KR20100053285A

KR20100053285A - 신균주 페니실륨 피노필럼 ｋｍｊ601 유래 엔도글루카네이즈의 생산 최적화 및 유전자 클로닝

Info

Publication number: KR20100053285A
Application number: KR1020080112329A
Authority: KR
Inventors: 이정걸; 이경미; 마리무투 제야; 주아름; 이종인; 노항덕
Original assignee: 건국대학교 산학협력단
Priority date: 2008-11-12
Filing date: 2008-11-12
Publication date: 2010-05-20
Also published as: KR101062978B1

Abstract

본 발명은 신규 균주인 페니실륨 피노필럼(Penicillium pinophilum)으로부터 셀룰로오스 분해 효소 중 하나인 엔도글루카네이즈 (endo-1,4-glucanase, EG)의 생산 방법, 최적 조건 확립, EG 효소 및 그 효소를 코딩하는 유전자에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 페니실륨 피노필럼 KMJ601로부터 고활성 EG의 생산 방법, 최적 조건 확립 및 EG 효소 및 그 효소를 코딩하는 유전자에 관한관한 것이다.

발현생산, 셀룰라아제, 엔도글루카네이즈 유전자, 페니실륨 피노필럼

Description

신균주 페니실륨 피노필럼 ＫＭＪ601 유래 엔도글루카네이즈의 생산 최적화 및 유전자 클로닝 {Optimization of endo-β-1,4-glucanase production by a novel strain Penicillium pinophilum KMJ601 and its gene cloning}

본 발명은 신균주 페니실륨 피노필럼 KMJ601로부터 엔도-β-1,4-글루카나아제 효소를 대량 생산하는 방법, 그 엔도글루카네이즈 효소 및 그 효소를 코딩하는 유전자에 관한 것이다.

셀룰로스(cellulose)는 지구상에 존재하는 가장 풍부한 유기물질이며 재생 가능한 자원이나, 대부분의 셀룰로스 자원은 농산 및 임산 폐기물이 범람하고 있는 현재 주요한 환경오염원으로 작용하고 있다. 그러므로 이에 대한 효율적인 당화공정의 개발은 식량문제, 연료문제 그리고 환경문제의 해결에 큰 도움이 될 수 있을 것이다. 전 세계의 농산 및 임산 폐자원은 매년 30억 톤 이상이며, 아시아에서만 8억 톤 이상이 생산된다. 이는 주로 셀룰로스와 헤미셀룰로스로 이루어져있어 이들의 당화에 의한 포도당을 포함한 단당류의 생산은 바이오에너지 자원의 중요한 원료 생산 기술이 된다.

오랫동안 셀룰로스를 고효율로 당화시키기 위한 많은 연구가 있어 왔으며 그 중 특히 당화효소의 개발에 초점을 맞춰 많은 연구가 이루어져 왔다. 그 결과 현재에는 이들 당화효소의 용도가 다양하게 개발되어 여러 분야에서 상업화 되었으며 또한 새로운 응용연구도 활발하게 진행되고 있다. 셀룰라아제는 섬유산업, 제지산업, 세제산업, 사료산업 등에서 많이 이용되고 있으며 이외에도 식품 산업에 있어, 저 칼로리 식품의 제조와 음식물 쓰레기의 발효 등 다양한 용도에 적용되고 있다.

한편, 식물체의 세포벽은 셀룰로스(불용성 β-1,4-글루칸 섬유), 헤미셀룰로스 (hemicellulose, 비셀룰로스계 다당류), 리그닌(lignin, 복잡한 폴리페놀 구조의 다당류)과 같은 중합체로 구성되어 있다. 구성성분 중 가장 많이 존재하는 셀룰로스는 포도당 단위가 β-1,4 결합으로 연결된 동종 중합체로서 이를 단당류로 분해하기 위해서는 엔도-β-1,4-글루카나아제(endo-β-1,4-glucanase) [EC 3. 2. 1. 4], 엑소-β-1,4-글루칸아제(exo-β-1,4-glucanase) [EC 3. 2. 1. 91], 베타-글루코시다아제(β-glucosidase) (EC 3. 2. 1. 21) 등 세 종류의 효소가 필요하다. 엔도-글루칸아제는 안쪽에서 β-1,4 포도당 결합을 무작위적으로 절단하고 엑소-글루칸아제가 비환원당 말단에서 포도당 이당체인 셀로비오스(cellobiose)로 절단해 나간다. 셀로비오스는 베타-글루코시다아제에 의해서 포도당으로 최종 분해된다.

종래에 이들 효소의 생산은 주로 곰팡이(fungi)를 이용하였으며, 특히 산업적인 측면에서 효소 생산은 아스퍼질러스(Aspergillus)와 트리코더마 (Trichoderma)를 이용하였다. 셀룰라아제 생산 균주로는 트리코더마 리제이 ZU-02 (Trichoderma reesei ATCC 56764)가 대표적인 균주로 집중 연구되어 왔으나, 효소 의 생산 농도 및 활성이 충분히 높지 못하다는 단점이 있다. 바이오매스로부터 에탄올을 생산하는 공정은 원료 물질의 재생, 생산 연료의 환경 친화성 등 많은 장점을 갖고 있지만 그 생산 단가가 현저히 높아 실용화에 장애가 되고 있다. 이러한 에탄올 생산 공정에 있어 비용의 가장 큰 부분은 당화효소의 생산비로서 전체 비용의 약 60 %에 해당한다. 그러므로 고활성 셀룰라아제 및 이를 생산하는 고활성 균주의 개발이 절실히 요구되고 있다.

본 발명은 상기의 문제점을 해결하고 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 고활성 셀룰라아제를 생산하는 균주를 선별하고 그 균주를 이용하여 셀룰라아제를 생산하는 최적 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 균주로부터 셀룰라아제 효소유전자를 클로닝 하는 방법을 제공하는데 있다.

상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 고활성 셀룰라아제 엔도-β-1,4-글루카나아제를 생산하는 페니실륨 피노필럼 (Penicillium pinophilum) KMJ601(기탁번호 93063P)을 제공한다.

또한 본 발명은 본 발명의 상기 균주를 배양하는 단계를 포함하는 엔도-β-1,4-글루카나아제의 생산방법을 제공한다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 배양 단계에서 배양 온도는 23~32℃인 것이 바람직하고, 교반 조건은 100∼300 rpm인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

또한 본 발명은 서열번호 4에 기재된 아미노산 서열을 가지는 엔도-β-1,4-글루카나아제를 제공한다. 본 발명의 엔도-β-1,4-글루카나아제는 서열번호 4에 예시된 것이 바람직하나, 서열번호 4의 아미노산 서열에 하나 이상의 치환, 결손, 부가 등의 변이가 일어난 본 발명의 엔도-β-1,4-글루카나아제의 활성을 가지는 모든 변이 엔도-β-1,4-글루카나아제도 본 발명의 보호범위에 포함된다.

본 발명의 바람직한 실시예에서, 상기 엔도-β-1,4-글루카나아제 활성을 가진 효소는 서열번호: 4에 개시된 아미노산 서열과의 서열 동일성이 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 및 99% 이상인 아미노산 서열을 포함한다.

본 발명에서 폴리펩티드가 또 다른 서열에 대하여 특정 비율 (예컨대, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99%) 의 서열 동일성을 가진다는 것은, 상기 두 서열을 정렬시킬 때, 상기 서열들의 비교시에 상기 비율의 아미노산 잔기가 동일함을 의미한다. 상기 정렬 및 백분율 상동성 또는 동일성은, 당업계에 공지된 임의의 적당한 소프트웨어 프로그램, 예를 들어 문헌[CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F. M. Ausubel 등 (eds) 1987 Supplement 30 section 7.7.18)]에 기재된 것들을 사용하여 결정할 수 있다. 바람직한 프로그램으로는, GCG Pileup 프로그램, FASTA(Pearson 등 1988 Proc. Natl Acad. Sci USA85:2444-2448), 및 BLAST (BLAST Manual, Altschul 등, Natl. Cent. Biotechnol. Inf., Natl Lib. Med. (NCIB NLM NIH), Bethesda, MD, 및 Altschul 등 1997 NAR25:3389-3402)이 있다. 또 다른 바람직한 정렬 프로그램은 ALIGN Plus(Scientific and Educational Software, PA) 로서, 바람직하게는 기본 매개변수를 사용하는 것이다. 사용가능한 또 다른 서열 소프트웨어 프로그램은 Sequence Software Package Version 6.0 (Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, WI) 에서 이용가능한 TFASTA Data Searching Program 이다.

또한 본 발명은 상기 엔도-β-1,4-글루카나아제를 코딩하는 유전자를 제공한다. 본 발명의 바람직한 실시예에 있어서, 상기 유전자는 서열번호 5에 기재된 염기 서열을 가지는 것이 바람직하나 상기 변이된 본 발명이 단백질을 코딩하는 유전자도 본 발명의 보호범위에 포함되며, 유전자 코드를 고려하여 서열번호 5에 기재된 서열과 적어도 85%, 바람직하게는 90%, 더욱 바람직하게는 적어도 95% 이상 상동성을 가진 서열도 본 발명의 유전자에 포함된다.

본 발명의 엔도-β-1,4-글루카나아제는 페니실륨 피노필럼 (Penicillium pinophilum)의 배양물의 상등액 또는 상청액으로부터 분리 및 정제할 수 있으며, 유전공학적 재조합 기술을 이용하여 페니실륨 피노필럼 (Penicillium pinophilum) 이외 균주 또는 인공적인 화학적 합성법 등에 의하여 생산 및 분리할 수 있다.

재조합 기술을 이용하는 경우, 통상적인 재조합 단백질 발현의 용이함을 위하여 사용되는 인자들, 예컨대 항생제 저항성 유전자, 친화성 컬럼 크로마토그래피에 사용될 수 있는 리포터 단백질 또는 펩타이드를 사용할 수 있으며, 이러한 기술은 본원발명이 속하는 기술분야의 당업자라면 용이하게 실시 가능한 범주에 해당된다.

본 발명의 엔도-β-1,4-글루카나아제 유전자는 페니실륨 피노필럼 균체로부터 분리된 것이다. 먼저, 엔도-β-1,4-글루카나아제 유전자를 가진 균주로부터 염색체 DNA를 취득한다. 염색체 DNA의 분리방법은 공지의방법을 사용할 수 있다.

예를 들면, 페니실륨 피노필럼 균주를 LB배지, 또는 M9배지에 적당한 탄소원을 첨가한 것 등에서 배양한 후, 예를 들면, 마머(Marmer)등의 방법(Journal of Molecular Biology, 3권, 208페이지, 1961년) 등에 의해 염색체 DNA를 조제한다. 이 방법에 의해 얻게 된 염색체 DNA를 적당한 제한효소(예를 들면 Sau3AI 등)를 사용해서 분해하고, 적당한 단편길이를 가진 분해물에 대해서, 이들을 연결가능한 제한효소(예를 들면 BamHI 등)로 절단한 벡터에 연결하여, 유전자 라이브러리를 제작한다. 여기서의 적당한 단편길이란, 통상의 플라스미드벡터를 사용할 때는 4000～25000염기쌍 정도, 코스미드 또는 파지(phage)벡터를 사용할 때는 15000～30000의 염기쌍정도이다. 적당한 길이의 DNA단편을 분리하여 취하는 방법으로서는, 자당밀도구배를 사용하는 방법이나 아가로즈겔을 사용하는 방법(Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory출판(1982년)) 등 공지의 방법을 사용하면 된다.

벡터는 숙주미생물에 있어서 자율적으로 증식할 수 있는 파지벡터 또는 플라스미드벡터가 사용된다. 파지벡터 또는 코스미드벡터로서는, 예를 들면 pWE15, M13, λEMBL3, λEMBL4, λFIXII, λDASHII, λZAPII, λgt10, λgt11, Charon4A,

Charon21A 등을 들 수 있고, 플라스미드벡터로서는, 예를 들면 pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pET계 등을 들 수 있다. 그 외에, 대장균이나 슈도모나스속 등의 복수의 숙주미생물에서 자율적 증식이 가능한 벡터 등의 각종

셔틀벡터를 사용할 수도 있다. 이와 같은 벡터에 대해서도 상기와 마찬가지로 적당한 제한효소에 의해 절단함으로써 원하는 단편을 얻을 수 있다.

염색체 DNA단편과 벡터단편과의 연결은 DNA리가제를 사용하면 되고, 예를 들면 라이게이션 키트(타카라(주) 제품 등)를 사용해서 행할 수 있다. 이와 같이 해서 염색체 DNA단편과 벡터단편을 연결시켜, 여러 가지의 DNA단편을 함유하는 재조 합 플라스미드의 혼합물(이하, "유전자 라이브러리"라 기재)을 제작한다. 여기서 유전자 라이브러리제작에 있어서는 적당한 길이의 염색체 DNA단편을 사용하는 방법 외에, 바실러스 리체니포미스 균주로부터 mRNA를 추출정제하여, 역전사효소를 이용해서 cDNA단편을 합성하는 방법(Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory출판, 1982년)을 이용할 수도 있다. 또, 유전자 라이브러리를, 대장균에 한번 형질전환 또는 형질도입한 후, 유전자 라이브러리를 대량으로 증폭하는 것도 가능하다(Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory출판, 1982년).

숙주미생물에의 재조합벡터의 도입은, 공지의 방법에 의해 행한다. 예를 들면, 숙주미생물이 대장균인 경우, 염화칼슘법(Journal of Molecular Biology, 53권, 159페이지, 1970년), 염화루비듐법(Methods in Enzymology, 68권, 253페이지,

1979년)이나 일렉트로포레이션법(Current Protocols in Molecular Biology, 1권, 184페이지, 1994년) 등을 이용할 수 있다. 또, 코스미드벡터나 파지벡터를 이용하는 경우의 형질도입에 대해서는 인비트로 패키징법(Current Protocols in

Molecular Biology, 1권, 571페이지, 1994년) 등을 사용할 수 있다. 그 외에, 접합전달에 의한 방법도 이용가능하다.

다음에, 페니실륨 피노필럼 균주의 엔도-β-1,4-글루카나아제 유전자를 함유하는 DNA단편을 얻기 위한 프로브를 조제한다. 엔도-β-1,4-글루카나아제 유전자의 염기서열은 서열번호 5에 기재된 것과 같은 염기서열로부터 올리고뉴클레오타이드를 설계한다. 이들 올리고뉴클레오타이드는 예를 들면 아마샴-파머시아 바이오테크의 커스텀 합성 서비스 등을 이용해서 합성이 가능하다.

다음에, 설계한 올리고뉴클레오타이드를 프라이머로 하고, 페니실륨 피노필럼 균주의 염색체 DNA를 주형으로 해서 폴리머라제 연쇄반응(이하, "PCR"이라 기재)을 행하여, 엔도-β-1,4-글루카나아제 유전자를 부분적으로 증폭한다. 이와 같이 해서 얻게 된 PCR증폭단편은 페니실륨 피노필럼 균주의 엔도-β-1,4-글루카나아제 유전자에 100% 가까운 상동성을 가진 단편으로서, 콜로니하이브리디제이션을 행할 때의 프로브로서 높은 S/N비를 기대할 수 있는 동시에, 하이브리디제이션의 스트린전시(stringency)제어를 용이한 것으로 하는 것이 가능하다. 상기의 PCR증폭단편을 적당한 시약을 사용해서 표지하고, 상기 염색체 DNA라이브러리에 대해서 콜로니 하이브리디제이션을 행하여, 엔도-β-1,4-글루카나아제 유전자를 선발한다(Current Protocols in Molecular Biology, 1권, 603페이지, 1994년).

상기의 어느 하나의 방법에 의해 선발된 대장균으로부터 알칼리법(Current Protocols in Molecular Biology, 1권, 161페이지, 1994년)을 사용해서 플라스미드를 회수함으로써, 엔도-β-1,4-글루카나아제 유전자를 함유하는 DNA단편을 얻을 수 있다. 상기 DNA단편의 염기서열의 결정은, 예를 들면 생거법(Sanger's sequencing method)(Molecular Cloning, 2권, 133페이지,1989년) 등에 의해서 행하는 것이 가능하고, 염기서열 자동분석장치, 예를 들면 DNA시퀀서 377A(퍼킨 엘머) 등을 사용해서 다이프라이머법 또는 다이터미네이터법에 의해 행할 수 있다.

또한, 상기 방법에 의해 전체 염기서열을 결정한 후에는, 화학합성법, 염색체 DNA를 주형으로 한 PCR법, 또는 상기 염기서열을 가진 DNA단편의 제한효소에 의한 분해 등의 임의의 방법에 의해 조제한 DNA단편을 프로브로 해서 하이브리다이즈 함으로써, 본 발명의 유전자를 얻는 것이 가능하다.

서열번호 4는 상기 유전자가 코딩하는 아미노산서열을 표시하나, 앞서 설명한 바와 같이, 상기 아미노산서열을 가진 폴리펩티드가 엔도-β-1,4-글루카나아제 활성을 가지는 한, 몇 가지의, 예를 들면 1 또는 수개의 아미노산에 대해서 결실, 치환, 부가 등의 변이가 있어도 된다. 또, 본 발명의 유전자는 서열번호 5로 표시되는 염기서열을 가진 것에 이외에, 축중코돈에 있어서만 상이한 동일한 폴리펩티드를 코딩하는 축중이성체도 포함한다. 여기서 결실, 치환, 부가 등의 변이는, 부위돌연변이 도입방법(Current Protocols in Molecular Biology 1권, 811페이지, 1994년) 등에 의해 도입가능하다.

본 발명의 형질전환된 미생물은 본 발명의 재조합벡터를, 상기 재조합벡터를 제작할 때에 사용한 발현벡터에 적합한 숙주속에 도입함으로써 얻게 된다. 숙주로서는, 에셰리키아( Esherichia)속, 슈도모나스( Pseudomonas)속, 랄스토니아

( Ralstonia)속, 알칼리게네스( Alcaligenes)속, 코마모나스( Comamonas)속, 버크홀데리아( Burkholderia)속, 아그로박테리움( Agrobacterium)속, 플라보박테리움( Flabobacterium)속, 비브리오( Vibrio)속, 엔테로박터( Enterobacter)속, 리조

비움( Rhizobium)속, 글루코노박터( Gluconobacter)속,아시네토박터 (Acinetobacter)속, 모라셀라( Moraxella)속, 니트로조모나스( Nitrosomonas)속, 아에로모나스( Aeromonas)속, 파라코커스( Paracoccus)속, 바실루스( Bacillus)속, 클로스트리디움( Clostridium)속, 락토바실루스( Lactobacillus)속, 코리네박테리움( Corynebacterium)속, 아르트로박터( Arthrobacter)속, 아크로모박터( Achromobacter)속, 미크로코커스( Micrococcus)속, 마이코박테리움(Mycobacterium)

속, 스트렙토코커스( Streptococcus)속, 스트렙토마이세스( Streptomyces)속, 악티노마이세스( Actinomyces)속, 노카르디아( Nocardia)속, 메틸로박테리움

(Methylobacterium)속 등의 각종 세균을 들 수 있다. 또, 상기 세균 이외에, 사카로마이세스( Saccharomyces)속, 칸디다( Candida)속 등의 효모, 또한 각종 곰팡이 등을 숙주로서 들 수 있다.

예를 들면 대장균 등의 세균을 숙주로서 사용하는 경우는, 본 발명에 관한 재조합벡터는, 그 자신이 숙주속에서 자율복제가능한 동시에, 프로모터, 엔도-β-1,4-글루카나아제 유전자를 함유하는 DNA 및 전사종결서열 등의 발현에 필요한 구성을 가진 것임이 바람직하다.

프로모터는, 숙주속에서 발현할 수 있는 것이면 어느 것이나 사용가능하고, 예를 들면, trp프로모터, trc프로모터, tac프로모터, lac프로모터, PL프로모터, PR프로모터, T7프로모터, T3프로모터 등의 대장균이나 파지 등에 유래하는 프로모터를 사용할 수 있다. 세균에의 재조합 DNA의 도입방법으로서는, 상기한 염화칼슘법이나 일렉트로포레이션법 등이 이용가능하다.

효모를 숙주로서 사용하는 경우는, 발현벡터로서, 예를 들면 YEp13, YCp50, pRS계, pYEX계 벡터 등이 이용가능하다. 프로모터로서는, 예를 들면 GAL 프로모터, AOD 프로모터 등을 사용할 수 있다. 효모에의 재조합체 DNA의 도입방법으로서

는, 예를 들면 일렉트로포레이션법(Method Enzymol., 194, 182-187(1990)), 스페로플라스트법(Proc. Natl. Acad. Sci.USA, 84, 1929-1933(1978)), 아세트산리튬법(J. Bacteriol., 153, 163-168(1983)) 등이 이용가능하다.

또, 재조합벡터에는 발현의 억제 또는 증폭, 또는 유도를 위한 각종의 기능을 가진 발현억제용의 단편이나, 형질전환체의 선택을 위한 마커나 항생물질에 대한 내성유전자, 또는, 균체밖으로의 분비를 목적으로 한 시그널을 코딩하는 유전자 등을 또 가진 것도 가능하다.

본 발명에 관한 엔도-β-1,4-글루카나아제 효소의 제조는 예를 들면 이것을 코딩하는 유전자를 가진 재조합벡터에 의해 숙주를 형질전환해서 얻은 형질전환체를 배양하고, 배양물(배양균체 또는 배양상청액)속에 유전자 산물인 엔도-β-1,4-글루카나아제를 생성축적시켜, 배양물로부터 엔도-β-1,4-글루카나아제 효소를 취득함으로써 행하여진다.

본 발명의 형질전환체를 배양하는 방법은, 숙주의 배양에 사용되는 통상의 방법을 사용하면 된다.

또 배양방법은, 배치(batch)식, 유동배치식, 연속배양, 리액터형식 등, 통상의 미생물의 배양에 사용하는 어떠한 방법도 사용할 수 있다.대장균 등의 세균을 숙주로 해서 얻게 된 형질전환체를 배양하는 배지로서는, 완전배지 또는 합성배지, 예를 들면 LB배지,M9배지 등을 들 수 있다. 또, 배양온도는 상기 언급한 적온의 범위에서 배양함으로써 엔도-β-1,4-글루카나아제 효소를 균체 내에 축적시키고, 회수한다.

탄소원은 미생물의 증식에 필요하고, 예를 들면 글루코스, 프럭토스, 슈크로스, 말토스, 갈락토스, 전분 등의 당류; 에탄올, 프로판올, 부탄올 등의 저급알콜류; 글 리세롤 등의 다가알콜류; 아세트산, 시트르산, 숙신산, 타르타르산, 락트산, 글루콘산 등의 유기산; 프로피온산, 부탄산, 펜탄산, 헥산산, 헵탄산, 옥탄산, 노난산, 데칸산, 운데칸산, 도데칸산 등의 지방산 등을 이용할 수 있다.

질소원으로서는, 예를 들면 암모니아, 염화암모늄, 황산암모늄, 인산암모늄등의 암모늄염 외에, 펩톤, 고기즙, 효모엑기스,맥아엑기스, 카제인분해물, 옥수수 침지액 등의 천연물유래의 것을 들 수 있다. 또, 무기물로서는, 예를 들면 인산제 1칼륨,인산제 2칼륨, 인산마그네슘, 황산마그네슘, 염화나트륨 등을 들 수 있다. 배양액에, 카나마이신, 암피실린, 테트라사이클린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신 등의 항생물질을 첨가해도 된다.

또 프로모터가 유도성의 발현벡터를 사용해서 형질전환한 미생물을 배양하는 경우는 프로모터의 종류에 적합한 유도물질을 배지에 첨가하면 된다. 예를 들면, 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드(IPTG), 테트라사이클린, 인돌아크릴산

(IAA) 등을 유도물질로서 들 수 있다.

아라비노스 이성화효소의 취득 및 정제는 얻게 되는 배양물 중으로부터 균체 또는 상청액을 원심 회수하여, 균체파쇄, 추출, 친화성크로마토그래피, 양이온 또는 음이온교환크로마토그래피, 겔여과 등을 단독으로 또는 적당히 조합함으로써 행할 수 있다.

얻게 된 정제물질이 목적의 효소인 것의 확인은, 통상의 방법, 예를 들면 SDS-폴리아크릴아미드겔전기영동, 웨스턴블로팅등에 의해 행할 수 있다.

또한, 숙주로서 미생물을 사용한 형질전환체의 배양, 형질전환체에 의한 엔 도-β-1,4-글루카나아제 효소의 생산과 균체내에의 축적, 및, 균체로부터의 엔도-β-1,4-글루카나아제 효소의 회수는, 상기의 방법에 한정되는 것은 아니다.

이하 본 발명을 설명한다.

본 발명의 셀룰라아제의 생산방법에 있어서, 셀룰로오스 10~30g/L, 옥수수 침지액 8~10g/L, 효모추출물 2~5g/L, 일인산칼륨 3~5g/L, 이인산칼륨 3~5g/L 및 티아민 염산염 0.005~0.01g/L을 포함하는 셀룰라아제의 생산배지를 이용하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

또한 본 발명은 셀룰라아제의 생산방법에 있어서, 교반속도는 100~500 rpm, 바람직하게는 100~300 rpm, 배양온도는 23~33℃ 바람직하게는 23~30℃에서 배양시키는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

또한 본 발명은 서어던 하이브리다이제이션과 콜로니 혼성화를 통하여 페니실륨 피노필럼으로부터 셀룰로오스 분해효소 EG 유전자를 클로닝하는 것을 특징으로 한다.

본 발명을 통해 버섯에서 분리한 신균주 페니실륨 피노필럼 KMJ601에서 생산되는 고활성 셀룰라아제는 종래 셀룰로오스 분해 효소보다 우수한 분해율을 나타내므로 바이오에너지의 생산, 섬유산업, 제지산업, 세제산업, 사료산업 및 식품 산업에 있어 저 칼로리 식품의 제조와 음식물 쓰레기의 발효 등 다양한 용도에 적용될 수 있다. 또한, 페니실륨 피노필럼의 고활성 엔도-β-1,4-글루카나아제 유전자의 전체 염기서열을 규명함으로써 고활성 엔도-β-1,4-글루카나아제의 대량 생산에 적용할 수 있다.

이하, 본 발명을 다음의 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명하나, 본 발명이 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 셀룰라아제 생산균의 선별

셀룰라아제를 생산하는 균주를 분리하기 위하여 각종 버섯 균의 배양액 10ul를 생리식염수 10 ml에 현탁하고, 현탁액의 10ul(1x10⁴ cfu ml^-1) 취하여 2% 카르복시메칠 셀룰로스가 첨가된 복합한천배지 (potato dextrose agar)에 도말한 후, 27 ^oC에서 3일간 배양 하였다. 고체 한천배지에서 콜로니가 형성된 후 0.1%의 콩고레드 시약으로 염색하고, 1 M 염화나트륨으로 탈색하여 그 콜로니 주위에 섬유소 분해환이 생성된 균들을 선별하는 방법으로 다양한 버섯 포자로부터 셀룰라아제를 생산하는 버섯균을 탐색하였다.

위의 탐색과정을 통해 1차 선별된 균주(S1부터 S7까지)를 대조군(C)으로 종래 셀룰라아제 생산균주로 이용되는 트리코더마 리제이 ZU-02를 이용하여, 상기와 같이 카르복시메칠 셀룰로스를 첨가한 고체 한천배지에서 섬유소 분해능을 확인한 후, 섬유소 분해능이 가장 뛰어난 S3 균주를 선별하였다.

실시예 2: 균주의 동정

실시예 1에서 분리한 S3 균주의 동정을 위하여 한국미생물 보존센터에서 ITS-5.8S rDNA 서열을 분석하였다. S3 균주의 ITS-5.8S rDNA 서열은 서열번호 6에 나타내었다.

상기 S3 균주의 ITS-5.8S rDNA 서열의 유사종과의 유연관계를 분석한 결과 페니실륨 피노필럼으로 동정되었다(도 2).

상기 S3 균주는 페니실륨 피노필럼(Penicillium pinophilum) KMJ601로 명명하였고, 국립 농업과학원 농업유전자원센터에 2008년 11월 7일 기탁번호 KACC 93063P 호로 기탁하였다.

실시예 3: 삼각플라스크에서 상기 균주에 의한 셀룰라아제의 기본 생산 실험

상기 실시예 1에서 분리한 페니실럼 피노필럼 KMJ601균주에 의한 셀룰라아제의 기본 생산실험을 다음과 같은 조건에서 수행하였다. 분리한 균주를 50 mL의 생산배지(표1)가 담긴 500 mL 삼각플라스크에 접종하여 200 rpm, 28℃에서 5일간 배양하였다. 세포를 제거한 배양액을 분석하여 엔도-β-1,4-글루카나아제의 활성을 조사한 결과 엔도-β-1,4-글루카나아제 7.3 U/mg-단백질로 확인되었다.

성분	농도(g/L)
옥수수침지액	8
효모추출물	2
일인산칼륨(KH₂PO₄)	5
이인산칼륨(K₂HPO₄)	5
볏짚	20
티아민 염산염	0.005

표 1은 셀룰라아제 기본 생산배지의 조성을 나타낸 표이다.

실시예 4: 균주의 셀룰라아제 생산을 위한 최적 배지 성분 시험

(1) 탄소원의 농도에 따른 엔도-β-1,4-글루카나아제 활성

7L 발효조에서 셀룰로오스 농도에 따른 본 발명 균주 페니실럼 피노필럼 KMJ601의 셀룰라아제 생산 실험을 수행하였다.

종 배양: 보관된 페니실륨 피노필럼 단일 군락을 전 배양 배지 (PDB: potato dextrose broth) 50mL가 들어있는 500mL 플라스크에 접종하여 진탕배양기에서 200rpm, 30℃로 3일간 배양하였다.

성분	농도(g/L)
Potato starch	4
Dextrose	20

표 2는 종배지(PDB)의 성분 구성표를 나타낸 표이다.

본 배양: 200mL의 종배양액을 4000mL의 생산배지가 들어있는 7L의 발효조에 접종하여 200rpm, 28℃, pH 4으로 5일간 본 배양을 수행하였다. 생산 배지의 부피가 4L이었고 발효과정 중에 교반속도는 200rpm, 배양온도는 28℃로 조절하였다. 초기 셀룰로스의 농도를 10~40g/L로 달리하여 실험한 결과 표 3과 같았고 20g/L의 셀룰로스 농도에서 최대 셀룰라아제의 활성을 나타내었다.

g/L		엔도-β-1,4-글루카나아제 (u/mg)
셀룰로스	10	1.53
	20	2.15
	30	1.00
	40	0.99

표 3은 여러 볏짚 농도에서 엔도-β-1,4-글루카나아제의 생산을 나타낸 표이다.

(2) 질소원(옥수수 침지액)의 농도에 따른 엔도-β-1,4-글루카나아제 활성 시험

7L 발효조에서 셀룰로오스 농도를 20g/L로 하여 질소원(옥수수 침지액) 농도별 실험을 수행하였다. 배양방법과 발효배지는 실시예3과 같으며, 질소원 농도를 6~12g/L로 달리하여 배양한 결과 활성은 표 4와 같았고, 8g/L 옥수수 침지액에서 최대활성을 나타내었다.

	g/L	엔도-β-1,4-글루카나아제 (U/mg-단백질)
옥수수 침지액	6	2.15
	8	2.78
	10	2.01
	12	0.94

표 4는 여러 옥수수 침지액의 농도에서 엔도-β-1,4-글루카나아제의 활성을 나타낸다.

(3) 효모추출액의 농도에 따른 엔도-β-1,4-글루카나아제 활성 시험

7L 발효조에서 볏짚과 옥수수 침지액 농도를 각각 20g/L, 8g/L로 하여 효모 추출액의 농도별 실험을 수행하였다. 배양방법과 발효배지는 실시예3과 같으며, 효모추출액의 농도를 1~5g/L로 달리하여 배양한 결과 활성은 표 5와 같았고, 2g/L 효모추출액에서 최대활성을 나타내었다.

	g/L	엔도-β-1,4-글루카나아제 (U/mg-단백질)
효모 추출액	1	2.78
	2	3.14
	3	2.56
	4	1.77
	5	1.58

표 5는 여러 효모추출액 농도에서 엔도-β-1,4-글루카나아제 효소활성을 나타낸다.

(4) 일인산칼륨 농도에 따른 엔도-β-1,4-글루카나아제 활성 시험

4L발효조 에서 셀룰로오스와 옥수수 침지액 그리고 효모추출액 농도를 각각 20g/L, 8g/L, 2g/L 로 하여 일인산칼륨의 농도별 실험을 수행하였다. 배양방법과 발효배지는 실시예3과 같으며, 일인산칼륨 농도를 3-6g/L로 달리하여 배양한 결과 활성은 표 6과 같았고, 5g/L 일인산칼륨 에서 최대활성을 나타내었다.

	g/L	엔도-β-1,4-글루카나아제 (U/mg-단백질)
일인산칼륨	3	3.14
	4	3.32
	5	4.34
	6	2.76

표 6은 여러 일인산칼륨 농도에서 엔도-β-1,4-글루카나아제 효소활성을 나타낸다.

(5) 이인산칼륨 농도에 따른 엔도-β-1,4-글루카나아제 활성 시험

7L 발효조 에서 셀룰로오스와 옥수수 침지액, 효모추출액 그리고 일인산칼륨 농도를 각각 20g/L, 8g/L, 2g/L, 5g/L 로 하여 이인산칼륨의 농도별 실험을 수행하였다. 배양방법과 발효배지는 실시예3과 같으며, 이인산칼륨 농도를 3~5g/L로 달리하여 배양한 결과 활성은 표7과 같았고, 5g/L 이인산칼륨에서 최대활성을 나타내었다.

	g/L	엔도-β-1,4-글루카나아제 (U/mg-단백질)
이인산칼륨	3	4.34
	4	4.66
	5	5.48
	6	3.92

표 7은 여러 이인산칼륨 농도에서 엔도-β-1,4-글루카나아제 효소활성을 나타낸다.

(6) 티아민염산염 농도에 따른 엔도-β-1,4-글루카나아제 활성 시험

7L 발효조에서 셀룰로오스, 옥수수 침지액, 효모추출액, 일인산칼륨, 이인산칼륨의 농도를 각각 20g/L, 8g/L, 2g/L, 5g/L, 5g/L 로 하여 티아민 염산염 농도별 실험을 수행하였다. 배양방법과 발효배지는 실시예3과 같으며, 티아민 염산염 농도를 0.003~0.008g/L로 달리하여 배양한 결과 활성은 표 8과 같았고, 0.005g/L 티아민 염산염에서 최대활성을 나타내었다.

	g/L	엔도-β-1,4-글루카나아제 (U/mg-단백질)
티아민 염산염	0.003	5.48
	0.004	5.49
	0.005	6.31
	0.006	5.00
	0.007	4.67
	0.008	4.43

표 8은 여러 이인산칼륨 농도에서 엔도-β-1,4-글루카나아제 효소활성을 나타낸다.

실시예5: 고활성 엔도-β-1,4-글루카나아제 생산을 위한 최적 배양조건 실험

7L 발효조에서 셀룰로스, 옥수수 침지액, 효모추출액, 일인산칼륨, 이인산칼륨, 티아민 염산염의 농도를 각각 20g/L, 8g/L, 2g/L, 5g/L, 5g/L, 0.005g/L로 하여 배양 환경조건의 최적화 실험을 수행하였다. 교반속도를 100~400rpm으로, 배양온도를 23~32℃로 달리하여 엔도-β-1,4-글루카나아제 활성을 비교한 결과 표 9와 같이 교반속도 200rpm, 배양온도 28℃에서 최대 엔도-β-1,4-글루카나아제 활성을 나타내었다.

		엔도-β-1,4-글루카나아제 (U/mg-단백질)
배양 온도 (℃)	23	6.31
	25	6.43
	28	6.99
	30	6.39
	32	5.21
교반조건 (rpm)	100	6.93
	200	7.30
	300	6.89
	400	5.21

표 9는 효소활성 최적화를 위한 조건 실험표를 나타낸다.

실시예 6: 최적 효소 활성측정 실험

배양배지 및 배양조건은 각각 실시예3의 표1 및 실시예5의 표9와 같으며, 활성측정은 7L 발효조에서 5일간 배양 후 그 상등액을 사용하였다. 엔도-β-1,4-글루카나아제의 활성은 환원당을 이용한 somogyi-nelson법을 이용하여 측정하였다. 활성 대조균으로는 트리코더마 리제이 ZU-02를 이용하였으며 배양조건은 모두 일관되게 적용되었다. 그 결과 페니실륨 피노필럼 KMJ601 균주가 생산하는 엔도-β-1,4-글루카나아제 효소 활성이 7.3 U/mg-단백질로서 대조군에 비해 현저히 높은 것을 확인하였다(표 10)(도 3).

균주	엔도-β-1,4-글루카나아제(U/mg-단백질)
트리코더마 리제이 ZU-02	4.7
페니실륨 피노필럼 KMJ601	7.3

표 10은 엔도-β-1,4-글루카나아제의 대조군과의 활성 비교한 것이다.

실시예 7: 페니실륨 피노필럼 KMJ601로부터 고활성 엔도-β-1,4-글루카나아제 유전자의 클로닝

셀룰레이즈 분해 효소인 엔도-β-1,4-글루카나아제 유전자의 염기서열을 얻기 위해 상기 버섯균 페니실륨 피노필럼 KMJ601을 사용하였다. 일반적으로 유사한 기능을 지니는 유전자의 경우에는 각 염기서열과 크기가 어느 정도 유사하다고 알려져 있다. 따라서 페니실륨 피노필럼 KMJ601의 엔도-β-1,4-글루카나아제 효소의 유전자도 약 1.2kb정도의 크기를 지녔을 것으로 추정하고 다른 버섯균의 이미 알려진 엔도-β-1,4-글루카나아제 효소 염기서열을 바탕으로 페니실륨 피노필럼 KMJ601의 엔도-β-1,4-글루카나아제 효소 전체 유전자를 클로닝 하였다.

클로닝에는 대장균 XL1-Blue와 pUC18 벡터를 사용하였다. 대장균의 배양 배지로는 일반적 조성의 LB 배지를 사용하였고, 페니실륨 피노필럼 KMJ601의 배양에는 상기 [표1]의 배지를 사용하였다. 대장균의 평판(plate) 배지로는 각각 LB 아가(agar)와 3~5% 설탕, 0.3~0.5% 쇠고기 추출물, 0.9~1.1% 박토 펩톤, 1.3~1.7% 아가 조성의 아가 플레이트를 사용하였다. 필요에 따라 50 ㎍/ml 엠피실린(amipicillin)을 첨가하였다.

배양 방법은 페니실륨 피노필럼 KMJ601경우, 배지 50 ml이 들어 있는 250 ml의 삼각 플라스크에 접종하여 28℃, 200 rpm 조건에서 5일간 배양하였고, 대장균의 경우에는 37℃, 200 rpm 조건에서 16 시간 배양하였다.

대부분의 DNA는 아가로스겔(TAE buffer, 0.5%) 전기영동법으로 확인하였고, 겔 상에서 DNA 밴드의 정제는 QiaXII 겔 추출장지(QIAGEN, USA)를 이용하였으며, DNA간의 연결(ligation) 반응은 T4 DNA 연결효소(NEB)를 이용하였다. 또한 페니실륨 피노필럼의 RNA 추출은 Qiagen plant total RNA kit(QIAGEN)을 이용하였으며, cDNA 합성을 위한 역전사 효소는 Oligo-dT RT-mix(intron)를 이용하였다.

엔도-β-1,4-글루카나아제 생산효소 유전자를 클로닝하기 위하여 페니실륨 피노필럼 염색체를 분리하였다. 페니실륨 피노필럼 엔도-β-1,4-글루카나아제 유전자의 일부분을 증폭하기위해 다른 버섯균에서 이미 알려진 EG 염기서열을 바탕으로 비특이적 프라이머(degenerated primer)를 제작하였다. 이를 이용하여 연쇄중합반응에 의해 1.1kb 크기에 해당하는 엔도-β-1,4-글루카나아제 효소 유전자 일부를 페니실륨 피노필럼 염색체에서 증폭하였다.

전방 프라이머 (Forward Primer) 5'CAGCARACKGYYTGGGGMCARTG -3'(서열번호 1)

후방 프라이머 (Reverse Primer) 5'ACGTTRCCRCCACCRGTYTCKG-3'(서열번호 2)

그리고 증폭된 상기의 부분 염기서열 중 그 절단 부위가 존재하지 않는 제한 효소인 BamHI, EcoRI, HindIII, SalI, XbaI을 이용하여 페니실륨 피노필럼의 genomic DNA를 완전히 절단하였다. 그리고 앞서 중합효소 연쇄반응을 통하여 얻은 DNA 단편을 이용하여 방사능 표지된 탐침자(probe)를 만들었다. 이를 이용하여 서어던 하이브리다이제이션으로 찾고자 하는 유전자를 지닌 DNA 단편을 탐색하였다(도 4). BamHI, HindIII, XbaI으로 염색체를 자른 경우에 있어서는 서어던 하이브리다이제이션의 결과 나타난 엔도-β-1,4-글루카나아제 효소의 유전자를 지닌 DNA의 크기가 약 20~23 kb정도 되어 너무 큰 관계로 이용하지 않았고, 2.5kb 정도의 EcoRI으로 잘린 조각과 약 5.5 kb정도의 SalI으로 잘린 조각을 이용하여 원하는 유전자를 탐색하였다. 페니실륨 피노필럼 염색체를 EcoRI으로 절단한 후 분리한 2.5kb 정도 크기의 DNA 조각과 SalI으로 절단한 5.5kb 정도의 DNA 단편들을 pUC18에 클로닝하고 이를 pUC-EG라고 명명하였다(도 5).

pUC-EG 라이브러리에서 앞서 만든 1.1kb 크기의 탐침자를 이용하여 콜로니 혼성화를 수행하여 원하는 엔도-β-1,4-글루카나아제 효소의 유전자를 지닌 클론을 결정하였다. 그리고 결정한 클론을 이용하여 염기서열을 분석하여 엔도-β-1,4-글루카나아제의 전체 유전자 염기서열 1,426bp를 밝혔다 (도 6). 이는 앞서 예상한 바와 같이 다른 여러 버섯균에서 밝혀진 엔도-β-1,4-글루카나아제 효소 유전자와 크기가 비슷하였다. 또한 페니실륨 피노필럼 엔도-β-1,4-글루카나아제 효소는 glycohydrolase family 5에서 공통적으로 나타나는 염기서열을 지니고 있음을 확인하였다.

보존된 서열 (conserved sequence)

FGVMNEPH (서열목록 3)

또한 진스캔 (http://genes.mit.edu/GENSCAN.html) 사이트와 NCBI의 blast 사이트를 이용하여 분석한 결과 인트론 부분이 페니실륨 피노필럼의 엔도-β-1,4-글루카나아제에는 포함되지 않음을 확인하였다.

도 1은 1차 선별된 균주(S1부터 S7까지)와 대조군(C)으로 트리코더마 리제이 ZU-02를 이용하여, 카르복시메칠 셀룰로스를 첨가한 고체 한천배지에서 섬유소 분해능을 비교한 사진이다.

도 2는 본 발명 균주의 ITS-5.8S rDNA 서열의 유사종과의 유연관계를 분석한 결과이다.

도 3은 본 발명 균주의 최적 발현 조건에서의 엔도-β-1,4-글루카나아제의 활성을 대조군 트리코더마 리제이의 활성과 비교한 결과이다.

도 4는 페니실륨 피노필럼 KMJ601 염색체(genomic DNA) 내에서 셀룰레이즈 EG 합성효소를 지닌 단편의 서어던 하이브리다이제이션(southern hybridization)을 통한 탐색을 나타낸 도면으로, lane 1은 페니실륨 피노필럼 KMJ601 염색체 (genomic DNA)에 아무런 제한효소도 처리하지 않은 것, lane 2, 3, 4, 5, 6은 각각 제한 효소 EcoRI, SalI, BamHI, HindIII, XbaI 등을 처리한 것이다.

도 5는 벡터 pUC-EGdml 구조로서 페니실륨 피노필럼의 염색체에서 엔도-β-1,4-글루카나아제 생산효소 유전자를 지니고 있는 단편을 찾아 대장균에서 이용되는 벡터에 클로닝 한 것이다.

도 6은 셀룰레이즈 엔도-β-1,4-글루카나아제 생산효소의 전체 유전자의 핵산 염기서열이다.

도 7은 셀룰레이즈 엔도-β-1,4-글루카나아제 생산효소의 전체 유전자의 단백질 염기서열이다.

도 8은 페니실륨 피노필럼 엔도-β-1,4-글루카나아제의 단백질 염기서열을 이미 알려진 페니실륨 디컴벤스의 엔도-β-1,4-글루카나아제의 단백질 염기서열과 비교한 것이다.

<110> Konkuk University Industrial Cooperation Corp. <120> Optimization of endo-beta-1,4-glucanase production by a novel strain Penicillium pinophilum KMJ601 and its gene cloning <160> 6 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 cagcarackg yytggggmca rtg 23 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 acgttrccrc caccrgtytc kg 22 <210> 3 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> conserved sequence <400> 3 Phe Gly Val Met Asn Glu Pro His 1 5 <210> 4 <211> 411 <212> PRT <213> Penicillium pinophilum <400> 4 Met Thr Ile Ile Ser Lys Phe Gly Ile Gly Val Leu Ile Ala Met Val 1 5 10 15 Ser Glu Ala Thr Ala Gln Gln Thr Val Trp Gly Gln Cys Gly Ile Gly 20 25 30 Trp Thr Gly Pro Val Ser Cys Val Ser Gly Ser Tyr Cys Ala Pro Gly 35 40 45 Asn Ala Tyr Tyr Ser Gln Cys Leu Pro Gly Ala His Leu Asn Gly Pro 50 55 60 Ser Thr Thr Thr Ala Arg Thr Thr Ile Thr Thr Ser Ser Ser Phe Thr 65 70 75 80 Thr Ser Val Ser Thr Thr Ala Ile Pro Thr Ser Thr Gly Lys Val Gln 85 90 95 Phe Ala Gly Val Asn Ile Ala Gly Phe Asp Phe Gly Met Val Thr Ser 100 105 110 Gly Thr Gln Asp Leu Thr Gln Ile Val Asp Glu Ser Val Asp Gly Val 115 120 125 Thr Gln Ile Lys His Phe Val Asn Asp Asp Thr Phe Asn Met Phe Arg 130 135 140 Leu Pro Thr Gly Trp Gln Tyr Leu Val Asn Asn Asn Leu Gly Gly Gln 145 150 155 160 Leu Asp Ala Thr Asn Phe Gly Gln Tyr Asp Lys Leu Val Gln Gly Cys 165 170 175 Leu Ser Thr Gly Ala His Cys Ile Val Asp Ile His Asn Tyr Ala Arg 180 185 190 Trp Asn Gly Ala Ile Ile Gly Gln Gly Gly Pro Ser Asp Ala Gln Phe 195 200 205 Val Asp Leu Trp Thr Gln Leu Ala Thr Lys Tyr Lys Ala Asp Ser Lys 210 215 220 Val Val Phe Gly Val Met Asn Glu Pro His Asp Leu Thr Ile Ser Thr 225 230 235 240 Trp Ala Ala Thr Val Gln Lys Val Val Thr Ala Ile Arg Asn Ala Gly 245 250 255 Ala Thr Ser Gln Met Ile Leu Leu Pro Gly Thr Asp Tyr Thr Ser Ala 260 265 270 Ala Asn Phe Val Glu Asn Gly Ser Gly Ala Ala Leu Ala Ala Val Val 275 280 285 Asn Pro Asp Gly Ser Thr His Asn Leu Ile Phe Asp Val His Lys Tyr 290 295 300 Leu Asp Ser Asp Asn Ser Gly Thr His Ala Glu Cys Val Thr Asn Asn 305 310 315 320 Val Asp Ala Phe Ser Ser Leu Ala Thr Trp Leu Arg Ser Val Gly Arg 325 330 335 Gln Ala Leu Leu Ser Glu Thr Gly Gly Gly Asn Val Gln Ser Cys Ala 340 345 350 Thr Tyr Met Cys Gln Gln Leu Asp Phe Leu Ser Ala Asn Ser Asp Val 355 360 365 Tyr Leu Gly Trp Thr Ser Trp Ser Ala Gly Gly Phe Gln Ala Ser Trp 370 375 380 Asn Tyr Ile Leu Thr Glu Val Pro Asn Gly Asn Thr Asp Gln Tyr Leu 385 390 395 400 Val Gln Gln Cys Phe Val Pro Lys Trp Lys Asn 405 410 <210> 5 <211> 1426 <212> DNA <213> Penicillium pinophilum <400> 5 atgacaatca tctcaaaatt cggtattggc gtgttgatcg caatggtcag tgaggccact 60 gcgcaacaga ctgtttgggg acaatgtcag cttacaacat atttctgaac caaatgaatt 120 ggcttctaat ctttattttc taaaggtggt ggtatcggct ggactggacc agttagttgt 180 gtttctggct cctactgcgc gcctggaaat gcctactact cgcagtgtct tccaggatct 240 ggtaggtgtt ttactctcaa taatgtccga atatctcaat cgctcacttg aactaaggac 300 cgtcaacgac cacggcaaga acgacaataa ccacgtcgag cagctttacg acaagtgtca 360 gcacgacggc aattcccacg agtaccggta aggtacagtt cgccggagtg aacattgccg 420 gcttcgactt tggcatggtt accagtggca cacaggatct aactcagatt gtcgatgagt 480 ccgtcgacgg cgtcacacaa atcaagcatt tcgttaatga tgataccttc aacatgttcc 540 gcttgcctac tgggtggcag tatctcgtca acaataacct aggtggccag cttgacgcga 600 caaatttcgg ccagtacgat aagctcgttc agggttgcct ttctacgggt gcgcactgca 660 tcgttgacat ccacaactat gcccgctgga atggagccat cattggccaa ggtggtccgt 720 cggatgcaca attcgtggat ttgtggactc agcttgcgac caaatataag gctgatagca 780 aggtagtctt tggcgtcatg aatgagcccc atgatctaac tatcagcaca tgggctgcca 840 ctgtacaaaa ggtcgttaca gcaattcgta atgctggcgc aacttcacag atgatcttgc 900 tccctggtac agactacaca agtgccgcaa acttcgtgga aaatggatcc ggtgcagccc 960 tggcggcagt ggtaaaccca gatggatcta ctcataactt gatcttcgat gttcataagt 1020 acctggattc tgacaatagt ggcacccatg ccgagtgtgt caccaacaat gtcgacgctt 1080 tctcaagtct cgcaacctgg ctgcgatctg ttggtcgcca ggctctgctc tctgaaaccg 1140 gcggcggtaa cgttcagagt tgtgcaacgt acatgtgcca acagcttgat tttctcaagt 1200 aagtatacat ctacttctct gaaaatttgc attgaaaaat gcgtcatgcc atatctgata 1260 tgctgatatt gcctgtagtg cgaactctga tgtctatctc ggatggactt cctggtcagc 1320 tggtggcttt caggcatcat ggaactatat tttgacggaa gtgccaaatg gcaataccga 1380 tcagtactta gttcagcagt gcttcgtccc caagtggaag aactaa 1426 <210> 6 <211> 526 <212> DNA <213> 5.8s rDNA sequence <400> 6 cctgcggaag gatcattacc gagtgcgggc ctcgcggccc aacctcccac ccttgtctct 60 ctacccctgt tgctttggcg ggcccaccgg ggccacctgg tcgccggggg acgcacgtcc 120 ccggacccgc gcccgccgaa gcgctctgtg aaccctgatg aagatgggct gtctgagtac 180 gatgaaaatt gtcaaaactt tcaacaatgg atctcttggt tccggcatcg atgaagaacg 240 cagcgaaatg cgataagtaa tgtgaattgc agaattccgt gaatcatcga atctttgaac 300 gcacattgcg ccccctggca ttccgggggg catgcctgtc cgagcgtcat ttctgccctc 360 aagcacggct tgtgtgttgg gtgtggtccc cccggggacc tgcccgaaag gcagcggcga 420 cgtccgtctg gtcctcgagc gtatggggct ctgtcactcg ctcgggaagg acctgcgggg 480 gttggtcacc accatatttt accacggttg acctcggatc aggtag 526

Claims

고활성 셀룰라아제 엔도-β-1,4-글루카나아제를 생산하는 페니실륨 피노필럼 (Penicillium pinophilum) KMJ601(기탁번호 93063P).
제 1항의 균주를 배양하는 단계를 포함하는 엔도-β-1,4-글루카나아제의 생산방법.
제 2항에 있어서, 상기 배양 온도는 23~33℃인 것을 특징으로 하는 엔도-β-1,4-글루카나아제의 생산방법.
제 2항에 있어서, 상기 교반 조건은 100∼500 rpm인 것을 특징으로 하는 엔도-β-1,4-글루카나아제의 생산방법.
제 2항에 있어서, 상기 배양은 배지에 일인산칼륨, 이인산칼륨, 또는 티아민 염산염의 첨가에 의하여 효소 활성이 증가되는 것을 특징으로 하는 엔도-β-1,4-글루카나아제의 생산방법.
서열번호 4에 기재된 아미노산 서열을 가지는 엔도-β-1,4-글루카나아제.
제 6항의 엔도-β-1,4-글루카나아제를 코딩하는 유전자.
제 7항에 있어서, 상기 유전자는 서열번호 5에 기재된 염기 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 유전자.