CN101137750B - 具有纤维二糖水解酶活性的多肽和编码它的多核苷酸 - Google Patents

Abstract

本发明涉及具有纤维二糖水解酶活性的分离的多肽和编码所述多肽的分离的多核苷酸。本发明还涉及包含所述多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞，以及用于制备和使用所述多肽的方法。

Description

具有纤维二糖水解酶活性的多肽和编码它的多核苷酸

对于在联邦资助的研究和开发下所进行发明的权利声明

本发明依据能源部(Department of Energy)授予的基本合同(Prime Contract)DE-AC36-98GO10337、NREL转包合同(Subcontract)No.ZCO-30017-02在政府支持下完成。政府对本发明具有一定的权利。

发明背景

发明领域

本发明涉及具有纤维二糖水解酶活性的分离的多肽和编码所述多肽的分离的多核苷酸。本发明还涉及包含所述多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞，以及用于产生和使用所述多肽的方法。

相关领域描述

纤维素是单糖葡萄糖通过β-1，4-键共价连接的聚合物。许多微生物产生水解β-键葡聚糖的酶。这些酶包括内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶。内切葡聚糖酶在随机位置消化纤维素聚合物，将其打开(opening it)以被纤维二糖水解酶攻击(attack)。纤维二糖水解酶继而从纤维素聚合物的末端释放纤维二糖分子。纤维二糖水解酶I是1，4-D-葡聚糖纤维二糖水解酶(E.C.3.2.1.91)活性，其催化纤维素、cellotetriose或任何含有β-1，4-连接的葡萄糖的聚合物中1，4-β-D-糖苷键的水解，从链的还原性末端释放纤维二糖。纤维二糖水解酶II是1，4-D-葡聚糖纤维二糖水解酶(E.C.3.2.1.91)活性，其催化纤维素、cellotetriose或任何含有β-1，4-连接的葡萄糖的聚合物中1，4-β-D-糖苷键的水解，从链的非还原性末端释放纤维二糖。纤维二糖是水溶性的β-1，4-连接的葡萄糖二聚体。β-葡糖苷酶水解纤维二糖成为葡萄糖。纤维二糖是水溶性的β-1，4-连接的葡萄糖二聚体。β-葡糖苷酶水解纤维二糖成为葡萄糖。

转化纤维素原料成为乙醇具有以下优势：大量原料现成可用，避免燃烧或填埋材料的愿望，和乙醇燃料的清洁性。木材、农业残余物、草本作物和城市固体废物被认为是用于乙醇生产的原料。这些材料主要由纤维素、半纤维素和木质素组成。一旦将纤维素转化成葡萄糖，葡萄糖将容易地由酵母发酵成乙醇。

WO04/56981公开了来自嗜热毛壳(Chaetomium thermophilum)的纤维二糖水解酶II。

本发明的目的是提供具有纤维二糖水解酶活性的多肽和编码该多肽的多核苷酸。

发明概述

本发明涉及具有纤维二糖水解酶活性的分离的多肽，所述多肽选自下组：

(a)多肽，其包含与SEQ ID NO：2的成熟多肽具有至少80％同一性的氨基酸序列；

(b)多肽，其由在至少中-高严紧条件下与以下序列杂交的核苷酸序列编码：(i)SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列，(ii)包含SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列的基因组DNA序列，或(iii)(i)或(ii)的互补链；和

(c)变体，其包含保守取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸的SEQ IDNO：2的成熟多肽。

本发明还涉及分离的多核苷酸，其编码具有纤维二糖水解酶活性的多肽，所述多核苷酸选自下组：

(a)多核苷酸，其编码的多肽包含与SEQ ID NO：2的成熟多肽具有至少80％同一性的氨基酸序列；

(b)多核苷酸，其与SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列具有至少60％的同一性；和

(c)多核苷酸，其在至少中-高严紧条件下与以下序列杂交：(i)SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列，(ii)包含SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列的基因组DNA序列，或(iii)(i)或(ii)的互补链。

在优选的方面中，成熟多肽是SEQ ID NO：2的氨基酸18至481。在另一个优选的方面中，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO：1的核苷酸52至1443。

本发明还涉及核酸构建体、重组表达载体和重组宿主细胞，其包含所述多核苷酸。

本发明还涉及用于产生具有纤维二糖水解酶活性的这种多肽的方法，其包括：(a)在有益于所述多肽产生的条件下，培养包含核酸构建体的重组宿主细胞，该核酸构建体包含编码所述多肽的多核苷酸；和(b)回收所述多肽。

本发明还涉及在洗涤剂(detergent)中和在纤维素变为葡萄糖的转化中使用具有纤维二糖水解酶活性的多肽的方法。

本发明进一步涉及核酸构建体，其包含编码蛋白质的基因，其中所述基因与编码信号肽的核苷酸序列可操作地连接，所述信号肽包含SEQ ID NO：2的氨基酸1至17或由SEQ ID NO：2的氨基酸1至17组成，其中所述基因对于所述核苷酸序列是外源的。

附图简述

图1A和1B显示土生梭孢霉(Thielavia terrestris)NRRL 8126纤维二糖水解酶(Cel6A)的cDNA序列和推定的氨基酸序列(分别为SEQ ID NOs：1和2)。

图2显示pAlLo1的限制图。

图3显示pBANe10的限制图。

图4显示pAlLo2的限制图。

图5显示pAlLo21的限制图。

图6显示PASC到葡萄糖的水解，所述水解通过来自土生梭孢霉或特异腐质霉(Humicola insolens)的Cel6A纤维二糖水解酶进行。将来自米曲霉(Aspergillus oryzae)的β-葡糖苷酶包括在纤维二糖转化为葡萄糖的试验中。

图7显示pCW076的限制图。

图8显示pCW085的限制图。

定义

纤维二糖水解酶活性：术语“纤维二糖水解酶活性”在本文中定义为1，4-D-葡聚糖纤维二糖水解酶(E.C.3.2.1.91)活性，其催化纤维素、cellotetriose或任何含有β-1，4-连接的葡萄糖的聚合物中1，4-β-D-糖苷键的水解，从链的末端释放纤维二糖。就本发明而言，通过水溶性还原糖从纤维素的释放测定纤维二糖水解酶活性，其通过Lever et al.，1972，Anal.Biochem.47：273-279的PHBAH方法测量。纤维二糖水解酶攻击的外切葡聚糖酶模式和攻击的内切葡聚糖酶模式之间的区别通过从取代的纤维素释放还原糖的相似测量方法获得，所述取代纤维素例如羧甲基纤维素或羟乙基纤维素(Ghose，1987，Pure &Appl.Chem.59：257-268)。真正的纤维二糖水解酶将具有非常高的非取代纤维素活性相对于取代纤维素活性的比率(Bailey et al.，1993，Biotechnol.Appl.Biochem.17：65-76)。

本发明的多肽具有至少20％，优选至少40％，更优选至少50％，更优选至少60％，更优选至少70％，更优选至少80％，甚至更优选至少90％，最优选至少95％，并且甚至最优选至少100％的SEQ ID NO：2的成熟多肽的纤维二糖水解酶活性。

家族6糖苷水解酶或家族GH6(Family 6 glycoside hydrolase or FamilyGH6)：术语“家族6糖苷水解酶”或“家族GH6”在本文中定义为属于根据Henrissat B.，1991，A classification of glycosyl hydrolases based on amino-acidsequence similarities，Biochem.J.280：309-316，and Henrissat and Bairoch，1996，Updating the sequence-based classification of glycosyl hydrolases，Biochem.J.316：695-696落入糖苷水解酶家族6的多肽。

分离的多肽：术语“分离的多肽”用于本文中指如通过SDS-PAGE测定的，其为至少20％纯，优选至少40％纯，更优选至少60％纯，甚至更优选至少80％纯，最优选至少90％纯，并且甚至最优选至少95％纯的多肽。

基本上纯的多肽：术语“基本上纯的多肽”在本文表示多肽制剂，所述多肽制剂按重量计含有至多10％，优选至多8％，更优选至多6％，更优选至多5％，更优选至多4％，更优选至多3％，甚至更优选至多2％，最优选至多1％，并且甚至最优选至多0.5％的与其天然结合的(associated)的其它多肽材料。因此优选所述基本上纯的多肽是按存在于制剂中的全部多肽材料的重量计至少92％纯，优选至少94％纯，更优选至少95％纯，更优选至少96％纯，更优选至少96％纯，更优选至少97％纯，更优选至少98％纯，甚至更优选至少99％纯，最优选至少99.5％纯，并且甚至最优选100％纯。

本发明的多肽优选是基本上纯的形式。具体而言，优选所述多肽是“基本上(essentially)纯的形式”，即，所述多肽制剂基本上无与其天然结合的其它多肽材料。这能够通过以下方法实现，例如，通过公知的重组方法或由经典纯化方法制备多肽。

在本文中，术语“基本上纯的多肽”与术语“分离的多肽”和“分离形式的多肽”同义。

成熟多肽：术语“成熟多肽”在本文中定义为具有纤维二糖水解酶活性的多肽，所述多肽处于其在翻译和任何翻译后修饰之后的最终形式，所述翻译后修饰例如N末端加工、C末端截短(truncation)、糖基化等。

同一性：参数“同一性”描述两种氨基酸序列之间或两种核苷酸序列之间的相关性。

就本发明而言，两种氨基酸序列之间的同一性程度通过Clustal方法(Higgins，1989，CABIOS 5：151-153)使用LASERGENE^TM MEGALIGN^TM软件(DNASTAR，Inc.，Madison，WI)测定，此用PAM250残基量表(residue weighttable)和以下多重比对参数：缺口罚分(gap penalty)10和缺口长度罚分(gaplength penalty)10。配对比对参数是Ktuple＝1、缺口罚分＝3、窗口(window)＝5和对角线(diagonal)＝5。

就本发明而言，两种核苷酸序列之间的同一程度通过Wilbur-Lipman方法(Wilbur and Lipman，1983，Proceedings of the National Academy of ScienceUSA 80：726-730)使用LASERGENE^TM MEGALIGN^TM软件(DNASTAR，Inc.，Madison，WI)测定，采用同一性表和以下多重比对参数：缺口罚分10和缺口长度罚分10。配对比对参数是Ktuple＝3、缺口罚分＝3和窗口＝20。

同源序列：术语“同源序列”在本文定义为预测的蛋白质，其在用本发明的土生梭孢霉纤维二糖水解酶的tfasty搜索(Pearson，W.R.，1999，inBioinformatics Methods and Protocols，S.Misener and S.A.Krawetz，ed.，pp.185-219)中给出低于0.001的E值(或期望分数(expectancy score))。

多肽片段：术语“多肽片段”在本文中定义为具有一个或多个氨基酸从SEQ ID NO：2的成熟多肽的氨基和/或羧基末端缺失的多肽；或其同源序列；其中所述片段具有纤维二糖水解酶活性。在优选的方面中，片段含有SEQ IDNO：2的成熟多肽或其同源序列的至少390个氨基酸残基，更优选至少415个氨基酸残基，并且最优选至少440个氨基酸残基。

亚序列：术语“亚序列(subsequence)”在本文中定义为具有一个或多个核苷酸从SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列的5’和/或3’端缺失的核苷酸序列；或其同源序列；其中所述亚序列编码具有纤维二糖水解酶活性的多肽片段。在优选的方面，亚序列含有SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列或其同源序列的至少1170个核苷酸，更优选至少1245个核苷酸，并且最优选至少1320个核苷酸。

等位变体(allelic variant)：术语“等位变体”在本文中表示占据相同染色体基因座的基因的任何两种或两种以上可选形式。等位变异通过突变天然地发生，并且可导致种群内的多态性。基因突变可以是沉默的(在编码的多肽中无改变)或可以编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位变体是由基因的等位变体编码的多肽。

分离的多核苷酸：术语“分离的多核苷酸”用于本文指如通过琼脂糖电泳所测定的至少20％纯，优选至少40％纯，更优选至少60％纯，甚至更优选至少80％纯，最优选90％纯，并且甚至最优选至少95％纯的多核苷酸。

基本上纯的多核苷酸：术语“基本上纯的多核苷酸”用于本文指无其它外来的或不期望的核苷酸的多核苷酸制剂，并且所述多核苷酸制剂处于适合于在遗传工程的蛋白质产生体系中使用的形式。因此，基本上纯的多核苷酸按重量计含有至多10％，优选至多8％，更优选至多6％，更优选至多5％，更优选至多4％，更优选至多3％，甚至更优选至多2％，最优选至多1％，并且甚至最优选至多0.5％的与其天然结合的其它多核苷酸材料。然而，基本上纯的多核苷酸可以包括天然存在的5’和3’非翻译区，例如启动子和终止子。优选基本上纯的多核苷酸是按重量计至少90％纯，优选至少92％纯，更优选至少94％纯，更优选至少95％纯，更优选至少96％纯，更优选至少97％纯，甚至更优选至少98％纯，最优选至少99％，并且甚至最优选至少99.5％纯。本发明所述多核苷酸优选为基本上纯的形式。具体而言，优选在本文公开的多核苷酸是“基本上纯的形式”，即，所述多核苷酸制剂基本上无与其天然结合的其它多核苷酸材料。在本文中，术语“基本上纯的多核苷酸”与术语“分离的多核苷酸”和“分离形式的多核苷酸”同义。所述多核苷酸可以是基因组的、cDNA、RNA、半合成的、合成的来源，或它们的任何组合。

成熟多肽编码序列：术语“成熟多肽编码序列”在本文中定义为编码具有纤维二糖水解酶活性的成熟多肽的核苷酸序列。

cDNA：术语“cDNA”在本文中定义为能够通过反转录从得自真核细胞的成熟的、已剪接的mRNA分子制备的DNA分子。cDNA缺少通常存在于相应基因组DNA中的内含子序列。起始的(initial)、初级的RNA转录物是mRNA的前体，其在作为成熟的已剪接的mRNA出现之前，要通过一系列的步骤加工。这些步骤包括通过称为剪接的过程去除内含子序列。源自mRNA的cDNA因而没有任何内含子序列。

核酸构建体：术语“核酸构建体”用于本文指单链或双链的核酸分子，所述核酸分子分离自天然存在的基因，或将所述核酸分子以本来不存在于(nototherwise exist)自然界中的方式修饰以含有核酸的片段。当所述核酸构建体含有本发明的编码序列表达所需的调控序列时，术语核酸构建体与术语“表达盒”同义。

调控序列(control sequence)：术语“调控序列”在本文定义为包括对编码本发明多肽的多核苷酸表达是必需的或有利的所有成分。各种调控序列对于编码所述多肽的核苷酸序列可以是天然的或外源的，或对于彼此是天然的或外源的。这种调控序列包括但不限于前导序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列和转录终止子。最少的情况，调控序列包括启动子和转录和翻译的终止信号。调控序列可以和用于引入特异性限制位点的接头一起提供，所述特异性限制位点促进调控序列与编码多肽的核苷酸序列编码区的连接。

可操作地连接：术语“可操作地连接”在本文表示这样的结构(configuration)，其中将调控序列置于相对于多核苷酸编码序列的合适位置，使得调控序列指导多肽编码序列的表达。

编码序列：当用于本文时术语“编码序列”的意思是直接指定其蛋白质产物的氨基酸序列的核苷酸序列。编码序列的边界通常由开读框决定，所述开读框通常以ATG起始密码子或可供选择的起始密码子例如GTG和TTG开始，并且以终止密码子，例如TAA、TAG和TGA结束。编码序列可以是DNA、cDNA或重组核苷酸序列。

表达：术语“表达”包括任何涉及多肽产生的步骤，其包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。

表达载体：术语“表达载体”在本文定义为线性的或环状的DNA分子，其包含编码本发明多肽的多核苷酸，并且所述多核苷酸与提供用于其表达的额外核苷酸可操作地连接。

宿主细胞：如本文中所使用的术语“宿主细胞”包括任何细胞类型，所述细胞类型对于使用包含本发明多核苷酸的核酸构建体或表达载体的转化、转染、转导等是易感的(susceptible)。

修饰：术语“修饰”在本文的意思是任何化学修饰由SEQ ID NO：2的成熟多肽组成的多肽；或其同源序列；以及遗传操作编码这种多肽的DNA。所述修饰可以是取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸以及取代一个或多个氨基酸侧链。

人工变体：当用在本文时，术语“人工变体”的意思是具有纤维二糖水解酶活性的多肽，所述多肽通过表达SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列或其同源序列的修饰的核苷酸序列的生物体产生。所述修饰的核苷酸序列通过人为干预(human intervention)通过修饰公开于SEQ ID NO：1的核苷酸序列或其同源序列而获得。

发明详述

具有纤维二糖水解酶活性的多肽

在第一个方面，本发明涉及分离的多肽，其包含与SEQ ID NO：2的成熟多肽具有至少60％的氨基酸序列，优选至少65％，更优选至少70％，更优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，甚至更优选至少90％，最优选95％，并且甚至最优选至少97％、98％或99％的同一性程度的氨基酸序列，所述分离的多肽具有纤维二糖水解酶活性(下文中的“同源多肽”)。在优选的方面，同源多肽具有氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：2的成熟多肽相差10个氨基酸，优选5个氨基酸，更优选4个氨基酸，甚至更优选3个氨基酸，最优选2个氨基酸，并且甚至最优选1个氨基酸。

本发明的多肽优选包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列或其等位变体；或它们的具有纤维二糖水解酶活性的片段。在优选的方面，多肽包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列。在另外的优选方面，多肽包含SEQ ID NO：2的成熟多肽。在另外的优选方面，多肽包含SEQ ID NO：2的氨基酸18至481，或其等位变体；或它们的具有纤维二糖水解酶活性的片段。在另外的优选方面，多肽包含SEQ ID NO：2的氨基酸18至481。在另外的优选方面，多肽由SEQ ID NO：2的氨基酸序列或其等位变体组成；或它们的具有纤维二糖水解酶活性的变体。在另外的优选方面，多肽由SEQ ID NO：2的氨基酸序列组成。在另外的优选方面，多肽由SEQ ID NO：2的成熟多肽组成。在另外的优选方面，多肽由SEQ ID NO：2的氨基酸18至481或其等位变体组成；或它们的具有纤维二糖水解酶活性的片段。在另外的优选方面，多肽由SEQ ID NO：2的氨基酸18至481组成。

在第二个方面，本发明涉及具有纤维二糖水解酶活性的分离的多肽，所述纤维二糖水解酶活性由多核苷酸编码，所述多核苷酸在非常低严紧条件下，优选低严紧条件下，更优选中等严紧条件下，更优选中-高严紧条件下，甚至更优选高严紧条件下，并且最优选非常高严紧条件下与以下序列杂交：(i)SEQID NO：1的成熟多肽编码序列，(ii)包含SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列的基因组DNA序列，(iii)(i)或(ii)的亚序列，或(iv)(i)、(ii)或(iii)的互补链(J.Sambrook，E.F.Fritsch，and T.Maniatis，1989，Molecular Cloning，A LaboratoryManual，2d edition，Cold Spring Harbor，New York)。SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列的亚序列含有至少100个连续的核苷酸或优选至少200个连续的核苷酸。此外，所述亚序列可编码具有纤维二糖水解酶活性的多肽片段。在优选的方面，所述成熟多肽编码序列是SEQ ID NO：1的核苷酸52至1443。

SEQ ID NO：1的核苷酸序列；或其亚序列；以及SEQ ID NO：2的氨基酸序列；或其片段；可用于设计核酸探针，以根据本领域内公知的方法从不同属和种的菌株鉴定和克隆编码具有纤维二糖水解酶活性的多肽的DNA。具体而言，根据标准的Southern印迹步骤，可将这些探针用于与感兴趣的属或种的基因组或cDNA杂交，以鉴定和分离其中相应的基因。这种探针可明显短于完整序列，但长度上应为至少14，优选至少25，更优选至少35，并且最优选至少70个核苷酸。然而优选所述核酸探针是至少100个核苷酸长度。例如，所述核酸探针可以是至少200个核苷酸，优选至少300个核苷酸，更优选至少400个核苷酸，或最优选至少500个核苷酸的长度。甚至可以使用更长的探针，例如，至少600个核苷酸，至少优选至少700个核苷酸，更优选至少800个核苷酸，或最优选至少900个核苷酸长度的核酸探针。DNA和RNA探针二者均可使用。通常将探针标记以探测相应的基因(例如，用³²P、³H、³⁵S、生物素或抗生物素蛋白(avidin)标记)。这些探针包含于本发明中。

因而，可从由这些其它生物体制备的基因组DNA或cDNA文库中筛选DNA，所述DNA与上述探针杂交并且编码具有纤维二糖水解酶活性的多肽。可以通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳，或通过其它分离技术分离来自这些其它生物体的基因组或其它DNA。可以将来自文库的DNA或分离的DNA转移至硝化纤维素(nitrocellulose)或其它合适的载体材料并且固定于其上。为了鉴定与SEQ ID NO：1；或其亚序列同源的克隆或DNA，将所述载体材料用在Sounthern印迹中。

就本发明而言，杂交表示核苷酸序列在非常低至非常高的严紧条件下与标记的核酸探针杂交，所述核酸探针对应于SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列、包含SEQ ID NO：1成熟多肽编码序列的基因组DNA序列；它的互补链；或它们的亚序列。可使用例如X射线片(X-ray film)检测在这些条件下与核酸探针杂交的分子。

在优选的方面，所述核酸探针是SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列。在另外的优选方面，所述核酸探针是SEQ ID NO：1的核苷酸52至1443。在另外的优选方面，所述核酸探针是编码SEQ ID NO：2的多肽或其亚序列的多核苷酸序列。在另外的优选方面，所述核酸探针是SEQ ID NO：1。在另外的优选方面，所述核酸探针是包含于质粒pTter6A中的多核苷酸序列，所述质粒包含于大肠杆菌NRRL B-30802中，其中所述其多核苷酸序列编码具有纤维二糖水解酶活性的多肽。在另外的优选方面，所述核酸探针是包含于质粒pTter6A中的成熟多肽编码区，所述质粒包含于大肠杆菌NRRL B-30802中。

对于长度至少100核苷酸的长探针，将非常低至非常高的严紧条件定义为在42℃，在5X SSPE、0.3％SDS、200μg/ml已剪切并且变性的鲑精DNA中预杂交和杂交，和对于非常低和低严紧性为25％的甲酰胺、对于中等和中-高严紧性为35％的甲酰胺或对于高和非常高严紧性为50％的甲酰胺，根据标准的Southern印迹法进行最佳12至24小时处理。

对于长度为至少100个核苷酸的长探针，使用2X SSC、0.2％SDS优选至少在45℃(非常低严紧性)，更优选至少在50℃(低严紧性)，更优选至少在55℃(中严紧性)，更优选至少在60℃(中-高严紧性)，甚至更优选至少在65℃(高严紧性)，并且最优选至少在70℃(非常高严紧性)将载体材料最终洗涤三次，每次15分钟。

对于长度大约15个核苷酸至大约70个核苷酸的短探针，将严紧条件定义为在比用根据Bolton和McCarthy计算(1962，Proceedings of the NationalAcademy of Sciences USA 48：1390)得出的T_m低大约5℃至大约10℃，在0.9MNaCl，0.09M Tris-HCl pH7.6，6mM EDTA，0.5％NP-40，1×Denhardt溶液，1mM焦磷酸钠(sodium pyrophosphate)，1mM磷酸二氢钠(sodium monobasicphosphate)，0.1mM ATP和0.2mg每ml的酵母RNA中，根据标准的Southern印迹步骤进行预杂交、杂交和杂交后洗涤，最佳进行12至24小时。

对于长度大约15个核苷酸至大约70个核苷酸的短探针，将所述载体材料在6×SSC加0.1％SDS中洗涤一次15分钟，并用6×SSC在比计算的T_m低5℃至10℃的温度下洗涤两次，每次15分钟。

在第三个方面，本发明涉及人工变体，所述人工变体包含保守取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸的SEQ ID NO：2的成熟多肽；或其同源序列。优选氨基酸改变对性质是不重要的(of a minor nature)，即保守的氨基酸取代或插入，其不显著影响蛋白质的折叠和/或活性；通常为1至大约30个氨基酸的小缺失；小的氨基或羧基末端延伸，例如氨基末端甲硫氨酸残基；多至大约20-25残基的小接头肽；或通过改变净电荷或其它功能，例如多组氨酸序列(poly histidine tract)、抗原表位(antigenic epitope)或结合域来促进纯化的小延伸。

保守取代的实例是在以下组之内：碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)、芳族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸)。通常不改变比活性(specific activity)的氨基酸取代是本领域已知的，并且由例如H.Neurathand R.L.Hill，1979，In，The Proteins，Academic Press，New York描述。最普遍发生的交换是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Ryr/Phe、Ala/Pro、Iys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly。

除了20个基本氨基酸，非基本氨基酸(例如4-羟脯氨酸、6-N-甲基赖氨酸、2-氨基异丁酸、异缬氨酸和α-甲基丝氨酸)可以取代野生型多肽的氨基酸残基。有限数量的非保守氨基酸、不由遗传密码编码的氨基酸和非天然氨基酸可以取代氨基酸残基。“非天然氨基酸”在蛋白质合成后已经修饰，和/或在它们的侧链具有不同于标准氨基酸的化学结构。非天然氨基酸能够以化学方法合成，并且优选是商业上能够获得的，包括六氢吡啶羧酸(pipecolic acid)、噻唑烷羧酸(thiazolidine acrboxylic acid)、脱氢脯氨酸、3-和4-甲基脯氨酸，和3，3-二甲基脯氨酸。

可供选择的是，氨基酸改变具有这样性质以使多肽的物理化学性质改变。例如，氨基酸改变可改进多肽的热稳定性，改变底物特异性，改变最适pH等。

能够根据本领域已知的方法，例如定位诱变或丙氨酸分区诱变法(Cunningham and Wells，1989，Science 244：1081-1085)来鉴定亲本多肽中的必需氨基酸。在后一技术中，将单一丙氨酸突变引入到分子中的每个残基，并且测试所得突变分子的生物活性(即，纤维二糖水解酶活性)以鉴定对于所述分子的活性关键的氨基酸残基。同样参见Hilton et al.，1996，J. Biol.Chem.271：4699-4708。酶的活性部位或其它的生物相互作用也能够通过结构的物理分析而测定，如通过以下这样的技术：如核磁共振、晶体学、电子衍射或光亲和标记，连同推定接触位点氨基酸的突变来测定。参见例如de Vos et al.，1992，Science 255：306-312；Smith et al.，1992，J. Mol.Biol.224：899-904；Wlodaver etal.，1992，FEBS Lett.309：59-64。必需氨基酸的同一性也能够从与多肽的同一性分析推断，所述多肽与根据本发明的多肽相关。

能够使用已知的诱变、重组和/或改组(shuffling)方法，然后是有关的筛选方法，例如那些由Reidhaar-Olson and Sauer，1988，Science 241：53-57；Bowieand Sauer，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：2152-2156；WO95/17413；或WO95/22625公开的那些方法来进行和测试单个或多个氨基酸取代。能够使用的其它方法包括易错聚合酶链式反应、噬菌体展示(例如，Lowman et al.，1991，Biochem.30：10832-10837；美国专利号5,223,409；WO92/06204)和区域定向的诱变(Derbyshire et al.，1986，Gene 46：145；Ner et al.，1988，DNA 7：127)。

诱变/改组方法能够与高通量、自动化的筛选方法组合以检测由宿主细胞表达的克隆的、诱变的多肽的活性(Ness et al.，1999，Nature Biotechnology 17：893-896)。能够从宿主细胞回收编码活性多肽的诱变的DNA分子，并且使用本领域内标准方法快速测序。这些方法允许快速测定感兴趣的多肽中单独氨基酸残基的重要性，并且能够应用于未知结构的多肽。

SEQ ID NO：2的成熟多肽，例如SEQ ID NO：2的氨基酸18至481中的氨基酸取代、缺失和/或插入的总数是10，优选9，更优选8，更优选7，更优选至多6，更优选5，更优选4，甚至更优选3，最优选2，并且甚至最优选1。

具有纤维二糖水解酶活性的多肽的来源

本发明的多肽可以获得自任何属的微生物。就本发明而言，术语“获得自”用于本文与给定的来源有关，意思是核苷酸序列编码的多肽由所述来源产生，或由其中插入了来自所述来源的核苷酸序列的菌株产生。在优选的方面，获得自给定来源的所述多肽是胞外分泌的。

本发明的多肽可以是细菌多肽。例如，所述多肽可以是革兰氏阳性细菌多肽例如具有纤维二糖水解酶活性的芽孢杆菌属(Bacillus)多肽，例如具有纤维二糖水解酶活性的嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacfillus amyloliquefaciens)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、灿烂芽孢杆菌(Bacilluslautus)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)多肽；或具有纤维二糖水解酶活性的链霉菌属(Streptomyces)多肽，例如，具有纤维二糖水解酶活性的浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)或鼠灰链霉菌(Streptomyces murinus)多肽；或具有纤维二糖水解酶活性的革兰氏阴性细菌多肽，例如，具有纤维二糖水解酶活性的大肠杆菌或假单胞菌属菌种(Pseudomonas sp.)多肽。

本发明的多肽也可以是真菌多肽，并且更优选酵母多肽例如具有纤维二糖水解酶活性的念珠菌属(Candida)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)或西洋蓍霉属(Yarrowia)多肽；或更优选丝状真菌多肽例如具有纤维二糖水解酶活性的枝顶孢霉属(Acremonium)、曲霉属(Aspergillus)、短梗霉属(Aureobasidium)、隐球菌属(Cryptococcus)、Filibasidium、镰孢属(Fusarium)、腐质霉属(Humicola)、Magnaporthe、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、Neocallimastix、脉孢菌属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属(Penicillium)、Piromyces、裂褶菌属(Schizophyllum)、踝节菌属(Talaromyces)、热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳属(Thielavia)、Tolypocladium或木霉属(Trichoderma)多肽。

在优选的方面，所述多肽是具有纤维二糖水解酶活性的卡尔酵母(Saccharomyces carlsbergensis)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)、Saccharomyces douglasii、克鲁弗酵母(Saccharomyces kluyveri)、诺地酵母(Saccharomyces norbensis)或卵形酵母(Saccharomyces oviformis)多肽。

在另外的优选方面，所述多肽是具有纤维二糖水解酶活性的棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、烟曲霉(Aspergillusfumigatus)、臭曲霉(Aspergillus foetidus)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉、杆孢状镰孢(Fusarium bactridioides)、Fusarium cerealis、Fusarium crookwellense、大刀镰孢(Fusarium culmorum)、禾本科镰孢(Fusarium graminearum)、禾赤镰孢(Fusarium graminum)、异孢镰孢(Fusarium heterosporum)、合欢木镰孢(Fusarium negundi)、尖镰孢(Fusarium oxysporum)、多枝镰孢(Fusariumreticulatum)、粉红镰孢(Fusarium roseum)、接骨木镰孢(Fusarium sambucinum)、肤色镰孢(Fusarium sarcochroum)、拟分枝孢镰孢(Fusarium sporotrichioides)、硫色镰孢(Fusarium sulphureum)、Fusarium torulosum、Fusariumtrichothecioides、Fusarium venenatum、特异腐质霉、Humicola lanuginosa、米黑毛霉(Mucor miehei)、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophla)、粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)、产紫青霉(Penicillium purpurogenum)、Trichodermaharzianum、康宁木霉(Trichoderma koningii)、Trichoderma longibrachiatum、里氏木霉(Trichoderma reesei)或绿色木霉(Trichoderma viride)多肽。

在另外的优选方面，所述多肽是具有纤维二糖水解酶活性的Thielaviaachromatica、Thielavia albomyces、Thielavia albopilosa、Thielavia australeinsis、Thielavia fimeti、Thielavia microspora、Thielavia ovispora、Thielavia peruviana、瘤孢梭孢壳(Thielavia spededonium)、毛梭孢壳(Thielavia setosa)、Thielaviasubthermophila、土生梭孢霉(Thielavia terrestris)、Thielavia terricola嗜热梭孢壳(Thielavia thermophila)、Thielavia variospora或Thielavia wareingii多肽。

在更优选的方面，所述多肽是土生梭孢霉多肽，并且最优选土生梭孢霉NRRL8126，例如，SEQ ID NO：2的多肽或其成熟多肽。

可理解的是对于前述的种，本发明包含完全和不完全阶段(perfect andimperfect states)两种，和其它分类学的等同物(equivalent)，例如无性型(anamorph)，无论它们已知的属名。本领域熟练技术人员将轻易地识别适合的等同物的同一性。

这些种的菌株在许多培养物保藏中心对于公众能够轻易地取得，所述保藏中心诸如美国典型培养物保藏中心(the American Type Culture Collection)(ATCC)、德意志微生物和细胞培养物保藏中心(Deutsche Sammiung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH)(DSM)、真菌菌种保藏中心(Centraalbureau Voor Schimmelcultures)(CBS)和农业研究机构保藏中心北区研究中心(Agricultural Research Service Patent Culture Collection，NorthernRegional Research Center)(NRRL)。

此外，可以使用上述的探针从其它来源，包括从自然界(例如，土壤、堆肥、水等)分离的微生物鉴定和获得这些多肽。用于从天然生境(habitat)分离微生物的技术是本领域内公知的。随后可通过相似地筛选这种微生物的基因组或cDNA文库来获得所述多核苷酸。一旦用所述探针检测到编码多肽的多核苷酸序列，就能够使用本领域普通技术人员熟知的技术将所述多核苷酸分离或克隆(参见，例如，Sambrook et al.，1989，见上文)。

本发明的多肽还包括融合多肽或可切割的融合多肽，其中将另外的多肽融合到所述多肽或其片段的N末端或C末端。通过将编码另一种多肽的核苷酸序列(或其部分)融合于本发明的核苷酸序列(或其部分)来产生融合的多肽。产生融合多肽的技术是本领域已知的，包括连接编码多肽的编码序列以使它们在阅读框中，并且融合多肽的表达在相同启动子和终止子的控制下。

多核苷酸

本发明还涉及分离的多核苷酸，所述多核苷酸包含编码具有纤维二糖水解酶活性的本发明多肽的核苷酸序列或由编码具有纤维二糖水解酶活性的本发明多肽的核苷酸序列组成。

在优选的方面，所述核苷酸序列包含SEQ ID NO：1或由SEQ ID NO：1组成。在另外的更优选的方面，所述核苷酸序列包含质粒pTter6A中包含的序列或由质粒pTter6A中包含的序列组成，所述质粒包含于大肠杆菌NRRLB-30802中。在另外的优选方面，所述核苷酸序列包含SEQ ID NO：1的成熟多肽编码区或由SEQ ID NO：1的成熟多肽编码区组成。在另外的优选方面，所述核苷酸序列包含SEQ ID NO：1的核苷酸52至1443或由SEQ ID NO：1的核苷酸52至1443组成。在另外的更优选方面，所述核苷酸序列包含质粒pTter6A中包含的成熟多肽编码区或由质粒pTter6A中包含的成熟多肽编码区组成，所述质粒包含于大肠杆菌NRRL B-30802。本发明还包含编码多肽的核苷酸序列，所述多肽包含SEQ ID NO：2或其成熟多肽的氨基酸序列或由SEQID NO：2或其成熟多肽的氨基酸序列组成，由于遗传密码子的简并性其不同于SEQ ID NO：1或其成熟多肽编码序列。本发明还涉及SEQ ID NO：1的亚序列，其编码具有纤维二糖水解酶活性的SEQ ID NO：2的片段。

本发明还涉及突变多核苷酸，所述突变多核苷酸在SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列中包含或包括至少一个突变，其中所述突变核苷酸序列编码SEQ ID NO：2的成熟多肽。在优选的方面，所述成熟多肽是SEQ ID NO：2的氨基酸18至481。

用于分离或克隆编码多肽的多核苷酸的技术是本领域内已知的，包括从基因组DNA分离，从cDNA制备，或其组合。可通过例如使用熟知的聚合酶链式反应(PCR)或表达文库的抗体筛选以检测具有共有结构特性的克隆DNA片段，从而实现从这种基因组DNA克隆本发明的多核苷酸。参见，例如，Innis et al.，1990，PCR：A Guide to Methods and Application，Academic Press，New York。可以使用其它核酸扩增方法，例如连接酶链式反应(LCR)、连接活化转录(ligated activated transcription；LAT)和基于核苷酸序列的扩增(NASBA)。可以从梭孢壳属的菌株，或从其它或相关的生物体克隆多核苷酸，并且因此可以是例如所述核苷酸序列的多肽编码区的等位基因变体或种变体(species variant)。

本发明还涉及多核苷酸，所述多核苷酸包含如下序列或由如下序列组成：与SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列具有至少60％，优选至少65％，更优选至少70％，更优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，甚至更优选至少95％，并且最优选至少97％同一性的同一性程度的核苷酸序列，所述核苷酸序列编码活性多肽。在优选的方面，所述成熟多肽编序列是SEQ ID NO：1的核苷酸52至1443。

修饰编码本发明多肽的核苷酸序列对于合成与所述多肽基本上相似的多肽是必需的。术语与所述多肽“基本上相似”指多肽的非天然存在的形式。这些多肽可能以一些工程改造的方式而不同于从其天然来源分离的多肽，例如，比活性、热稳定性、最适pH等方面不同的人工变体。可以在作为SEQ IDNO：1的多肽编码区存在的核苷酸序列，例如其亚序列的基础上，和/或通过引入如下核苷酸取代来构建变体序列：所述取代不产生由核苷酸序列编码的多肽的另外的氨基酸序列，但是符合意欲产生酶的宿主生物体的密码子选择；或者所述取代可产生不同的氨基酸序列。关于核苷酸取代的概述，参见，例如，Ford et al.，1991，Protein Expression and Purification 2：95-107。

对于本领域技术人员显而易见的是，这些取代能够在对于分子功能重要的区域之外进行，并且仍然产生活性多肽。对于由本发明的分离的多核苷酸编码的多肽活性关键的并且因此优选地不进行取代的氨基酸残基，可以根据本领域公知的方法，例如定位诱变或丙氨酸分区诱变法(参见，例如，Cunningham and Wells，1989，见上文)来鉴定。在后一的技术中，将突变引入到分子中的每个正电残基处，并且测试所得突变分子的纤维二糖水解酶活性，以鉴定对于所述分子的活性关键的氨基酸残基。底物-酶相互作用的位点也能够通过分析三维结构测定，通过如核磁共振分析、晶体学或光亲和标记这样的技术测定(参见，例如，de Vos et al.，1992，见上文；Smith et al.，1992，见上；Wlodaver et al.，1992，见上文)。

本发明还涉及编码本发明多肽的分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸在非常低的严紧条件下，优选低严紧条件，更优选中等严紧条件，更优选中-高严紧条件，甚至更优选高严紧条件，并且最优选非常高的严紧条件下，与以下序列杂交：(i)SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列，(ii)包含SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列的基因组DNA序列，或(iii)(i)或(ii)的互补链；或它们的等位基因变体和其亚序列(Sambrook et al.，1989，见上文)，如本文所定义的。在优选的方面，SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列是核苷酸52至1443。

本发明还涉及分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸通过以下方法获得：(a)在非常低、低、中等、中-高、高或非常高严紧条件下，将DNA的群体与以下序列杂交：(i)SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列，(ii)包含SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列的基因组DNA序列，或(iii)(i)或(ii)的互补链；和(b)分离杂交的多核苷酸，其编码具有纤维二糖水解酶活性的多肽。在优选的方面，SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列是核苷酸52至1443。

核酸构建体

本发明还涉及核酸构建体，所述核酸构建体包含本发明的分离的多核苷酸，其与一个或多个调控序列可操作地连接，所述调控序列在合适的宿主细胞中在与该调控序列相容的条件下指导编码序列的表达。

可以用许多方式操作编码本发明多肽的分离的多核苷酸以提供多肽的表达。依赖于表达载体，在将多核苷酸序列插入载体之前对其进行操作可能是理想的或必需的。使用重组DNA方法修饰多核苷酸序列的技术是本领域中熟知的。

调控序列可以是合适的启动子序列，其是由用于表达编码本发明多肽的多核苷酸的宿主细胞识别的核苷酸序列。启动子序列含有介导多肽的表达的转录调控序列。启动子可以是在所选的宿主细胞中显示转录活性的任何核苷酸序列，包括突变体、截断的和杂合的启动子，并且可以从编码与宿主细胞同源或异源的胞外或胞内多肽的基因获得。

用于指导本发明的核酸构建体转录，特别是在细菌宿主细胞中转录的合适启动子的实例是从下述获得的启动子：大肠杆菌lac操纵子、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)琼脂糖酶基因(dagA)、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)、嗜热脂肪芽孢杆菌产麦芽淀粉酶基因(amyM)、解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因和原核β-内酰胺酶基因(Villa-Kamaroff et al.，1978，Proceedings of the National Academy of SciencesUSA 75：3727-3731)，以及tac启动子(DeBoer et al.，1983，Proceedings of theNational Academy of Sciences USA 80：21-25)。另外的启动子在″Useful proteinsfrom recombinant bacteria″in Scientific American，1980，242：74-94中；和在Sambrook et al.，1989，见上文中有所描述。

用于指导本发明的核酸构建体在丝状真菌宿主细胞中转录的合适启动子的实例是从下列酶的基因获得的启动子：米曲霉TAKA淀粉酶、曼赫根毛霉(Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、曼赫根毛霉脂肪酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、构巢曲霉乙酰胺酶、Fusarium venenatum淀粉葡糖苷酶(WO00/56900)、Fusarium venenatum Daria(WO00/56900)、Fusarium venenatum Quinn (WO00/56900)、尖镰孢胰蛋白酶-样蛋白酶(WO96/00787)、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶IV、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉β-木糖苷酶，以及NA2-tpi启动子(来自黑曲霉中性α-淀粉酶和米曲霉丙糖磷酸异构酶基因的启动子的杂合体)；和它们的突变的、截断的和杂合的启动子。

在酵母宿主中，有用的启动子从如下酶的基因获得：酿酒酵母烯醇化酶(ENO-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH1，ADH2/GAP)、酿酒酵母丙糖磷酸异构酶(TPI)、酿酒酵母金属硫蛋白(CUP1)和酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。对于酵母宿主细胞其它有用的启动子由Romanos et al.，1992，Yeast 8：423-488描述。

调控序列也可以是合适的转录终止子序列，是由宿主细胞识别以终止转录的序列。所述终止子序列与编码多肽的核苷酸序列的3’末端可操作地连接。可以将在所选宿主细胞中有功能的任何终止子用在本发明中。

对于丝状真菌宿主细胞优选的终止子从如下酶的基因获得：米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉α-葡糖苷酶和尖镰孢胰蛋白酶-样蛋白酶。

对于酵母宿主细胞优选的终止子从如下酶的基因获得：酿酒酵母烯醇化酶、酿酒酵母细胞色素C(CYC1)和酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶。对于酵母宿主细胞其它有用的终止子由Romanos et al.，1992，见上文描述。

调控序列还可以是合适的前导序列，其是对于宿主细胞的翻译重要的mRNA非翻译区。前导序列可操作地连接于编码多肽的核苷酸序列的5’-末端。可以将在所选宿主细胞中有功能的任何前导序列用在本发明中。

对于丝状真菌宿主细胞优选的前导序列从如下酶的基因获得：米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶。

对于酵母宿主细胞合适的前导序列从如下酶的基因获得：酿酒酵母烯醇化酶(ENO-1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α因子和酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)。

调控序列也可以是聚腺苷酸化序列，其是与核苷酸序列的3’末端可操作地连接的序列，并且在转录时，宿主细胞将其识别为将聚腺苷残基添加至转录mRNA的信号。可以将在所选宿主细胞中有功能的任何聚腺苷酸化序列在本发明中使用。

对于丝状真菌宿主细胞优选的聚腺苷酸化序列从如下酶的基因获得：米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸邻氨基苯甲酸合酶、尖镰孢胰蛋白酶-样蛋白酶和黑曲霉α-葡糖苷酶。

对于酵母宿主细胞有用的聚腺苷酸化序列由Guo and Sherman，1995，Molecular Cellular Biology 15：5983-5990描述。

调控序列还可以是信号肽编码区，其编码与多肽的氨基末端相联的氨基酸序列，并且指导编码的多肽进入细胞分泌途径。核苷酸序列的编码序列5’端可固有地包含信号肽编码区，其与编码分泌多肽的编码区片段一起天然地连接在翻译阅读框中。可供选择的是，编码序列5’端可含有对于所述编码序列是异源的信号肽编码区。异源信号肽编码区在编码序列不天然地含有信号肽编码区时可能是必需的。或者，外源信号肽编码区可以简单地取代天然信号肽编码区以增强多肽的分泌。然而，指导表达的多肽进入所选宿主细胞的分泌途径，即分泌入培养基中的任何信号肽编码区可在本发明中使用。

对于细菌宿主细胞有效的信号肽编码区是从如下酶的基因获得的信号肽编码区：芽孢杆菌属NCIB 11837产麦芽糖淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶、地衣芽孢杆菌枯草蛋白酶、地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT，nprS，nprM)和枯草芽孢杆菌prsA。另外的信号肽由Simonen and Palva，1993，Microbiological Reviews 57：109-137描述。

对于丝状真菌宿主细胞有效的信号肽编码区是从如下酶的基因获得的信号肽编码区：米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、特异腐质霉纤维素酶、特异腐质霉内切葡聚糖酶V和Humicola lanuginosa脂肪酶。

在优选的方面，信号肽是SEQ ID NO：2的氨基酸1至17。在另外的优选方面，信号肽编码区是SEQ ID NO：2的核苷酸1至51，其编码SEQ ID NO：2的氨基酸1至17。

对于酵母宿主细胞有用的信号肽从酿酒酵母α-因子和酿酒酵母转化酶的基因获得。其它有用的信号肽编码区由Romanos et al.，1992，见上文，描述。

调控序列还可以是前肽编码区，其编码位于多肽氨基末端的氨基酸序列。所得多肽称为酶原(proenzyme)或前多肽(propolypeptide)(或在某些情况下称为酶原(zymogen))。前多肽通常是无活性的并且能够通过前肽的催化或自催化切割从前多肽转化成成熟活性多肽。可以从枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、酿酒酵母α-因子、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶和嗜热毁丝霉漆酶(WO95/33836)的基因获得前肽编码区。

当信号肽和前肽区二者均出现在多肽的氨基末端时，将前肽区置于紧接着(next to)多肽氨基末端，并且将信号肽区置于紧接着前肽区的氨基末端。

同样理想的是添加调节序列，其允许相对于宿主细胞的生长来调节多肽的表达。调节系统的实例是引起基因表达响应化学或物理刺激物，包括调节化合物的存在而开启或关闭的那些系统。原核系统中的调节系统包括lac、tac和trp操纵基因系统。在酵母中，可以使用ADH2系统或GAL1系统。在丝状真菌中，可以使用TAKA α-淀粉酶启动子、黑曲霉葡糖淀粉酶启动子和米曲霉葡糖淀粉酶启动子作为调节序列。调节序列的其它实例是那些允许基因扩增的序列。在真核系统中，这些序列包括在氨甲蝶呤(methotrexate)存在下扩增的二氢叶酸还原酶基因，和以重金属(with heavy metal)扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况下，编码多肽的核苷酸序列将与调节序列可操作地连接。

表达载体

本发明还涉及重组表达载体，所述重组表达载体包含本发明的多核苷酸、启动子和转录和翻译终止信号。本文中描述的多种核酸和调控序列可以结合在一起以产生重组表达载体，其可以包括一个或多个方便的限制位点以允许在这些位点插入或取代编码多肽的核苷酸序列。可供选择的是，可以通过在合适的用于表达的载体中插入包含所述序列的核苷酸序列或核酸构建体来表达本发明的核苷酸序列。在制备表达载体的过程中，将编码序列置于载体中，从而将该编码序列与合适的表达调控序列可操作地连接。

重组表达载体可以是任何载体(例如，质粒或病毒)，其能够方便地进行重组DNA步骤，并且能够产生核苷酸序列的表达。载体的选择将通常依赖于载体与将引入该载体的宿主细胞的相容性。载体可以是线状或闭合环状质粒。

载体可以是自主复制载体，即，作为染色体外实体(entity)存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如，质粒、染色体外元件、微型染色体(minichromosome)或人工染色体。载体可以含有任何用于确保自复制的手段(means)。或者，载体可以是一种当被引入宿主细胞中时，整合到基因组中并且与整合了该载体的染色体一起复制的载体。此外，可以使用单独的载体或质粒或两个或更多个载体或质粒，其共同含有待引入宿主细胞基因组的完整DNA，或可以使用转座子(transposon)。

本发明的载体优选地含有一个或多个选择性标记，其允许简单选择转化、转染、转导等的细胞。选择性标记是基因，其产物提供杀生物剂或病毒抗性、对重金属的抗性、对营养缺陷型的原养性(prototrophy to auxotrophs)等。

细菌选择性标记的实例是来自枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的dal基因，或赋予抗生素抗性的标记，例如氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素或四环素抗性。对于宿主细胞合适的标记是ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。用于丝状真菌宿主细胞的选择性标记包括但不限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(草铵膦(phosphinothricin)乙酰转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)(nitrate reductase)、pyrG(乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶)(orotidine-5’-phosphate decarboxylase)、sC(硫酸腺苷酰转移酶)和trpC(邻氨基苯甲酸合酶(anthranilate synthase))以及它们的等价物。优选用在曲霉属细胞中的是构巢曲霉或米曲霉的amdS和pyrG基因和吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)的bar基因。

本发明的载体优选含有元件，其允许载体整合入宿主细胞基因组或独立于基因组的载体在细胞中的自主复制。

为了整合入宿主细胞基因组，载体可依赖编码多肽的多核苷酸的序列或用于通过同源或非同源重组整合进入基因组的任何其它载体元件。或者，载体可以含有额外的核苷酸序列，用于指导通过同源重组整合入宿主细胞基因组染色体上的精确位置。为了增加在精确位置整合的可能性，整合元件应该优选含有足够数量的核酸，如100至10,000碱基对，优选400至10,000碱基对，并且最优选800至10,000碱基对，其与相应的目标序列具有高度同一性以增强同源重组的概率。整合元件可以是任何序列，其与宿主细胞基因组中的目标序列同源。此外，整合元件可以是非编码或编码的核苷酸序列。另一方面，可以将载体通过非同源重组整合到宿主细胞基因组中。

为了自主复制，载体可以进一步包含复制起点，其使载体能够在所述的宿主细胞中自主地复制。复制起点可以是介导自主复制的任何质粒复制子(replicator)，其在细胞中发挥功能。术语“复制起点”或“质粒复制子”在本文定义为能够使质粒或载体体内复制的核苷酸序列。

细菌复制起点的实例是在大肠杆菌中允许复制的质粒pBR322、pUC19、pACYC177和pACYC184的复制起点，和在芽孢杆菌属细菌中允许复制的质粒pUB110、pE194、pTA1060和pAMβ1的复制起点。

用于酵母宿主细胞中的复制起点的实例是2微米复制起点，ARS1，ARS4，ARS1和CEN3的组合，和ARS4和CEN6的组合。

在丝状真菌细胞中有用的复制起点的实例是AMA1和ANS1(Gems et al.，1991，Gene 98：61-67；Cullen et al.，1987，Nucleic Acids Research 15：9163-9175；WO00/24883)。分离AMA1基因和构建包含该基因的质粒或载体能够根据公开于WO00/24883中的方法完成。

可以将多于一个拷贝的本发明的多核苷酸插入宿主细胞以增加基因产物的产生。多核苷酸拷贝数的增加可通过如下方法获得：将至少一个额外拷贝的序列整合入宿主细胞基因组，或包括与多核苷酸一起的可扩增选择性标记基因，其中细胞含有选择性标记基因的扩增的拷贝，并且由此可通过在合适的选择剂(selectable agent)存在下选择多核苷酸的额外拷贝。

用于连接上述元件以构建本发明重组表达载体方法是本领域技术人员熟知的(参见，例如，Sambrook et al.，1989，见上文)。

宿主细胞

本发明还涉及重组宿主细胞，所述重组宿主细胞包含本发明的多核苷酸，将其有利地用于多肽的重组产生中。将包含本发明多核苷酸的载体引入宿主细胞中，从而将该载体保留作为染色体整合体(chromosomal integrant)或作为前述的自复制的染色体外载体。术语“宿主细胞”包含亲本细胞的任何子代，其由于复制过程中发生的突变而与亲本细胞不相同。宿主细胞的选择将很大程度依赖于编码多肽的基因和它的来源。

宿主细胞可以是单细胞微生物，例如，原核生物，或非单细胞微生物，例如，真核生物。

有用的单细胞微生物是细菌细胞，例如革兰氏阳性细菌，包括但不限于，芽孢杆菌属细胞，例如，嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、Bacillus clausii、凝结芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌；或链霉菌属细胞，例如，浅青紫链霉菌和鼠灰链霉菌，或革兰氏阴性细菌例如大肠杆菌和假单胞菌属菌种。在优选的方面，细菌宿主细胞是迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌细胞。在另外优选的方面，芽孢杆菌属细胞是嗜碱芽孢杆菌属。

可通过如下方法实现将载体引入到细菌宿主细胞：例如原生质体转化(参见，例如，Chang and Cohen，1979，Molecular General Genetics 168：111-115)，使用感受态细胞(参见，例如，Young and Spizizen，1961，Journal of Bacteriology81：823-829或Dubnau and Davidoff-Abelson，1971，Journal of MolecularBiology 56：209-221)，电穿孔(参见，例如，Shigekawa and Dower，1988，Biotechniques 6：742-751)或接合(参见，例如，Koehler and Thorne，1987，Journalof Bacteriology 169：5771-5278)。

宿主细胞还可以是真核生物，例如哺乳动物、昆虫、植物或真菌细胞。

在优选的方面，宿主细胞是真菌细胞。“真菌”用在本文包括以下门：子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)和接合菌门(Zygomycota)(如由Hawksworth et al.，In，Ainsworth and Bisby’sDictionary of The Fungi，8th edition，1995，CAB International，University Press，Cambridge，UK所定义)以及卵菌门(Oomycota)(如Hawksworth et al.，1995，见上，171页中所引用)，和所有有丝分裂孢子真菌(mitosporic fungi)(Hawksworthet al.，1995，见上)。

在更优选的方面，真菌宿主细胞是酵母细胞。“酵母”用在本文包括产子囊酵母(ascosporogenous yeast)(内孢霉目(Endomycetales))、产担子酵母(basidiosporogenous yeast)和属于半知菌类(Fungi Imperfecti)(芽孢纲(Blastomycetes))的酵母。由于酵母的分类在未来可能改变，就本发明而言，将酵母定义为如Biology and Activities of Yeast(Skinner，F.A.，Passmore，S.M.，and Davenport，R.R.，eds，Soc.App.Bacteriol.Symposium Series No.9，1980)中所述。

在更加优选的方面，酵母宿主细胞是念珠菌属、汉逊酵母属(Hansenula)、克鲁维酵母属、毕赤酵母属、酵母属、裂殖酵母属或西洋蓍霉属细胞。

在最优选的方面，酵母宿主细胞是卡尔酵母，酿酒酵母，糖化酵母，Saccharomyces douglasii，克鲁弗酵母，诺地酵母或卵形酵母细胞。在另外最优选的方面，酵母宿主细胞是乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)细胞。在另外最优选的方面，酵母宿主细胞是Yarrowia lipolytica细胞。

在另外更优选的方面，真菌宿主细胞是丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括真菌门(Eumycota)和卵菌门的亚门(如由Hawksworth et al.，1995，见上文，所定义)的所有丝状形式。丝状真菌通常的特征在于由壳多糖(chitin)、纤维素、葡聚糖、壳聚糖(chitosan)、甘露聚糖和其它复杂多糖组成的菌丝体壁。通过菌丝延伸进行营养生长，而碳分解代谢是专性需氧的。相反，酵母例如酿酒酵母的营养生长通过单细胞菌体的出芽生殖(budding)进行，而碳分解代谢可以是发酵的。

在甚至更优选的方面，丝状真菌宿主细胞是枝顶孢霉属、曲霉属、短梗霉属、烟管霉属(Bjerkandera)、Ceriporiopsis、鬼伞属(Coprinus)、革盖菌属(Coriolus)、隐球菌属、Filibasidium、镰孢属、腐质霉属、Magnaporthe、毛霉属、毁丝霉属、Neocallimastix、脉孢菌属、拟青霉属、青霉属、Phanerochaete、射脉菌属(Phlebia)、Piromyces、侧耳属(Pleurotus)、裂褶菌属、踝节菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、Tolypocladium、栓菌属(Trametes)或木霉属细胞。

在最优选的方面，丝状真菌宿主细胞是泡盛曲霉、烟曲霉、臭曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉或米曲霉细胞。在另外的最优选方面，丝状真菌宿主细胞是杆孢状镰孢、Fusarium cerealis、Fusarium crookwellense、大刀镰孢、禾本科镰孢、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖镰孢、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟分枝孢镰孢、硫色镰孢、Fusariumtorulosum、Fusarium trichothecioides或Fusarium venenatum细胞。在另外最优选的方面，丝状真菌宿主细胞是黑刺烟管菌(Bjerkandera adusta)、Ceriporiopsis aneirina、Ceriporiopsis aneirina、Ceriporiopsis caregiea、Ceriporiopsis gilvescens、Ceriporiopsis pannocinta、Ceriporiopsis rivulosa、Ceriporiopsis subrufa、Ceriporiopsis subvermispora、灰盖鬼伞(Coprinuscinereus)、毛革盖菌(Coriolus hirsutus)、特异腐质霉、Humicola lanuginosa、米赫毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙脉孢菌、产紫青霉、Phanerochaete chrysosporium、辐射射脉菌(Phlebia radiata)、Pleurotus eryngii、土生梭孢霉、Trametes villosa、Trametes versicolor、Trichoderma harzianum、康宁木霉、Trichodermalongibrachiatum、里氏木霉或绿色木霉细胞。

可以将真菌细胞通过涉及原生质体形成、原生质体转化和细胞壁重建的方法以本身公知的方式转化。用于转化曲霉属和木霉属宿主细胞的合适方法在EP238023和Yelton et al.，1984，Proceedings of the National Academy ofSciences USA 81：1470-1474中描述。用于转化镰孢属菌种的合适方法由Malardier et al.，1989，Gene 78：147-156和WO96/00787描述。可以使用由如下文献描述的方法转化酵母：Becker and Guarente，In Abelson，J.N.and Simon，M.I.，editors，Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology，Methods inEnzymology，Volume 194，pp 182-187，Academic Press，Inc.，New York；Ito et al.，1983，Journal of Bacteriology 153：163；and Hinnen et al.，1978，Proceedings ofthe National Academy of Sciences USA 75：1920。

产生方法

本发明还涉及用于产生本发明多肽的方法，其包括：(a)在有益于产生多肽的条件下培养细胞，所述细胞以其野生型形式能够产生所述多肽；和(b)回收所述多肽。在优选的方面，所述细胞是梭孢壳属细胞。在更优选的方面，所述细胞是土生梭孢霉。

本发明还涉及用于产生本发明的多肽的方法，其包括：(a)在有益于产生多肽的条件下培养宿主细胞；和(b)回收所述多肽。

本发明还涉及用于产生本发明的多肽的方法，其包括：(a)在有益于产生多肽的条件下培养宿主细胞，其中所述宿主细胞包含突变核苷酸序列，其在SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列中包含至少一个突变，其中所述突变核苷酸序列编码多肽，其包含SEQ ID NO：2的成熟多肽或由SEQ ID NO：2的成熟多肽组成，和(b)回收所述多肽。

在优选的方面，SEQ ID NO：2的成熟多肽是氨基酸18至481。

在本发明的产生方法中，使用本领域熟知的方法在适合于产生所述多肽的培养基中培养细胞。例如，可以通过在合适培养基中和允许表达和/或分离所述多肽的条件下进行的摇瓶培养，和实验室或工业发酵罐中的小规模或大规模发酵(包括连续、分批、补料分批或固态发酵)来培养细胞。使用本领域已知的方法在合适的培养基中进行培养，所述培养基包含碳源和氮源和无机盐。合适的培养基能够从商业供应商获得或可以根据公布的成分制备(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)。如果多肽分泌到营养培养基中，该多肽能够从所述培养基中直接回收。如果多肽不分泌到培养基中，其能够从细胞裂解物(lysate)回收。

可以使用本领域已知的对于所述多肽是特异性的方法来检测多肽。这些检测方法包括特异性抗体的使用、酶产物的形成或酶底物的消失。例如，酶测定(enzyme assay)可用于测定如本文所述的多肽的活性。

所得多肽可以使用本领域已知的方法回收。例如，多肽可以通过常规方法从营养培养基中回收，所述常规方法包括但不限于离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发和沉淀。

本发明的多肽可以通过多种本领域已知的方法纯化，所述方法包括但不限于层析(例如，离子交换、亲和、疏水、层析聚焦和大小排阻)、电泳方法(例如，制备型(preparative)等电聚焦)、差示溶解度(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE或提取(参见，例如，Protein Purification，J.-C.Janson and Lars Ryden，editors，VCH Publishers，New York，1989)以获得基本上纯的多肽。

植物

本发明还涉及转基因植物、植物部分或植物细胞，将其用编码具有本发明纤维二糖水解酶活性的多肽的核苷酸序列转化，从而以可回收的量表达和产生该多肽。多肽可以从植物或植物部分回收。或者，同样可以将含有该重组多肽的植物或植物部分用于改进食品或饲料的质量，例如，改进营养价值、适口性(palatability)和流变性质(rheological properties)，或用于破坏抗营养因子。

转基因植物可以是双子叶的(双子叶植物)或单子叶的(单子叶植物)。单子叶的实例是草(grasses)，如草地早熟禾(meadow grass)(蓝草(blue grass)，早熟禾属(Poa))；饲用牧草(forage grass)如羊茅属(Festuca)、黑麦草属(Lolium)；寒地型牧草(temperate grass)，如Agrostis；和谷类，例如，小麦、燕麦、黑麦、大麦、稻(rice)、高粱和玉蜀黍(maize)(玉米)。

双子叶植物的实例是烟草(tobacco)，豆类(legumes)，如羽扇豆(lupins)，马铃薯，糖甜菜(sugar beet)，豌豆，豆(bean)和大豆(soybean)和十字花科的(cruciferous)植物(十字花科(family Brassicaceae))，如花椰菜(cauliflower)，油菜籽(rape seed)和紧密相关的模型生物体拟南芥(Arabidopsis thaliana)。

植物部分的实例是茎(stem)、愈伤组织(callus)、叶(leave)、根(root)、果实(fruits)、种子(seed)和块茎(tuber)，以及包含这些部分的独立组织，例如，表皮(epidermis)、叶肉(mesophyll)、薄壁组织(parenchyma)、维管组织(vasculartissues)、分生组织(meristems)。而且具体的植物细胞区室(compartments)，如叶绿体(chloroplast)、质外体(apoplast)、线粒体(mitochondria)、液泡(vacuole)、过氧化物酶体(peroxisome)和细胞质(cytoplasm)也被认为是植物部分。此外，任何植物细胞，无论什么组织来源，都被认为是植物部分。同样地，植物部分，如分离以促进本发明的应用的具体组织和细胞也被认为是植物部分，例如胚胎(embryos)、胚乳(endosperms)、糊粉(aleurone)和种皮(seed coat)。

同样包含于本发明范围内的还有这些植物、植物部分和植物细胞的子代。

表达本发明多肽的转基因植物或植物细胞可以依照本领域已知方法构建。简而言之，通过如下方法构建所述植物或植物细胞：将编码本发明多肽的一个或多个表达构建体并入植物宿主基因组或叶绿体基因组，并且繁殖所得的修饰植物或植物细胞成为转基因植物或植物细胞。

表达载体便利地是包含编码本发明多肽的多核苷酸的核酸构建体，所述多核苷酸与在选择的植物或植物部分中表达该多核苷酸序列所必需的合适的调节序列可操作地连接。此外，表达构建体可以包含对于鉴定宿主细胞有用的选择性标记，在所述宿主细胞中整合了表达构建体和将该构建体引入到所述植物中所必需的DNA序列(后者依赖于使用的DNA引入方法)。

调节序列，例如启动子和终止子序列和任选地信号或转运序列的选择，例如基于期望何时、何处以及如何表达多肽而确定。例如，编码本发明多肽的基因的表达可以是组成型的或诱导型的，或可以是发育、阶段或组织特异性的，并且基因产物可以靶向特定的组织或植物部分例如种子或叶。调节序列由例如Tague et al.，1988，Plant Physiology 86：506所述。

对于组成性表达，可以使用35S-CaMV、玉米泛素1和水稻肌动蛋白1启动子(Franck et al.，1980，Cell 21：285-294，Christensen et al.，1992，Plant Mo.Biol.18：675-689；Zhang et al.，1991，Plant Cell 3：1155-1165)。器官特异性启动子可以是例如来自贮藏库组织(storage sink tissue)例如种子、马铃薯块茎和果实的启动子(Edwards & Coruzzi，1990，Ann.Rev.Genet.24：275-303)，或来自代谢库组织(metabolic sink tissue)例如分生组织的启动子(Ito et al.，1994，PlantMol.Biol.24：863-878)，种子特异性启动子诸如来自稻的谷蛋白(glutelin)、醇溶蛋白(prolamin)、球蛋白(globulin)或白蛋白(albumin)启动子(Wu等，1998，Plant and Cell Physiology 39：885-889)，来自豆球蛋白(legumin)B4和蚕豆(Vicia faba)的未知的种子蛋白基因的蚕豆启动子(Conrad等，1998，Journal ofPlant Physiology 152：708-711)、来自种子油体蛋白(oil body protein)的启动子(Chen等，1998，Plant and Cell Physiology 39：935-941)，来自欧洲油菜(Brassicanapus)的贮藏蛋白napA启动子，或本技术领域公知的任何其他种子特异性的启动子，例如，在WO91/14772中所描述的。此外，启动子可为叶特异性的启动子，如来自稻或番茄的rbcs启动子(Kyozuka等，1993，Plant Physiology 102：991-1000)，小球藻病毒(chlorella virus)腺嘌呤甲基转移酶(adeninemethyltransferase)基因启动子(Mitra和Higgins，1994，Plant Molecular Biology26：85-93)，或来自稻的aldP基因启动子(Kagaya等，1995，Molecular andgeneral genetics 248：668-674)，或伤口诱导的启动子，如马铃薯pin2启动子(Xu等，1993，Plant Molecular Biology 22：573-588)。同样地，所述启动子可通过非生物的处理诱导，所述非生物的处理诸如温度、干旱或盐度变化，或通过外源应用的激活所述启动子的物质诱导，例如乙醇、雌激素(oestrogens)、植物激素(plant hormones)如乙烯、脱落酸(abscisic acid)、赤霉酸(gibberellic acid)和/或重金属。

启动子增强子元件也可以用于实现本发明多肽在植物中的较高表达。例如，启动子增强子元件可以是内含子，将其置于启动子和编码本发明多肽的核苷酸序列之间。例如Xu et al.，1993，见上，公开了使用水稻肌动蛋白1基因的第一内含子以增强表达。

选择性标记基因和表达构建体的任何其它部分可以选自本领域内可用的那些。

将核酸构建体根据本领域已知的常规技术并入植物基因组，所述常规技术包括土壤杆菌属(Agrobacterium)介导的转化、病毒介导的转化、显微注射(microinjection)、粒子轰击、生物射弹转化和电穿孔(Gasser et al.，1990，Science244：1293；Potrykus，1990，Bio/Technology 8：535；Shimamoto et al.，1989，Nature 338：274)。

目前，根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)-介导的基因转移(genetransfer)，是产生转基因双子叶植物的优选方法(为了参考，见Hooykas和Schilperoort，1992，Plant Molecular Biology 19：15-38)，而且它也可以用于转化单子叶植物，虽然对于这些植物其他的转化方法是常用的。目前，产生转基因单子叶植物的优选的方法，是用粒子(用转化DNA涂覆的微观的金或钨粒子)轰击胚胎愈伤组织(embryonic calli)或发育中的胚(developing embryos)(Christou，1992，Plant Journal 2：275-281；Shimamoto，1994，Current OpinionBiotechnology 5：158-162；Vasil et al.，1992，Bio/Technology 10：667-674)。转化单子叶植物的可替换的方法，是基于原生质体转化，如由Omirulleh等，1993，Plant Molecular Biology 21：415-428所描述的。

转化之后，根据本领域熟知的方法选择具有并入的表达构建体的转化体并且再生成为完整植物。通常设计转化方法用于通过如下方法在再生期间或在后续世代中选择性消除选择基因：例如，使用与两种独立的T-DNA构建体的共转化或通过特异性重组酶位点特异性地切除选择基因。

本发明还涉及用于产生本发明多肽的方法，其包括：(a)在有益于产生多肽的条件下培养转基因植物或植物细胞，其包含编码本发明具有纤维二糖水解酶活性的多肽的多核苷酸；和(b)回收所述多肽。

去除或减少纤维二糖水解酶活性

本发明还涉及用于产生亲本细胞突变体的方法，其包含破坏或缺失编码本发明的多肽的多核苷酸序列或其部分，所述方法导致在相同条件下培养时，与亲本细胞相比突变的细胞产生较少的所述多肽。

可以使用本领域熟知的方法通过减少或消除编码本发明多肽的核苷酸序列的表达，例如，插入、破坏、取代或缺失来构建突变细胞。在优选的方面，所述核苷酸序列是失活的。待修饰或失活的核苷酸序列可以是，例如，编码区或其对活性关键的部分，或表达编码区必需的调节元件。这种调节或调控序列的实例可以是启动子序列或其功能部分，即，足以影响核苷酸序列表达的部分。用于可能的修饰的其它调控序列包括但不限于前导序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、信号肽序列、转录终止子和转录激活子。

可以通过向亲本细胞施以诱变，并且选择其中已将所述核苷酸序列的表达减少或消除的突变细胞来进行核苷酸序列的修饰或失活。诱变可能是特异性的或随机的，可以通过例如使用合适的物理或化学诱变剂进行，通过使用合适的寡核苷酸进行，或通过将所述DNA序列进行PCR产生的诱变。此外，可以通过使用这些诱变剂的任何组合来进行诱变。

适合于本发明目的的物理或化学诱变剂的实例包括紫外线(UV)照射、羟胺、N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)、O-甲基羟胺、亚硝酸、乙基甲烷磺酸酯(ethyl methane sulphonate)(EMS)、亚硫酸氢钠、甲酸和核苷酸类似物。

当使用这些试剂时，通常通过如下方法来进行所述诱变：在合适条件下存在优选的诱变剂时孵育待诱变的亲本细胞，并筛选和/或选择显示基因表达减少的或无基因表达的突变体细胞。

通过导入、取代，或去除基因中的一个或多个核苷酸或其转录或翻译所必需的调控元件可以实现所述核苷酸序列的修饰或失活。例如，可以插入或去除核苷酸从而导致引入终止密码子，去除起始密码子，或改变开放阅读框。按照本领域已知的方法通过定位诱变或PCR产生的诱变可以实现这种修饰或失活。尽管在理论上所述修饰可以在体内进行，即，直接在表达待修饰核苷酸序列的细胞上进行，但优选如下面所示例的那样在体外进行所述修饰。

消除或减少核苷酸序列通过细胞表达的便利方法的例子是基于基因取代，基因缺失，或基因破坏的技术。例如，在基因破坏方法中，将相应于内源核苷酸序列的核酸序列在体外进行诱变以产生缺陷性的核苷酸序列，随后将其转化入亲本细胞中以产生缺陷基因。通过同源重组，所述缺陷性核酸序列替代了内源性核苷酸序列。理想的是所述缺陷性核苷酸序列还编码标记，其可用于选择其中核苷酸序列被修饰或破坏的转化子。在特别优选的方面，用可选择的标记，如本文所述的那些来破坏所述核苷酸序列。

或者，可以使用与所述核苷酸序列互补的序列通过确定的反义或RNAi技术来进行所述核苷酸序列的修饰或失活。更具体地，通过导入与所述基因的核苷酸序列互补的序列可以减少或消除所述核苷酸序列通过细胞的表达，所述序列可以在细胞中转录并且能够与细胞中产生的mRNA杂交。在允许所述互补反义核苷酸序列与mRNA杂交的条件下，由此减少或消除翻译的蛋白质的量。

本发明进一步涉及亲本细胞的突变体细胞，其包含编码多肽的核苷酸序列或其调控序列的破坏或缺失，这导致与亲本细胞相比突变体细胞产生更少的多肽或不产生多肽。

这样生成的多肽缺陷型突变细胞作为表达同源和/或异源多肽的宿主细胞特别有用。所以，本发明进一步涉及生产同源或异源多肽的方法，其包括：(a)在有益于生产多肽的条件下培养突变细胞；和(b)回收所述多肽。术语“异源多肽”在本文中定义为对宿主细胞不是天然的多肽，进行了修饰以改变天然序列的天然蛋白，或作为通过重组DNA技术对宿主细胞操作的结果其表达在量上改变的天然蛋白。

在另一方面，本发明涉及通过发酵可产生本发明的多肽以及目标蛋白产物的细胞来生产基本上无纤维二糖水解酶活性的蛋白质产品的方法：在发酵之前、之中，或发酵完成之后向发酵液(fermentation broth)中添加有效量的能够抑制纤维二糖水解酶活性的试剂，从发酵液中回收目标产物，并且任选地将回收的产物进行进一步纯化。

在另一方面，本发明涉及如下生产基本上无纤维二糖水解酶活性的蛋白质产品的方法：在允许产物表达的条件下培养细胞，将得到的培养液进行组合的pH和温度处理以基本上减少纤维二糖水解酶活性，和从发酵液中回收产物。或者，可以将从培养液回收的酶制备物进行组合的pH和温度处理。所述组合的pH和温度处理可任选地与纤维二糖水解酶抑制剂处理组合使用。

依照本发明的这个方面，可能去除至少60％，优选至少75％，更优选至少85％，还更优选至少95％，并且最优选至少99％的纤维二糖水解酶活性。可使用此方法获得纤维二糖水解酶活性的完全去除。

组合的pH和温度处理优选在2-4或9-11范围内的pH和至少70-80℃范围内的温度进行一段足够的时间以达到期望的效果，通常30至60分钟是足够的。

用于培养和纯化感兴趣的产物的方法可以通过本领域已知的方法进行。

用于产生基本上无纤维二糖水解酶产物的本发明的方法在真核多肽，特别是真菌蛋白质例如酶的产生中是特别令人有兴趣的。所述酶可以选自，例如，淀粉分解酶(amylolytic enzyme)、脂肪分解酶、蛋白水解酶、纤维素分解酶(cellulolytic enzyme)、氧化还原酶或植物细胞壁降解酶。这些酶的实例包括氨肽酶、淀粉酶、淀粉葡糖苷酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、几丁质酶(chitinase)、角质酶(cutinase)、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、葡糖氧化酶、葡糖苷酶、卤素过氧化酶、半纤维素酶、转化酶、异构酶、漆酶、连接酶、脂肪酶、裂合酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、肌醇六磷酸酶、酚氧化酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转移酶、转谷氨酰胺酶或木聚糖酶。纤维二糖水解酶缺陷细胞也可以用于表达在制药上引起兴趣的异源蛋白质例如激素、生长因子、受体等。

可理解的是术语“真核多肽”不仅包括天然多肽，也包括多肽例如酶，其通过氨基酸取代、缺失或添加修饰，或通过其它这样的修饰以增强活性、热稳定性、pH耐受性等。

在另外的方面，本发明涉及基本上无纤维二糖水解酶活性的蛋白质产物，其通过本发明的方法产生。

组合物

本发明还涉及包含本发明的多肽的组合物。优选地，所述组合物富含这种多肽。术语“富含”表示所述组合物的纤维二糖水解酶活性，例如，以至少1.1的富集因数(enrichment factor)增加。

所述组合物可以包含本发明的多肽作为主要酶成分，例如，单成分组合物。或者，所述组合物可以包含多种酶活性，例如氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、几丁质酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、卤素过氧化酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果胶分解酶、肽谷氨酰胺酶(peptidoglutaminase)、过氧化物酶、肌醇六磷酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶或木聚糖酶。额外的酶可以通过例如属于以下属或种的微生物产生：曲霉属，优选棘孢曲霉、泡盛曲霉、烟曲霉、臭曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉或米曲霉；镰孢属，优选地杆孢状镰孢、Fusarium cerealis、Fusarium crookwellense、大刀镰孢、禾本科镰孢、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖镰孢、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、硫色镰孢、Fusarium toruloseum、Fusarium trichothecioides或Fusarium venenatum；腐质霉属，优选特异腐质霉或Humicola lanuginosa；或木霉属，优选Trichoderma harzianum、康宁木霉、Trichoderma longibrachiatum、里氏木霉或绿色木霉。

可以依照本领域内已知的方法制备多肽组合物，并且可以是液体或干组合物的形式。例如，所述多肽组合物可以是颗粒或微粒的形式。可以将包括于所述组合物中的多肽依照本领域内已知方法稳定。

以下提供的实施例是本发明多肽组合物的优选的用途。本发明的多肽组合物的剂量和使用该组合物的其它条件可以基于本领域内已知的方法决定。

用途

本发明还涉及使用具有纤维二糖水解酶活性的多肽或其组合物的以下方法。

将生物质降解为单糖、二糖和多糖

本发明的具有纤维二糖水解酶活性的多肽和宿主细胞可以作为来自生物质的化学的或发酵原料用于产生单糖、二糖和多肽，所述生物质用于产生乙醇、塑料或其它产品或中间物。具有纤维二糖水解酶活性的多肽可以是去除或不去除细胞的粗发酵液形式，或是半纯化或纯化的酶制剂形式。或者，本发明的宿主细胞可以在使用生物质的发酵方法中用作多肽的来源。

生物质可以包括但不限于木材资源、城市固体废物、废纸和作物残余物(参见，例如Wiselogel et al.，1995，in Handbook on Bioethanol(Charles E.Wyman，editor)，PP.105-118，Taylor & Francis，Washington D.C.；Wyman，1994，Bioresource Technology 50：3-16；Lynd，1990，Applied Biochemistry andBiotechnology 24/25：695-719；Mosier et al.，1999，Recent Progress inBioconversion of Lignocellulosics，in Advances in BiochemicalEngineering/Biotechnology，T.Scheper，managing editor，Volume 65，pp.23-40，Springer-Verlag，New York)。

生物质初生细胞壁(primary cell wall)中的主要多糖是纤维素，其次最丰富的是半纤维素，而第三是果胶。次生细胞壁(secondary cell wall)在细胞停止生长后产生，其同样含有多糖并通过聚合木质素共价交联至半纤维素而加强。纤维素是脱水纤维二糖的均聚物，并且因此是线性β-(1-4)-D-葡聚糖，而半纤维素包括多种化合物，例如木聚糖、木葡聚糖(xyloglucan)、阿拉伯木聚糖和甘露聚糖，具有系列取代基的复杂分支结构。尽管通常是多形的，存在于植物组织中的纤维素主要作为平行葡聚糖链的不溶晶体基质。半纤维素通常与纤维素以及其它半纤维素以氢键相连，其帮助稳定细胞壁基质。

将三种主要类别的糖水解酶(glycohydrolase)用于破坏纤维素生物质：

(1)“内切-1，4-β-葡聚糖酶”或1，4-β-D-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶(EC3.2.1.4)，其随机作用于可溶和不溶的1，4-β-葡聚糖底物。

(2)“外切-1，4-β-葡聚糖酶”包括1，4-β-D-葡聚糖糖水解酶(EC 3.2.1.74)，其从1，4-β-D-葡聚糖释放D-葡萄糖并且缓慢水解D-纤维二糖，和纤维二糖水解酶(1，4-β-D-葡聚糖纤维二糖水解酶，EC 3.2.1.91)，其从1，4-β-葡聚糖释放D-纤维二糖。

(3)“β-D-葡糖苷酶”或β-D-葡糖苷糖水解酶(EC3.2.1.21)，其作用于从纤维二糖和可溶的纤维糊精以及一系列糖苷释放D-葡萄糖单位。

这三个类别的酶一起协同地作用使来自生物质的天然纤维素有效解晶(decrystallization)和水解以产生还原糖。

本发明具有纤维二糖水解酶活性的多肽可以与上述酶一同使用以进一步降解生物质底物的纤维素成分(参见例如Brigham et al.，1995，in Handbook onBioethanol(Charles E.Wyman，editor)，PP.119-141，Taylor & Francis，Washington D.C.；Lee，1997，Journal of Biotechnology 56：1-24)。

能够通过酶降解生物质并将释放的糖转化为乙醇来产生乙醇。这种乙醇通常称为生物乙醇或生物燃料。可将其以少于1％-多至100％(燃料替代品)的混合物用作燃料添加剂或补充剂(extender)使用。

洗涤剂(detergent)组合物

可以将本发明的具有纤维二糖水解酶活性的多肽添加至洗涤剂组合物，并且因此成为所述洗涤剂组合物的成分。

可以将本发明的洗涤剂组合物例如配制为手洗或机洗的洗涤剂组合物，包括适于预处理沾污织物的洗衣添加剂组合物和添加了漂洗剂的织物柔软剂组合物，或将其配制为用于通常家庭硬表面清理操作的洗涤剂组合物，或配制用于手洗或机洗的洗碟(dishwashing)操作。

在具体的方面，本发明提供包含本发明的酶的洗涤剂添加剂。所述洗涤剂添加剂以及洗涤剂组合物可以包含一个或多个其它酶，例如蛋白酶、脂肪酶、角质酶、淀粉酶、糖酶、纤维素酶、果胶酶、甘露聚糖酶、阿拉伯糖酶(arabinase)、半乳聚糖酶、木聚糖酶、氧化酶，例如，漆酶和/或过氧化物酶。

通常所选酶的性质应该与选择的洗涤剂相容(即，最适pH，与其它酶和非酶成分的相容性等)，并且所述酶应该以有效量存在。

蛋白酶：合适的蛋白酶包括动物、植物或微生物来源的那些蛋白酶。微生物来源是优选的。其中包括化学修饰或蛋白质工程的突变体。所述蛋白酶可以是丝氨酸蛋白酶或金属蛋白酶，优选碱性微生物蛋白酶或胰蛋白酶样蛋白酶。碱性蛋白酶的实例是枯草杆菌蛋白酶，特别是源自芽孢杆菌属的那些，例如，枯草杆菌蛋白酶Novo、枯草杆菌蛋白酶Carlsberg、枯草杆菌蛋白酶309、枯草杆菌蛋白酶147和枯草杆菌蛋白酶168(在WO89/06279中描述)。胰蛋白酶样蛋白酶的实例是胰蛋白酶(例如，猪或牛来源)和镰孢属蛋白酶，在WO89/06270和WO94/25583中描述。

有用的蛋白酶的实例是在WO92/19729、WO98/20115、WO98/20116和WO98/34946中描述的变体，特别是在一个或多个以下位置具有取代的变体：27、36、57、76、87、97、101、104、120、123、167、170、194、206、218、222、224、235和274。

优选的商业上能够获得的蛋白酶包括Alcalase^TM、Savinase^TM、Primase^TM、Duralase^TM、Esperase^TM和Kannase^TM(Novozymes A/S)、Maxatase^TM、Maxacal^TM、Maxapem^TM、Properase^TM、Purafect^TM、Purafect OxP^TM、FN2^TM和FN3^TM(Genencor International Inc.)。

脂肪酶：合适的脂肪酶包括细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰或蛋白质工程的突变体。有用的脂肪酶的实例包括来自如下的脂肪酶：腐质霉属(同物异名嗜热霉属(Thermomyces))，例如，来自H.lanuginosa(细毛嗜热霉(T.lanuginosus))如EP258 068和EP305 216中所述，或来自特异腐质霉如WO96/13580中所述，假单胞菌属脂肪酶，例如，来自产碱假单胞菌(P.alcaligenes)或类产碱假单胞菌(P.pseudoalcaligenes)(EP218 272)、洋葱假单胞菌(Pcepacia)(EP331 376)、施氏假单胞菌(P.stutzeri)(GB1,372,034)、荧光假单胞菌(P.fluorescens)、假单胞菌属菌种(Pseudomonas sp.)菌株SD 705(WO95/06720和WO96/27002)、P.wisconsinensis(WO96/12012)、芽孢杆菌属脂肪酶，例如，来自枯草芽孢杆菌(Dartois et al.，1993，Biochemica et BiophysicaActa，1131：253-360)、嗜热脂肪芽孢杆菌(JP64/744992)或短小芽孢杆菌(B.pumilus)(WO91/16422)的脂肪酶。

其它实例是例如在WO92/05249、WO94/01541、EP407 225、EP260 105、WO95/35381、WO96/00292、WO95/30744、WO94/25578、WO95/14783、WO95/22615、WO97/04079和WO97/07202中描述的那些脂肪酶变体。

优选的商业上能够获得的脂肪酶包括Lipolase^TM和Lipolase Ultra^TM(Novozymes A/S)。

淀粉酶：合适的淀粉酶(α和/或β)包括细菌和真菌来源的那些。包括化学修饰的或蛋白质工程化的变体。淀粉酶包括例如从芽孢杆菌属获得的α-淀粉酶，例如，地衣芽孢杆菌的特殊菌株，在GB1,296,839中有更详细的描述。

有用的淀粉酶的实例是在WO94/02597、WO94/18314、WO96/23873和WO97/43424中描述的变体，特别在一个或多个以下位置具有取代的变体：15、23、105、106、124、128、133、154、156、181、188、190、197、202、208、209、243、264、304、305、391、408和444。

商业上能够获得的淀粉酶是Duramyl^TM、Termamyl^TM、Fungamyl^TM和BAN^TM(Novozymes A/S)、Rapidase^TM和Purastar^TM(Genencor InternationalInc.)。

纤维素酶：合适的纤维素酶包括细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰或蛋白质工程的突变体。合适的纤维素酶包括来自芽孢杆菌属、假单胞菌属、腐质霉属、镰孢属、梭孢壳属、枝顶孢霉属菌属的纤维素酶，例如，产生自特异腐质霉、嗜热毁丝霉和尖镰孢的真菌纤维素酶，其公开于美国专利号4,435,307、5,648,263、5,691,178和5,776,757和WO89/09259。

特别合适的纤维素酶是碱性或中性纤维素酶，其具有保护颜色的益处(colour care benefits)。这种纤维素酶的实例是在EP0 495 257、EP0 531 372、WO96/11262、WO96/29397、WO98/08940中描述的纤维素酶。其它实例是纤维素酶变体，例如在WO94/07998、EP0 531 315、美国专利号5,457,046、美国专利号5,686,593、美国专利号5,763,254、WO95/24471、WO98/12307和PCT/DK98/00299中描述的那些。

商业上能够获得的纤维素酶包括Celluzyme^TM和Carezyme^TM(NovozymesA/S)、Clazinase^TM和Puradax HA^TM(Genencor International Inc.)和KAC-500(B)^TM(Kao Corporation)。

过氧化物酶/氧化酶：合适的过氧化物酶/氧化酶包括植物、细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰或蛋白质工程的突变体。有用的过氧化物酶的实例包括来自鬼伞属的过氧化物酶，例如，来自灰盖鬼伞(C.cinereus)及其变体，如在WO93/24618、WO95/10602和WO98/15257中描述的那些。

商业上能够获得的过氧化物酶包括Guardzyme^TM(Novozymes A/S)。

通过添加含有一种或多种酶的单独的添加剂，或通过添加包含所有这些酶的组合添加剂可将洗涤剂酶包括在洗涤剂组合物中。可将本发明的洗涤剂添加剂(即单独的添加剂或组合的添加剂)配制成例如，颗粒状、液体、浆等。优选的洗涤剂添加剂剂型是颗粒，具体为无粉尘(non-dusting)颗粒，液体，具体为稳定的液体，或浆。

例如，可以如美国专利号4,106,991和4,661,452中所公开的产生无粉尘颗粒，并且可以任选地通过本领域已知的方法包覆。蜡制包覆材料(waxy coatingmaterial)的实例是具有1000至20000的平均摩尔量的聚(环氧乙烷)产品(聚乙二醇，PEG)；具有从16至50个的环氧乙烷单元的乙氧基化壬基酚；乙氧基化脂肪醇，其中醇含有从12至20个碳原子，并且其中具有15至80个环氧乙烷单元；脂肪醇；脂肪酸；和脂肪酸的单酸甘油酯和甘油二酯和甘油三酯。适合于流化床技术应用的成膜涂覆材料的实例提供于GB1483591。例如，可根据已经建立的方法通过添加多元醇例如丙二醇、糖或糖醇、乳酸或硼酸来稳定液体酶制剂。可以根据公开于EP238,216中的方法来制备保护酶。

本发明的洗涤剂组合物可以是任何方便的形式，例如，条、片剂、粉剂、颗粒、糊剂或液体。液体洗涤剂可以是含水的，通常含有多至70％的水和0-30％的有机溶剂，或非水的(non-aqueous)。

洗涤剂组合物包含一种或多种表面活性剂，其可以是非离子的，包括半极性的和/或阴离子的和/或阳离子的和/或两性离子的。所述表面活性剂通常以按重量计0.1％至60％的水平存在。

当包括于此时，所述洗涤剂将通常含有大约1％至大约40％的阴离子表面活性剂，例如线性烷基苯磺酸盐、α-烯烃磺酸酯(olefinsulfonate)、烷基硫酸盐(脂肪醇硫酸酯)、醇乙氧基硫酸盐(alcohol ethoxysulfate)、仲链烷磺酸盐(secondaryalkanesulfonate)、α-磺基脂肪酸甲酯、烷基-或烯基琥珀酸，或肥皂(soap)。

当包括于此时，洗涤剂将通常含有大约0.2％至大约40％的非离子表面活性剂，例如脂肪醇乙氧基化物、壬基苯酚乙氧基化物、烷基聚糖苷(alkylpolyglycoside)、烷基二甲基氧化胺(alkyldimethylamineoxide)、乙氧基化脂肪酸单乙醇酰胺(ethoxylated fatty acid monoethanolamide)、脂肪酸单乙醇酰胺、多羟基烷基脂肪酸酰胺或葡糖胺的N-酰基N-烷基衍生物(“葡糖酰胺(glucamide)”)。

洗涤剂可以含有0-65％的洗涤剂增清剂(builder)或复合剂例如沸石、二磷酸盐、三磷酸盐、膦酸酯(phosphonate)、碳酸盐(carbonate)、柠檬酸盐、氮川三乙酸(nitrilotriacetic acid)、乙二胺四乙酸、二亚乙基三胺五乙酸、烷基-或烯基琥珀酸、可溶硅酸盐或分层硅酸盐(例如来自Hoechst的SKS-6)。

洗涤剂可包含一种或多种聚合物。实例是羧甲基纤维素、聚(乙烯基吡咯烷酮)、聚(乙二醇)、聚(乙烯醇)、聚(乙烯吡啶-N-氧化物)、聚(乙烯咪唑)、聚羧酸酯(polycarboxylates)例如聚丙烯酸酯(polyacrylates)、马来酸/丙烯酸共聚物和甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物。

洗涤剂可以含有漂白体系，其可以包含H₂O₂源例如过硼酸盐或过碳酸盐，其可以与形成过酸的漂白激活剂例如四乙酰乙二胺或壬酰羟苯磺酸(nonanoyloxybenzenesulfonate)组合。或者，漂白体系可以包含过氧酸，例如，酰胺、二酰亚胺(imide)或砜类型的过氧酸。

本发明的洗涤剂组合物的酶可以使用常规稳定剂稳定，例如，多元醇例如丙二醇或甘油、糖或糖醇、乳酸、硼酸或硼酸衍生物，例如，芳香硼酸酯，或苯基硼酸(phenyl boronic acid)衍生物例如4-甲酰苯基硼酸(4-formylphenylboronic acid)，并可例如WO92/19709和WO92/19708中所述配制所述组合物。

洗涤剂还可以含有其它常规洗涤剂成分，例如，织物整理剂(fabricconditioner)包括粘土、泡沫促进剂、抑泡剂、防腐蚀剂、悬污剂、防污再沉积剂、染料、杀菌剂、光亮剂(optical brightener)、水溶助剂(hydrotrope)、晦暗抑制剂(tamish inhibitors)或香料。

在洗涤剂组合物中的任何酶，特别是本发明的酶，可以按相当于每升洗涤液0.01-100mg酶蛋白，优选每升洗涤液0.05-5mg酶蛋白，特别是每升洗涤液0.1-1mg酶蛋白的量添加。

本发明的酶可以额外地并入公开于WO97/07202的洗涤剂配制物，WO97/07202在本文中作为参考文献并入。

其它用途

本发明的具有纤维二糖水解酶活性的多肽还可以与其它糖水解酶和相关的酶组合使用，如本文所述，在纺织品处理中作为生物抛光剂和用于减少起毛(fuzz)、起球(pilling)、质地(texture)改变和石洗(stonewashing)(N.K.Lange，in P.Suominen，T. Reinikainen(Eds.)，Trichoderma reesei cellulases and OtherHydrolases，Foundation for Biotechnical and Industrial Fermentation Research，Helsinki，1993，pp.263-272)。此外，所述多肽还可以与其它糖水解酶和相关的酶组合使用，如本文所述，在木材加工中用于生物制浆或剥皮，在造纸中用于纤维修饰、漂白和减少精制(refining)能量成本、白水(white water)处理，对于废水循环、木素纤维素的(lignocellulosic)纤维循环如脱墨(deinking)和二级纤维加工和木材残余物利用是重要的(S.D，Mansfield and A.R.Esteghlalian inS.D，Mansfield and J.N.Saddler(Eds.)，Applications of Enzymes toLignocellulosics，ACS Symposium Series 855，Washington，D.C.，2003，pp.2-29)。

信号肽

本发明还涉及核酸构建体，所述核酸构建体包含编码蛋白质的基因，该基因与编码信号肽的核苷酸序列可操作地连接，所述信号肽包含SEQ ID NO：2的氨基酸1至17或由SEQ ID NO：2的氨基酸1至17组成，其中所述基因对于该核苷酸序列是外源的。在优选的方面，所述核苷酸序列包含SEQ ID NO：1的核苷酸1至51。在另外的优选方面，所述核苷酸序列由SEQ ID NO：1的核苷酸1至51组成。

本发明还涉及包含这种核酸构建体的重组表达载体和重组宿主细胞。

本发明还涉及用于产生蛋白质的方法，其包括(a)在适合于产生所述蛋白质的条件下培养这样的重组细胞；和(b)回收所述蛋白质。

所述蛋白质对于宿主细胞可以是天然的或异源的。术语“蛋白质”在本文的意思不是指特定长度的编码产物，并且因此包含肽、寡肽和蛋白质。术语“蛋白质”还包含组合以形成编码产物的两种或两种以上多肽。所述蛋白质还包括杂合多肽，其包含部分或全部多肽序列的组合，所述多肽序列从至少两种不同的蛋白质获得，其中一个或多个对于宿主细胞可以是异源或天然的。蛋白质进一步包括上述蛋白质和杂合蛋白质天然存在的等位基因变异和工程的变异。

优选蛋白质是激素或其变体、酶、受体或其部分、抗体或其部分，或报道蛋白(reporter)。在更优选的方面，所述蛋白质是氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂合酶(lyase)、异构酶或连接酶。在更加优选的方面，所述蛋白质是氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、几丁质酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、转化酶、漆酶、另外的脂肪酶、甘露糖苷酶、变位酶(mutanase)、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、肌醇六磷酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶或木聚糖酶。

基因可以从任何原核、真核或其它来源获得。

通过以下实施例进一步对本发明进行描述，但不应将其理解为对本发明范围的限制。

实施例

材料

作为缓冲液和底物使用的化学品是至少试剂等级的商业产品。

SDS-PAGE凝胶、上样缓冲液和电泳缓冲液来自Invitrogen/Novex(Carlsbad，CA)。测序等级修饰的胰蛋白酶来自Princeton Separations(Aldelphia，NJ)。BioSafe Commassie Blue G250蛋白质染色剂(protein stain)来自BioRadLaboratories(Hercules，CA)。

菌株

将米曲霉Jal250菌株(WO99/61651)用于表达具有纤维二糖水解酶活性的土生梭孢霉多肽。将土生梭孢霉NRRL菌株8126用作6A家族蛋白质(Family 6A protein)的基因的来源。

培养基

PDA平板由每升39克马铃薯葡糖琼脂组成。

NNCYP培养基由如下物质组成：每升5.0g NH₄NO₃、0.5g MgSO₄·7H₂O、0.3g of CaCl₂、2.5g柠檬酸、1.0g Bacto Peptone、5.0g酵母提取物、1ml COVE痕量金属溶液，和足够的K₂HPO₄以达到最终pH大约5.4。

NNCYPmod培养基由如下物质组成：每升1.0g NaCl、5.0g NH₄NO₃、0.2g MgSO₄·7H₂O、0.2g CaCl₂、2.0g柠檬酸、1.0g Bacto Peptone、5.0g酵母提取物、1ml COVE痕量金属溶液，和足够的K₂HPO₄以达到最终pH大约5.4。

COVE痕量金属溶液由如下物质组成：每升0.04g Na₂B₄O₇·10H₂O、0.4gCuSO₄·5H₂O、1.2g FeSO₄·7H₂O、0.7g MnSO₄·H₂O、0.8g Na₂MoO₂·2H₂O和10g ZnSO₄·7H₂O。

LB平板由如下物质组成：每升10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、5g氯化钠和15g Bacto Agar。

MDU2BP培养基由下述物质组成：每升45g麦芽糖、1g MgSO₄·7H₂O、1g NaCl、2g K₂HSO₄、12g KH₂PO₄、2g尿素和500μl AMG痕量金属；将pH调节至5.0并且随后用0.22μm过滤装置过滤除菌。

AMG痕量金属由如下物质组成：每升14.3g ZnSO₄·7H₂O、2.5gCuSO₄·5H₂O、0.5g NiCl₂·6H₂O、13.8g FeSO₄·7H₂O、8.5g MnSO₄·7H₂O和3g柠檬酸。

SOC培养基由如下物质组成：2％胰蛋白胨、0.5％酵母提取物、10mMNaCl、2.5mM KCl、10mM MgCl₂和10mM MgSO₄；通过高压灭菌并且随后添加过滤灭菌的葡萄糖至20mM。

冷冻培养基由60％SOC和40％甘油组成。

2X YT培养基平板由如下物质组成：每升16g胰蛋白胨、10g酵母提取物、5g NaCl和15g Bacto琼脂，通过高压灭菌。

YP培养基由每升10g酵母提取物和20g Bactopeptone(Difco)组成。

纤维素酶诱导培养基(CIM)由如下物质组成：每升20g纤维素、10g CornSteep Solids、1.45g(NH₄)₂SO₄、2.08g KH₂PO₄、0.28g CaCl₂、0.42gMgSO₄·7H₂O和0.42ml痕量金属溶液。

痕量金属溶液由如下物质组成：每升216g FeCl₃·6H₂O、58g ZnSO₄·7H₂O、27g MnSO₄·H₂O、10g CuSO₄·5H₂O、2.4g H₃BO₃和336g柠檬酸。

实施例1：编码来自土生梭孢霉NRRL 8126的家族6纤维二糖水解酶的多肽通过串联质谱法的肽测序

将来自在PDA上生长的土生梭孢霉NRRL 8126新鲜平板的三个琼脂糖圆柱形样品(plug)接种到补充1.5％葡萄糖的100ml NNCYP培养基中，并且于42℃和200rpm在定轨摇床(orbital shaker)上温育25小时。将50ml这种培养物用于接种1.8升补充0.4％葡萄糖和每升52g粉状纤维素的NNCYP培养基，并且于42℃温育。通过按需添加15％氢氧化铵或5N磷酸将pH控制在5.0。

在42℃，最小溶氧25％以1.0VVM气流和1100rpm搅拌进行发酵。将进料培养基(feed medium)输送至2升发酵容器中，在0小时以进料速率6.0-8.0g/小时持续120小时。汇集的(pooled)培养物在3000xg离心10分钟，并且将上清液通过具有玻璃纤维预滤器的一次性过滤装置(Nalgene，RochesterNY)过滤。将滤出液冷却至4℃储存。

将0.3ml等分试样(aliquot)的滤出液用10％三氯乙酸(TCA)-80％丙酮在冰上沉淀20分钟。将悬浮液于13,000xg离心10分钟。将上清液移除并且将残余的蛋白质沉淀用冷丙酮冲洗。将蛋白质沉淀溶解于30μl具有50mM二硫苏糖醇(DTT)的1X十二烷基硫酸锂(lithium dodecyl sulfate)(LDS)SDS-PAGE上样(loading)缓冲液中，并且加热至80℃持续10分钟。使用7cm4-12％NuPAGE Bis-Tris SDS-PAGE梯度凝胶和2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)电泳缓冲液通过SDS-PAGE分离15μl样品。在根据制造商推荐方案(Invitrogen，Carlsbad，CA)的还原条件下进行SDS-PAGE。将凝胶从盒中去除，用去离子水冲洗3次，每次至少5分钟，并且用Bio-Safe Coomassie Stain(BioRadLaboratories，Hercules，CA)染色1小时，接着用双蒸馏水脱色30分钟以上。将在大约66kDa和73kDa观察到的蛋白质条带切除，并且用100mM碳酸氢铵中的50μl 10mM DTT还原30分钟。在还原之后，将凝胶碎片用50μl在100mM碳酸氢铵中的55mM碘乙酰胺烷基化20分钟。让干燥的凝胶碎片在胰蛋白酶消化溶液(50mM碳酸氢铵中6ng/μl测序级胰蛋白酶)中于室温再水合30分钟，接着于40℃消化8小时。每个描述的反应步骤继之以用期望的溶液多次洗涤和预洗涤。将50μl乙腈用于在反应之间使凝胶碎片脱水，并且将它们在步骤之间空气干燥。将肽用HPLC级水中的1％甲酸/2％乙腈提取两次各30分钟。将肽提取溶液转移至96孔PCR型微量滴定板，其已冷却至10-15℃。将含有回收肽溶液的微量滴定板密封以防止蒸发，并储存于4℃直到能够进行质谱分析。

对于通过串联质谱法的重新肽测序(de-novo peptide sequencing)，使用Q-Tof micro^TM，混合正交四极飞行时间质谱仪(hybrid orthogonal quadrupoletime-of-flight mass spectrometer)(Waters Micromass

MS Technologies，Milford，MA)用于LC/MS/MS分析。Q-Tof micro^TM配以Ultimate^TM毛细管和纳米-流(nano-flow)HPLC体系，该体系已与FAMOS微量自动进样器和Switchos II柱转换设备(LCPackings，San Francisco)连接，用于使样品浓缩和脱盐。将样品加样到装配到注射环的保护柱(guard column)(300μm ID X 5cm，C18 pepmap)上，并且用0.1％的甲酸水溶液以40μl/分钟使用Switchos II泵洗涤2分钟。将肽在75μm ID x 15cm，C18，3μm，100

 PepMap^TM(LC Packings，SanFrancisco)纳米流(nanoflow)融合毛细管柱(nanoflow fused capillary column)上使用NAN-75校准器(calibrator)(Dionex，Sunnyvale，CA)以175nl/分钟的流速从175μl/分钟的分流(split flow)分离。在45分钟间隔期间使用5％至80％乙腈的0.1％甲酸溶液的分步洗脱梯度。在215nm监测柱洗提液，并且通过配有纳喷射界面(nanospray interface)的电喷射离子源将其导入Q-Tof micro^TM。Q-Tof micro^TM完全由微处理器控制，使用Masslynx^TM软件3.5版本(WatersMicromass

MS Technologies，Milford，MA)。数据以全扫描(survey scan)方式获得，并且质量范围从m/z 400至1990，用于MS至MS/MS的转换标准包括大于每秒10.0计数的离子强度(ion intensity)和+2、+3和+4的电荷状态。使用1.9秒扫描时间和0.1秒内部扫描时间(inter-scan time)能够获得至多4种共洗脱种(co-eluting species)的分析谱。通常使用65伏特的椎体电压(cone voltage)，并将碰撞能量程序设定为根据洗脱肽的质量和电荷状态而改变并且在10-60伏特范围内。将获得的谱以自动化的方式组合、平滑化(smoothed)和居中(centered)并且产生峰列表。使用ProteinLynx^TM Global Server 1.1软件(WatersMicromass

MS Technologies，Milford，MA)针对所选公开和私有的数据库搜索这种峰列表。评估来自ProteinLynx^TM搜索的结果并且通过评估感兴趣的每种离子的MS/MS谱来进一步分析未鉴定的蛋白质，并通过鉴定y和b离子系列和将质量差异匹配至合适的氨基酸来测定重新的(de-novo)序列。

通过质谱从重新测序获得的肽序列得自大约73kDa的多肽凝胶条带的几种多(multiply)电荷离子。将574.25m/z序列的双电荷胰蛋白酶(doubly chargedtryptic)肽离子测定为Val-Pro-Ser-[Phe或氧化的Met]-Gln-Trp-[Ile或Leu]-Asp-Arg(SEQ ID NO：2的氨基酸163至171)。将982.42的第二种双电荷胰蛋白酶肽离子测定为Gly-Ala-Asn-Pro-Pro-Tyr-Ala-Gly-[Ile或Leu]-[Phe或氧化的Met]-Val-Val-Tyr-Asp-[Leu或Ile]-Pro-Asp-Arg(SEQ ID NO：2的氨基酸193至210)。将60kDa蛋白质条带同样使用胰蛋白酶在凝胶内消化并且将所得的肽回收。将1159.02的双电荷肽离子重新测序测定为[Ile或Leu]-[Ile或Leu]-[Phe或氧化的Met]-Val-[Ile或Leu]-Glu-Pro-Asp-Ser-[Leu或Ile]-Ala-Asn-Met-Val-Thr-Asn-[Leu或Ile]-Asn-Val--Ala-Lys(SEQ ID NO：2的氨基酸250至270)。

实施例2：表达序列标签(EST)cDNA文库构建

将来自土生梭孢霉NRRL 8126的24小时液体培养物(250ml瓶中的50mlNNCYPmod加1％葡萄糖，45℃，200rpm)的2ml等分试样用于接种500ml摇瓶，所述500ml摇瓶含有补充2％Sigmacell-20的100ml NNCYPmod培养基。将培养物在45℃、200rpm温育3天。将菌丝体通过过滤收获，所述过滤通过具有玻璃纤维预过滤器的布氏漏斗(Buchner funnel)(Nalgene，Rochester NY)，用10mM Tris-HCl-1mM EDTA pH8(TE)洗涤两次，并且在液氮中快速冷冻。

使用如下方法分离总RNA。将土生梭孢霉NRRL 8126的冷冻菌丝体在电动咖啡研磨机中研磨。在50ml Falcon管中将研磨的材料与20ml Fenazol(Ambion，Inc.，Austin，TX)1∶1 v/v混合。一旦将菌丝体悬浮，使用氯仿提取并且使用苯酚-氯仿-异戊醇25∶24∶1 v/v/v的混合物提取三次。通过添加1/10体积的3M乙酸钠pH5.2和1.25体积的异丙醇从所得水相沉淀RNA。将沉淀的RNA通过在4℃ 12,000xg离心30分钟回收。将最终的固体沉淀用冷的70％乙醇洗涤，空气干燥，并且在500ml焦碳酸二乙酯处理的水(DEPC水)中重悬。

用Agilent Bioanalyzer 2100(Agilent Technologies，Inc.，Palo Alto，CA)评估纯化的RNA的质和量。将聚腺苷酸化mRNA从360μg总RNA中分离，所述分离借助Poly(A)Purist Magnetic Kit(Ambion，Inc.，Austin，TX)根据制造商的说明书进行。

为了创造cDNA文库，使用CloneMiner^TM Kit(Invitrogen，Carlsbad，CA)来构建定向文库(directional library)，其不需要使用限制酶克隆，因此降低嵌合克隆的数目和大小偏差。

为了确保cDNA的成功合成，平行进行具有两种不同浓度mRNA(2.2和4.4μg的聚(A)⁺mRNA)的两个反应。将mRNA样品与Biotin-attB2-Oligo(dt)引物(CloneMiner^TM Kit，Invitrogen，Carlsbad，CA)、1X第一链缓冲液(Invitrogen，Carlsbad，CA)、2μl的0.1M二硫苏糖醇(DTT)、10mM dATP、dTTP、dGTP、和dCTP的混合物和水分别混合至终体积18和16μl。

将反应混合物小心地混合，并且随后添加2和4μl的SuperScript^TM反转录酶和在45℃温育60分钟以合成第一互补链。为了第二链的合成，向各个第一链反应添加30μl的5X第二链缓冲液(Invitrogen，Carlsbad，CA)、3μl的10mM dATP、dTTP、dGTP和dCTP混合物、10单位大肠杆菌DNA连接酶、40单位大肠杆菌DNA聚合酶I和2单位大肠杆菌RNase H至总体积150μl。随后将混合物在16℃温育2小时。两小时温育之后向各个反应添加2μlT4-DNA聚合酶并且在16℃温育5分钟以产生平端cDNA。将cDNA反应使用苯酚-氯仿-异戊醇25∶24∶1 v/v/v的混合物提取并且在20μg糖原、120μl 5M乙酸铵和660μl乙醇中沉淀。在4℃ 12,000xg离心30分钟之后，将cDNA沉淀用冷的70％乙醇洗涤，在真空中干燥2-3分钟，并且在18μl DEPC水中重悬。向各个重悬的cDNA样品中添加10μl 5X连接(adapted)缓冲液、10μgattB1衔接头(adapter)(和试剂盒一起提供；以下所示的双链序列)、7μl 0.1 MDTT和5单位的T4 DNA连接酶。

5′-TCGTCGGGGACAACTTTGTACAAAAAAGTTGG-3′(SEQ ID NO：3)

3′-CCCCTGTTGAAACATGTTTTTTCAACCp-5′(SEQ ID NO：4)

连接反应在16℃温育过夜。过量的衔接头通过在1ml Sphacryl^TM S-500HR树脂(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)中的大小排阻层析去除。根据试剂盒的说明书收集柱级分，并且将级分3至14使用Agilent Bioanalizer分析以测定其中attB1衔接头开始洗脱的级分。这种分析显示衔接头在大约级分10或11开始洗脱。对于第一文库汇集级分6至11，而对于第二文库汇集级分4-11。

通过根据Gateway System规程(Invitrogen，Carlsbad，CA)的同源DNA重组进行cDNA的克隆，所述Gateway System规程使用BP Clonase^TM(Invitrogen，Carlsbad，CA)作为重组酶。每个BP Clonase^TM重组反应含有大约70ng的attB侧接的cDNA(attB-flanked-cDNA)、250ng pDONR^TM222、2μl 5X BPClonase^TM缓冲液、2μl TE和3μl BP Clonase^TM。将重组反应在25℃温育过夜。

随后将热失活的BP重组反应分成6个等分试样并且在BioRad GenePulser II(BioRad，Hercules，CA)上使用如下参数电穿孔入ElectroMax^TMDH10B电感受态细胞(Invitrogen，Carlsbad，CA)中：电压：2.0kV，电阻：200Ω电容25μF。将电穿孔的细胞在1ml SOC培养基中重悬，并且在37℃伴随持续摇动(200rpm)温育60分钟。温育期之后，将转化的细胞汇集并且与冷冻培养基1∶1混合。将200μl等分试样取出用于文库滴定，并且随后将剩余的每种文库等分至1.8ml冷冻管(Wheaton Science Products，Millville，NJ)中，在-80℃冷冻贮藏。

制备每个文库的四个系列的稀释：1/100、1/1000、1/10⁴、1/10⁵。从每种稀释将100μl涂布于补充50μg每ml卡那霉素的150mm LB平板上并且在37℃温育过夜。计数每个稀释平板上的菌落数目并且用于计算每个文库中转化体的总数。

显示第一文库具有540万独立克隆而第二文库显示具有900万独立克隆。

实施例3：模板制备和cDNA克隆的核苷酸测序

将来自两种文库的等分试样混合并且涂布到补充50μg每ml卡那霉素的25×25cm LB平板上。将独立克隆借助于Genetix QPix Robot(Genetix Inc.，Boston，MA)排列在96孔平板上，所述平板含有补充50μg每ml卡那霉素的100μl LB。从总共4320个单独克隆获得四十五个96孔平板。将平板在37℃以200rpm摇动温育过夜。温育过后，将100μl无菌的50％甘油添加至每个孔。将转化体借助96针工具(Boekel，Feasterville，PA)复制到第二深碟96孔微量培养平板(Advanced Genetic Technologies Corporation，Gaithersburg，MD)中，所述深碟96孔微量培养平板在每个孔中含有补充50μg每ml卡那霉素的1mlMagnificent Broth^TM(MacConnell Research，San Diego，CA)。将最初的微量滴定板在-80℃冷冻贮藏。将第二深碟平板在旋转振荡器上剧烈搅拌(300rpm)于37℃温育过夜。为了避免溢出和交叉污染，并且使其能够充分通气，将每个第二培养平板用聚丙烯垫(Advanced Genetic Technologies Corporation，Gaithersburg，MD)和塑料微量滴定碟盖覆盖。使用MWG Robot-Smart 384(MWG Biotech Inc.，High Point，NC)和Montage Plasmid Miniprep Kits(Millipore，Billerica，MA)制备质粒DNA。

使用Big-Dye^TM(Applied Biosystems，Inc.，Foster City，CA)终止子化学(terminator chemistry)(Giesecke et al.，1992，Journal of Virology Methods 38：47-60)和M13 Forward(-20)测序引物进行测序反应，所述引物如下：

5’-GTAAAACGACGGCCAG-3’(SEQ ID NO：5)

测序反应使用Robot-Smart 384(MWG Biotech Inc.，High Point，NC)以384孔形式进行，并且使用Millipore MultiScreen Seq384 Sequencing Clean-up Kits(Millipore，Billerica，MA)进行终止子去除(terminator removal)。反应含有6μl质粒DNA和4μl测序主混合(master-mix)，所述主混合含有1μl 5X测序缓冲液(Millipore，Billerica，MA)、1μl Byg-Dye^TM终止子(Applied Biosystems，Inc.，Foster City，CA)、1.6pmol M13 Forward引物和1μl水。单通道DNA测序使用ABI PRISM Automated DNA Sequencer Model 3700(Applied Biosystems，Foster City，CA)进行。

实施例4：cDNA克隆的DNA序列数据分析

将碱基判定(calling)、质量数值分配和载体修整(vector trimming)在PHRED/PHRAP软件(University of Washington，Seattle，WA)的帮助下进行。EST的聚类分析(clustering abalysis)使用Parcel Transcript Assembler v.2.6.2.(Paracel，Inc.，Pasadena，CA)进行。EST聚类分析显示存在395独立簇。

将装配的EST序列针对PIR和ERDBP数据库进行序列同源性分析，在32节点Linux群集(32-node Linux cluster)(Paracel，Inc.，Pasadena，CA)上使用Blastx程序(Altschul et.al.，1990，J.Mol.Biol.215：403-410)进行所述分析，使用BLOSUM 62矩阵(Henikoff，1992，Proc.Natl.Acad. Sci.USA 89：10915-10919)。从这些之中，246个对于公共和私有的蛋白质数据库中的已知基因具有一致的结果(hit)，并且149个对于这些数据库无显著一致的结果。在这246个基因中，13个具有针对充分表征的糖基水解酶基因同源物的一致的结果。

实施例5：编码家族6纤维二糖水解酶(Cel6A)的cDNA克隆的鉴定

编码家族6纤维二糖水解酶(Cel6A)的cDNA克隆最初通过其与来自特异腐质霉(NR34811679)的家族6A蛋白质的同源性而鉴定。分析指出两种蛋白质在蛋白质水平的120个氨基酸(360个碱基对)的延伸(stretch)内是50％同一的。在这样初始鉴定克隆之后，从原始冷冻原种(stock)平板恢复(retrieve)Tter11C9，并且在补充50μg每ml卡那霉素的LB平板上划线。将平板在37℃温育过夜，并且在次日使用来自平板的单菌落接种3ml补充150μg每ml卡那霉素的LB。将液体培养物在37℃温育过夜，并且使用Qiagen BioRobot 9600(QIAGEN，Inc.，Valencia，CA)制备质粒DNA。使用如上所述的Big-Dye^TM终止子化学再次测序克隆Tter11C9质粒DNA，使用M13 Forward和如下所示的Po1y-T引物测序克隆的3’端。

5′-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN-3′(SEQ ID NO：6)

其中V＝G、A、C和N＝G、A、C、T

新序列信息的Blastx同源性分析指出3’引发端(prime end)与Talaromycesemersonii家族6蛋白质具有非常高的同一性。这些蛋白质在39氨基酸的延伸段(over a 39 amino acid stretch)是97％同一的。同样，使用Interproscan程序(Zdobnov and Apweiler，2001，Bioinformatics 17：847-8.)分析克隆Tter11C9的5’引发端显示由克隆Tter11C9编码的基因含有糖基水解酶家族6蛋白质的序列特征。从起始氨基酸甲硫氨酸起的202个氨基酸存在称为Prosite型PS00655(Sigrist et al.，2002，Brief Bioinform.3：265-274)的序列特征，这确认克隆Tter11C9编码土生梭孢霉糖基水解酶家族6基因。

cDNA序列(SEQ ID NO：1)和推导的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)示于图1A和1B。cDNA克隆编码481氨基酸的多肽。基因的cDNA克隆的％G+C含量是66.9％，并且成熟蛋白质编码区域(SEQ ID NO：1的核苷酸52至1443)的％G+C含量是66.7％。使用SignalP软件程序(Nielsen et al.，1997，ProteinEngineering 10：1-6)预测出17残基的信号肽。预测的成熟蛋白质含有464氨基酸具有49.3kDa的分子量。

糖基水解酶家族6序列的比较比对使用Clustal W方法(Higgins，1989，见上文)测定，所述方法使用LASERGENE^TM MEGALIGN^TM软件(DNASTAR，Inc.，Madison，WI)，使用PAM250残基权重表(residue weight table)和下列多重比对参数：缺口罚分10和缺口长度罚分10。配对比对参数是Ktuple＝1、缺口罚分＝3、窗口＝5和对角线＝5。比对说明土生梭孢霉Cel6A纤维二糖水解酶基因的推导的氨基酸序列与嗜热毛壳(Chaetomium thermophilum)纤维二糖水解酶基因(Geneseqp ADP84824)的推导的氨基酸序列共有74％的同一性。

一旦确定了含有pTter11C9的克隆Tter11C9的同一性，将重新定名为pTter6A的来自这种克隆的质粒DNA的0.5μl等分试样转移到大肠杆菌TOP10细胞的小管(Invitrogen，Carlsbad，CA)中，轻轻地混合并且在冰上温育10分钟。随后将细胞在42℃热休克(heat-shock)30秒并且再次在冰上温育2分钟。将细胞在250μl SOC培养基中重悬，并且持续摇动(200rpm)在37℃温育60分钟。温育期之后，将两个30μl等分试样涂布于补充50μg每ml卡那霉素的LB平板上，并且在37℃温育过夜。次日挑取单菌落并且划线接种至三个1.8ml冷冻小管，所述冷冻小管含有大约1.5ml补充50μg每ml卡那霉素的LB琼脂糖。将小管用PetriSeal^TM(Diversified Biotech，Boston MA)密封，并作为NRRL B-30802保藏在农业研究机构保藏中心(AgriculturalResearch Service Patent Culture Collection)，Northern Regional Research Center，1815 University Street，Peoria，Illinois，61604，保藏日期为2004年12月17日。

实施例6：pAlLo2表达载体的构建

通过修饰pBANe6(美国专利号6,461,837)构建表达载体pAlLol，所述pBANe6包含来自黑曲霉中性α-淀粉酶和米曲霉磷酸丙糖异构酶的基因启动子的杂合体(NA2-tpi启动子)、黑曲霉淀粉葡糖苷酶终止子序列(AMG终止子)和构巢曲霉乙酰胺酶基因(amdS)。使用所述的Big-Dye^TM终止子化学通过测序验证所有诱变步骤。通过如下方法进行pBANe6的修饰：首先通过定位诱变从amdS选择标记消除在位置2051、2722和3397bp的三个NcoI限制位点。将所有改变设计为“沉默的”，保留amdS基因产物的实际蛋白质序列不变。根据制造商的说明书用GeneEditor^TM in vitro Site-Directed Mutagenesis Kit(Promega，Madison，WI)，使用如下引物(加下划线的核苷酸代表改变的碱基)同时进行这三个位点的去除：

AMDS3NcoMut(2050)：

5’-GTGCCCCATGATACGCCTCCGG-3’(SEO ID NO：7)

AMDS2NcoMut(2721)：

5’-GAGTCGTATTTCCAAGGCTCCTGACC-3’(SEQ ID NO：8)

AMDS1NcoMut(3396)：

5’-GGAGGCCATGAAGTGGACCAACGG-3’(SEQ ID NO：9)

随后使用QuickChange^TM Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene，LaJolla，CA)将包含所有三种期望的序列改变的质粒进行定位诱变，以消除在AMG终止子末端在位置1643的NcoI限制位点。下列引物(加下划线的核苷酸代表改变的碱基)用于诱变：

诱变AMG终止子序列的Upper Primer：

5’-CACCGTGAAAGCCATGCTCTTTCCTTCGTGTAGAAGACCAGACAG-3’(SEQ ID NO：10)

诱变AMG终止子序列的Lower Primer：

5’-CTGGTCTTCTACACGAAGGAAAGAGCATGGCTTTCACGGTGTCTG-3’(SEQ ID NO：11)

修饰pBANe6的最后步骤是使用  QuickChange^TM Site-DirectedMutagenesis Kit(Stratagene，La Jolla，CA)和以下引物(加下划线的核苷酸代表改变的碱基)在多接头的开始添加新的NcoI限制位点以生成pAlLo1(图2)。

诱变NA2-tpi启动子的Upper Primer：

5’-CTATATACACAACTGGATTTACCATGGGCCCGCGGCCGCAGATC-3’(SEQ ID NO：12)

诱变NA2-tpi启动子的Lower Primer：

5’-GATCTGCGGCCGCGGGCCCATGGTAAATCCAGTTGTGTATATAG-3’(SEQ ID NO：13)

将pAlLo1的amdS基因与构巢曲霉pyrG基因交换(swap)。将质粒pBANe10(图3)用作作为选择标记的pyrG基因的来源。pBANe10的序列分析说明pyrG标记包含在NsiI限制片段之内，并且不含有NcoI或PacI限制位点。因为amdS也与NsiI限制位点在侧翼连接，转变选择标记的策略是简单的交换NsiI限制片段。将来自pAlLo1和pBANe10的质粒DNA使用限制酶NsiI消化，并且通过琼脂糖凝胶电泳纯化产物。将含有pyrG基因的来自pBANe10的NsiI片段连接到pAlLo1的骨架中以取代原始含有amdS基因的NsiI DNA片段。将重组克隆通过限制消化分析以确定它们具有正确的插入物以及插入方向。选择以逆时针方向转录的具有pyrG基因的克隆。将新质粒定名为pAlLo2(图4)。

实施例7：将家族GH6A纤维二糖水解酶基因克隆入米曲霉表达载体

设计以下所示两种合成寡核苷酸引物用于PCR扩增来自土生梭孢霉ESTTter11C9的全长开读框，其编码家族GH6A纤维二糖水解酶。使用In-FusionCloning Kit(BD Biosciences，Palo Alto，CA)将片段直接克隆到pAILo2中。

In-Fusion Forward引物：

5’-ACTGGATTACCATGGCTCAGAAGCTCCTTCT-3’(SEQ ID NO：14)

In-Fusion Reverse引物：

5’-TCACCTCTAGTTAATTAAAAGGGCGGGTTGGCGT-3’(SEQ ID NO：15)

粗体字母表示编码序列。剩余序列与pAlLo2的插入位点相比具有序列同一性。

将50皮摩尔的以上各种引物用在PCR反应中，所述反应在50μl终体积中含有50ng pTter11C9 DNA、1X Pfx Amplification Buffer(Invitrogen，Carlsbad，CA)、6μl 10mM dATP、dTTP、dGTP和dCTP的混合物、2.5单位PlatinumPfxDNA Polymerase(Invitrogen，Carlsbad，CA)、1μl 50mM MgSO₄和5μl 10XpCRx Enhancer溶液(Invitrogen，Carlsbad，CA)。使用Eppendorf Mastercycler5333(Eppendorf Scientific，Inc.，Westbury，NY)扩增片段，程序设定为在98℃ 2分钟的一个循环；和94℃ 30秒、65℃ 30秒和68℃ 1.5分钟的35个循环。在35个循环之后，将反应在68℃温育10分钟，并且随后在10℃冷却直到进一步处理。使用40mM Tris碱-20mM乙酸钠-1mM EDTA二钠(TAE)缓冲液和每ml 0.1μg溴化乙锭在0.8％GTG琼脂糖凝胶(Cambrex Bioproducts OneMeadowlands Plaza East Rutherford，New Jersey 07073)上分离1.5kb的PCR反应产物。在Dark Reader^TM(Clare Chemical Research，Dolores，CO)的辅助下显现DNA条带以避免UV诱导的突变。使用一次性剃刀刀片(razor blade)切除1.5kb DNA条带并根据制造商的说明书使用Ultrafree-DA转杯(spin cup)(Millipore，Billerica，MA)将其纯化。

通过用NcoI和PacI的消化(使用制造商说明的条件)将载体pAlLo2线性化。将片段通过如上所述的凝胶电泳和超滤纯化。将纯化的PCR片段克隆到线性化并且纯化的pAlLo2载体载体中，使用In-Fusion Cloning Kit(BDBiosciences，Palo Alto，CA)进行所述克隆。反应(20μl)包含1X In-Fusion Buffer(BD Biosciences，Palo Alto，CA)、1X B SA(BD Biosciences，Palo Alto，CA)、1μlIn-Fusion酶(1∶10稀释的)(BD Biosciences，Palo Alto，CA)、100ng用NcoI和PacI消化的pAlLo2和50ng土生梭孢霉GH6A的纯化PCR产物。将反应在室温温育30分钟。将反应的2μl样品用于根据制造商的说明书转化大肠杆菌XL10 SoloPac

Gold细胞(Stratagene，La Jolla，CA)。在恢复期(recovery period)之后，将来自转化反应的两个100μl等分试样涂布到补充100μg每ml的氨苄青霉素的150mm 2X YT培养基平板上。将平板在37℃温育过夜。从培养平板中随机选择两组各八个推定的重组克隆，并且使用BioRobot 9600(QIAGEN，Inc.，Valencia，CA)从每个制备质粒DNA。将克隆通过NcoI限制消化分析。随后将具有期望的限制消化模式(restriction digest pattern)的四个克隆测序以确定在克隆的插入物中不存在突变。选择来自第二组的克隆#13并定名为pAlLo21(图5)。

实施例8：土生梭孢霉家族GH6A纤维二糖水解酶基因在米曲霉JAL250中的表达

根据Christensen et al.，1988，Bio/Technology 6：1419-1422的方法制备米曲霉Jal250(WO99/61651)原生质体。将5微克pAlLo21用于转化米曲霉JAL250原生质体。将pAlLo2作为载体对照进行操作。

使用pAlLo21转化米曲霉Jal250产生大约50个转化体。将8个转化体分离到独立的PDA平板并且在34℃温育5天。

用5ml 0.01％Tween 80洗涤汇合孢子平板(confluent spore plate)，并将孢子悬浮液用于接种125ml玻璃摇瓶中的25ml MDU2BP培养基。将转化体培养物以200rpm的持续摇动在34℃温育。在接种后的第五天，将培养物在6000xg离心并且收集它们的上清液。将5微升的每种上清液与等体积的2X上样缓冲液(10％β-巯基乙醇)混合，上样到1.5mm 8％-16％Tris-GlycineSDS-PAGE凝胶上并用Simply Blue SafeStain(Invitrogen，Carlsbad，CA)染色。培养液的SDS-PAGE分布显示转化体之一(指定的转化体2)具有大约60kDa的蛋白质条带。

通过在过量β-葡糖苷酶存在下将磷酸溶胀纤维素(phosphoric-acid-swollen cellulose)(PASC)水解为葡萄糖来测定米曲霉中表达的土生梭孢霉Cel6A纤维二糖水解酶的生物化学活性。

从Avicel(Fluka，从Sigma-Aldrich，St.Louis，MO获得)制备PASC。将用冰冷的正磷酸，85％(VWR International，Pittsburgh，PA)以30ml酸对1g Avicel的比率添加至Avicel，并且在冰浴中搅拌1小时。搅拌时使用每g Avicel 100ml添加冷丙酮(VWR International，Pittsburgh，PA)。将浆转移至玻璃过滤漏斗并且使用冷丙酮洗涤(waste)，使用每g Avicel 20ml丙酮的三次洗涤。最后，将纤维素使用每g丙酮100ml水洗涤两次。将PASC在水中重悬，至1％PASC浓度，并且在4℃贮藏。

使用15.9μg的每种Cel6酶和0.8μg的β-葡糖苷酶，将土生梭孢霉Cel6A纤维二糖水解酶的活性与特异腐质霉Cel6A纤维二糖水解酶进行比较。将酶在45℃温育，所述温育在96深孔平板(Axygen Scientific，Union City，CA)中的1.182ml 50mM乙酸钠，pH5.0、0.001％叠氮化钠和1.59mg PASC中进行，将所述平板用平板密封物(ALPS-300，Abgene，Epsom，UK)密封。温育不同时间之后，将反应混合物离心并且使用葡萄糖分析器(YSI，Inc.，Yellow Springs，OH)测定上清液的葡萄糖浓度。如图6所示，来自土生梭孢霉的Cel6A纤维二糖水解酶的水解时程和活性几乎与来自特异腐质霉的Cel6A纤维二糖水解酶的情况相同。

实施例9：用于蛋白质鉴定的基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法(MALDI-TOF MS)肽质量指纹(PMF)分析

将60kDa蛋白质条带(实施例8)如实施例1中所述在凝胶内使用胰蛋白酶消化。通过用于蛋白质鉴定的肽质量指纹分析来分析回收的肽。使用Maldi^TM-LR Time of Flight质谱仪(Waters Micromass

MS Technologies，Milford，MA)。通过使用100％乙腈(E.M.Science，Gibbstown，NJ)洗涤毫克量的α-氰-4-羟基桂皮酸(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)来制备重结晶的α-氰-4-羟基桂皮酸，并且充分混合和离心以形成基质沉淀。将乙腈溶液去除和丢弃。添加HPLC级的水(Fisher Chemicals，Fairlawn，NJ，)，接着缓慢添加28-30％氢氧化铵(J.T.Baker，Phillipsburg，NJ)直到几乎全部的沉淀溶解。弃去不溶的沉淀。将浓缩的HCl水(Fisher Chemicals，Fairlawn，NJ)缓慢添加至基质溶液直到大量的基质重结晶。将结晶的基质通过过滤去除，并用0.1M HCl洗涤几次，并且使其完全干燥。最终的基质溶液由50％乙腈/50％水的0.1％TFA中的重结晶α-氰-4-羟基桂皮酸的10mg/ml溶液组成。将从蛋白质凝胶内消化获得的1μl肽提取溶液与1μl重结晶的基质溶液混合并且在不锈钢MALDI-TOF目标平板(target plate)上点干燥(spot dry)。

将质谱仪以反射(reflectron)和阳离子模式操作，使用+15kV的加速电压、2535伏特的脉冲电压和2000伏特的反射电压(reflectron voltage)。将数据获取质量范围设定为640-3000m/z。锁定质量校准标准(lock mass calibrationstandard)由1μl的200fmols/μl ACTH(Adenocorticotrophic Hormone Clip18-39 MW＝2，465.1989)(Sigma Chemical Co，St.Louis，MO)和1μl的重结晶基质溶液组成，将所述标准用于内标(internal standard)，并且点样至(spot to)相邻的锁定质量目标孔。使用Windows NT控制的微处理器工作站使用Masslynx 4.0质谱软件(Waters Micromass

MS Technologies，Milford，MA)进行数据获取。将获得的谱组合、平滑化和居中，并且产生肽离子质量(peptide ionmass)的峰列表。将这种峰列表针对数据库使用ProteinLynx^TM Global Server2.05软件(Waters Micromass

MS Technologies，Milford，MA)搜索。

来自肽质量指纹分析的结果说明大约60kD的蛋白质点(protein spot)是土生梭孢霉Cel6A蛋白，基于与土生梭孢霉Cel6A纤维二糖水解酶匹配的以下肽质量：

实施例10：由里氏木霉表达土生梭孢霉Cel6A纤维二糖水解酶

用里氏木霉CBHII启动子取代表达质粒pSMai155(WO05/074647)中的里氏木霉纤维二糖水解酶I基因(CBHI)启动子，以产生质粒pCW076。将里氏木霉纤维二糖水解酶II基因(CBHII)启动子通过使用SalI和NcoI的消化从质粒pEJG114(WO05/074647)分离。通过使用SalI和NcoI的消化完成从pSMai155去除CBHI启动子。CBHII DNA片段和缺失了CBHI启动子的线性化的pSMai155质粒二者均在Dark Reader^TM(Clare Chemical Rese arch，Dolores，CO)的辅助下观察到。将两种片段使用一次性剃刀刀片切除，并且根据制造商的说明书使用QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN Inc.，Valencia，CA)纯化。随后利用在去除CBHI启动子后产生的SalI和NcoI位点，遵循制造商的说明书使用Rapid DNA Ligation Kit(Roche，Indianapolis，IN)将CBHII启动子连接到线性化的pSMai155中。使用连接产物转化大肠杆菌XL1-BlueSubcloning-Grade Competent Cells(Stratagene，La Jolla，CA)。通过DNA测序来自质粒的CBHII启动子序列确认构建体的同一性，所述启动子纯化自转化的大肠杆菌。将含有重组质粒的一个克隆定名为pCW076(图7)。

设计以下所示的两种合成寡核苷酸引物用于从质粒pAlLo21(实施例7)PCR扩增土生梭孢霉Cel6A纤维二糖水解酶基因。正向引物产生5’平端而反向引物在3’端并入PacI位点。使用5’端的平端NcoI位点和3’端的PacI位点将Cel6A片段直接克隆到pCW076中。

正向引物：5’-ATGGCTCAGAAGCTCCTTCTCGCCG-3’(SEQ ID NO：16)

反向引物：5’-CAGTCACCTCTAGTTAATTAATTAGAAGGGCGGG-3’(SEQ ID NO：17)

将50皮摩尔的以上每种引物用在由以下组成的PCR反应中：50μl终体积中的50ng pAlLo21、1μl 10mM dATP、dTTP、dGTP和dCTP的混合物、5μl 10X  AmpliTaqDNA Polymerase Buffer I(Perkin-Elmer/AppliedBiosystems、Inc.、Foster City、CA)和5单位Amplitaq

DNA Polymerase(Perkin-Elmer/Applied Biosystems，Inc.，Foster City，CA)。使用EppendorfMastercycler 5333(Eppendorf Scientific，Inc.，Westbury，NY)扩增DNA片段，并且将程序设定为：95℃ 3分钟的一个循环；和95℃ 45秒、55℃ 60秒和72℃1分30秒的30个循环。30个循环之后，将反应在72℃温育10分钟然后在4℃冷却直到进一步处理。将Cel6A PCR片段的3’端使用PacI消化。使用MinElute^TM Reaction Cleanup Kit(QIAGEN，Valencia，CA)根据制造商的说明书(QIAGEN Inc.，Valencia，CA)纯化消化产物。使用NcoI和PacI消化质粒pCW076。随后使用Klenow酶填补5’凹陷的(recessed)NcoI位点而将NcoI位点平端化。Klenow反应由20μl pCW076消化反应混合物和1mM dNTPs和1μl Klenow enzyme(Roche，Indiahapolis，IN)组成，将其在室温简单温育。使用MinElute^TM Reaction Cleanup Kit(QIAGEN，Valencia，CA)根据制造商的说明书(QIAGEN Inc.，Valencia，CA)纯化线性化的pCW076。这些反应导致与产生的Cel6A片段相容的5’平端和3’PacI位点的产生。随后使用Rapid DNALigation Kit(Roche，Indianapolis，IN)遵循制造商的说明书将Cel6A片段克隆到pCW076中。使用连接产物转化大肠杆菌XL1-Blue Subcloning-GradeCompetent Cells(Stratagene，La Jolla，CA)。通过DNA测序来自质粒的Cel6A编码序列确认构建体的同一性，所述质粒纯化自转化的大肠杆菌。将含有重组质粒的一个克隆定名为pCW085(图8)。

将含有25ml YP培养基、2％葡萄糖和10mM尿苷的摇瓶用5X10⁷个里氏木霉菌株SaMe-FX16的孢子接种。将温育在27℃以90rpm摇动进行17小时。随后将菌丝体使用500ml“Vacuum Driven Disposable Filtration System”(Millipore)用大约100ml去离子水洗涤两次。随后将菌丝体使用1.2M山梨糖醇洗涤两次，并通过将菌丝体悬浮在每ml 5mg Glucanex^TM(Novozymes A/S，Bagsvaerd，DK)和每ml 1mg几丁质酶(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)的20ml 1.2M山梨糖醇的无菌过滤溶液中来产生原生质体。将消化物在34℃温育并且以90rpm轻轻摇动大约20分钟或直到原生质体形成。一旦原生质体产生，将混合物在冰上温育以减缓消化。随后将消化物转移至50ml Falcon管，并且将30ml用冰冷的1.2M山梨糖醇添加至消化物。随后将原生质体在200rpm离心7分钟。离心之后将上清液倒出，并且将原生质体在50ml冰冷的1.2M山梨糖醇中洗涤。将此步骤重复两次，并且在第二次洗涤之后计数原生质体并且以1X 10⁸原生质体/ml的浓度在STC(1M山梨糖醇、10mM CaCl₂、10mM Tris-HCl，pH7.5)中重悬。将原生质体贮藏于-80℃直至使用。

将2至5μg用PmeI线性化的pCW085、100μl 1X 10⁸里氏木霉菌株SaMe-FXl6原生质体和250μl PEG缓冲液(50％PEG 4000、10mM CaCl₂、10mM Tris-HCl，pH7.5)在12ml Falcon管2059中轻轻混合在一起，并且在室温温育30分钟。温育之后，将3ml STC(1M山梨糖醇、10mM CaCl₂、10mMTris-HCl，pH7.5)添加至反应混合物。将转化反应轻轻地混合，并且随后将全部量倾倒至含有每ml 100ng潮霉素B(Sigma Chemical Co.，St.Loius，MO)的PDA平板上并且在28℃温育5-7天。

挑取21个转化体并且接种到含有25ml CIM的250ml摇瓶中。在200rpm摇动的同时将摇瓶在28℃培育5天。将定名为里氏木霉SaMe-D8的一个转化体根据以下方法在2升发酵中培养。

将来自生长在PDA平板上的里氏木霉SaMe-D8新鲜平板的琼脂糖圆柱形样品接种到含有100ml培养基的摇瓶中，所述培养基每升由20g葡萄糖、10g Corn Steep Solids、1.45g(NH₄)₂SO₄、2.08g KH₂PO₄、0.36g CaCl₂·2H₂O、0.42g MgSO₄·7H₂O和0.2ml痕量金属溶液组成。痕量金属溶液每升由216gFeCl₃·6H₂O、58g ZnSO₄·7H₂O、27g MnSO₄·H₂O、10g CuSO₄·5H₂O、2.4gH₃BO₃和336g柠檬酸组成。将摇瓶在定轨摇床上于28℃ 200rpm温育2天。将50ml的这种培养物用于接种1.8升培养基，所述培养基每升由30g纤维素、10g Corn Steep Solids、4g葡萄糖、2.64g CaCl₂·2H₂O、3.8g(NH₄)₂SO₄、2.8g KH₂PO₄、1.63g MgSO₄·7H₂O、0.75ml痕量金属溶液(同上)和3ml pluronicacid组成。将温度设定为28℃并且将pH控制在4.75。

在1.0VVM气流和1100rpm的搅拌下，以25％最小溶氧进行发酵。根据需要将进料培养基输送至2升发酵容器中，补料速率为6.0-8.0g/小时进行7-8天。进料培养基每kg由600g葡萄糖、35.5g H₃PO₄、20g纤维素和5g pluronic acid组成。

将全部发酵液在3000xg离心10分钟，并且将上清液通过带有玻璃纤维预滤器的一次性过滤装置(Nalgene，Rochester NY)过滤。将滤液冷却至4℃用于贮藏。

随后将滤液进行二维聚丙烯酰胺凝胶电泳以确定土生梭孢霉Cel6A纤维二糖水解酶的表达(参见实施例11)。

实施例11：里氏木霉SaMe-D8中土生梭孢霉Cel6A表达的鉴定

二维聚丙烯酰胺凝胶电泳。将来自实施例10中所述Tricoderma reeseiSaMe-D8的2升发酵物的1ml滤液通过如下方法沉淀：在4℃添加100μl饱和的三氯乙酸(TCA)，并且在冰上温育10分钟，接着添加9ml用冰冷的丙酮，进一步在冰上温育20分钟。将沉淀的溶液在4℃ 10,000xg离心10分钟，将上清液倾析，并且将沉淀用冰冷的丙酮冲洗两次并且空气干燥。将干燥的沉淀溶于0.2ml等电聚焦(IEF)样品缓冲液(蒸馏水中的9.0M尿素、3.1％(wt/v)3-[(3-cholamidopropyl)dimethyl-ammonium]-1-propanesulfonate(CHAPS，Pierce Chemical Co.Rockford，IL)、1％(v/v)pH4-7两性电解质、50mM二硫苏糖醇(DTT)和0.005％溴酚蓝)中。使用来自BioRad Laboratories(Hercules，CA)的20-5-筛目，混合床树脂AG 501-X8(D)将尿素储备溶液去离子化。将去离子溶液贮藏在-20℃。允许所得混合物在LabQuake^TM Shaker(Lab Industries，Berkeley，CA)上以轻轻地混合溶解(solubilize)几小时。将200μl的每种IEF样品缓冲液-蛋白质混合物应用于IPG再水合托盘(IPG rehydration tray)(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)上的11cm IPG条带(strip)(BioRadLaboratories，Hercules，CA)中。将干燥条带覆盖液体(dry-strip cover fluid)(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)的750μl等分试样分层铺到IPG条带上以防止蒸发和在20℃应用30伏特使用IPGPhor Isoelectric Focusing Unit(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)时使其再水合12小时。将IPGPhor Unit的程序设定为恒定电压但是最大电流为每条带50μA。12小时的再水合之后，等点聚焦条件如下：200伏特1小时、500伏特1小时和1000伏特1小时。随后应用从1000伏特至8000伏特的梯度30分钟，将等点聚焦程序设定为在8000伏特进行并且当达到＞30,000伏特小时完成。将IPG凝胶条带在第二维分析之前通过以下步骤还原和烷基化：首先在每10ml SDS-平衡缓冲液(50mM Tris HCl pH8.8、6.0M尿素、2％(w/v)十二烷基硫酸钠(SDS)、30％甘油和0.002％(w/v)溴酚蓝)100mg二硫苏糖醇中还原15分钟，接着在黑暗中在每10ml平衡缓冲液250mg碘乙酰胺中烷基化15分钟。将IPG条带在SDS-PAGE电泳缓冲液(Invitrogen/Novex，Carlsbad，CA)中迅速冲洗并且置于11cm、1孔8-16％Tris-Glycine SDS-PAGE凝胶(BioRad Laboratories，Hercules，CA)上，并且使用Criterion电泳装置(BioRad Laboratories，Hercules，CA)在50伏特电泳直到样品进入凝胶，随后将电压增加至200伏特并且使其运行直到溴酚蓝染料到达凝胶底部。

多肽检测。将二维凝胶从盒中去除并且使用水冲洗三次，每次至少5分钟，使用Bio-Safe^TM Coomassie G250 Stain(BioRad Laboratories，Hercules，CA)染色1小时，接着使用双蒸馏水脱色30分钟以上。将观察到的蛋白质凝胶点使用2mm Acu-Punch Biopsy Punch(Acuderm Inc.，Ft.Lauderdale，FL)切除，并且储存在96孔平板中，将所述平板使用60％乙腈中0.1％三氟乙酸(TFA)预洗涤，接着使用HPLC级水额外洗涤两次。在-20℃将染色的二维凝胶点贮藏在预洗涤的平板内的25-50μl水中直至消化。将对应于期望的MW和土生梭孢霉Cel6A多肽的理论等电点(pI)的蛋白质点通过如实施例9中所述的MALDI-TOF MS肽质量指纹分析进行分析。

来自肽质量指纹分析的结果说明大约60kD的蛋白质点是土生梭孢霉Cel6A蛋白，基于与土生梭孢霉Cel6A纤维二糖水解酶匹配的以下肽质量：

生物材料保藏

依据布达佩斯条约的条款，下述的生物材料已经保藏于农业研究机构保藏中心，北方区研究中心(Agricultural Research Service Patent CultureCollection，Northern Regional Research Center)，1815 University Street，Peoria，Illinois，61604，给出了下述的保藏号：

保藏物             保藏号          保藏日期

大肠杆菌pTter6A    NRRL B-30802    2004年12月17日

该菌株于下述条件下保藏：确保在本专利申请未决期间，由专利与商标委员依据37C.F.R.§1.14和35U.S.C.§122授权的人能够获得该培养物。该保藏物为所保藏菌株的基本上纯的培养物。在提交了该申请的副本，或其后续文本的国家，依据该外国专利法律的要求，可以获得该保藏物。然而，应当理解，保藏物的获得并不构成对实施本发明的许可，实施本发明是对政府行为所授予的专利权的侵犯。

此处，本发明所描述的和要求的并非是要用此处所公开的特定方面来限定范围，因为这些方面意欲作为本发明几个方面的说明。任何等价的方面意欲在本发明的范围之内。事实上从前面的说明中，对于本领域技术人员来说，除本文所显示和描述的之外，本发明的多种修改是显而易见的。这些修改也意欲落入所附的权利要求的范围之内。在冲突的情况下，将以包括定义部分的本公开为准。

本文引用了许多参考文献，其中公开的全部内容并入作为参考。

PCT/RO/134表(7/1992)

序列表

<110>诺维信公司(Novozymes，Inc.)

<120>具有纤维二糖水解酶活性的多肽和编码它的多核苷酸

<130>10748.204-WO

<150>60/642,274

<151>2005-01-06

<160>17

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>1446

<212>DNA

<213>土生梭孢霉(Thielavia terrestris)

<400>1

atggctcaga agctccttct cgccgccgcc cttgcggcca gcgccctcgc tgctcccgtc    60

gtcgaggagc gccagaactg cggttccgtc tggagccaat gcggcggcat tggctggtcc   120

ggcgcgacct gctgcgcttc gggcaatacc tgcgttgagc tgaacccgta ctactcgcag   180

tgcctgccca acagccaggt gactacctcg accagcaaga ccacctccac caccaccagg   240

agcagcacca ccagccacag cagcggtccc accagcacga gcaccaccac caccagcagt   300

cccgtggtca ctaccccgcc gagtacctcc atccccggcg gtgcctcgtc aacggccagc   360

tggtccggca acccgttctc gggcgtgcag atgtgggcca acgactacta cgcctccgag   420

gtctcgtcgc tggccatccc cagcatgacg ggcgccatgg ccaccaaggc ggccgaggtg   480

gccaaggtgc ccagcttcca gtggcttgac cgcaacgtca ccatcgacac gctgttcgcc   540

cacacgctgt cgcagatccg cgcggccaac cagaaaggcg ccaacccgcc ctacgcgggc   600

atcttcgtgg tctacgacct tccggaccgc gactgcgccg ccgccgcgtc caacggcgag   660

ttctccatcg cgaacaacgg ggcggccaac tacaagacgt acatcgacgc gatccggagc   720

ctcgtcatcc agtactcaga catccgcatc atcttcgtca tcgagcccga ctcgctggcc   780

aacatggtga ccaacctgaa cgtggccaag tgcgccaacg ccgagtcgac ctacaaggag   840

ttgaccgtct acgcgctgca gcagctgaac ctgcccaacg tggccatgta cctggacgcc   900

ggccacgccg gctggctcgg ctggcccgcc aacatccagc cggccgccaa cctcttcgcc   960

gagatctaca cgagcgccgg caagccggcc gccgtgcgcg gcctcgccac caacgtggcc  1020

aactacaacg gctggagcct ggccacgccg ccctcgtaca cccagggcga ccccaactac  1080

gacgagagcc actacgtcca ggccctcgcc ccgctgctca ccgccaacgg cttccccgcc  1140

cacttcatca ccgacaccgg ccgcaacggc aagcagccga ccggacaacg gcaatgggga  1200

gactggtgca acgttatcgg aactggcttc ggcgtgcgcc cgacgacaaa caccggcctc  1260

gacatcgagg acgccttcgt ctgggtcaag cccggcggcg agtgcgacgg cacgagcaac  1320

acgacctctc cccgctacga ctaccactgc ggcctgtcgg acgcgctgca gcctgctccg  1380

gaggccggca cttggttcca ggcctacttc gagcagctcc tgaccaacgc caacccgccc  1440

ttttaa                                                             1446

<210>2

<211>481

<212>PRT

<213>土生梭孢霉(Thielavia terrestris)

<400>2

Met Ala Gln Lys Leu Leu Leu Ala Ala Ala Leu Ala Ala Ser Ala Leu

1               5                   10                  15

Ala Ala Pro Val Val Glu Glu Arg Gln Asn Cys Gly Ser Val Trp Ser

            20                  25                  30

Gln Cys Gly Gly Ile Gly Trp Ser Gly Ala Thr Cys Cys Ala Ser Gly

        35                  40                  45

Asn Thr Cys Val Glu Leu Asn Pro Tyr Tyr Ser Gln Cys Leu Pro Asn

    50                  55                  60

Ser Gln Val Thr Thr Ser Thr Ser Lys Thr Thr Ser Thr Thr Thr Arg

65                  70                  75                  80

Ser Ser Thr Thr Ser His Ser Ser Gly Pro Thr Ser Thr Ser Thr Thr

                85                  90                  95

Thr Thr Ser Ser Pro Val Val Thr Thr Pro Pro Ser Thr Ser Ile Pro

            100                 105                 110

Gly Gly Ala Ser Ser Thr Ala Ser Trp Ser Gly Asn Pro Phe Ser Gly

        115                 120                 125

Val Gln Met Trp Ala Asn Asp Tyr Tyr Ala Ser Glu Val Ser Ser Leu

    130                 135                 140

Ala Ile Pro Ser Met Thr Gly Ala Met Ala Thr Lys Ala Ala Glu Val

145                 150                 155                 160

Ala Lys Val Pro Ser Phe Gln Trp Leu Asp Arg Asn Val Thr Ile Asp

                165                 170                 175

Thr Leu Phe Ala His Thr Leu Ser Gln Ile Arg Ala Ala Asn Gln Lys

            180                 185                 190

Gly Ala Asn Pro Pro Tyr Ala Gly Ile Phe Val Val Tyr Asp Leu Pro

        195                 200                 205

Asp Arg Asp Cys Ala Ala Ala Ala Ser Asn Gly Glu Phe Ser Ile Ala

    210                 215                 220

Asn Asn Gly Ala Ala Asn Tyr Lys Thr Tyr Ile Asp Ala Ile Arg Ser

225                 230                 235                 240

Leu Val Ile Gln Tyr Ser Asp Ile Arg Ile Ile Phe Val Ile Glu Pro

                245                 250                 255

Asp Ser Leu Ala Asn Met Val Thr Asn Leu Asn Val Ala Lys Cys Ala

            260                 265                 270

Asn Ala Glu Ser Thr Tyr Lys Glu Leu Thr Val Tyr Ala Leu Gln Gln

        275                 280                 285

Leu Asn Leu Pro Asn Val Ala Met Tyr Leu Asp Ala Gly His Ala Gly

    290                 295                 300

Trp Leu Gly Trp Pro Ala Asn Ile Gln Pro Ala Ala Asn Leu Phe Ala

305                 310                 315                 320

Glu Ile Tyr Thr Ser Ala Gly Lys Pro Ala Ala Val Arg Gly Leu Ala

                325                 330                 335

Thr Asn Val Ala Asn Tyr Asn Gly Trp Ser Leu Ala Thr Pro Pro Ser

            340                 345                 350

Tyr Thr Gln Gly Asp Pro Asn Tyr Asp Glu Ser His Tyr Val Gln Ala

        355                 360                 365

Leu Ala Pro Leu Leu Thr Ala Asn Gly Phe Pro Ala His Phe Ile Thr

    370                 375                 380

Asp Thr Gly Arg Asn Gly Lys Gln Pro Thr Gly Gln Arg Gln Trp Gly

385                 390                 395                 400

Asp Trp Cys Asn Val Ile Gly Thr Gly Phe Gly Val Arg Pro Thr Thr

                405                 410                 415

Asn Thr Gly Leu Asp Ile Glu Asp Ala Phe Val Trp Val Lys Pro Gly

            420                 425                 430

Gly Glu Cys Asp Gly Thr Ser Asn Thr Thr Ser Pro Arg Tyr Asp Tyr

        435                 440                 445

His Cys Gly Leu Ser Asp Ala Leu Gln Pro Ala Pro Glu Ala Gly Thr

    450                 455                 460

Trp Phe Gln Ala Tyr Phe Glu Gln Leu Leu Thr Asn Ala Asn Pro Pro

465                 470                 475                 480

Phe

<210>3

<211>32

<212>DNA

<213>土生梭孢霉(Thielavia terrestris)

<400>3

tcgtcgggga caactttgta caaaaaagtt gg                                        32

<210>4

<211>27

<212>DNA

<213>土生梭孢霉(Thielavia terrestris)

<400>4

cccctgttga aacatgtttt ttcaacc                                              27

<210>5

<211>16

<212>DNA

<213>大肠杆菌(Escherichia coli)

<400>5

gtaaaacgac ggccag                                                          16

<210>6

<211>25

<212>DNA

<213>构巢曲霉(Aspergillus nidulans)

<220>

<221>misc_feature

<222>(24)..(24)

<223>V＝A，C，G

<220>

<221>misc_feature

<222>(25)..(25)

<223>N＝A，C，G，T

<400>6

tttttttttt tttttttttt tttvn                                                25

<210>7

<211>22

<212>DNA

<213>构巢曲霉(Aspergillus nidulans)

<400>7

gtgccccatg atacgcctcc gg                                                   22

<210>8

<211>26

<212>DNA

<213>构巢曲霉(Aspergillus nidulans)

<400>8

gagtcgtatt tccaaggctc ctgacc                                               26

<210>9

<211>24

<212>DNA

<213>黑曲霉(Aspergillus niger)

<400>9

ggaggccatg aagtggacca acgg                                                 24

<210>10

<211>45

<212>DNA

<213>黑曲霉(Aspergillus niger)

<400>10

caccgtgaaa gccatgctct ttccttcgtg tagaagacca gacag                          45

<210>11

<211>45

<212>DNA

<213>黑曲霉(Aspergillus niger)

<400>11

ctggtcttct acacgaagga aagagcatgg ctttcacggt gtctg                          45

<210>12

<211>44

<212>DNA

<213>黑曲霉(Aspergillus niger)

<400>12

ctatatacac aactggattt accatgggcc cgcggccgca gatc                           44

<210>13

<211>44

<212>DNA

<213>黑曲霉(Aspergillus niger)

<400>13

gatctgcggc cgcgggccca tggtaaatcc agttgtgtat atag                           44

<210>14

<211>31

<212>DNA

<213>土生梭孢霉(Thielavia terrestris)

<400>14

actggattac catggctcag aagctccttc t                                         31

<210>15

<211>34

<212>DNA

<213>土生梭孢霉(Thielavia terrestris)

<400>15

tcacctctag ttaattaaaa gggcgggttg gcgt                                      34

<210>16

<211>25

<212>DNA

<213>土生梭孢霉(Thielavia terrestris)

<400>16

atggctcaga agctccttct cgccg                                                25

<210>17

<211>34

<212>DNA

<213>土生梭孢霉(Thielavia terrestris)

<400>17

cagtcacctc tagttaatta attagaaggg cggg                                      34

Claims (22)

1.一种具有纤维二糖水解酶活性的分离的多肽，其选自下组：

(a)多肽，其由SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：2的成熟多肽的氨基酸序列组成；和

(b)多肽，其由以下多核苷酸编码：(i)SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列，(ii)包含SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列的基因组DNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链。

2.权利要求1的多肽，所述多肽由SEQ ID NO：2组成。

3.权利要求1的多肽，所述多肽由SEQ ID NO：2的成熟多肽组成。

4.权利要求1的多肽，所述多肽由包含在质粒pTter6A中的多核苷酸编码，所述pTter6A包含在大肠杆菌NRRL B-30802中。

5.权利要求1的多肽，其中所述成熟多肽是SEQ ID NO：2的氨基酸18至481。

6.权利要求1的多肽，其中所述成熟多肽编码序列是SEQ ID NO：1的核苷酸52至1443。

7.一种分离的多核苷酸，其由编码权利要求1-6中任一项的多肽的核苷酸序列组成。

8.权利要求7的分离的多核苷酸，其在SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列中包含至少一个突变，其中突变的核苷酸序列编码SEQ ID NO：2的成熟多肽。

9.一种核酸构建体，其包含权利要求7的多核苷酸，所述多核苷酸与一个或多个调控序列可操作地连接，所述调控序列指导多肽在表达宿主中的产生。

10.重组的表达载体，包含权利要求9的核酸构建体。

11.重组宿主细胞，包含权利要求9的核酸构建体。

12.一种用于产生权利要求1-6中任一项的多肽的方法，其包括：(a)在有益于所述多肽产生的条件下培养梭孢霉NRRL8126细胞，所述细胞以其野生型形式能够产生所述多肽；和(b)回收所述多肽。

13.一种用于产生权利要求1-6中任一项的多肽的方法，其包括：(a)在有益于所述多肽产生的条件下培养包含核酸构建体的宿主细胞，所述核酸构建体包含编码所述多肽的核苷酸序列；和(b)回收所述多肽。

14.一种用于产生亲本细胞突变体的方法，所述方法包含破坏或缺失编码权利要求1-6中任一项的多肽的核苷酸序列，和选择其中所述核苷酸序列的表达已经缺失的突变体，其中所述突变体与亲本细胞相比不产生权利要求1-6中任一项的多肽。

15.一种通过权利要求14的方法产生的突变细胞。

16.权利要求15的突变细胞，所述突变细胞进一步包含编码天然或异源蛋白质的基因。

17.一种用于产生蛋白质的方法，其包括：(a)在有益于蛋白质产生的条件下培养权利要求16的突变细胞；和(b)回收所述蛋白质。

18.一种洗涤剂组合物，所述洗涤剂组合物包含权利要求1-6中任一项的具有纤维二糖水解酶活性的多肽和表面活性剂。

19.一种用于降解或转化含有纤维素和半纤维素的生物质的方法，其包括用有效量的根据权利要求1-6的具有纤维二糖水解酶活性的多肽处理生物质和回收降解的生物质。

20.权利要求19的方法，还包括用有效量的内切-1，4-β-葡聚糖酶和β-D-葡糖苷酶处理生物质。

21.一种用于降解或转化含有纤维素和半纤维素的生物质的方法，其包括用权利要求11的宿主细胞处理生物质和回收降解的生物质。

22.权利要求21的方法，还包括用有效量的内切-1，4-β-葡聚糖酶和β-D-葡糖苷酶处理生物质。

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