CN103998605A - 纤维二糖水解酶变体和编码它们的多核苷酸 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及纤维二糖水解酶变体。本发明还涉及编码这些变体的多核苷酸;包含这些多核苷酸的核酸构建体、载体、以及宿主细胞;以及产生并使用这些变体的方法。

Description

纤维二糖水解酶变体和编码它们的多核苷酸
关于在联邦资助的研究和开发下完成的发明的权利的声明
本发明是根据能源部授予的合作协议DE-FC36-08GO18080在政府支持下完成的。政府在本发明中拥有一定权利。
序列表的引用
本申请包含一个计算机可读形式的序列表,该序列表通过引用结合在此。
发明背景
发明领域
本发明涉及纤维二糖水解酶变体、编码这些变体的多核苷酸、以及产生和使用这些变体的方法。
相关技术说明
纤维素是单糖葡萄糖通过β-1,4-键共价连接的一种聚合物。许多微生物产生水解β-连接葡聚糖的酶。这些酶包括内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、以及β-葡糖苷酶。内切葡聚糖酶在任意位置消化纤维素聚合物,使其打开而被纤维二糖水解酶攻击。纤维二糖水解酶从纤维素聚合物的末端顺序释放纤维二糖分子。纤维二糖是葡萄糖的一种水溶性β-1,4-连接的二聚体。β-葡糖苷酶将纤维二糖水解成葡萄糖。
将木质纤维素原料转化成乙醇具有如下优点,即易于获得大量原料、避免燃烧或填埋材料的合意性、以及乙醇燃料的清洁性。现在认为木材、农业残余物、草本作物、和城市固体废物是生产乙醇的原料。这些材料主要由纤维素、半纤维素、以及木质素组成。一旦将木质纤维素转化成可发酵的糖,例如葡萄糖,那么这些可发酵的糖就可以容易地被酵母发酵成乙醇。
WO2011/050037披露了具有改进的热稳定性的土生梭孢壳霉(Thielaviaterrestris)纤维二糖水解酶变体。WO2011/050037披露了具有改进的热稳定性的烟曲霉(Aspergillus fumigatus)纤维二糖水解酶变体。
本发明提供具有增加的热稳定性的纤维二糖水解酶变体。
发明概述
本发明涉及分离的纤维二糖水解酶变体,这些变体包含在与SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置112、154、197、228、261、306、以及375相对应的一个或多个(例如,数个)位置处的取代,其中这些变体具有纤维二糖水解酶活性。
本发明还涉及编码这些变体的分离的多核苷酸;包含这些多核苷酸的核酸构建体、载体、以及宿主细胞;以及产生这些变体的方法。
本发明还涉及用于降解或转化纤维素材料的方法,该方法包括:在本发明的纤维二糖水解酶变体的存在下,用一种酶组合物处理该纤维素材料。在一方面,这些方法进一步包括回收所降解的或转化的纤维素材料。
本发明还涉及产生一种发酵产物的方法,这些方法包括:(a)在本发明的纤维二糖水解酶变体的存在下,用一种酶组合物使纤维素材料糖化;(b)用一种或多种(例如,数种)发酵微生物发酵糖化的纤维素材料,以产生该发酵产物;并且(c)从发酵中回收该发酵产物。
本发明还涉及发酵纤维素材料的方法,这些方法包括:用一种或多种(例如,数种)发酵微生物发酵该纤维素材料,其中在本发明的纤维二糖水解酶变体的存在下用一种酶组合物使该纤维素材料糖化。在一方面,发酵该纤维素材料产生一种发酵产物。在另一方面,这些方法进一步包括从发酵中回收该发酵产物。
附图简要说明
图1示出编码具有纤维二糖水解酶活性的GH6多肽的嗜热真菌丝衣霉状篮状菌(Talaromyces byssochlamydoides)基因的基因组DNA序列(SEQ IDNO:1)和推导的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)。
图2示出嗜热真菌丝衣霉状篮状菌家族GH6A纤维二糖水解酶变体的热稳定性。
定义
乙酰木聚糖酯酶:术语“乙酰木聚糖酯酶”意指一种羧基酯酶(EC3.1.1.72),其催化乙酰基从聚合木聚糖、乙酰化木糖、乙酰化葡萄糖、乙酸α-萘酯、以及乙酸对硝基苯酯的水解。出于本发明的目的,在含有0.01%TWEENTM20(聚氧乙烯脱水山梨糖醇单月桂酸酯)的50mM乙酸钠(pH5.0)中使用0.5mM乙酸对硝基苯酯作为底物来测定乙酰木聚糖酯酶活性。一个单位的乙酰木聚糖酯酶定义为能够在pH5、25℃下每分钟释放1微摩尔的对硝基苯酚阴离子的酶的量。
等位基因变体:术语“等位基因变体”意指占据相同染色体基因座的基因的两种或更多种替代形式中的任一种。等位基因变异由突变天然产生,且可导致群体内的多态性。基因突变可以是沉默的(所编码的多肽没有变化)或可以编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位基因变体是由基因的等位基因变体编码的多肽。
α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶:术语“α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶”意指一种α-L-阿拉伯呋喃糖苷阿拉伯呋喃水解酶(EC3.2.1.55),其催化α-L-阿拉伯糖苷中的末端非还原性α-L-阿拉伯呋喃糖苷残基的水解。该酶对α-L-阿拉伯呋喃糖苷、含有(1,3)-和/或(1,5)-键的α-L-阿拉伯聚糖、阿拉伯糖基木聚糖、以及阿拉伯半乳聚糖起作用。α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶还被称为阿拉伯糖苷酶、α-阿拉伯糖苷酶、α-L-阿拉伯糖苷酶、α-阿拉伯呋喃糖苷酶、多糖α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、α-L-阿拉伯呋喃糖苷水解酶、L-阿拉伯糖苷酶、或α-L-阿拉伯聚糖酶。出于本发明的目的,使用每ml的100mM乙酸钠(pH5)中5mg的中等粘度小麦阿拉伯糖基木聚糖(麦格酶国际爱尔兰股份有限公司(Megazyme International Ireland,Ltd.),爱尔兰威克洛郡布瑞公司(Bray,Co.Wicklow,Ireland)以总体积200μl在40℃下持续30分钟,接着通过HPX-87H柱色谱(伯乐实验室有限公司(Bio-Rad Laboratories,Inc.),美国加州赫拉克勒斯(Hercules,CA,USA)进行阿拉伯糖分析来测定α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶活性。
α-葡糖醛酸糖苷酶:术语“α-葡糖醛酸糖苷酶”意指一种α-D-葡糖苷酸葡糖醛酸水解酶(EC3.2.1.139),其催化α-D-葡糖醛酸糖苷到D-葡糖醛酸和醇的水解。出于本发明的目的,根据德弗里斯(de Vries),1998,细菌学杂志(J.Bacteriol.)180:243-249来测定α-葡糖醛酸糖苷酶活性。一个单位的α-葡糖醛酸糖苷酶等于能够在pH5、40℃下每分钟释放1微摩尔的葡糖醛酸或4-O-甲基葡糖醛酸的酶的量。
β-葡糖苷酶:术语“β-葡糖苷酶”意指一种β-D-葡糖苷葡糖水解酶(E.C.3.2.1.21),其催化末端非还原性β-D-葡萄糖残基的水解,并释放β-D-葡萄糖。出于本发明的目的,根据文丘里(Venturi)等人,2002,来自嗜热毛壳菌嗜粪变种的胞外β-D-葡糖苷酶:产生、纯化以及一些生物化学特性(Extracellularbeta-D-glucosidase from Chaetomium thermophilum var.coprophilum:production,purification and some biochemical properties),基础微生物学杂志(J.Basic Microbiol.)42:55-66的程序使用对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷作为底物来测定β-葡糖苷酶活性。一个单位的β-葡糖苷酶定义为在25℃、pH4.8下,在含有0.01%20的50mM柠檬酸钠中从作为底物的1mM对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷每分钟产生1.0微摩尔的对硝基苯酚阴离子。
β-木糖苷酶:术语“β-木糖苷酶”意指一种β-D-木糖苷木糖水解酶(E.C.3.2.1.37),其催化短β(1→4)-木寡糖的外切水解,以从非还原性末端去除连续的D-木糖残基。出于本发明的目的,一个单位的β-木糖苷酶定义为在40℃、pH5下在含有0.01%20的100mM柠檬酸钠中从作为底物的1mM对硝基苯基-β-D-木糖苷每分钟产生1.0微摩尔的对硝基苯酚阴离子。
cDNA:术语“cDNA”意指可以通过反转录从得自真核或原核细胞的成熟的、剪接的mRNA分子制备的DNA分子。cDNA缺乏可以存在于相对应的基因组DNA中的内含子序列。起始的、初级的RNA转录物是mRNA的前体,它通过一系列的步骤(包括剪接)加工,然后作为成熟的已剪接的mRNA出现。
纤维二糖水解酶:术语“纤维二糖水解酶”意指一种1,4-β-D-葡聚糖纤维二糖水解酶(E.C.3.2.1.91和E.C.3.2.1.176),其催化纤维素、纤维寡糖、或任何含有β-1,4-连接葡萄糖的聚合物中的1,4-β-D-糖苷键的水解,从而从链的还原性末端(纤维二糖水解酶I)或非还原性末端(纤维二糖水解酶II)释放纤维二糖(泰里(Teeri),1997,生物技术趋势(Trends in Biotechnology)15:160-167;泰里等人,1998,生物化学学会会刊(Biochem.Soc.Trans.)26:173-178)。根据里弗(Lever)等人,1972,分析生物化学(Anal.Biochem.)47:273-279;范·帝伯赫(van Tilbeurgh)等人,1982,欧洲生化学会联合会快报(FEBS Letters),149:152-156;范·帝伯赫和克莱森斯(Claeyssens),1985,欧洲生化学会联合会快报,187:283-288;以及汤美(Tomme)等人,1988,欧洲生物化学杂志(Eur.J.Biochem.)170:575-581所描述的程序来测定纤维二糖水解酶活性。
纤维素分解酶或纤维素酶:术语“纤维素分解酶”或“纤维素酶”意指一种或多种(例如,数种)水解纤维素材料的酶。这类酶包括一种或多种内切葡聚糖酶、一种或多种纤维二糖水解酶、一种或多种β-葡糖苷酶、或其组合。用于测量纤维素分解活性的两种基本方法包括:(1)测量总纤维素分解活性,并且(2)测量单独的纤维素分解活性(内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、以及β-葡糖苷酶),如在张(Zhang)等人,纤维素酶改进的展望:筛选和选择策略(Outlook for cellulase improvement:Screening and selectionstrategies),2006,生物技术进展(Biotechnology Advances)24:452-481中所综述的。总纤维素分解活性通常使用不溶性底物来测量,这些底物包括瓦特曼(Whatman)1号滤纸、微晶纤维素、细菌纤维素、藻类纤维素、棉花、预处理的木质纤维素等等。最常见的总纤维素分解活性测定是使用瓦特曼1号滤纸作为底物的滤纸测定。该测定是由国际纯粹与应用化学联合会(International Union of Pure and Applied Chemistry(IUPAC))(高斯(Ghose),1987,纤维素酶活性的测量(Measurement of cellulase activities),纯粹与应用化学(Pure Appl.Chem.)59:257-68)确立的。
出于本发明的目的,通过测量在以下条件下与未添加纤维素分解酶蛋白的对照水解相比,由一种或多种纤维素分解酶进行的纤维素材料水解的增加来测定纤维素分解酶活性:1-50mg的纤维素分解酶蛋白/g于PCS中的纤维素(或其他预处理的纤维素材料),在适合的温度(如40℃-80℃,例如50℃、55℃、60℃、65℃、或70℃)和适合的pH(如4-9,例如,5.0、5.5、6.0、6.5、或7.0)下持续3-7天。典型条件为:1ml反应,洗涤或未洗涤的预处理的玉米秸秆(PCS),5%不溶性固形物,50mM乙酸钠(pH5),1mMMnSO4,50℃、55℃、或60℃,72小时,通过HPX-87H柱(伯乐实验室有限公司,美国加州赫拉克勒斯)进行的糖分析。
纤维素材料:术语“纤维素材料”意指含有纤维素的任何材料。生物质的初生细胞壁中的主要多糖是纤维素,第二丰富的是半纤维素,而第三丰富的是果胶。细胞停止生长后产生的次生细胞壁也包含多糖,并且它通过与半纤维素共价交联的聚合木质素得到强化。纤维素是脱水纤维二糖的均聚物,因此是一种线性β-(l-4)-D-葡聚糖,而半纤维素包括多种化合物,如具有一系列取代基以复杂支链结构存在的木聚糖、木葡聚糖、阿拉伯糖基木聚糖、以及甘露聚糖。尽管纤维素一般为多态的,但发现其在植物组织中主要以平行葡聚糖链的不溶性晶体基质存在。半纤维素通常氢键合至纤维素以及其他半纤维素,这有助于稳定细胞壁基质。
纤维素通常见于例如植物的茎、叶、壳、皮、以及穗轴,或树的叶、枝、以及木材中。纤维素材料可以是,但不限于:农业残余物、草本材料(包括能源作物)、城市固体废物、纸浆和造纸厂残余物、废纸、以及木材(包括林业残余物)(参见,例如,维色洛戈尔(Wiselogel)等人,1995,于生物乙醇手册(Handbook on Bioethanol)(查尔斯·E·怀曼(Charles E.Wyman)编辑),第105-118页,泰勒弗朗西斯出版集团(Taylor&Francis),华盛顿特区(Washington D.C.);怀曼(Wyman),1994,生物资源技术(BioresourceTechnology)50:3-16;林德(Lynd),1990,应用生物化学与生物技术(AppliedBiochemistry and Biotechnology)24/25:695-719;莫思尔(Mosier)等人,1999,木质纤维素的生物转化的最近进展(Recent Progress in Bioconversion ofLignocellulosics),生物化学工程/生物技术的进展(Advances in BiochemicalEngineering/Biotechnology),T·谢伯(T.Scheper)主编,第65卷,第23-40页,纽约斯普林格出版社(Springer-Verlag,New York)。在此应理解的是,纤维素可以是呈以下形式:木质纤维素、包含木质素的植物细胞壁材料、纤维素、以及混合基质中的半纤维素。在一个优选方面,纤维素材料是任何生物质材料。在另一个优选方面,纤维素材料是木质纤维素,其包含纤维素、半纤维素和木质素。
在一方面,纤维素材料是农业残余物。在另一方面,纤维素材料是草本材料(包括能源作物)。在另一方面,纤维素材料是城市固体废物。在另一方面,纤维素材料是纸浆和造纸厂残余物。在另一方面,纤维素材料是废纸。在另一方面,纤维素材料是木材(包括林业残余物)。
在另一方面,纤维素材料是芦竹。在另一方面,纤维素材料是甘蔗渣。在另一方面,纤维素材料是竹材。在另一方面,纤维素材料是玉米穗轴。在另一方面,纤维素材料是玉米纤维。在另一方面,纤维素材料是玉米秸杆。在另一方面,纤维素材料是芒草。在另一方面,纤维素材料是橙皮。在另一方面,纤维素材料是稻草。在另一方面,纤维素材料是柳枝稷。在另一方面,纤维素材料是小麦杆。
在另一方面,纤维素材料是山杨。在另一方面,纤维素材料是桉树。在另一方面,纤维素材料是冷杉。在另一方面,纤维素材料是松树。在另一方面,纤维素材料是白杨。在另一方面,纤维素材料是云杉。在另一方面,纤维素材料是柳树。
在另一方面,纤维素材料是藻类纤维素。在另一方面,纤维素材料是细菌纤维素。在另一方面,纤维素材料是棉绒。在另一方面,纤维素材料是滤纸。在另一方面,纤维素材料是微晶纤维素。在另一方面,纤维素材料是磷酸处理的纤维素。
在另一方面,纤维素材料是一种水生生物质。如在此所使用,术语“水生生物质”意指在水生环境中通过光合作用过程产生的生物质。水生生物质可以是藻类、挺水植物、浮叶植物、或沉水植物。
纤维素材料可以按原样使用或可以使用本领域已知的常规方法进行预处理,如在此所描述。在一个优选方面,纤维素材料进行了预处理。
编码序列:术语“编码序列”意指直接指定一个变体的氨基酸序列的多核苷酸。编码序列的边界通常由开放阅读框决定,该开放阅读框以起始密码子(如ATG、GTG或TTG)开始,并且以终止密码子(如TAA、TAG或TGA)结束。编码序列可以是基因组DNA、cDNA、合成DNA、或其组合。
控制序列:术语“控制序列”意指对于表达编码本发明的变体的多核苷酸来说必需的核酸序列。每个控制序列对于编码该变体的多核苷酸来说可以是原生的(即,来自相同基因)或外源的(即,来自不同基因),或相对于彼此是原生的或外源的。这类控制序列包括但不限于:前导序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列、以及转录终止子。至少,控制序列包括启动子以及转录和翻译终止信号。出于引入有利于将这些控制序列与编码一种变体的多核苷酸的编码区连接的特异性限制酶切位点的目的,这些控制序列可以提供有多个接头。
内切葡聚糖酶:术语“内切葡聚糖酶”意指一种内切-1,4-(1,3;1,4)-β-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶(E.C.3.2.1.4),其催化纤维素、纤维素衍生物(如羧甲基纤维素和羟乙基纤维素)、地衣多糖中的1,4-β-D-糖苷键和混合β-1,3葡聚糖如谷类β-D-葡聚糖或木葡聚糖以及含有纤维素组分的其他植物材料中的β-1,4键的内切水解。可以通过测量底物粘度的降低或通过还原糖测定所确定的还原性末端的增加来确定内切葡聚糖酶活性(张等人,2006,生物技术进展24:452-481)。出于本发明的目的,根据高斯,1987,纯粹与应用化学59:257-268的程序,在pH5、40℃下使用羧甲基纤维素(CMC)作为底物来确定内切葡聚糖酶活性。
表达:术语“表达”包括涉及变体产生的任何步骤,包括但不限于:转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰、以及分泌。
表达载体:术语“表达载体”意指包含编码一种变体的一种多核苷酸并且可操作地连接至提供其表达的控制序列的线性或环形DNA分子。
家族61糖苷水解酶:术语“家族61糖苷水解酶”或“家族GH61”或“GH61”意指根据亨利萨特B.(Henrissat B.),1991,基于氨基酸序列相似性的糖基水解酶的分类(A classification of glycosyl hydrolases based onamino-acid sequence similarities),生物化学杂志(Biochem.J.)280:309-316;和亨利萨特B.和贝洛赫A.(Bairoch A.),1996,修正糖基水解酶的基于序列的分类(Updating the sequence-based classification of glycosyl hydrolases),生物化学杂志316:695-696属于糖苷水解酶家族61的多肽。这个家族中的酶最初基于在一个家族成员中测量到的非常弱的内切-1,4-β-D葡聚糖酶活性而被分类为糖苷水解酶家族。这些酶的结构和作用模式是不规范的,并且它们不能被视为真正的糖苷酶。然而,基于它们在与纤维素酶或纤维素酶的混合物结合使用时增强木质纤维素分解的能力,它们被保留在CAZy分类中。
阿魏酸酯酶:术语“阿魏酸酯酶“意指4-羟基-3-甲氧基肉桂酰基-糖水解酶(EC3.1.1.73),其催化4-羟基-3-甲氧基肉桂酰基(阿魏酰基)基团从酯化的糖(其在天然生物质底物中通常为阿拉伯糖)的水解,以产生阿魏酸酯(4-羟基-3-甲氧基肉桂酸酯)。阿魏酸酯酶(feruloyl esterase)也被称为阿魏酸酯酶(ferulic acid esterase)、羟基肉桂酰基酯酶、FAE-III、肉桂酸酯水解酶、FAEA、cinnAE、FAE-I、或FAE-II。出于本发明的目的,在50mM乙酸钠(pH5.0)中使用0.5mM阿魏酸对硝基苯酯作为底物来测定阿魏酸酯酶活性。一个单位的阿魏酸酯酶等于能够在pH5、25℃下每分钟释放1微摩尔的对硝基苯酚阴离子的酶的量。
片段:术语“片段”意指缺失其成熟多肽的氨基和/或羧基末端的一个或多个(例如,数个)氨基酸的多肽,其中该片段具有纤维二糖水解酶活性。在一方面,片段包含纤维二糖水解酶的成熟多肽的至少85%的氨基酸残基,例如至少90%的氨基酸残基、或至少95%的氨基酸残基。
半纤维素分解酶或半纤维素酶:术语“半纤维素分解酶”或“半纤维素酶”意指一种或多种(例如,数种)水解半纤维素材料的酶。参见,例如,沙洛姆·D.(Shallom,D.)和肖汉姆·Y.(Shoham,Y.),微生物半纤维素酶(Microbial hemicellulases),微生物学新见(Current Opinion InMicrobiology),2003,6(3):219-228)。半纤维素酶是植物生物质降解中的关键组分。半纤维素酶的实例包括但不限于:乙酰甘露聚糖酯酶、乙酰木聚糖酯酶、阿拉伯聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、香豆酸酯酶、阿魏酸酯酶、半乳糖苷酶、葡糖醛酸糖苷酶、葡糖醛酸酯酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、木聚糖酶、以及木糖苷酶。这些酶的底物即半纤维素是支链和线性多糖的异质群体,这些多糖经由氢与植物细胞壁中的纤维素微纤维键合,从而将它们交联成一个稳固网络。半纤维素还共价附接至木质素,从而与纤维素一起形成高度复杂的结构。半纤维素的可变结构和组织要求许多酶的协同作用以使其完全降解。半纤维素酶的催化模块是水解糖苷键的糖苷水解酶(GH),或是水解乙酸或阿魏酸侧基的酯键的碳水化合物酯酶(CE)。这些催化模块基于它们一级序列的同源性,可以被分配到GH和CE家族中。具有总体相似的折叠的一些家族可以进一步被分组为以字母标记的氏族(例如,GH-A)。这些和其他碳水化合物活性酶的最具信息性和最新的分类可在碳水化合物活性酶(Carbohydrate-Active Enzymes)(CAZy)数据库中获得。可以根据高斯和比萨拉(Bisaria),1987,纯粹与应用化学59:1739-1752,在适合的温度(例如50℃、55℃、或60℃)和pH(例如5.0或5.5)下测量半纤维素分解酶活性。
高严格度条件:术语“高严格度条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针来说,根据标准DNA印迹程序,在42℃下在5X SSPE、0.3%SDS、200微克/ml剪切的并且变性的鲑鱼精子DNA、以及50%的甲酰胺中进行预杂交和杂交12至24小时。将载体材料最终使用2X SSC、0.2%SDS在65℃下洗涤三次,每次15分钟。
宿主细胞:术语“宿主细胞”意指易于用包含本发明的多核苷酸的核酸构建体或表达载体进行转化、转染、转导等的任何细胞类型。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间发生的突变与亲本细胞不同的该亲本细胞的任何子代。
改进的特性:术语“改进的特性”意指与一种变体相关的相对于亲本有所改进的特征。这种改进的特性包括但不限于增加的热稳定性。
增加的热稳定性:术语“增加的热稳定性”意指相对于亲本,在某一温度下孵育一段时期之后变体的纤维二糖水解酶活性的更高程度的保留。变体相对于亲本的增加的热稳定性可以例如在一个或多个(例如,数个)温度的条件下进行评估。例如,该一个或多个(例如,数个)温度可以是45℃至95℃范围中的任何一个或多个温度,例如,45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃、或95℃(或在此之间,例如62℃、67℃、68℃、72℃等),一个或多个(例如,数个)pH在3至9的范围内,例如3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、或9.0(或在此之间),持续适合时期(时间)的孵育,例如1分钟、5分钟、10分钟、15分钟、20分钟、25分钟、30分钟、45分钟、或60分钟(或在此之间,例如23分钟、37分钟等),这样使得该变体保留残余活性。然而,还可以使用更长时期的孵育。术语“增加的热稳定性”在此可以与“改进的热稳定性”互换使用。
变体相对于亲本的增加的热稳定性可以通过差示扫描量热法(DSC)使用本领域中的标准方法来确定(参见,例如,斯特蒂文特(Sturtevant),1987,物理化学年评(Annual Review of Physical Chemistry)38:463-488)。变体相对于亲本的增加的热稳定性还可以使用蛋白质热解折叠分析来确定。变体相对于亲本的增加的热稳定性还可以使用用于该变体的其中将变体的性能与亲本相比较的任何应用测定来确定。例如,可以使用实例8中所描述的应用测定。
分离的:术语“分离的”意指处于非天然存在的形式或环境中的物质。分离的物质的非限制性实例包括:(1)任何非天然存在的物质;(2)至少部分地从与其天然相关联的一种或多种或所有天然存在的成分中去除的任何物质,包括但不限于任何酶、变体、核酸、蛋白质、肽或辅因子;(3)相对于在自然界中发现的那种物质通过人工修饰的任何物质;或(4)通过相对于与其天然相关联的其他组分增加该物质的量(例如,宿主细胞中的重组体产量;编码该物质的基因的多个拷贝;以及比与编码该物质的基因天然相关联的启动子更强的启动子的使用)而修饰的任何物质。
低严格度条件:术语“低严格度条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针来说,根据标准的DNA印迹程序,在42℃下在5X SSPE、0.3%SDS、200微克/ml剪切的并且变性的鲑鱼精子DNA、以及25%的甲酰胺中进行预杂交和杂交12至24小时。将载体材料最终使用2X SSC、0.2%SDS在50℃下洗涤三次,每次15分钟。
成熟多肽:术语“成熟多肽”意指在翻译和任何翻译后修饰(如N-末端加工、C-末端截短、糖基化、磷酸化等)之后处于其最终形式的多肽。在一方面,基于预测SEQ ID NO:2的氨基酸1至19是信号肽的SignaIP程序(尼尔森(Nielsen)等人,1997,蛋白质工程(Protein Engineering)10:1-6),成熟多肽是SEQ ID NO:2的氨基酸20至456。在本领域中已知的是,宿主细胞可以产生由相同多核苷酸表达的两种或更多种不同的成熟多肽(即,具有不同的C末端和/或N末端氨基酸)的混合物。
成熟多肽编码序列:术语“成熟多肽编码序列”意指编码具有纤维二糖水解酶活性的成熟多肽的多核苷酸。在一方面,基于预测SEQ ID NO:1的核苷酸1至57编码信号肽的SignalP程序(尼尔森等人,1997,同上),成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:1的核苷酸58至1786或其cDNA序列。
术语“成熟多肽编码序列”在此应理解为包括基因组DNA序列的cDNA序列或cDNA序列的基因组DNA序列。
中等严格度条件:术语“中等严格度条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针来说,根据标准的DNA印迹程序,在42℃下在5X SSPE、0.3%SDS、200微克/ml剪切的并且变性的鲑鱼精子DNA、以及35%的甲酰胺中进行预杂交和杂交12至24小时。将载体材料最终使用2X SSC、0.2%SDS在55℃下洗涤三次,每次15分钟。
中-高等严格度条件:术语“中-高等严格度条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针来说,根据标准DNA印迹程序,在42℃下在5X SSPE、0.3%SDS、200微克/ml剪切的并且变性的鲑鱼精子DNA、以及35%甲酰胺中进行预杂交和杂交12至24小时。将载体材料最终使用2X SSC、0.2%SDS在60℃下洗涤三次,每次15分钟。
突变体:术语“突变体”意指编码一种变体的一种多核苷酸。
核酸构建体:术语“核酸构建体”意指从天然存在的基因中分离的、或以自然中不会另外出现的方式被修饰成包含核酸区段的、或是合成的单链抑或双链的核酸分子,它包含一个或多个控制序列。
可操作地连接:术语“可操作地连接”意指这样一种构型,其中控制序列相对于多核苷酸的编码序列置于适当位置处,这样使得该控制序列指导该编码序列的表达。
亲本或亲本纤维二糖水解酶:术语“亲本”或“亲本纤维二糖水解酶”意指对其做出改变以产生本发明的纤维二糖水解酶变体的一种纤维二糖水解酶。亲本可以是天然存在的(野生型)多肽或其变体或片段。
具有纤维素分解增强活性的多肽:术语“具有纤维素分解增强活性的多肽”意指催化具有纤维素分解活性的酶对纤维素材料的水解的增强的GH61多肽。出于本发明的目的,通过测量在以下条件下与用相等的总蛋白质负载量而无纤维素分解增强活性(1-50mg纤维素分解蛋白/g于PCS中的纤维素)的对照水解相比,来自由纤维素分解酶水解纤维素材料的还原糖的增加或纤维二糖与葡萄糖总量的增加来测定纤维素分解增强活性:1-50mg总蛋白质/g于预处理的玉米秸秆(PCS)中的纤维素,其中总蛋白质由50%-99.5%w/w纤维素分解酶蛋白和0.5%-50%w/w具有纤维素分解增强活性的GH61多肽的蛋白质组成,在适合的温度(如40℃-80℃,例如,50℃、55℃、60℃、65℃、或70℃)和适合的pH(如4-9,例如,5.0、5.5、6.0、6.5、或7.0)下持续1-7天。在一个优选方面,使用在总蛋白质重量的2%-3%的米曲霉(Aspergillus oryzae)β-葡糖苷酶(根据WO02/095014在米曲霉中重组产生)或总蛋白质重量的2%-3%的烟曲霉β-葡糖苷酶(如WO2002/095014中所描述在米曲霉中重组产生)的纤维素酶蛋白负载量的存在下1.5L(诺维信公司(Novozymes A/S),丹麦巴格斯瓦尔德(Denmark))的混合物作为纤维素分解活性的来源。
用于确定GH61多肽的纤维素分解增强活性的另一种测定是在40℃下将GH61多肽与0.5%磷酸溶胀纤维素(PASC)、100mM乙酸钠(pH5)、1mM MnSO4、0.1%没食子酸、0.025mg/ml的烟曲霉β-葡糖苷酶、以及0.01%X100一起孵育24-96小时,接着测定从PASC释放的葡萄糖。
具有纤维素分解增强活性的GH61多肽通过将达到相同的水解程度所需要的纤维素分解酶的量降低优选至少1.01倍,例如,至少1.05倍、至少1.10倍、至少1.25倍、至少1.5倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少10倍、或至少20倍,来增强由具有纤维素分解活性的酶催化的纤维素材料的水解。
预处理的玉米秸杆:术语“PCS”或“预处理的玉米秸杆”意指通过热和稀硫酸处理、碱预处理、中性预处理、或本领域已知的任何预处理从玉米秸杆得到的纤维素材料。
序列一致性:两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性通过参数“序列一致性”来描述。
出于本发明的目的,使用如在EMBOSS包(EMBOSS:欧洲分子生物学开放软件套件(The European Molecular Biology Open Software Suite),赖斯(Rice)等人,2000,遗传学趋势(Trends Genet.)16:276-277)(优选5.0.0版或更新版本)的Needle程序中所实施的尼德尔曼-翁施(Needleman-Wunsch)算法(尼德尔曼和翁施,1970,分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)48:443-453)来测定两个氨基酸序列之间的序列一致性。使用的参数是空位开放罚分10、空位扩展罚分0.5以及EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。使用尼德尔标记为“最长一致性”的输出(使用–nobrief选项获得)作为百分比一致性并且计算如下:
(一致的残基X100)/(比对长度-比对中的空位总数)
出于本发明的目的,使用如在EMBOSS包(EMBOSS:欧洲分子生物学开放软件套件,赖斯等人,2000,同上)(优选5.0.0版或更新版本)的Needle程序中所实施的尼德尔曼-翁施算法(尼德尔曼和翁施,1970,同上)来测定两个脱氧核糖核苷酸序列之间的序列一致性。使用的参数是空位开放罚分10、空位扩展罚分0.5,以及EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版本)取代矩阵。使用尼德尔标记为“最长一致性”的输出(使用–nobrief选项获得)作为百分比一致性并且计算如下:
(一致的脱氧核糖核酸X100)/(比对长度-比对中的空位总数)
子序列:术语“子序列”意指缺失成熟多肽编码序列的5'和/或3'端的一个或多个(例如,数个)核苷酸的多核苷酸,其中该子序列编码具有纤维二糖水解酶活性的片段。在一方面,一个子序列包含纤维二糖水解酶的成熟多肽编码序列的至少85%的核苷酸,例如至少90%的核苷酸或至少95%的核苷酸。
变体:术语“变体”意指具有纤维二糖水解酶活性的、包含一个改变(即在一个或多个(例如,数个)位置处的一个取代、插入和/或缺失)的一个多肽。取代意指占据一个位置的氨基酸被一个不同的氨基酸替代;缺失意指占据一个位置的氨基酸的去除;并且插入意指邻近于并且紧跟着占据一个位置的氨基酸之后添加一个氨基酸。本发明的变体具有其亲本纤维二糖水解酶的纤维二糖水解酶活性的至少20%,例如至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、或至少100%。
极高严格度条件:术语“极高严格度条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针来说,根据标准DNA印迹程序,在42℃下在5X SSPE、0.3%SDS、200微克/ml剪切的并且变性的鲑鱼精子DNA、以及50%甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。将载体材料最终使用2X SSC、0.2%SDS在70℃下洗涤三次,每次15分钟。
极低严格度条件:术语“极低严格度条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针来说,根据标准DNA印迹程序,在42℃下在5X SSPE、0.3%SDS、200微克/ml剪切的并且变性的鲑鱼精子DNA、以及25%甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。将载体材料最终使用2X SSC、0.2%SDS在45℃下洗涤三次,每次15分钟。
野生型纤维二糖水解酶:术语“野生型”纤维二糖水解酶意指由天然存在的微生物(如在自然界中发现的细菌、酵母或丝状真菌)表达的一种纤维二糖水解酶。
含有木聚糖的材料:术语“含有木聚糖的材料”意指包含含有β-(1-4)连接木糖残基主链的植物细胞壁多糖的任何材料。陆生植物的木聚糖是具有β-(1-4)-D-吡喃木糖主链的杂聚物,其通过短的碳水化合物链分支。它们包含D-葡糖醛酸或其4-O-甲基醚,L-阿拉伯糖、和/或由D-木糖、L-阿拉伯糖、D-或L-半乳糖、以及D-葡萄糖组成的不同寡糖。木聚糖类型的多糖可以分为均木聚糖和杂木聚糖,这些杂木聚糖包括葡糖醛酸木聚糖、(阿拉伯)葡糖醛酸木聚糖、(葡糖醛酸)阿拉伯糖基木聚糖、阿拉伯糖基木聚糖、以及复合杂木聚糖。参见,例如,埃伯林格罗瓦(Ebringerova)等人,2005,聚合物科学进展(Adv.Polym.Sci.)186:1-67。
木聚糖降解活性或木聚糖分解活性:术语“木聚糖降解活性”或“木聚糖分解活性”意指水解含有木聚糖的材料的生物活性。用于测量木聚糖分解活性的两种基本方法包括:(1)测量总木聚糖分解活性,并且(2)测量单独的木聚糖分解活性(例如,内切木聚糖酶、β-木糖苷酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、α-葡糖醛酸糖苷酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、以及α-葡糖醛酸酯酶)。木聚糖分解酶测定的最近进展总结于若干出版物中,这些出版物包括:别雷(Biely)和普乔尔德(Puchard),2006,食品与农业科学杂志(Journal of theScience of Food and Agriculture)86(11):1636-1647;斯帕尼科瓦(Spanikova)和别雷,2006,葡糖醛酸酯酶-由裂褶菌产生的新颖碳水化合物酯酶(Glucuronoyl esterase-Novel carbohydrate esterase produced bySchizophyllum commune),欧洲生化学会联合会快报580(19):4597-4601;赫尔曼(Herrmann)、沃散斯卡(Vrsanska)、尤日奇科娃(Jurickova)、赫西(Hirsch)、别雷、以及库比切克(Kubicek),1997,里氏木霉的β-D-木糖苷酶是一种多功能β-D-木聚糖木糖水解酶(The beta-D-xylosidase ofTrichoderma reesei is a multifunctional beta-D-xylan xylohydrolase),生物化学杂志321:375-381。
总木聚糖降解活性可以通过测定由不同类型的木聚糖(包括例如燕麦(oat spelt)木聚糖、山毛榉木木聚糖、以及落叶松木木聚糖)形成的还原糖,或通过光度法测定从不同共价染色的木聚糖释放的染色的木聚糖片段来测量。最常见的总木聚糖分解活性测定是基于从聚合4-O-甲基葡糖醛酸木聚糖产生还原糖,如贝利(Bailey)、别雷、剖坦恩(Poutanen),1992,用于木聚糖酶活性的测定方法的实验室间测试(Interlaboratory testing of methodsfor assay of xylanase activity),生物技术杂志(Journal of Biotechnology)23(3):257-270中所述。木聚糖酶活性还可以在37℃下在0.01%X-100(4-(1,1,3,3-四甲基丁基)苯基-聚乙二醇)和200mM磷酸钠缓冲液(pH6)中用0.2%AZCL-阿拉伯糖基木聚糖作为底物来测定。一个单位的木聚糖酶活性定义为在37℃、pH6下在200mM磷酸钠(pH6)中从作为底物的0.2%AZCL-阿拉伯糖基木聚糖每分钟产生1.0微摩尔天青蛋白。
出于本发明的目的,通过测量在以下典型条件下由一种或多种木聚糖降解酶引起的桦木木聚糖(西格玛化学有限公司(Sigma Chemical Co.,Inc.),美国密苏里州圣路易斯(St.Louis,MO,USA))水解的增加来确定木聚糖降解活性:1ml反应、5mg/ml底物(总固体)、5mg木聚糖分解蛋白/g底物、50mM乙酸钠(pH5)、50℃、24小时,使用如里弗(Lever),1972,用于碳水化合物的比色测定的新反应(A new reaction for colorimetricdetermination of carbohydrates),分析生物化学47:273-279所描述的对羟基苯甲酸酰肼(PHBAH)测定进行糖分析。
木聚糖酶:术语“木聚糖酶”意指1,4-β-D-木聚糖-木糖水解酶(E.C.3.2.1.8),其催化木聚糖中的1,4-β-D-木糖苷键的内切水解。出于本发明的目的,在37℃下在0.01%X-100和200mM磷酸钠缓冲液(pH 6)中用0.2%AZCL-阿拉伯糖基木聚糖作为底物来测定木聚糖酶活性。一个单位的木聚糖酶活性定义为在37℃、pH6下在200mM磷酸钠(pH6)中从作为底物的0.2%AZCL-阿拉伯糖基木聚糖每分钟产生1.0微摩尔天青蛋白。
用于变体命名的规则
出于本发明的目的,在SEQ ID NO:2中披露的成熟多肽用于确定另一种纤维二糖水解酶中相对应的氨基酸残基。将另一种纤维二糖水解酶的氨基酸序列与SEQ ID NO:2中披露的成熟多肽进行比对,并且基于该比对,使用如在EMBOSS包(EMBOSS:欧洲分子生物学开放软件套件,赖斯等人,2000,遗传学趋势16:276-277)(优选5.0.0版或更新版本)的Needle程序中所实施的尼德尔曼-翁施算法(尼德尔曼和翁施,1970,分子生物学杂志48:443-453)来确定与SEQ ID NO:2中所披露的成熟多肽中的任何氨基酸残基相对应的氨基酸位置编号。使用的参数是空位开放罚分10、空位扩展罚分0.5以及EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。氨基酸位置的编号是基于SEQ ID NO:2的全长多肽(例如,包括信号肽),其中位置1是信号肽的第一个氨基酸(例如,Met)。
另一种纤维二糖水解酶中相对应的氨基酸残基的鉴别可以通过使用若干计算机程序使用其对应的缺省参数比对多个多肽序列来确定,这些计算机程序包括但不限于MUSCLE(通过对数期望值的多序列比较;3.5版或更新版本;埃德加(Edgar),2004,核酸研究(Nucleic Acids Research)32:1792-1797);MAFFT(6.857版或更新版本;加藤(Katoh)和库玛(Kuma),2002,核酸研究30:3059-3066;加藤等人,2005,核酸研究33:511-518;加藤和朝都(Toh),2007,生物信息学(Bioinformatics)23:372-374;加藤等人,2009,分子生物学中的方法(Methods in Molecular Biology)537:39-64;加藤和朝都,2010,生物信息学26:1899-1900);以及采用ClustalW的EMBOSS EMMA(1.83版或更新版本;汤普森等人,1994,核酸研究22:4673-4680)。
当另一个纤维二糖水解酶与SEQ ID NO:2的成熟多肽歧异使得传统的基于序列的比较无法检测出它们的关系时(林达尔(Lindahl)和埃洛氟松(Elofsson),2000,分子生物学杂志295:613-615)时,可以使用其他配对序列比较算法。在基于序列的搜索中的更大灵敏度可以使用搜索程序来获得,这些搜索程序利用多肽家族的概率表示(谱(profile))来搜索数据库。例如,PSI-BLAST程序通过迭代数据库搜索过程来产生多个谱,并且能够检测远距离同源物(阿特休尔(Atschul)等人,1997,核酸研究25:3389-3402)。如果多肽的家族或超家族在蛋白质结构数据库中具有一个或多个代表,那么可以实现甚至更大的灵敏度。程序如GenTHREADER(琼斯(Jones),1999,分子生物学杂志287:797-815;麦古芬(McGuffin)和琼斯,2003,生物信息学19:874-881)利用来自不同来源(PSI-BLAST、二级结构预测、结构比对谱、以及溶剂化势)的信息作为预测查询序列的结构折叠的神经网络的输入。类似地,高夫(Gough)等人,2000,分子生物学杂志313:903-919的方法可以用于将未知结构的序列与存在于SCOP数据库中的超家族模型进行比对。这些比对进而可以用于产生多肽的同源性模型,并且使用出于该目的而开发的多种工具可以评估这类模型的准确度。
对于已知结构的蛋白质,数种工具和资源可用于检索并且产生结构比对。例如,蛋白的SCOP超家族已经在结构上进行了比对,并且那些比对是可访问的并且可下载的。两个或更多个蛋白质结构可以使用多种算法,如距离比对矩阵(Holm(霍尔姆)和桑德尔(Sander),1998,蛋白质(Proteins)33:88-96)或组合扩展(辛迪亚洛夫(Shindyalov)和博尔内(Bourne),1998,蛋白质工程11:739-747)进行比对,并且这些算法的实施可以另外用于查询具有相关结构的结构数据库,以便发现可能的结构同源物(例如,霍尔姆和帕克(Park),2000,生物信息学16:566-567)。
在描述本发明的纤维二糖水解酶变体中,以下所描述的命名法适于方便参考。采用已接受的IUPAC单字母或三字母氨基酸缩写。
取代。对于氨基酸取代,使用了以下命名法:原始氨基酸、位置、取代的氨基酸。因此,在位置226处的苏氨酸被丙氨酸取代被表示为“Thr226Ala”或“T226A”。多个突变由加号(“+”)分开,例如“Gly205Arg+Ser411Phe”或“G205R+S411F”代表分别在位置205和位置411处甘氨酸(G)被精氨酸(R)取代,并且丝氨酸(S)被苯丙氨酸(F)取代。
缺失。对于氨基酸缺失,使用了以下命名法:原始氨基酸、位置、*。因此,在位置195处的甘氨酸缺失被表示为“Gly195*”或者“G195*”。多个缺失由加号(“+”)分开,例如,“Gly195*+Ser411*”或“G195*+S411*”。
插入。对于氨基酸插入,使用了以下命名法:原始氨基酸、位置、原始氨基酸、插入的氨基酸。因此,在位置195处的甘氨酸之后插入赖氨酸被表示为“Gly195GlyLys”或“G195GK”。多个氨基酸的插入被表示为[原始氨基酸、位置、原始氨基酸、插入的氨基酸#1、插入的氨基酸#2;等]。例如,在位置195处的甘氨酸之后插入赖氨酸和丙氨酸被表示为“Gly195GlyLysAla”或“G195GKA”。
在这类情况下,通过将小写字母添加至在所插入的一个或多个氨基酸残基之前的氨基酸残基的位置编号中来对所插入的一个或多个氨基酸残基进行编号。在以上实例中,该序列因此将是:
亲本: 变体:
195 195195a195b
G G-K-A
多个取代。包含多个取代的变体由加号(“+”)分开,例如“Arg170Tyr+Gly195Glu”或“R170Y+G195E”代表在位置170和位置195处的精氨酸和甘氨酸分别被酪氨酸和谷氨酸取代。
不同的取代。在可以在一个位置处引入不同取代的情况下,这些不同取代由逗号分开,例如“Arg170Tyr,Glu”代表在位置170处的精氨酸被酪氨酸或谷氨酸取代。因此,“Tyr167Gly,Ala+Arg170Gly,Ala”表示以下变体:
“Tyr167Gly+Arg170Gly”、“Tyr167Gly+Arg170Ala”、“Tyr167Ala+Arg170Gly”、以及“Tyr167Ala+Arg170Ala”。
发明详细说明
本发明涉及分离的纤维二糖水解酶变体,这些变体包含在与SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置112、154、197、228、261、306、以及375相对应的一个或多个(例如,数个)位置处的取代,其中这些变体具有纤维二糖水解酶活性。
变体
在一个实施例中,该变体与亲本纤维二糖水解酶的氨基酸序列具有至少60%,例如至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%、但小于100%的序列一致性。
在另一个实施例中,该变体与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ IDNO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、SEQ IDNO:34、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:50、SEQ IDNO:52、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:68、SEQ IDNO:70、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:112、SEQ ID NO:114、或SEQ ID NO:116的成熟多肽具有至少60%,例如至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%、但小于100%的序列一致性。
在一方面,在本发明的变体中的取代数目是1-7个,例如1、2、3、4、5、6、或7个取代。
在另一方面,变体包含在与位置112、154、197、228、261、306、以及375相对应的一个或多个(例如,数个)位置处的取代。在另一方面,变体包含在与位置112、154、197、228、261、306、以及375中的任何一个相对应的两个位置处的取代。在另一方面,变体包含在与位置112、154、197、228、261、306、以及375中的任何一个相对应的三个位置处的取代。在另一方面,变体包含在与位置112、154、197、228、261、306、以及375中的任何一个相对应的四个位置处的取代。在另一方面,变体包含在与位置112、154、197、228、261、306、以及375中的任何一个相对应的五个位置处的取代。在另一方面,变体包含在与位置112、154、197、228、261、306、以及375中的任何一个相对应的六个位置处的取代。在另一方面,变体包含在与位置112、154、197、228、261、306、以及375相对应的每个位置处的取代。
在另一方面,该变体包含在与位置112相对应的位置处的取代或由该取代组成。在另一方面,与位置112相对应的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val取代,优选被His取代。在另一方面,该变体包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代Y112H或由该取代组成。
在另一方面,该变体包含在与位置154相对应的位置处的取代或由该取代组成。在另一方面,与位置154相对应的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val取代,优选被Met取代。在另一方面,该变体包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代V154M或者由该取代组成。
在另一方面,该变体包含在与位置197相对应的位置处的取代或由该取代组成。在另一方面,与位置197相对应的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val取代,优选被Tyr取代。在另一方面,该变体包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代S197Y或由该取代组成。
在另一方面,该变体包含在与位置228相对应的位置处的取代或由该取代组成。在另一方面,与位置228相对应的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val取代,优选被Val取代。在另一方面,该变体包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代I228V或由该取代组成。
在另一方面,该变体包含在与位置261相对应的位置处的取代或由该取代组成。在另一方面,与位置261相对应的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val取代,优选被Leu取代。在另一方面,该变体包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代I261L或由该取代组成。
在另一方面,该变体包含在与位置306相对应的位置处的取代或由该取代组成。在另一方面,与位置306相对应的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val取代,优选被Ala取代。在另一方面,该变体包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代S306A或由该取代组成。
在另一方面,该变体包含在与位置375相对应的位置处的取代或由该取代组成。在另一方面,与位置375相对应的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val取代,优选被Glu取代。在另一方面,该变体包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代G375E或由该取代组成。
在另一方面,该变体包含在与位置112和位置154相对应的位置处的取代(如以上所描述的那些)或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含在与位置112和位置197相对应的位置处的取代(如以上所描述的那些)或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含在与位置112和位置228相对应的位置处的取代(如以上所描述的那些)或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含在与位置112和位置261相对应的位置处的取代(如以上所描述的那些)或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含在与位置112和位置306相对应的位置处的取代(如以上所描述的那些)或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含在与位置112和位置375相对应的位置处的取代(如以上所描述的那些)或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含在与位置154和位置197相对应的位置处的取代(如以上所描述的那些)或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含在与位置154和位置228相对应的位置处的取代(如以上所描述的那些)或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含在与位置154和位置261相对应的位置处的取代(如以上所描述的那些)或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含在与位置154和位置306相对应的位置处的取代(如以上所描述的那些)或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含在与位置154和位置375相对应的位置处的取代(如以上所描述的那些)或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含在与位置197和位置228相对应的位置处的取代(如以上所描述的那些)或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含在与位置197和位置261相对应的位置处的取代(如以上所描述的那些)或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含在与位置197和位置306相对应的位置处的取代(如以上所描述的那些)或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含在与位置197和位置375相对应的位置处的取代(如以上所描述的那些)或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含在与位置228和位置261相对应的位置处的取代(如以上所描述的那些)或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含在与位置228和位置306相对应的位置处的取代(如以上所描述的那些)或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含在与位置228和位置375相对应的位置处的取代(如以上所描述的那些)或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含在与位置261和位置306相对应的位置处的取代(如以上所描述的那些)或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含在与位置261和位置375相对应的位置处的取代(如以上所描述的那些)或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含在与位置306和位置375相对应的位置处的取代(如以上所描述的那些)或由这些取代组成。
在另一方面,该变体包含在与位置112、154、以及197相对应的位置处的取代(如以上所描述的那些)或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含在与位置112、154、以及228相对应的位置处的取代(如以上所描述的那些)或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含在与位置112、154、以及261相对应的位置处的取代(如以上所描述的那些)或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含在与位置112、154、以及306相对应的位置处的取代(如以上所描述的那些)或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含在与位置112、154、以及375相对应的位置处的取代(如以上所描述的那些)或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含在与位置112、197、以及228相对应的位置处的取代(如以上所描述的那些)或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含在与位置112、197、以及261相对应的位置处的取代(如以上所描述的那些)或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含在与位置112、197、以及306相对应的位置处的取代(如以上所描述的那些)或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含在与位置112、197、以及375相对应的位置处的取代(如以上所描述的那些)或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含在与位置112、228、以及261相对应的位置处的取代(如以上所描述的那些)或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含在与位置112、228、以及306相对应的位置处的取代(如以上所描述的那些)或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含在与位置112、228、以及375相对应的位置处的取代(如以上所描述的那些)或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含在与位置112、261、以及306相对应的位置处的取代(如以上所描述的那些)或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含在与位置112、261、以及375相对应的位置处的取代(如以上所描述的那些)或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含在与位置112、306、以及375相对应的位置处的取代(如以上所描述的那些)或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含在与位置154、197、以及228相对应的位置处的取代(如以上所描述的那些)或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含在与位置154、197、以及261相对应的位置处的取代(如以上所描述的那些)或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含在与位置154、197、以及306相对应的位置处的取代(如以上所描述的那些)或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含在与位置154、197、以及375相对应的位置处的取代(如以上所描述的那些)或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含在与位置154、228、以及261相对应的位置处的取代(如以上所描述的那些)或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含在与位置154、228、以及306相对应的位置处的取代(如以上所描述的那些)或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含在与位置154、228、以及375相对应的位置处的取代(如以上所描述的那些)或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含在与位置154、261、以及306相对应的位置处的取代(如以上所描述的那些)或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含在与位置154、261、以及375相对应的位置处的取代(如以上所描述的那些)或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含在与位置154、306、以及375相对应的位置处的取代(如以上所描述的那些)或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含在与位置197、228、以及261相对应的位置处的取代(如以上所描述的那些)或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含在与位置197、228、以及306相对应的位置处的取代(如以上所描述的那些)或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含在与位置197、228、以及375相对应的位置处的取代(如以上所描述的那些)或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含在与位置197、261、以及306相对应的位置处的取代(如以上所描述的那些)或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含在与位置197、261、以及375相对应的位置处的取代(如以上所描述的那些)或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含在与位置197、306、以及375相对应的位置处的取代(如以上所描述的那些)或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含在与位置228、261、以及306相对应的位置处的取代(如以上所描述的那些)或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含在与位置228、261、以及375相对应的位置处的取代(如以上所描述的那些)或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含在与位置228、306、以及375相对应的位置处的取代(如以上所描述的那些)或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含在与位置261、306、以及375相对应的位置处的取代(如以上所描述的那些)或由这些取代组成。
在另一方面,该变体包含在与位置112、154、197、以及228相对应的位置处的取代(如以上所描述的那些)或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含在与位置112、154、197、以及261相对应的位置处的取代(如以上所描述的那些)或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含在与位置112、154、197、以及306相对应的位置处的取代(如以上所描述的那些)或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含在与位置112、154、197、以及375相对应的位置处的取代(如以上所描述的那些)或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含在与位置112、154、228、以及261相对应的位置处的取代(如以上所描述的那些)或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含在与位置112、154、228、以及306相对应的位置处的取代(如以上所描述的那些)或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含在与位置112、154、228、以及375相对应的位置处的取代(如以上所描述的那些)或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含在与位置112、154、261、以及306相对应的位置处的取代(如以上所描述的那些)或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含在与位置112、154、261、以及375相对应的位置处的取代(如以上所描述的那些)或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含在与位置112、154、306、以及375相对应的位置处的取代(如以上所描述的那些)或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含在与位置112、197、228、以及261相对应的位置处的取代(如以上所描述的那些)或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含在与位置112、197、228、以及306相对应的位置处的取代(如以上所描述的那些)或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含在与位置112、197、228、以及375相对应的位置处的取代(如以上所描述的那些)或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含在与位置112、197、261、以及306相对应的位置处的取代(如以上所描述的那些)或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含在与位置112、197、261、以及375相对应的位置处的取代(如以上所描述的那些)或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含在与位置112、197、306、以及375相对应的位置处的取代(如以上所描述的那些)或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含在与位置112、228、261、以及306相对应的位置处的取代(如以上所描述的那些)或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含在与位置112、228、261、以及375相对应的位置处的取代(如以上所描述的那些)或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含在与位置112、228、306、以及375相对应的位置处的取代(如以上所描述的那些)或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含在与位置112、261、306、以及375相对应的位置处的取代(如以上所描述的那些)或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含在与位置154、197、228、以及261相对应的位置处的取代(如以上所描述的那些)或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含在与位置154、197、228、以及306相对应的位置处的取代(如以上所描述的那些)或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含在与位置154、197、228、以及375相对应的位置处的取代(如以上所描述的那些)或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含在与位置154、197、261、以及306相对应的位置处的取代(如以上所描述的那些)或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含在与位置154、197、261、以及375相对应的位置处的取代(如以上所描述的那些)或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含在与位置154、197、306、以及375相对应的位置处的取代(如以上所描述的那些)或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含在与位置154、228、261、以及306相对应的位置处的取代(如以上所描述的那些)或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含在与位置154、228、261、以及375相对应的位置处的取代(如以上所描述的那些)或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含在与位置154、228、306、以及375相对应的位置处的取代(如以上所描述的那些)或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含在与位置154、261、306、以及375相对应的位置处的取代(如以上所描述的那些)或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含在与位置197、228、261、以及306相对应的位置处的取代(如以上所描述的那些)或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含在与位置197、228、261、以及375相对应的位置处的取代(如以上所描述的那些)或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含在与位置197、228、306、以及375相对应的位置处的取代(如以上所描述的那些)或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含在与位置197、261、306、以及375相对应的位置处的取代(如以上所描述的那些)或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含在与位置228、261、306、以及375相对应的位置处的取代(如以上所描述的那些)或由这些取代组成。
在另一方面,该变体包含在与位置112、154、197、228、以及261相对应的位置处的取代(如以上所描述的那些)或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含在与位置112、154、197、228、以及306相对应的位置处的取代(如以上所描述的那些)或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含在与位置112、154、197、228、以及375相对应的位置处的取代(如以上所描述的那些)或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含在与位置112、154、197、261、以及306相对应的位置处的取代(如以上所描述的那些)或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含在与位置112、154、197、261、以及375相对应的位置处的取代(如以上所描述的那些)或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含在与位置112、154、197、306、以及375相对应的位置处的取代(如以上所描述的那些)或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含在与位置112、154、228、261、以及306相对应的位置处的取代(如以上所描述的那些)或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含在与位置112、154、228、261、以及375相对应的位置处的取代(如以上所描述的那些)或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含在与位置112、154、228、306、以及375相对应的位置处的取代(如以上所描述的那些)或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含在与位置112、154、261、306、以及375相对应的位置处的取代(如以上所描述的那些)或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含在与位置112、197、228、261、以及306相对应的位置处的取代(如以上所描述的那些)或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含在与位置112、197、228、261、以及375相对应的位置处的取代(如以上所描述的那些)或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含在与位置112、197、228、306、以及375相对应的位置处的取代(如以上所描述的那些)或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含在与位置112、197、261、306、以及375相对应的位置处的取代(如以上所描述的那些)或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含在与位置112、228、261、306、以及375相对应的位置处的取代(如以上所描述的那些)或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含在与位置154、197、228、261、以及306相对应的位置处的取代(如以上所描述的那些)或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含在与位置154、197、228、261、以及375相对应的位置处的取代(如以上所描述的那些)或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含在与位置154、197、228、306、以及375相对应的位置处的取代(如以上所描述的那些)或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含在与位置154、197、261、306、以及375相对应的位置处的取代(如以上所描述的那些)或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含在与位置154、228、261、306、以及375相对应的位置处的取代(如以上所描述的那些)或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含在与位置197、228、261、306、以及375相对应的位置处的取代(如以上所描述的那些)或由这些取代组成。
在另一方面,该变体包含在与位置112、154、197、228、261、以及306相对应的位置处的取代(如以上所描述的那些)或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含在与位置112、154、197、228、261、以及375相对应的位置处的取代(如以上所描述的那些)或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含在与位置112、154、197、228、306、以及375相对应的位置处的取代(如以上所描述的那些)或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含在与位置112、154、197、261、306、以及375相对应的位置处的取代(如以上所描述的那些)或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含在与位置112、154、228、261、306、以及375相对应的位置处的取代(如以上所描述的那些)或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含在与位置112、197、228、261、306、以及375相对应的位置处的取代(如以上所描述的那些)或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含在与位置154、197、228、261、306、以及375相对应的位置处的取代(如以上所描述的那些)或由这些取代组成。
在另一方面,该变体包含在与位置112、154、197、228、261、306、以及375相对应的位置处的取代(如以上所描述的那些)或由这些取代组成。
在另一方面,该变体包含以下取代或由以下取代组成:选自下组的一个或多个(例如,数个)取代,该组由以下各项组成:Y112H、V154M、S197Y、I228V、I261L、S306A、以及G375E;或在与如在此所描述的其他纤维二糖水解酶中的SEQ ID NO:2相对应的位置处的选自下组的一个或多个(例如,数个)取代,该组由以下各项组成:Y112H、V154M、S197Y、I228V、I261L、S306A、以及G375E。
在以下各方面中,该变体包含在与如在此所描述的其他纤维二糖水解酶中的SEQ ID NO:2相对应的位置处的一个或多个(例如,数个)以下所描述的取代或由这些取代组成。
在另一方面,该变体包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代Y112H+V154M或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代Y112H+S197Y或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代Y112H+I228V或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代Y112H+I261L或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代Y112H+S306A或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代Y112H+G375E或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代V154M+S197Y或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代V154M+I228V或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代V154M+I261L或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含SEQID NO:2的成熟多肽的取代V154M+S306A或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代V154M+G375E或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代S197Y+I228V或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代S197Y+I261L或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含SEQID NO:2的成熟多肽的取代S197Y+S306A或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代S197Y+G375E或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代I228V+I261L或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代I228V+S306A或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含SEQID NO:2的成熟多肽的取代I228V+G375E或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代I261L+S306A或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代I261L+G375E或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代S306A+G375E或由这些取代组成。
在另一方面,该变体包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代Y112H+V154M+S197Y或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代Y112H+V154M+I228V或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代Y112H+V154M+I261L或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代Y112H+V154M+S306A或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代Y112H+V154M+G375E或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代Y112H+S197Y+I228V或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代Y112H+S197Y+I261L或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代Y112H+S197Y+S306A或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代Y112H+S197Y+G375E或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含SEQID NO:2的成熟多肽的取代Y112H+I228V+I261L或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代Y112H+I228V+S306A或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代Y112H+I228V+G375E或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代Y112H+I261L+S306A或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代Y112H+I261L+G375E或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代Y112H+S306A+G375E或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代V154M+S197Y+I228V或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代V154M+S197Y+I261L或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代V154M+S197Y+S306A或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代V154M+S197Y+G375E或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代V154M+I228V+I261L或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代V154M+I228V+S306A或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代V154M+I228V+G375E或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含SEQID NO:2的成熟多肽的取代V154M+I261L+S306A或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代V154M+I261L+G375E或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代V154M+S306A+G375E或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代S197Y+I228V+I261L或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代S197Y+I228V+S306A或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代S197Y+I228V+G375E或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代S197Y+I261L+S306A或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代S197Y+I261L+G375E或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含SEQID NO:2的成熟多肽的取代S197Y+S306A+G375E或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代I228V+I261L+S306A或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代I228V+I261L+G375E或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代I228V+S306A+G375E或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代I261L+S306A+G375E或由这些取代组成。
在另一方面,该变体包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代Y112H+V154M+S197Y+I228V或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含SEQID NO:2的成熟多肽的取代Y112H+V154M+S197Y+I261L或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代Y112H+V154M+S197Y+S306A或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含SEQID NO:2的成熟多肽的取代Y112H+V154M+S197Y+G375E或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代Y112H+V154M+I228V+I261L或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含SEQ IDNO:2的成熟多肽的取代Y112H+V154M+I228V+S306A或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代Y112H+V154M+I228V+G375E或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含SEQID NO:2的成熟多肽的取代Y112H+V154M+I261L+S306A或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代Y112H+V154M+I261L+G375E或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含SEQID NO:2的成熟多肽的取代Y112H+V154M+S306A+G375E或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代Y112H+S197Y+I228V+I261L或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含SEQ IDNO:2的成熟多肽的取代Y112H+S197Y+I228V+S306A或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代Y112H+S197Y+I228V+G375E或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含SEQ IDNO:2的成熟多肽的取代Y112H+S197Y+I261L+S306A或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代Y112H+S197Y+I261L+G375E或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含SEQ IDNO:2的成熟多肽的取代Y112H+S197Y+S306A+G375E或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代Y112H+I228V+I261L+S306A或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含SEQ IDNO:2的成熟多肽的取代Y112H+I228V+I261L+G375E或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代Y112H+I228V+S306A+G375E或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含SEQ IDNO:2的成熟多肽的取代Y112H+I261L+S306A+G375E或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代V154M+S197Y+I228V+I261L或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含SEQ IDNO:2的成熟多肽的取代V154M+S197Y+I228V+S306A或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代V154M+S197Y+I228V+G375E或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含SEQ IDNO:2的成熟多肽的取代V154M+S197Y+I261L+S306A或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代V154M+S197Y+I261L+G375E或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含SEQ IDNO:2的成熟多肽的取代V154M+S197Y+S306A+G375E或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代V154M+I228V+I261L+S306A或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含SEQ IDNO:2的成熟多肽的取代V154M+I228V+I261L+G375E或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代V154M+I228V+S306A+G375E或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含SEQ IDNO:2的成熟多肽的取代V154M+I261L+S306A+G375E或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代S197Y+I228V+I261L+S306A或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代S197Y+I228V+I261L+G375E或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代S197Y+I228V+S306A+G375E或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代S197Y+I261L+S306A+G375E或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代I228V+I261L+S306A+G375E或由这些取代组成。
在另一方面,该变体包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代Y112H+V154M+S197Y+I228V+I261L或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代Y112H+V154M+S197Y+I228V+S306A或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代Y112H+V154M+S197Y+I228V+G375E或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代Y112H+V154M+S197Y+I261L+S306A或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含SEQ IDNO:2的成熟多肽的取代Y112H+V154M+S197Y+I261L+G375E或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代Y112H+V154M+S197Y+S306A+G375E或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代Y112H+V154M+I228V+I261L+S306A或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代Y112H+V154M+I228V+I261L+G375E或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代Y112H+V154M+I228V+S306A+G375E或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代Y112H+V154M+I261L+S306A+G375E或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代Y112H+S197Y+I228V+I261L+S306A或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代Y112H+S197Y+I228V+I261L+G375E或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含SEQ IDNO:2的成熟多肽的取代Y112H+S197Y+I228V+S306A+G375E或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代Y112H+S197Y+I261L+S306A+G375E或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代Y112H+I228V+I261L+S306A+G375E或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代V154M+S197Y+I228V+I261L+S306A或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代V154M+S197Y+I228V+I261L+G375E或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代V154M+S197Y+I228V+S306A+G375E或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代V154M+S197Y+I261L+S306A+G375E或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代V154M+I228V+I261L+S306A+G375E或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含SEQ IDNO:2的成熟多肽的取代S197Y+I228V+I261L+S306A+G375E或由这些取代组成。
在另一方面,该变体包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代Y112H+V154M+S197Y+I228V+I261L+S306A或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代Y112H+V154M+S197Y+I228V+I261L+G375E或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含SEQ IDNO:2的成熟多肽的取代Y112H+V154M+S197Y+I228V+S306A+G375E或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代Y112H+V154M+S197Y+I261L+S306A+G375E或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代Y112H+V154M+I228V+I261L+S306A+G375E或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代Y112H+S197Y+I228V+I261L+S306A+G375E或由这些取代组成。在另一方面,该变体包含SEQ IDNO:2的成熟多肽的取代V154M+S197Y+I228V+I261L+S306A+G375E或由这些取代组成。
在另一方面,该变体包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代Y112H+V154M+S197Y+I228V+I261L+S306A+G375E或由这些取代组成。
这些变体可以进一步包含在一个或多个(例如,数个)其他位置处的一个或多个另外的改变,例如,取代、插入、或缺失。
这些氨基酸变化可以具有微小性质,即不显著影响蛋白质的折叠和/或活性的保守性氨基酸取代或者插入;典型地1至30个氨基酸的小缺失;小氨基或羧基末端扩展,如氨基末端甲硫氨酸残基;高达20至25个残基的小接头肽;或通过改变净电荷或另一种功能来促进纯化的小扩展,如一个多组氨酸束(tract)、一个抗原表位或者一个结合结构域。
保守取代的实例处于以下组内:碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸以及组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸以及缬氨酸)、芳族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸以及酪氨酸)、以及小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸以及甲硫氨酸)。通常不改变比活性的氨基酸取代是本领域中已知的,并且例如由H.诺伊拉特(H.Neurath)和R.L.希尔(R.L.Hill),1979,蛋白质(TheProteins),学术出版社(Academic Press),纽约(New York)描述。常见的取代是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu、以及Asp/Gly。
可替代地,氨基酸变化具有多肽的物理-化学特性被改变的这样一种性质。例如,氨基酸变化可以改进多肽的热稳定性、改变底物特异性、改变pH最佳值等。
本发明的变体可以进一步或甚至进一步包含在与SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置247、262、300、322、332、338、以及439相对应的一个或多个(例如,数个)位置处的取代,其中这些变体具有纤维二糖水解酶活性(WO2010/141325)。
在一方面,在本发明的变体中的另外的取代数目是1-7个,如1、2、3、4、5、6、或7个取代。
在另一方面,该变体进一步包含在与位置247、262、300、322、332、338、以及439相对应的一个或多个(例如,数个)位置处的取代。在另一方面,该变体进一步包含在与位置262、287、322、以及332中的任何一个相对应的两个位置处的取代。在另一方面,该变体进一步包含在与位置247、262、300、322、332、338、以及439中的任何一个相对应的三个位置处的取代。在另一方面,该变体进一步包含在与位置247、262、300、322、332、338、以及439中的任何一个相对应的四个位置处的取代。在另一方面,该变体进一步包含在与位置247、262、300、322、332、338、以及439中的任何一个相对应的五个位置处的取代。在另一方面,该变体进一步包含在与位置247、262、300、322、332、338、以及439中的任何一个相对应的六个位置处的取代。在另一方面,该变体进一步包含在与位置247、262、300、322、332、338、以及439相对应的每个位置处的取代。
在另一方面,该变体进一步包含在与位置247相对应的位置处的取代。在另一方面,与位置247相对应的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val取代,优选被Ser取代。在另一方面,该变体进一步包含SEQ IDNO:2的成熟多肽的取代A247S。
在另一方面,该变体进一步包含在与位置262相对应的位置处的取代。在另一方面,与位置262相对应的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val取代,优选被Lys取代。在另一方面,该变体进一步包含SEQ IDNO:2的成熟多肽的取代T262K或由该取代组成。
在另一方面,该变体进一步包含在与位置300相对应的位置处的取代。在另一方面,与位置300相对应的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val取代,优选被Asp取代。在另一方面,该变体进一步包含SEQ IDNO:2的成熟多肽的取代N300D。
在另一方面,该变体进一步包含在与位置322相对应的位置处的取代。在另一方面,与位置322相对应的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val取代,优选被Ile取代。在另一方面,该变体进一步包含SEQ IDNO:2的成熟多肽的取代V322I。
在另一方面,该变体进一步包含在与位置332相对应的位置处的取代。在另一方面,与位置332相对应的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val取代,优选被Asp取代。在另一方面,该变体进一步包含SEQ IDNO:2的成熟多肽的取代D332N。
在另一方面,该变体进一步包含在与位置338相对应的位置处的取代。在另一方面,与位置338相对应的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val取代,优选被Lys取代。在另一方面,该变体进一步包含SEQ IDNO:2的成熟多肽的取代E338K。
在另一方面,该变体进一步包含在与位置439相对应的位置处的取代。在另一方面,与位置439相对应的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val取代,优选被Gln取代。在另一方面,该变体进一步包含SEQ IDNO:2的成熟多肽的取代T439Q。
在另一方面,该变体进一步包含在与位置247和位置262相对应的位置处的取代,如以上所描述的那些。在另一方面,该变体进一步包含在与位置247和位置300相对应的位置处的取代,如以上所描述的那些。在另一方面,该变体进一步包含在与位置247和位置322相对应的位置处的取代,如以上所描述的那些。在另一方面,该变体进一步包含在与位置247和位置332相对应的位置处的取代,如以上所描述的那些。在另一方面,该变体进一步包含在与位置247和位置338相对应的位置处的取代,如以上所描述的那些。在另一方面,该变体进一步包含在与位置247和位置439相对应的位置处的取代,如以上所描述的那些。在另一方面,该变体进一步包含在与位置262和位置300相对应的位置处的取代,如以上所描述的那些。在另一方面,该变体进一步包含在与位置262和位置322相对应的位置处的取代,如以上所描述的那些。在另一方面,该变体进一步包含在与位置262和位置332相对应的位置处的取代,如以上所描述的那些。在另一方面,该变体进一步包含在与位置262和位置338相对应的位置处的取代,如以上所描述的那些。在另一方面,该变体进一步包含在与位置262和位置439相对应的位置处的取代,如以上所描述的那些。在另一方面,该变体进一步包含在与位置300和位置322相对应的位置处的取代,如以上所描述的那些。在另一方面,该变体进一步包含在与位置300和位置332相对应的位置处的取代,如以上所描述的那些。在另一方面,该变体进一步包含在与位置300和位置338相对应的位置处的取代,如以上所描述的那些。在另一方面,该变体进一步包含在与位置300和位置439相对应的位置处的取代,如以上所描述的那些。在另一方面,该变体进一步包含在与位置322和位置332相对应的位置处的取代,如以上所描述的那些。在另一方面,该变体进一步包含在与位置322和位置338相对应的位置处的取代,如以上所描述的那些。在另一方面,该变体进一步包含在与位置322和位置439相对应的位置处的取代,如以上所描述的那些。在另一方面,该变体进一步包含在与位置332和位置338相对应的位置处的取代,如以上所描述的那些。在另一方面,该变体进一步包含在与位置332和位置439相对应的位置处的取代,如以上所描述的那些。在另一方面,该变体进一步包含在与位置338和位置439相对应的位置处的取代,如以上所描述的那些。
在另一方面,该变体进一步包含在与位置247、262、以及300相对应的位置处的取代,如以上所描述的那些。在另一方面,该变体进一步包含在与位置247、262、以及322相对应的位置处的取代,如以上所描述的那些。在另一方面,该变体进一步包含在与位置247、262、以及332相对应的位置处的取代,如以上所描述的那些。在另一方面,该变体进一步包含在与位置247、262、以及338相对应的位置处的取代,如以上所描述的那些。在另一方面,该变体进一步包含在与位置247、262、以及439相对应的位置处的取代,如以上所描述的那些。在另一方面,该变体进一步包含在与位置247、300、以及322相对应的位置处的取代,如以上所描述的那些。在另一方面,该变体进一步包含在与位置247、300、以及332相对应的位置处的取代,如以上所描述的那些。在另一方面,该变体进一步包含在与位置247、300、以及338相对应的位置处的取代,如以上所描述的那些。在另一方面,该变体进一步包含在与位置247、300、以及439相对应的位置处的取代,如以上所描述的那些。在另一方面,该变体进一步包含在与位置247、322、以及332相对应的位置处的取代,如以上所描述的那些。在另一方面,该变体进一步包含在与位置247、322、以及338相对应的位置处的取代,如以上所描述的那些。在另一方面,该变体进一步包含在与位置247、322、以及439相对应的位置处的取代,如以上所描述的那些。在另一方面,该变体进一步包含在与位置247、332、以及338相对应的位置处的取代,如以上所描述的那些。在另一方面,该变体进一步包含在与位置247、332、以及439相对应的位置处的取代,如以上所描述的那些。在另一方面,该变体进一步包含在与位置247、338、以及439相对应的位置处的取代,如以上所描述的那些。在另一方面,该变体进一步包含在与位置262、300、以及322相对应的位置处的取代,如以上所描述的那些。在另一方面,该变体进一步包含在与位置262、300、以及332相对应的位置处的取代,如以上所描述的那些。在另一方面,该变体进一步包含在与位置262、300、以及338相对应的位置处的取代,如以上所描述的那些。在另一方面,该变体进一步包含在与位置262、300、以及439相对应的位置处的取代,如以上所描述的那些。在另一方面,该变体进一步包含在与位置262、322、以及332相对应的位置处的取代,如以上所描述的那些。在另一方面,该变体进一步包含在与位置262、322、以及338相对应的位置处的取代,如以上所描述的那些。在另一方面,该变体进一步包含在与位置262、322、以及439相对应的位置处的取代,如以上所描述的那些。在另一方面,该变体进一步包含在与位置262、332、以及338相对应的位置处的取代,如以上所描述的那些。在另一方面,该变体进一步包含在与位置262、332、以及439相对应的位置处的取代,如以上所描述的那些。在另一方面,该变体进一步包含在与位置262、338、以及439相对应的位置处的取代,如以上所描述的那些。在另一方面,该变体进一步包含在与位置300、322、以及332相对应的位置处的取代,如以上所描述的那些。在另一方面,该变体进一步包含在与位置300、322、以及338相对应的位置处的取代,如以上所描述的那些。在另一方面,该变体进一步包含在与位置300、322、以及439相对应的位置处的取代,如以上所描述的那些。在另一方面,该变体进一步包含在与位置300、332、以及338相对应的位置处的取代,如以上所描述的那些。在另一方面,该变体进一步包含在与位置300、332、以及439相对应的位置处的取代,如以上所描述的那些。在另一方面,该变体进一步包含在与位置300、338、以及439相对应的位置处的取代,如以上所描述的那些。在另一方面,该变体进一步包含在与位置322、332、以及338相对应的位置处的取代,如以上所描述的那些。在另一方面,该变体进一步包含在与位置322、332、以及439相对应的位置处的取代,如以上所描述的那些。在另一方面,该变体进一步包含在与位置322、338、以及439相对应的位置处的取代,如以上所描述的那些。在另一方面,该变体进一步包含在与位置332、338、以及439相对应的位置处的取代,如以上所描述的那些。
在另一方面,该变体进一步包含在与位置247、262、300、以及322相对应的位置处的取代,如以上所描述的那些。在另一方面,该变体进一步包含在与位置247、262、300、以及332相对应的位置处的取代,如以上所描述的那些。在另一方面,该变体进一步包含在与位置247、262、300、以及338相对应的位置处的取代,如以上所描述的那些。在另一方面,该变体进一步包含在与位置247、262、300、以及439相对应的位置处的取代,如以上所描述的那些。在另一方面,该变体进一步包含在与位置247、262、322、以及332相对应的位置处的取代,如以上所描述的那些。在另一方面,该变体进一步包含在与位置247、262、322、以及338相对应的位置处的取代,如以上所描述的那些。在另一方面,该变体进一步包含在与位置247、262、322、以及439相对应的位置处的取代,如以上所描述的那些。在另一方面,该变体进一步包含在与位置247、262、332、以及338相对应的位置处的取代,如以上所描述的那些。在另一方面,该变体进一步包含在与位置247、262、332、以及439相对应的位置处的取代,如以上所描述的那些。在另一方面,该变体进一步包含在与位置247、262、338、以及439相对应的位置处的取代,如以上所描述的那些。在另一方面,该变体进一步包含在与位置247、300、322、以及332相对应的位置处的取代,如以上所描述的那些。在另一方面,该变体进一步包含在与位置247、300、322、以及338相对应的位置处的取代,如以上所描述的那些。在另一方面,该变体进一步包含在与位置247、300、322、以及439相对应的位置处的取代,如以上所描述的那些。在另一方面,该变体进一步包含在与位置247、300、332、以及338相对应的位置处的取代,如以上所描述的那些。在另一方面,该变体进一步包含在与位置247、300、332、以及439相对应的位置处的取代,如以上所描述的那些。在另一方面,该变体进一步包含在与位置247、300、338、以及439相对应的位置处的取代,如以上所描述的那些。在另一方面,该变体进一步包含在与位置247、322、332、以及338相对应的位置处的取代,如以上所描述的那些。在另一方面,该变体进一步包含在与位置247、322、332、以及439相对应的位置处的取代,如以上所描述的那些。在另一方面,该变体进一步包含在与位置247、322、338、以及439相对应的位置处的取代,如以上所描述的那些。在另一方面,该变体进一步包含在与位置247、332、338、以及439相对应的位置处的取代,如以上所描述的那些。在另一方面,该变体进一步包含在与位置262、300、322、以及332相对应的位置处的取代,如以上所描述的那些。在另一方面,该变体进一步包含在与位置262、300、322、以及338相对应的位置处的取代,如以上所描述的那些。在另一方面,该变体进一步包含在与位置262、300、322、以及439相对应的位置处的取代,如以上所描述的那些。在另一方面,该变体进一步包含在与位置262、300、332、以及338相对应的位置处的取代,如以上所描述的那些。在另一方面,该变体进一步包含在与位置262、300、332、以及439相对应的位置处的取代,如以上所描述的那些。在另一方面,该变体进一步包含在与位置262、300、338、以及439相对应的位置处的取代,如以上所描述的那些。在另一方面,该变体进一步包含在与位置262、322、332、以及338相对应的位置处的取代,如以上所描述的那些。在另一方面,该变体进一步包含在与位置262、322、332、以及439相对应的位置处的取代,如以上所描述的那些。在另一方面,该变体进一步包含在与位置262、322、338、以及439相对应的位置处的取代,如以上所描述的那些。在另一方面,该变体进一步包含在与位置262、332、338、以及439相对应的位置处的取代,如以上所描述的那些。在另一方面,该变体进一步包含在与位置300、322、332、以及338相对应的位置处的取代,如以上所描述的那些。在另一方面,该变体进一步包含在与位置300、322、332、以及439相对应的位置处的取代,如以上所描述的那些。在另一方面,该变体进一步包含在与位置300、322、338、以及439相对应的位置处的取代,如以上所描述的那些。在另一方面,该变体进一步包含在与位置300、332、338、以及439相对应的位置处的取代,如以上所描述的那些。在另一方面,该变体进一步包含在与位置322、332、338、以及439相对应的位置处的取代,如以上所描述的那些。
在另一方面,该变体进一步包含在与位置247、262、300、322、以及332相对应的位置处的取代,如以上所描述的那些。在另一方面,该变体进一步包含在与位置247、262、300、322、以及338相对应的位置处的取代,如以上所描述的那些。在另一方面,该变体进一步包含在与位置247、262、300、322、以及439相对应的位置处的取代,如以上所描述的那些。在另一方面,该变体进一步包含在与位置247、262、300、332、以及338相对应的位置处的取代,如以上所描述的那些。在另一方面,该变体进一步包含在与位置247、262、300、332、以及439相对应的位置处的取代,如以上所描述的那些。在另一方面,该变体进一步包含在与位置247、262、300、338、以及439相对应的位置处的取代,如以上所描述的那些。在另一方面,该变体进一步包含在与位置247、262、322、332、以及338相对应的位置处的取代,如以上所描述的那些。在另一方面,该变体进一步包含在与位置247、262、322、332、以及439相对应的位置处的取代,如以上所描述的那些。在另一方面,该变体进一步包含在与位置247、262、322、338、以及439相对应的位置处的取代,如以上所描述的那些。在另一方面,该变体进一步包含在与位置247、262、332、338、以及439相对应的位置处的取代,如以上所描述的那些。在另一方面,该变体进一步包含在与位置247、300、322、332、以及338相对应的位置处的取代,如以上所描述的那些。在另一方面,该变体进一步包含在与位置247、300、322、332、以及439相对应的位置处的取代,如以上所描述的那些。在另一方面,该变体进一步包含在与位置247、300、322、338、以及439相对应的位置处的取代,如以上所描述的那些。在另一方面,该变体进一步包含在与位置247、300、332、338、以及439相对应的位置处的取代,如以上所描述的那些。在另一方面,该变体进一步包含在与位置247、322、332、338、以及439相对应的位置处的取代,如以上所描述的那些。在另一方面,该变体进一步包含在与位置262、300、322、332、以及338相对应的位置处的取代,如以上所描述的那些。在另一方面,该变体进一步包含在与位置262、300、322、332、以及439相对应的位置处的取代,如以上所描述的那些。在另一方面,该变体进一步包含在与位置262、300、322、338、以及439相对应的位置处的取代,如以上所描述的那些。在另一方面,该变体进一步包含在与位置262、300、332、338、以及439相对应的位置处的取代,如以上所描述的那些。在另一方面,该变体进一步包含在与位置262、322、332、338、以及439相对应的位置处的取代,如以上所描述的那些。在另一方面,该变体进一步包含在与位置300、322、332、338、以及439相对应的位置处的取代,如以上所描述的那些。
在另一方面,该变体进一步包含在与位置247、262、300、322、332、以及338相对应的位置处的取代,如以上所描述的那些。在另一方面,该变体进一步包含在与位置247、262、300、322、332、以及439相对应的位置处的取代,如以上所描述的那些。在另一方面,该变体进一步包含在与位置247、262、300、322、338、以及439相对应的位置处的取代,如以上所描述的那些。在另一方面,该变体进一步包含在与位置247、262、300、332、338、以及439相对应的位置处的取代,如以上所描述的那些。在另一方面,该变体进一步包含在与位置247、262、322、332、338、以及439相对应的位置处的取代,如以上所描述的那些。在另一方面,该变体进一步包含在与位置247、300、322、332、338、以及439相对应的位置处的取代,如以上所描述的那些。在另一方面,该变体进一步包含在与位置262、300、322、332、338、以及439相对应的位置处的取代,如以上所描述的那些。
在另一方面,该变体进一步包含在与位置247、262、300、322、332、338、以及439相对应的位置处的取代,如以上所描述的那些。
在另一方面,该变体进一步包含:选自下组的一个或多个(例如,数个)取代,该组由以下各项组成:A247S、T262K、N300D、V322I、D332N、E338K、以及T439Q;或在与如在此所描述的其他纤维二糖水解酶中的SEQ ID NO:2相对应的位置处的选自下组的一个或多个(例如,数个)取代,该组由以下各项组成:A247S、T262K、N300D、V322I、D332N、E338K、以及T439Q。
在以下各方面中,该变体进一步包含在与如在此所描述的其他纤维二糖水解酶中的SEQ ID NO:2相对应的位置处的一个或多个(例如,数个)以下所描述的取代。
在另一方面,该变体进一步包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代A247S+T262K。在另一方面,该变体进一步包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代A247S+N300D。在另一方面,该变体进一步包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代A247S+V322I。在另一方面,该变体进一步包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代A247S+D332N。在另一方面,该变体进一步包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代A247S+E338K。在另一方面,该变体进一步包含SEQID NO:2的成熟多肽的取代A247S+T439Q。在另一方面,该变体进一步包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代T262K+N300D。在另一方面,该变体进一步包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代T262K+V322I。在另一方面,该变体进一步包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代T262K+D332N。在另一方面,该变体进一步包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代T262K+E338K。在另一方面,该变体进一步包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代T262K+T439Q。在另一方面,该变体进一步包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代N300D+V322I。在另一方面,该变体进一步包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代N300D+D332N。在另一方面,该变体进一步包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代N300D+E338K。在另一方面,该变体进一步包含SEQID NO:2的成熟多肽的取代N300D+T439Q。在另一方面,该变体进一步包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代V322I+D332N。在另一方面,该变体进一步包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代V322I+E338K。在另一方面,该变体进一步包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代V322I+T439Q。在另一方面,该变体进一步包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代D332N+E338K。在另一方面,该变体进一步包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代D332N+T439Q。在另一方面,该变体进一步包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代E338K+T439Q。
在另一方面,该变体进一步包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代A247S+T262K+N300D。在另一方面,该变体进一步包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代A247S+T262K+V322I。在另一方面,该变体进一步包含SEQ IDNO:2的成熟多肽的取代A247S+T262K+D332N。在另一方面,该变体进一步包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代A247S+T262K+E338K。在另一方面,该变体进一步包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代A247S+T262K+T439Q。在另一方面,该变体进一步包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代A247S+N300D+V322I。在另一方面,该变体进一步包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代A247S+N300D+D332N。在另一方面,该变体进一步包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代A247S+N300D+E338K。在另一方面,该变体进一步包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代A247S+N300D+T439Q。在另一方面,该变体进一步包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代A247S+V322I+D332N。在另一方面,该变体进一步包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代A247S+V322I+E338K。在另一方面,该变体进一步包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代A247S+V322I+T439Q。在另一方面,该变体进一步包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代A247S+D332N+E338K。在另一方面,该变体进一步包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代A247S+D332N+T439Q。在另一方面,该变体进一步包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代A247S+E338K+T439Q。在另一方面,该变体进一步包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代T262K+N300D+V322I。在另一方面,该变体进一步包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代T262K+N300D+D332N。在另一方面,该变体进一步包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代T262K+N300D+E338K。在另一方面,该变体进一步包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代T262K+N300D+T439Q。在另一方面,该变体进一步包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代T262K+V322I+D332N。在另一方面,该变体进一步包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代T262K+V322I+E338K。在另一方面,该变体进一步包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代T262K+V322I+T439Q。在另一方面,该变体进一步包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代T262K+D332N+E338K。在另一方面,该变体进一步包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代T262K+D332N+T439Q。在另一方面,该变体进一步包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代T262K+E338K+T439Q。在另一方面,该变体进一步包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代N300D+V322I+D332N。在另一方面,该变体进一步包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代N300D+V322I+E338K。在另一方面,该变体进一步包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代N300D+V322I+T439Q。在另一方面,该变体进一步包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代N300D+D332N+E338K。在另一方面,该变体进一步包含SEQ IDNO:2的成熟多肽的取代N300D+D332N+T439Q。在另一方面,该变体进一步包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代N300D+E338K+T439Q。在另一方面,该变体进一步包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代V322I+D332N+E338K。在另一方面,该变体进一步包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代V322I+D332N+T439Q。在另一方面,该变体进一步包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代V322I+E338K+T439Q。在另一方面,该变体进一步包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代D332N+E338K+T439Q。
在另一方面,该变体进一步包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代A247S+T262K+N300D+V322I。在另一方面,该变体进一步包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代A247S+T262K+N300D+D332N。在另一方面,该变体进一步包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代A247S+T262K+N300D+E338K。在另一方面,该变体进一步包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代A247S+T262K+N300D+T439Q。在另一方面,该变体进一步包含SEQ IDNO:2的成熟多肽的取代A247S+T262K+V322I+D332N。在另一方面,该变体进一步包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代A247S+T262K+V322I+E338K。在另一方面,该变体进一步包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代A247S+T262K+V322I+T439Q。在另一方面,该变体进一步包含SEQ IDNO:2的成熟多肽的取代A247S+T262K+D332N+E338K。在另一方面,该变体进一步包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代A247S+T262K+D332N+T439Q。在另一方面,该变体进一步包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代A247S+T262K+E338K+T439Q。在另一方面,该变体进一步包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代A247S+N300D+V322I+D332N。在另一方面,该变体进一步包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代A247S+N300D+V322I+E338K。在另一方面,该变体进一步包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代A247S+N300D+V322I+T439Q。在另一方面,该变体进一步包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代A247S+N300D+D332N+E338K。在另一方面,该变体进一步包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代A247S+N300D+D332N+T439Q。在另一方面,该变体进一步包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代A247S+N300D+E338K+T439Q。在另一方面,该变体进一步包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代A247S+V322I+D332N+E338K。在另一方面,该变体进一步包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代A247S+V322I+D332N+T439Q。在另一方面,该变体进一步包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代A247S+V322I+E338K+T439Q。在另一方面,该变体进一步包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代A247S+D332N+E338K+T439Q。在另一方面,该变体进一步包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代T262K+N300D+V322I+D332N。在另一方面,该变体进一步包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代T262K+N300D+V322I+E338K。在另一方面,该变体进一步包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代T262K+N300D+V322I+T439Q。在另一方面,该变体进一步包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代T262K+N300D+D332N+E338K。在另一方面,该变体进一步包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代T262K+N300D+D332N+T439Q。在另一方面,该变体进一步包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代T262K+N300D+E338K+T439Q。在另一方面,该变体进一步包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代T262K+V322I+D332N+E338K。在另一方面,该变体进一步包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代T262K+V322I+D332N+T439Q。在另一方面,该变体进一步包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代T262K+V322I+E338K+T439Q。在另一方面,该变体进一步包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代T262K+D332N+E338K+T439Q。在另一方面,该变体进一步包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代N300D+V322I+D332N+E338K。在另一方面,该变体进一步包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代N300D+V322I+D332N+T439Q。在另一方面,该变体进一步包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代N300D+V322I+E338K+T439Q。在另一方面,该变体进一步包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代N300D+D332N+E338K+T439Q。在另一方面,该变体进一步包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代V322I+D332N+E338K+T439Q。
在另一方面,该变体进一步包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代A247S+T262K+N300D+V322I+D332N。在另一方面,该变体进一步包含SEQ IDNO:2的成熟多肽的取代A247S+T262K+N300D+V322I+E338K。在另一方面,该变体进一步包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代A247S+T262K+N300D+V322I+T439Q。在另一方面,该变体进一步包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代A247S+T262K+N300D+D332N+E338K。在另一方面,该变体进一步包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代A247S+T262K+N300D+D332N+T439Q。在另一方面,该变体进一步包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代A247S+T262K+N300D+E338K+T439Q。在另一方面,该变体进一步包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代A247S+T262K+V322I+D332N+E338K。在另一方面,该变体进一步包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代A247S+T262K+V322I+D332N+T439Q。在另一方面,该变体进一步包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代A247S+T262K+V322I+E338K+T439Q。在另一方面,该变体进一步包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代A247S+T262K+D332N+E338K+T439Q。在另一方面,该变体进一步包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代A247S+N300D+V322I+D332N+E338K。在另一方面,该变体进一步包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代A247S+N300D+V322I+D332N+T439Q。在另一方面,该变体进一步包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代A247S+N300D+V322I+E338K+T439Q。在另一方面,该变体进一步包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代A247S+N300D+D332N+E338K+T439Q。在另一方面,该变体进一步包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代A247S+V322I+D332N+E338K+T439Q。在另一方面,该变体进一步包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代T262K+N300D+V322I+D332N+E338K。在另一方面,该变体进一步包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代T262K+N300D+V322I+D332N+T439Q。在另一方面,该变体进一步包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代T262K+N300D+V322I+E338K+T439Q。在另一方面,该变体进一步包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代T262K+N300D+D332N+E338K+T439Q。在另一方面,该变体进一步包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代T262K+V322I+D332N+E338K+T439Q。在另一方面,该变体进一步包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代N300D+V322I+D332N+E338K+T439Q。
在另一方面,该变体进一步包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代A247S+T262K+N300D+V322I+D332N+E338K。在另一方面,该变体进一步包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代A247S+T262K+N300D+V322I+D332N+T439Q。在另一方面,该变体进一步包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代A247S+T262K+N300D+V322I+E338K+T439Q。在另一方面,该变体进一步包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代A247S+T262K+N300D+D332N+E338K+T439Q。在另一方面,该变体进一步包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代A247S+T262K+V322I+D332N+E338K+T439Q。在另一方面,该变体进一步包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代A247S+N300D+V322I+D332N+E338K+T439Q。在另一方面,该变体进一步包含SEQ IDNO:2的成熟多肽的取代T262K+N300D+V322I+D332N+E338K+T439Q。
在另一方面,该变体进一步包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代A247S+T262K+N300D+V322I+D332N+E338K+T439Q。
本发明的变体可以进一步或甚至进一步包含在与SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置256、287、以及344相对应的一个或多个(例如,数个)位置处的取代,其中这些变体具有纤维二糖水解酶活性(WO2011/123450)。
在一方面,在本发明的变体中的另外的取代数目是1-3个,如1、2、或3个取代。
在另一方面,该变体进一步包含在与位置256、287、以及344相对应的一个或多个(例如,数个)位置处的取代。在另一方面,变体包含在与位置256、287、以及344中的任何一个相对应的两个位置处的取代。在另一方面,变体包含在与位置256、287、以及344相对应的每个位置处的取代。
在另一方面,该变体进一步包含在与位置256相对应的位置处的取代。在另一方面,与位置256相对应的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val取代,优选被Leu取代。在另一方面,该变体进一步包含SEQ IDNO:2的成熟多肽的取代C256L。
在另一方面,该变体进一步包含在与位置287相对应的位置处的取代。在另一方面,与位置287相对应的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val取代,优选被Ile取代。在另一方面,该变体进一步包含SEQ IDNO:2的成熟多肽的取代L287I。
在另一方面,该变体进一步包含在与位置344相对应的位置处的取代。在另一方面,与位置344相对应的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val取代,优选被Phe取代。在另一方面,该变体进一步包含SEQ IDNO:2的成熟多肽的取代L344F。
在另一方面,该变体进一步包含在与位置256和位置287相对应的位置处的取代,如以上所描述的那些。在另一方面,该变体进一步包含在与位置256和位置344相对应的位置处的取代,如以上所描述的那些。在另一方面,该变体进一步包含在与位置287和位置344相对应的位置处的取代,如以上所描述的那些。
在另一方面,该变体进一步包含在与位置256、287、以及344相对应的位置处的取代,如以上所描述的那些。
在另一方面,该变体进一步包含:选自下组的一个或多个(例如,数个)取代,该组由以下各项组成:C256L、L287I、以及L344F;或在与如在此所描述的其他纤维二糖水解酶中的SEQ ID NO:2相对应的位置处的选自下组的一个或多个(例如,数个)取代,该组由以下各项组成:C256L、L287I、以及L344F。
在以下各方面中,该变体进一步包含在与如在此所描述的其他纤维二糖水解酶中的SEQ ID NO:2相对应的位置处的一个或多个(例如,数个)以下所描述的取代。
在另一方面,该变体进一步包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代C256L+L287I。在另一方面,该变体进一步包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代C256L+L344F。在另一方面,该变体进一步包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代L287I+L344。
在另一方面,该变体进一步包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代C256L+L287I+L344F。
该变体可以由相对应的亲本纤维二糖水解酶的成熟多肽的至少85%的氨基酸残基,例如至少90%的氨基酸残基或至少95%的氨基酸残基组成。
可以根据本领域中已知的程序,如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(坎宁安(Cunningham)和威尔斯(Wells),1989,科学(Science)244:1081-1085)来鉴别一种多肽中的必需氨基酸。在后一种技术中,在分子中的每个残基处引入单一丙氨酸突变,并且测试所得突变分子的纤维二糖水解酶活性以鉴别对该分子的活性至关重要的氨基酸残基。还参见,希尔顿(Hilton)等人,1996,生物化学杂志271:4699-4708。还可以结合推定的接触位点氨基酸的突变,如通过以下技术如核磁共振、结晶学、电子衍射、或光亲和标记进行确定,对结构进行物理学分析,来确定酶的活性位点或其他生物学相互作用。参见,例如,德弗斯(de Vos)等人,1992,科学255:306-312;史密斯(Smith)等人,1992,分子生物学杂志224:899-904;乌乐达维尔(Wlodaver)等人,1992,欧洲生化学会联合会快报309:59-64。必需氨基酸的身份还可以从与一种相关多肽的比对来推断。纤维二糖水解酶中的必需氨基酸与SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置22、107、194、和/或196相对应。
在一个实施例中,变体具有与其亲本纤维二糖水解酶相比增加的热稳定性。
在一方面,变体相对于亲本的热稳定性是在pH3.0和45℃下测定的。在另一方面,变体相对于亲本的热稳定性是在pH3.0和50℃下测定的。在另一方面,变体相对于亲本的热稳定性是在pH3.0和55℃下测定的。在另一方面,变体相对于亲本的热稳定性是在pH3.0和60℃下测定的。在另一方面,变体相对于亲本的热稳定性是在pH3.0和65℃下测定的。在另一方面,变体相对于亲本的热稳定性是在pH3.0和70℃下测定的。在另一方面,变体相对于亲本的热稳定性是在pH3.0和75℃下测定的。在另一方面,变体相对于亲本的热稳定性是在pH3.0和80℃下测定的。在另一方面,变体相对于亲本的热稳定性是在pH3.0和85℃下测定的。在另一方面,变体相对于亲本的热稳定性是在pH3.0和90℃下测定的。在另一方面,变体相对于亲本的热稳定性是在pH3.0和95℃下测定的。
在另一方面,变体相对于亲本的热稳定性是在pH3.5和45℃下测定的。在另一方面,变体相对于亲本的热稳定性是在pH3.5和50℃下测定的。在另一方面,变体相对于亲本的热稳定性是在pH3.5和55℃下测定的。在另一方面,变体相对于亲本的热稳定性是在pH3.5和60℃下测定的。在另一方面,变体相对于亲本的热稳定性是在pH3.5和65℃下测定的。在另一方面,变体相对于亲本的热稳定性是在pH3.5和70℃下测定的。在另一方面,变体相对于亲本的热稳定性是在pH3.5和75℃下测定的。在另一方面,变体相对于亲本的热稳定性是在pH3.5和80℃下测定的。在另一方面,变体相对于亲本的热稳定性是在pH3.5和85℃下测定的。在另一方面,变体相对于亲本的热稳定性是在pH3.5和90℃下测定的。在另一方面,变体相对于亲本的热稳定性是在pH3.5和95℃下测定的。
在另一方面,变体相对于亲本的热稳定性是在pH4.0和45℃下测定的。在另一方面,变体相对于亲本的热稳定性是在pH4.0和50℃下测定的。在另一方面,变体相对于亲本的热稳定性是在pH4.0和55℃下测定的。在另一方面,变体相对于亲本的热稳定性是在pH4.0和60℃下测定的。在另一方面,变体相对于亲本的热稳定性是在pH4.0和65℃下测定的。在另一方面,变体相对于亲本的热稳定性是在pH4.0和70℃下测定的。在另一方面,变体相对于亲本的热稳定性是在pH4.0和75℃下测定的。在另一方面,变体相对于亲本的热稳定性是在pH4.0和80℃下测定的。在另一方面,变体相对于亲本的热稳定性是在pH4.0和85℃下测定的。在另一方面,变体相对于亲本的热稳定性是在pH4.0和90℃下测定的。在另一方面,变体相对于亲本的热稳定性是在pH4.0和95℃下测定的。
在另一方面,变体相对于亲本的热稳定性是在pH4.5和45℃下测定的。在另一方面,变体相对于亲本的热稳定性是在pH4.5和50℃下测定的。在另一方面,变体相对于亲本的热稳定性是在pH4.5和55℃下测定的。在另一方面,变体相对于亲本的热稳定性是在pH4.5和60℃下测定的。在另一方面,变体相对于亲本的热稳定性是在pH4.5和65℃下测定的。在另一方面,变体相对于亲本的热稳定性是在pH4.5和70℃下测定的。在另一方面,变体相对于亲本的热稳定性是在pH4.5和75℃下测定的。在另一方面,变体相对于亲本的热稳定性是在pH4.5和80℃下测定的。在另一方面,变体相对于亲本的热稳定性是在pH4.5和85℃下测定的。在另一方面,变体相对于亲本的热稳定性是在pH4.5和90℃下测定的。在另一方面,变体相对于亲本的热稳定性是在pH4.5和95℃下测定的。
在另一方面,变体相对于亲本的热稳定性是在pH5.0和45℃下测定的。在另一方面,变体相对于亲本的热稳定性是在pH5.0和50℃下测定的。在另一方面,变体相对于亲本的热稳定性是在pH5.0和55℃下测定的。在另一方面,变体相对于亲本的热稳定性是在pH5.0和60℃下测定的。在另一方面,变体相对于亲本的热稳定性是在pH5.0和65℃下测定的。在另一方面,变体相对于亲本的热稳定性是在pH5.0和67℃下测定的。在另一方面,变体相对于亲本的热稳定性是在pH5.0和70℃下测定的。在另一方面,变体相对于亲本的热稳定性是在pH5.0和75℃下测定的。在另一方面,变体相对于亲本的热稳定性是在pH5.0和80℃下测定的。在另一方面,变体相对于亲本的热稳定性是在pH5.0和85℃下测定的。在另一方面,变体相对于亲本的热稳定性是在pH5.0和90℃下测定的。在另一方面,变体相对于亲本的热稳定性是在pH5.0和95℃下测定的。
在另一方面,变体相对于亲本的热稳定性是在pH5.5和45℃下测定的。在另一方面,变体相对于亲本的热稳定性是在pH5.5和50℃下测定的。在另一方面,变体相对于亲本的热稳定性是在pH5.5和55℃下测定的。在另一方面,变体相对于亲本的热稳定性是在pH5.5和60℃下测定的。在另一方面,变体相对于亲本的热稳定性是在pH5.5和65℃下测定的。在另一方面,变体相对于亲本的热稳定性是在pH5.5和70℃下测定的。在另一方面,变体相对于亲本的热稳定性是在pH5.5和75℃下测定的。在另一方面,变体相对于亲本的热稳定性是在pH5.5和80℃下测定的。在另一方面,变体相对于亲本的热稳定性是在pH5.5和85℃下测定的。在另一方面,变体相对于亲本的热稳定性是在pH5.5和90℃下测定的。在另一方面,变体相对于亲本的热稳定性是在pH5.5和95℃下测定的。
在另一方面,变体相对于亲本的热稳定性是在pH6.0和45℃下测定的。在另一方面,变体相对于亲本的热稳定性是在pH6.0和50℃下测定的。在另一方面,变体相对于亲本的热稳定性是在pH6.0和55℃下测定的。在另一方面,变体相对于亲本的热稳定性是在pH6.0和60℃下测定的。在另一方面,变体相对于亲本的热稳定性是在pH6.0和65℃下测定的。在另一方面,变体相对于亲本的热稳定性是在pH6.0和70℃下测定的。在另一方面,变体相对于亲本的热稳定性是在pH6.0和75℃下测定的。在另一方面,变体相对于亲本的热稳定性是在pH6.0和80℃下测定的。在另一方面,变体相对于亲本的热稳定性是在pH6.0和85℃下测定的。在另一方面,变体相对于亲本的热稳定性是在pH6.0和90℃下测定的。在另一方面,变体相对于亲本的热稳定性是在pH6.0和95℃下测定的。
在另一方面,变体相对于亲本的热稳定性是在pH6.5和45℃下测定的。在另一方面,变体相对于亲本的热稳定性是在pH6.5和50℃下测定的。在另一方面,变体相对于亲本的热稳定性是在pH6.5和55℃下测定的。在另一方面,变体相对于亲本的热稳定性是在pH6.5和60℃下测定的。在另一方面,变体相对于亲本的热稳定性是在pH6.5和65℃下测定的。在另一方面,变体相对于亲本的热稳定性是在pH6.5和70℃下测定的。在另一方面,变体相对于亲本的热稳定性是在pH6.5和75℃下测定的。在另一方面,变体相对于亲本的热稳定性是在pH6.5和80℃下测定的。在另一方面,变体相对于亲本的热稳定性是在pH6.5和85℃下测定的。在另一方面,变体相对于亲本的热稳定性是在pH6.5和90℃下测定的。在另一方面,变体相对于亲本的热稳定性是在pH6.5和95℃下测定的。
在另一方面,变体相对于亲本的热稳定性是在pH7.0和45℃下测定的。在另一方面,变体相对于亲本的热稳定性是在pH7.0和50℃下测定的。在另一方面,变体相对于亲本的热稳定性是在pH7.0和55℃下测定的。在另一方面,变体相对于亲本的热稳定性是在pH7.0和60℃下测定的。在另一方面,变体相对于亲本的热稳定性是在pH7.0和65℃下测定的。在另一方面,变体相对于亲本的热稳定性是在pH7.0和70℃下测定的。在另一方面,变体相对于亲本的热稳定性是在pH7.0和75℃下测定的。在另一方面,变体相对于亲本的热稳定性是在pH7.0和80℃下测定的。在另一方面,变体相对于亲本的热稳定性是在pH7.0和85℃下测定的。在另一方面,变体相对于亲本的热稳定性是在pH7.0和90℃下测定的。在另一方面,变体相对于亲本的热稳定性是在pH7.0和95℃下测定的。
在另一方面,变体相对于亲本的热稳定性是在pH7.5和45℃下测定的。在另一方面,变体相对于亲本的热稳定性是在pH7.5和50℃下测定的。在另一方面,变体相对于亲本的热稳定性是在pH7.5和55℃下测定的。在另一方面,变体相对于亲本的热稳定性是在pH7.5和60℃下测定的。在另一方面,变体相对于亲本的热稳定性是在pH7.5和65℃下测定的。在另一方面,变体相对于亲本的热稳定性是在pH7.5和70℃下测定的。在另一方面,变体相对于亲本的热稳定性是在pH7.5和75℃下测定的。在另一方面,变体相对于亲本的热稳定性是在pH7.5和80℃下测定的。在另一方面,变体相对于亲本的热稳定性是在pH7.5和85℃下测定的。在另一方面,变体相对于亲本的热稳定性是在pH7.5和90℃下测定的。在另一方面,变体相对于亲本的热稳定性是在pH7.5和95℃下测定的。
在另一方面,变体相对于亲本的热稳定性是在pH8.0和45℃下测定的。在另一方面,变体相对于亲本的热稳定性是在pH8.0和50℃下测定的。在另一方面,变体相对于亲本的热稳定性是在pH8.0和55℃下测定的。在另一方面,变体相对于亲本的热稳定性是在pH8.0和60℃下测定的。在另一方面,变体相对于亲本的热稳定性是在pH8.0和65℃下测定的。在另一方面,变体相对于亲本的热稳定性是在pH8.0和70℃下测定的。在另一方面,变体相对于亲本的热稳定性是在pH8.0和75℃下测定的。在另一方面,变体相对于亲本的热稳定性是在pH8.0和80℃下测定的。在另一方面,变体相对于亲本的热稳定性是在pH8.0和85℃下测定的。在另一方面,变体相对于亲本的热稳定性是在pH8.0和90℃下测定的。在另一方面,变体相对于亲本的热稳定性是在pH8.0和95℃下测定的。
在另一方面,变体相对于亲本的热稳定性是在pH8.5和45℃下测定的。在另一方面,变体相对于亲本的热稳定性是在pH8.5和50℃下测定的。在另一方面,变体相对于亲本的热稳定性是在pH8.5和55℃下测定的。在另一方面,变体相对于亲本的热稳定性是在pH8.5和60℃下测定的。在另一方面,变体相对于亲本的热稳定性是在pH8.5和65℃下测定的。在另一方面,变体相对于亲本的热稳定性是在pH8.5和70℃下测定的。在另一方面,变体相对于亲本的热稳定性是在pH8.5和75℃下测定的。在另一方面,变体相对于亲本的热稳定性是在pH8.5和80℃下测定的。在另一方面,变体相对于亲本的热稳定性是在pH8.5和85℃下测定的。在另一方面,变体相对于亲本的热稳定性是在pH8.5和90℃下测定的。在另一方面,变体相对于亲本的热稳定性是在pH8.5和95℃下测定的。
在另一方面,变体相对于亲本的热稳定性是在pH9.0和45℃下测定的。在另一方面,变体相对于亲本的热稳定性是在pH9.0和50℃下测定的。在另一方面,变体相对于亲本的热稳定性是在pH9.0和55℃下测定的。在另一方面,变体相对于亲本的热稳定性是在pH9.0和60℃下测定的。在另一方面,变体相对于亲本的热稳定性是在pH9.0和65℃下测定的。在另一方面,变体相对于亲本的热稳定性是在pH9.0和70℃下测定的。在另一方面,变体相对于亲本的热稳定性是在pH9.0和75℃下测定的。在另一方面,变体相对于亲本的热稳定性是在pH9.0和80℃下测定的。在另一方面,变体相对于亲本的热稳定性是在pH9.0和85℃下测定的。在另一方面,变体相对于亲本的热稳定性是在pH9.0和90℃下测定的。在另一方面,变体相对于亲本的热稳定性是在pH9.0和95℃下测定的。
在以上各方面中,变体相对于亲本的热稳定性可以通过将该变体与亲本孵育1分钟来测定。在以上各方面中,变体相对于亲本的热稳定性可以通过将该变体与亲本孵育5分钟来测定。在以上各方面中,变体相对于亲本的热稳定性可以通过将该变体与亲本孵育10分钟来测定。在以上各方面中,变体相对于亲本的热稳定性可以通过将该变体与亲本孵育15分钟来测定。在以上各方面中,变体相对于亲本的热稳定性可以通过将该变体与亲本孵育20分钟来测定。在以上各方面中,变体相对于亲本的热稳定性可以通过将该变体与亲本孵育30分钟来测定。在以上各方面中,变体相对于亲本的热稳定性可以通过将该变体与亲本孵育45分钟来测定。在以上各方面中,变体相对于亲本的热稳定性可以通过将该变体与亲本孵育60分钟来测定。在以上各方面中,变体相对于亲本的热稳定性可以通过将该变体与亲本孵育任何适合的时间来测定。
在一方面,与亲本相比,具有纤维二糖水解酶活性的变体的热稳定性增加至少1.01倍,例如至少1.05倍、至少1.1倍、至少1.2倍、至少1.3倍、至少1.4倍、至少1.5倍、至少1.8倍、至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少50倍、至少75倍、或至少100倍。
亲本纤维二糖水解酶
亲本纤维二糖水解酶可以是任何纤维二糖水解酶。
亲本纤维二糖水解酶可以是(a)与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ IDNO:24、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:40、SEQ IDNO:42、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:58、SEQ IDNO:60、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:112、SEQ ID NO:114、或SEQ ID NO:116的成熟多肽具有至少60%序列一致性的多肽;(b)由在低严格度条件下与以下各项杂交的多核苷酸编码的多肽:(i)SEQ ID NO:1、SEQID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ IDNO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:37、SEQ IDNO:39、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:55、SEQ IDNO:57、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:111、SEQ IDNO:113、或SEQ ID NO:115的成熟多肽编码序列,或(ii)(i)的全长补体;或(c)由与以下各项具有至少60%序列一致性的多核苷酸编码的多肽:SEQID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:27、SEQID NO:29、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:45、SEQ IDNO:47、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:63、SEQ IDNO:65、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:113、或SEQ ID NO:115的成熟多肽编码序列。
在一方面,该亲本与具有纤维素二糖水解酶活性的SEQ ID NO:2、SEQID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ IDNO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:38、SEQ IDNO:40、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:56、SEQ IDNO:58、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:112、SEQ IDNO:114、或SEQ ID NO:116的成熟多肽具有至少60%,例如至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列一致性。
在另一方面,该亲本的氨基酸序列与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ IDNO:24、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:40、SEQ IDNO:42、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:58、SEQ IDNO:60、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:112、SEQ ID NO:114、或SEQ ID NO:116的成熟多肽具有多达10个氨基酸,例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个氨基酸的差异。
在另一方面,该亲本包含SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42、SEQ IDNO:44、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:60、SEQ IDNO:62、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:112、SEQ ID NO:114、或SEQ ID NO:116的氨基酸序列或由其组成。
在另一方面,该亲本包含SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42、SEQ IDNO:44、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:60、SEQ IDNO:62、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:112、SEQ ID NO:114、或SEQ ID NO:116的成熟多肽或由其组成。
在另一方面,该亲本包含以下各项或由其组成:SEQ ID NO:2的氨基酸20至456、SEQ ID NO:4的氨基酸17至447、SEQ ID NO:6的氨基酸18至481、SEQ ID NO:8的氨基酸18至482、SEQ ID NO:10的氨基酸20至454、SEQ ID NO:12的氨基酸20至463、SEQ ID NO:14的氨基酸18至399、SEQID NO:16的氨基酸18至400、SEQ ID NO:18的氨基酸20至450、SEQ IDNO:20的氨基酸20至457、SEQ ID NO:22的氨基酸19至468、SEQ ID NO:24的氨基酸18至403、SEQ ID NO:26的氨基酸19至484、SEQ ID NO:28的氨基酸19至464、SEQ ID NO:30的氨基酸19至485、SEQ ID NO:32的氨基酸17至385、SEQ ID NO:34的氨基酸20至457、SEQ ID NO:36的氨基酸20至457、SEQ ID NO:38的氨基酸20至455、SEQ ID NO:40的氨基酸19至469、SEQ ID NO:42的氨基酸18至487、SEQ ID NO:44的氨基酸19至471、SEQ ID NO:46的氨基酸17至401、SEQ ID NO:48的氨基酸23至408、SEQ ID NO:50的氨基酸18至386、SEQ ID NO:52的氨基酸23至399、SEQ ID NO:54的氨基酸19至469、SEQ ID NO:56的氨基酸17至400、SEQ ID NO:58的氨基酸19至459、SEQ ID NO:60的氨基酸20至393、SEQID NO:62的氨基酸18至403、SEQ ID NO:64的氨基酸18至492、SEQ IDNO:66的氨基酸20至459、SEQ ID NO:68的氨基酸19至470、SEQ ID NO:70的氨基酸19至480、SEQ ID NO:110的氨基酸19至470、SEQ ID NO:112的氨基酸18至394、SEQ ID NO:114的氨基酸18至469、或SEQ ID NO:116的氨基酸19至464或由其组成。
在另一方面,该亲本是含有纤维二糖水解酶的成熟多肽的至少85%的氨基酸残基,例如至少90%的氨基酸残基或至少95%的氨基酸残基的片段。
在另一方面,该亲本是SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42、SEQ IDNO:44、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:60、SEQ IDNO:62、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:112、SEQ ID NO:114、或SEQ ID NO:116的成熟多肽的一个等位基因变体。
在另一方面,该亲本由在极低严格度条件、低严格度条件、中等严格度条件、中-高等严格度条件、高严格度条件、或极高严格度条件下与以下各项杂交的多核苷酸编码:(i)SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQID NO:25、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:41、SEQ IDNO:43、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:59、SEQ IDNO:61、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:113、或SEQ ID NO:115的成熟多肽编码序列、或其全长补体(萨姆布鲁克(Sambrook)等人,1989,分子克隆:实验室手册(Molecular Cloning,A Laboratory ManualM),第2版,冷泉港(Cold Spring Harbor),纽约(New York))。
SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ IDNO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25、SEQ IDNO:27、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:43、SEQ IDNO:45、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:61、SEQ IDNO:63、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:113、或SEQ ID NO:115的多核苷酸、或其子序列,以及SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ IDNO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:34、SEQ IDNO:36、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:52、SEQ IDNO:54、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:70、SEQ IDNO:110、SEQ ID NO:112、SEQ ID NO:114、或SEQ ID NO:116的多肽、或其片段可以用于设计核酸探针,以根据本领域熟知的方法由不同属或种的菌株鉴别和克隆编码亲本的DNA。具体地说,可以根据标准DNA印迹程序,使用这类探针与感兴趣的细胞的基因组DNA或cDNA杂交,以便鉴别和分离其中的相应基因。这类探针可以明显短于完整序列,但是长度应该是至少15,例如至少25、至少35、或至少70个核苷酸。优选地,该核酸探针的长度是至少100个核苷酸,例如长度是至少200个核苷酸、至少300个核苷酸、至少400个核苷酸、至少500个核苷酸、至少600个核苷酸、至少700个核苷酸、至少800个核苷酸、或至少900个核苷酸。DNA探针与RNA探针两者均可以使用。典型地将探针进行标记,以用于检测相应基因(例如,用32P、3H、35S、生物素、或抗生物素蛋白标记)。本发明涵盖这类探针。
可以针对与以上所描述的探针杂交并且编码亲本的DNA来筛选由这类其他菌株制备的基因组DNA或cDNA文库。来自这类其他菌株的基因组或其他DNA可以通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳、或其他分离技术来分离。来自这些文库的DNA或分离的DNA可以转移到并且固定于硝基纤维素或其他适合载体材料上。为了鉴别与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ IDNO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:31、SEQ IDNO:33、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:49、SEQ IDNO:51、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:67、SEQ IDNO:69、SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:113、或SEQ ID NO:115、或其子序列杂交的克隆或DNA,将该载体材料用于DNA印迹中。
出于本发明的目的,杂交指示多核苷酸在极低严格度条件至极高严格度条件下与对应于以下各项的标记的核酸探针杂交:(i)SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:29、SEQ IDNO:31、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:47、SEQ IDNO:49、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:65、SEQ IDNO:67、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:113、或SEQ ID NO:115;(ii)其成熟多肽编码序列;(iii)其全长补体;或(iv)其子序列。可以使用例如X-射线胶片或本领域已知的任何其他检测手段来检测在这些条件下该核酸探针所杂交的分子。
在一方面,该核酸探针是SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQID NO:25、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:41、SEQ IDNO:43、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:59、SEQ IDNO:61、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:113、或SEQ ID NO:115的成熟多肽编码序列。
在另一方面,该核酸探针是SEQ ID NO:1的核苷酸58至1786、SEQ IDNO:3的核苷酸109至1401、SEQ ID NO:5的核苷酸52至1443、SEQ ID NO:7的核苷酸52至1809、SEQ ID NO:9的核苷酸58至1710、SEQ ID NO:11的核苷酸58至1392、SEQ ID NO:13的核苷酸52至1197、SEQ ID NO:15的核苷酸52至1200、SEQ ID NO:17的核苷酸58至1350、SEQ ID NO:19的核苷酸58至1371、SEQ ID NO:21的核苷酸55至1404、SEQ ID NO:23的核苷酸52至1209、SEQ ID NO:25的核苷酸55至1452、SEQ ID NO:27的核苷酸55至1392、SEQ ID NO:29的核苷酸55至1455、SEQ ID NO:31的核苷酸49至1155、SEQ ID NO:33的核苷酸58至1371、SEQ ID NO:35的核苷酸58至1371、SEQ ID NO:37的核苷酸58至1365、SEQ ID NO:39的核苷酸55至1407、SEQ ID NO:41的核苷酸52至1461、SEQ ID NO:43的核苷酸55至1413、SEQ ID NO:45的核苷酸49至1203、SEQ ID NO:47的核苷酸67至1224、SEQ ID NO:49的核苷酸52至1158、SEQ ID NO:51的核苷酸67至1197、SEQ ID NO:53的核苷酸55至1407、SEQ ID NO:55的核苷酸49至1200、SEQ ID NO:57的核苷酸55至1377、SEQ ID NO:59的核苷酸58至1179、SEQ ID NO:61的核苷酸52至1209、SEQ ID NO:63的核苷酸52至1476、SEQ ID NO:65的核苷酸58至1377、SEQ ID NO:67的核苷酸55至1410、SEQ ID NO:69的核苷酸55至1440、SEQ ID NO:109的核苷酸55至1575、SEQ ID NO:111的核苷酸52至1379、SEQ ID NO:113的核苷酸52至1659、或SEQ ID NO:115的核苷酸55至1895。
在另一方面,该核酸探针是编码SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ IDNO:24、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:40、SEQ IDNO:42、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:58、SEQ IDNO:60、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:112、SEQ ID NO:114、或SEQ ID NO:116的多肽、其成熟多肽、或其片段的多核苷酸。
在另一方面,该核酸探针是SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ IDNO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:31、SEQ IDNO:33、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:49、SEQ IDNO:51、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:67、SEQ IDNO:69、SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:113、或SEQ ID NO:115。
在另一个实施例中,该亲本由与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:31、SEQ IDNO:33、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:49、SEQ IDNO:51、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:67、SEQ IDNO:69、SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:113、或SEQ ID NO:115的成熟多肽编码序列具有至少60%,例如至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列一致性的多核苷酸编码。
该亲本可以是其中一个多肽的一个区域融合在另一个多肽的一个区域的N-末端或C-末端的一种杂合多肽。
该亲本还可以是其中另一个多肽融合在本发明的多肽的N-末端或者C-末端的一种融合多肽或可裂解的融合多肽。融合多肽是通过将编码另一个多肽的多核苷酸与本发明的多核苷酸融合来产生。用于产生融合多肽的技术是本领域已知的,并且包括连接编码多肽的编码序列,这样使得它们在框内并且该融合多肽的表达处于相同的一个或多个启动子和终止子的控制下。融合多肽还可以使用内含肽技术构建,在该技术中,融合多肽是翻译后产生的(库珀(Cooper)等人,1993,欧洲分子生物学学会杂志(EMBO J.)12:2575-2583;道森(Dawson)等人,1994,科学266:776-779)。
融合多肽可以在两个多肽之间另外包含一个裂解位点。在融合蛋白分泌之后,该位点被裂解,从而释放这两个多肽。裂解位点的实例包括但不限于在以下各项中披露的位点:马丁(Martin)等人,2003,工业微生物学与生物技术杂志(J.Ind.Microbiol.Biotechnol.)3:568-576;斯韦蒂娜(Svetina)等人,2000,生物技术杂志(J.Biotechnol.)76:245-251;罗斯默森-威尔森(Rasmussen-Wilson)等人,1997,应用与环境微生物学(Appl.Environ.Microbiol.)63:3488-3493;沃德(Ward)等人,1995,生物技术(Biotechnology)13:498-503;以及孔特雷拉斯(Contreras)等人,1991,生物技术9:378-381;伊顿(Eaton)等人,1986,生物化学(Biochemistry)25:505-512;柯林斯-雷西(Collins-Racie)等人,1995,生物技术13:982-987;卡特(Carter)等人,1989,蛋白质:结构、功能与遗传学(Proteins:Structure,Function,andGenetics)6:240-248;以及史蒂文斯(Stevens),2003,世界药物发现(DrugDiscovery World)4:35-48。
该亲本可以从任何属的微生物中获得。出于本发明的目的,如在此结合一种给定的来源使用的术语“从......中获得”应意指由一种多核苷酸编码的亲本是由该来源或由其中已经插入来自该来源的多核苷酸的一种菌株产生。在一方面,该亲本是胞外分泌的。
该亲本可以是一种细菌纤维二糖水解酶。例如,亲本可以是一种革兰氏阳性细菌多肽,如芽孢杆菌(Bacillus)、梭状芽孢杆菌(Clostridium)、肠球菌(Enterococcus)、土芽孢杆菌(Geobacillus)、乳酸杆菌(Lactobacillus)、乳球菌(Lactococcus)、大洋芽孢杆菌(Oceanobacillus)、葡萄球菌(Staphylococcus)、链球菌(Streptococcus)或链霉菌属(Streptomyces)纤维二糖水解酶,或一种革兰氏阴性细菌多肽,如弯曲杆菌(Campylobacter)、大肠杆菌(E.coli)、黄质菌属(Flavobacterium)、梭杆菌(Fusobacterium)、螺杆菌(Helicobacter)、泥杆菌属(Ilyobacter)、奈瑟氏菌(Neisseria)、假单胞菌(Pseudomonas)、沙门氏菌(Salmonella),或脲原体(Ureaplasma)纤维二糖水解酶。
在一方面,该亲本是嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、坚硬芽孢杆菌(Bacillus firmus)、灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、或苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)纤维二糖水解酶。
在另一方面,该亲本是似马链球菌(Streptococcus equisimilis)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、乳房链球菌(Streptococcus uberis)、或马链球菌兽疫亚种(Streptococcus equi subsp.Zooepidemicus)纤维二糖水解酶。
在另一方面,该亲本是不产色链霉菌(Streptomyces achromogenes)、阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)、灰色链霉菌(Streptomyces griseus)或变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)纤维二糖水解酶。
该亲本可以是一种真菌性纤维二糖水解酶。例如,该亲本可以是一种酵母纤维二糖水解酶,如假丝酵母属(Candida)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母菌属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、或耶氏酵母属(Yarrowia)纤维二糖水解酶;或一种丝状真菌纤维二糖水解酶,如枝顶孢霉属(Acremonium)、伞菌属(Agaricus)、链格孢属(Alternaria)、曲霉属(Aspergillus)、短梗霉属(Aureobasidium)、Botryospaeria、拟蜡菌属(Ceriporiopsis)、毛喙壳属(Chaetomidium)、金孢子菌属(Chrysosporium)、麦角菌属(Claviceps)、旋孢腔菌属(Cochliobolus)、鬼伞属(Coprinopsis)、乳白蚁属(Coptotermes)、棒囊壳属(Corynascus)、隐丛赤壳菌属(Cryphonectria)、隐球菌属(Cryptococcus)、色二孢属(Diplodia)、黑耳属(Exidia)、线黑粉酵母属(Filibasidium)、镰刀菌属(Fusarium)、赤霉属(Gibberella)、全鞭毛虫属(Holomastigotoides)、腐质霉属(Humicola)、耙齿菌属(Irpex)、蘑燕属(Lentinula)、小腔球菌属(Leptospaeria)、梨孢菌属(Magnaporthe)、Melanocarpus、多孔菌属(Meripilus)、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、新美鞭菌属(Neocallimastix)、脉孢菌属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉菌属(Penicillium)、平革菌属(Phanerochaete)、瘤胃壶菌属(Piromyces)、Poitrasia、假黑盘菌属(Pseudoplectania)、Pseudotrichonympha、根毛霉菌属(Rhizomucor)、裂褶菌属(Schizophyllum)、柱顶孢属(Scytalidium)、踝节菌属(Talaromyces)、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳霉属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)、木霉属(Trichoderma)、长毛盘菌属(Trichophaea)、轮枝孢属(Verticillium)、小包脚菇属(Volvariella)或炭角菌属(Xylaria)纤维二糖水解酶。
在另一方面,该亲本是卡氏酵母(Saccharomyces carlsbergensis)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)、道格拉氏酵母(Saccharomyces douglasii)、克鲁弗酵母(Saccharomyceskluyveri)、诺地酵母(Saccharomyces norbensis)、或卵形酵母(Saccharomycesoviformis)纤维二糖水解酶。
在另一方面,该亲本是解纤维枝顶孢霉(Acremonium cellulolyticus)、棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、臭曲霉(Aspergillus foetidus)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、日本曲霉(Aspergillusjaponicus)、迟缓曲霉(Aspergillus lentulus)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、土曲霉(Aspergillusterreus)、Chrysosporium inops、嗜角质金孢子菌(Chrysosporiumkeratinophilum)、Chrysosporium lucknowense、Chrysosporium merdarium、租金孢子菌(Chrysosporium pannicola)、Chrysosporium queenslandicum、热带金孢子菌(Chrysosporium tropicum)、Chrysosporium zonatum、雪白芬尼菌(Fennellia nivea)、杆孢状镰孢(Fusarium bactridioides)、谷类镰孢(Fusariumcerealis)、库威镰孢(Fusarium crookwellense)、大刀镰孢(Fusariumculmorum)、禾谷镰孢(Fusarium graminearum)、禾赤镰孢(Fusariumgraminum)、异孢镰孢(Fusarium heterosporum)、合欢木镰孢(Fusariumnegundi)、尖镰孢(Fusarium oxysporum)、多枝镰孢(Fusarium reticulatum)、粉红镰孢(Fusarium roseum)、接骨木镰孢(Fusarium sambucinum)、肤色镰孢(Fusarium sarcochroum)、拟分枝孢镰孢(Fusarium sporotrichioides)、硫色镰孢(Fusarium sulphureum)、圆镰孢(Fusarium torulosum)、拟丝孢镰孢(Fusarium trichothecioides)、镶片镰孢(Fusarium venenatum)、灰腐质霉(Humicola grisea)、特异腐质霉(Humicola insolens)、疏棉状腐质霉(Humicola lanuginosa)、白耙齿菌(Irpex lacteus)、米黑毛霉(Mucor miehei)、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)、粗糙链孢菌(Neurospora crassa)、埃默森青霉菌(Penicillium emersonii)、绳状青霉菌(Penicillium funiculosum)、嗜松青霉菌(Penicillium pinophilum)、产紫青霉菌(Penicilliumpurpurogenum)、黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、Talaromycesleycettanus、金黄色嗜热子囊菌(Thermoascus aurantiacus)、无色梭孢壳霉(Thielavia achromatica)、Thielavia albomyces、Thielavia albopilosa、澳洲梭孢壳霉(Thielavia australeinsis)、Thielavia fimeti、小孢梭孢壳霉(Thielaviamicrospora)、卵孢梭孢壳霉(Thielavia ovispora)、Thielavia peruviana、毛梭孢壳霉(Thielavia setosa)、瘤孢梭孢壳霉(Thielavia spededonium)、Thielaviasubthermophila、土生梭孢壳霉(Thielavia terrestris)、哈茨木霉(Trichodermaharzianum)、康宁木霉(Trichoderma koningii)、长枝木霉(Trichodermalongibrachiatum)、里氏木霉(Trichoderma reesei)、或绿色木霉(Trichodermaviride)纤维二糖水解酶。
将理解的是,对于以上提到的物种来说,本发明涵盖完全状态和不完全状态(perfect and imperfect states)二者、以及其他分类学等效物,例如无性型,而不管它们已知的物种名称是什么。本领域的普通技术人员将容易地识别适当等效物的身份。
这些物种的菌株可以容易地在许多培养物保藏中心为公众所获得,如美国典型培养物保藏中心(ATCC)、德国微生物菌种保藏中心(DeutscheSammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH,DSMZ)、荷兰菌种保藏中心(Centraalbureau Voor Schimmelcultures,CBS)、以及美国农业研究菌种保藏中心北方地区研究中心(NRRL)。
该亲本可以从其他来源鉴别并获得,这些其他来源包括从自然界(例如,土壤、堆肥、水等)分离的微生物或者使用上述探针直接从天然材料(例如,土壤、堆肥、水等)获得的DNA样品。用于直接从天然生境中分离微生物和DNA的技术是本领域中熟知的。然后可以通过类似地筛选另一种微生物的一个基因组DNA或cDNA文库或混合的DNA样品来获得编码一个亲本的一种多核苷酸。一旦已经用一个或多个探针检测到编码一个亲本的一种多核苷酸,就可以通过利用本领域的普通技术人员已知的技术来分离或克隆该多核苷酸(参见,例如上文的萨姆布鲁克等人,1989)。
变体的制备
本发明还涉及用于获得纤维二糖水解酶变体的方法,这些方法包括:(a)在亲本纤维二糖水解酶中与SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置112、154、197、228、261、306、以及375相对应的一个或多个(例如,数个)位置处引入取代,其中这些变体具有纤维二糖水解酶活性;并且(b)回收该变体。在一方面,该方法进一步或甚至进一步包括在亲本纤维二糖水解酶中与SEQ IDNO:2的成熟多肽的位置247、262、300、322、332、338、以及439相对应的一个或多个(例如,数个)位置处引入取代,其中该变体具有纤维二糖水解酶活性。在另一方面,该方法进一步或甚至进一步包括在亲本纤维二糖水解酶中与SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置256、287、以及344相对应的一个或多个(例如,数个)位置处引入取代,其中该变体具有纤维二糖水解酶活性。
可以使用本领域已知的任何诱变程序来制备这些变体,如定点诱变、合成基因构建、半合成基因构建、随机诱变、改组等。
定点诱变是在编码该亲本的多核苷酸中的一个或多个限定位点引入一个或多个(例如,数个)突变的技术。
可以通过涉及使用含有所希望的突变的寡核苷酸引物的PCR在体外实现定点诱变。还可以通过以下方式在体外进行定点诱变:涉及由一种限制性内切酶在包含编码该亲本的多核苷酸的质粒的一个位点处进行裂解的盒式诱变,并且随后连接一种包含该多核苷酸中的突变的寡核苷酸。通常,消化该质粒与该寡核苷酸的限制性内切酶是相同的,从而允许该质粒的粘性末端与插入片段彼此连接。参见,例如,谢勒(Scherer)和戴维斯(Davis),1979,美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)76:4949-4955;以及巴顿(Barton)等人,1990,核酸研究18:7349-4966。
还可以通过本领域已知的方法在体内实现定点诱变。参见,例如,美国专利申请公开号2004/0171154;斯道瑞希(Storici)等人,2001,自然生物技术(Nature Biotechnol.)19:773-776;卡伦(Kren)等人,1998,自然医学(Nat.Med.)4:285-290;以及凯利萨诺(Calissano)和马奇诺(Macino),1996,真菌遗传学简讯(Fungal Genet.Newslett.)43:15-16。
位点饱和诱变在一个或多个(例如,数个)特定位置处将多肽编码序列系统性地替代为编码全部19个氨基酸的序列(帕里克(Parikh)和松村(Matsumura),2005,分子生物学杂志352:621-628)。
可以在本发明中使用任何定点诱变程序。存在可以用于制备变体的许多可商购的试剂盒。
合成基因构建需要体外合成一种设计的多核苷酸分子以编码一种所感兴趣的多肽。基因合成可以利用多种技术来进行,如由田(Tian)等人(2004,自然432:1050-1054)所描述的基于多路微芯片的技术、以及其中在光可编程的微流芯片上合成并组装寡核苷酸的类似技术。
单个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入可以使用已知的诱变、重组和/或改组方法、随后进行一种相关筛选程序来制造和测试,该相关筛选程序如由里德哈尔-奥尔森(Reidhaar-Olson)和萨奥尔(Sauer),1988,科学241:53-57;博维(Bowie)和萨奥尔,1989,美国国家科学院院刊86:2152-2156;WO95/17413;或WO95/22625披露的那些。其他可以使用的方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如洛曼(Lowman)等人,1991,生物化学30:10832-10837;美国专利号5,223,409、WO92/06204)以及区域定向诱变(德比什尔(Derbyshire)等人,1986,基因46:145;内尔(Ner)等人,1988,DNA7:127)。
诱变/改组方法可以与高通量、自动筛选方法组合以检测由宿主细胞表达的克隆的诱变的多肽的活性(内丝(Ness)等人,1999,自然生物技术17:893-896)。编码活性多肽的诱变的DNA分子可以从宿主细胞回收,并且使用本领域的标准方法对其进行迅速测序。这些方法允许快速确定多肽中单独氨基酸残基的重要性。
半合成基因构建是通过组合合成基因构建、和/或定点诱变、和/或随机诱变、和/或改组的多个方面来实现的。半合成构建典型地是,利用合成的多核苷酸片段的一个过程结合PCR技术。基因的限定区域因而可以从头合成,而其他区域可以使用位点特异性诱变引物扩增,而还有其他区域可以进行易错PCR或非易错PCR、扩增。然后可以对多核苷酸子序列进行改组。
多核苷酸
本发明还涉及编码本发明的纤维二糖水解酶变体的分离的多核苷酸。
核酸构建体
本发明还涉及包含编码本发明的纤维二糖水解酶变体的、可操作地连接至一个或多个控制序列上的一种多核苷酸的核酸构建体,该一个或多个控制序列在与控制序列相容的条件下指导编码序列在一种适合的宿主细胞中的表达。
可以按多种方式来操纵该多核苷酸以提供一种纤维二糖水解酶变体的表达。取决于表达载体,在将多核苷酸插入载体中之前对其进行操纵可能是希望的或必需的。用于利用重组DNA方法修饰多核苷酸的技术是本领域熟知的。
该控制序列可以是一个启动子,即,被宿主细胞识别以对编码本发明的变体的多核苷酸进行表达的一种多核苷酸。启动子包含介导纤维二糖水解酶变体的表达的转录控制序列。该启动子可以是在宿主细胞中显示转录活性的任何多核苷酸,包括突变型启动子、截短型启动子、以及杂合型启动子,并且可以从编码与宿主细胞同源或异源的细胞外或细胞内多肽的基因获得。
用于指导本发明的核酸构建体在细菌宿主细胞中的转录的合适启动子的实例是从以下各项获得的启动子:解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、嗜热脂肪芽孢杆菌产麦芽淀粉酶基因(amyM)、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因、苏云金芽孢杆菌crylllA基因(埃盖斯(Agaisse)和勒尔克吕(Lereclus),1994,分子微生物学(MolecularMicrobiology)13:97-107)、大肠杆菌lac操纵子、大肠杆菌trc启动子(埃贡(Egon)等人,1988,基因(Gene)69:301-315)、天蓝色链霉菌琼脂糖酶基因(dagA)、以及原核β-内酰胺酶基因(维拉-科马罗夫(Villa-Kamaroff)等人,1978,美国国家科学院院刊75:3727-3731)、以及tac启动子(德波尔(DeBoer)等人,1983,美国国家科学院院刊80:21-25)。另外的启动子描述于吉尔伯特(Gilbert)等人,1980,科学美国人(Scientific American)242:74-94中的“来自重组细菌的有用蛋白质”(“Useful proteins fromrecombinant bacteria”)、以及萨姆布鲁克等人,1989,见上文。串联启动子的实例披露于WO99/43835中。
用于指导本发明的核酸构建体在丝状真菌宿主细胞中的转录的合适启动子的实例是从以下各项的基因获得的启动子:构巢曲霉乙酰胺酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、米曲霉TAKA淀粉酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶(WO96/00787)、镶片镰孢淀粉葡糖苷酶(WO00/56900)、镶片镰孢Daria(WO00/56900)、镶片镰孢Quinn(WO00/56900)、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)脂肪酶、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉木聚糖酶III、里氏木霉β-木糖苷酶、以及里氏木霉翻译延长因子,以及NA2-tpi启动子(一种修饰的启动子,其来自曲霉属中性α-淀粉酶基因,其中未翻译的前导序列由曲霉属丙糖磷酸异构酶基因的未翻译的前导序列替代;非限制性实例包括修饰的启动子,其来自黑曲霉中性α-淀粉酶的基因,其中未翻译的前导序列由构巢曲霉或米曲霉丙糖磷酸异构酶基因的未翻译的前导序列替代);以及其突变型启动子、截短型启动子、以及杂合型启动子。其他启动子描述于美国专利号6,011,147中。
在酵母宿主中,有用的启动子是从以下各项的基因获得:酿酒酵母烯醇酶(ENO-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH1、ADH2/GAP)、酿酒酵母丙糖磷酸异构酶(TPI)、酿酒酵母金属硫蛋白(CUP1)、以及酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。用于酵母宿主细胞的其他有用的启动子由罗马诺斯(Romanos)等人,1992,酵母(Yeast)8:423-488描述。
控制序列还可以是被宿主细胞识别以终止转录的转录终止子。该终止子可操作地连接至编码纤维二糖水解酶变体的多核苷酸的3’-末端。可以使用在宿主细胞中具有功能的任何终止子。
用于细菌宿主细胞的优选终止子是从克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprH)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(amyL)、以及大肠杆菌核糖体RNA(rrnB)的基因获得。
用于丝状真菌宿主细胞的优选终止子是从以下各项的基因获得:构巢曲霉乙酰胺酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉木聚糖酶III、里氏木霉β-木糖苷酶、以及里氏木霉翻译延长因子。
用于酵母宿主细胞的优选终止子是从酿酒酵母烯醇化酶、酿酒酵母细胞色素C(CYC1)、以及酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶的基因获得。用于酵母宿主细胞的其他有用的终止子由罗马诺斯等人,1992,见上文所描述。
控制序列还可以是启动子下游和基因的编码序列上游的mRNA稳定子区,它增加该基因的表达。
适合的mRNA稳定子区的实例是从以下获得:苏云金芽孢杆菌cryIIIA基因(WO94/25612)和枯草芽孢杆菌SP82基因(化(Hue)等人,1995,细菌学杂志(Journal of Bacteriology)177:3465-3471)。
控制序列还可以是前导序列,即对于宿主细胞的翻译来说重要的mRNA非翻译区。该前导序列可操作地连接至编码该纤维二糖水解酶变体的多核苷酸的5’-末端。可以使用在宿主细胞中具有功能的任何前导序列。
用于丝状真菌宿主细胞的优选前导序列是从米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶的基因获得。
用于酵母宿主细胞的适合前导序列从酿酒酵母烯醇化酶(ENO-1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α因子、以及酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)的基因获得。
该控制序列还可以是一种聚腺苷酸化序列,即可操作地连接至该纤维二糖水解酶变体编码序列的3’-末端并且在转录时由宿主细胞识别成将多腺苷酸残基添加到所转录的mRNA上的一个信号的一种序列。可以使用在宿主细胞中具有功能的任何聚腺苷酸化序列。
用于丝状真菌宿主细胞的优选聚腺苷酸化序列是从以下各项的基因获得:构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶、以及尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶。
用于酵母宿主细胞的有用的聚腺苷酸化序列是由郭(Guo)和夏尔曼(Sherman),1995,分子细胞生物学(Mol.Cellular Biol.)15:5983-5990所描述。
控制序列还可以是编码连接至一个纤维二糖水解酶变体的N-末端上的一个信号肽并且指导该变体进入细胞的分泌途径的一个信号肽编码区域。多核苷酸的编码序列的5’-端可以固有地包含在翻译阅读框内与编码该变体的编码序列的区段天然地连接的一个信号肽编码序列。可替代地,编码序列的5’-末端可以包含对该编码序列是外源的信号肽编码序列。在编码序列并不天然地包含信号肽编码序列时,可能需要外源信号肽编码序列。可替代地,外源信号肽编码序列可以简单地替代天然信号肽编码序列,以便增强变体的分泌。然而,可以使用指导所表达的变体进入宿主细胞的分泌途径中的任何信号肽编码序列。
用于细菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是从以下各项的基因获得的信号肽编码序列:芽孢杆菌属NCIB11837麦芽糖淀粉酶、地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶、地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶、嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT、nprS、nprM)、以及枯草芽孢杆菌prsA。另外的信号肽是由西蒙(Simonen)和帕夫拉(Palva),1993,微生物学综述(Microbiological Reviews)57:109-137所描述。
用于丝状真菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是从以下各项的基因获得的信号肽编码序列:黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉TAKA淀粉酶、特异腐质霉纤维素酶、特异腐质霉内切葡聚糖酶V、疏棉状腐质霉脂肪酶、以及米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶。
用于酵母宿主细胞的有用信号肽是从酿酒酵母α因子和酿酒酵母转化酶的基因获得。其他有用的信号肽编码序列由罗马诺斯等人,1992,见上文所描述。
控制序列还可以是编码位于一个纤维二糖水解酶变体的N-末端的前肽的一种前肽编码序列。所得多肽被称为酶原(proenzyme)或多肽原(或在一些情况下称为酶原(zymogen))。多肽原通常是无活性的,并且可以通过前肽的催化或自催化裂解从多肽原转化成一种活性多肽。前肽编码序列可以从以下各项的基因获得:枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、嗜热毁丝霉漆酶(WO95/33836)、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、以及酿酒酵母α因子。
在信号肽和前肽序列二者均存在的情况下,该前肽序列定位成紧邻纤维二糖水解酶变体的N末端,并且该信号肽序列定位成紧邻该前肽序列的N末端。
还会令人希望的是添加相对于宿主细胞的生长来调控该纤维二糖水解酶变体的表达的调控序列。调控序列的实例是使得基因的表达响应于化学或物理刺激(包括调控化合物的存在)而开启或关闭的那些序列。原核系统中的调控系统包括lac、tac、以及trp操纵子系统。在酵母中,可以使用ADH2系统或GAL1系统。在丝状真菌中,可以使用黑曲霉葡糖淀粉酶启动子、米曲霉TAKAα-淀粉酶启动子和米曲霉葡糖淀粉酶启动子、里氏木霉纤维二糖水解酶I启动子、以及里氏木霉纤维二糖水解酶II启动子。调控序列的其他实例是允许基因扩增的那些序列。在真核系统中,这些调控序列包括在甲氨蝶呤的存在下扩增的二氢叶酸还原酶基因、以及在重金属下扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况下,编码该变体的多核苷酸将可操作地连接至该调控序列。
表达载体
本发明还涉及包含编码本发明的纤维二糖水解酶变体的多核苷酸、启动子、以及转录和翻译终止信号的重组表达载体。不同的核苷酸和控制序列可以接合在一起以产生一个重组表达载体,该重组表达载体可以包含一个或多个便利的限制性位点以允许在这类位点处插入或取代编码该变体的多核苷酸。可替代地,该多核苷酸可以通过将该多核苷酸或包含该多核苷酸的核酸构建体插入用于表达的适当载体中来表达。在产生表达载体时,编码序列是位于该载体中,这样使得该编码序列与用于表达的适当控制序列可操作地连接。
该重组表达载体可以是能便利地经受重组DNA程序并且可以引起该多核苷酸的表达的任何载体(例如质粒或病毒)。载体的选择将典型地取决于该载体与有待引入该载体的宿主细胞的相容性。载体可以是一种线性的或闭合的环状质粒。
载体可以是自主复制型载体,即作为染色体外实体而存在、其复制独立于染色体复制的载体,例如,质粒、染色体外元件、微型染色体或人工染色体。该载体可以包含用于确保自我复制的任何装置。可替代地,该载体可以是当被引入宿主细胞中时整合到基因组中并且与它已经整合至其中的一个或多个染色体一起复制的载体。此外,可以使用单一载体或质粒、或两个或更多个载体或质粒(这些载体或质粒共同包含了待引入到宿主细胞的基因组中的总DNA)、或转座子。
载体优选包含允许容易选择转化细胞、转染细胞、转导细胞或类似细胞的一种或多种选择性标记。选择性标记是一种基因,该基因的产物提供了杀生物剂或病毒抗性、重金属抗性、营养缺陷型的原养型等。
细菌选择性标记的实例是地衣芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌dal基因、或赋予抗生素抗性(如氨苄青霉素、氯霉素、卡那霉素、新霉素、壮观霉素、或四环素抗性)的标记物。用于酵母宿主细胞的适合的标记包括但不限于:ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1、以及URA3。用于在丝状真菌宿主细胞中使用的选择性标记包括但不限于:adeA(磷酸核糖氨基咪唑-琥珀甲酰胺合酶)、adeB(磷酸核糖-氨基咪唑合酶)、amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(草丁膦乙酰转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)、pyrG(乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶)、sC(硫酸腺苷基转移酶)、以及trpC(邻氨基苯甲酸合酶)、以及其等效物。优选在曲霉属细胞中使用的是构巢曲霉或米曲霉amdS和pyrG基因以及吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)bar基因。优选在木霉属细胞中使用的是adeA、adeB、amdS、hph、以及pyrG基因。
选择性标记可以是如WO2010/039889中所描述的双选择性标记系统。在一方面,双选择性标记是hph-tk双选择性标记系统。
载体优选包含允许载体整合到宿主细胞的基因组或允许载体在细胞中独立于基因组而自主复制的一个或多个元件。
对于整合到宿主细胞基因组中,载体可以依靠编码纤维二糖水解酶变体的多核苷酸序列或用于通过同源或非同源重组整合到基因组中的该载体的任何其他元件。可替代地,该载体可以包含用于指导通过同源重组整合到宿主细胞基因组中一个或多个染色体中的一个或多个精确位置处的另外的多核苷酸。为了增加在精确位置处整合的可能性,这些整合的元件应包含足够数量的核酸,如100至10,000个碱基对、400至10,000个碱基对、以及800至10,000个碱基对,这些碱基对与相应的靶序列具有高度的序列一致性以增强同源重组的可能性。这些整合元件可以是与宿主细胞的基因组中的靶序列同源的任何序列。此外,这些整合元件可以是非编码多核苷酸或编码多核苷酸。另一方面,载体可以通过非同源重组整合到宿主细胞的基因组中。
对于自主复制,载体可以进一步包含使该载体能够在所讨论的宿主细胞中自主复制的复制起点。复制起点可以是在细胞中起作用的介导自主复制的任何质粒复制基因。术语“复制起点”或“质粒复制基因”意指使质粒或载体能够在体内复制的多核苷酸。
细菌复制起点的实例是允许在大肠杆菌中复制的质粒pBR322、pUC19、pACYC177、以及pACYC184的复制起点,以及允许在芽孢杆菌中复制的质粒pUB110、pE194、pTA1060、以及pAMβ1的复制起点。
用于在酵母宿主细胞中使用的复制起点的实例是2微米复制起点ARS1、ARS4、ARS1与CEN3的组合、以及ARS4与CEN6的组合。
适用于丝状真菌细胞的复制起点的实例是AMA1和ANS1(格姆斯(Gems)等人,1991,基因98:61-67;卡伦(Cullen)等人,1987,核酸研究15:9163-9175;WO00/24883)。AMA1基因的分离以及包含该基因的质粒或载体的构建可以根据在WO00/24883中所披露的方法达成。
可以将本发明的多核苷酸的多于一个的拷贝插入到宿主细胞中以增加纤维二糖水解酶变体的产生。多核苷酸拷贝数的增加可通过如下方式获得:将至少一个额外拷贝的序列整合到宿主细胞基因组,或包括可与多核苷酸一起扩增的选择性标记基因,其中可以通过在适当的选择性试剂(selectableagent)存在下培养细胞来选择含有选择性标记基因的扩增拷贝的细胞,并且由此来选择含有多核苷酸的额外拷贝的细胞。
用于连接以上所描述的元件以构建本发明的重组表达载体的程序是本领域的普通技术人员熟知的(参见,例如,萨姆布鲁克等人,1989,同上文)。
宿主细胞
本发明还涉及重组宿主细胞,这些重组宿主细胞包含编码本发明的纤维二糖水解酶变体的、可操作地连接至一个或多个控制序列的一种多核苷酸,该一个或多个控制序列指导本发明的变体的产生。将包含多核苷酸的构建体或载体引入宿主细胞,这样使得该构建体或载体被维持作为染色体整合体或自我复制的染色体外载体,如早先所述。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间发生的突变而与亲本细胞不同的该亲本细胞的任何子代。宿主细胞的选择将在很大程度上将取决于编码变体的基因及其来源。
宿主细胞可以是在纤维二糖水解酶变体的重组产生中有用的任何细胞,例如原核细胞或真核细胞。
原核宿主细胞可以是任何革兰氏阳性细菌或革兰氏阴性细菌。革兰氏阳性细菌包括但不限于:芽孢杆菌、梭状芽孢杆菌、肠球菌、土芽孢杆菌、乳酸杆菌、乳球菌、大洋芽孢杆菌、葡萄球菌、链球菌、以及链霉菌。格兰氏阴性细菌包括但不限于,弯曲杆菌、大肠杆菌、黄杆菌、梭杆菌、螺杆菌、泥杆菌、奈瑟氏菌、假单胞菌、沙门氏菌、以及脲原体。
细菌宿主细胞可以是任何芽孢杆菌细胞,包括但不限于:嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚硬芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、以及苏云金芽孢杆菌细胞。
细菌宿主细胞还可以是任何链球菌细胞,包括但不限于:似马链球菌、酿脓链球菌、乳房链球菌、以及马链球菌兽疫亚种细胞。
细菌宿主细胞还可以是任何链霉菌细胞,包括但不限于:不产色链霉菌、阿维链霉菌、天蓝色链霉菌、灰色链霉菌、以及变铅青链霉菌细胞。
可以通过如下方式实现将DNA引入芽孢杆菌细胞中:原生质体转化(参见,例如,常(Chang)和科恩(Cohen),1979,分子和普通遗传学(Mol.Gen.Genet.)168:111-115)、感受态细胞转化(参见,例如,扬(Young)和斯皮宰曾(Spizizen),1961,细菌学杂志(J.Bacteriol.)81:823-829、或Dubnau和达维多夫-阿贝尔森(Davidoff-Abelson),1971,分子生物学杂志56:209-221)、电穿孔(参见,例如,茂川(Shigekawa)和道尔(Dower),1988,生物技术(Biotechniques)6:742-751)、或接合(参见,例如,克勒(Koehler)和索恩(Thorne),1987,细菌学杂志169:5271-5278)。可以通过如下方式实现将DNA引入大肠杆菌细胞中:原生质体转化(参见,例如,哈纳汉(Hanahan),1983,分子生物学杂志166:557-580)、或电穿孔(参见,例如,道尔等人,1988,核酸研究16:6127-6145)。可以通过如下方式实现将DNA引入到链霉菌细胞中:原生质体转化、电穿孔(参见,例如贡(Gong)等人,2004,微生物学报(Folia Microbiol.(布拉格(Praha))49:399-405)、接合(参见,例如,马佐迪耶(Mazodier)等人,1989,细菌学杂志171:3583-3585)、或转导(参见,例如,布尔克(Burke)等人,2001,美国科学院院刊98:6289-6294)。可以通过如下方式实现将DNA引入到假单胞菌细胞中:电穿孔(参见,例如,蔡(Choi)等人,2006,微生物学方法杂志(J.Microbiol.Methods)64:391-397)、或接合(参见,例如,皮内多(Pinedo)和斯梅茨(Smets),2005,应用与环境微生物学(Appl.Environ.Microbiol.)71:51-57)。可以通过如下方式实现将DNA引入链球菌细胞中:天然感受态(参见,例如,佩里(Perry)和藏满(Kuramitsu),1981,传染与免疫(Infect.Immun.)32:1295-1297)、原生质体转化(参见,例如,卡特(Catt)和约里克(Jollick),1991,微生物(Microbios)68:189-207)、电穿孔(参见,例如,布克莱(Buckley)等人,1999,应用与环境微生物学65:3800-3804)、或接合(参见,例如,克莱怀尔(Clewell),1981,微生物学综述(Microbiol.Rev.)45:409-436)。然而,可以使用本领域已知的用于将DNA引入宿主细胞中的任何方法。
宿主细胞还可以是真核细胞,如哺乳动物、昆虫、植物、或真菌细胞。
宿主细胞可以是真菌细胞。如在此所用的“真菌”包括子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)、以及接合菌门(Zygomycota)、连同卵菌门(Oomycota)和全部有丝分裂孢子真菌(如由霍克斯沃思(Hawksworth)等人在安斯沃思和拜斯比真菌词典(Ainsworth and Bisby’s Dictionary of The Fungi),第8版,1995,国际应用生物科学中心(CAB International),大学出版社(University Press),英国剑桥(Cambridge,UK)中进行定义的)。
该真菌宿主细胞可以是酵母细胞。如在此使用的“酵母”包括产子囊酵母(ascosporogenous yeast)(内孢霉目(Endomycetale))、产担子酵母(basidiosporogenous yeast)、以及属于半知菌类(Fungi Imperfecti)(芽生菌(Blastomycete))的酵母。由于酵母的分类在未来可能改变,因此出于本发明的目的,酵母应如酵母的生物学和活性(Biology and Activities of Yeast)(斯金纳(Skinner)、帕斯莫尔(Passmore)、以及达文波特(Davenport)编辑,应用细菌学学会讨论会系列号9(ACS Symposium),1980)中所描述来定义。
酵母宿主细胞可以是假丝酵母(Candida)、汉逊酵母(Hansenula)、克鲁维酵母(Kluyveromyces)、毕赤酵母(Pichia)、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母(Schizosaccharomyces)、或耶氏酵母(Yarrowia)细胞,如乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、卡氏酵母(Saccharomyces carlsbergensis)、酿酒酵母、糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)、道格拉氏酵母(Saccharomyces douglasii)、克鲁维氏酵母(Saccharomyces kluyveri)、诺地酵母(Saccharomyces norbensis)、卵形酵母(Saccharomyces oviformis)、或解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)细胞。
该真菌宿主细胞可以是一种丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括真菌门(Eumycota)和卵菌门的亚门(如由霍克斯沃思等人,1995,见上文所定义)的所有丝状形式。丝状真菌的特征一般在于由壳多糖、纤维素、葡聚糖、壳聚糖、甘露聚糖、以及其他复合多糖组成的菌丝体壁。营养生长是通过菌丝延长,并且碳分解代谢是专性需氧的。相反,酵母(如酿酒酵母)的营养生长是通过单细胞菌体的出芽,并且碳分解代谢可以是发酵的。
丝状真菌宿主细胞可以是枝顶孢属(Acremonium)、曲霉菌属、短梗霉属(Aureobasidium)、烟管菌属(Bjerkandera)、拟蜡菌属(Ceriporiopsis)、金孢子菌属(Chrysosporium)、鬼伞属(Coprinus)、革盖菌属(Coriolus)、隐球菌属(Cryptococcus)、网孢菌属(Filibasidium)、镰孢菌属(Fusarium)、腐质霉属(Humicola)、稻瘟病菌属(Magnaporthe)、毛霉菌(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、新美鞭菌属(Neocallimastix)、脉孢菌属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉菌属(Penicillium)、平革菌属(Phanerochaete)、白腐菌属(Phlebia)、梨囊鞭菌属(Piromyces)、侧耳属(Pleurotus)、裂褶菌属(Schizophyllum)、踝节菌属(Talaromyces)、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳霉属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)、栓菌属(Trametes)、或木霉属(Trichoderma)细胞。
例如,丝状真菌宿主细胞可以是泡盛曲霉、臭曲霉、烟曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、黑刺烟管菌(Bjerkandera adusta)、干拟赌菌(Ceriporiopsis aneirina)、Ceriporiopsis caregiea、浅黄拟蜡孔菌(Ceriporiopsisgilvescens)、Ceriporiopsis pannocinta、Ceriporiopsis rivulosa、Ceriporiopsissubrufa、虫拟蜡菌(Ceriporiopsis subvermispora)、Chrysosporium inops、嗜角质金孢子菌、Chrysosporium lucknowense、Chrysosporium merdarium、租金孢子菌、Chrysosporium queenslandicum、热带金孢子菌、Chrysosporiumzonatum、灰盖鬼伞(Coprinus cinereus)、毛革盖菌(Coriolus hirsutus)、杆孢状镰孢、谷类镰孢、库威镰孢、大刀镰孢、禾谷镰孢、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖镰孢、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟分枝孢镰孢、硫色镰孢、圆镰孢、拟丝孢镰孢、镶片镰孢、特异腐质霉、疏棉状腐质霉、米黑毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙链孢菌、产紫青霉菌、黄孢平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、射脉菌(Phlebia radiata)、刺芹侧耳(Pleurotus eryngii)、土生梭孢壳霉、长域毛栓菌(Trametes villosa)、变色栓菌(Trametes versicolor)、哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉、或绿色木霉细胞。
真菌细胞可以通过涉及原生质体形成、原生质体转化、以及细胞壁再生的方法以本身已知的方式来转化。用于转化曲霉属和木霉属宿主细胞的适合程序在EP238023和约尔顿(Yelton)等人,1984,美国国家科学院院刊81:1470-1474、以及克里斯滕森(Christensen)等人,1988,生物/技术(Bio/Technology)6:1419-1422中描述。用于转化镰孢菌属种的适合方法由马拉迪尔(Malardier)等人,1989,基因78:147-156、以及WO96/00787描述。酵母可以使用以下各文献中所描述的程序转化:贝克尔(Becker)和古伦特(Guarente),艾本尔森J.N.(Abelson,J.N.)和塞蒙M.I.(Simon,M.I.)编辑,酵母遗传学与分子生物学指南(Guide to Yeast Genetics and MolecularBiology),酶学方法(Methods in Enzymology),第194卷,第182-187页,纽约学术出版社有限公司;埃托(Ito)等人,1983,细菌学杂志(J.Bacteriol.)153:163;以及辛伦(Hinnen)等人,1978,美国国家科学院院刊75:1920。
产生方法
本发明还涉及产生纤维二糖水解酶变体的方法,这些方法包括:(a)在适合于该变体的表达的条件下培养本发明的一种宿主细胞;并且任选地(b)回收该变体。
使用本领域已知的方法在适合于产生该纤维二糖水解酶变体的一种营养培养基中培养这些宿主细胞。例如,可以通过在一种合适培养基中并且在允许该变体表达和/或分离的条件下进行摇瓶培养,或在实验室或工业发酵罐中进行小规模或大规模发酵(包括连续发酵、分批发酵、进料分批发酵、或固态发酵)来培养细胞。培养是使用本领域中已知的程序,在包含碳源和氮源以及无机盐的一种适合的营养培养基中进行的。适合的培养基可从商业供应商获得或可以根据公开的组成(例如,在美国典型培养物保藏中心的目录中)来制备。如果变体被分泌到该营养培养基中,那么该变体可直接从该培养基中回收。如果变体没有分泌,那么其可以从细胞裂解物中回收。
可以使用本领域已知的对纤维二糖水解酶变体特异的多种方法来检测该变体。这些检测方法包括但不限于:特异性抗体的使用、酶产物的形成、或酶底物的消失。例如,酶测定可以用于确定该变体的活性。参见,例如,在实例5中所描述的测定。
可以使用本领域已知的方法来回收该纤维二糖水解酶变体。例如,可以通过多种常规程序从该营养培养基中回收该变体,这些常规程序包括但不限于,收集、离心、过滤、萃取、喷雾干燥、蒸发、或沉淀。在一方面,回收了包含本发明的变体的全发酵液。
可以通过本领域中已知的多种程序来纯化纤维二糖水解酶变体以获得基本上纯的变体,这些程序包括但不限于:色谱法(例如,离子交换色谱、亲和色谱、疏水作用色谱、色谱聚焦、以及尺寸排阻色谱)、电泳程序(例如,制备型等电点聚焦)、差别溶解度(例如,硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE、或萃取(参见,例如,蛋白质纯化(Protein Purification),詹森(Janson)和赖登(Ryden)编辑,VCH出版社(VCH Publishers),纽约,1989)。
在一个替代方面,没有回收纤维二糖水解酶变体,而是将表达该变体的本发明的一种宿主细胞用作该变体的一个来源。
发酵液配制品或细胞组合物
本发明还涉及包含本发明的变体的一种发酵液配制品或一种细胞组合物。发酵液产物进一步包含在发酵过程中使用的另外的成分,例如像,细胞(包括含有编码本发明的多肽的基因的宿主细胞,这些宿主细胞被用于产生感兴趣的多肽)、细胞碎片、生物质、发酵介质和/或发酵产物。在一些实施例中,该组合物是含有一种或多种有机酸、杀死的细胞和/或细胞碎片、以及培养基的细胞杀死全液。
如在此使用的术语“发酵液”是指由细胞发酵产生、不经历或经历最低限的回收和/或纯化的制剂。举例来说,当微生物培养物生长至饱和,在碳限制条件下孵育以允许蛋白质合成(例如,由宿主细胞表达酶)并且分泌到细胞培养基中时,发酵液产生。该发酵液可以包含在发酵终止时得到的发酵物质的未分级或分级的内容物。典型地,发酵液是未分级的并且包含用过的培养基以及例如通过离心去除微生物细胞(例如,丝状真菌细胞)之后存在的细胞碎片。在一些实施例中,发酵液包含用过的细胞培养基、胞外酶、以及有活力和/或无活力的微生物细胞。
在一个实施例中,发酵液配制品和细胞组合物包含一种第一有机酸组分和一种第二有机酸组分,该第一有机酸组分包含至少一种1至5个碳的有机酸和/或其盐,并且该第二有机酸组分包含至少一种6个或更多个碳的有机酸和/或其盐。在一个具体实施例中,该第一有机酸组分是乙酸、甲酸、丙酸、其盐,或前述酸中的两种或更多种的混合物;并且该第二有机酸组分是苯甲酸、环己烷羧酸、4-甲基戊酸、苯乙酸、其盐,或前述酸中的两种或更多种的混合物。
在一方面,该组合物包含一种或多种有机酸,并且任选地进一步包含杀死的细胞和/或细胞碎片。一个实施例中,从细胞杀死的全液中去除这些杀死的细胞和/或细胞碎片,以提供不含这些组分的组合物。
这些发酵液配制品或细胞组合物可以进一步包含一种防腐剂和/或抗微生物(例如抑菌)剂,包括但不限于山梨糖醇、氯化钠、山梨酸钾、以及本领域中已知的其他试剂。
这些发酵液配制品或细胞组合物可以进一步包含多种酶活性,如选自下组的一种或多种(例如,数种)酶,该组由以下各项组成:纤维素酶、半纤维素酶、具有纤维素分解增强活性的GH61多肽、酯酶、苹果菌素、漆酶、木质素分解酶、果胶酶、过氧化物酶、蛋白酶、以及膨胀蛋白(swollenin)。这些发酵液配制品或细胞组合物还可以包含选自由下组的一种或多种(例如,数种)酶,该组由以下各项组成:水解酶、异构酶、连接酶、裂解酶、氧化还原酶、或转移酶,例如,α-半乳糖苷酶、α-葡糖苷酶、氨肽酶、淀粉酶、β-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶、β-木糖苷酶、碳水化物酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、壳多糖酶、角质酶、环糊精葡萄糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、内切葡聚糖酶、酯酶、葡糖淀粉酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、变位酶、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白分解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、或木聚糖酶。
该细胞杀死的全液或组合物可以包含在发酵终止时得到的发酵物质的未分级的内容物。典型地,该细胞杀死的全液或组合物包含用过的培养基以及在微生物细胞(例如,丝状真菌细胞)生长至饱和、在碳限制条件下孵育以允许蛋白质合成(例如,纤维素酶和/或一种或多种葡糖苷酶的表达)之后存在的细胞碎片。在一些实施例中,该细胞杀死的全液或组合物包含用过的细胞培养基、胞外酶、以及杀死的丝状真菌细胞。在一些实施例中,在细胞杀死的全液或组合物中存在的微生物细胞可以使用本领域中已知的方法进行渗透和/或裂解。
如在此所描述的全液或细胞组合物典型地是一种液体,但是可以包含不溶性组分,如杀死的细胞、细胞碎片、培养基组分、和/或一种或多种不溶性酶。在一些实施例中,可以去除不溶性组分以提供澄清的液体组合物。
本发明的全液配制品和细胞组合物可以通过WO90/15861或WO2010/096673中所描述的方法来产生。
以下给出了本发明的组合物的优选用途的实例。可以基于本领域已知的方法来确定组合物的剂量和使用该组合物的其他条件。
酶组合物
本发明还涉及包含本发明的一种变体的组合物。优选地,这些组合物富含这种变体。术语“富含”指示该组合物的纤维二糖水解酶活性已经增加,例如,富集因子为至少1.1。
这些组合物可以包含本发明的一种变体作为主要酶组分,例如一种单组分组合物。可替代地,这些组合物可以包含多种酶活性,如选自下组的一种或多种(例如,数种)酶,该组由以下各项组成:纤维素酶、半纤维素酶、具有纤维素分解增强活性的GH61多肽、酯酶、苹果菌素、漆酶、木质素分解酶、果胶酶、过氧化物酶、蛋白酶、以及膨胀蛋白。这些组合物还可以包含选自下组的一种或多种(例如,数种)酶,该组由以下各项组成:水解酶、异构酶、连接酶、裂解酶、氧化还原酶、或转移酶,例如,α-半乳糖苷酶、α-葡糖苷酶、氨肽酶、淀粉酶、β-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶、β-木糖苷酶、碳水化物酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、壳多糖酶、角质酶、环糊精葡萄糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、内切葡聚糖酶、酯酶、葡糖淀粉酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、变位酶、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白分解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、或木聚糖酶。这些组合物可以根据本领域中已知的方法来制备,并且可以呈液体或干燥组合物的形式。这些组合物可以根据本领域中已知的方法进行稳定化。
以下给出了本发明的组合物的优选用途的实例。可以基于本领域已知的方法来确定组合物的剂量和使用该组合物的其他条件。
用途
本发明还涉及用于使用纤维二糖分解酶变体、或其组合物的以下方法。
本发明还涉及用于降解或转化纤维素材料的方法,该方法包括:在本发明的纤维二糖水解酶变体的存在下,用一种酶组合物处理该纤维素材料。在一方面,这些方法进一步包括回收所降解的或转化的纤维素材料。该纤维素材料的降解或转化的可溶性产物可以使用本领域中已知的方法(例如像离心、过滤、和/或重力沉降)与不溶性纤维素材料分离。
本发明还涉及产生一种发酵产物的方法,这些方法包括:(a)在本发明的纤维二糖水解酶变体的存在下,用一种酶组合物使纤维素材料糖化;(b)用一种或多种(例如,数种)发酵微生物发酵糖化的纤维素材料,以产生该发酵产物;并且(c)从发酵中回收该发酵产物。
本发明还涉及发酵一种纤维素材料的方法,这些方法包括:用一种或多种(例如,数种)发酵微生物发酵该纤维素材料,其中在本发明的纤维二糖水解酶变体的存在下用一种酶组合物使该纤维素材料糖化。在一方面,发酵该纤维素材料产生一种发酵产物。在另一方面,这些方法进一步包括从发酵中回收该发酵产物。
本发明的方法可以用于将该纤维素材料糖化成可发酵糖,并且将这些可发酵糖转化成许多有用的发酵产物,例如燃料、饮用乙醇、和/或平台化学品(例如酸类、醇类、酮类、气体等)。由该纤维素材料产生所希望的发酵产物典型地涉及预处理、酶水解(糖化)、以及发酵。
根据本发明的纤维素材料的加工可以使用本领域常规的方法来完成。此外,本发明的方法可以使用被配置成根据本发明来操作的任何常规生物质加工设备来实施。
分开或同时的水解(糖化)和发酵包括但不限于:分开水解和发酵(SHF)、同时糖化和发酵(SSF)、同时糖化和共发酵(SSCF)、杂合的水解和发酵(HHF)、分开水解和共发酵(SHCF)、杂合的水解和共发酵(HHCF),以及直接微生物转化(DMC),有时还被称为合并的生物加工(CBP)。SHF使用单独的处理步骤以首先将纤维素材料酶水解为可发酵糖,例如,葡萄糖、纤维二糖、以及戊糖单体,并且然后将这些可发酵糖发酵成乙醇。在SSF中,纤维素材料的酶水解和糖发酵成乙醇被组合在一个步骤中(菲利皮迪斯·G.P.(Philippidis,G.P.),1996,纤维素生物转化技术(Cellulose bioconversiontechnology),生物乙醇手册:生产和利用(Handbook on Bioethanol:Productionand Utilization),怀曼·C.E(Wyman,C.E.)编辑,泰勒-弗朗西斯出版集团(Taylor&Francis),华盛顿特区(Washington,DC),179-212))。SSCF涉及多种糖的共发酵(希恩·J.(Sheehan,J.)和希默尔·M.(Himmel,M.),1999,酶、能量与环境:美国能源部研究和开发生物乙醇活性的战略性观点(Enzymes,energy and the environment:A strategic perspective on the U.S.Department of Energy’s research and development activities for bioethanol),生物技术进展(Biotechnol.Prog.)15:817-827)。HHF涉及一个单独的水解步骤,并且另外涉及一个同时糖化和水解步骤,这些步骤可以在同一反应器中进行。HHF过程中的步骤可以在不同的温度下进行,即高温酶糖化,接着在发酵菌株能够耐受的更低温度下进行SSF。DMC将全部三个过程(酶产生、水解以及发酵)组合在一个或多个(例如,数个)步骤中,其中相同生物体被用来产生用于将纤维素材料转化成可发酵糖的酶并且将可发酵糖转化成最终产物(林德·L.R.(Lynd,L.R.)、韦默·P.J.(Weimer,P.J.),范泽尔·W.H.(van Zyl,W.H.)、以及普利特瑞斯·I.S.(Pretorius,I.S.),2002,微生物纤维素利用:基础与生物技术(Microbial cellulose utilization:Fundamentals and biotechnology),微生物分子生物学综述(Microbiol.Mol.Biol.Reviews)66:506-577)。在此应理解的是,本领域中已知的包括预处理、酶水解(糖化)、发酵、或其组合的任何方法,可以用于实施本发明的方法。
常规设备可以包括进料分批搅拌反应器、分批搅拌反应器、具有超滤的连续流搅拌反应器、和/或连续活塞流柱式反应器(费尔南达.德.卡斯蒂柳斯.柯瑞芝(Fernanda de Castilhos Corazza)、弗拉维奥.法里亚.德.莫赖斯(FlávioFaria de Moraes)、吉塞拉.玛丽亚.扎宁(Gisella Maria Zanin)以及伊沃.雷特泽尔(Ivo Neitzel),2003,用于纤维二糖水解的进料分批反应器的优化控制(Optimal control in fed-batch reactor for the cellobiose hydrolysis),科技学报(自然科学版)(Acta Scientiarum.Technology)25:33-38;古萨科夫·A.V.(Gusakov,A.V.)和辛涅特西·A.P.(Sinitsyn,A.P.),1985,纤维素的酶水解动力学:1.分批反应器加工的数学模型(Kinetics of the enzymatic hydrolysisof cellulose:1.A mathematical model for a batch reactor process),酶与微生物技术(Enz.Microb.Technol.)7:346-352);摩擦反应器(隆·S.K.(Ryu,S.K.)和李·J.M.(Lee,J.M.),1983,通过使用摩擦生物反应器进行的废弃纤维素的生物转化(Bioconversion of waste cellulose by using an attrition bioreactor),生物技术与生物工程(Biotechnol.Bioeng.)25:53-65);或具有由电磁场引起的强烈搅拌的反应器(古萨科夫·A.V.、辛涅特西·A.P.、谢尔盖·I.Y.(Davydkin,I.Y.)、谢尔盖·V.Y.、普罗塔斯·O.V.(Protas,O.V.),1996,使用具有由电磁场引起的强烈搅拌的新型反应器增强酶纤维素水解(Enhancement of enzymatic cellulose hydrolysis using a novel type ofbioreactor with intensive stirring induced by electromagnetic field),应用生物化学与生物技术(Appl.Biochem.Biotechnol.)56:141-153)。另外的反应器类型包括:用于水解和/或发酵的流化床反应器、升流层(upflow blanket)反应器、固定化反应器、以及挤出机型反应器。
预处理。在本发明的方法的实践中,可以使用本领域已知的任何预处理方法来破坏植物细胞壁的纤维素材料组分(钱德拉(Chandra)等人,2007,底物预处理:木质纤维素的有效酶水解的关键?(Substrate pretreatment:Thekey to effective enzymatic hydrolysis of lignocellulosics?),生物化学工程/生物技术的进展(Adv.Biochem.Engin./Biotechnol.)108:67-93;盖博(Galbe)和小林(Zacchi),2007,用于高效生物乙醇生产的木质纤维素材料的预处理(Pretreatment of lignocellulosic materials for efficient bioethanol production),生物化学工程/生物技术的进展108:41-65;亨德里克斯(Hendriks)和季曼(Zeeman),2009,用以增强木质纤维素生物质的消化性的预处理(Pretreatments to enhance the digestibility of lignocellulosic biomass),生物资源技术(Bioresource Technol.)100:10-18;莫热(Mosier)等人,2005,用于木质纤维素生物质的预处理的有前景技术的特征(Features of promisingtechnologies for pretreatment of lignocellulosic biomass),生物资源技术96:673-686;塔希尔扎德(Taherzadeh)和卡里米(Karimi),2008,预处理木质纤维素废弃物以改善乙醇和生物气体产生:综述(Pretreatment oflignocellulosic wastes to improve ethanol and biogas production:A review),分子科学国际杂志(Int.J.of Mol.Sci.)9:1621-1651;杨(Yang)和怀曼,2008,预处理:释放低成本纤维素乙醇的关键(Pretreatment:the key to unlockinglow-cost cellulosic ethanol),生物燃料、生物产品与生物精炼(BiofuelsBioproducts and Biorefining-Biofpr.)2:26-40)。
纤维素材料也可以在预处理之前使用本领域中已知的方法进行粒度减小、筛分、预浸泡、润湿、洗涤、和/或调理。
常规预处理包括但不限于:蒸汽预处理(伴随或不伴随爆炸)、稀酸预处理、热水预处理、碱性预处理、石灰预处理、湿氧化、湿爆炸、氨纤维爆炸、有机溶剂预处理、以及生物预处理。另外的预处理包括氨渗滤、超声、电穿孔、微波、超临界CO2、超临界H2O、臭氧、离子性液体、以及γ辐射预处理。
可以在水解和/或发酵之前对纤维素材料进行预处理。预处理优选在水解之前进行。可替代地,预处理可以与酶水解同时进行以释放可发酵糖,如葡萄糖、木糖、和/或纤维二糖。在大多数情况下,预处理步骤本身引起生物质到可发酵糖的些许转化(即使不存在酶)。
蒸汽预处理。在蒸汽预处理中,加热纤维素材料以破坏植物细胞壁成分,包括木质素、半纤维素、以及纤维素,以使酶可接触纤维素和其他级分,例如,半纤维素。使纤维素材料经过或通过反应容器,其中注入蒸汽以将温度增加至所需的温度和压力,并且在其中保持所希望的反应时间。蒸汽预处理优选在140℃至250℃,例如160℃至200℃、或170℃至190℃下进行,其中最佳温度范围取决于化学催化剂的添加。蒸汽预处理的停留时间优选是1至60分钟,例如1至30分钟、1至20分钟、3至12分钟、或4至10分钟,其中最佳停留时间取决于温度范围和化学催化剂的添加。蒸汽预处理允许相对较高的固体加载量,这样使得纤维素材料在预处理过程中通常仅变得潮湿。蒸汽预处理经常与预处理后的材料的爆炸放料组合,这被称为蒸汽爆炸,即,迅速闪变至大气压和材料湍流,以通过破碎增加可及的表面积(达夫(Duff)和默里(Murray),1996,生物资源技术855:1-33;盖博和小林,2002,应用微生物学与生物技术(Appl.Microbiol.Biotechnol.)59:618-628;美国专利申请号20020164730)。在蒸汽预处理过程中,半纤维素乙酰基被裂解,并且所得到的酸自催化半纤维素部分水解成单糖和寡糖。仅在有限的程度上去除木质素。
化学预处理:术语“化学处理”是指能促进纤维素、半纤维素、和/或木质素的分离和/或释放的任何化学预处理。这种预处理可以将结晶纤维素转化为无定形纤维素。适合的化学预处理方法的实例包括:(例如)稀酸预处理、石灰预处理、湿氧化、氨纤维/冷冻爆炸(AFEX)、氨渗滤(APR)、离子性液体、以及有机溶剂预处理。
经常在蒸汽预处理之前添加催化剂,如H2SO4或SO2(典型地0.3%至5%w/w),这降低时间和温度、增加回收率、并且改善酶水解(巴列斯特罗斯(Ballesteros)等人,2006,应用生物化学与生物技术129-132:496-508;瓦尔加(Varga)等人,2004,应用生物化学与生物技术113-116:509-523;萨斯那(Sassner)等人,2006,酶与微生物技术(Enzyme Microb.Technol.)39:756-762)。在稀酸预处理中,将纤维素材料与稀酸(典型地H2SO4)和水混合以形成浆料,通过蒸汽加热至所希望的温度,并且在停留时间后闪变至大气压。可以用许多反应器设计来进行稀酸预处理,例如,活塞流反应器、逆流反应器、或连续逆流收缩床反应器(达夫和默里,1996,见上文,舍尔(Schell)等人,2004,生物资源技术91:179-188;李(Lee)等人,1999,生物化学工程与生物技术的进展65:93-115)。
还可以使用碱性条件下的几种预处理方法。这些碱性预处理包括但不限于:氢氧化钠、石灰、湿氧化、氨渗滤(APR)、以及氨纤维/冷冻爆炸(AFEX)。
用氧化钙或氢氧化钙,在85℃至150℃的温度下进行石灰预处理,并且停留时间为从1小时到几天(怀曼等人,2005,生物资源技术96:1959-1966;莫热等人,2005,生物资源技术96:673-686)。WO2006/110891、WO2006/110899、WO2006/110900、以及WO2006/110901披露了使用氨的预处理方法。
湿氧化是一种热预处理,其典型地在添加氧化剂(如过氧化氧或过压氧)的情况下在180℃至200℃下持续5-15分钟进行(施密特(Schmidt)和汤姆森(Thomsen),1998,生物资源技术64:139-151;帕罗内(Palonen)等人,2004,应用生物化学与生物技术117:1-17;瓦尔加等人,2004,生物技术与生物工程(Biotechnol.Bioeng.)88:567-574;马丁(Martin)等人,2006,化学技术与生物技术杂志(J.Chem.Technol.Biotechnol.)81:1669-1677)。预处理优选以1%至40%干物质,例如2%至30%干物质或5%至20%干物质进行,并且经常通过添加碱如碳酸钠来增加初始pH。
被称为湿爆炸(湿氧化和蒸汽爆炸的组合)的湿氧化预处理方法的修改方案能够处理高达30%的干物质。在湿爆炸中,在预处理过程中,在一定的停留时间之后引入氧化剂。然后通过闪变至大气压来终止预处理(WO2006/032282)。
氨纤维爆炸(AFEX)涉及在如90℃至150℃的中等温度和如17至20bar的高压下,用液体或气态氨处理纤维素材料5至10分钟,其中干物质含量可以高达60%(格拉帕里(Gollapalli)等人,2002,应用生物化学与生物技术98:23-35;俊达瓦特(Chundawat)等人,2007,生物技术与生物工程(Biotechnol.Bioeng.)96:219-231;阿里扎德(Alizadeh)等人,2005,应用生物化学与生物技术121:1133-1141;泰莫里(Teymouri)等人,2005,生物资源技术96:2014-2018)。在AFEX预处理过程中,纤维素和半纤维素保持相对完整。木质素-碳水化合物复合物被裂解。
有机溶剂预处理通过使用含水乙醇(40%-60%乙醇)在160℃-200℃下萃取30至60分钟而将纤维素材料脱木质素(潘(Pan)等人,2005,生物技术与生物工程90:473-481;潘等人,2006,生物技术与生物工程94:851-861;库拉比(Kurabi)等人,2005,应用生物化学与生物技术121:219-230)。通常添加硫酸作为催化剂。在有机溶剂预处理中,大部分半纤维素和木质素被去除。
适合的预处理方法的其他实例由舍尔等人,2003,应用生物化学与生物技术,第105-108卷,第69-85页、和莫热等人,2005,生物资源技术96:673-686、以及美国公开申请2002/0164730描述。
在一方面,化学预处理优选作为稀酸处理,并且更优选作为连续稀酸处理形式进行。酸通常是硫酸,但也可以使用其他酸,如乙酸、柠檬酸、硝酸、磷酸、酒石酸、琥珀酸、氯化氢、或其混合物。弱酸处理优选在1至5,例如1至4或1至2.5的pH范围中进行。在一方面,酸浓度在优选从0.0.1wt%至10wt%酸,例如0.05wt%至5wt%酸或0.1wt%至2wt%酸的范围中。使酸与纤维素材料相接触,并且保持在优选140℃至200℃,例如165℃至190℃范围中的温度下,持续从1至60分钟范围内的时期。
在另一方面,预处理在含水浆料中进行。在优选方面,在预处理过程中纤维素材料以优选在10wt%至80wt%之间,例如20wt%至70wt%或30wt%至60wt%,如大约40wt%的量存在。预处理的纤维素材料可以不洗涤或使用本领域已知的任何方法洗涤,例如,用水洗涤。
机械预处理或物理预处理:术语“机械预处理”或“物理预处理”是指促进颗粒大小减少的任何预处理。例如,这种预处理可以涉及各种类型的研磨或碾磨(例如,干磨、湿磨、或振动球磨)。
纤维素材料可以物理地(机械地)且化学地预处理。机械或物理预处理可以与以下相结合:蒸汽/蒸汽爆炸、水热解(hydrothermolysis)、稀酸或弱酸处理、高温、高压处理、辐射(例如微波福射)、或其组合。在一方面,高压意指在优选约100至约400psi,例如约150至约250psi范围中的压力。在另一方面,高温意指在约100℃至约300℃,例如约140℃至约200℃范围中的温度。在一个优选方面,机械或物理预处理在分批过程中使用蒸汽枪水解器系统,例如从顺智公司(Sunds Defibrator AB),瑞典(Sweden)可获得的Sunds水解器(Sunds Hydrolyzer)来进行,该系统使用如上所定义的高压和高温。这些物理预处理和化学预处理可以根据需要顺序地进行或同时进行。
因此,在一个优选方面,使纤维素材料经受物理(机械)或化学预处理、或其任何组合,以促进纤维素、半纤维素、和/或木质素的分离和/或释放。
生物预处理:术语“生物预处理”是指促进纤维素、半纤维素、和/或木质素从纤维素材料中分离和/或释放的任何生物预处理。生物预处理技术可以涉及应用溶解木质素的微生物和/或酶(参见,例如,舒·T.-A.(Hsu,T.-A.),1996,生物质的预处理(Pretreatment of biomass),生物乙醇手册:生产和利用,怀曼·C.E.编辑,泰勒-弗朗西斯出版集团,华盛顿特区,179-212;高希(Ghosh)和辛格(Singh),1993,用于纤维素生物质的酶/微生物转化的物理化学与生物处理(Physicochemical and biological treatments forenzymatic/microbial conversion of cellulosic biomass),应用微生物学进展(Adv.Appl.Microbiol.)39:295-333;麦克米兰·J.D.(McMillan,J.D.),1994,预处理木质纤维素生物质:综述(Pretreating lignocellulosic biomass:a review),用于燃料生产的生物质的酶转化(Enzymatic Conversion of Biomass for FuelsProduction),希默尔·M.E.、贝克·J.O.、以及奥弗伦·R.P.(Overend,R.P.)编辑,美国化学学会讨论会系列566(ACS Symposium Series566),美国化学学会(American Chemical Society),华盛顿特区,第15章;贡·C.S.(Gong,C.S.)、卡奥·N.J.(Cao,N.J.)、杜·J.(Du,J.)、以及曹·G.T.(Tsao,G.T.),1999,由可再生资源生产乙醇(Ethanol production from renewable resources),生物化学工程/生物技术的进展,舍佩尔·T.编辑,施普林格出版社德国海德堡柏林(Berlin Heidelberg,Germany),65:207-241);奥尔森(Olsson)和哈恩-哈格达尔(Hahn-Hagerdal),1996,用于乙醇生产的木质纤维素水解物的发酵(Fermentation of lignocellulosic hydrolysates for ethanol production),酶与微生物技术(Enz.Microb.Tech.)18:312-331;以及瓦蓝德(Vallander)和埃里克松(Eriksson),1990,由木质纤维素材料生产乙醇:技术现状(Production of ethanol from lignocellulosic materials:State of the art),生物化学工程/生物技术的进展42:63-95)。
糖化。在水解步骤(还称为糖化)中,将(例如预处理的)纤维素材料水解,以将纤维素和半纤维素分解成可发酵糖,如葡萄糖、纤维二糖、木糖、木酮糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖、和/或可溶性寡糖。水解由酶组合物在本发明的纤维二糖水解酶变体的存在下酶促进行。这些组合物的酶可以同时或顺序地添加。
酶水解优选在适合的含水环境中在可以由本领域技术人员容易确定的条件下进行。在一方面,水解在适合于一种或多种酶的活性,即对于该一种或多种酶来说最佳的条件下进行。水解可以作为进料分批过程或连续过程进行,其中将纤维素材料逐渐进料至例如含酶的水解溶液中。
糖化通常在受控的pH、温度以及混合条件下在搅拌釜反应器或发酵罐中进行。适合的处理时间、温度以及pH条件可以由本领域技术人员容易地确定。例如,糖化可以持续长达200小时,但是典型地进行优选约12至约120小时,例如约16至约72小时或约24至约48小时。温度在优选约25℃至约80℃,例如约30℃至约65℃、约40℃至约60℃、或约50℃至55℃的范围中。pH在优选约3至约9,例如约3.5至约7、约4至约6、或约5.0至约5.5范围中。干燥固体含量在优选约5wt%至约50wt%,例如约10wt%至约40wt%或约20wt%至约30wt%的范围中。
这些酶组合物可以包含适用于降解纤维素材料的任何蛋白。
在一方面,该酶组合物包含或进一步包含选自下组的一种或多种(例如,数种)蛋白质,该组由以下各项组成:纤维素酶、具有纤维素分解增强活性的多肽、半纤维素酶、酯酶、苹果菌素、漆酶、木质素分解酶、果胶酶、过氧化物酶、蛋白酶、以及膨胀蛋白。在另一方面,该纤维素酶优选是选自下组的一种或多种(例如,数种)酶,该组由以下各项组成:内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、以及β-葡糖苷酶。在另一方面,该半纤维素酶优选是选自下组的一种或多种(例如,数种)酶,该组由以下各项组成:乙酰甘露聚糖酯酶、乙酰木聚糖酯酶、阿拉伯聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、香豆酸酯酶、阿魏酸酯酶、半乳糖苷酶、葡糖醛酸糖苷酶、葡糖醛酸酯酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、木聚糖酶、以及木糖苷酶。
在另一方面,该酶组合物包含一种或多种(例如,数种)纤维素分解酶。在另一方面,该酶组合物包含或进一步包含一种或多种(例如,数种)半纤维素分解酶。在另一方面,该酶组合物包含一种或多种(例如,数种)纤维素分解酶和一种或多种(例如,数种)半纤维素分解酶。在另一方面,该酶组合物包含选自纤维素分解酶和半纤维素分解酶的组的一种或多种(例如,数种)酶。在另一方面,该酶组合物包含一种内切葡聚糖酶。在另一方面,该酶组合物包含一种纤维二糖水解酶。在另一方面,该酶组合物包含一种β-葡糖苷酶。在另一方面,该酶组合物包含一种具有纤维素分解增强活性的多肽。在另一方面,该酶组合物包含一种内切葡聚糖酶和一种具有纤维素分解增强活性的多肽。在另一方面,该酶组合物包含一种纤维二糖水解酶和一种具有纤维素分解增强活性的多肽。在另一方面,该酶组合物包含一种β-葡糖苷酶和一种具有纤维素分解增强活性的多肽。在另一方面,该酶组合物包含一种内切葡聚糖酶和一种纤维二糖水解酶。在另一方面,该酶组合物包含一种内切葡聚糖酶和一种β-葡糖苷酶。在另一方面,该酶组合物包含一种纤维二糖水解酶和一种β-葡糖苷酶。在另一方面,该酶组合物包含一种内切葡聚糖酶、一种纤维二糖水解酶、以及一种具有纤维素分解增强活性的多肽。在另一方面,该酶组合物包含一种内切葡聚糖酶、一种β-葡糖苷酶、以及一种具有纤维素分解增强活性的多肽。在另一方面,该酶组合物包含一种纤维二糖水解酶、一种β-葡糖苷酶、以及一种具有纤维素分解增强活性的多肽。在另一方面,该酶组合物包含一种内切葡聚糖酶、一种纤维二糖水解酶、以及一种β-葡糖苷酶。在另一个方面,该酶组合物包含一种内切葡聚糖酶、一种纤维二糖水解酶、一种β-葡糖苷酶、以及一种具有纤维素分解增强活性的多肽。
在另一方面,该酶组合物包含一种乙酰甘露聚糖酯酶。在另一方面,该酶组合物包含一种乙酰木聚糖酯酶。在另一方面,该酶组合物包含一种阿拉伯聚糖酶(例如,α-L-阿拉伯聚糖酶)。在另一方面,该酶组合物包含一种阿拉伯呋喃糖苷酶(例如,α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶)。在另一方面,该酶组合物包含一种香豆酸酯酶。在另一方面,该酶组合物包含一种阿魏酸酯酶。在另一方面,该酶组合物包含一种半乳糖苷酶(例如,α-半乳糖苷酶和/或β-半乳糖苷酶)。在另一方面,该酶组合物包含一种葡糖醛酸糖苷酶(例如,α-D-葡糖醛酸糖苷酶)。在另一方面,该酶组合物包含一种葡糖醛酸酯酶。在另一方面,该酶组合物包含一种甘露聚糖酶。在另一方面,该酶组合物包含一种甘露糖苷酶(例如,β-甘露糖苷酶)。在另一方面,该酶组合物包含一种木聚糖酶。在一个优选方面,该木聚糖酶是一种家族10木聚糖酶。在另一个优选方面,该木聚糖酶是一种家族11木聚糖酶。在另一方面,该酶组合物包含一种木糖苷酶(例如,β-木糖苷酶)。
在另一方面,该酶组合物包含一种酯酶。在另一方面,该酶组合物包含一种苹果菌素。在另一方面,该酶组合物包含一种漆酶。在另一方面,该酶组合物包含一种木质素分解酶。在一个优选方面,该木质素分解酶是一种锰过氧化物酶。在另一个优选方面,该木质素分解酶是一种木质素过氧化物酶。在另一个优选方面,该木质素分解酶是一种H2O2产生酶。在另一方面,该酶组合物包含一种果胶酶。在另一个方面,该酶组合物包含一种过氧化物酶。在另一方面,该酶组合物包含一种蛋白酶。在另一方面,该酶组合物包含一种膨胀蛋白。
在本发明的方法中,可以在糖化、糖化和发酵、或发酵之前或期间添加该一种或多种酶。
该酶组合物的一种或多种(例如,数种)组分可以是野生型蛋白、重组蛋白、或野生型蛋白与重组蛋白的组合。例如,一种或多种(例如,数种)组分可以是用作宿主细胞以重组表达该酶组合物的一种或多种(例如,数种)其他组分的细胞的天然蛋白质。该酶组合物的一种或多种(例如,数种)组分可以作为单组分产生,然后将这些单组分组合以形成该酶组合物。该酶组合物可以是多组分蛋白制剂与单组分蛋白制剂的组合。
在本发明的方法中使用的酶可以处于适合于使用的任何形式,例如像,发酵液配制品或细胞组合物、含或不含细胞碎片的细胞裂解液、半纯化或纯化的酶制剂、或作为这些酶的来源的宿主细胞。酶组合物可以是干粉或颗粒、无粉尘的颗粒、液体、稳定化液体、或稳定化受保护的酶。液体酶制剂可以根据已确立的工艺,例如通过添加稳定剂(如糖、糖醇或另一种多元醇、和/或乳酸或另一种有机酸)来进行稳定化。
酶和纤维二糖水解酶变体的最佳量取决于几个因素,包括但不限于:纤维素分解酶和/或半纤维素分解酶组分的混合物、纤维素材料、纤维素材料的浓度、纤维素材料的一种或多种预处理、温度、时间、pH、以及所包含的发酵生物体(例如,用于同时进行糖化和发酵的酵母)。
在一方面,纤维素分解酶或半纤维素分解酶对纤维素材料的有效量是约0.5至约50mg,例如,约0.5至约40mg、约0.5至约25mg、约0.75至约20mg、约0.75至约15mg、约0.5至约10mg、或约2.5至约10mg/g纤维素材料。
在另一方面,纤维二糖水解酶变体对纤维素材料的有效量是约0.01至约50.0mg,例如,约0.01至约40mg、约0.01至约30mg、约0.01至约20mg、约0.01至约10mg、约0.01至约5mg、约0.025至约1.5mg、约0.05至约1.25mg、约0.075至约1.25mg、约0.1至约1.25mg、约0.15至约1.25mg、或约0.25至约1.0mg/g纤维素材料。
在另一方面,纤维二糖水解酶变体对纤维素分解酶或半纤维素分解酶的有效量是约0.005至约1.0g,例如,约0.01至约1.0g、约0.15至约0.75g、约0.15至约0.5g、约0.1至约0.5g、约0.1至约0.25g、或约0.05至约0.2g/g纤维素分解酶或半纤维素分解酶。
具有纤维素分解酶活性或半纤维素分解酶活性的多肽,以及适用于纤维素材料的降解的其他蛋白质/多肽,例如具有纤维素分解增强活性的GH61多肽(在下文统称为“具有酶活性的多肽”)可以源自或获自任何适合的来源,包括细菌、真菌、酵母、植物、或哺乳动物来源。术语“获得的”在此还意指该酶可能已在宿主生物体中采用在此所描的方法重组产生,其中重组产生的酶对于宿主生物体是原生的或外源的,或具有修饰的氨基酸序列,例如,具有一个或多个(例如,数个)缺失、插入和/或取代的氨基酸,即重组产生的酶为天然氨基酸序列的突变体和/或片段,或通过本领域已知的核酸改组方法产生的酶。天然酶的含义中涵盖天然变体,而外源酶的含义中涵盖重组(如通过定点诱变或改组)获得的变体。
具有酶活性的多肽可以是细菌多肽。例如,该多肽可以是革兰氏阳性细菌多肽,如具有酶活性的芽孢杆菌、链球菌、链霉菌、葡萄球菌、肠球菌、乳酸杆菌、乳球菌、梭菌、土芽孢杆菌、热解纤维素菌(Caldicellulosiruptor)、热酸菌(Acidothermus)、角质酶产生菌(Thermobifidia)、或大洋芽孢杆菌多肽;或革兰氏阴性细菌多肽,如具有酶活性的大肠杆菌、假单胞菌、沙门氏菌、弯曲杆菌、螺杆菌、黄杆菌、梭杆菌、泥杆菌、奈瑟氏菌、或脲原体属多肽。
在一方面,该多肽是具有酶活性的嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚硬芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、或苏云金芽孢杆菌多肽。
在另一方面,该多肽是具有酶活性的似马链球菌、酿脓链球菌、乳房链球菌、或马链球菌兽疫亚种多肽。
在另一方面,该多肽是具有酶活性的不产色链霉菌、阿维链霉菌、天蓝色链霉菌、灰色链霉菌、或变铅青链霉菌多肽。
具有酶活性的多肽还可以是真菌多肽,并且更优选地是一种具有酶活性的酵母多肽,如假丝酵母属、克鲁维酵母属、毕赤酵母属、酵母菌属、裂殖酵母属、或耶氏酵母属多肽;或更优选地是一种具有酶活性的丝状真菌多肽,如枝顶孢霉属、伞菌属、链格孢属、曲霉属、短梗霉属、Botryospaeria、拟蜡菌属、毛喙壳属、金孢子菌属、麦角菌属、旋孢腔菌属、鬼伞属、乳白蚁属、棒囊壳属、隐丛赤壳菌属、隐球菌属、色二孢属、黑耳属、线黑粉酵母属、镰刀菌属、赤霉属、全鞭毛虫属、腐质霉属、耙齿菌属、蘑燕属、小腔球菌属、梨孢菌属、Melanocarpus、多孔菌属、毛霉属、毁丝霉属、新美鞭菌属、链孢菌属、拟青霉属、青霉菌属、平革菌属、瘤胃壶菌属、Poitrasia、假黑盘菌属、Pseudotrichonympha、根毛霉菌属、裂褶菌属、柱顶孢属、踝节菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳霉属、弯颈霉属、木霉属、长毛盘菌属、轮枝孢属、小包脚菇属、或炭角菌属多肽。
在一方面,该多肽是具有酶活性的卡尔酵母、酿酒酵母、糖化酵母、道格拉氏酵母、克鲁弗酵母、诺地酵母、或卵形酵母多肽。
在另一方面,该多肽是具有酶活性的解纤维枝顶孢霉、棘孢曲霉、泡盛曲霉、烟曲霉、臭曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、嗜角质金孢子菌、Chrysosporium lucknowense、热带金孢子菌、Chrysosporiummerdarium、Chrysosporium inops、租金抱子菌、Chrysosporiumqueenslandicum、Chrysosporium zonatum、杆孢状镰孢、谷类镰抱、库威镰孢、大刀镰孢、禾谷镰孢、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖镰孢、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟分枝孢镰孢、硫色镰孢、圆镰孢、拟丝孢镰孢、镶片镰孢、灰腐质霉、特异腐质霉、疏棉状腐质霉、白耙齿菌、米黑毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙链孢菌、绳状青霉菌、产紫青霉菌、黄孢平革菌、Thielavia achromatica、Thielavia albomyces、Thielavia albopilosa、澳洲梭孢壳霉、Thielavia fimeti、小孢梭孢壳霉、卵孢梭孢壳霉、Thielaviaperuviana、瘤孢梭孢壳霉、毛梭孢壳霉、Thielavia subthermophila、土生梭孢壳霉、哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉、绿色木霉、或褐孢长毛盘菌(Trichophaea saccata)多肽。
还可以使用具有酶活性的多肽的化学修饰或蛋白质工程化的突变体。
酶组合物的一种或多种(例如,数种)组分可以是重组组分,即,通过克隆编码该单一组分的DNA序列并且随后用该DNA序列转化细胞并且在宿主中表达产生(参见,例如,WO91/17243和WO91/17244)。该宿主优选是异源宿主(酶对于宿主来说是外源的),但该宿主在某些条件下也可以是同源宿主(酶对于宿主来说是原生的)。单组分纤维素分解蛋白还可以通过从发酵液中纯化这种蛋白质来制备。
在一方面,该一种或多种(例如,数种)纤维素分解酶包含商业纤维素分解酶制剂。适用于本发明的商业纤维素分解酶制剂的实例包括:(例如)CTec(诺维信A/S公司)、CTec2(诺维信A/S公司)、CTec3(诺维信A/S公司)、CELLUCLASTTM(诺维信A/S公司)、NOVOZYMTM188(诺维信A/S公司)、CELLUZYMETM(诺维信A/S公司)、CEREFLOTM(诺维信A/S公司)、以及ULTRAFLOTM(诺维信A/S公司)、ACCELERASETM(杰能科国际公司(Genencor Int.))、LAMINEXTM(杰能科国际)、SPEZYMETMCP(杰能科国际)、NL(帝斯曼(DSM));S/L100(帝斯曼)、ROHAMENTTM7069W(罗姆股份有限公司)、LDI(Dyadic国际有限公司(DyadicInternational,Inc.))、LBR(Dyadic国际有限公司)、或150L(Dyadic国际有限公司)。以从约0.001wt%至约5.0wt%的固体,例如0.025wt%至约4.0wt%的固体、或约0.005wt%至约2.0wt%的固体的有效量添加纤维素酶。
可以在本发明的方法中使用的细菌内切葡聚糖酶的实例包括但不限于:解纤维热酸菌(Acidothermus cellulolyticus)内切葡聚糖酶(WO91/05039;WO93/15186、美国专利号5,275,944;WO96/02551;美国专利号5,536,655;WO00/70031;WO05/093050);褐色高温双歧菌(Thermobifida fusca)内切葡聚糖酶III(WO05/093050);以及褐色高温双歧菌内切葡聚糖酶V(WO05/093050)。
可以用于本发明的真菌内切葡聚糖酶的实例包括但不限于:里氏木霉内切葡聚糖酶I(彭蒂莱(Penttila)等人,1986,基因45:253-263,里氏木霉Cel7B内切葡聚糖酶I(GENBANKTM登录号M15665);里氏木霉内切葡聚糖酶II(萨洛黑莫(Saloheimo)等人,1988,基因63:11-22),里氏木霉Cel5A内切葡聚糖酶II(GENBANKTM登录号M19373);里氏木霉内切葡聚糖酶III(奥卡达(Okada)等人,1988,应用与环境微生物学(Appl.Environ.Microbiol.)64:555-563,GENBANKTM登录号AB003694);里氏木霉内切葡聚糖酶V(萨洛黑莫等人,1994,分子微生物学(Molecular Microbiology)13:219-228,GENBANKTM登录号Z33381);棘孢曲霉内切葡聚糖酶(黄(Ooi)等人,1990,核酸研究l8:5884);川地曲霉(spergillus kawachii)内切葡聚糖酶(坂元(Sakamoto)等人,1995,当代遗传学(Current Genetics)27:435-439);胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwinia carotovara)内切葡聚糖酶(萨里拉赫蒂(Saarilahti)等人,1990,基因90:9-14);尖镰孢内切葡聚糖酶(GENBANKTM登录号L29381);灰腐质霉高温变种内切葡聚糖酶(GENBANKTM登录号AB003107);热白丝菌(Melanocarpus albomyces)内切葡聚糖酶(GENBANKTM登录号MAL515703);粗糙链孢菌内切葡聚糖酶(GENBANKTM登录号XM_324477);特异腐质霉内切葡聚糖酶V;嗜热毁丝霉CBS117.65内切葡聚糖酶;担子菌纲(basidiomycete)CBS495.95内切葡聚糖酶;担子菌纲CBS494.95内切葡聚糖酶;土生梭孢壳霉NRRL8126CEL6B内切葡聚糖酶;土生梭孢壳霉NRRL8126CEL6C内切葡聚糖酶;土生梭孢壳霉NRRL8126CEL7C内切葡聚糖酶;土生梭孢壳霉NRRL8126CEL7E内切葡聚糖酶;土生梭孢壳霉NRRL8126CEL7F内切葡聚糖酶;Cladorrhinum foecundissimum ATCC62373CEL7A内切葡聚糖酶;以及里氏木霉菌株号VTT-D-80133内切葡聚糖酶(GENBANKTM登录号M15665)。
适用于本发明的纤维二糖水解酶的实例包括但不限于:棘孢曲霉纤维二糖水解酶II(WO2011/059740)、嗜热毛壳菌纤维二糖水解酶I、嗜热毛壳菌纤维二糖水解酶II、特异腐质霉纤维二糖水解酶I、嗜热毁丝霉纤维二糖水解酶II(WO2009/042871)、Thielavia hyrcanie纤维二糖水解酶II(WO2010/141325)、土生梭孢壳霉纤维二糖水解酶II(CEL6A,WO2006/074435)、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、以及褐孢长毛盘菌纤维二糖水解酶II(WO2010/057086)。
适用于本发明的β-葡糖苷酶的实例包括但不限于来自以下各项的β-葡糖苷酶:棘孢曲霉(川口(Kawaguchi)等人,1996,基因173:287-288)、烟曲霉(WO2005/047499)、黑曲霉(丹(Dan)等人,2000,生物化学杂志(J.Biol.Chem.)275:4973-4980)、米曲霉(WO2002/095014)、巴西青霉菌IBT20888(WO2007/019442和WO2010/088387)、土生梭孢壳霉(WO2011/035029)、以及褐孢长毛盘菌(WO2007/019442)。
β-葡糖苷酶可以是一种融合蛋白。在一方面,β-葡糖苷酶是米曲霉β-葡糖苷酶变体BG融合蛋白(WO2008/057637)或米曲霉β-葡糖苷酶融合蛋白(WO2008/057637)。
其他有用的内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、以及β-葡糖苷酶披露于使用根据以下的分类的许多糖基水解酶家族中:亨利萨特·B.,1991,基于氨基酸序列相似性的糖基水解酶的分类,生物化学杂志280:309-316;以及亨利萨特·B.和贝洛赫·A.,1996,修正糖基水解酶的基于序列的分类,生物化学杂志316:695-696。
可以用于本发明的其他纤维素分解酶描述于以下文献中:WO98/13465、WO98/015619、WO98/015633、WO99/06574、WO99/10481、WO99/025847、WO99/031255、WO2002/101078、WO2003/027306、WO2003/052054、WO2003/052055、WO2003/052056、WO2003/052057、WO2003/052118、WO2004/016760、WO2004/043980、WO2004/048592、WO2005/001065、WO2005/028636、WO2005/093050、WO2005/093073、WO2006/074005、WO2006/117432、WO2007/071818、WO2007/071820、WO2008/008070、WO2008/008793、美国专利号5,457,046、美国专利号5,648,263、以及美国专利号5,686,593。
在本发明的方法中,具有纤维素分解增强活性的任何GH61多肽都可以用作酶组合物的组分。
适用于本发明的方法的具有纤维素分解增强活性的GH61多肽的实例包括但不限于来自以下各项的GH61多肽:土生梭孢壳霉(WO2005/074647、WO2008/148131、以及WO2011/035027)、金黄色嗜热子囊菌(WO2005/074656和WO2010/065830)、里氏木霉(WO2007/089290)、嗜热毁丝霉(WO2009/085935、WO2009/085859、WO2009/085864、WO2009/085868)、烟曲霉(WO2010/138754);来自以下各项的GH61多肽:嗜松青霉菌(WO2011/005867)、嗜热子囊菌属菌种(WO2011/039319)、青霉菌属种(WO2011/041397)、甲壳嗜热子囊菌(WO2011/041504)、棘孢曲霉(WO2012/0307990)、以及嗜热棉毛菌(WO2012/113340)。WO2012/146171披露了来自特异腐质霉的具有纤维素分解增强活性的GH61多肽及其多核苷酸。
在一方面,具有纤维素分解增强活性的GH61多肽在根据WO2008/151043的可溶性活化二价金属阳离子(例如锰或铜)的存在下使用。
在另一方面,具有纤维素分解增强活性的GH61多肽在二氧基化合物、双环化合物、杂环化合物、含氮化合物、醌化合物、含硫化合物、或从预处理的纤维素材料(如预处理的玉米秸杆(PCS))获得的液剂的存在下使用。
二氧基化合物可以包括含有两个或更多个氧原子的任何适合的化合物。在一些方面,二氧基化合物包含如在此所描述的取代的芳基部分。二氧基化合物可以包含一个或多个(例如,数个)羟基和/或羟基衍生物,而且包括缺乏羟基和羟基衍生物的取代的芳基部分。二氧基化合物的非限制性实例包括邻苯二酚或儿茶酚;咖啡酸;3,4-二羟基苯甲酸;4-叔丁基-5-甲氧基-1,2-苯二醇;连苯三酚;没食子酸;3,4,5-三羟基苯甲酸甲酯;2,3,4-三羟基二苯甲酮;2,6-二甲氧基苯酚;芥子酸;3,5-二羟基苯甲酸;4-氯-1,2-苯二醇;4-硝基-1,2-苯二醇;丹宁酸;没食子酸乙酯;羟乙酸甲酯;二羟基富马酸;2-丁炔-1,4-二醇;克酮酸;1,3-丙二醇;酒石酸;2,4-戊二醇;3-乙氧基-1,2-丙二醇;2,4,4'-三羟基二苯甲酮;顺-2-丁烯-1,4-二醇;3,4-二羟基-3-环丁烯-1,2-二酮;二羟基丙酮;丙烯醛缩醛;4-羟基苯甲酸甲酯;4-羟基苯甲酸;以及3,5-二甲氧基-4-羟基苯甲酸甲酯;或其盐或溶剂化物。
双环化合物可以包括如在此所描述的任何适合的取代的稠合环系统。这些化合物可以包含一个或多个(例如,数个)另外的环,并且除非另外说明,否则不限于具体数目的环。在一方面,双环化合物是一种类黄酮。在另一方面,双环化合物是一种任选取代的异类黄酮。在另一方面,双环化合物是一种任选取代的花色离子(flavylium ion),如一种任选取代的花色素或任选取代的花色素苷、或其衍生物。双环化合物的非限制性实例包括:表儿茶素、槲皮素、杨梅黄酮、紫衫叶素、堪非醇、桑色素、刺槐素、柚皮素、异鼠李素、芹黄素、矢车菊素、矢车菊素苷、黑豆多酚、花青素鼠李葡糖苷、或其盐或溶剂合物。
杂环化合物可以是如在此所描述的任何适合的化合物,如包含一个杂原子的一种任选取代的芳香族或非芳香族环。在一方面,杂环是包含一个任选取代的杂环烷基部分或一个任选取代的杂芳基部分的一种化合物。在另一方面,任选取代的杂环烷基部分或任选取代的杂芳基部分是一个任选取代的5元杂环烷基或一个任选取代的5元杂芳基部分。在另一方面,任选取代的杂环烷基或任选取代的杂芳基部分是选自以下各项的一个任选取代的部分:吡唑基、呋喃基、咪唑基、异噁唑基、噁二唑基、噁唑基、吡咯基、吡啶基、嘧啶基、哒嗪基、噻唑基、三唑基、噻吩基、二氢噻吩并-吡唑基、硫茚基、咔唑基、苯并咪唑基、苯并噻吩基、苯并呋喃基、吲哚基、喹啉基、苯并三唑基、苯并噻唑基、苯并噁唑基、苯并咪唑基、异喹啉基、异吲哚基、吖啶基、苯并异噁唑基、二甲基乙内酰脲、吡嗪基、四氢呋喃基、吡咯啉基、吡咯烷基、吗啉基、吲哚基、二氮杂环庚三烯基、氮杂环庚三烯基、硫杂环庚三烯基、哌啶基、以及氧杂环庚三烯基基。在另一方面,任选取代的杂环烷基部分或任选取代的杂芳基部分是一个任选取代的呋喃基。杂环化合物的非限制性实例包括:(1,2-二羟乙基)-3,4-二羟呋喃-2(5H)-酮、4-羟基-5-甲基-3-呋喃酮、5-羟基-2(5H)-呋喃酮、[1,2-二羟乙基]呋喃-2,3,4(5H)-三酮、α-羟基-γ-丁内酯、核糖酸γ-内酯、己醒糖酸γ-内酯(aldohexuronicaldohexuronic acidγ-lactone)、葡糖酸δ-内酯、4-羟基香豆素、二氢苯并呋喃、5-(羟甲基)糠醛、联糠醛、2(5H)-呋喃酮、5,6-二氢-2H-吡喃-2-酮、以及5,6-二氢-4-羟基-6-甲基-2H-吡喃-2-酮、或其盐或溶剂化物。
含氮化合物可以是具有一个或多个氮原子的任何适合的化合物。在一方面,含氮化合物包含一个胺、亚胺、羟胺、或氮氧化物部分。含氮化合物的非限制性实例包括:丙酮肟、紫尿酸、吡啶-2-醛肟、2-氨基苯酚、1,2-苯二胺、2,2,6,6-四甲基-1-哌啶基氧基、5,6,7,8-四氢生物蝶呤、6,7-二甲基-5,6,7,8-四氢蝶呤、以及马来酰胺酸、或其盐或溶剂化物。
醌化合物可以是如在此所描述的包含一个醌部分的任何适合的化合物。醌化合物的非限制性实例包括:1,4-苯醌、1,4-萘醌、2-羟基-1,4-萘醌、2,3-二甲氧基-5-甲基-1,4-苯醌或辅酶Q0、2,3,5,6-四甲基-1,4-苯醌或杜醌、1,4-二羟基蒽醌、3-羟基-1-甲基-5,6-吲哚啉二酮或肾上腺素红、4-叔丁基-5-甲氧基-1,2-苯醌、吡咯并喹啉醌、或其盐或溶剂化物。
含硫化合物可以是包括一个或多个硫原子的任何适合的化合物。在一个方面,含硫化合物包含一个选自以下各项的部分:亚硫酰基、硫醚、亚磺酰基、磺酰基、硫酰胺、磺酰胺、磺酸以及磺酸酯。含硫化合物的非限制性实例包括乙硫醇;2-丙硫醇;2-丙烯-1-硫醇;2-巯基乙磺酸;苯硫酚;苯-1,2-二硫醇;半胱氨酸;蛋氨酸;谷胱甘肽;胱氨酸;或其盐或溶剂化物。
在一方面,以上所描述的这种化合物对纤维素材料的有效量,作为与纤维素的葡糖基单元的摩尔比是约10-6至约10,例如,约10-6至约7.5、约10-6至约5、约10-6至约2.5、约10-6至约1、约10-5至约1、约10-5至约10-1、约10-4至约10-1、约10-3至约10-1、或约10-3至约10-2。在另一方面,以上所描述的这种化合物的有效量是约0.1μM至约1M,例如,约0.5μM至约0.75M、约0.75μM至约0.5M、约1μM至约0.25M、约1μM至约0.1M、约5μM至约50mM、约10μM至约25mM、约50μM至约25mM、约10μM至约10mM、约5μM至约5mM、或约0.1mM至约1mM。
术语“液剂(liquor)”意指在如在此所描述的条件下,由处理浆料中的木质纤维素和/或半纤维素材料、或其单糖(例如木糖、阿拉伯糖、甘露糖等)所产生的溶液相(水相、有机相抑或其组合)、以及其可溶性内容物。用于GH61多肽的纤维素分解增强的液剂可以通过,任选在催化剂(例如酸)的存在下、任选在有机溶剂的存在下、并且任选与物理破坏一种木质纤维素或半纤维素材料(或原料)组合,通过施加热和/或压力来对该材料进行处理,并且然后将溶液与残余固体分离来产生。这类条件确定在由纤维素酶制剂水解纤维素底物的过程中,通过液剂与GH61多肽的组合可获得的纤维素分解增强的程度。该液剂可以使用本领域中的标准方法(如过滤、沉积、或离心)与处理的材料分离。
在一方面,该液剂对纤维素的有效量是约10-6至约10g/g纤维素,例如,约10-6至约7.5g、约10-6至约5g、约10-6至约2.5g、约10-6至约1g、约10-5至约1g、约10-5至约10-1g、约10-4至约10-1g、约10-3至约10-1g、或约10-3至约10-2g/g纤维素。
在一方面,该一种或多种(例如,数种)半纤维素分解酶包含商业半纤维素分解酶制剂。适用于本发明的商业半纤维素分解酶制剂的实例包括:(例如)SHEARZYMETM(诺维信公司A/S)、HTec(诺维信公司A/S)、HTec2(诺维信公司A/S)、HTec3(诺维信公司A/S)、(诺维信公司A/S)、(诺维信公司A/S)、HC(诺维信公司A/S)、木聚糖酶(杰能科)、XY(杰能科)、XC(杰能科)、TX-200A(AB酶制剂公司(AB Enzymes))、HSP6000木聚糖酶(帝斯曼)、DEPOLTM333P(生物催化剂有限公司(Biocatalysts Limit),英国威尔士(Wales,UK))、DEPOLTM740L.(生物催化剂有限公司,英国威尔士)以及DEPOLTM762P(生物催化剂有限公司,英国威尔士)。
适用于本发明的方法的木聚糖酶的实例包括但不限于来自以下各项的木聚糖酶:棘孢曲霉(GeneSeqP:AAR63790;WO94/21785)、烟曲霉(WO2006/078256)、嗜松青霉菌(WO2011/041405)、青霉菌属种(WO2010/126772)、土生梭孢壳霉NRRL8126(WO2009/079210)、以及褐孢长毛盘菌GH10(WO2011/057083)。
适用于本发明的方法的β-木糖苷酶的实例包括但不限于来自以下各项的β-木糖苷酶:粗糙链孢菌(SwissProt登录号Q7SOW4)、里氏木霉(UniProtKB/TrEMBL登录号Q92458)、以及埃默森踝节菌(Talaromycesemersonii)(SwissProt登录号Q8X212)。
适用于本发明的方法的乙酰木聚糖酯酶的实例包括但不限于来自以下各项的乙酰木聚糖酯酶:棘孢曲霉(WO2010/108918)、球毛壳菌(Uniprot登录号Q2GWX4)、细毛壳菌(Chaetomium gracile)(GeneSeqP登录号AAB82124)、特异腐质霉DSM1800(WO2009/073709)、红褐肉座菌(Hypocrea jecorina)(WO2005/001036)、嗜热毁丝霉(WO2010/014880)、粗糙链孢菌(UniProt登录号q7s259)、颖枯壳针孢(Phaeosphaeria nodorum)(Uniprot登录号Q0UHJ1)、以及土生梭孢壳霉NRRL8126(WO2009/042846)。
适用于本发明的方法的阿魏酸酯酶(feruloyl esterase)(阿魏酸酯酶(ferulic acid esterase))的实例包括但不限于来自以下各项的阿魏酸酯酶:特异腐质霉DSM1800(WO2009/076122)、费希新萨托菌(Neosartoryafischeri)(UniProt登录号A1D9T4)、粗糙链孢菌(UniProt登录号Q9HGR3)、橘灰青霉菌(WO2009/127729)、以及土生梭孢壳霉(WO2010/053838和WO2010/065448)。
适用于本发明的方法的阿拉伯呋喃糖苷酶的实例包括但不限于来自以下各项的阿拉伯呋喃糖苷酶:黑曲霉(GeneSeqP登录号AAR94170)、特异腐质霉DSM1800(WO2006/114094和WO2009/073383)、以及巨多孔菌(M.giganteus)(WO2006/114094)。
适用于本发明的方法的α-葡糖醛酸糖苷酶的实例包括但不限于来自以下各项的α-葡糖醛酸糖苷酶:棒曲霉(Aspergillus clavatus)(UniProt登录号alccl2)、烟曲霉(SwissProt登录号Q4WW45)、黑曲霉(Uniprot登录号Q96WX9)、土曲霉(Aspergillus terreus)(SwissProt登录号Q0CJP9)、特异腐质霉(WO2010/014706)、橘灰青霉菌(WO2009/068565)、埃默森踝节菌(UniProt登录号Q8X211)、以及里氏木霉(Uniprot登录号Q99024)。
用于本发明的方法的具有酶活性的多肽可以通过在含有适合碳源和氮源以及无机盐的营养培养基上,使用本领域中已知的程序发酵上述微生物菌株来产生(参见,例如,班尼特·J.W.(Bennett,J.W.)和拉热·L.(LaSure,L.)(编辑),真菌中的更多基因操纵(More Gene Manipulations in Fungi),学术出版社,加利福尼亚州,1991)。适合的培养基可从商业供应商获得或可以根据公开的组成(例如,在美国典型培养物保藏中心的目录中)制备。适合用于生长和酶产生的温度范围和其他条件在本领域中是已知的(参见,例如,贝利·J.E.(Bailey,J.E.)和奥利斯·D.F.(Ollis,D.F.),生物化学工程基础(Biochemical Engineering Fundamentals),麦格劳-希尔图书公司(McGraw-Hill Book Company),纽约,1986)。
发酵可以是导致酶或蛋白质表达或分离的任何细胞培养方法。因此,发酵可以理解为包括在适合的培养基中并且在允许该酶表达或分离的条件下进行摇瓶培养,或在实验室或工业发酵罐中进行小规模或大规模发酵(包括连续发酵、分批发酵、进料分批发酵或固态发酵)。通过以上所描述的方法产生的所得酶可以从发酵培养基中回收并且通过常规程序纯化。
发酵。可以通过能够将糖直接或间接发酵成所希望的发酵产物的一种或多种(例如,数种)发酵微生物发酵从水解的纤维素材料获得的可发酵糖。“发酵”或“发酵方法”是指任何发酵方法或包括发酵步骤的任何方法。发酵方法还包括用于消费性醇工业(例如啤酒和葡萄酒)、乳品工业(例如发酵的乳制品)、皮革工业和烟草工业的发酵方法。发酵条件取决于所希望的发酵产物和发酵生物体,并且可以由本领域的技术人员容易地确定。
在发酵步骤中,预处理和酶水解步骤所导致的从纤维素材料释放的糖由发酵生物体(如酵母)发酵成一种产物,例如,乙醇。如上所述,水解(糖化)和发酵可以是分开的或同时的。
在实践本发明的发酵步骤中可以使用任何适合的水解的纤维素材料。通常基于所希望的发酵产物(即,要从发酵获得的物质)和所采用的方法来选择材料,如本领域中所熟知的。
术语“发酵培养基”在此可理解为指在添加一种或多种发酵微生物之前的培养基,如,由糖化过程产生的培养基,以及在同时糖化和发酵过程(SSF)中使用的培养基。
“发酵微生物”是指适合在所希望的发酵过程中使用以产生发酵产物的任何微生物,包括细菌生物体和真菌生物体。发酵生物体可以是己糖和/或戊糖发酵生物体、或其组合。己糖和戊糖发酵生物体二者均是本领域中所熟知的。适合的发酵微生物能够将糖(如葡萄糖、木糖、木酮糖、阿拉伯糖、麦芽糖、甘露糖、半乳糖、和/或寡糖)直接或间接地发酵(即,转化)成所希望的发酵产物。产生乙醇的细菌和真菌发酵生物体的实例由琳(Lin)等人,2006,应用微生物学与生物技术69:627-642描述。
能够发酵己糖的发酵微生物的实例包括细菌生物体和真菌生物体,如酵母。优选酵母包括以下各项的菌株:假丝酵母属、克鲁维酵母属、以及酵母菌属,例如萨纳瑞西斯假丝酵母(Candida sonorensis)、马克斯克鲁维酵母、以及酿酒酵母。
能够以其天然状态发酵戊糖的发酵生物体的实例包括细菌生物体和真菌生物体,如一些酵母。优选的木糖发酵酵母包括假丝酵母属菌株,优选休哈塔假丝酵母(C.sheatae)或萨纳瑞西斯假丝酵母;和毕赤酵母属菌株,优选树干毕赤酵母(P.stipitis),如树干毕赤酵母CBS5773。优选的戊糖发酵酵母包括管囊酵母属(Pachysolen)菌株,优选嗜鞋管囊酵母(P.tannophilus)。不能发酵戊糖(如木糖和阿拉伯糖)的生物体可以通过本领域已知方法来进行遗传修饰而发酵戊糖。
能够有效地将己糖和戊糖发酵成乙醇的细菌的实例包括,例如,凝结芽孢杆菌、丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)、热纤维梭菌(Clostridiumthermocellum)、phytofermentans梭菌(Clostridium phytofermentans)、土芽孢杆菌属种、解糖热厌氧杆菌(Thermoanaerobacter saccharolyticum)、以及运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)(菲利皮迪斯,1996,见上文)。
其他发酵生物体包括以下各项的菌株:芽孢杆菌属,如凝结芽孢杆菌;假丝酵母属,如萨纳瑞西斯假丝酵母、C.methanosorbosa、迪丹斯假丝酵母(C.diddensiae)、近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)、C.naedodendra、布朗克假丝酵母(C.blankii)、嗜虫假丝酵母(C.entomophilia)、芸薹假丝酵母(C.brassicae)、假热带假丝酵母(C.pseudotropicalis)、博伊丁假丝酵母(C.boidinii)、产朊假丝酵母(C.utilis)、以及休哈塔假丝酵母;梭菌属,如丙酮丁醇梭菌、热纤维梭菌、以及C.phytofermentans;大肠杆菌,特别是已被遗传修饰以改善乙醇产率的大肠杆菌菌株;土芽孢杆菌属种;汉逊酵母属,如异常汉逊酵母(Hansenula anomala);克雷伯氏菌属(Klebsiella),如产酸克雷伯氏菌(K.oxytoca);克鲁维酵母属,如马克斯克鲁维酵母(K.marxianus)、乳酸克鲁维酵母(K.lactis)、耐热克鲁维酵母(K.thermotolerans)、以及脆壁克鲁维酵母(K.fragilis);裂殖酵母属,如粟酒裂殖酵母(S.pombe);热厌氧杆菌属(Thermoanaerobacter),如解糖热厌氧杆菌、以及发酵单胞菌属(Zymomonas),如运动发酵单胞菌。
在一个优选方面,酵母是酒香酵母属(Bretannomyces)。在一个更优选方面,酵母是克劳森酒香酵母(Bretannomyces clausenii)。在另一个优选方面,酵母是假丝酵母。在另一个更优选方面,酵母是萨纳瑞西斯假丝酵母。在另一个更优选方面,酵母是博伊丁假丝酵母。在另一个更优选方面,酵母是布朗克假丝酵母。在另一个更优选方面,酵母是芸薹假丝酵母。在另一个更优选方面,酵母是迪丹斯假丝酵母。在另一个更优选方面,酵母是嗜虫假丝酵母。在另一个更优选方面,酵母是假热带假丝酵母。在另一个更优选方面,酵母是休哈塔假丝酵母。在另一个更优选方面,酵母是产朊假丝酵母。在另一个优选方面,酵母是棒孢酵母属(Clavispora)。在另一个更优选方面,酵母是葡萄牙棒孢酵母(Clavispora lusitaniae)。在另一个更优选方面,酵母是仙人掌棒孢酵母(Clavispora opuntiae)。在另一个优选方面,酵母是克鲁维酵母属。在另一个更优选方面,酵母是脆壁克鲁维酵母。在另一个更优选方面,酵母是马克斯克鲁维酵母。在另一个更优选方面,酵母是耐热克鲁维酵母。在另一个优选方面,酵母是管囊酵母属。在另一个更优选方面,酵母是嗜鞋管囊酵母。在另一个优选方面,酵母是毕赤酵母属。在另一个优选方面,酵母是树干毕赤酵母。在另一个优选方面,酵母是酵母属种。在另一个更优选方面,酵母是酿酒酵母。在另一个更优选方面,酵母是糖化酵母(Saccharomyces distaticus)。在另一个更优选方面,酵母是葡萄汁酵母(Saccharomyces uvarum)。
在一个优选方面,细菌是芽孢杆菌属。在一个更优选方面,细菌是凝结芽孢杆菌。在另一个优选方面,细菌是梭菌属。在另一个更优选方面,细菌是丙酮丁醇梭菌。在另一个更优选方面,细菌是Clostridium phytofermentans。在另一个更优选方面,细菌是热纤维梭菌。在另一个更优选方面,细菌是土芽孢杆菌属种。在另一个更优选方面,细菌是热厌氧杆菌属。在另一个更优选方面,细菌是解糖热厌氧杆菌。在另一个优选方面,细菌是发酵单胞菌属。在另一个更优选方面,细菌是运动发酵单胞菌。
适用于乙醇产生的可商购的酵母包括,例如,BIOFERMTMAFT和XR(NABC-北美生物产品基团(North American Bioproducts Corporation),美国佐治亚州(GA,USA))、ETHANOL REDTM酵母(弗曼迪斯/乐斯福(Fermentis/Lesaffre),美国)、FALITM(菲氏酵母(Fleischmann’s Yeast),美国)、FERMIOLTM(帝斯曼配料部(DSM Specialties))、GERT STRANDTM(Gert Strand AB,瑞士(Sweden))、以及SUPERSTARTTM和THERMOSACCTM新鲜酵母(乙醇技术(Ethanol Technology),美国威斯康辛州(WI,USA))。
在一个优选方面,发酵微生物已经经过遗传修饰,以提供发酵戊糖的能力,如利用木糖的微生物、利用阿拉伯糖的微生物、以及共同利用木糖和阿拉伯糖的微生物。
将异源基因克隆到多种发酵微生物中已经构建出能够将己糖和戊糖转化成乙醇(共发酵)的生物体(陈(Chen)和霍(Ho),1993,酿酒酵母中毕赤酵母木糖还原酶基因的克隆和改善表达(Cloning and improving theexpression of Pichia stipitis xylose reductase gene in Saccharomyces cerevisiae),应用生物化学与生物技术(Appl.Biochem.Biotechnol.)39-40:135-147;霍等人,1998,能够有效共发酵葡萄糖和木糖的遗传工程化的酵母菌属酵母(Genetically engineered Saccharomyces yeast capable of effectivelycofermenting glucose and xylose),应用与环境微生物学64:1852-1859;科特(Kotter)和西拉塞(Ciriacy),1993,酿酒酵母发酵木糖(Xylose fermentationby Saccharomyces cerevisiae),应用微生物学与生物技术(Appl.Microbiol.Biotechnol.)38:776-783;维尔福森(Walfridsson)等人,1995,过表达编码戊糖磷酸途径酶转酮醇酶和转醛醇酶的TKL1和TAL1基因的木糖代谢酿酒酵母菌株(Xylose-metabolizing Saccharomyces cerevisiae strainsoverexpressing the TKL1and TAL1genes encoding the pentose phosphatepathway enzymes transketolase and transaldolase),应用与环境微生物学61:4184-4190;凯珀(Kuyper)等人,2004,用于有效厌氧木糖发酵的酿酒酵母的最小代谢工程化:原理的证实(Minimal metabolic engineering ofSaccharomyces cerevisiae for efficient anaerobic xylose fermentation:a proof ofprinciple),欧洲微生物学会联合会酵母研究(FEMS Yeast Research)4:655-664;比尔(Beall)等人,1991,通过重组大肠杆菌从木糖和其他糖产生乙醇的参数研究(Parametric studies of ethanol production from xylose andother sugars by recombinant Escherichia coli),生物技术与生物工程(Biotech.Bioeng.)38:296-303;英格拉姆(Ingram)等人,1998,用于乙醇产生的细菌的代谢工程化(Metabolic engineering of bacteria for ethanol production),生物技术与生物工程58:204-214;张(Zhang)等人,1995,产生乙醇的运动发酵单胞菌中戊糖代谢途径的代谢工程化(Metabolic engineering of a pentosemetabolism pathway in ethanologenic Zymomonas mobilis),科学(Science)267:240-243;狄安妲(Deanda)等人,1996,通过代谢途径工程化开发发酵阿拉伯糖的运动发酵单胞菌菌株(Development of an arabinose-fermentingZymomonas mobilis strain by metabolic pathway engineering),应用与环境微生物学62:4465-4470;WO2003/062430,木糖异构酶)。
在一个优选方面,遗传修饰的发酵微生物是萨纳瑞西斯假丝酵母。在另一个优选方面,遗传修饰的发酵微生物是大肠杆菌。在另一个优选方面,遗传修饰的发酵微生物是产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)。在另一个优选方面,遗传修饰的发酵微生物是马克斯克鲁维酵母。在另一个优选方面,遗传修饰的发酵微生物是酿酒酵母。在另一个优选方面,遗传修饰的发酵微生物是运动发酵单胞菌。
本领域中熟知的是,以上所描述的生物体还可以用于产生其他物质,如在此所描述。
典型地向降解的纤维素材料或水解物中添加发酵微生物,并且进行发酵持续约8至约96小时,例如约24至约60小时。温度典型地在约26℃至约60℃之间,例如约32℃或50℃,并且pH为约pH3至约pH8,例如pH4至5、6、或7。
在一方面,对降解的纤维素材料施用酵母和/或另一种微生物,并且进行发酵持续约12至约96小时,如典型地24至60小时。在另一方面,温度优选在约20℃至约60℃之间,例如约25℃至约50℃、约32℃至约50℃、或约32℃至约50℃,并且pH通常是从约pH3至约pH7,例如约pH4至约pH7。然而,一些发酵生物体(例如细菌)具有更高的最适发酵温度。酵母或另一种微生物优选以每ml发酵液大约105至1012,优选从大约107至1010,特别是大约2×108个活细胞计数的量施用。关于使用酵母进行发酵的进一步指南可以见于例如“醇教材”(“The Alcohol Textbook”)(K·雅克(K.Jacques)、T.P.里昂(T.P.Lyons)以及D.R.凯尔索尔(D.R.Kelsall)编辑,诺丁汉大学出版社(Nottingham University Press),联合王国(UnitedKingdom)1999),其通过引用结合在此。
发酵刺激剂可以与在此所描述的任何方法组合使用,以进一步改进发酵方法,特别是改进发酵微生物的性能,如,提高速度和乙醇产率。“发酵刺激剂”是指用于发酵微生物(特别是酵母)生长的刺激剂。用于生长的优选发酵刺激剂包括维生素和矿物质。维生素的实例包括多种维生素、生物素、泛酸、烟酸、内消旋肌醇、硫胺、吡哆醇、对氨基苯酸、叶酸、核黄素、以及维生素A、B、C、D和E,例如参见阿尔弗雷多(Alfenore)等人,通过在进料分批方法过程中的一种维生素进料策略改进乙醇产生和酿酒酵母的存活力(Improving ethanol production and viability of Saccharomyces cerevisiaby a vitamin feeding strategy during fed-batch process),施普林格(2002),其特此通过引用结合。矿物质的实例包括可以提供含P、K、Mg、S、Ca、Fe、Zn、Mn以及Cu的营养素的矿物质和矿物盐。
发酵产物:发酵产物可以是由发酵得到的任何物质。发酵产物可以是而不限于:醇(例如,阿拉伯糖醇、正丁醇、异丁醇、乙醇、甘油、甲醇、乙二醇、1,3-丙二醇(丙二醇)、丁二醇、丙三醇、山梨糖醇、以及木糖醇);烷烃(例如戊烷、己烷、庚烷、辛烷、壬烷、癸烷、十一烷、以及十二烷);环烷烃(例如,环戊烷、环己烷、环庚烷、以及环辛烷);烯烃(例如,戊烯、己烯、庚烯、以及辛烯);氨基酸(例如,天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、赖氨酸、丝氨酸、以及苏氨酸);气体(例如,甲烷、氢气(H2)、二氧化碳(CO2)、以及一氧化碳(CO));异戊二烯;酮(例如,丙酮);有机酸(例如,乙酸、醋酮酸、己二酸、抗坏血酸、柠檬酸、2,5-二酮-D-葡糖酸、甲酸、富马酸、葡糖二酸、葡糖酸、葡糖醛酸、戊二酸、3-羟基丙酸、衣康酸、乳酸、苹果酸、丙二酸、草酸、草酰乙酸、丙酸、琥珀酸、以及木糖酸);以及聚酮化合物。发酵产物还可以是作为高价值产品的蛋白质。
在一个优选方面,发酵产物是一种醇。应理解的是,术语“醇”涵盖包含一个或多个羟基部分的物质。在一个更优选方面,该醇是正丁醇。在另一个更优选方面,该醇是异丁醇。在另一个更优选方面,该醇是乙醇。在另一个更优选方面,该醇是甲醇。在另一个更优选方面,该醇是阿拉伯糖醇。在另一个更优选方面,该醇是丁二醇。在另一个更优选方面,该醇是乙二醇。在另一个更优选方面,该醇是丙三醇。在另一个更优选方面,该醇是甘油。在另一个更优选方面,该醇是1,3-丙二醇。在另一个更优选方面,该醇是山梨糖醇。在另一个更优选方面,该醇是木糖醇。参见,例如,贡·C.S.、卡奥·N.J.、杜·J.、以及曹·G.T.,1999,由可再生资源生产乙醇,生物化学工程/生物技术的进展,舍佩尔·T.编辑,施普林格,德国海德堡柏林,65:207-241;西尔韦拉·M.M.(Silveira,M.M.)和乔纳斯·R.(Jonas,R.),2002,山梨糖醇的生物技术生产(The biotechnological production of sorbitol),应用微生物学与生物技术59:400-408;尼加姆·P.(Nigam,P.)和辛格·D.,1995,用于木糖醇-一种糖替代品的发酵产生工艺(Processes for fermentativeproduction of xylitol–a sugar substitute),加工生物化学(ProcessBiochemistry)30(2):117-124;伊泽吉·T.C.(Ezeji,T.C.)、库雷希·N.(Qureshi,N.)和布拉舍克·H.P.(Blaschek,H.P.),2003,通过拜季林斯基羧菌BA101生产丙酮、丁醇和乙醇并且通过气提原位回收(Production of acetone,butanoland ethanol by Clostridium beijerinckii BA101and in situ recovery by gasstripping),微生物与生物技术世界杂志(World Journal of Microbiology andBiotechnology)19(6):595-603。
在另一个优选方面,发酵产物是一种烷烃。该烷烃可以是非支链或支链烷烃。在另一个更优选方面,该烷烃是戊烷。在另一个更优选方面,该烷烃是己烷。在另一个更优选方面,该烷烃是庚烷。在另一个更优选方面,该烷烃是辛烷。在另一个更优选方面,该烷烃是壬烷。在另一个更优选方面,该烷烃是癸烷。在另一个更优选方面,该烷烃是十一烷。在另一个更优选方面,该烷烃是十二烷。
在另一个优选方面,发酵产物是一种环烷烃。在另一个更优选方面,该环烷烃是环戊烷。在另一个更优选方面,该环烷烃是环己烷。在另一个更优选方面,该环烷烃是环庚烷。在另一个更优选方面,该环烷烃是环辛烷。
在另一个优选方面,发酵产物是一种烯烃。该烯烃可以是非支链或支链烯烃。在另一个更优选方面,该烯烃是戊烯。在另一个更优选方面,该烯烃是己烯。在另一个更优选方面,该烯烃是庚烯。在另一个更优选方面,该烯烃是辛烯。
在另一个优选方面,发酵产物是一种氨基酸。在另一个更优选方面,该有机酸是天冬氨酸。在另一个更优选方面,该氨基酸是谷氨酸。在另一个更优选方面,该氨基酸是甘氨酸。在另一个更优选方面,该氨基酸是赖氨酸。在另一个更优选方面,该氨基酸是丝氨酸。在另一个更优选方面,该氨基酸是苏氨酸。参见,例如,理查德·A.(Richard,A.)和马加里蒂斯·A.(Margaritis,A.),2004,用于聚(谷氨酸)产生和其他微生物生物聚合物的分批发酵动力学的经验模型(Empirical modeling of batch fermentation kinetics forpoly(glutamic acid)production and other microbial biopolymers),生物技术与生物工程87(4):501-515。
在另一个优选方面,发酵产物是一种气体。在另一个更优选方面,该气体是甲烷。在另一个更优选方面,该气体是H2。在另一个更优选方面,该气体是CO2。在另一个更优选方面,该气体是CO。参见,例如,片冈·N.(Kataoka,N.)、A·米亚(A.Miya)、以及K·桐山(K.Kiriyama),1997,关于通过产氢厌氧细菌连续培养系统产生氢气的研究(Studies on hydrogenproduction by continuous culture system of hydrogen-producing anaerobicbacteria),水科学与技术(Water Science and Technology)36(6-7):41-47;以及古那森兰·V.N.(Gunaseelan V.N.),生物质与生物能源(Biomass andBioenergy),第13(1-2)卷,第83-114页,1997,用于甲烷生产的生物质的厌氧消化:综述(Anaerobic digestion of biomass for methane production:Areview)。
在另一个优选方面,发酵产物是异戊二烯。
在另一个优选方面,发酵产物是一种酮。应理解的是,术语“酮”涵盖包含一个或多个酮部分的物质。在另一个更优选方面,该酮是丙酮。参见,例如,库雷希和布拉舍克,2003,见上文。
在另一个优选方面,发酵产物是有机酸。在另一个更优选方面,该有机酸是乙酸。在另一个更优选方面,该有机酸是醋酮酸。在另一个更优选方面,该有机酸是己二酸。在另一个更优选方面,该有机酸是抗坏血酸。在另一个更优选方面,该有机酸是柠檬酸。在另一个更优选方面,该有机酸是2,5-二酮-D-葡糖酸。在另一个更优选方面,该有机酸是甲酸。在另一个更优选方面,该有机酸是富马酸。在另一个更优选方面,该有机酸是葡糖二酸。在另一个更优选方面,该有机酸是葡糖酸。在另一个更优选方面,该有机酸是葡糖醛酸。在另一个更优选方面,该有机酸是戊二酸。在另一个更优选方面,该有机酸是3-二羟基丙酸。在另一个更优选方面,该有机酸是衣康酸。在另一个更优选方面,该有机酸是乳酸。在另一个更优选方面,该有机酸是苹果酸。在另一个更优选方面,该有机酸是丙二酸。在另一个更优选方面,该有机酸是草酸。在另一个更优选方面,该有机酸是丙酸。在另一个更优选方面,该有机酸是琥珀酸。在另一个更优选方面,该有机酸是木糖酸。参见,例如,陈·R.(Chen,R.)和李·Y.Y.,1997,用于由纤维素生物质产生乳酸的膜介导的萃取发酵(Membrane-mediated extractive fermentation for lactic acidproduction from cellulosic biomass),应用生物化学与生物技术63-65:435-448。
在另一个优选方面,发酵产物是聚酮化合物。
回收。可以使用本领域已知的任何方法,任选地从发酵培养基中回收发酵产物,这些方法包括但不限于:色谱法、电泳程序、差别溶解度、蒸馏、或萃取。例如,通过常规蒸馏方法从发酵的纤维素材料中分离和纯化醇。可以获得纯度高达约96体积%的乙醇,其可以用作(例如)燃料乙醇、饮用乙醇,即,饮用中性酒、或工业乙醇。
植物
本发明还涉及植物,例如,转基因植物、植物部分、或植物细胞,这些植物包含本发明的多核苷酸,以便以可回收的量表达和产生纤维二糖水解酶变体。该变体可以从植物或植物部分回收。可替代地,含有该变体的植物或植物部分可以按原样用于改善食品或进料的质量,例如,改善营养价值、可口性、以及流变性能,或用以破坏抗营养因子。
转基因植物可以是双子叶的(双子叶植物)或单子叶的(单子叶植物)。单子叶植物的实例是草,如草甸草(蓝草,早熟禾属);饲草,如羊茅属(Festuca)、黑麦草属(Lolium);温带草,如翦股颖属(Agrostis);以及谷类,例如小麦、燕麦、黑麦、大麦、稻、高粱、以及玉蜀黍(玉米)。
双子叶植物的实例是烟草、豆类(如羽扇豆、马铃薯、糖甜菜(sugar beet)、豌豆、豆和大豆)、以及十字花科植物(十字花科(family Brassicaceae))(如花椰菜、油菜籽、以及紧密相关的模式生物体拟南芥)。
植物部分的实例是茎、愈伤组织、叶、根、果实、种子、以及块茎、连同包含这些部分的独立组织,例如,表皮、叶肉、薄壁组织、维管组织、分生组织。特定的植物细胞区室,如叶绿体、质外体、线粒体、液泡、过氧化物酶体以及细胞质也被认为是植物部分。此外,任何植物细胞,无论是何种组织来源,都被认为是植物部分。同样地,植物部分,如分离以有助于本发明的利用的特定组织和细胞也被认为是植物部分,例如胚、胚乳、糊粉和种皮。
同样包含于本发明范围内的是这类植物、植物部分以及植物细胞的子代。
表达变体的转基因植物或植物细胞可以根据本领域已知的方法来构建。简而言之,通过如下方法构建该植物或植物细胞:将编码变体的一个或多个表达构建体并入到植物宿主基因组或叶绿体基因组中,并且使所得的修饰植物或植物细胞繁殖为转基因植物或植物细胞。
表达构建体宜为包含编码变体的多核苷酸的核酸构建体,该多核苷酸与在选择的植物或植物部分中表达该多核苷酸所需的适当的调控序列可操作地连接。而且,表达构建体可包含用于鉴别整合了此表达构建体的植物细胞的选择性标记,和将此构建体引入所讨论的植物所必需的DNA序列(后者取决于所用引入DNA的方法)。
例如,根据希望在何时、何处、以及如何表达多肽来选择调控序列,如启动子和终止子序列和任选的信号或转运序列。例如,编码变体的基因的表达可以是组成型的或诱导型的,或可以是发育、阶段或组织特异性的,并且可以使基因产物靶向特定组织或植物部分,如种子或叶。调控序列由例如塔格(Tague)等人,1988,植物生理学(Plant Physiology)86:506描述。
对于组成型表达,可以使用35S-CaMV、玉米泛素1、或稻肌动蛋白1启动子(弗兰克(Franck)等人,1980,细胞(Cell)21:285-294;克里斯滕森等人,1992,植物分子生物学(Plant Mol.Biol.)18:675-689;张(Zhang)等人,1991,植物细胞(Plant Cell)3:1155-1165)。器官特异性启动子可以是例如:来自贮藏库组织(storage sink tissue)(如种子、马铃薯块茎、以及果实)的启动子(爱德华兹(Edwards)和科鲁兹(Coruzzi),1990,遗传学年评(Ann.Rev.Genet.)24:275-303);或来自代谢库组织(如分生组织)的启动子(伊托(Ito)等人,1994,植物分子生物学24:863-878);种子特异性启动子,如来自稻的谷蛋白、醇溶蛋白、球蛋白、或白蛋白启动子(吴(Wu)等人,1998,植物细胞生理学(Plant Cell Physiol.)39:885-889);来自豆球蛋白B4和蚕豆的未知种子蛋白基因的蚕豆启动子(康拉德(Conrad)等人,1998,植物生理学杂志(J.Plant Physiol.)152:708-711);来自种子油体蛋白的启动子(陈(Chen)等人,1998,植物细胞生理学39:935-941);来自欧洲油菜(Brassica napus)的贮藏蛋白napA启动子;或本领域已知的任何其他种子特异性启动子,例如,如在WO91/14772中所描述。此外,启动子可以是叶特异性启动子,如来自稻或番茄的rbcs启动子(京冢(Kyozuka)等人,1993,植物生理学102:991-1000)、小球藻病毒腺嘌呤甲基转移酶基因启动子(麦卓(Mitra)和希金斯(Higgins),1994,植物分子生物学26:85-93)、来自稻的aldP基因启动子(加贺屋(Kagaya)等人,1995,分子遗传学与基因组学(Mol.Gen.Genet.)248:668-674)、或伤口诱导型启动子(如马铃薯pin2启动子)(许(Xu)等人,1993,植物分子生物学22:573-588)。同样地,启动子可以通过非生物处理,如温度、干旱、或盐度变化来诱导,或通过外源施加的激活启动子的物质,例如乙醇、雌激素、植物激素(如乙烯、脱落酸、以及赤霉酸)、以及重金属来诱导。
还可以使用启动子增强子元件来在该植物中实现变体的更高表达。例如,启动子增强子元件可以是放置在启动子与编码变体的多核苷酸之间的内含子。例如,许等人,1993,同上文,披露了使用稻肌动蛋白1基因的第一内含子来增强表达。
选择性标记基因和表达构建体的任何其他部分可以选自本领域种可用的那些。
核酸构建体是根据本领域已知的常规技术并入到植物基因组中,这些常规技术包括:农杆菌介导的转化、病毒介导的转化、显微注射、粒子轰击、基因枪转化、以及电穿孔(盖瑟(Gasser)等人,1990,科学244:1293;波特里库斯(Potrykus),1990,生物/技术(Bio/Technology)8:535;岛本(Shimamoto)等人,1989,自然(Nature)338:274)。
目前根癌农杆菌介导的基因转移是一种用于产生转基因双子叶植物(关于综述,请参见霍伊卡(Hooykas)和施尔伯鲁特(Schilperoort),1992,植物分子生物学19:15-38)并且用于转化单子叶植物的方法,但对于这些植物还常常使用其他的转化方法。用于产生转基因单子叶植物的方法是粒子(涂覆有转化DNA的微观金或钨粒子)轰击胚愈伤组织或发育中的胚(克里斯托(Christou),1992,植物杂志(Plant J.)2:275-281;岛本,1994,生物技术当前述评(Curr.Opin.Biotechnol.)5:158-162;瓦西尔(Vasil)等人,1992,生物/技术10:667-674)。用于转化单子叶植物的替代方法是基于原生质体转化,如由奥米儒勒(Omirulleh)等人,1993,植物分子生物学21:415-428所描述。另外的转化方法包括在美国专利号6,395,966和7,151,204中所描述的那些(这两个专利均通过引用以其全文结合在此)。
转化之后,根据本领域熟知的方法对已经并入表达构建体的转化体进行选择并且使其再生成为完整植物。通常转化程序被设计成通过使用例如用两种分开的T-DNA构建体共转化或通过特异性重组酶进行的选择基因的位点特异性切除,在再生期间或在后代中选择性清除选择基因。
除用本发明的构建体直接转化具体植物基因型之外,还可以通过使具有构建体的植物与缺乏该构建体的第二植物杂交来产生转基因植物。例如,可以通过杂交将编码变体的构建体引入具体植物品种中,而无需总是直接地转化该给定品种的植物。因此,本发明不仅涵盖从根据本发明已经转化的细胞直接再生的植物,而且还涵盖这类植物的子代。如在此所使用,子代可以指根据本发明制备的亲本植物的任何代的后代。这种子代可以包括根据本发明制备的DNA构建体。杂交导致通过起始系与供体植物系交叉授粉而将转基因引入植物系中。这类步骤的非限制性实例在美国专利号7,151,204中描述。
可以通过回交转化方法产生植物。例如,植物包括被称为回交转化的基因型、系、近交种、或杂交种的植物。
可以使用遗传标记来辅助本发明的一种或多种转基因从一种遗传背景渗入到另一种遗传背景中。相对于常规育种,标记辅助选择提供了很多优点,优点在于它可以用于避免由表型变异引起的错误。另外,遗传标记可以提供关于具体杂交的个别子代中优良种质的相对程度的数据。例如,当具有所希望性状并且另外具有非农艺学所希望的遗传背景的植物与一种优良亲本杂交时,可以使用遗传标记来选择不仅具有感兴趣的性状,而且还具有相对较大比例的所希望的种质的子代。以此方式,使一种或多种性状渗入特定遗传背景所需的世代数最小化。
本发明还涉及产生本发明的变体的方法,这些方法包括:(a)在有益于产生该变体的条件下培养包含编码该变体的多核苷酸的一种转基因植物或一种植物细胞;并且任选地(b)回收该变体。
通过以下实例进一步描述本发明,这些实例不应被解释为限制本发明的范围。
实例
菌株
使用嗜热真菌丝衣霉状篮状菌CBS413.71作为纤维二糖水解酶基因的来源。使用米曲霉MT3568作为嗜热真菌丝衣霉状篮状菌CBS413.71纤维二糖水解酶的表达宿主。米曲霉MT3568是米曲霉JaL355的amdS(乙酰胺酶)基因被破坏的衍生物(WO2002/40694),其中pyrG营养缺陷型在敲除米曲霉amdS基因的过程中恢复。米曲霉菌株JaL250(WO99/61651)用作纤维二糖水解酶变体的表达宿主。
培养基和试剂
PDA板由39克马铃薯右旋糖琼脂和加至1升的去离子水组成。
2XYT板由以下各项组成:16g的胰蛋白胨、10g的酵母萃取物、5g的NaCl、15g的细菌培养用琼脂(Bacto agar)、以及加至1升的去离子水。
MDU2BP培养基由以下各项组成:45g的麦芽糖、1g的MgSO4·7H2O、1g的NaCl、2g的K2SO4、12g的KH2PO4、7g的酵母萃取物、2g的尿素、0.5ml的AMG痕量金属溶液、以及加至1升的去离子水;pH至5.0。
AMG痕量金属溶液由以下各项组成:14.3g的ZnSO4·7H2O、2.5g的CuSO4·5H2O、0.5g的NiCl2·6H2O、13.8g的FeSO4·7H2O、8.5g的MnSO4·H2O、3g的柠檬酸、以及加至1升的去离子水。
TAE缓冲液由以下各项组成:4.84g的Tris碱、1.14ml的冰醋酸、2ml的0.5M EDTA(pH8.0)、以及加至1升的去离子水。
实例1:来自嗜热真菌丝衣霉状篮状菌CBS413.71的基因组DNA的纤维二糖水解酶基因的PCR扩增
在一种两步法中通过PCR扩增来自嗜热真菌丝衣霉状篮状菌CBS413.71的基因组DNA的一种纤维二糖水解酶基因。首先,使用简并引物对基因的中心片段进行扩增,这些简并引物被设计来匹配编码已知家族GH6纤维二糖水解酶的基因中的序列的两个保守区。在扩增内部片段之后,确定该片段的序列并且使用该序列来设计用于基因在5'和3'两个方向上步移的特异性引物以获得完整编码序列。
使用以下所示的简并引物859和860以一种渐降式(touch-down)PCR方案对内部基因片段进行扩增,在该方案中初始退火温度67℃在每个逐次循环中降低1℃,总计10个循环,直到达到57℃的退火温度。然后以利用57℃退火温度的另外29个循环完成扩增。
引物859:
tkccygaycgygaytgygc(SEQ ID NO:71)
引物860:
tcrccacckggcttkaycca(SEQ ID NO:72)
使用REDDYMIXTMPCR Master Mix(ABgene有限公司,埃普索姆(Epsom),英国)进行扩增。扩增反应液由以下各项组成:1μl的嗜热真菌丝衣霉状篮状菌CBS413.71基因组DNA作为模板、各为50皮摩尔的引物859和引物860、以及12.5μl的REDDYMIXTMPCR Master Mix,最终体积为25μl。使用SPIN土壤试剂盒(Qbiogene公司,美国加利福利亚州卡尔巴斯德(Carlsbad))的方案从新鲜菌丝体萃取嗜热真菌丝衣霉状篮状菌基因组DNA。在一个热循环仪中进行扩增,该热循环仪被编程为:94℃下的起始模板变性步骤,持续2分钟;11个循环的在94℃下变性45秒、在67℃下退火45秒(其中每个后续循环降低1℃)、以及在72℃下伸长1分钟;以及29个循环的在94℃下变性45秒、在57℃下退火45秒、以及在72℃下延伸1分钟。在72℃下进行最终伸长,持续7分钟。
使用TAE缓冲液通过1%琼脂糖凝胶电泳对反应产物进行解析,其中观察到大约700-800bp的PCR产物带。将该带从该凝胶切下,并且使用ILLUSTRATM GFXTM PCR DNA和凝胶带纯化试剂盒(通用电气医疗集团(GE Healthcare),小查尔方特(Little Chalfont),英国)对DNA进行纯化。根据制造商的说明书,使用TA 试剂盒(英杰(Invitrogen),美国生命技术公司(Life Technologies),美国加利福利亚州卡尔巴斯德)将纯化的PCR片段克隆至载体(英杰,美国生命技术公司,美国加利福利亚州卡尔巴斯德)中,并且接着根据制造商的说明书将其转化到化学感受态大肠杆菌细胞(英杰,美国生命技术公司,美国加利福利亚州卡尔巴斯德)中。
直接用引物859和引物860并且通过用以下所示的M13正向载体引物和M13反向载体引物对PCR产物的4个单独克隆进行测序来确定该PCR产物的序列。
M13正向:
TGTAAAACGACGGCCAGT(SEQ ID NO:73)
M13反向:
AGCGGATAACAATTTCACACAGG(SEQ ID NO:74)
使用BLAST搜索工具(阿尔丘尔(Altschul)等人,1990,分子生物学杂志215:403-410)将该序列与已知序列进行比较,并且该序列被确认为与已知的纤维二糖水解酶编码基因相似。
使用嗜热真菌丝衣霉状篮状菌纤维二糖水解酶基因的部分序列来设计以下所示的基因特异性引物934、935、1044、以及1045,以使得基因能够从该序列的两端步移。
引物934:
AGAGTCTCGTCTCAGTACATG(SEQ ID NO:75)
引物935:
CGAATACGTCACCAGCCAC(SEQ ID NO:76)
引物1044:
AATTGCTGAGCTGTTTCAGC(SEQ ID NO:77)
引物1045:
TGACTGGTGCAACGTGATCG(SEQ ID NO:78)
基于制造商的方案,在一些较小差异的情况下使用DNA步移SPEEDUPTM预混合试剂盒(Seegene,韩国首尔(Seoul,Korea))来进行基因步移。仅利用该方案中所描述的前两组PCR反应,这两组PCR反应包括:用基因特异性引物和四种不同的返回引物进行的头一组扩增,和用第二基因特异性引物进行的一组巢式(nested)反应。使用所推荐的反应体积的一半用于第一组反应。
对于在5’方向上的基因步移来说,用基因特异性引物934来进行第一组PCR反应。在扩增之后,反应用150μl的水进行稀释,并且使用5μl的稀释液作为用基因特异性引物935进行的第二组巢式PCR反应中的模板。如由DNA步移SPEEDUPTM预混合试剂盒方案所描述以58℃退火温度进行第二组扩增。使用TAE缓冲液通过1%琼脂糖凝胶电泳对反应产物进行解析,其中在四个巢式反应中的一个中观察到大约1000bp的模糊单一带。将该1000bp片段再扩增两次,首先通过使用1μl的反应液,包括1000bp产物作为模板重复巢式PCR反应。使用TAE缓冲液通过1%琼脂糖凝胶电泳对反应产物进行解析,并且通过用移液管尖端从该凝胶去除一小片的1000bp带来从此反应进行第二再扩增,该1000bp带在相同条件下的PCR反应中用作模板。使用TAE缓冲液通过1%琼脂糖凝胶电泳对反应产物进行解析,并且将该1000bp带从该凝胶切下,并且使用ILLUSTRATM GFXTM PCR DNA和凝胶带纯化试剂盒对DNA进行纯化。使用引物935来确定该PCR产物的序列。
对于在3’方向上的基因步移来说,用基因特异性引物1044来进行第一组PCR反应。在扩增之后,反应用150μl的水进行稀释,并且使用5μl的稀释液作为用基因特异性引物1045进行的第二组巢式PCR反应中的模板。如由DNA步移SPEEDUPTM预混合试剂盒方案所描述以56℃退火温度进行第二组扩增。将反应产物使用ILLUSTRATM GFXTM PCR DNA和凝胶带纯化试剂盒从PCR反应组分纯化,并且通过在该试剂盒提供的10μl洗脱缓冲液中洗脱来浓缩。通过以下方式对这些产物进行分析:首先根据制造商的说明书使用TA试剂盒反应将4μl的各纯化的PCR反应液直接克隆到中,并且将这些反应液转化到TOP10化学感受态大肠杆菌细胞中。通过限制性消化针对插入物对所获得的克隆进行筛选,并且用M13正向载体引物(SEQ ID NO:73)和M13反向载体引物(SEQ ID NO:74)对含有插入物的那些克隆进行测序。各自大约为800bp的四个单独克隆为嗜热真菌丝衣霉状篮状菌纤维二糖水解酶基因提供3’序列。将所有序列组装成单个毗连序列群(contig)。
嗜热真菌丝衣霉状篮状菌纤维二糖水解酶编码序列的基因组DNA序列和推导的氨基酸序列分别在SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2中示出。1789bp的基因组DNA序列(包括终止密码子)包含位于SEQ ID NO:1的核苷酸80至131、201至253、540至592、847至897、1036至1095、1354至1443、以及1686至1744处的7个内含子。该基因组DNA片段编码具有456个氨基酸的多肽。成熟多肽编码序列的%G+C含量是56%。使用SignaIP软件程序(尼尔森等人,1997,蛋白质工程化10:1-6),预测具有19个残基的信号肽。所预测的成熟蛋白包含437个氨基酸,具有46kDa的预测分子量和4.0的等电点。该蛋白质包含在N末端处的CBM1类型的碳水化合物结合模块(SEQ ID NO:2的氨基酸20至56)。催化结构域是氨基酸397至1786。
实例2:将嗜热真菌丝衣霉状篮状菌纤维二糖水解酶编码序列克隆至曲霉表达载体中
通过使用以下所示的两种合成寡核苷酸引物扩增来自基因组DNA的蛋白质编码序列来将嗜热真菌丝衣霉状篮状菌纤维二糖水解酶编码序列克隆至曲霉表达载体pMStr57(WO2004/032648)中。载体pMStr57包含用于在大肠杆菌中选择和繁殖、以及在曲霉中选择和表达的序列。在曲霉中的选择通过构巢曲霉的amdS基因帮助,该amdS基因允许使用乙酰胺作为唯一氮源。在曲霉中的表达通过来自黑曲霉的修饰的中性淀粉酶II(NA2)启动子介导,该启动子与来自构巢曲霉的丙糖磷酸异构酶(tpi)编码基因的5’前导序列和来自黑曲霉的淀粉葡糖苷酶编码基因的终止子融合。
引物1167:
acacaactggggatcctcaccatgcgaaatattcttg(SEQ ID NO:79)
引物1168:
CCCTCTAGATCTCGAGCTAGAATGACGGATTGGCGTT(SEQ ID NO:80)
按照制造商的说明书,使用IPROOFTM高保真2X Master Mix(伯乐实验室有限公司,美国加州赫拉克勒斯)来进行扩增。扩增反应液由以下各项组成:嗜热真菌丝衣霉状篮状菌CBS413.71基因组DNA作为模板、各为25皮摩尔的引物1167和引物1168、以及25μl的IPROOFTM高保真2X MasterMix,最终体积为50μl。在一个热循环仪中进行扩增,该热循环仪被编程为:98℃下的起始模板变性步骤持续2分钟;5个循环的各在98℃下变性10秒、在65℃下退火10秒,以及在72℃下伸长1分钟;以及30个循环的各在98℃下变性10秒,和在72℃下组合退火延伸1分钟。在72℃下进行最终伸长,持续10分钟。
根据制造商的说明书,使用ILLUSTRATMGFXTMPCR DNA和凝胶带纯化试剂盒从残余反应组分中分离大约2000bp的PCR产物。对所纯化的PCR片段进行测序,并且该序列与SEQ.ID NO.1的序列一致。
根据制造商的说明书,使用IN-FUSIONTM干燥PCR克隆试剂盒(克罗泰克实验室有限公司(Clontech Laboratories,Inc.),美国加利福尼亚州山景城(Mountain View,CA,USA))将该PCR片段克隆到Bam HI和Xho I消化的pMStr57中。对所得到的曲霉表达构建体pMStr215的嗜热真菌丝衣霉状篮状菌纤维二糖水解酶编码DNA进行测序,并且该序列与SEQ.ID NO.1的序列一致。
实例3:嗜热真菌丝衣霉状篮状菌纤维二糖水解酶编码序列在米曲霉MT3568中的表达
根据克里斯滕森等人,1988,生物技术6,1419-1422和WO2004/032648将真菌表达宿主米曲霉菌株MT3568用pMStr215进行转化。将八个转化体各自在750μl的DAP2C-1培养基(WO2004/032648)中在30℃下培养4天。根据制造商的说明书,使用具有Plus2分子量标准的E-PAGETM488%凝胶(英杰,美国生命技术公司,美国加利福利亚州卡尔巴斯德)通过SDS-PAGE来对样品进行分析。用INSTANTBLUETM(艾本德蛋白溶液公司(Expedeon Protein Solutions),英国剑桥巴布拉汉(BabrahamCambridge,UK))对该凝胶进行染色。六个转化体产生了一个大约55kDa的新颖蛋白质带。
通过在含有0.01%X-100的选择性培养基(amdS)上稀释划线分生孢子来将这些转化体中的两个(指定为米曲霉MStr390和MStr391)分离两次以便限制菌落大小。
实例4:用于嗜热真菌丝衣霉状篮状菌家族GH6A纤维二糖水解酶II基因在里氏木霉宿主中的表达的质粒的构建
以下所示的两种合成寡核苷酸引物被设计来扩增来自pMStr215的嗜热真菌丝衣霉状篮状菌GH6A纤维二糖水解酶II编码序列的全长开放阅读框。使用IN-FUSIONTM克隆试剂盒(克罗泰克实验室有限公司,美国加利福尼亚州山景城)将该片段克隆到质粒pMJ09(WO2005/056772)中。
In-Fusion正向引物:
5’-CAACCGCGGACTGCGCACCATGCGAAATATTCTTGCTCTTG-3’(SEQ ID NO:81)
In-Fusion反向引物:
5’-CAGGCTTTCGCCACGGAGCTTACTAGAATGACGGATTGGCG-3’(SEQ ID NO:82)
粗体字母代表编码序列。其余序列包含与质粒pJM09的插入位点的序列一致性。
将五十皮摩尔的各以上引物用于如下PCR反应液中,该PCR反应液由以下各项组成:大约150ng的质粒pMStr215、具有1.5mM MgCl2的1X高保真PCR DNA聚合酶缓冲液(罗氏应用科学(Roche AppliedScience),德国曼海姆(Mannheim,Germany))、1.0μl的dATP、dTTP、dGTP、以及dCTP的10mM共混物、以及0.5单位的DNA聚合酶(纽英伦生物技术有限公司(New England Biolabs Inc.),美国麻萨诸塞州伊普斯威奇(Ipswich,MA,USA)),最终体积为50μl。在 5333(艾本德科技公司(Eppendorf Scientific,Inc.),美国纽约州韦斯特伯里(Westbury,NY,USA))中进行扩增反应,编程为94℃、2分钟,一个循环;以及各自98℃、10秒钟,55℃、30秒钟,以及72℃、30分钟,30个循环。在这30个循环之后,将该反应在72℃下孵育10分钟。根据制造商的方案,将所得到的PCR反应产物通过添加20单位的Dpn1(纽英伦生物技术有限公司,美国麻萨诸塞州)在37℃下限制性消化1小时以便消化任何残余的质粒pMStr215,并且然后使用PCR净化试剂盒(Macherey-Nagel公司,德国迪伦(Düren,Germany))进行纯化。
通过用Nco I和Pac I消化来使质粒pMJ09线性化。根据制造商的方案,使用PCR净化试剂盒(凯杰有限公司(QIAGEN Inc.),美国加州瓦伦西亚(Valencia,CA,USA))来纯化该片段。使用IN-FUSIONTM克隆试剂盒将纯化的PCR片段克隆到线性化的且纯化的pMJ09载体中。反应液(10μl)由以下各项组成:1X IN-FUSIONTM缓冲液(克罗泰克实验室有限公司,美国加利福尼亚州山景城)、1X BSA(克罗泰克实验室有限公司,美国加利福尼亚州山景城)、1μl的IN-FUSIONTM酶(克罗泰克实验室有限公司,美国加利福尼亚州山景城)、145ng的用Nco I和Pac I消化的pMJ09、以及大约150ng的嗜热真菌丝衣霉状篮状菌纯化的PCR产物。将该反应在50℃下孵育15分钟,并且在37℃下孵育15分钟。根据制造商的说明书,使用2μl反应液样品来转化XL-10大肠杆菌感受态细胞(Stratagene公司,美国加州拉霍亚(La Jolla,CA,USA))。在复苏期后,将175μl的转化反应液铺展在补充有100μg氨比西林/ml的150mm2XYT板上。将该板在37℃下孵育过夜。从选择板中随机选择转化体并且使用9600(凯杰有限公司,美国加州瓦伦西亚)从每种转化体制备质粒DNA。通过Sac I限制性消化对克隆进行分析。使用3130xl遗传分析器(应用生物系统公司(Applied Biosystems,Inc.),美国加州福斯特市(Foster City,CA,USA))对具有期望限制性消化模式的克隆进行测序以验证变化并正确插入到pMJ09质粒中。选择这些质粒中的一种并且指定为pAJ226。
实例5:嗜热真菌丝衣霉状篮状菌家族GH6A纤维二糖水解酶II基因突变体的构建
通过使用XL定点诱变试剂盒(Stratagene公司,美国加州拉霍亚)在pAJ226(实例4)上进行定点诱变来构建嗜热真菌丝衣霉状篮状菌GH6A纤维二糖水解酶II的变体。用于定点诱变的寡核苷酸和所获得的变体的汇总在表1中示出。
所得的突变质粒DNA是使用9600来制备的并且使用3130xl遗传分析器进行测序以验证变化。
表1
实例6:用于嗜热真菌丝衣霉状篮状菌家族GH6A纤维二糖水解酶II基因变体在米曲霉宿主中的表达的质粒的构建
以下所示的两种合成寡核苷酸引物被设计来扩增编码来自实例5的嗜热真菌丝衣霉状篮状菌GH6A纤维二糖水解酶II变体的全长开放阅读框。所使用的模板和所得的质粒的名称在表2中示出。使用IN-FUSIONTM克隆试剂盒来将这些PCR产物中的每种克隆到pAILo2(WO2004/099228)中。
In-Fusion正向引物:
5’-ACTGGATTTACCatgcgaaatattcttgctc-3’(SEQ ID NO:107)
In-Fusion反向引物:
5’-AGTCACCTCTAGTTActagaatgacggattggc-3’(SEQ ID NO:108)
粗体字母代表编码序列。其余序列包含与pAlLo2(WO2005/074747)的插入位点的序列一致性。
将三十八皮摩尔的各以上引物用于如下PCR反应液中,该PCR反应液由以下组成:40ng的如表2中所指示的嗜热真菌丝衣霉状篮状菌突变体DNA、1X Pfx DNA聚合酶缓冲液(英杰,美国加州卡尔斯巴德)、1mM硫酸镁、1.5μl的dATP、dTTP、dGTP、以及dCT的10mM共混物、以及2.5单位的Pfx DNA聚合酶(英杰,美国加州卡尔斯巴德),最终体积为50μl。在5333中进行扩增反应,编程为94℃、2分钟,1个循环;以及每个94℃、15秒,55℃、30秒,以及68℃或72℃、1.5分钟或2分钟,30个循环。在30个循环以后,将该反应在68℃下孵育10分钟并且然后在4℃下冷却直到进一步处理。根据制造商的方案,使用PCR净化试剂盒来对所得的PCR反应产物进行纯化。在一些情况下,根据制造商的方案,将PCR反应产物通过添加20单位的Dpn1在37℃下限制性消化1小时以便消化任何残余的pAlLo2,并且然后使用PCR净化试剂盒进行纯化。
通过用Nco I和Pac I消化来使质粒pAlLo2线性化。根据制造商的方案,使用PCR净化试剂盒来对质粒片段进行纯化。使用IN-FUSIONTM克隆试剂盒将每个纯化的PCR片段克隆到线性化的且纯化的pAlLo2载体中。反应液(10μl)由以下各项组成:1X IN-FUSIONTM缓冲液、1X BSA、1μl的IN-FUSIONTM酶、100ng的用Nco I和Pac I消化的pAlLo2、以及大约50ng或100ng的每种纯化的PCR产物。将这些反应在50℃下孵育15分钟,并且在37℃下孵育15分钟。根据制造商的说明书,使用2μl的每种反应液样品来转化XL-10或XL1-Blue大肠杆菌感受态细胞(Stratagene公司,美国加州拉霍亚)。在复苏期后,将175μl的转化反应液铺展在补充有100μg氨比西林/ml的150mm2XYT板上。将该板在37℃下孵育过夜。从选择板中随机选择推定的重组克隆并且使用9600从每种克隆制备质粒DNA。通过Bam HI和Sna BI或Eco RI限制性消化对克隆进行分析。使用3130xl遗传分析器对具有期望限制性消化模式的克隆进行测序以验证变化并正确插入到pAlLo2中。所得质粒汇总于表2中。
表2
模板 所得质粒
pMaWo92 pMaWo92Ao
pMaWo95 pMaWo95Ao
pMaWo98 pMaWo98Ao
pMaWo99 pMaWo99Ao
pMaWo100 pMaWo100Ao
pMaWo102 pMaWo102Ao
pMaWo103 pMaWo103Ao
pAJ235 pAJ238
pAJ234 pAJ240
pMaWo105 pMaWo105Ao
pMaWo106 pMaWo106Ao
pMaWo108 pMaWo108Ao
实例7:嗜热真菌丝衣霉状篮状菌野生型GH6A纤维二糖水解酶II及其纤维二糖水解酶II变体在米曲霉JaL250中的表达
将根据克里斯滕森等人,1988,生物/科技6:1419-1422的方法制备的米曲霉JaL250(WO99/061651)原生质体用5μg的pMaWo92Ao、pMaWo95Ao、pMaWo98Ao、pMaWo99Ao、pMaWo100Ao、pMaWo102Ao、pMaWo103Ao、pAJ238、pAJ240、pMaWo105Ao、pMaWo106Ao、或pMaWo108Ao进行转化,对于每种载体该转化产生约1至10种转化体。对于各转化将多达十种转化体分离到单独的PDA板上。
将这些变体转化体和米曲霉MStr391(实例3)的汇合PDA板用8ml的0.01%20洗涤,并且单独接种到于无菌24孔组织培养板中的1ml MDU2BP培养基中并且在34℃下孵育。在孵育后三至五天,根据制造商的说明书使用8%-16%Tris-甘氨酸凝胶(英杰,美国加州卡尔斯巴德)通过SDS-PAGE对从各培养物收获的20μl培养液进行分析。这些培养物的SDS-PAGE谱显示若干转化体具有大约75kDa的新的主带。
将各转化的一种转化体(在PDA板上生长)的汇合板用8ml的0.01%20洗涤,并且接种到含有25ml MDU2BP培养基的125ml塑料摇瓶中并且在34℃下孵育(静止或在200rpm下摇晃),以产生用于表征这些变体的培养液。在第3至5天时收获这些摇瓶,并且使用0.22μm过滤器单元(密理博公司(Millipore),美国马萨诸塞州贝德福德(Bedford,MA,USA))进行过滤。
实例8:测量嗜热真菌丝衣霉状篮状菌家族GH6A纤维二糖水解酶II变体的热稳定性
将3ml的来自实例7的每种培养物的过滤培养液使用10DG脱盐柱(伯乐实验室有限公司,美国加州赫拉克勒斯)脱盐至100mMNaCl-50mM乙酸钠(pH5.0)中。使用6(5kDa截留值)超滤器(阿哥斯科技(Argos Technology),美国伊利诺伊州埃尔金(Elgin,IL,USA))将脱盐的培养液中的蛋白质浓缩至0.5ml的体积。
使用100mM NaCl-50mM乙酸钠(pH5.0)将这些浓缩的培养液稀释至1mg/ml的蛋白质浓度。在280nm下测定蛋白质浓度(1.9A280=1mg/ml)。将各1mg/ml蛋白质样品的两个25μl等分部分添加至管条PCR管(康宁公司(Corning),康宁,美国纽约)中。将一个等分部分保持在冰上,而另一个等分部分在ep梯度S热循环仪(艾本德科技公司,美国纽约州韦斯特伯里)中在67℃下加热20分钟并且然后冷却至4℃,接着放置在冰上。然后用175μl的0.0114%20-100mM NaCl-50mM乙酸钠(pH5.0)对这两个样品进行稀释。
然后通过测定加热的样品和保持在冰上的样品在磷酸溶胀纤维素(PASC)的水解中的活性来测量加热的样品的残余活性。将十微升的每种样品一式三份地添加至96孔PCR板(艾本德科技公司,美国纽约州韦斯特伯里)中。然后将于0.01%-20-50mM乙酸钠(pH5.0)中的190μl的2.1g/l PASC添加至10μl样品中并且进行混合。以200μl/孔一式两份地添加于50mM乙酸钠(pH5.0)缓冲液中的100、75、50、25、12.5以及0mg/升的葡萄糖标准液。将所得的混合物在50℃下在 梯度S热循环仪中孵育30分钟。通过向各孔添加50μl的0.5M NaOH(包括葡萄糖标准液)来终止反应。然后将该板在配备有微板载体(赛默科技(Thermo cientific),美国麻萨诸塞州沃尔瑟姆(Waltham,MA,USA))、具有1000B转子的RT6000D离心机(赛默科技,美国麻萨诸塞州沃尔瑟姆)中在2,000rpm下离心2分钟。
通过测量在50℃下30分钟水解过程中释放的还原性末端来确定对PASC的活性。将来自离心板的一百微升的各上清液转移至一个单独的96孔PCR板。将于0.5M NaOH中的五十微升的1.5%(w/v)PHBAH(4-羟基-苯甲酰肼,西格玛化学有限公司(Sigma Chemical Co.,Inc.),美国密苏里州圣路易斯(St.Louis,MO,USA))添加至各孔中。然后将该板在梯度S热循环仪在95℃下加热15分钟并且然后在15℃下加热5分钟。将总计100μl的各样品转移至一个透明的平底96孔板(康宁公司,康宁,美国纽约)。然后使用340pc分光光度计板读取器(分子仪器公司(Molecular Devices),美国加州森尼韦尔(Sunnyvale,CA,USA))来测量410nm下的吸光度。从所释放的还原性末端的浓度对比葡萄糖标准页在410nm下的吸光度的直线拟合来确定所释放的还原性末端的浓度。然后通过将从由加热的样品水解的PASC释放的还原性末端除以从由保持在冰上的样品水解的PASC释放的还原性末端来计算残余活性。变体的残余活性与亲本酶的残余活性的比是该酶的热稳定性的一个量度。具有大于1的值的变体相比亲本酶热稳定性更高。
通过与亲本酶相比所指示的变体的更高残余活性,图2所示的结果证明了热稳定性的增加。
通过以下编号的段落进一步说明本发明:
[1]一种纤维二糖水解酶变体,包含在与SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置112、154、197、228、261、306、以及375相对应的一个或多个位置处的取代,其中该变体具有纤维二糖水解酶活性。
[2]如段落1所述的变体,该变体与亲本纤维二糖水解酶的氨基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%、但小于100%的序列一致性。
[3]如段落1或2所述的变体,该变体是选自下组的亲本纤维二糖水解酶的一种变体,该组由以下各项组成:(a)与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:40、SEQ IDNO:42、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:58、SEQ IDNO:60、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:112、SEQ ID NO:114、或SEQ ID NO:116的成熟多肽具有至少60%序列一致性的多肽;(b)由在至少低严格度条件下与以下各项杂交的多核苷酸编码的多肽:(i)SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ IDNO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:37、SEQ IDNO:39、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:55、SEQ IDNO:57、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:111、SEQ IDNO:113、或SEQ ID NO:115的成熟多肽编码序列,或(ii)(i)的全长补体;(c)由与以下各项具有至少60%序列一致性的多核苷酸编码的多肽:SEQID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:27、SEQID NO:29、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:45、SEQ IDNO:47、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:63、SEQ IDNO:65、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:113、或SEQ ID NO:115的成熟多肽编码序列;以及(d)SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ IDNO:30、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:46、SEQ IDNO:48、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:64、SEQ IDNO:66、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:112、SEQ ID NO:114、或SEQ ID NO:116的成熟多肽的片段,该变体具有纤维二糖水解酶活性。
[4]如段落3所述的变体,其中该亲本纤维二糖水解酶与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:38、SEQ IDNO:40、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:56、SEQ IDNO:58、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:112、SEQ IDNO:114、或SEQ ID NO:116的成熟多肽具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列一致性。
[5]如段落3所述的变体,其中该亲本纤维二糖水解酶由在低严格度条件、中等严格度条件、中-高等严格度条件、高严格度条件、或极高严格度条件下与以下各项杂交的多核苷酸编码:(i)SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQID NO:23、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:39、SEQ IDNO:41、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:57、SEQ IDNO:59、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:113、或SEQ ID NO:115的成熟多肽编码序列,或(ii)(i)的全长补体。
[6]如段落3所述的变体,其中该亲本纤维二糖水解酶由与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:37、SEQ IDNO:39、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:55、SEQ IDNO:57、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:111、SEQ IDNO:113、或SEQ ID NO:115的成熟多肽编码序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列一致性的多核苷酸编码。
[7]如段落3所述的变体,其中该亲本纤维二糖水解酶包含SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ IDNO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ IDNO:30、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:46、SEQ IDNO:48、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:64、SEQ IDNO:66、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:112、SEQ ID NO:114、或SEQ ID NO:116的成熟多肽或由其组成。
[8]如段落3所述的变体,其中该亲本纤维二糖水解酶是SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:38、SEQ IDNO:40、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:56、SEQ IDNO:58、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:112、SEQ IDNO:114、或SEQ ID NO:116的成熟多肽的一个片段,其中该片段具有纤维二糖水解酶活性。
[9]如段落1至8中任一项所述的变体,该变体与SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ IDNO:32、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:48、SEQ IDNO:50、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:66、SEQ IDNO:68、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:112、SEQ ID NO:114、或SEQ ID NO:116的成熟多肽具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%、但小于100%的序列一致性。
[10]如段落2至9中任一项所述的变体,其中该变体由该亲本纤维二糖水解酶的成熟多肽的至少85%的氨基酸残基,例如至少90%的氨基酸残基或至少95%的氨基酸残基组成。
[11]如段落1至10中任一项所述的变体,其中取代的数目是1至7个,例如,1、2、3、4、5、6、或7个取代。
[12]如段落1至11中任一项所述的变体,包含在与位置112相对应的位置处的取代。
[13]如段落12所述的变体,其中该取代是His。
[14]如段落1至13中任一项所述的变体,包含在与位置154相对应的位置处的取代。
[15]如段落14所述的变体,其中该取代是Met。
[16]如段落1至15中任一项所述的变体,包含在与位置197相对应的位置处的取代。
[17]如段落16所述的变体,其中该取代是Tyr。
[18]如段落1至17中任一项所述的变体,包含在与位置228相对应的位置处的取代。
[19]如段落18所述的变体,其中该取代是Val。
[20]如段落1至19中任一项所述的变体,包含在与位置261相对应的位置处的取代。
[21]如段落20所述的变体,其中该取代是Leu。
[22]如段落1至21中任一项所述的变体,包含在与位置306相对应的位置处的取代。
[23]如段落22所述的变体,其中该取代是Ala。
[24]如段落1至23中任一项所述的变体,包含在与位置375相对应的位置处的取代。
[25]如段落24所述的变体,其中该取代是Glu。
[26]如段落1至25中任一项所述的变体,包含在与位置112、154、197、228、261、306、以及375中的任何一个相对应的两个位置处的取代。
[27]如段落1至25中任一项所述的变体,包含在与位置112、154、197、228、261、306、以及375中的任何一个相对应的三个位置处的取代。
[28]如段落1至25中任一项所述的变体,包含在与位置112、154、197、228、261、306、以及375中的任何一个相对应的四个位置处的取代。
[29]如段落1至25中任一项所述的变体,包含在与位置112、154、197、228、261、306、以及375中的任何一个相对应的五个位置处的取代。
[30]如段落1至25中任一项所述的变体,包含在与位置112、154、197、228、261、306、以及375中的任何一个相对应的六个位置处的取代。
[31]如段落1至25中任一项所述的变体,包含在与位置112、154、197、228、261、306、以及375相对应的每个位置处的取代。
[32]如段落1至31中任一项所述的变体,包含选自下组的一个或多个取代,该组由以下各项组成:Y112H、V154M、S197Y、I228V、I261L、S306A、以及G375E。
[33]如段落1至32中任一项所述的变体,进一步包含在与SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置247、262、300、322、332、338、以及439相对应的一个或多个位置处的取代,其中该变体具有纤维二糖水解酶活性。
[34]如段落33所述的变体,其中取代的数目是1至7个,例如,如1、2、3、4、5、6、或7取代。
[35]如段落33或34所述的变体,进一步包含在与位置247相对应的位置处的取代。
[36]如段落35所述的变体,其中该取代是Ser。
[37]如段落33至36中任一项所述的变体,进一步包含在与位置262相对应的位置处的取代。
[38]如段落37所述的变体,其中该取代是Lys。
[39]如段落33至38中任一项所述的变体,进一步包含在与位置300相对应的位置处的取代。
[40]如段落39所述的变体,其中该取代是Asp。
[41]如段落33至40中任一项所述的变体,进一步包含在与位置322相对应的位置处的取代。
[42]如段落41所述的变体,其中该取代是Ile。
[43]如段落33至42中任一项所述的变体,进一步包含在与位置332相对应的位置处的取代。
[44]如段落43所述的变体,其中该取代是Asp。
[45]如段落33至44中任一项所述的变体,进一步包含在与位置338相对应的位置处的取代。
[46]如段落45所述的变体,其中该取代是Lys。
[47]如段落33至46中任一项所述的变体,进一步包含在与位置439相对应的位置处的取代。
[48]如段落47所述的变体,其中该取代是Gln。
[49]如段落33至48中任一项所述的变体,进一步包含在与位置247、262、300、322、332、338、以及439中的任何一个相对应的两个位置处的取代。
[50]如段落33至48中任一项所述的变体,进一步包含在与位置247、262、300、322、332、338、以及439中的任何一个相对应的三个位置处的取代。
[51]如段落33至48中任一项所述的变体,进一步包含在与位置247、262、300、322、332、338、以及439中的任何一个相对应的四个位置处的取代。
[52]如段落33至48中任一项所述的变体,进一步包含在与位置247、262、300、322、332、338、以及439中的任何一个相对应的五个位置处的取代。
[53]如段落33至48中任一项所述的变体,进一步包含在与位置247、262、300、322、332、338、以及439中的任何一个相对应的六个位置处的取代。
[54]如段落33至48中任一项所述的变体,进一步包含在与位置247、262、300、322、332、338、以及439相对应的每个位置处的取代。
[55]如段落33至54中任一项所述的变体,进一步包含选自下组的一个或多个取代,该组由以下各项组成:A247S、T262K、N300D、V322I、D332N、E338K、以及T439。
[56]如段落1至55中任一项所述的变体,进一步包含在与SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置256、287、以及344相对应的一个或多个位置处的取代,其中该变体具有纤维二糖水解酶活性。
[57]如段落56所述的变体,其中取代的数目是1至3个,例如,如1、2、或3个取代。
[58]如段落56或57所述的变体,进一步包含在与位置256相对应的位置处的取代。
[59]如段落58所述的变体,其中该取代是Leu。
[60]如段落56至59中任一项所述的变体,进一步包含在与位置287相对应的位置处的取代。
[61]如段落60所述的变体,其中该取代是Ile。
[62]如段落56至61中任一项所述的变体,进一步包含在与位置344相对应的位置处的取代。
[63]如段落62所述的变体,其中该取代是Phe。
[64]如段落56至63中任一项所述的变体,进一步包含在与位置256、287、以及344中的任何一个相对应的两个位置处的取代。
[65]如段落56至63中任一项所述的变体,进一步包含在与位置256、287、以及344相对应的每个位置处的取代。
[66]如段落56至65中任一项所述的变体,进一步包含选自下组的一个或多个取代,该组由以下各项组成:C256L、L287I、以及L344F。
[67]如段落1至66中任一项所述的变体,该变体具有与该亲本相比增加至少1.01倍,例如至少1.05倍、至少1.1倍、至少1.2倍、至少1.3倍、至少1.4倍、至少1.5倍、至少1.8倍、至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少50倍、至少75倍、或至少100倍的热稳定性。
[68]一种分离的多核苷酸,该分离的多核苷酸编码如段落1至67中任一项所述的变体。
[69]一种核酸构建体,包含如段落68所述的多核苷酸。
[70]一种表达载体,包含如段落68所述的多核苷酸。
[71]一种宿主细胞,包含如段落68所述的多核苷酸。
[72]一种产生纤维二糖水解酶变体的方法,该方法包括:在适合于该变体表达的条件下培养如段落71所述的宿主细胞。
[73]如段落72所述的方法,进一步包括回收该变体。
[74]一种用如段落68所述的多核苷酸转化的转基因植物、植物部分或植物细胞。
[75]一种产生如段落1至67中任一项所述的变体的方法,该方法包括:在有益于该变体产生的条件下培养包含编码该变体的多核苷酸的转基因植物或植物细胞。
[76]如段落75所述的方法,进一步包括回收该变体。
[77]一种用于获得纤维二糖水解酶变体的方法,该方法包括:在亲本纤维二糖水解酶中与SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置112、154、197、228、261、306、以及375相对应的一个或多个位置处引入取代,其中该变体具有纤维二糖水解酶活性;并且回收该变体。
[78]如段落77所述的方法,进一步包括在该亲本纤维二糖水解酶中与SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置247、262、300、322、332、338、以及439相对应的一个或多个(例如,数个)位置处引入取代,其中该变体具有纤维二糖水解酶活性。
[79]如段落77或78所述的方法,进一步包括在该亲本纤维二糖水解酶中与SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置256、287、以及344相对应的一个或多个(例如,数个)位置处引入取代,其中该变体具有纤维二糖水解酶活性。
[80]一种用于降解或转化纤维素材料的方法,该方法包括:在如段落1至67中任一项所述的纤维二糖水解酶变体的存在下,用一种酶组合物处理该纤维素材料。
[81]如段落80所述的方法,其中对该纤维素材料进行了预处理。
[82]如段落80或81所述的方法,进一步包括回收该降解的纤维素材料。
[83]如段落80至82中任一项所述的方法,其中该酶组合物包含选自下组的一种或多种酶,该组由以下各项组成:纤维素酶、具有纤维素分解增强活性的多肽、半纤维素酶、酯酶、苹果菌素、漆酶、木质素分解酶、果胶酶、过氧化物酶、蛋白酶、以及膨胀蛋白。
[84]如段落83所述的方法,其中该纤维素酶是选自下组的一种或多种酶,该组由以下各项组成:内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、以及β-葡糖苷酶。
[85]如段落83所述的方法,其中该半纤维素酶是选自下组的一种或多种酶,该组由以下各项组成:木聚糖酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、木糖苷酶、以及葡糖醛酸糖苷酶。
[86]如段落80至85中任一项所述的方法,其中该降解的纤维素材料是糖。
[87]如段落86所述的方法,其中该糖选自下组,该组由以下各项组成:葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳糖、以及阿拉伯糖。
[88]一种用于产生发酵产物的方法,该方法包括:(a)在如段落1至67中任一项所述的纤维二糖水解酶变体的存在下,用一种酶组合物使一种纤维素材料糖化;(b)用一种或多种发酵微生物发酵该糖化的纤维素材料,以产生该发酵产物;并且(c)从该发酵中回收该发酵产物。
[89]如段落88所述的方法,其中对该纤维素材料进行了预处理。
[90]如段落88或89所述的方法,其中该酶组合物包含选自下组的一种或多种酶,该组由以下各项组成:纤维素酶、具有纤维素分解增强活性的多肽、半纤维素酶、酯酶、苹果菌素、漆酶、木质素分解酶、果胶酶、过氧化物酶、蛋白酶、以及膨胀蛋白。
[91]如段落90所述的方法,其中该纤维素酶是选自下组的一种或多种酶,该组由以下各项组成:内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、以及β-葡糖苷酶。
[92]如段落90所述的方法,其中该半纤维素酶是选自下组的一种或多种酶该组由以下各项组成:木聚糖酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、木糖苷酶、以及葡糖醛酸糖苷酶。
[93]如段落88至92中任一项所述的方法,其中步骤(a)和步骤(b)是在同时发生的糖化和发酵中同时进行。
[94]如段落88至93中任一项所述的方法,其中该发酵产物是醇、烷烃、环烷烃、烯烃、氨基酸、气体、异戊二烯、酮、有机酸、或聚酮化合物。
[95]一种发酵纤维素材料的方法,该方法包括:用一种或多种发酵微生物发酵该纤维素材料,其中在如段落1至67中任一项所述的纤维二糖水解酶变体的存在下,用一种酶组合物使该纤维素材料糖化。
[96]如段落95所述的方法,其中在糖化之前对该纤维素材料进行了预处理。
[97]如段落95或96所述的方法,其中该酶组合物包含选自下组的一种或多种酶,该组由以下各项组成:纤维素酶、具有纤维素分解增强活性的多肽、半纤维素酶、酯酶、苹果菌素、漆酶、木质素分解酶、果胶酶、过氧化物酶、蛋白酶、以及膨胀蛋白。
[98]如段落97所述的方法,其中该纤维素酶是选自下组的一种或多种酶,该组由以下各项组成:内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、以及β-葡糖苷酶。
[99]如段落97所述的方法,其中该半纤维素酶是选自下组的一种或多种酶,该组由以下各项组成:木聚糖酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、木糖苷酶、以及葡糖醛酸糖苷酶。
[100]如段落95至99中任一项所述的方法,其中该纤维素材料的该发酵产生一种发酵产物。
[101]如段落100所述的方法,进一步包括从该发酵中回收该发酵产物。
[102]如段落100或101所述的方法,其中该发酵产物是醇、烷烃、环烷烃、烯烃、氨基酸、气体、异戊二烯、酮、有机酸、或聚酮化合物。
[103]一种全液配制品或细胞培养组合物,包含如段落1至67中任一项所述的变体。
在此描述的并且要求的本发明在范围上不受在此披露的具体方面限制,因为这些方面旨在作为本发明数个方面的说明。任何等效方面都旨在处于本发明的范围之内。事实上,除在此所示和描述的那些之外,本发明的不同修改对于本领域普通技术人员来说从前述说明将变得清楚。这类修改也旨在落入所附权利要求书的范围之内。在有冲突的情况下,将以本披露(包括定义)为准。

Claims (20)

1.一种纤维二糖水解酶变体,包含在与SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置112、154、197、228、261、306、以及375相对应的一个或多个位置处的取代,其中该变体具有纤维二糖水解酶活性。
2.如权利要求1所述的变体,该变体与亲本纤维二糖水解酶的氨基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%、但小于100%的序列一致性。
3.如权利要求1或2所述的变体,该变体是选自下组的亲本纤维二糖水解酶的一种变体,该组由以下各项组成:(a)与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:40、SEQ IDNO:42、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:58、SEQ IDNO:60、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:112、SEQ ID NO:114、或SEQID NO:116的成熟多肽具有至少60%序列一致性的多肽;(b)由在至少低严格度条件下与以下各项杂交的多核苷酸编码的多肽:(i)SEQ ID NO:1、SEQID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ IDNO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:37、SEQ IDNO:39、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:55、SEQ IDNO:57、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:111、SEQ IDNO:113、或SEQ ID NO:115的成熟多肽编码序列,或(ii)(i)的全长补体;(c)由与以下各项具有至少60%序列一致性的多核苷酸编码的多肽:SEQID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ IDNO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:35、SEQ IDNO:37、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:53、SEQ IDNO:55、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:109、SEQ IDNO:111、SEQ ID NO:113、或SEQ ID NO:115的成熟多肽编码序列;以及(d)SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ IDNO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:36、SEQ IDNO:38、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:54、SEQ IDNO:56、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:110、SEQ IDNO:112、SEQ ID NO:114、或SEQ ID NO:116的成熟多肽的片段,该变体具有纤维二糖水解酶活性。
4.如权利要求3所述的变体,其中该亲本纤维二糖水解酶包含以下各项,或由其组成:SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:34、SEQ IDNO:36、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:52、SEQ IDNO:54、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:70、SEQ IDNO:110、SEQ ID NO:112、SEQ ID NO:114、或SEQ ID NO:116的成熟多肽;或其具有纤维二糖水解酶活性的片段。
5.如权利要求1至4中任一项所述的变体,该变体与SEQ ID NO:2、SEQID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ IDNO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:38、SEQ IDNO:40、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:56、SEQ IDNO:58、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:112、SEQ IDNO:114、或SEQ ID NO:116的成熟多肽具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%、但小于100%的序列一致性。
6.如权利要求1至5中任一项所述的变体,包含选自下组的一个或多个取代,该组由以下各项组成:Y112H、V154M、S197Y、I228V、I261L、S306A、以及G375E。
7.如权利要求1至6中任一项所述的变体,进一步包含在与SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置247、262、300、322、332、338、以及439相对应的一个或多个位置处的取代,其中该变体具有纤维二糖水解酶活性。
8.如权利要求7所述的变体,进一步包含选自下组的一个或多个取代,该组由以下各项组成:A247S、T262K、N300D、V322I、D332N、E338K、以及T439。
9.如权利要求1至8中任一项所述的变体,进一步包含在与SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置256、287、以及344相对应的一个或多个位置处的取代,其中该变体具有纤维二糖水解酶活性。
10.如权利要求9所述的变体,进一步包含选自下组的一个或多个取代,该组由以下各项组成:C256L、L287I、以及L344F。
11.如权利要求1至10中任一项所述的变体,该变体具有与该亲本相比增加至少1.01倍,例如至少1.05倍、至少1.1倍、至少1.2倍、至少1.3倍、至少1.4倍、至少1.5倍、至少1.8倍、至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少50倍、至少75倍、或至少100倍的热稳定性。
12.一种分离的多核苷酸,该分离的多核苷酸编码如权利要求1至11中任一项所述的变体。
13.一种产生纤维二糖水解酶变体的方法,该方法包括:(a)在适合于该变体的表达的条件下培养包含如权利要求12所述的多核苷酸的宿主细胞;并且任选地(b)回收该变体。
14.一种用如权利要求12所述的多核苷酸转化的转基因植物、植物部分或植物细胞。
15.一种产生如权利要求1至11中任一项所述的变体的方法,该方法包括:(a)在有益于该变体的产生的条件下培养包含编码该变体的多核苷酸的一种转基因植物或一种植物细胞;并且任选地(b)回收该变体。
16.一种用于获得纤维二糖水解酶变体的方法,该方法包括:在亲本纤维二糖水解酶中与SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置112、154、197、228、261、306、以及375相对应的一个或多个位置处引入取代,其中该变体具有纤维二糖水解酶活性;并且回收该变体。
17.一种用于降解或转化纤维素材料的方法,该方法包括:在如权利要求1至11中任一项所述的纤维二糖水解酶变体的存在下,用一种酶组合物处理该纤维素材料。
18.一种用于产生发酵产物的方法,该方法包括:(a)在如权利要求1至11中任一项所述的纤维二糖水解酶变体的存在下,用一种酶组合物使一种纤维素材料糖化;(b)用一种或多种发酵微生物发酵该糖化的纤维素材料,以产生该发酵产物;并且(c)从该发酵中回收该发酵产物。
19.一种发酵纤维素材料的方法,该方法包括:用一种或多种发酵微生物发酵该纤维素材料,其中在如权利要求1至11中任一项所述的纤维二糖水解酶变体的存在下,用一种酶组合物使该纤维素材料糖化。
20.一种全液配制品或细胞培养组合物,包含如权利要求1至11中任一项所述的变体。
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