JP2004501636A - 同時糖化発酵のための方法及び組成物 - Google Patents

Abstract

本発明は、オリゴ糖をエンドグルカナーゼにより、相乗的に分解するための組成物及び方法を提供するものである。それにくわえてさらに本発明は、オリゴ糖を相乗的に分解することができるエンドグルカナーゼをコードする、一つ以上の遺伝子を含有する組換えホスト細胞についても提供する。本発明の好適なホスト細胞は、エタノール生産性であり、かつ、同時糖化発酵を行うことにより複合セルロース基質からエタノールを生産することができる。

Description

【０００１】
関連情報
本出願は、２０００年６月２６日出願の標題「二種（ＥＧＺ及びＥＧＹ）のエンドグルカナーゼによるカルボキシメチルセルロース及び酸膨潤セルロースの相乗加水分解」の米国暫定出願番号６０／２１４，１３７号及び２０００年６月２１日出願の標題「同時糖化発酵のための方法及び組成物」の米国暫定出願番号６０／２１９，９１３号（これら両方の全文をこの言及をもってここに編入することとする）の優先権を主張するものである。本明細書を通じて引用された全特許、特許出願、及び参考文献の内容全体を、言及をもってここに編入することとする。
【０００２】
政府後援の研究
本研究は、部分的に、米国農務省、ナショナル・リサーチ・イニシアチブ（９８−３５５０４−６１７７及び９８−３５５０５−６９７６）、米国エネルギー省基本エネルギー科学事務局 （ＦＧ０２−９６ＥＲ２０２２２）、及びフロリダ大学フロリダ・アグリカルチュラル・エクスペリメント・ステーションの助成金による支援を受けてなされた。
【０００３】
石油を基にした自動車燃料を、植物材料から得られる再生可能燃料に代替できれば、環境面及び社会面で大変有益であろう（Ｌｙｎｄ ｅｔ ａｌ．， （１９９１） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５１：１３１８−１３２３； Ｏｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， （１９９６） Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｃｒｏｂ． Ｔｅｃｈｎｏｌ． １８：１−１７； Ｗｙｍａｎ ｅｔ ａｌ．， （１９９５） Ａｍｅｒ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． Ｓｙｍｐ． ６１８：２７２−２９０）。毎年、米国では１２００億ガロンを越える自動車燃料が消費されるが、これは輸入される石油の合計量に匹敵する。再生可能な代替燃料としてのエタノールの開発によって、米国の輸入石油への依存を無くし、環境を向上させ、新しい雇用を創出できるという可能性がある（Ｓｈｅｅｈａｎ， （１９９４） ＡＣＳ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ Ｎｏ． ５６６， ＡＣＳ Ｐｒｅｓｓ， ｐｐ１−５３）。
【０００４】
理論的には、自動車燃料用輸入石油の問題は大変容易に解決できると思われる。有限の資源である石油を使う代わりに、エタノールという再生可能資源を、植物材料を発酵させれば効率的に生成できる。実際、ブラジルでは、エタノール生成や、主要な自動車燃料としてのエタノールの利用の実現性が、２０年以上もかけて実証されてきた。同様に、米国では、１２億ガロンを越える燃料エタノールが毎年生成されている。現在のところ、燃料エタノールはサッカロミセス−セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）又はジモモナス−モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ　ｍｏｂｉｌｉｓ）（Ｚ． ｍｏｂｉｌｉｓ）を用いてコーン・スターチ又はサトウキビから生成されている。しかしながら、これらの糖原料のいずれも、石油を基にした自動車燃料の代替を実現するのに必要な量を提供できていない。加えて、サトウキビ及びコーン・スターチの両方ともが、比較的に高価な開始材料であり、食料品という競合する用途がある。
【０００５】
さらに、これらの糖基質は、植物中の全糖質のうちのごく僅かな割合に過ぎない。実際、植物中の糖質の大部分は、リグノセルロースという、セルロース、ヘミセルロース、ペクチン及びリグニンを含有する複合構造の重合体の形をしている。リグノセルロースは、例えば植物の茎、葉、外皮、殻及び穂軸に見られる。これらの重合体が加水分解すると、グルコース、キシロース、マンノース、ガラクトース及びアラビノースを含む中性の糖の混合物が遊離する。天然の生物で、これらの糖すべてを迅速かつ効率的に代謝してエタノールにできるものは未知である。
【０００６】
にもかかわらず、この基質源を利用しようとする試みとして、ガルフ・オイル・カンパニー社は、同時糖化発酵法（ＳＳＦ）と呼ばれる、酵母を基にしたプロセスを用いてセルロースからエタノールを生成する方法を開発した（Ｇａｕｓｓ ｅｔ ａｌ． （１９７６） 米国特許第３，９９０，９４４号）。真菌セルラーゼ標品及び酵母が、一個の容器に入ったセルロース基質のスラリに加えられた。セルロースの加水分解の際にエタノールが同時に生成された。しかしながら、ガルフ社のＳＳＦ法にはいくつかの欠点がある。例えば真菌セルラーゼは、これまでのところ、大規模なバイオエタノール法で用いるには高価過ぎると考えられてきた（Ｈｉｍｍｅｌ ｅｔ ａｌ．， （１９９７） Ａｍｅｒ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． ｐｐ． ２−４５； Ｉｎｇｒａｍ ｅｔ ａｌ．， （１９９７） Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ５３：２４２０−２４２５； Ｏｋａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．， （１９９４） Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ４２：５６３−５６８； Ｐｈｉｌｉｐｐｉｄｉｓ， Ｇ．， （１９９４） Ａｍｅｒ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． ｐｐ． １８８−２１７； Ｓａｉｔｏ ｅｔ ａｌ．， （１９９０） Ｊ． Ｆｅｒｍｅｎｔ． Ｂｉｏｅｎｇ． ６９：２８２−２８６； Ｓｈｅｅｈａｎ， Ｊ．， （１９９４） Ａｍｅｒ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． ｐｐ１−５２；　Ｓｕ ｅｔ ａｌ．， （１９９３） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｌｅｔｔ． １５：９７９−９８４）。
【０００７】
発明の概要
セルロースを加水分解するための安価な酵素法の開発は、基質資化の効率や、糖化発酵法の経済効率を向上させる上で、大きな可能性を孕んでいる。従って、複合糖を効率的に脱重合させ、その後その糖を急速に発酵させてアルコールにするのに利用できるような酵素、そして好ましくはこのような酵素を生産する生体触媒、を開発できれば、利点が大きいと考えられる。
【０００８】
エルウィニア−クリサンセミ（Ｅｒｗｉｎｉａ ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ）など、いくつかの微生物は、複合糖を含有する植物組織を分解するのに大変効果的な加水分解酵素及び融解酵素を、数多く生産する。特にこの生物は二種類の異なる（ＥＧＹ及びＥＧＺを含む）エンドグルカナーゼ活性を生産するが、これら二種のエンドグルカナーゼ活性は、特定の量、用いたときに、複合糖を分解する効果の高い酵素組成物として働くことが発見されている。これらの酵素を、所望のエンドグルカナーゼ活性が混合した粗抽出物として用いることもできるが、精製された組成物として用いるのが好ましいであろう。
【０００９】
さらに、生体触媒、好ましくは組換え細菌、より好ましくはエタノール生産性細菌を操作して、複合糖を分解するのに充分な特定の量、これらの酵素活性の一つ以上を発現するようにすることができる。このような生体触媒は、同時糖化発酵法（ＳＳＦ）として公知のプロセスにより、複合糖を効率的に分解し、その後発酵させてアルコールにするのに適している。上記のエンドグルカナーゼ組成物又は生体触媒の長所の一つは、複合糖を分解させるのに別の真菌セルラーゼを今まで程必要としないか、又は全く必要としない点である。
【００１０】
本発明は、複合糖の分解を行うためのエンドグルカナーゼ活性、より好ましくは、複合糖を至適に分解させるために特定の比でエンドグルカナーゼ活性を利用すること、を提案するものである。
【００１１】
加えて、本発明は、複合糖を分解するのに適したエンドグルカナーゼ活性を至適に発現及び分泌するよう操作された組換えホスト細胞も提供する。具体的には、至適な発現のためのサロゲート・プロモータの転写制御下でエンドグルカナーゼを発現する組換え腸内細菌、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）及びクレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）を例示する。さらに、特定の比で至適に発現するよう、それぞれがサロゲート・プロモータの転写制御下にある二種の異なるエンドグルカナーゼｃｅｌＹ 及びｃｅｌＺを発現する組換え腸内細菌も例示する。
【００１２】
本発明は、これらのホストをさらに改変して、細胞による当該エンドグルカナーゼの生産及び／又は分泌が増加するような一種又は複数の分泌たんぱくを含めることも提案する。ある好適な実施例では、本発明は、ジモモナス−モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ）など、効率的なエタノール生産生物を由来とする外因性のエタノール生産遺伝子を含める改変をこれらのホストに行うことも提案する。
【００１３】
従って、これらのホストは、単独で用いても、又は、複合糖からアルコールを効率的に生成できるよう他の酵素又は組換えホストと組み合わせて用いてもよいタンパク質を、高レベルで発現することができる。
【００１４】
より具体的には、本発明はある態様において、オリゴ糖を分解する組成物であって、第一分解活性を有する第一エンドグルカナーゼと、第二分解活性を有する第二エンドグルカナーゼとを含有し、このとき前記第一及び第二エンドグルカナーゼによるオリゴ糖分解が相乗するような比で、前記第一及び第二分解活性が存在する、組成物、を提供するものである。
【００１５】
第二の態様では、本発明は、オリゴ糖を分解する方法であって、オリゴ糖を、第一分解活性を有する第一エンドグルカナーゼと、第二分解活性を有する第二エンドグルカナーゼとに接触させるステップを含み、このとき前記第一及び第二エンドグルカナーゼによるオリゴ糖分解が相乗するような比で、前記第一及び第二分解活性が存在する、方法、を提供する。
【００１６】
上記の態様の一実施例においては、オリゴ糖を第一エンドグルカナーゼ及び第二エンドグルカナーゼに接触させる前記ステップを、何らかの順序で行うか、又は同時に行う。
【００１７】
上記の態様の一実施例においては、前記第一エンドグルカナーゼ又は第二エンドグルカナーゼ、あるいは前記第一エンドグルカナーゼ及び第二エンドグルカナーゼの両者、は細胞抽出物から得られる。前記細胞抽出物は、例えば、前記第一エンドグルカナーゼ又は第二エンドグルカナーゼ、あるいは第一及び第二エンドグルカナーゼの両者、を発現するよう組換え操作された細菌細胞など、細菌細胞から得られる。関連する実施例では、前記細菌細胞は、エンテロバクテリアセエ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）科から選択され、好ましくはエシェリヒア又はクレブシエラのいずれかであり、より好ましくは、ｃｅｌＺ にコードされた第一エンドグルカナーゼと、ｃｅｌＹにコードされた第二エンドグルカナーゼとを含有し、ただしこのときｃｅｌＺ 及びｃｅｌＹ はエルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）由来であるとよい。
【００１８】
上記の態様の別の実施例では、前記第一エンドグルカナーゼはＥＧＺであり、前記第二エンドグルカナーゼはＥＧＹであり、好ましくは約１：１乃至、より好ましくは約９：１乃至約１９：１の範囲の比で含まれているとよい。
【００１９】
上記の態様のさらに別の実施例では、前記第一エンドグルカナーゼ又は第二エンドグルカナーゼ、あるいは第一及び第二エンドグルカナーゼの両者は、精製されている。
【００２０】
上記の態様のさらに別の実施例では、オリゴ糖の分解は、約１．１乃至約２．０の範囲の因数、そして好ましくは約１．８の因数で相乗される。
【００２１】
上記の態様のさらに別の実施例では、前記組成物は、エンドグルカナーゼ、エキソグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、β−グルコシダーゼ、エンド−１，４−β−キシラナーゼ、α−キシロシダーゼ、α−グルクロニダーゼ、α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ、アセチルエステラーゼ、アセチルキシランエステラーゼ、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、プルラナーゼ、β−グルカナーゼ、ヘミセルラーゼ、アラビノシダーゼ、マンナナーゼ、ペクチンヒドロラーゼ、ペクチン酸リアーゼ、又はこれらの組み合わせ、などの付加的な酵素を含有する。
【００２２】
上記態様の関連する実施例では、前記の付加的な酵素は、真菌、好ましくはＴ．ロンギブランキアタム（Ｔ． ｌｏｎｇｉｂｒａｎｃｈｉａｔｕｍ）、を由来とするグルカナーゼである。
【００２３】
上記の態様の別の関連する実施例では、前記の付加的な酵素は、エタノール生産性酵素、好ましくは例えばピルビン酸デカルボキシラーゼ又はアルコールデヒドロゲナーゼなどのエタノール生産性酵素である。
【００２４】
上記の態様の別の実施例では、前記第一エンドグルカナーゼ及び第二エンドグルカナーゼは、別々にパッケージされている。
【００２５】
上記の態様の別の実施例では、前記組成物が同時糖化発酵に用いられる。
【００２６】
上記の態様のさらに別の実施例では、前記オリゴ糖はセロオリゴ糖、リグノセルロース、ヘミセルロース、セルロース、ペクチン、又はこれらの何らかの組み合わせである。
【００２７】
上記の態様のさらに別の実施例では、本組成物又は方法は、それぞれ、水溶液中に用いられる、又は、水溶液中で行われる。
【００２８】
第三の態様では、本発明は、オリゴ糖を分解するのに適した組換えホスト細胞であって、第一分解活性を有する第一エンドグルカナーゼをコードする第一異種ポリヌクレオチドセグメントを、サロゲート・プロモータの転写制御下に、そして、第二分解活性を有する第二エンドグルカナーゼをコードする第二異種ポリヌクレオチドセグメントを、サロゲート・プロモータの転写制御下に、含有する、組換えホスト細胞を提供する。該組換えホスト細胞においては、前記第一及び第二エンドグルカナーゼによるオリゴ糖の分解が相乗するような比で、前記第一及び第二分解活性が存在するように、前記第一エンドグルカナーゼ及び第二エンドグルカナーゼを発現させる。
【００２９】
ある実施例では、前記第一エンドグルカナーゼ又は第二エンドグルカナーゼ、あるいは、前記第一及び第二エンドグルカナーゼの両者は、分泌される。ある関連する実施例では、前記第一エンドグルカナーゼ又は第二エンドグルカナーゼ、あるいは、前記第一及び第二エンドグルカナーゼの両者は、細胞抽出物から得られる。前記細胞抽出物は、例えば、前記第一エンドグルカナーゼ又は第二エンドグルカナーゼ、あるいは第一及び第二エンドグルカナーゼの両者、を発現するよう組換え操作された細菌細胞など、細菌細胞から得られる。関連する実施例では、前記細菌細胞は、エンテロバクテリアセエ科から選択され、好ましくはエシェリヒア又はクレブシエラのいずれかであるが、より好ましくはＥ．コリＢ、Ｅ．コリＤＨ５α、又はクレブシエラ−オキシトカ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａ）であるとよい。
【００３０】
上記の態様のさらに別の実施例では、本組成物は、エンドグルカナーゼ、エキソグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、β−グルコシダーゼ、エンド−１，４−β−キシラナーゼ、α−キシロシダーゼ、α−グルクロニダーゼ、α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ、アセチルエステラーゼ、アセチルキシランエステラーゼ、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、プルラナーゼ、β−グルカナーゼ、ヘミセルラーゼ、アラビノシダーゼ、マンナナーゼ、ペクチンヒドロラーゼ、ペクチン酸リアーゼ、又はこれらの組み合わせ、などの付加的な酵素を含有する。
【００３１】
一実施例では、前記第一エンドグルカナーゼは、ｃｅｌＺ にコードされており、そして前記第二エンドグルカナーゼはｃｅｌＹにコードされており、このときｃｅｌＺ 及びｃｅｌＹ はエルウィニア由来である。
【００３２】
上記の態様の関連する実施例では、前記の付加的な酵素は、真菌、好ましくはＴ．ロンギブランキアタム、を由来とするグルカナーゼである。
【００３３】
別の関連する実施例では、前記第一エンドグルカナーゼはＥＧＺであり、そして前記第二エンドグルカナーゼはＥＧＹである。
【００３４】
別の関連する実施例では、前記の付加的な酵素は、分泌性酵素、好ましくはｐｕｌ又はｏｕｔ遺伝子産物である。
【００３５】
上記の態様の別の関連する実施例では、本ホスト細胞は、例えばＥ．コリ ＫＯ４ （ＡＴＣＣ ５５１２３）、Ｅ． コリＫＯ１１ （ＡＴＣＣ ５５１２４）、Ｅ． コリＫＯ１２ （ＡＴＣＣ ５５１２５）及び Ｅ． コリＬＹ０１ （ＡＴＣＣ　　　　）、Ｋ． オキシトカ Ｍ５Ａ１、及びＫ． オキシトカ Ｐ２ （ＡＴＣＣ ５５３０７）など、エタノール生産性である。
【００３６】
第四の態様では、本発明は、第一分解活性を有する第一エンドグルカナーゼをコードする第一異種ポリヌクレオチドセグメントを、サロゲート・プロモータの転写制御下に含有し、さらに第二分解活性を有する第二エンドグルカナーゼをコードする一配列を含有する第二異種ポリヌクレオチドセグメントを、サロゲート・プロモータの転写制御下に含有するようなホスト細胞に、オリゴヌクレオチドを接触させることにより、オリゴ糖の分解を促進する方法を提供するものである。さらに本方法は、前記第一及び第二エンドグルカナーゼによるオリゴ糖の分解が相乗し、ひいては促進されるような比で、前記第一及び第二分解活性が存在するよう、前記第一エンドグルカナーゼ及び第二エンドグルカナーゼを発現させることを提案する。
【００３７】
上記の態様の一実施例では、前記第一エンドグルカナーゼ又は第二エンドグルカナーゼ、あるいは前記第一及び第二エンドグルカナーゼの両者が分泌される。
【００３８】
別の実施例では、上記の方法のホスト細胞はエタノール生産性である。
【００３９】
別の実施例では、本方法は水溶液中で行われる。
【００４０】
さらに別の実施例では、本方法は、同時糖化発酵に用いられる。
【００４１】
さらに別の実施例では、本方法は、セロオリゴ糖、リグノセルロース、ヘミセルロース、セルロース、ペクチン、又はこれらの何らかの組み合わせ、からなる群より選択されるオリゴ糖を分解することを包含する。
【００４２】
第五の態様では、本発明は、第一分解活性を有する第一エンドグルカナーゼをコードする第一異種ポリヌクレオチドセグメントを、サロゲート・プロモータの転写制御下に来るよう、そして第二分解活性を有する第二エンドグルカナーゼをコードする一配列を含有する第二異種ポリヌクレオチドセグメントを、サロゲート・プロモータの転写制御下に来るよう、ホスト細胞に導入することにより、オリゴ糖を分解するのに適した組換えホスト細胞を作製する方法を提供するものである。さらに本方法は、前記第一及び第二エンドグルカナーゼによるオリゴ糖の分解が相乗するような比で、前記第一及び第二分解活性が存在するよう、前記第一及び第二エンドグルカナーゼを発現させることを提案する。
【００４３】
上記の態様の一実施例では、前記第一エンドグルカナーゼ又は第二エンドグルカナーゼ、あるいは、前記第一及び第二エンドグルカナーゼの両者が分泌される。
【００４４】
別の態様では、前記ホスト細胞はエタノール生産性である。
【００４５】
さらに別の実施例では、前記第一エンドグルカナーゼはｃｅｌＺにコードされており、そして前記第二エンドグルカナーゼはｃｅｌＹにコードされており、そして ｃｅｌＺ及びｃｅｌＹはエルウィニアを由来とする。
【００４６】
さらに別の実施例では、前記第一異種ポリヌクレオチドセグメント又は前記第二異種ポリヌクレオチドセグメント、あるいは、前記第一及び第二ポリヌクレオチドセグメントの両者、のサロゲート・プロモータは、ジモモナス−モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ）を由来とするポリヌクレオチド断片を含有する。
【００４７】
さらに別の実施例では、前記組換えホスト細胞は、同時糖化発酵に適し、好ましくはエタノール生産性である。
【００４８】
第六の態様では、本発明は、ｐＬＯＩ２３５２ のポリヌクレオチド配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １７）を含有するベクタをホスト細胞に導入し、前記ベクタが安定に組み込まれたホスト細胞を特定することにより、組換えホスト細胞組込み体を作製する方法を提供する。
【００４９】
第七の態様では、本発明は、ｐＬＯＩ２３０６ のポリヌクレオチド配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １２）を含有するベクタをホスト細胞に導入し、エンドグルカナーゼを発現しているホスト細胞を同定することにより、ホスト細胞でエンドグルカナーゼを発現させる方法を提供する。
【００５０】
第八の態様では、本発明は、第一分解活性を有する第一エンドグルカナーゼをコードする第一異種ポリヌクレオチドセグメントをサロゲート・プロモータの転写制御下に、そして第二分解活性を有する第二エンドグルカナーゼをコードする第二異種ポリヌクレオチドセグメントをサロゲート・プロモータの転写制御下に含有するようなエタノール生産性ホスト細胞に、オリゴ糖源を接触させることにより、オリゴ糖源からエタノールを生成する方法を提供する。さらに本方法は、前記第一及び第二エンドグルカナーゼによるオリゴ糖の分解が相乗する結果、オリゴ糖が分解し、発酵してエタノールになるような比で、前記第一及び第二分解活性が存在するよう、前記第一及び第二エンドグルカナーゼを発現させることを提案する。
【００５１】
ある態様では、前記第一エンドグルカナーゼは、ｃｅｌＺにコードされており、そして前記第二エンドグルカナーゼはｃｅｌＹ 遺伝子にコードされており、ｃｅｌＺ 及びｃｅｌＹ はエルウィニアを由来とする。
【００５２】
別の実施例では、本ホスト細胞は、少なくとも一つのｐｕｌ遺伝子又はｏｕｔ遺伝子をコードする異種ポリヌクレオチドセグメントをさらに含有する。
【００５３】
さらに別の実施例では、本ホスト細胞は、エンテロバクテリアセエ科、好ましくはエシェリヒア又はクレブシエラ、より好ましくはＥ． コリＫＯ４ （ＡＴＣＣ ５５１２３）、Ｅ． コリＫＯ１１ （ＡＴＣＣ ５５１２４）、Ｅ． コリＫＯ１２ （ＡＴＣＣ ５５１２５）、ＬＹ０１ （ＡＴＣＣ　　　 ）、Ｋ． オキシトカ Ｍ５Ａ１、又はＫ． オキシトカ Ｐ２ （ＡＴＣＣ ５５３０７）から選択される。
【００５４】
別の実施例では、本方法は水溶液中で行われる。
【００５５】
さらに別の実施例では、前記オリゴ糖は、セロオリゴ糖、リグノセルロース、ヘミセルロース、セルロース、ペクチン、及びこれらの何らかの組み合わせ、からなる群より選択される。
【００５６】
別の実施例では、前記異種ポリヌクレオチドセグメントは、ｐＬＯＩ ２３５２ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １７）であるか、又は、ｐＬＯＩ ２３５２ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １７）を由来とする。
【００５７】
さらに別の実施例では、前記第一エンドグルカナーゼはＥＧＺであり、前記第二エンドグルカナーゼはＥＧＹである。
【００５８】
別の実施例では、前記第一ポリヌクレオチドセグメント又は第二ポリヌクレオチドセグメント、あるいは、前記第一及び第二ポリヌクレオチドセグメントの両者、のサロゲート・プロモータは、ジモモナス−モビリスを由来とするポリヌクレオチド断片を含有する。
【００５９】
第九の態様では、本発明は、プラスミドｐＬＯＩ２３１１、ｐＬＯＩ１６２０、ｐＬＯＩ２３１６、ｐＬＯＩ２３１７、ｐＬＯＩ２３１８、ｐＬＯＩ２３１９、ｐＬＯＩ２３２０、ｐＬＯＩ２３２３、ｐＬＯＩ２３４２、ｐＬＯＩ２３４８、ｐＬＯＩ２３４９、ｐＬＯＩ２３５０、ｐＬＯＩ２３５２、ｐＬＯＩ２３５３、ｐＬＯＩ２３５４、ｐＬＯＩ２３５５、ｐＬＯＩ２３５６、ｐＬＯＩ２３５７、ｐＬＯＩ２３５８、又はｐＬＯＩ２３５９のポリヌクレオチド配列又はその断片を含有するベクタを提供する。
【００６０】
第十の態様では、本発明は、プラスミドｐＬＯＩ２３１１、ｐＬＯＩ１６２０、ｐＬＯＩ２３１６、ｐＬＯＩ２３１７、ｐＬＯＩ２３１８、ｐＬＯＩ２３１９、ｐＬＯＩ２３２０、ｐＬＯＩ２３２３、ｐＬＯＩ２３４２、ｐＬＯＩ２３４８、ｐＬＯＩ２３４９、ｐＬＯＩ２３５０、ｐＬＯＩ２３５２、ｐＬＯＩ２３５３、ｐＬＯＩ２３５４、ｐＬＯＩ２３５５、ｐＬＯＩ２３５６、ｐＬＯＩ２３５７、ｐＬＯＩ２３５８、又はｐＬＯＩ２３５９のポリヌクレオチド配列又はその断片を有するベクタを含有するホスト細胞を提供する。
【００６１】
ある実施例では、前記ホストはクレブシエラ−オキシトカ株Ｐ２ （ｐＣＰＰ２００６）、クレブシエラ−オキシトカ株ＳＺ６ （ｐＣＰＰ２００６）、クレブシエラ−オキシトカ株ＳＺ２１ （ｐＣＰＰ２００６）、又はクレブシエラ−オキシトカ株ＳＺ２２ （ｐＣＰＰ２００６）である。
【００６２】
第十一の態様では、本発明は、第一分解活性を有する第一エンドグルカナーゼを得、第二分解活性を有する第二エンドグルカナーゼを得、前記第一及び第二エンドグルカナーゼにオリゴ糖を接触させることで、オリゴ糖を分解する方法であって、前記第一及び第二分解活性が、前記第一及び第二エンドグルカナーゼによるオリゴ糖分解が相乗するような比で存在する、方法、を提供する。
【００６３】
第十二の態様では、本発明は、第一分解活性を有する第一エンドグルカナーゼと、第二分解活性を有する第二エンドグルカナーゼとに、オリゴ糖を接触させることにより、オリゴ糖の分解を促進する方法であって、前記第一及び第二分解活性が、前記第一及び第二エンドグルカナーゼによるオリゴ糖分解が相乗して促進されるような比で存在する、方法、を提供する。
【００６４】
関連する態様では、本発明は、第一分解活性を有する第一エンドグルカナーゼと、第二分解活性を有する第二エンドグルカナーゼとに、オリゴ糖を接触させることにより、オリゴ糖を分解する、及び／又は、オリゴ糖の分解を促進する方法であって、前記第一及び第二分解活性は、前記第一及び第二エンドグルカナーゼによるオリゴ糖分解の結果、粘性の変化、好ましくは粘性の低下が、より好ましくは少なくとも例えば５センチポアズ、１０センチポアズ、２０センチポアズ、５０センチポアズ、１００センチポアズ、５００センチポアズ、又は１０００センチポアズもしくはそれ以上、又はこれらの範囲内の量、起きるような比で存在する、方法、を提供する。
【００６５】
ある好適な実施例では、前記オリゴ糖はセルロース、例えば非晶質セルロース又は結晶質セルロースなど、であり、例えば紙、パルプ又は植物繊維などを原料としてもよい。
【００６６】
第十三の態様では、本発明は、第一エンドグルカナーゼをコードする第一異種ポリヌクレオチドセグメントと、第二エンドグルカナーゼをコードする第二異種ポリヌクレオチドセグメントと、を含有する、オリゴ糖を分解するのに適した組換えホスト細胞を提供するものである。
【００６７】
関連する態様では、前記ホスト細胞が、第一エンドグルカナーゼをコードする第一異種ポリヌクレオチドセグメントと、第二エンドグルカナーゼをコードする第二異種ポリヌクレオチドセグメントと、を含んで成ることで、オリゴ糖の粘性を低下させるのに適したものとなっている。
【００６８】
ある実施例では、前記第一異種ポリヌクレオチドセグメントがサロゲート・プロモータの転写制御下にあり、前記第二異種ポリヌクレオチドセグメントがサロゲート・プロモータの転写制御下にある。
【００６９】
別の実施例では、前記細胞は、細菌細胞であり、好ましくはエンテロバクテリアセエ科、より好ましくはエシェリヒア 又はクレブシエラ属から選択されるとよい。
【００７０】
別の実施例では、前記第一エンドグルカナーゼは ｃｅｌＺ にコードされており、前記第二エンドグルカナーゼはｃｅｌＹにコードされており、そしてｃｅｌＺ 及びｃｅｌＹ はエルウィニアを由来とする。
【００７１】
別の実施例では、前記第一エンドグルカナーゼはＥＧＺであり、そして前記第二エンドグルカナーゼはＥＧＹである。
【００７２】
第十四の態様では、本発明は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションの寄託番号ＡＴＣＣ　　　　の寄託株を代表とするクレブシエラ−オキシトカ株Ｐ２（ｐＣＰＰ２００６）の組換えホスト株を提供する。
【００７３】
第十五の態様では、本発明は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションの寄託番号ＡＴＣＣ　　　　の寄託株を代表とするクレブシエラ−オキシトカ株ＳＺ６（ｐＣＰＰ２００６）の組換えホスト株を提供する。
【００７４】
第十六の態様では、本発明は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションの寄託番号ＡＴＣＣ　　　　の寄託株を代表とするクレブシエラ−オキシトカ株ＳＺ２１（ｐＣＰＰ２００６）の組換えホスト株を提供する。
【００７５】
第十七の態様では、本発明は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションの寄託番号ＡＴＣＣ　　　　の寄託株を代表とするクレブシエラ−オキシトカ株ＳＺ２２（ｐＣＰＰ２００６）の組換えホスト株を提供する。
【００７６】
第十八の態様では、本発明は、第一エンドグルカナーゼをコードする第一異種ポリヌクレオチドセグメントと、第二エンドグルカナーゼをコードする第二異種ポリヌクレオチドセグメントと、を含有する組換え細胞であって、このとき第一エンドグルカナーゼをコードする前記第一ポリヌクレオチドセグメント又は第二エンドグルカナーゼをコードする前記第二ポリヌクレオチドセグメント、あるいはこの両者、が、エルウィニア由来のｃｅｌＹ又はｃｅｌＺのいずれかの遺伝子産物にアミノ酸アライメントしたときに充分相同であるために、多糖を分解できる機能的活性を共有する、組換え細胞、を提供する。
【００７７】
第十九の態様では、本発明は、接触させたオリゴ糖を分解する、及び／又は、その粘性を低下させるのに適した、例えば分泌されたポリペプチド、ライセートもしくはブロス、あるいは、純粋な、半純粋な、もしくは未精製の酵素抽出物又はポリペプチドなど、本発明のホスト細胞を由来とする抽出物又は組成物を提供するものである。
【００７８】
本発明の他の特徴及び長所は、以下の詳細な説明及び請求の範囲から明かとなろう。
【００７９】
発明の詳細な説明
本発明の範囲全体を明瞭に理解できるよう、以下の定義を設ける。
【００８０】
Ｉ．定義
ここで用いる用語「組換えホスト」には、例えば異種のポリヌクレオチド配列を組み込めたり、トランスフェクトが可能であるなど、遺伝子操作に適した細胞が包含されるものと、意図されている。当該細胞は微生物であっても、又は高等真核細胞であってもよい。この用語には、最初にトランスフェクトされた細胞の後代も含まれると、意図されている。好適な実施例では、当該細胞は、グラム陰性細菌細胞などの細菌細胞であり、この用語には、例えばエシェリヒア、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、シトロバクター（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、クレブシエラ、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、エルウィニア、クリュイベラ（Ｋｌｕｙｖｅｒａ）、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、セデセア（Ｃｅｄｅｃｅａ）、モルガネラ（Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ）、ハフニア（Ｈａｆｎｉａ）、エドワードシエラ（Ｅｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ）、プロビデンシア（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ）、プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）及びエルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）など、エンテロバクテリアセエ科のあらゆる条件的嫌気性グラム陰性細胞が含まれるものと、意図されている。特に好適な組換えホストはエシェリヒア−コリ又はクレブシエラ−オキシトカ細胞である。
【００８１】
用語「比」には、所定の組み合わせにした二種の酵素の（活性又はモルなどで測定したときの）量の間の関係が含まれると意図されているが、このとき好ましくは、この比は天然の比でないとよく、より好ましくは相乗的な酵素活性を生ずる比であるとよい。
【００８２】
「第一分解活性を有する第一エンドグルカナーゼ」及び「第二分解活性を有する第二エンドグルカナーゼ」という用語には、それぞれ、第二活性を持つ別のエンドグルカナーゼ（例えば第二エンドグルカナーゼ）から、機能（例えば特定の基質に対するその活性；別の酵素との相乗作用など）や、由来となったもと（例えば天然発生型の株や、又は、あるエンドグルカナーゼを発現するクローンを発現する遺伝子改変された株、を含めたホスト細胞株など）や、又は、公知の技術（例えば分子量決定又は精製上の特徴など）による生化学的性質で、区別することのできる活性を持つエンドグルカナーゼが包含されるものと、意図されている。オリゴ糖の酵素的加水分解など、当該分解活性には、さらに、オリゴ糖の粘性変化が含まれていてもよい。
【００８３】
用語「相乗作用」、「相乗的活性」及び「相乗した」とは、識別可能なポリペプチド間又はポリペプチド活性間の相互作用であって、このとき当該ポリペプチドの総活性を一緒に捉えたときの効果が、個々の活性の効果を合計したときよりも大きくなるような相互作用、を言うものと、意図されている。当該ポリペプチドは、例えば、エンドグルカナーゼ、 エキソグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、β−グルコシダーゼ、エンド−１，４−β−キシラナーゼ、α−キシロシダーゼ、α−グルクロニダーゼ、α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ、 アセチルエステラーゼ、アセチルキシランエステラーゼ、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、プルラナーゼ、β−グルカナーゼ、ヘミセルラーゼ、アラビノシダーゼ、マンナナーゼ、ペクチンヒドロラーゼ、ペクチン酸リアーゼ、又はこれらの何らかの組合せ、であってよい。ポリペプチドの活性には、オリゴ糖の分解（例えば加水分解）が含まれるが、オリゴ糖の粘性変化を含めてもよい。オリゴ糖の相乗した分解とは、好ましくは約１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、又はより好ましくは約２．０の因数での相乗であるが、典型的な因数は約１．８である。
【００８４】
用語「異種ポリヌクレオチドセグメント」には、一種又はそれ以上のポリペプチド又はポリペプチドの部分もしくは断片をコードするポリヌクレオチドセグメントが含まれるものと、意図されている。異種ポリヌクレオチドセグメントは、例えば真核生物、原核生物、ウィルス、又は合成ポリヌクレオチド断片など、いかなる源を由来としてもよい。
【００８５】
用語「ポリサッカラーゼ」、「セルラーゼ」又は「グルカナーゼ」はここでは互換可能に用いられており、例えば二糖、三糖、オリゴ糖や、セルロース、ヘミセルロース及びペクチンを含んで成るセロオリゴ糖及びリグノセルロースなど、の複合糖とも言及される複合糖質を含め、連結された何らかの糖部分の分解又は脱重合を触媒できるポリペプチド含むものと、意図されている。この用語には、好ましくはエンドグルカナーゼなどのグルカナーゼなどを含み、さらにエキソグルカナーゼ、β−グルコシダーゼ、セロビオヒドロラーゼ、エンド−１，４−β−キシラナーゼ、β−キシロシダーゼ、α−グルクロニダーゼ、α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ、アセチルエステラーゼ、アセチルキシランエステラーゼ、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、プルラナーゼ、β−グルカナーゼ、ヘミセルラーゼ、アラビノシダーゼ、マンナナーゼ、ペクチンヒドロラーゼ、ペクチン酸リアーゼ、又はこれらのセルラーゼのいずれかの組合せ、を含むセルラーゼが含まれるものと、意図されている。
【００８６】
用語「エンドグルカナーゼ」には、重合体になった基質の内側のβ１乃至４位のグルコシル結合を典型的に加水分解し、この鎖の末端にある結合は優先的には加水分解しないようなセルラーゼを含むものと、意図されている。
【００８７】
用語「サロゲート・プロモータ」には、天然では転写上の制御を行わない相手である目的遺伝子の転写を制御できるポリヌクレオチドセグメントが含まれるものと、意図されている。ある好適な実施例では、サロゲート・プロモータによる転写制御の結果、 目的遺伝子の発現が増加する。ある好適な実施例では、サロゲート・プロモータは、目的遺伝子の５’側に位置している。サロゲート・プロモータを天然のプロモータの代わりに用いてもよく、又は天然のプロモータに加えて用いてもよい。サロゲート・プロモータは、用いられる先のホスト細胞にとって内因性のものでも、又は、例えば用いられる先のホスト細胞にとって外因性であるなど、ホスト細胞に導入される異種ポリヌクレオチド配列であってもよい。細菌に用いるのに適した他のプロモータには、例えばｌａｃＺ、Ｔ７、及びＳＰ６ （例えば下に言及する Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．の文献を参照されたい）がある。
【００８８】
用語「オリゴ糖源」、「オリゴ糖」、「複合セルロース」、「複合糖質」、及び「複合糖」及び「多糖」は基本的に互換可能に用いられており、糖分子を２個以上含んで成るあらゆる糖質源を包含するものと、意図されている。これらの糖質は、いかなる未加工の植物原料又はいかなる加工済みの植物原料を由来としてもよい。例は、木材、紙、パルプ、植物由来繊維、又は、糖質部分、即ち糖残基一個、を二個以上連結して成る合成繊維、である。オリゴ糖源の具体的な一例は、乾燥重量で大半の植物原料の約９０％を占め、セルロース、ヘミセルロース、ペクチンなどの糖質、及び芳香族高分子、例えばリグニン、を含有するリグノセルロースである。セルロースは、乾燥重量でリグノセルロースの３０乃至５０％を構成し、セロビオース（グルコースの二量体）のホモポリマーである。同様に、ヘミセルロースは、乾燥重量でリグノセルロースの２０乃至５０％を構成し、アセチル及びグルクロニル側鎖を含有するペントース（キシロース、アラビノース）及びヘキソース（グルコース、マンノース、ガラクトース）糖が混合した複合ポリマーである。ペクチンは、乾燥重量でリグノセルロースの１乃至２０％を構成し、グルクロン酸のメチル化ホモポリマーである。他のオリゴ糖源には、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、非晶質セルロース（例えば酸膨潤セルロース）、及びセロオリゴ糖類のセロビオース、セロトリオース、セロテトラオース及びセロペンタオース、がある。非晶質セルロースなどのセルロースは、紙又はパルプ源（例えばこれらの液性廃棄物を含む）、又は農業副産物、例えばとうもろこしの茎、大豆の可溶性の液、及びてん菜パルプなど、を由来としてもよい。上記の糖質ポリマーのいずれの一つ又は組合せは、いかなるものも、本発明の製品及び方法に基づく発酵により、脱重合後にエタノールに生物変換させることのできる糖原料候補である。
【００８９】
用語「遺伝子」又は「ポリヌクレオチドセグメント」は、例えばあるポリペプチドをコードする開放読み取り枠を含むポリヌクレオチドなどの核酸分子を包含する用語であり、さらに、コーディング配列以外の調節配列及びイントロンもこれに含めることができる。加えて、この用語には、さらに、それぞれエルウィニア及びクレブシエラのｏｕｔ又はｐｕｌ遺伝子など、分泌性ポリペプチドなどの遺伝子産物を２種以上コードする、一箇所の機能的遺伝子座にマップされる一つ以上の遺伝子が含まれると、意図されている。加えて、この用語には、所定の目的のための特定の遺伝子が含まれると、意図されている。当該遺伝子は、ホスト細胞にとって内因性のものでも、又は、例えばエピソームのまま残ったプラスミドや、ゲノムに安定に組み込まれたプラスミド（又はその断片）など、ホスト細胞に組換えにより導入されるものでもよい。ある好適な実施例では、ポリヌクレオチドセグメントの当該遺伝子は、糖質のエタノールへの生物変換のうちの少なくとも一つの段階に関与するものである。従って、この用語には、アルコール脱水素酵素、ピルビン酸デカルボキシラーゼなどのポリペプチドや、分泌たんぱく又はポリサッカラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ又はエキソグルカナーゼなどのグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、β−グルコシダーゼ、エンド−１，４−β−キシラナーゼ、β−キシロシダーゼ、α−グルクロニダーゼ、α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ、アセチルエステラーゼ、アセチルキシランエステラーゼ、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、プルラナーゼ、β−グルカナーゼ、ヘミセルラーゼ、アラビノシダーゼ、マンナナーゼ、ペクチンヒドロラーゼ、ペクチン酸リアーゼ、又はこれらの組合せ、などのポリペプチドをコードするあらゆる遺伝子が包含されると、意図されている。
【００９０】
用語「同時糖化発酵」又は「ＳＳＦ」には、複合糖の分解又は脱重合と、発酵によるその糖残基のエタノールへの生物変換とを同時に行うために一種以上の組換えホスト（又は精製済み又は未精製の抽出物を含むその抽出物）を使用することが含まれると、意図されている。
【００９１】
用語「転写制御」には、転写レベルで遺伝子発現を調節する能力が含まれるものと、意図されている。ある好適な実施例では、目的遺伝子のコーディング領域の５’末端近傍にサロゲート・プロモータを置換する又は加えて遺伝子発現を変化させることにより、転写、ひいては遺伝子発現を調節する。最も好適な実施例では、一つ以上の遺伝子の転写制御を操作して、このような遺伝子が、例えば所定比で発現するなど、至適に発現するようにする。この用語はさらに、当業で公知の誘導性転写制御も含む。
【００９２】
用語「発現」には、少なくともｍＲＮＡ生成レベルでの、遺伝子発現が含まれるものと、意図されている。
【００９３】
用語「発現産物」には、ポリペプチドなど、発現した遺伝子の産物が含まれると、意図されている。
【００９４】
用語「発現の増加」には、少なくともｍＲＮＡ生成レベルの増加、そして好ましくはポリペプチド発現レベルでの増加といった、遺伝子発現の変化が含まれると、意図されている。
【００９５】
用語「生成の増加」には、発現するポリペプチド量の増加、ポリペプチドの酵素活性レベルの増加、又はこれらの組合せ、が含まれると、意図されている。
【００９６】
用語「活性」及び「酵素活性」は互換可能に用いられており、好ましい条件下で生じた所定のポリペプチドに通常帰属するあらゆる機能的活性を含むものと、意図されている。エンドグルカナーゼ（例えばＥＧＹ又はＥＧＺ）の活性は、例えば、このポリペプチドが、複合糖を酵素的に脱重合できることである。典型的には、所定のポリペプチドの活性とは、生じるポリペプチドに関連した総酵素活性を包含するものである。ホスト細胞により生産され、酵素活性を有するポリペプチドは、当該細胞の細胞内空間にあったり、細胞に結合していたり、細胞外ミリューに分泌されたり、又はこれらの組合せで存在する。分泌された活性に比較したときの総活性を決定する技術はここに解説されているが、当業でも公知である。
【００９７】
用語「分泌された」には、異種ポリペプチド、好ましくはポリサッカラーゼなどのポリペプチドの、ペリプラスム空間又は細胞外ミリューへの分泌の増加が含まれるものと、意図されている。典型的には、当該ポリペプチドは、天然で起きる分泌量を超える、増加したレベルで分泌される。より好ましくは、用語「分泌された」とは、天然で起きる分泌レベルに比較して、少なくとも１０％、そしてより好ましくは少なくとも約１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、１０００％、又はそれ以上である、ポリペプチドの分泌の増加を言う。
【００９８】
用語「分泌ポリペプチド」には、別のポリペプチドの、ある細胞の細胞内空間から細胞外ミリューへの輸送を促進するような、あらゆる単独のポリペプチド又は他のポリペプチドとの組合せ、が含まれると、意図されている。ある実施例では、前記一つ又は複数の本分泌ポリペプチドは、分泌活性をグラム陰性ホスト細胞にもたらすのに充分な、あらゆる必要な分泌ポリペプチドを包含するもの。典型的には、分泌たんぱくは、単一の領域又は遺伝子座にコードされており、この領域又は遺伝子座を、ある一つのホスト細胞から単離して別のホスト細胞に、遺伝子操作で移してもよい。ある好適な実施例では、当該の一つ又は複数のポリペプチドは、分泌活性を有する細菌細胞由来である。より好適な実施例では、当該の一つ又は複数のポリペプチドはタイプＩＩ分泌活性を有するホスト細胞由来である。別のより好適な実施例では、当該ホスト細胞を、エンテロバクテリアセエ科から選択する。最も好適な実施例では、当該の一つ又は複数のポリペプチドは、それぞれエルウィニア又はクレブシエラを由来とするｏｕｔ又はｐｕｌ遺伝子の一つ又はそれ以上の遺伝子産物である。さらに、当業者であれば、関連するホストを由来とし、ここに解説した一つ又は複数のｏｕｔ又はｐｕｌ遺伝子に充分相同ないかなる一種又は複数の分泌タンパク質を利用してもよいことは理解されよう（Ｐｕｇｓｌｅｙ ｅｔ ａｌ．， （１９９３） Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ５７：５０−１０８； Ｌｉｎｄｅｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．， （１９９６） Ｍｏｌ． Ｍｉｃｒｏ． ２０：１７５−１９０； Ｌｉｎｄｅｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．， （１９９２） Ｊ． ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １７４：７３８５−７３９７； Ｈｅ ｅｔ ａｌ．， （１９９１） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８８：１０７９−１０８３）。
【００９９】
用語「由来とする」には、提示した源からポリヌクレオチドセグメントを（全部又は部分的に）単離すること、又は、提示した源からポリペプチドを精製すること、が含まれると、意図されている。この用語には、例えば、提示したポリヌクレオチド源に関連する配列からの、又は、このような配列に基づく、直接的クローニング、ＰＣＲ増幅又は人工合成が含まれるものと、意図されている。
【０１００】
用語「エタノール生産性」には、微生物が、糖質から、主要な発酵産物としてエタノールを生産できる能力が含まれる、と意図されている。この用語には、天然のエタノール生産性生物、天然型又は誘導型変異を持つ生物、及び遺伝子改変された生物も含まれるが、これらに限定はされない。
【０１０１】
用語「グラム陰性細菌」には、当業で認識されているこの用語の定義が含まれると、意図されている。典型的には、グラム陰性細菌には、例えば、とりわけエシェリヒア種及びクレブシエラ種を含むエンテロバクテリアセエ科がある。
【０１０２】
用語「充分相同な」には、結果的に第一及び第二のアミノ酸又はヌクレオチド配列が共通の構造ドメイン及び／又は共通の機能的活性を有しているよう、第一のアミノ酸又はヌクレオチド配列が、第二のアミノ酸又はヌクレオチド配列に対して、例えば同様な側鎖を有するアミノ酸残基など、充分な又は最小の数の同一又は同等なアミノ酸残基又はヌクレオチドを含有していることが含まれると、意図されている。例えば、共通の構造ドメインを有するアミノ酸又はヌクレオチド配列が、このドメインのアミノ酸配列に渡って、少なくとも約４０％の相同性、好ましくは５０％の相同性、より好ましくは６０％、７０％、８０％、又は９０％の相同性を有し、少なくとも一つ、好ましくは二つ、より好ましくは三つ、さらにより好ましくは四つ、五つ、又は六つの構造ドメインを含有するような場合をここでは充分に相同であると、定義する。さらに、少なくとも４０％、好ましくは５０％、より好ましくは６０％、７０％、８０％、又は９０％の相同性を共有し、共通の機能的活性を共有するようなアミノ酸又はヌクレオチド配列が、充分に相同であると、ここで定義しておく。
【０１０３】
ある実施例では、プロモータなどの二つのポリヌクレオチドセグメントが、ヌクレオチド配列において実質的な同一性を持つために実質的に同じ調節作用を有するような場合、これらは「充分に相同」である。典型的には、「充分に相同な」配列は、少なくとも所望の調節に関与することが判明している領域において、少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％、７０％、８０％、又は９０％、同一である。より好ましくは、異なる塩基が５個を越えないと良い。最も好ましくは、少なくとも５個の連続した塩基が異ならないとよい。
【０１０４】
二つのポリヌクレオチドセグメント間、又は二つのアミノ酸配列間のパーセント同一性を決定するには、比較が最適にできるよう、これら配列をアライメントする（例えば最適にアライメントできるよう、第一及び第二アミノ酸又は核酸配列の一方又は両方に、ギャップを導入してもよく、相同でない配列は、比較を目的にしたときは無視することができる）。ある好適な実施例では、基準配列のうちで比較を目的としてアライメントする長さは、基準配列の長さの少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、さらにより好ましくは少なくとも６０％、そしてさらにより好ましくは少なくとも７０％、８０％、又は９０％である。次に、対応するアミノ酸位置又はヌクレオチド位置にあるアミノ酸残基又はヌクレオチドを比較する。第一の配列のある位置が、第二の配列の対応する位置にあるのと同じアミノ酸残基又はヌクレオチドで占められていれば、それらの分子はその位置において同一である（ここで用いる場合のアミノ酸又は核酸の「同一性」とは、アミノ酸又は核酸の「相同性」と同等である）。二つの配列間のパーセント同一性は、これら二つの配列を最適にアライメントするのに導入せねばならないギャップの数、及び各ギャップの長さを考慮に入れたときの、これら配列に共通の同一位置の数の関数である。
【０１０５】
二つの配列間の配列の比較や、パーセント同一性の決定は、数学的アルゴリズムを用いて行うことができる。ある好適な実施例では、二つのアミノ酸配列間のパーセント同一性は、ＧＣＧソフトウェア・パッケージ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで入手できる）のＧＡＰプログラムに組み込まれたニードルマン及びワンシュ （Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． （４８）：４４４−４５３ （１９７０））のアルゴリズムを用い、Ｂｌｏｓｓｕｍ ６２ 行列又はＰＡＭ２５０行列を用いて、ギャップ・ウェイトを１６、１４、１２、１０、８、６、又は４にし、レングス・ウェイトを１、２、３、４、５、又は６にして、決定する。さらに別の好適な実施例では、二つのヌクレオチド配列間のパーセント同一性を、ＧＣＧソフトウェア・パッケージ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで入手できる）のＧＡＰプログラムを用い、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰ 行列を用いて、ギャップ・ウェイトを４０、５０、６０、７０、又は８０ にし、そしてレングス・ウェイトを１、２、３、４、５、又は６にして決定する。別の実施例では、二つのアミノ酸又はヌクレオチド配列間のパーセント同一性を、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれた Ｅ． マイヤース及びＷ． ミラーのアルゴリズム（ＣＡＢＩＯＳ， ４：１１−１７（１９８９）） を用い、ＰＡＭ１２０ ウェイト残基表を用いて、ギャップ・レングス・ペナルティを１２、そしてギャップ・ペナルティを４にして、決定する。
【０１０６】
さらに本発明のポリヌクレオチド及びアミノ酸配列を「クエリー配列」として利用して、公開データベースの検索を行って、他のファミリーメンバー又はプロモータ配列などの関連する配列を同定することなどができる。このような検索は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ， ｅｔ ａｌ． （１９９０） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５：４０３−１０のＮＢＬＡＳＴ 及びＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）を利用すれば行える。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索を、ＮＢＬＡＳＴプログラムを用い、スコア＝ １００、ワード長＝ １２ にして行うと、本発明のポリヌクレオチド分子に相同なヌクレオチド配列を得ることができる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索を、 ＸＢＬＡＳＴプログラムを用い、スコア＝ ５０、ワード長＝ ３にして行うと、本発明のポリペプチド分子に相同なアミノ酸配列を得ることができる。比較を目的としてギャップのあるアライメントを行うには、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ をＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．， （１９９７） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５（１７）：３３８９−３４０２が解説するとおりに利用できる。ＢＬＡＳＴ及びギャップドＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、各プログラムの（例えばＸＢＬＡＳＴ 及びＮＢＬＡＳＴ）のデフォルト・パラメータを利用できる。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ． を参照されたい。
【０１０７】
ＩＩ．エンドグルカナーゼ間の相乗作用
本発明は、少なくとも部分的に、エンドグルカナーゼは複合糖を分解する上で相乗的に作用するという発見に基づくものである。本発明は、やはり部分的であるが、エタノール生産性ホスト細胞（例えばＫ．オキシトカＰ２）により、二種のエンドグルカナーゼ（ＥＧＹ及びＥＧＺなど）を機能的に統合及び発現させることで、オリゴ糖（例えば結晶質セルロース）の分解を相乗的に行わせ、同時糖化発酵（ＳＳＦ）によるエタノールの生産を増加させる、という方法に基づくものである。
【０１０８】
実施例の一つでは、エンドグルカナーゼは、Ｅ．クリサンセミ（Ｅ． ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ）を由来とし、ｃｅｌＺ遺伝子にコードされたエンドグルカナーゼＥＧＺである（Ｂｏｙｅｒ， ｅｔ ａｌ． （１９８７） Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １６２：３１１−３１６）。別の実施例では、エンドグルカナーゼは、Ｅ．クリサンセミを由来とし、ｃｅｌＹ遺伝子にコードされたエンドグルカナーゼＥＧＹである （Ｇｕｉｓｅｐｐｉ ｅｔ ａｌ．， （１９９１） Ｇｅｎｅ １０６：１０９−１１４）。Ｅ．クリサンセミ ＥＧＹ及び ＥＧＺは、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）を分解する上で活性の高いエンドグルカナーゼであり、それぞれタイプＩＶ及びタイプＩＩ分泌グループに属する （Ｈｕｅｃｋ ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｍｉｃｒｏ ａｎｄ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｒｅｖ ６２：３７９−４３３）。ＥＧＹ及びＥＧＺは基質範囲が異なり、ＣＭＣ及び非晶質セルロースの加水分解に際しては相乗的に機能するため、セルラーゼ活性を至適に働かせるには両方の酵素が必要である可能性があることが分かる。具体的には、ＥＧＺはセロトリオース、セロテトラオース、セロペンタオース、非晶質セルロース、及びＣＭＣを加水分解する。ＥＧＹは重合体型の基質を加水分解して約１０個のグルコシル残基から成る生成物にする。
【０１０９】
別の実施例では、当該エンドグルカナーゼ（例えばＥＧＹ及びＥＧＺなど）を別々に精製し、オリゴ糖基質の相乗的分解が起きるのに充分な比で配合するが、これはここに開示した検定を用いて決定してもよい。これらの検定により、エンドグルカナーゼなどの二種のグルカナーゼ間の比を決定及び至適化することができる。典型的には、この比は、約９対１乃至約１９対１の間である。ある実施例では、この比を、ＥＧＺ対ＥＧＹが約９対１又は１９対１になるようにしてもよい。ある好適な実施例では、Ｅ．クリサンセミや、ｃｅｌＹ及びｃｅｌＺを発現するＫ．オキシトカ組換え株であるＳＺ２１が生産するのと同様に、ＥＧＺ対ＥＧＹが高い比のときに、至適な相乗効果が観察される（実施例４を参照されたい）。
【０１１０】
さらに別の実施例では、当該のエンドグルカナーゼ群を、オリゴ糖基質に同時に配合することができる。さらに別の実施例では、当該のエンドグルカナーゼ群を、オリゴ糖基質に順番に加えることができる。ある好適な実施例では、ＥＧＹを加え、ＥＧＹ活性を熱失活させた後にＥＧＺを基質に加える。実施例３では、多様な比のエンドグルカナーゼ（例えばＥＧＹ及びＥＧＺ）の相乗効果、エンドグルカナーゼ（例えばＥＧＹ及びＥＧＺ）を順に加えたときの相乗効果（表１２を参照されたい）、及び、多様な基質濃度（表１１を参照されたい）及びインキュベーション時間が、エンドグルカナーゼの相乗的活性に及ぼす影響、を詳細に解説する。
【０１１１】
さらに別の実施例では、オリゴ糖の相乗的分解は、約１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、又は２．０の因数で起き、より好ましい因数は約１．８である。この相乗因数は、観察された分解を、ＥＧＹ単独及びＥＧＺ単独のときの予測寄与度の合計で除算して計算する（Ｒｉｅｄｅｌ， ｅｔ ａｌ． （１９９７） ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｌｅｔｔ． １４７：２３９−２４３）。ある実施例では、当該エンドグルカナーゼ群はＥＧＹ及びＥＧＺである。ＥＧＹ単独のときの予測寄与度は、総活性の約１０％であり、ＥＧＺ単独のときの予測寄与度は、総活性の約９０％である。
【０１１２】
本発明の別の態様では、エンドグルカナーゼ群の少なくとも一方を、細胞抽出物から得る。この細胞を、少なくとも一種のエンドグルカナーゼを生産するよう、組換え操作してもよい。ある好適な実施例では、当該細胞を、二種のエンドグルカナーゼ（例えばＥＧＹ及びＥＧＺ）を生産するように組換え操作する。例えば、当該細胞は細菌細胞であってもよい。当該組換え細胞は、一つ又はそれ以上の異種サロゲート・プロモータの転写制御下で一種又は複数のポリペプチドをコードする、少なくとも一つの異種ポリヌクレオチドセグメント、又は好ましくは二つ又はそれ以上の異種ポリヌクレオチドセグメントを含んで成る。この異種ポリヌクレオチド及びサロゲート・プロモータは、（実施例で説明するように）プラスミドを基にしてもよく、又は、当該生物のゲノムに組み込ませてもよい。ある好適な実施例では、当該ホスト細胞を、複合糖のエタノールへの生物変換又はその一段階で用いる所望のポリペプチドの源として用いる。別の好適な実施例では、当該異種ポリヌクレオチドセグメントは、そのホストで天然に起きるよりも高いレベルで発現する一種又はそれ以上のエンドグルカナーゼ（例えばＥＧＹ又はＥＧＺ）をコードしている。一実施例では、当該エンドグルカナーゼ群を、異なる組換え細胞から別々に精製した後、基質（オリゴ糖など）を相乗的に分解するように配合する。別の実施例では、一個の組換えホスト細胞が、二種又はそれ以上のエンドグルカナーゼを同時に生産でき、基質を分解するのに相乗的に作用することができる。
【０１１３】
本発明の別の態様では、本組換え細菌ホスト細胞は、例えばＭ５Ａ１のエタノール生産性類縁体である、Ｋ．オキシトカＰ２などのエタノール生産性細菌である（Ｗｏｏｄ， ｅｔ ａｌ． （１９９２） Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ５８：２１０３−２１１０）。ある実施例では、本組換えエタノール生産性細菌は、少なくとも一種のエンドグルカナーゼ（例えばＥＧＹ又はＥＧＺ）をコードする少なくとも一つの異種ポリヌクレオチドセグメント（例えばエルウィニア由来のｃｅｌＹ又はｃｅｌＺ）を含有する。ある好適な実施例では、本組換えエタノール生産性細菌は、エンドグルカナーゼをコードする二つ以上の異種ポリヌクレオチドセグメントを含有する。例えば、実施例４で詳述するように、 オリゴ糖基質（結晶質セルロースなど）からエタノールを生産するよう、ｃｅｌＹ 及びｃｅｌＺ を機能的に一体化し、エタノール生産性株Ｋ．オキシトカＰ２に同時に発現及び分泌させることができる。
【０１１４】
別の実施例では、本組換えホストはグラム陰性細菌である。さらに別の実施例では、本組換えホストは、エンテロバクテリアセエ科のものである。例えば、言及をもってここに編入する米国特許第５，８２１，０９３号のエタノール生産性ホストが適したホストであり、具体的にはＥ． コリ株ＫＯ４ （ＡＴＣＣ ５５１２３）、ＫＯ１１ （ＡＴＣＣ ５５１２４）、及びＫＯ１２ （ＡＴＣＣ ５５１２５）、及びクレブシエラ−オキシトカ株Ｐ２ （ＡＴＣＣ ５５３０７）がこれに含まれる。あるいは、ジモモナス−モビリスなどの効率的なエタノール生産生物のエタノール生産遺伝子などを導入することにより、本発明の非エタノール生産性ホストをエタノール生産性ホスト（例えば上に言及した株など）に変換してもよい。標準的な技術を用いてこの種類の遺伝子操作を行うと、効率的に糖を発酵させてエタノールにすることのできる組換えホストが得られる。加えて、ＬＹ０１エタノール耐性株を公開済みのＰＣＴ国際出願ＷＯ ９８／４５４２５が解説するように利用してもよく、この公開済み出願を、言及をもってここに編入することとする（さらに例えばＹｏｍａｎｏ ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｊ． ｏｆ Ｉｎｄ． Ｍｉｃｒｏ． ＆ Ｂｉｏ． ２０：１３２−１３８も参照されたい）。
【０１１５】
別の好適な実施例では、本発明は、例えば Ｅ． コリ株Ｂ、Ｅ． コリ株ＤＨ５α、又はクレブシエラ−オキシトカ株Ｍ５Ａ１などの非エタノール生産性組換えホストを利用する。これらの株を、ここに解説する技術を用いて、エンドグルカナーゼなどの所望のポリペプチドを少なくとも一つ、発現させるのに利用できよう。さらに、これらの組換えホストを、異なるエンドグルカナーゼなど、さらに別の好ましいポリペプチドを発現する別の組換えホストと、併用してもよい。例えば、相乗効果を生じるよう、ＥＧＺを生産する組換えホストと、ＥＧＹを生産する組換えホストとを組み合わせることができる。また、一つ又は複数の非エタノール生産性ホスト細胞をエタノール生産性ホスト細胞と併用してもよい。例えば、複合糖を相乗的に脱重合させるためなどに一つ又は複数の非エタノール生産性ホストを用いた後に、脱重合後の糖を発酵させるためにエタノール生産性ホストを利用してもよい。従って、非エタノール生産性及びエタノール生産性組換えホストの同種又は混合培養株などを用いると、これらの反応を順に行わせたり、又は、同時に行わせることができることは理解されよう。
【０１１６】
ある好適な実施例では、糖基質を発酵させてエタノールにするための一つ又はそれ以上の遺伝子を、プラスミド上に提供するか、又は、ホスト染色体に組み込む。より好ましくは、糖基質を発酵させてエタノールにする、例えばピルビン酸デカルボキシラーゼ（例えばｐｄｃ）及び／又はアルコール脱水素酵素（例えばａｄｈ）などの遺伝子を、本発明のホストに、言及をもってここに編入することとする米国特許第５，８２１，０９３号が解説するようなＰＥＴオペロンなどの人工オペロンを用いて導入するとよい。実際、本発明を当業の知見と組み合わせると、複数の遺伝子を適したホストに導入するための技術及びベクタが想到されることは、理解されよう（例えば、言及をもってここに編入するＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ｅｄｓ． Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ （１９９２）， Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ． ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ． ２ｎｄ， ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ （１９８９）， ａｎｄ Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ， Ｋｒｅｉｇ ｅｔ ａｌ．， Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ （１９８４）を参照されたい）。
【０１１７】
従って、本発明の方法を用いれば、単一の遺伝子コンストラクトに、同時糖化発酵（ＳＳＦ）を行うのに必要な遺伝子産物（例えばグルカナーゼ、エンドグルカナーゼ、エキソグルカナーゼ、一種又は複数の分泌たんぱく、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、アルコール脱水素酵素）をすべてコードさせることができる。例えば、実施例４では、エタノール生産性Ｋ．オキシトカの生産する細菌性セルラーゼＥＧＹ及びＥＧＺに、市販のセルラーゼ（スペザイム^（Ｒ））を加えたものによる結晶質セルロース（シグマセル５０）の同時糖化発酵（ＳＳＦ）を詳述する。エタノール生産性Ｋ．オキシトカの生産するエンドグルカナーゼと、市販のセルラーゼ（スペザイム^（Ｒ））とは相乗的に働いて、結晶質セルロース（シグマセル５０）からのエタノール生産を（７％から２２％に）増加させる。ＥＧＹの活性はＥＧＺに比較して低いという事実に関わらず、この有利な作用はほとんどがＥＧＹ活性によるものである。ＥＧＹを発現するエタノール生産性Ｋ．オキシトカ株ＳＺ２２の活性は、ＥＧＹ及びＥＧＺ活性の両者を発現するエタノール生産性Ｋ．オキシトカ株ＳＺ２１の活性にほぼ同等であった。ＥＧＺしか発現しないＫ．オキシトカ株ＳＺ６は、１リットル当たり２０，０００単位を越えるエンドグルカナーゼ活性を生じても、ほとんど利点は示さなかった。
【０１１８】
一実施例では、オリゴ糖を分解するのに相乗的に働く二種のエンドグルカナーゼから成る組成物に、少なくとも一つの付加的な酵素活性がさらに含まれる。この付加的な活性は、エンドグルカナーゼ、エキソグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、β−グルコシダーゼ、エンド−１，４−β−キシラナーゼ、α−キシロシダーゼ、α−グルクロニダーゼ、α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ、アセチルエステラーゼ、アセチルキシランエステラーゼ、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、プルラナーゼ、β−グルカナーゼ、ヘミセルラーゼ、アラビノシダーゼ、マンナナーゼ、ペクチンヒドロラーゼ、ペクチン酸リアーゼ、又はこれらの組合せ、からなる群より選択されるグルカナーゼ活性であってよい。別の実施例では、この付加的な酵素活性は、Ｔ．ロンギブランキアタムなどの真菌を由来とするものでもよい。Ｔ．ロンギブランキアタムなどの真菌は、複数のエンドグルカナーゼ活性を生産するが、これらのエンドグルカナーゼ活性は、結晶質セルロースの加水分解に際してエキソグルカナーゼと一緒に働くと予測されている （Ｎｉｄｅｔｚｋｙ， ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｅｌｌｕｌａｓｅｓ ｆｒｏｍ Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ ｄｕｒｉｎｇ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｐ．９０−１１２． Ｉｎ Ｊ． Ｎ． Ｓａｄｄｌｅｒ ａｎｄ Ｍ． Ｅ． Ｈｉｍｍｅｌ （ｅｄ．）． Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｓｏｌｕｂｌｅ ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓ ＡＣＳ ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｓｅｒｉｅｓ ６１８， Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， Ｄ．Ｃ．； Ｔｏｍｍｅ， ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ａｄｖ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． ３７：１−８１； Ｗｏｏｄｗａｒｄ， Ｊ． （１９９１） Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｔｅｃｈｎｏｌ． ３６：６７−７５）。
【０１１９】
ＥＧＺとは対照的に、ＥＧＹは可溶性のセロビオシドは加水分解しないが、鎖がより長く延びた基質には優先的に作用して、エキソグルカナーゼ活性の新しい部位とすることのできる末端にする。真菌セルラーゼの添加がないときは、ＥＧＹ及びＥＧＺは非晶質セルロースを分解するのに相乗的に働く。自然界では、真菌及び細菌が共働して生み出す細胞外酵素の混合物により、リグノセルロース様の基質が脱重合されている。このように、Ｅ．クリサンセミ酵素と、真菌Ｔ．リーセイ（Ｔ． ｒｅｅｓｅｉ） の酵素の混合物は、エタノールへの生物変換中のリグノセルロース様基質の消化を促進することができる。
【０１２０】
さらに、導入した遺伝子の安定性、発現、機能、及び分泌に干渉しそうな一つ又は複数の内因性遺伝子（例えばリコンビナーゼ遺伝子）に変異が起きるよう、当業で公知の方法を用いて組換えホストをさらに操作してもよいことは、理解されよう。また、ここに解説したものに充分相同なあらゆる調節配列、遺伝子、又は遺伝子産物、即ちポリペプチド、も、本発明に包含されるものと意図されていることも、理解されよう。
【０１２１】
オリゴ糖を効果的に分解させるには、グルカナーゼ（例えばＥＧＹ又はＥＧＺ）を細胞外ミリューに分泌させることが好ましい。従って、本発明の別の実施例では、細胞からの所望のポリペプチドの輸出を促進する一種又は複数の分泌たんぱくを発現するよう、本ホスト細胞に操作を加えておく。ある実施例では、前記一種又は複数の分泌たんぱくは、エンテロバクテリアセエ科の細胞など、グラム陰性細菌細胞を由来とする。別の実施例では、前記の一種又は複数の分泌たんぱくはエルウィニアを由来とし、ｏｕｔ遺伝子にコードされている。別の実施例では、前記の複数の分泌たんぱくはクレブシエラ由来のｐｕｌ遺伝子である。ホスト細胞が細胞壁を有するグラム陰性細菌などの腸内細菌である場合、一種又は複数のこれらの分泌たんぱくを導入することが特に好ましい。本発明のグラム陰性ホスト細胞の例は、エンテロバクテリアセエ科のものであり、例えばエシェリヒア及びクレブシエラがこれに含まれる。ある実施例では、ホストに一種又は複数の分泌たんぱくを導入した結果、天然での分泌レベルに比較して、グルカナーゼなどの所定のタンパク質の分泌が増加する。好ましくは、この分泌の増加は、天然での分泌レベルに比較して、少なくとも約１０％、そしてより好ましくは１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、１０００％、又はそれ以上であるとよい。ある好適な実施例では、分泌遺伝子の追加により、グルカナーゼポリペプチドをより高レベルで生産させることができる。ある好適な実施例では、分泌遺伝子の追加により、酵素活性のより高いグルカナーゼポリペプチドを生産させることができる。最も好適な実施例では、グルカナーゼは、より高レベルで、かつより高い酵素活性を持って、生産される。好ましくは、少なくとも約１０％、より好ましくは約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は １００％のグルカナーゼ活性の上昇が見られるとよい。最も好ましくは、分泌遺伝子のない細胞（例えば分泌遺伝子がないか、又は、分泌遺伝子を充分なレベルで発現しない細胞など）に比較して、例えば約２００％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、又は１０００％など、グルカナーゼ活性の数倍への上昇が得られるとよい。このような遺伝子を導入し、グルカナーゼなどの所望のポリペプチドの増加した産出を測定する技術及び方法を、実施例でさらに詳述することとする。他の同等な方法は、当業者に公知である。
【０１２２】
ＥＧＹ及びＥＧＺは異なる機序で分泌される。実施例４で説明するように、Ｅ．クリサンセミｏｕｔ遺伝子をプラスミド（ｐＣＰＰ２００６）に載せて加えた場合、生産されるＥＧＺの約７０％が細胞外産物として分泌され、タイプＩＩ分泌系（Ｈｕｅｃｋ， Ｃ．Ｊ． （１９９８） Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． Ｒｅｖ． ６２：３７９−４３３）に合致した。ＥＧＹ活性の半分は、ｏｕｔ遺伝子の存在下又は不在下で分泌し、タイプＩＶ分泌系（上記のＨｕｅｃｋ， Ｃ．Ｊ． ）と合致した。
【０１２３】
遺伝子（エンドグルカナーゼをコードする例えばｃｅｌＹ及びｃｅｌＺなどの遺伝子や、アルコール脱水素酵素遺伝子）が導入された株をスクリーニングする方法は慣例であり、アルコール脱水素酵素（ＡＤＨ）又はグルカナーゼ（例えばＥＧＺ又はＥＧＹ）遺伝子産物のいずれかを発現している細胞を同定できる視覚的スクリーンがあれば容易に行えよう。ＡＤＨ遺伝子産物の生ずるアセトアルデヒドは、ｐ−ロセアニリンのロイコスルホン酸誘導体と反応して赤みの強い生成物を生ずる。従って、ＡＤＨ陽性クローンは、血のように赤いコロニーとして容易にスクリーニング及び同定できる。ポリサッカラーゼ活性（例えばＥＧＺ又はＥＧＹなどのエンドグルカナーゼなど）をスクリーニングする方法でも、以下及び実施例で説明するように、明確な視覚的表現型が生じる。
【０１２４】
二種のエンドグルカナーゼ間の相乗作用をスクリーニングする方法は、実施例で詳述することとする。ＥＧＹ及びＥＧＺは、ｃｅｌＹ 遺伝子又は ｃｅｌＺ 遺伝子を含有するプラスミドで形質転換した組換えホスト細胞から、別々に精製することができる。その無細胞培養ブロスを用いれば、細胞外エンドグルカナーゼ活性を調べられる。総活性を調べるには、超音波破砕した細胞を含有するブロスを利用できる。セロオリゴ糖の加水分解は、薄層クロマトグラフィで解析できる。さらに、ＣＭＣを基質として用いた場合のエンドグルカナーゼ活性は、還元糖について試料を解析すれば、インビトロで調べることができる。還元糖は、グルコースを標準とし、３，５−ジニトロサリチル酸試薬を用いれば測定することができる。相乗効果は、観察された活性を、ＥＧＹ単独のとき（１０％）及びＥＧＺ単独のとき（９０％）に予想される寄与度の合計で除算したものとして、計算する。
【０１２５】
あるいは、組換えホスト細胞を、両方のエンドグルカナーゼを含有するプラスミドで形質転換して、両方のエンドグルカナーゼを同時に生産させることもできる。相乗効果は、上述のように調べられる。同時糖化発酵（ＳＳＦ）を行って、ある基質からのエタノール生産を（実施例４で解説するように）観察することもできる。市販のセルラーゼを加えたＳＳＦ実験では、少なくとも一種のＥ．クリサンセミエンドグルカナーゼを含有するＫ．オキシトカ組換え株のうちの二つが、Ｅ．クリサンセミエンドグルカナーゼを欠く親Ｋ．オキシトカ株よりも多くのエタノールを生産した。これらの株の両者とも、追加の市販セルラーゼの量の約３分の１ （組換え酵母で、５００ ＦＰＵ／セルロース１グラム対に対し１８ ＦＰＵ／セルロース１グラム）を用いた最も結果の良かった酵母ＳＳＦ実験（Ｃｈｏ， ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｊ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ９：３４０−３４５） と同等のエタノールレベルを生産した。
【０１２６】
ＰＥＴオペロンなどを発現する組換え細菌は、生成する発酵生成物が酸性よりも中性に近いために、未改変の親生物よりも、より高い細胞密度まで液体培地中で成長することが多い （Ｉｎｇｒａｍ ｅｔ ａｌ．， （１９８８） Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ５４：３９７−４０４）。プレート上では、エタノール生産性のクローンは、酵母に大変似た、大きな盛り上がったコロニーとして目に大変明かである。これらの形質は、新しい株構築の際には大変便利であり、新しい構築物の実用性の予備的指標とすることができる。また、アルデヒド指示プレート上で赤い斑点が形成される速度を調べれば、エタノール生産能を迅速に評価することができる（Ｃｏｎｗａｙ ｅｔ ａｌ．， （１９８７） Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １６９：２５９１−２５９７）。典型的には、糖のエタノールへの転化を効率的に行える株は、移してから数分以内に、赤い斑点がアルデヒド指示プレート上に生ずることで、認識できる。
【０１２７】
本発明の最も好適な実施例では、単一のホスト細胞がエタノール生産性のものであり、即ち、天然のもの又は人工的に導入された又は（例えばサロゲート・プロモータ、及び／又は、異なる種又は株を由来とする遺伝子を用いるなどして）改良されたものに関係なく、必要な遺伝子をすべて有している。その結果、このホスト細胞は、二種のグルカナーゼ、好ましくはエンドグルカナーゼ、より好ましくは、複合糖を分解し、分解された糖を発酵させてエタノールにするのに充分な少なくとも二種のエンドグルカナーゼ、を生産及び分泌する能力を有する。従って、このようなホストは同時糖化発酵に適切である。
【０１２８】
さらに、本発明は、天然Ｅ．コリ発酵経路により酸性及び中性の生成物の混合物（豊富度の順に：乳酸、水素＋二酸化炭素（ギ酸塩から）、酢酸、エタノール及びコハク酸塩、が生成することを考慮に入れている。しかしながら、Ｚ．モビリスＰＤＣ（ピルビン酸デカルボキシラーゼ）の有するピルビン酸に対するＫｍは、競合するＥ．コリ酵素のどれよりも低い。より活性の高いＰＤＣを発現させることで、炭素の流れを効果的に乳酸及びアセチル−ＣｏＡからアセチルアルデヒド及びエタノールに方向修正することができる。少量のコハク酸塩は、フマル酸レダクターゼ遺伝子（ｆｒｄ）を欠失させれば、消失させることができる（Ｉｎｇｒａｍ ｅｔ ａｌ．， （１９９１） 米国特許第５，０００，０００号； Ｏｈｔａ ｅｔ ａｌ．， （ｌ９９１） Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ５７：８９３−９００）。他にも変異（例えばｐｆｌ 又はｌｄｈ 遺伝子など）を作って、他の競合する経路を完全に消失させてもよい （Ｉｎｇｒａｍ ｅｔ ａｌ．， （１９９１） 米国特許第５，０００，０００号）。導入される遺伝子（プラスミドを基にした、又は、ゲノムに組み込まれるもの、のいずれでも）の安定性を損ないそうな酵素（例えばｒｅｃＡなどのリコンビナーゼなど）を除く更なる変異も導入しても、選択を行っても、又は、特定のバックグラウンドから選び出してもよい。
【０１２９】
加えて、当業者であれば、ある一個のタンパク質、又は、代謝経路全体をコードする遺伝子を、単一の操作可能な構築物に変換できるという、本発明が提供する能力は、大変有用であることは、明白であろう。この意味では、例えば、異なる遺伝子座にある複数の遺伝子を一本の染色体上に配置するという多様な場合に、本発明を応用することが想到される。これは、単一のプロモータの制御下にある多シストロン・カセットであってもよいが、あるいは、別々のプロモータを利用してもよい。
【０１３０】
エタノール生産性であり、本発明の方法に基づいて更なる改良を行うのに適しているＥ．コリ株の例には、例えばＫＯ４、ＫＯ１１、及びＫＯ１２ 株や、Ｅ．コリ株ＫＯ１１のエタノール耐性変異株であるＬＹ０１株がある。理想的には、これらの株は、環境ストレスに耐え、エタノール生産性にしてポリサッカラーゼを一種又は複数分泌するように操作できるＥ．コリ株ＡＴＣＣ １１３０３を由来とするとよい。加えて、近年のＰＣＲ調査で、ＡＴＣＣ １１３０３株は、Ｅ．コリの病原性に関係することが既知の遺伝子をすべて欠いていることが確認された（Ｋｕｈｎｅｒｔ ｅｔ ａｌ．， （１９９７） Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ６３：７０３−７０９）。
【０１３１】
本発明の方法で改良するのに好適なもう一つのエタノール生産性ホストは、数多くの異なるリグノセルロース様物質及び他の基質から出るヘミセルロース加水分解産物を発酵させることのできるＥ． コリＫＯ１１株である（Ａｓｇｈａｒｉ ｅｔ ａｌ．， （１９９６） Ｊ． Ｉｎｄ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． １６：４２−４７； Ｂａｒｂｏｓａ ｅｔ ａｌ．， （１９９２） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ２８：２７９−２８２； Ｂｅａｌｌ ｅｔ ａｌ．， （１９９１） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｅｎｇ． ３８：２９６−３０３； Ｂｅａｌｌ ｅｔ ａｌ．， （１９９２） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｌｅｔｔ． １４：８５７−８６２； Ｈａｈｎ−Ｈａｇｅｒｄａｌ ｅｔ ａｌ．， （１９９４） Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ４１：６２−７２； Ｍｏｎｉｒｕｚｚａｍａｎ ｅｔ ａｌ．， （１９９６） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｌｅｔｔ． １８：９５５−９９０； Ｍｏｎｉｒｕｚｚａｍａｎ ｅｔ ａｌ．， （１９９８） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｌｅｔｔ． ２０：９４３−９４７； Ｇｒｏｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， （１９９４） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｌｅｔｔ． １６：２８１−２８６； Ｇｕｉｍａｒａｅｓ ｅｔ ａｌ．， （１９９２） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｅｎｇ． ４０：４１−４５； Ｇｕｉｍａｒａｅｓ ｅｔ ａｌ．， （１９９２） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｌｅｔｔ． １４：４１５−４２０； Ｍｏｎｉｒｕｚｚａｍａｎ ｅｔ ａｌ．， （１９９７） Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １７９：１８８０−１８８６）。図１で、この株の生物変換の動態を示す。具体的には、この株は、（５８．５ ｇ／Ｌ のペントース糖及び３７ ｇ／Ｌのヘキソース糖を含有した）コメ外皮から出るヘミセルロース加水分解産物を急速に発酵させてエタノールにすることができる（Ｍｏｎｉｒｕｚｚａｍａｎ ｅｔ ａｌ．， （１９９８） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｌｅｔｔ． ２０：９４３−９４７）。この株は、４８乃至７２時間で、そして理想条件下では２４時間以内で、ヘミセルロース加水分解産物の発酵を完了させることができたことが注目された。
【０１３２】
本発明で好適なもう一つのホスト細胞は、細菌クレブシエラである。具体的には、クレブシエラ−オキシトカが好適である。なぜなら、Ｅ．コリと同様、この腸内細菌は、より複雑な糖の構成要素である単量体の糖を代謝する天然の能力を有するからである。さらに、Ｋ． オキシトカは、セルロースの酵素加水分解から出る可溶性の中間生成物であるセロビオース及びセロトリオースを輸送及び代謝できるという、付加的な利点も有する （Ｌａｉ ｅｔ ａｌ．， （１９９６） Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ６３：３５５−３６３； Ｍｏｎｉｒｕｚｚａｍａｎ ｅｔ ａｌ．， （１９９７） Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ６３：４６３３−４６３７； Ｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ．， （１９９２） Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ５８：２１０３−２１１０）。本発明は、Ｋ．オキシトカの遺伝子操作されたエタノール生産性類縁体、例えば（ここで解説し、また米国特許第５，８２１，０９３号； Ｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ．， （１９９２） Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ５８：２１０３−２１１０にも解説された）Ｚ．モビリスｐｄｃ及びａｄｈＢ遺伝子をＰＥＴオペロン内にコードして有する株Ｍ５Ａ１ を提供する。
【０１３３】
従って、その結果得られる生物、株Ｐ２は、単量体の糖や、ラフィノース、スタキロース、スクロース、セロビオース、セロトリオース、キシロビオース、キシロトリオース、マルトース、等々を含む多種の糖から、エタノールを効率的に生産する （Ｂｕｒｃｈｈａｒｄｔ ｅｔ ａｌ．， （１９９２） Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ５８：１１２８−１１３３； Ｍｏｎｉｒｕｚｚａｍａｎ ｅｔ ａｌ．， （１９９７） Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ６３：４６３３−４６３７； Ｍｏｎｉｒｕｚｚａｍａｎ ｅｔ ａｌ．， （１９９７） Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １７９：１８８０−１８８６； Ｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ．， （１９９２） Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ５８：２１０３−２１１０）。これらの株を、本発明の方法に基づいてさらに改変して、一種又はそれ以上のポリサッカラーゼ（例えばエンドグルカナーゼ）を発現及び分泌するようにしてもよい。従って、この株は、ＳＳＦ法で複合糖を生物変換する際に使用するのに適切である （Ｄｏｒａｎ ｅｔ ａｌ．， （１９９３） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｐｒｏｇｒｅｓｓ． ９：５３３−５３８； Ｄｏｒａｎ ｅｔ ａｌ．， （１９９４） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｅｎｇ． ４４：２４０−２４７； Ｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ．， （１９９２） Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ５８：２１０３−２１１０）。具体的には、このエタノール生産性Ｐ２株を使用すると、市販の真菌セルラーゼの最も不安定な構成成分の一つである補助的なセロビアーゼを加える必要がなくなる（Ｇｒｏｈｍａｎｎ， （１９９４） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｌｅｔｔ． １６：２８１−２８６）。
【０１３４】
異種遺伝子発現で利用するのに適したプロモータのスクリーニング
ある実施例では、本発明のサロゲート・プロモータは、ポリサッカラーゼ（例えばエンドグルカナーゼ）などの異種の遺伝子の発現を向上させるために、用いられる。しかし、本発明により、何らかの所望の遺伝子産物の発現を向上させるのに適したサロゲート・プロモータをスクリーニングすることもできることは、理解されよう。概略的には、本スクリーニング法は、実施例１で解説し、図３で示したクローニング・ベクターを利用することで、あるレポータ・遺伝子に候補プロモータ断片を適宜連結し、作用的に連鎖させることができる。ある実施例では、グルカナーゼをコードするｃｅｌＺ遺伝子は便利なレポータ遺伝子として役立てることもできる。なぜなら、このプラスミドを持つ細胞を特定の培地（ＣＭＣプレート）で成長させると、この酵素（グルカナーゼ）が発現することで、強力な比色変化が起きるからである。従って、特定のプロモータ配列などの候補プロモータや、又は、その代わりに、「ショットガン」法でクローンし、ベクタに作用的に連鎖させることのできる無作為の配列を、ホスト細胞に導入し、生ずるコロニーを、遺伝子発現の増加を有するかどうかについて、ＣＭＣプレート上のグルカナーゼが媒介する比色変化という表現型を証拠として、視覚的にスキャンすることができる。次に、所望の表現型を有するコロニーを処理して形質転換ＤＮＡを取り出し、そのプロモータを、適切なプライマを用いて配列決定する（詳細は実施例１を参照されたい）。
【０１３５】
グルカナーゼが媒介するＣＭＣプレート上の比色変化と、酵素の発現レベルとの間に高い対応関係があれば、ある候補プロモータの強度の優れた指標となる（図４）。よって、本発明の方法は、候補サロゲート・プロモータの強度を格付けする高速視覚テストを提供するものである。従って、この検定を用いれば、ある特定の遺伝子産物に必要な所望の発現レベルに応じて、同定された特定のサロゲート・プロモータを選択することができる。例えば、単に最も高い発現レベルを欲しいのであれば、最も大きな比色変化を起こす候補プロモータを選択すればよい。例えば、目的の産物が高レベルでは毒性であるか、又は、別の産物と同等のレベルで発現させねばならないなどのために、発現レベルを低くしたいのであれば、解説するように、より弱いサロゲート・プロモータを同定し、選択し、用いることができる。
【０１３６】
プラスミドｐＬＯＩ２３１１は、ｃｅｌＹコーディング領域をｌａｃプロモータの制御下に含有し、そしてｐＬＯＩ２３１６ は、エンドグルカナーゼ指示プレートで調べたときに、ｌａｃプロモータからｃｅｌＹを発現する方向を向いたクローンとして同定された。天然プロモータをｌａｃプロモータに置換すると、このプラスミドを持つ組換えＥ．コリによるｃｅｌＹ発現が増加した。加えて、異種遺伝子をエタノール生産性Ｋ．オキシトカＰ２株などの産業用の株で発現させることに伴う問題を抑えるために、機能検定を用いてＺ．モビリスＤＮＡのランダム断片から、非調節性プロモータを単離した。この方法で、Ｚ．モビリスＳａｕ３Ａ１断片を異種として含有するプラスミド（ｐＬＯＩ２３２３）を構築した（実施例４及び図１３及び１４を参照されたい）。加えて、高レベルのＥＧＺが、プラスミドｐＬＯＩ１６２０を持つＥ．コリにより生産された。これらプラスミドの作成や、異種プロモータの選択に関する詳細については、実施例３及び４を参照されたい。
【０１３７】
実施例４では、 サロゲート・プロモータを持つｃｅｌＹ、ｃｅｌＺ組み込みベクタ （ｐＬＯＩ２３５２） の作成を解説する（図１５を参照されたい）。このプラスミドの安定性を確認するために、ハイブリッド遺伝子をその染色体に組み込み、作成で用いた抗生物質耐性マーカーを、ＦＬＰリコンビナーゼ系を利用して削除（Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ｍｏｒａｌｅｓ， ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １８１：７１４３−７１４８） して、その後の遺伝子改変を容易にできるようにした。
【０１３８】
ＩＩＩ．利用の方法
複合糖の分解又は脱重合
ある実施例では、本発明のホスト細胞を、リグノセルロース又はオリゴ糖などの複合糖を、より小型の糖部分に分解又は脱重合させるのに用いる。これを行うためには、本発明のホスト細胞は、ＥＧＹ及びＥＧＺなどのエンドグルカナーゼなど、一種又は複数のポリサッカラーゼを発現すると好ましいが、これらのポリサッカラーゼは、その生産生物が天然で放出するものでもよい。あるいは、これらポリサッカラーゼは、細胞を物理的に破壊することで、生産細胞から放出させる。細胞を機械的（例えばせん断、音波破砕）、酵素的（例えばリゾチーム）、又は化学的に破壊する多様な方法が当業で公知であり、これらの方法のいずれを利用してもよい。所望のポリペプチドを内側の細胞空間から放出させたら、それを用いて複合糖基質を、後にエタノールに生物変換させるべく、より小型の糖部分に分解することができる。放出されたポリサッカラーゼを、当業で公知の標準的な生化学的技術を用いて精製してもよい。あるいは、放出させたポリサッカラーゼを、必ずしも精製したり、又は、他の細胞成分から単離する必要なく、糖基質に直接利用することもできる。
【０１３９】
従って、一種又はそれ以上のポリサッカラーゼをその活性で選択でき、複合糖を分解するのに至適化された活性、好ましくは相乗的な活性、を有する組成物を調合できることは、当業者であれば理解されよう。当該組成物は、複合糖を至適に分解するような比で一種又はそれ以上のエンドグルカナーゼと混合された、未精製の、半精製済み、又は精製済みのエンドグルカナーゼ活性の形など、であってもよい。あるいは、各酵素活性は、複合糖の至適な分解を達成するために、使用上の注意、即ち、好適な順序及び／又は比で混合又は利用する際の注意、と一緒に別々に調合されていてもよい。
【０１４０】
別の実施例では、一種又はそれ以上のポリサッカラーゼ及び一種又は複数の分泌たんぱくが共発現することで、そのポリサッカラーゼが成長培地中に分泌されるようなホスト細胞を利用する。こうすると、ポリサッカラーゼをホスト細胞から放出させなければならないという上記のステップがなくなる。この種類のホストを利用する場合、ホストを、オリゴ糖を含有する水溶液中で直接利用してもよい。
【０１４１】
別の実施例では、本発明のホスト細胞を、二種以上のポリサッカラーゼを発現するよう設計するか、又は、異なるポリサッカラーゼを発現する別のホストと、オリゴ糖の相乗的な分解を起こすのに充分な比で、混合する。例えば、ある一つのホスト細胞に異種エンドグルカナーゼ（例えばＥＧＹ）を発現させ、別のホスト細胞に、別のエンドグルカナーゼ（例えばＥＧＺ）を発現させ、これらの細胞を組み合わせて、オリゴ糖の分解において相乗的な活性を有する異種培養物を形成してもよいであろう。あるいは、ある好適な実施例では、単一のホスト株を操作して、上記のポリサッカラーゼのすべてを生産するようにする。いずれの場合でも、オリゴ糖に利用する所望のポリサッカラーゼの発現の高い、一種又は複数の組換えホストの培養物を得る。必要に応じ、真菌セルラーゼなどの外因性のセルラーゼなど、更なるセルラーゼにこれらの混合物を組み合わせることもできる。こうして、この混合物を複合基質の分解に用いる。あるいは、複合糖基質を加える前に、これら一種又は複数のポリサッカラーゼを細胞及び／又は培地から、標準的な生化学技術を用いて精製し、糖基質を脱重合する純粋な酵素源として用いる。
【０１４２】
本発明のエタノール生産性細菌株は、（例えば酸素がないなどの）嫌気条件下でも、タンパク質の（ジスルフィド結合形成が適当に起きないことが原因などの）間違った折り畳みを起こす機会が少ないため、組換えたんぱくを生成するのに優れたホストであることは、当業者であれば理解されよう。従って、本発明のホスト及び培養条件を用いれば、生物学的に活性な生成物の回収量が大きくなるであろう。
【０１４３】
複合糖の発酵
本発明のある好適な実施例では、上記の属性を有するホスト細胞は、エタノール生産性でもある。従って、このようなホスト細胞を、複合糖を単糖へ相乗的に分解又は脱重合させるのに利用できる。その後、この細胞は、簡単になった糖をエタノールへ、発酵により異化することができる。複合糖がより小型の糖残基へ脱重合し、その後発酵するというこの同時のプロセスは、同時糖化発酵（ＳＳＦ）と呼ばれている。
【０１４４】
典型的には、発酵条件は、生産生物であるホスト細胞株の最良の成長動態を促進し、培養物が生産する酵素にとっての触媒条件にとって至適なｐＨ及び温度を提供するような条件を選択する（Ｄｏｒａｎ ｅｔ ａｌ．， （１９９３） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｐｒｏｇｒｅｓｓ． ９：５３３−５３８）。例えば、Ｐ２株などのクレブシエラの場合、至適な条件は、３５乃至３７℃、そしてｐＨは５．０乃至ｐＨ５．４であることが決定されている。これらの条件下では、外因的に加えられた真菌エンドグルカナーゼ及びエキソグルカナーゼでも非常に安定であり、長時間機能し続ける。他の条件は実施例で解説されている。さらに、当業者であれば、本発明の発酵反応を至適に行わせるには、当業で公知の技術を用いたごく慣例的な実験が必要なだけであることは、理解されよう。
【０１４５】
現在、リグノセルロースなどの複合糖の転化は、大変込み入った複数の段階を伴う工程である。例えばリグノセルロースはまず酸加水分解を用いて分解又は脱重合しなければならない。次に、固形物から液体を分離するステップが続き、その後これらの生成物を洗浄及び解毒して、（セルラーゼを加えて）更なる脱重合の可能なセルロースにし、最終的には適したエタノール生産性ホスト細胞で発酵させる。対照的に、とうもろこしの発酵では、アミラーゼを用いてとうもろこしでんぷんを分解すれば、基本的に一段階のプロセスで、エタノール生産性ホストによりすぐに生物変換させられるという点で、はるかに簡単である。
【０１４６】
従って、本発明の組換えホスト及び方法により、リグノセルロースを発酵させるのに、同じように簡単、かつ、より効率的なプロセスの利用が可能となることは、当業者であれば理解されよう。例えば、本発明の方法は、酸加水分解を完全に避けた方法を包含することを意図している。さらに、本発明のホストは以下の長所：１）ペントース及びヘキソースの同時発酵という効率性；２）毒素に対する耐性；３）複合糖の脱重合のための酵素の生産；及び４）耐環境性、を有する。従って、リグノセルロースを脱重合する上での複雑さは、本発明の優れた生体触媒を利用すれば簡便化することができる。実際、本発明のある好適な実施例では、当該反応を、一個の反応容器内で、しかも酸加水分解のない状態で、ＳＳＦ法などとして行わせることができる。
【０１４７】
エタノールへ生物変換させる基質の候補
本発明の利点の一つは、これまであまり資化されてこなかった糖源を利用できることである。その結果、数多くの複合糖基質を、本発明のホスト細胞及び方法を用いた脱重合及びその後の発酵のための開始材料として用いることができよう。理想的には、リサイクル可能な資源をこのＳＳＦ法で用いるとよい。混合廃棄事務用紙は好適な基質であり（Ｂｒｏｏｋｓ ｅｔ ａｌ．， （１９９５） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｐｒｏｇｒｅｓｓ． １１：６１９−６２５； Ｉｎｇｒａｍ ｅｔ ａｌ．， （１９９５） 米国特許第５，４２４，２０２号）、酸で予備処理したバガス （Ｄｏｒａｎ ｅｔ ａｌ．， （１９９４） Ｂｉｏｔｅｃｈ． Ｂｉｏｅｎｇ． ４４：２４０−２４７）又は高度に精製された結晶質セルロース（Ｄｏｒａｎ ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｐｒｏｇｒｅｓｓ． ９：５３３−５３８）よりもずっと簡単に消化される。エンドグルカナーゼ及びエキソグルカナーゼの両方とも、グルカナーゼはセルロース結合ドメインを含有するため、遠心分離によって未消化のセルロース残渣を回収すれば、その後の発酵に向けてこれらの酵素を容易にリサイクルできる （Ｂｒｏｏｋｓ ｅｔ ａｌ．， （１９９５） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｐｒｏｇｒｅｓｓ． １１：６１９−６２５）。酵素を結合させた状態で有するこの残渣を出発物として加えることにより、（単位基質当たりの）エタノール収量は、理論収量の８０％を越えるところまで増加し、と同時に真菌の酵素利用率は６０％減少した（図２）。リグニン含有率の高い基質ではリサイクル回数が限られるであろうが、このような方法は精製セルロースでは成功する。本発明の範囲内にある他の基質源には、例えば芝生の切りくず、外皮、穂軸、茎、葉、繊維、パルプ、大麻、のこぎりくず、新聞紙、等々など、あらゆる種類の処理済み又は未処理の植物材料がある。
【０１４８】
さらに本発明の実例を以下の実施例により挙げるが、以下の実施例を限定的なものと捉えてはならない。
【０１４９】
実施例１
オリゴ糖をエタノールに発酵させるのに適した組換えエシェリヒアホストの作製法
この実施例では、オリゴ糖をエタノールに発酵させるのに適したエシェリヒアホストを開発し利用する方法を解説する。具体的には、ポリサッカラーゼ（例えばグルカナーゼ）の発現を増加させるのに利用可能な強力なプロモータを特定する。加えて、エルウィニア−クリサンセミ（Ｅｒｗｉｎｉａ ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ ）由来の遺伝子を用いて、ポリサッカラーゼの分泌を促し、それにより、所望のポリサッカラーゼ活性を放出させるのに細胞を破壊する必要を無くす。
【０１５０】
この実施例を通じて、特に他に明示しない場合は、以下の材料及び方法を用いる。
【０１５１】
材料及び方法
生物及び培養条件
【０１５２】
この実施例で用いた細菌株及びプラスミドを下の表１に挙げる。
【０１５３】
プラスミド作製には、ホスト細胞Ｅ．コリＤＨ５α を用いた。ポリサッカラーゼ（例えばグルカナーゼ）をコードする、利用した遺伝子は、具体的にはエルウィニア−クリサンセミ Ｐ８６０２１ 由来のｃｅｌＺ遺伝子であった（Ｂｅａｌｌ， （１９９５） Ｐｈ．Ｄ． Ｄｉｓｓｅｒｔａｔｉｏｎ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｆｌｏｒｉｄａ； Ｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ．， （１９９７） Ｂｉｏｔｅｃｈ． Ｂｉｏｅｎｇ． ５５：５４７−５５５）。分泌を向上させるのに利用した遺伝子は、具体的にはＥ．クリサンセミＥＣ１６由来のｏｕｔ遺伝子であった （Ｈｅ ｅｔ ａｌ．， （１９９１） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ． ８８：１０７９−１０８３）。
【０１５４】
典型的には、ホスト細胞培養株を、ルリア−ベルタニブロス（ＬＢ）（１０ ｇ Ｌ^−１ ディフコ^（Ｒ）トリプトン、５ ｇ Ｌ^−１ディフコ^（Ｒ）酵母抽出物、 ５ ｇ Ｌ^−１ 塩化ナトリウム）又はルリア寒天 （１５ ｇ Ｌ^−１の寒天を補ったＬＢ）中で成長させた。グルカナーゼｃｅｌＺ活性（ＥＧＺ）を有するホスト細胞をスクリーニングするためには、ＣＭＣ−プレート（カルボキシメチルセルロース（３ ｇ Ｌ^−１）を含有するルリア寒天プレート）を用いた（Ｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ．， （１９８８） Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １６０：８７−１１２）。適切な場合は、抗生物質アンピシリン（５０ ｍｇ Ｌ^−１）、スペクチノマイシン（１００ ｇ Ｌ^−１）、カナマイシン（５０ ｇ Ｌ^−１） を培地に加えて、耐性マーカを含有する組換え体又は組み込み体のホスト細胞を選択した。温度条件的ｐＳＣ１０１レプリコン（Ｐｏｓｆａｉ ｅｔ ａｌ．， （１９９７） Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １７９：４４２６−４４２８）を持つプラスミドを含有する作製物を３０℃で成長させ、特に他に明示しない場合は、ｐＵＣを基にしたプラスミドを持つ作製物を３７℃で成長させた。
【０１５５】
【表１】

【０１５６】
遺伝子法
標準的方法を全てのプラスミド作製に用いた（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， （１９８７） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．； Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， （１９８９） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ： ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ　ｅｄ． Ｃ．Ｓ．Ｈ．Ｌ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ）。小規模プラスミド単離を行うためには、ＴＥＬＴ法を行った。大規模プラスミド単離を行うためには、プロメガ^（Ｒ）ウィザード・キットを用いた。ゲルからＤＮＡ断片を単離するには、キアゲン^（Ｒ）社のキアクイック^（Ｒ）ゲル・エクストラクション・キットを用いた。染色体ＤＮＡをＥ．コリ及びＺ．モビリスから単離するには、カッティング及びヨマノ氏の方法を用いた（Ｃｕｔｔｉｎｇ ｅｔ ａｌ．， （１９９０）， Ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ， ｐｐ． ６１−７４， Ｉｎ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｂａｃｉｌｌｕｓ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．； Ｙｏｍａｎｏ ｅｔ ａｌ．， （１９９３） Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １７５：３９２６−３９３３。
【０１５７】
ここに解説した二つの糖分解遺伝子プロモータ（例えば ｇａｐ及びｅｎｏ）を単離するために、Ｅ．コリＤＨ５α由来の精製染色体ＤＮＡをテンプレートとして用い、以下のプライマ対： ｇａｐプロモータ、５’−ＣＧＡＡＴＴＣＣＴＧＣＣＧＡＡＧＴＴＴＡＴＴＡＧＣＣＡ−３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３）及び５’−ＡＡＧＧＡＴＣＣＴＴＣＣＡＣＣＡＧＣＴＡＴＴＴＧＴＴＡＧＴＧＡ−３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４）； ｅｎｏ プロモータ、 ５’−ＡＧＡＡＴＴＣＴＧＣＣＡＧＴＴＧＧＴＴＧＡＣＧＡＴＡＧ−３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５） 及び５’−ＣＡＧＧＡＴＣＣＣＣＴＣＡＡＧＴＣＡＣＴＡＧＴＴＡＡＡＣＴＧ−３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６）を用いてこれらの核酸をＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）増幅した。Ｅ．クリサンセミ（ｐＣＰＰ２００６）由来の、分泌タンパク質をコードするｏｕｔ遺伝子をＥ．コリに、可動化のためにｐＲＫ２０１３を用いて接合した（Ｆｉｇｕｒｓｋｉ ｅｔ ａｌ．， （１９７９） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ． ７６： １６４８−１６５２； Ｍｕｒａｔａ ｅｔ ａｌ．， （１９９０） Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １７２：２９７０−２９７８）。
【０１５８】
目的の様々なＤＮＡの配列を決定するために、蛍光プライマを用いたジデオキシ配列決定法をＬＩ−ＣＯＲモデル４０００−ＬＤＮＡシーケンサで行った。ｐＳＴ７６−Ｋを基にしたプラスミドはＴ７プライマ（５’−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ−３’　（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ７））を用いて一方向で配列決定した。ｐＵＣ１８ 及び ｐＵＣＩ９を基にしたプラスミドは、正方向プライマ （５’−ＣＡＣＧＡＣＧＴＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣ−３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８））又は逆方向プライマ（５’ＴＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧＧＡ−３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ９））のいずれかを用いて二方向で配列決定した。この配列決定法の伸長反応は、パーキン・エルマＧｅｎｅＡｍｐ^（Ｒ）ＰＣＲ ９６００及びＳｅｑｕｉＴｈｅｒｍ ロング−リード・シーケンシング・キット−ＬＣ^（Ｒ）を用いて行った。次に、得られた配列をウィスコンシン・ジェネティック・コンピュータ・グループ（ＧＣＧ） ソフトウェアパッケージを用いて解析した （Ｄｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ．， （１９８４） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｖ． １２：３８７−３９５）。
【０１５９】
上記のプロモータ内の転写開始点を調べるために、標準的な技術を用いてプライマ伸長解析を行った。具体的には、キアゲン社のＲＮｅａｓｙ^（Ｒ）キットを用い、対数期後期にある細胞から単離したｃｅｌＺ遺伝子ＲＮＡに一致のあるプライマを用いて転写開始部位をマッピングすることで、プロモータ領域を特定した。簡単に説明すると、０．２Ｍのスクロースを含有する、リゾチーム（４００μｇ／ｍｌ）の ＴＥ （Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ＥＤＴＡ）溶液で細胞を処理し、２５℃で５分間インキュベートしてから溶解させた。放出されたＲＮＡをエタノール沈殿させ、次に２０μｌのプロメガ^（Ｒ）ＡＭＶ逆転写酵素緩衝液 （５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ ８．３， ５０ ｍＭ ＫＣｌ、１０ ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．５ ｍＭ スペルマジン、１０ ｍＭ ＤＴＴ）に溶解させた。次に、ＬＩ−Ｃｏｒ社のＩＲＤ４１−で標識したプライマ（５’ＧＡＣＴＧＧＡＴＧＧＴＴＡＴＣＣＧＡＡＴＡＡＧＡＧＡＧＡＧＧ−３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １０））を加え、この試料を８０℃で５分間、変性させ、５５℃で１時間アニールさせてから、アルコール沈殿により精製した。アニールした試料を、５００ ｍＭのｄＮＴＰ及び１０ 単位のＡＭＶ逆転写酵素を含有する１９μｌのＡＭＶ逆転写酵素緩衝液に溶解させ、インキュベートして伸長させた（４２℃で１時間）。生成物を０．５ μｇ／ｍｌのＤＮａｓｅフリーＲＮａｓｅ Ａで処理し、沈殿させ、添加液に溶解させ、ＬＩ−ＣＯＲモデル ４０００−Ｌ ＤＮＡシーケンサを用いて得たパラレルジデオキシプロモータの配列に比較した。
【０１６０】
ポリサッカラーゼ活性
ｃｅｌＺ遺伝子の発現の結果生じたポリサッカラーゼ活性（例えばグルカナーゼ活性）の量を調べるために、コンゴ・レッド法を用いた（Ｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ．， （１９８８） Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １６０：８７−１１２）。具体的には、選択されたクローンを格子状ＣＭＣプレートに移し、１８時間、３０℃でインキュベートした後、染色すると、グルカナーゼを発現している組換えホスト細胞は赤いバックグラウンド上に黄色の領域を形成した。従って、これらの比色領域の直径を、ｃｅｌＺ発現の相対的測定値として記録した。
【０１６１】
さらに、カルボキシメチルセルロースを基質として用いて、グルカナーゼ活性（ＥＧＺ）を測定した。この検査では、無細胞培養ブロス（細胞外活性）、又は、超音波で処理した細胞を含有するブロス（総活性）、の適した希釈液を、カルボキシメチルセルロース（２０ｇＬ^−１）を含有する５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ５．２）中で３５℃で検定した。３から４ｍｌの試料について至適酵素放出を起こさせる条件は、細胞破砕機（ニューヨーク州プレインビュー、ヒート・システム−ウルトラソニックス社製モデルＷ−２２０Ｆ）を用いると１秒ごとに全出力で４回のパルスであると、決定された。この検定の酵素反応を停止させるために、試料を沸騰水の水槽中で１０分間、加熱した。グルコースを標準として、グルカナーゼにより酵素的に遊離した還元糖をジニトロサリチル酸試薬で測定した（Ｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ．， （１９８８） Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １６０：８７−１１２）。酵素活性量（ＩＵ）を、１分間当たりに遊離した還元糖のμモル数か、又は、二回以上の検査値の平均から採った総活性のパーセンテージとして表した。
【０１６２】
超微細構造解析
様々な組換えホスト細胞の超微細構造を調べるために、ルリア寒天プレートの新鮮なコロニを２％のグルタルアルデヒドを加えた０．２Ｍのカコジル酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７）内に固定し、１％の四酸化オスミウム中で、続いて１％の酢酸ウラニルの蒸留水溶液中で、インキュベートして、分析用に調製した。試料をエタノールで脱水し、スパーズ（Ｓｐｕｒｒ’ｓ）プラスチック内に包埋し、超薄切片を調製し、ツァイス^（Ｒ）ＥＭ−ＩＯＣＡ電子顕微鏡 （Ｓｐｕｒ （１９６９） Ｊ． Ｕｌｔｒａｓｔｒｕｃｔ． Ｒｅｓ． ２６：３１）を用いて調べた。
【０１６３】
ｃｅｌＺをレポータ遺伝子として用いた、低コピー数のプロモータ・プローブ・ベクタの作製
強力なプロモータの単離を容易に行うために、ｐＳＣ１０１レプリコンと、プロモータのないｃｅｌＺ遺伝子の直前に来たＢａｍＨＩ部位とを持つ低コピー数のベクタを作製した（ｐＬＯ１２１７１）。従って、このプロモータのないプラスミドを陰性対照として用いた。プラスミドｐＬＯＩ１６２０をｃｅｌＺの源として用いたが、これは連続したｌａｃ及びｃｅｌｚプロモータから発現するｐＵＣ１８類縁体である。このプラスミドのＢａｍＨＩ部位を消化及びクレノウ処理で抹消した（ｐＬＯＩ２１６４）。クレノウ処理後、ｃｅｌＺ遺伝子を、プロモータのないＮｄｅＩ断片として単離した。その結果生じた平滑末端断片をＨｉｎｄＩＩＩで消化して下流のＤＮＡを除去し、ｐＵＣ１９（ＨｉｎｄＩＩＩからＨｉｎｃＩＩまで）に連結して、ｐＬＯＩ２１７０を作製した。このプラスミドでは、ｃｅｌＺはｌａｃＺの転写方向とは反対方向に向かっており、ごく僅かに発現した。次に、ｃｅｌＺを含有するｐＬＯＩ２１７０のＢａｍＨＩ（アミノ末端）−ＳｐｈＩ（カルボキシル末端）断片を、温度感受性レプリコンを持つ低コピー数のベクタであるｐＳＴ７６−Ｋの対応する部位にクローンして、ｐＬＯＩ２１７１（図３）を作製した。このベクタでのｃｅｌＺの発現は非常に低かったため、強力なプロモータである候補を探す便利なプローブとして、これを利用することができる。
【０１６４】
二つのＥ．コリ糖分解プロモータ（ｇａｐ及びｅｎｏ）からのｃｅｌＺ発現の分析
Ｅ．コリで糖分解遺伝子を働かせるプロモータの二つの例（ｇａｐ及びｅｎｏ）を、グルカナーゼをコードする異種のｃｅｌＺ遺伝子の発現を開始させる上でのそれらの能力について調べた。Ｅ．コリＤＨ５α株の染色体ＤＮＡをテンプレートとして用いて、ｇａｐ及びｅｎｏプロモータ領域をポリメラーゼ連鎖反応で増幅した。生成したそれぞれ約４００ｂｐの断片をＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで消化し、ｐＬＯＩ２１７１のプロモータのないｃｅｌＺ遺伝子の前の対応する部位にクローンして、ｐＬＯＩ２１７４（ｇａｐプロモータ）及び ｐＬＯＩ２１７５ （ｅｎｏプロモータ）を作製した。コントロールとして、完全なｃｅｌＺ遺伝子及び天然Ｅ．クリサンセミのプロモータを含有するｐＬＯＩ２１６４から採ったＥｃｏＲＩ−ＳｐｈＩ断片をｐＳＴ７６−Ｋの対応する部位にクローンして、ｐＬＯＩ２１７３を作製した。これら三つのプラスミドをＥ．コリ株Ｂ及びＤＨ５α内に導入して、グルカナーゼ活性（ＥＧＺ）を比較した。Ｅ．コリの両方の株で、グルカナーゼ活性は、Ｅ．コリの糖分解プロモータを持つＣＭＣプレートの方が、天然Ｅ．クリサンセミプロモータを含有するｐＬＯＩ２１７３のプレートよりも低かった（表２）。活性が各領域の半径の二乗に関係すると想定すると（フィックの拡散の法則）、糖分解プロモータ（ｐＬＯＩ２１７４ 及びｐＬＯＩ２１７５）によるＥＧＺ生成は、天然プロモータ作製物（ｐＬＯＩ２３７３）でよりも３３％から６５％低いと推定された。従って、高レベルのｃｅｌＺ遺伝子発現を働かせる他の候補プロモータを調べた。
【０１６５】
異種の遺伝子発現のプロモータとして用いるのに適したランダムＤＮＡ断片を特定及びクローンする
Ｚ．モビリス由来のランダム断片は、Ｅ．コリ内で異種遺伝子を高レベルで発現させるサロゲート・プロモータの効果的な供給源かも知れない（Ｃｏｎｗａｙ ｅｔ ａｌ．， （１９８７） Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １６９：２３２７−２３３５； Ｉｎｇｒａｍ ｅｔ ａｌ．， （１９８８） Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏ． ５４：３９７−４０４）。従って、エルウィニアのｃｅｌＺ発現のためのサロゲート・プロモータを特定するために、Ｚ．モビリス染色体ＤＮＡをＳａｕ３ＡＩでよく消化し、生成した断片をｐＬＯＩ２１７１にＢａｍＨＩ部位で連結して、Ｅ．コリＤＨ５α内に導入して、可能性ある候補プロモータのライブラリを作製した。ｃｅｌＺ遺伝子発現をＥ．コリ内で起こさせることのできる、より優れた候補プロモータを迅速に特定するために、以下の生物学的スクリーンを利用した。様々なランダム候補プロモータを有するｃｅｌＺプラスミドで形質転換させたコロニを、格子状ＣＭＣプレートに移し、インキュベート後、グルカナーゼ活性について染色した（表２）。テストした１８，０００のクローンのうち約２０％が、ＣＭＣ陽性であった。対照であるｐＬＯＩ２１７３よりも大きな領域を生じた７５のクローンを、さらに別の株、Ｅ．コリＢを用いて調べた。
【０１６６】
【表２】

【０１６７】
^ａ　活性の範囲を示したクローンの数
^ｂ三つのＣＭＣ消化領域の直径の平均の大きさ
^ｃ　Ｒ^２ _ｘは、テストプラスミドのある浄化領域の半径の二乗である：Ｒ^２ _ｃは、対照（ｐＬＯＩ２１７３）の浄化領域の半径の二乗である。
【０１６８】
このように、選択された候補プロモータのプロモータとしての強さは、二つの異なる株で確認され、大まかに言うと、株Ｂの組換え体よりも大きな領域（例えばグルカナーゼがより多いなど）をＤＨ５αの組換え体は生じた。しかしながら、各ホストでの相対的なプロモータの強さは、大半のクローンについて同様であった。ＣＭＣプレートを用いて領域の大きさで測定したグルカナーゼ生産に関するこれらの分析に基づくと、四つのクローンが、元のＥ．クリサンセミｃｅｌＺ遺伝子を持つ作製物（ｐＬＯＩ２１７３）よりも約６倍高いレベル、そしてＥ．コリ糖分解プロモータのいずれよりも１０倍高いレベルで、ｃｅｌＺを発現すると思われた。従って、これらの、及び、同様に強い候補プロモータを更なる研究対象に選んだ。
【０１６９】
グルカナーゼの生産及び分泌
ｐＳＴ７６−Ｋの八つのプラスミド類縁体（ｐＬＯＩ２１７７ からｐＬＯＩ２１８４まで）を上記のスクリーン（グループＩ及びグループＩＩ（表２）を参照されたい）から選択し、Ｅ．コリ株Ｂ内での総グルカナーゼ活性について検定した（表３）。ＣＭＣプレート上で最も大きな領域を形成した四つのプラスミドは、グルカナーゼ活性も最も高いことも確認した（ （ｐＬＯＩ２１７７、ｐＬＯＩ２１８０、ｐＬＯＩ２１８２、及びｐＬＯＩ２１８３）。これらの活性は、未改変のｃｅｌＺ （ｐＬＯＩ２１７３）のそれよりも約６倍高く、ＣＭＣプレート上での浄化領域の半径の二乗に基づいた我々の予測と大変一致していた。図４は、分泌タンパク質をコードするｏｕｔ遺伝子を加えた、又は、加えない状態で行った、様々な別々のプロモータを含有する株Ｂについて調べた、ＣＭＣプレートで予測した活性とインビトロ酵素検定の比較を示す。いくばくかの散らばりはあるが、直接的な関係がはっきりと分かり、相対的活性を予測するこのプレート法の有効性を裏付けている。高コピー数のプラスミドであるｐＵＣ１８を用いた最初の作製物も、比較のために含めた（ｐＬＯＩ２１６４）。ｌａｃ及びｃｅｌＺプロモータを連続して有するこの作製物が生じたＥＧＺ活性は、サロゲート・プロモータを持つ三つの低コピー数のプラスミド（ｐＬＯＩ２１７７、ｐＬＯＩ２１８２、及びｐＬＯＩ２１８３）よりも低かった。このように、ｃｅｌＺによるグルカナーゼ発現をさらに増加させるために、ｃｅｌＺと、最も効果的なサロゲート・プロモータとを含有するＤＮＡ断片を（ＥｃｏＲＩ−ＳｐｈＩ断片として）ｐＬＯＩ２１８３ から単離し、ｌａｃプロモータとは反対の転写方向でｐＵＣｌ９ に挿入した（ｐＬＯＩ２３０７）。従って、上記の強力なサロゲート・プロモータを高コピー数のプラスミドに導入すると、グルカナーゼ活性がさらに２倍に増加した。
【０１７０】
グルカナーゼの分泌増加を操作する
上記の結果をさらに向上させてｃｅｌＺにコードされたグルカナーゼの発現を高めるべく、分泌が増加するように上記のホスト細胞を操作した。Ｅ．クリサンセミＥ１６を由来とする分泌タンパク質をコードする遺伝子（例えばｏｕｔ遺伝子）を用いて、ｏｕｔ遺伝子を含有するヒー氏らの説いたプラスミド（ｐＣＰＰ２００６）を用いてグルカナーゼの輸出を高めようとした （Ｈｅ ｅｔ ａｌ．， （１９９１） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ． ８８：１０７９−１０８３）。Ｅ．コリＢでのＥＧＺの分泌増加を調べたが、その結果を表３に示す。
【０１７１】
【表３】

【０１７２】
^ａ　プラスミドｐＬＯＩ２１７３ 及びｐＬＯＩ２１６４はｃｅｌＺ天然プロモータを含有する；ｐＬＯＩ２３０７ はｐＬＯＩ２１８３由来の強力なプロモータを含有する。
プラスミドｐＬＯＩ２１６４ 及びｐＬＯＩ２３０７はｐＵＣを基にしたプラスミド（高コピー数）である。その他のプラスミドはすべて、ｐＳＴ７６−Ｋの類縁体 （低コピー数）である。
^ｂ　グルカナーゼ活性は、３０℃で１６時間成長させた後に調べた。
^ｃ　細胞外活性（分泌又は放出されたもの）。
【０１７３】
低コピー数のプラスミドを持つ組換えホストは、（１６時間の成長後）、総ＥＧＺのうち、異種の分泌タンパク質（プラスミドｐＣＰＰ２００６がコードするｏｕｔタンパク質）を持たない僅かに７から１７％を細胞外に生成した。高コピー数のｐＵＣを基にしたプラスミドを持つホスト細胞の方が、同じプロモータを含有する低コピー数のｐＳＴ７６を基にしたプラスミドを持つものより、取り囲む細胞外ブロス中に、より大きな割合の（２０から２８％）ＥＧＺが見られた。しかしながら、いずれの場合でも、分泌タンパク質をコードする（例えばｐＣＰＰ２００６）ｏｕｔ遺伝子を加えると、発現の合計レベルが最大で２倍に増加し、また細胞外酵素の割合（３８から７４％）がほぼ４倍に増加した。最も高い活性は１３，０００ＩＵ／Ｌの総グルカナーゼであり、そのうちの７，８００ＩＵ／Ｌは無細胞上清に見られたが、この最も高い活性は、強力なサロゲート・プロモータで働くｃｅｌＺをコードするｐＬＯＩ２３０７と、ｏｕｔ分泌タンパク質をコードするｐＣＰＰ２００６の両方を有する株Ｂにより生成されたものだった。
【０１７４】
特定の条件（ｐＨ ７、３７℃）では、純粋なＥＧＺ酵素の特異的活性は ４１９ ＩＵであると報告されており （Ｐｙ ｅｔ ａｌ．， （１９９１） Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ４：３２５−３３３） 、これらの条件下で生成するＥＧＺは上記の条件より低い条件（ｐＨ ５．２ のクエン酸緩衝液、３５℃）下よりも２５％、活性が高いと判断されている。従って、ｐＨ ５．２（３５℃）のときの純粋な酵素の特異的活性を３１６ＩＵと想定すると、（例えばグルカナーゼ及び分泌タンパク質をコードするプラスミドなど、ｐＬＯＩ２３０７及びｐＣＰＰ２００６を含有する）Ｅ．コリＢの培養物は、１リットル当たり約４１ｍｇの活性ＥＧＺを生成し、即ち全ホスト細胞タンパク質の４から６％が活性グルカナーゼだったことになる。
【０１７５】
Ｚ．モビリスを由来とする最も強力なプロモータの配列解析
四つの最も強力なサロゲート・プロモータ（ｐＬＯＩ２１７７、ｐＬＯＩ２１８０、ｐＬＯＩ２１８２、及びｐＬＯＩ２１８３）の配列を決定した。このプロセスを簡単に行うために、それぞれをｐＵＣ１９にＰｓｔＩ 部位で接合した。その結果できるプラスミドｐＬＯＩ２１９６、ｐＬＯＩ２１９７、ｐＬＯＩ２１９８、及びｐＬＯＩ２１９９を高コピー数（ＣｏｌＥＩレプリコン）で生産させ、Ｍ１３及びＴ７ 配列決定プライマを用いて両方向で配列決定することができた。四つのプラスミドはすべて、Ｚ．モビリスの全く同じＤＮＡ断片を含有しており、同胞であった。それぞれは１４１７塩基対長であり、４つのインターナルＳａｕ３ＡＩ部位を含有していた。各断片のＤＮＡ配列及び翻訳後タンパク質の配列（６つの読み枠）を現在のデータベースに比較した。一個の断片（２８１塩基対のインターナル断片）のみが、ブラスト検索（ナショナル・センター・フォー・バイオテクノロジー・インフォメーション；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）で強い対合を示し、この断片は、Ｚ．モビリスｈｐｎＢ遺伝子のうちで、細胞エンベロープの生合成で働くと提案されている部分にＤＮＡ配列が９９％同一であった （Ｒｅｉｐｅｎ ｅｔ ａｌ．， （１９９５） Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １４１：１５５−１６１）。プライマ伸長解析の結果、一個の主要な開始部位が、ｃｅｌＺとのＳａｕ３ＡＩ／ＢａｍＨＩ 接合部位から６７塩基上流に見つかり、そして二番目のマイナーな開始部位がさらに上流に見つかった（図５）。−１０領域及び−３５領域の配列を、Ｅ．コリシグマ因子の保存配列に比較した（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， （１９８９） Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １８０：５６２６−５６３１； Ｗｉｓｅ ｅｔ ａｌ．， （１９９６） Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １７８：２７８５−２７９３）。この顕性プロモータ領域（全開始部位の約８５％）は、シグマ^７０プロモータと同様に思われるが、他方、二番目のプロモータ部位はシグマ^３８プロモータに似ている。
【０１７６】
グルカナーゼを生産する組換えホスト細胞の顕微鏡分析
光学顕微鏡では、組換え体と、親生物との間には、細胞形態ではほとんど違いが観察されなかった。しかし電子顕微鏡では、多量のグルカナーゼを発現している株Ｂ（ｐＬＯＩ２１６４）のペリプラスムに小型の極性封入体がはっきりと見え、これらの封入体は、ＥＧＺを含有していると予測された（図６）。活性が２倍高いグルカナーゼを生産した株Ｂ（ｐＬＯＩ２３０７）では、封入体はさらに大きく、全細胞体積の最大２０％を占めていた。これらの極体が大きいことは、グルカナーゼ活性の測定値は総ＥＧＺ生産を過小評価する可能性があることを示唆している。多くの場合、ペリプラスム間隙からのタンパク質分泌を増加させるｏｕｔ分泌タンパク質をコードする作製物も有するホスト細胞では、極性の封入体はより小型であった。予測通り、グルカナーゼを生産しない陰性コントロール株Ｂ（ｐＵＣ１９）ではペリプラスムの封入体は見られなかった。
【０１７７】
実施例２
オリゴ糖を発酵させてエタノールにするのに適した組換えクレブシエラホスト　この実施例では、オリゴ糖を脱重合及び発酵させてエタノールにする生体触媒として用いるのに適した組換えクレブシエラホストを解説する。
【０１７８】
他に特に明示する場合を除き、以下の材料及び方法を、本実施例全体で用いる。
【０１７９】
材料及び方法
細菌、プラスミド、及び培養条件
この実施例で用いた株及びプラスミドを、下の表４に要約する。
【０１８０】
【表４】

【０１８１】
Ｅ．コリ及びＫ．オキシトカＭ５Ａ１を培養するのに用いた培養条件は、典型的には、１リットル当たり１０ｇのディフコ^（Ｒ）トリプトン、５ｇの酵母抽出物、及び５ｇの塩化ナトリウムを含有するルリア−ベルタニブロス（ＬＢ）か、又は代替的に、ルリア寒天（１５ｇの寒天を補ったＬＢ）を用いるものであった （Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， （１９８９）， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃ．Ｓ．Ｈ．Ｌ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ．）。
【０１８２】
選択条件下で細菌コロニをスクリーニングするために、ＣＭＣプレート（３ｇＬ^−１のカルボキシメチルセルロースを含有するルリア寒天プレート）を用いて、所定の細菌株が発現したグルカナーゼ活性のレベルを調べた（Ｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ． （１９８８） Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， １６０：８７−１１２）。エタノール生産性株を培養するために、グルコースを固体培地（ ２０ ｇ Ｌ^−１） 及びブロス （５０ ｇ Ｌ^−１）に加えた。グルカナーゼ活性を調べるときには、成長培地中のグルコースを非還元糖であるソルビトール （５０ ｇ Ｌ ^−１）に置き換えた。電気穿孔法で核酸を導入する前の様々な株又は培養物を培養するには、改良ＳＯＣ培地を用いた（例えば２０ｇＬ^−１ディフコ（Ｒ）トリプトン、５ｇＬ^−１ディフコ^（Ｒ）酵母抽出物、１０ｍＭ ＮａＣｌ、 ２．５ ｍＭ ＫＣｌ、１０ ｍＭ ＭｇＳＯ_４、 １０ ｍＭ ＭｇＣｌ_２、及び５０ ｇＬ^−１グルコース）。抗生物質アンピシリン（５０ ｍｇ Ｌ^−１）、スペクチノマイシン（１００ ｍｇ Ｌ^−１）、カナマイシン（５０ ｍｇ Ｌ^−１）、テトラサイクリン（６ 又は１２ ｍｇ Ｌ^−１）、及びクロラムフェニコール（４０、２００、又は６００ ｍｇ Ｌ^−１） を、抗生物質耐性マーカを持つ組換えホストを選択するのに適当な場合に、加えた。他に特に明示しない限り、培養物は３７℃で成長させた。エタノール生産性株と、温度感受性ｐＳＣ１０１レプリコンを持つプラスミドを含有する株は、３０℃で成長させた。
【０１８３】
遺伝子法
プラスミド作製、クローニング及び形質転換のために、標準的方法とＥ．コリＤＨ５αホストを用いた （Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ． （１９８７） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ． Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．； Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， （１９８９） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃ．Ｓ．Ｈ．Ｌ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ．）。ｃｅｌｚ組み込み体ベクタであるｐＬＯＩ２３０６の作製は、図７に示すように行った。ｐＬＯＩ２３０６由来の、レプリコンを欠く環状ＤＮＡ断片（図７を参照されたい）をバイオ−ラド・ジーン・パルサを用い、以下の条件を用いて、エタノール生産性Ｋ．オキシトカＰ２に電気穿孔で入れた。即ち、この条件とは：３．８−４．０ミリ秒の測定された時定数で２．５ ｋＶ 及び２５μＦである （Ｃｏｍａｄｕｒａｎ ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｌｅｔｔ． ２０：４８９−４９３）。Ｅ．クリサンセミＥＣ １６分泌系（ｐＣＰＰ２００６）をＫ．オキシトカに、可動化のためにｐＲＫ２０１３を用いて接合した （Ｍｕｒａｔａ ｅｔ ａｌ． （１９９０） Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １７２：２９７０−２９７８）。小規模及び大規模なプラスミド単離をそれぞれＴＥＬＴ法及びプロメガ・ウィザード・キットを用いて行った。ＤＮＡ断片は、ゲルから、キアゲン^（Ｒ） （カリフォルニア州チャットワース、キアゲン社）のキアクイック^（Ｒ）ゲル・エクストラクション・キットを用いて単離した。Ｋ．オキシトカＭ５Ａ１及びＺ．モビリス ＣＰ４の染色体ＤＮＡはカッティング氏及びヨマノ氏らの説いたように単離した（実施例１を参照されたい）。目的のＤＮＡを、 ＬＩ−ＣＯＲ モデル ４０００−Ｌ ＤＮＡシーケンサを用いて配列決定した （Ｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｂｉｏｔｅｃｈ． Ｂｉｏｅｎｇ． ５５：５４７−５５５）。
【０１８４】
ｃｅｌＺの染色体組み込み
Ｅ．コリについて前に解説された手法を用いる温度条件的プラスミド（ｐＬＯＩ２１８３）を用いた選択法 （Ｈａｍｉｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， （１９８９） Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １７１：４６１７−４６２２）と、機能的レプリコンを持たない環状ＤＮＡ断片を直接組み込むという、二つの方法を用いて、ｃｅｌＺの染色体組み込みを行った。この同じ方法を、Ｅ．コリＢ（Ｏｈｔａ Ｋ ｅｔ ａｌ．， （１９９１） Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ５７：８９３−９００）及びＫ．オキシトカＭ５Ａ１ （Ｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ． （１９９２） Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ５８：２１０３−２１１０）へ、エタノール経路をコードするＺ．モビリス遺伝子を染色体組み込みする際にも利用した。典型的には、環状ＤＮＡを、Ｐ２に、バイオ−ラド・ジーン・パルサを用いた電気穿孔法により形質転換させた。次に、形質転換体を、テトラサイクリン （６ ｍｇ Ｌ^−１） を含有する固体培地上で選択し、ＣＭＣプレート上で成長させて、グルカナーゼ活性のレベルを調べた。
【０１８５】
グルカナーゼ活性
別々のテストプロモータの制御下でｃｅｌＺ遺伝子産物（即ちグルカナーゼ）が発現した結果生じたグルカナーゼ活性を、実施例１で説明したようにＣＭＣプレートを染色することで、評価した。この比色検定法により、グルカナーゼ活性の指標となる黄色の領域が生じ、この領域の直径を、ｃｅｌＺポリペプチド発現の相対的測定値として用いた。最も大きな黄色領域を生じたクローンを、さらに、カルボキシメチルセルロース（２０ ｇ Ｌ^−１ を５０ ｍＭ のクエン酸緩衝液に溶解させたもの、ｐＨ ５．２）を基質として用い、３５℃でグルカナーゼ活性について評価した （Ｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ． （１９８８） Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １６０： ８７−１１２）。細胞内グルカナーゼの量を測定するために、超音波（ニューヨーク州プレインビュー、ヒート・システム−ウルトラソニックス社製、モデルＷ−２９０Ｆ細胞破砕機）で４秒間処理して培養物から酵素活性を放出させた。発現したグルカナーゼ活性量を測定し、ここでは１分間当たりに遊離した還元糖のμモル数（ＩＵ）で表す。還元糖はウッド氏が説いたように（Ｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ． （１９８８） Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １６０： ８７−１１２） グルコース標準を用いて測定した。
【０１８６】
基質の脱重合
様々なホスト細胞が生じたグルカナーゼ活性の量をさらに調べるために、様々な糖質基質（２０ ｇ Ｌ^−１ を５０ ｍＭ のクエン酸緩衝液に溶解させたもの、ｐＨ ５．２）を様々な細胞抽出物と一緒にインキュベートした。実施例の一つでは、酸で膨潤させ、ボールミルしたセルロースを含んだテスト基質をウッド氏が説いた （Ｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ． （１９８８） Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １６０： ８７−１１２）ように調製した。典型的なポリサッカラーゼ抽出物（即ちＫ．オキシトカＳＺ６ （ｐＣＰＰ２００６）の生成したＥＧＺ（グルカナーゼ））を、ホスト細胞を３０℃で１６時間、非還元糖のソルビトールを補ったＬＢ中で培養することで、調製した。無細胞ブロスの希釈液を基質に加え、３５℃で１６時間、インキュベートした。インキュベーション中に外因性の混入物が成長するのを防ぐべく、数滴のクロロホルムを加えた。インキュベーション前及び後に試料を取り出して、還元糖をＤＮＳ法で測定した （Ｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ． （１９８８） Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １６０： ８７−１１２を参照されたい）。重合の程度（ＤＰ）は、重合体中に存在する合計の糖残基を、還元後の数で割ったもので推定した。
【０１８７】
発酵条件
発酵は、５０ｇＬ^−１の糖質を補った１００ｍｌのルリア・ブロスを入れた２５０ｍｌのフラスコ中で行わせた。テスト糖質は別々に滅菌後に冷却してから加えた。基質の変化を抑えるために、酸で膨潤させた、ボールミルしたセルロース及びキシランは、オートクレーブしなかった。抗生物質クロラムフェニコール（２００ｍｇＬ^−１）を加えて、混入生物の成長を防いだ。フラスコに２４時間ブロス培養物（５０ｇＬ^−１グルコース）を播種（１０％ｖ／ｖ）し、攪拌しながら（１００ｒｐｍ）３５℃で２４から９６時間、インキュベートした。培養物を観察するために、試料を毎日取り出して、ガスクロマトグラフィでエタノール濃度を調べた （Ｄｏｍｂｅｋ ｅｔ ａｌ． （１９８６） Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ５２：９７５−９８１）。
【０１８８】
サロゲート・プロモータを単離及び特定する方法
異種の遺伝子をクレブシエラ及びその他のホスト細胞で発現させるサロゲート・プロモータとして働くであろうＺ．モビリスのランダム断片を特定するために、候補プロモータの効率的なクローニングを行うためのベクタを実施例１で説明したように作製した（さらに Ｉｎｇｒａｍ ｅｔ ａｌ． （１９８８） Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ５４：３９７−４０４を参照されたい）。
【０１８９】
次に、Ｓａｕ３ＡＩで消化したＺ．モビリスＤＮＡ断片をｐＬＯＩ２１７１のＢａｍＨＩ部位に連結して、潜在的プロモータのライブラリを作製した。これらのプラスミドをＥ．コリＤＨ５αへ形質転換して最初のスクリーニングを行った。ＣＭＣプレートで個別に調べた１８，０００ 個のコロニのうち、７５個のクローンが、コントロール （ｐＬＯＩ２１７３）よりも大きな黄色の領域を生じた。次に、これら７５個のクローンのプラスミドをＫ．オキシトカＭ５Ａ１内に形質転換させ、再テストすると、この二番目のホストで高レベルのｃｅｌｚが発現していることが判明した。
【０１９０】
ポリサッカラーゼを生産する組換えクレブシエラホスト
ｃｅｌＺ発現の指標である最も大きな領域をＣＭＣプレート上で形成した発現度の高いクローン（ｐＬＯＩ２１７７ からｐＬＯＩ２１９４まで）をＬＢブロスで成長させ、グルカナーゼ活性について検定した（表５）。
【０１９１】
【表５】

【０１９２】
^ａ　ｐＬＯＩ２１７３は、元のプロモータと一緒にｃｅｌＺ遺伝子を含有する。他のものはすべて、サロゲート・プロモータとして働くＺ．モビリスＤＮＡ断片と一緒にｃｅｌＺ遺伝子を含有する。
^ｂ　グルカナーゼ（ＣＭＣアーゼ）活性は、３０℃で１６時間成長させた後に調べた。
【０１９３】
これらのプラスミドによる活性は、天然のｃｅｌＺプロモータを含有するコントロール・プラスミド（ｐＬＯＩ２１７３）によるものよりも最大で８倍高かった。最も大きな領域を生じた四つのプラスミド（ｐＬＯＩ２１７７、ｐＬＯＩ２１８０、ｐＬＯＩ２１８２及びｐＬＯＩ２１８３）もまた、最も高い総グルカナーゼ活性（約３０，０００ ＩＵ Ｌ^−１）を生じた。これらのプラスミドのうちの一つ、ｐＬＯＩ２１８３を、染色体組み込みに選んだ。
【０１９４】
ポリサッカラーゼ遺伝子の染色体組み込み
好ましいポリサッカラーゼ遺伝子を適したホスト細胞、例えばクレブシエラＰ２株など、に安定に取り込ませるために、複製機能を全て欠くが、ｃｅｌＺ遺伝子と一緒に、サロゲート・プロモータ、選択マーカ、及び 組込用の相同のＤＮＡ断片、を含有したＤＮＡ断片の単離を簡単にできるよう、新規なベクタ（ｐＬＯＩ２３０６）を作製した。ポリリンカ領域をフランクするクレノウ処理済みＮｄｅＩ 及びＳａｐＩ 部位内にリンカ （ＧＧＣＧＣＧＣＣ； ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １１）を挿入することで、二つのＡｓｃＩ部位をｐＵＣ１９に加えて、ｐＬＯＩ２３０２を作製した。 ｐＢＲ３２２由来のｔｅｔ耐性マーカ遺伝子を含有する平滑末端断片（ＥｃｏＲＩ及びＡｖａＩで切断した後、クレノウ処理を行ったもの）を、ｐＬＯＩ２３０２のＰｓｔＩ部位（ＰｓｔＩで切断後、クレノウ処理したもの）にクローンして、ｐＬＯＩ２３０３を作製した。このプラスミド、ｐＬＯＩ２３０３のＳｍａＩ部位に、Ｋ．オキシトカＭ５Ａ１染色体ＤＮＡの平滑断片（ＥｃｏＲＩで切断後、クレノウ処理で平滑末端にしたもの）を連結して（ｐＬＯＩ２３０５）を作製した。サロゲートＺ．モビリス・プロモータと、ｐＬＯＩ２１８３由来のｃｅｌＺ遺伝子とを含有するＥｃｏＲＩ − ＳｐｈＩ断片（クレノウ処理済み）を、ｐＬＯＩ２３０５のＥｃｏＲＩ部位（ＥｃｏＲＩ、クレノウ処理済み）に連結して、ｐＬＯＩ２３０６を作製した。ｐＬＯＩ２３０６をＡｓｃＩで消化して二つの断片を作製したが、その二つの大きい方はサロゲート・プロモータ付きのｃｅｌＺ遺伝子、ｔｅｔ遺伝子、及び相同組換え用の染色体ＤＮＡ断片を含有していた。この大きい方の断片（１０キロ塩基対）をアガロースゲル電気泳動法で精製し、自己連結させて環状にし、クレブシエラ株Ｐ２内に電気穿孔で入れた後、テトラサイクリン耐性について淘汰的な成長を行わせた。その結果得られた２１個のテトラサイクリン耐性コロニを精製し、ＣＭＣプレートでグルカナーゼ活性についてテストした。すべてが陽性で大型の領域を形成し、ｃｅｌＺ遺伝子産物が機能的に発現したことを示した。
【０１９５】
ＤＨ５αをプラスミドＤＮＡの標品で形質転換させ、ゲル電気泳動法を行って、組換え株を作製するのに用いたクローンに、不要なプラスミドが存在していないかを調べた。調べた１２個のクローンでは、形質転換体は得られなかった。しかしながら、その後これらの株のうち二つが、ｃｅｌＺを含有しているかも知れない大きなプラスミドの帯を含有することが判明したため、これらを廃棄した。大きなプラスミドを持った両方の株が含有していたＤＮＡを、Ｔ７及びＭ１３プライマで配列決定することができ、こうして複数コピーのプラスミドの存在が確認された。残りの１０個の株ではｃｅｌＺ遺伝子が組み込まれており、いずれのプライマでも配列決定できなかった。
【０１９６】
新規なベクタｐＬＯＩ２３０６の構造上の特徴を図８に概略的に示し、様々なコドン領域（即ち遺伝子ｃｅｌＺ、ｂｌａ、及びｔｅｔのコドン領域）を含めた、このベクタのヌクレオチド配列を、配列表のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １２に示す。ｃｅｌＺ遺伝子の下流にある（Ｅ．クリサンセミ由来の）非コドン配列であるヌクレオチド塩基対３２８２−４２８１と、Ｋ．オキシトカＭ５Ａ１由来の非コドン標的配列の一部である塩基対９４７６−１１５４４については、標準的技術（例えばＳａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ． ｅｔ ａｌ．， Ｔ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ． ２ｎｄ， ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ， （１９８９）； Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ｅｄｓ． Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ （１９９２）に説かれたものなど）による配列決定をまだ行っていない。例えば、これら既知の配列に対応する配列決定プライマを合成でき、この配列決定プライマを用いてｐＬＯＩ２３０６プラスミドをテンプレートとして用いた標準的な配列決定反応を行えるよう、ｐＬＯＩ２３０６プラスミドの上記の配列決定を行っていない領域のいずれかの側に来る充分なフランキング配列が開示されている。
【０１９７】
代替的には、当業者であれば、テンプレートとして用いるｐＬＯＩ２３０６プラスミドがない場合でも、これらの配列未決定の領域を調べられることは、理解されよう。例えば、ここに提供した配列（例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １２のヌクレオチド１４５２−２７３５ ）を利用すれば、残りのｃｅｌＺ配列を決定でき、こうしてＥ．クリサンセミ配列を含んで成るライブラリからｃｅｌＺ含有クローンを単離するためのプローブを合成したり、そしてこの単離されたクローンを標準的なＤＮＡ配列決定反応を用いて配列決定するためのプライマを合成することができる。同様に、ここに提供した配列（例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １２のヌクレオチド８４２６−９４７５ ）を利用すれば、残りの標的配列を決定でき、こうして（例えば適当な大きさの）Ｋ．オキシトカＭ５Ａ１ ＥｃｏＲＩ断片を含んで成るライブラリから、標的配列を含有するクローンを単離するためのプローブを合成したり、そしてその単離されたクローンを、標準的なＤＮＡ配列決定反応を用いて配列決定するためのプライマを合成することができる（Ｋ．オキシトカＭ５Ａ１の源は、例えば標準的な技術を用いてあらゆるプラスミドを取り除いた ＡＴＣＣ ６８５６４などであろう）。当業者であれば、さらに、細菌のｃＤＮＡ又はゲノム配列を表すライブラリの作製法や、このようなライブラリ（例えばｃＤＮＡライブラリ又はゲノムライブラリなど）からの所望の核酸断片の単離法は、当業で公知であることは理解されよう。また、典型的には例えばハイブリダイゼーション技術又はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて行われ、これらの技術はすべて、当業で標準的なものである（例えばＳａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ． ｅｔ ａｌ．， Ｔ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ． ２ｎｄ， ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ， （１９８９）； Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ｅｄｓ． Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ （１９９２）； Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ （Ｍ．Ｊ． Ｇａｉｔ， Ｅｄ． １９８４）； ａｎｄ ＰＣＲ Ｈａｎｄｂｏｏｋ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ｂｅａｕｃａｇｅ， Ｅｄ． Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ （１９９９） （編纂者）を参照されたい）。
【０１９８】
サロゲート・プロモータと、組み込まれた又はプラスミドを基にした作製物とを利用した異種遺伝子の発現
１０個の組み込まれた株（ＳＺ１−ＳＺ１０）を、ＬＢソルビトールブロス中でグルカナーゼ生産について調べた（表６）。すべてが、５，０００−７，０００ ＩＵＬ^−１の活性酵素を生産した。 これは天然ｃｅｌＺプロモータを含有するプラスミド ｐＬＯＩ２１７３が発現する活性の二倍であるが、これら組み込まれた株は、同じサロゲートＺ．モビリス・プロモータを含有するＰ２ （ｐＬＯＩ２１８３） が生じるグルカナーゼ活性の僅かに３分の１を生じた。組み込みで起きたグルカナーゼ発現の減少は、コピー数の減少に起因するかも知れない（即ち、複数コピーのプラスミド、対、単一の組み込まれたコピー）。
【０１９９】
グルカナーゼＥＧＺの分泌
Ｋ．オキシトカは、ペクチン酸リアーゼ及びグルカナーゼ（ＥＧＺ）を分泌するエルウィニア−クリサンセミのｏｕｔ遺伝子がコードする分泌系と類似の天然のタイプＩＩ分泌系をプルラナーゼ分泌（Ｐｕｇｓｌｅｙ （１９９３） Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｒｅｖ． ５７：５０−１０８）のために含有している （Ｂａｒｒａｓ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌ． ３２：２０１−２３４； Ｈｅ ｅｔ ａｌ． （１９９１） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ． ８８： １０７９− １０８３）。タイプＩＩ分泌系は、典型的には、特異性が大変高く、異種タンパク質ではあまり機能しない（Ｈｅ ｅｔ ａｌ． （１９９１） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ． ８８： １０７９− １０８３； Ｐｙ ｅｔ ａｌ． （１９９１） ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｌｅｔｔ． ７９：３１５−３２２； Ｓａｕｖｏｎｎｅｔ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｍｏｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ２２： １−７）。このように、予測通り、組換えｃｅｌＺはＭ５Ａ１ （表５） 又はＰ２ （表６）のどちらかをホストとして細胞に結び付いた産物として発現された。総組換え体ＥＧＺ活性のうちの約４分の１（１２から２６％）がブロス中で回収された。Ｅ．コリＤＨ５αでは、総細胞外ＥＧＺの約８から１２％が存在した。このように、Ｋ．オキシトカの天然の分泌系は組換え体ＥＧＺの部分的な分泌を促すかも知れない。
【０２００】
所望の産物の分泌をさらに向上させるために、Ｅ．クリサンセミＥＣ１６由来のタイプＩＩ分泌遺伝子（ｏｕｔ遺伝子）を、（例えばｐＣＰＰ２００６を用いて）導入して、株Ｐ８６０２１由来組換え体ＥＧＺのエタノール生産性Ｋ．オキシトカ株での分泌を促した（表５及び表６）。ｃｅｌＺを持つプラスミドを含有する大半の株で、ｏｕｔ遺伝子を加えた結果、細胞外ＥＧＺが５倍に増加し、総グルカナーゼ活性が２倍に増加した。ｃｅｌＺが組み込まれた株では、ｏｕｔ遺伝子を加えたことで、細胞外ＥＧＺが１０倍に増加し、総グルカナーゼ活性が４倍に増加した。いずれの場合でも、ｏｕｔ遺伝子により、総グルカナーゼ活性のほぼ半分の分泌が促された。ｏｕｔ遺伝子の追加で起きたＥＧＺ活性の増加は、プラスミド及び組み込まれたｃｅｌＺ作製物の両方で分泌生成物の折り畳みが向上したことを反映していると考えられよう。ｐＵＣを基にした類縁体で観察された増加は小さかったが、このことは、プラスミドの負荷と、この高コピー数のプラスミド上のｂｌａ遺伝子からのペリプラスムβ−ラクタマーゼの生産中に輸出機構をめぐって競合が起きたことが原因かも知れない。
【０２０１】
二つの基準を用いて、最も良好に組み込まれたＰ２株を特定し、高レベルのクロラムフェニコール（上流のｐｄｃ遺伝子及びａｄｈＢ遺伝子の高レベル発現のマーカ）と、ｏｕｔ遺伝子によるグルカナーゼの効果的分泌を含有する固体培地で成長させた。ＳＺ２及びＳＺ６の二つの組換え株をその後の研究に選んだ。両方とも、総細胞タンパク質の約５％に匹敵する２４，０００ ＩＵ ^Ｌ−１ のグルカナーゼ活性を生じた （Ｐｙ ｅｔ ａｌ． （１９９１） Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎ． ４：３２５−３３３）。
【０２０２】
基質の脱重合
ＣＭＣ源に用いた場合の組換え体ＥＧＺによる基質の脱重合は優れていることが判明した（表７）。酸膨潤セルロースに用いた場合、グルカナーゼの活性はＣＭＣでの活性で測定した活性の１０％未満であった。このポリサッカラーゼをアビセル^（Ｒ）又はキシランに用いた場合は、ほとんど活性は認められなかった。しかし、一晩消化させたとき、ＥＧＺポリサッカラーゼはすべての基質について平均重合長を測定可能な程度に減少させた。ＣＭＣ及び酸膨潤セルロースを脱重合させて、平均７糖残基の長さにした。これら７個の残基から成るセルロース重合体はぎりぎりに可溶性であり、理想的には、効率的な代謝のためにはさらに消化するとよいであろう（Ｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ． （１９９２） Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ５８：２１０３−２１１０）。ボールミルしたセルロース及びアビセル^（Ｒ）の平均の鎖長は元の長さの３分の１に減少し、他方、キシラン重合体１個当たりでは一回未満の切断が観察された。
【０２０３】
【表６】

【０２０４】
グルカナーゼ（ＣＭＣアーゼ）活性は、３０℃で１６時間成長させた後で調べた。
【０２０５】
【表７】

【０２０６】
株ＳＺ６ （ｐＣＰＰ２００６）は、分泌ＥＧＺ源としてＬＢ−ソルビトールブロス中で１６時間成長させた。
【０２０７】
生体触媒の糖化及び発酵化能力
実用性のためには、ｃｅｌＺ及びｏｕｔ遺伝子を株Ｐ２に加えた結果、その結果生ずる生体触媒の発酵能力が落ちてはならない。グルコース及びセロビオースを用いて比較を行った（表８）。全ての株は、これらの糖を発酵させる能力で同等であり、ｃｅｌＺの組み込み又はｐＣＰＰ２００６の追加が原因の悪影響がないことを示した。これらの株についてはさらに酸膨潤セルロースを直接エタノールに転化させる能力についても調べた。最も活性な作製物ＳＺ６ （ｐＣＰＰ２００６） は少量のエタノール（３．９ ｇ Ｌ ^−１） を非晶質セルロースから生成した。約 １．５ ｇ Ｌ^−１ のエタノールが、全ての株の播種時点で最初に存在した。ＳＺ６ （ｐＣＰＰ２００６）を除くすべての株でこれは時間と共に減少してゼロになった。このように、ＳＺ６ （ｐＣＰＰ２００６）で観察された３．９ ｇ Ｌ^−１ のエタノールの生成は、総エタノール生産量の過小評価につながるかも知れない。しかしながら、よく言っても、これは存在する重合体のごく一部分の転化を表す数値である。低レベルのグルコース、セロビオース、及びセロトリオースが、酸膨潤セルロースがＥＧＺによる加水分解で生じ、発酵した可能性がある。これらの化合物は、Ｋ．オキシトカの天然のホスホエノールピルビン酸依存的リン酸転移酵素系で代謝され得る（Ｏｈｔａ Ｋ ｅｔ ａｌ．， （１９９１） Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ５７：８９３−９００； Ｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ． （１９９２） Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ５８：２１０３−２１１０）。
【０２０８】
【表８】

【０２０９】
播種時の当初のエタノール濃度はすべての株で約１．５ｇＬ^−１であった。酸膨潤セルロースを基質とした場合、これらのレベルはＳＺ６（ｐＣＰ２０６）を除く全ての株で７２時間のインキュベート後にゼロまで減少した。
【０２１０】
実施例３
カルボキシメチルセルロース及び酸膨潤セルロースの、エルウィニア−クリサンセミ由来の二種のエンドグルカナーゼ（ＥＧＺ及びＥＧＹ）による相乗的な加水分解　本実施例では、組換えＥ．コリによるエンドグルカナーゼＥＧＹ及びＥＧＺの生産と、これらのエンドグルカナーゼによるカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）及び酸膨潤セルロースの相乗的な加水分解を解説する。
【０２１１】
本実施例全体を通じて、他に特に明示しない限り、以下の材料及び方法を用いる。
【０２１２】
材料及び方法
細菌、プラスミド及び培養条件
この研究で用いた細菌株及びプラスミドを表９に挙げる。
【０２１３】
【表９】

【０２１４】
エシェリヒア−コリＤＨ５α及びＴＯＰＯ１０Ｆ’を、プラスミド作成用のホストとして用いた。ｃｅｌＺ 遺伝子はＥ．クリサンセミＰ８６０２１からクローンした （Ｂｅａｌｌ， ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｊ． Ｉｎｄｕｓｔ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． １１：１５１−１５５）。ｃｅｌＹ 遺伝子は、Ｇｕｉｓｅｐｐｉ ｅｔ ａｌ． （（１９９１） Ｇｅｎｅ １０６：１０９−１１４）により、Ｅ．クリサンセミ３９３７からクローンした。ｏｕｔ 遺伝子はＨｅ ｅｔ ａｌ． （（１９９１） Ｐｒｏｃ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８８：１０７９−１０８３） によりＥ．クリサンセミＥＣ１６からクローンした。
【０２１５】
１リットル当たり１０ｇのディフコ・トリプトン、５ｇのディフコ^（Ｒ）酵母抽出物、及び５ｇの塩化ナトリウムを含有するルリア−ベルタニ・ブロス（ＬＢ）中か、又は寒天（１．５％）を含有する固形ＬＢ培地上で、Ｅ．コリ培養株を３７℃で成長させた。コンゴ・レッド法を用いて、エンドグルカナーゼ生産についてクローンをスクリーニングした（Ｗｏｏｄ， ｅｔ ａｌ． （１９８９） Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． ２６０：３７−４３）。ＬＢ寒天に低粘性ＣＭＣ（０．３％）を補って、指示プレートを調製した。アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）、カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）及びスペクチノマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を適宜、淘汰のために加えた。
【０２１６】
遺伝子法
標準的な方法を、プラスミド作成及び解析に用いた （Ａｕｓｕｂｅｌ， ｅｔ ａｌ． （１９８７） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ．　Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ： Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ）。ｃｅｌＹのコーディング領域を、ポリメラーゼ連鎖反応で、ｐＭＨ１８をテンプレートとして用い、以下のプライマ対：Ｎ−末端５’ＣＴＧＴＴＣＣＧＴＴＡＣＣＡＡＣＡＣ３ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）’， Ｃ−末端５’ＧＴＧＡＡＴＧＧＧＡＴＣＡＣＧＡＧＴ３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）で増幅した。Ｅ．クリサンセミのｏｕｔ遺伝子 （ｐＣＰＰ２００６）を、可動化のためにｐＲＫ２０１３を用いて接合して移した （Ｚｈｏｕ， ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｂ． Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ６５：２４３９−２４４５）。ＬＩ−ＣＯＲ モデル ４０００−Ｌ ＤＮＡシーケンサ及び蛍光プライマを用いたジデオキシ法で、ＤＮＡを配列決定した。
【０２１７】
酵素検定
ＣＭＣを基質として用いて、エンドグルカナーゼ活性をインビトロで調べた。無細胞ブロス（細胞外活性）か、又は、超音波破砕してある細胞を含有するブロス（総活性）の適当な希釈液を、３５℃で、低粘性ＣＭＣ（１リットル当たり２０ｇ）を含有する５０ ｍＭ クエン酸緩衝液 （ｐＨ ５．２）中で検定した。沸騰水の水槽で１０分間加熱して反応を停止させた。グルコースを標準として用いて、３，５−ジニトロサリチル酸試薬で還元糖を測定した（Ｗｏｏｄ， ｅｔ ａｌ． （１９８８） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １６０：８７−１１２）。酵素活性（ＣＭＣａｓｅ） は、１分間当たりに遊離した還元糖のμモル数（ＩＵ）で表してある。結果は二つ以上の調査の平均である。
【０２１８】
相乗作用
ＤＨ５α（ｐＬＯＩ１６２０ ＋ ｐＣＰＰ２００６） 及びＤＨ５α（ｐＬＯＩ２３１１） の固相培養株を、上記のＺｈｏｕ， ｅｔ ａｌ． （１９９９）が説くように音波破砕及び遠心分離して、それぞれＥＧＺ及びＥＧＹの源とした。これらを必要に応じ、ＣＭＣａｓｅ活性が同等になるように希釈した。ＥＧＺ及び ＥＧＹの混合物を、ＣＭＣ（２０ｇ／Ｌ）又は酸膨潤セルロース（１リットル当たり２０ｇ）を含有する３５℃の５０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．２）で相乗作用についてテストした。アビセル^（Ｒ）（１リットル当たり２０ｇ）を使ったテストでは、酵素標品を、前もった希釈を行わずに混合した。酸膨潤セルロース及びアビセル^（Ｒ）の加水分解後の試料を遠心分離（１０，０００ ×ｇ、５分）して、不溶性の物質を取り除いてから還元糖を調べた。
【０２１９】
ＥＧＺ及びＥＧＹを順に加えたときの効果も調べた。基質を一種類の酵素で４時間加水分解してから、２０分間沸騰させて失活させた。冷却後、二番目の酵素を加え、さらに４時間インキュベートした。両方の酵素を一緒にしたものと（４時間）、各酵素単独のもの（４時間）とで、コントロール実験を行った。試料を還元糖について分析した。場合によっては、薄層クロマトグラフィでも生成物を分析した。
【０２２０】
酵素混合物の相乗作用の程度を、観察された活性を、ＥＧＹ単独及びＥＧＺ単独の場合の予測される寄与度の合計で除算したものとして計算した （Ｒｉｅｄｅｌ， ｅｔ ａｌ． （１９９７） ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｌｅｔｔ． １４７：２３９−２４３）。
【０２２１】
セロオリゴ糖の加水分解
セロビオース、セロトリオース、セロテトラオース、セロペンタオース、酸膨潤セルロース（上記のＷｏｏｄ， ｅｔ ａｌ． （１９８８））及びアビセル^（Ｒ）の加水分解生成物を、薄層クロマトグラフィで分析した。これらの分析物について、１５μｌの１％基質を４５μｌの粗酵素（０．０７ＩＵ）と混合し、３５℃で２時間インキュベートし、沸騰水の水槽で加熱して停止させた。加水分解生成物をワットマンの２５０μｍのシリカ−ゲル１５０Ａ プレートにスポットし、Ｋｉｍ， （１９９５） Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ６１：９５９−９６５）が解説した溶媒系を用いて約４時間、展開させた。体積では、この溶媒は６部のクロロホルム、７部の酢酸、及び１部の水を含んでいた。６．５ ｍＭ Ｎ−（１−ナフチル）エチレンジアミンジヒドロクロリドを噴霧し、１００℃で約１０分間加熱して、糖を視覚化した（Ｂｏｕｎｉａｓ， （１９８０） Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １０６：２９１−２９５）。
【０２２２】
材料及び化学物質
トリプトン及び酵母抽出物はディフコ社（ミシガン州デトロイト）の製品だった。抗生物質、低粘性ＣＭＣ、セロビオース、セロトリオース、及びセロテトラオースは、シグマ・ケミカル・カンパニー社（ミズーリ州セントルイス）から得た。セロペンタオースはＶ−ラブ（ルイジアナ州コビントン）から得た。アビセル^（Ｒ）はフルカ・ケミカ社（スイス、ブッハ）から購入した。
【０２２３】
組換えＥ．コリによるＥＧＹ及びＥＧＺの生産
低レベルのＥＧＹ活性が、天然Ｅ．クリサンセミ ３９３７と、プラスミドｐＭＨ１８を持つ組換えＥ．コリで生産された （Ｂｏｙｅｒ， ｅｔ ａｌ． （（１９８７） Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １６２：３１１−３１６； 上記のＧｕｉｓｅｐｐｉ， ｅｔ ａｌ．）。Ｅ．コリに入れた高コピー数のプラスミドから起きた発現が低かったのは、プロモータの機能と、ｃｅｌＹ活性化たんぱくが必要と推測されることが、原因とされた （上記のＧｕｉｓｅｐｐｉ， ｅｔ ａｌ．）。相乗作用を調べる我々の調査のために、高レベルのＥＧＹを生じるよう、新たなクローンを作成した。ＥＧＹコーディング領域（プロモータなし）を、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて増幅し、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯのｌａｃプロモータの後ろにクローンした。その結果出来たプラスミド ｐＬＯＩ２３１１は、ＣＭＣａｓｅ 指示プレートで強陽性であった。その天然プロモータをｌａｃプロモータに置換したことで、ｃｅｌＹ の発現が、１６５ ＩＵ／Ｌ から１８００ ＩＵ／Ｌへと、約１０倍に増加した（下の表１０を参照されたい）。
【０２２４】
【表１０】

【０２２５】
^ａ培養上清中に分泌又は放出されたＣＭＣａｓｅ活性
^ｂ略語：ｎｄは不明。
【０２２６】
ＥＧＹの活性のうち約９０％が細胞外ミリューに見つかった。ｃｅｌＺの発現も比較のために含めた（表１０を参照されたい）。プラスミドｐＬＯＩ１６２０を持つＥ．コリでは高レベルのＥＧＺが生産された。細胞外ＥＧＺ及び総ＥＧＺ活性は、Ｅ．クリサンセミｏｕｔ遺伝子（ｐＣＰＰ２００６） を前に解説された（Ｚｈｏｕ， ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ６５：２４３９−２４４５）通りに加えると、さらに増加した。しかし、ＥＧＺとは異なり、ＥＧＹ活性はｏｕｔ遺伝子の存在に左右されなかった。最大のＥＧＹ及びＥＧＺ活性は２４時間培養物から得られた。ｐＬＯＩ２３１１ 又はｐＬＯＩ１６２０ 及びｐＣＰＰ２００６ （ｏｕｔ 遺伝子） を含有するＤＨ５αの破壊培養物の上清を、それぞれその後の調査のＥＧＹ及びＥＧＺ源として用いた。
【０２２７】
ＣＭＣを基質にしたときのＥＧＹ及びＥＧＺの相乗作用
ＥＧＹ及びＥＧＺを組み合わせたときの作用を調べる最初の研究は （１リットル当たり２０ ｇの）ＣＭＣを用い、インキュベーション時間を一種類にして行われた（図９）。ＥＧＹ及びＥＧＺを含有する破砕細胞の標品をそれぞれ活性（ＣＭＣａｓｅ）が等しくなるまで希釈し、個々の活性の合計は一定に維持しながら様々な比率で配合した。ＥＧＹ及びＥＧＺを個別にしたものはコントロールとしてテストした。ＥＧＹ及びＥＧＺの混合物はすべて、単独で検定したいずれの酵素よりも有意に高く、相乗的な相互作用が示された。この相乗効果は、ＥＧＺの比率と共に増した。最大の相乗作用（１．４２）は、ＥＧＺ活性対ＥＧＹ活性の比が９ 対１及び１９ 対１のときに観察された。
【０２２８】
更なる実験では、ＣＭＣを基質とし、ＥＧＺ及びＥＧＹの活性比をそれぞれ ９ 対１としたときのインキュベーション時間の影響を調べた（図９）。ＥＧＺ及びＥＧＹ単独はコントロールとして含めた。ＥＧＺ及びＥＧＹを組み合わせたときの相乗作用は、加水分解の速度及び程度の増加として明かであった。計算上の相乗作用はインキュベーション時間と共に増した。インキュベーションの終了時（４時間）、還元糖の濃度は、個々のＥＧＺ及びＥＧＹ活性の計算上の合計で予測したものよりも、混合した酵素標品の方が１．８倍高く、即ち相乗的な活性があった。
【０２２９】
相乗作用に対する基質（ＣＭＣ）濃度の効果
ＥＧＺ及びＥＧＹ間の相乗作用に及ぼす基質濃度の影響も研究した（下の表１１を参照されたい）。ＣＭＣ濃度を１リットル当たり２．５ｇから１リットル当たり２０ｇに上げると、観察される相乗作用が１．１２から１．８９に上昇した。ＥＧＺ及びＥＧＹの特異活性及び１．８９という最大の相乗作用に基づけば、この組合せの酵素回転率は、精製ＥＧＹ単独のときの８倍、そして精製ＥＧＺ単独のときの１．５倍であった。
【０２３０】
【表１１】

【０２３１】
^ａ平均±標準偏差
^ｂＥＧＺ及びＥＧＹは、ＣＭＣａｓｅ活性が等しくなるまで希釈した。反応液（０．１５ ＩＵ／ｍｌ）は９部のＥＧＺ、及び１部のＥＧＹを含んでいた。コントロールとして、ＥＧＺ （０．１５ ＩＵ／ｍｌ） 及びＥＧＹ （０．１５ ＩＵ／ｍｌ）をそれぞれ個別にテストした。
^ｃ相乗作用は、観察された活性を、ＥＧＹ単独（１０％）及びＥＧＺ単独（９０％）のときの予測寄与度の合計で除算したものとして計算した。
【０２３２】
ＥＧＹはＥＧＺよりも基質濃度への感受性が高かった。ＣＭＣ濃度を上げると、ＥＧＹによる還元糖生成物は８倍に増加したが、ＥＧＺでは僅かに３倍の増加であった。表１１のデータの二重逆数プロットに基づくと、１リットル当たり１０４、１２、及び３８ｇという見かけのＫｍ値が、ＥＧＹ、ＥＧＺ及び両酵素の組合せ（それぞれ９部ＥＧＺ＋１部ＥＧＹ）について推定された。ＥＧＹの見かけのＫｍが高いことは、基質分子がより長いときの必要条件と合致する。
【０２３３】
ＣＭＣ加水分解の程度も、加水分解生成物の大体の大きさを決定することで調べた。ＣＭＣ（１リットル当たり１．２５ｇ）を、ＥＧＹ、ＥＧＺ及び両酵素の組合せ（９部ＥＧＺ＋１部ＥＧＹ）と一緒にインキュベートした（４時間、０．７５ ＩＵ ＣＭＣａｓｅ／ｍｌ）。インキュベーション前（２５０グルコシル単位）及びインキュベーション後に、還元糖検定に基づいて鎖の長さを推定した。平均の鎖長は、三種類の酵素標品のすべてで、大きく減少した。ＥＧＺは鎖長を短くする上でＥＧＹよりも効果的であり、それぞれ３．６対１０．７グルコシル残基であった。両酵素を組み合わせると相乗作用が起きた。両方の酵素で同時に加水分解させると、加水分解生成物の平均の大きさが２．３グルコシル残基に低下し、ＥＧＺ単独よりも３６％小さく、ＥＧＹ単独よりも７９％小さくなった。これらの結果から、ＥＧＺは両方の大型ＣＭＣ重合体及びより小型の糖を容易に加水分解することが確認できる。ＥＧＹの作用はより限られたものであり、主に１０グルコシル単位を越える大型の重合体を加水分解するようである。
【０２３４】
ＥＧＺ及びＥＧＹによるＣＭＣの逐次及び同時の加水分解
ＥＧＺ及びＥＧＹ間の相乗作用のメカニズムを、さらに、個々のエンドグルカナーゼで順に加水分解したときの効果を、両方の酵素の混合物で同時に加水分解したときのそれと比較することで調査した（下の表１２を参照されたい）。やはり、両方の酵素を同時に作用させた場合に相乗作用が見られた。ＥＧＺを一番目の酵素として用いた後に（ＥＧＺを熱失活させた後）ＥＧＹによる消化を行ったＣＭＣの逐次加水分解では、相乗作用は観察されなかった。対照的に、ＣＭＣをまずＥＧＹで処理し、次に（ＥＧＹを熱失活させた後で）ＥＧＺで処理した場合には相乗作用は完全に残った。これらの結果は、ＥＧＹ及びＥＧＺの独立の活性により相乗作用が達成できることを示している。ＥＧＹにより基質に酵素修飾が起きることで、ＥＧＺによるその後の加水分解の速度及び程度が上昇した。これらの結果は、ＥＧＹ及びＥＧＺの働きが大変異なることの更なる証拠である。ＥＧＹは主に、大型の重合体の鎖長を小さくするのに対し、ＥＧＺはよりランダムに作用して、大型及び小型の基質分子の両方を加水分解するようである。
【０２３５】
【表１２】

【０２３６】
^ａＥＧＺ及びＥＧＹは、ＣＭＣａｓｅ活性が等しくなるまで希釈した。同時及び馳駆時の加水分解反応（０．１５ ＩＵ／ｍｌ）は両方とも、９部のＥＧＺ、及び１部のＥＧＹを用いて調査した。逐次の加水分解実験では、一番目の酵素を基質と一緒に４時間インキュベートし、２０分間沸騰させて失活させた。冷却後、二番目の酵素を添加し、さらに４時間インキュベートした。反応はすべて沸騰で停止させた。
^ｂ平均±標準偏差（３実験）。
^ｃ個々のＥＧＹ及びＥＧＺ活性の計算上の合計。
^ｄ相乗作用は、観察された活性を、ＥＧＹ単独（１０％）及びＥＧＺ単独（９０％）のときの予測寄与度の合計で除算したものとして計算した。
【０２３７】
酸膨潤及び結晶質セルロースに対する相乗作用
基質として酸膨潤セルロース、そしてＣＭＣａｓｅ活性に基づいて９対１の比のＥＧＺ：ＥＧＹを用いて潜在的相乗作用を調べた（図９）。酸膨潤セルロースを用いた場合のＥＧＺ及びＥＧＹの活性は、ＣＭＣを用いた場合よりも低いため（Ｂｏｙｅｒ， ｅｔ ａｌ． （１９８７） Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １６２：３１１−３１６）、酵素添加量 （１．５ ＩＵ）及びインキュベーション時間を増した。酸膨潤セルロースで個別に検定したとき、ＥＧＹの活性はＥＧＺの約３分の１であった。しかし、これらの二つの酵素を組み合わせると、いずれの時点でも、個別の活性の予測される計算上の合計よりも、著しく高い活性があった。相乗作用の程度は、３６時間のインキュベーションの間、基本的に一定（１．３６±０．１７）だった。
【０２３８】
酸膨潤セルロースの加水分解生成物（６時間）を薄層クロマトグラフィで分析した（図１０）。ＥＧＹのみとインキュベートした後では、可溶性の糖類は観察されなかった。セロビオース及びセロトリオースが、ＥＧＺ単独及びＥＧＹ及びＥＧＺの組合せによる加水分解で出た主な生成物だった。両方の酵素を組み合わせると、より高いレベルの生成物が、より暗い色でより大型の斑点として現れ、相乗作用のあったことが裏付けられた。
【０２３９】
ＥＧＺ及びＥＧＹの相乗作用を、結晶性の高いセルロースであるアビセル^（Ｒ）でも調べた（図１０）。少量のセロビオース及びセロトリオースが、ＥＧＺ単独、及び、ＥＧＹ及びＥＧＺの混合物、を用いて生じた加水分解生成物として観察された。アビセル^（Ｒ）での活性が低いために、生成物を薄層プレート上で視覚化するためには、高い添加量（１０μｌ）が必要であった。この追加した塩により、標準に比べ、オリゴ糖生成物の相対的移動が増したことに留意されたい。ＥＧＹ単独ではセロオリゴ糖の斑点は見られなかった。やはり、相乗作用がＥＧＹ及びＥＧＺの組合せで明確に見られた。ＥＧＺ単独に比べ、活性を組み合わせた方で、セロビオース、セロトリオース、及びセロテトラオースに相当する、より大きく、より濃い斑点が観察された。アビセル^（Ｒ）を基質にしたときに活性が低いことと、生成物の相対的レベルが低いことは、アビセル^（Ｒ）のうち結晶領域ではなく非晶質領域の加水分解が起きることと合致する。これらの結果は、ＥＧＺ及びＥＧＹの相乗作用は、ＣＭＣなどの基質モデルに限られないことを示している。相乗的な加水分解は酸膨潤セルロースや、アビセル^（Ｒ）の非晶質領域でも見られた。
【０２４０】
セロオリゴ糖の加水分解
さらに、ＥＧＺ及びＥＧＹの基質特異性を可溶性セロオリゴ糖（セロビオース、セロトリオース、セロテトラオース、及びセロペンタオース）を用いて調べた。加水分解生成物は薄層クロマトグラフィで分析した（図１１）。セロビオースはＥＧＹでも、ＥＧＺでも、又は両酵素の組合せでも加水分解しなかった。これらセロオリゴ糖のいずれも、ＥＧＹ単独では加水分解しなかった（図１１、パネルＢ）。対照的に、ＥＧＺはセロテトラオース及びセロペンタオースは加水分解したが、セロトリオースはしなかった（図１１、パネルＣ）。セロテトラオースから出たＥＧＺ加水分解生成物は、主にセロビオースであり、それより量は少ないがセロトリオース及びグルコースもあった。セロペンタオースを基質とした場合、ＥＧＺは、ほぼ等量のセロビオース及びセロトリオースを生成したことから、二番目又は三番目のグリコシド結合が優先的に破壊されることが示唆された。このことを、セロペンタオースのＥＧＺとのインキュベート中の様々な時点で試料を調べてさらに確認した（図１１、パネルＤ）。セロビオース及びセロトリオースはインキュベーション中に次第に累積し、対応してセロペンタオースは減少していった。このように、ＥＧＹでは大型の基質が必要なのとは対照的に、ＥＧＺは４個又はそれ以上のグルコシル単位を含有する可溶性のセロオリゴ糖を加水分解するのである。
【０２４１】
実施例４
エルウィニア−クリサンセミ・エンドグルカナーゼＥＧＹ（ｃｅｌＹ）及びＥＧＺ（ｃｅｌＹ）のエタノール生産性クレブシエラ−オキシトカＰ２での一体化、発現、及び細胞外分泌
この実施例では、Ｅ．クリサンセミ由来のｃｅｌＹ及びｃｅｌＺの両方を、Ｋ．オキシトカＰ２の染色体へ機能的に一体化した例を解説する。さらに、同時糖化発酵を用いてセルロースをエタノールに発酵させる際の、組換えＥＧＹ及びＥＧＺ並びに真菌セルラーゼ（スペザイムＣＥ^（Ｒ））の間の相乗作用も解説する。
【０２４２】
本実施例全体を通じ、他に明示しない限り、以下の材料及び方法を用いる。
【０２４３】
材料及び方法
細菌、プラスミド及び培養条件
本実施例で用いた株及びプラスミドを下の表１３に挙げる。
【０２４４】
【表１３】

【０２４５】
エシェリヒア コリＤＨ５α及びＴＯＰＯ１０Ｆ’を、プラスミド作製中のホストとして用いた。 ｃｅｌＺ 遺伝子、ｃｅｌＹ遺伝子、及び ｏｕｔ 遺伝子を、実施例３で解説したようにクローンした。
【０２４６】
Ｅ． コリ培養株を、３７℃で、１リットル当たり：１０ ｇ ディフコ^（Ｒ）トリプトン、５ ｇディフコ酵母抽出物、及び５ ｇ塩化ナトリウムを含有するルリア−ベルタニブロス（ＬＢ）か、又は、寒天（１．５％）を含有する固形ＬＢ培地上で成長させた。エタノール生産性株の成長のために、使用したブロス（５％ グルコース又はソルビトール）及び固形培地（２％ グルコース）に糖を必ず含有させた。コンゴレッド法を用いてエンドグルカナーゼ生産についてクローンをスクリーニングした（Ｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ． （１９８８） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １６０：８７−１１２）。エンドグルカナーゼ指示プレートは、ＬＢ寒天に０．３％低粘性カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）を補って調製した。淘汰にはアンピシリン （５０μｇ／ｍｌ）、アプラマイシン（１００μｇ／ｍｌ）、カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）、クロラムフェニコール（４０μｇ／ｍｌ） 及びスペクチノマイシン（１００ μｇ／ｍｌ） を用いた。Ｋ． オキシトカ のエタノール生産性株をグルコース（２％）及びクロラムフェニコール（６００μｇ／ｍｌ）を含有する固形ＬＢ培地上で３０℃に維持した。
【０２４７】
遺伝子法
標準的方法をプラスミド作成、分析、及び配列決定に用いた。ｃｅｌＹのリボソーム結合部位及びプロモータのないコーディング領域を、ポリメラーゼ連鎖反応で、以下のプライマー対：Ｎ末端５’ＣＴＧＴＴＣＣＧＴＴＡＣＣＡＡＣＡＣ３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）、Ｃ末端５’ＧＴＧＡＡＴＧＧＧＡＴＣＡＣＧＡＧＴ３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）で、ｐＭＨ１８をテンプレートとして用いて増幅した。Ｅ．クリサンセミｏｕｔ 遺伝子（ｐＣＰＰ２００６） を、可動化のために ｐＲＫ２０１３ を用いて接合により移動させた。作成は、蛍光プライマを用いたジデオキシ法及びＬＩ−ＣＯＲモデル４０００−Ｌ ＤＮＡシーケンサを利用して配列決定することで、確認した。Ｅ．クリサンセミ ｃｅｌＹ 及びｃｅｌＺ 遺伝子は、バイオ−ラド・ジーン・パルサー^（Ｒ）を用いた電気穿孔により、Ｋ．オキシトカＰ２に導入した。Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ｍｏｒａｌｅｓ， ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １８１：７１４３−７１４８， ａｎｄ Ｚｈｏｕ， ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｉｎｄｕｓｔ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２２：６００−６０７が解説するように、カナマイシン（５０ｍｇ／リットル）を含有する固形培地上で組換え株を選択した。
【０２４８】
プライマー伸長分析
コーディング領域内に ＩＲＤ４１標識付プライマーである蛍光プライマー： ５’−ＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＴＣＡＡＣＧＣＣＣＡＡＣＡＡＣＧ−３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １５） をｃｅｌＹに、そして５’−ＧＡＣＴＧＧＡＴＧＧＴＴＡＴＣＣＧＡＡＴＡＡＧＡＧＡＧＡＧＧ−３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １６）をｃｅｌＺに用いて、転写開始部位をマッピングすることでプロモータ領域を同定した。伸長産物を添加バッファに溶解させて、ＬＩ−ＣＯＲ モデル ４０００−Ｌ ＤＮＡシーケンサ（ネブラスカ州リンカーン）を用いてパラレルジデオキシ配列に比較した。
【０２４９】
酵素検定
エンドグルカナーゼ活性を実施例３で解説したように調べた。
【０２５０】
発酵
同時糖化発酵（ＳＳＦ）テストを、２００ｍｌのブロスを容れた、バッフルのない５００ｍｌ入りフラスコ内で行った。フラスコにはゴム製ストッパを取り付け、１８番針で換気した。発酵は、１０％シグマセル５０（結晶質セルロース）を含有するＬＢ培地で３５℃（１２０ｒｐｍ）で行わせた。播種材料は、５％のグルコースを含有するＬＢで１２時間成長させた。遠心分離で細胞を採集し、ＬＢ内に再懸濁させた。各フラスコに、当初密度が１６ｍｇの細胞（乾燥重量）となるように播種した。
【０２５１】
材料及び化学薬品
トリプトン及び酵母抽出物はディフコ社（ミシガン州デトロイト）の製品だった。抗生物質、低粘性ＣＭＣ、及びシグマセル５０^（Ｒ）はシグマ・ケミカル・カンパニー社（ミズーリ州セントルイス）から得た。ＩＲＤ４１で標識されたプライマは、ＬＩ−ＣＯＲ社（ネブラスカ州リンカーン）から購入した。
【０２５２】
ｃｅｌＹ用プロモータ−プローブベクタの作成
Ｅ．クリサンセミ由来のｃｅｌＹ遺伝子は、Ｅ．コリ内ではその天然プロモータのままでは発現が乏しい（Ｇｕｉｓｅｐｐｉ， ｅｔ ａｌ （１９９１） Ｇｅｎｅ １０６：１０９−１１４を参照されたい）。従って、発現を増すために、ｃｅｌＹをレポータとして用いて以下のようにプロモータ−プローブベクタを作成した（図１３を参照されたい）。リボソーム結合部位を持つがプロモータのないｃｅｌＹコーディング領域（１．２ ｋｂｐ） を、ＰＣＲによりｐＭＨ１８をテンプレートとして用いて増幅し、トポイソメラーゼベクターＰＣＲ２．１−ＴＯＰＯに無作為に挿入した。ｃｅｌＹの機能的発現はエンドグルカナーゼ指示プレートを用いて確認した。ｌａｃ プロモータからｃｅｌＹを発現する方向になったクローンを選択し、ｐＬＯＩ２３１１ （５．２ ｋｂｐ）と指定した。プロモータのないｃｅｌＹ遺伝子を含有するＥｃｏＲＩ 断片をＬＯＩ２３１１から単離した。この断片の両末端をクレノウポリメラーゼで平滑末端にしてから、ｐＵＣ１８のＨｉｎｃＩＩ 部位に連結した。ｌａｃ プロモータからｃｅｌＹ を発現する方向に向いたクローンを選択 （３．９ ｋｂｐ） し、エンドグルカナーゼ指示プレートを用いて発現を確認した（ｐＬＯＩ２３１６）。ＥｃｏＲＩ 及びＨｉｎｄＩＩＩ を用いて、このプロモータのないｃｅｌＹ遺伝子をｐＬＯＩ２３１６から１．２ ｋｂｐの断片として単離し、ｐＬＯＩ２３０２ （ｐＵＣ１９ 類縁体）の対応する部位に挿入して、ｃｅｌＹ遺伝子の方向を逆転させた。予想通り、出来上がった 作成物ＤＨ５α（ｐＬＯＩ２３１７）は、プロモータがないために、エンドグルカナーゼ指示プレート上で不活性であった。プロモータ領域を含有するＤＮＡ断片の挿入を容易にできるよう、プラスミド ｐＬＯＩ２３１７ （３．９ ｋｂｐ）は、ｃｅｌＹ遺伝子のすぐ上流の ポリリンカー領域にＢａｍＨＩ 部位を含有している（図１３を参照されたい）。
【０２５３】
Ｅ．コリＤＨ５αでのｃｅｌＹの発現を増加させてあるプラスミドの作成
Ｚ．モビリス染色体ＤＮＡのＳａｕ３Ａ１ 断片を用いて、Ｋ．オキシトカで本来の調節作用を受けないような、又は、Ｋ．オキシトカ染色体へのその後の組み込みに干渉するような異種プロモータを作成した（Ｚｈｏｕ， ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｊ． Ｉｎｄｕｓｔ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２２：６００−６０７）。０．５−１．５ ｋｂｐの断片を単離し、ｐＬＯＩ２３１７のＢａｍＨＩ部位に無作為に連結して、サロゲート・プロモータのライブラリを作った（図１３を参照されたい）。約７５，０００のコロニーをエンドグルカナーゼ指示プレートでスクリーニングした。クローンのうち３分の１がｃｅｌＹを活発に生産した。最も活発な１００のクローンを、ゾーンの大きさで特定し、精製し、再テストした。活性ゾーンの最も大きな３０のクローンをＬＢで一晩成長させて、ＣＭＣａｓｅ活性について検定した。最も活性の高かった、元のクローンｐＭＨ１８よりも約７倍高い活性を呈した５つのクローンを、下の表１４に挙げる。その後の調査にプラスミド ｐＬＯＩ２３２３を選択した。
【０２５４】
【表１４】

【０２５５】
プラスミドはすべてｐＵＣ類縁体である。エンドグルカナーゼ活性は、３７℃で約１６時間成長させた培養株を用いて測定した。
【０２５６】
ｐＬＯＩ２３２３中のＺ．モビリス Ｓａｕ３Ａ１ 断片 （９３７ｂｐ）を、両方向で配列決定した（ＧｅｎＢａｎｋ 受託番号Ｎｏ． ＡＦ３０５９１９）。データベースの比較に基づくと、この断片は二つの種を由来とし、８８２ｂｐ の断片は、前に配列決定されている領域に相当するＺ．モビリス染色体由来であり、残りの５５ ｂｐ 断片はベクタ由来のようである。翻訳後の配列をＢＬＡＳＴ検索 （ナショナル・センター・フォーバイオテクノロジー・インフォメーション；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／） しても、公知の遺伝子への同一性は明らかにならなかった。三種類の異なるシグマ因子、σ^３２、σ^３８、及びσ^７０、を含むプライマー伸長分析を行って、ＤＨ５α（ｐＬＯＩ２３２３）のうちの４箇所の転写開始部位を特定した（図１４を参照されたい）。強度の違いは２倍未満であったが、最も強い開始部位の上流にある配列は、ヒートショックプロモータであるσ^３２（ｒｐｏＨ）のコンセンサス配列に似ていた （Ｗａｎｇ， ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １８０：５６２６−５６３１； Ｗｉｓｅ， ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １７８：２７８５−２７９３）。
【０２５７】
ｃｅｌＹ及びｃｅｌＺをＫ．オキシトカＰ２の染色体に組み込むためのベクターの作成
プラスミドｐＬＯＩ２３０７ （７．２ ｋｂｐ） を作成し、組換えＥ．コリＤＨ５α （Ｚｈｏｕ， ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｂ．Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ６５：２４３９−２４４５を参照されたい） 及びＫ．オキシトカＭ５Ａ１（Ｚｈｏｕ， ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｉｎｄｕｓｔ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２２：６００−６０７を参照されたい）でサロゲートＺ．モビリスプロモータからｃｅｌＺを高レベルで発現させるのに用いた。このハイブリッドｃｅｌＺ遺伝子及びプロモータ（４．５ｋｂｐ）のサブクローニングを簡単に行えるよう、 ＥｃｏＲＩ リンカーをｐＬＯＩ２３０７のＴ４ ポリメラーゼ処置済みＳｐｈＩ部位に挿入して、切断が都合良く起きるフランキングＥｃｏＲＩ 部位を作った（ｐＬＯＩ２３４９）。ｃｅｌＹ 及び ｃｅｌＺを含有するプラスミドを作成する前に、ＥｃｏＲＩで消化後のＫ． オキシトカ Ｍ５Ａ１染色体ＤＮＡのうち無作為の３ ｋｂｐ断片を、ｃｅｌＹ（及びサロゲート・プロモータ）を含有するｐＬＯＩ２３２３に挿入して、相同組換えの案内として役立てた（ｐＬＯＩ２３４８； ８ ｋｂｐ）。この３ ｋｂｐ のＭ５Ａ１断片を部分的に配列決定すると、完全Ｍ５Ａ１ ｇｌｇＰ遺伝子をコードしているようである。ｐＬＯＩ２３４８ （８ ｋｂｐ）では、フランキングＡｓｃＩ 部位のおかげで、Ｍ５Ａ１ ｇｌｇＰ 遺伝子、Ｚ．モビリスサロゲート・プロモータ、及びＥ．クリサンセミｃｅｌＹを含有する一個の５．５ ｋｂｐ 断片を切断することができた。
【０２５８】
図１５は、ｐＬＯＩ２３４９、ｐＬＯＩ２２２４、及びｐＬＯＩ２３４８からのｃｅｌＹ、ｃｅｌＺ 組み込みベクタの作成を要約したものである。サロゲート・プロモータ及び前記案内断片を含有する組換えｃｅｌＹ 及びｃｅｌＺ 遺伝子を、コア組み込みベクタｐＬＯＩ２２２４ （上記のＭａｒｔｉｎｅｚ−Ｍｏｒａｌｅｚ， ｅｔ ａｌ．） に、Ｅ．コリＳ１７−１ をホストとして用いて順に挿入して、ｐＬＯＩ２３５２ （１２ ｋｂｐ）を作成した。ｐＬＯＩ２３４９から取った、ｃｅｌＺを含有する４．５ ｋｂｐのＥｃｏＲＩ断片を、ＥｃｏＲＩ部位を利用してｐＬＯＩ２２２４に挿入して、ｐＬＯＩ２３５０ （６．４ ｋｂｐ）を作った。ｐＬＯＩ２３４８から取った、ｃｅｌＹを含有する５．５ ｋｂｐ のＡｓｃＩ 断片は、ｐＬＯＩ２３５０のＡｓｃＩ部位に挿入して、ｐＬＯＩ２３５２ （１２ ｋｂｐ）を作った。ｃｅｌ 遺伝子を含有するこれら断片は、サロゲート・プロモータからの発現が互いに異なるような方向になっていた。出来たベクタは、ＤＨ５α又はＭ５Ａ１では機能しないＲ６Ｋ レプリコンを含有していた。ｐＬＯＩ２３５２ には二箇所のＦＲＴ部位があるため、組み込み後にカナマイシン遺伝子及びレプリコンを容易に取り除くことができる （上記のＭａｒｔｉｎｅｚ−Ｍｏｒａｌｅｚ， ｅｔ ａｌ．）。
【０２５９】
Ｋ．オキシトカＰ２染色体内へのｃｅｌＹ及び ｃｅｌＺ の機能的組み込み
プラスミドｐＬＯＩ２３５２をＰ２へ電気穿孔で導入した後、カナマイシン耐性で淘汰を行った。約１５０のコロニーが回収されたが、すべて、エンドグルカナーゼ指示プレートで陽性であった。活性ゾーンの最も大きい１０個のクローンを、精製し、ブロスで成長させ、エンドグルカナーゼ活性について検定した。これらは５乃至６ ＩＵ／ｍｌのエンドグルカナーゼ活性を生産していた。その後の研究に向けてクローンの一つを選択し、ＳＺ１２と指定した。
【０２６０】
Ｋ． オキシトカがアンピシリンに対して持つ天然の耐性があるため、別の抗生物質耐性マーカ（ｔｅｔ）を、選択が容易なようｆｌｐ リコンビナーゼを含有するｐＦＴ−Ａ プラスミドに加えた。テトラサイクリン遺伝子を、１．４ ｋｂｐ のＥｃｏＲＩ から ＡｖａＩ までの断片としてｐＢＲ３２２から単離した。クレノウ・ポリメラーゼで処理後、この断片を、ｐＦＴ−Ａのクレノウ処理済みＣｌａＩ部位に連結して、ｐＬＯＩ２３５３ （７．０ ｋｂｐ）を作成した。このプラスミドは、アンピシリン及びテトラサイクリンの両方に対する耐性、テトラサイクリン・プロモータ制御下のＦＬＰリコンビナーゼ（ｆｌｐ）、及び、温度条件的ｐＳＣ１０１レプリコン、をコードしている。
【０２６１】
プラスミドｐＬＯＩ２３５３をＳＺ１２ に形質転換させて、３０℃でプレートしてテトラサイクリン耐性について淘汰を行った。テトラサイクリンの存在により、ｆｌｐ の発現も誘導された結果、カナマイシン遺伝子及びＲ６Ｋレプリコンが、染色体に組み込まれたｐＬＯＩ２３５３から欠失した。調べた３０７ 個のテトラサイクリン耐性コロニーのうち、９９％ を越えるものにエンドグルカナーゼ遺伝子の発現が残り、カナマイシン感受性であった。クローンを精製し、ブロスで成長させ、エンドグルカナーゼ活性について検定した。すべてが同様であったが、一つをＳＺ２１（ｐＬＯＩ２３５３）と指定した。当該ヘルパー・プラスミドは、ＳＺ２１から、３７℃で一晩成長させることで消失させた。
【０２６２】
ｃｅｌＺ ノックアウト変異の作成
機能的ｃｅｌＹ がＳＺ２１に存在することを確認するために、染色体に組み込まれたｃｅｌＺのノックアウト変異を、プラスミドｐＬＯＩ２３５７ （図１６）を用いた二重相同組換えにより、作成した。プラスミドｐＵＣ１９をＳｍａＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化し、クレノウ・ポリメラーゼで処理し、自己連結させて、ポリリンカー部位の多くを消失させた （ｐＬＯＩ２３５４）。残った ＥｃｏＲＩ 部位を用いて、ｐＬＯＩ２３４９由来のプロモータ及びｃｅｌＺ遺伝子を含有する４．５ｋｂｐのＥｃｏＲＩ 断片を挿入して、ｐＬＯＩ２３５５ （７．２ ｋｂｐ）を作った。次に、アプラマイシン耐性遺伝子（ａａｃ）を含有するｐＨＰΩ４５ａａｃの１．８ ｋｂｐのＳｍａＩ断片をｃｅｌＺの中央領域に連結して、小さな内側のＰｓｔＩ 断片に （Ｔ４ポリメラーゼで平滑末端にした後で）置換して、 ｐＬＯＩ２３５６ （９．０ ｋｂｐ）を作った。このプラスミドの６．３ ｋｂｐ のＥｃｏＲＩ 断片を単離し、コア組み込みベクタ ｐＬＯＩ２２２４に挿入して、ｐＬＯＩ２３５７ （８．２ ｋｂｐ）を作成した。このプラスミドは、アプラマイシン耐性遺伝子を途中に持つｃｅｌＺ遺伝子に加え、条件的Ｒ６Ｋレプリコン及びカナマイシン耐性遺伝子を含有する。
【０２６３】
プラスミドｐＬＯＩ２３５７を、アプラマイシンで淘汰してあるＳＺ２１に電気穿孔で挿入した。この組換え株の約１０％がアプラマイシン耐性であり、カナマイシン感受性であったことから、二重の相同組換え事象があったことが分かる。これらのクローンは低レベルのエンドグルカナーゼ生産を指示プレートで呈した（下の表１５を参照されたい）。一つを選び出し、ＳＺ２２と指定した。ＳＺ２２ではＥＧＺが消失し、ＥＧＹが残っていることを、ファルマシア・ファースト・ゲル・システムを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した。
【０２６４】
多くはＭ５Ａ１及びＰ２である液体培養での細胞集塊が、組み込まれた遺伝子か、又はプラスミドを由来とするｃｅｌＺが機能的に発現したことで消失したことは、興味深い。集塊はｃｅｌＹ単独の機能的発現では影響を受けなかった。
【０２６５】
Ｋ． オキシトカ ＳＺ２１での転写開始
ｃｅｌＹ 及びｃｅｌＺのＳＺ２１におけるプライマ伸長分析は、ＤＨ５αで観察されたものと同様であった。ｃｅｌＺのための主要な転写開始点が一箇所、特定されたが、この開始点は、同じプロモータ断片を含有するＤＨ５α（ｐＬＯＩ２１８３）の最も顕著な開始部位と精確に対応していた （Ｚｈｏｕ， ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｊ． Ｉｎｄｕｓｔ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２２：６００−６０７； Ｚｈｏｕ， ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｂ． Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ６５：２４３９−２４４５）。この部位のすぐ上流のＤＮＡはσ^７０プロモータの認識配列（上記のＷａｎｇ， ｅｔ ａｌ， 及び上記の Ｗｉｓｅ， ｅｔ ａｌ．）と似ている。ＤＨ５α（ｐＬＯＩ２３２３）で観察されたように（図１４を参照されたい）、 ｃｅｌＹ をプライマ伸長分析したところ、複数の推定上の転写開始点がＳＺ２１にあることが示された。ＤＨ５α（ｐＬＯＩ２３２３）の開始部位と同じ領域に局在してはいるが、バンドはすべてほぼ等しい強度のものであった。
【０２６６】
Ｅ．クリサンセミｏｕｔ遺伝子（ｐＣＰＰ２００６）がＫ．オキシトカＰ２の類縁体でＥＧＹ及びＥＧＺの細胞外分泌に及ぼす影響
表７は、エタノール生産性Ｋ．オキシトカＰ２のセルロース分解性類縁体が呈するエンドグルカナーゼ活性を要約したものである。株ＳＺ６ （Ｚｈｏｕ， ｅｔ ａｌ．， （１９９９） Ｊ． Ｉｎｄｕｓｔ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２２：６００−６０７）は、染色体に組み込まれたハイブリッドｃｅｌＺ遺伝子を、ＳＺ２１を作成するのに用いたのと同じプロモータ断片と一緒に含有している。ＳＺ２１には二つのエンドグルカナーゼ遺伝子があるにも係わらず、細胞外及び総エンドグルカナーゼ活性は、この株ではＳＺ６よりも１３％低かった。ＳＺ２１が生ずるエンドグルカナーゼ活性の大半は、ｃｅｌＺに起因するものだとすることができる。ＳＺ２１のｃｅｌＺ変異株である ＳＺ２２の発現したエンドグルカナーゼは、機能的ｃｅｌＹ及びｃｅｌＺ遺伝子を含有する親の生じたものの僅かに１１％であった。機能的ｃｅｌＺを含有する株ＳＺ６ 及びＳＺ２１では、エンドグルカナーゼ活性の大半（主にＥＧＺ）は細胞に結び付いていた。機能的ｃｅｌＹのみを含有する株ＳＺ２２ では、エンドグルカナーゼ活性の半分が細胞外にあった。
【０２６７】
【表１５】

【０２６８】
^ａエンドグルカナーゼ活性は、５％ソルビトールを含有するＬＢで３０℃で２４時間成長させた培養株を用いて測定した。
^ｂ発酵実験（表４）で用いた最も高いスペザイム^（Ｒ）レベルと同等の希釈
【０２６９】
ｏｕｔ 遺伝子 （ｐＣＰＰ２００６）を、ｃｅｌＺを持つ組換えＥ． コリ及びＫ． オキシトカ Ｍ５Ａ１ に加えると、ｃｅｌＺ の機能的発現と、細胞外ミリューに分泌されるＥＧＺの割合を、劇的に増加させることができる。（Ｚｈｏｕ， ｅｔ ａｌ．， （１９９９） Ｊ． Ｉｎｄｕｓｔ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２２：６００−６０７； Ｚｈｏｕ， ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｂ． Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ６５：２４３９−２４４５）。これらの同じ効果が、ｃｅｌＺ 及びｃｅｌＹを含有するエタノール生産性Ｋ． オキシトカ ＳＺ２１で観察された（図１４を参照されたい）。ｏｕｔ 遺伝子をＳＺ２２ （不活性のｃｅｌＺ） に加えても、ｃｅｌＹ の機能的発現にも、ＥＧＹ分泌の程度にも、何ら影響はなかった。このｃｅｌＺ 変異株 ＳＺ２２ （ｐＣＰＰ２００６）は、機能的ｃｅｌＹ 及び ｃｅｌＺ 遺伝子を含有するＳＺ２１ （ｐＣＰＰ２００６） の生ずる総エンドグルカナーゼ活性（ＥＧＹ）の僅かに３％を生産した。ｏｕｔ遺伝子を持つＳＺ２１の生産した分泌型エンドグルカナーゼは、ＳＺ６ （ＥＧＺ） 及びＳＺ２２ （ＥＧＹ）で同じ各プロモータから発現する個々の活性の合計よりも実質的に高く、これら二つの酵素の相乗作用に合致した。この検定では、相乗効果は、ＳＺ２１（ｐＣＰＰ２００６）が生産する細胞外酵素を組み合わせた場合、個々の活性（ＳＺ６（ｐＣＰＰ２００６） 及びＳＺ２２（ｐＣＰＰ２００６））の計算上の合計の１．４倍であると推定される。
【０２７０】
セルロースからエタノールへの発酵中の組換えＥ．クリサンセミエンドグルカナーゼ（ＥＧＺ及びＥＧＹ）と真菌セルラーゼ（スペザイムＣＥ^（Ｒ））との間の相乗効果
ＳＳＦテストを、フラスコで、ｐＨをコントロールせずに行って、真菌セルラーゼ（スペザイム^（Ｒ））と生体触媒が生産するセルラーゼ酵素とが組み合わされたときに、高結晶質の基質であるシグマセル５０^（Ｒ）からのエタノール生産に及ぼされる影響を、評価した。結果を下の表１６に示す。
【０２７１】
【表１６】

【０２７２】
^{ａ ）}セルロース（１００ｇ／リットル）又はスペザイム^{（ Ｒ）}を加えなかった培養株は０．２２±０．０１ｇ／リットルのエタノールを生産した。スペザイム^（Ｒ）は、約１００ＦＰＵ／ｍｌを含んでいた。５ｍｌ及び１０ｍｌのスペザイム^（Ｒ）の添加は、それぞれ５ＦＰＵ／ｇ及び１０ＦＰＵ／ｇのセルロースに相当する。
^ｂ）スチューデントｔ検定は、各スペザイム^（Ｒ）希釈液で、各Ｐ２コントロールに比較して、エタノール生産に有意な違いがあることを示している。Ｐ値≦０．００１を二つのアスタリスクで示す。Ｐ値≦０．０５を一つのアスタリスクで示す。
【０２７３】
スペザイム_{（Ｒ ）}の不在下でもすべての株で大変低レベルのエタノール生産があったが、機能的ｃｅｌＺ遺伝子を含有する株ＳＺ６（ｐＣＰＰ２００６） 及びＳＺ２１（ｐＣＰＰ２００６） は、機能的ｃｅｌＹ遺伝子のみを含有する株ＳＺ２２（ｐＣＰＰ２００６）や、エンドグルカナーゼ遺伝子のない株Ｐ２（ｐＣＰＰ２００６） よりも、高いレベルのエタノール （ｐ≦０．０５）を生産した。スペザイム^（Ｒ）及びシグマセル５０^（Ｒ）の両方がない状態では、すべての株が０．２２ ｇ／Ｌのエタノールを生産した。シグマセル５０ とのインキュベーション中に、ＳＺ６（ｐＣＰＰ２００６） 及び ＳＺ２１（ｐＣＰＰ２００６）が生産するエタノール量の増分は、基質のうち小さな割合の非晶質セルロースがＥＧＺにより加水分解されていくためとされている （Ｚｈｏｕ， ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｊ． ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２２：６００−６０７； Ｚｈｏｕ， ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｂ． Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ６５：２４３９−２４４５； Ｚｈｏｕ， Ｓ．， ｅｔ ａｌ． （２０００） Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １８２：５６７６−５６８２）。非晶質セルロースがＥＧＹで消化されて生ずる糖は、輸送されてその後の加水分解を受けずに代謝されるには大きすぎるのである （Ｚｈｏｕ， Ｓ．， ｅｔ ａｌ． （２０００） Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １８２：５６７６−５６８２）。
【０２７４】
スペザイムＣＥ^（Ｒ）及びスペザイムＣＰ^（Ｒ）は、エンドグルカナーゼ、エキソグルカナーゼ、及びセロビアーゼ活性を、商業的に至適化した組合せを含有している（Ｂｅｇｕｉｎ， ｅｔ ａｌ． （１９９４） ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｒｅｖ． １３：２５−５８； Ｂｏｙｅｒ， ｅｔ ａｌ． （１９８７） Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １６２：３１１−３１６； Ｎｉｅｖｅｓ， ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｗｏｒｌｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：３１０−３１４； Ｏｈｍｉｙａ， ｅｔ ａｌ．　（１９９７） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇ． Ｒｅｖ． １４：３６５−４１４）。この至適化にも係わらず、エンドグルカナーゼ生産性生体触媒のうちの二つ、ＳＺ２１（ｐＣＰＰ２００６） 及びＳＺ２２（ｐＣＰＰ２００６）を用いて、スペザイム^（Ｒ）を補った発酵を行うと、エンドグルカナーゼ遺伝子のないコントロールＰ２（ｐＣＰＰ２００６）よりも有意に高いレベルのエタノールが生産された。スペザイム^（Ｒ）及びＳＺ２１（ｐＣＰＰ２００６）及びＳＺ２２（ｐＣＰＰ２００６）の組合せは、エタノール生産という点では相乗的であり、それぞれ個別で生産するエタノールの合計量よりも最高で２０％高くなる（ｐ≦０．０５）。相乗効果はスペザイムＣＥ^（Ｒ）の希釈液及びスペザイムＣＰ^（Ｒ）の希釈液の両方で観察された。この相乗効果は主にＥＧＹに起因するとすることができる。なぜなら、これはＳＺ２２（ｐＣＰＰ２００６）が生産する唯一のエンドグルカナーゼだからである。ＥＧＺのみを生産するＳＺ６（ｐＣＰＰ２００６） では相乗効果は見られなかった。
【０２７５】
実施例５
補助的なセルラーゼを補わずに行う、組換えクレブシエラ−オキシトカＳＺ２１による非晶質セルロースのエタノールへの同時糖化発酵
この実施例では、エタノール生産のためにジモモナス−モビリス由来の染色体組み込み遺伝子（ｐｄｃ、ａｄｈＢ）と、エルウィニア−クリサンセミ由来のエンドグルカナーゼ遺伝子（ｃｅｌＹ、ｃｅｌＺ）とを含有するクレブシエラ−オキシトカＭ５Ａ１類縁体が、発酵中に２０，０００Ｕ／Ｌを越えるエンドグルカナーゼ活性を生産することを実証する。具体的には、この株が、他の生物由来のセルラーゼ酵素を加えることなく、セロビオース及びセロトリオースを代謝するその本来の能力と組み合わせて、非晶質セルロースをエタノールに（理論的収量は５８乃至７６％）発酵させることを実証する。
【０２７６】
この実施例全体を通じて、他に明示しない限り、以下の材料及び方法を用いる。
【０２７７】
材料及び方法
細菌、プラスミド及び培養条件
クレブシエラ−オキシトカ Ｍ５Ａ１の４種類のエタノール生産性類縁体をこの研究で用いた。株Ｐ２は、エタノール生産のために、染色体に組み込まれたＺ．モビリス由来ｐｄｃ 及びａｄｈＢ 遺伝子を含有している （Ｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ．， （１９９２） Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ５８： ２１０３−２１１０）。この株は、Ｅ．クリサンセミ由来の高度に発現する、染色体に組み込まれたエンドグルカナーゼ遺伝子を含有する三種の株にとって親生物であった（Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ． （２００１） Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ６７： ６−１４）。株ＳＺ６、ＳＺ２２、及びＳＺ２１は、ｃｅｌＺ のみ、ｃｅｌＹ のみ、並びにｃｅｌＹ 及び ｃｅｌＺの両方、をそれぞれ含有する。更なる遺伝子（約 １５ のｏｕｔ 遺伝子）が、エンドグルカナーゼＣｅｌＺを効率的に分泌させるのに必要であり（Ｈｅ ｅｔ ａｌ． （１９９１） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８８：１０７９−１０８３； Ｐｕｇｓｌｅｙ ｅｔ ａｌ．， （１９９７） Ｇｅｎｅ １９２： １３−１９）、プラスミドｐＣＰＰ２００６に提供させた。一貫性のために、このプラスミドはすべての株に挿入してあった。組換えＫ． オキシトカ 株は、糖質を含有するルリアブロス （１リットル当たり：１０ ｇ 酵母抽出物、５ ｇ トリプトン、５ ｇ ＮａＣｌ）で成長させた。 スペクチノマイシン（１００ ｍｇ／Ｌ）を、プラスミドｐＣＰＰ２００６を維持するために含めた。種培養液（５％ グルコース、１２乃至１６時間）及び発酵液を、３５℃（１２０ｒｐｍ）でインキュベートし、２２番の針で換気した。
【０２７８】
エンドグルカナーゼ活性の検定
総エンドグルカナーゼ活性（Ｃｅｌ Ｙ及びＣｅｌＺ） を、還元糖の調査中に干渉が起きるのを抑えるために５％のソルビトールを含有するルリア・ブロスで２４時間、成長させた培養株について調べた（Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ． （２０００） Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １８２： ５６７６−５６８２）。細胞のブロス懸濁液を超音波で簡単に処理して、結合した酵素を解離させた。カルボキシメチルセルロースを基質（２％）として用いて５０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．２）中で３５℃で希釈液を検定した。加熱（１０分間、１００℃）して反応を停止させた。活性は、グルコースを標準として用いて、１分間当たりの還元糖（Ｕ）μモルで表した。
【０２７９】
セロビオシドの薄層クロマトグラフィ（ＴＬＣ）分析
セロビオシドをワットマンＬＫ５シリカゲルプレート（Ｃａｔ． Ｎｏ． ４８５５−６２０）を用いて分離した。プレートを溶媒（６部のクロロホルム、７部の酢酸、及び１部の水）中で展開させ、空気乾燥し、二回目も同じ溶媒中で展開させた。６．５ ｍＭ Ｎ−（１−ナフチル）エチレンジアミンジヒドロクロリドを噴霧し、１００℃まで１０分間加熱することで、糖を視覚化した（上記のＺｈｏｕ ｅｔ ａｌ． ）。
【０２８０】
微結晶セルロースからのセロビオシドの調製
Ｐｅｒｅｉｒａ ｅｔ ａｌ． （１９８８）の方法に基づいてセルロースをセロビオシドに転化させた。シグマセル・タイプ５０セルロース（１００ ｇ； Ｃａｔ． Ｎｏ． Ｓ−５５０４）を、４００ ｇ の７２％ Ｈ_２ＳＯ_４（ｗ／ｗ）にゆっくり加え、攪拌しながら２２℃で１８時間、加水分解させた。消化後のスラリを２．５ Ｌの低温のエタノール （１００％）にゆっくり加えて沈降させ、遠心分離し、ペレットを２回、１ Ｌの低温のエタノールで洗浄した。このペレットを１００ ｍｌ のＨ_２Ｏに溶解させ、ｐＨ ６に調節し、５０００ ｘ ｇ で２０分間遠心して、不溶性の繊維を取り除いた。セロビオシドを含有する上清を乾燥し、分析した。
【０２８１】
セロビオシドのＨＰＬＣ分析
屈折率監視装置及びデジタル積分装置を取り付けたウォーターズＨＰＬＣを用いてセロビオシドを解析した。分離は、６５℃で、バイオラドＨＰＸ−４２Ａカラムを用い、移動相には蒸留水（０．６ｍｌ／分）を用いて 行った。
【０２８２】
セロビオシドの発酵
最初の発酵は、シグマ・ケミカル・カンパニーから購入したセロビオシド（Ｃａｔ． Ｎｏ． Ｃ− ８０７１）を用いた。種培養株（１１２．５μＬ） は、典型的には、３７．５μＬの４％セロビオシドに、１．５−ｍｌ マイクロ遠心管内で配合し、３６時間（３５℃及び１２０ｒｐｍ）インキュベートした。試料（それぞれ５０μＬ；０時間、１０時間、及び３６時間）を加熱（１００℃、１０分間）して、酵素を失活させ、遠心分離（１０，０００×ｇ、５分間）して細胞片を取り除いた。次に、上清（４μＬ）を分析用にＴＬＣプレート上にスポットした。
【０２８３】
小規模発酵 （５０−ｍｌ フラスコ、５ ｍｌ ブロス容量）を、同様な態様で、硫酸加水分解で調製したセロビオシドの研究室試料を用いて行った。セロビオシド（７グルコシル残基未満の糖について合計６ ｇ／Ｌ ）をルリア・ブロスに入れて濾過滅菌した。フラスコに、種培養物（乾燥重量で０．３３ｇ／Ｌ）から採ったペレット状細胞（５，０００×ｇ、１０分間）を播種して、種培地中のグルコースから生じたエタノールを消失させた。試料を最初に取り出し、次に２４時間間隔で取り出して、ガス・クロマトグラフィでエタノールの存在を調べた（Ｂｅａｌｌ ｅｔ ａｌ． （１９９１） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ． ３８： ２９６−３０３）。
【０２８４】
非晶質セルロースの調製
ウッド（１９８８）の解説した方法の改良法により、リン酸膨潤セルロースを調製した。約２０ ｇ のアビセル （Ｃａｔ． Ｎｏ． ＰＨ１０５、フルカ・ケミカ社製）を５００ ｍｌ ８５％ Ｈ_３ＰＯ_４にゆっくり加え、室温で一晩攪拌し、４Ｌの氷温の水に注ぎ入れ、攪拌せずに３０分間かけて沈殿させた。上側の液層をデカントした後、４ Ｌの低温の水を加え、完全に混合し、水で５回、１％ ＮａＨＣＯ_３で１回、そして水でさらに５回、繰り返した（最終ｐＨ ６−７）。このセルロース懸濁液を遠心分離 （５０００ ｘ ｇ、２０分間） で濃縮し、発酵の基質として用いた。この粘性の懸濁液は、結晶性及び非晶質の混合したセルロースを含有していた。
【０２８５】
このリン酸膨潤セルロース中に存在する非晶質セルロースの割合を、ＣｅｌＹ及びＣｅｌＺエンドグルカナーゼで繰り返し消化して推定した。ＳＺ２１（ｐＣＰＰ２００６） の２４時間培養株を簡単に音波破砕し、遠心分離 （５，０００ ｘ ｇ、１０分間）し、上清をエンドグルカナーゼの源（〜２０Ｕ／ｍｌ）として用いた。約１ ｇの粘性の酸膨潤セルロースを、それぞれ、６本の予め重さを量ってある試験管に量り入れた。２本をコントロール（酵素なし）とし、乾燥させて、最初の乾燥重量及び含水量を決定した。エンドグルカナーゼ（９ ｍｌ） を４本の試験管に加え、これらを３５℃で１２時間、インキュベートした。クロロホルム（２滴）を各試験管に加えて、微生物の成長を遅らせた。遠心分離（５，０００ ｘ ｇ、２０分間）した後、この工程を、新しい酵素標品を用いて繰り返し、合計６回、７２時間にわたって連続的に処理した。試験管を様々な時点で取り出し、遠心分離し、蒸留水で１回洗浄して、可溶性の生成物及び塩類を取り除き、一定の重量になるまで７０℃で乾燥させた。非晶質セルロースは、エンドグルカナーゼ消化で出来る乾燥物質の減少分として計算した。
【０２８６】
非晶質セルロースの発酵
酸膨潤セルロース（４０ｇ、非滅菌）を、ルリア・ブロスの５ ｍｌ の１０倍濃縮液及び５ ｍｌ の種培養株（細胞乾燥重量０．３３ ｍｇ／Ｌ）に、１２５−ｍｌ フラスコで配合した。スペクチノマイシン （１００μｇ／ｍｌ） 及びクロラムフェニコール（４０μｇ／ｍｌ） の両方を加えてコンタミをなくした。この粘性の混合液を、まずアプリケータ・スティックで混合してから、３５℃でインキュベートした。最初の粘性が高いために、フラスコは最初の２時間、２００ｒｐｍで混合し、次に１２０ｒｐｍで混合した。ガス・クロマトグラフィでエタノールを測定した （Ｂｅａｌｌ ｅｔ ａｌ． （１９９１） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｅｎｇ． ３８：２９６−３０３）。
【０２８７】
粘性
酸膨潤セルロース標品の粘性を、垂直方向の１０−ｍｌガラス製ピペットを流れる時間を計って ２２℃で推定した。グリセロール溶液を標準として用いた。２秒乃至７５秒の流下時間が発酵ブロスで観察され、それぞれ１乃至１，３００センチポイズの粘性に相当した。
【０２８８】
結果
Ｋ．オキシトカのエタノール生産性類縁体が生産するエンドグルカナーゼ活性の比較
Ｅ．クリサンセミを由来とするエンドグルカナーゼ遺伝子を含有するエタノール生産性株は、グルコース発酵中、かなりなレベルの活性を生産した。最も高い活性は、ｃｅｌＺ 及びｃｅｌＹ， の両方を含有する 株ＳＺ２１（ｐＣＰＰ２００６） が生産した、２９．３±１．６ Ｕ／培養液１ｍｌ当たり、であった。ｃｅｌＺ のみを含有する株ＳＺ６（ｐＣＰＰ２００６）は、２２．５±１．７ Ｕ／ｍｌ を生産し、そしてｃｅｌＹ を含有する株ＳＺ２２（ｐＣＰＰ２００６） （株ＳＺ２１のｃｅｌＺ 欠失株） は、１．０±０．１ Ｕ／ｍｌを生産した。活性の約 ６０％ がそれぞれの株で分泌され、その残りは細胞に結び付いていたが、軽く音波破砕することで容易に解離した。親株Ｐ２（ｐＣＰＰ２００６）ではエンドグルカナーゼ活性は検出されなかった。
【０２８９】
セロビオシドの分析
薄層クロマトグラフィ及びＨＰＬＣでセロビオシドの存在を分析した。シグマ・ケミカル・カンパニー社の標品及び我々の研究室で調製したものは同様であった。両方の薄層クロマトグラム（図１７、パネルＡ及びＢ）のレーン１は、発酵の開始時点のシグマ製品の分離例を示している。少量のグルコース及びセロビオースが存在し、セロトリオース及びセロヘキサオースは中程度の量であり、セロテトラオース及びセロペンタオースの量はそれより多かった。しかし最も輝度の強い領域は依然、原点にあった。この領域は、６残基よりも大きいセロビオシドと、特徴付けの済んでいない他の化合物を含んでいる。
【０２９０】
ＨＰＬＣ分析は薄層クロマトグラムと一致した。シグマ社製品は３％ のグルコース、３％ のセロビオース、１３％ のセロトリオース、２５％ のセロテトラオース、２２％ のセロペンタオース、及び ９％ のセロヘキサオースを含んでいた。ピーク面積に基づくと、糖類の約２５％が６残基よりも長かった。我々の研究室で調製したセロビオシドは、７％のグルコース、６％ のセロビオース、１０％ のセロトリオース、１５％ のセロテトラオース、１２％ のセロペンタオース、１９％ のセロヘキサオース、及び３０％ の６グルコシル残基より長い糖類、を含有していた。
【０２９１】
セロビオシドの発酵
図１７は、エンドグルカナーゼＣｅｌＹ及びＣｅｌＺの両方を分泌する類縁体である株Ｐ２（ｐＣＰＰ２００６） 及びＳＺ２１（ｐＣＰＰ２００６）によるセロビオシド（シグマ・ケミカル・カンパニー社製）の発酵を比較した薄層クロマトグラムを示す。グルコース、セロビオース、及びセロトリオースの株Ｐ２による資化が確認されたが、特に、３６時間後に明かである。しかし、この株は長いセロビオシド類は代謝できなかった。対照的に、株ＳＺ２１は分離されたセロビオシドの実質的にすべてと、原点にある物質の一部とを、分解及び代謝した。１０時間後には、ＳＺ２１発酵液中のセロビオース及びセロトリオースのレベルは、最初に存在した量の数倍高いことに注目することが重要である。この増加は、分泌されたＣｅｌＹ及びＣｅｌＺによる長いセロビオシド類の加水分解が原因であるとした。
【０２９２】
さらに分泌されたエンドグルカナーゼの有効性を、研究室のセロビオシドからのエタノール生産中に調べた（表１７）。基質濃度が低いために、低レベルのエタノールが生産されただけであったが、ＣｅｌＺ エンドグルカナーゼの利点は明確である。親Ｐ２（ｐＣＰＰ２００６） 及び株ＳＺ２２（ｐＣＰＰ２００６； ＣｅｌＹ のみ）の生産したエタノールは、ＣｅｌＺを分泌した二種の株：　ＳＺ６（ｐＣＰＰ２００６； ＣｅｌＺ のみ） 及びＳＺ２１（ｐＣＰＰ２００６； ＣｅｌＹ 及びＣｅｌＺ）の半分であった。エンドグルカナーゼＣｅｌＹは、セロビオシドを基質として利用すると何の利益もなく、長鎖の基質を必要とすることと、合致した。
【０２９３】
７個未満のグルコシル残基を含有するセロビオシドに基づいて、エタノール収量を推定した（表１７）。エンドグルカナーゼＣｅｌＺを生産する二種の株について、平均６２％の理論収量が見られた。以前には、より高い収量（９０％を越える）が、１００ ｇ／Ｌ のセロビオースを株Ｐ２ で発酵中（Ｗｏｏｄ ＆ Ｉｎｇｒａｍ １９９２）に測定されている。セロビオシドが低濃度のときに観察される収量が低い原因は、部分的には、蒸発による消失分と、炭素の大部分が細胞成長の方に流用されることだと思われる。
【０２９４】
リン酸膨潤セルロースの非晶質セルロース含有量
酸膨潤セルロースは、セルロースのリボン同士の間の水素結合が長いために、酸の除去及び保管の間に部分的に再結晶化する。Ｅ．クリサンセミＣｅｌＹ及びＣｅｌＺは非晶質セルロース及びカルボキシメチルセルロースを加水分解するが、結晶質のセルロースは加水分解することができない。結晶質セルロースのエンドグルカナーゼ加水分解に対するこのような耐性を利用して、非晶質のままの洗浄後の酸膨潤セルロースの割合を、不溶性の物質の（乾燥重量）消失分として推定した。非晶質セルロースの試料を、新鮮なエンドグルカナーゼ標品（￣２０Ｕ／ｍｌ）と一緒に繰り返しインキュベートした。 最初の１２時間の処理後、乾燥重量の２８％が可溶化した。四回の連続処理後、４３％が可溶化し、二回の最後の処理では一定に留まった。この４３％という値が、非晶質状態で留まるセルロースの割合の推定値を表す。非晶質セルロースの実際の割合は、もう少し低いであろう。なぜなら、推定値には、遠心分離及び洗浄中に起きるであろう結晶質セルロースの消失分が含まれているからである。
【０２９５】
非晶質セルロースの発酵
エンドグルカナーゼの高レベルの機能的発現が起きれば、Ｋ．オキシトカＰ２の二種の類縁体で非晶質セルロースをエタノールに直接転化させるには充分である（表１７；図１８）。三種類の濃度の非晶質セルロースをテストしたが、同様の結果が得られた。
【０２９６】
最も高いレベルは、ＣｅｌＹ及びＣｅｌＺエンドグルカナーゼの組合せを分泌する株Ｚ２１（ｐＣＰＰ２００６） が生産した。低いレベルのエタノールを生産したのはＣｅｌＺのみを分泌する株ＳＺ６（ｐＣＰＰ２００６） であった。親株Ｐ２（ｐＣＰＰ２００６；エンドグルカナーゼなし）及びＣｅｌＹのみを分泌した株ＳＺ２２（ｐＣＰＰ２００６） の種培地中の残留グルコースからは少量のエタノールが生じた。ＣｅｌＹ 及びＣｅｌＺ を組み合わせたときの効果は、ＣｅｌＹ単独の効果がないにも係わらず、エタノール生産及びエタノール収量については相乗的なようである。株ＳＺ２１（ｐＣＰＰ２００６； 両酵素） のエタノール収量は、理論上最大値の５８％乃至７６％の範囲であった。エタノール生産に対するこの相乗効果は、基質特異性の違いを原因とする加水分解の向上の結果起きたのであろう。
【０２９７】
非晶質セルロースの発酵中の粘性変化
エンドグルカナーゼ分泌株による非晶質セルロースの発酵中に、大きな粘性変化が観察された（図１８）。粘性の最も大きな低下は、ＳＺ６（ｐＣＰＰ２００６； ＣｅｌＺ のみ） 及びＳＺ２１（ｐＣＰＰ２００６； ＣｅｌＹ 及びＣｅｌＺ）をインキュベートする最初の２時間に見られ、純粋なグリセロールの粘性に近い粘性から、水に近い粘性に低下した。それより小さな変化は、ＳＺ２２（ｐＣＰＰ２００６； ＣｅｌＹ のみ）で観察され、コントロールとして役立てた親株Ｐ２（ｐＣＰＰ２００６） では変化は見られなかった。粘性の変化は基本的には１２時間後に終了した。
【０２９８】
実験４の発酵の終了時に、粘性の差を表１７（図１８、パネルＣ）に定量した。これらは三段階の大きさで異なっていた。最も高い最終的な粘性は、エンドグルカナーゼを生産しないＰ２（ｐＣＰＰ２００６）で観察され、１，３００センチポイズであった。ＳＺ２２（ｐＣＰＰ２００６） で発酵中は、エンドグルカナーゼＣｅｌＹ のみによる加水分解の結果、粘性は半分に低下した（５００センチポイズ）。発酵終了時、ＣｅｌＺを分泌する両方の株のブロスの粘性は、水のそれと基本的に同等になり、ＳＺ２１（ｐＣＰＰ２００６； ＣｅｌＹ及びＣｅｌＺ）は１センチポイズとなり、ＳＺ６（ｐＣＰＰ２００６； ＣｅｌＺ のみ）は２センチポイズとなった。明らかに、ＣｅｌＺ単独はＣｅｌＹ単独よりも効果的であった。両酵素はエタノールの生産中（表１７；図１８）及び糖化中は相乗的に機能するのだが、発酵終了時（９６時間）で比較すると、その後の利点はＣｅｌＺと組み合わせたＣｅｌＹの生産に起因するものとはされなかった。
【０２９９】
要約すると、Ｋ． オキシトカ株ＳＺ２１などを用いたこれらの結果は、セロビオシド及び非晶質セルロースを、補助的な酵素を加えずにエタノールに直接生物変換するのに充分なセルラーゼ酵素を生産する、という目標に向けた進歩を示している。この株が生産するエンドグルカナーゼレベルは、エタノール発酵中の酵母及び他の細菌の操作された株についてこれまで報告されたものの１０倍を越えるレベルである （Ｂｒｅｓｔｉｃ−Ｇｏａｃｈｅｔ ｅｔ ａｌ． １９８９， Ｃｈｏ ｅｔ ａｌ． １９９９， Ｃｈｏ ＆ Ｙｏｏ １９９９， Ｍｉｓａｗａ ｅｔ ａｌ． １９８８， Ｓｕ ｅｔ ａｌ． １９９３， Ｖａｎ Ｒｅｎｓｂｕｒｇ ｅｔ ａｌ． １９９６， １９９８）。さらに、株ＳＺ２１が生産するエンドグルカナーゼのレベルは、．市販のセルラーゼ濃縮物に存在するエンドグルカナーゼ活性の１％にほぼ等しい（Ｎｉｅｖｅｓ ｅｔ ａｌ． １９９８， Ｔｏｍｍｅ ｅｔ ａｌ． １９９５， Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ． １９９７）。
【０３００】
非晶質セルロースの加水分解における株ＳＺ２１の有効性は、二種のエンドグルカナーゼ酵素Ｅ．クリサンセミの組合せの所産であり、相乗的に働く（Ｇｕｉｓｅｐｐｉ ｅｔ ａｌ． １９９１， Ｚｈｏｕ ＆ Ｉｎｇｒａｍ ２０００）。さらに、これらの分泌酵素は、セロビオース及びセロトリオースの効率的な取り込み及び代謝を提供するＫ．オキシトカのホスホトランスフェラーゼ系で働く（Ｗｏｏｄ ＆ Ｉｎｇｒａｍ １９９２， Ｌａｉ ｅｔ ａｌ． １９９７）。
【０３０１】
【表１７】

【０３０２】
^ａセロビオシド発酵用の播種材料を遠心分離で回収して、エタノール源としての種ブロスを消失させた。平均１．８５ ｇ／Ｌ のエタノールが、非晶質セルロースの三種類の発酵液を播種するのに用いた種ブロスの残留糖から生産された。
^ｂ＊＊数値が、Ｅ．クリサンセミエンドグルカナーゼをコードする遺伝子のないコントロール株（Ｐ２）のそれとは有意に異なることを示している （ｐ＜０．００１）。
^ｃ収量は、セロビオース１グラム当たり推定０．５４ｇのエタノール、そして非晶質セルロース１グラム当たり推定０．５６ｇのエタノールという、理論上最大値のパーセンテージで計算されている。非晶質セルロースについては、収量は、播種材料中の糖から生じたエタノールを減算後に計算した。
^ｄセロビオシド（ｇ／Ｌ）は、グルコースと、６個以下のグルコシル残基を含有するセロビオシドとの合計を表す。
^ｅ実験２及び３の偏差の最高係数は、平均値の４．５％であった。同様の偏差係数（測定された値の５％）に基づいて、実験３についても有意差を推定した。
【０３０３】
同等物
当業者であれば、慣例的な実験を利用するのみで、ここに解説した本発明の特定の実施例の同等物を数多く認識され、又は確認できることであろう。このような同等物は以下の請求の範囲の包含するところと意図されている。さらに、いかなる数の米国特許第 ５，８２１，０９３号； 第５，４８２，８４６号； 第５，４２４，２０２号； 第５，０２８，５３９号； 第５，０００，０００号； 第５，４８７，９８９号， 第５，５５４，５２０号及び第 ５，１６２，５１６号が解説する遺伝子コンストラクト、ホスト細胞、及び方法を、本発明の実施に当たって利用してもよく、これらを言及をもってここに編入することとする。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、希酸で予備処理し、二種の異なる培地を補ったコメ外皮基質を用いたエタノール生産性組換えホストＥ．コリＫＯ１１の発酵率を示す。
【図２】図２は、混合廃棄事務用紙を用いた、エタノール生産性組換えホスト株Ｋ．オキシトカＰ２の同時糖化発酵（ＳＳＦ）率を示す。ＳＳＦで出た不溶性の残渣は、セルラーゼ酵素及び基質が結合した供給源として次の発酵時でリサイクルした。
【図３】図３は、低コピー数のプロモータプローブベクタであるプラスミドｐＬＯＩ２１７１の構造を示し、選択のためのカナマイシン耐性遺伝子（ｋａｎ）、プラスミドのエピソーム維持のための温度感受性ｐＳＣ１０１レプリコン（Ｒｅｐ（ｔｓ））、及び、ホスホ−ベータ−グルコシダーゼ（ＥＧＺ）をコードする、プロモータのないポリサッカラーゼ遺伝子ｃｅｌＺ、の方向を示す。
【図４】図４は、形質転換した細菌コロニで測定したＣＭＣ指示プレート上の浄化領域の大きさ（ｘ軸）と、発現したグルカナーゼ活性量（ｙ軸）との間の高い対応を示すグラフである。
【図５】図５は、ｐＬＯＩ２１８３プラスミド内でサロゲート・プロモータとして機能するＺ．モビリスＤＮＡ断片の部分的なヌクレオチド配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）を示す。その完全な配列は、ジェンバンク受託番号ＡＦ１０９２４２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）を付与されている。二つの転写開始部位（＃）、−３５及び−１０領域、シャイン−ダルガルノ部位（太字）、ベクタ及びｃｅｌＺの部分的な配列（小文字）、及びｃｅｌＺ開始コドン（太字で示したａｔｇ）を示してある。
【図６】図６は、僅かなレベル（ｐＵＣ１９；パネルＡ）、中程度のレベル（ｐＬＯＩ２１６４；パネルＢ）及び高レベル（ｐＬＯＩ２３０７；パネルＣ）のグルカナーゼを発現している様々なプラスミドを、外側の細胞壁と内側の膜（ｉｍ）との間に位置したペリプラスム封入体（ｐｉｂ）の形で持つＥ．コリＤＨ５α細胞の電子顕微鏡写真である。図示の棒は０．１μｍを表す。
【図７】図７は、組換えホストのゲノムに導入させ、そのホストに安定なグルカナーゼ発現活性をもたらすことのできる遺伝子作成物であるｃｅｌＺ組み込みベクタｐＬＯＩ２３０６を作成するのに用いるクローニング戦略の概略詳細図である。
【図８】図８は、Ｚ．モビリス由来のサロゲート・プロモータ、Ｅ．クリサンセミ由来のｃｅｌＺ遺伝子、耐性マーカ（ｂｌａ及びｔｅｔ）及びＫ．オキシトカ標的配列の位置を示した、ｃｅｌＺ組み込みベクタｐＬＯＩ２３０６（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）の概略図である。
【図９】図９は、ＥＧＹ及びＥＧＺの相乗作用の図解である。両酵素をＣＭＡａｓｅ活性が等しく（１．５ＩＵ／ｍｌ）なるまで希釈し、計算上の相乗作用を括弧内に示した。パネルＡは、酵素の比率が相乗作用に及ぼす作用を示したグラフである。個々の酵素の寄与度に基づき、予想上の活性が一定（１．５ＩＵ／ｍｌ）になるようにしながら、様々な量のＥＧＹ及びＥＧＺを組み合わせた。検定はＣＭＣと一緒に１時間、３５℃でインキュベートし、沸騰させて反応を停止させた。Ｘ軸上の数字は、ＥＧＺ及びＥＧＹ間の比率を示す。相乗作用を各棒線の上方に示す。パネルＢは、単独及び組み合わせたとき（９部ＥＧＺ ＋ １部ＥＧＹ）のＥＧＺ及びＥＧＹによるＣＭＣの加水分解を示したグラフである。検定はすべて、個々のＥＧＹ活性及びＥＧＺ活性の合計に基づき、同等の総活性 （０．１５ ＩＵ／ｍｌ）を含んでいた。相乗作用を、両酵素の組合せについて各点上方に示す。パネルＣは、単独及び組み合わせたときのＥＧＺ及びＥＧＹによる酸膨潤セルロースの加水分解を示したグラフである。組合せの酵素反応については、ＥＧＺ 対ＥＧＹ を９対１の比で用いた。検定はすべて、個々のＥＧＹ及びＥＧＺ活性の合計に基づいて１．５ ＩＵ／ｍｌを含んでいた。相乗作用を、両酵素の組合せについて各点上方に示す。
【図１０】図１０は、酸膨潤セルロース及びアビセル^（Ｒ）という二種の複合糖からの加水分解生成物の薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）分析を示す。約１．５ ＩＵ 及び２５ ＩＵ のＣＭＣａｓｅ をそれぞれ酸膨潤セルロース及びアビセル^（Ｒ）の反応に用いた。Ｙ軸の略字は；Ｇ１はグルコース；Ｇ２はセロビオース；Ｇ３はセロトリオース；Ｇ４はセロテトラオース；及びＧ５はセロペンタオースを表す。レーンでは、Ｓは混合セロオリゴ糖の標準；Ｃは酵素なしのコントロール；ＺはＥＧＺ；ＹはＥＧＹ、そして Ｚ ＋ Ｙは ＥＧＺ ＋ ＥＧＹを表す。パネルＡは酸膨潤セルロースをＣＭＣａｓｅ（１μｌ添加量）と一緒に６時間インキュベートした結果を示す。パネルＢは、酸膨潤セルロースをＣＭＣａｓｅ（２μｌ添加量）と一緒に６時間インキュベートした結果を示す。パネルＣは、アビセル^（Ｒ）を ＣＭＣａｓｅ （１０μｌの添加量）と一緒に４８時間インキュベートした結果を示す。
【図１１】図１１は、ＥＧＺ及びＥＧＹによるセロオリゴ糖の加水分解を示したＴＬＣ分析を示す。各テストは、１ｍｌ当たり約０．０７ ＩＵ の ＣＭＣａｓｅ　（２時間のインキュベーション、３５℃）を含んでいた。略字は；Ｓは混合セロオリゴ糖の標準；Ｇ１はグルコース；Ｇ２はセロビオース；Ｇ３はセロトリオース；Ｇ４はセロテトラオース；及びＧ５はセロペンタオースを表す。パネルＡは、加水分解前の基質を示し、パネルＢはＥＧＹと一緒にインキュベートした後の基質を示し、パネルＣはＥＧＺと一緒にインキュベートした後の基質を示し、そしてパネルＤは、様々な時間（０、５、１０、及び２５）のインキュベーション後のセロペンタオースのＥＧＺ加水分解を示す。
【図１２】図１２は、Ｅ．クリサンセミによる非晶質セルロースの資化を示すモデルである。三種類のグルコシダーゼを、非晶質セルロースの異化に用いる。これらのうちの二つ、即ちＥＧＹ及びＥＧＺは、共に相乗的に働く細胞外エンドグルカナーゼである。ＥＧＹ は大型の基質分子を要し、これらをより短い不溶性のフラグメントに加水分解する。ＥＧＹ は可溶性のセロオリゴ糖（２乃至５グルコシル残基）を加水分解しない。ＥＧＺは可溶性のセロオリゴ糖 （セロペンタオース及びセロテトラオース）及び中間の長さの非晶質フラグメントを簡単に加水分解して、セロビオース及びセロトリオースを生成する。セロビオース及びセロトリオースは、ホスホエノールピルビン酸依存的ホスホトランスフェラーゼ系による細胞取り込みの際にリン酸化する。加水分解は、第三の酵素であるホスホ−β−グルコシダーゼにより細胞内で完了する。その結果生ずる単量体の生成物（グルコース及びグルコース−６−リン酸）は、解糖により代謝される。
【図１３】図１３は、ｃｅｌＹのためのプロモータ−プローブ・ベクタの構築の概略図である。Ｚ．モビリス染色体ＤＮＡのＳａｕ３ＡＩ 断片をｐＬＯＩ２３１７のＢａｍＨＩ 部位に連結して、ｃｅｌＹ コーディング領域（太線部分）のための強力なサロゲート・プロモータを作った。Ｚ．モビリスＤＮＡ断片（プロモータ１及びプロモータ２）を、白抜き部分として示す。レプリコン及び抗生物質耐性遺伝子を点彩した。他のベクタＤＮＡは、細い接続線で示す。矢印は転写の方向を表す。
【図１４】図１４は、ＤＨ５α（ｐＬＯＩ２３２３）における転写開始部位とｃｅｌＹプロモータの推定プロモータ領域を示す。
【図１５】図１５は、ｃｅｌＹ及びｃｅｌＺをエタノール生産性Ｋ．オキシトカＰ２の染色体に機能的に組み込むためのｐＬＯＩ２３５２の構築の概略図を示す。ｃｅｌＹ 及び ｃｅｌＺのコーディング領域を太線部分で示す。プロモータとして働くＺ．モビリスＤＮＡ断片（ｐｒｏｍ１及びｐｒｏｍ２）を白抜き部分で示す。レプリコン及び抗生物質耐性遺伝子を点彩した。他のベクタＤＮＡは、細い接続線で示す。各部分の上の矢印は転写の方向を表す。小さな白抜きの矢印は、ｆｌｐリコンビナーゼが認識するＦＲＴ部位を表す。ＦＲＴ配列は非対称であり、染色体組み込み後にプラスミドＤＮＡ（レプリコン及び選択マーカ）の欠失が可能なよう、配置されている。
【図１６】図１６は、二重相同組換えによりｃｅｌＺを不活化させるためのｐＬＯＩ２３５７の構築の概略図である。ｃｅｌＹ のコーディング領域を太線部分で示す。プロモータとして働くＺ．モビリスＤＮＡ断片（ｐｒｏｍ１）を、白抜き部分として示す。レプリコン及び抗生物質耐性遺伝子を点彩した。他のベクタＤＮＡは、細い接続線で示す。各部分の上の矢印は転写の方向を表す。小さな白抜きの矢印は、ｆｌｐリコンビナーゼが認識するＦＲＴ部位を表す。
【図１７】図１７は、セロビオシドの資化を示す、発酵ブロスの薄層クロマトグラムのデジタル画像を示す。左側パネル（Ａ）は、Ｅ．クリサンセミエンドグルカナーゼを欠く親株である株Ｐ２（ｐＣＰＰ２００６）を表し、右側パネル（Ｂ）は、高レベルのＣｅｌＹ及びＣｅｌＺエンドグルカナーゼを分泌する組換え株である株ＳＺ２１（ｐＣＰＰ２００６）を表す。約４μＬのブロスを、各レーンにスポットし、Ｇ１乃至 Ｇ６というラベルは、隣のスポットのグルコシル残基の数を表す。両パネル（Ａ及びＢ）のレーンは、左から右に向かって、：１は当初（０時間目）；２は発酵から１０時間後；そして３は３６時間後、を表す。
【図１８】図１８は、Ｋ．オキシトカＭ５Ａ１のエタノール生産性類縁体による非晶質セルロースからのエタノール生産量のグラフを示す。 上側及び中央のパネル（Ａ及びＢ）に示した結果には、三回の重複測定から採った標準偏差が含まれる。下側のパネル（Ｃ）に示した結果は、一回の発酵を表す。上側のパネル（Ａ）は、 ６．８５ ｇ／Ｌ の非晶質セルロースの発酵結果を示し、中央のパネル（Ｂ）は、１５．３３ ｇ／Ｌ の非晶質セルロースの発酵結果を示し、下側のパネル（Ｃ）は、２８．９６ ｇ／Ｌの非晶質セルロースの発酵結果を示す。株Ｐ２（ｐＣＰＰ２００６）は、親株であり、Ｅ．クリサンセミエンドグルカナーゼ遺伝子はない。株ＳＺ６（ｐＣＰＰ２００６）はＣｅｌＺエンドグルカナーゼを分泌し、株ＳＺ２１（ｐＣＰＰ２００６） はＣｅｌＹ及びＣｅｌＺエンドグルカナーゼを分泌し、株ＳＺ２２（ｐＣＰＰ２００６）はＣｅｌＹエンドグルカナーゼを分泌する。
【配列表】

Claims (110)

1. 第一分解活性を有する第一エンドグルカナーゼと、
   第二分解活性を有する第二エンドグルカナーゼと
   を含んで成り、
   ただし前記第一及び第二エンドグルカナーゼによるオリゴ糖分解が相乗するような比で、前記第一及び第二分解活性が存在する、
   オリゴ糖を分解する組成物。
2. 前記第一エンドグルカナーゼ又は前記第二エンドグルカナーゼ、あるいは前記第一及び第二エンドグルカナーゼの両者、が細胞抽出物から得られる、請求項１に記載の組成物。
3. 前記細胞抽出物が、細菌細胞から得られる、請求項２に記載の組成物。
4. 前記細菌細胞が、前記第一エンドグルカナーゼ又は前記第二エンドグルカナーゼ、あるいは前記第一及び第二エンドグルカナーゼの両者、を発現するよう組換え操作されている、請求項３に記載の組成物。
5. 前記細菌細胞がエンテロバクテリアセエ科（原語：Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）から選択される、請求項４に記載の組成物。
6. 前記細菌細胞がエシェリヒア（原語：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）又はクレブシエラ（原語：Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）である、請求項５に記載の組成物。
7. 前記細胞抽出物が、ｃｅｌＺ にコードされた第一エンドグルカナーゼと、ｃｅｌＹにコードされた第二エンドグルカナーゼとを含んで成り、ただしこのときｃｅｌＺ 及びｃｅｌＹ はエルウィニア（原語：Ｅｒｗｉｎｉａ）由来である、請求項３に記載の組成物。
8. 前記第一エンドグルカナーゼがＥＧＺであり、前記第二エンドグルカナーゼがＥＧＹである、請求項１に記載の組成物。
9. 前記比が、約９：１乃至約１９：１の範囲内である、請求項７に記載の組成物。
10. 前記第一エンドグルカナーゼ又は前記第二エンドグルカナーゼ、あるいは前記第一及び第二エンドグルカナーゼの両者が、精製されている、請求項１に記載の組成物。
11. 前記分解が、約１．１乃至約２．０の範囲の因数で相乗される、請求項１に記載の組成物。
12. 前記因数が約１．８である、請求項１１に記載の組成物。
13. 付加的な酵素をさらに含んで成る、請求項１に記載の組成物。
14. 前記付加的な酵素が、エンドグルカナーゼ、エキソグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、β−グルコシダーゼ、エンド−１，４−β−キシラナーゼ、α−キシロシダーゼ、α−グルクロニダーゼ、α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ、アセチルエステラーゼ、アセチルキシランエステラーゼ、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、プルラナーゼ、β−グルカナーゼ、ヘミセルラーゼ、アラビノシダーゼ、マンナナーゼ、ペクチンヒドロラーゼ、ペクチン酸リアーゼ、又はこれらの組み合わせ、からなる群より選択される、請求項１３に記載の組成物。
15. 前記グルカナーゼが真菌を由来とする、請求項１４に記載の組成物。
16. 前記真菌がＴ．ロンギブランキアタム（原語：Ｔ． ｌｏｎｇｉｂｒａｎｃｈｉａｔｕｍ）である、請求項１５に記載の組成物。
17. 前記付加的な酵素がエタノール生成性酵素である、請求項１３に記載の組成物。
18. 前記エタノール生成性酵素が、ピルビン酸デカルボキシラーゼ及びアルコールデヒドロゲナーゼからなる群より選択される、請求項１７に記載の組成物。
19. 前記第一エンドグルカナーゼ及び前記第二エンドグルカナーゼが、別々にパッケージされている、請求項１に記載の組成物。
20. 前記組成物が同時糖化発酵に用いられる、請求項１に記載の組成物。
21. 前記オリゴ糖がセロオリゴ糖、リグノセルロース、ヘミセルロース、セルロース、ペクチン、及びこれらの何らかの組み合わせからなる群より選択される、請求項１に記載の組成物。
22. オリゴ糖を、第一分解活性を有する第一エンドグルカナーゼと、第二分解活性を有する第二エンドグルカナーゼとに接触させるステップを含み、このとき前記第一及び第二エンドグルカナーゼによるオリゴ糖分解が相乗するような比で、前記第一及び第二分解活性が存在する、
    オリゴ糖を分解する方法。
23. 前記オリゴ糖を前記第一エンドグルカナーゼ及び前記第二エンドグルカナーゼに接触させる前記ステップが、何らかの順序で、又は同時に行われる、請求項２２に記載の方法。
24. 前記第一エンドグルカナーゼ又は前記第二エンドグルカナーゼ、あるいは前記第一及び第二エンドグルカナーゼの両者、が細胞抽出物から得られる、請求項２２に記載の方法。
25. 前記細胞抽出物が、細菌細胞から得られる、請求項２４に記載の方法。
26. 前記細菌細胞が、前記第一エンドグルカナーゼ又は前記第二エンドグルカナーゼ、あるいは前記第一及び第二エンドグルカナーゼの両者、を発現するよう組換え操作されている、請求項２５に記載の方法。
27. 前記細菌細胞がエンテロバクテリアセエ科から選択される、請求項２５に記載の方法。
28. 前記細菌細胞がエシェリヒア又はクレブシエラである、請求項２７に記載の方法。
29. 前記細菌細胞抽出物が、ｃｅｌＺ にコードされた第一エンドグルカナーゼと、ｃｅｌＹにコードされた第二エンドグルカナーゼとを含んで成り、ただしこのときｃｅｌＺ 及びｃｅｌＹ はエルウィニア由来である、請求項２５に記載の方法。
30. 前記第一エンドグルカナーゼがＥＧＺであり、前記第二エンドグルカナーゼがＥＧＹである、請求項２２に記載の方法。
31. 前記比が、約９：１乃至約１９：１の範囲内である、請求項３０に記載の方法。
32. 前記第一エンドグルカナーゼ又は前記第二エンドグルカナーゼ、あるいは前記第一及び第二エンドグルカナーゼの両者が、精製されている、請求項２２に記載の方法。
33. 前記分解が、約１．１乃至約２．０の範囲の因数で相乗される、請求項２２に記載の方法。
34. 前記因数が約１．８である、請求項３３に記載の方法。
35. 前記オリゴ糖を付加的な酵素に接触させるステップをさらに含む、請求項２２に記載の方法。
36. 前記付加的な酵素が、エンドグルカナーゼ、エキソグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、β−グルコシダーゼ、エンド−１，４−β−キシラナーゼ、α−キシロシダーゼ、α−グルクロニダーゼ、α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ、アセチルエステラーゼ、アセチルキシランエステラーゼ、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、プルラナーゼ、β−グルカナーゼ、ヘミセルラーゼ、アラビノシダーゼ、マンナナーゼ、ペクチンヒドロラーゼ、ペクチン酸リアーゼ、又はこれらの組み合わせ、からなる群より選択されるグルカナーゼである、請求項３５に記載の方法。
37. 前記グルカナーゼが真菌を由来とする、請求項３６に記載の方法。
38. 前記真菌がＴ．ロンギブランキアタムである、請求項３７に記載の方法。
39. 前記付加的な酵素がエタノール生成性酵素である、請求項３５に記載の方法。
40. 前記エタノール生成性酵素が、ピルビン酸デカルボキシラーゼ及びアルコールデヒドロゲナーゼからなる群より選択される、請求項３９に記載の方法。
41. 前記方法が同時糖化発酵に用いられる、請求項２２に記載の方法。
42. 前記オリゴ糖がセロオリゴ糖、リグノセルロース、ヘミセルロース、セルロース、ペクチン、及びこれらの何らかの組み合わせからなる群より選択される、請求項２２に記載の方法。
43. 前記方法が水溶液中で行われる、請求項２２に記載の方法。
44. オリゴ糖を分解するのに適した組換えホスト細胞であって、
    第一分解活性を有する第一エンドグルカナーゼをコードする第一異種ポリヌクレオチドセグメントを、サロゲート・プロモータの転写制御下に、そして
    第二分解活性を有する第二エンドグルカナーゼをコードする第二異種ポリヌクレオチドセグメントを、サロゲート・プロモータの転写制御下に、含んで成り、
    ただしこのとき前記第一及び第二エンドグルカナーゼによる前記オリゴ糖の分解が相乗するような比で、前記第一及び第二分解活性が存在するように、前記第一エンドグルカナーゼ及び第二エンドグルカナーゼが発現される、
    組換えホスト細胞。
45. 前記第一エンドグルカナーゼ又は前記第二エンドグルカナーゼ、あるいは、前記第一及び第二エンドグルカナーゼの両者、が分泌される、請求項４４に記載の組換えホスト細胞。
46. 前記ホスト細胞が細菌細胞である、請求項４４に記載の組換えホスト細胞。
47. 前記ホスト細胞が、エンテロバクテリアセエ科から選択される、請求項４６に記載の組換えホスト細胞。
48. 前記ホストがエシェリヒア又はクレブシエラである、請求項４７に記載の組換えホスト細胞。
49. 前記ホスト細胞が、Ｅ．コリＢ、Ｅ．コリＤＨ５α、及びクレブシエラ−オキシトカからなる群より選択される、請求項４８に記載の組換えホスト細胞。
50. 付加的な酵素をさらに含んで成る、請求項４４に記載の組換えホスト細胞。
51. 前記付加的な酵素が、グルカナーゼ、エンドグルカナーゼ、エキソグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、β−グルコシダーゼ、エンド−１，４−β−キシラナーゼ、α−キシロシダーゼ、α−グルクロニダーゼ、α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ、アセチルエステラーゼ、アセチルキシランエステラーゼ、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、プルラナーゼ、β−グルカナーゼ、ヘミセルラーゼ、アラビノシダーゼ、マンナナーゼ、ペクチンヒドロラーゼ、ペクチン酸リアーゼ、又はこれらの組み合わせ、からなる群より選択される、請求項４８に記載の組換えホスト細胞。
52. 前記付加的な酵素がエタノール生成性酵素である、請求項５０に記載の組換えホスト細胞。
53. 前記酵素が、ピルビン酸デカルボキシラーゼ及びアルコールデヒドロゲナーゼからなる群より選択されるエタノール生成性酵素である、請求項５０に記載の組換えホスト細胞。
54. 前記第一エンドグルカナーゼがｃｅｌＺ にコードされており、そして前記第二エンドグルカナーゼがｃｅｌＹにコードされており、ただしこのときｃｅｌＺ 及びｃｅｌＹ はエルウィニア由来である、請求項５０に記載の組換えホスト細胞。
55. 前記第一エンドグルカナーゼがＥＧＺであり、そして前記第二エンドグルカナーゼがＥＧＹである、請求項４４に記載の組換えホスト細胞。
56. 前記の付加的な酵素が分泌性酵素である、請求項５０に記載の組換えホスト細胞。
57. 前記分泌性酵素がｐｕｌ又はｏｕｔ遺伝子産物である、請求項５６に記載の組換えホスト細胞。
58. 前記ホスト細胞がエタノール生産性である、請求項４４に記載の組換えホスト細胞。
59. 前記ホスト細胞が、Ｅ．コリ ＫＯ４ （ＡＴＣＣ ５５１２３）、Ｅ． コリＫＯ１１ （ＡＴＣＣ ５５１２４）、Ｅ． コリＫＯ１２ （ＡＴＣＣ ５５１２５）及び Ｅ． コリＬＹ０１ （ＡＴＣＣ １１３０３）、及びＫ． オキシトカ Ｐ２ （ＡＴＣＣ ５５３０７）を含んで成る群より選択される、請求項５８に記載の組換えホスト細胞。
60. 第一分解活性を有する第一エンドグルカナーゼをコードする第一異種ポリヌクレオチドセグメントを、サロゲート・プロモータの転写制御下に、そして
    第二分解活性を有する第二エンドグルカナーゼをコードする一配列を含んで成る第二異種ポリヌクレオチドセグメントを、サロゲート・プロモータの転写制御下に、
    含んで成るホスト細胞に、オリゴヌクレオチドを接触させるステップ
    を含む、オリゴ糖の分解を促進する方法であって、
    ただしこのとき前記第一及び第二エンドグルカナーゼによる前記オリゴ糖の分解が相乗し、ひいては促進されるような比で、前記第一及び第二分解活性が存在するよう、前記第一エンドグルカナーゼ及び前記第二エンドグルカナーゼが発現される、
    方法。
61. 前記第一エンドグルカナーゼ又は前記第二エンドグルカナーゼ、あるいは前記第一及び第二エンドグルカナーゼの両者が、分泌される、請求項６０に記載の方法。
62. 前記ホスト細胞がエタノール生産性である、請求項６０に記載の方法。
63. 前記方法が水溶液中で行われる、請求項６０に記載の方法。
64. 前記方法が同時糖化発酵に用いられる、請求項６０に記載の方法。
65. 前記オリゴ糖が、セロオリゴ糖、リグノセルロース、ヘミセルロース、セルロース、ペクチン、及びこれらの何らかの組み合わせ、からなる群より選択される、請求項６０に記載の方法。
66. 第一分解活性を有する第一エンドグルカナーゼをコードする第一異種ポリヌクレオチドセグメントを、サロゲート・プロモータの転写制御下に来るよう、及び；
    第二分解活性を有する第二エンドグルカナーゼをコードする一配列を含んで成る第二異種ポリヌクレオチドセグメントを、サロゲート・プロモータの転写制御下に来るよう、
    ホスト細胞に導入するステップを含む、オリゴ糖を分解するのに適した組換えホスト細胞を作製する方法であって、
    ただしこのとき前記第一及び第二エンドグルカナーゼによる前記オリゴ糖の分解が相乗するような比で、前記第一及び第二分解活性が存在するよう、前記第一及び第二エンドグルカナーゼが発現される、
    方法。
67. 前記第一エンドグルカナーゼ又は第二エンドグルカナーゼ、あるいは、前記第一及び第二エンドグルカナーゼの両者、が分泌される、請求項６５に記載の方法。
68. 前記ホスト細胞がエタノール生産性である、請求項６６に記載の方法。
69. 前記第一エンドグルカナーゼがｃｅｌＺにコードされており、そして前記第二エンドグルカナーゼがｃｅｌＹにコードされており、ただしこのとき ｃｅｌＺ及びｃｅｌＹがエルウィニアを由来とする、請求項６６に記載の方法。
70. 前記第一異種ポリヌクレオチドセグメント又は前記第二異種ポリヌクレオチドセグメント、あるいは、前記第一及び第二ポリヌクレオチドセグメントの両者、の前記サロゲート・プロモータが、ジモモナス−モビリス（原語：Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ）を由来とするポリヌクレオチド断片を含んで成る、請求項６６に記載の方法。
71. 前記組換えホスト細胞が、同時糖化発酵に適する、請求項６８に記載の方法。
72. 前記ホスト細胞がエタノール生産性である、請求項７０又は７１に記載の方法。
73. ｐＬＯＩ２３５２ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １７）のポリヌクレオチド配列を含んで成るベクタをホスト細胞に導入するステップと、
    前記ベクタが安定に組み込まれたホスト細胞を特定するステップと
    を含んで成る、組換えホスト細胞組込み体を作製する方法。
74. ｐＬＯＩ２３０６ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １２） のポリヌクレオチド配列を含んで成るベクタをホスト細胞に導入するステップと、
    エンドグルカナーゼを発現しているホスト細胞を同定するステップと
    を含んで成る、ホスト細胞でエンドグルカナーゼを発現させる方法。
75. 第一分解活性を有する第一エンドグルカナーゼをコードする第一異種ポリヌクレオチドセグメントをサロゲート・プロモータの転写制御下に、及び
    第二分解活性を有する第二エンドグルカナーゼをコードする第二異種ポリヌクレオチドセグメントをサロゲート・プロモータの転写制御下に
    含んで成るエタノール生産性ホスト細胞に、オリゴ糖源を接触させるステップを含む、オリゴ糖源からエタノールを生成する方法であって、
    ただし前記第一及び第二エンドグルカナーゼによる前記オリゴ糖の分解が相乗する結果、オリゴ糖が分解され、発酵してエタノールになるような比で、前記第一及び第二分解活性が存在するよう、前記第一及び第二エンドグルカナーゼが発現される、
    方法。
76. 前記第一エンドグルカナーゼがｃｅｌＺにコードされており、そして前記第二エンドグルカナーゼがｃｅｌＹ 遺伝子にコードされており、ただしこのときｃｅｌＺ 及びｃｅｌＹ がエルウィニアを由来とする、請求項７５に記載の方法。
77. 前記ホスト細胞が少なくとも一つのｐｕｌ遺伝子又はｏｕｔ遺伝子をコードする異種ポリヌクレオチドセグメントをさらに含んで成る、請求項７５に記載の方法。
78. 前記ホスト細胞が、エンテロバクテリアセエ科から選択される、請求項７５に記載の方法。
79. 前記ホスト細胞がエシェリヒア又はクレブシエラである、請求項７５に記載の方法。
80. 前記ホスト細胞が、Ｅ． コリＫＯ４ （ＡＴＣＣ ５５１２３）、Ｅ． コリＫＯ１１ （ＡＴＣＣ ５５１２４）、Ｅ． コリＫＯ１２ （ＡＴＣＣ ５５１２５）、及びＫ． オキシトカ Ｐ２ （ＡＴＣＣ ５５３０７）からなる群より選択される、請求項７９に記載の方法。
81. 前記方法が水溶液中で行われる、請求項７５に記載の方法。
82. 前記オリゴ糖が、セロオリゴ糖、リグノセルロース、ヘミセルロース、セルロース、ペクチン、及びこれらの何らかの組み合わせ、からなる群より選択される、請求項７５に記載の方法。
83. 前記異種ポリヌクレオチドセグメントが、ｐＬＯＩ ２３５２ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １７）であるか、又は、ｐＬＯＩ ２３５２ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １７）を由来とする、請求項７５に記載の方法。
84. 前記第一エンドグルカナーゼがＥＧＺであり、そして前記第二エンドグルカナーゼがＥＧＹである、請求項７５に記載の方法。
85. 前記第一ポリヌクレオチドセグメント又は第二ポリヌクレオチドセグメント、あるいは、前記第一及び第二ポリヌクレオチドセグメントの両者、の前記サロゲート・プロモータが、ジモモナス−モビリスを由来とするポリヌクレオチド断片を含んで成る、請求項７５に記載の方法。
86. ｐＬＯＩ２３１１、ｐＬＯＩ１６２０、ｐＬＯＩ２３１６、ｐＬＯＩ２３１７、ｐＬＯＩ２３１８、ｐＬＯＩ２３１９、ｐＬＯＩ２３２０、ｐＬＯＩ２３２３、ｐＬＯＩ２３４２、ｐＬＯＩ２３４８、ｐＬＯＩ２３４９、ｐＬＯＩ２３５０、ｐＬＯＩ２３５２、ｐＬＯＩ２３５３、ｐＬＯＩ２３５４、ｐＬＯＩ２３５５、ｐＬＯＩ２３５６、ｐＬＯＩ２３５７、ｐＬＯＩ２３５８、及びｐＬＯＩ２３５９からなる群より選択されるプラスミドのポリヌクレオチド配列又はその断片を含んで成るベクタ。
87. ｐＬＯＩ２３１１、ｐＬＯＩ１６２０、ｐＬＯＩ２３１６、ｐＬＯＩ２３１７、ｐＬＯＩ２３１８、ｐＬＯＩ２３１９、ｐＬＯＩ２３２０、ｐＬＯＩ２３２３、ｐＬＯＩ２３４２、ｐＬＯＩ２３４８、ｐＬＯＩ２３４９、ｐＬＯＩ２３５０、ｐＬＯＩ２３５２、ｐＬＯＩ２３５３、ｐＬＯＩ２３５４、ｐＬＯＩ２３５５、ｐＬＯＩ２３５６、ｐＬＯＩ２３５７、ｐＬＯＩ２３５８、及びｐＬＯＩ２３５９からなる群より選択されるプラスミドのポリヌクレオチド配列又はその断片を有するベクタを含んで成るホスト細胞。
88. 前記ホストがクレブシエラ−オキシトカ株Ｐ２ （ｐＣＰＰ２００６）、クレブシエラオキシトカ株ＳＺ６ （ｐＣＰＰ２００６）、クレブシエラ−オキシトカ株ＳＺ２１ （ｐＣＰＰ２００６）、及びクレブシエラ−オキシトカ株ＳＺ２２ （ｐＣＰＰ２００６）を含んで成る群より選択される、請求項８７に記載のホスト細胞。
89. 第一分解活性を有する第一エンドグルカナーゼを得るステップと、
    第二分解活性を有する第二エンドグルカナーゼを得るステップと、
    前記第一及び第二エンドグルカナーゼにオリゴ糖を接触させるステップと
    を含む、オリゴ糖を分解する方法であって、
    ただし前記第一及び第二分解活性が、前記第一及び第二エンドグルカナーゼによる前記オリゴ糖の分解が相乗するような比で存在する、
    方法。
90. 第一分解活性を有する第一エンドグルカナーゼと、第二分解活性を有する第二エンドグルカナーゼとに、オリゴ糖を接触させるステップ
    を含む、オリゴ糖の分解を促進する方法であって、
    ただし前記第一及び第二分解活性が、前記第一及び第二エンドグルカナーゼによる前記オリゴ糖分解が相乗して促進されるような比で存在する、
    方法。
91. オリゴ糖の前記分解に、粘性の変化が伴う、請求項８９又は９０に記載の方法。
92. 前記変化が低下である、請求項９１に記載の方法。
93. 前記変化が、少なくとも、５センチポアズ、１０センチポアズ、２０センチポアズ、５０センチポアズ、１００センチポアズ、５００センチポアズ、及び１０００センチポアズからなる群より選択される量の粘性低下である、請求項９１に記載の方法。
94. 前記オリゴ糖がセルロースである、請求項９１に記載の方法。
95. 前記セルロースが、紙、パルプ及び植物繊維からなる群より選択される原料を由来とする、請求項９４に記載の方法。
96. 第一分解活性を有する第一エンドグルカナーゼを得るステップと、
    第二分解活性を有する第二エンドグルカナーゼを得るステップと、
    前記第一及び第二エンドグルカナーゼにオリゴ糖を接触させるステップと
    を含む、オリゴ糖を分解する方法であって、
    ただし前記第一及び第二分解活性が、前記第一及び第二エンドグルカナーゼによる前記オリゴ糖の分解の結果、粘性変化が起きるような比で存在する、
    方法。
97. 第一エンドグルカナーゼをコードする第一異種ポリヌクレオチドセグメントと、
    第二エンドグルカナーゼをコードする第二異種ポリヌクレオチドセグメントと、
    を含んで成る、オリゴ糖を分解するのに適した組換えホスト細胞。
98. 第一エンドグルカナーゼをコードする第一異種ポリヌクレオチドセグメントと、
    第二エンドグルカナーゼをコードする第二異種ポリヌクレオチドセグメントと、
    を含んで成る、オリゴ糖の粘性を低下させるのに適した組換えホスト細胞。
99. 前記第一異種ポリヌクレオチドセグメントがサロゲート・プロモータの転写制御下にあり、前記第二異種ポリヌクレオチドセグメントがサロゲート・プロモータの転写制御下にある、請求項９７又は９８に記載の組換えホスト細胞。
100. 前記細胞が細菌細胞である、請求項９７又は９８に記載の組換えホスト細胞。
101. 前記細菌細胞がエンテロバクテリアセエ科から選択される、請求項１００に記載の組換えホスト細胞。
102. 前記細菌細胞がエシェリヒア 又はクレブシエラである、請求項１０１に記載の組換えホスト細胞。
103. 前記第一エンドグルカナーゼが ｃｅｌＺ にコードされており、第二エンドグルカナーゼがｃｅｌＹにコードされており、ただしこのときｃｅｌＺ 及びｃｅｌＹ がエルウィニアを由来とする、請求項１００に記載の組換えホスト細胞。
104. 前記第一エンドグルカナーゼがＥＧＺであり、そして前記第二エンドグルカナーゼがＥＧＹである、請求項９７に記載の組換えホスト細胞。
105. 請求項９７に記載のホスト細胞を由来とする酵素抽出物。
106. アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションの寄託番号ＡＴＣＣ　　　　の寄託株を代表とするクレブシエラ−オキシトカ株Ｐ２（ｐＣＰＰ２００６）の組換えホスト株。
107. アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションの寄託番号ＡＴＣＣ　　　　の寄託株を代表とするクレブシエラ−オキシトカ株ＳＺ６（ｐＣＰＰ２００６）の組換えホスト株。
108. アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションの寄託番号ＡＴＣＣ　　　　の寄託株を代表とするクレブシエラ−オキシトカ株ＳＺ２１（ｐＣＰＰ２００６）の組換えホスト株。
109. アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションの寄託番号ＡＴＣＣ　　　　の寄託株を代表とするクレブシエラ−オキシトカ株ＳＺ２２（ｐＣＰＰ２００６）の組換えホスト株。
110. 第一エンドグルカナーゼをコードする第一異種ポリヌクレオチドセグメントと、
     第二エンドグルカナーゼをコードする第二異種ポリヌクレオチドセグメントと、
     を含んで成る組換え細胞であって、ただしこのとき第一エンドグルカナーゼをコードする前記第一ポリヌクレオチドセグメント又は第二エンドグルカナーゼをコードする前記第二ポリヌクレオチドセグメント、あるいは第一エンドグルカナーゼをコードする前記第一ポリヌクレオチドセグメント及び第二エンドグルカナーゼをコードする前記第二ポリヌクレオチドセグメントの両者、が、エルウィニア由来のｃｅｌＹ又はｃｅｌＺのいずれかの遺伝子産物にアミノ酸アライメントしたときに充分相同であるために多糖を分解できる機能的活性を共有している、組換え細胞。

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