 4: Análisis de los datos de la secuencia de AND de los clones de cADN Llamamiento de base, asignación de valor de calidad, y recorte de vector, fueron realizados con la ayuda del software PHRED/PHRAP (University of Washington, Seattle, WA) . El análisis de agrupamiento de los ESTs fue realizado con un ensamblador de transcrito Parcel v. 2.6.2. (Paracel, Inc., Pasadena, CA) . El análisie del agrupamiento EST indicó la preeencia de 395 grupoe independientes. El análisie de homología de eecuencia de lae eecuenciae EST eneambladae contra las bases de datos PIR y ERDBP se realizó con el programa Blastx (Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215:403-410) sobre un grupo Linux de 32 nodos (Paracel, Inc., Pasadena, CA) utilizando la matriz BLOSUM 62 (Henikoff, 1992, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89: 10915-10919) . A partir de éstos, 246 tuvieron aciertos a los genes conocidos ya sea en las bases de datos públicas o privadas de proteínas y 149 no tuvieron aciertoe eignificativoe contra eetae basee de datos. Entre estos 246 genes, 13 tuvieron aciertoe contra loe homólogos bien caracterizados de los genes de glucosil hidrolasa.

Ejemplo 5: Identificación de los clones de cADN que codifican para una celobiohidrolasa de la Familia 6 (CelßA) Un clon de cADN que codifica para una celobiohidrolasa de la Familia 6 (Cel6A) fue inicialmente identificado por su homología a una proteína de la Familia 6A proveniente de Humicola insoiens (NR 34811679) . El análisie indicó que las dos proteínas eran 50% idénticas al nivel de proteínas sobre un tramo de 120 aminoácidos (360 pares de basee) . Deepuée de eeta identificación inicial, el clon TterllC9 fue recuperado de la placa de reserva congelada, original, y se eembró por estrías sobre una placa de LB suplementada con 50 µg de kanamicina por mililitro. La placa fue incubada toda la noche a 37 aC y al siguiente día se utilizó una colonia simple proveniente de la placa para inocular 3 ml de LB suplementado con 150 µg de kanamicina por mililitro. El cultivo de líquido fue incubado toda la noche a 37 aC y el ADN plásmido fue preparado con un Qiagen BioRobot 9600 (QIAGEN, Inc., Valencia, CA) . El clon del ADN plásmido TterllC9 fue secuenciado nuevamente con la química del terminador Big-Dye"* como se describe anteriormente, utilizando un cebador delantero M13 y un cebador Poli-T mostrado en seguida, para secuenciar el extremo 3' del clon. 5 ' -TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN-3 ' (SEQ ID NO: 6) Donde V=G, A, C y N= G, A,C,T El análisie de homología Blaetx de la nueva información de secuencia indicó que el extreme 3 ' tenía una muy alta identidad a la proteína de la Familia 6 de Talaromycee emereonii . Estas proteínas fueron 97% idénticae sobre un tramo de 39 aminoácidos. También, el análisis del extremo 5' del clon de TterllC9 con el programa Interproscan (Zdobnov y Apweiler, 2001, Bioinformatice 17: 847-8.) mostró que el gen codificado por el clon TterllC9 contenía la firma de la secuencia de las proteínas de la Familia 6 de glucosil- hidrolasa. Esta firma de eecuencia conocida como el patrón PS00655 de Prosite (Sigrist et al., 2002, Brief Bioinform. 3: 265-274) se encontró a 202 aminoácidos de inicio metionina, confirmando que el clon TterllC9 codifica para un gen de la Familia 6 de glucosil hidrolasa de Thielavia terrestris . La eecuencia de cADN (SEQ ID No: 1) y la secuencia deducida de aminoácidos (SEQ ID No: 2) son mostradas en las Figuras IA y IB. El clon de cADN codifica para un polipéptido de 481 aminoácidos. El contenido de % de G+C del clon de cADN del gen es de 66.9% y el de la región de codificación para la proteína madura (nucleótidos 52 al 1443 de la SEQ ID No: 1) es de 66.7%. Utilizando el programa de software SignalP (Nielsen et al., 1997, Protein Engineering 10: 1-6), se predijo un péptido de señal de 17 residuoe. La proteína madura predicha contiene 464 aminoácidos con una masa molecular de 49.3 kDa. Una alineación comparativa de las secuenciae de la Familia 6 de glucosil-hidrolasa fue determinada utilizando el método Clustal W (Higgins, 1989, eupra) utilizando el software LASERGENE"* MEGALIGN"* (DNASTAR, Inc., Madison, Wl) con una de ponderación de pesoe de residuos PAM250 y los siguientes múltiples parámetroe de alineación múltiplee: Penalidad por eepacio vacío de 10 y penalidad por longitud de eepacio vacío de 10. Loe parámetros de alineación de apareamiento fueron Ktuplo=l, penalidad por espacio vacío=3, ventanas=5, y diagonales=5. La alineación mostró que la secuencia deducida de aminoácidos del gen de la celobiohidrolasa Cel6A de Thielavia terreetrie comparte 74% de identidad con la secuencia deducida de aminoácidoe del gen de la celobiohidrolasa de Chaetomiu/n thermophi 1 um (Geneseqp ADP84824) . Una vez que fue confirmada la identidad del clon TterllC9 que contiene pTterllC9, una alícuota de 0.5 µl del ADN pláemido proveniente de eete clon, que fue redeeignado pTter6A, fue transferida a un frasco de células de E. coli TOP10 (Invitrogen, Carisbad, CA) , suavemente mezclada, e incubada eobre hielo por 10 minutoe. Lae célulae fueron luego chocadae por calor a 42°C por 30 eegundos e incubadas nuevamente sobre hielo por 2 minutoe. Las células fueron resuspendidae en 250 µl de medio SOC e incubadas a 37 aC por 60 minutos con agitación constante (200 rpm) . Después del periodo de incubación, dos alícuotas de 30 µl fueron sembradas sobre placas LB suplementado con 50 µg de kanamicina por mililitro e incubadas toda la noche a 37°C. Al día siguiente fue recogida una colonia simple y sembrada por estríae eobre tree criofráseos de 1.8 ml que contenían aproximadamente 1.5 de agaroea LB euplementada con 50 µg de kanamicina por mililitro. Loe fraecoe fueron eellados con PetriSeal"* (Diversified Biotech, Boston MA) y depositadoe con la Agricultural Reeearch Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center, 1815 University Street, Peoría, Illinois, 61604, como NRRL B-30802, con una fecha de depóeito de 17 de Diciembre del 2004.

Ejemplo 6: Construcción del vector de expresión pAXLo2 El vector de expreeión pAILol fue construido mediante la modificación de pBANe6 (Patente de los Estados Unidos No. 6,461,837), que comprende un híbrido de los promotores provenientes de los genes para la alfa-amilasa neutra de Aepergillue niger y la triosa-foefato-isomerasa de Aspergillus oryzae (promotor NA2-tpi) , la eecuencia terminadora de la amiloglucoeidasa de Aepergillue niger (terminador AMG) , y el gen de la acetamidasa de Aepergillus nidulane { amdS) . Todos los pasoe de mutagéneeie fueron verificados mediante secuenciamiento utilizando la química del terminador Big-Dye"* como se describe. La modificación de pBANe6 fue realizada primeramente mediante la eliminación de tres sitios de restricción Neo I en las posiciones 2051, 2722, y 3397 pares de bases a partir del marcador de selección amdS mediante mutagéneeie dirigida al eitio. Todos los cambios fueron designados como "silenciosos", dejando la secuencia de proteína efectiva del producto del gen amdS sin cambio. La eliminación de estos tres eitioe fue realizada simultáneamente con un equipo de mutagénesie dirigida al sitio GeneEditor"* in vi tro (Promega, Madison, Wl) de acuerdo a lae inetruccionee del fabricante, utilizando los siguientes cebadores (el nucleótido subrayado repreeenta la base cambiada) : AMDS3NcoMut (2050) : 5'-GTGCCCCATGATACGCCTCCGG-3' (SEQ ID No: 7) AMDS2NcoMut (2721) : 5'-GAGTCGTATTTCCAAGGCTCCTGACC-S' (SEQ ID No: 8) AMDSlNcoMut (3396) : d'-GGAGGCCATGAAGTGGACCAACGG-S ' (SEQ ID No : 9) Un plásmido que comprende los tres cambios de secuencia eeperados fue luego sometido a mutagénesie dirigida al eitio, utilizando el equipo de mutagéneeie dirigida al sitio QuickChange"* (Stratagene, La Jolla, CA) , para eliminar el sitio de restricción Neo I en el extremo del terminador AMG en la posición 1643. Fueron utilizados los siguientes cebadores (el nucleótido subrayado representa la base cambiada) para la mutagénesie: El cebador euperior para mutagenizar la eecuencia terminadora AMG: 5'-CACCGTGAAAGCCATGCTCTTTCCTTCGTGTAGAAGACCAGACAG-3' (SEQ ID No: 10) El cebador inferior para mutagenizar la secuencia terminadora AMG: 5'-CTGGTCTTCTACACGAAGGAAAGAGCATGGCTiTCACGGTGTCTG-3' (SEQ ID No: 11) El ultimo paso en la modificación de pBANe6 fue la adición de un Nuevo sitio de restricción Neo I al comienzo del poliligador utilizando un equipo de mutagénesis dirigida al sitio QuickChange™ y los siguientes cebadores (los nucleótidos subrayadoe repreeentan lae baeee cambiadas) para producir pAlLol (Figura 2) . El cebador superior para mutagenizar el promotor NA2-tpi: 5 ' -CTATATACACAACTGGATTTACCATGGGCCCGCGGCCGCAGATC-3 ' (SEQ ID No: 12) El cebador inferior para mutagenizar el promotor NA2-tpi: 5'-GATCTGCGGCCGCGGGCCCATGGTAAATCCAGTTGTGTATATAG-3' (SEQ ID No: 13) El gen amdS de pAILol fue intercambiado con el gen pyrG de Aepergillue nidulane . El plásmido pBANelO (Figura 3) fue utilizado como una fuente para el gen pyrG como un marcador de selección. El análisie de la eecuencia de pBANelO mostró que el marcador pyrG estaba contenido dentro de un fragmento de reetricción Nsil y no contiene ninguno de los sitios de restricción Ncol o Pací. Ya que el amdS está también flanqueado por los sitios de restricción Neil la estrategia para cambiar el marcador de selección fue un intercambio simple de los fragmentos de restricción Nsil . El AD? plásmido proveniente de pAILol y pBA?elO fue digerido con enzimas de restricción Nsil y los productos purificados mediante electroforesis en gel de agarosa. El fragmento Nsil proveniente de pBA?elO que contenía el gen pyrG fue ligado a la cadena principal de pAILol para reemplazar el fragmento de AD? de Nsil original que contenía el gen amdS. Los clones recombinantes fueron analizados mediante digestión de restricción para determinar que éstoe tenían el ineerto correcto y también su orientación. Un clon con el gen pyrG transcrito en la dirección en contra de lae manecillas del reloj, fue también eeleccionado. El nuevo pláemido fue designado pAILo2 (Figura 4) .

Ejemplo 7: Clonación del gen de la celobiohidrolasa de la Familia GH6A dentro de un vector de expresión de Aspergílluß oryzae Dos cebadores oligonucleotídicos sintéticos, mostrados en seguida, fueron diseñados para amplificación por PCR de la estructura de lectura abierta de longitud completa proveniente del EST TterllC9 de Thielavia terreetris que codifica para una celobiohidrolasa de la Familia GH6A. Un equipo de clonación en fusión (BD Biosciencee, Palo Alto, GA) fue utilizado para clonar el fragmento directamente dentro de pAILo2. Cebador delantero In-Fueion: 5 ' -ACTGGATTACCATGGCTCAGAAGCTCCTTCT-3 ' (SEQ ID ?o : 14) Cebador invereo In-Fusion: 5'-TCACCTCTAGTTAATTAAAAGGGCGGGTTGGCGT-3' (SEQ ID No : 15) Las letras negritae representan la secuencia de codificación. La secuencia restante contiene la identidad de eecuencia comparada con loe eitios de inserción de pAILo2. Cincuenta picomoles de cada uno de loe cebadores anteriores fueron utilizados en una reacción de PCR que contenía 50 ng del ADN de pTterllC9, IX del amortiguador de amplificación Pfx (Invitrogen, Carlebad, CA) , 6 µl de una mezcla 10 mM de dATP, dTTP, dGTP, y dCTP, 2.5 unidades de ADN-polimerasa Platinum Pfx (Invitrogen, Carisbad, CA) , 1 µl de sulfato de magnesio 50 M, y 5 µl de solución aumentadora 10X pCRx (Invitrogen, Carisbad, CA) en un volumen final de 50 µl. Se utilizó un Eppendorf Mastercycler 5333 (Eppendorf Scientific, Inc., Westbury, NY) para amplificar el fragmento programado para un ciclo a 98°C por 2 minutos; y 35 ciclos cada uno a 94°C por 30 segundos, 65aC por 30 segundos, y 68°C por 1.5 minutos. Después de los 35 ciclos, la reacción fue incubada a 68°C por 10 minutos y luego enfriada a 10BC hasta que se procesó adicionalmente. Se aisló un producto de reacción de PCR de 1.5 kb sobre un gel de GTG-agarosa al 0.8% (Cambrex Bioproducte One Meadowlands Plaza East Rutherford, New Jersey 07073) utilizando Tris base 40 mM-acetato de sodio 20 mM-EDTA disódicol mM (TAE) como amortiguador y 0.1 µg de bromuro de etidio por mililitro. La banda de AND fue visualizada con la ayuda de un Dark Reader"* (Clare Chemical Research, Dolores, CO) para evitar las mutaciones inducidas por UV. La banda de ADN de 1.5 kb fue extirpada con una navaja de afeitar desechable purificada con una copa giratoria Ultrafree-DA (Millipore, Billerica, MA) de acuerdo a las instruccionee del fabricante. El vector pAILo2 fue linearizado mediante digeetión con Neo I y Pac I (utilizando lae condiciones especificadas por el fabricante) . El fragmento fue purificado mediante electroforesie en gel y ultrafiltración como ee deecribe anteriormente. La clonación del fragmento de PCR purificado dentro del vector pAILo2 linearizado y purificado ee realizó con un equipo de clonación In-Fueion (BD Bioeciencee, Palo Alto, CA) . Lae reaccionee (20 µl) contenía IX del amortiguador In-Fusion (BD Biosciencee, Palo Alto, CA) , IX BSA (BD Biosciences, Palo Alto, CA) , 1 µl de la enzima In-Fusion (diluida 1:10) (BD Biosciences, Palo Alto, CA) , 100 ng de pAILo2 digerido con Neo I y Pac I, y 50 ng del producto del PCR purificado GH6A de Thielavia terreetris . La reacción fue incubada a temperatura ambiente por 30 minutos. Una muestra de 2 µl de la reacción se utilizaron para transformar las células Gold de E. coli XL10 SoloPac® (Stratagene, La Jolla, CA) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Después del periodo de recuperación, dos alícuotas de 100 µl de la reacción de transformación fueron sembradas sobre placas de medio 2X YT de 150 mm, suplementadas con 100 µg de ampicilina por mililitro. Las placas fueron incubadas toda la noche a 37°C. Dos grupos de ocho clones recombinantes putativos fueron seleccionadoe aleatoriamente de lae placas de selección y el ADN pláemido fue preparado a partir de cada uno utilizando un BioRobot 9600 (QIAGEN, Inc., Valencia, CA) . Loe clones fueron analizadoe mediante la digestión de restricción con Neo I. Cuatro clones que tenían el patrón de digestión de restricción esperado, fueron luego secuenciadoe para confirmar que no existían mutaciones en el inserto clonado. El clon #13 proveniente del segundo grupo fue seleccionado y designado pAILo21 (Figura 5) .

Ejemplo 8: Expresión del gen de la celobiohidrolasa a la Familia GH6A de Thielavia terrestriß en Aspergillus oryzae JAL250 Los protoplastos de Aepergillue oryzae Jal250 (WO 99/61651) fueron preparados de acuerdo al método de Christeneen et at., 1988, Bio/Technology 6: 1419-1422. Se utilizaron cinco microgramos de pAILo21 para transformar los protoplastoe de Aepergillue oryzae JAL250. pAILo2 fue corrido como un control vector. La traneformación de Aepergillue oryzae Jal250 con pAILo21 produjo aproximadamente 50 transformantes . Fueron aislados ocho transformantes a las placas de PDA individuales e incubados por cinco días a 34aC. Lae placas de esporas confluentes fueron lavadas con 5 ml de Tween 80 al 0.01% y la suepeneión de eeporas fue utilizada para inocular 25 ml del medio MDU2BP en matraces de agitación de vidrio de 125 ml . Los cultivos de transformantes fueron incubados a 34SC con agitación conetante a 200 rpm. En el día cinco poet-inoculación, los cultivos fueron centrifugados a 6000 xg y sus sobrenadantes fueron recolectados. Cinco micro-litros de cada sobrenadante fueron mezclados con un volumen igual de amortiguador de carga de 2X (ß-mercaptoetanol al 10%) y cargados en un gel de SDS-PAGE de Trie-glicina al 8%-16% de 1.5 mm, y teñido con Si ply Blue SafeStain (Invitrogen, Carisbad, CA) . Los perfiles de SDS-PAGE de los caldos de cultivo mostraron que uno de los transformantee (deeignado traneformante 2) tenía una banda de proteína de aproximadamente 60 kDa. La actividad bioquímica de la celobiohidrolaea Cel6A de la Thielavia terreetrie expreeada en Aepergillue oryzae fue determinada como hidrólisis de la celulosa hinchada con ácido fosfórico (PASC) a glucosa en presencia de ß-glucosidasa en exceeo. Se preparó PASC a partir de Avicel (Fluka, obtenido de Sigma-Aldrich, St. Louie, MO) . Se agregó al Avicel, el ácido orto-fosfórico enfriado con hielo, 85% (VWR International, Pittsburgh, PA) en la proporción de 30 ml de ácido a 1 g de Avicel, y se agitó en un baño con hielo por una hora. Se agregó acetona fría (VWR International, Pittsburgh, PA) mientras se agitaba, utilizando 100 ml por g de Avicel. La suepeneión se transfirió a un embudo de filtro de vidrio y se lavó con acetona fría, utilizando tras lavados de 20 ml de acetona por g de Avicel. Finalmente, la celulosa se lavó dos veces con 100 ml de agua por gr de acetona. El PASC fue reeuspendido en agua, hasta una concentración de 1% de PASC, y se almacenó a 4°C. La actividad de la celobiohidrolasa Cel6A de Thielavia terreetrie fue comparada a la celobiohidrolasa Cel6A de Humicola ineolene utilizando 15.9 µg de cada enzima Cel6 y 0.8 µg de ß-glucosidaea. Lae enzimae fueron incubadas a 45 aC en 1.182 ml de acetato de sodio 50 mM, pH 5.0, 0.001% de azida de eodio, y 1.59 mg de PASC en placae de 96 pozos (Axygen Scientific, Union City, CA) selladas con un sellador de placas (ALPS-300, Abgene, Epsom, UK) . Después de varios tiempos de incubación, las mezclas de reacción fueron centrifugadas y la concentración de glucosa del sobrenadante fue determinada con un analizador de glucosa (YSI, Inc., Yellow Springs, OH) . Como se muestra en la Figura 6, el curso de tiempo de la hidrólieie y la actividad de la celobiohidrolaea Cel6A de Thielavia terreetrie fue casi idéntico a aquel de la celobiohidrolasa Cel6A proveniente de Humicola ineolens.

Ejemplo 9: Análisis de huella digital de masa del péptido (PMF) por espectroscopia de masa de tiempo de vuelo, de ionización de desorción con láser asistida por matriz (MALDI-TOF MS) para verificación de las proteínas La banda de proteína de 60 kDA (Ejemplo 8) fue digerida en gel con tripsina como se describe en el Ejemplo 1. Los péptidoe recuperados fueron analizados mediante el análisie de huella digital de maea de péptido para la verificación de la proteína. Se utilizó un espectrómetro de masa de tiempo de vuelo Maldi"*-LR (Waters Micromase® MS Technologies, Milford, MA) . El ácido alfa-ciano-4-hidroxicinámico recristalizado fue preparado mediante lavado con cantidades en miligramo del ácido alfa-ciano-4-hidroxicinámico (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) con 100% de acetonitrilo (E.M. Science, Gibbstown, NJ) y ee mezcló perfectamente y se centrifugó para formar un botón de matriz. La solución acetonitrilo fue removida y desechada. El agua grado HPLC (Fisher Chemicals, Fairlawn, NJ, ) fue agregada seguido por la adición lenta de 28-30% de hidróxido de amonio (J.T. Baker, Phillipsburg, NJ) hasta que casi todo el botón fue disuelto. El botón no disuelto fue desechado. Se agregó lentamente HCl acuoso concentrado <Fisher Chemicals, Fairlawn, NJ) a la solución de matriz hasta que una gran cantidad de la matriz se había recristalizado. La matriz recristalizada fue removida mediante filtración y lavada variae veces con HCl 0.1 y se dejó secar completamente. La eolución de matriz final coneistió de una solución de 10 mg/ml del ácido alfa-ciano-4-hidroxicinámico recristalizado, en 50% de acetonitrilo/50% de TFA acuoso al 0.1%. Un µl de la solución de extracción de péptido obtenida de la digestión en gel de proteína, fue mezclado con 1 µl de la solución de matriz recristalizada y secada por puntos sobre una placa objetivo MALDI-TOF de acero inoxidable. El espectrómetro de masa fue operado en reflexión y en modo de ion positivo utilizando un voltaje de aceleración de +15kV, voltaje de pulso de 2535 voltios y voltaje de reflectron de 2000 voltios. El intervalo de masa de adquisición de datos fue ajustado de 640 -3000 m/z. Un estándar de calibración de maea de aeeguramiento consistió de 1 µl de 200 fmoles/µl de ACTH (Hormona Adenocorticotrófica Pinza 18-39 PM = 2,465.1989) (Sigma Chemical Co, St. Louis, MO) y 1 µl de solución de matriz cristalizada se utilizó para el estándar interno, y ee tranefirió por puntoe a un pozo de objetivo de masa de aseguramiento adyacente. Se realizó la adquisición de datos utilizando una estación de trabajo microprocesadora controlada por Windows NT utilizando el software de espectrometría de masa Masslynx 4.0 (Waters Micromaes® MS Technologies, Milford, MA) . Los espectros adquiridos fueron combinados, afinados y centrados, y una lista de picos de lae masas iónicae de loe péptidoe, fue generada. La lieta de picos fue buscada contra basee de datoe utilizando el eoftware ProteinLynx"* Global Server 2.05 (Watere Micromaee® MS Technologies, Milford, MA) . Los resultados del análieie de huella digital de maea peptídica indicó que la mancha de proteína de aproximadamente 60 kD es la proteína Cel6A de Thielavia terreetrie basada en las eiguientee concordanciae de masa de los péptidoe a la celobiohidrolasa CE16A de Thielavia arreetrie : Masa medida Masa teórica Secuencia Posición «n la (m + H) (m + H) SEQ ID No.: 2 986.423 986.430 CANAESTYK 271-279 1147.792 1147.590 VPSFQWLDR 163-171 1193.856 1193.653 SLVIQYSDIR 240-249 1829.213 1828.990 NVTIDTLFAHTLSOIR 172-187 1964.197 1963.991 GANPPYAGIFWYDLPDR 193-210 2301.317 2301.250 IIFVIEPDSLANMVTNLNVAK 250-270 Ejemplo 10: Expresión de la celobiohidrolasa CeISA de Thielavia terreetris por Trichoderma reesei El promotor del gel de la celobiohidrolasa I de Trichoderma reeeei (CBHI) en el plásmido de expresión pSMail55 (WO 05/074647) fue reemplazado con un promotor CBHII de Trichoderma reeeei dando como resultado el plásmido pCW076. El promotor del gen de la celobiohidrolasa II de Trichoderma reeeei (CBHII) fue aislado del plásmido pEJG114 (WO 05/074647) mediante digestión con Sal I y Neo I. La eliminación del promotor CBHI de pSMail55 fue lograda mediante digestión con Sal I y Neo I. El fragmento de ADN de CBHII y el plásmido pSMail55 linearizado, menoe el promotor CBHI, fueron vieualizadoe con ayuda de un Dark Reader™ (Clare Chemical Research, Dolores, CO) . Ambos fragmentos fueron extirpados con navajas de afeitar desechables y purificados con el equipo de extracción en gel QIAquick (QIAGEN Inc., Valencia, CA) de acuerdo a las inetruccionee del fabricante. El promotor CBHII fue luego ligado dentro de pSMail55 linearizado, utilizando loe eitios Sal I y Neo I realizados después de la eliminación del promotor CBHI utilizando un equipo de ligadura rápida de ADN (Roche, Indianapolis, IN) , eiguiendo lae instrucciones del fabricante. Las células competentes, grado subclonación E. coli XLl-Blue (Stratagene, La Jolla, CA) fueron transformadas con el producto de ligadura. La identidad de la construcción fue confirmada mediante secuenciamiento de AND de la secuencia promotora CBHII a partir de los plásmidoe purificados a partir de E. coli transformado. Un clon que contenía el plásmido recombinante fue designado pCW076 (Figura 7) . Dos cebadores oligonucleótidos sintéticoe mostrados más adelante fueron diseñados para amplificar por PCR el gen de la celobiohidrolaea Cel6A de Thielavia terreetrie a partir del plásmido pAILo21 (Ejemplo 7) . El cebador delantero da como resultado un extremo 5 ' romo y el cebador inverso incorpora un sitio Pac I en el extremo 3 ' . El f agmento Cel6A fue directamente clonado dentro pCW076 utilizando un sitio Neo I romo en el extremo 5 ' y un sitio Pac I en el extremo 3 ' . Cebador delantero: 5 ' -ATGGCTCAGAAGCTCCTTCTCGCCG-3 ' (SEQ ID No: 16) Cebador invereo : 5 ' -CAGTCACCTCTAGTTAATTAATTAGAAGGGCGGG-3 ' (SEQ ID No: 17) Cincuenta picomolee de cada uno de los cebadores anterioree fueron utilizados en una reacción de PCR que consistió de 50 ng de pAILo21, 1 µl de una mezcla 10 mM de dATP, dTTP, dGTP, y dCTP, 5 µl del amortiguador I de ADN-polimerasa AmpliTaq® 10X (Perkin-Elmer/Applied Biosyeteme, Inc., Foster City, CA) , y 5 unidades de ADN-polimerasa AmpliTaq® (Perkin-Elmer/Applied Biosyeteme, Inc., Foster City, CA) , en un volumen final de 50 µl . Se utilizó un Eppendorf Mastercycler 5333 (Eppendorf Scientific, Inc., Weetbury, NY) para amplificar el fragmento de AND y fue programado para un ciclo a 95°C por 3 minutos; y 30 ciclos cada uno a 95fiC por 45 segundoe, 55aC por 60 eegundoe, y 72°C por 1 minuto 30 segundos . Despuée de 30 ciclos, la reacción fue incubada a 72°C por 10 minutos y luego se enfrió a 4°C hasta el procesamiento posterior. El extremo 3' del fragmento de PCR de Cel6A fue digerido utilizando Pad I. El producto de digestión fue purificado utilizando un equipo de limpieza de reacción MinElute"* (QIAGEN, Valencia, CA) de acuerdo a las instruccionee del fabricante (QIAGEN Inc., Valencia, CA) . El plásmido pCW076 fue digerido con Neo I y Pad I. El sitio Neo I fue luego hecho romo utilizando una enzima Klenow para rellenar el sitio Neo I ahuecado en 5'. La reacción de Klenow consistió de 20 µl de la mezcla de la reacción de digestión pCW076 más de dNTPs 1 mM y 1 µl de enzima Klenow (Roche, Indianapolie, IN) que fue incubada brevemente a temperatura ambiente. El pCW076 linearizado fue purificado utilizando un equipo de limpieza de reacción MinElute"* (QIAGEN, Valencia, CA) de acuerdo a las instruccionee del fabricante (QIAGEN Inc., Valencia, CA) . Estae reacciones dieron como resultado la creación de un extremo 5' romo y un sitio Pac I 3' compatible al fragmento Cel6A generado. El fragmento Cel6A fue luego clonado dentro de pCW076 utilizando un equipo de ligadura rápida de ADN (Roche, Indianapolis, IN) siguiendo las instrucciones del fabricante. Las células competentes grados de clonación de E. coli XLl-Blue (Stratagene, La Jolla, CA) fueron transformadas con el producto de ligadura. La identidad de la construcción fue confirmada mediante secuenciamiento de ADN de la secuencia que codifica para Cel6A a partir de los plásmidos purificados de la E. coli transformada. Un clon que contenía el plásmido recombinante fue designado pCW085 (Figura 8) . Matraces de agitación que contenían 25 ml de medio YP, 2% de glucosa, y uridina 10 mM fueron inoculados con 5 X 107 esporae de Trichoderma reeeei cepa SaMe-FXl6. La incubación fue llevada a cabo por 17 horas a 27fiC con agitación a 90 rpm. Los micelios fueron luego lavados utilizando 500 ml del "Sistema de Filtración Deeechable Accionado por Vacío" (Millipore) doe veces con aproximadamente 100 ml de agua desionizada. Los micelios fueron luego lavados doe veces con sorbitol 1.2 M y los protoplaetoe fueron generadoe mediante la euepeneión de loe micelios en una solución filtrada estéril de 5 mg de Glucanex"* (Novozymes A/S, Bagsvaerd, DK) por mililitro y 1 mg de quitinaea (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) por mililitro en 20 ml de sorbitol 1.2 M. La digestión fue incubada a 34 aC y suavemente agitada a 90 rpm por aproximadamente 20 minutos o hasta que se formaron los protoplastos. Una vez que los protoplastos fueron generados, la mezcla fue incubada sobre hielo para retardar la digestión. La digestión fue luego transferida a un tubo Falcon de 50 ml y se agregaron 30 ml de sorbitol 1.2 M enfriado con hielo a la digestión. Los protoplastos fueron luego centrifugados por 7 minutoe a 200 rpm. Deepués de la centrifugación, el sobrenadante fue vaciado y los protoplastoe fueron vaciados en 50 ml de sorbitol 1.2 M, enfriado con hielo. Este paso fue repetido dos veces y después del segundo lavado, los protoplastos fueron contados, y resuependidos en STC (sorbitol 1 M, cloruro de calcio 10 mM, Tris-HCl 10 mM, pH 7.5) a una concentración de 1 X 108 protoplastoe/ml . Loe protoplaetoe fueron almacenadoe a -80aC hasta el uso. Dos a cinco µg del pCW085 linearizado con Pme I, 100 µl de 1 X 108 protoplastoe de Trichoderma reesei cepa SaMe-FX16, y 250 µl de amortiguador PEG (50% de PEG 4000, cloruro de calcio 10 mM, Tris-HCl 10 mM, pH 7.5) fueron suavemente mezclados conjuntamente en un tubo Falcon 2059 de 12 ml y ee incubó por 30 minutoe a temperatura ambiente. Después de la incubación, se agregaron 3 ml de STC (sorbitol 1 M, cloruro de calcio 10 mM, Tris-HCl 10 rriM, pH 7.5) a la mezcla de reacción. La reacción de transformación fue mezclada suavemente y luego la cantidad completa fue vaciada sobre placas de PDA que contenían 100 ng de higromicina B (Sigma Chemical Co., St. Loius, MO) por mililitro y se incubaron a 28fiC por 5-7 días. Veintiún transformantee fueron recogidoe e inoculados en matraces de agitación de 250 ml que contenían 25 ml de CIM. Los matraces de agitación fueron desarrolladoe por cinco díae a 28aC mientrae que ee agitaba a 200 rpm. Un traneformante designado Trichoderma reesei SaMe-D8 fue cultivado en una fermentación de 2 litros de acuerdo al eiguiente procedimiento. Doe tapones de agarosa provenientes de una placa fresca de Trichoderma reesei SaMe-D8 desarrollada sobre placas de PDA, se inocularon dentro de un matraz de agitación que contenía 100 ml de medio compuesto por litro de 20 g de glucosa, 10 g de sólidos de infusión de maíz, 1.45 g de sulfato de amonio, 2.08 g de fosfato diácido de potasio, 0.36 g de cloruro de calcio bihidratado, 0.42 g de sulfato de magnesio heptahidratado, y 0.2 ml de solución de metales en trazas. La solución de metales en trazas estuvo compuesta por litro de 216 g de FeCl3»7H20, 58 g de ZnS04«7H20, 27 g de MnS04»H20, 10 g de CuS04»5H20, 2.4 g de H3B03, y 336 g de ácido cítrico. El material de agitación fue incubado por 2 días a 28°C y a 200 rpm sobre un agitador orbital. Cincuenta ml de este cultivo ee utilizaron para inocular 1.8 litros del medio compuesto por litro de 30 g de celulosa, 10 g de sólidos de infusión de maíz, 4 g de glucosa, 2.64 g de CaCI2»2H20, 3.8 g de (NH4)2S04, 2.8 g de KH2P0 , 1.63 g de MgS04«7H20, 0.75 ml de solución de metales en trazas (el mismo que se describe anteriormente), y 3 ml de ácido plurónico. La temperatura fue ajustada a 28 C y el pH fue controlado a 4.75. La fermentación fue corrida con oxígeno disuelto mínimo a 25% a un flujo de aire de 1.0 WM y una agitación de 1100 rpm. El medio de alimentación fue distribuido dentro del recipiente de fermentación de 2 litros como fuera necesario con una velocidad de alimentación de 6.0-8.0 g/hora por 7-8 días. El medio de alimentación estuvo compuesto por kg de 600 g de glucosa, 35.5 g de H3P0 , 20 g de celuloea, y 5 g de ácido plurónico. El caldo de fermentación completo fue centrifugado a 3000 x g por 10 minutoe y el eobrenadante ee filtró a travée de una unidad de filtración deeechable con un prefiltro de fibra de vidrio (Nalgene, Rocheeter NY) . El filtrado fue enfriado a 4aC para el almacenamiento. El filtrado fue luego eometido a electroforesis en gel de poliacrilamida bidimensional parar confirmar la expresión de la celobiohidrolaea Cel6A de Thielavia terreetrie (ver Ejemplo 11) .

Ejemplo 11: Verificación de la expresión de C 16A de Thielavia terrestres en Trichoderma reesei SaMe-D8 Electroforesis en gel de poliacrilamida bidimensional. Un ml del filtrado proveniente de una fermentación de 2 litros de Tricoderma reeeei SaMe-D8, descrita en el Ejemplo 10, se precipitó mediante la adición de 100 µl de ácido tricloroacético saturado (TCA) a 4SC y la incubación por 10 minutos sobre hielo seguida por la adición de 9 ml de acetona enfriada con hielo y la incubación posterior sobre hielo por 20 minutos. La solución precipitada fue centrifugada a 10,000 x g por 10 minutoe a 4aC, el eobrenadante ee decantó y el botón ee enjuagó doe veces con acetona enfriada con hielo y se secó al aire. El botón seco se disolvió en 0.2 ml de amortiguador de muestra de enfoque isoeléctrico (IEF) (urea 9.0 M, 3.1% (p/v) de 3-[ (3-colamidopropil) dimetil-amonio] -1-propaneulfonato (CHAPS, Pierce Chemical Co . Rockford, IL) , 1% (v/v) de anfolitoe de pH 4-7, ditiotreitol (DTT) 50 mM, y azul de bromofenol al 0.005% en agua deetilada) . La eolución de reserva de urea fue desionizada utilizando AG 501-X8 (D) , resina de lecho mixto, de malla 20-5 de BioRad Laboratories (Hercules, CA) . La solución desionizada fue almacenada a -20SC. La mezcla resultante se dejó eolubilizar por variae horae con mezclado euave eobre un agitador LabQuake™ (Lab Industries, Berkeley, CA) , doscientos µl de cada mezcla de amortiguador de muestra IEF-proteína se aplicaron a una tira de IPG de 11 cm (BioRad Laboratories, Herculee, CA) en una charola de rehidratación IPG (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) . Una alícuota de 750 µl del fluido de cubierta de tira seca (Amersham Biosciencee, Piecataway, NJ) ee colocó en capae eobre lae tiras de IPG para prevenir la evaporación y se dejó rehidratar por 12 horas mientras que se aplicaban 30 voltios utilizando una unidad de enfoque isoeléctrico IPGPhor (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) a 20aC. La unidad de IPGPhor fue programada para el voltaje constante pero con una corriente máxima de 50 µA por tira. Después de 12 horas de rehidratación, las condiciones de enfoque isoeléctrico fueron como eigue: 1 hora a 200 voltioe, 1 hora a 500 voltioe, y 1 hora a 1000 voltioe. Luego, se aplicó un gradiente desde 1000 voltioe haeta 8000 voltioe por 30 minutos y el enfoque isoeléctrico fue programado para correr a 8000 voltios y se completó cuando se alcanzaron más de 30,000 voltios por hora. Las tiras de gel de IPG fueron reducidae y alquiladas antes del segundo análieie dimeneional primeramente mediante la reducción por 15 minutoe en 100 mg de ditiotreitol por 10 ml de amortiguador de SDS-equilibrio (Tris HCl 50 M, pH 8.8, urea 6.0 M, solución al 2% (p/v) de dodecilsulfato de eodio (SDS), 30% de glicerol, y 0.002% (p/v) de azul de bromofenol) eeguido por 15 minutos de alquilación en 250 mg de yodoacetamida por 10 ml de amortiguador de equilibrio en la oscuridad. Las tiras de IPG fueron enjuagadas rápidamente en el amortiguador de corrida de SDS-PAGE (Invitrogen/Novex, Carisbad, CA) y se colocaron sobre un gel de SDS-PAGE de 8-16% de Tris-glicina, de 11 cm, de 1 pozo (BioRad Laboratories, Hercules, CA) y se sometieron a electroforesie utilizando una unidad de electroforeeie Criterion (BioRad Laboratoriee, Herculee, CA) a 50 voltios hasta que la muestra entró al gel y luego el voltaje fue incrementado a 200 voltios y se dejó correr hasta que el colorante de azul de bromofenol alcanzó el fondo del gel.

Detección del polipéptido. El gel bidimensional fue removido del cásete y enjuagado tres veces con agua por al menos 5 minutos cada vez, y se tiñó con tinción Bio-Safe"* Comasie G250 (BioRad Laboratories, Hercules, CA) por 1 hora, seguido por el deeteñido con agua bideetilada, por más de 30 minutos. Las mueetrae de gel de proteína observadas fueron extirpadas utilizando un punzón de biopsia Acu-Punch de 2 mm (Acuderm Inc., Ft . Lauderdale, FL) y se almacenaron en placas de noventa y seis pozos que fueron pre-lavadas con ácido trifluoroacético al 0.1% (TFA) en 60% de acetonitrilo, seguido por dos lavados adicionales con agua grado HPLC. Las manchas de gel bidimensionales teñidas fueron almacenadas en 25-50 µl de agua en las placas pre-lavadas a -20 aC haeta que ee digirieron. Una mancha de proteína correepondiente al peso molecular esperado y el punto isoeléctrico teórico (pl) del polipéptido Cel6A de Thielavia terrestris, fue analizada mediante el análisis de huella digital de masa peptídico de MALDI-TOF MS como se describe en el Ejemplo 9. Los resultados del análisis de huella digital de masa peptídica indicaron que la mancha de proteína de aproximadamente 60 kD es la proteína de Cel6A de Thielavia terreetrie basada en las siguientee concordancias de masa peptídica a la celobiohidrolasa Cel6A de Thielavia terrestris : Depósito de Material Biológico El siguiente material biológico ha sido depositado bajo los términos del Tratado de Budapest con la Agricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center, 1815 University Street, Peoría, Illinois, 61604, y se le dio el siguiente número de acceso: Depósito Número de acceso Fecha de depósito E. coli pTterßA NRRL B-30802 17 de Diciembre del 2004 La cepa ha sido depositada bajo condiciones que aseguran que el acceso al cultivo será disponible durante la duración de esta solicitud de patente a alguien determinado por el Comieionado de Patentee y Marcas , para estar autorizado a éste bajo 37 C . F . R . Sección 1. 14 y 35 U . S .C . Sección 122 . El depósito repreeenta un cultivo euetancialmente puro de la cepa depoeitada . El depósito es disponible como es requerido por las leyes de patentes extranjeras -en loe paíeee en donde eean preeentadae contrapartes de la presente eolicitud o eu progenie. No obetante, ee debe entender que la dieponibilidad de loe depóeitoe no conetituye una licencia para practicar la presente invención en derogación de los derechos de patente otorgados por acción gubernamental. La invención descrita y reclamada en la presente no está limitada en alcance por los aspectos específicos descritos en la presente, ya que estoe aspectos eetán deetinados co o ilustracionee de varios aspectos de la invención. Cualesquiera aspectos equivalentes están destinadoe a eetar dentro del alcance de esta invención. Por supueeto, divereae modificaciones de la invención además de aquellas mostradas y descritas en la presente, se volverán aparentes para aquellos ejqpertoe en la técnica a partir de la descripción anterior. Se pretende que tales modificaciones caigan dentro del alcance de las reivindicaciones anexas. En el caso de conflicto, será de control la presente descripción, incluyendo las definiciones . Son citadas en la preeente diversas referencias, las descripciones de las cuales se incorporan por referencia en la presente, en eu totalidad. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (26)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :

1. Un polipéptido aislado que tiene actividad celobiohidrolasa, caracterizado porque se selecciona del grupo que consiste de: (a) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene preferentemente al menos 80%, más preferentemente al menos 85%, aún más preferentemente al menos 90%, lo más preferentemente al menos 95%, y todavía más preferentemente a lo más al menos 97% de identidad al polipéptido maduro de la SEQ ID No.: 2 ; (b) un polipéptido que es codificado por un polinucleótido que se hibrida preferentemente bajo condiciones de severidad media-alta, más preferentemente al menos condiciones de alta severidad con (i) la secuencia de la SEQ ID No.: 1 que codifica para el polipéptido maduro, (ii) la secuencia de ADN genómico que comprende la secuencia de la SEQ ID No . : 1 que codifica para el polipéptido maduro, o (iii) una hebra complementaria de (i) o (ii) ; y (c) una variante que comprende una sustitución, supresión, y/o ineerción de uno o máe aminoácidos del polipéptido maduro de la SEQ ID No.: 2.

2. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende o coneiste de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID No. : 2 o un fragmento de la misma que tiene actividad de celobiohidrolasa.

3. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende o coneiete del polipéptido maduro de la SEQ ID No. : 2.

4. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque ee codificado por el polinucleótido contenido en el pláemido pTter6A que eetá contenido en E. coli NRRL B-30802.

5. El polipéptido de conformidad con cualquiera de lae reivindicacionee 1-4, caracterizado porque el polipéptido maduro es de los aminoácidos 18 al 481 de la SEQ ID No. : 2, y la secuencia que codifica para el polipéptido maduro es de los nucleótidos 52 al 1443 de la SEQ ID No.: 1.

6. Un polinucleótido aislado, caracterizado porque comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para el polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

7. Una construcción de ácido nucleico o un vector de expresión, caracterizada porque comprende el polinucleótido de conformidad con la reivindicación 6, operablemente enlazado a una o más secuenciae de control que dirigen la producción del polipéptido en un hoepedero de expreeión.

8. Una célula hoepedera recombinante, caracterizada porque comprende la construcción de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 7.

9. Un método para producir el polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, caracterizado porque comprende: (a) el cultivo de una célula, que en su forma de tipo de silveetre ee capaz de producir el polipéptido, bajo condiciones que conducen a la producción del polipéptido; y (b) la recuperación del polipéptido.

10. Un método para producir el polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, caracterizado porque comprende: (a) el cultivo de una célula hospedera que comprende una construcción de ácido nucleico que incluye un polinucleótido que codifica para el polipéptido, bajo condiciones que conducen a la producción del polipéptido; y (b) la recuperación del polipéptido.

11. Un método para producir un mutante de una célula progenitora, caracterizado porque comprende la fractura o supreeión de una eecuencia nucleotídica que codifica para el polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, que da como resultado que el mutante produzca menoe del polipéptido que la célula progenitora.

12. Una célula mutante, caracterizada porque es producida mediante el método de conformidad con la reivindicación 11.

13. La célula mutante de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada porque comprende además un gen que codifica para una proteína nativa o heteróloga.

14. Un método para producir una proteína, caracterizado porque comprende: (a) el cultivo de la célula mutante de conformidad con la reivindicación 13 bajo condiciones que conducen a la producción de la proteína; y (b) la recuperación de la proteína.

15. Un polinucleotido aislado, caracterizado porque es obtenido mediante: (a) la hibridación de una población de ADN preferentemente bajo al menos condiciones de severidad media-alta, más preferentemente al menos bajo condiciones de alta severidad con (i) la secuencia de la SEQ ID No. : 1 que codifica para el polipéptido maduro, (ii) la secuencia de ADN genómico que comprende la secuencia de la SEQ ID No.: 1 que codifica para el polipéptido maduro, o (iii) una hebra complementaria de (i) o (ii) ; y (b) el aislamiento del polinucleótido de hibridación, que codifica para un polipéptido que tiene actividad de celobiohidrolasa.

16. El polinucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque la secuencia que codifica para el polipéptido maduro es de los nucleótidos 52 al 1443 de la SEf ID No.: 1.

17. Una conetrucción de ácido nucleico, caracterizada porque comprende un gen que codifica para una proteína operablemente enlazada a una eecuencia nucleotídica que codifica para un péptido de eeñal que comprende o que coneiete de loe aminoácidoe 1 al 17 de la SEQ ID No.: 2, en donde el gen ee extraño para la eecuencia nucleotídica.

18. Una célula hoepedera recombinante, caracterizada porque comprende la conetrucción de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 17.

19. Un método para producir una proteína, caracterizado porque comprende: (a) el cultivo de la célula hospedera recombinante de conformidad con la reivindicación 18, bajo condiciones que conducen a la producción de la proteína; y (b) la recuperación de la proteína.

20. Un método para producir el polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, caracterizado porque comprende: (a) el cultivo de una planta transgénica o una célula vegetal que comprende un polinucleótido que codifica para un polipéptido que tiene actividad de celobiohidrolasa, bajo condiciones que conducen a la producción del polipéptido, (b) la recuperación del polipéptido.

21. Una planta transgénica, parte de planta o célula vegetal, caracterizada porque ha eido traneformada con un polinucleótido que codifica para el polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-5 .

22 . Una composición detergente, caracterizada porque comprende un polipéptido que tiene actividad celobiohidrolaea de conformidad con cualquiera de lae reivindicacionee 1-5 y un eurf actante .

23. Un método para degradar o convertir la biomasa que contiene celuloea y hemiceluloea, caracterizado porque comprende el tratamiento de la biamaea con una cantidad efectiva de un polipéptido que tiene actividad celobiohidrolaea de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-5 y la recuperación de la biomasa degradada.

24. El método de conformidad con la reivindicación 23 , caracterizado porque comprende además el tratamiento de la biomasa con una cantidad efectiva de endo-l, 4-beta-glucanasa y beta-D-glucosidaea.

25 . Un método para degradar o convertir una biomaea que contiene celulosa y hemicelulosa, caracterizado porque comprende el tratamiento de la biomasa con la célula hospedera de conformidad con la reivindicación 20 , y la recuperación de la biomasa degradada .

26 . El método de conformidad con la reivindicación 25 , caracterizado porque comprende ademáe el tratamiento de la biomaea con una cantidad efectiva de endo-1 , 4-beta-glucanasa y beta-D-glucosidasa .