KR101288314B1

KR101288314B1 - 셀룰라아제를 생산하는 페니실리움 종 ｇｄｘ01 균주 및 이의 용도

Info

Publication number: KR101288314B1
Application number: KR1020110061270A
Authority: KR
Inventors: 김윤성; 장진원; 배정훈; 정화지; 이용욱
Original assignee: 주식회사 젠닥스
Priority date: 2011-06-23
Filing date: 2011-06-23
Publication date: 2013-07-22
Also published as: KR20130000628A

Abstract

본 발명은 셀룰라아제를 생산하는 페니실리움 종 GDX01 균주, 상기 균주를 배양하여 셀룰라아제를 생산하는 방법, 상기 방법으로 생산된 셀룰라아제를 이용하여 셀룰로오스의 당화과정을 수행하는 셀룰로오스의 당화방법, 상기 균주에 의해 생산되는 셀룰라아제, 상기 균주 또는 이의 배양액을 포함하는 미생물 제제, 상기 균주를 배양하여 미생물 제제를 제조하는 방법, 상기 균주 또는 이의 배양액을 포함하는 셀룰로오스 분해 증진용 사료첨가제 및 세제 조성물 및 고분자량의 탄수화물을 포함하는 바이오매스 물질에 상기 균주 또는 이의 배양액을 첨가하여 가수분해시키는 단계를 포함하는 바이오연료의 제조방법을 제공한다.

Description

셀룰라아제를 생산하는 페니실리움 종 ＧＤＸ01 균주 및 이의 용도{Penicillium sp. GDX01 strain producing cellulase and uses thereof}

본 발명은 셀룰라아제를 생산하는 페니실리움 종 GDX01 균주 및 이의 용도에 관한 것으로, 셀룰라아제를 생산하는 페니실리움 종 GDX01 균주, 상기 균주를 배양하여 셀룰라아제를 생산하는 방법, 상기 방법으로 생산된 셀룰라아제를 이용하여 셀룰로오스의 당화과정을 수행하는 셀룰로오스의 당화방법, 상기 균주에 의해 생산되는 셀룰라아제, 상기 균주 또는 이의 배양액을 포함하는 미생물 제제, 상기 균주를 배양하여 미생물 제제를 제조하는 방법, 상기 균주 또는 이의 배양액을 포함하는 셀룰로오스 분해 증진용 사료첨가제 및 세제 조성물 및 고분자량의 탄수화물을 포함하는 바이오매스 물질에 상기 균주 또는 이의 배양액을 첨가하여 가수분해시키는 단계를 포함하는 바이오연료의 제조방법에 관한 것이다.

매년 전 세계적으로 많은 양의 농산 및 임산 폐자원 바이오매스가 생산되며 최근에는 이들 폐자원을 활용하여 바이오연료를 포함한 고부가가치제품을 생산하는 바이오리파이너리 기술개발이 급성장하고 있다. 바이오매스 자원의 대부분은 셀룰로오스와 헤미셀룰로오스로 구성되어 있으며 화학적, 물리적 또는 생물학적 전환기술에 의해 당화과정을 거쳐 단당류로 전환이 된다. 지금까지 생물학적 전환과정에 필요한 당화효소는 주로 곰팡이를 이용하여 생산하고 있으나 바이오연료 생산을 목적으로 개발 상용화된 당화효소의 제품이 매우 제한적인 실정이다.

사료곡물의 바이오매스 역시 난소화성 셀룰로오스를 건조 중량의 40% 이상을 함유하고 있다.

국제 곡물가격의 급등에 따라 사료곡물에 함유되어 있는 난소화성 탄수화물, 특히 셀룰로오스를 효율적으로 이용하기 위해 셀룰라아제가 사료첨가용 효소로서 널리 이용되고 있다. 이는 가축의 장내에서 곡물 사료의 이용성을 높임으로써 사료효율 및 가축의 생산성을 향상시킬 뿐만 아니라 (Beguin 과 Aubert, 1994. FEMS Microbiol. Rev. 13:25-58), 가축분뇨의 퇴비화 촉진 (Kim 등, 1999. Kor. J. Microbiol. 35:277-282) 등 다양한 효과가 있는 것으로 알려져 있기 때문이다. 또한, 혐기성 섬유소분해세균 배양액을 한우에 급여할 경우 반추위 발효에 개선효과가 있는 것으로 보고된 바 있다 (Park 등, 2009. J. Anim. Sci. & Tech. (Kor). 51(1):45-52).

지금까지 다양한 종류의 미생물이 셀룰라아제를 분비하는 것으로 알려져 있는데, 곰팡이 중에서는 주로 Trichoderma 속이나 Aspergillus 속에서 주로 보고되고 있으며 (Oh 등, 2003. J. Microbiol. Biotechnol. 31(3):42-45), 재래산양과 한우의 장내에서도 셀룰라아제 활성이 있는 혐기성 곰팡이가 분리된 바 있다 (Kim 등, 2003. J. Anim. Sci. & Tech. (Kor). 45(6):1007-1018). 세균으로부터는 Bacillus 속, Clostridium 속, Streptomyces 속 등이 보고되었다 (Kim 등, 1999. Kor. J. Microbiol. 35:277-282). Jeong 등 (2003. Kor. J. Microbiol. Biotechnol. 31(4): 383-388)은 사료첨가용 셀룰라아제 및 자일라나아제 효소를 생산하기 위한 배지 및 배양조건을 보고한 바 있다.

한편, 한국공개특허 제2007-0116881호에는 '셀룰라제, 이것을 암호화하는 핵산 및 이들을 제조 및 사용하는 방법'이 개시되어 있고, 한국공개특허 제2008-0036369호에는 '셀룰라아제를 생산하는 신규한 바실러스 속 미생물 및 그 용도'가 개시되어 있으나, 본 발명에서와 같이 셀룰라아제 활성이 뛰어난 신규한 균주인 페니실리움 종 GDX01 균주에 대하여 개시된 바가 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 안출된 것으로서, 본 발명에서는 부패된 바이오매스 표면이나 주변 흙에서 분리한 페니실리움 종 GDX01 균주가 2종류의 페니실리움 옥살리쿰(Penicillium oxalicum) 및 페니실리움 디베르숨(Penicillium diversum) 균주보다 셀룰라아제 활성이 훨씬 더 높은 것을 확인함으로서 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 셀룰라아제를 생산하는 페니실리움 종 GDX01 균주를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 균주를 배양하여 셀룰라아제를 생산하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법으로 생산된 셀룰라아제를 이용하여 셀룰로오스의 당화과정을 수행하는 셀룰로오스의 당화방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 균주에 의해 생산되는 셀룰라아제를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 균주 또는 이의 배양액을 포함하는 미생물 제제를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 균주를 배양하여 미생물 제제를 제조하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 균주 또는 이의 배양액을 포함하는 셀룰로오스 분해 증진용 사료첨가제를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 균주 또는 이의 배양액을 포함하는 세제 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 고분자량의 탄수화물을 포함하는 바이오매스 물질에 상기 균주 또는 이의 배양액을 첨가하여 가수분해시키는 단계를 포함하는 바이오연료의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 페니실리움 종 GDX01 균주는 셀룰라아제 활성이 높기 때문에, 셀룰로오스 당화에 이용될 수 있고, 본 발명의 균주 및 이의 배양액은 미생물 제제, 사료첨가제, 세제 조성물 및 바이오 연료의 생산에 매우 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 균주의 ITS(internal transcribed spacer) 영역을 통한 PCR을 모식적으로 나타낸다.
도 2는 블라스트(Blast)를 통해 본 발명에서 개발한 균주의 동정을 실시한 결과이다.
도 3은 콩고레드(Congo-red) 염색을 통해 본 발명의 균주인 페니실리움 종 GDX01 균주의 셀룰라아제 활성을 확인한 결과이다.
도 4는 탄소원(팜부산물(EFB) 및 쌀)에 따른 본 발명의 균주의 셀룰라아제 활성을 나타낸다((a) : CMCase, (b) : FPase, (c) : CBase).
도 5는 밀기울의 농도에 따른 본 발명의 균주의 셀룰라아제 활성을 나타낸다((a) : CMCase, (b) : FPase, (c) : CBase).
도 6은 효소 추출물의 농도에 따른 본 발명의 균주의 셀룰라아제 활성을 나타낸다.
도 7은 초기함수율에 따른 본 발명의 균주의 셀룰라아제 활성을 나타낸다.
도 8은 바이오매스 크기에 따른 본 발명의 균주의 셀룰라아제 활성을 나타낸다((a) : CMCase, (b) : FPase, (c) : CBase).
도 9는 본 발명의 균주의 자일라나아제 활성을 나타낸다.
도 10은 본 발명의 균주를 포함한 페니실리움 종 간의 셀룰라아제 활성을 비교한 결과이다((a) : CMCase, (b) : FPase, (c) : CBase)

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 셀룰라아제(cellulase)를 생산하는 페니실리움 종 GDX01 (Penicillium sp. GDX01) 균주를 제공한다.

부패된 바이오매스 표면이나 주변 흙에서 곰팡이를 분리하였고, 균사상 및 포자상으로 자라는 곰팡이로부터 수차례 계대배양함으로써 단일 균주인 페니실리움 종 GDX01 균주를 분리하였다.

분리한 균주의 ITS(internal transcribed spacer) 영역을 분석한 결과 페니실리움 옥살리쿰(Penicillium oxalicum)과 96% 일치하는 것을 확인함으로써 페니실리움 종 GDX01 균주를 동정한 것이다.

상기 페니실리움 종 GDX01 (Penicillium sp. GDX01) 균주를 한국생명공학연구원 생물자원센터에 2011년 5월 23일자로 기탁하였다(기탁번호: KCTC 11939BP).

본 발명의 균주는 호기성 조건하에 다른 필수 영양분과 함께 동화가능한 탄소 및 질소를 함유하는 배지에서 배양될 수 있다. 배지는 당업계에 통상적으로 이용되는 배지를 이용할 수 있다.

본 발명의 탄소원은 바람직하게는 볏짚 또는 팜부산물(empty fruit bunch)을 포함하는 바이오매스일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 균주 배양 배지에 포함된 팜부산물의 크기가 2cm 이상일 경우 셀룰라아제의 활성은 거의 없고, 크기가 작을수록 활성이 더 높다. 바람직한 팜부산물의 크기는 1 ~ 10mm일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 질소원은 효모 추출물(yeast extract) 또는 밀기울(wheat bran)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 균주의 상기 배양은 배지 함수율이 40~60 중량%일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 셀룰라아제는 엔도-β-1,4-글루카나아제, 엑소-β-1,4-글루칸 셀로바이오히드롤라아제 및/또는 셀로비아제를 포함한다.

본 발명의 셀룰라아제는 CMCase(carboxymethylcellulase), FPase(filter paperase) 및/또는 CBase(beta-glucosidase)를 포함한다.

본 발명의 상기 당화과정은 셀룰로오스 공급원으로 볏짚 또는 팜부산물을 포함하는 바이오매스를 사용하여 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 당화과정은 셀룰로오스 공급원인 바이오매스를 전처리하는 단계 및 전처리한 바이오매스를 셀룰라아제로 가수분해시키는 단계로 이루어지는 당업계에 통상적으로 이용되는 당화방법을 통해 수행될 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명의 균주에 의해 생산되는 셀룰라아제를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 미생물 제제를 제공한다. 본 발명의 셀룰로오스 분해용 미생물 제제는 유효성분으로서 페니실리움 종 GDX01 균주를 이용하여 제조될 수 있다. 본 발명에 따른 셀룰로오스 분해용 미생물 제제는 용액, 분말, 현탁액, 분산액, 에멀젼, 유성 분산액, 페이스트, 분진, 흩뿌림 물질 또는 과립제로 제조할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

또한, 본 발명은 상기 균주를 배양하는 단계를 포함하는 미생물 제제를 제조하는 방법을 제공한다. 본 발명의 균주는 호기성 조건하에 다른 필수 영양분과 함께 동화가능한 탄소 및 질소를 함유하는 배지에서 배양될 수 있다. 배지는 당업계에 통상적으로 이용되는 배지를 이용할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 셀룰로오스 분해 증진용 사료첨가제를 제공한다.

상기 균주 및 이의 배양은 전술한 바와 같다.

본 발명의 사료 첨가제에는 구연산, 후말산, 아디픽산, 젖산, 사과산 등의 유기산이나 인산나트륨, 인산칼륨, 산성피로인산염, 폴리인산염(중합인산염) 등의 인산염이나 폴리페놀, 카테킨(catechin), 알파-토코페롤, 로즈메리 추출물(rosemary extract), 비타민 C, 녹차 추출물, 감초 추출물, 키토산, 탄닌산, 피틴산 등의 천연 항산화제 중 어느 하나 또는 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 사료 첨가제에는 아미노산, 무기염류, 비타민, 항생물질, 항균물질, 항산화, 항곰팡이 효소, 다른 생균 형태의 미생물 제제 등과 같은 보조제 성분; 곡물, 예를 들면 분쇄 또는 파쇄된 밀, 귀리, 보리, 옥수수 및 쌀; 식물성 단백질 사료, 예를 들면 평지, 콩 및 해바라기를 주성분으로 하는 것; 동물성 단백질 사료, 예를 들면 혈분, 육분, 골분 및 생선분; 당분 및 유제품, 예를 들면 각종 분유 및 유장 분말로 이루어지는 건조성분; 지질, 예를 들면 가열에 의해 임의로 액화시킨 동물성 지방 및 식물성 지방 등과 같은 주성분; 영양보충제, 소화 및 흡수향상제, 성장촉진제, 질병예방제와 같은 첨가제가 포함될 수 있다.

본 발명의 사료첨가제는 건조 또는 액체 상태의 제제 형태일 수 있으며, 사료 첨가용 부형제를 포함할 수 있다. 사료 첨가용 부형제로는 예를 들어, 제올라이트, 옥분 또는 미강 등을 들 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 사료 첨가제는 하나 이상의 효소 제제를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어 리파제와 같은 지방 분해효소, 피틴산(phytic acid)을 분해하여 인산염과 이노시톨인산염을 만드는 파이타제(phytase), 녹말과 글리코겐 등에 포함되어 있는 알파-1,4-글리코시드 결합(α-1,4-glycoside bond)을 가수분해하는 효소인 아밀라제, 유기인산에스테르를 가수분해하는 효소인 포스파타제(phosphatase), 말토오스를 두 분자의 글루코스로 가수분해하는 말타제 및 사카로스를 가수분해하여 글루코스-프룩토스 혼합물을 만드는 전환효소 등을 포함할 수 있다.

본 발명의 가축 사료 첨가제는 동물에게 단독으로 투여되거나 식용 담체 중에서 다른 사료 첨가제와 조합되어 투여될 수 있다. 또한, 상기 가축 사료 첨가용 조성물에는 탑 드레싱으로서 또는 이들을 가축 사료에 직접 혼합하거나 또는 사료와 별도로, 별도의 경구 제형으로, 또는 다른 성분과 조합하여 쉽게 투여할 수 있다. 통상적으로, 당업계에 잘 알려진 바와 같이 단독 일일 섭취량 또는 분할 일일 섭취량을 사용할 수 있다.

본 발명의 사료 첨가제가 사용될 수 있는 동물은 예를 들어 식용우, 젖소, 송아지, 돼지, 돼지새끼, 양, 염소, 말, 토끼, 개, 고양이 등과 같은 가축, 병아리, 알닭, 가정용 닭, 수탉, 오리, 거위, 칠면조, 메추라기, 작은새 등과 같은 가금류를 포함하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 사료 첨가제에 포함되는 본 발명의 페니실리움 종 GDX01 (Penicillium sp. GDX01) 균주의 양은 특별히 한정되지 않으나, 가축의 소화관에서 장기간 생존하면서 섬유질계 및 반섬유질계 물질을 분해하기에 적합한 양으로 포함된다.

또한, 본 발명은 상기 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 세제 조성물을 제공한다.

본 발명의 세제 조성물은 1부 및 2부 수성 세제 조성물, 비수성 액체 세제 조성물, 성형 고체(cast solid), 과립 형태, 입자 형태, 압축 정제, 겔 및/또는 페이스트 및 슬러리 형태일 수 있다. 상기와 같은 세제 조성물을 사용하여 음식물의 찌든 때, 음식물 잔류막 및 기타 소량의 식품 조성물을 신속하게 제거할 수 있다. 본 발명의 세제 조성물은 전분 다당류를 촉매 가수분해하여 말라붙은 얼룩 제거에 효과적일 수 있다.

본 발명의 세제 조성물은 단단한 표면을 세정하는 세제 조성물, 직물을 세정하는 세제 조성물, 설거지용 세제 조성물, 구강 세정용 세제 조성물, 의치 세정용 세제 및 콘택트 렌즈 세정 용액을 비롯한 세제 조성물을 제공할 수 있다.

또한, 본 발명은 고분자량의 탄수화물을 포함하는 바이오매스 물질로부터 바이오연료(Biofuel)를 제조하는 방법에 있어서, 상기 바이오매스 물질에 본 발명의 균주 또는 이의 배양액을 첨가하여 가수분해시키는 단계를 포함하는 바이오연료(Biofuel)의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 고분자량의 탄수화물을 포함하는 바이오매스 물질로부터 바이오연료(Biofuel)를 제조하는 방법은 고분자량의 탄수화물을 포함하는 바이오매스 물질을 전처리하는 단계, 전처리한 바이오매스를 효소로 가수분해시키는 단계 및 가수분해된 바이오매스 물질을 발효시키는 단계로 이루어지는 당업계에 통상적으로 이용되는 바이오연료(Biofuel)의 제조방법을 통해 수행될 수 있다.

본 발명의 바이오연료의 제조방법에 있어서, 상기 바이오매스는 전분질계(곡물, 감자류 등), 셀룰로오스계(초본, 임목, 왕겨 등), 당질계(사탕수수, 사탕무 등) 및 단백질계(가축분뇨, 사체, 미생물 균체 및 이들로부터 유래하는 종이와 음식물찌꺼기 등 유기성 자원) 등의 고분자량의 탄수화물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 바이오연료를 제공한다. 상기 바이오연료는 바이오에탄올, 바이오디젤, 바이오가스 등을 예로 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실험방법

1. 균주의 분리 및 보관

셀룰라아제 생산 곰팡이를 분리하기 위해서 부패된 바이오매스 표면이나 주변 흙을 이용하였다. 곰팡이만을 분리하기 위해서는 박테리아를 제거해주어야 한다. 또한 곰팡이의 종류도 다양하기 때문에 단일균주로의 분리도 진행되어야 한다. 곰팡이를 분리하기 위해서 멸균된 증류수(DW)에 흙이나 바이오매스를 넣고 볼텍싱(vortexing)한다. 이것을 연속 희석(serial dilution)하여 10^-3까지 희석한다. 박테리아를 최대한으로 제거해주기 위해 다양한 기작으로 작용하는 항생제 (Kanamycin, streptomycin, gentamycin, ampicillin)가 포함된 PDA배지를 제작했다. 여기에 희석한 현탁액을 100μl 정도 뿌리고 도말했다. 30℃ 배양기에 약 일주일 정도 키우면 다양한 종류의 곰팡이들이 자란다. 균사상으로 자라는 곰팡이와 포자상으로 자라는 곰팡이가 섞여 있기 때문에 루프(loop)로 다시 긁어 수차례 계대 배양 끝에 단일 균주로 분리할 수 있었다.

분리된 단일 균주는 다음과 같은 방법으로 보존하고 있다. 다 자란 곰팡이를 플레이트로부터 아가 블럭(agar block) 상태로 자른 후 이것을 15% 글리세롤에 넣어 -70℃에 보관했다. 이때, 아가 블럭의 개수는 6개가 적당하고 만일을 대비해 스톡(stock)은 두 개씩 제작하여 각각 다른 곳에 보관했다. 동결보존법 이외에도 사면배지를 통해 계대를 하여 1년 동안 보관하는 방법도 사용했다.

2. 균주의 동정

일반적으로 동정에 사용하는 PCR 절편은 rRNA이며 이에 대한 정보도 많이 알려져 있지만, 사상균(filamentus fungi)의 경우 ITS (internal transcribed spacer) 영역에 대한 균주별 서열이 많이 알려져 있다. 도 1과 같이 작은 서브유닛 18S RNA와 5.8S RNA 사이의 ITS1에 해당하는 부분의 PCR 프라이머를 이용하여 PCR을 한 후 서열을 확인하였다.

PCR을 하기 위해서는 미확인 균주의 염색체 DNA가 PCR 주형으로 필요하기 때문에 단일균주로 분리된 미확인 균주로부터 염색체 DNA를 분리하였다. 곰팡이용 브레이킹 버퍼(breaking buffer)와 비드(bead)를 통해 세포를 분해(lysis)시키고 단백질과 같은 고분자를 제거하여 DNA만을 얻었다. 이것을 주형으로 사용하고 ITS1 영역에 해당하는 프라이머를 통해 PCR을 했다. 균주마다 차이는 있지만 약 200bp에 해당하는 PCR 산물을 얻었다. 얻어진 PCR 산물은 T-벡터에 클로닝하였다. T-벡터에 존재하는 SP1, T4의 프라이머를 이용하여 시퀀싱을 진행했고, 이에 해당하는 염기서열을 블라스트(blast)를 통해 어떤 균주의 DNA인지 확인하는 작업을 진행했다. 도 2에서 알 수 있듯이 분리한 균주는 페니실리움(Penicillium)과 가장 비슷한 것을 알 수 있다. 따라서 이 균주를 페니실리움 종 GDX01(Penicillium sp. GDX01)으로 명명하였다.

3. 균주의 특성 분석

3-1. 셀룰라아제 활성 측정법

페니실리움 종 GDX01이 만드는 셀룰라아제의 활성은 정성적, 정량적 방법을 통하여 확인할 수 있다. 정성적인 방법으로는 염색약(congo-red)을 이용한 셀룰로오스 분해능을 비교하는 방법이 있다. 셀룰로오스 유사물질인 CMC (carboxy- methylcellulose)가 1% 포함된 아가 플레이트에 효소를 5~10ul 떨어뜨리고 50℃에서 3시간 반응시킨 후, 0.1% 염색약(congo-red)으로 약 30분간 염색하고, 1M NaCl을 이용하여 약 30분간 탈색시킨다. 효소를 떨어뜨린 주위에 클리어 존(clear zone)이 형성되고 이것은 효소의 활성이 높을수록 크게 나타난다(도 3).

정량적인 방법으로는 셀룰로오스를 직접 기질로 넣어주고 효소에 의해 분해된 환원당을 OD값을 이용하여 측정하는 방법이 있다. 총 셀룰라아제의 활성을 측정하기 위해 필터 페이퍼 분석법(filter paper assay)을 이용했고, 이 방법은 기질을 셀룰로오스인 필터 페이퍼로 넣어준다. 또한 CMC를 통해 CMCase 활성을 확인할 수 있고, 글루코오스의 이합체인 셀로비오스를 기질로 사용하여 베타-글루코시다제(beta-glucosidase) 활성을 확인할 수 있다. 활성 측정에 사용하는 단위는 IU(international unit)으로 1분당 만들어지는 1 μmole의 산물을 기준으로 한다.

3-2. 필터 페이퍼 분석법( filter paper assay )

필터 페이퍼 분석법은 전체 셀룰라아제의 활성을 측정하는 방법이다. 기질로 Whatman no.1 필터 페이퍼의 1x6 cm 크기를 사용했다. 마이크로원심분리 튜브(Microcentrifuge tube)에 1ml의 0.05M 소듐 시트레이트 버퍼(sodium citrate buffer)를 넣고, 셀룰라아제가 포함된 고상발효 샘플의 상등액을 500μl 첨가시켜준다. 여기에 필터 페이퍼를 넣은 것과 넣지 않은 것으로 구분하여 50℃에서 1시간 동안 반응시킨다. 반응 후 즉시 얼음에 보관하고 기질을 분해하여 생성된 환원당을 확인하기 위해 DNS (dinitro salicylic acid) 분석을 이용한다. 반응액 200μl와 DNS 용액 700μl를 섞은 후 10분간 끓인다. 얼음에 식힌 후 540nm의 파장으로 흡광도를 측정한다. 이에 앞서 글루코스를 이용하여 표준 곡선(standard curve)을 만들고 이를 통해 생성된 당을 계산한다. 사용하는 단위는 U이며 이것은 1분당 필터 페이퍼를 분해하여 생성된 1μmole의 당을 기준으로 한다.

3-3. CMC 분석

CMC 분석은 셀룰라아제 타입 중 엔도-글루카나제의 활성을 측정하는 대표적인 방법이다. 기질로 1% CMC가 사용되며 필터 페이퍼 분석과 유사한 원리로 진행한다. 먼저 마이크로원심분리 튜브에 0.1M 포타슘 포스페이트 버퍼 (pH 6.0) 100μl를 넣고 1% CMC 50μl와 셀룰라아제가 포함된 고상발효 상등액을 50μl 첨가하여 전체 200μl 반응액을 만든다. (-) 대조구로 1% CMC 50μl 대신 0.1M 포타슘 포스페이트 버퍼 50μl를 넣어준 것도 같이 진행한다. 또한 분광광도계(spectrophotometer)의 블랭크(blank) 값으로 효소를 빼고 1% CMC를 대신 넣어준 것도 같이 진행한다. 반응액이 완성되면 50℃ 배양기에서 30분간 반응시키고, 필터 페이퍼 분석과 마찬가지로 DNS 분석을 통해 활성을 측정한다.

3-4. CB 분석( cellobiose assay )

일반적인 베타-글루코시다제의 활성 측정은 pNPG를 이용하여 한다. 그러나 CB(셀로비오스)를 직접 기질로 사용하면 더 간단한 활성측정이 가능하다. 500μl의 셀룰라아제가 포함된 고상발효 상등액에 소듐 시트레이트 버퍼 500μl를 첨가하여 반응액을 만든다. 기질로 15mM CB가 포함된 버퍼를 사용한다. 50℃ 배양기에 30분 반응시키고 즉시 10분간 끓여 반응을 멈춘다. 영동제약의 글루코오스 KIT을 이용해 분해된 글루코오스의 양을 측정한다. KIT 1ml에 반응액을 10μl 넣고 37℃에서 10분간 반응시킨다. 반응액을 안 넣은 샘플을 블랭크(blank)로 하여 OD_600nm에서 흡광도를 측정한다. DNS 분석과 마찬가지로 글루코오스를 이용해 표준 곡선을 잡는다.

3-5. 자일라나아제 활성 측정

6탄당인 셀룰로오스와 달리 5탄당인 헤미셀룰로오스는 자일라나아제(xylanase)에 의해 분해된다. 페니실리움 종 GDX01의 경우 셀룰라아제 및 자일라나아제도 동시에 발현시킨다. 기질은 1% 버치우드 자일란(birchwood xylan)을 사용하며 실험방법은 CMC 분석과 동일하다.

실시예 1. 페니실리움 종 GDX01 ( Penicillium sp . GDX01 )의 셀룰라아제 활성측정 결과

페니실리움 종 GDX01이 최고의 활성을 나타내는 조건을 찾기 위해 다양한 조건에서 셀룰라아제 활성을 측정하였다.

1-1. 탄소원에 따른 셀룰라아제 활성

볏짚, 갈대, 억새, 팜부산물(EFB, empty fruit bunch) 등 다양한 탄소원(biomass)을 이용하여 곰팡이를 생장시키고 이를 통해 나오는 셀룰라아제의 활성을 분석한 결과 볏짚, EFB에서 가장 높은 활성이 나타났다. 반면에 갈대, 억새의 경우 셀룰라아제의 활성이 거의 나타나지 않았다 (도 4).

1-2. 질소원에 따른 셀룰라아제 활성

셀룰라아제의 분비량은 넣어준 질소원에 의해 영향을 많이 받는다. 셀룰라아제와 같은 단백질을 세포 내에서 합성할 때, 탄소원에 의한 전환보다 질소원을 직접 이용하면 단백질 합성이 더 빠르다. 실제로 질소원의 농도가 높을수록 셀룰라아제의 활성이 높게 나왔다. 그러나 과량의 질소원을 넣어줄 경우 반대로 활성이 대폭 감소함을 확인했다.

질소원의 종류로 효모 추출물(yeast extract)와 밀기울(wheat bran)을 사용했다. 효모 추출물은 쉽게 사용할 수 있는 질소원이고, 밀기울은 주로 탄소원으로 사용되는 바이오매스(biomass)지만 여러 문헌을 통해 질소원이 많이 포함되어 있다고 알려져 있다. 효모 추출물의 농도는 0~15%까지 다양하게 사용했으며, 밀기울은 EFB에 0~50%까지 섞어 넣어주는 것으로 진행했다. 도 5와 같이 밀기울의 비율이 높을수록 CMCase, FPase, CBase의 활성이 비례하여 높아진 것을 확인했다. 반면 효모 추출물의 농도별 고상발효에서는 도 6과 같이 농도가 너무 높아지면 오히려 셀룰라아제 활성이 감소함을 확인했다. 수치상으로 비교해보면 밀기울을 사용했을 때보다 5% 효모 추출물을 사용했을 때 셀룰라아제 활성이 가장 높게 나타남을 확인했다.

1-3. 초기함수율에 따른 셀룰라아제 활성

곰팡이의 생장에 중요한 요소가 바로 물이다. 따라서 40 ~ 80%의 다양한 조건으로 초기함수율을 맞춰주고 곰팡이를 배양시켰다. 도 7과 같이 초기함수율에 따라 셀룰라아제 활성이 달라지는 것을 확인했고, 결과적으로 함수율 40~60% 수준의 물이 셀룰라아제 활성에 가장 좋은 요소임을 확인했다.

1-4. 바이오매스 ( Biomass ) 크기에 따른 셀룰라아제 활성

EFB의 크기가 셀룰라아제 활성에 영향을 미치는지 알아보기 위해 섬유(fiber) 형태의 EFB, 5mm, 2mm 크기를 이용하여 활성을 측정했다. 크기가 작을수록 미생물이 접촉할 수 있는 표면적이 늘어나기 때문에 셀룰라아제 활성에 영향을 미칠 것으로 생각하였다. 실험 결과 길이가 2~15cm의 EFB에서는 셀룰라아제 활성이 거의 나타나지 않았다. 반면 5mm, 2mm에서는 비슷한 활성을 나타냈다. 도 8에서 보듯이 5mm 이하의 EFB에서는 셀룰라아제 활성에 큰 영향을 미치지는 않았다. 그러나 CBase(beta-glucosidase)의 경우 크기가 작을수록 활성이 더 높게 나오는 것으로 확인되었다.

1-5. 자일라나아제 ( Xylanase ) 활성

볏짚, EFB와 같은 목질계 바이오매스에는 셀룰로오스 이외에도 헤미셀룰로오스가 존재한다. 셀룰라아제 활성을 갖는 페니실리움 종 GDX01에서도 헤미셀룰로오스의 분해능이 발견되었다(도 9).

실시예 2. 다른 페니실리움 균주와의 비교

페니실리움 종 GDX01의 ITS 영역 분석 결과 페니실리움 옥살리쿰(Penicillium oxalicum)과 약 96% 일치하는 것으로 나타났다. 따라서 기존 페니실리움 속의 다른 균주들과의 셀룰라아제 활성을 비교해 보았다. KCTC의 페니실리움 옥살리쿰 두 가지 균주(KCTC no. 6440, 16912)와 기존에 셀룰라아제 활성을 갖는다는 페니실리움 디베르섬(Penicillium diversum, KCTC 16052)을 이용해 같은 실험으로 활성을 비교했다. 그 결과 페니실리움 종 GDX01의 활성이 전체적으로 높게 나오는 것을 확인했다(도 10).

한국생명공학연구원

KCTC11939

20110523

Claims

셀룰라아제(cellulase)를 생산하는 페니실리움 종 GDX01 (Penicillium sp. GDX01) 균주(KCTC 11939BP).
제1항의 균주를 배양하여 셀룰라아제를 생산하는 것을 특징으로 하는 셀룰라아제의 생산방법.
제2항에 있어서, 상기 배양은 탄소원 및 질소원을 포함하는 배지에서 수행하는 것을 특징으로 하는 셀룰라아제의 생산방법.
제3항에 있어서, 상기 탄소원은 볏짚 또는 팜부산물(empty fruit bunch)을 포함하는 바이오매스인 것을 특징으로 하는 셀룰라아제의 생산방법.
제4항에 있어서, 상기 팜부산물의 크기는 1 ~ 10mm인 것을 특징으로 하는 셀룰라아제의 생산방법.
제3항에 있어서, 상기 질소원은 효모 추출물(yeast extract) 또는 밀기울(wheat bran)인 것을 특징으로 하는 셀룰라아제의 생산방법.
제3항에 있어서, 상기 배양은 배지 함수율이 40~60 중량%인 것을 특징으로 하는 셀룰라아제의 생산방법.
제2항 내지 제7항 중 어느 한 항의 방법으로 생산된 셀룰라아제를 이용하여 셀룰로오스의 당화과정을 수행하는 것을 특징으로 하는 셀룰로오스의 당화방법.
제8항에 있어서, 상기 당화과정은 셀룰로오스 공급원으로 볏짚 또는 팜부산물을 포함하는 바이오매스를 사용하여 수행하는 것을 특징으로 하는 셀룰로오스의 당화방법.
삭제
제1항의 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 미생물 제제.
제1항의 균주를 배양하는 단계를 포함하는 미생물 제제를 제조하는 방법.
제1항의 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 셀룰로오스 분해 증진용 사료첨가제.
제1항의 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 세제 조성물.
고분자량의 탄수화물을 포함하는 바이오매스 물질로부터 바이오연료(Biofuel)를 제조하는 방법에 있어서,
상기 바이오매스 물질에 제1항의 균주 또는 이의 배양액을 첨가하여 가수분해시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 바이오연료(Biofuel)의 제조방법.
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