EA021855B1 - Штаммы talaromyces и ферментные композиции - Google Patents

Штаммы talaromyces и ферментные композиции Download PDF

Info

Publication number
EA021855B1
EA021855B1 EA201200091A EA201200091A EA021855B1 EA 021855 B1 EA021855 B1 EA 021855B1 EA 201200091 A EA201200091 A EA 201200091A EA 201200091 A EA201200091 A EA 201200091A EA 021855 B1 EA021855 B1 EA 021855B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
tec
strain
protein
glucose
enzyme
Prior art date
Application number
EA201200091A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201200091A1 (ru
Inventor
Джон Б. Перкинс
Манодж Кумар
Маргриета Фредерик Ким Зийл Ван
Адрианус Вильхельмус Херманус Фоллебрехт
Панайотис Сарантинопоулос
Original Assignee
ДСМ АйПи АССЕТС Б.В.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ДСМ АйПи АССЕТС Б.В. filed Critical ДСМ АйПи АССЕТС Б.В.
Publication of EA201200091A1 publication Critical patent/EA201200091A1/ru
Publication of EA021855B1 publication Critical patent/EA021855B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
    • C12P7/16—Butanols
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C12N1/145—Fungal isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2434—Glucanases acting on beta-1,4-glucosidic bonds
    • C12N9/2437—Cellulases (3.2.1.4; 3.2.1.74; 3.2.1.91; 3.2.1.150)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2434—Glucanases acting on beta-1,4-glucosidic bonds
    • C12N9/2445—Beta-glucosidase (3.2.1.21)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2477—Hemicellulases not provided in a preceding group
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2477—Hemicellulases not provided in a preceding group
    • C12N9/248—Xylanases
    • C12N9/2482—Endo-1,4-beta-xylanase (3.2.1.8)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/58—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from fungi
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/14—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of a carbohydrase (EC 3.2.x), e.g. by alpha-amylase, e.g. by cellulase, hemicellulase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
    • C12P7/06—Ethanol, i.e. non-beverage
    • C12P7/08—Ethanol, i.e. non-beverage produced as by-product or from waste or cellulosic material substrate
    • C12P7/10—Ethanol, i.e. non-beverage produced as by-product or from waste or cellulosic material substrate substrate containing cellulosic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
    • C12Y301/01—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
    • C12Y301/01072—Acetylxylan esterase (3.1.1.72)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01004—Cellulase (3.2.1.4), i.e. endo-1,4-beta-glucanase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01008—Endo-1,4-beta-xylanase (3.2.1.8)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01021—Beta-glucosidase (3.2.1.21)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01091—Cellulose 1,4-beta-cellobiosidase (3.2.1.91)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
    • Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

Настоящее изобретение относится к штаммам Talaromyces. Изобретение также относится к ферментным композициям, которые могут вырабатывать штаммы Talaromyces. Кроме того, изобретение относится к способам получения полезных продуктов из лигноцеллюлозного материала с помощью ферментных композиций.

Description

Изобретение относится к штаммам Та1аготусек и мутантам с улучшенной выработкой целлюлаз. Изобретение также относится к ферментным композициям, которые могут вырабатывать штаммы Та1аготусек. Кроме того, изобретение относится к способам получения полезных продуктов из (лигно)целлюлозного материала с помощью ферментных композиций.
Предшествующий уровень техники
Углеводы являются наиболее распространенными органическими соединениями на Земле. Однако многие углеводы депонируются в сложных полимерах, включая крахмал (основной запасающий углевод в семенах и зернах), и агрегатах углеводов и лигнина, известных как лигноцеллюлоза. Основными углеводными компонентами лигноцеллюлозы являются целлюлоза, гемицеллюлоза и пектины. Эти сложные полимеры часто упоминаются под общим названием лигноцеллюлоза.
Биопреобразование возобновляемой лигноцеллюлозной биомассы в поддающийся ферментации сахар, который затем ферментируется с получением спирта (например, этанола), в качестве альтернативы жидкому топливу привлекло пристальное внимание исследователей после 1970-х г., когда из-за снижения добычи нефти ОПЕК разразился нефтяной кризис. В течение последних двух десятилетий этанол широко применялся в качестве 10% примеси к бензину в США или как чистое топливо для автомобилей в Бразилии. Совсем недавно специально для программы чистый город внедрили Е85, 85% этанольную смесь. Важность топливного биоэтанола будет расти параллельно с ростом цен на нефть и постепенным истощением ее источников. Кроме того, поддающиеся ферментации сахара применяют для получения пластиков, полимеров и другой биопродукции и эта отрасль, как ожидается, будет в существенной степени расти, что приведет к повышению спроса на дешевые распространенные ферментируемые сахара, которые могут быть использованы в качестве сырья вместо сырья на основе нефти.
Депонирование таких больших количеств углеводов в растительной биомассе обеспечивает изобильный источник потенциальной энергии в форме сахаров как пятиуглеродных, так и шестиуглеродных, которые могут быть применены во множестве промышленных и сельскохозяйственных процессов. Однако огромный энергетический потенциал этих углеводов в настоящее время используется недостаточно, поскольку эти сахара блокированы в сложных полимерах и, следовательно, не являются легко доступными для ферментации. Способы, с помощью которых получают сахара из растительной биомассы, обеспечат изобильный, экономически конкурентно способный источник ферментируемого сырья для химических соединений, пластмасс и топлива.
Независимо от типа целлюлозного сырья стоимость и гидролитическая эффективность ферментов являются основными факторами, которые ограничивают коммерциализацию процессов биопреобразования биомассы. Производственные затраты на микробно продуцируемые ферменты тесно связаны с продуктивностью вырабатывающего фермент штамма и выходом конечной активности в ферментативном бульоне.
Целлюлазы являются ферментами, которые гидролизуют целлюлозу (в-1,4-глюкан или бета Иглюкозидные связи), что приводит к образованию глюкозы, целлобиозы, целлоолигосахаридов и т.п.
Целлюлазы традиционно разделены на три основных класса: эндоглюканазы (ЕС 3.2.1.4) (ЕО), экзоглюканазы или целлобиогидролазы (ЕС 3.2.1.91) (СВН) и β-глюкозидазы ([бета]-И-глюкозидглюкогидролаза; ЕС 3.2.1.21) (ВО) (см., например, Кпо\\1е5 е! а1., Т1ВТЕСН 5, 255-261, 1987; 51ш1еит, Ме!йойк Еп/уто1., 160, 25, рр. 234-243, 1988). Эндонуклеазы действуют главным образом на аморфные части волокна целлюлозы, тогда как целлобиогидролазы также способны деградировать кристаллическую целлюлозу (№уа1ашеп апй РепйЛа, Мусо!а, 303-319, 1995). Таким образом, присутствие целлобиогидролазы в целлюлазной системе требуется для эффективной солюбилизации кристаллической целлюлозы (§иигпакк1 е! а1. Се11и1оке 7: 189-209, 2000). β-Глюкозидаза высвобождает единицы И-глюкозы из целлобиозы, целлоолигосахаридов и других глюкозидов (Ртеет, 1. Вю1. Сйет., уо1. 268, по. 13, рр. 9337-9342, 1993).
Известно, что целлюлазы вырабатываются большим количеством бактерий, дрожжей и грибов. Некоторые грибы продуцируют полную систему целлюлаз, способную деградировать кристаллические формы целлюлозы, при этом целлюлазы легко вырабатываются в больших количествах при ферментации. Мицелиальные грибы играют особую роль, поскольку многие дрожжи, такие как Зассйатотусек сегеуыае, утратили способность гидролизовать целлюлозу (см., например, АиЬей е! а1., 1988; Аоой е! а1., Ме!йойк ш Еп/уто^ду, уо1. 160, по. 9, рр. 87-116, 1988, апй СоидЫап е! а1., Сотратайуе Вюсйет181ту о! Рипда1 апй Вас!епа1 Се11и1о1уОс Еп/уте ЗукЮтк. ВюсНенпкОу апй Оепейск о! Се11и1оке Иедтайайоп, рр. 11-30, 1988).
Классификации грибных целлюлаз СВН, ЕО и ВО могут быть дополнительно расширены для включения множества элементов в каждую классификацию. Например, множество СВН, ЕО и ВО было выделено из различных грибных источников, включая ТпсНойегта теекец которая содержит известные гены для 2 СВН, т.е. СВН I и СВН II, по меньшей мере 8 ЕО, т.е. ЕО I, ЕО II, ЕО III, БОГУ, ЕОУ, ЕОУ1, ЕОУП и ЕОУШ, и по меньшей мере 5 ВО, т.е. ВО1, ВО2, ВО3, ВО4 и ВО5.
Несмотря на продолжающиеся в последние несколько десятилетий исследования, имеющие своей целью понимание ферментативной деградации лигноцеллюлозной биомассы и производство целлюлаз,
- 1 021855 желательным остается обнаружение или создание высокоактивных целлюлаз и гемицеллюлаз. Также было бы весьма желательно создать высокоэффективные ферментные композиции, способные осуществлять быструю и эффективную биодеградацию лигноцеллюлозных материалов.
Кроме того, доступные в настоящее время ферменты, обладающие целлюлазной активностью, как правило, полученные из ТпеНокеппа, функционируют при мезофильных температурах, например от 45 до 50°С, и при рН 5,0. Это, однако, может привести к бактериальной инфекции, уменьшающей выход продукта, так что желательно проводить осахаривание при температуре 65°С или выше. Кроме того, применение мезофильных температур увеличивает вязкость используемой биомассы, что ограничивает содержание используемого сухого материала. Также при использовании в качестве субстрата предварительно обработанной кислотой биомассы рН должно быть поднято до таких значений, при которых фермент может осахаривать сахара в биомассе. В контексте коммерчески жизнеспособной топливной этанольной промышленности это влечет за собой потребность, например, в гидроксиде натрия или сульфате кальция и потребность в производстве огромных количеств соответствующих солей, например гипса, в случае гидроксида натрия. Соответственно, необходимо проводить осахаривание с помощью фермента, который может работать при рН 4,0 или ниже.
Сущность изобретения
Изобретение обеспечивает мутантные штаммы Та1атотуее5, которые обладают улучшенной целлюлолитической активностью по меньшей мере 6 РРИ2%/мл. Мутантные штаммы по изобретению демонстрируют хороший рост и хорошую споруляцию.
Изобретение также относится к ферментным композициям, содержащим целлобиогидролазу (СВН) и эндоглюканазу (ЕС), где композиция содержит 40% или больше СВН и 20% или больше ЕС. Предпочтительно, если ферментные композиции имеют протеазную активность по большей мере 60 АРИ/мл.
Ферментные композиции могут чрезвычайно эффективно гидролизовать лигноцеллюлозный материал, например кукурузную солому или пшеничную солому, в мономерные сахара, которые затем могут быть преобразованы в полезный продукт, такой как этанол.
Для проведения высокоэффективного гидролиза лигноцеллюлозного субстрата могут быть использованы ферментные композиции. Это очень важно в контексте коммерчески жизнеспособного производства топливного этанола из лигноцеллюлозной биомассы, поскольку потребуются более низкие количества фермента (по сравнению с доступными в настоящее время продуктами).
Более того, этот гидролиз может быть проведен при высокой температуре, которая (ί) уменьшает риск бактериальной инфекции и (ίί) в результате дает менее вязкую пульпу биомассы.
Последний эффект является значимым, поскольку позволяет лучше смешивать ферменты, что приводит к улучшенной эксплуатации растительного сухого вещества, и позволяет достичь более высокой концентрации этанола. Таким образом, снижается использование энергии, улучшается устойчивость и при маломощном ферментационном процессе снижаются капиталовложения.
Также гидролиз может быть проведен при низком значении рН. Это необходимо, поскольку биомасса часто предварительно обработана кислотой. В обработанной таким способом биомассе не требуется корректировать рН, если ферменты, впоследствии используемые для осахаривания, способны действовать при низких значениях рН. Это подразумевает снижение потребности, например, в гидроксиде натрия или сульфате кальция и подразумевает процесс, в котором отсутствует отработанная соль. Это имеет значение в процессе, в котором, например, производится топливный этанол, поскольку в таких процессах потребляются большие количества материала. Это позволяет проводить процесс, в котором не требуется корректировка рН, т.е. нет необходимости добавления кислот или оснований. Таким образом, способ может быть проведен как безотходный процесс (/его \уаЧе ргосекк) и/или процесс, в котором не требуется внесение неорганических химических веществ.
Кроме того, было показано, что ферментная композиция может эффективно гидролизовать биомассу при использовании высокого содержания сухого вещества. Крайне необходимо, чтобы ферменты, применяемые в производстве, например, топливного этанола, были способны функционировать в субстратах, обладающих высокой вязкостью (т.е. композиция с высоким содержанием сухой массы), поскольку это позволяет достичь более высоких количеств конечного продукта, например топливного этанола.
Кроме того, изобретение относится к способам получения полезных продуктов из лигноцеллюлозного материала с помощью ферментных композиций.
Краткое описание чертежей
На фиг. 1 представлены различные фенотипы колоний штамма Та1атотуее5 етегкопи ТЕС-1А. А) ТЕС-1А; В) ТЕС-101, четко выраженный белый воздушный мицелий (80% популяции); С) ТЕС-102, редуцированный воздушный мицелий (20% популяции); ТЕС-104, отсутствие воздушного мицелия, коричневый цвет (1% популяции).
На фиг. 2 представлены результаты времязависимых экспериментов в перемешиваемых колбах с вариантами штамма ТЕС-1А с различной морфологией колоний, выращиваемых на среде 2 для Та1аготуеек.
На фиг. 3 показана эффективность мутантов ТЕС-101 по выработке целлюлаз, индуцированных
- 2 021855
ΝΤΟ (Ы-метил-№-нитро-Н-нитрозогуанидином), во вторичных тестах в перемешиваемых колбах (среда 2 для Та1аготусе§). Анализ с пшеничной соломой осуществляли при рН 4,5 в течение 20 ч при 65°С с неразведенной надосадочной жидкостью. Представляющие интерес штаммы размещены относительно идентификационного штамма (ГО). Уровни целлюлаз выражены в единицах пшеничной соломы на мл (англ. тейеа! 5(га\у ιιηίυ рег тЛШйег), νδυ/мл. Уровень целлюлаз, вырабатываемый родительским контрольным штаммом ТЕС-101, указан жирной линией.
На фиг. 4 представлена сводка результатов скрининга третьего порядка в перемешиваемых колбах. Ферментации в среде 2 для Та1аготусе8 96 ч при 46°С с использованием спор со скошенного агара. ТЕС101* является спонтанным мутантом, который продуцирует более высокие, чем обычно, уровни целлюлаз. Анализ с пшеничной соломой осуществляли при рН 4,5 в течение 20 ч при 65°С. Синие столбики представляют неразведенные образцы; розовые столбики представляют образцы, разведенные четыре раза. Оранжевые столбики представляют уровень выработки целлюлаз родительским контролем ТЕС-101 и являются средним двух или трех экспериментов в перемешиваемых колбах.
На фиг. 5 показана зависимость преобразования пшеничной соломы от дозы. Штаммы, протестированные в перемешиваемых колбах: ТЕС-142 (·) и ТЕС-101 (♦). Активность целлюлазы выражена в единицах пшеничной соломы на мл, νδυ/мл.
На фиг. 6 показана кривая зависимости от дозы разведенных надосадочных жидкостей культур мутантов, выращенных в перемешиваемых колбах в среде 2 для Та1аготусе8 в течение 4 дней при 46°С и проанализированных на предмет уровней целлюлаз в анализе с пшеничной соломой, которые выражены в единицах пшеничной соломы на мл (νδυ/мл).
На фиг. 7 представлено сравнение выхода этанола ИЙгаке® ΝΕ (♦) и надосадочной жидкости ТЕС-142 (·) в дозазависимых экспериментах по ферментации с одновременным осахариванием (англ. δ^ΗΐΠ^ΟΗδ δассΗа^^Πсаι^оη РегтейаЕоп, δδΡ) на предварительно обработанной и отмытой пшеничной соломе. ТЕС-142 выращивали в течение 96 ч в 10 л методом периодической ферментации. Выработка этанола выражена в виде процента от максимального теоретического выхода этанола, полученного из 48,5% содержания глюкановых волокон (ΝΡΕΕ) предварительно обработанной пшеничной соломы, который отмечен по оси у как Макс. теоретический выход этанола (%).
На фиг. 8 представлено сравнение роста ТЕС-165, дерепрессированного по глюкозе мутанта по ферментам, относительно его репрессируемого по глюкозе родительского штамма ТЕС-147. Раствор спор (107/мл) помещали на ТЕС-среду и выращивали при 40°С в течение 3-4 дней. Размер колонии указывает степень роста.
На фиг. 9 показано сравнение активностей СВН Ι+ΙΙ и β-глюкозидазы ТЕС-165 относительно ТЕС101 с помощью флуоресцентных субстратов 4-метилумбеллиферил-в-О-целлобиозида (МПС) или 4метилумбеллиферил-в-Э-глюкозы (ΜυΟ) соответственно. Для получения одиночных колоний раствор спор (107/мл) каждого штамма рассевали штрихом на дуплицированных агаровых чашках с ТЕС-средой, содержащей 0,1 мМ МПС или МИО с 2% глюкозой или без неё. Чашки инкубировали при 40°С в течение 1-2 дней. Чашки фотографировали в УФ-свете (366 нм). Светлые области агаровой чашки являются флуоресцентным (синим) сигналом, вызванным гидролизом субстрата целлюлазами, вырабатываемыми в ходе грибного роста; размер и интенсивность флуоресцентного сигнала указывает на степень активности фермента.
На фиг. 10 представлено сравнение ксиланазной активности дерепрессированных по глюкозе мутантов ТЕС-165, ТЕС-199, ТЕС-201 и ТЕС-207 с недерепрессированными по глюкозе родительскими штаммами ТЕС-147 и ТЕС-193 с помощью цветных субстратов ΑΖΟΕ. Для получения одиночных колоний раствор спор (107/мл) каждого штамма рассевали штрихом на агаровых чашках со средой ТЕС, содержащих 0,1% ΑΖΟΕ и 2% глюкозу. Чашки инкубировали при 40°С в течение 3-4 дней. Размер и интенсивность темных областей (синее гало), окружающих грибной рост, указывают на степень ферментативной активности.
Подробное описание изобретения
По всему данному описанию и в сопровождающих пунктах формулы изобретения слова содержать, включать и их вариации, такие как содержит, содержащий, включает и включающий, должны толковаться включительно. Т.е. эти слова призваны передать идею возможного включения других элементов или целых, специально не перечисленных, там, где позволяет контекст.
Слова в единственном числе также подразумевают множественное число. К примеру, элемент может обозначать один элемент или больше одного элемента.
Штаммы Та1аготусе8 по изобретению обладают целлюлолитической активностью по меньшей мере 6 РРИ2%/мл. Предпочтительно, если они имеют целлюлолитическую активность по меньшей мере 7 ЕРИ^/мл, по меньшей мере 8 или по меньшей мере 9, более предпочтительно по меньшей мере 10, по меньшей мере 11, по меньшей мере 12, по меньшей мере 13, по меньшей мере 14, по меньшей мере 15, по меньшей мере 16, по меньшей мере 17, по меньшей мере 18, по меньшей мере 19, по меньшей мере 20 ЕРИ^/мл. Предпочтительными диапазонами целлюлолитической активности являются 6-300 РРи2%/мл,
6-150 РРи2%/мл или 10-75 РРи2%/мл. Для активности ΕΟ - 5000-200000 УВСИ/мл, 5000-100000 и 8000- 3 021855
50000 А'ВПАмл. В данном документе измеренная целлюлолитическая активность основана на модифицированном способе Абиеу и Вакег, который описан в примерах, и выражена в единицах, сокращенно обозначенных как РРи2%/мл. Высокая целлюлолитическая активность желательна, поскольку она снижает конечную стоимость ферментной композиции, которую можно получить из штамма.
Предпочтительно, если штаммы Та1аготусе8 имеют эндоглюканазную активностью по меньшей мере 5000 \УВСи/мл, более предпочтительно по меньше мере 6000 ^ВСИ/мл, более предпочтительно по меньшей мере 7000 \УВСи/мл, более предпочтительно по меньшей мере 8000 ^ВСИ/мл, более предпочтительно по меньшей мере 9000 \УВСи/мл или наиболее предпочтительно по меньшей мере 10000 ^ВСИ/мл или больше. Предпочтительными диапазонами для эндоглюканазной активности являются 5000-200000 ^ВСИ/мл, 5000-100000 или 8000-50000 ^ВСИ/мл. В данном документе измеренная эндоглюканазная активность штаммов основана на способе, который описан в примерах, и выражена в Единицах Целлюлазы Белой Биотехнологии (англ. \У1Ше Вю1есН Се11и1а8е ииЙ8)/мл, сокращенно обозначенная как ^ВСИ/мл. Высокая эндоглюканазная активность является желательной, поскольку эндоглюканазная активность даст больше ферментативных участков для экзоглюканаз (СВН I и II), присутствующих в ферментной композиции, при этом субстрат может быть деградирован более быстро.
Предпочтительно, если штаммы Та1аготусе8 обладают низкой протеазной активностью, в частности низкой активностью кислых протеаз по большей мере 60 АРИ/мл, по большей мере 50 АРИ/мл, по большей мере 40 АРИ/мл, наиболее предпочтительно по большей мере 35 АРИ/мл, по большей мере 30 АРИ/мл, по большей мере 20 АРИ/мл, по большей мере 10 АРИ/мл. В данном документе измеренная активность кислых протеаз основана на способе, который описан в примерах, и выражена в Единицах Кислой Протеазы (англ. АсИ Рго!еа§е ииЙ8)/мл, сокращенно обозначенная как АРИ/мл. Желательная низкая протеазная активность поможет получить более стабильную (рассчитанную на длительный период) ферментную композицию.
Предпочтительно, если штамм Та1агошусе8 имеет споруляцию и продуцирует титр спор по меньшей мере 106/мл. Хорошая споруляция облегчает дальнейшее улучшение штамма классическими способами или способами генной инженерии.
Изобретение также относится к Мутантным штаммам Та1агошусе8, полученным мутацией штамма Та1агошусе8 дикого типа, где уровни одного или нескольких белков СВН I, СВН II, ЕС/СЕА, ЕС/СЕВ, ксиланазы, ацетилксиланэстеразы, сволленин-подобного белка, ЕС/СН61 и/или белка, деградирующего углеводы, имеющего молекулярную массу около 22993 Да, увеличиваются по меньшей мере в 1,5 раза относительно уровня белка в штамме Та1агошусе8 дикого типа, предпочтительно по меньшей мере в 2 раза.
В любом воплощении вышеуказанного СВН I имеет молекулярную массу около 48690 Да, и/или СВН II имеет молекулярную массу около 46674 Да, и/или ЕС/СЕА имеет молекулярную массу около 36825 Да, и/или ЕС/СЕВ имеет молекулярную массу около 51462 Да, и/или ацетилксиланксилаза имеет молекулярную массу около 48690 Да, и/или сволленин-подобный белок имеет молекулярную массу около 67911 Да, и/или ЕС/СН61 имеет молекулярную массу около 27007 Да.
Молекулярные массы в данном документе рассчитываются на основе последовательности аминокислот и выражаются в Да.
Уровни белков в данном документе определяются по данным АРЕХ, как описано в примере 14, за исключением тех ситуаций, для которых указано применение другого способа, например ДСН-ПААГ или протеазного анализа. В таких ситуациях способ будет осуществлен, как описано в примерах.
В любом воплощении в штаммах Та1агошусе8 по изобретению уровень белков СВН I, СВН II, ЕС/СЕА, ЕС/СЕВ, ксиланазы, ацетилксиланэстеразы, сволленин-подобного белка, ЕС/СН61 и белка, деградирующего углеводы, имеющего молекулярную массу около 22993 Да, повышен по меньшей мере в 1,5 раза, предпочтительно повышен по меньшей мере в 2 раза.
В любом воплощении в мутантных штаммах Та1агошусе8 по изобретению уровень белка одного или нескольких белков, а именно ЕС/СН61, сволленин-подобного белка и/или белка, деградирующего углеводы (Тетег1170), повышен относительно штамма Та1агошусе8 дикого типа, предпочтительно, если уровень выше по меньшей мере в 2 раза.
В любом воплощении в мутантных штаммах Та1аготусе8 по изобретению, имеющих сравнимый со штаммом Та1аготусе8 дикого типа уровень белков одного или нескольких из эндоглюканазы ЕС, ксилозидазы, хитиназы и/или протеазы, снижен относительно выработки в штамме Та1аготусе8 дикого типа, предпочтительно, если выработка снижена по меньшей мере в 2 раза. В любом воплощении в мутантных штаммах Та1аготусе8 по изобретению есть эндоглюканаза, ЕС, которая имеет молекулярную массу около 24136 Да, и/или ксилозидаза, которая имеет молекулярную массу около 95022 Да, и/или хитаназа, которая имеет молекулярную массу около 45111 Да, и/или протеаза, которая имеет молекулярную массу около 28800 Да.
В любом воплощении мутантные штаммы Та1аготусе8 по изобретению имеют отношение уровня белка ЕС/СН61 к сумме уровней белков а) ЕС, Ь) ЕС/СЕА и с) ЕС/СЕВ, равное по меньшей мере 0,8, предпочтительно по меньшей мере 1,0.
В любом воплощении мутантные штаммы Та1аготусе8 по изобретению продуцируют белки СВН I,
- 4 021855
СВН II, ЕС/СЕЛ, ЕС/СЕВ, ксиланазы, ацетилксиланэстеразы, сволленин-подобный белок, ЕС/СН61 и белок, деградирующий углеводы, Тетег01170, которые не репрессируются глюкозой.
В одном воплощении штаммом Та1атотусек ететкопи является ТЕС-142 (также обозначаемый как РВС 142), депонированный в СЕЭТКЛЛИ ВИКЕЛИ УООК ЗСН1ММЕЕСИЕТИКЕ8, Иррка1а1ааи 8, Р.О. Вох 85167, N6-3508 ΆΌ Утрехт, Нидерланды, 1 июля 2009 г., имеющий регистрационный номер СВЗ 124902, или его функционально эквивалентный мутант или потомок.
В одном воплощении штаммом Та1аготусек ететкопи является ТЕС-192 (также обозначаемый как РВС 192), депонированный в СЕЭТКЛЛИ ВИКЕЛИ УООК 8СШММЕЬСиЬТИКЕ8, Иррка1а1ааи 8, Р.О. Вох 85167, ΝΣ-3508 АО Утрехт, Нидерланды, 25 июня 2010 г., имеющий регистрационный номер СВ8 127389, или его функционально эквивалентный мутант или потомок.
Изобретение также относится к ферментным композициям, содержащим целлобиогидролазу (СВН) и эндоглюканазу (ЕС), где композиция содержит 40% (относительный % белка к общему белку, основанный на изображении ДСН-ПААГ) или больше СВН и 20% (относительный % белка к общему белку, основанный на изображении ДСН-ПААГ) или больше ЕС. Предпочтительно, если ферментные композиции имеют протеазные активности по большей мере 60 ЛРИ/мл, по большей мере 50 ЛРИ/мл, по большей мере 40 ЛРИ/мл или по большей мере 35 ЛРИ/мл.
Изобретение также относится к способу преобразования лигноцеллюлозного материала в полезный продукт, включающий следующие стадии: а) предварительной обработки одного или нескольких лигноцеллюлозных материалов для получения предварительно обработанного лигноцеллюлозного материала; Ь) ферментативной обработки предварительно обработанного лигноцеллюлозного материала для получения одного или нескольких сахаров; с) преобразования сахара в один или несколько полезных продуктов и б) разделения одного или нескольких полезных продуктов, где в стадии а), Ь) или с) добавляют или применяют ферментную композицию.
Предпочтительно, если в этом способе лигноцеллюлозным материалом являются садовые обрезки, чапаррель, отходы лесопильного производства, городские древесные отходы, городские отходы, отходы лесозаготовок, отходы, полученные при прореживании леса, деревянистые структуры с коротким циклом, индустриальный мусор, пшеничная солома, овсяная солома, рисовая солома, ячменная солома, ржаная солома, льняная солома, соевая шелуха, рисовая шелуха, рисовая солома, кукурузный глютеновый корм, овсяная шелуха, сахарный тростник, кукурузная солома, стебли кукурузы, стержни кукурузных початков, кукурузная шелуха, мискант, сорго сахарное, стебли канолы, стебли сои, бородач, трипсакум, лисохвост; свекловичный жом, мякоть цитрусовых плодов, семенные оболочки, целлюлозосодержащие отходы животных, настриг с лужаек, хлопок, морские водоросли, мягкая древесина, тополь, сосна, кустарники, травы, пшеница, жмых сахарного тростника, кукуруза, листовые обертки початка кукурузы, кукурузная сердцевина, волокна из сердцевин, продукты и побочные продукты помола злаков мокрым или сухим способом, твердые городские отходы, макулатура, садовые отходы, травянистый материал, сельскохозяйственные отходы, отходы лесного хозяйства, макулатура, пульпа, отходы бумажного производства, ветки, кустарники, тростники, энергетическая сельскохозяйственная культура, лесоматериал, фрукты, цветы, зерно, трава, травянистые культуры, листья, кора, иглы, бревна, корни, саженцы, кусты, просо, деревья, овощи, фруктовая кожура, виноград, жом сахарной свеклы, пшеничная крупка, овсяная шелуха, твердое или мягкое дерево, материал органических отходов, полученный в ходе сельскохозяйственного процесса, или древесные отходы лесного хозяйства, или комбинация любых двух или нескольких из них. Описанная выше стадия а) является предварительной обработкой одного или нескольких лигноцеллюлозных материалов для получения предварительно обработанного лигноцеллюлозного материала. В стадии предварительной обработки сырье может быть предварительно обработано нагреванием, механической и/или химической модификацией или любой комбинацией таких способов в целях усиления доступности субстрата ферментативному гидролизу и/или для гидролиза гемицеллюлозы и/или для солюбилизации гемицеллюлозы и/или целлюлозы и/или лигнина, любым известным в данной области способом. Предварительная обработка может включать воздействие на лигноцеллюлозный материал (горячей) водой, паром (паровым взрывом), кислотой, основанием, растворителем, нагреванием, пероксидом, озоном, механическим измельчением, дроблением, перемалыванием или быстрым сбросом давления или комбинацией любых двух или нескольких из перечисленного. Химическую предварительную обработку часто объединяют с термической предварительной обработкой, например, в диапазоне 150-220°С в течение от 1 до 30 мин.
Предпочтительно, если в способе по изобретению полезным продуктом являются этанол, бутанол, молочная кислота, пластмассы, органическая кислота, растворитель, добавка к корму для животных, лекарственное средство, витамин, аминокислота, фермент или химическое сырье. Настоящее изобретение относится к композиции, которая содержит целлюлазную и/или гемицеллюлазную ферментативную активность и которая обладает способностью модифицировать, например деградировать, некрахмальный углеводный материал. Некрахмальный углеводный материал является материалом, который содержит, состоит из или в существенной степени состоит из одного или нескольких некрахмальных углеводов. Углевод в данном контексте включает все сахариды, например полисахариды, олигосахариды, дисахариды или моносахариды.
- 5 021855
Композиция, описанная в данном документе, как правило, модифицирует некрахмальный углеводный материал химической модификацией такого материала. Химическая модификация углеводного материала может привести к деградации такого материала, например гидролизом, окислением или другой химической модификацией, такой как действие лигазы.
Некрахмальным углеводом, который подходит для модификации композицией, так как описано в данном документе, является лигноцеллюлоза. Основными полисахаридами, содержащими различные лигноцеллюлозные остатки, которые могут рассматриваться как потенциальный возобновляемый источник сырья, являются целлюлоза (глюканы). гемицеллюлозы (ксиланы, гетероксиланы и ксилоглюканы). Кроме того, некоторые гемицеллюлозы могут присутствовать в виде глюкоманнанов, например, в сырье, полученном из древесины. Ферментативный гидролиз этих полисахаридов до растворимых сахаров, включая как мономеры, так и мультимеры, например глюкозу, целлобиозу, ксилозу, арабинозу, галактозу, фруктозу, маннозу, рамнозу, рибозу, галактуроновую кислоту, глюкуроновую кислоту и другие гексозы и пентозы, включает действие различных ферментов, действующих совместно.
Кроме того, значительную долю сухой массы обычной клеточной стенки тканей недревесного растения могут составить пектины и другие пектиновые субстанции, такие как арабинаны (от около четверти до половины сухой массы могут быть пектинами).
Целлюлоза является линейным полисахаридом, состоящим из глюкозных остатков, связанных β1,4-связями. Линейная природа целлюлозных волокон, а также стехиометрия β-связанной глюкозы (относительно α-) образует структуры, которые более склонны к образованию водородных связей между цепями, чем сильно разветвленные α-связанные структуры крахмала. Таким образом, целлюлозные полимеры, в общем, менее растворимы и образуют более тесно связанные волокна, чем волокна, обнаруженные в крахмале.
Эндоглюканазы (ЕО) и экзоцеллобиогидролазы (СВН) катализируют гидролиз нерастворимой целлюлозы на целлоолигосахариды (с целлобиозой в качестве основного продукта), в то время как βглюкозидазы (ВО) преобразуют олигосахариды, главным образом целлобиозу и целлотриозу, в глюкозу.
Гемицеллюлоза является сложным полимером, и её композиция часто широко варьирует от организма к организму и от одного типа ткани к другому. В общем, основным компонентом гемицеллюлозы является в-1,4-связанная ксилоза, пятиуглеродный сахар. Однако эта ксилоза часто ветвиться в положениях 0-3 и/или 0-2 атома ксилозы и может быть заменена арабинозой, галактозой, маннозой, глюкуроновой кислотой, галактуроновой кислотой или этерифицирована уксусной кислотой (а арабиноза может быть этерифицирована ферруловой кислотой). Гемицеллюлоза также может содержать глюкан, который является общим названием для β-связанных шестиуглеродных сахаров (таких как β-(1,3)(1,4) глюканы и гетероглюканы, упомянутые выше) и дополнительно глюкоманнаны (в которых как глюкоза, так и манноза присутствуют в линейном каркасе, связанные друг с другом β-связями).
Ксиланазы вместе с другими вспомогательными ферментами, например с α-Ь-арабинофуранозидазами, ферулоил- и ацетилксиланэстеразами, глюкуронидазами и β-ксилозидазами катализируют гидролиз гемицеллюлоз.
Пектиновые вещества включают пектины, арабинаны, галактаны и арабиногалактаны. Пектины являются наиболее сложными полисахаридами в клеточной стенке растений. Они надстраиваются вокруг основной цепи из а(1,4)-связанных единиц Ό-галактуроновой кислоты, чередующейся в определенном порядке с Ь-рамнозой. В любой клеточной стенке существует множество структурных единиц, которые соответствуют этому описанию, и, в общем, считается, что они являются единой пектиновой молекулой, в которой основные цепи и различные структурные единицы непрерывно следуют друг за другом.
Основными типами структурных единиц являются галактоуронан (гомогалактоуронан), который может быть заменен метанолом на карбоксильной группе и ацетатом в О-2 и О-3; рамногалктоуронан I (КО1), в котором единицы галактуроновой кислоты чередуются с единицами рамнозы, несущими боковые цепи с (1,4)-связанным галактаном и (1,5)-связанным арабинаном. Арабинановые боковые цепи могут быть прикреплены напрямую к рамнозе или ненапрямую через галактановые цепи; ксилогалактуронан с одиночными ксилозильными единицами на О-3 галактуроновой кислоты (тесно ассоциированной с КО1); и рамногалактуронан II (КОП), особенно сложная минорная единица, содержащая необычные сахара, например апиозу. Единица ΚΟΙΙ может содержать два апиозных остатка, которые в подходящих ионных условиях могут обратимо образовывать эфиры с боратом.
Ферментная композиция будет содержать ферментативные активности, как правило, полученные из сапрофитного грибного микроорганизма класса РешсШшт и из рода Та1аготусек, например из Та1аготусек етегкопи. Та1аготусек етегкопн также может называться ОеоктПЫа етегкопи или РешсШшт етегкопи. Та1аготусек етегкопи также называют Та1аготусек биропй и РешсШшт биропй.
Ферментная композиция содержит по меньшей мере две активности, хотя, как правило, композиция будет содержать больше чем две активности, например три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять или больше. Как правило, ферментная композиция изобретения может содержать по меньшей мере одну целлюлазу и по меньшей мере одну гемицеллюлазу. Однако ферментная композиция изобретения может содержать целлюлазы, но не ксиланазы. Кроме того, композиция изобретения может содержать дополни- 6 021855 тельную ферментную активность, т.е. дополнительную активность, которая либо напрямую, либо косвенно приводит к деградации лигноцеллюлозы. Примеры таких вспомогательных активностей упомянуты в данном документе.
Таким образом, ферментная композиция может содержать эндоглюканазную активность, и/или целлобиогидролазную активность, и/или β-глюкозидазную активность. Ферментная композиция может содержать больше чем одну ферментную активность в одном или нескольких этих классах. Например, ферментная композиция может содержать две эндоглюканазные активности, например эндо-1,3(1,4)-в глюканазную активность и эндо-в-1,4-глюканазную активность. Такая композиция может также содержать одну или несколько ксиланазных активностей. Такая композиция может содержать вспомогательную ферментативную активность.
Ферментная композиция может быть получена из Та1аготусек етегкопп. В изобретении предполагается, что основной набор (деградирующих лигноцеллюлозу) ферментативных активностей может быть получен из Та1аготусек етегкопп. Та1аготусек етегкопи может предоставить высокоэффективный набор активностей для гидролиза лигноцеллюлозной биомассы, что продемонстрировано в данном документе. Такая активность может затем быть дополнена дополнительными ферментативными активностями из других источников. Такие дополнительные активности могут быть получены из классических источников и/или получены посредством генетически модифицированного организма.
Активности ферментной композиции могут быть термостабильными. В данном документе это означает, что активность имеет температурный оптимум 40°С или выше, например около 50°С или выше, например около 60°С или выше, например около 70°С или выше, например около 75°С или выше, например около 80°С или выше, например 85°С или выше. Активности в ферментной композиции, как правило, не будут иметь тот же температурный оптимум, но предпочтительно будут тем не менее термостабильными.
Кроме того, ферментные активности в ферментной композиции способны работать при низком рН. Для целей этого изобретения низкое значение рН означает рН около 5,5 или ниже, около 5 или ниже, около 4,5 или ниже, около 4,0 или ниже, около 3,8 или ниже или около 3,5 или ниже.
Активности в ферментной композиции могут быть определены комбинацией любых значений вышеупомянутого температурного оптимума и рН.
Примененная в способе изобретения композиция может содержать в дополнение к активностям, полученным из Та1аготусек, целлюлазу (например, полученную из источника, отличного от Та1аготусек) и/или гемицеллюлазу (например, полученную из источника, отличного от Та1аготусек) и/или пектиназу.
Ферментная композиция может содержать один, два или три класса целлюлаз, например одну, две или все из перечисленного: эндоглюканазу (ЕС), экзоцеллобигидролазу (СВН) и β-глюкозидазу (ВС). Ферментная композиция может содержать два или несколько этих классов целлюлаз.
Ферментная композиция изобретения может содержать активность, которая имеет другой тип целлюлазной активности и/или гемицеллюлазной активности и/или пектиназной активности, чем та, что представлена в ферментной композиции. Например, композиция изобретения может содержать первый тип целлюлазной, и/или гемицеллюлазной активности, и/или пектиназной активности, предоставленной композицией, как описано в данном документе, и второй тип целлюлазной, и/или гемицеллюлазной активности, и/или пектиназной активности, предоставленной дополнительной целлюлазой/гемицеллюлазой/пектиназой.
В данном документе целлюлаза является любым полипептидом, который способен деградировать или модифицировать целлюлозу. Полипептид, который способен деградировать целлюлозу, является полипептидом, который способен катализировать процесс разрушения целлюлозы на более мелкие единицы, либо частично, например в целлодекстрины. либо полностью, в глюкозные мономеры. Целлюлаза по изобретению может дать смешанную популяцию целлодекстринов и мономеров глюкозы при контакте с целлюлозой. Такая деградация будет, как правило, проводится путем реакции гидролиза.
В данном документе гемицеллюлаза является любым полипептидом, который способен деградировать или модифицировать гемицеллюлозу. Иначе говоря, гемицеллюлаза может быть способна деградировать или модифицировать один или несколько из представленного: ксилан, глюкуроноксилан, арабиноксилан, глюкоманнан и ксилоглюкан. Полипептид, который способен деградировать гемицеллюлозу, является ферментом, который способен катализировать процесс разрушения гемицеллюлозы на более мелкие полисахариды либо частично, например, на олигосахариды, либо полностью на мономеры сахара, например гексозный или пентозный сахарные мономеры. Гемицеллюлаза по изобретению может дать смешанную популяцию олигосахаридов и мономеров сахаров при контакте с гемицеллюлозой. Такая деградация будет, как правило, проводиться путем реакции гидролиза.
В данном документе пектиназа является любым полипептидом, который способен деградировать или модифицировать пектин. Полипептид, который способен деградировать пектин, является полипептидом, который способен катализировать процесс разрушения пектина на более мелкие единицы либо частично, например, в олигосахариды, либо полностью в мономеры сахаров. Пектиназа по изобретению может дать смешанную популяцию олигосахаридов и мономеров сахаров при контакте с пектином. Та- 7 021855 кая деградация будет, как правило, проводится путем реакции гидролиза.
Соответственно, композиция изобретения может содержать любую целлюлазу, например целлобиогидролазу и эндо-в-1,4-глюканазу, β-глюкозидазу или в-(1,3)(1,4)-глюканазу.
В данном документе целлогидролазой (ЕС 3.2.1.91) является любой полипептид, который способен катализировать гидролиз 1,4ф-О-гликозидных связей в целлюлозе или целлотетраозе, высвобождая целлобиозу с концов цепей. Этот фермент может также называться целлюлазой 1,4-в-целлобиозидазой, 1,4β-целлобиогидролазой, 1,4-в-Э-глюканцеллобиогидролазой, авицелазой, экзо-1,4-в-Э-глюканазой, экзоцеллобиогидролазой или экзоглюканазой. Целлобиогидролазы могут быть дополнительно разделены на целлобиогидролазу I (СВН I) и целлобиогидролазу II (СВН II). СВН I определяются как целлобиогидролазы, которые гидролизуют целлюлозу, главным образом, с восстанавливающих концов, отщепляя целлобиозу. СВН II определяются как целлобиогидролазы, которые гидролизуют целлюлозу, главным образом, с невосстанавливающих концов, отщепляя целлобиозу.
В данном документе эндо-в-1,4-глюканазой (ЕС 3.2.1.4) является любой полипептид, который способен катализировать эндогидролиз 1,4ф-О-глюкозидных связей в целлюлозе, лихенине или β-Ό-глюканах зерновых. Такой полипептид также может быть способен гидролизовать 1,4-связи в β-Ό-глюканах, также содержащих 1,3-связи. Этот фермент может также называться целлюлазой, авицелазой, в-1,4-эндоглюкангидролазой, в-1,4-глюканазой, карбоксиметилцеллюлазой, целлудекстриназой, эндо-1,4-в-О-глюканазой, эндо-1.4-в-Эглюканогидролазой, эндо-1,4ф-глюканазой или эндоглюканазой. СЕА в данном документе является эндоглюканазой ЕС 3.2.1.4, которая на основании ее трехмерной структуры классифицируется как относящаяся к семейству 5 гликозилгидролаз (СН5). Известные активности СН5 включают хитозаназу (ЕС 3.2.1.132); βманнозидазу (ЕС 3.2.1.25); целлюлазу (ЕС 3.2.1.4); глюкан 1,3ф-глюкозидазу (ЕС 3.2.1.58); лихенниназу (ЕК 3,2.1.73); глюкан эндо-1,6-в-глюкозидазу (ЕС 3.2.1.75); маннаноэндо-в-1,4-маннозидазу (ЕС 3.2.1.78), эндо-β1,4-ксиланазу (ЕС 3.2.1.8): целлюлозо-1,4-целлобиозидазу (ЕС 3.2.1.91): эндоф-1,6-галактаназу (ЕС 3.2.1.-); β1.3- маннаназу (ЕС 3.2.1.-); ксилоглюкан-специфичную эндоф-1,4-глюканазу (ЕС 3.2.1.151); маннанотрансглюкозилазу (ЕС 2.4.1.-). СЕВ в данном документе является эндоглюканазой ЕС 3.2.1.4, которая на основании ее трехмерной структуры классифицируется как относящаяся к семейству 7 гликозилгидролаз (СН7). Известные активности СН7 включают эндоф-1,4-глюканазу (ЕС 3.2.1.4); [действующую на восстанавливающих концах] целлобиогидролазу (ЕС 3.2.1.-); хитозаназу (ЕС 3.2.1.132): эндо-β-1,3-1,4-глюканазу (ЕС 3.2.1.73).
В данном документе β-глюкозидазой (ЕС 3.2.1.21) является любой полипептид, который способен катализировать гидролиз концевых, невосстанавливающих остатков β-Ό-глюкозы с высвобождением βΌ-глюкозы. Такой полипептид может обладать широкой специфичностью по отношению к β-Όглюкозидам и может также гидролизовать одно или несколько из представленных: β-Ό-галактозид, α-Ьарабинозид, β-Ό-ксилозид или β-Ό-фукозид. Этот фермент может также называться амигдалазой, β-Όглюкозидглюкогидролазой, целлобиазой или гентобиазой.
В данном документе β-(1,3)(1,4)-глюканазой (ЕС 3.2.1.73) является любой полипептид, который способен катализировать гидролиз 1,4ф-О-глюкозидных связей в β-Ό-глюканах, содержащих 1,3- и 1,4связи. Такие полипептиды могут действовать на лихенин и β-Ό-глюканы зерновых, но не на β-Όглюканы, содержащие только 1,3- или 1,4-связи. Этот фермент может также называться лихениназой,
1.3- 1,4ф-О-глюкан-4-глюканогидролазой, β-глюканазой, эндоф-1,3-1,4-глюканазой, лихеназой или βглюконазой смешанных связей. Альтернативой для этого типа фермента является ЕС 3.2.1.6, который описан как эндо-1,3(4)ф-глюконаза. Этот тип фермента гидролизует 1,3- или 1,4-связи в β-Ό-глюканах, когда остаток глюкозы, чья восстанавливающая группа участвует в образовании гидролизуемой связи, самозамещается по С-3. Альтернативные названия включают эндо-1,3-бетаглюканазу, ламинариназу, 1,3(1,3;1,4)ф-О-глюкан 3 (4) глюканогидролазу; субстраты включают ламинарии, лихенин и β-Ό-гликаны зерновых.
Ферментная композиция изобретения может содержать любую гемицеллюлазу, например эндоксиланазу, β-ксилозидазу, α-Ь-арабинофуранозидазу, α-Ό-глюкуронидазу, ацетилксиланэстеразу, феруоилэстеразу, кумароилэстеразу, α-галактозидазу, β-галактозидазу, β-маннаназу или β-маннозидазу.
В данном документе эндоксиланаза (ЕС 3.2.1.8) является ферментом, который способен катализировать эндогидролиз 1,4ф-О-ксилозидных связей в ксиланах. Этот фермент также называют эндо-1,4фксиланазой или 1,4ф-О-ксиланксиланогидролазой. Альтернативой является ЕС 3.2.1.136, глюкуроноарабиноксиланэндоксиланаза, фермент, который способен гидролизовать 1,4-ксилозидные связи в глюкуроноарабиноксиланах.
В данном документе β-ксилозидазой (ЕС 3.2.1.37) является любой полипептид, который способен катализировать гидролиз ^ф-О-ксиланов, удалять последовательные остатки Ό-ксилозы с невосстановливающих концов. Такие ферменты могут также гидролизовать ксилобиозу. Этот фермент также называется ксилан-1,4ф-ксилозидазой, 1,4ф-О-ксиланксилогидролазой, экзо-1,4ф-ксилозидазой или ксилобиазой.
В данном документе α-Ь-арабинофуранозидазой (ЕС 3.2.1.55) является любой полипептид, который
- 8 021855 способен действовать на α-Ь-арабинофуранозиды, α-Ь-арабинаны, содержащие (1,2)- и/или (1,3)- и/или (1,5)-связи, арабиноксиланы и арабиногалктаны. Этот фермент может также называться α-Ν-арабинофуранозидаза, арабинофуранозидаза или арабинозидаза.
В данном документе α-Ό-глюкуронидазой (ЕС 3.2.1.139) является полипептид, который способен катализировать реакцию следующего вида: α-Ό-глюкоронозид +Н2О=спирт + Ό-глюкуронат. Этот фермент также может называться альфа-глюкоронидазой или альфа-глюкозидуроназой. Эти ферменты также могут гидролизовать 4-О-метилированную глюкуроновую кислоту, которая также может присутствовать в качестве заместителя в ксиланах. Альтернативой является ЕС 3.2.1.131: ксилан-альфа-1,2-глюкуронозидаза, которая катализирует гидролиз альфа-1,2-(4-О-метил)глюкуронозильных связей.
В данном документе ацетилксиланэстеразой (ЕС 3.1.1.72) является любой полипептид, который способен катализировать деацетилирование ксиланов и ксилоолигосахаридов. Такой полипептид может катализировать гидролиз ацетильных групп на полимерном ксилане, ацетилированной ксилозе, ацетилированной глюкозе, альфа-нафтилацетате или β-нитрофенилацетате, но как правило, не на триацетилглицерине. Такой полипептид, как правило, не действует на ацетилированный маннан или пектин.
В данном документе, феруоилэстеразой (ЕС 3.1.1.73) является любой полипептид, который способен катализировать реакцию вида: феруоил-сахарид + Н2О=ферулат + сахарид. Сахарид может быть, например, олигосахаридом или полисахаридом. Он может, как правило, катализировать гидролиз 4гидрокси-3-метоксициннамоильной (феруоильной) группы на этерифицированном сахаре, которым обычно в естественных субстратах является арабиноза. β-Нитрофенолацетат и метилферулат, как правило, являются более слабыми субстратами. Этот фермент также называют гидролазой циннамоилового эфира, эстеразой феруловой кислоты или гидроксициннамоилэстеразой. Он также может называться вспомогательным ферментом гемицеллюлазы, поскольку он может помогать ксиланазам и пектиназам разрушать гемицеллюлозу и пектин клеточной стенки растений.
В данном документе кумароилэстеразой (ЕС 3.1.1.73) является любой полипептид, который способен катализировать реакцию вида: кумароил-сахарид + Н2О=кумарат + сахарид. Сахарид может быть, например, олигосахаридом или полисахаридом. Этот фермент также называют транс-4-кумароилэстеразой, транс-в-кумароилэстеразой, β-кумароилэстеразой или эстеразой β-кумаровой кислоты. Этот фермент также входит в ЕС 3.1.1.73, так что также может называться ферруоилэстеразой.
В данном документе α-галактозидазой (ЕС 3.2.1.22) является любой полипептид, который способен катализировать гидролиз конечных, невосстанавливающих α-Ό-галактозных остатков в α-Ό-галактозидах, включая галактозные олигосахариды, галактоманнаны, галактаны и арабиногалактаны. Такой полипептид может быть способен гидролизовать α-Ό-фукозиды. Этот фермент может также называться мелибиазой.
В данном документе β-галактозидазой (ЕС 3.2.1.23) является любой полипептид, который способен катализировать гидролиз концевых невосстанавливающих остатков β-Ό-галактозы в β-Ό-галактозидах. Такой полипептид может быть способен гидролизовать α-Ь-арабинозиды. Этот фермент также может называться экзо-(1 ч4)-β-^-галактаназой или лактазой.
В данном документе β-маннаназой (ЕС 3.2.1.78) является любой полипептид, который способен катализировать статистический гидролиз Щ^-О-маннозидных связей в маннанах, галактоманнанах и глюкоманнанах. Этот фермент также может называться маннаноэндо-1,4-β-маннозидазой или эндо-1,4маннаназой.
В данном документе β-маннозидазой (ЕС 3.2.1.25) является любой полипептид, который способен катализировать гидролиз концевых невосстанавливающих остатков β-Ό-маннозы в β-Ό-маннозидах. Этот фермент также может называться маннаназой или манназой.
Ферментная композиция изобретения может содержать любую пектиназу, например эндополигалактуроназу, пектинметилэстеразу, эндогалактаназу, бета-галактозидазу, пектинацетилэстеразу, эндопектинолиазу, пектатлиазу, альфа-рамнозидазу, экзо-галактуроназу, экзполиглактуронатлиазу, рамногалактуронангидролазу, рамногалактуронанлиазу, рамногалактуронанацетилэстеразу, рамногалактуронангалактуроногидролазу и ксилогалактуроназу.
В данном документе эндо-полигалактуроназа (ЕС 3.2.1.15) является любым полипептидом, который способен катализировать случайный гидролиз 1,4-а-О-галактозидуроновые связи в пектате и других галактуронанах. Этот фермент также может называться полигалактуроназа, пектиндеполимераза, пектиназа, эндополигалактуроназа, пектолаза, пектингидролаза, пектинполигалактуроназа, поли-а-1,4-галактуронидгликангидролаза, эндогалактуроназа; эндо-О-галактуроназа или поли(1,4-а-Э-галактуронид)гликангидролаза.
В данном документе пектинметилэстераза (ЕС 3.1.1.11) является любым ферментом, который способен катализировать реакцию: пектин + η Н2О=п метанол + пектат. Фермент также может быть известен как пектинэстераза, пектиндеметоксилаза, пектинметоксилаза, пектинметилэстераза, пектаза, пектиноэстераза или пектинпектилгидролаза.
В данном документе эндо-галактаназа (ЕС 3.2.1.89) является ферментом, который способен катали- 9 021855 зировать эндогидролиз 1.4-в-О-галактозидных связей в арабиногалактанах. Фермент также может быть известен как арабиногалактанэндо-1,4-в-галактозидаза, эндо-1,4-в-галактаназа, галактаназа, арабиногалактаназа или арабиногалактан-4-в-О-галактаногидролаза.
В данном документе пектинацетилэстераза определяется как любой фермент, который имеет ацетилэстеразную активность, которая катализирует деацетилирование ацетильных групп на гидроксильных группах остатков ОаША пектина.
В данном документе эндо-пектинлиазой (ЕС 4.2.2.10) является любой фермент, способный катализировать элиминирующее расщепление (1^4)-а-О-галактуронанметилового эфира для получения олигосахаридов с 4-деокси-6-О-метил-а-Э-галакт-4-энуронозиловых группами на их невосстанавливающих концах. Фермент также может быть известен как пектинлиаза, пектин-транс-элиминаза; эндопектинлиаза, полиметилгалактуроновая трансэлиминаза, пектинметилтрансэлиминаза, пектолиаза, РЬ, РМЬ или РМСЬ или (1^4)-6-О-метил-а-О-галактуронанлиаза.
В данном документе пектатлиаза (ЕС 4.2.2.2) является любым ферментом, способным катализировать элиминирующее расщепление (1^4)-а-О-галактоуронана для получения олигосахаридов с 4деокси-а-Э-галакт-4-энуронозильными группами на их невосстанавливающих концах. Фермент также может быть известен как полигалактуроновая трансэлиминаза, трансэлиминаза пектиновой кислоты, полигалактуронатлиаза, эндопектинметилтрансэлиминаза, пектаттрансэлиминаза, эндогалактуронаттрансэлиминаза, лиаза пектиновой кислоты, пектиновая лиаза, лиаза а-1,4-Э-эндополигалактуроновой кислоты, РСА-лиаза, РРаза-Ν, лиаза эндо-а-1,4-полигалактуроновой кислоты, лиаза полигалактуроновой кислоты, пектин-трансэлиминаза, трансэлиминаза полигалактуроновой кислоты или (1^4)-α-Όгалактуронанлиаза.
В данном документе альфа-рамнозидаза (ЕС 3.2.1.40) является любым полипептидом, который способен катализировать гидролиз концевых невосстанавливающих остатков α-Ь-рамнозы в а-Ьрамнозидах или, в ином случае, в рамногалактоуронане. Этот фермент также может быть известен как аЬ-рамнозидаза Т, α-Ь-рамнозидаза N или α-Ь-рамнозидрамногидролаза.
В данном документе экзогалактуроназа (ЕС 3.2.1.82) является любым полипептидом, который способен гидролизовать пектиновую кислоту из невосстановленного конца, высвобождая дигалактуронат. Фермент также может быть известен как экзо-поли-а-галактуронозидаза, экзополигалактуронозидаза или экзополигалактуранозидаза.
В данном документе экзо-галактуроназа (ЕС 3.2.1.67) является любым полипептидом, который способен катализировать (1,4-а-Э-галактуронид)п + Н2О=(1,4-а-Э-галактуронид)п-1 + Ό-галактуронат. Фермент также может быть известен как 1,4-а-галактуронидаза, экзополигалактуроназа, поли(галакуронат)гидролаза, экзо-О-галактуроназа, экзо-Э-галактуронаназа, экзополи-О-галактуроназа или поли(1,4а-Э-галактуронид)галактуроногидролаза.
В данном документе экзополигалакуронатлиаза (ЕС 4.2.2.9) является любым полипептидом, который способен катализировать элиминирующее расщепление 4-(4-дезокси-а-О-галакт-4-энуронозил)-Эгалактуронат от восстановленного конца пектата, т.е. деэстерифицированного пектина. Этот фермент также может быть известен как пектат дисахаридлиаза, пектатэкзолиаза, трансэлиминаза экзопектиновой кислоты, экзопектатлиаза, экзополигалактуроновая кислота-транс-элиминаза, РАТЕ, экзо-РАТЕ, экзоРСЬ или (1^4)-а-О-галактуронан дисахаридлиаза восстанавливающих концов.
В данном документе рамногалактуронангидролазой является любой полипептид, который способен гидролизовать связь между галактозилуроновой кислотой и рамнопиранозилом в любой эндоформе в строго чередующихся рамногалактуронановых структурах, состоящих из дисахарида [(1,2-а-Ь-рамноил(1.4) -а-галактозилуроновой] кислоты.
В данном документе рамногалактоуронанлиазой является любой полипептид, который способен расщеплять связи а-Ь-КЬар-(1^4)-а-О-Оа1рА в эндоформе в рамногалактоуронане посредством βэлиминации.
В данном документе рамногалактоуронанацетилэстеразой является любой полипептид, который катализирует деацетилирование каркаса перемежающихся остатков рамнозы и галактуроновой кислоты в рамногалактуронане.
В данном документе рамногалактоуронангалактуроногидролазой является любой полипептид, который способен гидролизовать галактуроновую кислоту из невосстанавливающего конца строго перемежающейся структуры рамногалактуронана в экзоформе.
В данном документе ксилогалактуроназой является любой полипептид, который действует на ксилогалактуронан посредством расщепления β-ксилозозамещенного каркаса из галактуроновой кислоты в эндо-форме. Данный фермент также может быть известен как ксилогалактуронангидролаза.
В данном документе α-Ь-арабинофуранозидазой (ЕС 3.2.1.55) является любой полипептид, который способен действовать на а-Ь-арабинофуранозиды, α-Ь-арабинаны, содержащие (1,2)-, и/или (1,3)-, и/или (1.5) -связи, арабиноксиланы и арабиногалактаны. Этот фермент также может быть известен как α-Νарабинофуранозидаза, арабинофуранозидаза или арабинозидаза.
- 10 021855
В данном документе эндо-арабинозидазой (ЕС 3.2.1.99) является любой полипептид, который способен катализировать эндогидролиз 1,5-а-арабинофуранозидных связей в 1,5-арабинанах. Фермент также может быть известен как эндо-арабиназа, арабинан эндо-1,5-а-Ь-арабинозидаза, эндо-1,5-а-Ь-арабинаназа, эндо-а-1,5-арабаназа, эндоарабаназа или 1,5-а-Ь-арабинан 1,5-а-Ь-арабинаногидролаза.
Ферментная композиция по изобретению, как правило, может содержать по меньшей мере одну целлюлазу, и/или по меньшей мере одну гемицеллюлазу, и/или по меньшей мере одну пектиназу (одна из которых является полипептидом по изобретению). Ферментная композиция изобретения может содержать целлобиогидролазу, эндоглюканазу и/или β-гликозидазу. Такая композиция может также содержать одну или несколько гемицеллюлаз и/или одну или несколько пектиназ.
Кроме того, в композиции изобретения могут присутствовать один или несколько (например, два, три, четыре или все) из перечисленных белков: амилаза, протеаза, липаза, лигниназа, гексозилтрансфераза, глюкуронидаза или экспрансин или целлюлозоиндуцируемый белок или интегрирующий на целлюлозе белок или подобный белок (выше они называются вспомогательными активностями).
Протеаза включает ферменты, которые гидролизуют пептидные связи (пептидазы), а также ферменты, которые гидролизуют связи между пептидами и другими составляющими, такими как сахара (гликопептидазы). Множество протеаз характеризуются в соответствии с ЕС 3.4 и являющиеся подходящими для применения в изобретении включены в данный документ посредством ссылки. Некоторые специфичные типы протеаз включают цистеиновые протеазы, включая пепсин, папаин и сериновые протеазы, включая химотрипсины, карбоксипептидазы и металлоэндопептидазы.
Липазы включают ферменты, которые гидролизуют липиды, жирные кислоты, и ацилглицериды, включая фосфоглицериды, липопротеины, диацилглицерины и т.п. В растениях липиды используются в качестве структурных компонентов для ограничения патогенных инфекций и потерь воды. Эти липиды включают воски, полученные из жирных кислот, а также кутин и суберин.
Лигниназа включает ферменты, которые могут гидролизовать или разрушать структуру лигниновых полимеров. Ферменты, которые могут разрушить лигнин, включают лигнинпероксидазы, марганецпероксидазы, лакказы и феруоилэстеразы и другие описанные в данной области ферменты, которые способны деполимеризовать или, в ином случае, разрушать лигниновые полимеры. Также включенными являются ферменты, которые способны гидролизовать связи, образованные между гемицеллюлозными сахарами (в частности, арабинозой) и лигнином. Лигниназы включают, без ограничения перечисленным, следующие группы ферментов: лигнинпероксидазы (ЕС 1.11.1.14), марганецпероксидазы (ЕС 1.11.1.13), лакказы (ЕС 1.10.3.2) и феруоилэстеразы (ЕС 3.1.1.73).
Гексозилтрансфераза (2.4.1-) включает ферменты, которые способны катализировать трансферазную реакцию, но которые могут также катализировать реакцию гидролиза, например целлюлозы и/или продуктов деградации целлюлозы. Примером гексозилтрансферазы, которая может быть применена в изобретении, является β-глюканозилтрансфераза.
Такой фермент может быть способен катализировать деградацию (1,3) (1,4) глюкана и/или целлюлозы и/или продукта деградации целлюлозы.
Глюкуронидаза включает ферменты, которые катализируют гидролиз глюкуронозида, например β-глюкуронозида, с получением спирта. Охарактеризовано множество глюкуронидаз и они могут подходить для применения в изобретении, например β-глюкуронидаза (ЕС 3.2.1.31), гиалуроно-глюкуронидаза (ЕС 3.2.1.36), глюкуронозил-дисульфглюкозаминглюкуронидаза (3.2.1.56), глицирризинат β-глюкуронидаза (3.2.1.128) или α-Ό-глюкуронидаза (ЕС 3.2.1.139).
Ферментная композиция может содержать экспансин или экспансин-подобный белок, такой как сволленин (см. 5>а1Ьеппо с1 а1., Еиг. 1. ВюЬет. 269, 4202-4211, 2002) или сволленин-подобный белок.
Экспансины вовлечены в ослабление структуры клеточной стенки в ходе роста растительной клетки. Экспансины были предложены для разрушения водородных связей между целлюлозой и другими полисахаридами клеточной стенки без гидролитической активности. Таким образом, они, как считается, позволяют раздвинуть целлюлозные волокна и расширить клеточную стенку. Сволленин, экспансинподобный белок, содержит домен Ν-концевого углеводсвязывающего модуля семейства I (СВЭ) и Сконцевой экспансин-подобный домен. Для целей изобретения экспансин-подобный белок или сволленин-подобный белок могут содержать один или оба таких домена и/или могут привести к разрушению клеточных стенок (например, нарушая структуру целлюлозы), необязательно без выработки детектируемых количеств восстанавливающих сахаров.
Ферментная композиция может содержать индуцируемый целлюлозой белок, например полипептидный продукт генов С1р1 или С1р2 или аналогичных генов (см. Ротетаи с1 а1., 1. ΒίοΙ. СЬет. 278(34), 31988-31997, 2003), интегрирующий на целлюлозе/целлюлосому белок, например полипептидный продукт гена είρΆ или С1рС, или скаффолдин или скаффолдин-подобный белок. Скаффолдины и интегрирующие на целлюлозе белки являются мультифункциональными интегрирующими субъединицами, которые могут организовать целлулолитические субъединицы в мультиферментный комплекс. Это достигается за счет взаимодействия двух комплементарных классов доменов, т.е. домена сцепления на скаффолдине и стыковочного домена на каждой ферментной единице. Субъединица скаффолдина также несет
- 11 021855 модуль связывания с целлюлозой (се11и1оке-Ътйш§ токи1е (СВМ)), который опосредует прикрепление целлюлосомы к ее субстрату. Скаффолдин или интегрирующий на целлюлозе белок для целей изобретения может содержать один или оба таких домена.
Ферментная композиция может состоять из представителей каждого класса ферментов, упомянутого выше, из нескольких членов одного ферментного класса или из любой комбинации этих ферментных классов или вспомогательных белков (т.е. тех упомянутых в данном документе белков, которые не обладают ферментативной активностью как таковой, но, тем не менее, помогают при деградации лигноцеллюлозы).
Ферментная композиция может состоять из ферментов, полученных (1) от коммерческих поставщиков; из (2) клонированных генов, экспрессирующих ферменты; (3) сложной жидкой питательной среды (такой, которая получается в результате роста микробного штамма в среде, где штаммы секретируют белки и ферменты в среды); (4) клеточных лизатов штаммов, растущих как в (3); и/или (5) растительного материала, экспрессирующего ферменты. Различные ферменты в композиции изобретения могут быть получены из различных источников.
Ферменты могут быть получены экзогенно в микроорганизмах, дрожжах, грибах, бактериях или растениях, затем выделены и добавлены к лигноцеллюлозному сырью. В ином случае, ферменты продуцируют, но не выделяют, и среда ферментации с сырой клеточной массой или растительный материал (такой как кукурузная солома или пшеничная солома) и т.п. могут быть добавлены, например, в сырье. В ином случае, сырая клеточная масса или среда для продуцирования фермента или растительный материал могут быть обработаны для предотвращения дальнейшего микробного роста (например, нагреванием или добавлением антимикробных средств), а затем добавлены в сырье. Эти сырые ферментные смеси могут включать организм, продуцирующий фермент. В ином случае, фермент может быть получен при ферментации, в которой используется сырье (такое как кукурузная солома или пшеничная солома) для обеспечения питания организма, который продуцирует фермент(ы). Таким образом, растения, которые продуцируют ферменты, могут служить в качестве лигноцеллюлозного сырья и могут быть добавлены в лигноцеллюлозное сырье.
В применениях и способах, описанных в данном документе, описанные выше компоненты композиции могут быть предоставлены одновременно (т.е. по сути в виде единой композиции) или отдельно или последовательно.
Изобретение таким образом относится к способам, в которых применяется описанная выше композиция, и относится к применениям композиции в промышленных процессах.
В принципе, ферментная композиция изобретения может быть применена в любом способе, который требует обработки материала, содержащего некрахмальный полисахарид. Таким образом, полипептид или композиция изобретения могут быть применены при обработке некрахмального полисахаридного материала. В данном документе полисахаридным материалом является материал, который содержит или который существенным образом состоит из одного или, что чаще, более чем одного некрахмального полисахарида.
Как правило, растения, грибы и материал, полученный из них, содержат значительные количества некрахмального полисахаридного материала. Соответственно, полипептид изобретения может быть применен при обработке растительного или грибного материала или материала, полученного из него.
Важным компонентном растительного некрахмального полисахаридного материала является лигноцеллюлоза (которая также называется здесь лигноцеллюлозной биомассой). Лигноцеллюлоза является растительным материалом, который состоит из целлюлозы, гемицеллюлозы и лигнина. Углеводные полимеры (целлюлоза и гемицеллюлоза) тесно связаны с лигнином водородными и ковалентными связями. Соответственно, полипептид изобретения может быть применен при обработке лигноцеллюлозного материала. В данном документе лигноцеллюлозным материалом является материал, который содержит или в основном состоит из лигноцеллюлозы. Таким образом, в способе по изобретению для обработки некрахмального полисахарида некрахмальным полисахаридом может быть лигноцеллюлозный материал/биомасса.
Соответственно, изобретение обеспечивает способ обработки некрахмального полисахарида, в котором обработка содержит деградацию и/или модификацию целлюлозы и/или гемицеллюлозы.
Деградация в данном контексте означает, что в результате обработки образуются продукты гидролиза целлюлозы и/или гемицеллюлозы и/или пектинового вещества, т.е. в результате обработки появляются более короткие олигосахариды, чем те, что присутствуют в аналогичном необработанном некрахмальном полисахариде. Таким образом, деградация в данном контексте может приводить к высвобождению олигосахаридов и/или сахаров-мономеров.
Все растения и грибы содержат некрахмальный полисахарид как и практически все полисахаридные материалы, полученные из растений и грибов. Соответственно, в способе изобретения для обработки некрахмального полисахарида указанный некрахмальный полисахарид может быть представлен в виде растения или материала, полученного из растений, или материала, содержащего растения, или материала, полученного из растений, например из растительной пульпы, растительного экстракта, продукта питания или его ингредиента, ткани, текстильного изделия или предмета одежды.
- 12 021855
Изобретение обеспечивает способ получения сахара из лигноцеллюлозного материала, где способ включает контакт описанной в данном документе композиции с лигноцеллюлозным материалом.
Такой способ позволяет получать свободные сахара (мономеры) и/или олигосахариды из лигноцеллюлозной биомассы. Эти способы включают преобразование лигноцеллюлозной биомассы в свободные сахара и малые олигосахариды с помощью полипептида или ферментной композиции изобретения.
Процесс преобразования сложного углевода, такого как лигноцеллюлоза, в сахара предпочтительно позволяет проводить преобразование в ферментируемые сахара. Такой процесс может называться осахариванием. Соответственно, способ изобретения может приводить к высвобождению одного или нескольких гексозных и/или пентозных сахаров, таких как один или несколько из перечисленного: глюкозы, целлобиозы, ксилозы, арабинозы, галактозы, галактуроновой кислоты, глюкуроновой кислоты, маннозы, рамнозы, сахарозы и фруктозы.
Лигноцеллюлозная биомасса, подходящая для применения в изобретении, включает первичную биомассу и/или непервичную биомассу, такую как сельскохозяйственная биомасса, коммерческая органика, строительный и городской мусор, твердые бытовые отходы, макулатура и садовые отходы. Распространенные формы биомассы включают деревья, кустарники и травы, пшеницу, пшеничную солому, жмых сахарного тростника, просо, мискант, кукурузу, кукурузную солому, листовую обертку початков кукурузы, стержни кукурузных початков, стебли канолы, стебли сои, сорго сахарное, зерна кукурузы, включая волокна из зерен, продукты и побочные продукты помола зерен, таких как кукуруза, пшеница или ячмень (включая влажный и сухой способы помола), которые часто называют отруби или волокна, а также твердые бытовые отходы, макулатура и садовые отходы. Биомасса может также быть, без ограничения перечисленным, травянистым материалом, отходами сельского хозяйства, отходами лесного хозяйства, твердыми бытовыми отходами, макулатурой, пульпой или отходами бумажного производства. Сельскохозяйственная биомасса включает ветки, кусты, тростники, кукурузу и листовую обертку початков кукурузы, энергетические культуры, лесоматериал, фрукты, цветы, зерно, травянистые культуры, листья, кору, иголки, бревна, корни, саженцы, древенистые культуры с коротким оборотом, кустарники, просо, деревья, овощи, фруктовые корки, виноград, жом сахарной свеклы, пшеничную крупку, шелуху овса и твердую и мягкую древесины (не включая древесину с вредными материалами). Кроме того, сельскохозяйственная биомасса включает материалы органических отходов, образованных в ходе сельскохозяйственных процессов, включая фермерскую и лесоводческую активности, особенно включая древесные отходы лесного хозяйства. Сельскохозяйственная биомасса может быть отдельно любой из вышеизложенных или любой их комбинацией или смесью.
Помимо первичной биомассы или сырья, уже обработанного в пищевой, кормовой или бумажной и целлюлозной отраслях, биомасса/сырье может быть дополнительно обработано тепловой, механической и/или химической модификацией или любой комбинацией таких способов в целях усиления ферментативной деградации.
Ферментируемые сахара могут быть преобразованы в полезные продукты ферментации с добавленной стоимостью, неограничивающие примеры которых включают аминокислоты, витамины, лекарства, добавки к кормам для животных, химические продукты тонкого химического синтеза, химическое сырье, пластмассы, растворители, топливо или другие органические полимеры, молочную кислоту и этанол, включая топливный этанол.
Конкретные продукты с добавленной стоимостью, которые могут быть получены способами изобретения, включают, без ограничения перечисленным, биотопливо (включая этанол, бутанол и биогаз); молочную кислоту; пластмассы; химические продукты тонкого органического синтеза; органические кислоты, в том числе лимонную кислоту, янтарную кислоту, фумаровую кислоту, итаконовую кислоту и малеиновую кислоту; 3-гидроксипропионовую кислоту, акриловую кислоту, уксусную кислоту, 1,3пропан-диол; этилен, глицерин; растворитель; добавка для питания животных, лекарство, такое как βлактамные антибиотики или цефалоспорины; витамины, аминокислоты, такие как лизин, метионин, триптофан, треонин и аспарагиновая кислота; промышленные ферменты, такие как протеазы, целлюлазы, амилазы, глюканазы, лактазы, липазы, лиазы, оксидоредуктазы, трансферазы или ксиланазы, и химическое сырье.
Композиция, природа заместителя и степень разветвленности гемицеллюлозы очень отличаются у двусемядольных растений (двудольных, т.е. растений, чьи семена имеют два котиледона или семядоли, такие как лимская фасоль, арахис, миндаль, горох, фасоль) по сравнению с односемядольными растениями (однодольными; т.е. растениями, имеющими одиночный котиледон или семядолю, такие как кукуруза, пшеница, рис, травы, ячмень). У двудольных гемицеллюлоза состоит главным образом из ксилоглюканов, которые являются ^^-связанными цепями глюкозы с Сб^-связанными ксилозильными боковыми цепями. В однодольных, включая большинство зерновых культур, основными компонентами гемицеллюлозы являются гетероксиланы. Они главным образом содержат ^^-связанные ксилозные каркасные полимеры с 1,3-α-связями с арабинозой, галактозой, маннозой и глюкуроновой кислотой или 4-О-метилглюкуроновой кислотой, а также ксилозой, модифицированной уксусной кислотой, связанной посредством эфирной связи. Также присутствуют β-гликаны, содержащие 1,3- и ^^-связанные глико- 13 021855 зильные цепи. В однодольных целлюлоза, гетероксиланы и β-глюканы могут присутствовать в примерно равных количествах, на каждое из которых приходится около 15-25% сухого вещества клеточных стенок. Также различные растения могут содержать различные количества и различные композиции пектиновых веществ. Например, сахарная свекла содержит около 19% пектина и около 21% арабинана в пересчете на сухое вещество.
Соответственно, композиция изобретения может быть адаптирована с учетом определенного сырья, которое будет использоваться. Иными словами, спектр активностей композиции изобретения может варьировать в зависимости от рассматриваемого сырья.
Ферментные комбинации или физические обработки могут быть проведены одновременно или последовательно или отдельно. Ферменты могут быть получены экзогенно из микроорганизмов, дрожжей, грибов, бактерий или растений, затем выделены и добавлены к лигноцеллюлозному сырью. В ином случае, ферменты вырабатываются, но не выделяются, и среда ферментации с сырой клеточной массой или растительный материал (такой как кукурузная солома) и т.п. добавляют в сырье. В ином случае, сырая клеточная масса или среда для продуцирования фермента или растительный материал может быть обработан для предотвращения дальнейшего микробного роста (например, нагреванием или добавление антимикробных средств) перед добавлением к сырью. Эти сырые ферментные смеси могут включать организм, продуцирующий фермент. В ином случае, фермент может быть получен при ферментации, в которой для обеспечения питания организма, который продуцирует фермент(ы), используется сырье (такое как кукурузная солома). Таким образом, растения, которые продуцируют ферменты, могут служить в качестве лигноцеллюлозного сырья и могут добавляться в лигноцеллюлозное сырье.
В способе изобретения фермент или комбинация ферментов действует на лигноцеллюлозный субстрат или на растительную биомассу, выступающую в качестве сырья, что приводит к преобразованию этого сложного субстрата в простые сахара и олигосахариды для получения этанола или других полезных продуктов ферментации.
Соответственно, другой аспект изобретения включает способы, в которых применяют описанную выше композицию, вместе с дополнительными ферментами или с физическими обработками, такими как температура и рН, для преобразования лигноцеллюлозной растительной биомассы в сахара и олигосахариды.
Хотя композиция обсуждалась в качестве отдельной смеси, следует признать, что ферменты могут быть добавлены последовательно, при этом температура, рН и другие условия могут быть изменены для увеличения активности каждого индивидуального фермента. В ином случае, для конкретной ферментной смеси могут быть определены оптимальные рН и температура.
Композиция взаимодействует с субстратом при любых соответствующих условиях. Например, ферменты можно инкубировать при около 25°С, около 30°С, около 35°С, около 37°С, около 40°С, около 45°С, около 50°С или около 55°С, около 60°С, около 65°С, около 70°С, около 75°С, около 80°С, около 85°С, около 90°С или выше. То есть их можно инкубировать при температуре от около 20°С до около 95°С, например, в буферах с ионной силой от низкой до средней и/или при рН от низкого до нейтрального. Под средней ионной силой понимается буфер, который имеет концентрацию ионов около 200 миллимоль/л (мМ) или менее для какого-либо одного ионного компонента. рН Может быть в диапазоне от около 2,5, около 3,0, около 3,5, около 4,0, около 4,5, около 5, около 5,5, около 6, около 6,5, около 7, около 7,5, около 8,0, до около 8,5. Как правило, диапазон рН будет от около рН 3,0 до около рН 9.
Как правило, реакция может быть проведена в условиях с низким рН, как определено выше. Таким образом, способ изобретения может быть проведен так, что корректировка рН (т.е. доведение до нейтрального рН) не потребуется. Иначе говоря, предварительно обработанное кислотой сырье может быть использовано как есть, без необходимости добавления, например, гидроксида натрия, до добавления ферментной композиции по изобретению.
Сырье может быть отмыто до ожижения/гидролиза. Такой отмывкой может быть, например, вода.
Инкубация композиции в этих условиях приводит к высвобождению или освобождению значительных количеств сахаров из лигноцеллюлозного материала. Под значительным количеством понимается по меньшей мере около 20%, по меньшей мере около 30%, по меньшей мере около 40%, по меньшей мере около 50%, по меньшей мере около 60%, по меньшей мере около 70%, по меньшей мере около 80%, по меньшей мере около 90%, по меньшей мере около 95% или более от имеющихся сахаров.
Может быть применена стадия ожижения/гидролиза или предварительного осахаривания, включающая инкубацию с ферментом или ферментной смесью. Эта стадия может быть осуществлена при различных температурах, но предпочтительно, если предварительное осахаривание происходит при температуре, наиболее подходящей для тестируемой ферментной смеси или наиболее подходящей для прогнозируемого ферментного оптимума тестируемых ферментов. Температура предварительного осахаривания может находится в диапазоне от около 10°С до 80°С, от около 20°С до около 80°С, от около 30°С до около 70°С, от около 40°С до около 60°С, от около 37°С до около 50°С, предпочтительно от около 37°С до около 80°С, более предпочтительно около 50°С. При отсутствии данных о температурном оптимуме предпочтительнее осуществлять реакции предварительной обработки при 37°С вначале, а затем при более высокой температуре, такой как 50°С. рН Предварительно осахаренной смеси может находиться в
- 14 021855 диапазоне от около 2,0 до около 10,0, но предпочтительно от около 3,0 до около 5,0. Опять же, может не потребоваться корректировка рН до осахаривания, поскольку ферментная композиция, как правило, подходит для применения при низком рН, как описано в данном документе.
Стадия ожижения/гидролиза или предварительного осахаривания может длиться в течение от нескольких минут до нескольких часов, например от около 1 ч до около 120 ч, предпочтительно от около 2 ч до около 48 ч, более предпочтительно от около 2 ч до около 24 ч, наиболее предпочтительно в течение от около 2 ч до около 6 ч. Обработка целлюлазой может длиться в течение от нескольких минут до нескольких часов, например от около 6 ч до около 168 ч, предпочтительно от около 12 ч до около 96 ч, более предпочтительно от около 24 ч до около 72 ч, еще более предпочтительно в течение от около 24 ч до около 48 ч.
Сахара, высвобождаемые из биомассы, могут быть преобразованы в полезные продукты ферментации, которые включают, без ограничения, аминокислоты, витамины, лекарства, кормовые добавки для животных, химические продукты тонкого органического синтеза, химическое сырье, пластмассы, этанол, включая топливный этанол.
Существенным является то, что способ изобретения может быть осуществлен при высоких концентрациях сухого вещества (лигноцеллюлозного материала) в реакции гидролиза. Таким образом, изобретение может быть проведено с содержанием сухого вещества около 5% или выше, около 8% или выше, около 10% или выше, около 15% или выше, около 20% или выше, около 25% или выше, около 30% или выше, около 35% или выше, около 40% или выше.
Соответственно, изобретение обеспечивает способ получения продукта ферментации, где способ включает
a) деградацию лигноцеллюлозы с помощью способа, как описано в данном документе; и
b) ферментацию полученного материала для получения продукта ферментации.
Такой процесс может быть проведен без какой-либо потребности в корректировке рН в ходе процесса. Иначе говоря, процесс является процессом, который может быть проведен без добавления кислоты(от) или основания(ий). Однако это исключает стадию предварительной обработки, в которой может быть добавлена кислота. Суть в том, что ферментная композиция изобретения способна действовать при низком значении рН и, следовательно, нет необходимости в корректировке рН предварительно обработанного кислотой сырья для осуществления осахаривания. Соответственно, способ изобретения может быть безотходным способом, в котором используют только органические продукты без необходимости введения неорганических химических веществ.
В соответствии с изобретением могут быть получены продукты ферментации, включая аминокислоты, витамины, лекарственные средства, добавки к кормам для животных, химические продукты тонкого химического синтеза, химическое сырье, пластмассы, растворители, топлива или другие органические полимеры, молочная кислота, этанол, включая топливный этанол (под термином этанол понимается включение этилового спирта или смесей этилового спирта и воды).
Конкретные продукты с добавленной стоимостью, которые могут быть получены способами изобретения включают, без ограничения перечисленным, биотопливо (включая этанол и бутанол); молочную кислоту; 3-гидроксипропионовую кислоту, акриловую кислоту, уксусную кислоту, 1,3-пропан-диол; этилен, глицерин, пластмассы; химические продукты тонкого органического синтеза; органические кислоты, в том числе лимонную кислоту, янтарную кислоту, фумаровую кислоту, растворитель; добавку к кормам для животных, лекарство, такое как β-лактамный антибиотик или цефалоспорин; витамин, аминокислоту, такую как лизин, метионин, триптофан, треонин, и аспарагиновую кислоту; фермент, такой как протеаза, целлюлаза, амилаза, глюканаза, лактаза, липаза, лиаза, оксидоредуктаза, трансфераза или ксиланаза и химическое сырье или добавку к кормам для животных.
Способ получения продукта ферментации необязательно может содержать извлечение продукта ферментации.
Такой процесс может быть проведен в аэробных или анаэробных условиях. Предпочтительно, если способ проводится в микроаэрофильных условиях или условиях с ограниченным кислородом и/или в условиях с ограничением по С.
Способ анаэробного сбраживания здесь определен как способ сбраживания, запускаемый в отсутствие кислорода или в котором фактически не потребляется кислород, предпочтительно менее чем около 5, около 2,5 или около 1 ммоль/л/ч, и в котором органические молекулы служат как донорами электронов, так и акцепторами электронов.
Процесс ферментации при ограничении кислорода является процессом, в котором потребление кислорода ограничивается переносом кислорода из газа в жидкость. Степень ограничения кислорода определяется количеством и композицией входящего потока газа, а также фактическими характеристиками перемешивания/переноса массы в используемом для ферментации оборудовании. Предпочтительно, если процесс проводится в условиях с ограниченным кислородом, и скорость потребления кислорода составляет по меньшей мере 5,5, более предпочтительно по меньшей мере 6, еще более предпочтительно по меньшей мере 7 ммоль/л/ч.
Настоящее изобретение также относится к мутантам Та1атотусек етегкопи, которые способны
- 15 021855 сверхпродуцировать деградирующие лигноцеллюлозы ферменты, которые могут деградировать растительную биомассу. Микроорганизм модифицирован таким образом, чтобы синтез лигноцеллюлозных ферментов увеличился по сравнению с немодифицированной формой микроорганизма.
Изобретение охватывает любую мутацию гена микроорганизма, которая приводит к увеличению выработки ферментов, деградирующих лигноцеллюлозы. Классический мутагенез и последующая программа скрининга является хорошо известным эмпирическим нерекомбинантным подходом улучшения штаммов (Уши апй Вупд, 1999).
Мутагенез означает индукцию наследуемых изменений - мутаций - в генетическом материале микроорганизма, обычно хромосомной ДНК (Сгиедег, 1993). Эти мутации вызваны изменениями в генотипе микроорганизма (мутанта). Мутации случаются спонтанно ш У1уо или после индукции мутагенами (например, радиацией или химическими агентами). Мутации также могут быть индуцированы ш уйго посредством методов сайтнаправленной генетической инженерии.
Мутагенез, индуцируемый в микроорганизмах физическими или химическими агентами, происходит случайно. Наиболее часто используемыми физическими мутагенами являются нагревание, замораживание и оттаивание, облучение дальним ультрафиолетом, облучение ближним ультрафиолетом в присутствии 8-метоксипсоралена и ионизирующее облучение. Предпочтительным физическим мутагеном является облучение УФ.
Наиболее часто используемыми химическими мутагенами являются: (ί) мутагены, влияющие на нереплицирующуюся ДНК (например, азотистая кислота, гидроксиламин и алкилирующие агенты), и (ίί) мутагены, влияющие на реплицирующуюся ДНК (например, аналоги оснований, такие как 5бромурацил, 2-аминопурин и Ы4-гидроксицитидин; и мутагены, сдвигающие рамку считывания, такие как акридиновый оранжевый, профлавин, 9-аминоакридин, акрифлавин, 1СК-соединения 1СК170 и 1СК191, хомидиум бромид и фотореактивные псоралены). За исключением ультрафиолетового облучения, алкилирующие агенты, группа химических мутагенов, являются наиболее мощными мутагенными системами для практического применения (Вгоокек, 1990, Сгиедег, 1993). Большинство алкилирующих агентов действуют как монофункциональные агенты, как, например, эпоксиды (например, диэпоксибутан [ΌΕΒ]), этиленимины (например, этиленимин [Е1]), алкилсульфаты (например, диэтилсульфат [ΌΕδ], диметилсульфата [ΌΜδ], алкилалкансульфонаты (например, метилметансульфонат [ММЗ], этилметансульфонат [ЕМЗ]), нитрозамиды (например, метилнитрозомочевина [МНМ], этилнитрозомочевина [ΕΝυ], Ы-метил-Ы'-нитро-Ы-нитрозогуанидин [ЫТС или МЫЫС], этил-Ы'-нитро-Ы-нитрозогуанидин [ЕЫЫС], пропил-Ы'-нитро-Ы-нитрозогуанидин [РЫЫС] 4-нитрохинолин |ΝΟΘ|) и действующие косвенно диметилнитрозамины [ΌΜΝ] и диэтилнитрозамины [ОЕЫ]. Ди- и полифункциональными алкилирующими агентами являются азотистые иприты (например, ди-(2-хлорэтил) сульфид [иприт], ди-(2-хлорэтил)амин [азотистый иприт], 1СК-соединения, митомицин С). Предпочтительными химическими мутагенами являются ЫТС и Νρϋ или комбинации обоих.
Для облучения или химических агентов мутационные изменения, как правило, являются результатами ошибок репликации или механизмов репарации посредством включения неправильного основания или нуклеотида в полинуклеотидную цепь или прямого химического взаимодействия с основанием или нуклеотидом. Механизмами репарации являются, например, фотореактивация, репарация длинными последовательностями и эксцизионная репарация, пострепликационная репарация, δΘδ репарация, репарация алкилирований, адаптивный ответ и репарация двухцепочечных разрывов.
При использовании химических или физических мутагенов типичные проценты выживания, используемые в данной области, находятся в диапазоне от 0,01 и 60%. Предпочтительно, если процент выживания находится в диапазоне от 0,05 до 50%. Более предпочтительно, если процент выживания находится между 0,1 и 30%. Специалисту хорошо известно, что конидиоспоры являются предпочтительным материалом для мутагенеза грибных микроорганизмов, включая виды Та1аготусек. Мутанты, однако, могут быть получены из клеток мицелия. Способ отбора, описанный в данном документе, может быть применен для отбора мутантов, полученных либо из конидиоспор, либо из клеток мицелия.
В дополнение к этим методам мутации в генах-мутаторах также могут усилить мутагенез в микроорганизмах за счет увеличения скорости спонтанных мутаций в других генах. Е. сой, например, имеет по меньшей мере девять локусов, которые известны как вызывающие мутаторные фенотипы: например, локус ти!Т повышает частоту мутаций в 1000 раз, главным образом трансверсий ЛТ^СС; тиФ5 является наиболее мощным мутатором, который имеет дефект экзонуклеазы из ДНК-полимеразы III и дефект в пострепликационной репарации ошибочно спаренных оснований (НогшсЫ е! а1., 1989; ЗсЬаарег апй Кайтап, 1989; Сгиедег, 1993). Различные гены-мутаторы также были генетически охарактеризованы в В. киййИк. Хотя спонтанная мутация не затронута в мутанте В. кийййк ти!Т, частота спонтанной мутации может быть значительно усилена при использовании мутантов ти!8, ти!Ь, ти!М и ти!У из В. киййИк (Сшей е! а1., 1996; Закак е! а1., 2000; §акак1 апй Кигики, 2004).
Мутация может быть делецией, заменой или добавлением в последовательность гена. Мутация может быть разрушением, мутацией со сдвигом рамки или нонсенс-мутацией. Мутация может быть разрушением, влияющим на всю последовательность гена или на его часть. Мутация может затронуть кодирующую или некодирующую последовательность, например промотор гена. Мутация может быть ре- 16 021855 зультатом полной потери транскрипции гена или преждевременной терминации трансляции. Аналогичным образом, мутация может быть расположена в предшествующем (или расположенном выше) гене, который разрушает транскрипцию смежного (или расположенного ниже) гена(ов), посредством процесса, известного как полярность. В ином случае, мутация может оказывать влияние, заключающееся в том, что транслируемый белок, в сравнении с белком дикого типа, несет мутацию, которая приводит белок в нефункциональное состояние.
Такие мутации могут повысить выработку целлюлаз множеством различных путей. Например, мутации в пределах промотора и регуляторных (цис) участков гена, кодирующего целлюлазу, могут напрямую затронуть экспрессию указанного гена, что повысит уровень или активность целлюлазы. В ином случае, мутации могут затронуть экспрессию генов, которые кодируют белки, участвующие в механизме внеклеточной секреции белков. Повышение уровня этих белков может дать в результате более высокий уровень секреций в культуральную среду. Также мутации могут действовать на протеазы или РНКнуклеазы для предотвращения деградации мРНК-транскриптов целлюлазных генов или целлюлазных ферментов, что таким образом повышает уровни белка целлюлаз относительно немодифицированной клетки.
Таким образом, штаммы Та1аготусе8 по изобретению могут быть получены способом, который включает следующие стадии:
a) отбора и выделения варианта в виде одной колонии из множества морфологий колоний штамма Та1аготусе§;
b) мутагенеза варианта в виде колонии и скрининг полученных мутантов на предмет высокой целлюлазной активности;
c) отбора и выделения из мутантов одного или нескольких мутантных штаммов с высокой целлюлазной активностью;
и необязательно
б) отбора и выделения варианта в виде одной колонии мутантного штамма с высокой целлюлазной активностью из множества морфологий колоний мутантного штамма с высокой целлюлазной активностью;
е) мутагенеза штаммов из варианта в виде колонии стадии б) и скрининга полученных мутантов на предмет устойчивости к аналогам глюкозы (например, к 2-деокси-Э-глюкозе [ΌΘΟ]);
ί) отбора и выделения из мутанта стадии е) одного или нескольких дерепрессированных по глюкозе мутантных штаммов с высокой целлюлазной активностью;
д) повторного мутагенеза мутанта с улучшенной целлюлазной активностью из стадии с) и скрининга полученных мутантов на предмет более высокой целлюлазной активности;
и необязательно
й) мутагенеза штаммов из варианта в виде колонии стадии д) и скрининга полученных мутантов на предмет устойчивости к аналогам глюкозы (например, к 2-деокси-Э-глюкозе [ΌΘΟ]);
ί) повторное выделение дерепрессированного по глюкозе мутантного штамма с высокой целлюлазной активностью из одного или нескольких дерепрессированных по глюкозе мутатных штаммов с высокой целлюлазной активностью из стадии й).
В одном воплощении в стадии Ь) мутагеном является ΝΤΟ. ΝΤΟ дает высокий мутационный фактор для устойчивости к ΡΘΑ (5-фторооротовой кислоте).
В одном воплощении в стадиях е) и й) мутаген является комбинацией ΝΟΘ и ΝΤΟ. Данная комбинация мутагенов дает высокий мутационный фактор для устойчивости к ΌΘΟ (2-деоки-Э-глюкозе).
Эффективность мутагенеза в данном документе оценивается путем определения выживания после мутагенной обработки и повышения частоты появления мутантов, устойчивых к 5-фтороротовой кислоте (ΡΘΑ), фенотипу, легко поддающемуся балльной оценке. Соотношение этих частот в данном документе называется мутационным фактором (МР).
В одном воплощении отбор на стадиях с) и ί) проводят в две стадии, где первой сортировкой является высокопроизводительный скрининг, а вторая сортировка проводится по выработке целлюлаз в культурах в перемешиваемых колбах.
Промотор является последовательностью ДНК, которая расположена выше старта транскрипции гена и участвует в распознавании и связывании с РНК полимеразой и/или с другими белками для инициации транскрипции гена. Обычно промотор определяют в условиях, в которых экспрессируется ген.
Термин дерегулированный или дерегуляция включает изменение или модификацию по меньшей мере одного гена в микроорганизме таким образом, чтобы уровень активности генного продукта в микроорганизме изменился или модифицировался. Предпочтительно, если по меньшей мере один ген изменяется или модифицируется таким образом, чтобы генный продукт усиливался или увеличивался.
Дерегулированный промотор является промотором, который допускает генную экспрессию в условиях роста и окружающей среды, в которой он обычно является репрессированным. Сильно дерегулированный промотор является промотором, который вызывает инициацию мРНК с большей частотой по сравнению с нативным промотором в условиях роста и окружающей среды, когда он является дерепрессированным.
- 17 021855
Мутации могут снизить или полностью предотвратить экспрессию одного или более чем одного гена, который репрессирует экспрессию генов, кодирующих целлюлазы. Это привело бы к появлению клеток с повышенной выработкой целлюлаз. Примерами таких регуляторных генов (также общеизвестных как транскрипционные факторы) являются, без ограничения перечисленным, Асе1 из Тпсйойегта гее§е1 и т1§1 из δассЬа^отусе8 сегеу181ае и их ортологи, обнаруженные в грибах, включая Та1аготусе8 етегеопп и родственные виды.
Мутации также могут увеличить экспрессию или сверхэкспрессию одного или больше чем одного гена, который активирует экспрессию генов, кодирующих целлюлазы. Это привело бы к появлению клеток с повышенной выработкой целлюлаз. Примерами таких регуляторных генов (также общеизвестных как транскрипционные факторы) являются, без ограничения перечисленным, Х1пК из АкрегдШик тдег и Асе11 из ТпсНойегта гее§е1 и их ортологи, обнаруженные в грибах, включая Та1аготусе8 етегеопп и родственные виды.
Мутации также могут повысить экспрессию целлюлазных генов, чья экспрессия репрессируется глюкозой, клеточное состояние, общеизвестное как дерепрессия по глюкозе или мутации, дерепрессированные по глюкозе. Клетки для выработки целлюлаз, которые являются дерепрессированными по глюкозе, являются клетками, которые допускают более высокую выработку одной или нескольких целлюлаз, когда глюкоза все еще присутствует в ростовой среде или в соответствующих количествах в клетках, в которых целлюлазы, как правило, не вырабатываются или продуцируются на более низких уровнях. Дерепрессия по глюкозе может быть вызвана различными мутациями в клетке, включая, без ограничения перечисленным, мутации в промоторной области гена, кодирующего целлюлазу, которая предотвращает связывание с репрессирующими по глюкозе регуляторными белками. Предотвращение связывания с такими регуляторными белками делает возможной экспрессию кодирующего целлюлазу гена в присутствии глюкозы. Примером регуляторного белка, который участвует в репрессии по глюкозе выработки фермента/целлюлазы в грибах, является, без ограничения перечисленным, СгеА из АкрегдШик шйи1ап и его ортологи, обнаруженные в грибах, включая Та1аготусе8 етегеопп и родственные виды. В ином случае, мутации генов, которые регулируют экспрессию СгеА и схожих ортологов, также будут приводить к повышенной экспрессии кодирующего целлюлазу гена в присутствии глюкозы.
В одном воплощении штамм Та1аготусе8 является дерепрессированным по глюкозе. В одном воплощении выработка ферментов дерепрессированным штаммом в присутствии глюкозы в течение 96 ч по меньшей мере в два раза выше, чем у родительского штамма в схожих условиях. В предпочтительных воплощениях соотношение составляет по меньшей мере 3, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7, по меньшей мере 8, по меньшей мере 9, по меньшей мере 10, по меньшей мере 15, по меньшей мере 20, по меньшей мере 50, по меньшей мере 100 раз. В одном воплощении штамм Та1аготусе8 вырабатывает ксиланазу при росте в присутствии глюкозы.
В любом воплощении дерепрессированный по глюкозе штамм имеет целлюлазную активность, которая составляет по меньшей мере 25% активности (репрессированного глюкозой) родительского штамма дикого типа, который растет в схожих условиях в среде 2 для Та1аготусе8 без глюкозы в течение 96 ч.
В настоящем изобретении классический мутагенез и скрининг проводили в следующей последовательности: (ί) получение библиотек мутантов с помощью УФ или КТО отдельно или в сочетании с ΝΟΘ; (ίί) отбор случайных мутантов по повышенной выработке целлюлаз или мутантов, устойчивых к аналогам глюкозы, что приводит к дерепрессии по глюкозе при выработке целлюлаз; (ίίί) эксперименты в перемешиваемых колбах с мутантами, демонстрирующими улучшенную выработку целлюлаз в присутствии или отсутствие глюкозы, и, наконец, (ίν) ферментация для определения уровней целлюлазы тех мутантов, которые в экспериментах в перемешиваемых колбах выработали целлюлаз значимо больше, чем родительский штамм, или которые вырабатывают целлюлазу в присутствии глюкозы.
Микроорганизм изобретения способен вырабатывать выше нормы один или несколько лигноцеллюлозных ферментов. При использовании в данном документе термин выработка лигноцеллюлозного фермента выше нормы относится к значимо повышенной выработке лигноцеллюлозного фермента микроорганизмом изобретения по сравнению с формой дикого типа указанного микроорганизма. Предпочтительно, если выработка лигноцеллюлозного фермента выше нормы означает выработку по меньшей мере 6 РРИ на мл культуральной среды.
Другой аспект изобретения заключается в способе получения смеси целлюлаз, который включает (а) культивирование микроорганизмов по изобретению в условиях, в которых получают целлюлазную смесь; и (Ь) необязательно извлечение целлюлазной смеси из клеточной культуральной среды.
Способ изобретения включает стадию культивирования модифицированных микроорганизмов в условиях, при которых вырабатывается смесь целлюлаз. Термин культивирование включает поддержание и/или рост живого микроорганизма настоящего изобретения. Микроорганизм изобретения культивируют в питательной среде, подходящей для выработки смеси целлюлаз с помощью известных в данной области способов. Культуральная среда, необходимая для процесса культивирования по изобретению, не является критичной для изобретения. Питательные вещества добавляют в процесс в соответствии с потребностями рассматриваемого организма, при этом питательные вещества предоставляются в избытке. Целесообразно, если культуральная среда содержит источник углерода, источник азота, а также дополнитель- 18 021855 ные соединения, необходимые для роста микроорганизма и/или образования ценной целлюлазной смеси. Например, дополнительные соединения могут быть необходимы для индукции выработки ценного соединения. Общее количество источника углерода и азота, добавляемое в процессе культивирования в соответствии с изобретением, может варьировать в зависимости, например, от потребностей микроорганизма и/или длины процесса культивирования.
Например, микроорганизм изобретения может быть культивирован в подходящей среде и в условиях, позволяющих экспрессировать и/или выделять смесь целлюлаз. Культивирование проводится в подходящей питательной среде, содержащей источники углерода, азота и неорганические соли, с помощью процедур, известных в данной области (см., например, ВеппеИ !\У. апб Ьа8иге, Ь., еЙ8., Моге Сепе Матри1аЬоп8 ίη Рип§1, Асабепис Рге88, СА, 1991). Подходящие среды можно получить у коммерческих поставщиков или их можно приготовить по опубликованным составам (например, в каталогах Американской коллекции типовых культур). Примеры подходящих источников углерода или углеродных субстратов, известных в данной области, можно найти в \УО 98/37179, включая, без ограничения перечисленным, сложные углеводы, такие как соевая или зерновая крупа, зерновая мука, крахмалы, сахара, сахарные спирты, углеводороды, масла, жиры, жирные кислоты, органические кислоты и спирты. Зерновая мука определяется, без ограничения перечисленным, как полированный рис, пшеница, очищенная пшеница, кукуруза, ячмень, овес или овсяная мука.
Примеры подходящих источников азота, известные в данной области, включают, без ограничения перечисленным, овощные белки, пептоны, пептиды и аминокислоты, полученные из зерновых, бобовых и клубней, белки, пептиды и аминокислоты, полученные из животных источников, таких как мясо, молоко, и животные побочные продукты, таких как пептоны, мясные экстракты, гидролизаты казеина, соевая крупа, дрожжевой экстракт, кукурузный экстракт, мочевина, сульфат аммония, хлористый аммоний, нитрат аммония и фосфат аммония.
Дополнительные соединения, требуемые для роста микроорганизма и/или для образования продукта, такие как фосфат, сульфат, микроэлементы (например, соли магния, железа, марганца, кальция, меди, цинка, бора, молибдена и/или кобальта), витамины или промоторы роста, могут быть добавлены в количествах, которые могут варьировать между различными классами микроорганизмов, т.е. между грибами, дрожжами и бактериями. Кроме того, количество добавляемого дополнительного соединения может быть определено типом образуемого ценного соединения. Как правило, количество компонентов среды, необходимых для роста микроорганизма, может быть определено относительно количества источника углерода, используемого в культивировании, поскольку количество образуемой биомассы главным образом будет определено количеством используемого источника углерода.
Микроорганизм предпочтительно культивируют с индуктором для индукции целлюлазных ферментов. Индукторы могут быть одним или несколькими олиго-, ди- или моносахаридами, которые приводят к индукции выработки целлюлаз клеткой-хозяином. Индуктор может быть получен ферментативным гидролизом целлюлозы одним или несколькими целлюлазными ферментами для получения главным образом β-связанных глюкозных димеров. Подходящие коммерческие индукторы, включают, без ограничения перечисленным, Ауюе11, АгЬосе11, Вискеуе и УтсокгаП. Более предпочтительным является выделение мутанта Та1аготусе8, который не требует целлюлозы для индукции целлюлазных ферментов. Микроорганизм можно культивировать в жидких средах либо непрерывно, либо периодически, обычными способами культивирования, такими как постоянная культура, культура в пробирке, перемешиваемая культура, аэрируемая спинкультура или ферментация. Предпочтительно, если микроорганизмы культивируют в ферментере. Процесс культивирования по изобретению может быть осуществлен как периодический, повторяющийся периодический, подпитываемый, повторяющийся подпитываемый, как непрерывное культивирование, в режиме взвеси или твердого вещества. Для конкретного применения (т.е. для примера) периодический процесс применяют, когда до начала процесса культивирования все компоненты среды добавляют в среду напрямую, полностью в избытке. В предпочтительном воплощении дерепрессированный по глюкозе штамм культивируют в условиях с подпиткой. В соответствии с этим воплощением могут быть получены очень высокие ферментные титры, например, при подпитываемом процессе активности целлюлаз могут достичь, например, 20 РРИ2//мл или больше, 25 РРИ2о/о/мл или больше или 30 РРИ2//мл или больше. Подпитываемый процесс не осуществим с репрессируемым глюкозой штаммом, поскольку глюкоза, которая подается в подпитываемый процесс, будет репрессировать выработку целлюлаз, что в результате приведет к низким выходам целлюлаз.
Как правило, процесс микробного культивирования может быть разделен на фазу роста, целью которой является образование биомассы, и фазу продуцирования, целью которой является выработка ценного соединения. Специалисту в данной области ясно, что эти две эти фазы не могут быть строго разделены во времени, но в некоторой степени могут перекрываться. Процесс культивирования по изобретению предпочтительно осуществляют в промышленном масштабе. Процесс промышленного масштаба следует понимать как включающий процесс культивирования в ферментере, объем которого составляет > 0,01 м3, предпочтительно > 0,1 м3, предпочтительно > 0,5 м3, предпочтительно > 5 м3, предпочтительно > 10 м3, более предпочтительно > 25 м3, наиболее предпочтительно > 50 м3.
Дополнительный аспект настоящего изобретения касается выбора последующей переработки жид- 19 021855 кой питательной среды. Периодический процесс, примененный в соответствии с изобретением, облегчает последующую переработку особенно из-за высокого выхода ценного соединения и низкого количества побочных продуктов. Последующая переработка может включать извлечение, а также стадии разработки композиций.
После окончания процесса культивирования ценный продукт может быть извлечен из жидкой питательной среды с помощью стандартной методологии, разработанной для извлечения представляющего интерес ценного соединения. Соответствующая технология последующей переработки, таким образом, зависит от природы и клеточной локализации ценного соединения и от требуемого уровня чистоты представляющего интерес продукта. В типичном процессе извлечения биомассу отделяют от культуральной жидкости с помощью, например, центрифугирования или фильтрации. Ценное соединение затем извлекают из биомассы в случае, когда ценный продукт накапливается внутри или связан с микробными клетками. Термин извлечение включает выделение, экстракцию, сбор, отделение или очистку соединения из культуральных сред. Выделение соединения может быть осуществлено в соответствии с любой известной в данной области методологией выделения и очистки, включая, без ограничения перечисленным, изменение рН, экстракцию растворителем, диализ, клеточную фильтрацию и ультрафильтрацию, концентрирование, лиофилизацию и т.п.
Конечно, биомасса как таковая также может быть использована. В ином случае, если ценный продукт секретируется из микробной клетки, его можно извлечь из культуральной жидкости. Биомасса и/или ценное соединение могут быть включены в состав в виде жидких или твердых продуктов. В другом воплощении требуемое соединение не очищают из микроорганизма или культуры, в качестве источника продукта могут быть использованы цельная культура или культуральная надосадочная жидкость. В конкретном воплощении культуру или культуральную надосадочную жидкость применяют без модификации. В дополнительном воплощении культуру или культуральную надосадочную жидкость добавляют напрямую к лигноцеллюлозному материалу для гидролиза.
Различные воплощения изобретения, описанные в данном документе, могут быть объединены перекрестно.
Следующие неограничивающие примеры дополнительно иллюстрируют изобретение.
Примеры
Общая методология
Штаммы
Штаммы Та1аготусек етегкопп настоящего изобретения получены из АТСС16479, который ранее являлся РетсШшт деоктйШа етегкопп. Другими обозначениями Т. етегкопп АТСС 16479 являются СВ8393.64, ШО31232 и IМН 16815. Одиночную колонию АТСС 16479 очищали и хранили; этим штаммом является ТЕС-1. Для приготовления стоков для дальнейших исследований применили массовую инокуляцию ТЕС-1, и этот штамм назвали ТЕС-1А. Все мутанты, описанные в данном документе, получены из одиночной колонии ТЕС-1А, названной ТЕС-101.
Среды и растворы
1. Общий рост, очистка колоний и консервация штаммов
Картофельный агар с декстрозой, РИА (Ро!а!о йеХтоке адаг), (Р1ика, Са!. Ыо. 70139)
Картофельный экстракт 4 г/л
Декстроза 20 г/л
Бакто агар 15 г/л рН 5,4
Вода до одного литра
Стерилизовать 20 мин при 120°С
Физиологические соли
ИаС1 9 г/л
Ν&2ΗΡΟ4.Η2Ο 0,8 г/л
кн2ро4 0,14 г/л
РН 7 (скорректирована 3,5 М фосфорной кислотой).
- 20 021855
2. Споруляция
Агаровая среда для Та1аготусе§
Солевая фракция по.З Целлюлоза (3%)
Бакто пептон
Мука крупного помола
КН2РО4
СаС12.2Н2О
Бакто агар
РН
Вода
Стерилизовать г
г
7,5 г 15 г 5 г 1 г 20 г 6,0 до одного литра 20 мин при 120°С
Композиция солевой фракции
Солевая фракция соответствовала раскрытию νθ 98/37179, табл. 1. Отклонениями от композиции этой таблицы были СаС12-2Н2О 1,0 г/л, КС1 1,8 г/л, лимонная кислота 1 Н2О 0,45 г/л (хелатирующее средство).
3. Анализ флуоресценции в чашках
С-агар
10х М8-буфер Бакто пептон Целлюлза (10%) Оксоидный агар по 3 Вода
Стерилизовать
10хМ§-буфер
КН2РО4 (ΝΗ4)28Ο4
Мочевина
М§ЗО4.7Н2О
СаС12
РеЗО4.7Н2О
МпЗО4.7Н2О
Ζη8Ο4.7Η2Ο
Вода
РН
Хранить
4. Среда для уменьшения размера колоний СТХ-агар
С-агар
ТпЮп Х100 (0,05%)
5. Проращивание спор и стимуляция роста СТХО-агар
СТХ-агар глюкоза вплоть до 1,5%
6. Отбор устойчивых к аналогам глюкозы мутантов ΥΝΒ-агар (дрожжевая азотная основа)
ΥΝΒ + аминокислоты Крахмал растворимый Бакто пептон Целлюлоза Оксоидный агар по 3 Вода рН
Стерилизовать
ΥΝΒ + аминокислоты (ЭНсо. СаС Νο. 239210)
7. Отбор мутантов, устойчивых к фтороротовой кислоте
100 мл 7,5 г 100 мл 20 г до одного литра 20 мин при 120°С г
г г
Зг г
мг мг мг до одного литра 1л
6,0 максимум 6 месяцев, охлажденным г 20 г Юг 10 г 25 г до одного литра
6,2 мин при 120°С
- 21 021855
Агаровая среда с РоА
Бакто Дрожжевой экстракт
МЕЗ гидрат
Глюкоза.Н2О (ΝΗ4)25Ο4
КН21’О4
ΝβΗ2ΡΟ4
МдЗО4.7П2О
СаС12.2Н2О 0,13 г
Т\уееп-40
Урацил
Оксоидный агар по 1 Микроэлементы Вода рН
Стерилизовать г Юг 35 г 0,2 г 0.4 г 0,15 г 0,5 г г
г г 10 мл довести до 1 л довести до 5,3 20 мин при 120°С
Стерилизованная фильтром фтороротовая кислота (8|дта. СаГ Νο. Р5013; 10% стоковый раствор, приготовленный в ΌΜ8Ο) добавляют после смешивания до конечной концентрации 0,1% (1 г/л).
Среды для перемешиваемых колб
1. Среда для инокуляции Среда 1 для Та1атотусех
Глюкоза 20 г/л
Дрожжевой экстракт (ϋί&ο) 20 г/л
С1его1 ЕВ АЗ 107 (АГ) (антивспениватель) 4 капли на литр рН 6,0
Стерилизовать 20 мин при 120°С
2. Среда 2, 3 и 4 для Та1атотусех
А3 50%, А2 25% и А3 20% называются среда 2 для Та1атотусех (Т2), среда 3 для Та1атотусех (Т3) и среда 4 для Та1атотусех (Т4) соответственно. Рецептуры даны в табл. 1.
Таблица 1. Композиция ростовых сред для проверки выработки целлюлаз в перемешиваемых колбах и микротитрационных планшетах. Стерилизация 20 мин при 120°С
Ингредиенты (г/литр)
СредыА2 среды АЗ
Среды ТЗ Т4 Т2
Состав сред 25% 50% 20% 50% 100%
Солевая фракция 30 15 30 15 30
Целлюлоза 20 20 30 30 30
Бакто пептон 3,75 7,53 3 7,5 15
Мука грубого помола 7,5 15 6 15 30
КН2РО4 10 10 10 10 10
СаС12.2Н2О 0,5 0,5 0,5 0,5 1
С1его1 РВАЗ 107 (АР) 0,4 мл 0,4 мл 0,4 мл 0,4 мл 0,4 мл
ЕН 5 5 5 5 5
Аналоги/интермедиаты
2-дезоксиглюкоза (8|дта. СаГ Ыо. Ό6134): готовили стоковый раствор на воде в концентрации 10%.
1-тиоглюкоза (8|дта. СаГ Ыо. Т6375): готовили стоковый раствор на воде в концентрации 10%.
Протокол выращивания в перемешиваемых колбах
Предварительные культуры
Штаммы выращивали из стоков на скошенных агарах со средой для Та1атотусех в течение 5-7 дней при 40°С; стоки штаммов хранили при -80°С в 10% глицерине. Выращенные штаммы на скошенном агаре необходимо хранить при комнатной температуре с максимальным периодом хранения две недели, после этого для тестирования штаммов необходимо приготовить свежие культуры на скошенном агаре.
Споры и мицелий со скошенных агаров использовали для инокуляции предварительных культур, содержащих среду 1 для Та1атотусех (20 мл культуральной среды в 100-мл колбе Эрленмейера). Инокуляцию осуществляли пипетированием 2 мл среды 1 для Та1атотусех на поверхности скошенного агара, многократным пипетированием и соскабливанием до удаления мицелия; суспендированную биомассу перемешивали в среде для инокуляции. Несколько капель оставшейся клеточной суспензии использовали для инокуляции свежих скошенных агаров для проверки сохранности штамма. Затем предварительную культуру выращивали максимум 20 ч при 44°С с перемешиванием (280 об/мин).
Продуцирующая культура
Один или 0,5 мл предварительной культуры использовали для инокуляции 20 мл продуцирующей среды (табл. 1) в 100-мл колбе Эрленмейера. Культуры инкубировали в течение 4 дней при 44°С с перемешиванием (280 об/мин).
Анализы целлюлаз
1. Анализ на пшеничной соломе (англ. \УНеа1 81га\у аххау) (^8И-анализ).
- 22 021855
Приготовление образцов
Для культур в перемешиваемых колбах 10 мл культурального бульона переносили в 12-мл одноразовую пробирку и центрифугировании для удаления биомассы. Один мл надосадочной жидкости затем переносили в 96-луночный планшет с глубокими лунками для хранения при -20°С.
Для 24-луночных микротитрационных планшетов планшеты центрифугировали для удаления биомассы. Один мл надосадочной жидкости затем переносили в 96-луночные планшеты с глубокими лунками для хранения при -20°С.
Для 96-луночных полуглубоких планшетов в каждую лунку вначале добавляли 300-400 мкл воды. После этого планшеты центрифугировали для удаления биомассы. Максимум 200 мкл надосадочной жидкости затем переносили в 96-луночные планшеты с глубокими лунками для хранения при -20°С.
Приготовление предварительно обработанного субстрата из промытой пшеничной соломы.
Предварительно обработанную разведенной кислотой пшеничную солому промывали водой до достижения рН раствора с пшеничной соломой значения 6,5 или выше и гомогенизировали массу с помощью иЬТКА-ТиККАХ, лиофилизировали и перемалывали для анализа. Для получения предварительно обработанной пшеничной соломы можно применять предварительную обработку разведенной кислотой (см. Пике, М. е! а1., Вютакк апк Вюепегду 32 (2008), 326-332) и оборудование (см. 8ске11, Ό.Ι, Арркек Вюскеттку апк Вю1есЬпо1о§у (2003), уо1. 105-108, рр. 69-85).
Под 1 \У8и понимают 0,119 мг/мл глюкозы, высвобожденной из 2,1 мас./об.% отмытой обработанной соломы 200 мкл ферментной смеси в течение 20 ч при 65°С и рН 4,50.
Высвобождение глюкозы не является линейной функцией количества фермента в композиции. Другими словами, удвоение количества фермента автоматически не приводит к удвоению количества глюкозы в течение одного и того же периода времени. Следовательно, предпочтительно выбрать разведение композиции, тестируемое для активности ^8И так, чтобы ^8И не превышало 40.
Измерение целлюлазной активности в единицах ^8И
Сохраненные образцы размораживали и осуществляли серийные разведения в деминерализованной воде с 2-кратным шагом, вплоть до разведения в 32 раза. Разведенный образец использовали для осуществления измерений, в которых анализировали 200 мкл разведенного образца. В первом измерении 200 мкл разведенного образца переносили во флакон, который содержал 700 мкл воды, содержащей 3% (мас./об.) сухого материала предварительно обработанного субстрата из промытой пшеничной соломы и 100 мкл 250 мМ цитратного буфера, конечный рН скорректировали до рН 4,5. Во втором измерении пустой образец, 200 мкл разведенного образца переносили во флакон, который вместо предварительно обработанного субстрата из промытой пшеничной соломы содержал 700 мкл воды и 100 мкл 250 мМ цитратного буфера, конечный рН корректировали до 4,5. Анализируемые образцы инкубировали в течение 20 и/или 60 ч при 65°С. После инкубации анализируемых образцов к ним добавляли 100 мкл раствора внутреннего стандарта (20 г/л малеиновой кислоты, 40 г/л ЭДТА в Ό2Θ). Количество высвобожденной глюкозы рассчитывается на основании сигнала при 5,20 ррт относительно диметил-сила-пентан-сульфоната, определенного посредством 1Ό 1Н ЯМР с рабочей частотой для протонов 500 МГц, с помощью пульсовой программы с супрессией воды, при температуре 27°С. Число ^8И рассчитывали из данных путем вычитания количества глюкозы, которое было определено в холостом образце, из количества глюкозы, которое было измерено в образце, инкубированном с пшеничной соломой. Единицы пшеничной соломы (\УНеа1 к1га\у ипкк) выражены как функция коэффициента разбавления образца.
2. Анализ с фильтровальной бумагой (РРи2»/0-анализ)
Целлюлазную активность также измеряли в значениях единиц фильтровальной бумаги (П11ег рарег τιιτίΐκ, РРИ) на мл при проведении анализа единиц фильтровальной бумаги в исходном (неразведенном) ферментном растворе. Способ модифицировали из аналитической процедуры Акпеу и Вакег (1996, МоА ЬаЪога!огу Аиа1укса1 Ргосекигек-006 епккек: Меакигетеп! о£ се11и1аке аскуйек Ъу Акпеу апк Вакег (1996) №№№.пге1.доу/Ъюта55/апа1укса1_ргосекиге5.к1т1) для того, чтобы сделать его чувствительнее, чем стандартный способ, который основан на рекомендациях международного союза теоретической и прикладной химии (ШРАС). Для количественных результатов ферментные композиции сравнивали на основе значимых и равных преобразований. Содержание 1,0 мг восстанавливающего сахара, такого как глюкоза, преобразованного в течение 60 мин, на 50 мг фильтровальной бумаги (2% преобразование вместо международного стандарта 4%), приняли как цену деления для расчета единиц фильтровальной бумаги (РРИ) по ШСА. В этой процедуре выход восстанавливающего сахара не является линейной функцией количества фермента в анализируемой смеси, поскольку двойное количество фермента не даст двойное количество восстанавливающего сахара в течение одного и того же периода времени. Процедура анализа, следовательно, предусматривает выявление разведения исходного ферментного стока, при котором аликвота разведения объемом 0,5 мл катализирует 2% преобразование в течение 60 мин, после чего по разведению осуществляется расчет активности (в РРИ^/мл) исходного стока.
РРИ рассчитывали с помощью следующей формулы:
Активность по фильтровальной бумаге=0,37/([Фермента] высвобождающего 1,0 мг глюкозы) [Единиц/мл] [Фермент] означает долю раствора исходного фермента, присутствующую в непосредственно тес- 23 021855 тируемом разведении фермента.
Ферментные анализы индивидуальных целлюлаз β-Глюкозидаза (АВИО)
Ферментативную активность β-глюкозидазы определяли при 37°С и рН 4,40 с помощью паранитрофенил-β-^-глюкопиранозида (81дта, Са1. Νο. N-7006) в качестве субстрата. Ферментативный гидролиз ρΝΡ-β-Ό-глюкопиранозида приводит к высвобождению пара-нитрофенола (ρΝΡ) и Ό-глюкозы. Для определения ферментативной активности измеряли количественно высвобожденный пара-нитрофенол, определенный в щелочных условиях. Через 20 мин инкубации реакцию останавливали добавлением карбоната натрия и поглощение измеряли при длине волны 405 нм. Активность β-гликозидазы рассчитывали путем применения коэффициента молярной экстинкции пара-нитрофенола (81дта, Са1. Νο. N-7660).
Примененная методология является абсолютным способом и активность выражается в наномолях высвобожденного β-нитрофенола в секунду на мл или на г образца. Активность β-глюкозидазы выражается в единицах Бета-Э-Глюкозидазы Белой Биотехнологии (англ. АЬЪе Вю1есН Ве1а-О-О1исо81Да8е, АВОО) на г или на мл. Одна единица АВОО определяется как количество фермента, которое высвобождает один наномоль пара-нитрофенола в секунду из пара-нитрофенил-β-^-глюкопиранозида при определенных условиях анализа (4,7 мМ ρΝΡΒΌΟ, ρΗ 4,40 и Т=37°С). Абсолютную активность рассчитывали с помощью известных в данной области стандартных протоколов для расчетов.
Активность эндоглюконаз (АВСи)
Эндоглюканаза катализирует гидролиз карбоксиметилцеллюлозы. Количество восстанавливающих сахаров, образованных в ходе ферментной реакции, определяли с помощью реактива динитросалициловой кислоты. Образцы инкубировали в присутствии раствора карбоксиметилцеллюлозы (№уасе1, геГ.394) 18 г/л в ацетатном буфере, ρΗ 4,60 при 37°С. Инкубацию останавливали через 60 мин добавлением раствора гидроксида натрия. Образцы кипятили в течение 5 мин в присутствии реактива динитросалициловой кислоты (Лсго8 15644500). После разведения водой интенсивность цвета измеряли при 540 нм. Методологию использовали как относительный способ. Результаты связаны с целлюлазной композицией с формально присвоенной активностью. Активность выражали в единицах АВСИ. Единица АВСИ определяется как количество целлюлазы, которая гидролизует в течение 1 ч некоторое количество эквивалентных гликозидных связей для образования 0,5 мг глюкозы в условиях анализа. Активность рассчитывали с помощью известных в данной области стандартных протоколов расчета путем нанесения значений Де11аОО540 относительно активности образцов с известной активностью, с последующим расчетом активности неизвестных образцов с помощью уравнения, полученного из калибровочной линии.
Анализы измерения белков
1. Общий белок
ТХУ/биуретовая реакция
Способ являлся комбинацией осаждения белка с помощью трихлоруксусной кислоты (ТХУ) с целью удаления мешающих веществ и для того, чтобы сделать возможным определение белка с помощью колориметрической биуретовой реакции. В биуретовой реакции ион меди (ίί) восстанавливается в медь (ί), которая образует комплекс с азотами и углеродами пептидных связей в щелочном растворе. Фиолетовый цвет указывает на присутствие белков. Интенсивность цвета и, следовательно, абсорбция при 546 нм прямо пропорциональна концентрации белка в соответствии с законом Ламберта-Бера. Стандартизацию осуществляли с помощью БСА (бычьего сывороточного альбумина), а содержание белка выражали в г белка как эквивалента БСА/л или мг белка как эквивалента БСА/мл. Содержание белка рассчитывали с помощью известных в данной области стандартных протоколов расчета путем нанесения значений ОИ546 относительно концентрации образцов с известной концентрацией, с последующим расчетом активности неизвестных образцов с помощью уравнения, полученного из калибровочной линии.
2. Индивидуальные белки с помощью ПААГ, денситометра и ЖХ/МС/МС измерений
Предварительная обработка образцов для ДСН-ПААГ
Осуществляли приготовление образцов на основе вычисленной концентрации белка. Для разведения образцов в пять раз (~1 мг/мл) к 10 мкл образцов добавляли по 40 мкл воды Μί11ίΟ и 50 мкл ТХУ (20%), после чего высаживали белки. После 1 ч на льду образец центрифугировали (10 мин, 14000 об/мин). Осадок промывали 500 мкл ацетона и центрифугировали (10 мин, 14000 об/мин). Осадок обрабатывали, как описано ниже.
ДСН-ПААГ
Осадок растворяли в 65 мкл воды Μί11ίΟ. 25 мкл буфера для образцов ΝηΡΑΟΕ™ ЬИ8 (4х), Ιηуйгодеи и 20 мкл средства для восстановления образцов ΝηΡΆΟΕ™ (10х), 1п\з1годеп. Перед стадией денатурации образец разводили в 5 раз смесью Μί11ίΟ: буфер для образцов ΝηΡΑΟΕ™ΕΟ8 и 10 мкл средства для восстановления образцов ΝηΡΆΟΕ™ в соотношении 65:25:10. После смешивания образцы инкубировали в термомиксере в течение 10 мин при 70°С. Растворы образцов наносили на 4-12% БисТрис гель (ΝηΡΑΟΕ™ В18ТГ18, 1иуЬгодеи). Также на гель наносили образец (10 мкл) маркера М12 (ΙηνίЦодеи). Гель прогоняли при 200 В в течение 50 мин на ХСЕБЕ 8нге1оск с 600 мл разведенного в 20 раз буфера с ДСН во внешней камере для буфера и 200 мл разведенного в 20 раз буфера с ДСН, содержаще- 24 021855 го 0,5 мл антиоксиданта (ЫиРЛОЕ™ 1пуйгодеп), во внутренней камере для буфера. После прогона гель споласкивали дважды диминерализованной водой, гели фиксировали раствором 50% метанол/7% уксусная кислота в течение 1 ч и окрашивали Зурго КиЪу (50 мл на гель) в течение ночи. Изображение получали с помощью Туркооп 9200 (610 ВР 30, Огееп (532 нм), РМТ 600В, 100 мкм) после отмывки геля водой МН НО.
Количественный анализ белка
Соотношение белковых полос в дорожке определяли сканером Туркооп с помощью стандартных способов, известных в данной области. Образец наносили трижды и уровень яркости определяли программным анализом изображений.
Значения выражали как относительный % белка по отношению к общему белку, рассчитанному по уровню яркости полосы выбранного белка относительно общего уровня яркости полос всех белков.
Выбранные полосы вырезали с помощью Ехциек! Зрокийет от ВюКаб (РЕ003) и смывали с помощью воды МПНО в 96-луночный микротитрационный планшет. Воду МПНО отбрасывали и все полосы резали второй раз для того, чтобы собрать больше материала образца.
Расщепление белков в геле для анализа последовательностей пептидов с помощью ЖХ/МС/МС
Кусочки геля, собранные в микротитрационный планшет, отмывали 50 мМ ИН4НСО3 рН 7,8. Промывку повторяли несколько раз, каждый раз уплотняя кусочки геля между стадиями отмывки с помощью ацетонитрила для удаления примесей и для обеспечения идеальных условий расщепления в геле. Количество добавляемых 50 мМ ИН4НСО3 и ацетонитрила может варьировать в зависимости от размера кусочков геля; кусочек геля должен быть хорошо погружен в растворы. Добавляли свежеприготовленный раствор трипсина и инкубировали микротитрационные планшеты в течение по меньшей мере получаса на льду или при 4°С в холодильнике с последующей инкубацией в течение ночи при 37°С при нагреве крышки микротитрационного планшета. После ночной инкубации кусочки геля обрабатывали ультразвуком в течение 1-5 мин и жидкую фракцию переносили в новый микротитрационный планшет ЬоВшб. Для удаления из кусочков геля максимально возможного количества пептидов в кусочки геля добавляли минимально возможный объем ацетонитрила и муравьиной кислоты с последующей обработкой ультразвуком в течение 1-5 мин. Жидкую фракцию переносили в микротитрационные планшеты ЬоВшб и добавляли малый объем муравьиной кислоты.
Аминокислотную последовательность триптических пептидов определяли с помощью стандартного анализа ЖХ/МС/МС, известного в данной области.
Для анализа пептидных смесей использовали так называемое детальное сканирование (кигуеу ксап). Данный способ, в котором сканирование состоит из двух сегментов, определен следующим образом:
1) полный сканирующий МС-анализ для отбора ионов-предшественников для МС/МС, основанного на определенных критериях;
2. МС/МС выбранных ионов для получения информации об аминокислотной последовательности.
С помощью этой процедуры один ион-предшественник единовременно отбирали для МС/МС в пределах определенных пороговых значений, что дает массивы данных МС/МС по пептидам, всей представленной аминокислотной последовательности части белка. Все спектры МС/МС использовали для идентификации белка поиском по базе с помощью поискового системы Максо! в соответствующих базах данных.
3. Индивидуальные белки с помощью протеомного анализа АРЕХ
Материалы
ЖХ-МС/МС-система, состоящая из Ассе1а и ЙТ0-Уе1ок от Ткегто Иккег (Сан-Хосе, Калифорния, США). Колонки были приобретены у АдПеШ: 2огЪах, 2,1 ммх5 м, С18-колонка с частицами 1,8 рм. ВюГике Ггексо от Негаеик использовали для центрифугирования пробирок ЕррепбогГ, Весктап Соикег А11едга Х-15К использовали для центрифугирования пробирок Отешет. Термомиксер СотГой от ЕррепбогГ1 (Гамбург, Германия) использовали для инкубации, а пробирки ЕррепйогГ ЬоЪшб использовали для всех экспериментов. Поиски по базам данных осуществляли с помощью поисковой машины Зогсегег 2 (§адеЫ, Сан-Диего, Калифорния, США), использующей Тгапк-Рго1еопПск Р1ре1ше (ТРР).
Результаты идентификации обрабатывали с помощью свободного программного обеспечения АЪко1и!е Рго1еш Ехргеккюп коГйуаге (АРЕХ), кйр://рГд^с.^сν^.о^д/^ибеx.ркр/Ъ^о^пГо^тайск/ареx.кΐт, для получения количеств белков.
Буферы А и В, ЖХ-МС-категории, 0,1% муравьиная кислота в воде и 0,1% муравьиная кислота в ацетонитриле соответственно приобретены у ВюкоКе (Валкенсваард, Нидерланды). Бычий сывороточный альбумин (БСА), мочевина, йодацетамид (1АА) и 6,1 N раствор трихлоруксусной кислоты (ТХУ) приобрели у §1дта А1бпсН (Сент-Луис, Миссури, США). Раствор ТХУ разводили в 4,5 раза для получения 20% раствора ТХУ. Дитиотреитол (ДТТ) приобрели у Коске Арркеб Заепсе (Индианаполис, Индиана, США). Муравьиную кислоту (МК) приобрели у 'ЗТ Вакег (Филипсбург, Нью-Джерси, США). Трипсин со степенью чистоты для секвенирования приобрели у Коске Арркеб Заепсе (Пензберг, Германия).
- 25 021855
Преципитация с ТХУ и расщепление
Образцы осторожно размораживали и хранили на льду столько, сколько необходимо для приготовления образцов. Образцы разводили до концентрации белка 5 мг/мл. 100 мкл Образца и 50 мкл 0,1 мг/мл БСА разводили 1:1 20% ТХУ. Образцы инкубировали при 4°С в течение 30 мин и осаждали белки центрифугированием в течение 10 мин при 13000 об/мин, 4°С. Надосадочную жидкость удаляли и осадки отмывали 200 мкл ацетона при -20°С. Белки снова осаждали центрифугированием в течение 10 мин при 13000 об/мин, 4°С и удаляли надосадочную жидкость.
Отмытые осадки разводили в 75 мкл 8М мочевины. Данный раствор разводили 392, 5 мкл 100 мМ ЫН4НСО3. Добавляли 5 мкл 500 мМ ДТТ и инкубировали образцы при комнатной температуре в течение 30 мин при максимальном перемешивании на термомиксере. Цистеины алкилировали добавлением 13,5 мкл 550 мМ ΙΑΑ и инкубацией при комнатной температуре в течение 30 мин с максимальным перемешиванием на термомиксере в темноте.
Расщепление осуществляли добавлением 20 мкл 250 мкг/мл трипсина, рН 3 и инкубацией при 37°С в течение ночи при максимальной перемешивании в термомиксере. Для обеспечения полноты расщепления добавляли еще 5 мкл 250 мкг/мл трипсина, рН 3 и продолжали расщепление в течение 3 ч при 37°С.
Образцы анализировали с помощью системы Ассе1а ЬТЦ-Уе1ок кук1ет (ТЬегто Е1ес1гоп).
Колонка АдНеШ 2,1x5 мм, Ц8-колонка, частицы 1,8 цм.
Градиент 80 мин 5-40% АсЫ, 0,1% муравьиная кислота, 2 мин 40-60% АсЫ, 0,1% муравьиная кислота.
Скорость потока 400 цл/мин.
Инъецируемый объем 20 цл.
Общее время выполнения, включая инъекцию, отмывку колонки и повторное установление равновесия, составило 85 мин.
М8-Способ: 10 порядка двойная (ДоиЬ1е р1ау) улучшенная МС, т/ζ 300-2000, и МС/МС на 10 лучших пиках.
Сортировка по заряженному состоянию пропускает только ионы 2+ и 3+.
Динамическое исключение: повтор 1, длительность исключения 10 с.
Анализ данных с помощью Зогсегег и ЗроШге
Данные искали в базе данных Та1аготусек етегкопи (ТЕМЕК), которую вручную редактировали для включения последовательностей внутреннего стандарта БСА. Поиск по базам данных осуществляли на Зогсегег 2, с помощью ТРР. Статистический анализ данных осуществляли с помощью стандартных статистических инструментов.
Анализы протеаз
Примененный способ использовали для определения протеазной активности в кислых условиях (рН 3,5). Образец инкубировали в присутствии гемоглобина (81дта, Са1. Ыо. Н2625) как субстрата при 60°С. Реакцию останавливали через 60 мин добавлением трихлоруксусной кислоты. Образовавшийся преципитат удаляли фильтрацией с помощью фильтра \УНа1тап 42. Оптическую плотность фильтрата, измеренную при 280 нм, сравнивали с плотностями растворов калибровочной линии, определенных в той же серии. Активность выражается в АРИ (англ. АсШ Рго1еаке ипй, Единицах Кислой Протеазы) на мл или на г. 1 АРИ является количеством фермента, который в условиях теста гидролизует количество субстрата в минуту, дающего раствор с оптической плотностью при 280 нм, равный оптической плотности раствора, содержащего 1,911 мкг тирозина на мл.
Активность рассчитывается с помощью известных в данной области стандартных протоколов расчета путем нанесения значений ΟΌ280 относительно активности образцов с известной активностью с последующим расчетом активности неизвестных образцов с помощью уравнения, полученного из калибровочной линии.
Анализ целлюлаз в чашках
Флуоресцентный анализ целлюлаз в чашках
Флуоресцентные соединения 4-метилумбеллиферил-в-О-целлобиозид (81дта, Са1. Ыо. М6018) и метилумбеллиферил-β-глюкозу (81дта, Са1. Ыо. М3633) использовали для визуализации экспрессии СВН и β -глюкозидазной активности, соответственно, колоний, выращенных на чашках с С-агаром. Субстраты 4-метилумбеллиферил β-Ό-целлобиозу (англ. 4-те1Ну1итЬеШГегу1 в-Э-сеИоЬюке, МИС) и 4-метилумбеллиферил β-Ό-глюкозу (англ. 4-те1Ну1итЬеШГегу1 в-Э-д1исоке, МИС) хранили в виде 10 мМ стоковых растворов в ДМСО и непосредственно перед использованием стоки разводили в 10 раз 50 мМ натрийацетатным буфером, рН 4,5. Полученные растворы стерилизовали через фильтр (0,2 мкм) и добавляли к расплавленной агаровой среде (СТХС) до конечной концентрации 0,1 мМ и разливали по чашкам Петри. Использовали различные концентрации глюкозы: без глюкозы, 0,1, 0,5 и 1%. В качестве контроля использовали чашки агара с 0,5% мальтозой.
Планшеты Ц 1гау. содержащие СТХС + флуоресцентный субстрат, инокулировали 104 мутировавших спор из отобранных мутантных библиотек. В качестве контролей агаровые чашки подобным образом инокулировали эталонными штаммами, ТЕС-147, ТЕС-123 и ТЕС-101. В ходе инкубации при 40°С
- 26 021855 на предмет флуоресценции в присутствии или отсутствие глюкозы ежедневно проверяли колонии в Р бау в УФ-свете (366 нм). Всего 106 мутированных спор скринировали на флуоресцентной агаровой среде. Мутанты, которые давали наиболее сильную флуоресценцию в присутствии или отсутствие глюкозы, сохраняли для дальнейшего исследования.
Л2СЬ ксилан (анализ ксиланаз на чашках)
Цветные соединения Л2СЬ ксилан из овса (Медахуте, Са1. по 1-Л2ХОТ) использовали для визуализации экспрессии ксиланазной активности колоний, выращиваемых на агаровых чашках.
Использовали ΥΝΕ-агар, содержащий 1% целлюлозу, а Л2СЬ ксилан добавляли к агару до конечной концентрации 0,1%. Также в агар по мере необходимости добавляли 2% глюкозу. Тестируемые штаммы инокулировали (т.е. рассевали штрихом для получения одиночных колоний) на эти агаровые чашки с помощью суспензии спор из глицериновых стоков или с помощью хорошо спорулирующих скошенных агаров. Чашки с агаром инкубировали в течение 2-3 дней при 40°С. Качество роста и размер окрашенного в синий цвет гало, окружающего колонии, использовали для оценки уровня выработки ксиланазы среди различных штаммов.
Условия мутагенеза
Приготовление спор
Споры собирают с агаровых чашек со средой 2 для Та1аготусек, которые были инокулированы разведенной в 10 раз суспензией спор из стока спор штамма ТЕС-101. После инкубации в течение 7 дней при 40°С сбор завершали соскабливанием спорулирующего мицелия с агаровых чашек с помощью 10% раствора глицерина. Споры суспендировали в 10% глицерине и хранили при -80° С.
ЭТС
Партию спор Т. етегкопи (>108 спор) инокулировали в 20 мл среды 1 для Та1аготусек и эту культуру инкубировали в течение 4 ч при 45°С с перемешиванием (280 об/мин) для начала прорастания спор. Суспензию спор центрифугировали и концентрировали ресуспендированием осадка в 10 мл 0,01 М буфера Трис-малеиновая кислота, рН 8,0, содержащего 0,01% Тритон х100. Пророщенные споры подвергали мутагенезу №ГС с помощью известных в данной области стандартных способов (Сегба О1тебо, 1987, Ми1адеиек1к. 1п Рбусотусек (Е. Сегба-О1тебо апб Е. Ό. Пркоп, ебк.), рр. 341-344. С8Н ЬаЬогаПгу Ргекк, Со1б Зрбпд НагЬог, ΝΥ, И8Л).
Были использованы следующие концентрации №ГС: 0, 0,05, 0,1 и 0,2 мг/мл. Добавление 10% раствора №282О3 использовали для остановки/инактивации реакции №ГС.
После мутагенеза обработанные клетки отмывали один раз в физиологическом солевом буфере и разведения (10-1-10-5/мл) рассевали на чашки с агаровой средой для Та1аготусек для определения выживания клеток. Чашки инкубировали при 45°С в течение 3-7 дней для определения титров КОЕ.
Каждую партию мутантов (0,5 мл) использовали для инокуляции одного планшета 0-1гау (24 мх4 см; У\УК.), содержащего ТЕС-агар. Остаток суспензии мутированных клеток хранили при -80°С пробирках для замораживания с 10% глицерином.
Затем для оценки качества партий мутантов определяли частоту РоЛг-мутантов в различных партиях мутантов. ~107 Спор на партию мутанта помещали на среду с РОЛ-агаром. Чашки инкубировали при 40°С в течение 3-7 дней для определения титров КОЕ.
Партии мутантов с выживаемостью клеток 5-25%, которые имели по меньшей мере 10-кратное увеличение количества РоЛг-колоний, использовали для скрининга мутантов обычным способом.
УФ
Пророщенные споры облучали УФ стандартными способами, известными из (Вок, С.Б апб 81аб1ег, Ό., 1996. Ми1абоп. 1п Рипда1 Сепебск, Рбпс1р1ек апб Ргасбсе (С.б. Вок., еб.), рр. 28-31, Магсе1 Эеккег, Νον Υо^к; Вок е1 а1., 1992, Сигг. Сепеб 21: 117-120).
N6)6)
Пророщенные споры обрабатывали N^О известными в данной области стандартными способами (Зегху Ва1 е1 а1., 1977, Ми1абоп КекеагсЬ 56: 153-156). Вкратце, применяемый протокол является аналогичным протоколу, использованному для мутагенеза пророщенных спор Та1аготусек с №ГС. Использованные концентрации N^О составили 0,5, 1 и 2,5 мкг/мл суспензии спор. Время инкубации в присутствии N^О составило 1 ч. Добавление 10% раствора №282О3 использовали для остановки/инактивации реакции N^О.
Слияние протопластов для объединения мутаций
Образование протопластов
Условия для образования протопластов были получены из известных в данной области протоколов (РеЬегбу, 1975, ЛгсЬ Мюго 105: 201-205; РеЬегбу, 1985, I. Сеп. МюгоЬю1. 131: 2813-2823. Штаммы Та1аготусек с различными селективными маркерами, например, с устойчивостью к РОЛ (5-фтороротовой кислоте) и устойчивостью к ЭОС (2-деокси-Э-глюкозе) инокулировали из различных глицериновых стоков в среду 1 для Та1аготусек и выращивали в перемешиваемых колбах в течение 48 ч при 45°С, 280 об/мин. Два мл этих инокуляционных культур использовали для инокуляции 500 мл перемешиваемых колб с 50 мл среды ΥСС (на л: 8 г КС1, 16 г глюкозы-Н2О, 20 мл 10% дрожжевого экстракта, 10 мл 100х
- 27 021855 пен./стреп., 6,66 г ΥΝΒ + аминокислоты, 1,5 г лимонной кислоты и 6 г К2НРО4). Инкубацию продолжали в течение 16 ч при 45°С в ротационном шейкере при 250-280 об/мин. Мицелии из этих культур затем собирали центрифугированием в 50-мл пробирки Отешет в течение 10 мин при 4000 об/мин или использовали фильтровальную бумагу Миас1о1Ъ (Са1Ьюсйет). Осадки промывали и ресуспендировали в 0,6М КС1/20 мМ цитратном буфере, рН 5,8.
Выделение протопластов
Для образования протопластов на 2 г мицелия добавляли 10 мл буфера 8ТС (на л: 218 г сорбита (1, 2М), 7,35 г СаС12-2Н2О, 10 мМ Тпк/НО рН 7,5) и 2 мл раствора О1исапех (250 мг/мл О1исапех 200О (№уо/утек) в Н2О). Смесь инкубировали в ротационном шейкере при 100 об/мин и 34°С в течение 90150 мин. Протопласты отделяли от мицелия с помощью фильтра Миас1о1й и добавляли §ТС до конечного объема 45 мл. Суспензию протопластов суспендировали в течение 10 мин при 390 д и при 4°С, а после этого протопласты ресуспендировали в 45 мл 8ТС. Протопласты центрифугировали в течение 10 мин при 390 д и при 4°С и ресуспендировали в буфере 8ТС в концентрации 107-108 протопластов/мл. Качество и количество протопластов оценивали под микроскопом.
Слияние протопластов
Слияние протопластов индуцировали смешиванием 1 мл суспензии протопластов с 6 мл 60% РЕО 4000 (Мегск), содержащего 50 мМ СаС12, с последующей инкубацией в течение 15 мин при комнатной температуре. После инкубации РЕО разводили добавлением 30 мл КС1/цитратный буфер и центрифугировали в течение 5 мин при 2000 об/мин.
Осадок ресуспендировали в 2 мл свежего КС1/цитратный буфер и эту суспензию протопластов помещали на восстанавливающие агаровые чашки. Для восстановления использовали чашки с агаровой средой для Та1аготусек, как описано, но с добавлением сорбитола в качестве осмотического стабилизатора, в конечной концентрации 0,8 М. После инкубации в течение 7 дней при 40°С споры собирали с восстанавливающих агаровых чашек и эти суспензии спор рассевали на селективные агаровые среды для отбора слитых с обоими селектируемыми маркерами.
Периодическое выращивание
Процедура инокуляции
Содержимое одного флакона добавляли к среде для предварительного культивирования: 2-л колба с ребрами для перемешивания [20 г/л дрожжевого экстракта, 20 г/л глюкозы рН 6,8 (с КОН), 300 мл среды, стерилизация паром 20 мин при 121°С]. Предварительную культуру выращивали в течение 24-48 ч при 48°С и 200 об/мин. Временной интервал может быть адаптирован для конфигурации перемешиваемой колбы и жизнеспособности флакона.
Основная процедура ферментации
Среду составляли как смесь муки крупного помола (3%), целлюлозы (6%), источника азота (2,5%; известные в данной области примеры источников азота включают соевую крупу, дрожжевой экстракт, кукурузный экстракт, аммиак, соли аммония, нитратные соли), а также солевой фракции. Солевую фракцию привели в соответствие с ТОО 98/37179, табл. 1, с. 12. Отклонениями от композиции этой таблицы были: СаС12-2 водный 1,0 г/л, КС1 1,8 г/л, лимонная кислота 1 водная 0,45 г/л (хелатирующее средство). Среду стерилизовали паром в одной фракции. Биореакторы инокулировали при ~10% соотношении инокулюма, а рабочий объем равнялся 10 л. рН Процесса контролировали между 5,0-3,0 (с помощью фосфорной кислоты и аммиака), а температуру - на уровне 42-52°С. Воздушный поток поддерживали на уровне от 0,5 до 1,5 уут (англ. уо1ите аи рег уо1ите Ьго!й рег пипШе, объем воздуха на объем питательной среды в минуту) и ЭОТ выше 30% насыщения кислородом перед инокуляцией с целью перемешивания. В качестве противопенного средства периодически использовали С1его1: 2 с каждые 30 мин, в течение первых 24 ч, затем 2 с каждый час позднее.
В конце фазы предварительного культивирования брали образцы для проверки контаминации, определения глюкозы и измерения рН. В ходе основной ферментации образцы отбирали каждые 24 ч и осуществляли следующие анализы: контроль контаминации, измерение рН, ДСН-ПААГ гели, определение концентрации общего белка (биуретовый метод с ТХУ), активность в единицах фильтровальной бумаги (РРи2%/мл), активность β-глюкозидазы (ТОВИО), активность эндоглюканазы (ТОВСИ) и анализ на пшеничной соломе, как описано выше.
Пример 1
В этом примере описано выделение и характеризация вариантов Т. етегкопи с различной морфологией колоний.
Та1аготусек етегкопи является термофильным мицелиальным грибом. Споруляция на стандартной агаровой среде РИА крайне незначительна (<106/мл), рост на среде 2 для Та1аготусек дает улучшенную споруляцию (-107/мл). После рассева серийных разведений ТЕС-1А на чашках с агаровой средой для Та1аготусек могут быть распознаны колонии с тремя различными фенотипами (фиг. 1): ТЕС-101, четко выраженный белый воздушный мицелий (80% популяции); ЕС-102 и ТЕС-103, редуцированный воздушный мицелий (20% популяции; извлечено два изолята); ТЕС-104, отсутствие воздушного мицелия, коричневый цвет (1% популяции). Фенотип ТЕС-104 остается стабильным в течение многих поколений после
- 28 021855 роста на агаровых чашках или в жидких ростовых средах. Однако в случае ТЕС-101 схожие с ТЕС-104 варианты колоний продолжают образовываться с низкой частотой (<1%).
Тесты споруляции показали, что ТЕС-104 производит наивысшие титры спор (>107 мл). Однако во времязависимых экспериментах с перемешиваемыми колбами только ТЕС-101 вырабатывает целлюлазу на уровне, схожем или более высоком, чем уровни родительского ТЕС-1А (фиг. 2).
Более того, в 10-л ферментере периодическая ферментация ТЕС-101 вместе с ТЕС-1А дает 5 РРИ2.%/мл после 96 ч ферментации, тогда как ТЕС-104 дает меньше целлюлазы (2,3 РРИ2%/мл). Следовательно, ТЕС-101 показал лучшие общие характеристики и был выбран для дальнейшего улучшения штамма.
ТЕС-101 (также обозначаемый как РВО 101) депонировали в ΟΕΝΤΡΑΑΣ ВИКЕАи УООК §СН1ММЕРСиЬТиКЕ§, Иррка1а1аап 8, Р.О. Вох 85167, ΝΣ-3508 АО Утрехт, Нидерланды, 30 июля 2010 г., с регистрационным номером СВ§ 127450. Если где-либо в данном документе дается ссылка на штамм Та1аготусек дикого типа, или штамм дикого типа, или дикий тип, то подразумевается и/или используется ТЕС-101.
Пример 2
В этом примере описано выделение мутантов Т. ететкопп с улучшенной выработкой целлюлаз посредством высокопроизводительного скрининга случайных мутантов.
Обработанные ΝΤΟ споры ТЕС-101 рассевали из замороженных стоков на агаровую среду для Та1аготусек и выращивали в течение 4 дней при 40°С. Примерно 6000 мутантов переносили в 96-луночные микротитрационные планшеты (англ. писгоШег р1а1ек, МТР), содержащие агаровую среду для Та1аготусек (20 мкл/лунка). Эти МТР, названные мастер-планшетами, инкубировали при 40°С в течение 5 дней. Несколько лунок оставили пустыми, чтобы они позже содержали немутированный родитель ТЕС-101 и фермент РШгаке® ΝΣ.
Мастер-планшеты пересевали репликой с помощью автоматического устройства для инокуляции в 24-луночные МТР, содержащие среду 4 для Та1аготусек (3 мл/лунку). Для того чтобы осуществить это, в лунки мастер-планшетов добавляли физиологические соли (150 мкл/лунку) и суспензию спор переносили в 24-луночные МТР. Кроме того, по этому протоколу инокулировали новый 96-луночный мастерпланшет (200 мкл/лунку агаровой среды для Та1аготусек). 24-Луночные планшеты инкубировали в шейкере при 46°С и 80% влажности в течение 96 ч. Культуры откручивали для удаления биомассы и один мл надосадочной жидкости переносили во множество флаконов для проверки целлюлазной активности с помощью анализа с пшеничной соломой.
Мутанты, целлюлазная активность которых в ростовой среде была на 20-30% больше активности контрольной надосадочной жидкости из ТЕС-101, отбирали для дальнейших раундов скрининга. Данные раунды скрининга является более строгими, чем первый, что позволяет избавиться от ложноположительных результатов.
Для каждого отобранного мутанта первичного скрининга готовили по два скошенных агара для каждого штамма для вторичного скрининга в культурах в перемешиваемых колбах. Споры из этих культур использовали для инокуляции культур в дуплицированные перемешиваемые колбы, содержащие среду 2 для Та1аготусек. В некоторых сериях второй скошенных агар использовали вначале для инокуляции среды 1 для Та1аготусек (в перемешиваемых колбах); после роста в течение 24 ч 1 мл из этой культуры инокулировали в продуцирующую среду в перемешиваемой колбе.
Целлюлазную активность (анализ на пшеничной соломе при рН 4,5, 20 ч при 65°С, неразведенные образцы) всех мутантов, проверенных в перемешиваемых колбах, представлена на фиг. 3. Среднее значение целлюлазных активностей контрольного родительского штамма ТЕС-101 составило 62,6 ± 4,9 \νδυ. Один конкретный мутант (ОоЕ 600) имел значимое улучшение 63%.
В четвертичном скрининге тридцать наилучших мутантных штаммов из вторичных тестов снова проверяли в перемешиваемой колбе. Процедура была похожа на способ, используемый в вторичном скрининге. Штаммы отдельно проверяли инокуляцией спор со скошенного агара непосредственно в продуцирующую среду. На фиг. 4 дан обзор продуцирования всех испытанных повторно штаммов.
Первый набор в перемешиваемых колбах ОоЕ523, 529, 531, 541, 552, 553, 558, 618 и спонтанный мутант ТЕС-101*, которые продуцируют уровни целлюлаз выше, чем нормальные, повторно тестировали с использованием неразведенной надосадочной жидкости в анализе с пшеничной соломой; все другие проверяли на разведенных образцах для предотвращения ингибирования глюкозой выработки целлюлазы. В целом, большинство штаммов имели повышенную целлюлазную активность по сравнению с родительским штаммом. Интересно, что штамм ОоЕ 600 продемонстрировал наибольшее повышение, превышающее 100%.
Готовили маточные банки клеток всех 30 отобранных мутантов ТЕС-101 из четвертичного скрининга. Идентификаторами штаммов являются ТЕС-107-122, ТЕС-127-130 и ТЕС-135-144.
Эксперименты определения зависимости от дозы на пшеничной соломе подтвердили, что ТЕС-142 (ОоЕ600) вырабатывает едва ли не в два раз больше целлюлазной активности, чем контрольный родительский штамм ТЕС-101 (фиг. 5).
- 29 021855
Пример 3
В этом примере описана ферментация улучшенных по целлюлазе мутантов Т. етегкопи.
Три из вырабатывающих целлюлазу мутантов из случайного высокопроизводительного скрининга, ТЕС-121, ТЕС-137, ТЕС-142 и ТЕС-111; спонтанный мутант ТЕС-101 (ранее названный ТЕС-101*) проверяли в 10-л производственном ферментере в формате периодических ферментации. Для контроля похожим образом оценивали дополнительные штаммы: ТЕС-1А, исходный начальный штамм и ТЕС-101, распространенный вариант колонии из ТЕС-1А, который был прямым родителем мутантов.
В конце ферментации (96 ч) анализ ТХУ-биуретовая реакция показал, что во всех случаях концентрация общего белка находилась в диапазоне 9-10 г/кг. Только белковые уровни мутанта ТЕС-142 были значимо выше, примерно 16,4 г/кг (табл. 2).
Таблица 2. Обобщенные результаты периодической ферментации мутантов Т. етегкопн по выработке целлюлаз и родительских штаммов в 10-л ферментере, н.о. - не определено
Результаты ЕРИ-анализа показали, что четыре мутанта ТЕС-111, ТЕС-121, ТЕС-137 и ТЕС-142 вырабатывают значимо больше целлюлазной активности (больше чем на 10%), чем родительский штамм ТЕС-101 (измеренной в виде ЕРИ2%/мл через 96 ч ферментации и с учетом 10% отклонения в ЕРИанализе). Более того, ТЕС-142 продуцирует наиболее высокий уровень, 15,8 ЕРи2%/мл, который в 3 раза больше родительского ТЕС-101 (5,1 РРи2о/о/мл) (табл. 2). Для мутанта ТЕС-142 ферментные анализы показали по меньшей мере двукратное увеличение уровней ЕО (10200 ^БСИ/мл) и единиц пшеничной соломы (70,2 Χνδυ/16-кратное разведение), но показали повышение уровней ВО (~155 ^ΒΌΟ/мл) по сравнению с материнским штаммом ТЕС-101 (4580 VΒСи/мл, 33,1 νδυ/мл и 151 νΒΌΟ/мл соответственно). Это контрастирует состоянию мутанта ТЕС-137, в котором повышение уровня ЕРи (5,9 РРи2о%/мл, 20%) связано с увеличением активности ВО (172 νΒΌΟ/мл, 14%), а не, например, уровней ЕО (2990 VΒСυ/мл, 35% снижение) (табл. 2). Вторым наилучшим мутантом оказался ТЕС-121, демонстрирующий 7,2 ЕРи2%/мл (40% улучшение) и 48 νδυ/мл (45% улучшение), тогда как активности ВО и ЕО были ниже, чем у материнского штамма. Также было отмечено двукратное снижение активностей кислых протеаз.
Эксперименты зависимости от дозы на пшеничной соломе подтвердили, что ТЕС-142 вырабатывает почти в два раза больше целлюлазной активности, чем контрольный штамм ТЕС-1А или родительский штамм ТЕС-101 (фиг. 6). Интересно, что низкий, но значимый уровень высвобожденной целлобиозы был обнаружен ферментом, вырабатываемым этим мутантом.
И наконец, ДСН-ПААГ анализ ферментации показал, что целлюлазная активность вырабатывается на поздних стадиях ферментации (72-96 ч), тогда как вначале образуется главным образом биомасса. Кроме того, стало ясно, что мутант ТЕС-137 производит наиболее высокий уровень секретируемых белков через 48 ч. Такая ранняя секреция в ферментерах лабораторного масштаба или в предварительной культуре происходит из-за быстрорастущего фенотипа этих мутантов.
Пример 4
В этом примере даны характеристики улучшенного по целлюлазе мутанта Т. етегкопи, ТЕС-142.
Серийные разведения ТЕС-142 и родительского штамма ТЕС-101 поместили на чашки с агаровой средой для Та1аготусек и выращивали в течение 96 ч при 46°С. Колонии ТЕС-142 оказались меньше, чем ТЕС-101, и цвет колоний также изменился на зеленоватый оттенок. Также на агаровых чашках, содержащих 3% предварительно обработанной отмытой пшеничной соломы, тестировали рост. Через 96 ч при 46°С не наблюдали различий по размеру колоний между ТЕС-142 и ТЕС-101. Также не наблюдали различий между ТЕС-142 и ТЕС-101 при рассеве обоих штаммов на С-агаре с добавлением мальтозы (1%) и без нее. Также на гало С-агаровых чашек, содержащих предварительно обработанную, отмытую пшеничную солому (3%), не наблюдали каких-либо различий в размере гало между двумя штаммами. И наконец, ТЕС-142 не демонстрирует более высокую устойчивость к аналогам глюкозы, 2-деоксиглюкозе
- 30 021855 или 1-тиоглюкозе при уровнях МГС по сравнению с ТЕС-101.
ДСН-ПААГ анализ надосадочных жидкостей периодических ферментации ТЕС-142 в 10-л ферментере, объединенный с денситометрической оценкой и идентификацией ЖХ/МС/МС, подтвердил, что уровень белка целлюлазных ферментов повысился. В родительском штамме ТЕС-1А были идентифицированы по меньшей мере четыре специфические целлюлазы: целлобиогидолаза I (СВН I) плюс целлобиогидролаза II (СВН II), эндоглюконаза (ЕО), β-глюкозидаза (ВО). Также была идентифицирована одна гемицеллюлаза, ксиланаза (табл. 3).
Надосадочные жидкости из 96-часовых периодических ферментаций в 10-л ферментере ТЕС-1А и ТЕС-142 подвергли ДСН-ПААГ и внеклеточные белки идентифицировали посредством ЖХ/МС/МС с помощью общеизвестных баз данных, и их уровни подсчитывали денситометрическими измерениями. Значения выражали как относительный % белков по отношению к общему белку, рассчитанному по уровню яркости полосы выбранного белка относительно общего уровня яркости полос всех белков.
Таблица 3. Сравнение относительных уровней внеклеточных белков из ТЕС-1А и ТЕС-142
Размер белка (кДа) ТЕС-1А, Относительная интенсивность, %* ТЕС-142, Относительная интенсивность, %* Класс, белка определенный с помощью расщепления в геле с последующим ЮС/МС/МСанализом
-92 3 1 во
-48-55 47 45 СВН1/СВНII
-36-44 11 22 ЕО
* значения выражены как относительный % белков по отношению к общему белку, рассчитанному по уровню яркости полосы выбранного белка относительно общего уровня яркости полос всех белков
Сравнение данного профиля с профилем внеклеточных белков из ТЕС-142 продемонстрировало значимые различия. Наиболее важный белок ЕО был увеличен в 2 раза, что соответствует повышению ферментативной активности ЕО. Интересно, что не наблюдали значимых изменений в уровнях белков ВО или СВН М!
И наконец, как и с исходным штаммом Та1аготусек, ТЕС-1А, по меньшей мере две различные морфологии колоний ТЕС-142 наблюдали при рассевании на различные агаровые среды: наиболее распространенная (90% от общего числа) является ТЕС-101-подобная (колонии с четко выраженным воздушным мицелием), а наименее распространенным (10% от общего числа) является ТЕС-104-подобный (отсутствие воздушного мицелия, коричневый цвет). Эти два варианта очищали и переименовали как соответственно ТЕС-146 и ТЕС-147. Тесты споруляции показали, что ТЕС-147 производит наивысшие титры спор (>107/мл). Однако в отличие от предыдущих времязависимых экспериментов в перемешиваемых колбах с ТЕС-101 и ТЕС-104 ТЕС-147 вырабатывал на 10% больше целлюлазной активности (в анализе пшеничной соломы при 8-кратном разведении надосадочной жидкости), чем либо ТЕС-148, либо ТЕС142 в среде 2 для Та1аготусек после 96 ч роста при 46°С. Затем это подтвердили 10-л периодической ферментацией ЕксШуеПег. Через 96 ч роста ТЕС-146 выработал 14,9 РРИ2%/мл и 14,0 мг белка/мл (анализ ТХУ-биуретовая реакция), тогда как ТЕС-147 выработал 17,3 РРИ2%/мл и 17,4 мг белка/мл. При продлении ферментации ТЕС-147 до 120 ч в надосадочной жидкости обнаружили 20,5 РРи2»/о/мл и 19,4 мг/мл.
Таким образом, мутант ТЕС-147 объединяет как улучшенную выработку целлюлазы, так и хорошие свойства споруляции, которые облегчают дальнейшее улучшение штамма классическими способами или способами генной инженерии.
Пример 5
В данном примере описан анализ мутанта Т. етегкопп, ТЕС-142, с улучшенной выработкой целлюлазы в системе Ферментации с Одновременным Осахариванием (англ. 5нти11апеоик §ассНапйсаЛоп Регтеп!а!юп, δδΡ).
Периодические δδΡ-эксперименты проводили для сравнения эффективности целлюлазного фермента, вырабатываемого мутантом ТЕС-142, с ферментом РШтаке® ЫЬ. В этих экспериментах использовали отфильтрованную питательную среду для ферментации из примера 3. Условия для δδΡ известны в данной области и описаны в патентной заявке АО 2010018105. Осахаривание предварительно обработанной, отмытой пшеничной соломы осуществляли при 56°С в течение 20 ч, начиная с рН 5. Ферментные композиции добавляли непосредственно в ферментные партии при различных дозировках, определенных как мг белка, определенного ТХУ/биуретовой реакцией на г содержания глюкана+ксилана. δ. сегеуыае (пекарские дрожжи) добавляли в концентрации 0,5 г/л и ферментацию проводили при 33°С; среду для ферментации дополняли 0,025% КН2РО4 и 0,05% (ΝΗ4)2δΟ4. Выработку этанола измеряли в конце ферментации (168 ч) с помощью ЫМК Для того чтобы сделать это, примерно 2 мл пульпы поместили в каждую колбу, образцы центрифугировали при 4000 об/мин в течение 7 мин и надосадочную жидкость переносили во множество флаконов. Образцы хранили в холодильнике при -18°С до проведения анализа.
На фиг. 7 показано, что дозозависимые кривые выработки этанола из предварительно обработанной промытой пшеничной соломы при схожих дозировках РШтаке® ΝΣ и целлюлазной смеси из ТЕС-142 являются почти идентичными. Однако, поскольку этим мутантом вырабатывается в два раза больше бел- 31 021855 ка, чем штаммом дикого типа, то необходимо на 50% меньше объема фильтрата конца ферментации, что приводит к значимому снижению себестоимости.
ТЕС-142 депонировали в СЕЭТКААЬ ВИКЕАИ УООК δСНIΜΜΕ^Сυ^ΤυΚΕδ, ИрркаЫаап 8, Р.О. Вох 85167, ΝΣ-3508 ΑΌ Утрехт, Нидерланды, 1 июля 2009 г., с регистрационным номером СВδ 124902.
Пример 6
В данном примере описано выделение рациональным отбором с помощью аналогов глюкозы мутантов Т. етегеопп ТЕС-147, выработка целлюлаз которых дерегулирована по глюкозе.
Значения М1С для различных аналогов глюкозы (2-деоксиглюкозы, 1-тиоглюкозы, 5-тиоглюкозы) определены проверкой роста после инокуляции 0,1 мл разведений 107/мл суспензий спор ТЕС-142 на чашках с УКВ+-агаром с увеличением концентраций аналогов.
Результаты показывают, что уровни М1С для этих двух штаммов составляют: 2-дезоксиглюкоза 0,5 г/л и 1-тиоглюкоза - 4 г/л.
Партии мутантов ТЕС-147, полученные с помощью УФ, КТО и комбинации КТО и N00, затем рассевали на агаровые чашки (106 спор на чашку), содержащие аналоги глюкозы. Чашки с УКВ+-агаром + 0,1% деоксиглюкоза или 0,4% 1-тиоглюкоза использовали для отбора ожидаемых мутантов, устойчивых к аналогам глюкозы.
Для каждого отбора 100 устойчивых мутантов выкалывали из агаровых чашек и переносили на скошенные агары с средой для Та1аготусе8. Для инокуляции двух наборов дуплицированных перемешиваемых колб со средой 2 для Та1агошусе8 использовали скошенные агары, а культуры выращивали при 46°С с перемешиванием (280 об/мин). Один набор собирали через 48 ч роста, в тот момент, когда глюкоза только исчерпалась, а другой набор собирали через 96 ч роста, в тот момент, когда уровни целлюлаз обычно являются наивысшими. Сравнение соотношения выработки целлюлазного фермента при 48 и 96 ч использовали для идентификации дерепрессированных по глюкозе мутантов в отношении выработки целлюлаз. Дерепрессию по глюкозе подтверждали культивированием в перемешиваемых колбах мутанта на среде 2 для Та1аготусе8, содержащей 5% глюкозы в течение 96 ч, с последующим определением анализом с пшеничной соломой выработки фермента, которая составляет по меньшей мере 25% активности немутированного родительского штамма, выращиваемого подобным образом в среде 2 для Та1аготусе8 без глюкозы.
После этой сортировки выделили по меньшей мере один мутант, который дал значимо более высокое соотношение выработки фермента через 48 и 96 ч относительно родительского контроля и вырабатывает целлюлазную активность, которая составляет по меньшей мере 25% от активности немутированного родительского штамма при выращивании подобным образом в среде 2 для Та1аготусе8 без глюкозы в течение 96 ч. Таким образом, в изобретении предлагается штамм Та1аготусе8, дерепрессированный по глюкозе в отношении выработки целлюлаз.
Пример 7
В данном примере описано выделение с помощью высокопроизводительного скрининга случайных мутантов Т. етегеопп ТЕС-147, которые вырабатывают глюкозную целлюлазу на более ранних периодах роста.
Споры ТЕС-147, обработанные УФ, КТО или комбинацией КТО и N00, рассевали из замороженных стоков на агаровую среду для Та1аготусе8, содержащую антибиотики - пенициллин (6,7 мг/л) и стрептомицин (10 мг/л), и выращивали в течение 4 дней при 40°С. В общей сложности 11000 мутантов выращивали в 96-луночных титрационных микропланшетах (МТР), содержащих агаровую среду для Та1аготусе8 (200 мкл/лунку) с антибиотиком. Эти МТР, названные мастер-планшетами, инкубировали при 40°С в течение 5 дней.
Мастер-планшеты пересевали репликой в 96-луночные полуглубокие планшеты, содержащие среду 3 для Та1аготусе8 (300 мкл/лунку). После инокуляции планшеты с полуглубокими лунками покрывали воздухопроницаемой пленкой, а крышку заменяли. 96-Луночные планшеты инкубировали в шейкере при 44°С и 80% влажности в течение 96 ч. После добавления 500 мкл воды/лунку культуры откручивали для удаления биомассы и 50 мкл надосадочной жидкости переносили во множество ампул для проверки целлюлазной активности с помощью анализа на пшеничной соломе.
10% Лучших из мутантов (1000 мутантов), активность целлюлазного фермента которых в ростовой среде значимо выше по сравнению с контрольной надосадочной жидкостью из ТЕС-147, отбирали для второго раунда скрининга в формате 24-луночных микротитрационных планшетов, при использовании среды 4 для Та1аготусе8, как описано в примере 2. Для осуществления этого хиты из мастер-планшетов использовали для получения новых 96-луночных мастер-планшетов (200 мкл агаровой среды для Та1аготусек/лунку). Новые мастер-планшеты использовали для инокуляции 24-луночных планшетов в двух экземплярах, один набор инкубировали в шейкере при 40°С и влажности 80% в течение 72 ч, до момента истощения глюкозы, а другой набор собирали через 144 ч, в тот момент, когда уровни целлюлаз являются наиболее высокими. Сравнение соотношения выработки целлюлаз через 72 и 144 ч применяли для идентификации мутантов, которые дают целлюлазную активность раньше, чем родительский контроль (ТЕС-147). Культуры откручивали для удаления биомассы и надосадочную жидкость переносили во множество флаконов для проверки целлюлазной активности с помощью анализа на пшеничной соломе.
- 32 021855
10% Лучших из мутантов (1000 мутантов), активность целлюлазного фермента которых в ростовой среде значительно выше, чем в контрольной надосадочной жидкости из ТЕС-147, отбирали для третьего раунда скрининга в формате культур в перемешиваемых флаконах. Данный раунд скрининга является более строгим, чем первые два, что позволяет избавиться от ложноположительных результатов.
Для каждого отобранного мутанта из первичного скрининга готовили два скошенных агара каждого штамма для вторичного скрининга в культурах в перемешиваемых колбах. Споры из этих культур использовали для инокуляции дуплицированных культур в перемешиваемых колбах, содержащих продуцирующую среду 2 для Та1аготусек. В некоторых сериях второй скошенных агар использовали вначале для инокуляции среды 1 для Та1аготусек (в перемешиваемых колбах); после роста в течение 24 ч, 1 мл из этой культуры инокулировали в продуцирующую среду в перемешиваемой колбе.
Целлюлазную активность (анализ на пшеничной соломе при рН 4,5, 20 ч, разведенные образцы) всех мутантов тестировали в перемешиваемых колбах и из 10% лучших (10 мутантов) готовили маточные банки клеток. Ферментацию всех десяти мутантов по периодическому протоколу, описанному в примере 3, оценивали в 10-л ферментере. Был обнаружен один мутант, который давал наиболее высокий и наиболее ранний уровень целлюлазной активности по сравнению с родительским контролем ТЕС-147.
Пример 8
В данном примере дано описание комбинирования благоприятных мутаций мутантов Т. етегегкоии с улучшенной целлюлазой посредством слияния протопластов.
РоАг-вариант ТЕС-142, ТЕС-147 из примера 2 или его улучшенный мутант из примера 7 скрещивали с ΌΟΓ- или ТСг-мутантом ТЕС-142 или ТЕС-147 из примера 6, которые являются дерепрессированными по глюкозе в отношении выработки целлюлаз. Больше чем 107 протопластов из каждого штамма смешивали вместе и РЕС4000 + 50 мМ СаС12 добавляли до конечной концентрации 40% РЕС4000. После смешивания и инкубации в течение 15 мин при комнатной температуре смесь протопластов отмывали КС1/цитратным буфером, как описано. После отмывки серийные разведения смеси протопластов помещали на агаровую среду для Та1аготусек плюс сорбитол, как описано.
После инкубации в течение 7 дней при 40°С собирали споры из восстанавливающих агаровых чашек, делали серийные разведения и для получения одиночных колоний размазывали по 0,1 мл на чашках с агаровой средой для Та1аготусек. В некоторых случаях 5-фторооротовую кислоту и деоксиглюкозу или 5-фторооротовую кислоту и тиоглюкозид добавляли в чашки для отбора рекомбинантных фузантов.
Примерно 100 изолятов одиночных колоний тестировали на предмет выработки целлюлаз скринингом в 24-луночных планшетах. 50 Лучших по выработке целлюлаз изолятов повторно тестировали в перемешиваемых колбах в среде 2 для ТЕС с 5% глюкозой или без нее, с применением ТЕС142 или ТЕС147 в качестве эталонного штамма. Отобрали пять штаммов со значимо улучшенной, но при этом дерепрессированной по глюкозе выработкой целлюлаз.
Два штамма, ТЕС-РР1 и ТЕС-РР2, отобранные для теста выработки целлюлаз в 10-л масштабе, показали >20% улучшение выработки целлюлаз по сравнению с ТЕС-142 или ТЕС-147, при этом остались дерепрессированными по глюкозе.
Пример 9
В данном примере описано выделение рациональным отбором с помощью 2-деоксиглюкозы мутантов Т. етегкоии ТЕС-142 и ТЕС-147, которые являются дерепрессированными по глюкозе при выработке целлюлаз.
Значение М1С 2-деоксиглюкозы (ΌΟΟ) определяли путем проверки роста после инокуляции 0,1 мл разведений 107/мл суспензии спор ТЕС-142 на чашках с ΥNΒ+-агаром с увеличением концентраций аналога. Результаты указывают на то, что уровень М1С для этого штамма составил 0,5 г/л.
Партии мутантов ТЕС-142, полученные с помощью комбинации ΝΓΟ и ΝΟΟ. рассевали на чашках с ΥNΒ+-агаром, содержащим 0,1% деоксиглюкозу (106 спор на чашку). Примерно 300 ОСг-мутантов выкалывали из агаровых чашек и переносили на скошенные агары со средой для Та1аготусек. После споруляции мутанты очищали снова на чашках с ΥNΒ+-агаром, содержащим 0,1% деоксиглюкозу. После инкубации в течение 3-4 дней при 40°С колонии переносили на скошенную агаровую среду для Та1аготусек. Скошенные агары использовали для инокуляции двух наборов дублицированных перемешиваемых колб со средой 2 для Та1аготусек и выращивали культуры при 46°С с перемешиванием. Один набор собирали через 48 ч роста, в тот момент, когда глюкоза только исчерпалась, а другой набор собирали через 96 ч роста, в тот момент, когда уровни целлюлазы обычно являются наиболее высокими. Сравнение соотношения выработки целлюлазного фермента через 48 и 96 ч использовали для идентификации мутантов, которые являются дерепрессированными глюкозой в отношении выработки целлюлаз. Были идентифицированы по меньшей мере три мутанта с высоким соотношением выработки ТЕС между двумя временными точками (соотношение >0,5), ΌΟΟ32, ΌΟΟ33 и ΌΟΟ264. Дерепрессию по глюкозе оценивали при выращивании мутантов в среде 2 для Та1аготусек, содержащей 5% глюкозу, в течение 96 ч в культурах в перемешиваемых колбах, посредством мониторинга выработки фермента через 24, 48, 72 и 96 ч. Два мутанта ΌΟΟ33 и ΌΟΟ264 дают значимые количества ТЕС в присутствии глюкозы по сравнению с контрольными штаммами ТЕС-10, ТЕС-142 и ТЕС-147, которые не продуцируют детектируемые уровни ТЕС в течение одного и того же периода времени (табл. 4).
- 33 021855
Таблица 4. Зависимость от времени выработки ТЕС мутантами, выращенными в присутствии 5% глюкозы и 3% целлюлозы
Выработка ТЕС (\узи/8х разведение образца)
Штамм 24 ч 48 ч 72 ч 96 ч
ЦОС 32 <1 <1 <1 <1
ЦООЗЗ <1 10 12 14
ЦОО264 <1 6 9 12
ТЕС-101 <1 <1 <1 <1
ТЕС-142 <1 <1 <1 <1
ТЕС-147 <1 <1 <1 <1
После этой сортировки для дальнейшего исследования отобрали ЭОС33 (переименованный как ТЕС-152). Сравнение выработки ТЕС в §Р-культурах, содержащих среду 2 для Та1аготусек с 5% глюкозой или без нее, показало, что дерепрессия по глюкозе составила 74% (т.е. мутант вырабатывает на 25% меньше ТЕС в присутствии глюкозы по сравнению с уровнями, вырабатываемыми в отсутствие глюкозы в §Р-культурах через 96 ч инкубации). С помощью ДСН-ПААГ подтвердили полосы специфичных для целлюлаз белков при выращивании ТЕС-152 в присутствии глюкозы.
Затем рассевали колонии ТЕС-152 штрихом на С-среде, содержащей 5% глюкозу и любой из флуоресцентных индикаторов МИС и МИС, и определяли интенсивность флуоресценции через 72 ч роста при 46°С, при этом с ТЕС-142 не детектировали флуоресценцию или детектировали незначительную флуоресценцию. Это говорит о том, что при выращивании клеток в присутствии глюкозы активности СВН и β-глюкозидазы значительно повысились, что является ожидаемой дерепрессией по глюкозе.
Подобным образом при рассеве ТЕС-152 на С-среде, содержащей 5% глюкозу и А2СЬ-ксилан, через 72 ч роста при 46°С детектировали интенсивный синий цвет, при этом с ТЕС-142 окраску не детектировали или детектировали незначительное окрашивание. Это говорит о том, что при выращивании клеток в присутствии глюкозы активность ксиланаз значительно повысилась, что ожидаемо при дерепрессии по глюкозе.
Похожий подход использовали для получения дерепрессированных по глюкозе мутантов ТЕС-147. Партии мутантов ТЕС-142, полученные с помощью комбинации ЫТС и N00, рассевали на чашках с УЫВ+-агаром, содержащим 0,1% деоксиглюкозу (106 спор на чашку). Примерно 400 ЭСг-мутантов выкалывали из агаровых чашек и переносили на скошенные агары со средой для Та1аготусек. После споруляции мутанты снова очищали на чашках с ΥNВ+-агаром, содержащим 0,1% деоксиглюкозу. После инкубации в течение 3-4 дней при 40°С колонии переносили на скошенные агары со средой для Та1аготусек. Споры с этих скошенных агаров применяли для инокуляции перемешиваемых колб со средой 2 для Та1аготусек, содержащей 5% глюкозу, и выращивали культуры при 46°С при перемешивании. Были получены несколько мутантов, которые через 72 ч вырабатывали значительные уровни ТЕС (>10 \у5и/8/ разведение образца), тогда как родительский контроль ТЕС-147 не вырабатывал значимые детектируемые уровни ТЕС (< 1 теки/8-кратное разведение образца). Для дальнейшего изучения сохранили три мутанта на основании превосходной выработки ими ТЕС в течение 120 ч при росте в §Р-исследованиях на среде для ТЕС, содержащей 5% глюкозу: ТЕС-162 (ПОС-540), ТЕС-164 (ЭОС-563) и ТЕС-165 (ЭОС-568). Из трех лучшим мутантом был ТЕС-165, вырабатывающий на 15% больше ТЕС, чем ТЕС-147, при выращивании §Р-культур в течение 96 ч в среде для ТЕС.
Затем рассевали колонии ТЕС-165 штрихом на С-среде, содержащей 5% глюкозу и любой из флуоресцентных индикаторов МИС и МИС, и определяли интенсивность флуоресценции через 24 ч роста при 46°С, при этом ни с ТЕС-142, ни с ТЕС-147 не детектировали флуоресценцию или детектировали незначительную флуоресценцию. Это говорит о том, что при выращивании клеток в присутствии глюкозы активности СВН и β-глюкозидазы значительно повысились, что является ожидаемым при дерепрессии по глюкозе.
Подобным образом при рассеве ТЕС-165 на С-среде, содержащей 2% глюкозу и А2СЬ-ксилан, через 72 ч роста при 40°С детектировали интенсивный синий цвет, при этом ни с ТЕС-142, ни с ТЕС-147 окраску не детектировали или детектировали незначительное окрашивание. Это говорит о том, что при выращивании клеток в присутствии глюкозы активность ксиланаз значительно повысилась, что является ожидаемым при дерепрессии по глюкозе.
Сравнение ТЕС-165 и ТЕС-152 указывает на то, что мутант ТЕС-165 лучше дерепрессирован по глюкозе и в среде для ТЕС, содержащей 5% глюкозу, в течение 96 ч вырабатывает >50% больше ТЕС, чем ТЕС-152, несмотря на тот факт, что ТЕС-165 был дерепрессирован по глюкозе всего лишь на 50% (т.е. мутант вырабатывал на 50% меньше ТЕС в присутствии глюкозы по сравнению с уровнями, вырабатываемыми в отсутствие глюкозы в §Р-культурах через 96 ч инкубации).
С помощью ДСН-ПААГ подтвердили выработку белковых полос, специфичных для целлюлаз, при выращивании ТЕС-165 в присутствии глюкозы. При этом белковые полосы, специфичные для целлюлаз, были более интенсивными по сравнению с полосами из ТЕС-152.
Пример 10
В данном примере описано выделение с помощью высокопроизводительного скрининга случайных мутантов Т. етегкопи ТЕС-147, вырабатывающих более высокие уровни целлюлаз на более ранних или
- 34 021855 более поздних периодах роста.
Споры ТЕС-147, обработанные УФ, ЫТС или комбинацией ЫТС и ΝΟΘ. рассевали из замороженных стоков на агаровую среду для Та1аготусек, содержащую антибиотики - пенициллин (6,7 мг/л) и стрептомицин (10 мг/л), и выращивали в течение 4 дней при 40°С. В 96-луночных титрационных микропланшетах (МТР), содержащих агаровую среду для Та1аготусек (200 мкл/лунку) с антибиотиком, вырастили в общей сложности 11000 мутантов. Эти МТР, названные мастер-планшетами, инкубируют при 40°С в течение 5 дней.
Мастер-планшеты пересевали репликой в 96-луночные полуглубокие планшеты, содержащие среду 3 для Та1аготусек (300 мкл/лунку). После инокуляции планшеты с полуглубокими лунками покрывали воздухопроницаемой пленкой, а крышку заменяли. 96-Луночные планшеты инкубировали в шейкере при 44°С и 80% влажности в течение 96 ч. После добавления 500 мкл воды/лунку культуры откручивали для удаления биомассы и 50 мкл надосадочной жидкости переносили во множество ампул для проверки целлюлазной активности с помощью анализа на пшеничной соломе.
10% Лучших мутантов (>1100 мутантов), активность целлюлазного фермента которых в ростовой среде значимо выше по сравнению с контрольной надосадочной жидкостью из ТЕС-147, отбирали для второго раунда скрининга в формате 24-луночных микротитрационных планшетов, при использовании среды 4 для Та1аготусек, как описано в примере 2. Для осуществления этого хиты из мастер-планшетов использовали для получения новых 96-луночных мастер-планшетов (200 мкл агаровой среды для Та1аготусек/лунку). Новые мастер-планшеты использовали для инокуляции 24-луночных планшетов (с воздухопроницаемым покрытием и крышкой) в двух экземплярах: один набор инкубировали в шейкере при 40°С и влажности 80% в течение 72 ч, до момента истощения глюкозы, а другой набор собирали через 144 ч в тот момент, когда уровни целлюлаз являются наиболее высокими. Сравнение выработки целлюлаз через 72 и 144 ч с контролями использовали для идентификации мутантов, которые вырабатывают целлюлозную активность раньше или позднее, чем родительский контроль (ТЕС-147). Культуры откручивали для удаления биомассы и надосадочную жидкость переносили во множество флаконов для проверки целлюлазной активности с помощью анализа на пшеничной соломе. Сохранили все 24 мутанта (группа А) с активностью ТЕС значимо более высокой, чем у ТЕС-147. Затем извлекли другие 72 мутанта (группа В), в которых выработка ТЕС через 144 ч была значимо более высокой, чем в контрольной надосадочной жидкости из ТЕС-147. Среди этих 96 мутантов 11 были одинаковыми (группа С). Оба набора мутантов затем проверяли в культурах в перемешиваемых колбах на предмет повышения выработки ТЕС.
Для осуществления этого получали скошенные агары для первичного скрининга. Споры из этих культур использовали для инокуляции культур в перемешиваемых колбах, содержащих среду 2 для Та1аготусек. Мутанты выращивали в течение 96 ч и выработку ферментов отслеживали через 24, 48, 72 и 96 ч. Целлюлазная активность (анализ на пшеничной соломе при рН 4,5, 20 ч, 8-кратно разведенные образцы) указывает на то, что один мутант, ЕУЕ750, вырабатывает на 25-50% больше ТЕС, чем родительский контроль, ТЕС-147, как показано в табл. 5. Этот мутант был из группы В.
Таблица 5. Зависимость выработки ТЕС от времени в мутантах, выращенных на 8Р-среде, содержащей среду для ТЕС в течение 120 ч
Выработка ТЕС (αυ51ι/8χ разведение образца)
Штамм 72 ч 96 ч 120 ч
ΕΥΓ.750 22 37 34
ТЕС-101 9 11 10
ТЕС-147 18 24 26
Этот мутант сохранили для дальнейшего исследования и переименовали как ТЕС-180. Индивидуальные колонии ТЕС-180 получали повторным рассевом штрихом на агаровой среде для ТЕС и проверяли выработку ТЕС для 10 колоний. Только две колонии, названные ТЕС-192 и ТЕС-193, продуцировали больше >25% ТЕС, чем родительский контрольный штамм ТЕС-147. Готовили \УСВ для ТЕС-180, ТЕС192 и ТЕС-193. Эксперименты зависимости от дозы на пшеничной соломе подтвердили, что ТЕС-192 и ТЕС-193 вырабатывают >25% целлюлазной активности, чем контрольный родительский штамм ТЕС-147.
Пример 11
В данном примере описана ферментация дерепрессированного по глюкозе мутанта, ТЕС-165 и мутантов Т. етегкопи с дальнейшим улучшением по целлюлазе, ТЕС-192 и ТЕС-193.
Вышеупомянутые мутанты проверяли в формате периодических ферментаций в ферментере с продуктивным объемом 10 л.
Мутант ТЕС-165 демонстрирует длительную лаг-фазу примерно 24-30 ч наиболее вероятно из-за относительно плохого роста в предварительной культуре. По этой причине рост этого мутанта продлили на один день и ферментацию закончили через 117 ч. Напротив, для мутантов ТЕС-192 и -193 было сложно обнаружить какой-либо лаг-период и ферментацию заканчивали после 91 ч.
В конце ферментации анализ ТХУ-биуретовая реакция выявил, что концентрация общего белка составила ~17 г/кг для ТЕС-192 и -193, при этом для ТЕС-165 она была немного выше (18,8 г/кг). Эти значения находились в том же диапазоне, что и определенные для родительского штамма ТЕС-147 (17,5 г/кг) (табл. 6).
- 35 021855
Таблица 6. Обобщенные результаты выработки целлюлаз мутантами ТЕС-165, -192, -193 и их родительского штамма ТЕС-147 при периодической ферментации Т. етегкопи в 10-л ферментере
Штамм Время (ч) Белок по ТХУ/ Биуретовой реакции (г/кг) Целлюлазная активность ВО
(РРЦ2%/мл) (Ψ3ϋ/16χ разведение образца) (\\ЪП г/мл)
ТЕС-147 95 17,4 17,3 49* 144
ТЕС-165 117 18,8 18,5 41,2 Н.О.
ТЕС-192 91 17,1 20 51,6 н.о.
ТЕС-193 91 16,9 20 50,3 н.о.
другая партия пшеничной соломы
н.о. - не определено
Результаты ЕРи-анализа показали, что все три мутанта дают больше целлюлазной активности, чем родительский штамм ТЕС-147 (измеренную как ЕРи2%/мл в конце ферментации). В течение 91 ч ТЕС192 и -193 вырабатывают одинаковую целлюлазную активность, значимо более высокую (15%), чем у ТЕС-147. Принимая во внимание более высокую целлюлазную активность и более короткий общий период времени ферментации по сравнению с родительским штаммом, влияние, оказываемое на продуктивность, оказывается еще больше (21% увеличение). При анализе единиц пшеничной соломы разница между мутантами ТЕС-192 и -193 и родительским штаммом гораздо ниже, так как в первом случае использовали новую партию пшеничной соломы, что, в целом, дает на 5-10% более низкую активность, чем значения активности на старой соломе. Для ТЕС-165 увеличение целлюлазной активности (измеренной как ЕРи2о%/мл в конце ферментации) составила 7%, что попадает в 10% диапазон погрешности ЕРианализа (табл. 6). Из-за более длительного лаг-периода, который демонстрирует мутант ТЕС-165, продуктивность его была ниже по сравнению с родительским штаммом. Активность по Vδи также была ниже, но ни каких конкретных выводов нельзя было сделать, поскольку для анализа использовали различные партии пшеничной соломы. И наконец, анализ ДСН-ПААГ всех ферментаций показал, что целлюлазная активность вырабатывается на поздних стадиях ферментации (72-117 ч), тогда как вначале образуется главным образом биомасса.
Пример 12
В данном примере описано выделение рациональным отбором с помощью 2-деоксиглюкозы мутантов Т. етегкопи ТЕС-180 и его изолятов ТЕС-192 и ТЕС-193, выработка целлюлаз которых дерегулирована по глюкозе.
Значение МС 2-деоксиглюкозы (ООО) определяли путем проверки роста после инокуляции 0,1 мл разведений 107/мл суспензии спор ТЕС-180 на чашках с УКВ+-агаром с увеличением концентраций аналогов. Результаты говорят о том, что уровень МГС для этого штамма составил 0,5 г/л.
Партии мутантов ТЕС-180, полученные с помощью комбинации ЫТО и N00, рассевали на чашках с ΥNΒ+-агаром, содержащим 0,1% деоксиглюкозу (106 спор на чашку). Примерно 100 ОО'-мутантов выкалывали из агаровых чашек и переносили на скошенные агары со средой для Та1аготусек. После споруляции мутанты очищали снова на чашках с ΥNΒ+-агаром, содержащим 0,1% деоксиглюкозу. После инкубации в течение 3-4 дней при 40°С колонии переносили на скошенные агары со средой для Та1аготусек. Споры с этих скошенных агаров применяли для инокуляции перемешиваемых колб со средой 2 для Та1аготусек, содержащей 5% глюкозу, и культуры выращивали при 44°С при перемешивании (280 об/мин). Были получено несколько мутантов, вырабатывающих значимые уровни ТЕС через 72 ч (>10 \уки/8/ разведение образца), тогда как родительский контроль ТЕС-180 не вырабатывал значимые детектируемые уровни ТЕС (< 1 \уки/8-кратное разведение образца). Для дальнейшего изучения сохранили три мутанта на основании превосходной выработки ими ТЕС в течение 72 ч роста в δΕ-исследованиях на среде для ТЕС, содержащей 5% глюкозу: ТЕС-199 (ПОО158Л), ТЕС-200 (ПОО172Л) и ТЕС-201 (ЭОО173Л). Сравнение этих мутантов с ТЕС-165 указывает на то, что после 72 ч роста в среде для ТЕС, содержащей 5% глюкозу, все они продуцируют более высокие титры ТЕС, чем ТЕС-165 (табл. 7). С помощью ДСН-ПААГ подтвердили полосы белков, специфичные для целлюлаз, при выращивании каждого мутанта в присутствии глюкозы.
Таблица 7. Зависимость от времени выработки ТЕС мутантами, выращенными в присутствии 5% глюкозы и 3% целлюлозы
Выработка ТЕС (\уыл/8х разведение образца)
Штамм 72 ч 96 ч
ТЕС-199 10 22
ТЕС-200 15 21
ТЕС-201 10 22
ТЕС-147 <1 5
ТЕС-180 <1 4
ТЕС-165 12 15
- 36 021855
После этой сортировки для дальнейшего исследования отобрали все три мутанта. Сравнение выработки ТЕС в 8Р-культурах, содержащий среду 2 для Та1аготусех с 5% глюкозой или без нее, показали, что дерепрессия по глюкозе все трех составила 50% (т.е. мутант вырабатывал на 50% меньше ТЕС в присутствии глюкозы, по сравнению с уровнями, вырабатываемыми в отсутствие глюкозы в 8Р-культурах через 96 ч инкубации). Более того, все три мутанта сохранили свой высокий уровень выработки ТЕС в среде для ТЕС (без глюкозы), вырабатывая на 25-50% больше ТЕС, чем родитель ТЕС-147. Кроме того, анализы на чашках, содержащих флуоресцентные индикаторы МИО или МИС, или цветной индикатор ΑΖΟΌ ксилан, показали, что активности СВН, β-глюкозидазы и ксиланазы дерепрессируются глюкозой.
Похожий подход использовали для получения дерепрессированных по глюкозе мутантов ТЕС-192 и ТЕС-193. Партии мутантов ТЕС-192 и ТЕС-193, полученные с помощью комбинации ЫТО и ΝΟΟ. рассевали на чашках с УЫВ+-агаром, содержащим 0,1% деоксиглюкозу (106 спор на чашку). Примерно 75 ООг-мутантов выкалывали из агаровых чашек и переносили на скошенные агары со средой для Та1аготусех. После споруляции мутанты снова очищали на чашках с УЫВ+-агаром, содержащим 0,1% деоксиглюкозу. После инкубации в течение 3-4 дней при 40°С колонии переносили на скошенные агары со средой для Та1аготусех. Споры с этих скошенных агаров применяли для инокуляции перемешиваемых колб со средой 2 для Та1аготусех, содержащей 5% глюкозу, и после чего культуры выращивали при 46°С с перемешиванием. Было получено несколько мутантов, которые вырабатывали значительные уровни ТЕС через 72 ч (>10 \ухи/8/ разведение образца), тогда как родительские контроли ТЕС-192 и ТЕС-193 не вырабатывали значимые детектируемые уровни ТЕС (< 1 \Ухи/8-кратное разведение образца). Для дальнейшего изучения сохранили четыре мутанта на основании превосходной выработки ими ТЕС в течение 120 ч роста в 8Р-исследованиях на среде для ТЕС, содержащей 5% глюкозу: ТЕС-205 (ΌΟΟ235Α), ТЕС207 (ΌΟΟ340Α), ТЕС-209 (ΌΟΟ343Α) и ТЕС-210 (ΌΟΟ344Α) (табл. 8). Сравнение выработки ТЕС в 8Ркультурах, содержащий среду 2 для Та1аготусех с 5% глюкозой или без нее, показало, что дерепрессия по глюкозе во всех трех составила 50% (т.е. мутант вырабатывал на 50% меньше ТЕС в присутствии глюкозы, по сравнению с уровнями, вырабатываемыми в отсутствие глюкозы в 8Р-культурах через 96 ч инкубации). Однако на основании этого измерения мутант ТЕС-209 (ΌΟΟ343Α) был >60% дерепрессирован по глюкозе, но уровень ТЕС был ниже, чем у другого мутанта при выращивании в Α3 50% без глюкозы. И наконец, все три мутанта сохранили свой высокий уровень выработки ТЕС в среде для ТЕС (без глюкозы), вырабатывая на 25-50% больше ТЕС, чем родитель ТЕС-147. Для дальнейшего исследования отобрали все четыре мутанта. Кроме того, анализы на чашках, содержащих флуоресцентные индикаторы МИО или МИС, или цветной индикатор ΑΖίΈ ксилан, показали, что активности СВН, βглюкозидазы и ксиланазы дерепрессируются глюкозой в этих мутантах.
Таблица 8. Зависимость от времени выработки ТЕС мутантами, выращенными в присутствии 5% глюкозы и 3% целлюлозы
Пример 13
В этом примере даны характеристики дерепрессированных по глюкозе мутантов Т. ететхопн.
ТЕС-165 демонстрирует несколько свойств, отличных от своего родителя ТЕС-147 по показателям роста и ферментной выработки. При рассеве на агаровой среде колонии ТЕС-165 были значительно меньше, чем у родительского штамма ТЕС-147, что указывает на значительно более медленный рост (фиг. 8). Это свойство медленного роста также наблюдали в культурах в перемешиваемых колбах. Подобные свойства медленного роста также наблюдали у других дерепрессированных по глюкозе штаммов ТЕС-152, ТЕС-199, ТЕС-200, ТЕС-201, ТЕС-205, ТЕС-209 и ТЕС-210.
Анализы ферментов в чашках также продемонстрировали значимое отличие дерепрессированных по глюкозе мутантов от родительских штаммов по показателю выработки фермента в присутствии глюкозы. При росте на среде для ТЕС, содержащей 2-5% глюкозы и флуоресцентные субстраты 4метилумбеллиферил-β-^-целлобиозид или 4-метилумбеллиферил-β-^-глюкозу, которые применяют для визуализации экспрессии активности СВН Ι+ΙΙ и β-глюкозидазы, соответственно, колонии ТЕС-165 дают более интенсивную флуоресценцию по сравнению с ТЕС-101 или ТЕС-147 (фиг. 9), что указывает на большую активность СВН и β-глюкозидазы в ТЕС-165 по сравнению с ТЕС-147. Похожие результаты наблюдали со всеми другими депрессированными по глюкозе мутантами.
И наконец, в дополнение к демонстрации увеличения количества ферментов, деградирующих лигноцеллюлозу, ферментативные анализы на чашках также показали значимое увеличение в ТЕС-165 количества ксиланазы, фермента, деградирующего гемицеллюлозу. При росте на среде для ТЕС, содержа- 37 021855 щей 2-5% глюкозы и цветной субстрат А2СЬ ксилан, колонии дерепрессированных по глюкозе мутантов, ТЕС-165, ТЕС-199, ТЕС-201 и ТЕС-207, дают более интенсивное синее гало, окружающее штаммы, по сравнению с ТЕС-147 или ТЕС-193 (фиг. 10), что указывает на то, что активность ксиланазы в дерепрессированных по глюкозе мутантах выше, чем в недерепрессированных глюкозой родительских штаммах. Похожие результаты наблюдали со всеми другими дерепрессированными по глюкозе мутантами.
Таким образом, в дерепрессированные по глюкозе мутанты объединены улучшенные выработки целлюлаз и гемицеллюлаз.
Выводы экспериментов с мутагенезом
УФ, ЫТС, N00 и комбинацию НТС+ΝΟΘ применили для мутагенеза штаммов из группы штаммов 142 (ТЕС-142 и ТЕС-147) и группы штаммов 180 (ТЕС-180, ТЕС-192 и ТЕС-193). Эффективность мутагенеза оценивали путем определения повышения частоты мутантов с фенотипом, легко поддающимся балльной оценке (например, устойчивость к 5-Р0А). Наиболее эффективные обработки УФ и КГС дают сравнимые значения мутационного фактора, ~100. Комбинация КГС и N00 приводит к повышенному цитолизу и дает более высокое значение мутационного фактора >100. Предварительный отбор мутантов для выработки устойчивости к 2-деоксиглюкозе (Э0С) оказался эффективным способом получения дерепрессированных по глюкозе целлюлазных мутантов. Лучшим дерепрессированным мутантом из группы штаммов 142 был ТЕС-165, который был получен после обработки NТС+N^0. В стандартной среде для перемешиваемых колб с добавлением 5% глюкозы ТЕС-165 дает около 50-60% от активности ТЕС, которую можно получить в такой же среде для перемешиваемых колб без добавления глюкозы; ТЕС-142 в присутствии глюкозы вырабатывает меньше 1%. Ферментации в 10-л масштабе подтвердили дерепрессию по глюкозе фенотипа штамма ТЕС-165. На настоящий момент лучшими дерепрессированными по глюкозе мутантами группы штаммов 180 (выработка ТЕС при периодической ферментации на 15% лучше, чем у ТЕС-147) являются ТЕС-200 и ТЕС-205. Выработка ТЕС в глюкозной среде в перемешиваемых колбах любым из этих двух штаммов была на 10-20% выше, чем у ТЕС-165. Ферментации в 10-л масштабе подтвердили дерепрессию по глюкозе фенотипов штаммов ТЕС-201, ТЕС-205, ТЕС-209 и ТЕС210.
Пример 14
В этом примере дано описание определенных протеомикой характеристик повышенных уровней специфической целлюлазы мутантов Т. етегкопи ТЕС-147, ТЕС-165, ТЕС-180 и ТЕС-192 с улучшенной выработкой целлюлаз.
ДСН-ПААГ анализ надосадочных жидкостей 10-л периодических ферментаций Эшвайлера штаммов ТЕС-147, ТЕС-165, ТЕС-180 и ТЕС-192, объединенный с идентификацией и количественным определением с помощью ЖХ/МС/МС по базе последовательностей Е8Т и полного генома (АРЕХ), подтвердил, что белковый уровень целлюлазных ферментов ТЕС был повышен. При сравнении с родительским штаммом РВС-101 были идентифицированы по меньшей мере шесть специфических целлюлаз: целлобиогидролаза I (СВН I: молекулярная масса 48690 Да), целлобиогидролаза II (СВН II: молекулярная масса 46674 Да), три эндоглюканазы (ЕС с молекулярной массой 24136 Да; ЕС/СЕА с молекулярной массой 36825 Да и ЕС/СЕВ с молекулярной массой 51462 Да) и одна β-глюкозидаза (ВС с молекулярной массой 94888 Да). Дополнительно были идентифицированы по меньшей мере две гемицеллюлазы, ксиланаза (молекулярная масса 43818 Да) и ацетилксиланэстераза (АХЕ: молекулярная масса 32538 Да) и три белка, которые, как предполагается, могут содействовать деградации лигноцеллюлозы, белок ЕС/СН61 (молекулярная масса 27007 Да), сволленин-подобный белок (молекулярная масса 67911 Да), и белок, деградирующий углеводы (молекулярная масса 22993 Да) (табл. 9).
Сравнение профиля внеклеточных белков ТЕС-101 с профилями мутантов продемонстрировало важные различия. Все мутанты вырабатывали больше СВН I и СВН II, чем контроль, как правило, происходил прирост в 2-3 раза. Только ТЕС-147 и ТЕС-192 имели значимо более высокие белковые уровни ЕС/СЕА. Не было обнаружено никакой разницы по ЕС/СЕВ, но наблюдали снижение в третьей ЕС (ЕС с молекулярной массой 24136 Да). При сравнении с контролем ТЕС-101 наблюдали переменный уровень ВС: снижение в ТЕС-147, увеличение в ТЕС-165 и отсутствие изменений в ТЕС-165 и ТЕС-192.
Что касается гемицеллюлаз, то значимое увеличение уровня ксиланазы по сравнению с ТЕС-101 наблюдали в 3 из 4 мутантов, но не в ТЕС-192. Также детектировали повышение ацетилксиланэстеразы, но значимый уровень был только в ТЕС-180. И наконец, в случае вспомогательных белков, которые помогают целлюлазам деградировать лигноцеллюлозу, три белка продемонстрировали значимо более высокие уровни в мутантах по сравнению с ТЕС-101: белок ЕС/СН61 и сволленин-подобный белок. Прирост составил 3-4 раза и >10 раз. И наконец, также было показано, что белок, деградирующий углеводы (молекулярная масса 22993 Да), значимо повышается (в 1,8 раза или больше) во всех протестированных мутантах.
- 38 021855
Таблица 9. Сравнение относительных уровней целлюлаз и других белков (АРЕХ) штаммов Та1аготусек ТЕС-101, ТЕС-147, ТЕС-165, ТЕС-180 и ТЕС-192а
Штамм
Фермент/ Белок Молл, Масс, (Дальтон) ТЕС- 101 ТЕС- 147 ТЕС- 165 ТЕС- 180 ТЕС- 192
СВН I 48690 4,340,1 8,0±0,4 8,240,2 8,641,4 9,7±0,4*
СВН II 46674 2,640,7 7341,2 7,040,7 6,240,5 6,940,8
ЕС 24136 2,740,4 1,540,7 1,040,2 0,9403 0,940,1
ЕО/СЕА 36825 1,240,2 3,040,9 3,142,5 3,041,6 3,641,1
ЕО/СЕВ 51462 1,441,0 2,140,9 2,040,3 2,040,8 2,040,7
Общий уровень ЕС (ЕО±ЕО/СЕ А4ЕС/СЕВ) 5,3 6,6 6,1 5,9 6,5
ЕС 94888 1,240,1 0,940,1 1,640,3* 1,240,3* 1,2±0,2*
Ксиланаза 43818 2,540,3 3,540,1 3,840,2* 3,540,5 3,341,5
Ацетилксиланэстераза 32538 7,9±5,9 11,143,7 10,341,1 14,742,1 9,647,3
ЕО/ОН61 27007 2,84:0,3 8,641,5 9,4*5,4 8,143,7 10,8423
Шволленин-лолобный белок 67911 0,1±0,0 1,440,4 1,4±0,5 1,240,1 1,540,4
Белок, деградирующий углеводы 22993 1,640,9 3,441,5 3,641,3 3,1413 3,240,2
Общий 1в 18 ±1 3641 3743 3441,5* 4042,1
Общий IIе 2745 5143 5144 5342,5 53±4
ЕО/ОН61/Общий уровень ЕС 0,53 1,30 1,54 1,37 1,66
Протеаза 28800 2,740,8 1,840,3 1,541,6 1,340,8 1,640,4
Хитиназа 45)11 0,940,4 0,440,2 0,240,1 0,2403 03±0,2
рри2%/мл 5,1 17,3 18,5 н,о, 20,0
а Надосадочные жидкости 96-часовых 10-л периодических ферментаций Эшвайлера подвергали ДСН-ПААГ, внеклеточные белки в них идентифицировали и количественно оценивали посредством ЖХ/МС/МС по базе данных последовательностей полного генома и ЕЗТ. Все значения выражены как процент от обнаруженных белков. Значения полужирным шрифтом указывают на то, что уровни в штаммах-потомках статистически значимо отличаются от штамма ТЕС-101 (р-значение < 0,05 по критерию Стьюдента, 2-стороннему, с неодинаковой дисперсией). Значения со звездочкой указывают на уровни, которые статистически значимо изменяются между ТЕС-147 и штаммами-потомками (р-значение < 0,05 по критерию Стьюдента, 2стороннему, с неодинаковой дисперсией). Уровни ТЕС в периодических ферментациях в виде РРи2о/о/мл показаны снизу; н.о. - не определено.
ь Сумма перечисленных целлюлаз и вспомогательных белков. с Сумма перечисленных целлюлаз, гемицеллюлаз и вспомогательных белков.
Практические все эти изменения в уровнях белков произошли при первом высокопроизводительном мутагенезе и скрининге, результатом которых является штамм ТЕС-147. Однако дальнейшее повышение избытка ксиланазы наблюдали в ТЕС-165 (10%), а дополнительное улучшение СВН I (20%) наблюдали в ТЕС-192. Также ВО, которая значимо снизилась в ТЕС-147 относительно ТЕС-101, значимо повысилась в ТЕС-165, ТЕС-180 и ТЕС-192 до уровней, обнаруженных в ТЕС-101.
В целом, прирост белкового содержания этих шести целлюлаз, двух гемицеллюлаз и трех вспомогательных белков значимо повысился с 27% в ТЕС-101 до более чем 50% в мутантах. Однако при рассмотрении всего лишь шести целлюлаз и трех вспомогательных белков было обнаружено значимое увеличение в ТЕС-192 по сравнению с ТЕС-147, что демонстрирует, что вторая компания СЗ1 привела к дальнейшему улучшению выработки целлюлаз.
Список литературы
Вгоокек, Р. 1990. ТЬе еаг1у 1йк1огу оТ !Ье Ыо1од1са1 а1ку1айпд адеЫк, 1918-1968. Ми1а1. Кек. 233: 3-14.
Стиедет, А. 1993. МЫадепеык, р. 5-45. 1п Н.-Е КеЬт, О. Кеей, А. РиЫет, апй Р. §1ай1ет (ей.), Вю1есЬпо1оду, 2пй ейШоп, уо1. 2 Оепейс Рипйатеп1а1к апй Оепейс Епдтееппд. УСН, Vе^пЬе^т, Оегтапу.
Отейц Р., М. Регедо, А. М. АЬегйт, апй А. Ο;·ι1ίζζί. 1996. ВасШик киЫШк ти18 ти1Ь орегоп: Шепййсайоп, пис1еоййе кециепсе апй тЫадепеык. М1сгоЬю1оду 142: 2021-2029.
НойисЬг, Т., Н. Макк апй М. ЗекгдисЬг. 1989. Ми1а1отк апй ййеШу оТ ^NΑ терйсайоп. Ви11. 1пк!. Ракгейт 87: 309-336.
8акак1, М. апй Υ. Китики. 2004. Апа1уык оТ кройапеоик Ьаке киЬкШийопк депепйей ш ти1а1от кйашк оТ ВасШик киЫШк. РЕМЗ М1сгоЬю1. Ьей. 234: 37-42.
8акак1, М., Υ. Υопети^а, апй Υ. Китики. 2000. Оепейс апаййк оТ ВасШик киЫШк ти1а1от депек. 1. Оеп. Патент США МкгоЬюЕ 46: 183-187.
ЗсЬаарег, К.М., апй М. Кайтап. 1989. ТЬе ехйете ти!а1ог еГГес! оТ ЕксЬейсЬга сой тиГО гекийк Тгот каЫгайоп оТ тгкта!сЬ гераи Ьу ехсеккЫе ^NΑ терйсайоп еггогк. ЕМВО 1. 8: 3511-3516.
Ушсц У.А. апй Вупд, О. 1999. Зйаш ииргоуетеп! Ьу поп-гесотЬшап! те!Ьойк, р. 103-113. 1п А.Ь. Оеташ апй ЕЕ. Эаззек (ей.), Мапиа1 оТ 1пйикйга1 МгсгоЬю1оду апй Вю1есйпо1оду, 2пй ейШоп, Атепсап

Claims (20)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Штамм Та1аготусек етегкопи, который содержит делецию или модификацию СгеА и обладает целлюлолитической активностью по меньшей мере 6 ΡΡυ^/мл, по меньшей мере 7 ΡΡυ^,/мл, по меньшей мере 8 РΡυ2ο/ο/мл, по меньшей мере 10 ΡΡυ^,/мл, по меньшей мере 12 РΡυ2ο/ο/мл, по меньшей мере 15 РΡυ2.//мл, по меньшей мере 18 РΡυ2ο/ο/мл, по меньшей мере 20 ΡΡυ^/мл и обладает активностью кислой протеазы самое большее 60 ΑΡυ/мл.
  2. 2. Штамм Та1аготусек по п.1, обладающий активностью эндоглюканазы по меньшей мере 5000 АВСЫ/мл, по меньшей мере 6000 АВСЫ/мл, по меньшей мере 7000 АВСЫ/мл, по меньшей мере 8000 АВСЫ/мл, по меньшей мере 9000 АВСЫ/мл или по меньшей мере 10000 АВСЫ/мл.
  3. 3. Штамм Та1аготусек по любому из пп.1 или 2, обладающий активностью кислой протеазы самое большее 50 ΑΡυ/мл, самое большее 40 ΑΡυ/мл или самое большее 35 ΑΡυ/мл.
  4. 4. Штамм Та1аготусек по любому из пп.1-3, который обладает споруляцией и продуцирует титр спор по меньшей мере 106/мл.
  5. 5. Штамм Та1аготусек по любому из пп.1-4, который является дерепрессированным по глюкозе.
  6. 6. Штамм Та1аготусек по любому из пп.1-5, который продуцирует ксиланазу, когда растет в присутствии глюкозы.
  7. 7. Штамм Та1аготусек по любому из пп.1-6, который является штаммом с учетным номером СВ8 124902 или штаммом с учетным номером СВ8127389 или их функционально эквивалентным мутантом.
  8. 8. Мутантный штамм Та1аготусек етегкопи, полученный мутацией штамма Та1аготусек етегкопи дикого типа, который содержит делецию или модификацию СгеА, где уровни одного или нескольких белков СВН I, СВН II, ΕΟΆΈΛ, ΕΟ/СЕВ, ксиланазы, ацетилксиланэстеразы, сволленин-подобного белка, ΕΟ/ΟΗ61 и/или белка, деградирующего углеводы, имеющего молекулярную массу около 22993 Да, увеличивается по меньшей мере в 1,5 раза или по меньшей мере в 2 раза относительно уровня белка в штамме Та1аготусек етегкопи дикого типа, и который обладает активностью кислой протеазы самое большее 60 ΛΡυ/мл.
  9. 9. Мутант по п.8, в котором СВН I имеет молекулярную массу около 48690 Да, и/или СВН II имеет молекулярную массу около 46674 Да, и/или ΕΟΆΈΛ имеет молекулярную массу около 36825 Да, и/или ΕΟ/СЕВ имеет молекулярную массу около 51462 Да, и/или ацетилксиланксилаза имеет молекулярную массу около 48690 Да, и/или сволленин-подобный белок имеет молекулярную массу около 67911 Да, и/или ΕΟ/ΟΗ61 имеет молекулярную массу около 27007 Да.
  10. 10. Мутантный штамм Та1аготусек по любому из пп.8 или 9, в котором уровень белков СВН I, СВН II, ΕΟΆΈΛ, ΕΟ/СЕВ, ксиланазы, ацетилксиланэстеразы, сволленин-подобного белка, ΕΟ/ΟΗ61 и белка, деградирующего углеводы, имеющего молекулярную массу около 22993 Да, увеличивается по меньшей мере в 1,5 раза, предпочтительно увеличивается по меньшей мере в 2 раза.
  11. 11. Мутантный штамм Та1аготусек по любому из пп.8-10, в котором уровень одного или нескольких белков из ΕΟ/ΟΗ61, сволленин-подобного белка и/или белка с неизвестной функцией (Тетег1170) увеличивается относительно штамма Та1аготусек дикого типа, предпочтительно этот уровень увеличивается по меньшей мере в 2 раза.
  12. 12. Мутантный штамм Та1аготусек по любому из пп.8-12, в котором по сравнению с штаммом Та1аготусек дикого типа уровень одного или нескольких белков эндоглюканазы ΕΟ, ксилозидазы, хитиназы и/или протеазы снижается относительно уровня белка в штамме Та1аготусек дикого типа, предпочтительно уровень белка снижается по меньшей мере в 2 раза.
  13. 13. Мутантный штамм Та1аготусек по п.14, в котором эндоглюканаза ΕΟ имеет молекулярную массу около 24136 Да, и/или ксилозидаза имеет молекулярную массу около 95022 Да, и/или хитаназа имеет молекулярную массу около 45111 Да, и/или протеаза имеет молекулярную массу около 28800 Да.
  14. 14. Мутантный штамм Та1аготусек по любому из пп.8-13, в котором соотношение уровня белка ΕΟ/ΟΗ61 к сумме уровней белков а) ΕΟ, Ь) ΕΟΆΈΛ и с) ΕΟ/СЕВ составляет по меньшей мере 0,8, предпочтительно по меньшей мере 1,0.
  15. 15. Мутантный штамм Та1аготусек по любому из пп.8-14, в котором уровни белков СВН I, СВН II, ΕΟΆΈΛ, ΕΟ/СЕВ, ксиланазы, ацетилксиланэстеразы, сволленин-подобного белка, ΕΟ/ΟΗ61 и белка, деградирующего углеводы Тетег01170, не репрессируются глюкозой.
  16. 16. Ферментная композиция, содержащая целлобиогидролазу (СВН) и эндоглюканазу (ΕΟ), где композиция содержит 40% (относительный % белка к общему белку, детектируемый с помощью ДСНПААГ) или больше СВН и 20% (относительный % белка к общему белку, детектируемый с помощью ДСН-ПААГ) или больше ΕΟ.
  17. 17. Ферментная композиция по п.16, в которой активность протеазы ферментной композиции составляет самое большее 60 ΛΡυ/мл, самое большее 50 ΛΡυ/мл, самое большее 40 ΛΡυ/мл, самое большее 35 ΛΡυ/мл.
  18. 18. Способ преобразования лигноцеллюлозного материала в полезный продукт, включающий сле- 40 021855 дующие стадии: а) предварительной обработки одного или нескольких лигноцеллюлозных материалов для получения предварительно обработанного лигноцеллюлозного материала; Ь) ферментативной обработки предварительно обработанного лигноцеллюлозного материала для получения одного или нескольких сахаров; с) преобразования сахара в один или несколько полезных продуктов и б) разделения одного или нескольких полезных продуктов, где в стадии а), Ь) или с) добавляют или применяют ферментную композицию по п.16 или 17.
  19. 19. Способ по п.18, в котором лигноцеллюлозным материалом являются садовые обрезки, чапаррель, отходы лесопильного производства, городские древесные отходы, городские отходы, отходы лесозаготовок, отходы, полученные при прореживании леса, деревянистые структуры с коротким циклом, индустриальный мусор, пшеничная солома, овсяная солома, рисовая солома, ячменная солома, ржаная солома, льняная солома, соевая шелуха, рисовая шелуха, рисовая солома, кукурузный глютеновый корм, овсяная шелуха, сахарный тростник, кукурузная солома, стебли кукурузы, стержни кукурузных початков, кукурузная шелуха, мискант, сорго сахарное, стебли канолы, стебли сои, бородач, трипсакум, лисохвост; свекловичный жом, мякоть цитрусовых плодов, семенные оболочки, целлюлозосодержащие отходы животных, настриг с лужаек, хлопок, морские водоросли, мягкая древесина, тополь, сосна, кустарники, травы, пшеница, жмых сахарного тростника, кукуруза, листовые обертки початка кукурузы, кукурузная сердцевина, волокна из сердцевин, продукты и побочные продукты помола злаков мокрым или сухим способом, твердые городские отходы, макулатура, садовые отходы, травянистый материал, сельскохозяйственные отходы, отходы лесного хозяйства, макулатура, пульпа, отходы бумажного производства, ветки, кустарники, тростники, энергетическая сельскохозяйственная культура, лесоматериал, фрукты, цветы, зерно, трава, травянистые культуры, листья, кора, иглы, бревна, корни, саженцы, кусты, просо, деревья, овощи, фруктовая кожура, виноград, жом сахарной свеклы, пшеничная крупка, овсяная шелуха, твердое или мягкое дерево, материал органических отходов, полученный в ходе сельскохозяйственного процесса, или древесные отходы лесного хозяйства или комбинация любых двух или нескольких из них.
  20. 20. Способ по п.18 или 19, в котором полезным продуктом являются этанол, бутанол, молочная кислота, пластмассы, органическая кислота, растворитель, добавка к корму для животных, лекарственное средство, витамин, аминокислота, фермент или химическое сырье.
EA201200091A 2009-07-03 2010-07-02 Штаммы talaromyces и ферментные композиции EA021855B1 (ru)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP09164516 2009-07-03
EP10160187 2010-04-16
PCT/EP2010/059483 WO2011000949A1 (en) 2009-07-03 2010-07-02 Talaromyces strains and enzyme compositions

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201200091A1 EA201200091A1 (ru) 2012-07-30
EA021855B1 true EA021855B1 (ru) 2015-09-30

Family

ID=42536393

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201200091A EA021855B1 (ru) 2009-07-03 2010-07-02 Штаммы talaromyces и ферментные композиции

Country Status (9)

Country Link
US (1) US20120114797A1 (ru)
EP (2) EP2896686A1 (ru)
CN (1) CN102712893A (ru)
AU (1) AU2010267983A1 (ru)
BR (1) BR112012000078A2 (ru)
CA (1) CA2765691A1 (ru)
EA (1) EA021855B1 (ru)
MX (1) MX2011013700A (ru)
WO (1) WO2011000949A1 (ru)

Families Citing this family (64)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MX361395B (es) 2009-10-08 2018-12-05 Dsm Ip Assets Bv Proceso para la hidrólisis enzimática de material lignocelulósico y fermentación de azúcares.
WO2012093149A2 (en) 2011-01-06 2012-07-12 Dsm Ip Assets B.V. Novel cell wall deconstruction enzymes and uses thereof
WO2012103322A1 (en) 2011-01-26 2012-08-02 Novozymes A/S Polypeptides having endoglucanase activity and polynucleotides encoding same
EP2668266B1 (en) 2011-01-26 2018-01-03 Novozymes A/S Polypeptides having cellobiohydrolase activity and polynucleotides encoding same
CN103620028B (zh) 2011-01-26 2017-05-03 诺维信公司 具有纤维二糖水解酶活性的多肽和编码该多肽的多核苷酸
BR112013019039A2 (pt) 2011-01-26 2020-07-21 Novozymes A/S Célula hospedeira microbiana transgênica, métodos para produzir um polipeptídeo, para produzir um mutante de uma célula originária, para produzir uma proteína, para degradar um material celulósico, para produzir um produto de fermentação, 5 e parafermentar um material celulósico, construção de ácido nucleico ou vetor de expressão, polipeptídeo isolado, e polinucleotídeo isolado
WO2012130964A1 (en) 2011-04-01 2012-10-04 Dsm Ip Assets B.V. Novel cell wall deconstruction enzymes of thermomyces lanuginosus and uses thereof
WO2012130950A1 (en) 2011-04-01 2012-10-04 Dsm Ip Assets B.V. Novel cell wall deconstruction enzymes of talaromyces thermophilus and uses thereof
SG10201604324WA (en) * 2011-05-31 2016-07-28 Dsm Ip Assets Bv Process To Produce A Yeast-Derived Product Comprising Reducing Sugar
EP2776561A4 (en) * 2011-11-11 2015-09-02 Novozymes Inc POLYPEPTIDES WITH XYLANASE ACTIVITY AND POLYNUCLEOTIDES THAT CODE
US8759033B2 (en) * 2012-02-09 2014-06-24 Socpra Sciences Et Genie S.E.C. CSNR-deficient actinobacteria for the production of an enzyme having chitosanase activity
WO2013182669A2 (en) 2012-06-08 2013-12-12 Dsm Ip Assets B.V. Novel cell wall deconstruction enzymes of myriococcum thermophilum and uses thereof
WO2013182670A2 (en) 2012-06-08 2013-12-12 Dsm Ip Assets B.V. Novel cell wall deconstruction enzymes of scytalidium thermophilum and uses thereof
WO2013182671A1 (en) 2012-06-08 2013-12-12 Dsm Ip Assets B.V. Cell wall deconstruction enzymes of aureobasidium pullulans and uses thereof
WO2014060378A1 (en) 2012-10-16 2014-04-24 Dsm Ip Assets B.V. Cell wall deconstruction enzymes of pseudocercosporella herpotrichoides and|uses thereof
WO2014060380A1 (en) 2012-10-16 2014-04-24 Dsm Ip Assets B.V. Cell wall deconstruction enzymes of thermoascus aurantiacus and uses thereof
WO2014072394A1 (en) 2012-11-09 2014-05-15 Dsm Ip Assets B.V. Process for enzymatic hydrolysis of lignocellulosic material and fermentation of sugars
CA2888332C (en) * 2012-11-09 2021-01-19 Dsm Ip Assets B.V. Process for enzymatic hydrolysis of lignocellulosic material and fermentation of sugars
AU2013343595B2 (en) 2012-11-09 2017-06-22 Versalis S.P.A. Process for enzymatic hydrolysis of lignocellulosic material and fermentation of sugars
EP3486325A1 (en) * 2013-01-11 2019-05-22 DSM IP Assets B.V. Process for enzymatic hydrolysis of lignocellulosic material
WO2014118360A2 (en) 2013-02-04 2014-08-07 Dsm Ip Assets B.V. Carbohydrate degrading polypeptide and uses thereof
WO2014191267A1 (en) * 2013-05-28 2014-12-04 Dsm Ip Assets B.V. Process for enzymatic hydrolysis of lignocellulosic material
WO2014202622A2 (en) 2013-06-19 2014-12-24 Dsm Ip Assets B.V. Rasamsonia gene and use thereof
WO2014202616A2 (en) 2013-06-19 2014-12-24 Dsm Ip Assets B.V. Rasamsonia gene and use thereof
WO2014202624A2 (en) 2013-06-19 2014-12-24 Dsm Ip Assets B.V. Rasamsonia gene and use thereof
WO2014202620A2 (en) 2013-06-19 2014-12-24 Dsm Ip Assets B.V. Rasamsonia gene and use thereof
WO2015004098A1 (en) 2013-07-11 2015-01-15 Dsm Ip Assets B.V. Process for enzymatic hydrolysis of lignocellulosic material and fermentation of sugars
WO2015004099A1 (en) 2013-07-11 2015-01-15 Dsm Ip Assets B.V. Process for enzymatic hydrolysis of lignocellulosic material and fermentation of sugars
BR112016002045A2 (pt) 2013-07-29 2017-08-29 Danisco Us Inc Variantes de enzimas
RU2542486C1 (ru) * 2013-09-23 2015-02-20 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук (ИЦиг СО РАН) ШТАММ БАКТЕРИИ Esherichia coli EX pQE30, ПРОДУЦЕНТ ЭНДОКСИЛАНАЗЫ БАКТЕРИИ Geobacillus stearothermophillus 22
BR112016021866A2 (pt) 2014-04-03 2018-07-03 Dsm Ip Assets B.V. processo e aparelho para hidrólise enzimática de material lignocelulósico e fermentação de açúcares
EP3137620A1 (en) 2014-04-30 2017-03-08 DSM IP Assets B.V. Process for enzymatic hydrolysis of lignocellulosic material and fermentation of sugars
CN104059904A (zh) * 2014-06-17 2014-09-24 熊鹏 筛选抗分解代谢产物阻遏效应的产纤维素酶高效突变子的方法
CN107002107A (zh) 2014-12-19 2017-08-01 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 酶促水解木质纤维素材料和发酵糖的方法
DK3242950T3 (da) 2015-01-06 2021-12-20 Dsm Ip Assets Bv Crispr-cas-system til en trådformet svampeværtscelle
WO2016169893A1 (en) 2015-04-20 2016-10-27 Dsm Ip Assets B.V. Whole fermentation broth
WO2016169892A1 (en) 2015-04-20 2016-10-27 Dsm Ip Assets B.V. Process for enzymatic hydrolysis of lignocellulosic material and fermentation of sugars
WO2016207144A1 (en) 2015-06-22 2016-12-29 Dsm Ip Assets B.V. Process for enzymatic hydrolysis of lignocellulosic material and fermentation of sugars
EP3497203A1 (en) 2016-08-11 2019-06-19 Wim De Laat Consultancy B.V. Single cell protein from thermophilic fungi
CN106566818B (zh) * 2016-10-28 2019-05-17 中国农业科学院饲料研究所 酸性嗜热多聚半乳糖醛酸酶TePG28A及其编码基因和应用
BR112019009796A2 (pt) 2016-11-24 2019-08-06 Dsm Ip Assets Bv composição de enzimas
CA3043966A1 (en) 2016-11-24 2018-05-31 Dsm Ip Assets B.V. Enzyme composition
WO2018185071A1 (en) 2017-04-03 2018-10-11 Dsm Ip Assets B.V. Process for enzymatic hydrolysis of lignocellulosic material and fermentation of sugars
DK3695001T3 (da) 2017-10-09 2024-01-29 Versalis Spa Fremgangsmåde til enzymatisk hydrolyse af lignocellulosemateriale og fermentering af sukker
CN111278986A (zh) 2017-10-30 2020-06-12 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 用于酶促水解木质纤维素材料和发酵糖的方法
WO2019086370A1 (en) 2017-10-30 2019-05-09 Dsm Ip Assets B.V. Process for enzymatic hydrolysis of lignocellulosic material and fermentation of sugars
WO2019185681A1 (en) 2018-03-28 2019-10-03 Dsm Ip Assets B.V. Enzyme composition
WO2019219804A1 (en) 2018-05-17 2019-11-21 Dsm Ip Assets B.V. Process for producing a polypeptide
ES2944736T3 (es) 2018-05-30 2023-06-23 Versalis Spa Proceso para producir azúcares a partir de materiales de carbohidratos
WO2020058248A1 (en) 2018-09-18 2020-03-26 Dsm Ip Assets B.V. Process for enzymatic hydrolysis of carbohydrate material and fermentation of sugars
WO2020058249A1 (en) 2018-09-18 2020-03-26 Dsm Ip Assets B.V. Process for enzymatic hydrolysis of carbohydrate material and fermentation of sugars
WO2020058253A1 (en) 2018-09-18 2020-03-26 Dsm Ip Assets B.V. Process for enzymatic hydrolysis of carbohydrate material and fermentation of sugars
WO2020083951A1 (en) 2018-10-24 2020-04-30 Dsm Ip Assets B.V. Process for enzymatic hydrolysis of carbohydrate material and fermentation of sugars
BR112021017167A2 (pt) 2019-03-12 2021-11-09 Dsm Ip Assets Bv Processo para a produção de um caldo de fermentação
CN110184196B (zh) * 2019-05-09 2023-04-21 慕恩（广州）生物科技有限公司 一种篮状菌及其应用
BR112022002942A2 (pt) 2019-09-10 2022-05-10 Dsm Ip Assets Bv Composição enzimática
BR112022017768A2 (pt) 2020-03-06 2022-11-29 The Protein Brewery B V Pasteurização de biomassa microbiana adequada para aplicações alimentares
US20230139404A1 (en) 2020-03-06 2023-05-04 The Protein Brewery B.V. Improved single-cell protein production using antioxidants
CN111593034B (zh) * 2020-06-24 2022-07-05 江南大学 利用β-1,6-葡聚糖酶制备低聚龙胆糖的方法及其应用
WO2022214459A1 (en) 2021-04-06 2022-10-13 Dsm Ip Assets B.V. Enzyme composition
CN117178060A (zh) 2021-04-06 2023-12-05 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 酶组合物
CA3214435A1 (en) 2021-04-06 2022-10-13 Dsm Ip Assets B.V. Enzyme composition
AU2022253636A1 (en) 2021-04-08 2023-06-01 Versalis S.P.A. Process for the preparation of a sugar product and a fermentation product
CN115340964B (zh) * 2022-06-26 2024-05-14 上海龙殷生物科技有限公司 一种具有膨胀素活性的芽孢菌属菌株及其应用

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0970236B1 (en) 1997-02-20 2006-05-24 DSM IP Assets B.V. Fermentative production of valuable compounds on an industrial scale using chemically defined media
NZ548444A (en) * 2004-01-30 2010-09-30 Mixis France Sa Generation of recombinant genes in saccharomyces cerevisiae
IES20060090A2 (en) * 2006-02-10 2007-06-13 Nat Univ Ireland Talaromyces emersonii enzyme systems
MX2011001535A (es) 2008-08-11 2011-03-28 Dsm Ip Assets Bv Degradacion de material lignocelulosico.

Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BHAT M.K. "Cellulases and related enzymes in biotechnology". BIOTECHNOLOGY ADVANCES, ELSEVIER PUBLISHING, BARKING, GB, vol. 18, no. 5, 1 August 2000 (2000-08-01), pages 355-383, XP004211815, ISSN: 0734-9750, table 1 *
MCHALE A. ET AL. "The cellulolytic system of Talaromyces emersonii - Purification and characterization of the extracellular and intracellular beta-glucosidases". BBA ENZYMOLOGY, ELSEVIER, AMSTERDAM, NL, vol. 662, no. 1, 3 November 1981 (1981-11-13), pages 152-159, XP023514655, ISSN: 0005-2744 [retrieved on 1981-11-13] *
MOLONEY A.P. ET AL. "Isolation of mutants of Talaromyces emersonii CBS 814.70 with enhanced cellulase activity". ENZYME AND MICROBIAL TECHNOLOGY, STONEHAM, MA, US, vol. 5, no. 4, 1 January 1983 (1983-01-01), pages 260-264, XP002398223, ISSN: 0141-0229, page 260, column 2, paragraphs ISOLATION, OF, MUTANTS - page 261, column 1 *
MORRISON J. ET AL. "Cellulase production by Talaromyces emersonii CBS 814.70 and a mutant UV7 during growth on cellulose, lactose and glucose containing media". ENZYME AND MICROBIAL TECHNOLOGY, STONEHAM, MA, US, vol. 9, no. 7, 1 July 1987 (1987-07-01), pages 422-425, XP023689275, ISSN: 0141-0229 [retrieved on 1987-07-01], table 1 *
TRACEY C. MCCARTHY ET AL. "Comparison of wild-type and UV-mutant [beta]-glucanase-producing strains of Talaromyces emersonii with potential in brewing applications". JOURNAL OF INDUSTRIAL MICROBIOLOGY & BIOTECHNOLOGY; OFFICIAL JOURNAL OF THE SOCIETY FOR INDUSTRIAL MICROBIOLOGY, SPRINGER, BERLIN, DE, vol. 32, no. 4, 1 April 2005 (2005-04-01), pages 125-134, XP019357720, ISSN: 1476-5535, page 128; figure 1; table 1 *
TUOHY M.G. ET AL. "PRODUCTION OF THERMOSTABLE XYLAN-DEGRADING ENZYMES BY TALAROMYCES-EMERSONII". BIORESOURCE TECHNOLOGY, ELSEVIER, GB, vol. 39, no. 2, 1 January 1992 (1992-01-01), pages 131-138, XP002330765, ISSN: 0960-8524, page 133, column 2; table 1 *
ZHOU JIN ET AL. "Optimization of cellulase mixture for efficient hydrolysis of steam-exploded corn stover by statistically designed experiments". BIORESOURCE TECHNOLOGY, vol. 100, no. 2, January 2009 (2009-01), pages 819-825, XP002596453, ISSN: 0960-8524, page 824 *

Also Published As

Publication number Publication date
US20120114797A1 (en) 2012-05-10
CA2765691A1 (en) 2011-01-06
WO2011000949A1 (en) 2011-01-06
EP2449087A1 (en) 2012-05-09
CN102712893A (zh) 2012-10-03
EA201200091A1 (ru) 2012-07-30
EP2896686A1 (en) 2015-07-22
AU2010267983A1 (en) 2012-01-19
MX2011013700A (es) 2012-04-30
BR112012000078A2 (pt) 2017-03-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA021855B1 (ru) Штаммы talaromyces и ферментные композиции
Ang et al. Production of cellulases and xylanase by Aspergillus fumigatus SK1 using untreated oil palm trunk through solid state fermentation
US7883872B2 (en) Construction of highly efficient cellulase compositions for enzymatic hydrolysis of cellulose
US8790894B2 (en) Mutant cellobiohydrolase
US8802415B2 (en) Talaromyces transformants
JP2019010107A (ja) リグノセルロース系材料の酵素加水分解および糖類発酵のための方法
CN106460020A (zh) 酶促水解木质纤维素材料和发酵糖的方法
EA028880B1 (ru) Способ ферментативного гидролиза лигноцеллюлозного материала и ферментации сахаров
JP2009525747A (ja) タラロマイセス・エマーソニイ酵素系
US20130280764A1 (en) Method of improving the activity of cellulase enzyme mixtures in the saccharification (ligno)cellulosic material
WO2012018691A2 (en) Novel fungal enzymes
WO2012021883A2 (en) Novel fungal enzymes
US10030236B2 (en) Process for the production of an enzymatic cocktail using liquid residues from a process for the biochemical conversion of lignocellulosic materials
MX2012014990A (es) Polipeptido que tiene actividad suolenina y sus usos.
Tripathi et al. Current Advancements in Recombinant Technology for Industrial Cellulases: Part-I
ANJANA ISOLATION OF CELLULASE ENZYME BY ASPERGILLUS NIGER FROM SUGARCANE BAGASSE
Gemishev et al. Biosynthesis of Cellulases and Hemicellulases Enzymes by Aspergillus Niger A-5
JP2013099335A (ja) タラロマイセス・エマーソニイ酵素系

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM RU