JP5745404B2

JP5745404B2 - ２種類の異なる微生物に由来するエンドグルカナーゼを含んでなるセルラーゼ調製物

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Publication number: JP5745404B2
Application number: JP2011520982A
Authority: JP
Inventors: 岡倉　薫; 薫岡倉; 弘一郎村島
Original assignee: Meiji Seika Kaisha Ltd
Current assignee: Meiji Seika Kaisha Ltd
Priority date: 2009-07-03
Filing date: 2010-07-01
Publication date: 2015-07-08
Anticipated expiration: 2030-07-01
Also published as: WO2011002063A8; US20120100578A1; CA2766025A1; ES2553223T3; EP2450438A1; CN102471764B; JPWO2011002063A1; EP2450438B1; WO2011002063A1; CN102471764A; DK2450438T3; US9181537B2; BRPI1016260A2; EP2450438A4; EP2450438A9

Description

本発明は、２種類の異なる微生物に由来するエンドグルカナーゼを含んでなるセルラーゼ調製物、該セルラーゼ調製物の製造法、並びに該セルラーゼ調製物の用途に関する。

従来から、セルロース含有繊維を、その繊維に所望の特性を与えるためにセルラーゼで処理することが行われている。例えば、繊維業界においては、セルロース含有繊維の肌触り及び外観を改善するために、又は着色されたセルロース含有繊維にその色の局所的な変化を提供する「ストーンウォッシュ」の外観を与えるために、セルラーゼによる処理が行われてきた（特許文献１）。

従来、この様な用途に用いられるセルラーゼは、糸状菌などのセルラーゼ産生菌が産生するセルラーゼ複合物から、セルロース含有繊維に対して高活性を示す成分を単離することにより探索されてきた。その結果、ＧＨファミリー５、ＧＨファミリー１２、およびＧＨファミリー４５に分類されるエンドグルカナーゼが、主にセルロース含有繊維に高活性を示すセルラーゼとして単離された。例えば、ＧＨファミリー５に分類されるエンドグルカナーゼとしては、トリコデルマ・ビリデ（Trichoderma viride）に由来するＳＣＥ３（特許文献２）が、ＧＨファミリー１２に分類されるエンドグルカナーゼとしては、ペニシリウム・ピノフィラム（Penicillium pinophilum）に由来されるＰＰＣＥ（特許文献３）が、また、ＧＨファミリー４５に分類されるエンドグルカナーゼとしては、スタフィロトリカム・ココスポラム（Staphylotrichum cocosporum）に由来されるＳＴＣＥ（特許文献４）などが、知られている。

これらセルラーゼを商業的に製造する場合、当該セルラーゼをコードする遺伝子を糸状菌などの微生物に導入して得られる形質転換体を培養し、組換え酵素として大量に発現させることにより実施されるのが一般的である。この場合、調製されたセルラーゼ調製物のセルロース含有繊維に対する活性は、大量に発現させた組換えセルラーゼの活性に依存する。同様に、セルラーゼ調製物のｐＨ特性も大量に発現させた組換えセルラーゼの性質に依存する。例えば、ＳＣＥ３の場合、その至適ｐＨが弱酸性であり（特許文献２）、またＰＰＣＥの場合、その至適ｐＨが酸性である（特許文献３）。よって、それぞれを組換え酵素として大量発現させて得られるセルラーゼ調製物もＳＣＥ３およびＰＰＣＥと同様のｐＨ特性を示す。

これまで、セルラーゼ調製物の活性の向上や性質の改変を行うために、主として、所望の性質を示す新規セルラーゼの探索やタンパク質工学的手法による既存セルラーゼの改変が試みられてきた。しかしながら、既存セルラーゼよりも飛躍的に優れた活性を示すセルラーゼを得るためには、まず、新規の微生物を単離しなくてはならず、それ自体が容易ではない。さらに、その微生物等が所望の性質を持つセルラーゼを産生する可能性は低い。また、タンパク質工学的手法により既知のセルラーゼに変異を導入したとしても、その性質を飛躍的に改変することは難しかった。これらの問題から、従来、高い活性と優れたｐＨ特性を兼ね備えたセルラーゼ調製物が得られていないのが現状である。

欧州特許第３０７５６４号公報国際公開第９８／５４３３２号パンフレット国際公開第２００８／１１１６１３号パンフレット国際公開第２００５／０５４４７５号パンフレット

本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、高い活性を有し、かつ、優れたｐＨ特性を有するセルラーゼ調製物を提供することにある。さらなる本発明の目的は、このようなセルラーゼ調製物を簡便に生産する方法を提供することにある。

本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、２種類の異なる糸状菌に由来するエンドグルカナーゼを一定割合以上ずつ含んでなるセルラーゼ調製物を生産することにより、それぞれのエンドグルカナーゼを単独で発現させて得たセルラーゼ調製物と比較して、驚くべき高いセルロース含有繊維に対する活性が得られることを見出した。特に、トリコデルマ・ビリデ（Trichoderma viride）に由来するＳＣＥ３（ＧＨファミリー５に分類）とペニシリウム・ピノフィラムに由来するＰＰＣＥ（ＧＨファミリー１２に分類）とからなる組み合わせ、あるいは、ペニシリウム・ピノフィラム（Penicillium pinophilum）に由来するＰＰＣＥとスタフィロトリカム・ココスポラム（Staphylotrichum cocosporum）に由来するＳＴＣＥ（ＧＨファミリー４５に分類）とからなる組み合わせを、主要なセルラーゼとして、セルラーゼ調製物に含有させることにより、セルロース含有繊維に対する活性が顕著に増加した。また、このようにして得られたセルラーゼ調製物のｐＨ特性は、それぞれのエンドグルカナーゼを単独で発現させて得たセルラーゼ調製物と比較して広範なプロファイルを示し、２種類のエンドグルカナーゼを組み合わせることにより、セルラーゼ調製物のｐＨ特性を改変できることが判明した。さらに、本発明者は、この様なセルラーゼ調製物の生産において、２種類の異なる微生物に由来するエンドグルカナーゼをコードするＤＮＡを同一の宿主細胞に導入して発現させることにより、それぞれのエンドグルカナーゼを単独で宿主細胞に導入して発現させた場合と比較して、分泌タンパク質に占める組換えエンドグルカナーゼの割合が向上し、高活性の培養上清が得られることを見出した。

すなわち本発明は、２種類の異なる微生物に由来するエンドグルカナーゼを含んでなるセルラーゼ調製物、該セルラーゼ調製物の製造法、並びに該セルラーゼ調製物の用途に関し、より具体的には、
（１）２種の異なる微生物に由来するエンドグルカナーゼを含んでなるセルラーゼ調製物、
（２）エンドグルカナーゼが２種の異なる糸状菌に由来する、（１）に記載のセルラーゼ調製物、
（３）２種の異なる微生物に由来するエンドグルカナーゼがともに組み換えタンパク質である、（１）に記載のセルラーゼ調製物、
（４）主要な２種のエンドグルカナーゼのそれぞれが、全セルラーゼの少なくとも１０重量％含まれている（１）から（３）のいずれかに記載のセルラーゼ調製物、
（５）主要な２種のエンドグルカナーゼのそれぞれが、全セルラーゼの少なくとも２０重量％含まれている（４）に記載のセルラーゼ調製物、
（６）主要な２種のエンドグルカナーゼが異なるＧＨファミリーに分類される、（１）から（３）のいずれかに記載のセルラーゼ調製物、
（７）主要な２種のエンドグルカナーゼが、ＧＨファミリー５、ＧＨファミリー１２、およびＧＨファミリー４５のいずれかに分類されるものである、（６）に記載のセルラーゼ調製物、
（８）主要な２種のエンドグルカナーゼが、下記（ａ）または（ｂ）のいずれかの組み合わせである、（７）に記載のセルラーゼ調製物、
（ａ）ＧＨファミリー５に分類されるエンドグルカナーゼとＧＨファミリー１２に分類されるエンドグルカナーゼとからなる組み合わせ
（ｂ）ＧＨファミリー1２に分類されエンドグルカナーゼとＧＨファミリー４５に分類されるエンドグルカナーゼとからなる組み合わせ
（９）ＧＨファミリー５に分類されるエンドグルカナーゼが、配列番号：２に記載のアミノ酸配列もしくは該アミノ酸配列において１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であり、ＧＨファミリー１２に分類されるエンドグルカナーゼが配列番号：４に記載のアミノ酸配列もしくは該アミノ酸配列において１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であり、ＧＨファミリー４５に分類されるエンドグルカナーゼが配列番号：６に記載のアミノ酸配列もしくは該アミノ酸配列において１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質である、（８）に記載のセルラーゼ調製物、
（１０）（３）に記載のセルラーゼ調製物を生産する方法であって、２種のエンドグルカナーゼをコードするＤＮＡを同一の宿主細胞に導入し得られる形質転換体を培養する工程を含んでなる方法、
（１１）宿主細胞が糸状菌である、（１０）に記載の方法、
（１２）改良されたセルロース含有繊維の製造方法であって、セルロース含有繊維を、（１）から（３）のいずれかに記載のセルラーゼ調製物と接触させる工程を含んでなる方法、
（１３）バイオマスから糖を製造する方法であって、セルロース含有バイオマスを（１）から（３）のいずれかに記載のセルラーゼ調製物と接触させる工程を含んでなる方法、
を提供するものである。

本発明により、高活性でかつ広範なｐＨ範囲で活性を示すセルラーゼ調製物が提供された。また、本発明により、このようなセルラーゼ調製物を簡便に生産する方法が提供された。本発明により得られるセルラーゼ調製物を用いることにより、例えば、セルロース含有繊維の肌触り・外観の改良やバイオマスの糖化を効率的に行うことが可能となった。

図１は、ＳＣＥ３単独発現株、ＰＰＣＥ単独発現株およびＳＣＥ３・ＰＰＣＥ共発現株の毛羽除去活性におけるｐＨ特性の解析結果を示す図である。図２は、ＳＴＣＥ単独発現株、ＰＰＣＥ単独発現株およびＳＴＣＥ・ＰＰＣＥ共発現株の毛羽除去活性におけるｐＨ特性の解析結果を示す図である。

セルラーゼ調製物
本発明においてセルラーゼとは、セルロースを分解する活性を持つ酵素を指し、またセルラーゼ調製物とは、セロビオハイドロラーゼ、エンドグルカナーゼ、β−グルコシターゼなどのセルラーゼ成分を含んでなる調製物を指す。

本発明のセルラーゼ調製物は、２種の異なる微生物に由来するエンドグルカナーゼを含むことを特徴とする。エンドグルカナーゼが由来する２種の異なる微生物は、好ましくは２種の異なる糸状菌である。糸状菌としては、例えば、トリコデルマ（Trichoderma）属、ペニシリウム（Penicillium）属、またはスタフィロトリカム（Staphylotrichum）属、フミコーラ（Humicola）属、アクレモニウム（Acremonium）属、アスペルギルス（Aspergillus）属、リゾプス（Rizopus）属、ムコール(Mucor)属、ファイコマイセス(Phycomyces)属に属するものが挙げられ、好ましい例としては、トリコデルマ・ビリデ（Trichoderma viride）、ペニシリウム・ピノピラム（Penicillium pinophilum）、またはスタフィロトリカム・ココスポラム（Staphylotrichum cocosporum）、フミコーラ・インソレンス（Humicola insolens）、アクレモニウム・セルロリティカス（Acremonium cellulolyticus）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、アスペルギルス・アキュレアータス（Aspergillus aculeatus）リゾプス・オリゼ（Rizopus oryzae）属、ムコール・サーシネロイデス(Mucor circinelloides)、ファイコマイセス・ニテンス(Phycomyces nitens)が挙げられる。

本発明のセルラーゼ調製物に含まれる２種の主要なエンドグルカナーゼは、異なる微生物に由来し、かつ、異なるＧＨファミリーに分類されるエンドグルカナーゼから選択されることが好ましい。ここで「主要なエンドグルカナーゼ」とは、セルラーゼ調製物に含まれるエンドグルカナーゼのうち、タンパク質重量が最も多いエンドグルナカーゼを指す。従って、「２種の主要なエンドグルカナーゼ」とは、セルラーゼ調製物に含まれるエンドグルカナーゼのうち、タンパク質重量が最も多いエンドグルナカーゼおよび２番目に多いエンドグルカナーゼを指す。タンパク質重量は、セルラーゼ調製物についてSDS-PAGEを行い、その泳動像における各タンパク質バンドの濃度（タンパク質量）をデンシトメトリーにより解析することで、算出することができる。なお、ある種のエンドグルカナーゼは未分解のものに加えて、分解されたものも存在するため、SDS-PAGEの泳動像の解析において、同一のエンドグルカナーゼ遺伝子の翻訳物が異なるバンドとして観察される場合がある。本発明においては、同一のエンドグルカナーゼ遺伝子の翻訳物であれば、SDS-PAGEの泳動像において異なるバンドとして検出された場合でも、これらを同種のエンドグルカナーゼと評価して、タンパク質重量を算出するものとする。

異なるＧＨファミリーに分類されるエンドグルカナーゼは、ＧＨファミリー５、ＧＨファミリー１２、もしくはＧＨファミリー４５のいずかに分類されるエンドグルカナーゼから選択されることが望ましい。ここで「ＧＨファミリー」とは、糖質加水分解酵素の一次構造に着目した分類であり、具体的には、ＣＡＺＹのＷＥＢページ（http://www.cazy.org/fam/acc_GH.html）に記載された方法により分類される。

ＧＨファミリー５に分類されるエンドグルカナーゼとしては、トリコデルマ・ビリデ（Trichoderma viride）に由来するＳＣＥ３をその一例として挙げることができる。ここで「ＳＣＥ３」の代表的な天然型の蛋白質は、配列番号：２に記載のアミノ酸配列で示されるが、本発明においては、エンドグルカナーゼ活性を示す限り、配列番号：２に記載のアミノ酸配列において１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であっても構わない。

また、ＧＨファミリー１２に分類されるエンドグルカナーゼとしては、ペニシリウム・ピノフィラム（Penicillium pinophilum）に由来するＰＰＣＥをその一例として挙げることができる。ここで「ＰＰＣＥ」の代表的な天然型の蛋白質は、配列番号：４に記載のアミノ酸配列で示されるが、本発明においては、エンドグルカナーゼ活性を示す限り、配列番号：４に記載のアミノ酸配列において１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であっても構わない。

また、ＧＨファミリー４５に分類されるエンドグルカナーゼとしては、スタフィロトリカム・ココスポラム（Staphylotrichum cocosporum）に由来するＳＴＣＥをその一例として挙げることができる。ここで「ＳＴＣＥ」の代表的な天然型の蛋白質は、配列番号：６に記載のアミノ酸配列で示されるが、本発明においては、エンドグルカナーゼ活性を示す限り、配列番号：６に記載のアミノ酸配列において１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であっても構わない。

エンドグルカナーゼにおいて改変される「１もしくは複数個のアミノ酸」は、通常、５０アミノ酸以内、好ましくは３０アミノ酸以内、さらに好ましくは１０アミノ酸以内（例えば、５アミノ酸以内、３アミノ酸以内）である。エンドグルカナーゼのあるアミノ酸が他のアミノ酸に置換される場合、そのエンドグルカナーゼ活性の維持のためには、その置換は、同様の性質を有するアミノ酸同士の置換（保存的置換）であることが好ましい。

本発明において、セルラーゼ調製物に含まれる主要な２種のエンドグルカナーゼの組み合わせは、特に、ＳＣＥ３とＰＰＣＥとの組み合わせ、もしくはＰＰＣＥとＳＴＣＥとの組み合わせが、好ましい。

例えば、ＳＣＥ３とＰＰＣＥの組み合わせにおいては、それぞれを単独に発現させた場合と比較して全セルラーゼあたり２．４〜３．０倍程度の驚くべき高い毛羽除去活性を得ることができる。このような顕著な相乗効果に加え、この組み合わせにより得られるセルラーゼ調製物のｐＨ特性は、それぞれを単独に発現させた場合と比較して広範なプロファイルとなる。特に、ｐＨが４を超えた場合でも、一定ｐＨ範囲において、最適ｐＨの場合と同等レベルの高い毛羽除去活性を得ることができる。例えば、ＳＣＥ３を単独に発現させた場合、ｐＨ５においては、最適ｐＨにおける毛羽除去活性の約７５％となり、ＰＰＣＥを単独に発現させた場合、ｐＨ５においては、最適ｐＨにおける毛羽除去活性の約３０％となるが、この両者を組み合わせた場合には、ｐＨ５においても、最適ｐＨにおける毛羽除去活性と同等の活性を示すことができる。ここで「同等の活性」とは、少なくとも９０％以上、好ましくは９５％以上、最も好ましくは１００％の活性を意味する。このように、ＳＣＥ３とＰＰＣＥの組み合わせは、それぞれ単独のｐＨ特性からは予想できない、有利な特性を示す点にも特徴がある。

また、例えば、ＰＰＣＥとＳＴＣＥの組み合わせにおいては、それぞれを単独に発現させた場合と比較して、全セルラーゼあたり３．２〜３．７倍程度の高い毛羽除去活性を得ることができる。このような顕著な相乗効果に加え、この組み合わせにより得られるセルラーゼ調製物のｐＨ特性は、それぞれを単独に発現させた場合と比較して広範なプロファイルとなる。

本発明のセルラーゼ調製物は、主要な２種類のエンドグルカナーゼを含むことにより、上記の通り、それぞれを単独で発現させた場合と比較して、相対的に高い活性と改変されたｐＨ特性を有する。

セルラーゼ調製物の絶対的な活性を高めるためには、セルラーゼ調製物は、主要な２種類のエンドグルカナーゼのそれぞれを１０重量％（全セルラーゼに対して）以上、さらに好ましくは２０重量％以上含む。ＳＣＥ３とＰＰＣＥの組み合わせにおいては、例えば、ＳＣＥ３を４０重量％以上かつＰＰＣＥを２０重量％以上含むセルラーゼ調製物でありうる。また、ＰＰＣＥとＳＴＣＥの組み合わせにおいては、例えば、ＰＰＣＥを１５重量％以上かつＳＴＣＥを２５重量％以上含むセルラーゼ調製物でありうる。

ここで「全セルラーゼ」とは、セルラーゼ調製物に含まれるセロビオハイドロラーゼ、エンドグルカナーゼ、及びβ−グルコシターゼの総重量を指す。例えば、トリコデルマ・ビリデ・ストレイン２株を宿主としてエンドグルカナーゼを組換えタンパク質として発現させた場合には、組換えエンドグルカナーゼに加えて宿主由来のセロビオハイドロラーゼであるＣＢＨ１、ＣＢＨ２、エンドグルカナーゼであるＥＧ１、ＳＣＥ３、エンドグルカナーゼ(ＧＨファミリー７４)、β−グルコシターゼであるＢＧＬのそれぞれの重量の合計が全セルラーゼ量となる。
エンドグルカナーゼをコードするＤＮＡおよびそれらの取得
本発明においてエンドグルカナーゼをコードするＤＮＡとは、前記のエンドグルカナーゼのアミノ配列をコードするＤＮＡを指す。

本発明においてエンドグルカナーゼをコードするＤＮＡは、エンドグルカナーゼ遺伝子の塩基配列もしくはエンドグルカナーゼのアミノ酸配列を基に人工的に化学合成することにより得ることができる。また、本発明のエンドグルカナーゼをコードするＤＮＡは、既知エンドグルカナーゼ遺伝子の塩基配列もしくは既知エンドグルカナーゼのアミノ酸配列を基にして合成されたプライマーを使用して、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、プラスミドなど当該遺伝子が含まれるＤＮＡを鋳型としたＰＣＲにより増幅することができる。さらに本発明のエンドグルカナーゼをコードするＤＮＡは、既知エンドグルカナーゼ遺伝子の塩基配列もしくは既知エンドグルカナーゼのアミノ酸配列を基にして合成されたエンドグルカナーゼの部分遺伝子をプローブとして、当該エンドグルカナーゼ遺伝子を含むゲノムＤＮＡライブラリーもしくはｃＤＮＡライブラリーより当該エンドグルカナーゼ遺伝子を含む陽性クローンをスクリーニングすることにより得ることもできる。

また、導入するエンドグルカナーゼをコードするＤＮＡを宿主細胞にて活性を有するエンドグルカナーゼとして発現させるために、前記のエンドグルカナーゼをコードするＤＮＡには、その発現を制御する塩基配列や形質転換体を選択するための遺伝子マーカー等を含んでいることが好ましい。発現を制御する塩基配列としては、プロモーター、ターミネーター及びシグナルペプチドをコードする塩基配列等がこれに含まれる。プロモーターは宿主細胞において転写活性を示すものであれば特に限定されず、宿主細胞と同種若しくは異種のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子の発現を制御する塩基配列として得ることができる。また、シグナルペプチドは、宿主細胞において、タンパク質の分泌に寄与するものであれば特に限定されず、宿主細胞と同種若しくは異種のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子から誘導される塩基配列より得ることができる。
宿主細胞、およびその形質転換
本発明において、エンドグルカナーゼをコードするＤＮＡが導入される宿主細胞としては、大腸菌、放線菌、酵母、糸状菌などを利用することができるが、タンパク質生産性に優れる糸状菌を用いることが好ましい。また、宿主細胞として使用される糸状菌としては、フミコーラ（Humicola）属、アスペルギルス（Aspergillus）属またはトリコデルマ（Trichoderma）属、フザリウム（Fusarium）属、アクレモニウム（Acremonium）属、またはペニシリウム属（Penicillium）に属するものを利用できるが、さらにそれらの好ましい例としては、フミコーラ・インソレンス（Humicola insolens）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）若しくはアスペルギルス・オリゼー（Aspergillus oryzae）、またはトリコデルマ・ビリデ（Trichoderma viride）、フザリウム・オキシスポーラム（Fusarium oxysporum）、アクレモニウム・セルロリティカス（Acremonium cellulolyticus）、またはペニシリウム・ピノフィラム（Penicillium pinophilum）が挙げられる。

本発明においては、エンドグルカナーゼをコードするＤＮＡの宿主細胞への導入は、前記のエンドグルカナーゼをコードするＤＮＡを直接的に導入する方法に加え、宿主細胞内で複製可能で、かつ、その遺伝子がコードするセルラーゼを発現可能な状態で含んでなる発現ベクターで宿主細胞を形質転換する方法でも、実施することができる。宿主細胞の形質転換に使用される発現ベクターは、自己複製ベクター、すなわち、染色体外の独立体として存在し、その複製が染色体の複製に依存しない、例えば、プラスミドを基本に構築することができる。また、発現ベクターは、宿主微生物に導入されたとき、その宿主微生物のゲノム中に組み込まれ、それが組み込まれた染色体と一緒に複製されるものであってもよい。本発明によるベクター構築の手順及び方法は、遺伝子工学の分野で慣用されているものを用いることができる。

本発明において、前記エンドグルカナーゼをコードするＤＮＡおよび発現ベクターによる宿主細胞の形質転換は、この分野で慣用されている方法に従い実施することができる。エンドグルカナーゼをコードするＤＮＡの宿主細胞への導入法は、２種類のエンドグルカナーゼをコードするＤＮＡもしくはそれらを含む発現ベクターを、同時に宿主細胞に導入することにより実施される。また、導入されるエンドグルカナーゼをコードするＤＮＡもしくはそれらを含む発現ベクターの内の一つをまず宿主細胞に導入し、続いて、得られた形質転換体にさらに別のエンドグルカナーゼをコードするＤＮＡもしくは発現ベクター導入するという、段階的に２種類のセルラーゼ遺伝子もしくはそれらを含む発現ベクターを宿主細胞に導入することによっても実施することができる。また、形質転換の際に利用される遺伝子マーカーは、形質転換体の選択の方法に応じて適宜選択されてよいが、例えば薬剤耐性をコードする遺伝子、栄養要求性を相補する遺伝子を利用することができる。
セルラーゼ調製物の生産
本発明におけるセルラーゼ調製物の生産は、前記の形質転換された宿主細胞を適当な培地で培養し、その培養物から組換えセルラーゼを得ることができる。２種類の組換えエンドグルカナーゼを発現する宿主細胞の培養及びその条件は、使用する宿主細胞についてのそれと本質的に同等であってよい。
セルラーゼの用途
本発明においては、前記セルラーゼ調製物またはそれを利用したセルラーゼ剤で、セルロース含有繊維を処理することにより、肌触り及び外観が改良されたセルロース含有繊維を製造することができる。また、着色されたセルロース含有繊維にその色の局所的な変化を提供する「ストーンウォッシュ」の外観を与えることができる。

さらに本発明によれば、前記組換えセルラーゼ調製物またはそれを利用したセルラーゼ剤で、稲わら、バガス、コーンストーバー、椰子の実などの果実の絞りかす、廃木材などのバイオマスを処理することにより、これらのバイオマスから糖を製造（糖化）することができる。この様にして得られた糖は、酵母などでさらに発酵し、エタノールに変換することができる。

本発明を実施例により更に具体的に説明するが、本発明はその要旨を越えない限り以下の実施例に限定されるものではない。
[実施例１] エンドグルカナーゼＳＣＥ３及びエンドグルカナーゼＰＰＣＥを共発現するトリコデルマ・ビリデ（Trichoderma viride）の作製
（１）ＳＣＥ３発現プラスミドｐＣＢ−ｓｃｅ３の構築
トリコデルマ・ビリデ（Trichoderma viride）由来のエンドグルカナーゼＳＣＥ３の発現ベクターとしては、国際公開第９８／１１２３９号記載のｐＣＢ１−Ｅｇ３ＸをＸｂａＩで切断し得られた約７ｋｂの断片を自己連結し得られるｐＣＢ１−ｓｃｅ３を用いた。
（２）ＰＰＣＥ発現プラスミドｐＰＰＣＥ−Ｍの構築
ペニシリウム・ピノピラム（Penicillium pinophilum）由来エンドグルカナーゼＰＰＣＥ発現ベクターは、国際公開第２００８／１１６１３号記載のｐＰＰＣＥ−Ｍを用いた。
（３）選択マーカー発現プラスミドｐＰＹＲ４の構築
ニューロスポラ・クラッサ（Neurospora crassa）由来ｐｙｒ４遺伝子を含むマーカープラスミドは国際公開第２００５／０５６７８７号記載のｐＰＹＲ４を用いた。
（４）選択マーカー発現プラスミドｐＤＴ−１１８の構築
ｐＵＣ１１８（宝酒造社製）のＸｂａＩ部位に、国際公開第９８／０３６６７に記載のｐＭＫＤ０１からＸｂａＩにより切り出したアスペルギルス・ニデュランス（Aspergillus nidulans）由来ｔｒｐＣ遺伝子のプロモーター及びターミネーターを持つストレプトマイセス・リモファシエンス（Streptomyces rimofacience）由来デストマイシン耐性遺伝子（ＤｔＲ）を挿入しプラスミドｐＤＴ−１１８を構築した。
（５）ＳＣＥ３単独発現株の造出と培養
実施例１−（１）で得られたプラスミドｐＣＢ１−ｓｃｅ３及び実施例１−（３）で得られたプラスミドｐＰＹＲ４によるトリコデルマ・ビリデの形質転換は、国際公開第２００５／０５６７８７号に記載の方法に従い実施した。即ち、ウラシル生合成遺伝子（ｐｙｒ４）欠損株であるトリコデルマ・ビリデ・ストレイン２株を宿主とし、選択マーカーとしてニューロスポラ・クラッサのｐｙｒ４遺伝子を用いたコトランスフォーメーション（co-transformation）法により形質転換を実施した。まず国際公開第２００５／０５６７８７号に記載の方法に従い、トリコデルマ・ビリデ・ストレイン２株のプロトプラストを調製し、得られたプロトプラスト懸濁液１００μLを、７μｇのｐＣＢ１−ｓｃｅ３及び３μｇのｐＰＹＲ４と混合した。混合液を氷冷下で５分間静置し、４００μＬのＰＥＧ溶液（６０％ポリエチレングリコール４０００、１０ｍM塩化カルシウム、１０ｍMトリス塩酸緩衝液、ｐＨ７．５）を加え、更に氷冷下で２０分間静置した。以上の処理をしたプロトプラスト縣濁液をＳＵＴＣ緩衝液（０．５Mシュークロース、１０ｍM塩化カルシウム、１０ｍMトリス塩酸緩衝液、ｐＨ７．５）で洗浄した後、０．５Mシュークロースを含む最少培地に軟寒天とともに重層し、２８℃で５日間培養した。培養後、生育したコロニーを再度、最少培地に移植し、ここで生育したコロニーを形質転換体とした。得られた形質転換体２００株をＰＳＷ培地（１．０％グルコース，４．０％ラクトース、２．０％大豆粕、１．０％小麦胚芽、０．２％リン酸二水素カリウム、０．２％硫酸アンモニウム、０．２％リン酸アンモニウム、０．２％炭酸カルシウム）に植菌し、２８℃にて５日間培養した。培養後、遠心分離により菌体を除去し、得られた培養上清を粗酵素液とした。粗酵素液をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、セイフティーセルミニＳＴＣ−８０８電気泳動槽(テフコ社製)プリキャストミニゲル１２％−ＳＤＳ−ＰＡＧＥｍｉｎｉ、１．０ｍｍゲル厚(テフコ社製)を使用し、泳動方法は製品取り扱い説明書に従った。分子量マーカーはＬＭＷＣａｌｉｂｒａｔｉｏｎＦｏｒＳＤＳＥｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を用いた。泳動後、製品取り扱い説明書に従い、クマシーブリリアントブルーＲ２５０（ナカライテスク社製）で染色し、脱色した。その結果、形質転換体において特異的に４５ｋＤaのタンパク質が発現していた。特に発現量の多かった２−９９株をＳＣＥ３単独発現株とした。
（６）ＳＣＥ３・ＰＰＣＥ共発現株の造出と培養
実施例１−（２）で得られたｐＰＰＣＥ−Ｍおよび実施例１−（４）で得られたｐＤｔ−１１８により、実施例１−（５）で得られたＳＣＥ３単独発現株を形質転換した。形質転換の方法は実施例１−（５）の方法に従い、ＳＣＥ３単独発現株を宿主とし、選択マーカーとしてデストマイシン耐性遺伝子（ＤｔＲ）を用いたコトランスフォーメーション法により形質転換を実施した。７μｇのｐＰＰＣＥ−Ｍ及び３μｇのｐＤｔ−１１８を使用してＳＣＥ３単独発現株を形質転換し、２０μｇ／ｍｌのハイグロマイシンＢを含むＰＤＡ培地上にＰＤＡ寒天とともに重層し、２８℃で５日間培養した。培養後、生育したコロニーを再度、ハイグロマイシンＢを含むＰＤＡ培地に移植し、ここで生育したコロニーを形質転換体とし、７０株の形質転換体を得た。得られた形質転換体７０株を実施例１−（５）に記載のＰＳＷ培地に植菌し、２８℃にて５日間培養した。培養後、遠心分離により菌体を除去し、得られた培養上清を粗酵素液とした。粗酵素液をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供したところ、形質転換体において特異的に約２６ｋＤaのタンパク質が発現していた。特に発現量の多かった１１−８株をＳＣＥ３・ＰＰＣＥ共発現株とした。
（７）ＰＰＣＥ単独発現株の造出と培養
実施例１−（２）で得られたｐＰＰＣＥ−Ｍ及び実施例1−（３）で得られたｐＰＹＲ４によるトリコデルマ・ビリデ・ストレイン２株の形質転換は、実施例１−（５）に記載の方法に従い、実施した。即ち、７μｇのｐＰＰＣＥ−Ｍ及び３μｇのｐＰＹＲ４を使用してトリコデルマ・ビリデ・ストレイン２株を形質転換し、最少培地に軟寒天とともに重層し、２８℃で５日間培養した。培養後、生育したコロニーを再度、最少培地に移植し、ここで生育したコロニーを形質転換体とした。得られた形質転換体を実施例1−（５）に記載の方法で培養し、ＰＰＣＥを著量発現した株をＰＰＣＥ単独発現株とした。
（８）発現タンパク質濃度の測定
ＳＣＥ３単独発現株、ＰＰＣＥ単独発現株、及びＳＣＥ３・ＰＰＣＥ共発現株の組換えエンドグルカナーゼ発現量を評価した。それぞれの培養上清の総タンパク質量をＢＩＯ−ＲＡＤＰｒｏｔｅｉｎＡｓｓａｙＫｉｔ（ＢｉｏＲａｄ社製）を用い、添付のプロトコールに従って測定した。続いて、タンパク質量として１１μｇ分の培養上清を実施例１−（５）に記載の方法で電気泳動を実施した。モレキュラーイメージャーＦＸ（バイオラッドラボラトーズ社製）及びＱｕａｎｔｉｔｙＯｎｅ（バイオ・ラッドラボラトリーズ社製）を用いてバンド解析を行い、全セルラーゼ成分に占める発現セルラーゼ比率を測定した。ここで、バンド解析の条件は、Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ７．５１３、ＲｏｌｌｉｎｇＤｉｓｋｓｉｚｅ１０とした。結果を表１に示した。本結果から、ＳＣＥ３・ＰＰＣＥ共発現株においては、ＳＣＥ３とＰＰＣＥが主要な２種のエンドグルカナーゼであり、全セルラーゼに占めるそれぞれの割合は、４０．８％及び２０．２％であった。

また表１に示した通り、ＳＣＥ３およびＰＰＣＥの両者を同時に発現させることにより、それぞれを単独に発現させた場合と比較して、高い組換えエンドグルカナーゼ比率を持つ培養上清を得ることができた。

[実施例２] ＳＣＥ３単独発現株、ＰＰＣＥ単独発現株およびＳＣＥ３・ＰＰＣＥ共発現株の毛羽除去活性比較
実施例１で調製したＳＣＥ３単独発現株、ＰＰＣＥ単独発現株、及びＳＣＥ３・ＰＰＣＥ共発現株の培養上清を使用して毛羽除去活性を以下の洗浄条件にて調べた。
＜条件＞
試験機械：洗濯堅牢度試験機Ｌ−１２（大栄科学精器製作所社製）
温度：４０℃
時間：６０分
反応液：５ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ４）４０ｍｌ
処理液には、培養上清とともにゴムボールを適当量加えた。

洗浄後目視により毛羽の除去度を評価し、毛羽が目視評価でほぼ５０％除去されるのに要する培養上清液量を算出した。この液量より、ＰＰＣＥ単独発現株の培養上清当たりの毛羽除去活性を１００％として相対活性を求めた。また、実施例１の結果から、培養上清中の全セルラーゼ重量を算出し、全セルラーゼ量に対する相対毛羽除去活性を算出した。その結果、表２に示した通り、ＳＣＥ３とＰＰＣＥの両組換えエンドグルカナーゼを含んだＳＣＥ３・ＰＰＣＥ共発現株は、ＰＰＣＥ単独発現株と比較して、培養上清当たり４．１倍、全セルラーゼ当たり２．４倍高い活性を示した。また、ＳＣＥ３単独発現株と比較して培養上清当たり５．１倍、全セルラーゼ当たり３倍高い活性を示した。

以上の結果から、ＳＣＥ３およびＰＰＣＥを共発現させることにより、それぞれを単独で発現させた場合と比較して、相乗的に高い毛羽除去活性が得られることが示された。

[実施例３] ＳＣＥ３単独発現株、ＰＰＣＥ単独発現株およびＳＣＥ３・ＰＰＣＥ共発現株の毛羽除去活性におけるｐＨ特性の解析
実施例１で用いたＳＣＥ３単独発現株、ＰＰＣＥ単独発現株、及びＳＣＥ３・ＰＰＣＥ共発現株の培養上清を使用して、実施例２に記載の方法に従ってそれぞれの酵素のｐＨ特性を検討した。その結果、表３及び図１に示す通りの結果であり、ＳＣＥ３・ＰＰＣＥ共発現株は、それぞれの単独発現株と比較して弱酸性から酸性まで高い活性を維持する広範なｐＨプロファイルを示した。特に、驚くべきことに、ＳＣＥ３を単独に発現させた場合、ｐＨ５においては、最適ｐＨにおける毛羽除去活性の約７５％となり、ＰＰＣＥを単独に発現させた場合、ｐＨ５においては、最適ｐＨにおける毛羽除去活性の約３０％となるが、この両者を組み合わせた場合には、ｐＨ５においては、最適ｐＨにおける毛羽除去活性と同等の活性を示すことができた。

[実施例４] エンドグルカナーゼＳＴＣＥ及びエンドグルカナーゼＰＰＣＥを共発現するトリコデルマ・ビリデの作製
（１）ＳＴＣＥ発現ｐＣＢ−Ｓｔｍ１２の構築
スタフィロトリカム・ココスポラム（Staphylotrichum cocosporum）由来のエンドグルカナーゼＳＴＣＥの発現ベクターとしては、国際公開第２００５／０５６７８７号、実施例Ｂ４に記載のｐＣＢ−Ｓｔｍ１２を使用した。
（２）ＳＴＣＥ単独発現株の造出
プラスミドｐＣＢ−ｓｔｍ１２及びプラスミドｐＰＹＲ４によるトリコデルマ・ビリデの形質転換及び形質転換体の培養は、実施例１−（５）に記載の方法と同様に実施した。国際公開第２００５／０５６７８７号に記載の方法に従い、実施した。得られた形質転換体８０株について粗酵素液を調製し、実施例１−（５）に従ってＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。その結果、形質転換体において特異的に４５ｋＤのタンパク質が発現していた。特に発現量の多かったｍ１２−６０株をＳＴＣＥ単独発現株とした。
（３）ＳＴＣＥ・ＰＰＣＥ共発現株の造出
実施例１−（２）で得られたｐＰＰＣＥ−Ｍ、及び実施例１−（４）で得られたｐＤＴ−１１８により実施例４−（２）で造出されたＳＴＣＥ単独発現株を形質転換した。形質転換の方法は実施例１−（５）の方法に従い、形質転換を実施した。得られた形質転換体７０株を実施例１−（５）記載の方法で培養し粗酵素液を調製した。粗酵素液をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供したところ、形質転換体において特異的に約２６ｋＤのタンパク質が発現していた。特に発現量の多かった１０−８２株をＳＴＣＥ・ＰＰＣＥの共発現株とした。
（４）発現タンパク質濃度の測定
実施例1−（８）に記載の方法により、ＳＴＣＥ単独発現株、ＰＰＣＥ単独発現株、及びＳＴＣＥ・ＰＰＣＥ共発現株のセルラーゼ成分発現量を評価した。結果を表４に示した。本結果から、ＳＴＣＥ・ＰＰＣＥ共発現株においては、ＳＴＣＥとＰＰＣＥが主要な２種のエンドグルカナーゼであり、全セルラーゼに占めるそれぞれの割合は、２５．５％及び１８．５％であった。またＳＴＣＥおよびＰＰＣＥの両者を同時に発現させることにより、それぞれを単独に発現させた場合と比較して、高い組換えエンドグルカナーゼ比率を持つ培養上清を得ることができた。

[実施例５] ＳＴＣＥ単独発現株、ＰＰＣＥ単独発現株およびＳＴＣＥ・ＰＰＣＥ共発現株の毛羽除去活性比較
実施例１及び４で調製したＳＴＣＥ単独発現株、ＰＰＣＥ単独発現株及びＳＴＣＥ・ＰＰＣＥ共発現株の培養上清を使用して毛羽除去活性を実施例２と同様の方法により検討した。また、実施例４の結果から、培養上清中の全セルラーゼ重量を算出し、全セルラーゼ量に対する相対毛羽除去活性を算出した。その結果、表５に示した通り、ＳＴＣＥとＰＰＣＥの両組換えエンドグルカナーゼを含んだＳＴＣＥ・ＰＰＣＥ共発現株は、ＰＰＣＥ単独発現株と比較して、培養上清当たり４．２倍、全セルラーゼ当たり３．７倍高い活性を示した。また、ＳＴＣＥ単独発現株と比較して培養上清当たり３．５倍、全セルラーゼ当たり３．２倍高い活性を示した。

以上の結果から、ＳＴＣＥおよびＰＰＣＥを共発現させることにより、それぞれを単独で発現させた場合と比較して、相乗的に高い毛羽除去活性が得られることが示された。

[実施例６] ＳＴＣＥ単独発現株、ＰＰＣＥ単独発現株およびＳＴＣＥ・ＰＰＣＥ共発現株の毛羽除去活性におけるｐＨ特性の解析
実施例１および４で調製したＳＴＣＥ単独発現株、ＰＰＣＥ単独発現株、及びＳＴＣＥ・ＰＰＣＥ共発現株の培養上清を使用して、実施例３と同様の方法により、ｐＨプロファイルを以下の洗浄条件にて調べた。その結果、表６及び図２に示すとおりの結果であり、ＳＴＣＥ・ＰＰＣＥ共発現株は、それぞれの単独発現株と比較して弱酸性から酸性まで高い活性を維持する広範なｐＨプロファイルを示した。

本発明のセルラーゼ調製物は、高い活性と広範なｐＨ特性を有する。本発明のセルラーゼ調製物は、肌触り及び外観が改良されたセルロース含有繊維の製造や、着色されたセルロース含有繊維における「ストーンウォッシュ」の外観の形成に、利用することができる。また、稲わら、バガス、コーンストーバー、椰子の実などの果実の絞りかす、廃木材などのバイオマスからの糖の製造（糖化）、ひいては、バイオエタノールの製造に利用することもできる。

Claims

下記（ａ）または（ｂ）のいずれかに記載の２種のエンドグルカナーゼを含んでなるセルラーゼ調製物。
（ａ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列もしくは該アミノ酸配列において１０以内のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質と配列番号：４に記載のアミノ酸配列もしくは該アミノ酸配列において１０以内のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号：４に記載のアミノ酸配列もしくは該アミノ酸配列において１０以内のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質と配列番号：６に記載のアミノ酸配列もしくは該アミノ酸配列において１０以内のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質
請求項１に記載のセルラーゼ調製物を生産する方法であって、下記（ａ）または（ｂ）のいずれかに記載の２種のエンドグルカナーゼをコードするＤＮＡを同一の宿主細胞に導入し得られる形質転換体を培養する工程を含んでなる方法。
（ａ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列もしくは該アミノ酸配列において１０以内のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質と配列番号：４に記載のアミノ酸配列もしくは該アミノ酸配列において１０以内のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号：４に記載のアミノ酸配列もしくは該アミノ酸配列において１０以内のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質と配列番号：６に記載のアミノ酸配列もしくは該アミノ酸配列において１０以内のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質
宿主細胞が糸状菌である、請求項２に記載の方法。
改良されたセルロース含有繊維の製造方法であって、セルロース含有繊維を、請求項１に記載のセルラーゼ調製物と接触させる工程を含んでなる方法。
バイオマスから糖を製造する方法であって、セルロース含有バイオマスを請求項１に記載のセルラーゼ調製物と接触させる工程を含んでなる方法。