CN104768391A - 用于增加纤维素材料的消化率的方法和组合物 - Google Patents

用于增加纤维素材料的消化率的方法和组合物 Download PDF

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Abstract

披露了一种用于对纤维素材料进行处理的方法。更具体地，这种处理可增加微生物或生物过程之后的纤维素材料的消化率。

Description

用于增加纤维素材料的消化率的方法和组合物
对生物材料保藏库的参考
本申请包含对生物材料保藏的参考，该保藏通过引用结合在此。
发明领域
本发明涉及一种生产动物饲料的方法，该方法包括对纤维素材料的处理，这可提高纤维素材料的消化率。本发明还涉及能够增加纤维素材料的消化率的组合物和/或其任何组合，其采用一种或多种微生物和/或酶，并且涉及可被用在这类方法中的组合物。
发明背景
在动物饲料中可使用大量的谷物产品，主要是玉米。由于在如乙醇和丁醇等生物燃料产品生产中使用农作物，因此需要用于动物饲料的其它能量和蛋白来源。一种来源是天然植物性材料。
然而，存在着一项挑战，因为天然植物性材料，尤其是农作物秸秆材料、纤维性材料和/或其它农业副产品(agricultural side streams)、以及传统上用于青贮的材料，包括在许多生物系统中不能消化的或可缓慢/部分消化的非常大量的纤维素材料，这些生物系统包括并且尤其是动物，特别是反刍动物，如牛、山羊、绵羊、长颈鹿、野牛、驼鹿、麋鹿、牦牛、水牛、鹿、骆驼、羊驼、骆驼、羚羊、叉角羚等等。相应地，当给反刍动物饲喂纤维素植物性材料时，特别是饲喂农作物秸秆材料、纤维性材料以及其它农业副产品时，被处理过的材料中的相当大的一部分不能被消化或只能被部分消化。
美国专利申请号5,545,418披露了通过用氧化钙与氢氧化钠一起使用或不与氢氧化钠一起使用对蔗渣进行软化并同时防止纤维素和半纤维素的大量分解而制备而成的一种碱处理蔗渣、由碱处理蔗渣制备而成的蔗渣饲料和发酵蔗渣饲料、和它们的制品和应用，以及用于对碱处理蔗渣进行发酵的细菌(即乳杆菌属(Lactobacillus spp.))。
中国专利申请号101392268披露了用于获得一种可转化底物的木质纤维素材料的一种预处理方法，该可转化底物在生物精炼、生物能源、生物医药、食品加工、轻工化工产品、生物饲料和肥料的生产中是需要的，该方法采用了担子菌属(Basidiomycete sp.)菌株或菌群，其可选择性地破坏木质纤维素的结构来进行对多种木质纤维素材料在开放的条件下进行固体发酵的持续预处理。
美国专利申请号6,326,037披露了用于对选自由猪、家禽和反刍动物组成的组的动物进行处理的一种方法，以增加动物生产性能，该方法包括随其饲料给予动物可增加生产性能的量的一种生物，该生物选自于由以下各项组成的组：布氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri)，开菲尔乳杆菌(Lactobacilluskefir)，类开菲尔乳杆菌(Lactobacillus parakefir)、以及类布氏乳杆菌(Lactobacillus parabuchneri)。
美国专利申请号7,494,675公开了用于生产动物饲料的一种方法，该方法包括添加经过处理而使之更易于被动物消化的纤维素材料，并且添加随蒸馏器干燥向经处理的纤维素材料中加入干酒糟或具有可溶物的干酒糟。
WO 2012/027374披露了用以提高动物饲料的消化率的酶以及这些酶的组合物。
对于可增加纤维素材料的消化率的方法仍然存在需求。
发明概述
在第一方面中，本发明涉及一种用于生产动物饲料的方法，该方法包括：
(a)对纤维素材料进行预处理，以分离和/或释放纤维素、半纤维素和/或木质素；
(b)用至少一种芽孢杆菌(Bacillus)接种经过预处理的纤维素材料；
(c)对经过接种的预处理的纤维素材料进行孵育；并且
(d)向经过预处理的纤维素材料加入蛋白源，以生产该动物饲料；
其中步骤(d)是在步骤(a)、(b)或(c)之后发生的，或与步骤(b)或(c)同时发生。
在第二方面中，本发明涉及一种用于生产动物饲料的方法，该方法包括：
(a)对纤维素材料进行预处理，用以分离和/或释放纤维素、半纤维素和/或木质素；
(b)用至少一种微生物接种经过预处理的纤维素材料；
(c)将经过接种的预处理的纤维素材料在基本上厌氧的条件下进行孵育；并且
(d)用至少一种酶对经过预处理的纤维素材料进行处理；并且
(e)向经过预处理的纤维素材料加入蛋白源，以生产该动物饲料；
其中步骤(d)是在步骤(a)、(b)、(c)或(e)之后发生的，或与步骤(b)、(c)或(e)同时发生，并且步骤(e)是在步骤(a)、(b)、(c)或(d)之后发生的，或与步骤(b)、(c)或(d)同时发生。
在第三方面中，本发明涉及一种用于生产动物饲料的方法，该方法包括：
(a)对纤维素材料进行预处理，用以分离和/或释放纤维素、半纤维素和/或木质素；
(b)在pH7.5-11下，例如在pH8-10下，用一种或多种酶对经过预处理的纤维素材料进行处理，这个或这些酶选自于由以下各项组成的组：乙酰木聚糖酯酶，α-L-阿拉伯呋喃糖酶，β-葡糖苷酶，β-木糖苷酶，纤维二糖水解酶，纤维二糖脱氢酶，内切半乳糖苷酶，内切葡聚糖酶，阿魏酸酯酶，以及木聚糖酶。
(c)向经过预处理的纤维素材料加入蛋白源，以生产该动物饲料，其中步骤(c)是在步骤(a)或(b)之后发生的，或与步骤(b)同时发生。
本发明的方法可增加纤维素材料的可消化性。
在第四方面中，本发明涉及包括由本发明的方法生产的纤维素材料的动物饲料添加剂和组合物以及一种蛋白源。
在一个最后实施例中，本发明涉及用于增加玉米秸秆的消化率的一种组合物，该组合物包括至少一种微生物，该微生物能够在基本上厌氧的条件下接种一种经过化学处理的玉米秸秆。
定义
乙酰木聚糖酯酶：术语“乙酰木聚糖酯酶(Acetylxylan Esterase)”的意思是一种羧酸酯酶(EC3.1.1.72)，其催化乙酰基自聚合木聚糖、乙酰化木糖、乙酰化葡萄糖、α-萘基乙酸酯、和对硝基苯基乙酸酯的水解。为了本发明的目的，用0.5mM对硝基苯基乙酸酯作为底物，在含有0.01％TWEENTM20(聚氧乙烯山梨醇酐月桂酸酯)的50mM乙酸钠(pH5.0)中，对乙酰木聚糖酯酶的活性进行测定。一个单位的乙酰木聚糖酯酶被定义成是能够在pH5和25℃的条件下每分钟释放1微摩尔对硝基酚盐阴离子的酶量。
α-L-阿拉伯呋喃糖酶：术语“α-L-阿拉伯呋喃糖酶(α-L-Arabinofuranosidase)”的意思是一种α-L-阿拉伯呋喃糖苷阿拉伯呋喃糖水解酶(EC3.2.1.55)，其催化在α-L-阿拉伯糖苷中的末端非还原性α-L-阿拉伯呋喃糖苷残基的水解。该酶作用于α-L-阿拉伯呋喃糖苷、含有(1,3)-和/或(1,5)-键的α-L-阿拉伯聚糖、阿拉伯木聚糖以及阿拉伯半乳聚糖。已知α-L-阿拉伯呋喃糖酶还已知为阿拉伯糖苷酶、α-阿拉伯糖苷酶、α-L-阿拉伯糖苷酶、α-阿拉伯呋喃糖酶、多糖α-L-阿拉伯呋喃糖酶、α-L-阿拉伯呋喃糖苷水解酶、L-阿拉伯糖苷酶、或α-L-阿拉伯聚糖酶。为了本发明的目的，对α-L-阿拉伯呋喃糖酶活性进行测定，该测定使用在每毫升的100mM乙酸钠(pH5)溶液中的5mg中等粘度小麦阿拉伯糖基木聚糖(MegazymeInternational Ireland，Ltd.，Bray，Co.，威克洛郡，爱尔兰)，总体积是200微升，在40℃下持续30分钟，随后通过HPX-87H柱色谱法(美国伯乐公司(Bio-Rad Laboratories，Inc.)，赫拉克勒斯，CA，USA)进行阿拉伯糖分析。
α-葡萄糖醛酸酶：术语“α-葡萄糖醛酸酶(α-Glucuronidase)”是指可催化α-D-葡萄糖苷酸水解成为D-葡萄糖醛酸酯和醇的一种α-D-葡萄糖苷酸葡萄糖醛酸水解酶(EC3.2.1.139)。为了本发明的目的，可根据de Vries，1998，《细菌学杂志》(J.Bacteriol.)180：243-249的方法确定α-葡萄糖醛酸酶的活性。一个单位的α-葡萄糖醛酸酶等于在pH5、40℃的条件下每分钟能够释放1微摩尔葡萄糖醛酸或4-O-甲基葡萄糖醛酸的酶量。
淀粉酶：术语“淀粉酶(Amylase)”的意思是可水解低聚糖和多糖中的1,4-α-葡糖苷键的一种酶，包括下述类别的酶：α-淀粉酶(EC3.2.1.1)、β-淀粉酶(EC3.2.1.2)、葡糖淀粉酶(EC3.2.1.3)、α-葡糖苷酶(EC3.2.1.20)、G4-淀粉酶(EC3.2.1.60)、异淀粉酶(EC3.2.1.68)、G6-淀粉酶(EC3.2.1.98)、麦芽糖α-淀粉酶(EC3.2.1.133)、环糊精葡萄糖基转移酶(EC2.4.1.19)、以及淀粉酶III(EC2.4.1.161)。
β-葡糖苷酶：术语“β-葡糖苷酶(β-Glucosidase)”是指可催化末端非还原性β-D-葡萄糖残基的水解伴随释放β-D-葡萄糖的β-D-葡萄糖苷葡糖水解酶(E.C.3.2.1.21)。为了本发明的目的，使用对硝基苯基-β-D-吡喃葡糖苷作为底物对β-葡糖苷酶活性进行测定，其根据下述文献中的程序：Venturi等人，2002，“嗜热毛壳菌coprophilum亚种(Chaetomium thermophilum var.coprophilum)的细胞外β-D-葡糖苷酶：产生、纯化及一些生化特性”，《基础微生物学杂志》(J.Basic Microbiol.)42：55-66。一个单位的β-葡糖苷酶被定义为：在含有0.01％的50mM柠檬酸钠中，在25℃、pH4.8，从作为底物的1mM对硝基苯基-β-D-吡喃葡糖苷每分钟生成1.0微摩尔对硝基酚盐阴离子。
β-木糖苷酶：术语“β-木糖苷酶(β-Xylosidase)”是指可催化短β(1→4)-低聚木糖的外切水解而将连续的D-木糖残基从非还原端去除的一种β-D-木糖苷木糖水解酶(E.C.3.2.1.37)。为了本发明的目的，一个单位的β-木糖苷酶被定义为：在含有0.01％的100mM柠檬酸钠中，在40℃、pH5，从作为底物的1mM对硝基苯基-β-D-木糖苷每分钟生成1.0微摩尔对硝基酚盐阴离子。
纤维二糖水解酶：术语“纤维二糖水解酶(Cellobiohydrolase)”是指一种1,4-β-D-葡聚糖纤维二糖水解酶(E.C.3.2.1.91以及E.C.3.2.1.176)，可催化纤维素、纤维低聚糖或者任何含有β-1,4-连接葡萄糖的聚合物中的1,4-β-D-葡糖苷键的水解，从而从链的还原端或非还原端释放纤维二糖(Teeri，1997，“结晶纤维素的降解：纤维二糖水解酶的新观点”，《生物技术趋势》(Trendsin Biotechnology)15：160-167；Teeri等人，1998，“里氏木霉(Trichodermareesei)纤维二糖水解酶：为何如此高效作用于结晶纤维素？”，《生物化学协会学报》(Biochem.Soc.Trans.)26：173-178)。按照下述文献中描述的程序对纤维二糖水解酶的活性进行测定：Lever等人，1972，《分析生物化学》(Anal.Biochem.)47：273-279；van Tilbeurgh等人，1982，《欧洲生化学会联合会快报》(FEBS Lett.)，149：152-156；van Tilbeurgh和Claeyssens，1985，《欧洲生化学会联合会快报》(FEBS Lett.)，187：283-288；以及Tomme等人，1988，《欧洲生物化学期刊》(Eur.J.Biochem.)170：575-581。在本专利中，采用Tomme等人的方法对纤维二糖水解酶的活性进行测定。
纤维素分解酶或纤维素酶：术语“纤维素分解酶(Cellulolytic Enzyme)”或“纤维素酶(Cellulase)”是指可对纤维素材料进行水解的一种或多种(例如数种)酶。这类酶包括内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、β-葡糖苷酶、或它们的组合。测定纤维素分解活性的两种基本方法包括：(1)测定总纤维素分解活性，以及(2)测定个体纤维素分解活性(内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶)，如在Zhang等人，“纤维素酶改进的前景：筛选与选择策略”，2006，《生物技术进展》(Biotechnology Advances)24：452-481中所述的。通常使用不溶性底物对总纤维素分解活性进行测定，包括沃特曼一号(Whatman№1)滤纸、微晶纤维素、细菌纤维素、藻类纤维素、棉花、经过预处理的木质纤维素等。最常用的总纤维素分解活性测定法是使用沃特曼一号滤纸作为底物的滤纸测定法。该测定法是由国际纯粹与应用化学联合会(IUPAC)建立的(Ghose，1987，“纤维素酶活性的测定”，《纯粹与应用化学》(Pure Appl.Chem.)59：257-68)。
为了本发明的目的，通过在下述条件下由纤维素分解酶测定的纤维素材料水解的升高来确定纤维素分解酶的活性：在PCS中(或其他经过预处理的纤维素材料)1-50mg纤维素分解酶蛋白/g纤维素，，在合适的温度下，例如50℃、55℃或60℃，持续3-7天，与不添加纤维素分解酶蛋白的对照组的水解相比较。典型的条件是：1ml反应，洗涤或未洗涤的PCS，5％不溶性固形物，50mM乙酸钠，pH5，1mM MnSO4，50℃、55℃或60℃，72小时，由HPX-87H柱(美国伯乐公司(Bio-Rad Laboratories，Inc.)，赫拉克勒斯，CA，USA)进行糖分析。
纤维素材料：术语“纤维素材料(Cellulosic Material)”是指任何含有纤维素的材料。在生物质的初生细胞壁中的主要的多糖是纤维素，第二最丰富的是半纤维素，第三是果胶。细胞停止生长之后生成的次生细胞壁还含有多糖，并通过聚合木质素与半纤维素共价交联而被加强。纤维素是脱水纤维二糖的均聚物，并且由此是一种线性β-(1-4)-D-葡聚糖，而半纤维素包括多种化合物，如木聚糖、木葡聚糖、阿拉伯木聚糖、以及甘露聚糖，以具有一系列取代基的复杂支链结构而存在。虽然纤维素一般是多形性的，但是植物组织中发现的纤维素主要是一种平行葡聚糖链的不溶性晶体基质。半纤维素通常与纤维素以及其它半纤维素以氢键连接，这有助于稳定细胞壁基质。
内切葡聚糖酶：术语“内切葡聚糖酶(Endoglucanase)”是指内切-1,4-(1,3；1,4)-β-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶(E.C.3.2.1.4)，其催化纤维素、纤维素衍生物(如羧甲基纤维素和羟乙基纤维素)、地衣淀粉中的1,4-β-D-糖苷键，混合的β-1,3-葡聚糖如谷物β-D-葡聚糖或木葡聚糖、以及其它含有纤维素组分的植物材料中的β-1,4-键的内切水解。可通过测定底物粘度的下降或通过还原糖测定法测定的游离端的增加来确定内切葡聚糖酶的活性(Zhang等人，2006，《生物技术进展》(Biotechnology Advances)24：452-481)。为了本发明的目的，使用羧甲基纤维素(CMC)作为底物，根据在Ghose，1987，《纯粹与应用化学》(Pure and Appl.Chem.)59：257-268中所述的过程，在pH5、40℃下，确定内切葡聚糖酶的活性。
家族61的糖苷水解酶：术语“家族61的糖苷水解酶(Family61GlycosideHydrolase)”或“家族GH61”或“GH61”是指属于根据Henrissat，1991，“基于氨基酸序列的相似之的糖基水解酶的分类”，《生物化学期刊》(Biochem.J.)280：309-316，以及Henrissat和Bairoch，1996，“基于序列的糖基水解酶的分类的更新”，《生物化学期刊》(Biochem.J.)316：695-696的糖苷水解酶家族61的一种多肽。基于在一个家族成员中的极弱的内切1,4-β-D-葡聚糖酶的活性的测定，这个家族中的酶最初被分类为是一种糖苷水解酶家族。这些酶的结构和作用模式是不标准的，并且它们不能被视为真正的糖苷酶。然而，基于它们在与纤维素酶或纤维素酶的混合物一起使用时可提高木素纤维素的分解，它们被分在CAZy分类中。
阿魏酰酯酶：术语“阿魏酰酯酶(Feruloyl Esterase)”是指一种4-羟基-3-甲氧基肉桂酰基-糖水解酶(EC3.1.1.73)，可催化4-羟基-3-甲氧基肉桂酰基(阿魏酰)基团从酯化糖(通常是在天然生物质底物中的阿拉伯糖)上的水解，以产生阿魏酸酯(4-羟基-3-甲氧基肉桂酸酯)。阿魏酰酯酶也被称为阿魏酸酯酶、羟基肉桂酰基酯酶、FAE-III、肉桂酰酯水解酶、FAEA、cinnAE、FAE-I、或FAE-II。为了本发明的目的，使用0.5mM对硝基苯阿魏酸酯作为底物在50mM乙酸钠中在pH5.0对阿魏酰酯酶的活性进行测定。一个单位的阿魏酰酯酶相当于是能够在pH5和25℃每分钟释放1微摩尔对硝基酚盐阴离子的酶量。
半纤维素分解酶或半纤维素酶：术语“半纤维素分解酶(HemicellulolyticEnzyme)”或“半纤维素酶(Hemicellulase)”是指可对半纤维素材料进行水解的一种或多种(例如数种)酶。参见例如Shallom和Shoham，2003，“微生物半纤维素酶”，《医学病毒学评论》(Current Opinion In Microbiology)6(3)：219-228)中所述的。半纤维素酶是在植物生物质的降解中的关键组分。半纤维素酶的实例包括但不限于乙酰甘露聚糖酯酶、乙酰木聚糖酯酶、阿拉伯聚糖酶、阿拉伯呋喃糖酶、香豆酸酯酶、阿魏酰酯酶、半乳糖苷酶、葡萄糖醛酸酶、葡糖醛酸酯酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、木聚糖酶和木糖苷酶。这些酶的底物——半纤维素——是支链和直链多糖的异质性组，其可通过氢键与植物细胞壁中的纤维素微纤维相结合，交联成坚固的网络。半纤维素还可与木质素共价连接，与纤维素一起形成一种高度复杂的结构。半纤维素的可变结构和组织需要许多酶的协同作用来使其完全降解。半纤维素酶的催化模式是水解糖苷键的糖苷水解酶(GHs)、或水解醋酸酯或阿魏酸侧基团的酯键的碳水化合物酯酶(CEs)。这些催化模式可基于其主要序列的同源性而被分配到GH和CE家族中。具有总体上相似的折叠的某些家族可被分成族，按字母顺序进行标记(例如GH-A)。在碳水化合物活性酶(CAZy)数据库中可得到这些酶以及碳水化合物活性酶的最翔实和更新的分类。可根据Ghose和Bisaria，1987，《纯粹与应用化学》(Pure&AppI.Chem.)59：1739-1752中所述的方法在合适的温度(例如50℃、55℃或60℃)和pH(例如5.0或5.5)下对半纤维素分解酶的活性进行测定。
木质素分解酶：术语“木质素分解酶(ligninolytic enzyme)”是指可水解木质素聚合物的结构的一种酶。可分解木质素的酶包括木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶、漆酶和阿魏酰酯酶，以及在本领域中描述的已知可解聚或以其他方式分解木质素聚合物的其它酶。还包括能够水解在半纤维素糖类(主要是阿拉伯糖)与木质素之间形成的键的酶。
脂酶：术语“脂酶(Lipase)”是指可水解脂质、脂肪酸、以及包括磷酸甘油脂、脂蛋白、二酰基甘油等在内的酰基甘油酯的酶。在植物中，脂质被用作结构组分来限制失水和病原体感染。这些脂质包括由脂肪酸衍生的蜡，以及角质和软木脂。脂酶包括下述类别的酶：三酰甘油脂肪酶(EC3.1.1.3)、磷脂酶A2(EC3.1.1.4)、溶血磷脂酶(EC3.1.1.5)、酰基甘油脂肪酶(EC3.1.1.23)、半乳糖脂酶(EC3.1.1.26)、磷脂酶A1(EC3.1.1.32)、二氢香豆素脂肪酶(EC3.1.1.35)、2-乙酰-1-烷基甘油磷酸胆碱酯酶(EC3.1.1.47)、磷脂酰肌醇脱酰酶(EC3.1.1.52)、角质酶(EC3.1.1.74)、磷脂酶C(EC3.1.4.3)、磷脂酶D(EC3.1.4.4)、1-磷脂酰肌醇磷酸二酯酶(EC3.1.4.10)、以及烷基甘油磷酸乙醇胺磷酸二酯酶(EC3.1.4.39)。
微生物：术语“微生物(Microorganism)”是指任何生物，包括细菌以及包括酵母和丝状真菌的真菌生物，适用于提高纤维素材料的消化率。微生物的实例包括细菌生物，如来自芽孢杆菌属的细菌，以及真菌生物，如酵母。
具有纤维素分解增强活性的多肽：术语“具有纤维素分解增强活性的多肽(Polypeptide Having Cellulolytic Enhancing Activity)”指的是GH61多肽，其催化促进由具有纤维素分解活性的酶对纤维素材料的水解。为了本发明的目的，通过在以下条件下对纤维素分解酶水解纤维素材料生成的还原糖的增加或总共的纤维二糖和葡萄糖的增加进行测定来确定纤维素分解增强活性：在PCS中1-50mg总蛋白/g纤维素，其中总蛋白包括50-99.5％w/w的纤维素分解酶蛋白和0.5-50％w/w的具有有纤维素分解增强活性的GH61多肽的蛋白，在合适的温度(例如50℃、55℃或60℃)以及pH(例如5.0或5.5)下，持续1-7天，与不具有纤维素分解增强活性的相等总蛋白装载的对照水解(在PCS中，1-50mg纤维素分解蛋白/g纤维素)相比较。在一个实施例中，混合物1.5L(诺维信公司(诺维信公司(NovozymesA/S))，丹麦)中，存在2％-3％的总蛋白重量的米曲霉(Aspergillusoryzae)β-葡糖苷酶(根据WO02/095014在米曲霉(Aspergillus oryzae)中重组生成)或2％-3％的总蛋白重量的烟曲霉(Aspergillus fumigatus)β-葡糖苷酶(如在WO02/095014中所述的在米曲霉(Aspergillus oryzae)中重组生成)的纤维素酶装载，被用作纤维素分解活性的来源。
具有纤维素分解增强活性的GH61多肽可通过降低达到相同的水解程度所需要的纤维素分解酶量而来增强由具有纤维素分解活性的酶所催化的纤维素材料的水解，如至少1.01倍，例如至少1.05倍、至少1.10倍、至少1.25倍、至少1.5倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少10倍、或至少20倍。
经过预处理的玉米秸秆：术语“PCS”或“经过预处理的玉米秸秆(Pretreated Corn Stover)”指的是通过热处理以及稀硫酸、碱预处理或中性预处理的来源于玉米秸秆的一种纤维素材料。
蛋白酶：术语“蛋白酶(Protease)”指的是水解肽键的一种酶(肽酶)，以及水解肽与其它部分之间的键的酶类，如糖类(糖肽酶)。许多蛋白酶是在EC3.4下表征的，并且通过引用结合在此。一些特定类型的蛋白酶包括半胱氨酸蛋白酶，包括胃蛋白酶、木瓜蛋白酶和丝氨酸蛋白酶，包括糜蛋白酶、羧肽酶和金属内肽酶。
含木聚糖的材料：术语“含木聚糖的材料(Xylan-containing Material)”是指包括含有β-(1-4)-连接的木糖残基的主链的植物细胞壁多糖的任何材料。陆生植物的木聚糖是具有β-(1-4)-D-吡喃木糖主链的杂聚物，可由短的碳水化合物链形成分枝。它们包括D-葡糖醛酸或其4-O-甲基醚、L-阿拉伯糖和/或不同寡糖，由D-木糖、L-阿拉伯糖、D-或L-半乳糖和D-葡萄糖构成。木聚糖类型的多糖可分为均聚木聚糖和杂木聚糖，其包括葡糖醛酸木聚糖、(阿糖基)葡糖醛酸木聚糖、(葡糖醛酸基)阿拉伯木聚糖、阿拉伯木聚糖、以及复合杂木聚糖。参见例如：Ebringerova等人，2005，《聚合物科学进展》(Adv.Polym.Sci.)186：1-67。
在本发明的方法中，可以使用含有木聚糖的任何材料。在一个实施例中，所述含木聚糖的材料是木素纤维素。
木聚糖降解活性或木聚糖分解活性：术语“木聚糖降解活性(XylanDegrading Activity)”或“木聚糖分解活性(Xylanolytic Activity)”是指水解含木聚糖的材料的生物活性。测定木聚糖分解活性的两种基本方法包括：(1)测定总木聚糖分解活性，以及(2)测定单独的木聚糖分解活性(例如内切木聚糖、β-木糖苷酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、α-葡萄糖醛酸酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酰酯酶和α-葡糖醛酸基酯酶)。在许多刊物中对在木聚糖分解酶的最近进展进行了总结，包括：Biely和Puchard，2006，“木聚糖酶的检测的最新进展”，《食品科学与农业科学杂志》(Journal of the Science of Food andAgriculture)86(11)：1636-1647；Spanikova和Biely，2006，“葡糖醛酸酯酶——由裂褶菌(Schizophyllum commune)生成的新型碳水化合物酯酶”，《欧洲生化学会联合会快报》(FEBS Letters)580(19)：4597-4601；Herrmann等人，1997，“里氏木霉(Trichoderma reesei)的BITA-D-木糖苷酶是一种多功能β-D-木聚糖木糖水解酶”，《生物化学杂志》(Biochemical Journal)321：375-381。
可通过测定由不同类型的木聚糖(包括例如燕麦、山毛榉和落叶松的木聚糖)形成的还原糖，或通过光度测定从不同共价染色的木聚糖释放出的染色的木聚糖片段，来对总木聚糖降解活性进行测定。最常见的总木聚糖分解活性测定是基于从多聚4-O-甲基葡糖醛酸木聚糖生成还原糖，如在Bailey等人，1992，“Interlaboratory testing of methods for assay of木聚糖酶活性的实验室比对检测方法”，《生物技术杂志》(Journal of Biotechnology)23(3)：257-270中所述的。用0.2％的AZCL-阿拉伯糖基木聚糖作为底物，在0.01％的X-100(4-(1,1,3,3-四甲基丁基)苯基-聚乙二醇)和200mM的磷酸钠缓冲液中，在pH6、37℃下，对木聚糖酶的活性进行测定。一个单位的木聚糖酶活性被定义为在200mM磷酸钠缓冲液(pH6)中，在37℃、pH6下，从0.2％AZCL-阿拉伯糖基木聚糖底物中每分钟生成1.0微摩尔天青精。
为了本发明的目的，通过在以下典型条件下由木聚糖降解酶对桦木木聚糖(Sigma化学公司，公司，圣路易斯，MO，USA)的水解的增加的测定来确定木聚糖降解活性：1ml的反应，5mg/ml的底物(总固形物)，5mg木聚糖分解蛋白/g底物，50mM的醋酸钠(pH5)，50℃，24小时，使用对羟基苯甲酸酰肼(PHBAH)测定法的糖分析，如Lever，1972，“碳水化合物比色测定的新型反应”，《分析生物化学》(Anal.Biochem.)47：273-279中所述的。
木聚糖酶：术语“木聚糖酶(Xylanase)”指的是1,4-β-D-木聚糖-木糖水解酶(E.C.3.2.1.8)，其催化木聚糖中的1,4-β-D-木糖苷键的内切水解。为了本发明的目的，通过在37℃下、在0.01％的X-100和200mM的磷酸钠缓冲液(pH6)中、用0.2％AZCL-阿拉伯木聚糖作为底物，来确定木聚糖酶活性。一个单位的木聚糖酶被定义为在200mM磷酸钠缓冲液(pH6)中，在37℃、pH6下，从0.2％AZCL-阿拉伯糖基木聚糖底物中每分钟生成1.0微摩尔天青精。
发明详述
本发明涉及从纤维素材料生产动物饲料的方法。本发明还涉及能够使用一种或多种微生物和/或一种或多种酶来增加纤维素材料的消化率的组合物。
纤维素材料
纤维素材料可以是包含纤维素纤维的任何材料。这类材料的实例包括但不限于木材、稻草、干草、青草、如谷物青贮饲料、玉米青贮饲料、青草青贮饲料等青贮饲料、甘蔗渣等。包括纤维素纤维的合适的材料是农作物秸秆，例如玉米秸秆。纤维素通常见于例如植物的茎、叶、壳、皮，以及植物的穗轴或树的叶、枝和木材。纤维素材料可以是但不限于农业废弃物、草本材料(包括能源作物)、城市固体废物、纸浆和造纸厂废弃物、废纸、和木材(包括林业废弃物)(参见例如Wiselogel等人，1995，《生物乙醇手册》(Handbookon Bioethanol)(Charles E.Wyman，编者)，pp.105-118，Taylor&Francis，华盛顿D.C.；Wyman，1994，《生物资源技术》(Bioresource Technology)50：3-16；Lynd，1990，《应用生物化学与生物技术》(Applied Biochemistry andBiotechnology)24/25：695-719；Mosier等人，1999，“木质纤维素的生物转化的最近进展”，《生物化学工程/生物技术进展》(Advances in BiochemicalEngineering/Biotechnology)，T.Scheper，主编，第65卷，pp.23-40，施普林格出版公司(Springer-Verlag)，纽约)。在一个实施例中，该纤维素材料是任何生物质材料。在另一个方面中，该纤维素材料是木质纤维素，一种在混合基质中含有木质素、纤维素和半纤维素的植物细胞壁材料。含木质纤维素的材料通常见于例如植物的茎、叶、壳、皮，以及植物的穗轴或树的叶、枝和木材。木质纤维素材料也可以是但不限于草本材料、农业副产品(例如玉米秸秆、玉米纤维、大豆秸秆、大豆纤维、稻草、松木、刨花、杨木、麦秆、柳枝稷、甘蔗渣等)、传统上用于青贮的材料(例如绿色切碎的整个玉米、干草、苜蓿等)、林业废弃物、城市固体废物、废纸、以及纸浆和造纸厂废弃物。
在一个方面中，纤维素材料是一种农业废弃物。在另一个方面中，纤维素材料是草本材料(包括能源作物)。在另一个方面中，纤维素材料是城市固体废物。在另一个方面中，纤维素材料是纸浆和造纸厂废弃物。在另一个方面中，纤维素材料是废纸。在另一个方面中，纤维素材料是木材(包括林业废弃物)。
在另一个方面中，纤维素材料是芦竹。在另一个方面中，纤维素材料是甘蔗渣。在另一个方面中，纤维素材料是竹子。在另一个方面中，纤维素材料是玉米芯。在另一个方面中，纤维素材料是玉米纤维。在另一个方面中，纤维素材料是玉米秸秆。在另一个方面中，纤维素材料是芒草。在另一个方面中，纤维素材料是橘皮。在另一个方面中，纤维素材料是稻草。在另一个方面中，纤维素材料是柳枝稷。在另一个方面中，纤维素材料是小麦秸秆。
在另一个方面中，纤维素材料是白杨。在另一个方面中，纤维素材料是桉树。在另一个方面中，纤维素材料是杉木。在另一个方面中，纤维素材料是松树。在另一个方面中，纤维素材料是杨树。在另一个方面中，纤维素材料是云杉。在另一个方面中，纤维素材料是柳树。
在另一个方面中，纤维素材料是海藻纤维素。在另一个方面中，纤维素材料是细菌纤维素。在另一个方面中，纤维素材料是棉短绒。在另一个方面中，纤维素材料是滤纸。在另一个方面中，纤维素材料是微晶纤维素。在另一个方面中，纤维素材料是经过磷酸处理过的纤维素。
在另一个方面中，纤维素材料是一种水生生物质。如在此所用的，术语“水生生物质(Aquatic Biomass)”是指在水生环境中通过光合作用过程产生的生物质。水生生物质可以是藻类、挺水植物、浮叶植物、或沉水植物。
增加消化率的方法
本发明的方法可增加纤维素材料的消化率。为了确定消化率的增加，用本发明的方法对纤维素材料进行处理，确定可消化纤维素材料增加的百分数，并与不使用本发明的相同的方法进行处理的纤维素材料的消化率进行比较。
如果希望实现提高含纤维素纤维的材料的利用率，根据本发明的方法可与任何微生物或生物过程结合使用。本发明可用于但不限于生产家畜饲料。
本发明的方法可增加纤维素材料的消化率至少5％，例如至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％，直至100％。可根据如下讨论的体外真消化率(IVTD)方法来测定纤维素材料的增加的消化率。
预处理
本发明的方法的第一步是对纤维素材料进行预处理来分离和/或释放纤维素、半纤维素和/或木质素。可采用任何预处理过程来破坏纤维素材料的植物细胞壁组分(Chandra等人，2007，“基质预处理：木质纤维素的有效酶解的关键？”，《生物化学工程/生物技术进展》(Adv.Biochem.Engin./Biotechnol.)108:67-93，Galbe和Zacchi，2007，“用于高效生物乙醇生产的木质纤维素材料的预处理”，《生物化学工程/生物技术进展》(Adv.Biochem.Engin./Biotechnol.)108:41-65；Hendriks和Zeeman，2009，“增强木质纤维素生物质的消化率的预处理”，《生物资源技术》(BioresourceTechnology)100：10-18；Mosier等人，2005，“木质纤维素生物质预处理的有前景的技术特性”，《生物资源技术》(Bioresource Technology)96：673-686；Taherzadeh和Karimi，2008，“对木质纤维素废弃物进行预处理以改善乙醇和沼气生产：综述”，《分子科学国际杂志》(Int.J.Mol.Sci.)9：1621-1651；Yang和Wyman，2008，“预处理:开放低成本纤维素乙醇的关键”，《生物燃料、生物制品与生物精炼(Biofpr.)》(Biofuels Bioproducts andBiorefining-Biofpr.)2：26-40)。
还可在采用本领域已知的方法进行预处理之前对纤维素材料进行粒度缩分、筛分、预浸泡、润湿、洗涤和/或调节。
常规预处理包括但不限于热预处理(有或无爆炸)、稀酸预处理、热水预处理、碱性预处理、石灰预处理、湿氧化、湿爆炸、氨纤维爆炸、有机溶剂预处理以及生物预处理。另外的预处理包括氨渗滤、超声、电穿孔、微波、超临界CO2、超临界H2O、臭氧、离子液体、以及γ辐射预处理。
热预处理
在热预处理中，将纤维素材料加热来破坏植物细胞壁组分，包括木质素、半纤维素和纤维素，使纤维素和例如半纤维素等其它部分与酶接触。将纤维素材料传送到或通过反应容器，其中注入蒸汽以增加温度至所需温度和压力，并在其中保持所需的反应时间。在140℃-250℃，例如160℃-200℃或170℃-190℃，进行适当的热预处理，其中最佳温度范围取决于化学催化剂的添加。热预处理的保留时间是例如1-60分钟，如1-30分钟、1-20分钟、3-12分钟或4-10分钟，其中最佳停留时间取决于温度范围和化学催化剂的添加。热预处理允许相对高的固体负载，从而使纤维素材料通常在预处理过程中仅被湿润。热预处理往往与材料在预处理之后的爆炸性排出相结合，被称为蒸汽爆炸，即快速闪蒸(rapid flashing)至大气压力以及材料湍流，以通过碎裂增加可达到表面的面积(Duff和Murray，1996，《生物资源技术》(Bioresource Technology)855：1-33；Galbe and Zacchi，2002，《应用微生物学与生物技术》(Appl.Microbiol.Biotechnol.)59：618-628；美国专利申请公开号2002/0164730)。在热预处理过程中，半纤维素乙酰基团被剪切，并且所得的酸可自催化半纤维素部分水解成为单糖和低聚糖。仅有限程度地除去木质素。
化学、机械和/或生物预处理
可对纤维素材料进行化学、机械和/或生物预处理。机械处理(通常被称为物理预处理)可单独使用或与其它预处理组合使用。
可以在微生物和/或酶处理之前对经过预处理的纤维素材料进行清洗和/或解毒。这可以改善例如对经过碱处理的纤维素材料，如玉米秸秆的处理。可以任何合适的方式进行解毒，例如通过蒸汽汽提、挥发、离子交换、液体馏分的树脂或的炭处理、或通过洗涤经过预处理的材料。
化学预处理
术语“化学处理”是指可促进纤维素、半纤维素和/或木质素的分离和/或释放的任何化学预处理。这样的预处理可以将结晶纤维素转化为无定形纤维素。合适的化学预处理方法的实例包括例如稀酸预处理、石灰预处理、湿氧化、氨纤维/冷冻爆炸(AFEX)、氨渗滤(APR)、离子液体、以及有机溶剂预处理。其它合适的化学预处理方法是采用氧化钙、氢氧化钠、氨和/或它们的组合的处理。
在热预处理之前往往加入一种催化剂，如H2SO4或SO2(典型为0.3至5％w/w)，从而减少时间和温度，增加回收，并改善酶水解((Ballesteros等人，2006，《应用生物化学生物工程》(Appl.Biochem.Biotechnol.)129-132：496-508；Varga等人，2004，《应用生物化学生物工程》(Appl.Biochem.Biotechnol.)113-116：509-523；Sassner等人，2006，《酶与微生物技术》(EnzymeMicrob.Technol.)39：756-762)。在稀酸预处理中，将纤维素材料与稀酸(通常为H2SO4)和水混合以形成浆料，用蒸汽加热至所需要的温度，停留一段时间之后，闪蒸至大气压力。可采用多种反应器设计来进行稀酸预处理，例如活塞流反应器、逆流反应器或连续逆流收缩床反应器(Duff和Murray，1996，supra；Schell等人，2004，《生物资源技术》(Bioresource Technology)91：179-188；Lee等人，1999，《生物化学工程/生物技术进展》(Adv.Biochem.Engin./Biotechnol.)65：93-115)。
还可以使用在碱性条件下的几种预处理方法。这些碱性预处理包括但不限于氢氧化钠、石灰、湿氧化、氨渗滤(APR)与氨纤维/冷冻爆炸(AFEX)。
用氧化钙或氢氧化钙在温度85℃-150℃下进行石灰预处理，停留时间是从1小时至数天(Wyman等人，2005，《生物资源技术》(BioresourceTechnology)96：1959-1966；Mosier等人，2005，《生物资源技术》(BioresourceTechnology)96：673-686)。WO 2006/110891、WO 2006/110899、WO2006/110900和WO 2006/110901公开了使用氨的预处理方法。
湿式氧化法是典型地在加入如过氧化氢等氧化试剂或过压的氧气、在180℃-200℃下进行5-15分钟的热预处理(Schmidt和Thomsen，1998，《生物资源技术》(Bioresource Technology)64：139-151；Palonen等人，2004，《应用生物化学与生物技术》(Appl.Biochem.Biotechnol.)117：1-17；Varga等人，2004，《生物技术与生物工程》(Biotechnol.Bioeng.)88：567-574；Martin等人，2006，《化学技术和生物技术杂志》(J.Chem.Technol.Biotechnol.)81：1669-1677)。例如在1％-40％干物质，例如在2％-30％的干物质或5％-20％的干物质中，进行预处理，并往往通过加入如碳酸钠等碱而使初始pH升高。
湿氧化预处理方法的改进，称为湿爆炸(湿氧化与蒸汽爆炸的组合)，可处理多达30％的干物质。在湿爆炸中，氧化剂是在预处理过程中经过一定的停留时间之后引入的。然后通过闪蒸至大气压来结束预处理(WO2006/032282)。
氨纤维爆炸(AFEX)包括用液体或气态氨在如90℃-150℃等中等温度下和例如17-20巴等高压下对纤维素材料处理5-10分钟，其中干物质含量可高达60％(Gollapalli等人，2002，《应用生物化学与生物技术》(Appl.Biochem.Biotechnol.)98：23-35；Chundawat等人，2007，《生物技术与生物工程》(Biotechnol.Bioeng.)96：219-231；Alizadeh等人，2005，《应用生物化学与生物技术》(Appl.Biochem.Biotechnol.)121：1133-1141；Teymouri等人，2005，《生物资源技术》(Bioresource Technology)96：2014-2018)。在AFEX预处理过程中，纤维素和半纤维素保持相对完好。木质素-碳水化合物复合物被裂解。
有机溶剂预处理可通过使用乙醇水溶液(40％-60％ethanol)在160℃-200℃下萃取30-60分钟使纤维素材料去木质化(Pan等人，2005，《生物技术与生物工程》(Biotechnol.Bioeng.)90：473-481；Pan等人，2006，《生物技术与生物工程》(Biotechnol.Bioeng.)94：851-861；Kurabi等人，2005，《应用生物化学与生物技术》(Appl.Biochem.Biotechnol.)121：219-230)。通常加入硫酸作为催化剂。在有机溶剂预处理中，大部分半纤维素和木质素被去除。
合适的预处理的其他实例如在下述文献中所述的：Schell等人，2003，《应用生物化学与生物技术》(Appl.Biochem.and Biotechnol.)105-108：69-85，和Mosier等人，2005，《生物资源技术》(Bioresource Technology)96：673-686，以及美国专利申请公开号2002/0164730。
在一个方面中，化学预处理可以是稀酸处理，例如持续稀酸处理。酸通常为硫酸，但也可使用其它酸，如乙酸、柠檬酸、硝酸、磷酸、酒石酸、琥珀酸、盐酸、或它们的混合物。温和酸处理在pH1-5的范围内进行的，例如1-4或1-2.5。在一个方面中，酸浓度在0.01至10wt.％的酸的范围内，例如0.05至5wt.％的酸或0.1至2wt.％的酸。酸与纤维素材料接触，并且在温度140℃-200℃的范围内，例如165℃-190℃，进行1到60分钟范围的时间。
在另一个方面中，在水性浆料中发生预处理。在其他实施例中，在预处理过程中存在的纤维素材料的量是在10-80wt.％之间，例如20-70wt.％或30-60wt.％，例如大约40wt.％。经过预处理的纤维素材料可被洗涤或不洗涤，使用本领域中已知的任何方法，例如用水洗。
机械预处理
术语“机械预处理”或“物理预处理”是指可促进粒度缩分的任何预处理。例如，这样的预处理可以涉及不同类型的研磨或碾磨(例如，干磨、湿磨或振动球磨)。
可对该纤维素材料进行物理(机械)和化学预处理。机械或物理预处理可配合汽蒸/蒸汽爆炸、水热解、稀酸或弱酸处理、高温、高压处理、照射(例如微波照射)，或它们的组合。在一个方面中，高压是指在大约100至大约400psi的范围内的压力，例如约150至约250psi。在另一个方面中，高温意指温度在大约100至大约300℃，例如大约140至大约200℃。在一个方面中，机械的或物理预处理是以批量处理进行的，采用使用如上定义的高压和高温的蒸汽枪水解系统，例如瑞典的Sunds Defibrator AB的Sunds水解器。物理和化学预处理可以按需要按顺序进行或同时进行。
因此，在一个方面中，对纤维素材料进行物理(机械)或化学预处理或其任意组合，以促进纤维素、半纤维素和/或木质素的分离和/或释放。
联合的化学和机械预处理
在本发明的一个实施例中，化学和机械预处理涉及例如稀酸或弱酸预处理以及高温和高压处理。化学和机械预处理可以按需要按顺序进行或同时进行。
因此，在一个实施例中，对纤维素材料进行化学和机械预处理两者，以促进纤维素、半纤维素和/或木质素的分离和/或释放。
生物预处理
术语“生物预处理(Biological Pretreatment)”是指可促进纤维素、半纤维素和/或木质素从纤维素材料分离和/或释放的任何生物预处理。生物预处理技术可涉及施加可溶解木质素的微生物和/或酶(参见例如Hsu，T.-A.，1996，“生物质的预处理”，《生物乙醇手册:生产和利用》(Handbook onBioethanol：Production and Utilization)，Wyman，C.E.，ed.，Taylor&Francis，华盛顿，DC，179-212；Ghosh和Singh，1993，“纤维素类生物质的酶/微生物纤维素转化的物理化学和生物处理”，《应用微生物学进展》(Adv.Appl.Microbiol.)39：295-333；McMillan，J.D.，1994，“纤维素类生物质的预处理：综述”，《用于燃料生产的生物质的酶转化》(Enzymatic Conversion ofBiomass for Fuels Production)，Himmel，M.E.，Baker，J.O.，和Overend，R.P.，eds.，“ACS论文集566系列，美国化学学会(ACS Symposium Series566，American Chemical Society)”，华盛顿，DC，第15章；Gong，C.S.，Cao，N.J.，Du，J.，和Tsao，G.T.，1999，“来自可再生资源的乙醇生产”，《生物化学工程/生物技术进展》(Advances in BiochemicalEngineering/Biotechnology)，Scheper，T.，ed.，施普林格出版社(Springer-Verlag)，柏林，海德堡，德国，65：207-241；Olsson和Hahn-Hagerdal，1996，“用于乙醇生产的木质纤维素水解产物的发酵”，《酶与微生物技术》(Enz.Microb.Tech.)18：312-331；以及Vallander和Eriksson，1990，“从木质纤维素材料生产乙醇：当前发展状况”，《生物化学工程/生物技术进展》(Adv.Biochem.Eng./Biotechnol.)42：63-95)。
经过预处理的纤维素材料的微生物处理
在本发明的一些方面中，用至少一种微生物接种经过预处理的纤维素材料，并且对接种了微生物的材料进行孵育。
微生物可以在细菌、酵母或真菌或它们的混合物中进行选择。微生物的实例包括下述属的菌株：不动杆菌属(Acinetobacter)、曲霉属(Aspergillus)、芽孢杆菌属(Bacillus)、肠杆菌属(Enterobacter)、乳杆菌属(Lactobacillus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、以及红球菌属(Rhodococcus)，如鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumanii)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillusoryzae)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、溶解肠杆菌(Enterobacter dissolvens)、Pseudomonasasntarctica、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、门多萨假单胞菌(Pseudomonas mendocina)、蒙氏假单胞菌(Pseudomonas monteilii)、变形假单胞菌(Pseudomonas plecoglossicida)、假单孢菌(Pseudomonaspseudoacaligenes)、噁唑基臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、和嗜吡啶红球菌(Rhodococcus pyridinivorans)、以及其两种或更多种的任何组合。细菌生物包括芽孢杆菌属(Bacillus spp.)以及和乳杆菌属(Lactobacillus spp.)的菌株。具体地，芽孢杆菌属(Bacillus spp.)的菌株包括但不仅限于解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)、产氮芽孢杆菌(Bacillus azotoformans)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)、弯曲芽孢杆菌(Bacillus flexus)、梭形芽孢杆菌(Bacillusfusiformis)、球孢芽孢杆菌(Bacillus globisporus)、解葡糖芽孢杆菌(Bacillusglucanolyticus)、Bacillus infermus、左旋乳酸芽孢杆菌(Bacillus laevolacticus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、海洋芽孢杆菌(Bacillus marinus)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、莫海威芽孢杆菌(Bacillus mojavensis)、蕈状芽孢杆菌(Bacillus mycoides)、芽孢杆菌苍白球(Bacillus pallidus)、类短芽孢杆菌(Bacillus parabrevis)、巴氏芽孢杆菌(Bacillus pasteurii)、多粘芽孢杆菌(Bacillus polymyxa)、日本甲虫芽孢杆菌(Bacillus popiliae)、短小芽胞杆菌(Bacillus pumilus)、球形芽孢杆菌(Bacillus sphaericus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、淀粉芽孢杆菌(Bacillus thermoamylovorans)、或苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)。具体地，乳杆菌属(Lactobacillusspp.)包括但不限于耐酸乳杆菌(Lactobacillus acetotolerans)、嗜酸性乳杆菌(Lactobacillus acidifarinaei)、马里乳杆菌(Lactobacillus acidipiscis)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、能动乳杆菌(Lactobacillus agilis)、柄乳杆菌(Lactobacillus algidus)、食品乳杆菌(Lactobacillus alimentarius)、解淀粉类芽孢杆菌(Lactobacillus amylolyticus)、嗜淀粉乳杆菌(Lactobacillusamylophilus)、Lactobacillus amylotrophicus、食淀粉乳杆菌(Lactobacillusamylovorus)、动物双歧杆菌(Lactobacillus animalis)、Lactobacillus antri、Lactobacillus apodemi、鸟乳杆菌(Lactobacillus aviaries)、双发酵乳杆菌(Lactobacillus bifermentans)、短乳杆菌(Lactobacillus brevis)、布氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri)、Lactobacillus camelliae、干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)、链状乳杆菌(Lactobacillus catenaformis)、Lactobacillus ceti、Lactobacillus coleohominis、丘状菌落乳杆菌(Lactobacillus collinoides)、复合乳杆菌(Lactobacillus composti)、凹乳杆菌(Lactobacillus concavus)、棒状乳杆菌(Lactobacillus coryniformis)、卷曲乳酸杆菌(Lactobacilluscrispatus)、面包乳杆菌(Lactobacillus crustorum)、弯曲乳杆菌(Lactobacilluscurvatus)、德氏乳杆菌德氏亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp.delbrueckii)、德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus)、德氏乳杆菌乳酸亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp.lactis)、糊精乳杆菌(Lactobacillus dextrinicus)、Lactobacillus diolivorans、马乳杆菌(Lactobacillusequi)、同代乳杆菌(Lactobacillus equigenerosi)、Lactobacillus farraginis、香肠乳杆菌(Lactobacillus farciminis)、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)、Lactobacillus fornicalis、食果糖乳杆菌(Lactobacillus fructivorans)、Lactobacillus frumenti、Lactobacillus fuchuensis、禾口鸡乳杆菌(Lactobacillusgallinarum)、格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)、胃乳杆菌(Lactobacillusgastricus)、加纳乳杆菌(Lactobacillus ghanensis)、草乳杆菌(Lactobacillusgraminis)、Lactobacillus hammesii、仓鼠乳杆菌(Lactobacillus hamster)、哈尔滨乳杆菌(Lactobacillus harbinensis)、Lactobacillus hayakitensis、瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)、希氏乳杆菌(Lactobacillus hilgardii)、同型腐酒乳杆菌(Lactobacillus homohiochii)、惰性乳杆菌(Lactobacillus iners)、Lactobacillus ingluviei、肠乳杆菌(Lactobacillus intestinalis)、詹氏乳杆菌(Lactobacillus jensenii)、约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)、Lactobacilluskalixensis、马乳酒样乳杆菌(Lactobacillus kefiranofaciens)、开菲尔乳杆菌(Lactobacillus kefiri)、泡菜乳杆菌(Lactobacillus kimchii)、Lactobacilluskitasatonis、昆氏乳酸杆菌(Lactobacillus kunkeei)、赖氏乳杆菌(Lactobacillusleichmannii)、林氏乳酸杆菌(Lactobacillus lindneri)、坏发酵乳杆菌(Lactobacillus malefermentans)、马里乳杆菌(Lactobacillus mali)、Lactobacillus manihotivorans、Lactobacillus mindensis、粘膜乳杆菌(Lactobacillus mucosae)、小鼠乳杆菌(Lactobacillus murinus)、内氏乳杆菌(Lactobacillus nagelii)、Lactobacillus namurensis、Lactobacillus nantensis、寡发酵乳杆菌(Lactobacillus oligofermentans)、口乳杆菌(Lactobacillus oris)、潘尼斯乳杆菌(Lactobacillus panis)、Lactobacillus pantheris、短短乳杆菌(Lactobacillus parabrevis)、类布氏乳杆菌(Lactobacillus parabuchneri)、Lactobacillus paracollinoides、Lactobacillus parafarraginis、Lactobacillusparakefiri、类食品乳杆菌(Lactobacillus paralimentarius)、类植物乳杆菌(Lactobacillus paraplantarum)、戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus)、Lactobacillus perolens、植物乳酸杆菌(Lactobacillus plantarum)、蓬蒂斯乳杆菌(Lactobacillus pontis)、鹦鹉乳杆菌(Lactobacillus psittaci)、Lactobacillusrennin、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、雷曼氏乳酸杆菌(Lactobacillusrhamnosus)、龈沟乳杆菌(Lactobacillus rimae)、罗氏乳杆菌(Lactobacillusrogosae)、Lactobacillus rossiae、瘤胃乳酸杆菌(Lactobacillus ruminis)、Lactobacillus saerimneri、米酒乳杆菌(Lactobacillus sakei)、唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)、旧金山乳杆菌(Lactobacillus sanfranciscensis)、赤乳杆菌(Lactobacillus satsumensis)、Lactobacillus secaliphilus、Lactobacillussharpeae、Lactobacillus siliginis、Lactobacillus spicheri、猪双臼杆菌(Lactobacillus suebicus)、Lactobacillus thailandensis、Lactobacillus ultunensis、Lactobacillus vaccinostercus、阴道乳杆菌(Lactobacillus vaginalis)、Lactobacillus versmoldensis、Lactobacillus vini、小牛乳酸杆菌(Lactobacillusvitulinus)、玉米乳杆菌(Lactobacillus zeae)、Lactobacillus zymae。
在一个实施例中，施加到纤维素材料中的至少一种另外的微生物是芽孢杆菌属(Bacillus spp)的菌株。
在一个实施例中，施加到纤维素材料中的至少一种另外的微生物是乳杆菌(Lactobacillus spp)的菌株。
具体的菌株包括：芽孢杆菌属的菌株选自于由以下各项组成的组：ATCC700385、NRRL B-50136、NRRL B-50622、NRRL B-50623、NRRL B-50605、NRRL B-50621、NRRL B-50015、NRRL B-50607、NRRL B-50606、PTA-7543、PTA-7547，和/或它们的任何组合，包括两种以上，如至少三种上述菌株，至少四种上述菌株，至少五种上述菌株、至少六种上述菌株、至少七种上述菌株、至少八种上述菌株、至少九种上述菌株、至少十种上述菌株，最多达包括所有上述菌株。
酵母包括下述各项的菌株：酵母属(Saccharomyces)的，特别是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或葡萄汁酵母(Saccharomyces uvarum)；毕赤酵母属(Pichia)，特别是树干毕赤酵母(Pichia stipitis)，例如树干毕赤酵母(Pichia stipitis)CBS5773或巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)；念珠菌属(Candida)，特别是朊假丝酵母(Candida utilis)、迪丹假丝酵母(Candidadiddensii)或博伊丁假丝酵母(Candida boidinii)。其它设想的酵母包括下述各项的菌株：发酵单胞菌属(Zymomonas)，汉逊酵母(Hansenula)，特别是异常汉逊酵母(Hansenula anomala)；克鲁维酵母菌属(Klyveromyces)，特别是脆壁克鲁维酵母(Klyveromyces fragilis)；以及裂殖酵母(Schizosaccharomyces)，特别是粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)。
本领域技术人员将理解如何采用公知技术在本发明的方法中确定这些菌株的合适的量。在一个实施例中，菌株的加入量的范围是1.0×106至5.0×109CFU/g总固体量纤维素材料。在另一个实施例中，将喷雾干燥的孢子加入到纤维素材料中，加入量是5.0×107CFU/g总固体量纤维素材料。
可在厌氧、基本上厌氧(微氧)或有氧条件下适当进行孵育。简言之，厌氧是指缺乏氧气的环境，基本上厌氧(微氧)是指氧浓度低于空气的环境，有氧是指氧浓度约等于或大于空气的环境。基本上厌氧的条件包括例如培养、接种、分批发酵和/或连续发酵，使得培养基中的溶解氧浓度保持小于饱和度的10％。基本上厌氧的条件还包括如青贮条件(例如在筒仓、青贮堆、袋(真空密封袋或未密封袋)、捆包(包捆和/或解捆的捆包)和/或沙坑(覆盖和/或覆盖的沙坑)等中发生的条件)。基本上厌氧的条件还包括，在在密封室内，保持氧气小于1％的气氛中或在青贮条件下，使细胞在液体培养基中或固体琼脂上生长、接种、培养和/或休眠。可以通过例如向培养基喷洒N2/CO2混合物或其它合适的非氧气体或多种气体来维持氧气的百分比。在一些实施例中，培养和/或接种是在厌氧条件或基本上厌氧的条件下进行的。
孵育可发生在青贮条件下，包括但不限于孵育发生在筒仓、青贮堆、袋(真空密封袋或未密封袋)、和/或捆包(包捆和/或解捆的捆包)等中的条件。青贮条件包括如在此定义的厌氧或基本上厌氧的条件。在本发明的至少一个实施例中，青贮条件包括但不限于在发生筒仓、青贮堆、袋(真空密封袋或未密封袋)、捆包(包捆和/或解捆的捆包)和/或沙坑(覆盖和/或覆盖的沙坑)等中的条件。在此披露的一些实施例中，青贮接种是在厌氧条件或基本上厌氧的条件下进行的。
这个步骤的持续时间要考虑到以下来决定:应使孵育持续足够长的时间长度，以确保令人满意的纤维素材料的消化率。通常，发酵是厌氧的，并持续1至30天，例如从5至28天，从10至25天，特别是21天左右。已发现，使用这样孵育期，合适的纤维素材料的很大一部分被转换成一种更易消化的形式。
在这个步骤中的温度的选择应考虑到根据本发明使用的微生物或两种或更多种微生物的混合物的具体要求。通常，这个温度的选择范围是10℃至60℃，例如在15℃至50℃的范围内，在20℃至45℃的范围内，在25℃至40℃的范围内，尤其是在大约37℃。
经过预处理的纤维素材料的酶处理
在本发明的一些方面中，用选自下组的酶对经过预处理的纤维素材料进行处理，该组由以下各项组成：淀粉酶、碳水化物酶、过氧化氢酶、纤维素酶、β-葡聚糖酶、具有纤维素分解增强活性的GH61多肽、葡萄糖醛酸酶、半纤维素酶、漆酶、木质素分解酶、脂酶、果胶酶、过氧化物酶、植酸酶、蛋白酶、膨胀因子，和/或它们的任意组合，包括两种以上，如至少三种上述的酶，至少四种上述的酶，至少五种上述的酶、至少六种上述的酶、至少七种上述的酶、至少八种上述的酶、至少九种上述的酶，最多达并且包括所有上述的酶。
在酶处理步骤中，经过预处理的纤维素材料中的纤维素、半纤维素和/或木质素被分解。可以同时或依次加入这些酶。
酶处理可典型地在合适的水性环境中在本领域技术人员可容易地确定的条件下进行。在一个方面中，酶处理可在适合酶活性的条件下，即对酶的最佳条件下进行。这种处理可以补料分批或连续的过程来进行，其中纤维素材料，例如含有酶的水解溶液，是逐渐进料的。
通常在可控的pH、温度和混合的条件下在搅拌釜式反应器或发酵罐中进行处理。本领域技术人员可容易地确定合适的方法时间、温度和pH条件。例如，处理可以持续长达200小时，但典型地是大约12至大约120小时，例如大约16至大约72小时，或大约24至大约48小时。温度在大约25℃至大约70℃的范围内，例如，大约30℃至大约65℃，大约40℃至大约60℃，或大约50℃到大约55℃。pH值在大约3至大约8的范围内，例如大约3.5至大约7，大约4至大约6，或者大约5.0至大约5.5。干固体含量在大约5到大约50wt.％的范围内，例如大约10至大约40wt.％，或大约20到大约30wt.％。
酶组合物可包括在降解纤维素材料中有用的任何蛋白。
在一个方面中，酶组合物包括或进一步包括一种或多种(例如数种)选自下组的蛋白，该组由以下各项组成：纤维素酶、酯酶、棒曲霉素、具有纤维素分解增强活性的多肽GH61、半纤维素酶、漆酶、木质素分解酶、果胶酶、过氧化物酶、蛋白酶、以及膨胀因子(swollenin)。在另一个方面中，纤维素酶是选自下组的一种或多种(例如数种)酶，该组由以下各项组成：内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、以及β-葡糖苷酶。在另一个方面中，半纤维素酶是一种或多种(例如数种)选自下组的酶，该组由以下各项组成：乙酰甘露聚糖酯酶，乙酰木聚糖酯酶，阿拉伯聚糖酶(arabinanase)，阿拉伯呋喃糖苷酶，香豆酸酯酶，阿魏酰酯酶，半乳糖苷酶，葡萄糖醛酸酶，葡糖醛酸酯酶，甘露聚糖酶，甘露糖苷酶，木聚糖酶，以及木糖苷酶。
在另一个方面中，酶组合物包括一种或多种(例如数种)纤维素分解酶。在另一个方面中，酶组合物包括或进一步包括一种或多种(例如数种)半纤维素分解酶。在另一个方面中，酶组合物包括一种或多种(例如数种)纤维素分解酶、以及一种或多种(例如数种)半纤维素分解酶。在另一个方面中，酶组合物包括选自于下组的一种或多种(例如数种)酶：纤维素分解酶和半纤维素分解酶。在另一个方面中，酶组合物包括一种内切葡聚糖酶。在另一个方面中，酶组合物包括一种纤维二糖水解酶。在另一个方面中，酶组合物包括一种β-葡糖苷酶。在另一个方面中，酶组合物包括一种具有纤维素分解增强活性的多肽。在另一个方面中，酶组合物包括一种内切葡聚糖酶以及一种具有纤维素分解增强活性的多肽。在另一个方面中，酶组合物包括一种纤维二糖水解酶以及一种具有纤维素分解增强活性的多肽。在另一个方面中，酶组合物包括一种β-葡糖苷酶以及一种具有纤维素分解增强活性的多肽。在另一个方面中，酶组合物包括一种内切葡聚糖酶以及一种纤维二糖水解酶。在另一个方面中，酶组合物包括一种内切葡聚糖酶以及一种β-葡糖苷酶。在另一个方面中，酶组合物包括一种纤维二糖水解酶以及一种β-葡糖苷酶。在另一个方面中，酶组合物包括一种内切葡聚糖酶、一种纤维二糖水解酶、以及一种具有纤维素分解增强活性的多肽。在另一个方面中，酶组合物包括一种内切葡聚糖酶、一种β-葡糖苷酶、以及一种具有纤维素分解增强活性的多肽。在另一个方面中，酶组合物包括一种纤维二糖水解酶、一种β-葡糖苷酶、以及一种具有纤维素分解增强活性的多肽。在另一个方面中，酶组合物包括一种内切葡聚糖酶、一种纤维二糖水解酶、以及一种β-葡糖苷酶。在另一个方面中，酶组合物包括一种内切葡聚糖酶、一种纤维二糖水解酶、一种β-葡糖苷酶、以及一种具有纤维素分解增强活性的多肽。
在另一个方面中，酶组合物包括一种乙酰甘露聚糖酯酶。在另一个方面中，酶组合物包括一种乙酰木聚糖酯酶。在另一个方面中，酶组合物包括一种阿拉伯聚糖酶(例如α-L-阿拉伯聚糖酶)。在另一个方面中，酶组合物包括一种阿拉伯呋喃糖酶(例如α-L-阿拉伯呋喃糖酶)。在另一个方面中，酶组合物包括一种香豆酸酯酶。在另一个方面中，酶组合物包括一种阿魏酰酯酶。在另一个方面中，酶组合物包括一种半乳糖苷酶(例如α-半乳糖苷酶和/或β-半乳糖苷酶)。在另一个方面中，酶组合物包括一种葡萄糖醛酸酶(例如α-D-葡萄糖醛酸酶)。在另一个方面中，酶组合物包括一种葡糖醛酸酯酶。在另一个方面中，酶组合物包括一种甘露聚糖酶。在另一个方面中，酶组合物包括一种甘露糖苷酶(例如β-甘露糖苷酶)。在另一个方面中，酶组合物包括一种木聚糖酶。在一个实施例中，木聚糖酶是家族10的木聚糖酶。在另一个方面中，酶组合物包括一种木糖苷酶(例如β-木糖苷酶)。
在另一个方面中，酶组合物包括一种酯酶。在另一个方面中，酶组合物包括一种棒曲霉素。在另一个方面中，酶组合物包括一种漆酶。在另一个方面中，酶组合物包括一种木质素分解酶。在一个实施例中，木质素分解酶是一种锰过氧化物酶。在另一个方面中，木质素分解酶是一种木质素过氧化物酶。在另一个方面中，木质素分解酶是一种产H2O2酶。在另一个方面中，酶组合物包括一种果胶酶。在另一个方面中，酶组合物包括一种过氧化物酶。在另一个方面中，酶组合物包括一种蛋白酶。在另一个方面中，酶组合物包括一种膨胀因子。
在本发明的方法中，可在糖化、糖化和发酵、或发酵之前或过程中添加一种或多种酶。
酶组合物的一种或多种(例如数种)组分可以是野生型蛋白、重组蛋白或野生型蛋白与重组蛋白的组合。例如，一种或多种(例如数种)组分可以是细胞的天然蛋白，该细胞可被用作宿主细胞来重组地表达酶组合物的一种或多种(例如数种)其他组分。可以作为单组分生成酶组合物的一种或多种(例如数种)组分，然后将它们组合以形成酶组合物。酶组合物可以是多组分和单组分蛋白制剂的组合。
在本发明的方法中使用的酶可以是以任何适于使用的形式存在的，例如发酵液制剂或细胞组合物、有或没有细胞碎片的细胞裂解物、半纯化或纯化的酶制剂、或作为酶的来源的宿主细胞。酶组合物可以是干粉或颗粒、无尘颗粒、液体、稳定化的液体、或稳定化的受保护的酶。可以根据已建立的方法例如通过添加如糖、糖醇或其它多元醇等稳定剂和/或乳酸，对液体酶制剂进行稳定化。
酶的最佳量取决于多种因素，包括但不限于，组分纤维素分解酶和/或半纤维素分解酶的混合物、纤维素材料、纤维素材料的浓度、纤维素材料的预处理、温度、时间、pH、以及和包含的发酵生物(如用于同时糖化和发酵的酵母)。
在一个方面中，纤维素分解或半纤维素分解酶对于纤维素材料的有效量是大约0.5至大约50mg，例如大约0.5至大约40mg、大约0.5至大约25mg、大约0.75至大约20mg、大约0.75至大约15mg、大约0.5至大约10mg、或大约2.5至大约10mg，以每克纤维素材料计。
具有纤维素分解酶活性或半纤维素分解酶活性的多肽以及有用于降解纤维素材料的其它蛋白/多肽，例如具有纤维素分解增强活性的GH61多肽，可以从任何合适的来源衍生或获得，包括细菌、真菌、酵母、植物或哺乳动物来源。术语“获得”在此还指的是采用在此所述的方法已经在宿主生物体中重组生成该酶，其中重组生成的酶对宿主生物体可以是天然的或外源的，或具有修饰的氨基酸序列，例如具有一个或多个(例如数个)被缺失、插入和/或取代的氨基酸，即重组生成的酶，它是天然氨基酸序列的一种突变体和/或片段，或是由本领域已知的核酸重排过程中生成的酶。天然酶的涵义中包含自然变异，外源酶的涵义中包含由如通过定点突变或重排等重组而获得的变种。
每种酶可以是细菌多肽。例如，该多肽可以是革兰氏阳性细菌多肽，如热酸菌属(Acidothermus)、芽孢杆菌属(Bacillus)、热解纤维素菌属(Caldicellulosiruptor)、梭菌属(Clostridium)、肠球菌属(Enterococcus)、土芽孢杆菌属(Geobacillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、大洋芽孢杆菌属(Oceanobacillus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、链球菌属(Streptococcus)、链霉菌属(Streptomyces)、或嗜热裂孢菌属(Thermobifidia)的酶，或是革兰氏阴性细菌多肽，如大肠杆菌(E.coli)、弯曲杆菌(Campylobacter)、黄杆菌属(Flavobacterium)、梭杆菌属(Fusobacterium)、螺杆菌(Helicobacter)、泥杆菌属(Ilyobacter)、奈瑟菌属(Neisseria)、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙门氏菌属(Salmonella)、或脲原体属(Ureaplasma)的酶。
在一个方面中，该酶是嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens))、短芽孢杆菌(Bacillusbrevis)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)、灿烂芽胞杆菌(Bacillus lautus)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、短小芽胞杆菌(Bacillus pumilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、或苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)的酶。
在另一个方面中，该酶是似马链球菌(Streptococcus equisimilis)，酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)，乳房链球菌(Streptococcus uberis)或马链球菌兽疫(Streptococcus equi subsp.Zooepidemicus)亚种的酶。
在另一个方面，该酶是产色链霉菌(Streptomyces achromogenes)、除虫链霉菌(Streptomyces avermitilis)、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)、灰色链霉菌(Streptomyces griseus)、或变青链霉菌(Streptomyces lividans)的酶。
各酶也可以是真菌酶，例如酵母酶，如念珠菌属(Candida)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母菌属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、或耶氏酵母属(Yarrowia)的酶；或丝状真菌酶、如枝顶孢属(Acremonium)、伞菌属(Agaricus)、链格孢属(Alternaria)、曲霉属(Aspergillus)、短柄霉属(Aureobasidium)、葡萄座腔菌属(Botryospaeria)、拟腊菌属(Ceriporiopsis)、毛喙壳属(Chaetomidium)、金孢子菌属(Chrysosporium)、麦角菌属(Claviceps)、旋孢腔菌属(Cochliobolus)、鬼伞属(Coprinopsis)、家白蚁属(Coptotermes)、棒囊壳属(Corynascus)、栗疫属(Cryphonectria)、隐球菌属(Cryptococcus)、色二孢属(Diplodia)、黑耳属(Exidia)、网孢菌属(Filibasidium)、镰刀菌属(Fusarium)、赤霉菌属(Gibberella)、全鞭毛虫属(Holomastigotoides)、腐质霉属(Humicola)、耙齿菌属(Irpex)、香菇属(Lentinula)、小球腔菌属(Leptospaeria)、座壳属(Magnaporthe)、嗜热菌属(Melanocarpus)、亚灰树花菌属(Meripilus)、毛霉属(Mucor)、毁丝霉(Myceliophthora)、新美鞭菌属(Neocallimastix)、脉孢菌属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉菌属(Penicillium)、平革菌属(Phanerochaete)、梨囊鞭菌属(Piromyces)、Poitrasia、假黑盘菌属(Pseudoplectania)、假披发虫属(Pseudotrichonympha)、根毛霉属(Rhizomucor)、裂褶菌属(Schizophyllum)、节格孢属(Scytalidium)、踝节菌属(Talaromyces)、嗜热霉属(Thermoascus)、梭孢壳属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)、木霉(Trichoderma)、长毛盘菌属(Trichophaea)、黄萎病(Verticillium)、草菇(Volvariella)、或炭角菌(Xylaria)的酶。
在一个方面中，该酶是卡氏酵母(Saccharomyces carlsbergensis)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)、道格拉氏酵母(Saccharomyces douglasii)、克鲁弗酵母(Saccharomyceskluyveri)、诺地酵母(Saccharomyces norbensis)、或卵形酵母(Saccharomycesoviformis)的酶。
在另一个方面中，该酶是解纤维顶孢霉(Acremonium cellulolyticus)、棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、臭曲霉(Aspergillus foetidus)、日本曲霉(Aspergillusjaponicus)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、嗜角质金孢子菌(Chrysosporiumkeratinophilum)、Chrysosporium lucknowense、热带金孢子菌(Chrysosporiumtropicum)、Chrysosporium merdarium、狭边金孢子菌(Chrysosporium inops)、角膜金孢子菌(Chrysosporium pannicola)、Chrysosporium queenslandicum、带纹金孢子菌(Chrysosporium zonatum)、拟杆镰孢菌(Fusariumbactridioides)、蜀黍专化型镰孢菌(Fusarium cerealis)、克地德刀菌(Fusariumcrookwellense)、黄色镰孢菌(Fusarium culmorum)、禾谷镰刀菌(Fusariumgraminearum)、禾谷镰孢菌(Fusarium graminum)、异孢镰孢(Fusariumheterosporum)、合欢木镰刀菌(Fusarium negundi)、尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)、网状镰刀菌(Fusarium reticulatum)、粉红镰刀菌(Fusariumroseum)、接骨木镰刀菌(Fusarium sambucinum)、肤色镰孢菌(Fusariumsarcochroum)、拟枝孢镰刀菌(Fusarium sporotrichioides)、硫色镰刀菌(Fusarium sulphureum)、族囊镰刀菌(Fusarium torulosum)、拟丝孢镰刀菌(Fusarium trichothecioides)、镶片镰孢菌(Fusarium venenatum)、灰腐质霉(Humicola grisea)、特异腐质霉(Humicola insolens)、柔毛腐质霉(Humicolalanuginosa)、白耙齿菌(Irpex lacteus)、毛霉(Mucor miehei)、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)、粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)、绳状青霉菌(Penicillium funiculosum)、产紫青霉菌(Penicillium purpurogenum)、黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、无色梭孢壳(Thielaviaachromatica)、Thielavia albomyces、Thielavia albopilosa、澳洲梭孢壳(Thielaviaaustraleinsis)、Thielavia fimeti、小孢梭孢壳(Thielavia microspora)、卵抱梭孢壳(Thielavia ovispora)、秘鲁梭孢壳(Thielavia peruviana)、瘤抱梭孢壳(Thielavia spededonium)、毛梭孢壳(Thielavia setosa)、Thielaviasubthermophila、太瑞斯梭孢壳霉(Thielavia terrestris)、哈茨木霉菌(Trichoderma harzianum)、康宁木霉(Trichoderma koningii)、长梗木霉(Trichoderma longibrachiatum)、里氏木霉(Trichoderma reesei)、绿色木霉菌(Trichoderma viride)、或嚢状长毛盘菌(Trichophaea saccata)的酶。
还可以使用化学修饰的或蛋白工程化的突变体。
酶组合物的一种或多种(例如数种)组分可以是重组组分，即通过对编码单一组分的DNA序列的克隆以及随后用该DNA序列转化随后的细胞并且在宿主中表达((参见例如WO 91/17243和WO 91/17244))。宿主是一种异源宿主(酶是对宿主是异源的)，但是宿主在某些特定条件下可以是一种同源宿主(酶对宿主是天然(native)的)。单组分纤维素分解蛋白还可以通过从发酵液中提纯这样的蛋白来制备。
在一个方面中，一种或多种(例如数种)纤维素分解酶包括商业纤维素分解酶制剂。适用于本发明的商业纤维素分解酶制剂的实例包括例如CTec(诺维信公司(Novozymes A/S))、CTec2(诺维信公司(Novozymes A/S))、CTec3(诺维信公司(Novozymes A/S))、CELLUCLASTTM(诺维信公司(Novozymes A/S))、NOVOZYMTM188(诺维信公司(Novozymes A/S))、CELLUZYMETM(诺维信公司(NovozymesA/S))、CEREFLOTM(诺维信公司(Novozymes A/S))、以及ULTRAFLOTM(诺维信公司(Novozymes A/S))、ACCELERASETM(杰能科国际公司(Genencor Int.))、LAMINEXTM(杰能科国际公司(Genencor Int.))、SPEZYMETMCP(杰能科国际公司(Genencor Int.))、NL(DSM)；S/L100(DSM)、ROHAMENTTM7069W(GmbH)、LDI(Dyadic International,Inc.)、LBR(DyadicInternational,Inc.)或150L(Dyadic International,Inc.)。加入的纤维素酶的有效量是固体从大约0.001至大约5.0wt.％，例如固体的大约0.025至大约4.0wt.％，或固体的大约0.005至大约2.0wt.％。
可在本发明的方法中使用的细菌内切葡聚糖酶的实例包括但不限于：解纤维热酸菌(Acidothermus cellulolyticus)内切葡聚糖酶(WO 91/05039；WO 93/15186；美国专利申请号5,275,944；WO 96/02551；美国专利申请号5,536,655，WO 00/70031，WO 05/093050)；嗜热裂孢菌(Thermobifida fusca)内切葡聚糖酶III(WO 05/093050)；以及嗜热裂孢菌(Thermobifida fusca)内切葡聚糖酶V(WO 05/093050)。
可以在本发明中使用的真菌内切葡聚糖酶的实例包括但不限于：里氏木霉(Trichoderma reesei)内切葡聚糖酶I(Penttila等人，1986，Gene45:253-263)、里氏木霉(Trichoderma reesei)Cel7B内切葡聚糖酶I(TM基因库(GENBANK)保藏号M15665)、里氏木霉(Trichoderma reesei)内切葡聚糖酶II(Saloheimo，等人，1988，Gene63:11-22)、里氏木霉(Trichoderma reesei)Cel5A内切葡聚糖酶II(TM基因库保藏号M19373)、里氏木霉(Trichodermareesei)内切葡聚糖酶III(Okada等人，1988，Appl.Environ.Microbiol.64:555-563，TM基因库保藏号AB003694)、里氏木霉(Trichoderma reesei)内切葡聚糖酶V(Saloheimo等人，1994，Molecular Microbiology13:219-228，TM基因库保藏号Z33381)、棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)内切葡聚糖酶(Ooi等人，1990，Nucleic Acids Research18:5884)、白曲霉(Aspergilluskawachii)内切葡聚糖酶(Sakamoto等人，1995，Current Genetics27:435-439)、欧氏杆菌(Erwinia carotovara)内切葡聚糖酶(Saarilahti等人，1990，Gene90:9-14)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)内切葡聚糖酶(TM基因库保藏号L29381)、腐质霉(Humicola grisea)thermoidea变种内切葡聚糖酶(TM基因库保藏号AB003107)、热白丝菌(Melanocarpus albomyces)内切葡聚糖酶(TM基因库保藏号MAL515703)、粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)内切葡聚糖酶(TM基因库保藏号XM_324477)、特异腐质霉(Humicola insolens)内切葡聚糖酶V、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)CBS117.65内切葡聚糖酶、担子菌类CBS495.95内切葡聚糖酶、担子菌类CBS494.95内切葡聚糖酶、太瑞斯梭孢壳霉(Thielavia terrestris)NRRL8126CEL6B内切葡聚糖酶、太瑞斯梭孢壳霉(Thielavia terrestris)NRRL8126CEL6C内切葡聚糖酶、太瑞斯梭孢壳霉(Thielavia terrestris)NRRL8126CEL7C内切葡聚糖酶、太瑞斯梭孢壳霉(Thielavia terrestris)NRRL8126CEL7E内切葡聚糖酶、太瑞斯梭孢壳霉(Thielavia terrestris)NRRL8126CEL7F内切葡聚糖酶、Cladorrhinum foecundissimum ATCC62373CEL7A内切葡聚糖酶、以及里氏木霉(Trichoderma reesei)菌株编号VTT-D-80133内切葡聚糖酶(TM基因库保藏号M15665)。
可用在本发明中的纤维二糖水解酶的实例包括但不限于：棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)纤维二糖水解酶II(WO 2011/059740)、嗜热毛壳菌(Chaetomium thermophilum)纤维二糖水解酶I、嗜热毛壳菌(Chaetomiumthermophilum)纤维二糖水解酶II、特异腐质霉(Humicola insolens)纤维二糖水解酶I、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)纤维二糖水解酶II(WO 2009/042871)、Thielavia hyrcanie纤维二糖水解酶II(WO2010/141325)、太瑞斯梭孢壳霉(Thielavia terrestris)纤维二糖水解酶II(CEL6A，WO 2006/074435)、里氏木霉(Trichoderma reesei)纤维二糖水解酶I、里氏木霉(Trichoderma reesei)纤维二糖水解酶II、以及囊状长毛盘菌(Trichophaea saccata)纤维二糖水解酶II(WO 2010/057086)。
可用在本发明中的β-葡糖苷酶包括但不限于从下述各项获得的β-葡糖苷酶：棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)(Kawaguchi等人，1996，《基因》(Gene)173：287-288)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)(WO 2005/047499)、黑曲霉(Aspergillus niger)(Dan等人，2000，《生物化学杂志》(J.Biol.Chem.)275.4973-4980)，米曲霉(Aspergillus oryzae)(WO 02/095014)，巴西青霉(Penicillium brasilianum)IBT20888(WO 2007/019442和WO 2010/088387)，太瑞斯梭孢壳霉(Thielavia terrestris)(WO 2011/035029)、以及嚢状长毛盘菌(Trichophaea saccata)(WO 2007/019442)。
β-葡糖苷酶是一种融合蛋白。在一个方面中，β-葡糖苷酶是一种米曲霉(Aspergillus oryzae)β-葡糖苷酶变体BG融合蛋白(WO 2008/057637)或一种米曲霉(Aspergillus oryzae)β-葡糖苷酶融合蛋白(WO 2008/057637)。
其他有用的内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶在采用根据下述文献的分类的很多糖基水解酶家族中披露：Henrissat，1991，“基于氨基酸序列的相似之的糖基水解酶的分类”(A classification of glycosyl hydrolasesbased on amino-acid sequence similarities)，《生物化学期刊》(Biochem.J.)280：309-316，以及Henrissat和Bairoch，1996，“基于序列的糖基水解酶的分类的更新”(Updating the sequence-based classification of glycosyl hydrolases)，《生物化学期刊》(Biochem.J.)316：695-696。
可被用在本发明中的其他纤维素分解酶是在下述发明中披露的：WO98/13465、WO 98/15619、WO 98/15633、WO 99/06574、WO 99/10481、WO99/25847、WO 99/31255、WO 02/101078、WO 03/027306、WO 03/052054、WO 03/052055、WO 03/052056、WO 03/052057、WO 03/052118、WO2004/016760、WO 2004/043980、WO 2004/048592、WO 2005/001065、WO2005/028636、WO 2005/093050、WO 2005/093073、WO 2006/074005、WO2006/117432、WO 2007/071818、WO 2007/071820、WO 2008/008070、WO2008/008793、美国专利申请号5,457,046、美国专利申请号5,648,263、和美国专利申请号5,686,593。
在本发明的方法中，具有纤维素分解增强活性的多肽GH61可被用作酶组合物中的组分。
可用在本发明方法中的具有纤维素分解增强活性的GH61多肽包括但不限于来自于以下各项的GH61多肽：土生梭孢霉(Thielavia terrestris)(WO2005/074647、WO 2008/148131和WO 2011/035027)、嗜热子囊菌(Thermoascus aurantiacus)(WO 2005/074656和WO 2010/065830)、里氏木霉(Trichoderma reesei)(WO 2007/089290)、嗜热毁丝霉(Myceliophthorathermophila)(WO 2009/085935、WO 2009/085859、WO 2009/085864、WO2009/085868)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)(WO 2010/138754)、嗜松青霉(Penicillium pinophilum)(WO 2011/005867)、嗜热菌(Thermoascus sp.)(WO 2011/039319)、青霉属(Penicillium sp.)(WO 2011/041397)、以及甲壳嗜热子囊菌(Thermoascus crustaceous)(WO 2011/041504)。
在一个方面中，根据WO 2008/151043中所述的，具有纤维素分解增强活性的多肽GH61可在例如硫酸锰等可溶性活化二价金属阳离子的存在下使用。
在另一个方面中，具有纤维素分解增强活性的GH61多肽可在下述物质存在下使用：二氧基化合物、双环化合物、杂环化合物、含氮化合物、醌化合物、含硫化合物、或者从经过预处理的纤维素材料(如经过预处理的玉米秸秆(PCS))得到的液体。
二氧基化合物可包括含有两个或更多个氧原子的任何合适的化合物。在某些方面中，二氧基化合物含有如在此所述的取代的芳基部分。二氧基化合物可以包含一种或多种(例如数种)羟基和/或羟基衍生物，还包括无羟基和羟基衍生物的被取代的芳基部分。二氧基化合物的非限制性实例包括：邻苯二酚或儿茶酚、咖啡酸、3,4-二羟基苯甲酸、4-叔-丁基-5-甲氧基-1,2-苯二醇、邻苯三酚、没食子酸、甲基-3,4,5-三羟基苯甲酸酯、2,3,4-三羟基二苯酮、2,6-二甲氧基苯酚、芥子酸、3,5-二羟基苯甲酸、4-氯-1,2-苯二醇、4-硝基-1,2-苯二醇、单宁酸、没食子酸乙酯、乙醇酸甲酯、二羟基富马酸、2-丁炔-1,4-二醇、巴豆酸、1,3-丙二醇、酒石酸、2,4-戊二醇、3-乙氧基-1,2-丙二醇、2,4,4'-三羟基二苯酮、顺式-2-丁烯-1,4-二醇、3,4-二羟基-3-环丁烯-1,2-二酮、二羟基丙酮、丙烯醛缩醛(acrolein acetal)、甲基-4-羟基苯甲酸酯、4-羟基苯甲酸、和甲基-3,5-二甲氧基-4-羟基苯甲酸酯，以及其盐或溶剂化物。
双环化合物可包括如在此所述的任何合适的取代的稠合环体系。这些化合物可以包括一个或多个(例如数个)另外的环，并且除非另有说明不限于具体个数的环。在一个方面中，该双环化合物是类黄酮。在另一个方面中，该双环化合物是任选取代的异黄酮。在另一个方面中，，该双环化合物是任选取代的即花色基元(flavylium)离子，如任选取代的花青素或任选取代的花青苷，或它们的衍生物。双环化合物的非限制性实例包括表儿茶素、槲皮素、杨梅素、花旗松素、山奈酚、桑色素、金合欢素、柚皮素、异鼠李素、芹菜素、矢车菊色素(cyanidin)、花色素苷(cyanin)、矢车菊素(kuromanin)、花青素鼠李葡糖苷、或其盐或溶剂化物。
该杂环化合物可以是任何合适的化合物，例如任选取代的芳族或含有杂原子非芳族环，如在此所述的。在一个方面中，该杂环是含任选经取代的杂环烷基部分或任选取代的杂芳基部分的化合物。在另一个方面中，任选取代的杂环烷基部分或任选取代的杂芳基部分是一种任选取代的5元杂环烷基或一种任选取代的5元杂芳基部分。在另一个方面中，任选取代的杂环烷基或任选取代的杂芳基部分是选自以下的任选取代的部分：吡唑基、呋喃基、咪唑基、异噁唑基唑基、噁唑基二唑基、噁唑基、吡咯基、吡啶基、嘧啶基、哒嗪基、噻唑基、三唑基、噻吩基、二氢噻吩-吡唑基、硫茚基、咔唑基、苯并咪唑基、苯并噻吩基、苯并呋喃基、吲哚基、喹啉基、苯并三唑基、苯并噻唑基、苯并噁唑基唑基、苯并咪唑基、异喹啉基、异吲哚基、吖啶基、苯并异噁唑基唑基、二甲基乙内酰脲、吡嗪基、四氢呋喃基、吡咯啉基、吡咯烷基、吗啉基、吲哚基、二氮杂环庚三烯基、氮杂环庚三烯基、硫杂环庚三烯基、哌啶基、以及氧杂环庚三烯基。在另一个方面中，任选取代的杂环烷基部分或任选取代的杂芳基部分是任选取代的呋喃基。杂环化合物的非限制性实例包括：(1,2-二羟乙基)-3,4-二羟基呋喃-2(5H)-酮；4-羟基-5-甲基-3-呋喃酮、5-羟基-2(5H)-呋喃酮、[1,2-二羟基乙基]呋喃-2,3,4(5H)-三酮、α-羟基-γ-丁内酯、核糖酸γ-内酯、醛己糖醛酸γ-内酯(aldohexuronicaldohexuronicacid)、葡糖酸δ-内酯、4-羟基香豆素、二氢苯并呋喃、5-(羟甲基)糠醛、糠偶姻、2(5H)-呋喃酮、5,6-二氢-2H-吡喃-2-酮、和5,6-二氢-4-羟基-6-甲基-2H-吡喃-2-酮，或其盐或溶剂化物。
含氮化合物可以是具有一个或多个氮原子的任何合适的化合物。在一个方面中，该含氮化合物包括胺、亚胺、羟胺、或硝基氧部分。含氮化合物的非限制性实例包括：丙酮肟、紫尿酸、吡啶-2-醛肟、2-氨基苯酚、1,2-苯二胺、2,2,6,6-四甲基-1-哌啶基氧基、5,6,7,8-四氢生物蝶呤、6,7-二甲基-5,6,7,8-四氢碟呤、以及马来酰胺酸，或其盐或溶剂化物。
醌化合物可以是包括如在此所述的醌部分的任何合适的化合物。醌化合物的非限制性实例包括：1,4-苯醌、1,4-萘醌、2-羟基-1,4-萘醌、2,3-二甲氧基-5-甲基-1,4-苯醌或辅酶Q0、2,3,5,6-四甲基-1,4-苯醌或杜醌、1,4-二羟基蒽醌、3-羟基-1-甲基-5,6-吲哚啉二酮或肾上腺色素、4-叔-丁基-5-甲氧基-1,2-苯醌、吡咯喹啉醌，或其盐或溶剂化物。
该含硫化合物可以是包含一个或多个硫原子的任何合适的化合物。在一个方面中，所含硫包括选自于以下各项的部分：亚硫酸基、硫醚基、亚磺酰基、磺酰基、磺酰胺、磺胺、磺酸、以及磺酸酯。含硫化合物的非限制性实例包括：乙硫醇、2-丙硫醇、2-丙烯-1-硫醇、2-巯基乙磺酸、苯硫酚、苯-1,2-二硫醇、半胱氨酸、蛋氨酸、谷胱甘肽、胱氨酸，或其盐或溶剂化物。
在一个方面中，上述的化合物对纤维素材料的有效量，作为其与纤维素的葡糖基单位的摩尔比，是大约10-6至大约10，例如大约10-6至大约7.5，大约10-6至大约5，大约10-6至大约2.5，大约10-6至大约1，大约10-5至大约1，大约10-5至大约10-1，大约10-4至大约10-1，大约10-3至大约10-1，或大约10-3至大约10-2。在另一个方面中，上述这种化合物的有效量是大约0.1微摩(microM)至大约1M，例如，大约0.5微摩至大约0.75M，大约0.75微摩至大约0.5M，大约1微摩至大约0.25M，大约1微摩至大约0.1M，大约5微摩至大约50mM，大约10微摩至大约25mM，大约50微摩至大约25mM，大约10微摩至大约10mM，大约5微摩至大约5mM，或大约0.1mM至大约1mM。
术语“液体(Liquor)”是指溶液相，无论是含水的、有机的或它们的组合，是在如在此所述的条件下由对浆料中的木质纤维素和/或半纤维素材料的处理而产生的，或是对它们的单糖(如木糖、阿拉伯糖、甘露糖等)进行处理而产生的，以及其可溶性内容物。可以通过对木质纤维素或半纤维素材料(原料)加热和/或加压进行处理，任选地是在一种例如酸等催化剂存在下、任选地是在有机溶剂的存在下、和任选地与材料的物理破坏相结合，然后将溶液与残余固形物分离，来生成一种用于加强GH61多肽纤维分解的液体。在由纤维素酶制剂对纤维素底物的水解过程中，从液体与GH61多肽的组合中可得到纤维素分解增强的程度是由这类条件决定的。可以使用本领域的标准方法，如过滤、沉淀或离心，而将液体与经过处理的材料进行分离。
在一个方面中，液体对于纤维素的有效量是大约10-6至大约10g，以每克纤维素计，例如，大约10-6至大约7.5g，大约10-6至大约5g，大约10-6至大约2.5g，大约10-6至大约1g，大约10-5至大约1g，大约10-5至大约10-1g，大约10-4至大约10-1g，大约10-3至大约10-1g，或大约10-3至大约10-2g，以每克纤维素计。
在一个方面中，一种或多种(例如数种)半纤维素分解酶包括商业半纤维素分解酶制剂。适用于本发明的商业半纤维素分解酶制剂包括例如SHEARZYMETM(Novozymes A/S)、HTec(诺维信公司(NovozymesA/S))、HTec2(诺维信公司(Novozymes A/S))、HTec3(诺维信公司(Novozymes A/S))、(Novozymes A/S)、(诺维信公司(Novozymes A/S))、HC(诺维信公司(Novozymes A/S))、木聚糖酶(Genencor)、XY(杰能科公司(Genencor))、XC(杰能科公司(Genencor))、TX-200A(德国AB酶制剂公司(ABEnzymes))、HSP6000木聚糖酶(DSM)、DEPOLTM333P(Biocatalysts Limit，威尔士，UK)、DEPOLTM740L(Biocatalysts Limit，Wales，UK)，以及DEPOLTM762P(Biocatalysts Limit，威尔士，UK)。
在本发明的方法中有用的木聚糖酶的实例包括但不限于由下述各项得到的木聚糖酶：棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)(GeneSeqP：AAR63790；WO 94/21785)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)(WO 2006/078256)、嗜松青霉(Penicillium pinophilum)(WO 2011/041405)、青霉属(Penicillium sp.)(WO 2010/126772)、太瑞斯梭孢壳霉(Thielavia terrestris)NRRL8126(WO2009/079210)、以及囊状长毛盘菌(Trichophaea saccata)GH10(WO2011/057083)。
在本发明的方法中有用的β-木糖苷酶包括但不限于从下述各项中获得的β-木糖苷酶：粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)(SwissProt保藏号Q7SOW4)、里氏木霉(Trichoderma reesei)(UniProtKB/TrEMBL保藏号Q92458)，以及埃默森篮状菌(Talaromyces emersonii)(SwissProt保藏号Q8X212)。
在本发明的方法中有用的乙酰木聚糖酯酶的实例包括但不限于从下述各项得到的乙酰木聚糖酯酶：棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)(WO2010/108918)，球毛壳菌(Chaetomium globosum)(UniProt保藏号Q2GWX4)，细丽毛壳(Chaetomium gracile)(GeneSeqP保藏号AAB82124)，特异腐质霉(Humicola insolens)DSM1800(WO 2009/073709)，红褐肉座菌(Hypocreajecorina)(WO 2005/001036)，嗜热毁丝菌(Myceliophtera thermophila)(WO2010/014880)，粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)(UniProt保藏号q7s259)，颖枯壳针孢(Phaeosphaeria nodorum)(UniProt保藏号Q0UHJ1)，以及太瑞斯梭孢壳霉(Thielavia terrestris)NRRL8126(WO 2009/042846)。
在本发明的方法中有用阿魏酰酯酶(阿魏酸酯酶)是实例包括但不限于从下述各项中得到的阿魏酰酯酶：特异腐质霉(Humicola insolens)DSM1800(WO2009/076122)，费希新萨托菌(Neosartorya fischeri)(UniProt保藏号A1D9T4)，粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)(UniProt保藏号Q9HGR3)，黄灰青霉(Penicillium aurantiogriseum)(WO 2009/127729)，以及太瑞斯梭孢壳霉(Thielavia terrestris)(WO 2010/053838和WO 2010/065448)。
在本发明的方法中有用的阿拉伯呋喃糖酶的实例包括但不限于从下述各项得到的阿拉伯呋喃糖酶：黑曲霉(Aspergillus niger)(GeneSeqP保藏号AAR94170)，特异腐质霉(Humicola insolens)DSM1800(WO 2006/114094和WO 2009/073383)，以及巨多孔菌(M.giganteus)(WO 2006/114094)。
在本发明的方法中有用的α-葡萄糖醛酸酶的实例包括但不限于从下述各项中得到的α-葡萄糖醛酸酶：棒曲霉(Aspergillus clavatus)(UniProt保藏号alcc12)，烟曲霉(Aspergillus fumigatus)(SwissProt保藏号Q4WW45)，黑曲霉(Aspergillus niger)(UniProt保藏号Q96WX9)，土曲霉(Aspergillusterreus)(SwissProt保藏号Q0CJP9)，特异腐质霉(Humicola insolens)(WO2010/014706)，黄灰青霉(WO 2009/068565)，埃默森篮状菌(Talaromycesemersonii)(UniProt保藏号Q8X211)，以及里氏木霉(Trichoderma reesei)(UniProt保藏号Q99024)。
可以采用本领域中已知的方法通过对上述微生物菌株在含有合适的碳源、氮源和无机盐的营养培养基中进行发酵来生成在本发明的方法中使用的酶(参见例如Bennett，J.W.and LaSure，L.(eds.)，《在真菌中的更多的基因操纵》(More Gene Manipulations in Fungi)，学术出版社(Academic Press)，CA，1991)。适用的培养基可从商购获得，或可根据已经公开的组合物进行制备(例如在美国种质保存中心的目录中(American Type CultureCollection))。适宜生长以及酶的生成的温度范围和其他条件是本领域已知的(参见例如Bailey，J.E.，和Ollis，D.F.，《生物化学工程基础》(BiochemicalEngineering Fundamentals)，麦格劳-希尔图书公司(McGraw-Hill BookCompany)，NY，1986)。
发酵可以是导致酶或蛋白的表达或分离的细胞培养的任何方法。因此，可以理解发酵包括在实验室或工业培养罐中、在适用的培养基中、在可使酶被表达和/或分离的条件下进行摇瓶培养或小规模或大规模大发酵(包括持续、批量、流加培养、或固体发酵)。可从发酵培养基回收通过上述方法产生得到的酶，并通过常规方法进行纯化。
动物饲料
本发明还涉及动物饲料组合物和饲料添加剂，包括经过处理的纤维素材料和一种蛋白源(一种重要的营养因子)。
术语动物包括所有动物，包括人类。动物的实例是非反刍动物和反刍动物。反刍动物包括例如动物，如绵羊、山羊、马、牛，例如肉牛、奶牛和小牛犊。在一个具体的实施例中，动物是一种非反刍动物。非反刍动物包括单胃动物，例如猪(pig)或猪(swine)(包括但不限于小猪、生长猪和母猪)；家禽，例如火鸡、鸭和鸡(包括但不限于肉鸡、产蛋鸡)；水产动物物种，如鱼类(包括但不限于鲑鱼、鳟鱼、罗非鱼、鲶鱼和鲤鱼；以及甲壳类动物(包括但不限于基围虾和对虾)。
术语饲料或饲料组合物包括适于意在被动物摄入的任何化合物、制剂、混合物或组合物。
在根据本发明的应用中，可以在饮食之前、之后或同时将处理的纤维素材料饲喂给动物。优选后者。
经过处理的纤维素材料可以被(a)直接添加到饲料中(或直接用在蛋白处理过程中)，或(b)它可被用在如饲料添加剂或预混料等一种或多种中间组合物的生产中(或用在处理过程中)。
该动物饲料添加剂或组合物包括一种蛋白源，该蛋白源可以是一种动物蛋白，如肉和骨粉和/或鱼粉；或一种植物蛋白。
在此所用的术语植物蛋白是指包括至少一种来源于或来自于植物的蛋白(包括改性蛋白和蛋白衍生物)的任何化合物、组合物、制剂或混合物。在具体的实施例中，植物蛋白的蛋白含量是至少10、20、30、40、50或60％(w/w)。
植物蛋白可以从植物蛋白来源获得，如豆类和谷物，例如从豆科(Fabaceae)、十字花科(Cruciferaceae)、藜科(Chenopodiaceae)、禾本科(Poaceae)中获得的材料，如大豆粉，羽扇豆粕和菜籽粕。
在一个具体的实施例中，植物蛋白源是来自豆科(Fabaceae)的一种或多种植物的材料，如大豆、扁豆、豌豆、豆。
在另一个具体的实施例中，植物蛋白源是来自藜科的一种或多种植物的材料，例如甜菜、糖甜菜、菠菜或藜麦。
植物蛋白源的其它实例是油菜籽、向日葵籽、棉籽和卷心菜。
大豆是一种合适的植物蛋白源。
植物蛋白源的其它实实例是谷物，如大麦、小麦、黑麦、燕麦、玉蜀黍(玉米)、稻、黑小麦、高粱、具有可溶物的干酒糟(DDGS)和微藻。
蛋白源也可以是可被反刍动物利用以满足其蛋白需求的非蛋白氮源，如尿素或氨。
蛋白源可以是一种必需氨基酸，即必须被添加到动物的饮食中的氨基酸，因为它不能被合成或不能被足够大量合成来满足每日需要量。必需氨基酸包括但不限于苯丙氨酸、缬氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸、精氨酸、色氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、和赖氨酸。
根据本发明，用至少一种经过处理的纤维素材料对蛋白进行处理，可导致蛋白消化率的提高。采用经过处理的纤维素材料，可得到至少101％、或102％、103％、104％、105％、106％、107％、108％、109％、110％、111％、112％、113％、114％、115％、或至少116％的可消化的蛋白。
在处理过程的一个具体的实施例中，经过处理的纤维素材料影响(或作用于、或施加其影响于)蛋白，如植物蛋白或蛋白源。为了实现这一目标，典型地将蛋白或蛋白源悬浮在溶剂中，例如水性溶剂，如水，并且pH值和温度值调整应考虑到经过处理的纤维素材料的特性。
在一个实施例中，这种处理是用在动物饲料中的动物饲料或蛋白的预处理，即在进食之前将这些蛋白溶解。
术语改善动物饲料的营养价值是指改善蛋白的可用性，从而导致蛋白提取的增加、高蛋白产量和/或改善的蛋白利用率。饲料的营养价值会因此而增加，并且还改善了动物的生长速率和/或体重增加和/或饲料转化率(即相对于体重增加的摄取的饲料的重量)改善。
在另外一个方面中，本发明涉及在动物饲料中使用的组合物，例如动物饲料，以及动物饲料添加剂，例如，预混物。
本发明的动物饲料添加剂包含至少一种脂溶性维生素、和/或至少一种水溶性维生素、和/或至少一种痕量元素、和/或至少一种宏量元素。
动物饲料组合物还进一步地包括一种有机酸。适合于在本披露的特定的非限制性实施例中使用的有机酸包括但不限于：抗坏血酸、柠檬酸、乌头酸、苹果酸、延胡索酸、琥珀酸、乳酸、丙二酸、马来酸、酒石酸、天冬氨酸、草酸、丙醇二酸(tatronic acid)、草酰乙酸、异苹果酸、焦柠檬酸、戊二酸、酮戊二酸，以及它们的混合物。有机酸可以游离酸或盐的形式被加入到组合物中。合适的有机酸盐包括但不限于钠盐、钾盐、镁盐、钙盐、铵盐等。在一个非限制性实施例中，可以将有机酸或其盐，如抗坏血酸、柠檬酸、乌头酸、苹果酸、延胡索酸、琥珀酸、乳酸、丙二酸、马来酸、酒石酸、天冬氨酸、焦柠檬酸或其混合物及盐加入到组合物中，加入量是按重量计从0.1％至6.0％。
动物饲料组合物可进一步包括：谷粒的面筋蛋白，其是根据其溶解性被分类为四个类型的储存蛋白：可溶于水或盐水溶液中的白蛋白，不溶于水但溶于稀盐溶液的球蛋白，可溶于醇的醇溶蛋白，以及可溶于稀酸或碱的谷蛋白。合适的面筋蛋白包括但不限于小麦面筋蛋白、玉米面筋蛋白、燕麦面筋蛋白、黑麦面筋蛋白、水稻球蛋白蛋白、大麦面筋蛋白，以及它们的混合物。本披露的组合物中的面筋蛋白能以分离的面筋蛋白的形式或作为面筋粉被加入到该组合物中。在包括面筋蛋白，如玉米面筋蛋白、小麦面筋蛋白、或水稻球蛋白等蛋白的本披露的各种实施例中，面筋蛋白可构成0.25％至50.0％(按重量计)的组合物。
动物饲料组合物还可进一步包含二价金属离子，例如锌、锰和铁。适用于在本披露的组合物的不同非限制性实施例中使用的金属离子的非限制性实例是二价锌、二价锰和二价铁的水溶性盐，例如硫酸盐，虽然很重要的是需要注意的是所有的水溶性盐、以及金属或金属盐的组合均可以在本发明的实践中使用。该金属盐可以作为单独的化学实体或作为一个以上的盐的组合物被添加到组合物中，盐的组合物可包括含有相同的金属离子的盐和与不同金属离子的盐。
动物饲料组合物可进一步包含植物提取物，例如用作调味剂。如在此所用的术语“植物提取物”被定义为是从可被结合到本披露的组合物的某些非限制性实施例中的植物来源分离出来的任何形式的化合物，例如液体、油、晶体或干粉。适用于本发明的组合物的某些非限制性实施例中植物提取物包括但不限于：来自丝兰植物的皂苷，来自皂树植物的皂苷，来自大豆的皂苷，单宁，肉桂醛，丁香酚或其他丁香芽等提取物，包括丁香油或丁香粉，大蒜提取物，桂皮提取物，辣椒素，茴香脑，或它们的混合物。
动物饲料组合物可进一步地包括至少一种蛋白饲料成分，如植物和植物蛋白，包括可食用谷物以及选自下组的谷物粉粕，该组由以下各项组成：大豆、大豆粉、玉米、玉米粉、亚麻籽、亚麻籽粉、棉籽、棉籽粕、油菜籽粕、高粱蛋白和卡罗拉(canola)粕。蛋白饲料成分的其他实例可包括：玉米或玉米的一种组分，例如像玉米纤维、玉米壳、青贮饲料、玉米粉、或玉米植物的任何其他部分；大豆或大豆的一种组分，例如像大豆皮、大豆青贮、研磨大豆或大豆植物的任何其他部分；小麦或小麦的任何组分，例如像小麦纤维、小麦糠、小麦壳、研磨小麦、小麦胚芽、或小麦植物的任何其他部分；卡罗拉或卡罗拉的任何其它部分，例如像卡罗拉蛋白、卡罗拉壳、研磨卡罗拉或卡罗拉的任何其他部分；向日葵或向日葵植物的一种组分；高粱或高粱植物的一种组分；糖用甜菜或糖用甜菜植物的一种组分；甘蔗或甘蔗植物的一种组分；大麦或大麦植物的一种组分；玉米浆；农业加工设施的废物料；大豆糖蜜；亚麻；花生；豌豆；燕麦；草、例如果园草以及羊茅、以及苜蓿、用于青贮饲料或干草的三叶草。
动物饲料组合物可进一步地包括必需氨基酸。必需氨基酸包括但不限于苯丙氨酸、缬氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸、精氨酸、色氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、和赖氨酸。
在一个具体的实施例中，动物饲料组合物包括干酒糟(DDG)和具有可溶物的干酒糟(DDGS)。
另外，任选的饲料添加剂成分是着色剂，例如像β-胡萝卜素等类胡萝卜素，虾青素和叶黄素；稳定剂；生长改善添加剂和香味化合物/调味剂，例如甲酚、茴香脑、癸内酯、十一(unceca)内酯和/或十二(dodca)内酯、紫罗兰酮、鸢尾酮、姜醇、哌啶、亚丙基酞内酯、丁烯基酞内酯、辣椒素和/或单宁酸；抗菌肽；多不饱和脂肪酸(PUFA)；活性氧产生物质；还可使用可含有下述成分的载体：例如40％-50％(按重量计)的木纤维、8％-10％(按重量计)的硬脂、4％-5％(按重量计)的姜黄粉。4％-58％(按重量计)的迷迭香粉、22％-28％(按重量计)的石灰石、1％-3％(按重量计)的胶、如阿拉伯胶、5％-50％(按重量计)的糖和/或淀粉、以及5％-15％(按重量计)的水。
饲料或饲料添加剂还可包括至少一种选自于下组的其它酶，该组由以下各项组成：植酸酶(EC3.1.3.8或3.1.3.26)、木聚糖酶(EC3.2.1.8)、半乳聚糖酶(EC3.2.1.89)、α-半乳糖苷酶(EC3.2.1.22)、蛋白酶(EC3.4.-.-)，磷脂酶A1(EC3.1.1.32)、磷脂酶A2(EC3.1.1.4)、溶血磷脂酶(EC3.1.1.5)、磷脂酶C(3.1.4.3)、磷脂酶D(EC3.1.4.4)、如，例如α-淀粉酶(EC3.2.1.1)等的淀粉酶、和/或β-葡聚糖酶(EC3.2.1.4或EC3.2.1.6)。
抗菌肽(AMP)的实例是CAP18、明串珠菌素A(Leucocin A)、三色肽(Tritrpticin)、保护素-1(Protegrin-1)、死亡素(Thanatin)、防御素、乳铁蛋白(Lactoferrin)、乳铁(Lactoferricin)、以及Ovispirin，如诺弗斯匹林(Novispirin)(Robert Lehrer，2000)、Plectasins和他汀类，包括在WO03/044049和WO 03/048148中公开的化合物和多肽，以及保留上述抗菌活性的变体或片段。
抗真菌多肽(AFP)的实例是巨大曲霉(Aspergillus giganteus)和黑曲霉(Aspergillus niger)肽，以及其保留抗真菌活性的变体和片段，如在WO94/01459和WO 02/090384中所述的。
多不饱和脂肪酸的实例是C18、C20和C22多不饱和脂肪酸，如花生四烯酸、二十二碳六烯酸、二十碳五烯酸和γ-亚油酸。
活性氧产生物质的实例是化学品，例如过硼酸盐、过硫酸盐或过碳酸盐；以及酶，例如氧化酶、加氧酶或合成酶。
通常脂溶性和水溶性维生素以及痕量元素形成了用于添加到饲料中的所谓的预混物的一部分，而宏量元素通常是单独地添加到饲料中。各组合物类型都是本发明的动物饲料添加剂。
在一个具体实施例中，在动物饮食或饲料中包括(或按规定必须包括)的动物饲料添加剂的水平是0.01至10.0％，更具体地是0.05至5.0％，或0.2至1.0％(％的含义是每100克饲料中的添加剂的克数)。这尤其可用于预混料。
下述是这些组分的实例的非排他性列表：
脂溶性维生素的实例是维生素A、维生素D3、维生素E和维生素K，例如维生素K3。
水溶性维生素的实例是维生素B12、生物素和胆碱、维生素B1、维生素B2、维生素B6、烟酸、叶酸和泛酸酯，例如Ca-D-泛酸酯。
痕量元素的实例是锰、锌、铁、铜、碘、硒和钴。
宏量元素的实例是钙、磷和钠。
在WO 01/58275的表A中，列出了这些组分的营养需求(以家禽和仔猪/猪为例)。营养需求指的是应在饮食中提供指定浓度的这些组分。
在替代方案中，本发明的动物饲料添加剂包括在WO 01/58275的表A中指明的至少一种单独组分。至少一种指的是一种或多种、一种、或两种、或三种、或四种等等，最多所有的十三种、或最多所有的十五种单独组分。更具体地，在本发明的添加剂中包含至少一种单独组分，其量是来提供在表A的第四列、或第五列或第六列中指定的范围内的饲料中浓度。
在又另外的实施例中，本发明的动物饲料添加剂包括下述维生素中的至少一种：例如以提供在下表中的指定范围内(分别针对仔猪饮食和肉鸡饮食)的饲料中浓度。
典型的维生素建议
维生素 仔猪饮食 肉鸡饮食
维生素A 10,000-15,000IU/kg饲料 8-12,500IU/kg饲料
维生素D3 1800-2000IU/kg饲料 3000-5000IU/kg饲料
维生素E 60-100mg/kg饲料 150-240mg/kg饲料
维生素K3 2-4mg/kg饲料 2-4mg/kg饲料
维生素B1 2-4mg/kg饲料 2-3mg/kg饲料
维生素B2 6-10mg/kg饲料 7-9mg/kg饲料
维生素B6 4-8mg/kg饲料 3-6mg/kg饲料
维生素B12 0.03-0.05mg/kg饲料 0.015-0.04mg/kg饲料
烟酸(维生素B3) 30-50mg/kg饲料 50-80mg/kg饲料
泛酸 20-40mg/kg饲料 10-18mg/kg饲料
叶酸 1-2mg/kg饲料 1-2mg/kg饲料
生物素 0.15-0.4mg/kg饲料 0.15-0.3mg/kg饲料
氯化胆碱 200-400mg/kg饲料 300-600mg/kg饲料
本发明还涉及动物饲料组合物。动物饲料组合物或饮食具有相对较高含量的蛋白。在WO 01/58275的表B的第2-3列中指出了家禽和猪的饮食的特点。在表B的第4列指出了鱼类饮食的特点。此外，这类鱼类饮食通常具有粗脂肪含量200-310g/kg。WO 01/58275对应于美国专利号09/779,334，其通过引用结合在此。
根据本发明的动物饲料组合物具有粗蛋白含量50-800g/kg，并且此外包括如在此请求保护的至少一种蛋白酶。
此外，或在一种替代方案中(针对上面指出的粗蛋白含量)，本发明的动物饲料组合物具有可代谢能量的含量10-30MJ/kg；和/或钙的含量0.1-200g/kg；和/或有效磷的含量0.1-200g/kg；和/或蛋氨酸的含量0.1-100g/kg；和/或蛋氨酸加半胱氨酸的含量0.1-150g/kg；和/或赖氨酸的含量0.5-50g/kg。
在具体实施例中，可代谢能量、粗蛋白、钙、磷、蛋氨酸、蛋氨酸加半胱氨酸、和/或赖氨酸的含量是在WO 01/58275的表B的2、3、4或5的范围内(R.2-5)。
粗蛋白的计算公式为：氮(N)乘以系数6.25，即粗蛋白(g/kg)＝N(g/kg)×6.25。通过基耶达尔法对氮含量进行测定(A.O.A.C.，1984，官方分析方法(Official Methods of Analysis)，第14版，官方分析化学家协会(Association of Official Analytical Chemists)，华盛顿特区)。
可代谢能的计算是基于下述文献的：NRC公布的猪的营养需求，第九修订版1988，猪营养小组委员会，动物营养委员会，农业委员会，国家研究委员会，国家学术出版社(National Academy Press)，华盛顿特区(Washington，D.C.)，第2-6页，以及欧洲家禽饲料能量值表，斯贝尔霍特家禽研究与推广中心(Spelderholt centre for poultry research and extension)，7361，DA比克波登，荷兰，Grafisch bedrijf Ponsen&looijen BV，瓦赫宁根，国际标准书号90-71463-12-5。
可基于饲料表，如在Veevoedertabel1997，gegevens over chemischesamenstelling，verteerbaarheid en voederwaarde van voedermiddelen，CentralVeevoederbureau，Runderweg6，8219pk Lelystad.ISBN90-72839-13-7中所述的，计算在动物全饮食中的钙、有效磷和氨基酸的膳食含量。
在一个具体的实施例中，动物饲料组合物包含至少一种如上所述的植物蛋白。动物饲料组合物还可包含动物蛋白，如肉和骨粉和/或鱼粉，典型地量是0-25％。动物饲料组合物还可包括具有可溶物的干酒糟(DDGS)，典型地量是0-30％。
在又另外具体的实施例中，动物饲料组合物含有0-80％玉米、和/或0-80％高粱、和/或0-70％小麦、和/或0-70％大麦、和/或0-30％燕麦、和/或0-40％豆粕、和/或0-25％鱼粉、和/或0-25％肉和骨粉、和/或0-20％乳清。
动物的饮食例如可以被生产成为粉状饲料(非颗粒状)或颗粒状饲料。典型地，将粉状饲料材料混合，根据相关物质的规范添加足量的必需维生素和矿物质。可以固体或液体酶配制品的形式加入酶。例如，对于粉状饲料，典型地在成分混合步骤之前或在该步骤的过程中添加固体或液体酶配制品。对于颗粒状饲料，可在饲料成分之前或在该步骤的过程中添加(液体或固体)酶制剂。典型地是在制粒步骤之后加入液体酶制剂。还可在饲料添加剂或预混料中加入酶。
在饮食中的最终的酶浓度是在0.01-200mg酶(按每千克饮食计)的范围内，例如是在0.5-25mg酶(按每千克动物饮食计)的范围内。
经过处理的纤维素材料应以有效量被施加，即其量应足以提高消化率。
体外真消化率(IVTD)
IVTD是在实验室中进行的厌氧发酵，以在其发生在瘤胃中时刺激消化。从摄食典型完全混合日粮(TMR)的瘤胃插管的高产奶牛收集瘤胃液。在39℃(体温)下，在瘤胃液和缓冲液中孵育饲草样品，进行一段指定的时间。在这个时间期间，在瘤胃液中的微生物种群对样品进行消化，就像发生在瘤胃中一样。完成后，在中性洗涤剂溶液中提取样品，留下未消化的纤维残留物。其结果是对消化率的测定结果，可被用于评估纤维素材料的消化率；例如玉米秸秆、玉米纤维、大豆秸秆、大豆纤维、稻草、松木、刨花、杨木、麦秆、柳枝稷、甘蔗渣等。一般来说，IVTD的值越高，饲草的消化率越高，用于饲喂反刍动物的饲草的饲料价值越高。
体外真消化率(IVTD)的第一阶段在瘤胃液和缓冲液中培育24、30或48小时。在第二阶段中，用中性洗剂纤维(NDF)提取来代替胃蛋白酶和HCl。NDF是代表了纤维素材料的纤维体积的半纤维素、纤维素和木质素的测定。这三种组分被分类为细胞壁或结构碳水化物。它们使植物具有硬度，使得其可在生长时对自身进行支撑，更像动物的骨骼。半纤维素和纤维素可被瘤胃中的微生物所分解，用来为动物提供能量。NDF与摄食呈负相关。NDF提取可更完全地除去细菌性残留以及其他胃蛋白酶不溶性材料，产生无微生物污染的残留物。此外，它可将分析时间缩短两天。
实例
实例1——纤维素材料的微生物处理
挤出
通过25.4mm筛子将玉米秸秆碾碎，并且用水预湿润，用来生成悬浮液。氧化钙(CaO)与悬浮液混合，并且通过注射口进入连续加工装置(Readco Kurimoto，LLC，约克郡，PA，USA)来单独施加或与NaOH联用。将加工装置设置成可用于所有处理，以对于化学处理添加、搅拌与粒度缩分，具有近15秒的停留时间。加工装置在测试过程中的预估通量是每小时200kg干重。除了CaO以外的所有化学品添加的进行都无附加热。然而，通过化学反应会产生热量，这是放热的。经过处理的材料的出口温度是近60℃至80℃。在这些试验中不使用压力板，并且由此经过处理的颗粒不会在处理之后产生聚集。将经过处理的材料在送料之前被传送进入机筒或超级袋(supersack)用于随后存储。
在表1中(还参见美国专利申请号7,494,675和7,998,511关于用于改善动物饲料的木质纤维素的处理的内容)还对提高玉米秸秆的消化率的处理进行了描述。机械双螺杆挤出机的一个优点是加入的化学品的量较少，因为加工装置可比传统的混合装置更有效地分配化学品。
表1：玉米秸秆的Readco加工装置
处理 加入量，按干物质的百分数计 总含水量，％
CaO 5.0 35
CaO 5.0 50
CaO 10.0 35
CaO+NaOH 4.0和1.0 50
CaO+NaOH 3.0和2.0 50
分批加工
通过25.4mm筛子将玉米秸秆碾碎，并且对粉碎材料的含水量进行测定。然后将粉碎的秸秆装入配有水平卷钻的饲料混合车。基于初始含水量，另外加入水以达到近35％或50％的含水量，并且加入粉碎的反应性CaO(石灰)或NaOH，其量是5％(以干物质重量计)。将各经过处理的材料混合>5分钟至<10分钟，然后排出到装载了打包装置的输送机中。将经过处理的材料压入单独的包，并保持厌氧条件直至饲喂。
碱性预处理玉米秸秆的青贮模拟
对总共100g(以干重计)的经过如上所述的石灰预处理(挤出(5％CaO，含水量35％，初始pH大约8.2)或分批加工(5％CaO，含水量50％，初始pH大约8.7，或5％NaOH，含水量50％，初始pH大约11.5))的玉米秸秆进行分别接种，用十一种不同的芽孢杆菌(Bacillus)菌株，比率是在1加仑真空袋中5×107cfu/g经过预处理的玉米秸秆的总固体，。芽孢杆菌(Bacillus)的菌株是：
短小芽胞杆菌(Bacillus pumilus)ATTC700385
地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)NRRL B-50015
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)NRRL B-50136
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)NRRL B-50605
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)NRRL B-50606
解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)NRRL B-50607
地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)NRRL B-50621
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)NRRL B-50622
地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)NRRL B-50623
解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)PTA-7543
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)PTA-7547
将微生物与玉米秸秆充分混合。施加真空，并且使用可商购的真空系统形成厌氧环境而对袋子进行密封。将袋子在37℃下孵育达3周。
体外真消化率——乳制品及饲料实验室(Dairy One Forage Laboratory)
在青贮模拟之后，由乳制品及饲料实验室(Dairy One Forage Laboratory，Ithaca，NY，USA)进行体外真消化率(IVTD)研究。从各袋中取出青贮的玉米秸秆(见上面所述的)，在60℃下干燥4小时，然后通过1mm UDYCyclone Mill(UDY Corp.，Fort Collins，CO，USA)将其磨碎。将总共250mg的被干燥碾磨的玉米秸秆，在Van Soest缓冲液中(Goering and Van Soest，1970，Forage fiber analysis(设备、试剂、过程以及某些应用)，《农业手册》(Agricultural Handbook)No.379ARS-USDA，华盛顿特区)，用从摄食典型完全混合饮食(TMR)的高产奶牛得到的瘤胃液进行孵育。在F57滤袋(ANOKM Technology，马其顿，NY，USA)中，在39℃下孵育48小时。在孵育之后，采用NDF方法(ANKOM A200纤维滤袋技术(FBT)，ANKOM应用指南01/02“用于对中性洗涤剂纤维(aNDF)进行测定的方法”)对未消化的纤维残留物样品进行测定。溶液见在《乳业科学杂志》(Journal ofDairy Science)74：3583-3597(1991))中的描述。通过在消化之后的留下的未消化的纤维残留物对消化率进行测定。通过将未经过处理的对照组的已消化材料的平均百分比与微生物处理样品的已消化的材料的平均百分比进行比较，来确定消化率的升高。
对用于各微生物接种物的三种单独的青贮样品进行评估而得到标准差，如在表2-7中所示的。
表2：对在37℃下，CaO批处理一周时间的玉米秸秆进行体外真消化率分析的结果
IVTD：DM的百分比 STDEV
ATTC700385 72.0 1.7
NRRL B-50015 69.7 2.1
NRRL B-50136 73.3 2.9
NRRL B-50605 71.3 1.2
NRRL B-50606 72.3 0.6
NRRL B-50607 69.0 3.6
NRRL B-50621 71.3 2.5
NRRL B-50622 70.7 0.6
NRRL B-50623 72.7 1.2
PTA-7543 71.0 2.0
PTA-7547 68.0 2.6
未经处理的对照组 69.7 4.5
表3：对在37℃下CaO批处理一周时间的玉米秸秆进行体外真消化率分析的结果
试验1 试验2
IVTD：DM的百分比 IVTD：DM的百分比 STDEV STDEV
ATTC700385 71.3 72.0 3.8 1.7
NRRL B-50136 76.7 73.3 2.5 2.9
NRRL B-50606 74.3 72.3 3.5 0.6
NRRL B-50621 71.0 71.3 3.5 2.5
NRRL B-50623 65.7 72.7 2.9 1.2
未经处理的对照组 67.0 69.7 6.2 4.5
表4：对在37℃下CaO批处理三周时间的玉米秸秆进行体外真消化率分析的结果
IVTD：DM的百分比 STDEV
ATTC700385 62.0 4.0
NRRL B-50136 71.0 3.6
NRRL B-50606 59.7 5.8
NRRL B-50621 64.0 6.1
NRRL B-50623 73.7 2.5
未经处理的对照组 59.7 3.8
表5：对在37℃下CaO批处理一周时间的玉米秸秆进行体外真消化率分析的结果
表6：对未处理的在37℃下持续一周时间的玉米秸秆进行体外真消化率分析的结果
IVTD：DM的百分比 STDEV
ATTC700385 56.3 1.5
NRRL B-50136 55.7 1.5
NRRL B-50606 57.3 1.2
NRRL B-50621 55.0 1.0
NRRL B-50623 56.7 3.1
未经处理的对照组 57.0 2.0
表7：对在37℃下NaOH批处理一周时间的玉米秸秆进行体外真消化率分析的结果
IVTD：DM的百分比 STDEV
ATTC700385 93.7 2.3
NRRL B-50136 92.7 0.6
NRRL B-50606 92.7 1.5
NRRL B-50621 92.0 1.0
NRRL B-50623 91.7 2.5
未经处理的对照组 95.3 0.6
各芽孢杆菌(Bacillus)菌株的加入增加了经过氧化钙处理的玉米秸秆相对于未处理的对照组的IVTD，并且是可重复的(表3)。当青贮时间增加时，出现了消化率的持续增加，与未经处理的对照组相比较，采用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)NRRL B-50136是+11％(以干物质计)，采用地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)NRRL B-50623是+14％(以干物质计)(表4)。
对于采用各芽孢杆菌(Bacillus)菌株处理的氧化钙挤出的秸杆，也显示出相似的消化率的升高(表5)。在如上所述的条件下进行评定，检测的微生物接种物不会使未经处理的玉米秸秆或经过5％NaOH预处理的玉米秸秆的消化率增加(表6和7)。可能的原因包括与天然菌株的竞争以及碱处理的严重程度，尤其是较高的初始pH11.5。
实例2
材料
ULTRAFLOL-特异腐质霉(Humicola insolens)组合物，包括乙酰木聚糖酯酶、α-L-阿拉伯呋喃糖酶、β-葡糖苷酶、β-木糖苷酶、纤维二糖水解酶、纤维二糖脱氢酶、内切半乳糖苷酶、内切葡聚糖酶、阿魏酸酯酶以及木聚糖酶。
纤维素分解酶组合物1：棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)GH10木聚糖酶(WO 94/21785)与含有烟曲霉(Aspergillus fumigatus)β-葡糖苷酶(WO2005/047499)和嗜热子囊菌(Thermoascus aurantiacus)GH61A多肽(WO2005/074656)的里氏木霉(Trichoderma reesei)纤维素酶制剂的共混物。
纤维素分解酶组合物2：烟曲霉(Aspergillus fumigatus)GH10木聚糖酶(WO2006/078256)和烟曲霉(Aspergillus fumigatus)β-木糖苷酶(WO 2011/057140)与含有烟曲霉(Aspergillus fumigatus)纤维二糖水解酶I(WO 2011/057140)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)纤维二糖水解酶II(WO 2011/057140)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)β-葡糖苷酶变体(WO 2012/044915)和青霉属(Penicillium sp.)(埃默森青霉(emersonii))GH61多肽(WO 2011/041397)的里氏木霉(Trichoderma reesei)纤维素酶制剂的共混物。
纤维素材料的酶和微生物处理
由在实例1中所述的挤出过程在“挤出”下得到的经过碱预处理的玉米秸秆(5％CaO，含水量35％)是由ADM(Decatur，IL，USA)获得的。未经处理的材料的pH是大约9。没有进行另外的洗涤步骤或pH调节步骤来降低pH值。采用Mettler-Toledo卤素水分天平(Model#H663)对总固体含量进行测定。在总共100g干的等量的经过预处理的玉米秸秆中加入水、酶和微生物，达到总秸杆固体含量50％，组合如下：
i)只有水(对照组)
ii)0.15wt.％干物质计(每100g干秸杆中0.15g产品)和水
iii)地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)(NRRL B-50621)，加入量是1×107CFU/g干秸杆，以及水
iv)0.15wt.％干物质，地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)(NRRL B-50621)加入量是1×107CFU/g干秸杆，以及水
v)0.15wt.％干物质计，纤维素分解酶组合物2，0.2wt.％干物质(每100g干秸杆0.2g产品)和水
将得到的材料用手混合五分钟。在将样品分为四袋，各袋约50g之前，将各混合物静置十分钟。施加真空，并且使用可商购的真空系统形成厌氧环境而对袋子进行密封。将袋子在37℃下孵育3周。三周的孵育之后，将四份50克的样品送到乳制品及饲料实验室(Dairy One Forage Laboratory)进行体外真消化率(IVTD)检测。
从乳制品及饲料实验室(Dairy One Forage Laboratory)得到的平均IVTD数据、IVTD的平均提高率(高于对照组的干物质(DM)百分比)、以及由不同处理得到的标准差(四份样品的)，在表8中进行了描述。
表8：在37℃下进行三周孵育的结果
数据证明，(特异腐质霉(Humicola insolens))和地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)(NRRL B-50621)即使在没有pH调节时也可增加碱性秸杆的瘤胃体外消化率。另外，通过将与地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)(NRRL B-50621)或纤维素分解酶组合物2结合使用，可进一步地提高瘤胃消化率，可增加用于饲喂反刍动物的碱处理的秸杆的饲料价值。
实例3
从爱荷华州立大学(Iowa State University)获得被粉碎至6mm或以下的未经处理的材料玉米秸秆。粉碎的未经处理的秸杆具有一些较大的碎片(2-3英寸长)和应被去除的一些芯和仁的碎片(估计有大约10％-15％，按重量计)。通过筛子来对秸杆进行筛分，来除去一些尘土。采用Mettler-Toledo卤素水分天平对总固体含量进行测定。使用厨用混合器将近2.5kg上述玉米秸秆与水结合，使总固体含量达到70％。然后，将800g未经处理的秸杆放在间歇式反应器(Lab-O-Mat，Werner Mathis USA Inc.，Concord，NC，USA)中，在140℃下持续15分钟。在热处理之后，向大约400g经过热处理的秸杆中加入纤维素分解酶组合物1和水，使总固体含量达到50％。纤维素分解酶组合物1的加入量是固形物的0、0.1和1％wt.％(即为每100g干玉米秸秆固形物中0、0.1g和1g产品)。使用厨用混合器(4.5夸脱，立式混合器)来对水和/或酶与经过热处理的玉米秸秆进行混合。一式两份地制备大约250g的经过处理的样品(固形物大约50％)，然后在塑料袋中在30℃下孵育一周。一周的孵育之后，将样品送到乳制品及饲料实验室(Dairy OneForage Laboratory)进行体外真消化率(IVTD)检测。
从乳制品及饲料实验室(Dairy One Forage Laboratory)得到的平均IVTD数据、IVTD的平均提高率(高于未处理对照组的干物质(DM)百分比)、以及由这些处理得到的标准差(两份重复样品的)，在表9中进行了描述。
表9：在30℃下进行1周孵育的结果
数据显示，单用热处理可提高玉米秸秆的瘤胃消化率，但加入纤维素分解酶组合物1可进一步实质上增强经过热处理的秸杆的瘤胃消化率。
实例4
通过1”筛子使用筒式粉碎机(HayBuster H1000)将玉米秸秆(Mahomet农场，IL，2011收获)粉碎，然后水化至含水量45％。在混合小车(Kuhn andKnight3130)中的混合过程中施加标准生石灰(干秸杆的5wt.％)，将经过处理的秸杆在储存库中有氧条件下储存8天。在初始的熟化(curing)步骤之后，将经过石灰处理的秸杆从储存库中转移到混合小车(Kuhn and Knight3130)中，采用下述处理方法将微生物和酶与材料混合：
a)枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)(NRRL B-50606)，加入量是1×107CFU/gm秸杆(处理A)
b)枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)(NRRL B-50136)，加入量是1×107CFU/gm秸杆(处理B)
c)枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)(NRRL B-50606)，加入量是1×107CFU/gm秸杆，同时加入酶加入量是0.15wt.％(按干秸杆的wt.％，是每100g干秸杆0.15g的产品)(处理C)
酶和微生物首先与水混合以利于其在秸杆中的分散，其最终含水量是大约50wt.％。由上述处理A、B和C得到的大约1400kg经过处理的秸杆(含水量是50％)被送回储存，并且在饲喂之前厌氧储存3周。此外，将下述饲料成分预熟化(procured)。玉米(由Urabana，IL农场得)，湿酒糟及其可溶物(WDGS)(由ADM plant Peoria，IL plant获得)，维生素/矿物质补充剂(伊利诺伊大学牛肉研究中心(Beef research unit at Univ of Illinois))。除标准工业饲养场饮食以外，如下面所指明的以干物质为基础将各成份混合形成食谱A、B和C。与标准工业饲养场饮食相比，使用由处理A、B和C过程得到的经过处理的秸杆，使玉米的用量下降大约45％。
在26天饲喂试验中(伊利诺伊大学牛肉研究中心(Beef research unit，Univ of Illinois))，使用Angus cross小母牛(平均初始体重＝616±9kg)。在第2天对小母牛进行称重，随机分至4栏中的1栏。对各栏(4只动物/栏)指定进行如下处理之一：(％表示按干物质计的wt.％)。
1)标准工业饲养场饮食(5％的未经处理的玉米秸秆，40％的WDGS，45％的玉米，以及10％的维生素/矿物质补充剂)，
2)食谱A(30％的经过处理A的玉米秸秆，40％的WDGS，25％的玉米，以及5％的维生素/矿物质补充剂)，
3)食谱B(30％的经过处理B的玉米秸秆，40％的WDGS，25％的玉米，以及5％的维生素/矿物质补充剂)，以及
4)食谱C(30％的经过处理C的玉米秸秆，40％的WDGS，25％的玉米，以及5％的维生素/矿物质补充剂)。
在试验过程中，采用GrowSafe系统(购自加拿大艾尔德里)对所有小母牛记录个体采食量。在试验结束时再次对小母牛进行称重来确定最终体重。
结果：
在表10中对小母牛的性能结果进行了总结如下：
标准工业饮食 食谱A 食谱B 食谱C SE P值
开始时体重，kg 610 635 611 610 22 0.91
结束时体重，kg 649 649 636 633 22 0.98
平均日增重，kg 1.53 0.53 1.00 0.91 0.224 0.08
干物质采食量，kg/d 12.86 11.82 11.82 12.32 0.74 0.70
干物质采食量数据显示，经过石灰处理的玉米秸秆与微生物或微生物与酶进行混合后，即使在饮食中的玉米用量减少45％，也是适口的，由此可被用于替代广泛用于饲喂反刍动物的昂贵的玉米。含有枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)(NRRL B-50136)菌株的食谱B在平均日增重和干物质采食量方面显示了最佳性能。还有，通过将食谱A与食谱C相比较，观察到在枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)中添加特异腐质霉(Humicola insolens)蛋白复合物可增加适口性(干物质采食量)以及平均日增重。
生物材料保藏
下述生物材料遵照布达佩斯条约被保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)中，10801大学Blvd.，马纳萨斯(Manassas)，VA20108，USA，以及在美国国家农业应用研究中心的微生物基因组和生物加工研究单位(NRRL(农业研究培养物保藏中心))中1815N.大学路(University Street)，Peoria，IL61604，USA，并指定下述保藏号：
表3：生物材料保藏
鉴定 保藏号 保藏日期
短小芽胞杆菌(Bacillus pumilus) ATCC700385 1997年10月28日
地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis) NRRL B-50015 2007年3月14日
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) NRRL B-50136 2010年5月30日
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) NRRL B-50605 2011年11月30日
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) NRRL B-50606 2011年11月30日
解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens) NRRL B-50607 2011年11月30日
地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis) NRRL B-50621 2011年12月14日
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) NRRL B-50622 2011年12月14日
地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis) NRRL B-50623 2011年12月14日
解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens) PTA-7543 2006年4月20日
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) PTA-7547 2006年4月20日
这些菌株被保藏的条件是可确保其被国外专利法决定授权的未定期间可用来得到培养物。保藏物代表了被保藏菌株的基本上纯的培养物。需要按一些国家的国外专利法要求提供保藏物，在这些国家将申请主题的极似物(counterpart)或其子代(progeny)被提交。然而应理解，保藏物的可用性不构成将本发明主题用于由政府行为批准的专利权的克减的许可。
在此描述和要求保护的本发明不受在此披露的特定实施例的范围的限制，因为这些实施例用意是作为对本发明的几个方面的说明。任何等同的实施例都包括在本发明的范围之内。事实上，除了在此示出并且描述的那些，本发明的各种修改从前述说明书对于本领域技术人员来说将变得清楚。这类修改还旨在落入附加权利要求书的范围内。在发生冲突的情况下，包括这些定义的本披露将控制。
在此引用了不同的参考，其披露通过引用以其全部内部结合在此。
本发明在下面各段中进行了进一步的定义：
1.一种用于生产动物饲料的方法，该方法包括：
(a)对纤维素材料进行预处理，以分离和/或释放纤维素、半纤维素和/或木质素；
(b)用至少一种芽孢杆菌(Bacillus)菌株接种所述经过预处理的纤维素材料；
(c)将所述用至少一种芽孢杆菌(Bacillus)菌株接种的材料进行孵育；
(d)加入一种蛋白源来生产动物饲料添加剂；
其中步骤(d)是在步骤(a)、(b)或(c)之后发生的，或与步骤(b)或(c)同时发生。
2.如第1段所述的方法，其中步骤(d)发生在步骤(a)之后。
3.如第1段所述的方法，其中步骤(d)发生在步骤(b)之后。
4.如第1段所述的方法，其中步骤(d)发生在步骤(c)之后。
5.如第1段所述的方法，其中步骤(d)与步骤(b)同时发生。
6.如第1段所述的方法，其中步骤(d)与步骤(c)同时发生。
7.如第1-6段中的任何一项所述的方法，其中该至少一种芽孢杆菌(Bacillus)菌株是选自于下组的物种的菌株，该组由以下各项组成：解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)、产氮芽孢杆菌(Bacillus azotoformans)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)、弯曲芽孢杆菌(Bacillus flexus)、梭形芽孢杆菌(Bacillusfusiformis)、球孢芽孢杆菌(Bacillus globisporus)、解葡糖芽孢杆菌(Bacillusglucanolyticus)、Bacillus infermus、左旋乳酸芽孢杆菌(Bacillus laevolacticus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、海洋芽孢杆菌(Bacillus marinus)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、莫海威芽孢杆菌(Bacillus mojavensis)、蕈状芽孢杆菌(Bacillus mycoides)、芽孢杆菌苍白球(Bacillus pallidus)、类短芽孢杆菌(Bacillus parabrevis)、巴氏芽孢杆菌(Bacillus pasteurii)、多粘芽孢杆菌(Bacillus polymyxa)、日本甲虫芽孢杆菌(Bacillus popiliae)、短小芽胞杆菌(Bacillus pumilus)、球形芽孢杆菌(Bacillus sphaericus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、淀粉芽孢杆菌(Bacillus thermoamylovorans)、苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)，以及它们的组合。
8.如第7段所述的方法，其中该至少一种芽孢杆菌(Bacillus)菌株是选自于下组的物种的菌株，该组由以下各项组成：解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、短小芽胞杆菌(Bacillus pumilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、以及它们的任何组合。
9.如第8段所述的方法，其中该至少一种芽孢杆菌(Bacillus)菌株选自于下组,该组由以下各项组成的组：ATCC 700385、NRRL B-50136、NRRLB-50622、NRRL B-50623、NRRL B-50605、NRRL B-50621、NRRL B-50015、NRRL B-50607、NRRL B-50606、PTA-7543、PTA-7547、以及它们的任何组合。
10.如第1-9段中的任何一项所述的方法，其中所述至少一种微生物能够产生水解酶、纤维素分解酶、或它们的组合。
11.如第1-10段中的任何一项所述的方法，其中该纤维素材料是选自于下组，该组由以下各项组成：玉米秸秆、玉米纤维、大豆秸杆、大豆纤维、稻草、松木、木屑、杨树、小麦秸秆、柳枝稷、甘蔗渣、绿色切碎的整个玉米、干草、苜蓿、以及它们的任何组合。
12.如第11段所述的方法，其中所述材料是玉米秸秆。
13.如第1-12段中的任何一项所述的方法，其中该预处理包括化学预处理。
14.如第13段所述的方法，其中该化学预处理是碱性化学预处理。
15.如第14段所述的方法，其中该碱性化学预处理是用氧化钙、氢氧化钠、氨或它们的组合的处理。
16.如第1-15段中的任何一项所述的方法，其中该预处理包括机械预处理。
17.如第16段所述的方法，其中该机械预处理与化学预处理同时发生。
18.如第1-17段中的任何一项所述的方法，其中该预处理包括生物预处理。
19.如第1-18段中的任何一项所述的方法，其中该预处理包括热预处理。
20.如第1-19段中的任何一项所述的方法，其中该纤维素材料与至少一种芽孢杆菌(Bacillus)菌株在有氧条件下进行孵育。
21.如第1-19段中的任何一项所述的方法，其中该纤维素材料与该至少一种芽孢杆菌(Bacillus)菌株在基本上厌氧的条件下进行孵育。
22.如第1-19段中的任何一项所述的方法，其中该纤维素材料与该至少一种芽孢杆菌(Bacillus)菌株在厌氧条件进行孵育。
23.如第1-22段中的任何一项所述的方法，其中该蛋白源是一种动物蛋白或一种植物蛋白。
24.如第23段所述的方法，其中该动物蛋白是选自于下组，该组由以下各项组成：肉粉、骨粉和鱼粉。
25.如第23段所述的方法，其中该植物蛋白是豆科植物或谷物。
26.如第23段所述的方法，其中该植物蛋白是选自于由以下各项组成的组：大麦、卷心菜、棉籽、羽扇豆、玉米、微藻类、燕麦、油菜籽、大米、黑麦、大豆、向日葵种子、高粱、黑小麦和小麦。
27.如第23段所述的方法，其中该蛋白源是具有可溶物的干酒糟。
28.如第23段所述的方法，其中该蛋白源是一种可被反刍动物利用以满足其蛋白需求的非蛋白氮源，例如尿素或氨。
29.如第23段所述的方法，其中该蛋白源是一种必需氨基酸，例如选自于下组的一种氨基酸，该组由以下各项组成：苯丙氨酸、缬氨酸、苏氨酸、蛋氨酸、精氨酸、色氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸和赖氨酸。
30.如第1-29段中的任何一项所述的方法，该方法进一步包括向所述的纤维素材料施加至少一种另外的微生物。
31.如第30段所述的方法，其中所述的至少一种另外的微生物是乳杆菌(Lactobacillus spp)的一种菌株。
32.如第31段所述的方法，其中所述至少一种另外的微生物是选自下组的物种的菌株，该组由以下各项组成：耐酸乳杆菌(Lactobacillusacetotolerans)、嗜酸性乳杆菌(Lactobacillus acidifarinaei)、马里乳杆菌(Lactobacillus acidipiscis)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、能动乳杆菌(Lactobacillus agilis)、柄乳杆菌(Lactobacillus algidus)、食品乳杆菌(Lactobacillus alimentarius)、解淀粉类芽孢杆菌(Lactobacillusamylolyticus)、嗜淀粉乳杆菌(Lactobacillus amylophilus)、Lactobacillusamylotrophicus、食淀粉乳杆菌(Lactobacillus amylovorus)、动物双歧杆菌(Lactobacillus animalis)、Lactobacillus antri、Lactobacillus apodemi、鸟乳杆菌(Lactobacillus aviaries)、双发酵乳杆菌(Lactobacillus bifermentans)、短乳杆菌(Lactobacillus brevis)、布氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri)、Lactobacillus camelliae、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、链状乳杆菌(Lactobacillus catenaformis)、Lactobacillus ceti、Lactobacillus coleohominis、丘状菌落乳杆菌(Lactobacillus collinoides)、复合乳杆菌(Lactobacilluscomposti)、凹乳杆菌(Lactobacillus concavus)、棒状乳杆菌(Lactobacilluscoryniformis)、卷曲乳酸杆菌(Lactobacillus crispatus)、面包乳杆菌(Lactobacillus crustorum)、弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)、德氏乳杆菌德氏亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp.delbrueckii)、德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus)、德氏乳杆菌乳酸亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp.lactis)、糊精乳杆菌(Lactobacillusdextrinicus)、Lactobacillus diolivorans、马乳杆菌(Lactobacillus equi)、同代乳杆菌(Lactobacillus equigenerosi)、Lactobacillus farraginis、香肠乳杆菌(Lactobacillus farciminis)、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)、Lactobacillus fornicalis、食果糖乳杆菌(Lactobacillus fructivorans)、Lactobacillus frumenti、Lactobacillus fuchuensis、禾口鸡乳杆菌(Lactobacillusgallinarum)、格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)、胃乳杆菌(Lactobacillusgastricus)、加纳乳杆菌(Lactobacillus ghanensis)、草乳杆菌(Lactobacillusgraminis)、Lactobacillus hammesii、仓鼠乳杆菌(Lactobacillus hamster)、哈尔滨乳杆菌(Lactobacillus harbinensis)、Lactobacillus hayakitensis、瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)、希氏乳杆菌(Lactobacillus hilgardii)、同型腐酒乳杆菌(Lactobacillus homohiochii)、惰性乳杆菌(Lactobacillus iners)、Lactobacillus ingluviei、肠乳杆菌(Lactobacillus intestinalis)、詹氏乳杆菌(Lactobacillus jensenii)、约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)、Lactobacilluskalixensis、马乳酒样乳杆菌(Lactobacillus kefiranofaciens)、开菲尔乳杆菌(Lactobacillus kefiri)、泡菜乳杆菌(Lactobacillus kimchii)、Lactobacilluskitasatonis、昆氏乳酸杆菌(Lactobacillus kunkeei)、赖氏乳杆菌(Lactobacillusleichmannii)、林氏乳酸杆菌(Lactobacillus lindneri)、坏发酵乳杆菌(Lactobacillus malefermentans)、马里乳杆菌(Lactobacillus mali)、Lactobacillus manihotivorans、Lactobacillus mindensis、粘膜乳杆菌(Lactobacillus mucosae)、小鼠乳杆菌(Lactobacillus murinus)、内氏乳杆菌(Lactobacillus nagelii)、Lactobacillus namurensis、Lactobacillus nantensis、寡发酵乳杆菌(Lactobacillus oligofermentans)、口乳杆菌(Lactobacillus oris)、潘尼斯乳杆菌(Lactobacillus panis)、Lactobacillus pantheris、短短乳杆菌(Lactobacillus parabrevis)、类布氏乳杆菌(Lactobacillus parabuchneri)、Lactobacillus paracollinoides、Lactobacillus parafarraginis、Lactobacillusparakefiri、类食品乳杆菌(Lactobacillus paralimentarius)、类植物乳杆菌(Lactobacillus paraplantarum)、戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus)、Lactobacillus perolens、植物乳酸杆菌(Lactobacillus plantarum)、蓬蒂斯乳杆菌(Lactobacillus pontis)、鹦鹉乳杆菌(Lactobacillus psittaci)、Lactobacillusrennin、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、雷曼氏乳酸杆菌(Lactobacillusrhamnosus)、龈沟乳杆菌(Lactobacillus rimae)、罗氏乳杆菌(Lactobacillusrogosae)、Lactobacillus rossiae、瘤胃乳酸杆菌(Lactobacillus ruminis)、Lactobacillus saerimneri、米酒乳杆菌(Lactobacillus sakei)、唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)、旧金山乳杆菌(Lactobacillus sanfranciscensis)、赤乳杆菌(Lactobacillus satsumensis)、Lactobacillus secaliphilus、Lactobacillussharpeae、Lactobacillus siliginis、Lactobacillus spicheri、猪双臼杆菌(Lactobacillus suebicus)、Lactobacillus thailandensis、Lactobacillus ultunensis、Lactobacillus vaccinostercus、阴道乳杆菌(Lactobacillus vaginalis)、Lactobacillus versmoldensis、Lactobacillus vini、小牛乳酸杆菌(Lactobacillusvitulinus)、玉米乳杆菌(Lactobacillus zeae)、Lactobacillus zymae。
33.如第1-32段中的任何一项所述的方法，该方法进一步包括向经过预处理的纤维素材料中施加至少一种酶。
34.如第33段所述的方法，其中该至少一种酶是选自于由以下各项组成的组：淀粉酶、碳水化物酶、纤维素酶、酯酶、棒曲霉素、具有纤维素分解增强活性的GH61多肽、葡萄糖醛酸酶、半纤维素酶、漆酶、脂酶、木质素分解酶、果胶酶、过氧化物酶、植酸酶、蛋白酶、膨胀因子、木聚糖酶，以及它们的任意组合。
35.一种用于生产动物饲料的方法，该方法包括：
(a)对纤维素材料进行预处理，以分离和/或释放纤维素、半纤维素和/或木质素；
(b)用至少一种微生物接种所述经过预处理的纤维素材料；
(c)将所述用至少一种微生物接种的材料进行孵育；
(d)将至少一种酶施加到经过预处理的纤维素材料；并且
(e)加入一种蛋白源来生产动物饲料添加剂；
其中步骤(d)是在步骤(a)、(b)、(c)或(e)之后发生的，或与步骤(b)、(c)或(e)同时发生，并且步骤(e)是在步骤(a)、(b)、(c)或(d)之后发生的，或与步骤(b)、(c)或(d)同时发生。
36.如第35段所述的方法，其中步骤(d)发生在步骤(a)之后。
37.如第35段所述的方法，其中步骤(d)发生在步骤(b)之后。
38.如第35段所述的方法，其中步骤(d)发生在步骤(c)之后。
39.如第35段所述的方法，其中步骤(d)发生在步骤步骤(e)之后。
40.如第35段所述的方法，其中步骤(d)与步骤(b)同时发生。
41.如第35段所述的方法，其中步骤(d)与步骤(c)同时发生。
42.如第35段所述的方法，其中步骤(d)与步骤步骤(e)同时发生。
43.如第35-42段中的任何一项所述的方法，其中步骤(e)发生在步骤(a)之后。
44.如第35-42段中的任何一项所述的方法，其中步骤(e)发生在步骤(b)之后。
45.如第35-42段中的任何一项所述的方法，其中步骤(e)发生在步骤(c)之后。
46.如第35-42段中的任何一项所述的方法，其中步骤(e)发生在步骤(d)之后。
47.如第35-42段中的任何一项所述的方法，其中步骤(e)与步骤(b)同时发生。
48.如第35-42段中的任何一项所述的方法，其中步骤(e)与步骤(c)同时发生。
49.如第35-42段中的任何一项所述的方法，其中步骤(e)与步骤(d)同时发生。
50.如第35-49段中的任何一项所述的方法，其中该至少一种微生物包括一种芽孢杆菌(Bacillus)菌株.
51.如第50段所述的方法，其中该芽孢杆菌属(Bacillus spp.)的菌株是选自下组的物种的菌株，该组由以下各项组成：解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)、萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)、产氮芽孢杆菌(Bacillus azotoformans)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)、弯曲芽孢杆菌(Bacillus flexus)、梭形芽孢杆菌(Bacillusfusiformis)、球孢芽孢杆菌(Bacillus globisporus)、解葡糖芽孢杆菌(Bacillusglucanolyticus)、Bacillus infermus、左旋乳酸芽孢杆菌(Bacillus laevolacticus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、海洋芽孢杆菌(Bacillus marinus)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、莫海威芽孢杆菌(Bacillus mojavensis)、蕈状芽孢杆菌(Bacillus mycoides)、芽孢杆菌苍白球(Bacillus pallidus)、类短芽孢杆菌(Bacillus parabrevis)、巴氏芽孢杆菌(Bacillus pasteurii)、多粘芽孢杆菌(Bacillus polymyxa)、日本甲虫芽孢杆菌(Bacillus popiliae)、短小芽胞杆菌(Bacillus pumilus)、球形芽孢杆菌(Bacillus sphaericus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、淀粉芽孢杆菌(Bacillus thermoamylovorans)、苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)，以及它们的组合。
52.如第51段所述的方法，其中该至少一种细菌是选自于下组的芽孢杆菌(Bacillus)的菌株,该组由以下各项组成：ATCC 700385、NRRL B-50136、NRRL B-50622、NRRL B-50623、NRRL B-50605、NRRL B-50621、NRRLB-50015、NRRL B-50607、NRRL B-50606、PTA-7543、PTA-7547，以及它们的任何组合。
53.如第35-52段中的任何一项所述的方法，其中该至少一种微生物包括一种乳杆菌(Lactobacillus)菌株。
54.如第53段所述的方法，其中该乳杆菌属(Lactobacillus)菌株是选自于下组物种的菌株，该组由以下各项组成：耐酸乳杆菌(Lactobacillusacetotolerans)、嗜酸性乳杆菌(Lactobacillus acidifarinaei)、马里乳杆菌(Lactobacillus acidipiscis)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、能动乳杆菌(Lactobacillus agilis)、柄乳杆菌(Lactobacillus algidus)、食品乳杆菌(Lactobacillus alimentarius)、解淀粉类芽孢杆菌(Lactobacillusamylolyticus)、嗜淀粉乳杆菌(Lactobacillus amylophilus)、Lactobacillusamylotrophicus、食淀粉乳杆菌(Lactobacillus amylovorus)、动物双歧杆菌(Lactobacillus animalis)、Lactobacillus antri、Lactobacillus apodemi、鸟乳杆菌(Lactobacillus aviaries)、双发酵乳杆菌(Lactobacillus bifermentans)、短乳杆菌(Lactobacillus brevis)、布氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri)、Lactobacillus camelliae、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、链状乳杆菌(Lactobacillus catenaformis)、Lactobacillus ceti、Lactobacillus coleohominis、丘状菌落乳杆菌(Lactobacillus collinoides)、复合乳杆菌(Lactobacilluscomposti)、凹乳杆菌(Lactobacillus concavus)、棒状乳杆菌(Lactobacilluscoryniformis)、卷曲乳酸杆菌(Lactobacillus crispatus)、面包乳杆菌(Lactobacillus crustorum)、弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)、德氏乳杆菌德氏亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp.delbrueckii)、德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus)、德氏乳杆菌乳酸亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp.lactis)、糊精乳杆菌(Lactobacillusdextrinicus)、Lactobacillus diolivorans、马乳杆菌(Lactobacillus equi)、同代乳杆菌(Lactobacillus equigenerosi)、Lactobacillus farraginis、香肠乳杆菌(Lactobacillus farciminis)、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)、Lactobacillus fornicalis、食果糖乳杆菌(Lactobacillus fructivorans)、Lactobacillus frumenti、Lactobacillus fuchuensis、禾口鸡乳杆菌(Lactobacillusgallinarum)、格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)、胃乳杆菌(Lactobacillusgastricus)、加纳乳杆菌(Lactobacillus ghanensis)、草乳杆菌(Lactobacillusgraminis)、Lactobacillus hammesii、仓鼠乳杆菌(Lactobacillus hamster)、哈尔滨乳杆菌(Lactobacillus harbinensis)、Lactobacillus hayakitensis、瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)、希氏乳杆菌(Lactobacillus hilgardii)、同型腐酒乳杆菌(Lactobacillus homohiochii)、惰性乳杆菌(Lactobacillus iners)、Lactobacillus ingluviei、肠乳杆菌(Lactobacillus intestinalis)、詹氏乳杆菌(Lactobacillus jensenii)、约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)、Lactobacilluskalixensis、马乳酒样乳杆菌(Lactobacillus kefiranofaciens)、开菲尔乳杆菌(Lactobacillus kefiri)、泡菜乳杆菌(Lactobacillus kimchii)、Lactobacilluskitasatonis、昆氏乳酸杆菌(Lactobacillus kunkeei)、赖氏乳杆菌(Lactobacillusleichmannii)、林氏乳酸杆菌(Lactobacillus lindneri)、坏发酵乳杆菌(Lactobacillus malefermentans)、马里乳杆菌(Lactobacillus mali)、Lactobacillus manihotivorans、Lactobacillus mindensis、粘膜乳杆菌(Lactobacillus mucosae)、小鼠乳杆菌(Lactobacillus murinus)、内氏乳杆菌(Lactobacillus nagelii)、Lactobacillus namurensis、Lactobacillus nantensis、寡发酵乳杆菌(Lactobacillus oligofermentans)、口乳杆菌(Lactobacillus oris)、潘尼斯乳杆菌(Lactobacillus panis)、Lactobacillus pantheris、短短乳杆菌(Lactobacillus parabrevis)、类布氏乳杆菌(Lactobacillus parabuchneri)、Lactobacillus paracollinoides、Lactobacillus parafarraginis、Lactobacillusparakefiri、类食品乳杆菌(Lactobacillus paralimentarius)、类植物乳杆菌(Lactobacillus paraplantarum)、戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus)、Lactobacillus perolens、植物乳酸杆菌(Lactobacillus plantarum)、蓬蒂斯乳杆菌(Lactobacillus pontis)、鹦鹉乳杆菌(Lactobacillus psittaci)、Lactobacillusrennin、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、雷曼氏乳酸杆菌(Lactobacillusrhamnosus)、龈沟乳杆菌(Lactobacillus rimae)、罗氏乳杆菌(Lactobacillusrogosae)、Lactobacillus rossiae、瘤胃乳酸杆菌(Lactobacillus ruminis)、Lactobacillus saerimneri、米酒乳杆菌(Lactobacillus sakei)、唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)、旧金山乳杆菌(Lactobacillus sanfranciscensis)、赤乳杆菌(Lactobacillus satsumensis)、Lactobacillus secaliphilus、Lactobacillussharpeae、Lactobacillus siliginis、Lactobacillus spicheri、猪双臼杆菌(Lactobacillus suebicus)、Lactobacillus thailandensis、Lactobacillus ultunensis、Lactobacillus vaccinostercus、阴道乳杆菌(Lactobacillus vaginalis)、Lactobacillus versmoldensis、Lactobacillus vini、小牛乳酸杆菌(Lactobacillusvitulinus)、玉米乳杆菌(Lactobacillus zeae)、Lactobacillus zymae。
55.如第35-54段中的任何一项所述的方法，其中该纤维素材料是选自于以下各项组成的组：玉米秸秆、玉米纤维、大豆秸杆、大豆纤维、稻草、松木、木屑、杨树、小麦秸秆、柳枝稷、甘蔗渣、绿色切碎的整个玉米、干草、苜蓿、以及它们的任何组合。
56.如第55段所述的方法，其中所述的材料是玉米秸秆。
57.如第35-56段中的任何一项所述的方法，其中该预处理包括化学预处理。
58.如第57段所述的方法，其中该化学预处理是碱性化学预处理。
59.如第58段所述的方法，其中该碱性化学预处理是用氧化钙、氢氧化钠、氨或它们的组合的处理。
60.如第35-59段中的任何一项所述的方法，其中该预处理包括机械预处理。
61.如第60段所述的方法，其中该机械预处理与化学预处理同时发生。
62.如第35-61段中的任何一项所述的方法，其中该预处理包括生物预处理。
63.如第35-62段中的任何一项所述的方法，其中该预处理包括热预处理。
64.如第35-63段中的任何一项所述的方法，其中该纤维素材料与至少一种微生物在有氧条件下进行孵育。
65.如第35-63段中的任何一项所述的方法，其中该纤维素材料与至少一种微生物在基本上厌氧的条件下进行孵育。
66.如第35-63段中的任何一项所述的方法，其中该纤维素材料与至少一种微生物在厌氧条件下进行孵育。
67.如第35-66段中的任何一项所述的方法，其中该蛋白源是一种动物蛋白或一种植物蛋白。
68.如第67段所述的方法，其中该动物蛋白是选自于由以下各项组成的组：肉粉、骨粉和鱼粉。
69.如第67段所述的方法，其中该植物蛋白是豆科植物或谷物。
70.如第67段所述的方法，其中该植物蛋白是选自于由以下各项组成的组：大麦、卷心菜、棉籽、羽扇豆、玉米、微藻类、燕麦、油菜籽、大米、黑麦、大豆、向日葵种子、高粱、黑小麦和小麦。
71.如第67段所述的方法，其中该蛋白源是具有可溶物的干酒糟。
72.如第67段所述的方法，其中该蛋白源是一种可被反刍动物利用以满足其蛋白需求的非蛋白氮源，例如尿素或氨。
73.如第67段所述的方法，其中该蛋白源是一种必需氨基酸，例如选自于下组的一种氨基酸，该组由以下各项组成：苯丙氨酸、缬氨酸、苏氨酸、蛋氨酸、精氨酸、色氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸和赖氨酸。
74.如第35-73段中的任何一项所述的方法，其中该至少一种酶是选自于由以下各项组成的组：淀粉酶、碳水化物酶、纤维素酶、酯酶、棒曲霉素、具有纤维素分解增强活性的GH61多肽、葡萄糖醛酸酶、半纤维素酶、漆酶、脂酶、木质素分解酶、果胶酶、过氧化物酶、植酸酶、蛋白酶、膨胀因子、木聚糖酶，以及它们的任意组合。
75.如第74段所述的方法，其中该至少一种酶包括内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶以及β-葡糖苷酶。
76.如第74段所述的方法，其中该至少一种酶包括内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、β-葡糖苷酶、以及GH61多肽。
77.如第75段所述的方法，其中该至少一种酶进一步地包括木聚糖酶。
78.如第75或76段所述的方法，其中该至少一种酶进一步地包括β-木糖苷酶。
79.一种用于生产动物饲料的方法，该方法包括：
(a)对纤维素材料进行预处理，以分离和/或释放纤维素、半纤维素和/或木质素；
(b)在pH7.5-11下，用一种或多种选自下组的酶对经过预处理的纤维素材料进行处理，该组由以下各项组成：乙酰木聚糖酯酶，α-L-阿拉伯呋喃糖酶，β-葡糖苷酶，β-木糖苷酶，纤维二糖水解酶，纤维二糖脱氢酶，内切半乳糖苷酶，内切葡聚糖酶，阿魏酸酯酶，以及木聚糖酶；并且
(c)向经过预处理的纤维素材料加入蛋白源，以生产该动物饲料；
其中步骤(c)是在步骤(a)或(b)之后发生的，或与步骤(b)同时发生。
80.如第79段所述的方法，其中步骤(c)是在步骤(a)之后发生的。
81.如第79段所述的方法，其中步骤(c)是在步骤(b)之后发生的。
82.如第79段所述的方法，其中步骤(c)与步骤(b)同时发生。
83.如第79-82段中的任何一项所述的方法，其中pH是在8-10的范围内。
84.如第79-83段中的任何一项所述的方法，其中该经过预处理的纤维素材料是用乙酰木聚糖酯酶进行处理的。
85.如第79-84段中的任何一项所述的方法，其中该经过预处理的纤维素材料是用α-L-阿拉伯呋喃糖酶进行处理的。
86.如第79-85段中的任何一项所述的方法，其中该经过预处理的纤维素材料是用β-葡糖苷酶进行处理的。
87.如第79-86段中的任何一项所述的方法，其中该经过预处理的纤维素材料是用β-木糖苷酶进行处理的。
88.如第79-87段中的任何一项所述的方法，其中该经过预处理的纤维素材料是用纤维二糖水解酶进行处理的。
89.如第79-88段中的任何一项所述的方法，其中该经过预处理的纤维素材料是用纤维二糖脱氢酶进行处理的。
90.如第79-89段中的任何一项所述的方法，其中该经过预处理的纤维素材料是用内切半乳糖苷酶进行处理的。
91.如第79-90段中的任何一项所述的方法，其中该经过预处理的纤维素材料是用内切葡聚糖酶进行处理的。
92.如第79-91段中的任何一项所述的方法，其中该经过预处理的纤维素材料是用阿魏酸酯酶进行处理的。
93.如第79-92段中的任何一项所述的方法，其中该经过预处理的纤维素材料是用木聚糖酶进行处理的。
94.如第79-93段中的任何一项所述的方法，其中该经过预处理的纤维素材料是用下述酶中的每个进行处理的：乙酰木聚糖酯酶、α-L-阿拉伯呋喃糖酶、β-葡糖苷酶、β-木糖苷酶、纤维二糖水解酶、纤维二糖脱氢酶、内切半乳糖苷酶、内切葡聚糖酶、阿魏酸酯酶以及木聚糖酶。
95.如第79-94段中的任何一项所述的方法，其中该纤维素材料是选自于以下各项组成的组：玉米秸秆、玉米纤维、大豆秸杆、大豆纤维、稻草、松木、木屑、杨树、小麦秸秆、柳枝稷、甘蔗渣、绿色切碎的整个玉米、干草、苜蓿、以及它们的任何组合。
96.如第95段所述的方法，其中所述材料是玉米秸秆。
97.如第79-96段中的任何一项所述的方法，其中该预处理包括化学处理。
98.如第97段所述的方法，其中该化学处理是碱性化学预处理。
99.如第98段所述的方法，其中该碱性化学处理是用氧化钙、氢氧化钠、氨或它们的组合的处理。
100.如第79-99段中的任何一项所述的方法，其中该预处理包括机械处理。
101.如第100段所述的方法，其中该机械处理与该化学处理同时发生。
102.如第79-101段中的任何一项所述的方法，其中该预处理包括生物处理。
103.如第79-102段中的任何一项所述的方法，其中该预处理包括热预处理。
104.如第79-103段中的任何一项所述的方法，其中该蛋白源是一种动物蛋白或一种植物蛋白。
105.如第104段所述的方法，其中该动物蛋白是选自于由以下各项组成的组：肉粉、骨粉和鱼粉。
106.如第104段所述的方法，其中该植物蛋白是豆科植物或谷物。
107.如第104段所述的方法，其中该植物蛋白是选自于由以下各项组成的组：大麦、卷心菜、棉籽、羽扇豆、玉米、微藻类、燕麦、油菜籽、大米、黑麦、大豆、向日葵种子、高粱、黑小麦和小麦。
108.如第104段所述的方法，其中该蛋白源是具有可溶物的干酒糟。
109.如第104段所述的方法，其中该蛋白源是一种可被反刍动物利用以满足其蛋白需求的非蛋白氮源，例如尿素或氨。
110.如第104段所述的方法，其中该蛋白源是一种必需氨基酸，例如选自于下组的一种氨基酸，该组由以下各项组成：苯丙氨酸、缬氨酸、苏氨酸、蛋氨酸、精氨酸、色氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸和赖氨酸。
111.如第1-110段中的任何一项所述的方法，其中该方法可增加消化率至少5％，例如至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％，直到100％。
112.由第1-111段中的任何一项所述的方法生产的一种动物饲料。
113.如第112段所述的动物饲料，该动物饲料进一步包括至少一种脂溶性维生素、和/或至少一种水溶性维生素、和/或至少一种痕量元素、和/或至少一种宏量元素。
114.如第112或113段所述的动物饲料，该动物饲料进一步包括一种有机酸，如抗坏血酸、柠檬酸、乌头酸、苹果酸、延胡索酸、琥珀酸、乳酸、丙二酸、马来酸、酒石酸、天冬氨酸、草酸、丙醇二酸、草酰乙酸、异苹果酸、焦柠檬酸、戊二酸、酮戊二酸，以及它们的混合物。
115.如第112-114段中的任何一项所述的动物饲料，该动物饲料进一步包括面筋蛋白，例如小麦面筋蛋白、玉米面筋蛋白、燕麦面筋蛋白、黑麦面筋蛋白、水稻球蛋白蛋白、大麦面筋蛋白，以及它们的混合物。
116.如第112-115段中的任何一项所述的动物饲料，该动物饲料进一步包括二价金属离子，例如锌、锰和铁。
117.如第112-116段中的任何一项所述的动物饲料，该动物饲料进一步包括一种植物提取物。
118.如第112-117段中的任何一项所述的动物饲料，该动物饲料进一步包括一种蛋白饲料成分，如植物和植物蛋白，包括可食用谷物以及选自下组的谷物粉粕，该组由以下各项组成：大豆、大豆粉、玉米、玉米粉、亚麻籽、亚麻籽粉、棉籽、棉籽粕、油菜籽粕、高粱蛋白和卡罗拉(canola)粕。蛋白饲料成分的其他实例可包括：玉米或玉米的一种组分，例如像玉米纤维、玉米壳、青贮饲料、玉米粉、或玉米植物的任何其他部分；大豆或大豆的一种组分，例如像大豆皮、大豆青贮、研磨大豆或大豆植物的任何其他部分；小麦或小麦的任何组分，例如像小麦纤维、小麦糠、小麦壳、研磨小麦、小麦胚芽、或小麦植物的任何其他部分；卡罗拉或卡罗拉的任何其它部分，例如像卡罗拉蛋白、卡罗拉壳、研磨卡罗拉或卡罗拉的任何其他部分；向日葵或向日葵植物的一种组分；高粱或高粱植物的一种组分；糖用甜菜或糖用甜菜植物的一种组分；甘蔗或甘蔗植物的一种组分；大麦或大麦植物的一种组分；玉米浆；农业加工设施的废物料；大豆糖蜜；亚麻；花生；豌豆；燕麦；草、例如果园草以及羊茅、以及苜蓿、用于青贮饲料或干草的三叶草。
119.如第112-118段中的任何一项所述的动物饲料，该动物饲料进一步包括干酒糟(DDG)和具有可溶物的干酒糟(DDGS)。
120.如第112-119段中的任何一项所述的动物饲料，该动物饲料进一步包括至少一种选自于下组的其它酶,该组由以下各项组成：植酸酶(EC3.1.3.8或3.1.3.26)、木聚糖酶(EC3.2.1.8)、半乳聚糖酶(EC3.2.1.89)、α-半乳糖苷酶(EC3.2.1.22)、蛋白酶(EC3.4)，磷脂酶A1(EC3.1.1.32)、磷脂酶A2(EC3.1.1.4)、溶血磷脂酶(EC3.1.1.5)、磷脂酶C(3.1.4.3)、磷脂酶D(EC3.1.4.4)、如，例如α-淀粉酶(EC3.2.1.1)等的淀粉酶、和/或β-葡聚糖酶(EC3.2.1.4或EC3.2.1.6)。

Claims (4)

1.一种用于生产动物饲料的方法，该方法包括：
(a)对纤维素材料进行预处理，以分离和/或释放纤维素、半纤维素和/或木质素；
(b)用至少一种芽孢杆菌(Bacillus)菌株接种所述经过预处理的纤维素材料；
(c)将所述用至少一种芽孢杆菌(Bacillus)菌株接种的材料进行孵育；
(d)加入一种蛋白源来生产动物饲料添加剂；
其中步骤(d)是在步骤(a)、(b)或(c)之后发生的，或与步骤(b)或(c)同时发生。
2.一种用于生产动物饲料的方法，该方法包括：
(a)对纤维素材料进行预处理，以分离和/或释放纤维素、半纤维素和/或木质素；
(b)用至少一种微生物接种所述经过预处理的纤维素材料；
(c)将所述用至少一种微生物接种的材料进行孵育；
(d)将至少一种酶施加到经过预处理的纤维素材料；并且
(e)加入一种蛋白源来生产动物饲料添加剂；
其中步骤(d)是在步骤(a)、(b)、(c)或(e)之后发生的，或与步骤(b)、(c)或(e)同时发生，并且步骤(e)是在步骤(a)、(b)、(c)或(d)之后发生的，或与步骤(b)、(c)或(d)同时发生。
3.一种用于生产动物饲料的方法，该方法包括：
(a)对纤维素材料进行预处理，以分离和/或释放纤维素、半纤维素和/或木质素；
(b)在pH7.5-11下，用一种或多种选自下组的酶对经过预处理的纤维素材料进行处理，该组由以下各项组成：乙酰木聚糖酯酶，α-L-阿拉伯呋喃糖酶，β-葡糖苷酶，β-木糖苷酶，纤维二糖水解酶，纤维二糖脱氢酶，内切半乳糖苷酶，内切葡聚糖酶，阿魏酸酯酶，以及木聚糖酶；并且
(c)向经过预处理的纤维素材料加入蛋白源，以生产该动物饲料；
其中步骤(c)是在步骤(a)或(b)之后发生的，或与步骤(b)同时发生。
4.由权利要求1-3中的任何一项所述的方法生产的一种动物饲料。
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