CN101874109A

CN101874109A - 具有纤维二糖水解酶活性的多肽和编码该多肽的多核苷酸

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Publication number: CN101874109A
Application number: CN200880117634A
Authority: CN
Inventors: 苏钦德拉·梅尤兰; 保罗·哈里斯; 丁晗澍; 金伯利·布朗
Original assignee: Novozymes AS
Current assignee: Novozymes AS
Priority date: 2007-09-28
Filing date: 2008-09-26
Publication date: 2010-10-27
Anticipated expiration: 2028-09-26
Also published as: US20120156755A1; EP2195424B1; WO2009042871A1; BRPI0817474A2; US20120276640A1; EP2195424A1; CN101874109B; US20100240095A1; US8227667B2; BRPI0817474B1; US8124394B2; DK2195424T3; US8377693B2

Abstract

本发明涉及具有纤维二糖水解酶活性的分离的多肽和编码所述多肽的分离的多核苷酸。本发明还涉及包含所述多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞以及产生和使用所述多肽的方法。

Description

具有纤维二糖水解酶活性的多肽和编码该多肽的多核苷酸

涉及序列表

本申请含有计算机可读形式的序列表。所述计算机可读形式通过提述并入本文。

涉及生物材料的保藏物

本申请含有对生物材料的保藏物的涉及，所述保藏物通过提述并入本文。

发明背景

发明领域

本发明涉及具有纤维二糖水解酶活性的分离的多肽和编码该多肽的分离的多核苷酸。本发明还涉及包含所述多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞，以及产生和使用所述多肽的方法。

相关技术描述

纤维素是一种通过β-1，4-键共价结合的简单糖类葡萄糖的聚合物。许多微生物产生水解β-连接的葡聚糖的酶。这些酶包括内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶。内切葡聚糖酶在随机位置消化纤维素聚合物，使其对纤维二糖水解酶的攻击敞开。纤维二糖水解酶从纤维素聚合物的末端顺序释放纤维二糖分子。纤维二糖是水溶性β-1，4-连接的葡萄糖二聚体。β-葡糖苷酶将纤维二糖水解成葡萄糖。

将纤维素原料转化成乙醇具有以下优势：大量原料现成可用，避免焚烧或填埋材料的合意性，和乙醇燃料的清洁性。木材、农业残余物、草本作物和城市固体废物被认为是用于乙醇产生的原料。这些材料主要由纤维素、半纤维素和木质素组成。一旦将纤维素转化成葡萄糖，葡萄糖将容易地由酵母发酵成乙醇。

WO 2004/056981公开了来自嗜热毛壳(Chaetomium thermophilum)和嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)的纤维二糖水解酶。Gusakov等，2007，Biotechnology Bioengineering 97：1028-1038描述了分离自Chrysosporiumlucknowense的纤维二糖水解酶。

本发明涉及具有纤维二糖水解酶活性的多肽和编码所述多肽的多核苷酸。

发明内容

本发明涉及选自下组的具有纤维二糖水解酶活性的分离的多肽：

(a)多肽，其包含与SEQ ID NO：2的成熟多肽具有至少80％同一性的氨基酸序列；

(b)由如下多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸在至少高严紧条件下与以下杂交：(i)SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列，(ii)SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列中所含的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；

(c)由如下多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸包含与SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列具有至少80％同一性的核苷酸序列；和

(d)变体，其包含取代、缺失和/或插入一个或多个(几个)氨基酸的SEQID NO：2的成熟多肽。

本发明还涉及选自下组的分离的多核苷酸，其编码具有纤维二糖水解酶活性的多肽：

(a)多核苷酸，其编码包含与SEQ ID NO：2的成熟多肽具有至少80％同一性的氨基酸序列的多肽；

(b)多核苷酸，其在至少高严紧条件下与以下杂交：(i)SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列，(ii)SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列中所含的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；

(c)多核苷酸，其包含与SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列具有至少80％同一性的核苷酸序列；和

(d)多核苷酸，其编码变体，该变体包含取代、缺失和/或插入一个或多个(几个)氨基酸的SEQ ID NO：2的成熟多肽。

本发明还涉及包含所述多核苷酸的核酸构建体、重组表达载体、重组宿主细胞，和产生具有纤维二糖水解酶活性的多肽的方法。

本发明还涉及抑制多肽在细胞中表达的方法，包括向所述细胞施用或在所述细胞中表达双链RNA(dsRNA)分子，其中所述dsRNA包含本发明的多核苷酸的亚序列。本发明还涉及这样的双链抑制性RNA(dsRNA)分子，其中任选地所述dsRNA是siRNA或miRNA分子。

本发明还涉及在洗涤剂和在将纤维素转化成葡萄糖和多种物质的转化中使用所述具有纤维二糖水解酶(活性)的多肽。

本发明还涉及包含分离的多核苷酸的植物，所述多核苷酸编码这样的具有纤维二糖水解酶活性的多肽。

本发明还涉及产生这样的具有纤维二糖水解酶(活性)的多肽的方法，包括：(a)在有益于产生所述多肽的条件下培养转基因植物或植物部分，所述转基因植物或植物部分包含编码这样的具有纤维二糖水解酶活性的多肽的多核苷酸；和(b)回收所述多肽。

本发明还涉及包含编码蛋白质的基因的核酸构建体，其中所述基因与编码信号肽的核苷酸序列可操作地连接，所述信号肽包含SEQ ID NO：2的氨基酸1-17或由SEQ ID NO：2的氨基酸1-17组成，其中所述基因对于所述核苷酸序列是外源的。

附图简述

图1A和1B显示嗜热毁丝霉CBS 202.75纤维二糖水解酶的基因组DNA序列和推导的氨基酸序列(分别为SEQ ID NO：1和2)。

图2显示pSMai180的限制图谱。

图3显示pSMai182的限制图谱。

定义

纤维二糖水解酶活性：术语“纤维二糖水解酶活性”在本文中定义为1，4-D-葡聚糖纤维二糖水解酶(E.C.3.2.1.91)活性，其催化纤维素、纤维四糖(cellotetriose)或任何含有β-1，4-连接的葡萄糖的聚合物中1，4-β-D-糖苷键的水解，从链的还原端或非还原端释放纤维二糖。就本发明而言，根据由Lever等，1972，Anal.Biochem.47：273-279；van Tilbeurgh等，1982，FEBS Letters，149：152-156；van Tilbeurgh和Claeyssens，1985，FEBS Letters，187：283-288；和Tomme等，1988，Eur.J.Biochem.170：575-581描述的方法测定纤维二糖水解酶活性。在本发明中，可以采用Lever等的方法评定玉米秸秆(corn stover)中纤维素的水解，而van Tilbeurgh等和Tomme等的方法可以用于测定纤维二糖水解酶对于荧光二糖衍生物的活性。

内切葡聚糖酶活性：术语内切葡聚糖酶活性”在本文中定义为内切-1，4-(1，3；1，4)-β-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶(endo-1，4-(1，3；1，4)-β-D-glucan4-glucanohydrolase)(E.C.3.2.1.4)，其催化纤维素、纤维素衍生物(例如羧甲基纤维素和羟乙基纤维素)、地衣淀粉(lichenin)中的1，4-β-D-糖苷键、混合型β-1，3葡聚糖如谷类β-D-葡聚糖或木葡聚糖中的β-1，4键和其它含有纤维素组分的植物材料的内水解(endohydrolysis)。就本发明而言，内切葡聚糖酶活性是使用羧甲基纤维素(CMC)水解根据Ghose，1987，Pure and Appl.Chem.59：257-268的方法测定的。

β-葡糖苷酶活性：术语“β-葡糖苷酶活性”在本文中定义为β-D-葡糖苷葡糖水解酶(E.C.3.2.1.21)活性，其催化末端非还原性β-D-葡萄糖残基的水解并释放β-D-葡萄糖。纤维二糖酶与β-葡糖苷酶同义。就本发明而言，β-葡糖苷酶活性是在25℃使用1mM 4-硝基苯基-β-D-吡喃型葡糖苷作为底物在50mM柠檬酸钠pH 4.8中测定的。将一个单位的β-葡糖苷酶活性定义为在25℃、pH 4.8每分钟产生1.0微摩尔的4-硝基酚。

家族6或家族GH6或Cel6：术语“家族6”或“家族GH6”或“Cel6”在本文中定义为根据Henrissat B.，1991，A classification of glycosyl hydrolasesbased on amino-acid sequence similarities，Biochem.J.280：309-316，及Henrissat B.和Bairoch A.，1996，Updating the sequence-based classification ofglycosyl hydrolases，Biochem.J.316：695-696属于糖苷水解酶家族6的多肽。根据这样的分类，SEQ ID NO：2或其成熟多肽属于家族6并被预测为纤维二糖水解酶II。

分离的多肽：术语“分离的多肽”用于本文中指从来源分离的多肽。在一个优选的方面，如通过SDS-PAGE测定的，所述多肽为至少1％纯，优选至少5％纯，更优选至少10％纯，更优选至少20％纯，更优选至少40％纯，更优选至少60％纯，甚至更优选至少80％纯，并且最优选至少90％纯。

基本上纯的多肽：术语“基本上纯的多肽”在本文表示多肽制备物，所述多肽制备物含有按重量计至多10％，优选至多8％，更优选至多6％，更优选至多5％，更优选至多4％，更优选至多3％，甚至更优选至多2％，最优选至多1％，并且甚至最优选至多0.5％的与其天然或重组结合的(associated)的其它多肽材料。因此，优选所述基本上纯的多肽是按存在于制备物中的全部多肽材料的重量计至少92％纯，优选至少94％纯，更优选至少95％纯，更优选至少96％纯，更优选至少96％纯，更优选至少97％纯，更优选至少98％纯，甚至更优选至少99％纯，最优选至少99.5％纯，并且甚至最优选100％纯。本发明的多肽优选是基本上纯的形式，即所述多肽制备物基本上(essentially)不含与其天然或重组结合的其它多肽材料。例如，这能够通过如下实现：由公知的重组方法或由经典纯化方法制备多肽。

成熟多肽：术语“成熟多肽”在本文中定义为具有纤维二糖水解酶活性的多肽，所述多肽以其在翻译和任何翻译后修饰(如N-末端加工、C-末端截短、糖基化、磷酸化等)之后的最终形式存在。在一个优选的方面，基于预测SEQ ID NO：2的氨基酸1-17是信号肽的SignalP软件程序(Nielsen等，1997，Protein Engineering 10：1-6)，所述成熟多肽是SEQ ID NO：2的氨基酸18-482。

成熟多肽编码序列：术语“成熟多肽编码序列”在本文中定义为编码具有纤维二糖水解酶活性的成熟多肽的核苷酸序列。在一个优选的方面，基于预测核苷酸1-51编码信号肽的SignalP软件程序(Nielsen等，1997，ProteinEngineering 10：1-6)所述成熟多肽编码序列是SEQ ID NO：1的核苷酸52-1809。

同一性：两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性由参数“同一性”来描述。

就本发明而言，两个氨基酸序列之间的同一性程度是使用如EMBOSS程序包(EMBOSS：The European Molecular Biology Open Software Suite，Rice等，2000，Trends in Genetics 16：276-277)(优选版本3.0.0或更新的版本)的Needle程序中执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，1970，J.Mol.Biol.48：443-453)来测定的。使用的可选参数是：缺口产生罚分为10，缺口延伸罚分为0.5，和EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。将标记为“最长同一性”的Needle输出(使用-nobrief选项获得)用作百分比同一性并且是如下计算的：

(相同的残基x100)/(比对的长度-比对中的缺口总数)

就本发明而言，两个脱氧核糖核苷酸序列之间的同一性程度使用如EMBOSS程序包(EMBOSS：The European Molecular Biology Open SoftwareSuite，Rice等，2000，见上)(优选版本3.0.0或更新的版本)的Needle程序中执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，1970，见上)测定。使用的可选参数是：缺口产生罚分为10，缺口延伸罚分为0.5，和EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版本)取代矩阵。将标记为“最长同一性”的Needle输出(使用-nobrief选项获得)用作百分比同一性并且是如下计算的：

(相同的脱氧核糖核苷酸x100)/(比对的长度-比对中的缺口总数)

同源序列：术语“同源序列”在本文中定义为用SEQ ID NO：2的嗜热毁丝霉纤维二糖水解酶或其成熟多肽，在tfasty检索(Pearson，W.R.，1999，于Bioinformatics Methods and Protocols，S.Misener和S.A.Krawetz编，185-219页)中给出小于0.001的E值(或预期分数)的预测蛋白质。

多肽片段：术语“多肽片段”在本文定义为从SEQ ID NO：2的成熟多肽的氨基和/或羧基末端缺失了一个或多个(几个)氨基酸的多肽；或其同源序列；其中所述片段具有纤维二糖水解酶活性。在一个优选的方面，片段含有SEQ ID NO：2的成熟多肽或其同源序列的至少415个氨基酸残基，更优选至少435个氨基酸残基，并且最优选至少455个氨基酸残基。

亚序列：术语“亚序列(subsequence)”在本文中定义为从SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列的5′和/或3′端缺失了一个或多个(几个)核苷酸的核苷酸序列；或其同源序列；其中所述亚序列编码具有纤维二糖水解酶活性的多肽片段。在一个优选的方面，亚序列含有SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列或其同源序列的至少1245个核苷酸，更优选至少1305个核苷酸，并且最优选至少1365个核苷酸。

等位变体(allelic variant)：术语“等位变体”在本文中表示占据相同染色体基因座的基因的任何两种或两种以上可选形式。等位变异通过突变天然地发生，并且可导致种群内的多态性。基因突变可以是沉默的(在编码的多肽中无变化)或可以编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位变体是由基因的等位变体编码的多肽。

分离的多核苷酸：术语“分离的多核苷酸”用于本文中指从来源分离的多核苷酸。在一个优选的方面，如通过琼脂糖电泳测定的，所述多核苷酸为至少1％纯，优选至少5％纯，更优选至少10％纯，更优选至少20％纯，更优选至少40％纯，更优选至少60％纯，甚至更优选至少80％纯，并且最优选至少90％纯。

基本上纯的多核苷酸：术语“基本上纯的多核苷酸”用于本文指多核苷酸制备物，其不含其它外来的或不期望的核苷酸，并且处于适合于在遗传工程蛋白质生产体系中使用的形式。因此，基本上纯的多核苷酸含有按重量计至多10％，优选至多8％，更优选至多6％，更优选至多5％，更优选至多4％，更优选至多3％，甚至更优选至多2％，最优选至多1％，并且甚至最优选至多0.5％的与其天然或重组结合的其它多核苷酸材料。然而，基本上纯的多核苷酸可以包括天然存在的5’和3’非翻译区，如启动子和终止子。优选基本上纯的多核苷酸是按重量计至少90％纯，优选至少92％纯，更优选至少94％纯，更优选至少95％纯，更优选至少96％纯，更优选至少97％纯，甚至更优选至少98％纯，最优选至少99％，并且甚至最优选至少99.5％纯的。本发明的多核苷酸优选为基本上纯的形式，即所述多核苷酸制备物基本上(essentially)不含与其天然或重组结合的其它多核苷酸材料。所述多核苷酸可以是基因组、cDNA、RNA、半合成、合成来源的，或它们的任何组合。

编码序列：当用于本文时术语“编码序列”的意思是直接指定其蛋白产物的氨基酸序列的核苷酸序列。编码序列的边界通常由开读框确定，所述开读框通常以ATG起始密码子或可供选择的起始密码子如GTG和TTG开始，并且以终止密码子如TAA、TAG和TGA结束。编码序列可以是DNA、cDNA或重组核苷酸序列。

cDNA：术语“cDNA”在本文中定义为能够通过反转录从得自真核细胞的成熟的、已剪接的mRNA分子制备的DNA分子。cDNA缺少可能存在于相应基因组DNA中的内含子序列。起始的(initial)、初级的RNA转录物是mRNA的前体，其通过一系列的步骤加工然后作为成熟的已剪接的mRNA出现。这些步骤包括通过称为剪接的过程去除内含子序列。因而源自mRNA的cDNA没有任何内含子序列。

核酸构建体：术语“核酸构建体”用于本文指单链或双链的核酸分子，所述核酸分子分离自天然存在的基因，或将所述核酸分子以本来不存在于(not otherwise exist)自然界中的方式修饰以含有核酸的区段或所述核酸分子是合成的。当所述核酸构建体含有表达本发明的编码序列所需的调控序列时，术语核酸构建体与术语“表达盒”同义。

调控序列(control sequence)：术语“调控序列”在本文定义为包括对编码本发明多肽的多核苷酸表达是必需的或有利的所有组分。各个调控序列对于编码所述多肽的核苷酸序列可以是天然的或外源的，或各个调控序列对于彼此可以是天然的或外源的。这些调控序列包括但不限于前导序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列和转录终止子。最少的情况，调控序列包括启动子和转录和翻译的终止信号。调控序列可以和用于引入特异性限制位点的接头一起提供，所述特异性限制位点促进调控序列与编码多肽的核苷酸序列编码区的连接。

可操作地连接：术语“可操作地连接”在本文表示这样的构型，其中将调控序列置于相对于多核苷酸序列的编码序列的适当位置，使得调控序列指导多肽编码序列的表达。

表达：术语“表达”包括涉及多肽产生的任何步骤，其包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。

表达载体：术语“表达载体”在本文定义为线性的或环状的DNA分子，其包含编码本发明多肽的多核苷酸，并且所述多核苷酸与提供用于其表达的额外核苷酸可操作地连接。

宿主细胞：如本文中所使用的术语“宿主细胞”包括任何细胞类型，所述细胞类型对于使用包含本发明多核苷酸的核酸构建体或表达载体的转化、转染、转导等是易感的(susceptible)。

修饰：术语“修饰”在本文的意思是，对由SEQ ID NO：2的成熟多肽组成的多肽或其同源序列的任何化学修饰，以及对编码这样的多肽的DNA的遗传操作。所述修饰可以是一个或多个(几个)氨基酸的取代、缺失和/或插入，以及一个或多个(几个)氨基酸侧链的置换。

人工变体：当用在本文时，术语“人工变体”的意思是具有纤维二糖水解酶活性的多肽，所述多肽由表达SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列的修饰的多核苷酸序列或其同源序列的生物体产生。所述修饰的核苷酸序列通过人为干预(human intervention)，通过修饰公开于SEQ ID NO：1的多核苷酸序列或其同源序列来获得。

发明详述

具有纤维二糖水解酶活性的多肽

在第一个方面，本发明涉及包含下述氨基酸序列的分离的多肽，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：2的成熟多肽具有优选至少60％，更优选至少65％，更优选至少70％，更优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，甚至更优选至少90％，最优选至少95％，并且甚至最优选至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性程度，所述多肽具有纤维二糖水解酶活性(下文中的“同源多肽”)。在一个优选的方面，所述同源多肽具有的氨基酸序列与SEQ ID NO：2的成熟多肽相差十个氨基酸，优选相差五个氨基酸，更优选相差四个氨基酸，甚至更优选相差三个氨基酸，最优选相差两个氨基酸，并且甚至最优选相差一个氨基酸。

本发明的多肽优选包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列或其等位变体；或它们的具有纤维二糖水解酶活性的片段。在一个优选的方面，多肽包含SEQID NO：2的氨基酸序列。在另一优选的方面，多肽包含SEQ ID NO：2的成熟多肽。在另一优选的方面，多肽包含SEQ ID NO：2的氨基酸18至482，或其等位变体；或它们的具有纤维二糖水解酶活性的片段。在另一优选的方面，多肽包含SEQ ID NO：2的氨基酸18至482。在另一优选的方面，多肽由SEQ ID NO：2的氨基酸序列或其等位变体，或它们的具有纤维二糖水解酶活性的片段组成。在另一优选的方面，多肽由SEQ ID NO：2的氨基酸序列组成。在另一优选的方面，多肽由SEQ ID NO：2的成熟多肽组成。在另一优选的方面，多肽由SEQ ID NO：2的氨基酸18至482或其等位变体，或它们的具有纤维二糖水解酶活性的片段组成。在另一优选的方面，多肽由SEQ ID NO：2的氨基酸18至482组成。

在第二个方面，本发明涉及具有纤维二糖水解酶活性的分离的多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在优选极低严紧条件、更优选低严紧条件、更优选中严紧条件、更优选中-高严紧条件、甚至更优选高严紧条件、和最优选非常高严紧条件下与下列杂交：(i)SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列，(ii)SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列中所含的cDNA序列，(iii)(i)或(ii)的亚序列，或(iv)(i)、(ii)或(iii)的全长互补链(J.Sambrook，E.F.Fritsch和T.Maniatis，1989，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，第2版，Cold SpringHarbor，New York)。SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列的亚序列含有至少100个连续的核苷酸或优选至少200个连续的核苷酸。而且，所述亚序列可以编码具有纤维二糖水解酶活性的多肽片段。在一个优选的方面，所述互补链是SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列的全长互补链。

SEQ ID NO：1的核苷酸序列或其亚序列；以及SEQ ID NO：2的氨基酸序列或其片段，可用于设计核酸探针，以根据本领域内公知的方法从不同属或种的菌株鉴定和克隆编码具有纤维二糖水解酶活性的多肽的DNA。具体而言，可将这些探针用于根据标准的Southern印迹方法与感兴趣的属或种的基因组或cDNA杂交，以鉴定并从其中分离相应的基因。这些探针可明显短于完整序列，但长度上应为至少14个，优选至少25个，更优选至少35个，并且最优选至少70个核苷酸。然而，优选所述核酸探针长度上是至少100个核苷酸。例如，所述核酸探针长度上可以是至少200个核苷酸，优选至少300个核苷酸，更优选至少400个核苷酸，或最优选至少500个核苷酸。甚至可以使用更长的探针，例如，长度是优选至少600个核苷酸，更优选至少700个核苷酸，甚至更优选至少800个核苷酸，或最优选至少900个核苷酸的核酸探针。DNA和RNA探针二者均可使用。通常将探针标记以探测相应的基因(例如，用³²P、³H、³⁵S、生物素或抗生物素蛋白(avidin)标记)。将这些探针包含于本发明中。

因而，可从由这些其它菌株制备的基因组DNA或cDNA文库中筛选DNA，所述DNA与上述探针杂交并且编码具有纤维二糖水解酶活性的多肽。可以通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳，或通过其它分离技术分离来自这些其它菌株的基因组或其它DNA。可以将来自文库的DNA或分离的DNA转移至硝化纤维素(nitrocellulose)或其它合适的载体材料并且固定于其上。为了鉴定与SEQ ID NO：1或其亚序列同源的克隆或DNA，将所述载体材料优选用在Sounthern印迹中。

就本发明而言，杂交表示核苷酸序列在非常低至非常高的严紧条件下与标记的核酸探针杂交，所述核酸探针对应于SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列；SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列中所含的cDNA序列；其全长互补链；或其亚序列。可使用例如X射线片(X-ray film)检测在这些条件下与核酸探针杂交的分子。

在一个优选的方面，核酸探针是SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列。在另一优选的方面，核酸探针是SEQ ID NO：1的核苷酸52-1809。在另一优选的方面，核酸探针是编码SEQ ID NO：2的多肽的多核苷酸序列，或其亚序列。在另一优选的方面，核酸探针是SEQ ID NO：1。在另一优选的方面，核酸探针是包含在大肠杆菌(E.coli)NRRL B-50059中的质粒pSMai182中含有的多核苷酸序列，其中所述其多核苷酸序列编码具有纤维二糖水解酶活性的多肽。在另一优选的方面，核酸探针是包含在大肠杆菌NRRL B-50059中的质粒pSMai182中含有的成熟多肽编码区。

对于长度至少100个核苷酸的长探针，将非常低至非常高的严紧条件定义为在42℃，在5X SSPE、0.3％SDS、200μg/ml已剪切并且变性的鲑精DNA中，并且对于非常低和低严紧性为25％的甲酰胺、对于中和中-高严紧性为35％的甲酰胺、或对于高和非常高严紧性为50％的甲酰胺，根据标准的Southern印迹步骤进行预杂交和杂交最佳12至24小时。

对于长度为至少100个核苷酸的长探针，使用2X SSC、0.2％SDS优选在45℃(非常低严紧性)，更优选在50℃(低严紧性)，更优选在55℃(中严紧性)，更优选在60℃(中-高严紧性)，甚至更优选在65℃(高严紧性)，并且最优选在70℃(非常高严紧性)将载体材料最终洗涤三次，每次15分钟。

对于长度大约15个核苷酸至大约70个核苷酸的短探针，将严紧条件定义为在比使用根据Bolton和McCarthy计算法(1962，Proceedings of theNational Academy of Sciences USA 48：1390)计算得出的Tm低大约5℃至大约10℃，在0.9M NaCl，0.09M Tris-HCl pH 7.6，6mM EDTA，0.5％NP-40，1X Denhardt溶液，1mM焦磷酸钠(sodium pyrophosphate)，1mM磷酸二氢钠(sodium monobasic phosphate)，0.1mM ATP和0.2mg每ml的酵母RNA中，根据标准的Southern印迹步骤进行预杂交、杂交和杂交后洗涤最佳12至24小时。

对于长度大约15个核苷酸至大约70个核苷酸的短探针，将所述载体材料在6X SSC加0.1％SDS中洗涤一次15分钟，并用6X SSC在比计算得出的T_m低5℃至10℃的温度洗涤两次，每次15分钟。

在第三个方面，本发明涉及由如下多核苷酸编码的具有纤维二糖水解酶活性的分离的多肽，所述多核苷酸包含与SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列具有优选至少60％、更优选至少65％、更优选至少70％、更优选至少75％、更优选至少80％、更优选至少85％、甚至更优选至少90％、最优选至少95％、并且甚至最优选至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％同一性程度的核苷酸序列或由所述核苷酸序列组成，其编码活性多肽。参见本文多核苷酸部分。

在第四个方面，本发明涉及人工变体，所述人工变体包含取代、缺失和/或插入一个或多个(或几个)氨基酸的SEQ ID NO：2的成熟多肽；或其同源序列。优选地，氨基酸改变对性质是较不重要的(of a minor nature)，即保守的氨基酸取代或插入，其不显著影响蛋白质的折叠和/或活性；通常为1至大约30个氨基酸的小缺失；小的氨基或羧基末端延伸，如氨基末端甲硫氨酸残基；多至大约20-25个残基的小接头肽；或通过改变净电荷或其它功能来促进纯化的小延伸，如多组氨酸序列(poly-histidine tract)、抗原表位(antigenicepitope)或结合域(binding domain)。

保守取代的实例是在以下组之内：碱性氨基酸组(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸组(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸组(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸组(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)、芳族氨基酸组(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小氨基酸组(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸)。通常不改变比活性(specific activity)的氨基酸取代是本领域已知的，并且由例如H.Neurath和R.L.Hill，1979，于The Proteins，Academic Press，New York中描述。最普遍发生的交换是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly。

除了20个基本氨基酸，非基本氨基酸(如4-羟脯氨酸、6-N-甲基赖氨酸、2-氨基异丁酸、异缬氨酸和α-甲基丝氨酸)可以取代野生型多肽的氨基酸残基。有限数量的非保守氨基酸、不由遗传密码编码的氨基酸和非天然氨基酸可以取代氨基酸残基。“非天然氨基酸”在蛋白质合成后已经过修饰，和/或在它们的侧链具有不同于基本氨基酸的化学结构。非天然氨基酸能够以化学方法合成，并且优选是商业上可得到的，包括六氢吡啶羧酸(pipecolic acid)、噻唑烷羧酸(thiazolidine carboxylic acid)、脱氢脯氨酸、3-和4-甲基脯氨酸，和3，3-二甲基脯氨酸。

可供选择的是，氨基酸改变具有这样的性质以使多肽的物理化学性质改变。例如，氨基酸改变可改进多肽的热稳定性，改变底物特异性，改变最适pH等。

能够根据本领域已知的方法，例如定位诱变或丙氨酸分区诱变法(Cunningham和Wells，1989，Science 244：1081-1085)来鉴定亲本多肽中的必需氨基酸。在后一技术中，将单一丙氨酸突变引入到分子中的每个残基，并且测试所得突变分子的生物活性(即，纤维二糖水解酶活性)以鉴定对于所述分子的活性关键的氨基酸残基。同样参见Hilton等，1996，J.Biol.Chem.271：4699-4708。酶的活性部位或其它的生物相互作用也能够通过结构的物理分析而确定，如通过以下这些技术：如核磁共振、晶体学、电子衍射或光亲和标记，连同推定的接触位点氨基酸的突变来确定。参见例如de Vos等，1992，Science 255：306-312；Smith等，1992，J.Mol.Biol.224：899-904；Wlodaver等，1992，FEBS Lett.309：59-64。必需氨基酸的同一性也能够从与多肽的同一性分析来推断，所述多肽与根据本发明的多肽相关。

能够使用已知的诱变、重组和/或改组(shuffling)方法，然后是有关的筛选方法，例如那些由Reidhaar-Olson和Sauer，1988，Science 241：53-57；Bowie和Sauer，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：2152-2156；WO 95/17413；或WO95/22625公开的那些方法来进行并测试单个或多个氨基酸取代、缺失、和/或插入。能够使用的其它方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如，Lowman等，1991，Biochem.30：10832-10837；美国专利5,223,409号；WO 92/06204)和区域定向的诱变(Derbyshire等，1986，Gene 46：145；Ner等，1988，DNA 7：127)。

诱变/改组方法能够与高通量、自动化的筛选方法组合以检测由宿主细胞表达的克隆的、诱变的多肽的活性(Ness等，1999，Nature Biotechnology 17：893-896)。能够从宿主细胞回收编码活性多肽的诱变的DNA分子，并且使用本领域内标准方法快速测序。这些方法允许快速确定感兴趣的多肽中单个氨基酸残基的重要性，并且能够应用于未知结构的多肽。

SEQ ID NO：2的成熟多肽如SEQ ID NO：2的氨基酸18-482的氨基酸取代、缺失和/或插入的总数是10，优选9，更优选8，更优选7，更优选至多6，更优选5，更优选4，甚至更优选3，最优选2，并且甚至最优选1。

具有纤维二糖水解酶活性的多肽的来源

本发明的多肽可以获得自任何属的微生物。就本发明而言，用于本文与给定的来源有关的术语“获得自”，意思是核苷酸序列编码的多肽由所述来源产生，或由其中插入了来自所述来源的核苷酸序列的菌株产生。在一个优选的方面，获得自给定来源的多肽是胞外分泌的。

本发明具有纤维二糖水解酶活性的多肽可以是细菌多肽。例如，所述多肽可以是革兰氏阳性细菌多肽例如芽孢杆菌属(Bacillus)、链球菌属(Streptococcus)、链霉菌属(Streptomyces)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、肠球菌属(Enterococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、梭菌属(Clostridium)、地芽孢杆菌属(Geobacillus)或海洋芽孢杆菌属(Oceanobacillus)多肽，所述多肽具有纤维二糖水解酶活性；或革兰氏阴性细菌多肽，如大肠杆菌、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙门氏菌属(Salmonella)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、螺杆菌属(Helicobacter)、黄杆菌属(Flavobacterium)、梭杆菌属(Fusobacterium)、泥杆菌属(Ilyobacter)、奈瑟氏菌属(Neisseria)或脲原体属(Ureaplasma)多肽，所述多肽具有纤维二糖水解酶活性。

在一个优选的方面，所述多肽是具有纤维二糖水解酶活性的嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、坚强芽孢杆菌(Bacillusfirmus)、灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)多肽。

在另一个优选的方面，所述多肽是具有纤维二糖水解酶活性的似马链球菌(Streptococcus equisimilis)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、乳房链球菌(Streptococcus uberis)或马链球菌兽瘟亚种(Streptococcus equi subsp.Zooepidemicus)多肽。

在另一个优选的方面，所述多肽是具有纤维二糖水解酶活性的不产色链霉菌(Streptomyces achromogenes)、除虫链霉菌(Streptomyces avermitilis)、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)、灰色链霉菌(Streptomyces griseus)或浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)多肽。

本发明具有纤维二糖水解酶活性的多肽也可以是真菌多肽，并且更优选酵母多肽如念珠菌属(Candida)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)或西洋蓍霉属(Yarrowia)多肽，其具有纤维二糖水解酶活性；或更优选丝状真菌多肽如枝顶孢霉属(Acremonium)、伞菌属(Agaricus)、链格孢属(Alternaria)、曲霉属(Aspergillus)、短梗霉属(Aureobasidium)、Botryospaeria、拟蜡菌属(Ceriporiopsis)、毛喙壳属(Chaetomidium)、金孢子菌属(Chrysosporium)、麦角菌属(Claviceps)、旋孢腔菌属(Cochliobolus)、Coprinopsis、Coptotermes、棒囊壳属(Corynascus)、隐丛赤壳属(Cryphonectria)、隐球菌属(Cryptococcus)、色二胞属(Diplodia)、黑耳属(Exidia)、线黑粉酵母属(Filibasidium)、镰孢属(Fusarium)、赤霉属(Gibberella)、全毛虫目(Holomastigotoides)、腐质霉属(Humicola)、耙菌属(Irpex)、香菇属(Lentinula)、小球腔菌属(Leptospaeria)、梨孢菌属(Magnaporthe)、Melanocarpus、多孔菌属(Meripilus)、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、新考玛脂霉属(Neocallimastix)、脉孢菌属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属(Penicillium)、平革菌属(Phanerochaete)、瘤胃壶菌属(Piromyces)、Poitrasia、假黑盘菌属(Pseudoplectania)、Pseudotrichonympha、根毛霉属(Rhizomucor)、裂褶菌属(Schizophyllum)、柱顶孢属(Scytalidium)、踝节菌属(Talaromyces)、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)、木霉属(Trichoderma)、长毛盘菌属(Trichophaea)、轮枝孢属(Verticillium)、草菇属(Volvariella)或炭角菌属(Xylaria)多肽，其具有纤维二糖水解酶活性。

在一个优选的方面，所述多肽是具有纤维二糖水解酶活性的卡尔酵母(Saccharomyces carlsbergensis)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)、道格拉氏酵母(Saccharomyces douglasii)、克鲁弗酵母(Saccharomyces kluyveri)、诺地酵母(Saccharomyces norbensis)或卵形酵母(Saccharomyces oviformis)多肽。

在另一优选的方面，所述多肽是具有纤维二糖水解酶活性的解纤维枝顶孢霉(Acremonium cellulolyicus)、棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、臭曲霉(Aspergillusfoetidus)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、嗜角质金孢子菌(Chrysosporium keratinophilum)、Chrysosporium lucknowense、热带金孢子菌(Chrysosporium tropicum)、Chrysosporium merdarium、Chrysosporium inops、毡金孢子菌(Chrysosporium pannicola)、昆士兰金孢子菌(Chrysosporiumqueenslandicum)、褐薄金孢子菌(Chrysosporium zonatum)、杆孢状镰孢(Fusarium bactridioides)、禾谷镰孢(Fusarium cerealis)、库威镰孢(Fusariumcrookwellense)、大刀镰孢(Fusarium culmorum)、禾本科镰孢(Fusariumgraminearum)、禾赤镰孢(Fusarium graminum)、异孢镰孢(Fusariumheterosporum)、合欢木镰孢(Fusarium negundi)、尖镰孢(Fusarium oxysporum)、多枝镰孢(Fusarium reticulatum)、粉红镰孢(Fusarium roseum)、接骨木镰孢(Fusarium sambucinum)、肤色镰孢(Fusarium sarcochroum)、拟分枝孢镰孢(Fusarium sporotrichioides)、硫色镰孢(Fusarium sulphureum)、圆镰孢(Fusarium torulosum)、拟丝孢镰孢(Fusarium trichothecioides)、镶片镰孢(Fusarium venenatum)、灰腐质霉(Humicola grisea)、特异腐质霉(Humicolainsolens)、疏棉状腐质霉(Humicola lanuginosa)、白囊耙菌(Irpex lacteus)、米黑毛霉(Mucor miehei)、嗜热毁丝霉、粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)、绳状青霉(Penicillium funieulosum)、产紫青霉(Penicillium purpurogenum)、黄孢平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、Thielavia achromatica、Thielaviaalbomyces、Thielavia albopilosa、Thielavia australeinsis、Thielavia fimeti、微孢梭孢壳(Thielavia microspora)、卵孢梭孢壳(Thielavia ovispora)、Thielaviaperuviana、瘤孢梭孢壳(Thielavia spededonium)、毛梭孢壳(Thielavia setosa)、Thielavia subthermophila、土生梭孢霉(Thielavia terrestris)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、康宁木霉(Trichoderma koningii)、长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)、里氏木霉(Trichoderma reesei)或绿色木霉(Trichoderma viride)多肽。

在另一优选的方面，所述多肽是嗜热毁丝霉、Myceliophthora fergusii、Myceliophthora hinnulea、Myceliophthora histoplasmoides、Myceliophthoraindica、藤黄毁丝霉(Myceliophthora lutea)、硫磺毁丝霉(Myceliophthorasulphurea)、嗜热毁丝霉或Myceliophthora vellerea多肽。

在一个更优选的方面，所述多肽是具有纤维二糖水解酶活性的嗜热毁丝霉多肽。在一个优选的方面，所述多肽是具有纤维二糖水解酶活性的嗜热毁丝霉CBS 202.75多肽，例如，包含SEQ ID NO：2的成熟多肽的多肽。

可理解的是对于前述的种，本发明包含完全和不完全阶段(perfect andimperfect states)，和其它分类学的等同物(equivalent)，例如无性型(anamorph)，而无论它们已知的种名。本领域熟练技术人员会容易地识别适合的等同物的身份(identity)。

这些种的菌株在许多培养物保藏机构对于公众能够容易地获得，所述保藏机构如美国典型培养物保藏中心(the American Type Culture Collection)(ATCC)、德意志微生物和细胞培养物保藏中心(Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH)(DSM)、真菌菌种保藏中心(Centraalbureau Voor Schimmelcultures)(CBS)和农业研究机构专利培养物保藏中心北区研究中心(Agricultural Research Service Patent Culture Collection，Northern Regional Research Center)(NRRL)。

此外，可以使用上述的探针从其它来源，包括从自然界(例如，土壤、堆肥、水等)分离的微生物鉴定和获得这些多肽。用于从天然生境(habitat)分离微生物的技术是本领域内公知的。然后可通过相似地筛选这种微生物的基因组或cDNA文库来获得所述多核苷酸。一旦用所述探针检测到编码多肽的多核苷酸序列，就能够使用本领域普通技术人员熟知的技术将所述多核苷酸分离或克隆(参见，例如，Sambrook等，1989，见上)。

本发明的多肽还包括融合多肽或可切割的融合多肽，其中将另外的多肽融合到所述多肽或其片段的N末端或C末端。通过将编码另一个多肽的核苷酸序列(或其部分)融合于本发明的核苷酸序列(或其部分)来产生融合的多肽。产生融合多肽的技术是本领域已知的，并包括连接编码多肽的编码序列以使它们符合读框，并且使融合多肽的表达在相同启动子和终止子的控制下。

融合多肽还可以包括切割位点。一旦分泌了融合多肽，就切割所述位点，从融合蛋白质释放具有纤维二糖水解酶活性的多肽。切割位点的实例包括，但不限于，编码二肽Lys-Arg的Kex2位点(Martin等，2003，J.Ind.Microbiol.Biotechnol.3：568-76；Svetina等，2000，J.Biotechnol.76：245-251；Rasmussen-Wilson等，1997，Appl.Environ.Microbiol.63：3488-3493；Ward等，1995，Biotechnology 13：498-503；和Contreras等，1991，Biotechnology 9：378-381)；Ile-(Glu或Asp)-Gly-Arg位点，其在精氨酸残基后通过因子Xa蛋白酶切割(Eaton等，1986，Biochem.25：505-512)；Asp-Asp-Asp-Asp-Lys位点，其在赖氨酸后通过肠激酶切割(Collins-Racie等，1995，Biotechnology 13：982-987)；His-Tyr-Glu位点或His-Tyr-Asp位点，其通过Genenase I切割(Carter等，1989，Proteins：Structure，Function，and Genetics 6：240-248)；Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser位点，其在Arg后通过凝血酶切割(Stevens，2003，Drug Discovery World 4：35-48)；Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-Gly位点，其在Gln后通过TEV蛋白酶切割(Stevens，2003，见上)；和Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln-Gly-Pro位点，其在Gln后通过遗传工程形式的人鼻病毒3C蛋白酶切割(Stevens，2003，见上)。

多核苷酸

本发明还涉及分离的多核苷酸，其包含编码本发明具有纤维二糖水解酶活性的多肽的核苷酸序列，或由该核苷酸序列组成。

在一个优选的方面，核苷酸序列包含SEQ ID NO：1或由SEQ ID NO：1组成。在另一更优选的方面，核苷酸序列包含大肠杆菌NRRL B-50059中所含质粒pSMai182中的序列，或由该序列组成。在另一优选的方面，核苷酸序列包含SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列或由SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列组成。在另一优选的方面，核苷酸序列包含SEQ ID NO：1的核苷酸52-1809或由SEQ ID NO：1的核苷酸52-1809组成。在另一更优选的方面，核苷酸序列包含大肠杆菌NRRL B-50059中所含质粒pSMai182中的成熟多肽编码序列或由该成熟多肽编码区组成。本发明还包含编码如下多肽的核苷酸序列，所述多肽包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列或其成熟多肽，或由SEQ ID NO：2的氨基酸序列或其成熟多肽组成；由于遗传密码的简并性，所述核苷酸序列不同于SEQ ID NO：1或其成熟多肽编码序列。本发明还涉及SEQ ID NO：1的亚序列，所述亚序列编码具有纤维二糖水解酶活性的SEQ ID NO：2的片段。

本发明还涉及突变的多核苷酸，其在SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列中包含至少一个突变或由具有至少一个突变的SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列组成，其中突变的核苷酸序列编码SEQ ID NO：2的成熟多肽。

用于分离或克隆编码多肽的多核苷酸的技术是本领域内已知的，且包括从基因组DNA分离，从cDNA制备，或其组合。可通过例如使用熟知的聚合酶链式反应(PCR)或表达文库的抗体筛选来检测具有共有结构特性的克隆DNA片段，从而实现从这种基因组DNA克隆本发明的多核苷酸。参见，例如，Innis等，1990，PCR：A Guide to Methods and Application，Academic Press，New York。可以使用其它核酸扩增方法，如连接酶链式反应(LCR)、连接活化转录(ligated activated transcription；LAT)和基于核苷酸序列的扩增(NASBA)。可以从毁丝霉属菌株，或另外的或相关的生物体克隆所述多核苷酸，并且因此可以是例如所述核苷酸序列的多肽编码区的等位基因变体或种变体(species variant)。

本发明还涉及分离的多核苷酸，其包含下述核苷酸序列或由其组成，所述核苷酸序列与SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列具有优选至少60％，更优选至少65％，更优选至少70％，更优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，甚至更优选至少90％，最优选至少95％，并且甚至最优选至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性程度，所述多核苷酸编码活性多肽。

修饰编码本发明多肽的核苷酸序列对于合成与所述多肽基本上相似的多肽可为必需的。术语与所述多肽“基本上相似”指多肽的非天然存在的形式。这些多肽可能以一些工程改造的方式而不同于从其天然来源分离的多肽，例如，比活性、热稳定性、最适pH等方面不同的人工变体。可以在作为SEQ IDNO：1的成熟多肽编码序列存在的核苷酸序列，例如其亚序列的基础上，和/或通过引入如下核苷酸取代来构建变体序列：所述取代不产生由核苷酸序列编码的多肽的另外的氨基酸序列，但是符合意欲产生酶的宿主生物体的密码子选择；或者所述取代可产生不同的氨基酸序列。关于核苷酸取代的概述，参见，例如，Ford等，1991，Protein Expression and Purification 2：95-107。

对于本领域技术人员显而易见的是，这些取代能够在对于分子功能重要的区域之外进行，并且仍然产生活性多肽。对于由本发明的分离的多核苷酸编码的多肽活性关键的并且因此优选不进行取代的氨基酸残基，可以根据本领域公知的方法，如定位诱变或丙氨酸分区诱变法(参见，例如，Cunningham和Wells，1989，见上)来鉴定。在后一技术中，将突变引入到分子中的每个荷正电的残基处，并且测试所得突变分子的纤维二糖水解酶活性，以鉴定对于所述分子的活性关键的氨基酸残基。底物-酶相互作用的位点也能够通过分析三维结构确定，通过如核磁共振分析、晶体学或光亲和标记这样的技术来确定(参见，例如，de Vos等，1992，见上；Smith等，1992，见上；Wlodaver等，1992，见上)。

本发明还涉及编码本发明多肽的分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸在非常低严紧条件下，优选低严紧条件，更优选中严紧条件，更优选中-高严紧条件，甚至更优选高严紧条件，并且最优选非常高的严紧条件下，与以下杂交：(i)SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列，(ii)SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列中所含的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链，或它们的等位变体和亚序列(Sambrook等，1989，同上)，如本文所定义的。在一个优选的方面，互补链是SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列的全长互补链。

本发明还涉及如下获得的分离的多核苷酸：(a)在非常低、低、中、中-高、高或非常高严紧条件下，将DNA的群体与以下杂交：(i)SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列，(ii)SEQ IDNO：1的成熟多肽编码序列中所含的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；和(b)分离杂交的多核苷酸，其编码具有纤维二糖水解酶活性的多肽。在一个优选的方面，所述互补链是SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列的全长互补链。

核酸构建体

本发明还涉及包含本发明的分离的多核苷酸的核酸构建体，所述分离的多核苷酸与一个或多个(几个)调控序列可操作地连接，所述调控序列在合适的宿主细胞中在与该调控序列相容的条件下指导编码序列的表达。

可以用许多方式操作编码本发明多肽的分离的多核苷酸以供多肽的表达。依赖于表达载体，在将多核苷酸的序列插入载体之前对其进行操作可能是理想的或必需的。使用重组DNA方法修饰多核苷酸序列的技术是本领域熟知的。

调控序列可以是适当的启动子序列，其是由用于表达编码本发明多肽的多核苷酸的宿主细胞识别的核苷酸序列。启动子序列含有介导多肽的表达的转录调控序列。启动子可以是在所选的宿主细胞中显示转录活性的任何核苷酸序列，包括突变的、截短的和杂合的启动子，并且可以从编码与宿主细胞同源或异源的胞外或胞内多肽的基因获得。

用于指导本发明的核酸构建体转录，特别是在细菌宿主细胞中转录的合适启动子的实例是从下述获得的启动子：大肠杆菌lac操纵子、天蓝色链霉菌琼脂糖酶基因(dagA)、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)、嗜热脂肪芽孢杆菌产麦芽淀粉酶基因(amyM)、解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因和原核β-内酰胺酶基因(Villa-Kamaroff等，1978，Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75：3727-3731)，以及tac启动子(DeBoer等，1983，Proceedings of the National Academy of Sciences USA80：21-25)。另外的启动子在″Useful proteins from recombinant bacteria″于Scientific American，1980，242：74-94中；和在Sambrook等，1989，见上中描述。

用于指导本发明的核酸构建体在丝状真菌宿主细胞中转录的合适启动子的实例是从下列酶的基因获得的启动子：米曲霉TAKA淀粉酶、曼赫根毛霉(Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、曼赫根毛霉脂肪酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、构巢曲霉乙酰胺酶、镶片镰孢淀粉葡糖苷酶(WO 00/56900)、镶片镰孢Daria(WO 00/56900)、镶片镰孢Quinn(WO 00/56900)、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶(WO 96/00787)、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶IV、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉β-木糖苷酶，以及NA2-tpi启动子(来自黑曲霉中性α-淀粉酶基因和米曲霉丙糖磷酸异构酶基因的启动子的杂合体)；和它们的突变的、截短的和杂合的启动子。

在酵母宿主中，有用的启动子从如下酶的基因获得：酿酒酵母烯醇化酶(ENO-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH1，ADH2/GAP)、酿酒酵母丙糖磷酸异构酶(TPI)、酿酒酵母金属硫蛋白(CUP1)和酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。对于酵母宿主细胞其它有用的启动子由Romanos等，1992，Yeast 8：423-488描述。

调控序列也可以是合适的转录终止子序列，其是由宿主细胞识别以终止转录的序列。所述终止子序列与编码所述多肽的核苷酸序列的3’末端可操作地连接。可以将在所选宿主细胞中有功能的任何终止子用在本发明中。

对于丝状真菌宿主细胞优选的终止子从如下酶的基因获得：米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉α-葡糖苷酶和尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶。

对于酵母宿主细胞优选的终止子从如下酶的基因获得：酿酒酵母烯醇化酶、酿酒酵母细胞色素C(CYC1)和酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶。对于酵母宿主细胞其它有用的终止子由Romanos等，1992，见上描述。

调控序列还可以是合适的前导序列，其是对于宿主细胞的翻译重要的mRNA非翻译区。前导序列可操作地连接于编码多肽的核苷酸序列的5’-末端。可以将在所选宿主细胞中有功能的任何前导序列用在本发明中。

对于丝状真菌宿主细胞优选的前导序列从如下酶的基因获得：米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶。

对于酵母宿主细胞合适的前导序列从如下酶的基因获得：酿酒酵母烯醇化酶(ENO-1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α因子和酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)。

调控序列也可以是聚腺苷酸化序列，其是与核苷酸序列的3’末端可操作地连接的序列，并且在转录时，宿主细胞将其识别为向转录的mRNA添加聚腺苷残基的信号。可以将在所选宿主细胞中有功能的任何聚腺苷酸化序列在本发明中使用。

对于丝状真菌宿主细胞优选的聚腺苷酸化序列从如下酶的基因获得：米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶和黑曲霉α-葡糖苷酶。

对于酵母宿主细胞有用的聚腺苷酸化序列由Guo和Sherman，1995，Molecular Cellular Biology 15：5983-5990描述。

调控序列还可以是信号肽编码序列，其编码与多肽的氨基末端相连的氨基酸序列，并且指导编码的多肽进入细胞分泌途径。核苷酸序列的编码序列5’端可固有地包含信号肽编码序列，该信号肽编码序列与编码分泌多肽的编码序列区段一起天然地连接在翻译阅读框中。或者，编码序列5’端可含有对于所述编码序列为外源的信号肽编码序列。外源信号肽编码序列在编码序列不天然地含有信号肽编码序列时可为必需的。或者，外源信号肽编码序列可以简单地取代天然信号肽编码序列以增强多肽的分泌。然而，指导表达的多肽进入所选宿主细胞的分泌途径(即，分泌至培养基中)的任何信号肽编码序列可在本发明中使用。

对于细菌宿主细胞有效的信号肽编码序列是从如下酶的基因获得的信号肽编码序列：芽孢杆菌属NCIB 11837产麦芽糖淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶、地衣芽孢杆菌枯草蛋白酶(subtilisin)、地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT，nprS，nprM)和枯草芽孢杆菌prsA。另外的信号肽由Simonen和Palva，1993，Microbiological Reviews 57：109-137描述。

对于丝状真菌宿主细胞有效的信号肽编码序列是从如下酶的基因获得的信号肽编码序列：米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、特异腐质霉纤维素酶、特异腐质霉内切葡聚糖酶V和疏棉状腐质霉脂肪酶。

对于酵母宿主细胞有用的信号肽从酿酒酵母α因子和酿酒酵母转化酶的基因获得。其它有用的信号肽编码序列由Romanos等，1992，见上描述。

在一个优选的方面，信号肽包含SEQ ID NO：2的氨基酸1至17或由SEQID NO：2的氨基酸1至17组成。在另一优选的方面，信号肽编码序列包含SEQ ID NO：1的核苷酸1至51或由SEQ ID NO：1的核苷酸1至51组成。

调控序列还可以是前肽编码序列，其编码位于多肽氨基末端的氨基酸序列。所得多肽称为酶原(proenzyme)或前多肽(propolypeptide)(或在某些情况下称为酶原(zymogen))。前肽通常是无活性的并且能够通过前肽的催化或自催化切割从前多肽转化为成熟活性多肽。可以从枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、酿酒酵母α因子、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶和嗜热毁丝霉漆酶(WO 95/33836)的基因获得前肽编码区。

当信号肽和前肽序列二者均出现在多肽的氨基末端时，将前肽序列置于紧接着(next to)多肽氨基末端，并且将信号肽序列置于紧接着前肽序列的氨基末端。

同样理想的是添加调节序列，其允许相对于宿主细胞的生长来调节多肽的表达。调节系统的实例是引起基因表达响应化学或物理刺激物，包括调节化合物的存在而开启或关闭的那些系统。原核系统中的调节系统包括lac、tac和trp操纵基因系统。在酵母中，可以使用ADH2系统或GAL1系统。在丝状真菌中，可以使用TAKAα-淀粉酶启动子、黑曲霉葡糖淀粉酶启动子和米曲霉葡糖淀粉酶启动子作为调节序列。调节序列的其它实例是那些允许基因扩增的序列。在真核系统中，这些调节序列包括在氨甲蝶呤(methotrexate)存在下扩增的二氢叶酸还原酶基因，和以重金属(with heavy metal)扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况下，编码多肽的核苷酸序列将与调节序列可操作地连接。

表达载体

本发明还涉及重组表达载体，所述重组表达载体包含本发明的多核苷酸、启动子和转录和翻译终止信号。本文所述的多种核酸和调控序列可以结合在一起以产生重组表达载体，所述表达载体可以包括一个或多个(几个)方便的限制位点以允许在这些位点插入或取代编码多肽的核苷酸序列。可供选择的是，可以通过在适当的用于表达的载体中插入包含所述序列的核苷酸序列或核酸构建体来表达本发明的多核苷酸序列。在制备表达载体的过程中，将编码序列置于载体中，使得该编码序列与适当的表达用调控序列可操作地连接。

重组表达载体可以是任何载体(例如，质粒或病毒)，其能够方便地进行重组DNA步骤，并且能够产生核苷酸序列的表达。载体的选择将通常依赖于载体与将引入该载体的宿主细胞的相容性。载体可以是线状或闭合环状质粒。

载体可以是自主复制载体，即，作为染色体外实体(entity)存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如，质粒、染色体外元件、微型染色体(minichromosome)或人工染色体。载体可以含有任何用于确保自复制的手段(means)。或者，载体可以是一种当被引入宿主细胞中时，整合到基因组中并且与整合了该载体的染色体一起复制的载体。此外，可以使用单独的载体或质粒或两个或更多个载体或质粒，其共同含有待引入宿主细胞基因组的完整DNA(total DNA)，或可以使用转座子(transposon)。

本发明的载体优选地含有一个或多个(几个)选择性标记，其允许简单选择经转化、转染、转导等的细胞。选择性标记是基因，其产物提供杀生物剂或病毒抗性、对重金属的抗性、对营养缺陷型的原养性(prototrophy toauxotrophs)等。

细菌选择性标记的实例是来自枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的dal基因，或赋予抗生素抗性的标记，所述抗生素抗性如氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素或四环素抗性。对于酵母宿主细胞合适的标记是ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。用于丝状真菌宿主细胞的选择性标记包括但不限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(草铵膦(phosphinothricin)乙酰转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)(nitrate reductase)、pyrG(乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶)(orotidine-5’-phosphatedecarboxylase)、sC(硫酸腺苷酰转移酶)和trpC(邻氨基苯甲酸合酶(anthranilate synthase))以及它们的等价物。优选用在曲霉属细胞中的是构巢曲霉或米曲霉的amdS和pyrG基因和吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)的bar基因。

本发明的载体优选含有元件，其允许载体整合入宿主细胞基因组或载体在细胞中独立于基因组的自主复制。

为了整合入宿主细胞基因组，载体可依赖编码多肽的多核苷酸的序列或用于通过同源或非同源重组整合入基因组的任何其它载体元件。或者，载体可以含有额外的核苷酸序列，用于指导通过同源重组整合入宿主细胞基因组染色体中的精确位置。为了增加在精确位置整合的可能性，整合元件应优选含有足够数量的核酸，如100至10,000碱基对，优选400至10,000碱基对，并且最优选800至10,000碱基对，其与相应的目标序列具有高度同一性以增强同源重组的概率。整合元件可以是任何序列，其与宿主细胞基因组中的目标序列同源。此外，整合元件可以是非编码或编码的核苷酸序列。另一方面，可以将载体通过非同源重组整合到宿主细胞的基因组中。

为了自主复制，载体可以还包含复制起点，其使载体能够在所述的宿主细胞中自主地复制。复制起点可以是介导自主复制的任何质粒复制子(replicator)，其在细胞中发挥功能。术语“复制起点”或“质粒复制子”在本文定义为能够使质粒或载体体内复制的核苷酸序列。

细菌复制起点的实例是允许在大肠杆菌中复制的质粒pBR322、pUC19、pACYC177和pACYC184的复制起点，和允许在芽孢杆菌属中复制的质粒pUB110、pE194、pTA1060和pAMβ1的复制起点。

用于酵母宿主细胞中的复制起点的实例是2微米复制起点，ARS1，ARS4，ARS1和CEN3的组合，和ARS4和CEN6的组合。

在丝状真菌细胞中有用的复制起点的实例是AMA1和ANS1(Gems等，1991，Gene 98：61-67；Cullen等，1987，Nucleic Acids Research 15：9163-9175；WO 00/24883)。分离AMA1基因和构建包含该基因的质粒或载体能够根据公开于WO 00/24883中的方法完成。

可以将多于一个拷贝的本发明的多核苷酸插入宿主细胞以增加基因产物的产生。多核苷酸拷贝数的增加可通过如下方法获得：将至少一个额外拷贝的序列整合入宿主细胞基因组，或将可扩增的选择性标记基因包括于多核苷酸，其中可通过在合适的选择剂(selectable agent)存在下培养细胞来选择含有选择性标记基因的扩增拷贝，从而也含有多核苷酸的额外拷贝的细胞。

用于连接上述元件以构建本发明的重组表达载体的方法是本领域技术人员熟知的(参见，例如，Sambrook等，1989，见上)。

宿主细胞

本发明还涉及重组宿主细胞，其包含本发明的分离的多核苷酸，将所述重组宿主细胞有利地用于多肽的重组产生。将包含本发明的多核苷酸的载体引入宿主细胞使得所述载体作为染色体整合体或作为自复制的染色体外载体保持，如前文所述。术语“宿主细胞”包含亲本细胞的任何子代，其因为在复制过程中发生的突变而与该亲本细胞不同。宿主细胞的选择在很大程度上会依赖于编码多肽的基因及其来源。

宿主细胞可以是在本发明的多肽的重组产生中有用的任何细胞，例如，原核或真核细胞。

原核宿主细胞可以是任何革兰氏阳性细菌或革兰氏阴性细菌。革兰氏阳性细菌包括但不限于，芽孢杆菌属、链球菌属、链霉菌属、葡萄球菌属、肠球菌属、乳杆菌属、乳球菌属、梭菌属、地芽孢杆菌属和海洋芽孢杆菌属。革兰氏阴性细菌包括但不限于，大肠杆菌、假单胞菌属、沙门氏菌属、弯曲杆菌属、螺杆菌属、黄杆菌属、梭杆菌属、泥杆菌属、奈瑟氏菌属和脲原体属。

细菌宿主细胞可以是任何芽孢杆菌属细胞。在本发明的实施中有用的芽孢杆菌属细胞包括但不限于，嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌细胞。

在一个优选的方面，细菌宿主细胞是解淀粉芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌细胞。在一个更优选的方面，细菌宿主细胞是解淀粉芽孢杆菌细胞。在另一个更优选的方面，细菌宿主细胞是克劳氏芽孢杆菌细胞。在另一个更优选的方面，细菌宿主细胞是地衣芽孢杆菌细胞。在另一个更优选的方面，细菌宿主细胞是枯草芽孢杆菌细胞。

细菌宿主细胞还可以是任何链球菌属细胞。在本发明的实施中有用的链球菌属细胞包括但不限于，似马链球菌、酿脓链球菌、乳房链球菌和马链球菌兽瘟亚种细胞。

在一个优选的方面，细菌宿主细胞是似马链球菌细胞。在另一个优选的方面，细菌宿主细胞是酿脓链球菌细胞。在另一个优选的方面，细菌宿主细胞是乳房链球菌细胞。在另一个优选的方面，细菌宿主细胞是马链球菌兽瘟亚种细胞。

细菌宿主细胞还可以是任何链霉菌属细胞。在本发明的实施中有用的链霉菌属细胞包括但不限于，不产色链霉菌、除虫链霉菌、天蓝色链霉菌、灰色链霉菌和浅青紫链霉菌细胞。

在一个优选的方面，细菌宿主细胞是不产色链霉菌细胞。在另一个优选的方面，细菌宿主细胞是除虫链霉菌细胞。在另一个优选的方面，细菌宿主细胞是天蓝色链霉菌细胞。在另一个优选的方面，细菌宿主细胞是灰色链霉菌细胞。在另一个优选的方面，细菌宿主细胞是浅青紫链霉菌细胞。

可通过如下方法实现将DNA引入到芽孢杆菌细胞：例如原生质体转化(参见，例如，Chang和Cohen，1979，Molecular General Genetics 168：111-115)，使用感受态细胞(参见，例如，Young和Spizizen，1961，Journal of Bacteriology81：823-829或Dubnau和Davidoff-Abelson，1971，Journal of Molecular Biology56：209-221)，电穿孔(参见，例如，Shigekawa和Dower，1988，Biotechniques 6：742-751)或接合(参见，例如，Koehler和Thorne，1987，Journal of Bacteriology169：5771-5278)。可通过如下方法实现将DNA引入到大肠杆菌细胞：例如原生质体转化(参见，例如，Hanahan，1983，J.Mol.Biol.166：557-580)或电穿孔(参见，例如，Dower等，1988，Nucleic Acids Res.16：6127-6145)。可通过如下方法实现将DNA引入到链霉菌属细胞：例如原生质体转化和电穿孔(参见，例如，Gong等，2004，Folia Microbiol.(Praha)49：399-405)，接合(参见，例如，Mazodier等，1989，J.Bacteriol.171：3583-3585)，或转导(参见，例如，Burke等，2001，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98：6289-6294)。可通过如下方法实现将DNA引入到假单胞菌属细胞：例如电穿孔(参见，例如，Choi等，2006，J.Microbiol.Methods 64：391-397)或接合(参见，例如，Pinedo和Smets，2005，Appl.Environ.Microbiol.71：51-57)。可通过如下方法实现将DNA引入到链球菌属细胞：例如天然感受态(natural competence)(参见，例如，Perry和Kuramitsu，1981，Infect.Immun.32：1295-1297)，原生质体转化(参见，例如，Catt和Jollick，1991，Microbios.68：189-207)，电穿孔(参见，例如，Buckley等，1999，Appl.Environ.Microbiol.65：3800-3804)或接合(参见，例如，Clewell，1981，Microbiol.Rev.45：409-436)。然而，可以使用任何已知的将DNA引入宿主细胞的方法。

宿主细胞还可以是真核生物，如哺乳动物、昆虫、植物或真菌细胞。

在一个优选的方面，宿主细胞是真菌细胞。“真菌”用在本文包括以下门：子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)和接合菌门(Zygomycota)(如由Hawksworth等，于Ainsworth and Bisby’s Dictionary of The Fungi，第八版，1995，CAB International，University Press，Cambridge，UK中所定义)以及卵菌门(Oomycota)(如Hawksworth等，1995，见上，171页中所引用)，和所有有丝分裂孢子真菌(mitosporic fungi)(Hawksworth等，1995，见上)。

在一个更优选的方面，真菌宿主细胞是酵母细胞。“酵母”用在本文包括产子囊酵母(ascosporogenous yeast)(内孢霉目(Endomycetales))、产担子酵母(basidiosporogenous yeast)和属于半知菌类(Fungi Imperfecti)(芽孢纲(Blastomycetes))的酵母。由于酵母的分类在未来可能改变，就本发明而言，会将酵母定义为如Biology and Activities of Yeast(Skinner，F.A.，Passmore，S.M.，和Davenport，R.R.，eds，Soc.App.Bacteriol.Symposium Series No.9，1980)中所述。

在甚至更加优选的方面，酵母宿主细胞是念珠菌属、汉逊酵母属(Hansenula)、克鲁维酵母属、毕赤酵母属、酵母属、裂殖酵母属或西洋蓍霉属细胞。

在最优选的方面，酵母宿主细胞是卡尔酵母、酿酒酵母、糖化酵母、道格拉氏酵母、克鲁弗酵母、诺地酵母或卵形酵母细胞。在另一个最优选的方面，酵母宿主细胞是乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)细胞。在另一个最优选的方面，酵母宿主细胞是解脂西洋蓍霉(Yarrowia lipolytica)细胞。

在另一个更优选的方面，真菌宿主细胞是丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括真菌门(Eumycota)和卵菌门的亚门(如由Hawksworth等，1995，见上文，所定义)的所有丝状形式。丝状真菌通常的特征在于由壳多糖(chitin)、纤维素、葡聚糖、壳聚糖(chitosan)、甘露聚糖和其它复杂多糖组成的菌丝体壁。通过菌丝延伸进行营养生长，而碳分解代谢是专性需氧的。相反，酵母例如酿酒酵母的营养生长通过单细胞菌体的出芽生殖(budding)进行，而碳分解代谢可以是发酵的。

在甚至更优选的方面，丝状真菌宿主细胞是枝顶孢霉属、曲霉属、短梗霉属、烟管霉属(Bjerkandera)、拟蜡菌属、金孢子菌属、鬼伞属(Coprinus)、革盖菌属(Coriolus)、隐球菌属、线黑粉酵母属、镰孢属、腐质霉属、梨孢菌属、毛霉属、毁丝霉属、新考玛脂霉属、脉孢菌属、拟青霉属、青霉属、平革菌属、射脉菌属(Phlebia)、瘤胃壶菌属、侧耳属(Pleurotus)、裂褶菌属、踝节菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、弯颈霉属、栓菌属(Trametes)或木霉属细胞。

在最优选的方面，丝状真菌宿主细胞是泡盛曲霉、烟曲霉、臭曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉或米曲霉细胞。在另一个最优选方面，丝状真菌宿主细胞是杆孢状镰孢、禾谷镰孢、库成镰孢、大刀镰孢、禾本科镰孢、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖镰孢、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟分枝孢镰孢、硫色镰孢、圆镰孢、拟丝孢镰孢或镶片镰孢细胞。在另一个最优选的方面，丝状真菌宿主细胞是黑刺烟管菌(Bjerkanderaadusta)、Ceriporiopsis aneirina、Ceriporiopsis aneirina、Ceriporiopsis caregiea、Ceriporiopsis gilvescens、Ceriporiopsis pannocinta、Ceriporiopsis rivulosa、Ceriporiopsis subrufa、Ceriporiopsis subvermispora、嗜角质金孢子菌、Chrysosporium lucknowense、热带金孢子菌、Chrysosporium merdarium、Chrysosporium inops、毡金孢子菌、昆士兰金孢子菌、褐薄金孢子菌、灰盖鬼伞(Coprinus cinereus)、毛革盖菌(Coriolus hirsutus)、特异腐质霉、疏棉状腐质霉、米黑毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙脉孢菌、产紫青霉、黄孢平革菌、辐射射脉菌(Phlebia radiata)、刺芹侧耳(Pleurotus eryngii)、土生梭孢霉、Trametesvillosa、Trametes versicolor、哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉或绿色木霉细胞。

可以将真菌细胞通过涉及原生质体形成、原生质体转化和细胞壁重建的方法以本身公知的方式转化。用于转化曲霉属和木霉属宿主细胞的合适方法在EP 238023和Yelton等，1984，Proceedings of the National Academy ofSciences USA 81：1470-1474中描述。用于转化镰孢属菌种的合适方法由Malardier等，1989，Gene 78：147-156和WO 96/00787描述。可以使用由如下文献描述的方法转化酵母：Becker和Guarente，于Abelson，J.N.和Simon，M.I.(编者)，Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology，Methods inEnzymology，Volume 194，182-187页，Academic Press，Inc.，New York；Ito等，1983，Journal of Bacteriology 153：163；和Hinnen等，1978，Proceedings of theNational A cademy of Sciences USA 75：1920。

产生方法

本发明还涉及产生本发明多肽的方法，其包括：(a)在有益于产生多肽的条件下培养细胞，所述细胞以其野生型形式产生所述多肽；和(b)回收所述多肽。在一个优选的方面，所述细胞是毁丝霉属的。在一个更优选的方面，所述细胞是嗜热毁丝霉。在最优选的方面，所述细胞是嗜热毁丝霉CBS 202.75。

本发明还涉及产生本发明的多肽的方法，其包括：(a)在有益于产生多肽的条件下培养如本文所述的重组宿主细胞；和(b)回收所述多肽。

本发明还涉及产生本发明的多肽的方法，包括：(a)在有益于产生多肽的条件下培养重组宿主细胞，其中所述宿主细胞包含突变核苷酸序列，其在SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列中具有至少一个突变，其中所述突变核苷酸序列编码多肽，所述多肽包含SEQ ID NO：2的成熟多肽或由SEQ ID NO：2的成熟多肽组成，和(b)回收所述多肽。

在本发明的产生方法中，使用本领域熟知的方法在适合于产生所述多肽的营养培养基中培养细胞。例如，可以通过在合适培养基中和允许表达和/或分离所述多肽的条件下进行的摇瓶培养，和实验室或工业发酵罐中的小规模或大规模发酵(包括连续、分批、补料分批或固态发酵)来培养细胞。使用本领域已知的方法在合适的营养培养基中进行培养，所述营养培养基包含碳源和氮源和无机盐。合适的培养基能够从商业供应商获得或可以根据公开的组成制备(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)。如果多肽分泌到营养培养基中，该多肽能够从所述培养基中直接回收。如果多肽不分泌到培养基中，其能够从细胞裂解物(lysate)回收。

可以使用本领域已知的对于所述多肽是特异性的方法来检测多肽。这些检测方法可包括特异性抗体的使用、酶产物的形成或酶底物的消失。例如，酶试验(enzyme assay)可用于测定如本文所述的多肽的活性。

所得多肽可以使用本领域已知的方法回收。例如，多肽可以通过常规方法从营养培养基中回收，所述常规方法包括但不限于离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀。

本发明的多肽可以通过多种本领域已知的方法纯化以获得基本上纯的多肽，所述方法包括但不限于层析(例如，离子交换、亲和、疏水、层析聚焦和大小排阻)、电泳方法(例如，制备型(preparative)等电聚焦)、差示溶解度(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE或提取(参见，例如，Protein Purification，J.-C.Janson和Lars Ryden编，VCH Publishers，New York，1989)。

植物

本发明还涉及植物，例如，转基因植物、植物部分或植物细胞，其包含分离的多核苷酸，所述多核苷酸编码本发明具有纤维二糖水解酶活性的多肽，从而以可回收的量表达和产生所述多肽。可从植物或植物部分回收多肽。或者，可使用含有该重组多肽的植物或植物部分本身(as such)来改进食品或饲料的质量，例如，改进营养价值、适口性(palatability)和流变性质(rheologicalproperties)，或用于破坏抗营养因子。

转基因植物可以是双子叶的(双子叶植物)或单子叶的(单子叶植物)。单子叶植物的实例是草(grasses)，如草地早熟禾(meadow grass)(蓝草(bluegrass)，早熟禾属(Poa))；饲用牧草(forage grass)如羊茅属(Festuca)、黑麦草属(Lolium)；寒地型牧草(temperate grass)，如Agrostis(翦股颖属)；和谷类，例如，小麦、燕麦、黑麦、大麦、稻(rice)、高粱和玉蜀黍(maize)(玉米)。

双子叶植物的实例是烟草(tobacco)，豆类(legumes)，如羽扇豆(lupins)，马铃薯，糖甜菜(sugar beet)，豌豆，豆(bean)和大豆(soybean)和十字花科的(cruciferous)植物(十字花科(family Brassicaceae))，如花椰菜(cauliflower)，油菜籽(rape seed)和紧密相关的模型生物体拟南芥(Arabidopsis thaliana)。

植物部分的实例是茎(stem)、愈伤组织(callus)、叶(leaf)、根(root)、果实(fruit)、种子(seed)和块茎(tuber)，以及包含这些部分的独立组织，例如，表皮(epidermis)、叶肉(mesophyll)、薄壁组织(parenchyme)、维管组织(vasculartissue)、分生组织(meristem)。具体的植物细胞区室(compartments)，如叶绿体(chloroplast)、质外体(apoplast)、线粒体(mitochondria)、液泡(vacuole)、过氧化物酶体(peroxisome)和细胞质(cytoplasm)也被认为是植物部分。此外，任何植物细胞，无论什么组织来源，都被认为是植物部分。同样地，植物部分，如为了促进本发明的应用而分离的特定组织和细胞也被认为是植物部分，例如胚(embryo)、胚乳(endosperm)、糊粉(aleurone)和种皮(seed coat)。

同样包含于本发明范围内的还有这些植物、植物部分和植物细胞的后代。

表达本发明多肽的转基因植物或植物细胞可以依照本领域已知方法构建。简而言之，通过如下方法构建所述植物或植物细胞：将编码本发明多肽的一个或多个(几个)表达构建体并入植物宿主基因组或叶绿体基因组，并且将所得的修饰植物或植物细胞繁殖为转基因植物或植物细胞。

表达构建体便利地是包含编码本发明多肽的多核苷酸的核酸构建体，所述多核苷酸与在选择的植物或植物部分中表达该多核苷酸序列所需的适当的调节序列可操作地连接。此外，表达构建体可以包含对于鉴定其中整合了表达构建体的宿主细胞有用的选择性标记，和将该构建体引入到所述植物中所必需的DNA序列(后者依赖于使用的DNA引入方法)。

调节序列的选择，如启动子和终止子序列和任选地信号或转运序列的选择，举例来说，基于期望何时、何处以及如何表达多肽而确定。例如，编码本发明多肽的基因的表达可以是组成型的或诱导型的，或可以是发育、阶段或组织特异性的，并且基因产物可以靶向特定的组织或植物部分如种子或叶。调节序列由例如Tague等，1988，Plant Physiology 86：506描述。

对于组成性表达，可以使用35S-CaMV、玉米泛素1和稻肌动蛋白1启动子(Franck等，1980，Cell 21：285-294，Christensen等，1992，Plant Mo.Biol.18：675-689；Zhang等，1991，Plant Cell 3：1155-1165)。器官特异性启动子可以是例如来自贮藏库组织(storage sink tissue)例如种子、马铃薯块茎和果实的启动子(Edwards & Coruzzi，1990，Ann.Rev.Genet.24：275-303)，或来自代谢库组织(metabolic sink tissue)例如分生组织的启动子(Ito等，1994，Plant Mol.Biol.24：863-878)，种子特异性启动子诸如来自稻的谷蛋白(glutelin)、醇溶蛋白(prolamin)、球蛋白(globulin)或白蛋白(albumin)启动子(Wu等，1998，Plant andCell Physiology 39：885-889)，来自豆球蛋白(legumin)B4和蚕豆(Vicia faba)的未知种子蛋白基因的蚕豆启动子(Conrad等，1998，Journal of Plant Physiology152：708-711)、来自种子油体蛋白(oil body protein)的启动子(Chen等，1998，Plant and CellPhysiology 39：935-941)，来自欧洲油菜(Brassica napus)的贮藏蛋白napA启动子，或本技术领域公知的任何其它种子特异性的启动子，例如，在WO 91/14772中所描述的。此外，启动子可为叶特异性的启动子，如来自稻或番茄的rbcs启动子(Kyozuka等，1993，Plant Physiology 102：991-1000)，小球藻病毒(chlorella virus)腺嘌呤甲基转移酶(adenine methyltransferase)基因启动子(Mitra和Higgins，1994，Plant Molecular Biology 26：85-93)，或来自稻的aldP基因启动子(Kagaya等，1995，Molecular and General Genetics 248：668-674)，或伤口诱导的启动子，如马铃薯pin2启动子(Xu等，1993，PlantMolecular Biology 22：573-588)。同样地，所述启动子可通过非生物的处理诱导，所述非生物的处理如温度、干旱或盐度变化，或通过外源施加的激活所述启动子的物质诱导，例如乙醇、雌激素(oestrogens)、植物激素(plant hormones)如乙烯、脱落酸(abscisic acid)和赤霉酸(gibberellic acid)，和重金属。

启动子增强子元件也可以用于实现本发明多肽在植物中的较高表达。例如，启动子增强子元件可以是内含子，其置于启动子和编码本发明多肽的核苷酸序列之间。例如Xu等，1993，见上，公开了使用稻肌动蛋白1基因的第一内含子以增强表达。

选择性标记基因和表达构建体的任何其它部分可以选自本领域内可用的那些。

将核酸构建体根据本领域已知的常规技术并入植物基因组，所述常规技术包括土壤杆菌属(Agrobacterium)介导的转化、病毒介导的转化、显微注射(microinjection)、粒子轰击、生物射弹转化和电穿孔(Gasser等，1990，Science244：1293；Potrykus，1990，Bio/Technology 8：535；Shimamoto等，1989，Nature338：274)。

目前，根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的基因转移(genetransfer)，是产生转基因双子叶植物的优选方法(为了参考，见Hooykas和Schilperoort，1992，Plant Molecular Biology 19：15-38)，而且它也可以用于转化单子叶植物，虽然对于这些植物其它的转化方法是常用的。目前，产生转基因单子叶植物的优选的方法，是用粒子(用转化DNA涂覆的微观的金或钨粒子)轰击胚愈伤组织(embryonic calli)或发育中的胚(developing embryos)(Christou，1992，Plant Journal 2：275-281；Shimamoto，1994，Current OpinionBiotechnology 5：158-162；Vasil等，1992，Bio/Technology 10：667-674)。转化单子叶植物的可供选择的方法是基于原生质体转化，如由Omirulleh等，1993，Plant Molecular Biology 21：415-428所描述的。

转化之后，根据本领域熟知的方法选择并入了表达构建体的转化体并且再生成为完整植物。通常设计转化方法用于通过如下方法在再生期间或在后续世代中选择性消除选择基因：例如，使用带有两种独立的T-DNA构建体的共转化或通过特异性重组酶位点特异性地切除选择基因。

本发明还涉及产生本发明多肽的方法，其包括：(a)在有益于产生多肽的条件下培养包含多核苷酸的转基因植物或植物细胞，所述多核苷酸编码本发明具有纤维二糖水解酶活性的多肽；和(b)回收所述多肽。

去除或减少纤维二糖水解酶活性

本发明还涉及产生亲本细胞突变体的方法，其包括破坏或缺失编码本发明的多肽的多核苷酸序列或其部分，所述方法导致在相同条件下培养时，与亲本细胞相比突变的细胞产生较少的所述多肽。

可以使用本领域熟知的方法(例如，插入、破坏、替代或缺失)通过减少或消除编码本发明多肽的核苷酸序列的表达来构建突变细胞。在一个优选的方面，所述核苷酸序列是被失活的。待修饰或失活的核苷酸序列可以是，例如，编码区或其对活性关键的部分，或表达编码区所需的调节元件。这种调节或调控序列的实例可以是启动子序列或其功能部分，即，足以影响核苷酸序列表达的部分。用于可能的修饰的其它调控序列包括但不限于前导序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、信号肽序列、转录终止子和转录激活子。

可以通过向亲本细胞施以诱变，并且选择其中已将所述核苷酸序列的表达减少或消除的突变细胞来进行核苷酸序列的修饰或失活。诱变可能是特异性的或随机的，可以通过例如使用合适的物理或化学诱变剂进行，通过使用合适的寡核苷酸进行，或通过将所述DNA序列进行PCR产生的诱变。此外，可以通过使用这些诱变剂的任何组合来进行诱变。

适合于本发明目的的物理或化学诱变剂的实例包括紫外线(UV)照射、羟胺、N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)、O-甲基羟胺、亚硝酸、乙基甲烷磺酸酯(ethyl methane sulphonate)(EMS)、亚硫酸氢钠、甲酸和核苷酸类似物。

当使用这些试剂时，通常通过如下来进行所述诱变：在合适条件下存在优选的诱变剂时培育待诱变的亲本细胞，并筛选和/或选择显示基因表达减少的或无基因表达的突变体细胞。

通过导入、取代或去除基因中的一个或多个(几个)核苷酸或其转录或翻译所需的调节元件可以实现所述核苷酸序列的修饰或失活。例如，可以插入或去除核苷酸从而导致引入终止密码子，去除起始密码子，或改变开放阅读框。按照本领域已知的方法通过定位诱变或PCR产生的诱变可以实现这种修饰或失活。尽管在理论上所述修饰可以在体内进行，即，直接在表达待修饰核苷酸序列的细胞上进行，但优选如下面所示例的那样在体外进行所述修饰。

消除或减少核苷酸序列通过细胞的表达的便利方式的例子是基于基因替代、基因缺失或基因破坏的技术。例如，在基因破坏方法中，将相应于内源核苷酸序列的核酸序列在体外进行诱变以产生缺陷性的核酸序列，随后将其转化入亲本细胞中以产生缺陷基因。通过同源重组，所述缺陷性核酸序列替代了内源性核苷酸序列。可能理想的是所述缺陷性核苷酸序列还编码标记，其可用于选择其中核苷酸序列被修饰或破坏的转化子。在特别优选的方面，用可选择的标记(如本文所述的那些)来破坏所述核苷酸序列。

或者，可以使用与所述核苷酸序列互补的序列通过确定的反义或RNAi技术来进行所述核苷酸序列的修饰或失活。更具体地，通过导入与所述基因的核苷酸序列互补的序列可以减少或消除所述核苷酸序列通过细胞的表达，所述序列可以在细胞中转录并且能够与细胞中产生的mRNA杂交。在允许所述互补反义核苷酸序列与mRNA杂交的条件下，由此减少或消除翻译的蛋白质的量。

本发明进一步涉及亲本细胞的突变体细胞，其包含编码多肽的核苷酸序列或其调控序列的破坏或缺失，这导致与亲本细胞相比突变体细胞产生更少的多肽或不产生多肽。

这样生成的多肽缺陷型突变细胞作为表达天然和/或异源多肽的宿主细胞特别有用。所以，本发明进一步涉及产生天然或异源多肽的方法，其包括：(a)在有益于产生多肽的条件下培养突变细胞；和(b)回收所述多肽。术语“异源多肽”在本文中定义为对宿主细胞不是天然的多肽，进行了修饰以改变天然序列的天然蛋白，或作为通过重组DNA技术对宿主细胞操作的结果其表达在量上改变的天然蛋白。

在另一方面，本发明涉及通过发酵产生本发明的多肽以及目标蛋白产物的细胞来生产基本上无纤维二糖水解酶活性的蛋白质产物的方法：在发酵之前、之中或发酵完成之后向发酵液(fermentation broth)中添加有效量的能够抑制纤维二糖水解酶活性的试剂，从发酵液中回收目标产物，并且任选地将回收的产物进行进一步纯化。

在另一方面，本发明涉及如下生产基本上无纤维二糖水解酶活性的蛋白质产物的方法：在允许产物表达的条件下培养细胞，将得到的培养液进行组合的pH和温度处理以实质上(substantially)减少纤维二糖水解酶活性，和从发酵液中回收产物。或者，可以将从培养液回收的酶制备物进行组合的pH和温度处理。所述组合的pH和温度处理可任选地与纤维二糖水解酶抑制剂处理组合使用。

依照本发明的这个方面，可能去除至少60％，优选至少75％，更优选至少85％，还更优选至少95％，并且最优选至少99％的纤维二糖水解酶活性。可使用此方法获得纤维二糖水解酶活性的完全去除。

组合的pH和温度处理优选在2-4或9-11范围内的pH和至少60-70℃范围内的温度进行一段足够的时间以达到期望的效果，通常30至60分钟是足够的。

用于培养和纯化感兴趣的产物的方法可以通过本领域已知的方法进行。

本发明用于产生基本上无纤维二糖水解酶产物的方法在真核多肽，特别是真菌蛋白质如酶的产生中是特别令人有兴趣的。所述酶可以选自，例如，淀粉分解酶(amylolytic enzyme)、脂肪分解酶、蛋白水解酶、纤维素分解酶(cellulolytic enzyme)、氧化还原酶或植物细胞壁降解酶。这些酶的实例包括氨肽酶、淀粉酶、淀粉葡糖苷酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、几丁质酶(chitinase)、角质酶(cutinase)、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、内切葡聚糖酶、酯酶、半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、葡糖氧化酶、葡糖苷酶、卤素过氧化酶、半纤维素酶、转化酶、异构酶、漆酶、连接酶、脂肪酶、裂合酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、肌醇六磷酸酶、酚氧化酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转移酶、转谷氨酰胺酶或木聚糖酶。纤维二糖水解酶缺陷细胞也可以用于表达在制药上引起兴趣的异源蛋白质例如激素、生长因子、受体等。

可理解的是术语“真核多肽”不仅包括天然多肽，也包括多肽例如酶，其通过氨基酸取代、缺失或添加或其它这样的修饰而被修饰以增强活性、热稳定性、pH耐受性等。

在另外的方面，本发明涉及基本上无纤维二糖水解酶活性的蛋白质产物，其通过本发明的方法产生。

抑制具有纤维二糖水解酶活性的多肽表达的方法

本发明还涉及抑制具有纤维二糖水解酶活性的多肽在细胞中表达的方法，其包括对细胞施用双链RNA(dsRNA)分子或者在细胞中表达双链RNA(dsRNA)分子，其中所述dsRNA包含本发明多核苷酸的亚序列。在一个优选的方面，dsRNA长约15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多的双链体核苷酸。

dsRNA优选是小干扰RNA(siRNA)或微RNA(miRNA)。在一个优选的方面，dsRNA是用于抑制转录的小干扰RNA(siRNA)。在另一优选的方面，dsRNA是用于抑制翻译的微RNA(miRNA)。

本发明还涉及用于抑制细胞中多肽表达的这些包含SEQ ID NO：1成熟多肽编码序列的部分的双链RNA(dsRNA)分子。本发明不受到任何特定作用机制的限制，dsRNA能进入细胞，并引起相似或相同序列的单链RNA(ssRNA)的降解，所述RNA包括内源mRNA。当细胞接触dsRNA时，来自同源基因的mRNA选择性地受到称为RNA干扰(RNAi)的过程的降解。

本发明的dsRNA可以用于基因沉默疗法。在一个方面，本发明提供使用本发明的dsRNAi选择性地降解RNA的方法。所述过程可以在体外、在活体外(ex vivo)或在体内进行。在一个方面，dsRNA分子能够用于产生细胞、器官或动物中的功能丧失突变(loss-of-function mutation)。制备或使用选择性降解RNA的dsRNA分子的方法在本领域中公知，参见，例如，美国专利No.6,506,559；美国专利No.6,511,824；美国专利No.6,515,109；和美国专利No.6,489,127。

组合物

本发明还涉及包含本发明的多肽的组合物。优选地，所述组合物富含这种多肽。术语“富含”表示所述组合物的纤维二糖水解酶活性，例如，以至少1.1的富集因数(enrichment factor)增加。

所述组合物可以包含本发明的多肽作为主要酶组分，例如，单组分组合物。或者，所述组合物可以包含多种酶活性，例如氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、几丁质酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、卤素过氧化物酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果胶分解酶、肽谷氨酰胺酶(peptidoglutaminase)、过氧化物酶、肌醇六磷酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶或木聚糖酶。额外的酶可以通过例如属于以下属或种的微生物产生：曲霉属，优选棘孢曲霉、泡盛曲霉、烟曲霉、臭曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉或米曲霉；镰孢属，优选杆孢状镰孢、禾谷镰孢、库威镰孢、大刀镰孢、禾本科镰孢、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖镰孢、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、硫色镰孢、圆镰孢、拟丝孢镰孢或镶片镰孢；腐质霉属，优选特异腐质霉或疏棉状腐质霉；或木霉属，优选哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉或绿色木霉。

可以依照本领域内已知的方法制备多肽组合物，并且可以是液体或干组合物的形式。例如，所述多肽组合物可以是颗粒(granulate)或微粒(microgranulate)的形式。可以依照本领域内已知方法将包括于所述组合物中的多肽稳定化。

下面给出的是本发明多肽组合物的优选的用途的实例。本发明的多肽组合物的剂量和使用该组合物的其它条件可以基于本领域内已知的方法确定。

用途

本发明还涉及使用具有纤维二糖水解酶活性的多肽或其组合物的方法，如下文所述。

纤维素材料的降解或转化

本发明还涉及用于降解或转化纤维素材料的方法，其包括：在有效量的本发明具有纤维二糖水解酶活性的多肽存在下，用包含一种或多种纤维素分解蛋白的组合物处理纤维素材料。在一个优选的方面，所述方法进一步包括回收降解的或转化的纤维素材料。

本发明的多肽和宿主细胞可用于单糖、二糖和多糖的生产中，所述糖类作为来自纤维素生物质的化学或发酵原料用于产生乙醇、塑料、其它产品或中间物。包含具有纤维二糖水解酶活性的多肽的组合物可以是去除或不去除细胞的粗发酵液形式，或是半纯化或纯化的酶制备物形式。组合物还可以包含在生物质的加工中有用的其它蛋白质和酶，例如，内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、β-葡糖苷酶、半纤维素分解酶(hemicellulolytic enzyme)、增效剂(enhancer)(WO 2005/074647，WO 2005/074656)等。或者，组合物可以包含本发明的宿主细胞，所述宿主细胞在使用生物质的发酵方法中作为具有纤维二糖水解酶活性的多肽的来源。具体地，本发明的多肽和宿主细胞可以通过部分或全部降解纤维素或半纤维素而增加加工残余物(干燥的蒸馏残渣、酿酒酒糟、甘蔗渣等)的价值。宿主细胞也可以含有编码在生物质加工中有用的上述其它蛋白质和酶的天然或异源的基因。

生物质初生细胞壁(primary cell wall)中的主要多糖是纤维素，其次最丰富的是半纤维素，而第三是果胶。次生细胞壁(secondary cell wall)在细胞停止生长后产生，其同样含有多糖并通过聚合木质素共价交联至半纤维素而加强。纤维素是脱水纤维二糖的均聚物，并且因此是线性β-(1-4)-D-葡聚糖，而半纤维素包括多种具有系列取代基的复杂分支结构的化合物，如木聚糖、木葡聚糖(xyloglucan)、阿拉伯木聚糖和甘露聚糖。尽管通常是多形的，但是纤维素主要作为平行葡聚糖链的不溶晶体基质存在于植物组织中。半纤维素通常与纤维素以及其它半纤维素以氢键相连，其帮助稳定细胞壁基质。

在本发明的方法中，纤维素材料可以是任何含纤维素的材料。纤维素通常存在于例如植物的茎、叶、外皮(hull)、外壳(husk)和穗轴(cob)，或树木的叶、枝和木材。纤维素材料可以是，但不限于，草本材料、农业残余物、林业残余物、市政固体废物、废纸、纸浆和造纸厂残余物。纤维素材料可以是任何类型的生物质，包括但不限于木材资源、市政固体废物、废纸、作物和作物残余物(参见，例如，Wiselogel等，1995，于Handbook on Bioethanol(Charles E.Wyman编)，105-118页，Taylor & Francis，Washington D.C.；Wyman，1994，Bioresource Technology 50：3-16；Lynd，1990，Applied Biochemistry andBiotechnology 24/25：695-719；Mosier等，1999，Recent Progress inBioconversion of Lignocellulosics，于Advances in BiochemicalEngineering/Biotechnology，T.Scheper，主编，Volume 65，23-40页，Springer-Verlag，NewYork)。本文中可理解的是纤维素可以是木素纤维素的形式，其为在混合基质中含有木质素、纤维素和半纤维素的植物细胞壁材料。

在一个优选的方面，纤维素材料是玉米秸秆。在另一优选的方面，纤维素材料是玉米纤维。在另一优选的方面，纤维素材料是玉米穗轴。在另一优选的方面，纤维素材料是稻草。在另一优选的方面，纤维素材料是造纸和纸浆加工废物(paper and pulp processing waste)。在另一优选的方面，纤维素材料是木本或草本植物。在另一优选的方面，纤维素材料是甘蔗渣。在另一优选的方面，纤维素材料是桔橙皮(orange peel)。

将三种主要类别的酶用于分解纤维素生物质：

(1)“内切-1，4-β-葡聚糖酶”或1，4-β-D-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶(EC3.2.1.4)，其随机作用于可溶和不溶的1，4-β-葡聚糖底物。

(2)“外切-1，4-β-葡聚糖酶”，包括1，4-β-D-葡聚糖葡糖水解酶(EC3.2.1.74)，其从1，4-β-D-葡聚糖释放D-葡萄糖并且缓慢水解D-纤维二糖；和纤维二糖水解酶(1，4-β-D-葡聚糖纤维二糖水解酶，EC 3.2.1.91)，其从1，4-β-葡聚糖释放D-纤维二糖。

(3)“β-D-葡糖苷酶”或β-D-葡糖苷葡糖水解酶(EC 3.2.1.21)，其作用于从纤维二糖和可溶的纤维糊精以及一系列糖苷释放D-葡萄糖单位。

本发明具有纤维二糖水解酶活性的多肽优选与其它纤维素分解蛋白(例如，内切-1，4-β-葡聚糖酶和外切-1，4-β-D-葡聚糖酶)一同使用以降解生物质底物的纤维素组分(参见，例如，Brigham等，1995，于Handbook on Bioethanol(Charles E.Wyman编)中，119-141页，Taylor & Francis，Washington D.C.；Lee，1997，Journal of Biotechnology 56：1-24)。

内切-1，4-β-葡聚糖酶和外切-1，4-β-D-葡聚糖酶可以通过本领域已知的任何已知方法产生(参见，例如，Bennett，J.W.和LaSure，L.(编)，More GeneManipulations in Fungi，Academic Press，CA，1991)。

具有纤维二糖水解酶活性的多肽和其它纤维素分解蛋白的最适量取决于几个因素，其包括但不限于，组分纤维素分解蛋白的混合物、纤维素底物、纤维素底物的浓度、纤维素底物的预处理、温度、时间、pH和包括发酵生物体(例如，用于同步糖化和发酵的酵母)。术语“纤维素分解蛋白”在本文中定义为显示出能够在测试条件下水解或转化或降解纤维素的那些蛋白质或蛋白质的混合物。

在一个优选的方面，每克纤维素材料的具有纤维二糖水解酶活性的多肽的量是约0.5至约50mg，优选约0.5至约40mg，更优选约0.5至约25mg，更优选约0.75至约20mg，更优选约0.75至约15mg，甚至更优选约0.5至约10mg，并且最优选约2.5至约10mg每克纤维素材料。

在另一优选的方面，每克纤维素材料的纤维素分解蛋白的量是约0.5至约50mg，优选约0.5至约40mg，更优选约0.5至约25mg，更优选约0.75至约20mg，更优选约0.75至约15mg，甚至更优选约0.5至约10mg，并且最优选约2.5至约10mg每克纤维素材料。

在本发明的方法中，组合物可补充一种或几种其它的酶活性，以改善纤维素材料的降解。优选的其它酶是半纤维素酶、酯酶(例如，脂肪酶、磷脂酶和/或角质酶)、蛋白酶、漆酶、过氧化物酶或它们的混合物。

在本发明的方法中，可以在发酵前或发酵过程中(包括在发酵微生物的繁殖的过程中或之后)加入其它酶。

酶可以源自或获得自任何合适的来源，包括细菌、真菌、酵母或哺乳动物来源。术语“获得”在本文中表示酶可以从自然地产生所述酶作为天然酶的生物体分离。术语“获得”在本文中还表示酶可以在宿主生物体中重组产生，其中重组产生的酶对宿主生物体是天然或外源的，或具有修饰的氨基酸序列，例如，缺失、插入和/或取代一个或多个氨基酸，即，其为天然氨基酸序列的突变体和/或片段的重组产生的酶，或由本领域已知的核酸改组方法产生的酶。天然酶的意义中包含天然变体，而外源酶的意义中包含通过重组，如通过位点定向诱变或改组获得的变体。

还可以将酶纯化。本文中使用的术语“纯化”包括不含来自其所源自的生物体中其它组分的酶。术语“纯化”还包括不含来自其所获得自的天然生物体的组分的酶。可将酶纯化，仅存在少量的其它蛋白质。表述“其它蛋白质”具体涉及其它酶。本文使用的术语“纯化”还指去除其它组分，特别是其它蛋白质，并且最特别是存在于本发明的酶的起源细胞中的其它酶。所述酶可以是基本上纯的。

本发明使用的酶可以是适用于本文所述方法的任何形式，如，例如，含有或者不含细胞的粗发酵液、干粉或颗粒、无粉尘颗粒、液体、稳定化的液体或受保护的酶。颗粒可以通过，例如美国专利号4,106,991和4,661,452中公开的方法产生，并且可以任选地通过本领域已知的方法包覆。可以，例如，根据已确立的方法通过加入稳定剂(如糖、糖醇或另一种多羟基化合物(polyol)，和/或乳酸或另一种有机酸)将液体酶制备物稳定化。受保护的酶可以根据EP 238,216中公开的方法制备。

可以使用本发明的方法将纤维素材料处理成为很多有用的有机产品、化学品和燃料。除乙醇外，一些可以由纤维素产生的用品和专门化学品包括木糖、丙酮、乙酸、甘氨酸、赖氨酸、有机酸(例如，乳酸)、1，3-丙二醇、丁二醇、甘油、乙二醇、糠醛、多羟基链烷酸(polyhydroxyalkanoates)、顺式、顺式-粘康酸和动物饲料(Lynd，L.R.，Wyman，C.E.和Gerngross，T.U.，1999，Biocommodity Engineering，Biotechnol.Prog.，15：777-793；Philippidis，G.P.，1996，Cellulose bioconversion technology，于Handbook on Bioethanol：Production and Utilization，Wyman，C.E.编，Taylor & Francis，Washington，DC，179-212；及Ryu，D.D.Y.和Mandels，M.，1980，Cellulases：biosynthesis andapplications，Enz.Microb.Technol.，2：91-102)。可能的共生产效益扩大而超越了多种有机产物从可发酵糖的合成。生物处理后残留的富含木质素的残余物可以转化成木质素衍生的化学品，或者用于产生能量(power production)。

根据本发明的方法用于处理纤维素材料的常规方法为本领域那些技术人员充分理解。可以使用任何常规生物质处理设备来实施本发明的方法，所述设备经配置以根据本发明操作。

这种设备可以包括分批式搅拌反应器、具有超滤的连续流搅拌反应器、连续活塞流柱式反应器(Gusakov，A.V.，和Sinitsyn，A.P.，1985，Kinetics of theenzymatic hydrolysis of cellulose：1.A mathematical model for a batch reactorprocess，Enz.Microb.Technol.7：346-352)、研磨反应器(Ryu，S.K.，和Lee，J.M.，1983，Bioconversion of waste cellulose by using an attrition bioreactor，Biotechnol.Bioeng.25：53-65)，或者具有由电磁场引起的强烈搅拌的反应器(Gusakov，A.V.，Sinitsyn，A.P.，Davydkin，I.Y.，Davydkin，V.Y.，Protas，O.V.，1996，Enhancement of enzymatic cellulose hydrolysis using a novel type ofbioreactor with intensive stirring induced by electromagnetic field，Appl.Biochem.Biotechnol.56：141-153)。

常规方法包括但不限于，糖化、发酵、分离的水解和发酵(SHF)、同步糖化和发酵(SSF)、同步糖化和共发酵(SSCF)、混合的水解和发酵(HHF)，和直接微生物转化(DMC)。

SHF使用分离的处理步骤，首先将纤维素用酶水解为葡萄糖，然后将葡萄糖发酵成为乙醇。在SSF中，纤维素的酶水解和葡萄糖到乙醇的发酵组合在一个步骤中(Philippidis，G.P.，1996，Cellulose bioconversion technology，inHandbook on Bioethanol：Production and Utilization，Wyman，C.E.编，Taylor &Francis，Washington，DC，179-212)。SSCF包括多种糖的共发酵(Sheehan，J.，和Himmel，M.，1999，Enzymes，energy and the environment：A strategicperspective on the U.S.Department of Energy’s research and developmentactivities for bioethanol，Biotechnol.Prog.15：817-827)。HHF包括在同一个反应器但不同的温度进行的两个分开的步骤，即，高温酶糖化，然后在发酵菌株能够耐受的较低温度进行SSF。DMC在一个步骤中组合了所有三个过程(纤维素酶产生、纤维素水解和发酵)(Lynd，L.R.，Weimer，P.J.，van Zyl，W.H.，和Pretorius，I.S.，2002，Microbial cellulose utilization：Fundamentals andbiotechnology，Microbiol.Mol.Biol.Reviews 66：506-577)。

“发酵”或“发酵方法”指任何发酵方法或包含发酵步骤的任何方法。发酵方法包括而不限于，用于产生发酵产品的发酵方法，所述发酵产品包括醇(例如，阿拉伯糖醇(arabinitol)、丁醇、乙醇、甘油、甲醇、1，3-丙二醇、山梨醇和木糖醇)；有机酸(例如，乙酸、醋酮酸、己二酸、抗坏血酸、柠檬酸、2，5-二酮-D-葡萄糖酸、蚁酸、反丁烯二酸、葡萄糖二酸、葡糖酸、葡糖醛酸、戊二酸、3-羟基丙酸、衣康酸、乳酸、苹果酸、丙二酸、草酸、丙酸、琥珀酸和木糖酸)；酮(例如，丙酮)；氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、赖氨酸、丝氨酸和苏氨酸)；气体(例如，甲烷、氢气(H₂)、二氧化碳(CO₂)和一氧化碳(CO))。发酵方法还包括在消费品醇工业(例如，啤酒和酒)、乳制品业(例如，发酵乳制品)、皮革业和烟草业中使用的发酵方法。

本发明进一步涉及产生物质的方法，其包括：(a)在有效量的本发明具有纤维二糖水解酶活性的多肽存在下，用有效量的包含一种或多种纤维素分解蛋白的组合物糖化纤维素材料；(b)用一种或多种发酵微生物发酵步骤(a)的糖化的纤维素材料；和(c)从发酵回收物质。包含具有纤维二糖水解酶活性的多肽的组合物可以是去除或不去除细胞的粗发酵液的形式，或者是半纯化或纯化的酶制备物形式，或者组合物可以包含本发明的宿主细胞，作为具有生物质的发酵方法中具有纤维二糖水解酶活性的多肽的来源。

物质可以是任何源自发酵的物质。在优选的实施方案中，物质是醇。可理解的是，术语“醇”包括含一个或多个羟基部分(moiety)的物质。在更优选的实施方案中，所述醇是阿拉伯糖醇。在另一个更优选的实施方案中，所述醇是丁醇。在另一个更优选的实施方案中，所述醇是乙醇。在另一个更优选的实施方案中，所述醇是甘油。在另一个更优选的实施方案中，所述醇是甲醇。在另一个更优选的实施方案中，所述醇是1，3-丙二醇。在另一个更优选的实施方案中，所述醇是山梨醇。在另一个更优选的实施方案中，所述醇是木糖醇。参见，例如，Gong，C.S.，Cao，N.J.，Du，J.和Tsao，G.T.，1999，Ethanol production fromrenewable resources，于Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology，Scheper，T.编，Springer-Verlag Berlin Heidelberg，Germany，65：207-241；Silveira，M.M.和Jonas，R.，2002，The biotechnological production of sorbitol，Appl.Microbiol.Biotechnol.59：400-408；Nigam，P.和Singh，D.，1995，Processes forfermentative production of xylitol-a sugar substitute，Process Biochemistry 30(2)：117-124；Ezeii，T.C.，Qureshi，N.和Blaschek，H.P.，2003，Production of acetone，butanol and ethanol by Clostridium beijerinckii BA101 and in situ recovery by gasstripping，World Journal of Microbiology and Biotechnology 19(6)：595-603。

在另一个优选的实施方案中，所述物质是有机酸。在另一个更优选的实施方案中，所述有机酸是乙酸。在另一个更优选的实施方案中，所述有机酸是醋酮酸。在另一个更优选的实施方案中，所述有机酸是己二酸。在另一个更优选的实施方案中，所述有机酸是抗坏血酸。在另一个更优选的实施方案中，所述有机酸是柠檬酸。在另一个更优选的实施方案中，所述有机酸是2，5-二酮-D-葡糖酸。在另一个更优选的实施方案中，所述有机酸是蚁酸。在另一个更优选的实施方案中，所述有机酸是反丁烯二酸。在另一个更优选的实施方案中，所述有机酸是葡萄糖二酸。在另一个更优选的实施方案中，所述有机酸是葡糖酸。在另一个更优选的实施方案中，所述有机酸是葡糖醛酸。在另一个更优选的实施方案中，所述有机酸是戊二酸。在另一个优选的实施方案中，所述有机酸是3-羟基丙酸。在另一个更优选的实施方案中，所述有机酸是衣康酸。在另一个更优选的实施方案中，所述有机酸是乳酸。在另一个更优选的实施方案中，所述有机酸是苹果酸。在另一个更优选的实施方案中，所述有机酸是丙二酸。在另一个更优选的实施方案中，所述有机酸是草酸。在另一个更优选的实施方案中，所述有机酸是丙酸。在另一个更优选的实施方案中，所述有机酸是琥珀酸。在另一个更优选的实施方案中，所述有机酸是木糖酸。参见，例如，Chen，R.，和Lee，Y.Y.，1997，Membrane-mediatedextractive fermentation for lactic acid production from cellulosic biomass，Appl.Biochem.Biotechnol.63-65：435-448。

在另一个优选的实施方案中，所述物质是酮。可理解的是术语“酮”包括含有一个或多个酮基的物质。在另一个更优选的方面，所述酮是丙酮。参见，例如，Qureshi和Blaschek，2003，见上文。

在另一个优选的实施方案中，所述物质是氨基酸。在另一个更优选的实施方案中，所述有机酸是天冬氨酸。在另一个更优选的实施方案中，所述氨基酸是谷氨酸。在另一个更优选的实施方案中，所述氨基酸是甘氨酸。在另一个更优选的实施方案中，所述氨基酸是赖氨酸。在另一个更优选的实施方案中，所述氨基酸是丝氨酸。在另一个更优选的实施方案中，所述氨基酸是苏氨酸。参见，例如，Richard，A.，和Margaritis，A.，2004，Empirical modeling ofbatch fermentation kinetics for poly(glutamic acid)production and othermicrobial biopolymers，Biotechnology and Bioengineering 87(4)：501-515。

在另一个优选的实施方案中，所述物质是气体。在另一个更优选的实施方案中，所述气体是甲烷。在另一个更优选的实施方案中，所述气体是H₂。在另一个更优选的实施方案中，所述气体是CO₂。在另一个更优选的实施方案中，所述气体是CO。参见，例如，Kataoka，N.，A.Miya，和K.Kiriyama，1997，Studies on hydrogen production by continuous culture system ofhydrogen-producing anaerobic bacteria，Water Science and Technology 36(6-7)：41-47；和Gunaseelan V.N.in Biomass andnBioenergy，Vol.13(1-2)，pp.83-114，1997，Anaerobic digestion of biomass for methane production：A review。

从纤维素材料产生物质通常需要四个主要步骤。这四个步骤是预处理、酶水解、发酵和回收。下面示例的是产生乙醇的过程，但可理解的是，可以使用相似的过程产生其它物质，例如，上述物质。

预处理。在预处理或预水解步骤中，将纤维素材料加热以分解木质素和碳水化合物结构，溶解大部分半纤维素，并使纤维素分解酶能够到达纤维素部分。加热或者直接用蒸汽进行，或者在浆料中进行，此时也可向材料加入催化剂以加速反应的进行。催化剂包括强酸，如硫酸和SO₂，或碱，如氢氧化钠。预处理阶段的目的是促进酶和微生物的渗透。纤维素生物质还可以经过水热蒸汽爆炸预处理(参见美国专利申请号20020164730)。

糖化。在酶水解步骤(也称作糖化)中，将本文所述酶加入预处理的材料中以将纤维素部分转化成葡萄糖和/或其它糖。糖化通常在搅拌釜反应器或发酵罐中，在受控的pH、温度和混合条件下进行。糖化步骤可以持续长达200小时。糖化可以在约30℃至约65℃，特别是约50℃的温度，和约4-约5，尤其是约pH 4.5的pH进行。为了产生能由酵母代谢的葡萄糖，通常在存在β-葡糖苷酶时进行水解。

发酵。在发酵步骤中，作为预处理和酶水解步骤的结果从纤维素材料释放的糖，通过发酵生物体(如酵母)发酵成为乙醇。发酵还可与酶水解在同一个容器中，同样在受控的pH、温度和混合条件下同时进行。当糖化和发酵在同一个容器中同时进行时，该方法通常称作同步的糖化和发酵或SSF。

在本发明的发酵过程中可以使用任何合适的纤维素底物或原材料。通常根据理想的发酵产品(即，要从发酵获得的物质)和使用的方法来选择底物，如本领域中所公知。适用于本发明的方法中的底物的实例包括含纤维素材料，如木材或植物残余物或获得自能够由发酵微生物代谢的经处理的纤维素材料的低分子量糖DP1-3，所述物质可通过直接向发酵培养基中加入而提供。

术语“发酵培养基”可理解为指加入发酵微生物之前的培养基，如，由糖化方法产生的培养基，以及同步的糖化和发酵方法(SSF)中使用的培养基。

“发酵微生物”指适用于理想的发酵方法中的任何微生物。合适的发酵微生物能将糖(如葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖或寡糖)直接或间接地发酵(即，转化)成理想的发酵产物。发酵微生物的实例包括真菌生物体，如酵母。优选的酵母包括酵母属菌种的菌株，且具体为酿酒酵母。商业上可得到的酵母包括，例如RED

/Lesaffre Ethanol Red(可从RedStar/Lesaffre，USA获得)、FALI(可从Fleischmann’s Yeast，Burns Philp Food Inc.，USA的部门获得)、SUPERSTART(可从Alltech获得)、GERT

(可从Gert Strand AB，Sweden获得)和

(可从DSM Specialties获得)。

在优选的实施方案中，所述酵母是酵母属菌种。在更优选的实施方案中，所述酵母是酿酒酵母。在另一个更优选的实施方案中，所述酵母是糖化酵母(Saccharomyces distaticus)。在另一个更优选的实施方案中，所述酵母是葡萄汁酵母(Saccharomyces uvarum)。在另一个优选的实施方案中，所述酵母是克鲁维酵母属。在另一个更优选的实施方案中，所述酵母是马克思克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)。在另一个更优选的实施方案中，所述酵母是脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyces fragilis)。在另一个优选的实施方案中，所述酵母是念珠菌属。在另一个更优选的实施方案中，所述酵母是假热带念珠菌(Candida pseudotropicalis)。在另一个更优选的实施方案中，所述酵母是芸苔念珠菌(Candida brassicae)。在另一个优选的实施方案中，所述酵母是棍孢属(Clavispora)。在另一个更优选的实施方案中，所述酵母是葡萄牙棍孢(Clavispora lusitaniae)。在另一个更优选的实施方案中，所述酵母是仙人掌棍孢(Clavispora opuntiae)。在另一个优选的实施方案中，所述酵母是管囊酵母属(Pachysolen)。在另一个更优选的实施方案中，所述酵母是管囊酵母(Pachysolen tannophilus)。在另一个优选的实施方案中，所述酵母是酒香酵母属(Bretannomyces)。在另一个更优选的实施方案中，所述酵母是克劳森酒香酵母(Bretannomyces clausenii)(Philippidis，G.P.，1996，Cellulose bioconversiontechnology，于Handbook on Bioethanol：Production and Utilization，Wyman，C.E.编，Taylor & Francis，Washington，DC，179-212)。

可以有效地将葡萄糖发酵成乙醇的细菌包括，例如，运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)和热纤维梭菌(Clostridium thermocellum)(Philippidis，1996，见上文)。

在本领域中公知上述生物体还能用于产生其它物质，如本文所述。

在酿酒酵母(Chen，Z.，Ho，N.W.Y.，1993，Cloning and improving theexpress ion of Pichia stipitis xylose reductase gene in Saccharomyces cerevisiae，Appl.Biochem.Biotechnol.39-40：135-147；Ho，N.W.Y.，Chen，Z，Brainard，A.P.，1998，Genetically engineered Saccharomyces yeast capable of effectivelycofermenting glucose and xylose，Appl.Environ.Microbiol.64：1852-1859)或在细菌如大肠杆菌(Beall，D.S.，Ohta，K.，Ingram，L.O.，1991，Parametric studiesof ethanol production from xylose and other sugars by recombinant Escherichiacoli，Biotech.Bioeng.38：296-303)、产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)(Ingram，L.O.，Gomes，P.F.，Lai，X.，Moniruzzaman，M.，Wood，B.E.，Yomano，L.P.，York，S.W.，1998，Metabolic engineering of bacteria for ethanol production，Biotechnol.Bioeng.58：204-214)和运动发酵单胞菌(zhang，M.，Eddy，C.，Deanda，K.，Finkelstein，M.，和Picataggio，S.，1995，Metabolic engineering of apentose metabolism pathway in ethanologenic Zymomonas mobilis，Science 267：240-243；Deanda，K.，Zhang，M.，Eddy，C.，和Picataggio，S.，1996，Developmentof an arabinose-fermenting Zymomonas mobilis strain by metabolic pathwayengineering，Appl.Environ.Microbiol.62：4465-4470)中克隆异源基因导致构建能将己糖和戊糖转化成乙醇(共发酵)的生物体。

通常向降解的纤维素或水解产物中加入酵母或另一种微生物，进行约24至96小时的发酵，如约35至约60小时。温度通常在约26℃-约40℃，特别是约32℃，并在约pH 3至约pH 6，特别是约pH 4-5进行。

在优选的实施方案中，将酵母或另一种微生物施用于降解的纤维素或水解产物，且发酵进行约24至约96小时，如通常35-60小时。在优选的实施方案中，温度通常在约26至约40℃之间，特别是约32℃，而pH通常在约pH 3至约pH 6，优选约pH 4-5。优选以大约10⁵至10¹²，优选大约10⁷至10¹⁰，特别是大约5x10⁷活菌计数每ml发酵液的量施用酵母或另一种微生物。在乙醇产生阶段的过程中，酵母细胞计数应该优选在大约10⁷至10¹⁰的范围内，尤其是约2x10⁸。关于使用酵母进行发酵的其它指导可见于例如“TheAlcohol Textbook”(K.Jacques，T.P.Lyons和D.R.Kelsall编，NottinghamUniversity Press，United Kingdom 1999)中，所述文献通过提述并入本文。

本领域最广泛使用的方法是同步的糖化和发酵(SSF)方法，其中没有糖化的保留阶段，意味着酵母和酶是一起添加的。

对于乙醇产生，在发酵后蒸馏醪(mash)以提取乙醇。根据本发明的方法获得的乙醇可以用作，例如燃料乙醇；饮用乙醇，即，中性饮料酒(potableneutral spirits)，或工业乙醇。

发酵刺激剂可以与本文所述的任何酶方法组合使用，以进一步改进发酵方法，而且特定地，改进发酵微生物的性能，如，速率增加和乙醇得率。“发酵刺激剂”指用于发酵微生物(特别是酵母)生长的刺激剂。优选的用于生长的发酵刺激剂包括维生素和矿物质。维生素的实例包括多种维生素、生物素、泛酸(盐)、烟酸、内消旋肌醇(meso-inositol)、硫胺素、维生素B6(pyridoxine)、对氨基苯甲酸、叶酸、核黄素和维生素A、B、C、D和E。参见，例如，Alfenore等，Improving ethanol production and viability of Saccharomyces cerevisiae by avitamin feeding strategy during fed-batch process，Springer-Verlag(2002)，其通过提述并入本文。矿物质的实例包括能够提供营养物的矿物质和矿物质盐，所述营养物包括P、K、Mg、S、Ca、Fe、Zn、Mn和Cu。

回收。从发酵的纤维素材料中分离醇，并通过常规的蒸馏方法纯化。能够获得纯度高达约96体积％乙醇的乙醇，其可以用作，例如，燃料乙醇、饮用乙醇(即，中性饮料酒)或工业乙醇。

对于其它物质，可以使用本领域已知的任何方法，所述方法包括但不限于层析(例如，离子交换、亲和、疏水、层析聚焦和大小排阻)、电泳方法(例如，制备型等电聚焦)、差示溶解度(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE、蒸馏或提取。

在本发明的方法中，可以向具有纤维二糖水解酶活性的多肽和其它纤维素分解蛋白补充一种或多种其它酶活性，以改进纤维素材料的降解。优选的其它酶是半纤维素酶、酯酶(例如，脂肪酶、磷脂酶和/或角质酶)、蛋白酶、漆酶、过氧化物酶，或它们的混合物。

在本发明的方法中，可以在发酵前或发酵过程中(包括在发酵微生物繁殖的过程中或之后)加入其它酶。

洗涤剂组合物

本发明还涉及洗涤剂组合物，其包含表面活性剂和本发明的具有纤维二糖水解酶活性的多肽。可以加入所述具有纤维二糖水解酶活性的多肽并由此使其成为洗涤剂组合物的组分。

例如，本发明的洗涤剂组合物可以配制成手洗或机洗洗涤剂组合物，其包括适合于预处理沾污织物的洗衣添加剂组合物和漂洗添加的织物柔软剂组合物；或者可以配制成用于一般家庭硬表面清洁操作的洗涤剂组合物；或者配制用于手洗或机洗洗碗操作。

在具体的方面，本发明提供包含本发明具有纤维二糖水解酶活性的多肽的洗涤剂添加剂。洗涤剂添加剂以及洗涤剂组合物可以包含一种或多种其它的酶，如蛋白酶、脂肪酶、角质酶(cutinase)、淀粉酶、糖酶、纤维素酶、果胶酶、甘露聚糖酶(mannanase)、阿拉伯糖酶(arabinase)、半乳聚糖酶、木聚糖酶、氧化酶，例如漆酶，和/或过氧化物酶。

通常酶组分的性质应与选择的洗涤剂相容(即，最适pH、与其它酶和非酶成分的相容性等)，并且所述酶组分应该以有效量存在。

蛋白酶：合适的蛋白酶包括动物、植物或微生物来源的那些。微生物来源是优选的。包括化学修饰的或蛋白质工程的突变体。蛋白酶可以是丝氨酸蛋白酶或金属蛋白酶，优选是碱性微生物蛋白酶或胰蛋白酶-样蛋白酶。碱性蛋白酶的实例是枯草蛋白酶，特别是源自芽孢杆菌属的那些枯草蛋白酶，例如，枯草蛋白酶Novo、枯草蛋白酶Carlsberg、枯草蛋白酶309、枯草蛋白酶147和枯草蛋白酶168(在WO 89/06279中描述)。胰蛋白酶-样蛋白酶的实例是胰蛋白酶(例如，猪或牛来源的)和WO 89/06270和WO 94/25583中描述的镰孢属蛋白酶。

有用的蛋白酶的实例是WO 92/19729、WO 98/20115、WO 98/20116和WO 98/34946中描述的变体，特别是在以下位置中的一个或多个具有取代的变体：27、36、57、76、87、97、101、104、120、123、167、170、194、206、218、222、224、235和274。

优选的商业上能够获得的蛋白酶包括ALCALASE^TM、SAVINASE^TM、PRIMASE^TM、DURALASE^TM、ESPERASE^TM、和KANNASE^TM(Novozymes A/S)、MAXATASE^TM、MAXACAL^TM、MAXAPEM^TM、PROPERASE^TM、PURAFECT^TM、PURAFECT OXP^TM、FN2^TM和FN3^TM(Genencor International Inc.)。

脂肪酶：合适的脂肪酶包括细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰的或蛋白质工程的突变体。有用的脂肪酶的实例包括来自腐质霉属(同物异名嗜热霉属(Thermomyces))的脂肪酶，例如EP 258068和EP 305216中所述来自疏棉状腐质霉(细毛嗜热霉(T.lanuginosus))的脂肪酶或WO 96/13580中所述来自特异腐质霉的脂肪酶；假单胞菌属(Pseudomonas)脂肪酶，例如来自产碱假单胞菌(P.alcaligenes)或类产碱假单胞菌(P.pseudoalcaligenes)(EP 218272)、洋葱假单胞菌(P.cepacia)(EP 331376)、施氏假单胞菌(P.stutzeri)(GB 1,372,034)、荧光假单胞菌(P.fluorescens)、假单胞菌属菌种菌株SD 705(WO 95/06720和WO 96/27002)、威斯康辛假单胞菌(P.wisconsinensis)(WO 96/12012)；芽孢杆菌属脂肪酶，例如来自枯草芽孢杆菌(Dartois等，1993，Biochemica etBiophysica Acta，1131，253-360)、嗜热脂肪芽孢杆菌(JP 64/744992)或短小芽孢杆菌(WO 91/16422)。

其它例子是脂肪酶变体，如在WO 92/05249、WO 94/01541、EP 407225、EP 260105、WO 95/35381、WO 96/00292、WO 95/30744、WO 94/25578、WO95/14783、WO 95/22615、WO 97/04079和WO 97/07202中描述的那些变体。

优选的商业上能够获得的脂肪酶包括LIPOLASE^TM、LIPEX^TM和LIPOLASE ULTRA^TM(Novozymes A/S)。

淀粉酶：合适的淀粉酶(α和/或β)包括细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰的或蛋白质工程的突变体。淀粉酶包括，例如，获得自芽孢杆菌属，例如地衣芽孢杆菌的特殊菌株的α-淀粉酶，在GB 1,296,839中有更详细的描述。

有用的淀粉酶的实例是WO 94/02597、WO 94/18314、WO 96/23873和WO 97/43424中描述的变体，特别是在以下位置中的一个或几个具有取代的变体：15、23、105、106、124、128、133、154、156、181、188、190、197、202、208、209、243、264、304、305、391、408和444。

商业上能够获得的淀粉酶是DURAMYL^TM、TERMAMYL^TM、FUNGAMYL^TM和BAN^TM(Novozymes A/S)，RAPIDASE^TM和PURASTAR^TM(来自Genencor International Inc.)。

纤维素酶：合适的纤维素酶包括细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰的或蛋白质工程的突变体。合适的纤维素酶包括来自芽孢杆菌属、假单胞菌属、腐质霉属、镰孢属、梭孢壳属、枝顶孢霉属的纤维素酶，例如从特异腐质霉、嗜热毁丝霉和尖镰孢产生的真菌纤维素酶，其在美国专利4,435,307号、美国专利5,648,263号、美国专利5,691,178号、美国专利5,776,757号和WO 89/09259中公开。

特别合适的纤维素酶是具有颜色保护益处的碱性或中性纤维素酶。这些纤维素酶的实例是EP 0495257、EP 0531372、WO 96/11262、WO 96/29397、WO 98/08940中描述的纤维素酶。其它实例是纤维素变体如WO 94/07998、EP0531315、美国专利5,457,046号、美国专利5,686,593号、美国专利5,763,254号、WO 95/24471、WO 98/12307和PCT/DK98/00299中描述的那些变体。

商业上能够获得的纤维素酶包括CELLUZYME^TM，和CAREZYME^TM(Novozymes A/S)，CLAZINASE^TM和PURADAX HA^TM(Genencor InternationalInc.)，和KAC-500(B)^TM(Kao Corporation)。

过氧化物酶/氧化酶：合适的过氧化物酶/氧化酶包括植物、细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰的或蛋白质工程的突变体。有用的过氧化物酶的实例包括来自鬼伞属(Coprinus)例如来自灰盖鬼伞(C.cinereus)的过氧化物酶，和它们的变体，如WO 93/24618、WO 95/10602和WO 98/15257中所述的那些变体。

商业上能够获得的过氧化物酶包括GUARDZYME^TM(Novozymes A/S)。

可以通过加入含有一种或多种酶的单独的添加剂，或通过加入包含全部这些酶的组合添加剂，将酶成分包括在洗涤剂组合物中。可以将本发明的洗涤剂添加剂，即单独添加剂或组合添加剂，配制成例如颗粒、液体、浆料等。优选的洗涤剂添加剂剂型是颗粒，特别是无粉尘的颗粒；液体，特别是稳定化的液体；或浆料。

无粉尘的颗粒可以例如如美国专利4,106,991和4,661,452号中所公开的产生，并且可以任选地通过本领域已知的方法进行包覆。蜡质包覆材料的实例是具有1000-20000的平均摩尔量(mean molar weight)的聚(环氧乙烷)产品(聚乙二醇，PEG)；具有16-50个环氧乙烷单位的乙氧基化壬基酚；乙氧基化的脂肪醇，其中所述醇含有12-20个碳原子且其中存在15-80个环氧乙烷单位；脂肪醇；脂肪酸；和脂肪酸的单-和二-和三酸甘油酯。适于通过流化床技术施用的成膜包覆材料的实例在GB 1483591中给出。例如，可以通过根据已确定的方法添加多羟基化合物如丙二醇、糖或糖醇、乳酸或硼酸来使液体酶制备物稳定化。受保护的酶(protected enzyme)可根据EP 238,216中公开的方法来制备。

本发明的洗涤剂组合物可以是任何方便的形式，例如，条、片剂、粉剂、颗粒(granule)、糊剂(paste)或液体。液体洗涤剂可以是含水的，通常含有多至70％水和0-30％有机溶剂；或者是非水的。

洗涤剂组合物包含一种或多种表面活性剂，所述表面活性剂可以是非离子的包括半-极性的和/或阴离子的和/或阳离子的和/或两性离子的。表面活性剂通常以按重量计0.1％-60％的水平存在。

当包括于其中时，洗涤剂通常会含有约1％至约40％的阴离子表面活性剂，例如直链烷基苯磺酸酯(linear alkylbenzenesulfonate)、α-烯烃磺酸酯、烷基硫酸酯(脂肪醇硫酸酯)、醇乙氧基硫酸酯(alcohol ethoxysulfate)、仲烷基磺酸酯(secondary alkanesulfonate)、α-磺基脂肪酸甲酯、烷基-或烯基琥珀酸或肥皂(soap)。

当包括于其中时，洗涤剂通常会含有约0.2％至约40％的非离子表面活性剂，如醇乙氧基化物、壬基酚乙氧基化物、烷基聚苷(alkylpolyglycoside)、烷基二甲胺氧化物(alkyldimethylamineoxide)、乙氧基化的脂肪酸单乙醇酰胺(ethoxylated fatty acid monoethanolamide)、脂肪酸单乙醇酰胺、多羟基烷基脂肪酸酰胺，或葡糖胺的N-酰基N-烷基衍生物(“葡糖酰胺(glucamides)”)。

洗涤剂可以含有0-65％的洗涤剂增效剂(builder)或络合剂如沸石、二磷酸盐/酯、三磷酸盐/酯、膦酸盐/酯(phosphonate)、碳酸盐/酯、柠檬酸盐/酯、氮川三乙酸(nitrilotriacetic acid)、乙二胺四乙酸、二亚乙基三胺五乙酸、烷基-或烯基琥珀酸、可溶性硅酸盐或层状硅酸盐(例如来自Hoechst的SKS-6)。

洗涤剂可包含一种或多种聚合物。实例是羧甲基纤维素、聚(乙烯吡咯烷酮)、聚(乙二醇)、聚(乙烯醇)、聚(乙烯吡啶-N-氧化物)、聚(乙烯基咪唑)、聚羧酸盐/酯(polycarboxylate)如聚丙烯酸盐/酯、马来酸/丙烯酸共聚物和甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物。

洗涤剂可含有漂白体系，所述体系可包含H₂O₂源如过硼酸盐或过碳酸盐，可将其与形成过酸的漂白活化剂如四乙酰乙二胺或壬酰氧基苯磺酸酯(nonanoyloxybenzenesulfonate)组合。可供选择的是，漂白体系可包含过氧酸，例如酰胺、酰亚胺或砜型的过氧酸。

可以使用常规稳定剂使本发明的洗涤剂组合物中的酶组分稳定化，所述稳定剂例如，多羟基化合物如丙二醇或甘油，糖或糖醇，乳酸，硼酸或硼酸衍生物，例如，芳族硼酸酯，或苯基硼酸(phenyl boronic acid)衍生物如4-甲酰苯基硼酸，并且所述组合物可如例如WO 92/19709和WO 92/19708中所述配制。

洗涤剂也可含有其它常规洗涤剂成分如织物调节剂，包括粘土、泡沫促进剂、抑泡剂、抗腐蚀剂、悬污剂、防污物再沉积剂、染料、杀菌剂、光学增亮剂、助水溶物(bydrotrope)、晦暗抑制剂(tarnish inhibitors)或香料。

在洗涤剂组合物中，可以以相当于每升洗涤液0.01-100mg酶蛋白，优选每升洗涤液0.05-5mg酶蛋白，特别是每升洗涤液0.1-1mg酶蛋白的量加入任何酶组分，特别是本发明的具有纤维二糖水解酶活性的多肽。

可以额外地将本发明的具有纤维二糖水解酶活性的多肽并入WO97/07202中公开的洗涤剂配方，在此将WO 97/07202并入作为参考。

信号肽

本发明还涉及核酸构建体，所述核酸构建体包含编码蛋白质的基因，其中所述基因与编码信号肽的核苷酸序列可操作地连接，所述信号肽包含SEQID NO：2的氨基酸1到17，或由SEQ ID NO：2的氨基酸1至17组成，其中所述基因对于所述核苷酸序列是外源的。

在一个优选的方面，所述核苷酸序列包含SEQ ID NO：1的核苷酸1-51或由SEQ ID NO：1的核苷酸1-51组成。

本发明还涉及包含这样的核苷酸构建体的重组表达载体和重组宿主细胞。

本发明还涉及产生蛋白质的方法，包括(a)在适合于产生所述蛋白质的条件下培养这样的重组宿主细胞；和(b)回收所述蛋白质。

所述蛋白质对于宿主细胞可以是天然的或异源的。术语“蛋白质”在本文的意思不是指具体长度的编码产物，并因此包括肽、寡肽和蛋白质。术语“蛋白质”还包括组合以形成编码产物的两种或两种以上多肽。所述蛋白质还包括杂合多肽，其包含部分或全部多肽序列的组合，所述多肽序列从至少两种不同的蛋白质获得，其中一种或多种(几种)对于宿主细胞可以是异源或天然的。蛋白质进一步包括上述蛋白质和杂合蛋白质天然存在的等位基因变异和工程化的变异。

优选地，蛋白质是激素或其变体、酶、受体或其部分、抗体或其部分，或报告蛋白(reporter)。在一个更优选的方面，所述蛋白质是氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂合酶(lyase)、异构酶或连接酶。在更加优选的方面，所述蛋白质是氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、几丁质酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、转化酶、漆酶、另外的脂肪酶、甘露糖苷酶、变聚糖酶(mutanase)、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、肌醇六磷酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶或木聚糖酶。

基因可以获得自任何原核、真核或其它来源。

通过以下实施例进一步对本发明进行描述，但不应将其理解为对本发明范围的限制。

实施例

材料

用作缓冲液和底物的化学品是至少试剂级的商业产品。

菌株

使用嗜热毁丝霉CBS 202.75作为具有纤维二糖水解酶活性的家族6多肽的基因的来源。使用米曲霉JaL355菌株(WO 2002/40694)用于表达编码具有纤维二糖水解酶活性的多肽的嗜热毁丝霉基因。

培养基

基本培养基平板每升由6g NaNO₃、0.52g KCl、1.52g KH₂PO₄、1mlCOVE痕量元素溶液、20g Noble琼脂、20ml 50％葡萄糖、2.5ml MgSO₄·7H₂O和20ml 0.02％生物素溶液组成。

COVE痕量元素溶液每升由0.04g Na₂B₄O₇·10H₂O、0.4g CuSO₄·5H₂O、1.2g FeSO₄·7H₂O、0.7g MnSO₄·H₂O、0.8g Na₂MoO₂·2H₂O和10g ZnSO₄·7H₂O组成。

MDU2BP培养基每升由45g麦芽糖、1g MgSO₄.7H₂O、1g NaCl、2gK₂SO₄、12g KH₂PO₄、7g酵母提取物、2g尿素和0.5ml AMG痕量金属溶液；pH 5.0组成。

AMG痕量金属溶液每升由14.3g ZnSO₄·7H₂O、2.5g CuSO₄·5H₂O、0.5gNiCl₂·6H₂O、13.8g FeSO₄·7H₂O、8.5g MnSO₄·7H₂O和3g柠檬酸组成。

YEG培养基每升由20g右旋糖(dextrose)和5g酵母提取物组成。

实施例1：嗜热毁丝霉CBS 202.75基因组DNA提取

将嗜热毁丝霉CBS 202.75在带挡板的摇瓶中的100ml YEG培养基中于45℃和200rpm培养2天。使用

(Calbiochem，La Jolla，CA，USA)通过过滤收集菌丝体，在去离子水中洗涤两次，并在液氮中冷冻。将冷冻的菌丝体通过研钵和杵磨成细粉，并使用

Plant Maxi Kit(QIAGEN Inc.，Valencia，CA，USA)分离总DNA。

实施例2：从嗜热毁丝霉CBS 202.75分离全长家族6纤维二糖水解酶基因(cel6a)

使用GENOMEWALKER^TM Universal Kit(Clontech Laboratories，Inc.，Mountain View，CA，USA)按照制造商的说明书从嗜热毁丝霉CBS 202.75分离全长家族6纤维二糖水解酶基因(cel6a)。简言之，用四种不同的产生平末端的限制酶(Dra I、Eco RV、Pvu II和Stu I)分别消化来自嗜热毁丝霉CBS202.75的全基因组DNA。然后将各个批次消化的基因组DNA分别连接到GENOMEWALKER^TM Adaptor(Clontech Laboratories，Inc.，Mountain View，CA，USA)以创建四种文库。然后将这些文库用作PCR反应中的模板，所述PCR反应使用下文所示的两种基因特异性引物，一种用于首次PCR，一种用于二次PCR。所述引物是根据来自嗜热毁丝霉的部分家族6纤维二糖水解酶基因(cel6a)序列(WO 2004/056981)设计的。

引物MtCel6a-R4：

5′-ATTGGCAGCCCGGATCTGGGACAGAGTCTG-3′(SEQ ID NO：3)

引物MtCel6a-R5：

5′-CCGGTCATGCTAGGAATGGCGAGATTGTGG-3′(SEQ ID NO：4)

首次扩增由1μl(约6ng)的各文库作为模板，0.4mM dATP、dTTP、dGTP和dCTP中的每一种，10pmol Adaptor引物1(Clontech Laboratories，Inc.，Mountain View，CA，USA)，10pmol引物MtCel6a-R4，2μl 1X

GC-Melt LA缓冲液(Clontech Laboratories，Inc.，Mountain View，CA，USA)和1.25单位的

GC基因组聚合酶混合物(Genomic PolymeraseMix)(Clontech Laboratories，Inc.，Mountain View，CA，USA)组成，终体积为25μl。使用

5333(Eppendorf Scientific，Inc.，Westbury，NY，USA)进行扩增，程序为94℃预变性1分钟；7个循环，每个循环在94℃的变性温度30秒；在72℃退火和延伸5分钟；和32个循环，每个循环在67℃5分钟。

二次扩增由1μl的各首次PCR产物作为模板，0.4mM dATP、dTTP、dGTP和dCTP中的每一种，10pmol Adaptor引物2(Clontech Laboratories，Inc.，Mountain View，CA，USA)，10pmol引物MtCel6a-R5，1X

GC-Melt LA Buffer和1.25单位的

GC基因组聚合酶混合物组成，终体积为25μl。使用

5333进行扩增，程序为94℃预变性1分钟；5个循环，每个循环在94℃的变性温度30秒；在72℃退火和延伸5分钟；和20个循环，每个循环在67℃5分钟。

通过使用40mM Tris碱-20mM乙酸钠-1mM EDTA二钠(TAE)缓冲液的1.0％琼脂糖凝胶电泳分离反应产物，其中将来自Eco RV文库的3.5kb产物条带从凝胶切下，使用

凝胶提取试剂盒(QIAGEN，Valencia，CA，USA)按照制造商的说明书纯化，并测序。

实施例3：编码家族6纤维二糖水解酶的嗜热毁丝霉基因组序列的表征

对3.5kb PCR片段的DNA测序使用染料终止物化学(Giesecke等，1992，Journal of Virology Methods 38：47-60)和引物步移策略以Perkin-Elmer AppliedBiosystems Model 377XL自动DNA测序仪(Perkin-Elmer/Applied Biosystems，Inc.，Foster City，CA，USA)进行。使用了以下基因特异性引物进行测序：

MtCel6a-F2：

5’-GCTGTAAACTGCGAATGGGTTCAG-3’(SEQ ID NO：5)

MtCel6a-F3：

5’-GGGTCCCACATGCTGCGCCT-3’(SEQ ID NO：6)

MtCel6a-R8：

5’-AAAATTCACGAGACGCCGGG-3’(SEQ ID NO：7)

仔细检查核苷酸序列数据的质量并且在PHRED/PHRAP软件(Universityof Washington，Seattle，WA，USA)的辅助下将全部序列相互比较。将3.5kb序列与来自嗜热毁丝霉的部分家族6纤维二糖水解酶基因(cel6a)序列(WO2004/056981)比较并比对。

根据编码的蛋白质与来自土生梭孢霉、嗜热毛壳、特异腐质霉和里氏木霉的同源糖苷水解酶家族6蛋白的相似性构建了用于嗜热毁丝霉序列的基因模型。所述核苷酸序列(SEQ ID NO：1)和推导的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)示于图1A和1B。该基因组片段编码482个氨基酸的多肽，其被96、87、和180bp的3个内含子中断。所述基因和成熟编码序列的％G+C含量分别为61.6％和64％。使用SignalP软件程序(Nielsen等，1997，Protein Engineering10：1-6)，预测了17个残基的信号肽。预测的成熟蛋白含有465个氨基酸，具有49.3kDa的分子量。

使用如EMBOSS的Needle程序中执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，1970，J.Mol.Biol.48：443-453)，以缺口产生罚分10、缺口延伸罚分0.5和EBLOSUM62矩阵确定了氨基酸序列的比较型配对全局比对。所述比对显示，编码具有纤维二糖水解酶活性的CEL6A成熟多肽的嗜热毁丝霉基因的推导氨基酸序列分别与来自嗜热毛壳和特异腐质霉的两种糖苷水解酶家族6蛋白的推导氨基酸序列(GeneSeqP登录号分别为ADP84824和AAW44853)共享78.6％和77.6％同一性(不包括缺口)。

实施例4：嗜热毁丝霉纤维二糖水解酶基因(cel6a)的克隆和米曲霉表达载体的构建

设计了下文所示的两种合成寡核苷酸引物以从实施例1中制备的基因组DNA PCR扩增嗜热毁丝霉纤维二糖水解酶基因。使用InFusion克隆试剂盒(BD Biosciences，Palo Alto，CA，USA)直接将所述片段克隆到表达载体pAlLo2(WO 2004/099228)中，无需限制酶消化和连接。

MtCel6a-F4：

5’-ACTGGATTTACCATGGCCAAGAAGCTTTTCATCACC-3’(SEQ ID NO：8)

MtCel6a-R9：

5’-T ACC CTCTAGTTAATTAATTAGAAGGGCGGGTTGGCGT-3’(SEQ ID NO：9)

粗体字代表编码序列。余下的序列与pAlLo2的插入位点同源。

将50皮摩尔的以上各种引物用于PCR反应，所述PCR反应由100ng嗜热毁丝霉基因组DNA，2μl 1XGC-Melt LA缓冲液，0.4mM dATP、dTTP、dGTP和dCTP中的每一种，和1.25单位的

GC基因组聚合酶混合物组成，终体积为25μl。所述扩增使用

5333进行，程序为1个循环的94℃1分钟；和30个循环，每个在94℃30秒，62℃30秒，和72℃2分钟。然后使加热块(heat block)转到4℃浸渍循环(soak cycle)。

将反应产物通过使用TAE缓冲液的1.0％琼脂糖凝胶电泳分离，其中将1842bp的产物条带从凝胶切下，并使用

凝胶提取试剂盒按照制造商的说明书纯化。

将质粒pAlLo2(WO 2004/099228)用Nco I和Pac I消化，通过使用TAE缓冲液的1.0％琼脂糖凝胶电泳分离，并使用

凝胶提取试剂盒按照制造商的说明书纯化。

将所述基因片段和消化的载体使用Infusion克隆试剂盒连接在一起得到pSMai180(图2)，在pSMai180中纤维二糖水解酶基因的转录在来自黑曲霉中性α-淀粉酶基因和米曲霉丙糖磷酸异构酶基因的启动子杂合体(NA2-tpi启动子)的控制下。连接反应(50μl)由1X InFusion缓冲液(BD Biosciences，PaloAlto，CA，USA)、1X BSA(BD Biosciences，Palo Alto，CA，USA)、1μl Infusion酶(1∶10稀释)(BD Biosciences，Palo Alto，CA，USA)、100ng用Nco I和Pac I消化的pAlLo2和50ng嗜热毁丝霉cel6a纯化的PCR产物组成。将所述反应在室温培育30分钟。使用1μl的反应物转化大肠杆菌XL10

Gold超感受态细胞(Stratagene，La Jolla，CA，USA)。通过限制酶消化检测到了含有pSMai180的大肠杆菌转化体，并使用

9600(QIAGEN Inc.，Valencia，CA，USA)制备了质粒DNA。通过DNA测序确认了pSMai180中的嗜热毁丝霉cel6a插入物。

使用TOPO TA

试剂盒将同一1842bp PCR片段克隆到

2.1-TOPO载体(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)中，以产生pSMai182(图2)。通过DNA测序确认了pSMai182中的嗜热毁丝霉cel6a插入物。将大肠杆菌pSMai182于2007年9月6日保藏在农业研究机构专利培养物保藏中心(Agricultural Research Service Patent Culture Collection)，北区研究中心(Northern Regional Research Center)，Peoria，IL，USA。

实施例6：嗜热毁丝霉家族6纤维二糖水解酶cel6a基因在米曲霉JaL355中的表达

根据Christensen等，1988，Bio/Technology 6：1419-1422的方法制备了米曲霉JaL355(WO 2002/40694)原生质体。使用3μg pSMai180转化米曲霉JaL355。

用pSMai180转化米曲霉JaL355生成了约50个转化体。将20个转化体分离至单独的基本培养基平板。

用5ml 0.01％

20洗涤20个转化体的汇合的基本培养基平板，再分别接种至125ml玻璃摇瓶中的25ml MDU2BP培养基中，并在34℃、250rpm培育。培育5天之后，将来自各个培养物的5μl上清液在带有Cell(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA，USA)的

Tris-HCl凝胶上(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA，USA)按照制造商的说明书进行分析。所得凝胶用BIO-SAFE^TM考马斯染料(Bio-RadLaboratories，Hercules，CA，USA)来染色。培养物的SDS-PAGE谱显示大部分转化体具有约70kDa的主带。

将指名为转化体14的一个转化体的汇合平板用10ml 0.01％

20洗涤并接种到含有500ml MDU2BP培养基的2升Fernbach中以产生用于表征酶的培养液。在第5天收获培养物并使用0.22μm EXPRESSTM Plus膜(Millipore，Bedford，MA，USA)过滤。

实施例7：嗜热毁丝霉CEL6A纤维二糖水解酶的表征

在美国能源部国家可再生能源实验室(U.S.Department of Energy NationalRenewable Energy Laboratory)(NREL)，Boulder，CO，USA使用稀硫酸预处理玉米秸秆。使用以下条件进行预处理：在190℃和25％w/w干固体条件下，每克干生物质0.048g硫酸，进行大约1分钟。经预处理的玉米秸秆(PCS)中的水不溶性固体含有53.2％纤维素、3.6％半纤维素和29.8％木质素。使用NREL标准分析规程#002通过两阶段硫酸水解和后续的通过高效液相层析进行的糖类分析测定了纤维素和半纤维素。使用NREL标准分析规程#003在用硫酸水解纤维素和半纤维素级分之后以重量分析测定了木质素。在酶水解之前，用大量蒸馏水洗涤PCS直到pH高于4.0，然后从100目的筛子筛过，并最终在121℃高压灭菌30分钟。发现经洗涤并过筛的PCS的干内容物为6.54％。

使用ECONO-

10DG柱(Bio-Rad Laboratories，Inc.，Hercules，CA，USA)对如实施例6中所述制备的嗜热毁丝霉CEL6A纤维二糖水解酶的摇瓶培养液进行脱盐。使用微量板BCA^TM蛋白测定试剂盒(Microplate BCA^TMProtein Assay Kit)(Pierce，Rockford，IL，USA)测定了蛋白浓度。

克隆里氏木霉CEL7B内切葡聚糖酶I并在米曲霉JaL250中表达，如WO 2005/067531中所述。使用微量板BCA^TM蛋白测定试剂盒测定了蛋白浓度。使用

26/10脱盐柱(GE Healthcare Life Sciences，Piscataway，NJ，USA)按照制造商的说明书将里氏木霉CEL7B内切葡聚糖酶I脱盐并缓冲液交换至150mM NaCl-20mM乙酸钠pH 5.0。

如WO 2004/099228中所述重组制备了米曲霉Cel3Aβ-葡糖苷酶，并且如Langston等，2006，Biochim.Biophys.Acta Proteins Proteomics 1764：972-978所述进行了纯化。使用微量板BCA^TM蛋白测定试剂盒测定了蛋白质浓度。重组产生了巴西青霉(Penicillium brasilianum)IBT 20888Cel3Aβ-葡糖苷酶并且使用

26/10脱盐柱如上进行脱盐，并使用AKTA FPLC系统(GE Healthcare Life Sciences，Piscataway，NJ，USA)按照制造商的说明书以Mono

柱进一步纯化。

如WO 2005/056772中所述从里氏木霉RutC30分离了里氏木霉CEL6A纤维二糖水解酶基因。根据美国专利申请20060156437中所述步骤使用pEJG61作为表达载体在镶片镰孢中表达了所述里氏木霉CEL6A纤维二糖水解酶基因。如美国专利申请20060156437中所述进行发酵。使用微量板BCA^TM蛋白测定试剂盒测定了蛋白质浓度。使用

26/10脱盐柱按照制造商的说明书对里氏木霉CEL6A纤维二糖水解酶进行脱盐并缓冲液交换至20mM乙酸钠-150mM NaCl pH 5.0。

PCS的水解在用平板密封物(ALPS-300，Abgene，Epsom，UK)密封的96深孔板(Axygen Scientific，Union City，CA，USA)中进行，总反应体积为1.0ml。为了测试嗜热毁丝霉纤维二糖水解酶的活性，以1mg纤维二糖水解酶每克纤维素连同0.5mg米曲霉β-葡糖苷酶每克纤维素加样PCS。使用里氏木霉CEL6A纤维二糖水解酶(1mg每克纤维素)连同米曲霉β-葡糖苷酶(0.5mg每克纤维素)作为对照用于与嗜热毁丝霉CEL6A纤维二糖水解酶比较。在TS自流CO₂夹套式温箱(TS Autoflow CO₂ Jacketed Incubator)(FisherScientific，Pittsburgh，PA，USA)中在pH 5.0，50℃进行PCS水解。反应以一式三份进行，并在水解过程期间取得等分试样。通过将每种水解物的20μl等分试样与180μl 0.1M NaOH(终止试剂)混合来终止PCS水解反应。为每种样品生成适当的系列稀释物，并使用适于96孔微量板形式的对羟基苯甲酸酰肼(para-hydroxybenzoic acid hydrazide)(PHBAH，Sigma，St.Louis，MO，USA)测定法测定了还原糖含量。将适当稀释的样品的100μl等分试样置于96孔锥底微量板中。通过向各孔加入50μl 2％NaOH中的1.5％(w/v)PHBAH来起始反应。将平板在95℃不加盖加热10分钟，其后向各孔加入50μl蒸馏水。将来自各孔的100μl等分试样转移至平底96孔板，并使用

微量板读数器(Molecular Devices，Sunnyvale，CA，USA)测量410nm的吸光度。使用葡萄糖标准品(0.1-0.0125mg/ml，用0.4％氢氧化钠稀释)制作标准曲线以将获得的A_410nm值转换成葡萄糖当量。使用得到的当量计算每个反应的PCS纤维素转化的百分比。

纤维素转化成还原糖的程度(％转化率)使用以下方程式计算：

％转化率＝RS_(mg/ml)x 100x 162/(纤维素_(mg/ml)x 180)＝

＝RS_(mg/ml)x 100/(纤维素_(mg/ml)x 1.111)

在这个方程式中，RS是以葡萄糖当量(mg/ml)测量的溶液中的还原糖浓度，而因子1.111反映了纤维素转化为葡萄糖的重量增加。

结果归纳在表1中。在米曲霉β-葡糖苷酶的存在下嗜热毁丝霉CEL6A纤维二糖水解酶与里氏木霉CEL6A纤维二糖水解酶相比对PCS具有相似的或稍高的活性。

表1.由嗜热毁丝霉CEL6A纤维二糖水解酶或里氏木霉CEL6A纤维二糖水解酶加米曲霉β-葡糖苷酶进行的纤维素转化

试验#	酶的名称	加样量mg/g纤维素	65小时的转化率，％
试验#	酶的名称	加样量mg/g纤维素	65小时的转化率，％	1	嗜热毁丝霉CBH+米曲霉β-葡糖苷酶	1+0.5	5.0
2	里氏木霉CBH+米曲霉β-葡糖苷酶	1+0.5	3.7	1	嗜热毁丝霉CBH+米曲霉β-葡糖苷酶	1+0.5	5.0

使用AKTA FPLC系统通过PHENYLHR 16/10柱(GEHealthcare Life Sciences，Piscataway，NJ，USA)将脱盐的嗜热毁丝霉Cel6A进一步纯化。样品的SDS-PAGE显示其为至少90％纯的。下面使用的其它酶也如上使用AKTA FPLC系统进一步纯化，其纯度高于90％。

PCS(反应中40g/L)的水解在96深孔板中进行并如上所述密封，其中总反应体积为1.0ml。在使用人工酶混合物于pH 5，50和55℃(TS自流CO₂夹套式温箱)进行的PCS水解中测试了嗜热毁丝霉Cel6A纤维二糖水解酶(与里氏木霉Cel6A纤维二糖水解酶相比)。所述酶混合物由里氏木霉Cel7B内切葡聚糖酶(2mg/g纤维素)、巴西青霉GH3Aβ-葡糖苷酶(0.3mg/g纤维素)以及或者嗜热毁丝霉Cel6A纤维二糖水解酶或者里氏木霉Cel6A纤维二糖水解酶(2mg/g纤维素)组成。通过将每种水解物的20μl等分试样与180μl 0.1M NaOH(终止试剂)混合来终止PCS水解反应。水解反应分析和计算如上所述进行。纤维素转化结果归纳在表2中。

表2.由里氏木霉Cel7B内切葡聚糖酶(2mg/g纤维素)、巴西青霉GH3Aβ-葡糖苷酶(0.3mg/g纤维素)以及或者嗜热毁丝霉Cel6A或者里氏木霉Cel6A纤维二糖水解酶(2mg/g纤维素)在pH 5，50和55℃进行的纤维素转化

试验#	酶的名称(mg/g纤维素)	温度，℃	72小时的转化，％
试验#	酶的名称(mg/g纤维素)	温度，℃	72小时的转化，％	1	里氏木霉Cel7B内切葡聚糖酶(2)+巴西青霉GH3Aβ-葡糖苷酶(0.3)+嗜热毁丝霉Cel6A纤维二糖水解酶(2)	50	22.5
2	里氏木霉Cel7B内切葡聚糖酶(2)+巴西青霉GH3Aβ-葡糖苷酶(0.3)+里氏木霉Cel6A纤维二糖水解酶(2)	50	19.6	1	里氏木霉Cel7B内切葡聚糖酶(2)+巴西青霉GH3Aβ-葡糖苷酶(0.3)+嗜热毁丝霉Cel6A纤维二糖水解酶(2)	50	22.5
2	里氏木霉Cel7B内切葡聚糖酶(2)+巴西青霉GH3Aβ-葡糖苷酶(0.3)+里氏木霉Cel6A纤维二糖水解酶(2)	50	19.6	3	里氏木霉Cel7B内切葡聚糖酶(2)+巴西青霉GH3Aβ-葡糖苷酶(0.3)+嗜热毁丝霉Cel6A纤维二糖水解酶(2)	55	25.9
4	里氏木霉Cel7B内切葡聚糖酶(2)+巴西青霉GH3A(0.3)+里氏木霉Cel6A纤维二糖水解酶(2)	55	18.2	3	里氏木霉Cel7B内切葡聚糖酶(2)+巴西青霉GH3Aβ-葡糖苷酶(0.3)+嗜热毁丝霉Cel6A纤维二糖水解酶(2)	55	25.9

表1显示了嗜热毁丝霉6A纤维二糖水解酶在50和55℃的PCS水解中的表现都超过里氏木霉6A纤维二糖水解酶，并且特别是在55℃。

生物材料的保藏

依据布达佩斯条约的条款，下述的生物材料已经保藏于农业研究机构专利培养物保藏中心，亦称农业研究保藏中心(Agricultural Research ServicePatent Culture Collection)，北区研究中心(Northern Regional Research Center)，1815University Street，Peoria，Illinois，61604，并给予下述的登录号：

保藏物登录号保藏日期

大肠杆菌pSMai182 NRRL B-50059 2007年9月6日

所述菌株已于下述条件下保藏：确保在本专利申请未决期间，由外国专利法律决定授权的人能够获得所述培养物。所述保藏物为所保藏菌株的基本上纯的培养物。在提交了题述申请的副本，或其后续文本的国家，依据该外国专利法律的要求，可以获得所述保藏物。然而，应当理解，保藏物的获得并不构成对实施题述发明的许可，实施题述发明是对政府行为所授予的专利权的侵犯。

本文描述和要求保护的发明并不受限于本文所公开的具体方面的范围，因为这些方面意欲作为本发明几个方面的说明。任何等同的方面意欲在本发明的范围之内。实际上，从前面的说明中，除本文所显示和描述的之外，本发明的多种修改对于本领域的技术人员来说是显而易见的。这些修改也意欲落入所附的权利要求的范围内。在冲突的情况下，将以包括定义部分的本公开为准。

序列表

<110>诺维信公司(Novozymes A/S)

<120>具有纤维二糖水解酶II活性的多肽和编码该多肽的多核苷酸

<130>11307.204-WO

<150>60/976,207

<151>2007-09-28

<160>9

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>1812

<212>DNA

<213>嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)

<400>1

atggccaaga agcttttcat caccgccgcc cttgcggctg ccgtgttggc ggcccccgtc 60

attgaggagc gccagaactg cggcgctgtg tggtaagaaa gcccggtctg agtttcccat 120

gactttctca tcgagtaatg gcataaggcc caccccttcg actgactgtg agaatcgatc 180

aaatccagga ctcaatgcgg cggcaacggg tggcagggtc ccacatgctg cgcctcgggc 240

tcgacctgcg ttgcgcagaa cgagtggtac tctcagtgcc tgcccaacaa tcaggtgacg 300

agttccaaca ctccgtcgtc gacttccacc tcgcagcgca gcagcagcac ctccagcagc 360

agcaccagga gcggcagctc ctcctcctcc accaccacgc cccctcccgt ctccagcccc 420

gtgactagca ttcccggcgg tgcgaccacc acggcgagct actctggcaa ccccttctcg 480

ggcgtccggc tcttcgccaa cgactactac aggtccgagg tccacaatct cgccattcct 540

agcatgaccg gtactctggc ggccaaggct tccgccgtcg ccgaagtccc tagcttccag 600

tggctcgacc ggaacgtcac catcgacacc ctgatggtcc agactctgtc ccagatccgg 660

gctgccaata atgccggtgc caatcctccc tatgctggtg agttacatgg cggcgacttg 720

ccttctcgtc ccccaccttt cttgacggga tcggttacct gacctggagg caaaacaaaa 780

ccagcccaac ttgtcgtcta cgacctcccc gaccgtgact gcgccgccgc tgcgtccaac 840

ggcgagtttt cgattgcaaa cggcggcgcc gccaactaca ggagctacat cgacgctatc 900

cgcaagcaca tcattgagta ctcggacatc cggatcatcc tggttatcga gcccgactcg 960

atggccaaca tggtgaccaa catgaacgtg gccaagtgca gcaacgccgc gtcgacgtac 1020

cacgagttga ccgtgtacgc gctcaagcag ctgaacctgc ccaacgtcgc catgtatctc 1080

gacgccggcc acgccggctg gctcggctgg cccgccaaca tccagcccgc cgccgacctg 1140

tttgccggca tctacaatga cgccggcaag ccggctgccg tccgcggcct ggccactaac 1200

gtcgccaact acaacgcctg gagtatcgct tcggccccgt cgtacacgtc ccctaaccct 1260

aactacgacg agaagcacta catcgaggcc ttcagcccgc tcctgaacgc ggccggcttc 1320

cccgcacgct tcattgtcga cactggccgc aacggcaaac aacctaccgg tatggttttt 1380

ttcttttttt ttctctgttc ccctccccct tccccttcag ttggcgtcca caaggtctct 1440

tagtcttgct tcttctcgga ccaaccttcc cccaccccca aaacgcaccg cccacaaccg 1500

ttcgactcta tactcttggg aatgggcgcc gaaactgacc gttcgacagg ccaacaacag 1560

tggggtgact ggtgcaatgt caagggcact ggctttggcg tgcgcccgac ggccaacacg 1620

ggccacgacc tggtcgatgc ctttgtctgg gtcaagcccg gcggcgagtc cgacggcaca 1680

agcgacacca gcgccgcccg ctacgactac cactgcggcc tgtccgatgc cctgcagcct 1740

gctccggagg ctggacagtg gttccaggcc tacttcgagc agctgctcac caacgccaac 1800

ccgcccttct aa 1812

<210>2

<211>482

<212>PRT

<213>嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)

<400>2

Met Ala Lys Lys Leu Phe Ile Thr Ala Ala Leu Ala Ala Ala Val Leu

1 5 10 15

Ala Ala Pro Val Ile Glu Glu Arg Gln Asn Cys Gly Ala Val Trp Thr

20 25 30

Gln Cys Gly Gly Asn Gly Trp Gln Gly Pro Thr Cys Cys Ala Ser Gly

35 40 45

Ser Thr Cys Val Ala Gln Asn Glu Trp Tyr Ser Gln Cys Leu Pro Asn

50 55 60

Asn Gln Val Thr Ser Ser Asn Thr Pro Ser Ser Thr Ser Thr Ser Gln

65 70 75 80

Arg Ser Ser Ser Thr Ser Ser Ser Ser Thr Arg Ser Gly Ser Ser Ser

85 90 95

Ser Ser Thr Thr Thr Pro Pro Pro Val Ser Ser Pro Val Thr Ser Ile

100 105 110

Pro Gly Gly Ala Thr Thr Thr Ala Ser Tyr Ser Gly Asn Pro Phe Ser

115 120 125

Gly Val Arg Leu Phe Ala Asn Asp Tyr Tyr Arg Ser Glu Val His Asn

130 135 140

Leu Ala Ile Pro Ser Met Thr Gly Thr Leu Ala Ala Lys Ala Ser Ala

145 150 155 160

Val Ala Glu Val Pro Ser Phe Gln Trp Leu Asp Arg Asn Val Thr Ile

165 170 175

Asp Thr Leu Met Val Gln Thr Leu Ser Gln Ile Arg Ala Ala Asn Asn

180 185 190

Ala Gly Ala Asn Pro Pro Tyr Ala Ala Gln Leu Val Val Tyr Asp Leu

195 200 205

Pro Asp Arg Asp Cys Ala Ala Ala Ala Ser Asn Gly Glu Phe Ser Ile

210 215 220

Ala Asn Gly Gly Ala Ala Asn Tyr Arg Ser Tyr Ile Asp Ala Ile Arg

225 230 235 240

Lys His Ile Ile Glu Tyr Ser Asp Ile Arg Ile Ile Leu Val Ile Glu

245 250 255

Pro Asp Ser Met Ala Asn Met Val Thr Asn Met Asn Val Ala Lys Cys

260 265 270

Ser Asn Ala Ala Ser Thr Tyr His Glu Leu Thr Val Tyr Ala Leu Lys

275 280 285

Gln Leu Asn Leu Pro Asn Val Ala Met Tyr Leu Asp Ala Gly His Ala

290 295 300

Gly Trp Leu Gly Trp Pro Ala Asn Ile Gln Pro Ala Ala Asp Leu Phe

305 310 315 320

Ala Gly Ile Tyr Asn Asp Ala Gly Lys Pro Ala Ala Val Arg Gly Leu

325 330 335

Ala Thr Asn Val Ala Asn Tyr Asn Ala Trp Ser Ile Ala Ser Ala Pro

340 345 350

Ser Tyr Thr Ser Pro Asn Pro Asn Tyr Asp Glu Lys His Tyr Ile Glu

355 360 365

Ala Phe Ser Pro Leu Leu Asn Ala Ala Gly Phe Pro Ala Arg Phe Ile

370 375 380

Val Asp Thr Gly Arg Asn Gly Lys Gln Pro Thr Gly Gln Gln Gln Trp

385 390 395 400

Gly Asp Trp Cys Asn Val Lys Gly Thr Gly Phe Gly Val Arg Pro Thr

405 410 415

Ala Asn Thr Gly His Asp Leu Val Asp Ala Phe Val Trp Val Lys Pro

420 425 430

Gly Gly Glu Ser Asp Gly Thr Ser Asp Thr Ser Ala Ala Arg Tyr Asp

435 440 445

Tyr His Cys Gly Leu Ser Asp Ala Leu Gln Pro Ala Pro Glu Ala Gly

450 455 460

Gln Trp Phe Gln Ala Tyr Phe Glu Gln Leu Leu Thr Asn Ala Asn Pro

465 470 475 480

Pro Phe

<210>3

<211>30

<212>DNA

<213>嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)

<400>3

attggcagcc cggatctggg acagagtctg 30

<210>4

<211>30

<212>DNA

<213>嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)

<400>4

ccggtcatgc taggaatggc gagattgtgg 30

<210>5

<211>24

<212>DNA

<213>嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)

<400>5

gctgtaaact gcgaatgggt tcag 24

<210>6

<211>20

<212>DNA

<213>嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)

<400>6

gggtcccaca tgctgcgcct 20

<210>7

<211>20

<212>DNA

<213>嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)

<400>7

aaaattcacg agacgccggg 20

<210>8

<211>36

<212>DNA

<213>嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)

<400>8

actggattta ccatggccaa gaagcttttc atcacc 36

<210>9

<211>38

<212>DNA

<213>嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)

<400>9

tcacctctag ttaattaatt agaagggcgg gttggcgt 38

Claims

1.具有纤维二糖水解酶活性的分离的多肽，选自下组：

(a)多肽，其包含与SEQ ID NO：2的成熟多肽具有优选至少80％，更优选至少85％，甚至更优选至少90％，并且最优选至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列；

(b)由如下多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸在优选至少高严紧条件下与以下杂交：(i)SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列，(ii)包含SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列的基因组DNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；

(c)由如下多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸包含与SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列具有优选至少80％，更优选至少85％，甚至更优选至少90％，并且最优选至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％同一性的核苷酸序列；和

(d)变体，其包含取代、缺失和/或插入一个或多个(几个)氨基酸的SEQ IDNO：2的成熟多肽。

2.权利要求1的多肽，其包含或其组成为：SEQ ID NO：2的氨基酸序列；或其具有纤维二糖水解酶活性的片段。

3.权利要求1的多肽，其由如下多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或其组成为：SEQ ID NO：1的核苷酸序列；或其编码具有纤维二糖水解酶活性的片段的亚序列。

4.权利要求1的多肽，其由大肠杆菌NRRL B-50059中所含质粒pSMai182中含有的多核苷酸编码。

5.分离的多核苷酸，其包含编码权利要求1-4中任一项的多肽的核苷酸序列。

6.核酸构建体，其包含权利要求5的多核苷酸，该多核苷酸与指导所述多肽在表达宿主中产生的一种或多种调控序列可操作地连接。

7.重组宿主细胞，其包含权利要求6的核酸构建体。

8.产生权利要求1-4中任一项的多肽的方法，包括：(a)在用于产生所述多肽的条件下培养细胞，所述细胞以其野生型形式产生所述多肽；和(b)回收所述多肽。

9.产生权利要求1-4中任一项的多肽的方法，包括：(a)在有益于产生所述多肽的条件下培养包含核酸构建体的宿主细胞，所述核酸构建体包含编码多肽的核苷酸序列；和(b)回收所述多肽。

10.产生亲本细胞的突变体的方法，包括破坏或缺失编码权利要求1-4中任一项的多肽的核苷酸序列，这导致所述突变体产生的所述多肽少于亲本细胞。

11.产生权利要求1-4中任一项的多肽的方法，包括：(a)在有益于产生所述多肽的条件下培养转基因植物或植物细胞，所述转基因植物或植物细胞包含编码所述多肽的多核苷酸；和(b)回收所述多肽。

12.用编码权利要求1-4中任一项的多肽的多核苷酸转化的转基因植物、植物部分或植物细胞。

13.双链抑制性RNA(dsRNA)分子，其包含权利要求5的多核苷酸的亚序列，其中任选地所述dsRNA是siRNA或miRNA分子。

14.抑制细胞中多肽表达的方法，包括向所述细胞施用或在所述细胞中表达权利要求13的双链RNA(dsRNA)分子。

15.核酸构建体，其包含编码蛋白质的基因，该基因与编码信号肽的核苷酸序列可操作地连接，所述信号肽包含SEQ ID NO：2的氨基酸1-16或由SEQ ID NO：2的氨基酸1-16组成，其中所述基因对于所述核苷酸序列是外源的。

16.重组宿主细胞，其包含权利要求15的核酸构建体。

17.产生蛋白质的方法，包括：(a)在有益于产生所述蛋白质的条件下培养权利要求16的重组宿主细胞；和(b)回收所述蛋白质。

18.用于降解或转化纤维素材料的方法，包括：在有效量的权利要求1-4中任一项的具有纤维二糖水解酶活性的多肽存在下，用有效量的包含一种或多种纤维素分解蛋白的组合物处理所述纤维素材料，其中所述具有纤维二糖水解酶活性的多肽的存在使纤维素材料的降解与不存在所述具有纤维二糖水解酶活性的多肽时相比增加。

19.权利要求18的方法，还包括回收降解的纤维素材料。

20.用于产生物质的方法，包括：

(a)在有效量的权利要求1-4中任一项的具有纤维二糖水解酶活性的多肽存在下，用有效量的包含一种或多种纤维素分解蛋白的组合物糖化纤维素材料，其中所述具有纤维二糖水解酶活性的多肽的存在使纤维素材料的降解与不存在所述具有纤维二糖水解酶活性的多肽时相比增加；

(b)用一种或多种发酵微生物发酵步骤(a)的糖化的纤维素材料；和

(c)从所述发酵回收物质。

21.洗涤剂组合物，包含表面活性剂和权利要求1-4中任一项的具有纤维二糖水解酶活性的多肽。