BR112013019039A2 - Célula hospedeira microbiana transgênica, métodos para produzir um polipeptídeo, para produzir um mutante de uma célula originária, para produzir uma proteína, para degradar um material celulósico, para produzir um produto de fermentação, 5 e parafermentar um material celulósico, construção de ácido nucleico ou vetor de expressão, polipeptídeo isolado, e polinucleotídeo isolado - Google Patents

Abstract

CÉLULA HOSPEDEIRA MICROBIANA TRANSGÊNICA, MÉTODOS PARA PRODUZIR UM POLIPEPTÍDEO, PARA PRODUZIR UM MUTANTE DE UMA CÉLULA ORIGINÁRIA, PARA PRODUZIR UMA PROTEÍNA, PARA DEGRADAR UM MATERIAL CELULÓSICO, PARA PRODUZIR UM PRODUTO DE FERMENTAÇÃO, E PARA FERMENTAR UM MATERIAL CELULÓSICO, CONSTRUÇÃO DE ÁCIDO NUCLEICO OU VETOR DE EXPRESSÃO, POLIPEPTÍDEO ISOLADO, E POLINUCLEOTÍDEO ISOLADO A presente invenção diz respeito aos polipeptídeos isolados com atividade de celobioidrolase e polinucleotídeos isolados que codificam os polipeptídeos. A invenção também diz respeito aos construtos de ácido nucleico, vetores, e células hospedeiras que compreendem os polinucleotídeos, bem como métodos de produzir e usar os polipeptídeos.

Description

“CÉLULA HOSPEDEIRA MICROBIANA TRANSGÊNICA, MÉTODOS PARA PRODUZIR UM POLIPEPTÍDEO, PARA PRODUZIR UM MUTANTE DE UMA CÉLULA ORIGINÁRIA, PARA PRODUZIR UMA PROTEÍNA, PARA DEGRADAR UM MATERIAL CELULÓSICO, PARA PRODUZIR UM PRODUTO DE FERMENTAÇÃO, E PARA FERMENTAR UM MATERIAL CELULÓSICO, CONSTRUÇÃO DE ÁCIDO NUCLEICO OU VETOR DE EXPRESSÃO, POLIPEPTÍDEO ISOLADO, E POLINUCLEOTÍDEO ISOLADO” Declaração dos Direitos Para as Invenções Realizadas em Pesquisa e Desenvolvimento Patrocinadas Pelo Governo Federal Esta invenção foi realizada em parte com o auxílio do Governo no acordo de cooperação DE-FC36-08GO18080, concedida pelo Departamento de Energia.

O Governo apresenta certos direitos nesta invenção.

Referência a Uma Listagem de Sequência Este pedido contém uma listagem de sequência na forma legível em computador, que é aqui incorporada pela referência.

Fundamentos da Invenção Campo da Invenção A presente invenção diz respeito aos polipeptídeos com atividade de celobioidrolase e polinucleotídeos que codificam os polipeptídeos.

A invenção também diz respeito aos construtos de ácido nucleico, vetores e células hospedeiras que compreendem os polinucleotídeos, bem como métodos de produzir e usar os polipeptídeos.

Descrição da Técnica Relacionada A celulose é um polímero do açúcar simples glicose ligado covalentemente por ligação do tipo beta-14. Muitos microrganismos produzem enzimas que hidrolisam beta-glicanas ligadas.

Estas enzimas incluem —endoglucanases, celobioidrolases e beta-glicosidases.

As — endoglucanases digerem o polímero de celulose em locais aleatórios, abrindo-

o para ataque por celobioidrolases. As celobioidrolases liberam sequencialmente moléculas de celobiose a partir das extremidades do polímero de celulose. A celobiose é um dímero ligado a 1,4-beta de glicose solúvel em água. As beta-glicosidases hidrolisam celobiose em glicose. Ss A conversão de matérias primas lignocelulíticas em etanol : apresenta as vantagens da disponibilidade imediata de grandes quantidades de matéria prima, a vantagem de evitar queimar ou aterrar os materiais, e a limpeza do etanol combustível. Madeira, resíduos agrícolas, culturas herbáceas e resíduos sólidos municipais são considerados matérias primas paraa produção de etanol. Estes materiais consistem principalmente em celulose, hemicelulose, e lignina. Uma vez que a lignocelulose é convertida em açúcares fermentáveis, por exemplo, glicose, os açúcares fermentáveis são facilmente fermentáveis por levedura em etanol. A presente invenção fornece polipeptídeos com atividade de —celobioidrolase e polinucleotídeos que codificam os polipeptídeos.

O polipeptídeo GH7 de 7. byssochlamydoides, que apresenta atividade de celobioidrolase (SEQ ID NO: 2), compartilha 87,41 % de identidade (excluindo intervalos) com a sequência deduzida de aminoácidos de uma celobioidrolase de Talaromyces emersonii (GENESEQP: AYL28232).

O polipeptídeo GH7 de T. byssochlamydoides, que apresenta atividade de celobioidrolase (SEQ ID NO: 4), compartilha 78,94 % de identidade (excluindo intervalos) com a sequência deduzida de aminoácidos de uma proteína glicosil hidrolase da família 7 de Neosartorya fischeri (SWISSPROT:AIDAP8). Sumário da Invenção A presente invenção diz respeito aos polipeptídeos isolados com atividade de celobioidrolase selecionados do grupo que consiste em: (a) um polipeptídeo que apresenta pelo menos 90 % de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2, ou um polipeptídeo que apresenta pelo menos 80 % de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 4; (b) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo que apresenta pelo menos 90 % de identidade de sequência com a sequência que : codifica o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1, ou a sequência de DNAc deste, ou um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo que apresenta pelo menos 80 % de identidade de sequência com a sequência que codifica o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 3, ou a sequência de DNAc deste; (c) um variante que compreende uma substituição, eliminação e/ou inserção de um ou mais (vários) aminoácidos do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 ou de SEQ ID NO: 4; e (d) um fragmento do polipeptídeo de (a), (b), ou (c) que apresenta atividade de celobioidrolase.

1 A presente invenção também diz respeito aos polipeptídeos isolados que compreendem um domínio catalítico selecionado do grupo que consiste em: (a) um domínio catalítico que apresenta pelo menos 90 % de identidade de sequência com o domínio catalítico de SEQ ID NO: 2, ou um — domínio catalítico que apresenta pelo menos 80 % de identidade de sequência com o domínio catalítico de SEQ ID NO: 4; (b) um domínio catalítico codificado por um polinucleotídeo que apresenta pelo menos 90 % de identidade de sequência com a sequência que codifica o domínio catalítico de SEQ ID NO: 1, ou um domínio catalítico codificado por um polinucleotídeo que apresenta pelo menos 80 % de identidade de sequência com a sequência que codifica o domínio catalítico de SEQ1ID NO: 3; (c) um variante de um domínio catalítico que compreende uma substituição, eliminação e/ou inserção de um ou mais (vários) aminoácidos do domínio catalítico de SEQ ID NO: 2 ou de SEQ ID NO: 4; e (d) um fragmento de um domínio catalítico de (a), (b), ou (c), que apresenta atividade de celobioidrolase.

A presente invenção também diz respeito a uma composição de enzima que compreende o polipeptídeo da invenção; polinucleotídeos . isolados que codificam os polipeptídeos da presente invenção; construtos de ácido nucleico, vetores de expressão recombinantes, e células hospedeiras recombinantes que compreendem os polinucleotídeos; e métodos de produzir os polipeptídeos.

A presente invenção também diz respeito aos métodos para degradar ou converter um material celulósico compreendendo: tratar o material celulósico com uma composição de enzima na presença de um polipeptídeo que apresenta atividade de celobioidrolase da presente invenção. Em um aspecto, o método compreende adicionalmente recuperar o material

15. celulósico degradado ou convertido.

A presente invenção também diz respeito aos métodos de produzir um produto de fermentação compreendendo: (a) sacarificar um material celulósico com uma composição de enzima na presença de um polipeptídeo que apresenta atividade de celobioidrolase da presente invenção; (b) fermentar o material celulósico sacarificado com um ou mais (vários) microrganismos fermentadores para sintetizar o produto de fermentação; e (c) recuperar o produto de fermentação a partir da fermentação.

A presente invenção também diz respeito aos métodos de fermentar um material celulósico compreendendo: fermentar o material — celulósico com um ou mais (vários) microrganismos fermentadores, em que o material celulósico é sacarificado com uma composição de enzima na presença de um polipeptídeo que apresenta atividade de celobioidrolase da presente invenção. Em um aspecto, a fermentação do material celulósico sintetiza um produto de fermentação. Em um outro aspecto, o método compreende adicionalmente recuperar o produto de fermentação a partir da fermentação.

Definições

Celobioidrolase: O termo “celobioidrolase” significa uma 1,4- 5 — beta-D-glicano celobioidrolase (E.C. 3.2.1.91), que catalisa a hidrólise de ligações 1,4-beta-D-glicosídicas em celulose, celo-oligossacarídeos, ou qualquer polímero contendo glicose ligada a beta-1,4, que libera celobiose a partir das extremidades reduzidas ou não reduzidas da cadeia (Teeri, 1997, Crystalline cellulose degradation: New insight into the function of —cellobiohydrolases, Trends in Biotechnology 15: 160-167; Teeri et al., 1998, Trichoderma reesei cellobiohydrolases: why so efficient on crystalline cellulose?, Biochem.

Soc.

Trans. 26: 173-178). Com propósitos da presente invenção, a atividade de celobioidrolase é determinada de acordo com os procedimentos descritos Lever et al., 1972, Anal.

Biochem. 47: 273-279; van Tilbeurgh et al., 1982, FEBS Letters, 149: 152-156; van Tilbeurgh e Claeyssens, 1985, FEBS Letters, 187: 283-288; e Tomme et al., 1988, Eur.

J.

Biochem. 170: 575-581. Na presente invenção, o método de Lever et al. pode ser empregado para avaliar a hidrólise de celulose na resíduo de milho, enquanto os métodos de van Tilbeurgh et al. e Tomme et al. podem ser usados para determinar a atividade de celobioidrolase em um derivado de dissacarídeo fluorescente, 4-metilumbeliferil-B-D-lactosídeo.

Preferivelmente a celobioidrolase da invenção é uma glicosil hidrolase da família 7 (GH7). Na presente invenção, o ensaio descrito na seção de exemplo pode ser usado para avaliar a atividade de celobioidrolase.

Os polipeptídeos da presente invenção apresentam pelo menos 20 %, por exemplo, pelo menos 40 %, pelo menos 50 %, pelo menos 60 %, pelo menos 70 %, pelo menos 80 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, e pelo menos 100 % da atividade de celobioidrolase do polipeptídeo maduro de

SEQ ID NO: 2 ou de SEQ ID NO: 4.

Enzima celulolítica ou celulase: O termo “enzima celulolítica” ou “celulase” significa uma ou mais (várias) enzimas que hidrolisam um material celulolítico. Tais enzimas incluem endoglucanase(s), celobioidrolase(s), beta-glicosidase(s) ou combinações destas. As duas í 5 — abordagens básicas para medir atividade celulolítica incluem: (1) medir a . atividade celulolítica total, e (2) medir as atividades celulolíticas individuais (endoglucanases, celobioidrolases, e beta-glicosidases) da maneira revisada em Zhang et al., Outlook for cellulase improvement: Screening and selection strategies, 2006, Biotechnology Advances 24: 452-481. A atividade —celulolítica total é medida em geral usando substratos insolúveis, incluindo filtro de papel Whatman Nel, celulose microcristalina, celulose bacteriana, celulose de alga, algodão, lignocelulose pré-tratada, etc. O ensaio de atividade celulolítica total mais comum é o ensaio de filtro de papel usando filtro de papel Whatman Nel como o substrato. O ensaio foi estabelecido pelo International Union of Pure and Applied Chemistry (IUPAC) (Ghose, 1987, Measurement of cellulase activities, Pure Appl. Chem. 59: 257-68).

Com propósitos da presente invenção, a atividade da enzima celulolítica é determinada medindo o aumento na hidrólise de um material celulolítico pela(s) enzima(s) celulolítica(s) nas condições a seguir: 1-20 mg de proteína da enzima celulolítica/g de celulose em PCS por 3-7 dias a 50ºC comparada a uma hidrólise controle sem a adição de proteína da enzima celulolítica. As condições típicas são reações de 1 mL, PCS lavado ou não lavado, 5 % de sólidos insolúveis, acetato de sódio 50 mM em pH 5, MnSO, 1 mM, 50ºC, 72 horas, análise de açúcar por coluna AMINEX& HPX-87H (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA).

Endoglucanase: O termo “endoglucanase” significa uma endo-1,4-(1,3;1,4)-beta-D-glicano 4-glicanoidrolase (E.C. 3.2.1.4), que catalisa a endo-hidrólise de ligações 1,4-beta-D-glicosídicas em celulose, derivados de celulose (tais como carboximetil celulose e hidroxietil celulose),

liquenina, ligações beta-1,4 em beta-1,3 glicanos mistos, tais como beta-D- glicanos ou xiloglicanos de cereal e outro material vegetal contendo componentes celulolíticos. A atividade de endoglucanase pode ser determinada medindo a redução na viscosidade do substrato ou o aumento na ' 5 — redução das extremidades determinado por um ensaio de redução de açúcar " (Zhang et al., 2006, Biotechnology Advances 24: 452-481). Com propósitos da presente invenção, a atividade de endoglucanase é determinada usando carboximetil celulose (CMC) como substrato de acordo com o procedimento de Ghose, 1987, Pure e Appl. Chem. 59: 257-268, em pH 5, 40ºC.

Beta-glucosidase: O termo “beta-glucosidase” significa uma beta-D-glucosídeo glucoidrolase (E.C. 3.2.1.21), que catalisa a hidrólise de resíduos de beta-D-glicose não redutores terminais com a liberação de beta-D- glicose. Com propósitos da presente invenção, a atividade de beta-glucosidase é determinada de acordo com o procedimento básico descrito por Venturi et al, 2002, Extracellular beta-D-glucosidase from Chaetomium thermophilum var. coprophilum: production, purification and some biochemical properties, J. Basic Microbiol. 42: 55-66. Uma unidade de beta-glucosidase é definida como 1,0 umol de ânion p-nitrofenolato produzido por minuto a 25ºC, pH 4,8, a partir de p-nitrofenil-beta-D-glucopiranosídeo 1 mM como substrato em citrato de sódio 50 mM contendo TWEENQG 20 0,01 %.

Polipeptídeo com melhor atividade celulolítica: O termo “polipeptídeo com melhor atividade celulolítica” significa um polipeptídeo GH61 que catalisa a melhoria da hidrólise de um material celulósico por enzima que apresenta atividade celulolítica. Com propósitos da presente invenção, melhor atividade celulolítica é determinada medindo o aumento na redução de açúcares ou o aumento do total de celobiose e glicose a partir da hidrólise de um material celulolítico por enzima celulolítica nas condições a seguir: 1-50 mg de proteína total/g de celulose em PCS, em que proteína total é compreendida de 50-99,5 % p/p de proteína as enzima celulolítica e 0.5-50

% p/p de proteína de um polipeptideo GH61 com melhor atividade celulolítica por 1-7 dias a 50ºC, comparada a uma hidrólise controle com igual carregamento total proteico sem melhor atividade celulolítica (1-50 mg de proteína celulolítica/g de celulose em PCS). Em um aspecto preferido, uma : 5 mistura de CELLUCLASTO 1,5L (Novozymes A/S, Bagsvaerd, Dinamarca) - na presença de 2-3 % de peso proteico total de beta-glicosidase de Aspergillus oryzae (produzida de maneira recombinante em Aspergillus oryzae, de acordo com WO 02/095014) ou 2-3 % de peso proteico total de beta-glicosidase de Aspergillus fumigatus (produzida de maneira recombinante em Aspergillus —oryzae, da maneira descrita em WO 2002/095014) de carregamento de proteína celulase é usada como a fonte da atividade celulolítica.

Os polipeptídeos GH61 com melhor atividade celulolítica melhoram a hidrólise de um material celulolítico catalisado por enzima com atividade celulolítica, reduzindo a quantidade de enzima celulolítica exigida para atingiro mesmo grau de hidrólise, preferivelmente pelo menos 1,01 vez, mais preferivelmente pelo menos 1,05 vez, mais preferivelmente pelo menos 1,10 vez, mais preferivelmente pelo menos 1,25 vez, mais preferivelmente pelo menos 1,5 vez, mais preferivelmente pelo menos 2 vezes, mais preferivelmente pelo menos 3 vezes, mais preferivelmente pelo menos 4 vezes, mais preferivelmente pelo menos 5 vezes, ainda mais preferivelmente pelo menos 10 vezes, e acima de tudo preferivelmente pelo menos 20 vezes.

Família 7 ou família 61 de glicosídeo hidrolase: O termo “família GH7”, ou “GH7”, ou “família 7 de glicosídeo hidrolase”, ou “família GH61”, ou “GH61”, ou “família 61 de glicosídeo hidrolase”, significa um — polipeptídeo que pertence à família 7 ou família 61 de glicosídeo hidrolase, respectivamente, de acordo com Henrissat, 1991, A classification of glycosyl hydrolases based on amino-acid sequence similarities, Biochem. J. 280: 309- 316, e Henrissat e Bairoch, 1996, Updating the sequence-based classification of glycosyl hydrolases, Biochem. J. 316: 695-696.

Enzima hemicelulolítica ou hemicelulase: O termo “enzima hemicelulolítica” ou “hemicelulase” significa uma ou mais (várias) enzimas que hidrolisam um material hemicelulósico.

Ver, por exemplo, Shallom e Shoham, 2003, Microbial hemicellulases.

Current Opinion in Microbiology À 5 6(3):219-228). As hemicelulases são componentes chave na degradação da . biomassa de planta.

Os exemplos de hemicelulases incluem, mas sem limitação, uma acetilmanana esterase, uma acetixilano esterase, uma arabinanase, uma arabinofuranosidase, uma ácido coumárico esterase, uma : feruloil esterase, uma galactosidase, uma glucuronidase, uma glicuronoil —esterase, uma mananase, uma manosidase, uma xilanase e uma xilosidase.

O substratos destas enzimas, as hemiceluloses, são um grupo heterogêneo de polissacarídeos ramificados e lineares que são ligados por meio de ligações de hidrogênio às microfibrilas de celulose na parede celular vegetal, reticulando- as em uma rede grande.

As hemiceluloses também são covalentemente anexadas à lignina, formando junto com a celulose uma estrutura altamente complexa.

A estrutura variável e organização de hemiceluloses exige a ação combinada de muitas enzimas para sua completa degradação.

Os módulos catalíticos de hemicelulases são tanto glicosídeo hidrolases (GHs), que hidrolisam ligações glicosídicas, quanto carboidrato esterases (CEs), que —hidrolisam ligações éster de grupos laterais de acetato ou ácido ferúlico.

Estes módulos catalíticos, com base na homologia de sua sequência primária, : — podem ser determinados nas famílias GH e CE marcadas por números.

Algumas famílias, com dobramentos similares completes, podem ser agrupadas adicionalmente em clãs, marcadas alfabeticamente (por exemplo, —GH-A). Uma classificação mais informativa e atualizada destas e outras enzimas ativas em carboidrato está disponível na base de dados Carbohydrate- Active Enzymes (CAZy). As atividades hemicelulolíticas da enzima podem ser medidas de acordo com Ghose e Bisaria, 1987, Pure & Appl.

Chem. 59:

1739-1752.

Atividade que degrada xilano ou atividade xilanolítica: O termo “atividade que degrada xilano” ou “atividade xilanolítica” significa uma atividade biológica que hidrolisa material contendo xilano. As duas abordagens básicas para medir atividade xilanolítica incluem: (1) medir a i 5 atividade xilanolítica total, e (2) medir as atividades xilanolíticas individuais - (endoxilanases, beta-xilosidases, arabinofuranosidases, alfa-glucuronidases, acetilxilano esterases, feruloil esterases, e alfa-glicuronil esterases). Recentes progressos nos ensaios de enzimas xilanolíticas foram sumarizados em por exemplo, várias publicações, incluindo Biely e Puchard, Recent progress in 10 the assays of xylanolytic enzymes, 2006, Journal of the Science of Food and Agriculture 86(11): 1636-1647; Spanikova e Biely, 2006, Glicuronoyl esterase - Novel carbohydrate esterase produced by Schizophyllum commune, FEBS Letters 580(19): 4597-4601; Herrmann et al., 1997, The beta-D- xylosidase of Trichoderma reesei is a multifunctional beta-D-xilan 15º xylohydrolase, Biochemical Journal 321: 375-381.

A atividade total que degrada xilano pode ser medida determinando a redução de açúcares formada a partir de vários tipos de xilano incluindo, por exemplo, xilanos de espelta de aveia, madeira de faia e madeira de lariço, ou por determinação fotométrica de fragmentos de xilano corado liberados de vários xilanos covalentemente corados. O ensaio da atividade xilanolítica total mais comum baseia-se na produção de açúcares reduzidos de 4-O-metil glicuronoxilano polimérico, da maneira descrita em Bailey et al., 1992, Interlaboratory testing of methods for assay of xylanase activity, Journal of Biotechnology 23(3): 257-270. A atividade de xilanase também — pode ser determinada com 0,2 % de AZCL-arabinoxilano como substrato em TRITONGO X-100 0,01 % e tampão sulfato de sódio 200 mM pH 6 a 37ºC. Uma unidade de atividade de xilanase é definida como 1,0 umol de azurina produzido por minuto a 37ºC, pH 6, a partir de AZCL-arabinoxilano 0,2 % como substrato em tampão fosfato de sódio 200 mM pH 6.

Com propósitos da presente invenção, a atividade que degrada xilano é determinada medindo o aumento na hidrólise de xilano de vidoeiro (Sigma Chemical Co., Inc., St. Louis, MO, USA) por enzima(s) que degrada(m) xilano nas condições típicas a seguir: reações de 1 mL, 5 mg/mL d 5 de substrato (sólidos totais), 5 mg de proteína xilanolítica/g de substrato, . acetato de sódio 50 mM em pH 5, 50ºC, 24 horas, análise de açúcar usando o ensaio de hidrazida do ácido p-hidroxibenzóico (PHBAH) da maneira descrita por Lever, 1972, A new reaction for colorimetric determination of carbohydrates, Anal. Biochem 47: 273-279.

Xilanase: O termo “xilanase” significa uma 1,4-beta-D-xilan- xiloidrolase (E.C. 3.2.1.8) que catalisa a endo-hidrólise de ligações 1,4-beta- D-xilosídicas em xilanos. Com propósitos da presente invenção, a atividade de xilanase é determinada com AZCL-arabinoxilano 0,2 % como substrato em TRITON X-100 0,01% e tampão de fosfato de sódio 200 mM, pH 6 a 37ºC. Uma unidade da atividade de xilanase é definida como 1,0 umol de azurina produzida por minuto a 37ºC, pH 6, a partir de AZCL-arabinoxilano 0,2% como substrato em tampão de fosfato de sódio 200 mM, pH 6.

Beta-xilosidase: O termo “beta-xilosidase” significa uma beta-D-xilosídeo xiloidrolase (E.C. 3.2.1.37) que catalisa a exo-hidrólise de beta -—(4)-xilo-oligossacarídeos curtas para remover sucessivos resíduos de D-xilose a partir das terminações não reduzidas. Com propósitos da presente invenção, uma unidade de beta-xilosidase é definida como 1,0 umol de ânion p-nitrofenolato produzido por minuto a 40ºC, pH 5, a partir de p-nitrofenil- beta-D-xilosídeo | mM como substrato em citrato de sódio 100 mM contendo TWEENÇ&200,01%.

Acetilxilano esterase: O termo “acetilxilano esterase” significa uma carboxilesterase (EC 3.1.1.72) que catalisa a hidrólise de grupos acetila a partir de xilano polimérico, xilose acetilada, glicose acetilada, acetato de alfa-naftila e acetato de p-nitrofenila. Com propósitos da presente invenção, a atividade de acetilxilano esterase é determinada usando p- nitrofenilacetato 0,5 mM como substrato em acetato de sódio 50 mM, pH 5,0, contendo TWEENTYM 20 0,01 %. Uma unidade de acetilxilano esterase é definida como a quantidade de enzima capaz de liberar 1 umol de ânion p- i 5 — nitrofenolato por minuto em pH 5, 25ºC. . Feruloil esterase: O termo “feruloil esterase” significa uma 4- | hidróxi-3-metoxicinamoil-açúcar hidrolase (EC 3.1.1.73), que catalisa a hidrólise do grupo 4-hidróxi-3-metoxicinamoil (feruloil) a partir um açúcar esterificado, que é em geral arabinose em substratos “naturais”, para produzir ferulato (4-hidróxi-3-metoxicinamato). A feruloil esterase também é conhecida como ésteres de ácido ferúlico, hidroxicinamoil esterase, FAE-III, cinamoil éster hidrolase, FAEA, cinnÃE, FAE-LI, ou FAE-II. Com propósitos da presente invenção, a atividade da feruloil esterase é determinada usando p- nitrofenilferulato 0,5 mM como substrato em acetato de sódio 50 mM, pH 5,0.

Uma unidade de feruloil esterase é igual a quantidade de enzima capaz de liberar 1 umol de ânion p-nitrofenolato por minuto em pH 5, 25ºC.

Alfa-glucuronidase: O termo “alfa-glucuronidase” significa uma alfa-D-glucosiduronato glucuronoidrolase (EC 3.2.1.139) que catalisa a hidrólise de um alfa-D-glicuronosídeo em D-glicuronato e um álcool. Com propósitos da presente invenção, a atividade de alfa-glucuronidase é determinada de acordo com de Vries, 1998, J. Bacteriol. 180: 243-249. Uma unidade de alfa-glucuronidase é igual a quantidade de enzima capaz de liberar 1 umol de ácido glucurônico ou 4-O-metilglucurônico por minuto em pH 5, 40ºC.

Alfa-L-arabinofuranosidase: O termo “alfa-L- arabinofuranosidase” significa uma alfa-L-arabinofuranosídeo arabinofuranoidrolase (EC 3.2.1.55) que catalisa a hidrólise de resíduos de alfa-L-arabinofuranosídeo não reduzidos terminais em alfa-L-arabinosídeos. A enzima age em alfa-L-arabinofuranosídeos, alfa-L-arabinanos contendo ligações (1,3) e/ou (1,5), arabinoxilanos e arabinogalactanos. A alfa-L- arabinofuranosidase é também conhecida como arabinosidase, alfa- arabinosidase, alfa-L-arabinosidase, alfa-arabinofuranosidase, polissacarídeo de alfa-L-arabinofuranosidase, alfa-L-arabinofuranosídeo hidrolase, L- Í 5 — arabinosidase, ou alfa-L-arabinanase. Com propósitos da presente invenção, a . atividade de alfa-L-arabinofuranosidase é determinada usando 5 mg de arabinoxilano de trigo de viscosidade média (Megazyme International Ireland, Ltd., Bray, Co. Wicklow, Irlanda) por mL de acetato de sódio 100 mM, pH 5, em um volume total de 200 uL por 30 minutos a 40ºC, seguido por análise de —arabinose por cromatografia de coluna AMINEX& HPX-87H (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA).

Material celulósico: O termo “material celulolítico” significa qualquer material contendo celulose. O polissacarídeo predominante na parede celular primária da biomassa é a celulose, o segundo mais abundante é

15. ahemicelulose e o terceiro é a pectina. A parede celular secundária, produzida após a célula parar de crescer, também contém polissacarídeos e é reforçada por lignina polimérica covalentemente reticulada em hemicelulose. A celulose é um homopolímero de anidrocelobiose e, assim, um beta-(1-4)-D-glicano linear, enquanto as hemiceluloses incluem uma variedade de compostos, tais como xilanos, xiloglicanos, arabinoxilanos e mananas em estruturas ramificadas complexas com um espectro de substituintes. Embora em geral polimórfica, a celulose é encontrada no tecido vegetal principalmente como uma matriz cristalina insolúvel de cadeias paralelas de glicano. As hemiceluloses em geral ligam hidrogênio à celulose, bem como a outras — hemiceluloses, o que ajuda a estabilizar a matriz da parede celular.

A celulose é encontrada em geral, por exemplo, nos caules, folhas, sépalas, cascas e sabugos de plantas ou folhas, ramos e madeira de árvores. O material celulolítico pode ser, mas sem limitação, material herbáceo, resíduo agrícola, resíduo florestal, resíduo sólido municipal, resíduo de papel, e resíduo de polpa e papel moído (ver, por exemplo, Wiselogel et al., 1995, em Handbook on Bioethanol (Charles E. Wyman, editor), pp.105- 118, Taylor & Francis, Washington D.C.; Wyman, 1994, Bioresource Technology 50: 3-16; Lynd, 1990, Applied Biochemistry and Biotechnology : 3 24/25: 695-719; Mosier et al., 1999, Recent Progress in Bioconversion of . Lignocellulosics, em Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, T. Scheper, managing editor, Volume 65, pp.23-40, Springer-Verlag, Nova Iorque). Entende-se aqui que a celulose pode estar na forma de lignocelulose, um material de parede celular de planta contendo lignina, celulose e —hemicelulose em uma matriz mista. Em um aspecto preferido, o material celulolítico é lignocelulose, que compreende celulose, hemicelulose e lignina.

Em um aspecto, o material celulolítico é material herbáceo.

' Em um outro aspecto, o material celulolítico é resíduo agrícola. Em um outro aspecto, o material celulolítico é resíduo florestal. Em um outro aspecto, o material celulolítico é resíduo sólido municipal. Em um outro aspecto, o material celulolítico é resíduo de papel. Em um outro aspecto, o material celulolítico é resíduo de polpa e papel moído.

Em um outro aspecto, o material celulolítico é resíduo de milho. Em um outro aspecto, o material celulolítico é fibra de milho. Em um — outro aspecto, o material celulolítico é espiga de milho. Em um outro aspecto, o material celulolítico é casca de laranja. Em um outro aspecto, o material celulolítico é palha de arroz. Em um outro aspecto, o material celulolítico é palha de trigo. Em um outro aspecto, o material celulolítico é painço amarelo. Em um outro aspecto, o material celulolítico é Miscanthus. Em um outro — aspecto, o material celulolítico é bagaço.

Em um outro aspecto, o material celulolítico é celulose microcristalina. Em um outro aspecto, o material celulolítico é celulose bacteriana. Em um outro aspecto, o material celulolítico é celulose de alga. Em um outro aspecto, o material celulolítico é línter de algodão. Em um outro aspecto, o material celulolítico é celulose amorfa tratada com ácido fosfórico. Em um outro aspecto, o material celulolítico é papel de filtro.

O material celulolítico pode ser usado como é, ou pode ser submetido a pré-tratamento, usando métodos convencionais conhecidos na À 5 técnica, da maneira descrita aqui. Em um aspecto preferido, o material . celulolítico é pré-tratado.

Resíduo de milho pré-tratado: O termo “PCS” ou “resíduo de milho pré-tratado” significa um material celulolítico derivado de resíduo de milho por tratamento com calor e ácido sulfúrico diluído. * Condições de severidade muito baixa: O termo “condições de severidade muito baixa” significa sondas de pelo menos 100 nucleotídeos em comprimento, pré-hibridização e hibridização a 42ºC em SSPE 5X, SDS a 0,3 %, 200 microgramas/mL de DNA desnaturado e cisalhado de esperma de salmão, e formamida a 25 %, seguindo procedimentos padrões de Southern Dblottingpor 12 a 24 horas. O material carreador é finalmente lavado três vezes cada por 15 minutos usando SSC 2X, SDS a 0,2 % a 45ºC.

Condições de severidade baixa: O termo “condições de severidade baixa” significa sondas de pelo menos 100 nucleotídeos em comprimento, pré-hibridização e hibridização a 42ºC em SSPE 5X, SDS a 0,3 %, 200 microgramas/mL de DNA desnaturado e cisalhado de esperma de salmão, e formamida a 25 %, seguindo procedimentos padrões de Southern blotting por 12 a 24 horas. O material carreador é finalmente lavado três vezes cada, por 15 minutos, usando SSC 2X, SDS a 0,2 % a 50ºC.

Condições de severidade média: O termo “condições de — severidade média” significa sondas de pelo menos 100 nucleotídeos em comprimento, pré-hibridização e hibridização a 42ºC em SSPE 5X, SDS a 0,3 %, 200 microgramas/mL de DNA desnaturado e cisalhado de esperma de salmão, e 35 % formamida, seguindo procedimentos padrões de Southern blotting por 12 a 24 horas. O material carreador é finalmente lavado três vezes cada por 15 minutos usando SSC 2X, SDS a 0,2 % a 55ºC.

Condições de severidade média-alta: O termo “condições de severidade média-alta” significa sondas de pelo menos 100 nucleotídeos em comprimento, pré-hibridização e hibridização a 42ºC em SSPE 5X, SDS a 0,3 . 5 —%, 200 microgramas/ml de DNA desnaturado e cisalhado de esperma de - salmão, e 35 % formamida, seguindo procedimentos padrões de Southern blotting por 12 a 24 horas. O material carreador é finalmente lavado três vezes cada por 15 minutos usando SSC 2X, SDS a 0,2 % a 60ºC.

Condições de severidade alta: O termo “condições de severidade alta” significa sondas de pelo menos 100 nucleotídeos em comprimento, pré-hibridização e hibridização a 42ºC em SSPE 5X, SDS a 0,3 %, 200 microgramas/mL de DNA desnaturado e cisalhado de esperma de salmão, e formamida a 50 %, seguindo procedimentos padrões de Southern blotting por 12 a 24 horas. O material carreador é finalmente lavado três vezes cada por 15 minutos usando SSC 2X, SDS a 0,2 % a 65ºC.

Condições de severidade muito alta: O termo “condições de severidade muito alta” significa sondas de pelo menos 100 nucleotídeos em comprimento, pré-hibridização e hibridização a 42ºC em SSPE 5X, SDS a 0,3 %, 200 microgramas/mL de DNA desnaturado e cisalhado de esperma de salmão, e formamida a 50 %, seguindo procedimentos padrões de Southern blotting por 12 a 24 horas. O material carreador é finalmente lavado três vezes cada por 15 minutos usando SSC 2X, SDS a 0,2 % a 70ºC.

Isolado: O termo “isolado” significa uma substância em uma forma ou ambiente que não ocorre na natureza. Exemplos não limitantes de — substâncias isoladas incluem (1) qualquer substância de ocorrência não natural, (2) qualquer substância incluindo, mas sem limitação, qualquer enzima, variante, ácido nucleico, proteína, peptídeo ou cofator que é pelo menos parcialmente removido de um ou mais, ou todos, os constituintes de ocorrência natural com os quais está associado na natureza; (3) qualquer substância modificada por manipulação humana relacionada àquela substância encontrada na natureza; ou (4) qualquer substância modificada pelo aumento da quantidade da substância relacionada a outros componentes com os quais está naturalmente associada (por exemplo, cópias múltiplas de í 5 um gene que codifica a substância; uso de um promotor mais forte que o . promotor naturalmente associado ao gene que codifica a substância). Uma substância isolada pode estar presente em uma amostra de caldo de fermentação.

Polipeptídeo maduro: O termo “polipeptídeo maduro” significa um polipeptídeo em sua forma final após a tradução, e qualquer das modificações pós-translacional, tais como processamento N-terminal, truncação C-terminal, glicosilação, fosforilação, etc. Em um aspecto, o polipeptídeo maduro apresenta os aminoácidos 19 a 455 de SEQ ID NO: 2, com base no programa SignalP (Nielsen et al., 1997, Protein Engineering 10: 1-6) que prevê que os aminoácidos 1 a 18 de SEQ ID NO: 2 são um peptídeo sinal. É conhecido na técnica que uma célula hospedeira pode produzir uma mistura de dois ou mais polipeptídeo maduros diferentes (isto é, com um aminoácido C-terminal e/ou N-terminal diferente) expressos pelo mesmo polinucleotídeo. Em um outro aspecto, o polipeptídeo maduro apresenta os aminoácidos 26 a 537 de SEQ ID NO: 4, com base no programa SignalP (Nielsen et al., 1997, Protein Engineering 10: 1-6), que prevê que os aminoácidos 1 a 25 de SEQ ID NO: 4 são um peptídeo sinal. É conhecido na técnica que uma célula hospedeira pode produzir uma mistura de dois ou mais polipeptídeo maduros diferentes (isto é, com um aminoácido C-terminal e/ou —N-terminal diferente) expressos pelo mesmo polinucleotídeo. Sequência que codifica polipeptídeo maduro: O termo “sequência que codifica polipeptídeo maduro” significa um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo maduro que apresenta atividade de celobioidrolase. Em um aspecto, a sequência que codifica o polipeptídeo maduro apresenta os nucleotídeos 55 a 603, 668 a 1235, 1311 a 1507 de SEQ ID NO: 1 com base no programa SignalP (Nielsen et al., 1997, supra), que prevê que os nucleotídeos 1 a 54 de SEQ ID NO: 1 codificam um peptídeo sinal.

Em um outro aspecto, a sequência que codifica o polipeptídeo maduro apresenta os nucleotídeos 76 a 1614 de SEQ ID NO: 3 com base no programa - SignalP (Nielsen et al., 1997, supra), que prevê que os nucleotídeos 1 a 75 de SEQ ID NO: 3 codificam um peptídeo sinal.

Domínio catalítico: O termo “domínio catalítico” significa a porção de uma enzima contendo a maquinaria catalítica da enzima.

Domínio de ligação à celulose: O termo “domínio de ligação à celulose” significa a porção de uma enzima que medeia a ligação da enzima em regiões amorfas de um substrato de celulose.

O domínio de ligação à celulose (CBD) é encontrado na extremidade N-terminal quanto na C- terminal de uma enzima.

Um CBD também é referido como um módulo de ligação à celulose ou CBM.

Em uma modalidade, o CBM apresenta os aminoácidos 502 a 537 de SEQ ID NO: 4. O CBM é separado do domínio catalítico por uma sequência ligadora.

O ligador apresenta, em uma modalidade, os aminoácidos 452 a 495 de SEQ ID NO: 4. Identidade de sequência: A relação entre duas sequências de aminoácidos ou entre duas sequências de nucleotídeos é descrita pelo parâmetro “identidade de sequência”. Com propósitos da presente invenção, o grau de identidade de sequência entre as duas sequências de aminoácidos é determinado usando o algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman e Wunsch, 1970, J.

Mol.

Biol. 48: 443-453) da maneira implementada no programa Needle do pacote EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277), preferivelmente a versão 5,0.0 ou superior.

Os parâmetros opcionais usados são penalidade de abertura de intervalo de 10, penalidade de extensão de intervalo de 0,5, e a matriz de substituição EBLOSUM62 (EMBOSS versão de BLOSUMO62). O rendimento da “maior identidade” marcado em Needle (obtido usando a opção não resumida) é usado como a identidade percentual e é calculado da maneira a seguir: h (Resíduos idênticos x 100)/(Tamanho do alinhamento — Número . total de intervalos em alinhamento)

Ss Com propósitos da presente invenção, o grau de identidade de sequência entre duas sequências de desoxirribonucleotídeos é determinado usando o algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman e Wunsch, 1970, supra), da maneira implementada no programa Needle do pacote EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al, 2000, supra), preferivelmente a versão 5,0.0 ou superior.

Os parâmetros opcionais usados são penalidade de abertura de intervalo de 10, penalidade de extensão de intervalo de 0,5, e a matriz de substituição EDNAFULL (EMBOSS versão de NCBI NUCA4.4). O rendimento da “maior identidade” marcada por Needle (obtido usando a opção não resumida) é usado como a identidade percentual e é calculado da maneira a seguir:

(Desoxirribonucleotídeos — idênticos =x 100)/(Tamanho do alinhamento — Número total de intervalos em alinhamento) Fragmento: O termo “fragmento” significa um polipeptídeo que apresenta um ou mais (vários) aminoácidos eliminados da terminação amino e/ou carboxil de um polipeptídeo maduro; em que o fragmento apresenta atividade de celobioidrolase.

Em um aspecto, um fragmento contém pelo menos 390 resíduos de aminoácido, por exemplo, pelo menos 410 resíduos de aminoácido ou pelo menos 430 resíduos de aminoácido.

Subsequência: O termo “subsequência” significa um polinucleotídeo que apresenta um ou mais (vários) nucleotídeos eliminados da extremidade 5' e/ou 3' de uma sequência que codifica o polipeptídeo maduro;

em que a subsequência codifica um fragmento que apresenta atividade de celobioidrolase. Em um aspecto, uma subsequência contém pelo menos 1170 nucleotídeos, por exemplo, pelo menos 1230 nucleotídeos ou pelo menos 1290 nucleotídeos. Variante alélico: O termo “variante alélico” significa — qualquer de duas ou mais formas alternativas de um gene que ocupa o mesmo - locus cromossômico. A variação alélica aumenta naturalmente por meio de mutação, e pode resultar em polimorfismo nas populações. As mutações de gene podem ser silenciosas (nenhuma mudança no polipeptídeo codificado) ou podem codificar polipeptídeos com sequências alteradas de aminoácidos.

Um variante alélico de um polipeptídeo é um polipeptídeo codificado por um variante alélico de um gene.

Sequência codificante: O termo “sequência codificante” significa um polinucleotídeo, que especifica diretamente a sequência de aminoácidos de um polipeptídeo. As extremidades da sequência codificante são em geral determinadas por um quadro aberto de leitura, que em geral começa com o códon inicial ATG ou códons iniciais alternativos, tais como GTG e TTG, e termina com um códon de parada, tais como TAA, TAG e TGA. A sequência codificante pode ser um DNA, DNArc, sintética, ou polinucleotídeo recombinante.

DNAc: O termo “DNAc” significa uma molécula de DNA que pode ser preparada por transcrição reversa de uma molécula RNAm madura, unida obtida de uma célula eucariótica. O DNAc precisa de sequências intron que podem estar presentes no DNA genômico correspondente. O transcrito de RNA inicial e primário é um precursor para o RNAm que é processado por meio de uma série de etapas, incluindo união, antes de aparecer como RNAm unido maduro.

Construto de ácido nucleico: O termo “construto de ácido nucleico” significa uma molécula de ácido nucleico, tanto de fita simples quanto de fita dupla, que é isolada de um gene de ocorrência natural ou é modificada para conter segmentos de ácidos nucleicos de uma maneira que não pode existir de outra forma na natureza ou que é sintética. O termo construto de ácido nucleico é sinônimo do termo “cassete de expressão” quando o construto de ácido nucleico contém as sequências controle exigidas ' 5 — paraaexpressão de uma sequência codificante da presente invenção.

- Sequências controle: O termo “sequências controle” significa todos os componentes necessários para a expressão de um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo da presente invenção. Cada sequência controle pode ser natural ou estrangeira ao polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo ou natural ou estrangeira uma a outra. Tais sequências controle incluem, mas sem limitação, uma sequência líder, sequência de poliadenilação, sequência de pro-peptídeo, promotor, sequência de peptídeo sinal e finalizador de transcrição. No mínimo, as sequências controle incluem um promotor e sinais de parada trasncricionais e translacionais. As sequências controle podem ser fornecidas com ligadores com o propósito de introduzir sítios de restrição específicos que facilitam a ligação das sequências controle com a região codificante do polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo.

Operavelmente ligado: O termo “operavelmente ligado” significa uma configuração na qual uma sequência controle é colocada em uma posição adequada com relação à sequência codificante de um polinucleotídeo, de maneira tal que a sequência controle direcione a expressão da sequência codificante.

Expressão: O termo “expressão” inclui qualquer etapa envolvida na produção do polipeptídeo incluindo, mas sem limitação, transcrição, modificação pós-transcricional, tradução, modificação pós- translacionais e secreção.

Vetor de expressão: O termo “vetor de expressão” significa uma molécula de DNA linear ou circular que compreende um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo, e é operavelmente ligada a nucleotídeos adicionais que fornecem sua expressão.

Célula hospedeira: O termo “célula hospedeira” significa qualquer tipo de célula que é susceptível à transformação, transfecção, transdução, e similares a um construto de ácido nucleico ou vetor de :; 5 — expressão que compreende um polinucleotídeo da presente invenção. O termo - “célula hospedeira” inclui qualquer progênie de uma célula mãe que não é idêntica à célula mãe em virtude das mutações que ocorrem durante a replicação.

Variante: O termo “variante” significa um polipeptídeo com atividade de celobioidrolase que compreende uma alteração, isto é, uma substituição, inserção, e/ou deleção de um ou mais (vários) resíduos de aminoácido em uma ou mais (várias) posições. Uma substituição significa uma alteração de um aminoácido que ocupa uma posição com um aminoácido diferente; uma deleção significa remoção de um aminoácido que ocupa uma — posição; e uma inserção significa adicionar um ou mais (vários) aminoácidos, por exemplo, 1-5 aminoácidos, adjacentes a um aminoácido que ocupa uma posição.

Descrição Detalhada da Invenção Polipeptídeos com atividade de celobioidrolase A presente invenção diz respeito aos polipeptídeos isolados com atividade de celobioidrolase selecionados do grupo que consiste em: (a) um polipeptídeo que apresenta pelo menos 90 % de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2, ou um polipeptídeo que apresenta pelo menos 80 % de identidade de sequência com —opolipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 4; (b) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo que apresenta pelo menos 90 % de identidade de sequência com a sequência que codifica o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1, ou a sequência de DNAc deste, ou um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo que apresenta pelo menos 80 % de identidade de sequência com a sequência que codifica o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 3 ou a sequência de DNAc deste; : (c) um variante que compreende uma substituição, eliminação €/ou inserção de um ou mais (vários) aminoácidos do polipeptídeo maduro de “5 SEQIDNO:2 oude SEQID NO: 4; e . (d) um fragmento do polipeptídeo de (a), (b), ou (c) que apresenta atividade de celobioidrolase.

A presente invenção diz respeito aos polipeptídeos isolados com uma identidade de sequência com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2depelomenos 90 %, por exemplo pelo menos 92 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 %, ou 100 %, que apresentam atividade de celobioidrolase. Em um aspecto, os polipeptídeos diferem em não mais que dez aminoácidos, por exemplo, em cinco aminoácidos, em quatro aminoácidos, em três aminoácidos, em dois aminoácidos, e em um aminoácido a partir do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2.

Um polipeptídeo da presente invenção preferivelmente compreende ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 ou um variante alélico deste; ou é um fragmento deste que apresenta atividade de — celobioidrolase. Em um outro aspecto, o polipeptídeo compreende ou consiste no polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2. Em um outro aspecto preferido, o polipeptídeo compreende ou consiste em aminoácidos 19 a 469 de SEQ ID NO: 2.

A presente invenção diz respeito aos polipeptídeos isolados —comuma identidade de sequência com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 4 de pelo menos 80 %, por exemplo pelo menos 85 %, pelo menos 87 %, pelo menos 90 %, pelo menos 92 %, pelo menos 95 %, por exemplo, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 %, ou 100 %, que apresentam atividade de celobioidrolase. Em um aspecto, os polipeptídeos diferem em não mais que dez aminoácidos, por exemplo, em cinco aminoácidos, em quatro aminoácidos, em três aminoácidos, em dois à aminoácidos, e em um aminoácido a partir do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 4. í 5 Um polipeptídeo da presente invenção preferivelmente - compreende ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 ou um variante alélico deste; ou é um fragmento deste que apresenta atividade de celobioidrolase. Em um outro aspecto, o polipeptídeo compreende ou consiste no polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 4. Em um outro aspecto preferido, o —polipeptídeo compreende ou consiste em aminoácidos 26 a 537 de SEQ ID NO: 4. Em um outro aspecto o polipeptídeo compreende ou consiste em aminoácidos 26 a 465 de SEQ ID NO: 4. Este fragmento compreende o domínio catalítico.

A presente invenção também diz respeito aos polipeptídeos isolados com atividade de celobioidrolase que são codificados por polinucleotídeos que hibridizam em condições de severidade muito baixa, condições de severidade baixa, condições de severidade média, condições de severidade média-alta, condições de severidade alta, ou condições de severidade muito alta em (i) a sequência que codifica o polipeptídeo maduro de SEQID NO: 1, (ii) a sequência de DNAc contida na sequência que codifica o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1, ou (iii) a fita complementar de tamanho total de (1) ou (ii) (J. Sambrook, E.F. Fritsch, e T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2º edição, Cold Spring Harbor, Nova Iorque).

A presente invenção também diz respeito aos polipeptídeos isolados com atividade de celobioidrolase que são codificados por polinucleotídeos que hibridizam em condições de severidade muito baixa, condições de severidade baixa, condições de severidade média, condições de severidade média-alta, condições de severidade alta, ou condições de severidade muito alta em (i) a sequência que codifica o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 3, (li) a sequência de DNA genômico de SEQ ID NO: 3, ou . (ii) a fita complementar de tamanho total de (1) ou (ii) (J. Sambrook, E.F. Fritsch, e T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2º : 5 — edição, Cold Spring Harbor, Nova Iorque).

- O polinucleotídeo de SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 3ou uma subsequência deste, bem como a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4 ou um fragmento desta, pode ser usado para determinar sondas de ácido nucleico para identificar e clonar DNA que codifica —polipeptídeos com atividade de celobioidrolase a partir de cepas de diferentes gêneros ou espécies, de acordo com métodos bem conhecidos na técnica. Em particular, tais sondas podem ser usadas para hibridização com o DNA genômico ou DNAc do gênero ou espécie de interesse, seguindo procedimentos padrões de Southern, a fim de identificar e isolar o gene correspondente neste. Tais sondas podem ser consideravelmente menores que a sequência completa, mas podem ter pelo menos 14, por exemplo, pelo menos 25, pelo menos 35, ou pelo menos 70 nucleotídeos em tamanho. Preferivelmente, a sonda de ácido nucleico tem pelo menos 100 nucleotídeos em tamanho, por exemplo, pelo menos 200 nucleotídeos, pelo menos 300 — nucleotídeos, pelo menos 400 nucleotídeos, pelo menos 500 nucleotídeos, pelo menos 600 nucleotídeos, pelo menos 700 nucleotídeos, pelo menos 800 nucleotídeos, ou pelo menos 900 nucleotídeos em tamanho. Tanto as sondas de DNA quanto de RNA podem ser usadas. As sondas são tipicamente marcadas para detectar o gene correspondente (por exemplo, com **P, *H, **S, — biotinaou avidina). Tais sondas são incluídas na presente invenção.

Uma biblioteca de DNA genômico ou DNAc preparada a partir de tais outras cepas pode ser selecionada para o DNA que hibridiza com as sondas descritas anteriormente e codifica um polipeptídeo com atividade de celobioidrolase. O DNA genômico ou outro, a partir de tais outras cepas, pode ser separado por eletroforese em gel de agarose ou poliacrilamida, ou outras técnicas de separação. O DNA das bibliotecas ou o DNA separado pode ser : transferido e imobilizado em nitrocelulose ou outro material carreador adequado. A fim de identificar um clone ou DNA que é homólogo à SEQ ID : 5 —NO:1l,ou uma subsequência deste, o material carreador é preferivelmente . usado em um Southern Blot.

Com propósitos da presente invenção, a hibridização indica que o polinucleotídeo hibridiza em uma sonda de ácido nucleico marcado que corresponde a SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 3; a sequência que codifica o —polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 3; a sequência de DNAc contida na sequência que codifica o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: | ou a sequência de DNA genômico de SEQ ID NO: 3; sua fita complementar de tamanho completo; ou uma subsequência desta; em condições de severidade muito baixa a muito alta. As moléculas nas quais a sonda de ácido nucleico hibridiza nestas condições podem ser detectadas usando, por exemplo, filme de raios-X.

Em um aspecto, a sonda de ácido nucleico é a sequência que codifica o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1 ou a sequência de DNAc deste. Em um outro aspecto, a sonda de ácido nucleico apresenta os — nucleotídeos 55 a 1507 de SEQ ID NO: | ou a sequência de DNAc destes. Em um outro aspecto, a sonda de ácido nucleico é um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo de SEQ ID NO: 2 ou o polipeptídeo maduro desta; ou um fragmento deste. Em um outro aspecto preferido, a sonda de ácido nucleico é SEQ ID NO: 1 ou a sequência de DNAc deste.

Em um aspecto, a sonda de ácido nucleico é a sequência que codifica o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 3 ou a sequência de DNA genômico deste. Em um outro aspecto, a sonda de ácido nucleico apresenta os nucleotídeos 76 a 1614 de SEQ ID NO: 3 ou a sequência genômica deste. Em um outro aspecto, a sonda de ácido nucleico é um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo de SEQ ID NO: 4 ou o polipeptídeo maduro desta; ou um fragmento deste. Em um outro aspecto preferido, a sonda de ácido E nucleico é SEQ ID NO: 3 ou a sequência genômica desta. Para sondas longas de pelo menos 100 nucleotídeos em . 5 tamanho, as condições de severidade muito baixa a muito elevada são . definidas como pré-hibridização e hibridização a 42ºC em SSPE 5X, SDS 0,3 %, 200 microgramas/mL de DNA cisalhado e desnaturado de esperma de salmão, e tanto formamida a 25 % para severidades muito baixas e baixas, formamida a 35 % para severidades médias a médias-altas, quanto formamida a 50% para severidades elevadas e muito elevadas, seguindo procedimentos padrões de Southern blotting por 12 a 24 horas, de maneira ideal. O material carreador é finalmente lavado três vezes cada por 15 minutos usando SSC 2X, SDS 0,2 % a 45ºC (severidade muito baixa), a 50ºC (severidade baixa), a 55ºC (severidade média), a 60ºC (severidade média-alta), a 65ºC (severidade alta)ea70ºC (severidade muito elevada).

Para sondas curtas de cerca de 15 nucleotídeos a cerca de 70 nucleotídeos em tamanho, as condições de severidade são definidas como pré- hibridização e hibridização em cerca de 5ºC a cerca de 10ºC abaixo da T,, calculada usando o cálculo de acordo com Bolton e McCarthy (1962, Proc.

Natl. Acad. Sci USA 48:1390) em NaCl 0,9 M, Tris-HCI 0,09 M, pH 7,6, EDTA 6 mM, NP-40 0,5 %, solução de Denhardt 1X, pirofosfato de sódio 1 mM, fosfato monobásico de sódio 1 mM, ATP 0,1 mM, e 0,2 mg de RNA de levedura por mL, seguindo os procedimentos padrões de Southern blotting por 12 a 24 horas de maneira ideal. O material carreador é finalmente lavado uma vezemSCC 6X esSDS 0,1% por 15 minutos e duas vezes cada por 15 minutos usando SSC 6X a 5ºC a 10ºC abaixo da T, calculada.

A presente invenção também diz respeito aos polipeptídeos isolados com atividade de celobioidrolase, codificados por polinucleotídeos que apresentam uma identidade de sequência com a sequência que codifica o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1, ou a sequência de DNAc deste, de pelo menos 90 %, por exemplo pelo menos 92 %, pelo menos 95 %, . pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 %, ou 100 %. E S A presente invenção também diz respeito aos polipeptídeos - isolados com atividade de celobioidrolase codificada por polinucleotídeos com uma identidade de sequência com a sequência que codifica o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 3, ou a sequência genômica deste, de pelo menos 80 %, por exemplo pelo menos 85 %, pelo menos 87 %, pelo menos 90 %, pelo menos 92 %, pelo menos 95 %, por exemplo, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 %, ou 100 %. A presente invenção também diz respeito aos variantes que compreendem uma substituição, deleção, e/ou inserção de um ou mais (ou vários) aminoácidos do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 ou de SEQ ID NO:4,ouas sequências homólogas deste.

Preferivelmente, as alterações de * aminoácido são de uma natureza inferior, isto é, substituições ou inserções conservativas de aminoácido que não afetam significativamente o dobramento e/ou atividade da proteína; pequenas deleções, tipicamente de um a cerca de 30 aminoácidos; pequenas extensões amino ou carboxil-terminais, tal como um resíduo de metionina amino-terminal; um pequeno peptídeo ligador de até cerca de 20-25 resíduos; ou uma pequena extensão que facilita a purificação mudando a carga líquida ou uma outra função, tal como uma região de poli- histidina, um epítopo antigênico ou um domínio de ligação.

Exemplos de substituições conservativas estão no grupo de — aminoácidos básicos (arginina, lisina e histidina), aminoácidos acídicos (ácido glutâmico e ácido aspártico), aminoácidos polares (glutamina e asparagina), aminoácidos hidrofóbicos (leucina, isoleucina e valina), aminoácidos aromáticos (fenilalanina, triptofano e tirosina) e aminoácidos pequenos (glicina, alanina, serina, treonina e metionina). As substituições de aminoácido que não alteram, em geral, a atividade específica são conhecidas na técnica e são descritas, por exemplo, por H. Neurath e R.L. Hill, 1979, em : The Proteins, Academic Press, Nova Iorque. As mudanças que ocorrem mais comumente são Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, é 5 Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, . Leu/Val, Ala/Glu, e Asp/Gly.

Alternativamente, as mudanças de aminoácidos são de uma natureza tal que as propriedades fisico-químicas dos polipeptídeos são alteradas. Por exemplo, as mudanças de aminoácido podem melhorar a estabilidade térmica do polipeptídeo, alteram a especificidade do substrato, mudam o pH ideal e similares.

Os aminoácidos essenciais em um polipeptídeo pai podem ser identificados de acordo com procedimentos conhecidos na técnica, tal como mutagênese sítio direcionada ou mutagênese de varredura de alanina (Cunningham e Wells, 1989, Science 244: 1081-1085). Na última técnica, as x mutações de alanina simples são introduzidas e cada resíduo na molécula, e as moléculas mutantes resultantes são testadas com relação à atividade de celobioidrolase para identificar resíduos de aminoácido que são importantes para a atividade da molécula. Ver também, Hilton et al., 1996, J. Biol. Chem.

271:4699-4708.O sítio ativo da enzima ou outra interação biológica também pode ser determinada por análise física da estrutura, da maneira determinada por tais técnica como ressonância magnética nuclear, cristalografia, difração de elétron, ou marcação de foto afinidade, junto com mutação de aminoácidos de sítio de contato suposto. Ver, por exemplo, de Vos et al., 1992, Science 255: 306-312; Smith et al., 1992, J. Mol. Biol. 224: 899-904; Wlodaver et al., 1992, FEBS Lett. 309: 59-64. As identidades dos aminoácidos essenciais também podem ser inferidas a partir da análise de identidades com polipeptídeos que estão relacionados com o polipeptídeo pai.

As substituições, deleções, e/ou inserções de aminoácido simples ou únicas podem ser realizadas e testadas usando métodos conhecidos de mutagênese, recombinação, e/ou embaralhamento, seguido por um & procedimento de seleção relevante, tais como aqueles revelados por Reidhaar- Olson e Sauer, 1988, Science 241: 53-57; Bowie e Sauer, 1989, Proc. Natl. SS Acad Sci USA 86: 2152-2156; WO 95/17413; ou WO 95/22625. Outros . métodos que podem ser usados incluem PCR propensa ao erro, exibição de fago (por exemplo, Lowman et al., 1991, Biochemistry 30: 10832-10837; patente U.S. 5.223.409; WO 92/06204), e mutagênese região-direcionada (Derbyshire et al., 1986, Gene 46: 145; Ner et al., 1988, DNA 7: 127).

Os métodos de mutagênese/embaralhamento podem ser combinados com métodos de seleção automatizados de alto rendimento para detectar a atividade dos polipeptídeos clonados e mutagenizados expressos por células hospedeiras (Ness et al., 1999, Nature Biotechnology 17: 893- 896). As moléculas de DNA mutagenizado que codificam polipeptídeos ativos podem ser recuperadas a partir das células hospedeiras e rapidamente . sequenciadas usando métodos padrões na técnica. Estes métodos permitem a : rápida determinação da importância de resíduos individuais de aminoácido em um polipeptídeo.

O número total de substituições, eliminações e/ou inserções de aminoácido do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4 são, em uma modalidade, não mais que 10, por exemplo, 1, 2, 3,4,5,6,7,8 ou9.

O polipeptídeo pode ser polipeptídeo híbrido, no qual uma porção de um polipeptídeo é fundida na terminação N ou na terminação C de uma porção de um outro polipeptídeo.

O polipeptídeo pode ser um polipeptídeo fundido, ou polipeptídeo de fusão clivável, em que um outro polipeptídeo é fundido na terminação N ou na terminação C do polipeptídeo da presente invenção. Um polipeptídeo fundido é produzido fundindo um polinucleotídeo que codifica um outro polipeptídeo a um polinucleotídeo da presente invenção. As técnicas para produzir polipeptídeos de fusão são conhecidas na tecnologia, e incluem ligar as sequências codificantes que codificam os polipeptídeos, de maneira : tal que eles estejam em alinhamento e que a expressão do polipeptídeo fundido esteja no controle do(s) mesmo(s) promotor(s) e finalizador(s). As . 5 proteínas de fusão também podem ser construídas usando tecnologia de . inteína na qual as fusões são criadas pós-translacionalmente (Cooper et al., 1993, EMBO J. 12: 2575-2583; Dawson et al., 1994, Science 266: 776-779). Um polipeptídeo de fusão podem compreender adicionalmente um sítio de clivagem entre os dois polipeptídeos.

Mediante a secreção da proteína de fusão, o sítio é clivado liberando os dois polipeptídeos.

Exemplos de sítios de clivagem incluem, mas sem limitação, o sítios revelados em Martin et al., 2003, J.

Ind.

Microbiol.

Biotechnol. 3: 568-576; Svetina et al., 2000, J.

Biotechnol. 76: 245-251; Rasmussen-Wilson et al., 1997, Appl.

Environ.

Microbiol. 63: 3488-3493; Ward et al., 1995, Biotechnology 13: 498-503; e Contreras et al., 1991, Biotechnology 9: 378-381; Eaton et al., . 1986, Biochemistry 25: 505-512; Collins-Racie et al., 1995, Biotechnology 13: 982-987; Carter et al., 1989, Proteins: Structure, Function, e Genetics 6: 240-248; e Stevens, 2003, Drug Discovery World 4: 35-48. Fontes de polipeptídeos com atividade de celobioidrolase Um polipeptídeo com atividade de celobioidrolase da presente invenção pode ser obtido de microrganismos de qualquer gênero.

Com propósitos da presente invenção, o termo “obtido de”, da maneira aqui usada junto com uma dada fonte, pode significar que o polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo é produzido pela fonte ou por uma cepa na qual o — polinucleotídeo da fonte foi inserido.

Em um aspecto, o polipeptídeo obtido de uma dada fonte é secretado extracelularmente.

O polipeptídeo pode ser um polipeptídeo de Talaromyces.

Em um outro aspecto, o polipeptídeo é um polipeptídeo de Talaromyces byssochlamydoides.

Em um outro aspecto, o polipeptídeo é um polipeptídeo de Talaromyces byssochlamydoides CBS413.71. Será entendido que, para as espécies anteriormente : mencionadas, a invenção inclui tanto os estágios perfeitos quanto os imperfeitos, e outros equilvalentes taxonômicos, por exemplo, anamorfos, sem levarem consideração o nome da espécie pelo qual são conhecidas.

Os . versados na técnica reconhecerão facilmente a identidade dos equivalentes adequados.

As cepas destas espécies são facilmente acessíveis ao público em inúmeras coleções de cultura, tais como o American Type Culture Collection (ATCC), Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS), e Agricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center (NRRL). O polipeptídeo pode ser identificado e obtido de outras fontes, incluindo microrganismos isolados da natureza (por exemplo, soli, * compostos, água, etc.), usando as sondas anteriormente mencionadas.

As ; técnicas para isolar microrganismos de habitats naturais são bem conhecidas na tecnologia.

O polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo pode então ser obtido selecionando similarmente uma biblioteca de DNA genômico ou —DNAc de um outro microrganismo ou amostra mista de DNA.

Uma vez que um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo foi detectado com a(s) sonda(s), o polinucleotídeo pode ser isolado ou clonado utilizando técnicas que são bem conhecidas pelos versados na técnica (ver, por exemplo, Sambrook et al., 1989, supra). Domínios catalíticos A presente invenção também diz respeito aos polipeptídeos isolados que compreendem um domínio catalítico selecionado do grupo que consiste em: (a) um domínio catalítico que apresenta pelo menos 90 % de identidade de sequência com o domínio catalítico de SEQ ID NO: 2, ou um domínio catalítico que apresenta pelo menos 80 % de identidade de sequência : com o domínio catalítico de SEQ ID NO: 4; (b) um domínio catalítico codificado por um polinucleotídeo à: 5 — que apresenta pelo menos 90 % de identidade de sequência com a sequência * que codifica o domínio catalítico de SEQ ID NO: 1, ou um domínio catalítico codificado por um polinucleotídeo que apresenta pelo menos 80 % de identidade de sequência com a sequência que codifica o domínio catalítico de SEQ ID NO: 3; 10 (c) um variante de um domínio catalítico que compreende uma substituição, eliminação e/ou inserção de um ou mais (vários) aminoácidos do domínio catalítico de SEQ ID NO: 2 ou de SEQ ID NO: 4; e (d) um fragmento de um domínio catalítico de (a), (b), ou (c), que apresenta atividade de celobioidrolase. 15 O domínio catalítico apresenta preferivelmente um grau de r identidade de sequência com o domínio catalítico de SEQ ID NO: 2 de pelo menos 90 %, por exemplo pelo menos 92 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 %, ou 100 %. Em um aspecto, o domínio catalítico compreende uma sequência de aminoácidos que difereem dez aminoácidos, por exemplo, em cinco aminoácidos, em quatro aminoácidos, em três aminoácidos, em dois aminoácidos, e em um aminoácido a partir do domínio catalítico de SEQ ID NO: 2. O domínio catalítico preferivelmente compreende ou consiste no domínio catalítico de SEQ ID NO: 2 ou um variante alélico deste; ou é um fragmento deste que apresenta atividade de celobioidrolase.

Em um outro aspecto, o domínio catalítico compreende ou consiste no domínio catalítico de SEQ ID NO: 2. Em um outro aspecto preferido, o domínio catalítico compreende ou consiste em aminoácidos 19 a 455 de SEQ ID NO: 2. O domínio catalítico apresenta preferivelmente um grau de identidade de sequência com o domínio catalítico de SEQ ID NO: 4 de pelo menos 80 %, por exemplo pelo menos 85 %, pelo menos 87 %, pelo menos 90 L %, pelo menos 92 %, pelo menos 95 %, por exemplo, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 % ou 100 %. Em um aspecto, E 5 o domínio catalítico compreende uma sequência de aminoácidos que difere . em dez aminoácidos, por exemplo, em cinco aminoácidos, em quatro aminoácidos, em três aminoácidos, em dois aminoácidos, e em um aminoácido a partir do domínio catalítico de SEQ ID NO: 4. O domínio catalítico preferivelmente compreende ou consiste —nodomínio catalítico de SEQ ID NO: 4 ou um variante alélico deste; ou é um fragmento deste que apresenta atividade de celobioidrolase.

Em um outro aspecto, o domínio catalítico compreende ou consiste no domínio catalítico de SEQ ID NO: 4. Em um outro aspecto preferido, o domínio catalítico compreende ou consiste em aminoácidos 26 a 465 de SEQ ID NO: 4. Em um modalidade, o domínio catalítico pode ser codificado k por um polinucleotídeo que hibridiza em condições de severidade muito baixa, condições de severidade baixa, condições de severidade média, condições de severidade média-alta, condições de severidade alta, e condições de severidade muito alta (da maneira definida anteriormente) em (1) a — sequência que codifica o domínio catalítico de SEQ ID NO: 1, (ii) a sequência de DNAc contida na sequência que codifica o domínio catalítico de SEQ ID NO: 1, ou (iii) a fita complementar de tamanho total de (1) ou (ii) (J.

Sambrook et al., 1989, supra). O domínio catalítico pode ser codificado por um — polinucleotídeo que apresenta um grau de identidade de sequência com a sequência que codifica o domínio catalítico de SEQ ID NO: 1 de pelo menos 90 %, por exemplo pelo menos 92 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 %, ou 100 %, o qual codifica um polipeptídeo que apresenta atividade de celobioidrolase.

Em um aspecto, o polinucleotídeo que codifica o domínio catalítico compreende ou consiste em nucleotídeos 55 a 1507 de SEQ ID NO: : 1 ou a sequência de DNAc deste. Em particular, o polinucleotídeo que codifica o domínio catalítico compreende ou consiste em nucleotídeos 55 a fica 603, 668 a 1235, 1311 a 1507 de SEQID NO: 1.

' Em uma outra modalidade, o domínio catalítico pode ser codificado por um polinucleotídeo que hibridiza em condições de severidade muito baixa, condições de severidade baixa, condições de severidade média, condições de severidade média-alta, condições de severidade alta, e condições de severidade muito alta (da maneira definida anteriormente) com (1) a sequência que codifica o domínio catalítico de SEQ ID NO: 3, (11) a sequência de DNA genômico de SEQ ID NO: 3, ou (iii) a fita complementar de tamanho total de (1) ou (ii) (J. Sambrook er al., 1989, supra).

O domínio catalítico pode ser codificado por um —polinucleotídeo que apresenta um grau de identidade de sequência com a É sequência que codifica o domínio catalítico de SEQ ID NO: 3 de pelo menos 80 %, por exemplo pelo menos 85 %, pelo menos 87 %, pelo menos 90 %, pelo menos 92 %, pelo menos 95 %, por exemplo, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 %, ou 100 %, que codifica um — polipeptídeo que apresenta atividade de celobioidrolase.

Em um aspecto, o polinucleotídeo que codifica o domínio catalítico compreende ou consiste nos nucleotídeos 76 a 1395 de SEQ ID NO: 3 ou a sequência de DNAc destes.

Polinucleotídeos A presente invenção também diz respeito aos polinucleotídeos isolados que codificam um polipeptídeo da presente invenção.

As técnicas usadas para isolar ou clonar um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo são conhecidas na tecnologia e incluem o isolamento do DNA genômico, preparação do DNAc, ou uma combinação destes. A clonagem dos polinucleotídeos a partir de tal DNA genômico pode ser realizada, por exemplo, usando a bem conhecida reação em cadeia da E polimerase (PCR) ou seleção de anticorpo de bibliotecas de expressão para detectar fragmentos de DNA clonado com características estruturas S 5 compartilhadas. Ver, por exemplo, Innis er al., 1990, PCR: A Guide to “ Methods and Application, Academic Press, Nova Torque. Outros procedimentos de amplificação de ácido nucleico, tais como reação de ligação da ligase (LCR), transcrição ativada de ligação (LAT) e amplificação a base de nucleotídeos (NASBA) podem ser usados. Os polinucleotídeos podem ser — clonados a partir de uma cepa de Penicillium, ou um organismo relacionado e assim, por exemplo, pode ser um alélico ou espécie variante do polipeptídeo que codifica a região do polinucleotídeo.

A presente invenção também diz respeito aos polinucleotídeos isolados que compreendem ou que consistem em polinucleotídeos que apresentam um grau de identidade de sequência com a sequência que codifica » o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1, ou a sequência de DNAc, deste de e pelo menos 90 %, por exemplo pelo menos 92 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 %, ou 100 %, os quais codificam um polipeptídeo que apresenta atividade de celobioidrolase.

A presente invenção diz respeito adicionalmente a polinucleotídeos isolados que compreendem ou que consistem em polinucleotídeos que apresentam um grau de identidade de sequência com a sequência que codifica o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 3, ou a — sequência de DNA genômico deste, de pelo menos 80 %, por exemplo pelo menos 85 %, pelo menos 87 %, pelo menos 90 %, pelo menos 92 %, pelo menos 95 %, por exemplo, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 %, ou 100 %, que codificam um polipeptídeo que apresenta atividade de celobioidrolase.

A modificação de um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo da presente invenção pode ser necessária para a síntese de L polipeptídeos — substancialmente — similar ao polipeptídeo. “O termo “substancialmente similar” ao polipeptídeo refere-se a formas de ocorrência é 5 não natural do polipeptídeo. Estes polipeptídeos podem diferir, de alguma - maneira modificada por engenharia, do polipeptídeo isolado de sua fonte natural, por exemplo, variantes que diferem em atividade específica, termoestabilidade, pH ideal ou similares. O variante pode ser construído com base no polinucleotídeo apresentado como a sequência que codifica o —polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1, ou na sequência de DNAc deste, por exemplo, uma subsequência deste, e/ou por introdução de substituições de nucleotídeo que não resultam em uma mudança na sequência de aminoácidos do polipeptídeo, mas que correspondem ao uso do códon do organismo hospedeiro pretendido para a produção da enzima, ou por introdução de substituições de nucleotídeo que podem resultar em uma sequência de aminoácidos diferente. Para uma descrição geral de substituição de nucleotídeo, ver, por exemplo, Ford et al., 1991, Protein Expression and Purification 2: 95-107.

A presente invenção também diz respeito aos polinucleotídeos isolados que codificam polipeptídeos da presente invenção, que hibridizam em condições de severidade muito baixa, condições de severidade baixa, condições de severidade média, condições de severidade média-alta, condições de severidade alta, ou condições de severidade muito alta em (i) a sequência que codifica o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1, (ii) a — sequência de DNAc contida na sequência que codifica o polipeptídeo maduro de SEQ ID NG: 1, ou (iii) a fita complementar de tamanho total de (i) ou (ii); ou variantes alélicos e subsequências destes (Sambrook et al., 1989, supra), da maneira aqui definida. Em um aspecto, o polinucleotídeo compreende ou consiste em

SEQ ID NO: 1, a sequência que codifica o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1, ou uma subsequência de SEQ ID NO: 1 que codifica um fragmento de Ê SEQ ID NO: 2, que apresenta atividade de celobioidrolase, tal como o polinucleotídeo dos nucleotídeos 55 a 1507 de SEQ ID NO: 1, bem como as S 5 sequênciasdeDNAec deste.

* Em um outro aspecto, o polinucleotídeo compreende ou consiste na sequência que codifica o domínio catalítico de SEQ ID NO: 1, tal como o polinucleotídeo de nucleotídeos 55 a 603, 668 a 1235, 1311 a 15070f SEQ ID NC: 1.

A presente invenção também diz respeito aos polinucleotídeos isolados que codificam polipeptídeos da presente invenção, que hibridizam em condições de severidade muito baixa, condições de severidade baixa, condições de severidade média, condições de severidade média-alta, condições de severidade alta, ou condições de severidade muito alta em (1) a sequência que codifica o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 3, (ii) a 4 sequência de DNA genômico contida na sequência que codifica o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 3, ou (iii) a fita complementar de tamanho total de (1) ou (ii); ou variantes alélicos e subsequências destes (Sambrook et al., 1989, supra), da maneira aqui definida.

Em um aspecto, o polinucleotídeo compreende ou consiste em SEQ ID NO: 3, a sequência que codifica o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 3, ou uma subsequência de SEQ ID NO: 3 que codifica um fragmento de SEQ ID NO: 4 que apresenta atividade de celobioidrolase, tal como o polinucleotídeo de nucleotídeos 76 a 1614 de SEQ ID NO: 3, bem como as — sequências de DNA genômico deste.

Em um outro aspecto, o polinucleotídeo compreende ou consiste na sequência que codifica o domínio catalítico de SEQ ID NO: 3, tal como o polinucleotídeo de nucleotídeos 76 a 1395 de SEQ ID NO: 3, bem como as sequências de DNA genômico deste.

Construtos de ácido nucleico A presente invenção também diz respeito aos construtos de : ácido nucleico que compreende um polinucleotídeo da presente invenção, operavelmente ligado a um ou mais (vários) sequências controle, que ; 5 — direciona a expressão da sequência codificante em uma célula hospedeira ú adequada em condições compatíveis com as sequências controle.

Um polinucleotídeo pode ser manipulado em uma variedade de maneiras para fornecer a expressão do polipeptídeo. A manipulação do polinucleotídeo antes de sua inserção em um vetor pode ser desejável ou — necessária dependendo do vetor de expressão. As técnicas para modificar polinucleotídeos que utilizam métodos de DNA recombinante são bem conhecidas na tecnologia.

A sequência controle pode ser uma sequência promotora, um polinucleotídeo que é reconhecido por uma célula hospedeira para a expressão de um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo da presente invenção. À ' sequência promotora contém sequências controle transcricionais que medeiam a expressão do polipeptídeo. O promotor pode ser qualquer polinucleotídeo que mostra a atividade transcricional na célula hospedeira de escolha, incluindo promotores mutantes, truncados e híbridos, e pode ser obtido de genes que codificam polipeptídeos extracelulares ou intracelulares tanto homólogos quanto heterólogos à célula hospedeira.

Exemplos de promotores adequados para direcionar a transcrição dos construtos de ácido nucleico da presente invenção em uma célula hospedeira bacteriana são os promotores obtidos do gene alfa-amilase de Bacillus amyloliquefaciens (amyQ), gene alfa-amilase de Bacillus licheniformis (amyL), gene penicilinase de Bacillus licheniformis (penP), gene amilase maltogênica de Bacillus stearothermophilus (amyM), gene levansucrase de Bacillus subtilis (sacB), genes xylA e xylIB de Bacillus subtilis, operon lac de E. coli, gene agarase de Streptomyces coelicolor (dagA)

e gene beta-lactamase de procarioto (Villa-Kamaroff et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 3727-3731), bem como o promotor tac (DeBoer et al., S 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 21-25). Os promotores adicionais são descritos em “Useful proteins from recombinant bacteria” em Gilbert et al., 7 Ss 1980, Scientific American, 242: 74-94; e em Sambrook et al., 1989, supra.

* Exemplos de promotores adequados para direcionar a transcrição do construtos de ácido nucleico da presente invenção em células hospedeiras de fungo filamentoso são promotores obtidos dos genes para acetamidase de Aspergillus nidulans, alfa-amilase neutra de Aspergillus niger, —alfa-amilase ácida estável de Aspergillus niger, glucoamilase de Aspergillus niger ou Aspergillus awamori (glaA), TAKA amilase de Aspergillus oryzae, protease alcalina de Aspergillus oryzae, triose fosfato isomerase de Aspergillus oryzae, protease do tipo tripsina de Fusarium oxysporum (WO 96/00787), amiloglicosidase de Fusarium venenatum (WO 00/56900), Daria de Fusarium venenatum (WO 00/56900), Quinn de Fusarium venenatum : (WO 00/56900), lipase de Rhizomucor miehei, proteinase aspártica de : Rhizomucor miehei, beta-glicosidase de Trichoderma reesei, celobioidrolase I de Trichoderma reesei, celobioidrolase Il de Trichoderma reesei, endoglucanase I de Trichoderma reesei, endoglucanase UI de Trichoderma —reesei, endoglucanase IM de Trichoderma reesei, endoglucanase IV de Trichoderma reesei, endoglucanase V de Trichoderma reesei, xilanase I de Trichoderma reesei, xilanase II de Trichoderma reesei, beta-xilosidase de Trichoderma reeseii bem como o promotor NA2-tpi (um promotor modificado a partir de um gene que codifica uma alfa-amilase neutra em —Aspergilli,no qual o líder não traduzido é substituído por um líder não traduzido de um gene que codifica triose fosfato isomerase em Aspergilli; exemplos não limitantes incluem promotores modificados a partir do gene que codifica alfa-amilase neutra em Aspergillus niger, em que o líder não traduzido é substituído por um líder não traduzido a partir do gene que codifica triose fosfato isomerase em Aspergillus nidulans ou Aspergillus oryzae); e promotores mutantes, truncados e híbridos deste. E Em uma levedura hospedeira, os promotores usados são obtidos dos genes para enolase de Saccharomyces cerevisiae (ENO-I), . 5 —galactoquinasse de Saccharomyces —cerevisiavee (GALI1I), álcool " desidrogenase/gliceraldeído-3-fosfato — desidrogenase de Saccharomyces cerevisiae (ADH1, ADH2/GAP), triose fosfato isomerase de Saccharomyces cerevisiae (TPI), metalotioneína de Saccharomyces cerevisiae (CUP1) e 3- fosfoglicerato quinase de Saccharomyces cerevisiae. Outros promotores usados para leveduras como células hospedeiras são descritos por Romanos er al., 1992, Yeast 8: 423-488.

A sequência controle também pode ser uma sequência finalizadora de transcrição adequada, que é reconhecida por uma célula hospedeira para finalizar a transcrição. A sequência finalizadora é operavelmente ligado à terminação 3º do polinucleotídeo que codifica o > polipeptídeo. Qualquer finalizador que é funcional na célula hospedeira de escolha pode ser usado na presente invenção.

Os finalizadores preferidos para células hospedeiras de fungo filamentoso são obtidos dos genes para antranilato sintase de Aspergillus — nidulans, glucoamilase de Aspergillus niger, alfa-glicosidase de Aspergillus niger, TAKA amilase de Aspergillus oryzae e protease do tipo tripsina de — Fusarium oxysporum.

Os finalizadores preferidos para levedura como células hospedeiras são obtidos dos genes para enolase de Saccharomyces cerevisiae, — citocromo C de Saccharomyces cerevisiae (CYC1) e gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase de Saccharomyces cerevisiae. Outros finalizadores usados para levedura como células hospedeiras são descritos por Romanos et al., 1992, supra.

A sequência controle também pode ser uma sequência líder adequada, quando transcrita é uma região não traduzida de um RNAm que é importante para a tradução pela célula hospedeira. A sequência líder é - operavelmente ligada à terminação 5º do polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo. Qualquer sequência líder que é funcional na célula hospedeira 7 5 — de escolha pode ser usada. ' Os líderes preferidos para as células hospedeiras de fungo filamentoso são obtidos dos genes para TAKA amilase de Aspergillus oryzae e triose fosfato isomerase de Aspergillus nidulans. Os líderes adequados para levedura como células hospedeiras são obtidos dos genes para enolase de Saccharomyces cerevisiae (ENO-I), 3-fosfoglicerato quinase de Saccharomyces cerevisiae, fator alfa de Saccharomyces cerevisiae e álcool desidrogenase/gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase de Saccharomyces cerevisiae (ADH2/GAP).

A sequência controle também pode ser uma sequência de —poliadenilação, uma sequência operavelmente ligada à terminação 3º do : polinucleotídeo e, quando transcrita, é reconhecida pela célula hospedeira como um sinal para adicionar resíduos de poliadenosina ao RNAm transcrito. Qualquer sequência de poliadenilação que é funcional na célula hospedeira de escolha pode ser usada.

As sequências de poliadenilação preferidas para as células hospedeiras de fungo filamentoso são obtidas dos genes para TAKA amilase de Aspergillus oryzae, glucoamilase de Aspergillus niger, antranilato sintase de Aspergillus nidulans, protease do tipo tripsina de Fusarium oxysporum e alfa-glicosidase de Aspergillus niger.

As sequências de poliadenilação usadas para levedura como : células hospedeiras são descritas por Guo e Sherman, 1995, Mol. Cellular Biol. 15: 5983-5990, A sequência controle também pode ser uma região que codifica um peptídeo sinal, que codifica um peptídeo sinal ligado à terminação N de um polipeptídeo, e direciona o polipeptídeo na via de secreção da célula. A extremidade 5º da sequência codificante do E polinucleotídeo pode conter intrinsecamente uma sequência de peptídeo sinal codificante naturalmente ligada no quadro aberto de leitura, com o segmente = S da sequência codificante que codifica o polipeptídeo. Alternativamente, a i extremidade 5º da sequência codificante pode conter uma sequência de peptídeo sinal codificante que é estrangeira à sequência codificante. A sequência estrangeira de peptídeo sinal codificante pode ser exigida onde a sequência codificante não contém naturalmente uma sequência de peptídeo — sinal codificante. Alternativamente, a sequência estrangeira de peptídeo sinal codificante pode simplesmente substituir a sequência natural de peptídeo sinal codificante a fim de melhorar a secreção do polipeptídeo. Entretanto, qualquer sequência de peptídeo sinal codificante que direciona o polipeptídeo expresso na via secretória de uma célula hospedeira de escolha pode ser usada. As sequências de peptídeos sinais codificantes eficientes para . células hospedeiras bacterianas são as sequências de peptídeos sinais E codificantes obtidas dos genes para NCIB 11837 amilase maltogênica de Bacillus, subtilisina de Bacillus licheniformis, beta-lactamase de Bacillus licheniformis, alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus, proteases neutras de Bacillus stearothermophilus (nprT, nprS, norM) e prsA de Bacillus subtilis. Os peptídeos sinais adicionais são descritos por Simonen e Palva, 1993, Microbiological Reviews 57: 109-137.

As sequências de peptídeos sinais codificantes eficientes para células hospedeiras de fungo filamentoso são as sequências de peptídeos — sinais codificantes obtidas dos genes para amilase neutra de Aspergillus niger, glucoamilase de Aspergillus niger, TAKA amilase de Aspergillus oryzae, celulase de Humicola insolens, endoglucanase V de Humicola insolens, lipase de Humicola lanuginosa e proteinase aspártica de Rhizomucor miehei. Os peptídeos sinais usados para levedura como células hospedeiras são obtidos dos genes para fator alfa de Saccharomyces cerevisiae e invertase de Saccharomyces cerevisiae. Outras sequências de k peptídeos sinais codificantes usadas são descritas por Romanos et al., 1992, supra. E 3 A sequência controle também pode ser uma sequência de pro- 3 peptídeo codificante que codifica um pro-peptídeo posicionado na terminação N de um polipeptídeo. O polipeptídeo resultante é conhecido como uma pro- enzima ou pro-polipeptídeo (ou um zimogênio em alguns casos). Um pro- polipeptídeo é em geral inativo e pode ser convertido em um polipeptídeo — ativo por clivagem catalítica ou autocatalítica do pro-peptídeo a partir do pro- polipeptídeo. A sequência de pro-peptídeo codificante pode ser obtida dos genes para protease alcalina de Bacillus subtilis (aprE), protease neutra de Bacillus subtilis (nprT), lacase de Myceliophthora thermophila (WO 95/33836), proteinase aspártica de Rhizomucor miehei e fator alfa de Saccharomyces cerevisiae. " Onde tanto o peptídeo sinal quanto a sequência de pro- peptídeos estão presentes na terminação N de um polipeptídeo, a sequência de pro-peptídeo está posicionada próxima à terminação N de um polipeptídeo, e a sequência de peptídeo sinal está posicionada próxima à terminação N da — sequência de pro-peptídeo.

Também pode ser desejável adicionar sequências regulatórias que permitem a regulação da expressão do polipeptídeo com relação ao crescimento da célula hospedeira. Exemplos de sistemas regulatórios são aqueles que fazem com que a expressão do gene seja ligada e desligada em resposta a um estímulo químico ou físico, incluindo a presença de um composto regulatório. Os sistemas regulatórios em sistemas procariotos incluem os sistemas operadores lac, tac e trp. Em levedura, o sistema ADH2 ou sistema GAL1 podem ser usados. Em fungos filamentosos, o promotor de glucoamilase de Aspergillus niger, promotor de TAKA alfa-amilase de

Aspergillus oryzae e promotor de glucoamilase de Aspergillus oryzae podem ser usados.

Outros exemplos de sequências regulatórias são aquelas que E permitem a amplificação de gene.

Em sistemas eucarióticos, estas sequências regulatórias incluem o gene diidrofolato redutase que é amplificado na : 5 — presença de metotrexato, e o genes de metalotioneina que são amplificados É com metais pesados.

Nestes casos, o polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo pode ser operavelmente ligado com a sequência regulatória.

Vetores de expressão A presente invenção também diz respeito aos vetores de expressão recombinantes que compreendem um polinucleotídeo da presente invenção, um promotor, e sinais de parada trasncricionais e translacionais.

Os vários nucleotídeos e sequências controle podem ser reunidos para produzir um vetor de expressão recombinante que pode incluir um ou mais (vários) sítios de restrição convenientes para permitir a inserção ou substituição do — polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo em tais sítios.

Alternativamente, o : polinucleotídeo pode ser expresso inserindo o polinucleotídeo, ou um s construto de ácido nucleico que compreende a sequência, em um vetor apropriado para a expressão.

Na criação do vetor de expressão, a sequência codificante está localizada no vetor de maneira tal que a sequência codificante seja operavelmente ligada com as sequências controle adequadas para a expressão.

O vetor de expressão recombinante pode ser qualquer vetor (por exemplo, um plasmídeo ou vírus) que pode ser convenientemente submetido aos procedimentos de DNA recombinante e pode resultar na — expressão do polinucleotídeo.

A escolha do vetor dependerá tipicamente da compatibilidade do vetor com a célula hospedeira na qual o vetor será introduzido.

O vetor pode ser, um plasmídeo linear ou circular fechado.

O vetor pode ser um vetor que se replica autonomamente, isto é, um vetor que existe como uma entidade extracromossômica, cuja a replicação é independente da replicação cromossômica, por exemplo, um plasmídeo, um elemento extracromossômico, um minicromossomo, ou um : cromossomo artificial. O vetor pode conter qualquer meio para garantir a auto-replicação. Alternativamente, o vetor pode ser um que, quando . 5 — introduzido na célula hospedeira é integrado no genoma e replicado junto com “ o(s) cromossomo(s) nos(s) qual(s) foi integrado. Além do mais, um vetor simples, ou plasmídeo, ou dois ou mais vetores ou plasmídeos que juntos contêm o DNA total a ser introduzido no genoma da célula hospedeira, ou um transposon, podem ser usados.

O vetor contém preferivelmente um ou mais (vários) marcadores selecionáveis que permitem a fácil seleção de células transformadas, transfectadas, transduzidas ou similares. Um marcador selecionável é um produto do gene que fornece resistência biocida ou viral, resistência a metais pesados, prototrofia a auxotóficos e similares.

Exemplos de marcadores selecionáveis bacterianos são os " genes dal de Bacillus subtilis ou Bacillus licheniformis, ou marcadores que . conferem resistência a antibióticos, tal como resistência à ampicilina, cloranfenicol, canamicina ou tetraciclina. Os marcadores adequados para levedura como células hospedeiras são ADE2, HIS3, LEU2, LYS2, MET3, TRPI,eURA3.Os marcadores selecionáveis para uso em células hospedeiras de fungo filamentoso incluem, mas sem limitação, amdS (acetamidase), argB (ornitina carbamoltransferase), bar (fosfinotricina acetiltransferase), hph (higromicina fosfotransferase), niaD (nitrato redutase), pyrG (orotidina-5*- fosfato decarboxilase), sC (sulfato adeniltransferase), e trpC (antranilato — sintase), bem como equivalentes destes. São preferidos para uso em uma célula de Aspergillus osd genes amaS e pyrG de Aspergillus nidulans ou Aspergillus oryzae e o gene bar de Streptomyces hygroscopicus.

O vetor contém preferivelmente um(s) elemento(s) que permite(s) a integração do vetor no genoma da célula hospedeira ou a replicação autônoma do vetor na célula independente do genoma. Para a integração no genoma da célula hospedeira, o vetor t pode depender da sequência de polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo, ou qualquer outro elemento do vetor para a integração no genoma por i. 5 — recombinação homóloga ou não homóloga. Alternativamente, o vetor pode S conter polinucleotídeos adicionais para direcionar a integração por recombinação homóloga no genoma da célula hospedeira em um(s) local(s) exato(s) no(s) cromossomo(s). Para aumentar a probabilidade de integração em um local preciso, os elementos integracionais podem conter um número suficiente de ácidos nucleicos, tais como 100 a 10.000 pares de bases, 400 a

10.000 pares de bases e 800 a 10.000 pares de bases, que apresenta um alto grau de identidade de sequência com a sequência alvo correspondente para melhorar a probabilidade de recombinação homóloga. Os elementos integracionais podem ser qualquer sequência que é homóloga á sequência alvo no genoma da célula hospedeira. Além do mais, os elementos " integracionais podem ser polinucleotídeos não codificantes ou codificantes. Por outro lado, o vetor pode ser integrado no genoma da célula hospedeira por recombinação não homóloga.

Para replicação autônoma, o vetor pode compreender — adicionalmente uma origem de replicação que possibilita o vetor a replicar autonomamente na célula hospedeira em questão. A origem de replicação pode ser qualquer plasmídeo replicador que medeia a replicação autônoma que funciona em uma célula. O termo “origem de replicação” ou “plasmídeo replicador” significa um polinucleotídeo que possibilita que um plasmídeo ou — vetorsereplique in vivo.

Exemplos de origens de replicação bacterianas são as origens de replicação de plasmídeos pBR322, puUC19, pACYC177, e pACYC184 que permitem a replicação em E. coli, e PpUB110, pE194, prA1060, e pAMBI que permitem a replicação em Bacillus.

Exemplos de origens de replicação para uso em uma levedura como célula hospedeira são as origem de replicação de 2 micron, ARSI1, : ARSA, a combinação de ARS1 e CEN3, e a combinação de ARS4 e CEN6. Exemplos de origens de replicação usadas em uma célula de E 5 —filamentososão AMAI e ANSI (Gems et al., 1991, Gene 98: 61-67; Cullen er : al., 1987, Nucleic Acids Res. 15: 9163-9175; WO 00/24883). O isolamento do gene AMAI e a construção de plasmídeos ou vetores que compreendem o gene podem ser realizados de acordo com os métodos revelados em WO 00/24883.

Mais de uma cópia de um polinucleotídeo da presente invenção pode ser inserida em uma célula hospedeira para aumentar a produção de um polipeptídeo. Um aumento no número de cópias do polinucleotídeo pode ser obtido integrando pelo menos uma cópia adicional da sequência no genoma da célula hospedeira, ou incluindo um gene marcador selecionável amplificável com o polinucleotídeo, onde as células " contendo cópias amplificadas do gene marcador selecionável e, por meio disso, cópias adicionais do polinucleotídeo, podem ser selecionadas cultivando as células na presença do agente selecionável adequado.

Os procedimentos usados para ligar os elementos descritos anteriormente para construir os vetores de expressão recombinantes da presente invenção são bem conhecidos pelos versados na técnica (ver, por exemplo, Sambrook et al., 1989, supra).

Células hospedeiras A presente invenção também diz respeito às células — hospedeiras recombinantes, que compreendem um polinucleotídeo da presente invenção operavelmente ligado a uma ou mais (várias) sequências controle que direcionam a produção de um polipeptídeo da presente invenção. Um construto ou vetor que compreende um polinucleotídeo é introduzido em uma célula hospedeira, de maneira tal que o construto ou vetor seja mantido como um integrante cromossomal ou como um vetor auto replicante extra- cromossomal da maneira descrita anteriormente. O termo “célula hospedeira” é inclui qualquer progênie de uma célula mãe que não é idêntica à célula mãe em virtude das mutações que ocorrem durante a replicação. A escolha de uma — célula hospedeira dependerá muito do gene que codifica o polipeptídeo e sua , fonte.

A célula hospedeira pode ser qualquer célula usada na produção recombinante de um polipeptídeo da presente invenção, por exemplo, um procarioto ou um eucarioto.

A célula hospedeira procariota pode ser qualquer bactéria Gram-positiva ou Gram-negativa. As bactérias Gram-positivas incluem, mas sem limitação, Bacillus, Clostridium, Enterococcus, Geobacillus, Lactobacillus, Lactococcus, Oceanobacillus, Staphylococcus, Streptococcus, e Streptomyces. As bactérias Gram-negativas incluem, mas sem limitação,

15. Campylobacter, E. coli, Flavobacterium, Fusobacterium, Helicobacter, . Ilyobacter, Neisseria, Pseudomonas, Salmonella, e Ureaplasma.

A célula hospedeira bacteriana pode ser qualquer célula de Bacillus incluindo, mas sem limitação, células de Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus firmus, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis, e Bacillus thuringiensis.

A célula hospedeira bacteriana também pode ser qualquer célula de Streptococcus incluindo, mas sem limitação, células de Streptococcus equisimilis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus uberis, e Streptococcus equi subsp. Zooepidemicus.

A célula hospedeira bacteriana também pode ser qualquer célula de Streptomyces incluindo, mas sem limitação, células de Streptomyces achromogenes, — Streptomyces — avermitilis, — Streptomyces — coelicolor,

Streptomyces griseus, e Streptomyces lividans.

A introdução de DNA em uma célula de Bacillus, por É exemplo, pode ser realizada por transformação de protoplasto (ver, por exemplo, Chang e Cohen, 1979, Mol.

Gen.

Genet. 168: 111-115), usando — células competentes (ver, por exemplo, Young e Spizizen, 1961, J.

Bacteriol. . 81: 823-829, ou Dubnau e Davidoff-Abelson, 1971, J.

Mol.

Biol. 56: 209- 221), por eletroporação (ver, por exemplo, Shigekawa e Dower, 1988, Biotechniques 6: 742-751), ou por conjugação (ver, por exemplo, Koehler e Thorne, 1987, J.

Bacteriol. 169: 5271-5278). A introdução de DNA em uma célula de E. coli, por exemplo, pode ser realizada por transformação de protoplasto (ver, por exemplo, Hanahan, 1983, J.

Mol.

Biol. 166: 557-580) ou eletroporação (ver, por exemplo, Dower et al., 1988, Nucleic Acids Res. 16: 6127-6145). A introdução de DNA em uma célula de Streptomyces, por exemplo, pode ser realizada por transformação de protoplasto e eletroporação (ver, por exemplo, Gong et al., 2004, Folia Microbiol. (Praha) 49: 399-405), : por conjugação (ver, por exemplo, Mazodier et al., 1989, J.

Bacteriol. 171: 3583-3585), ou por transdução (ver, por exemplo, Burke et al., 2001, Proc.

Natl.

Acad.

Sci.

USA 98: 6289-6294). A introdução de DNA em uma célula de Pseudomonas, por exemplo, pode ser realizada por eletroporação (ver, por exemplo, Choi et al., 2006, J.

Microbiol.

Methods 64: 391-397) ou por conjugação (ver, por exemplo, Pinedo e Smets, 2005, Appl.

Environ.

Microbiol. 71: 51-57). A introdução de DNA em uma célula de Streptococcus, por exemplo, pode ser realizada competência natural (ver, por exemplo, Perry e Kuramitsu, 1981, Infect.

Immun. 32: 1295-1297), por transformação de protoplasto (ver, por exemplo, Catt e Jollick, 1991, Microbios 68: 189-207, por eletroporação (ver, por exemplo, Buckley et al., 1999, Appl.

Environ.

Microbiol. 65: 3800-3804) ou por conjugação (ver, por exemplo, Clewell, 1981, Microbiol.

Rev. 45: 409-436). Entretanto, qualquer método conhecido na técnica para introduzir DNA em uma célula hospedeira s1 pode ser usado. A célula hospedeira também pode ser um eucarioto, tal como ; uma célula de mamífero, inseto, planta ou fungo. A célula hospedeira pode ser uma célula fúngica. “Fungos”, da " 5 maneira aqui usada, inclui os filos Ascomycota, Basidiomycota, * Chytridiomycota e Zygomycota (da maneira definida por Hawksworth et al., Em, Ainsworth and Bisby's Dictionary of the Fungi, 8º edição, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, UK), bem como o Oomycota (da maneira citada em Hawksworth et al., 1995, supra, page 171) e todos os fungos mitospóricos (Hawksworth et al., 1995, supra).

A célula hospedeira fúngica pode ser uma célula de levedura. “Levedura”, da maneira aqui usada, inclui leveduras ascosporogêneas (Endomycetales), leveduras basidiosporogêneas e leveduras que pertencem aos fungos imperfeitos (Blastomycetes). Uma vez que a classificação de levedura pode mudar no futuro, com propósitos desta invenção, as leveduras : podem ser definidas da maneira descrita em Biology and Activities of Yeast . (Skinner, F.A., Passmore, S.M., e Davenport, R.R., eds, Soc. App. Bacteriol.

Symposium Series No. 9, 1980). A levedura como célula hospedeira pode ser uma célula de Candida, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, ou Yarrowia, tal como uma célula de Kluyveromyces lactis, — Saccharomyces — carlsbergensis, — Saccharomyces — cerevisiae, Saccharomyces — diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis, Saccharomyces oviformis, ou Yarrowia lipolytica.

A célula hospedeira fúngica pode ser uma célula de fungo filamentoso. “Fungos filamentosos” incluem todas as formas filamentosas da subdivisão Eumycota e Oomycota (da maneira definida por Hawksworth et al., 1995, supra). Os fungos filamentosos são caracterizados em geral por uma parede de micélio composta de quitina, celulose, glicana, quitosana, manana e outros polissacarídeos complexos. O crescimento vegetativo é por E alongamento de hifas e o catabolismo do carbono é obrigatoriamente aeróbico. Ao contrário, o crescimento vegetativo de leveduras, tal como E 5 Saccharomyces cerevisiae, é por brotamento de um talo unicelular e o “ catabolismo do carbono pode ser fermentativo.

As células hospedeiras de fungo filamentoso podem ser uma célula de Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Bjerkandera, Ceriporiopsis, — Chrysosporium, — Coprinus, — Coriolus, — Cryptococcus, Filibasidium, Fusarium, Humicola, Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Phanerochaete, Phlebia, Piromyces, Pleurotus, Schizophyllum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, Trametes, ou Trichoderma. Por exemplo, as células hospedeiras de fungo filamentoso podem ser uma célula de Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, . Aspergillus — fumigatus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Bjerkandera adusta, Ceriporiopsis aneirina, Ceriporiopsis caregiea, Ceriporiopsis gilvescens, Ceriporiopsis pannocinta, Ceriporiopsis rivulosa, Ceriporiopsis subrufa, Ceriporiopsis —subvermispora, Chrysosporium inops, Chrysosporium keratinophilum, Chrysosporium lucknowense, Chrysosporium merdarium, Chrysosporium pannicola, Chrysosporium queenslandicum, Chrysosporium tropicum, Chrysosporium zonatum, Coprinus cinereus, Coriolus hirsutus, Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium Oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, Fusarium venenatum, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora — crassa, — Penicillium — purpurogenum, Phanerochaete Lt chrysosporium, Phlebia radiata, Pleurotus eryngii, Thielavia terrestris, Trametes villosa, Trametes versicolor, Trichoderma harzianum, Trichoderma õ 5 koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei, ou Trichoderma : viride.

As células fúngicas podem ser transformadas por um processo que envolve formação de protoplasto, transformação dos protoplastos e regeneração da parede celular de uma maneira conhecida por se.

Os — procedimentos adequados para a transformação de células hospedeiras de Aspergillus e Trichoderma são descritos em EP 238023, Yelton et al., 1984, Proc.

Natl.

Acad.

Sci.

USA 81: 1470-1474, e Christensen et al., 1988, Bio/Technology 6: 1419-1422. Os métodos adequados para transformar as espécies de Fusarium são descritos por Malardier et al., 1989, Gene 78: 147- 156, e WO 96/00787. A levedura pode ser transformada usando os . procedimentos descritos por Becker e Guarente, Em Abelson, J.N. e Simon, ML.LI,, editors, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Volume 194, pp 182-187, Academic Press, Inc., Nova Iorque; Ito et al., 1983, J.

Bacteriol. 153: 163; e Hinnen et al., 1978, Proc.

Natl.

Acad.

Sci USATS: 1920. Métodos de produção A presente invenção também diz respeito aos métodos de produzir um polipeptídeo da presente invenção compreendendo: (a) cultivar uma célula, que em sua forma tipo selvagem produz o polipeptídeo, em — condições que conduzem para a produção do polipeptídeo; e (b) recuperar o polipeptídeo.

Em um aspecto preferido, a célula é do gênero Talaromyces.

Em um aspecto mais preferido, a célula é Talaromyces byssochlamydoides.

Em um aspecto acima de tudo preferido, a célula é Talaromyces byssochlamydoides cepa CBS413.71.

A presente invenção também diz respeito aos métodos de produzir um polipeptídeo da presente invenção, que compreende: (a) cultivar uma célula hospedeira recombinante da presente invenção em condições que conduzem para a produção do polipeptídeo; e (b) recuperar o polipeptídeo.

É $ As células hospedeiras são cultivadas em um meio nutriente : adequado para a produção do polipeptídeo usando métodos bem conhecidos na técnica. Por exemplo, a célula pode ser cultivada por cultivo em frasco de agitação, e fermentação em pequena escala ou grande escala (incluindo fermentações contínuas, em lotes, em lote alimentado ou em estado sólido) em fermentadores de laboratório ou industriais, realizada em um meio e condições adequadas que permitem que o polipeptídeo seja expresso e/ou isolado. O cultivo ocorre em um meio nutriente adequado que compreende fontes de carbono e nitrogênio e sais inorgânicos, usando os procedimentos conhecidos na técnica. Os meio adequados são disponíveis de fornecedores comerciais, ou podem ser preparados de acordo com as composições : publicadas (por exemplo, em catálogos do American Type Culture ' Collection). Se o polipeptídeo for secretado no meio nutriente, o polipeptídeo pode ser recuperado diretamente do meio. Se o polipeptídeo não for secretado, ele pode ser recuperado de lisados celulares.

O polipeptídeo pode ser detectado usando métodos conhecidos na técnica que são específicos para os polipeptídeos. Estes métodos de detecção podem incluir o uso de anticorpos específicos, a formação de um produto de enzima, ou o desaparecimento de um substrato de enzima. Por exemplo, um ensaio de enzima pode ser usado para determinar a atividade do — polipeptídeo.

O polipeptideo pode ser recuperado usando métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, o polipeptídeo pode ser recuperado do meio nutriente por procedimentos convencionais incluindo, mas sem limitação, centrifugação, filtração, extração, secagem por aspersão,

evaporação ou precipitação.

O polipeptídeo pode ser purificado por uma variedade de : procedimentos conhecidos na técnica incluindo, mas sem limitação, cromatografia (por exemplo, de troca iônica, de afinidade, hidrofóbica, . 5 focagem isoelétrica e por exclusão de tamanho), procedimentos : eletroforéticos (por exemplo, focagem isoelétrica preparativa), solubilidade diferencial (por exemplo, precipitação de sulfato de amônio), SDS-PAGE, ou extração (ver, por exemplo, Protein Purification, J.-C.

Janson e Lars Ryden, editores, VCH Publishers, Nova Iorque, 1989) para obter polipeptídeos — substancialmente puros.

Em um aspecto alternativo, o polipeptídeo não é recuperado, mas certamente uma célula hospedeira da presente invenção que expressa o polipeptídeo é usada como uma fonte do polipeptídeo.

Plantas A presente invenção também diz respeito a plantas isoladas, t por exemplo, uma planta transgênica, parte da planta ou célula de planta, que ' compreende um polinucleotídeo isolado da presente invenção de maneira a expressar e produzir o polipeptídeo em quantidades recuperáveis.

O polipeptídeo pode ser recuperado da planta ou parte da planta. — Alternativamente, a planta ou parte da planta contendo o polipeptídeo pode ser usada como tal para melhorar a qualidade de um alimento ou ração, por exemplo, melhorar o valor nutricional, palatabilidade e propriedades reológicas, ou para destruir um fator anti-nutritivo.

A planta transgênica pode ser dicotiledônea (um dicotilédone) ou monocotiledônca (um monocotilédone). Exemplos de plantas monocotiledôneas são gramíneas, tais como grama do prado (grama azul, Poa), gramíneas forrageiras tais como fFestuca, Lolium, gramíneas temperadas, tais como Agrostis, e cereais, por exemplo, trigo, aveias, centeio, cevada, arroz, sorgo e milho (grão de milho).

Exemplos de plantas dicotiledôneas são tabaco, legumes, tais como tremoços, batata, beterraba, ervilha, feijão e soja, e plantas crucíferas (família Brassicaceae), tais como couve flor, canola e o organismo modelo muito relacionado Arabidopsis thaliana. Ss Exemplos de parte da plantas são caule, calo, folhas, raiz, * frutas, sementes e tubérculos, bem como os tecidos individuais que compreendem estas partes, por exemplo, epiderme, mesófilo, parênquima, tecidos vasculares, meristemas. Os compartimentos celulares de planta específicos, tais como cloroplastos, apoplastos, mitocôndria, vacúolos, —peroxissomos e citoplasma também são considerados como uma parte da planta. Além do mais, qualquer célula de planta, seja qual for a origem do tecido, é considerada como uma parte da planta. Da mesma maneira, partes da planta tais como tecidos específicos e células isoladas para facilitar a utilização da invenção são também consideradas partes da planta, por exemplo, embriões, endospermas, aleurona e revestimentos de semente.

* São também incluídas no escopo da presente invenção são a F progênie de tais plantas, partes da planta e células da planta.

A planta transgênica ou célula de planta que expressa um polipeptídeo pode ser construída de acordo com métodos conhecidos na tecnologia. Em resumo, a planta ou célula de planta é construída incorporando um ou mais (vários) construtos de expressão que codificam um polipeptídeo no genoma da planta hospedeira ou genoma do cloroplasto e que propagam o a planta modificada resultante ou célula de planta em uma planta transgênica ou célula de planta.

O construto de expressão é convenientemente um construto de ácido nucleico, que compreende um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo operavelmente ligado a sequências regulatórias adequadas exigidas para a expressão do polinucleotídeo na planta ou parte da planta de escolha. Além do mais, o construto de expressão pode compreender um

ST marcador selecionável usado para identificar células hospedeiras, nas quais o construto de expressão foi integrado e as sequências de DNA necessárias para Y a introdução do construto na planta em questão (a última depende do método de introdução de DNA a ser usado). . 5 A escolha das sequências regulatórias, tais como sequências promotoras e finalizadoras e, opcionalmente, sequências sinal ou de trânsito, é determinada, por exemplo, com base em onde, quando e como deseja-se expressar o polipeptídeo.

Por exemplo, a expressão do gene que codifica um polipeptídeo pode ser constitutiva ou indutível, ou pode ser para oO — desenvolvimento, específica de estágio ou tecido, e o produto do gene pode ser alvejado em um tecido específico ou parte da planta tal como sementes ou folhas.

As sequências regulatórias são, por exemplo, descritas por Tague et al., 1988, Plant Physiology 86: 506. Para a expressão constitutiva, o 35S8-CaMV, a ubiquitina 1 do milho, eo promotor de actina 1 de arroz podem ser usados (Franck et al., " 1980, Cell 21: 285-294; Christensen et al., 1992, Plant Mol.

Biol. 18: 675- 689; Zhang et al., 1991, Plant Cell 3: 1155-1165). Os promotores específicos de órgão podem ser, por exemplo, um promotor de tecidos de armazenamento tais como sementes, tubérculos de batata e frutas (Edwards e Coruzzi, 1990, Ann Rev.

Genet. 24: 275-303), ou de tecidos de armazenamento metabólico tais como meristemas (Ito et al., 1994, Plant Mol.

Biol. 24: 863-878), um promotor específico de semente tal como o promotor de glutelina, prolamina, globulina, ou albumina de arroz (Wu et al., 1998, Plant Cell Physiol. 39: 885- 889), um promotor de Vicia faba da legumina B4 e o gene de proteína de semente desconhecido de Vicia faba (Conrad et al., 1998, J.

Plant Physiol. 152: 708-711), um promotor de um proteína de corpo oleoso de semente Chen et al., 1998, Plant Cell Physiol. 39: 935-941), o promotor de proteína de armazenamento napà de Brassica napus, ou qualquer outro promotor específico de semente conhecido na técnica, por exemplo, da maneira descrita em WO 91/14772. Além do mais, o promotor pode ser um promotor específico de folha tal como o promotor rbcs de arroz ou tomate (Kyozuka et : al., 1993, Plant Physiol. 102: 991-1.000), o promotor do gene adenina metiltransferase do vírus clorela (Mitra e Higgins, 1994, Plant Mol.

Biol. 26: 85-93), o promotor do gene aldP de arroz (Kagaya et al., 1995, Mol.

Gen. fr Genet. 248: 668-674), ou um promotor indutível de ferida tal como o promotor pin2 da batata (Xu et al., 1993, Plant Mol.

Biol. 22: 573-588). Da mesma forma, o promotor pode ser induzido por tratamentos abióticos, tais como temperatura, aridez, ou alterações na salinidade, ou induzido por — substâncias aplicadas exogenamente que ativam o promotor, por exemplo, etanol, estrogênio, hormônios vegetais, tais como etileno, ácido abscísico e ácido giberélico e metais pesados.

Um elemento melhorador de promotor também pode ser usado para atingir maior expressão de um polipeptídeo na planta.

Por exemplo, o elemento melhorador do promotor pode ser um intron que é colocado entre o r promotor e o polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo.

Por exemplo, Xu í et al., 1993, supra, revelam o uso do primeiro intron do gene actina 1 de arroz para melhorar a expressão.

O gene marcador selecionável e quaisquer outras partes do — construto de expressão podem ser escolhidos daqueles disponíveis na técnica.

O construto de ácido nucleico é incorporado no genoma da planta de acordo com técnicas convencionais conhecidas na técnica, incluindo transformação mediada por Agrobacterium, transformação mediada por vírus, microinjeção, bombardeamento de partícula, transformação biolística e — eletroporação (Gasser et al., 1990, Science 244: 1293; Potrykus, 1990, Bio/Technology 8: 535; Shimamoto et al., 1989, Nature 338: 274). A transferência de genes mediada por Agrobacterium tumefaciens é um método para gerar dicotiledôneas transgênicas (para uma revisão, ver Hooykas e Schilperoort, 1992, Plant Mol.

Biol. 19: 15-38) e também pode ser usado para transformar monocotiledôneas, embora outros métodos de transformação sejam frequentemente usados por estas plantas. : Um método para gerar monocotiledôneas transgênicas é o bombardeamento de partículas (partículas microscópicas de ouro ou tungstênio revestidas com : 5 o DNA transformante) de calos embrionários ou embriões em - desenvolvimento (Christou, 1992, Plant J. 2: 275-281; Shimamoto, 1994, Curr. Opin. Biotechnol. 5: 158-162; Vasil et al., 1992, Bio/Technology 10: 667-674). Um método alternativo para a transformação de monocotiledôneas baseia-se na transformação de protoplasto, da maneira descrita por Omirulleh etal, 1993, Plant Mol. Biol. 21: 415-428. Os métodos de transformação adicionais para uso de acordo com a presente revelação incluem aqueles descritos nas patentes U.S. 6.395.966 e 7.151.204 (ambas as quais são aqui incorporadas pela referência na sua íntegra).

Após a transformação, os transformantes com o construto de expressão incorporados são selecionados e regenerados nas plantas completas, + de acordo com métodos bem conhecidos na técnica. Em geral, o : procedimento da transformação é designado para a eliminação seletiva de genes de seleção tanto durante a regeneração quanto após as gerações usando, por exemplo, co-transformação com dois construtos de DNA-T separados ou — excisão sítio específica do gene de seleção por uma recombinase específica. Além de direcionar a transformação de um genótipo particular de planta com um construto preparado de acordo com a presente invenção, as plantas transgênicas podem ser preparadas cruzando uma planta com o construto em uma segunda planta que precisa do construto. Por exemplo, um —construto que codifica um polipeptídeo pode ser introduzido em uma variedade particular de planta por cruzamento, sem a necessidade de transformar diretamente uma planta daquela dada variedade. Portanto, a presente invenção inclui não apenas uma planta regenerada diretamente das células que foram transformadas de acordo com a presente invenção, mas também a progênie de tais plantas. Da maneira aqui usada, progênie pode se referir à descendência de qualquer geração de uma planta mãe preparada de : acordo com a presente invenção. Tal progênie pode incluir um construto de DNA preparado de acordo com a presente invenção, ou uma porção de um A 5 construto de DNA preparado de acordo com a presente invenção. Os cruzamentos resultam na introdução de um transgene em uma linhagem de planta polinizando de maneira cruzada uma linhagem inicial com uma linhagem de planta doadora. Os exemplos não limitantes de tais etapas são articulados adicionalmente na patente U.S. 7.151.204.

As plantas podem ser geradas por meio de um processo de conversão de retrocruzamento. Por exemplo, as plantas incluem plantas referidas como um genótipo, linhagem, inato, híbrido convertido por retrocruzamento.

Os marcadores genéticos podem ser usados para auxiliar na introgressão de um ou mais transgenes da invenção a partir de um antecedente É genético em um outro. A seleção auxiliada por marcador oferece vantagens com relação à reprodução convencional, na qual ele pode ser usado para evitar erros causados por variações fenotípicas. Adicionalmente, os marcadores genéticos podem fornecer dados com relação ao grau relativo de germoplasma elite na progênie individual de um cruzamento particular. Por exemplo, quando uma planta com uma característica desejada, que de outra forma apresenta um antecedente genético agronomicamente não desejável, é cruzada com uma mãe elite, os marcadores genéticos podem ser usados para selecionar a progênie que possui não apenas a característica de interesse, mas também apresentam uma proporção relativamente grande do germoplasma desejado. Desta maneira, o número de gerações exigidas pata introgressar uma ou mais características em um antecedente genético particular é minimizado.

A presente invenção também diz respeito aos métodos de produzir um polipeptídeo da presente invenção que compreende: (a) cultivar uma planta transgênica ou uma célula de planta, que compreende um : polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo, em condições que conduzem para a produção do polipeptídeo; e (b) recuperar o polipeptídeo.

Ss 5 Composições ó A presente invenção também diz respeito às composições de enzima que compreendem um polipeptídeo da presente invenção. Preferivelmente, as composições são enriquecidas em um polipeptídeo como este. O termo “enriquecido” indica que a atividade de celobioidrolase da composição foi aumentada, por exemplo, com um fator de enriquecimento de pelo menos 1,1.

A composição pode compreender um polipeptídeo da presente invenção como o principal componente enzimático, por exemplo, uma composição mono-componente. Alternativamente, a composição pode compreender múltiplas atividades enzimáticas, tais como uma ou mais : (várias) enzimas selecionadas do grupo que consiste em uma celulase, uma hemicelulase, uma expansina, uma esterase, uma laccase, uma enzima ligninolítica, uma pectinase, uma peroxidase, uma protease e uma swolenina.

Em uma modalidade preferida, a composição da enzima compreende pelo menos a celobioidrolase da invenção, pelo menos uma endoglucanase, pelo menos uma beta-glucosidase e pelo menos um polipeptídeo GH61 com melhor atividade celulolítica.

As composições de polipeptídeo podem ser preparadas de acordo com métodos conhecidos na técnica, e podem estar na forma de uma — composição líquida ou seca. Por exemplo, a composição de polipeptídeo pode estar na forma de um granulado ou um microgranulado. O polipeptídeo a ser incluído na composição pode ser estabilizado de acordo com métodos conhecidos na técnica.

As composições de enzima podem compreender qualquer proteína que é usada na degradação ou conversão do material celulósico. Em um aspecto, a composição de enzima compreende ou : compreende adicionalmente uma ou mais (várias) proteínas selecionadas do grupo que consiste em uma celulase, um polipeptíideo GH61 com melhor atividade celulolítica, uma hemicelulase, uma expansina, uma esterase, uma : laccase, uma enzima ligninolítica, uma pectinase, uma peroxidase, uma protease e uma swolenina. Em um outro aspecto, a celulase é preferivelmente uma ou mais (várias) enzimas selecionadas do grupo que consiste em uma endoglucanase, uma celobioidrolase adicional e uma beta-glucosidase. Em um — outro aspecto, a hemicelulase é preferivelmente uma ou mais (várias) enzimas selecionadas do grupo que consiste em uma acetilmanana esterase, uma acetilxilano esterase, uma arabinanase, uma arabinofuranosidase, uma ácido coumárico esterase, uma feruloil esterase, uma galactosidase, uma glucuronidase, uma glucuronoil esterase, uma mananase, um manosidase, uma xilanasee uma xilosidase.

t Em um outro aspecto, a composição de enzima compreende uma ou mais (várias) enzimas celulolíticas. Em um outro aspecto, a composição de enzima compreende ou compreende adicionalmente uma ou mais (várias) enzimas hemicelulolíticas. Em um outro aspecto, a composição — de enzima compreende uma ou mais (várias) enzimas celulolíticas e uma ou mais (várias) enzimas hemicelulolíticas. Em um outro aspecto, a composição de enzima compreende uma ou mais (várias) enzimas selecionadas do grupo de enzimas celulolíticas e enzimas hemicelulolíticas. Em um outro aspecto, a composição de enzima compreende uma endoglucanase. Em um outro — aspecto, a composição de enzima compreende uma celobioidrolase. Em um outro aspecto, a composição de enzima compreende uma beta-glucosidase. Em um outro aspecto, a composição de enzima compreende um polipeptídeo GH61 com melhor atividade celulolítica. Em um outro aspecto, a composição de enzima compreende uma endoglucanase e uma celobioidrolase. Em um outro aspecto, a composição de enzima compreende uma endoglucanase e uma beta-glucosidase.

Em um outro aspecto, a composição de enzima

: compreende uma celobioidrolase e uma beta-glucosidase.

Em um outro aspecto, a composição de enzima compreende uma endoglucanase, uma

S 5 — celobioidrolase e uma beta-glucosidase.

Em um outro aspecto, a composição * de enzima compreende uma endoglucanase, uma celobioidrolase, uma beta- glucosidase, e um polipeptídeo GH61 com melhor atividade celulolítica.

Em um outro aspecto, a composição de enzima compreende uma acetilmanana esterase.

Em um outro aspecto, a composição de enzima compreende uma

—acetilxilano esterase.

Em um outro aspecto, a composição de enzima compreende uma arabinanase (por exemplo, alfa-L-arabinanase). Em um outro aspecto, a composição de enzima compreende uma arabinofuranosidase

(por exemplo, alfa-L-arabinofuranosidase). Em um outro aspecto, a composição de enzima compreende uma ácido coumárico esterase.

Em um outro aspecto, a composição de enzima compreende uma feruloil esterase.

Em

Ê um outro aspecto, a composição de enzima compreende uma galactosidase : (por exemplo, alfa-galactosidase e/ou beta-galactosidase). Em um outro aspecto, a composição de enzima compreende uma glucuronidase (por exemplo, alfa-D-glucuronidase). Em um outro aspecto, a composição de enzima compreende uma glucuronoil esterase.

Em um outro aspecto, a composição de enzima compreende uma mananase.

Em um outro aspecto, a composição de enzima compreende um manosidase (por exemplo, beta- manosidase). Em um outro aspecto, a composição de enzima compreende uma xilanase.

Em um aspecto preferido, a xilanase é uma xilanase da família

10 . Em um outro aspecto, a composição de enzima compreende uma xilosidase (por exemplo, beta-xilosidase). Em um outro aspecto, a composição de enzima compreende uma expansina.

Em um outro aspecto, a composição de enzima compreende uma esterase.

Em um outro aspecto, a composição de enzima compreende uma laccase.

Em um outro aspecto, a composição de enzima compreende uma enzima ligninolítica. Em um aspecto preferido, a enzima ligninolítica é uma manganês peroxidase. Em um outro : aspecto preferido, a enzima ligninolítica é uma lignina peroxidase. Em um outro aspecto preferido, a enzima ligninolítica é uma enzima que produz ” 5 HO, Em um outro aspecto, a composição de enzima compreende uma : pectinase. Em um outro aspecto, a composição de enzima compreende uma peroxidase. Em um outro aspecto, a composição de enzima compreende uma protease. Em um outro aspecto, a composição de enzima compreende uma swolenina.

Nos métodos da presente invenção, a(s) enzima(s) podem ser adicionadas antes ou durante a fermentação, por exemplo, durante a sacarificação ou durante ou após a propagação do(s) microrganismo(s) fermentador(s).

Um ou mais (vários) componentes da composição de enzima podem ser proteínas tipo selvagem, proteínas recombinantes, ou uma ' combinação de proteínas tipo selvagem e proteínas recombinantes. Por exemplo, um ou mais (vários) componentes podem ser proteínas naturais de uma célula, que é usada como uma célula hospedeira para expressar de maneira recombinante um ou mais (vários) outros componentes da composição de enzima. Um ou mais (vários) componentes da composição de enzima podem ser produzidos como monocomponentes, que são então combinados para formar a composição de enzima. A composição de enzima pode ser uma combinação de multicomponente e preparações de proteína monocomponente.

As enzimas usadas nos métodos da presente invenção pode ser de qualquer forma adequada para uso tal como, por exemplo, um caldo bruto de fermentação com ou sem células removidas, um lisado celular com ou sem restos celulares, uma preparação de enzima semi-purificada ou purificada, ou uma célula hospedeira como uma fonte das enzimas. A composição de enzima pode ser um pó seco ou granulado, um granulado sem poeira, um líquido, um líquido estabilizado, ou uma proteína protegida estabilizada. As preparações k de enzima líquida, por exemplo, pode ser estabilizadas adicionando estabilizadores tais como um açúcar, um álcool de açúcar ou um outro poliol, : 5 e/ou ácido lático ou um outro ácido orgânico de acordo com os processos estabelecidos. As quantidades ideais das enzimas de um polipeptídeo que apresenta atividade de celobioidrolase dependem de vários fatores incluindo, mas sem limitação, a mistura de componentes de enzimas celulolíticas, o material celulósico, a concentração de material celulósico, o(s) pré- tratamento(s) do material celulósico, temperatura, tempo, pH, e inclusão de organismo fermentador (por exemplo, levedura para a sacarificação e fermentação simultânea).

Em um aspecto preferido, uma quantidade eficiente de enzima celulolítica para o material celulósico é cerca de 0,5 a cerca de 50 mg, . preferivelmente cerca de 0,5 a cerca de 40 mg, mais preferivelmente cerca de í 0,5 a cerca de 25 mg, mais preferivelmente cerca de 0,75 a cerca de 20 mg, mais preferivelmente cerca de 0,75 a cerca de 15 mg, ainda mais preferivelmente cerca de 0,5 a cerca de 10 mg, e acima de tudo preferivelmente cerca de 2,5 a cerca de 10 mg por g do material celulósico. Em um outro aspecto preferido, uma quantidade eficiente de um polipeptídeo que apresenta atividade de celobioidrolase para o material celulósico é cerca de 0,01 a cerca de 50,0 mg, preferivelmente cerca de 0,01 a cerca de 40 mg, mais preferivelmente cerca de 0,01 a cerca de 30 mg, mais — preferivelmente cerca de 0,01 a cerca de 20 mg, mais preferivelmente cerca de 0,01 a cerca de 10 mg, mais preferivelmente cerca de 0,01 a cerca de 5 mg, mais preferivelmente cerca de 0,025 a cerca de 1,5 mg, mais preferivelmente cerca de 0,05 a cerca de 1,25 mg, mais preferivelmente cerca de 0,075 a cerca de 1,25 mg, mais preferivelmente cerca de 0,1 a cerca de 1,25 mg, ainda mais preferivelmente cerca de 0,15 a cerca de 1,25 mg, e acima de tudo preferivelmente cerca de 0,25 a cerca de 1,0 mg por g do material celulósico. é Em um outro aspecto preferido, uma quantidade eficiente de um polipeptídeo que apresenta atividade de celobioidrolase para a enzima : 5 — celulolítica é cerca de 0,005 a cerca de 1,0 g, preferivelmente cerca de 0,01 a h cerca de 1,0 g, mais preferivelmente cerca de 0,15 a cerca de 0,75 g, mais preferivelmente cerca de 0,15 a cerca de 0,5 g, mais preferivelmente cerca de O,1 a cerca de 0,5 g, ainda mais preferivelmente cerca de 0,1 a cerca de 0,25 g, e acima de tudo preferivelmente cerca de 0,05 a cerca de 0,2 g por g de enzima celulolítica.

Os polipeptídeos com atividade de enzima celulolítica ou atividade de enzima hemicelulolítica, bem como outras proteínas/polipeptídeos usadas na degradação do material celulósico, por exemplo, polipeptídeos com melhor atividade celulolítica (daqui por diante “polipeptídeos com atividade de enzima”) podem ser derivados ou obtidos a . partir de qualquer origem adequada incluindo, origem bacteriana, fúngica, À levedura, planta ou mamífero. O termo “obtido” significa aqui que a enzima pode ter sido isolada de um organismo que produz naturalmente a enzima como uma enzima natural. O termo “obtido” também significa aqui que a enzima pode ter sido produzida de maneira recombinante em um organismo hospedeiro, empregando métodos aqui descritos, em que a enzima produzida de maneira recombinante é tanto natural ou estrangeira para o organismo hospedeiro, quanto apresenta uma sequência modificada de aminoácidos, por exemplo, que apresenta um ou mais (vários) aminoácidos que são eliminados, inseridos e/ou substituídos, isto é, uma enzima produzida de maneira recombinante que é um mutante e/ou um fragmento de uma sequência natural de aminoácidos, ou uma enzima produzida por processos de embaralhamento de ácido nucleico conhecidos na técnica. Estão incluídos no significado de uma enzima natural os variantes naturais, e no significado de uma enzima estrangeira estão os variantes obtidos de maneira recombinante, tal como por mutagênese sítio-direcionada ou embaralhamento. . Um ou mais (vários) componentes da composição de enzima podem ser um componente recombinante, isto é, produzidos pela clonagem de s 5 uma sequência de DNA que codifica o componente único, e S subsequentemente transformados na célula com a sequência de DNA e expressos em um hospedeiro (ver, por exemplo, WO 91/17243 e WO 91/17244). O hospedeiro é preferivelmente um hospedeiro heterólogo (a enzima é estrangeira ao hospedeiro), mas o hospedeiro em certas condições também pode ser um hospedeiro homólogo (a enzima é natural ao hospedeiro). As proteínas celulolíticas de monocomponente também podem ser preparadas purificando uma proteína como esta a partir de um caldo de fermentação.

Em um aspecto, a uma ou mais (várias) enzimas celulolíticas compreendem uma preparação comercial de enzima celulolítica.

Os exemplos . de preparações comerciais de enzima celulolítica adequadas para uso na É presente invenção incluem, por exemplo, CELLICTM CTec (Novozymes A/S), CELLICTM CTec2 (Novozymes A/S), CELLUCLAST'!M (Novozymes A/S), NOVOZYM'Y 188 (Novozymes A/S), CELLUZ YMETY (Novozymes A/S), CEREFLO'M (Novozymes A/S),) e ULTRAFLO!M (Novozymes A/S), ACCELERASE'M (Genencor Int), LAMINEX'M (Genencor Int), SPEZYME'Y CP (Genencor Int.), ROHAMENT'TY 7069 W (Róhm GmbH), FIBREZYMEG LDI (Dyadic International, Inc.), FIBREZYMER LBR (Dyadic International, Inc.), ou VISCOSTARG& 150L (Dyadic International, Inc). As enzimas celulase são adicionadas em quantidades eficientes a partir de cerca de 0,001 a cerca de 5,0 % em peso de sólidos, mais preferivelmente de cerca de 0,025 a cerca de 4,0 % em peso de sólidos, e acima de tudo preferivelmente de cerca de 0,005 a cerca de 2.0 % em peso de sólidos.

Os exemplos de endoglucanases bacterianas que podem ser usadas nos métodos da presente invenção incluem, mas sem limitação, uma endoglucanase de Acidothermus cellulolyticus (WO 91/05039; WO 93/15186; . patente U.S. 5.275.944; WO 96/02551; patente U.S. 5.536.655, WO 00/70031, WO 05/093050); endoglucanase III de Thermobifida fusca (WO

— 05/093050)e endoglucanase V de Thermobifida fusca (WO 05/093050). Os exemplos de endoglucanases fúngicas que podem ser usadas na presente invenção incluem, mas sem limitação, uma endoglucanase I de Trichoderma reesei (Penttila et al., 1986, Gene 45: 253-263; endoglucanase 1 de Trichoderma reesei Cel7B; número de acesso ao 10º GENBANK'Y MI15665); endoglucanase 1 de Trichoderma reesei (Saloheimo, et al., 1988, Gene 63:11-22; endoglucanase UI de Trichoderma reesei Cel5A; número de acesso ao GENBANKTY M19373); endoglucanase IM de Trichoderma reesei (Okada et al., 1988, Appl.

Environ.

Microbiol. 64: 555-563; número de acesso ao GENBANKTM AB003694); endoglucanase V de Trichoderma reesei (Saloheimo et al., 1994, Molecular Microbiology 13: . 219-228; número de acesso ao GENBANKTM 733381); endoglucanase de : Aspergillus aculeatus (Ooi et al., 1990, Nucleic Acids Research 18: 5884); endoglucanase de Aspergillus kawachii (Sakamoto et al., 1995, Current Genetics 27: 435-439); endoglucanase de Erwinia carotovara (Saarilahti er —al,1990, Gene 90: 9-14); endoglucanase de Fusarium oxysporuma (número de acesso ao GENBANKTY 129381); endoglucanase de Humicola grisea var. thermoidea (número de acesso ao GENBANKTY ABO003107); endoglucanase de Melanocarpus albomyces (número de acesso ao GENBANK'TY MAL515703); endoglucanase de Neurospora crassa (número de acesso ao GENBANKTM XM 324477); endoglucanase V de Humicola insolens; endoglucanase de Myceliophthora thermophila CBS 117.65; endoglucanase de basidiomiceto CBS 495.95; endoglucanase de basidiomiceto CBS 494.95; endoglucanase de Thielavia terrestris NKRL 8126 CEL6B; endoglucanase de Thielavia terrestris NRRL 8126 CEL6C; endoglucanase de Thielavia terrestris NRKRRL 8126 CEL7C; endoglucanase de Thielavia terrestris NKRL 8126 CEL7E; endoglucanase de Thielavia terrestris NKRL 8126 CELT7F; : endoglucanase de Cladorrhinum foecundissimum ATCC 62373 CEL7A e endoglucanase da cepa Trichoderma reesei No. VTT-D-80133 (número de . 5 —acessoao GENBANKTM M15665).

: Os exemplos de celobioidrolases adicionais usadas na hidrólise de biomassa incluem, mas sem limitação, celobioidrolase I de Trichoderma reesei; celobioidrolase II de Trichoderma reesei; celobioidrolase I de Humicola insolens; celobioidrolase Il de Myceliophthora thermophila; —celobioidrolase II de Thielavia terrestris (CEL6A); celobioidrolase I de Chaetomium thermophiluma e celobioidrolasse 1 de Chaetomium thermophiluma.

Os exemplos de beta-glucosidases usadas na presente invenção incluem, mas sem limitação, beta-glucosidase de Aspergillus oryzae; beta- glucosidase de Aspergillus fumigatus; beta-glucosidase de Penicillium * brasilianum IBT 20888; beta-glucosidase d e Aspergillus niger e beta- ; glucosidase de Aspergillus aculeatus.

O polipeptídeo de Aspergillus oryzae que apresenta a atividade de beta-glucosidase pode ser obtido de acordo com WO 2002/095014. O —polipeptídeo de Aspergillus fumigatus que apresenta a atividade de beta- glucosidase pode ser obtido de acordo com WO 2005/047499. O polipeptídeo de Penicillium brasilianum que apresenta a atividade de beta-glucosidase pode ser obtido de acordo com WO 2007/019442. O polipeptídeo de Aspergillus niger que apresenta a atividade de beta-glucosidase pode ser obtido de acordo com Dan et al., 2000, J. Biol. Chem. 275: 4973-4980. O polipeptídeo de Aspergillus aculeatus que apresenta a atividade de beta- glucosidase pode ser obtido de acordo com Kawaguchi et al., 1996, Gene 173: 287-288.

A beta-glucosidase pode ser um proteína de fusão. Em um

O) aspecto, a beta-glucosidase é a proteína de fusão BG beta-glucosidase do variante de Aspergillus oryzae, ou a proteína de fusão de beta-glucosidase de : Aspergillus oryzae obtida de acordo com WO 2008/057637. Outras endoglucanases, celobioidrolases e beta-glucosidases * 5 — usadas são reveladas em várias famílias de glicosil hidrolase usando a ' classificação de acordo com Henrissat, 1991, A classification de glyicosyl hydrolases based on amino-acid sequence similarities, Biochem. J. 280: 309- 316, e Henrissat e Bairoch, 1996, Updating the sequence-based classification of glycosyl hydrolases, Biochem. J. 316: 695-696.

Outras enzimas celulolíticas que podem ser usadas na presente invenção são descritas em EP 495,257, EP 531,315, EP 531,372, WO 89/09259, WO 94/07998, WO 95/24471, WO 96/11262, WO 96/29397, WO 96/034108, WO 97/14804, WO 98/08940, WO 98/012307, WO 98/13465, WO 98/015619, WO 98/015633, WO 98/028411, WO 99/06574, WO 99/10481, WO 99/025846, WO 99/025847, WO 99/031255, WO : 2000/009707, WO 2002/050245, WO 2002/0076792, WO 2002/101078, WO 2003/027306, WO 2003/052054, WO 2003/052055, WO 2003/052056, WO i 2003/052057, WO 2003/052118, WO 2004/016760, WO 2004/043980, WO 2004/048592, WO 2005/001065, WO 2005/028636, WO 2005/093050, WO 2005/093073, WO 2006/074005, WO 2006/117432, WO 2007/071818, WO 2007/071820, WO 2008/008070, WO 2008/008793, patente U.S. 4.435.307, patente U.S. 5,457,046, patente U.S. 5.648.263, patente U.S. 5.686.593, patente U.S. 5.691.178, patente U.S. 5.763.254 e patente U.S. 5.776.757.

Nos métodos da presente invenção, qualquer polipeptídeo —GH61 com melhor atividade celulolítica pode ser usado.

Os exemplos de polipeptíideos com melhor atividade celulolítica usados nos métodos da presente invenção incluem, mas sem limitação, polipeptídeos com melhor atividade celulolítica de Thielavia terrestris (WO 2005/074647); polipeptídeos com melhor atividade celulolítica de Thermoascus aurantiacus (WO 2005/074656); polipeptídeos com melhor atividade celulolítica de Trichoderma reesei (WO 2007/089290); e E polipeptídeos com melhor atividade celulolítica de Myceliophthora thermophila (WO 2009/085935; WO 2009/085859; WO 2009/085864; WO SS 2009/085868).

+ Em um aspecto, o uma ou mais (várias) enzimas hemicelulolíticas compreendem uma preparação comercial de enzima hemicelulolítica.. Os exemplos de preparações comerciais de enzima hemicelulolítica adequadas para uso na presente invenção incluem, por exemplo, SHEARZYMETY (Novozymes A/S), CELLICTM HTec (Novozymes A/S), CELLICTM HTec2 (Novozymes A/S), VISCOZYMEGR (Novozymes A/S), ULTRAFLOR (Novozymes A/S), PULPZYMER HC (Novozymes A/S), MULTIFECT?& Xilanase (Genencor), ECOPULPE& TX-200A (AB Enzimas), HSP 6000 Xilanase (DSM), DEPOLTY 333P (Biocatalysts Limit, Wales, UK), DEPOLTY 740L. (Biocatalysts Limit, Wales, UK), e DEPOLTY : 762P (Biocatalysts Limit, Wales, UK).

? Os exemplos de xilanases usadas nos métodos da presente invenção incluem, mas sem limitação, xilanases de Aspergillus aculeatus (GeneSeqP:AAR63790; WO 94/21785), xilanases de Aspergillus fumigatus (WO 2006/078256) e xilanases de Thielavia terrestris NRKRRL 8126 (WO 2009/079210).

Os exemplos de beta-xilosidases usadas nos métodos da presente invenção incluem, mas sem limitação, beta-xilosidase de Trichoderma reesei (número de acesso UniProtKB/TrEMBL Q92458), de Talaromyces emersonii (número de acesso SwissProt Q8X212) e de Neurospora crassa (número de acesso SwissProt Q7SOW4).

Os exemplos de acetilxilano esterases usadas nos métodos da presente invenção incluem, mas sem limitação, acetilxilano esterase de Hypocrea jecorina (WO 2005/001036), acetilxilano esterase de Neurospora crassa (número de acesso UniProt q7s259), acetilxilano esterase de Thielavia terrestriszs: NRRL 8126 (WO 2009/042846), acetilxilano esterase de b Chaetomium globosum (número de acesso Uniprot Q2GWX4), acetilxilano esterase de Chaetomium gracile (número de acesso GeneSegP AAB82124), * 5 acetilxilano esterase de Phaeosphaeria nodorum (número de acesso Uniprot " QO0UHJ1) e acetilxilano esterase de Humicola insolens DSM 1800 (WO 2009/073709).

Os exemplos de ácido ferúlico esterases usadas nos métodos da presente invenção incluem, mas sem limitação, feruloil esterase de Humicola insolens DSM 1800 (WO 2009/076122), feruloil esterase de Neurospora crassa (número de acesso UniProt Q9HGR3) e feruloil esterase de Neosartorya fischeri (número de acesso UniProt A1D9T4).

Os exemplos de arabinofuranosidases usadas nos métodos da presente invenção incluem, mas sem limitação, arabinofuranosidase de Humicola insolens DSM 1800 (WO 2009/073383) e arabinofuranosidase de f Aspergillus niger (número de acesso GeneSeqP AAR94170).

Os exemplos de alfa-glucuronidases usadas nos métodos da presente invenção incluem, mas sem limitação, alfa-glucuronidase de Aspergillus clavatus (número de acesso UniProt alcce12), alfa-glucuronidase de Trichoderma reesei (número de acesso Uniprot Q99024), alfa- glucuronidase de Talaromyces emersonii (número de acesso UniProt Q8X211), alfa-glucuronidase de Aspergillus niger (número de acesso Uniprot QI6WX9I), alfa-glucuronidase de Aspergillus terreus (número de acesso SwissProt Q0CJP9) e alfa-glucuronidase de Aspergillus fumigatus (número de — acesso SwissProt Q4WWA45).

As enzimas e proteínas usadas nos métodos da presente invenção podem ser produzidas por fermentação das cepas microbianas observadas anteriormente, em um meio nutriente contendo fontes adequadas de carbono e nitrogênio e sais inorgânicos, usando procedimentos conhecidos na técnica (ver, por exemplo, Bennett, J.W. e LaSure, L. (eds.), More Gene Manipulations in Fungi, Academic Press, CA, 1991). Os meios adequados E são disponíveis a partir de fornecedores comerciais, ou podem ser preparados de acordo com composições publicadas (por exemplo, em catálogos do ! 5 — American Type Culture Collection). As faixas de temperatura e outras É condições adequadas para crescimento e produção de enzima são conhecidas na técnica (ver, por exemplo, Bailey, J.E., e Ollis, D.F., Biochemical Engineering Fundamentals, McGraw-Hill Book Company, NY, 1986). A fermentação pode ser qualquer método de cultivo de uma célula, resultando na expressão ou isolamento de uma enzima ou proteína.

Portanto, a fermentação pode ser entendida como aquela que compreende cultivo em frasco de agitação, ou fermentação em pequena ou larga escala (incluindo fermentações contínuas, em lote, em lote alimentado, ou em estado sólido) em fermentadores de laboratório ou industriais, realizada em um meio adequado e em condições que permitem que a enzima seja expressa ou ã isolada.

As enzimas resultantes produzidas pelos métodos descritos anteriormente podem ser recuperadas a partir do meio de fermentação e purificadas por procedimentos convencionais.

São fornecidos a seguir exemplos de usos preferidos das composições de polipeptídeo da invenção.

À dosagem da composição de polipeptídeo da invenção e outras condições nas quais a composição é usada podem ser determinadas com base nos métodos conhecidos na técnica.

Usos A presente invenção é também diz respeito aos seguintes —métodos para usar os polipeptídeos com atividade de celobioidrolase, ou composições destes.

A presente invenção também diz respeito aos métodos para degradar ou converter um material celulósico que compreendem: tratar o material celulósico com uma composição de enzima na presença de um polipeptídeo com atividade de celobioidrolase da presente invenção.

Em um aspecto o material celulósico é pré-tratado.

Em um outro aspecto, o método : compreende adicionalmente recuperar o material celulósico degradado ou convertido.

Os produtos solúveis de degradação ou conversão do material S 5 — celulósico podem ser separados do material celulósico insolúvel usando a * tecnologia bem conhecida na técnica como tal, por exemplo, centrifugação, filtração e ambiente de gravidade.

A presente invenção também diz respeito aos métodos de produzir um produto de fermentação compreendendo: (a) sacarificar um material celulósico com uma composição de enzima na presença de um polipeptídeo que apresenta atividade de celobioidrolase da presente invenção; (b) fermentar o material celulósico sacarificado com um ou mais (vários) microrganismos fermentadores para sintetizar o produto de fermentação; e (c) recuperar o produto de fermentação a partir da fermentação.

A presente invenção também diz respeito aos métodos de : fermentar um material celulósico compreendendo: fermentar o material celulósico com um ou mais (vários) microrganismos fermentadores, em que o material celulósico é sacarificado com uma composição de enzima na presença de um polipeptídeo que apresenta atividade de celobioidrolase da presente invenção.

Em um aspecto, a fermentação do material celulósico sintetiza um produto de fermentação.

Em um outro aspecto, o método compreende adicionalmente recuperar o produto de fermentação a partir da fermentação.

Os métodos da presente invenção podem ser usados para sacarificar o material celulósico em açúcares fermentáveis, e converter os açúcares fermentáveis em muitas substâncias utilizáveis, por exemplo, combustível, etanol potável e/ou produtos de fermentação (por exemplo, ácidos, álcoois, cetonas, gases e similares). A produção de um produto de fermentação desejado a partir do material celulósico envolve tipicamente o pré-tratamento, a hidrólise enzimática (sacarificação) e fermentação.

O processamento do material celulósico de acordo com a á presente invenção pode ser realizado usando processos convencionais na técnica.

Além do mais, os métodos da presente invenção podem ser * 5 implementados usando qualquer aparelho de processamento de biomassa

. convencional configurado para funcionar de acordo com a invenção.

A hidrólise (sacarificação) e fermentação, separada ou simultânea incluem, mas sem limitação, hidrólise separada e fermentação (SHF); sacarificação e fermentação simultâneas (SSF); sacarificação e co- fermentação simultâneas (SSCF); hidrólise híbrida e fermentação (HHF); hidrólise separada e co-fermentação (SHCF); hidrólise híbrida e co- fermentação (HHCF) e conversão microbiana direta (DMC). SHF usa etapas de processo separadas para primeiro hidrolisar enzimaticamente o material celulósico em açúcares fermentáveis, por exemplo, os açúcares glicose, celobiose, celotriose e pentose, e a seguir fermentar os açúcares fermentáveis : em etanol.

Em SSF, a hidrólise enzimática do material celulósico e a bh fermentação de açúcares em etanol são combinadas em uma etapa (Philippidis, G.

P., 1996, Cellulose bioconversion technology, em Handbook on Bioetanol: Production and Utilization, Wyman, C.

E., ed., Taylor & Francis, Washington, DC, 179-212). SSCF envolve a co-fermentação de açúcares múltiplos (Sheehan, J., e Himmel, M., 1999, Enzymes, energy and teh environment: A strategic perspective on the U.S.

Department of Energy's research and development activities for bioethanol, Biotechnol.

Prog. 15: 817- 827). HHF envolve uma etapa separada de hidrólise e, além disso, uma etapa —de sacarificação e hidrólise simultâneas que pode ser realizada no mesmo reator.

As etapas em um processo de HHF podem ser realizadas em diferentes temperaturas, isto é, sacarificação enzimática em temperatura elevada, seguido por SSF em uma temperatura mais baixa que a cepa da fermentação pode tolerar.

DMC combina todos os três processos (produção de enzima,

hidrólise e fermentação) em uma ou mais (várias) etapas, onde o mesmo organismo é usado para produzir as enzimas para conversão do material E: celulósico nos açúcares fermentáveis, e para converter os açúcares fermentáveis em um produto final (Lynd et al., 2002, Microbial cellulose utilization: Fundamentals and biotechnology, Microbiol. Mol. Biol. Reviews " 66: 506-577). Entende-se aqui que qualquer método conhecido na técnica que compreende o pré-tratamento, hidrólise enzimática (sacarificação), fermentação, ou uma combinação destes, pode ser usado para realizar os métodos da presente invenção.

Um aparelho convencional pode incluir um reator agitado em lote alimentado, um reator em lote agitado, um reator agitado de fluxo contínuo com ultrafiltração, e/ou um reator de coluna de fluxo em pistão contínuo (Corazza et al., 2003, Optimal control in fed-batch reactor for the cellobiose hydrolysis, Acta Scientiarum. Technology 25: 33-38; Gusakov and Sinitsyn, 1985, Kinetics of the enzymatic hydrolysis of cellulose: 1. A * mathematical model for a batch reactor process, Enz. Microb. Technol. 7: 346-352), um reator de atrito (Ryu e Lee, 1983, Bioconversion of waste cellulose by using a attrition bioreactor, Biotechnol. Bioeng. 25: 53-65), ou um reator com agitação intensiva induzida por um campo eletromagnético —(Gusakov etal., 1996, Enhancement of enzymatic cellulose hydrolysis using a novel type of bioreactor with intensive stirring induced by electromagnetic field, Appl. Biochem. Biotechnol. 56: 141-153). Os tipos de reatores adicionais incluem: reatores do tipo leito fluidizado, de manta com fluxo ascendente, imobilizado e extrudor para hidrólise e/ou fermentação.

Pré-tratamento. Na prática dos métodos da presente invenção, qualquer processo de pré-tratamento conhecido na técnica pode ser usado para romper os componentes das paredes celulares das plantas de material celulósico e/ou contendo xilano (Chandra et al., 2007, Substrate pretreatment: The key to effective enzymatic hydrolysis enzimática of lignocellulosics?

Adv. Biochem. Engin./Biotechnol. 108: 67-93; Galbe e Zacchi, 2007, Pretreatment of lignomaterial celulósicos for efficient bioethanol production, ? Adv. Biochem. Engin. / Biotechnol. 108: 41-65; Hendriks e Zeeman, 2009, Pretreatments to enhance the digestibility of lignocellulosic biomass, É 5 — Bioresource Technol. 100: 10-18; Mosier et al., 2005, Features of promising * technologies for pretreatment od lignocellulosic biomass, Bioresource Technol. 96: 673-686; Taherzadeh e Karimi, 2008, Pretreatment of lignocellulosic wastes to improve ethanol and biogas production: A review, Int. J. de Mol. Sci. 9: 1621-1651; Yang e Wyman, 2008, Pretreatment: The key to unlocking low-cost cellulosic ethanol, Biofuels Bioproducts nd Biorefining-Biofpr. 2: 26-40).

O material celulósico também pode ser submetido a redução de tamanho de partícula, pré-enxarcamento, umidificação, lavagem e/ou condicionamento antes do pré-tratamento usando os métodos conhecidos na técnica.

. Os pré-tratamentos convencionais incluem, mas sem limitação, pré-tratamento com vapor (com ou sem explosão), pré-tratamento com ácido diluído, pré-tratamento com água quente, pré-tratamento alcalino, pré- tratamento com cal, oxidação úmida, explosão úmida, explosão com fibra de amônia, pré-tratamento com organosolv e pré-tratamento biológico. Os pré- tratamentos adicionais incluem tratamentos com percolação com amônia, ultrassom, eletroporação, micro-ondas, CO, supercrítico, HO supercrítica, ozônio e irradiação gama.

O material celulósico pode ser pré-tratado antes da hidrólise e/ou fermentação. O pré-tratamento é preferivelmente realizado antes da hidrólise. — Alternativamente, o pré-tratamento pode ser realizado simultaneamente com hidrólise enzimática para liberar açúcares fermentáveis, tais como glicose, xilose e/ou celobiose. Em muitos casos a etapa de pré- tratamento resulta ela mesma em alguma conversão de biomassa em açúcares fermentáveis (mesmo na ausência de enzimas).

Pré-tratamento com vapor. No pré-tratamento com vapor, o : material celulósico é aquecido para romper os componentes das paredes celulares das plantas, incluindo lignina, hemicelulose e celulose, para tornar a á 5 celulose e outras frações, por exemplo, hemicelulose, acessíveis às enzimas. ã O material celulósico passa por um vaso de reação onde o vapor é injetado para aumentar a temperatura para a temperatura e a pressão exigidas e é mantido ali pelo tempo de reação desejado. O pré-tratamento com vapor é preferivelmente realizado a 140-230ºC, mais preferivelmente 160-200ºC, e acima de tudo preferivelmente 170-190ºC, onde a faixa de temperatura ideal depende de qualquer adição de um catalisador químico. O tempo de permanência para o pré-tratamento com vapor é preferivelmente 1-15 minutos, mais preferivelmente 3-12 minutos, e acima de tudo preferivelmente 4-10 minutos, onde o tempo de permanência ideal depende da faixa de temperatura e de qualquer adição de um catalisador químico. O pré- . tratamento com vapor permite carregamentos sólidos relativamente altos, de maneira tal que o material celulósico é úmido em geral apenas durante o pré- tratamento. O pré-tratamento com vapor é frequentemente combinado com uma descarga explosiva do material após o pré-tratamento, que é conhecida como explosão de vapor, isto é, queima rápida em pressão atmosférica e fluxo turbulento do material para aumentar a área de superfície acessível por fragmentação (Duff e Murray, 1996, Bioresource Technology 855: 1-33; Galbe e Zacchi, 2002, Appl. Microbiol. Biotechnol. 59: 618-628; pedido de patente U.S. 2002/0164730). Durante o pré-tratamento com vapor, os grupos de acetil hemicelulose são clivados e o ácido resultante auto-catalisa a hidrólise parcial da hemicelulose em monossacarídeos e oligossacarídeos. A lignina é removida em apenas uma extensão limitada. Um catalisador, tal como H3SO, ou SO, (tipicamente 0,3 a 3 % p/p), é em geral adicionado ao pré-tratamento com vapor que diminui o tempo e a temperatura, aumenta a recuperação e melhora a hidrólise enzimática (Ballesteros et al., 2006, Appl. Biochem. Biotechnol. 129-132: Z 496-508; Varga et al., 2004, Appl. Biochem. Biotechnol. 113-116: 509-523; Sassner et al., 2006, Enzyme Microb. Technol. 39: 7156-762). f 5 Pré-tratamento químico: O termo “tratamento químico” refere- ? se a qualquer pré-tratamento químico que promove a separação e/ou liberação de celulose, hemicelulose e/ou lignina. Exemplos de processo de pré- tratamento químico adequados incluem, por exemplo, pré-tratamento com ácido diluído, pré-tratamento com cal, oxidação úmida, explosão de fibra com —amônia/congelamento (AFEX), percolação com amônia (APR) e pré- tratamentos com organosolv.

No pré-tratamento com ácido diluído, o material celulósico é misturado com o ácido diluído, tipicamente H2SO,, e água para formar uma lama, aquecido por vapor na temperatura desejada, e após um tempo de permanência é queimado em pressão atmosférica. O pré-tratamento com ácido * diluído pode ser realizado com inúmeros projetos de reator, por exemplo, reatores de fluxo em pistão, reatores contra corrente, ou reatores de leito : agitado em contra corrente contínua (Duff e Murray, 1996, supra; Schell er al., 2004, Bioresource Technol. 91: 179-188; Lee et al., 1999, Adv. Biochem.

Eng Biotechnol. 65: 93-115).

Vários métodos de pré-tratamento em condições alcalinas também podem ser usados. Estes pré-tratamentos alcalinos incluem, mas sem limitação, pré-tratamento com cal, oxidação úmida, percolação com amônia (APR), e explosão de fibra com amônia/congelamento (AFEX).

O pré-tratamento com cal é realizado com carbonato de cálcio, hidróxido de sódio, ou amônia em baixas temperaturas de 85-150ºC e tempo de permanência de | hora a vários dias (Wyman et al., 2005, Bioresource Technol. 96: 1959-1966; Mosier et al., 2005, Bioresource Technol. 96: 673- 686). WO 2006/110891, WO 2006/110899, WO 2006/110900, e WO

2006/110901 revelam métodos de pré-tratamento que usa amônia. A oxidação úmida é um pré-tratamento térmico realizado S tipicamente a 180-200ºC por 5-15 minutos com a adição de um agente oxidante, tal como peróxido de hidrogênio ou superpressão de oxigênio ás 5 (Schmidt e Thomsen, 1998, Bioresource Technol. 64: 139-151; Palonen et al., º 2004, Appl. Biochem. Biotechnol. 117: 1-17; Varga et al., 2004, Biotechnol. Bioeng. 88: 567-574; Martin et al., 2006, J. Chem. Technol. Biotechnol. 81: 1669-1677). O pré-tratamento é realizado preferivelmente em 1-40 % de material seco, mais preferivelmente 2-30 % de material seco, e acima de tudo preferivelmente 5-20 % de material seco, e frequentemente o pH inicial aumenta pela adição de álcali, tal como carbonato de sódio.

Uma modificação do método de pré-tratamento com oxidação úmida, conhecido como explosão úmida (combinação de explosão de oxidação úmida e vapor), pode manusear material seco até 30 %. Na explosão úmida, o agente oxidante é introduzido durante o pré-tratamento após um : certo tempo de permanência. O pré-tratamento é então finalizado queimando em pressão atmosférica (WO 2006/032282). : A explosão de fibra com amônia (AFEX) envolve tratar o material celulósico com amônia líquida ou gasosa em temperaturas — moderadas, tal como 90-100ºC, e alta pressão tal como 17-20 bar por 5-10 minutos, onde o conteúdo do material seco pode ser tão alto quanto 60 % (Gollapalli et al., 2002, Appl. Biochem. Biotechnol. 98: 23-35; Chundawat et al., 2007, Biotechnol. Bioeng. 96: 219-231; Alizadeh et al., 2005, Appl. Biochem. Biotechnol. 121: 1133-1141; Teymouri et al., 2005, Bioresource Technol. 96: 2014-2018). O pré-tratamento com AFEX resulta na despolimerização de celulose e hidrólise parcial de hemicelulose. Os complexos de lignina-carboidrato são clivados.

O pré-tratamento com organosolv delignifica o material celulósico por extração usando etanol aquoso (40-60 % etanol) a 160-200ºC por 30-60 minutos (Pan et al., 2005, Biotechnol. Bioeng. 90: 473-481; Pan et al., 2006, Biotechnol. Bioeng. 94: 851-861; Kurabi et al., 2005, Appl. : Biochem. Biotechnol. 121: 219-230). O ácido sulfúrico é em geral adicionado como um catalizador. Em pré-tratamento com organosolv, a maioria da Í 5 — hemicelulose é removida. : Outros exemplos de métodos de pré-tratamento adequados são descritos por Schell et al., 2003, Appl. Biochem. e Biotechnol. Vol. 105-108, p. 69-85, e Mosier et al., 2005, Bioresource Technology 96: 673-686, e pedido publicado U.S. 2002/0164730.

Em um aspecto, o pré-tratamento químico é realizado preferivelmente como um tratamento ácido e, mais preferivelmente, como um tratamento com ácido diluído contínuo e/ou fraco. O ácido é tipicamente ácido sulfúrico, mas outros ácidos também podem ser usados, tais como ácido acético, ácido cítrico, ácido nítrico, ácido fosfórico, ácido tartárico, ácido — succínico, cloreto de hidrogênio ou misturas destes. O tratamento com ácido : fraco é conduzido na faixa de pH de preferivelmente 1-5, mais : preferivelmente 1-4, e acima de tudo preferivelmente 1-3. Em um aspecto, a concentração do ácido está na faixa de preferivelmente 0,01 a 20 % em peso de ácido, mais preferivelmente 0,05 a 10 % em peso de ácido, ainda mais preferivelmente 0,1 a 5% em peso de ácido, e acima de tudo preferivelmente 0,2 a 2,0 % em peso de ácido. O ácido é colocado em contato com material celulósico e mantido a uma temperatura na faixa de preferivelmente 160- 220ºC, e mais preferivelmente 165-195ºC, por períodos que variam de segundos a minutos, por exemplo, 1 segundo a 60 minutos.

Em um outro aspecto, pré-tratamento é realizado como uma etapa de explosão de fibra (etapa de pré-tratamento com AFEX).

Em um outro aspecto, o pré-tratamento ocorre em uma lama aquosa. Em aspectos preferidos, o material celulósico está presente durante o pré-tratamento em quantidades preferivelmente entre 10-80 % em peso, mais preferivelmente entre 20-70 % em peso, e acima de tudo preferivelmente entre 30-60 % em peso, tal como em torno de 50 % em peso. O material é celulósico pré-tratado pode ser não lavado ou lavado usando qualquer método conhecido na técnica, por exemplo, lavado com água. = 5 Pré-tratamento mecânico: O termo “pré-tratamento mecânico” A refere-se a vários tipos de trituração ou moagem (por exemplo, moagem a seco, moagem úmida, ou moagem com bola vibratória). Pré-tratamento físico: O termo “pré-tratamento físico” refere- se a qualquer pré-tratamento que promove a separação e/ou liberação de celulose, hemicelulose, e/ou lignina do material celulósico ou contendo xilano. Por exemplo, o pré-tratamento físico pode envolver irradiação (por exemplo, irradiação por micro-ondas), explosão vaporosa/vapor, hidrotermólise e combinações destes.

O pré-tratamento físico pode envolver alta pressão e/ou alta temperatura (explosão por vapor). Em um aspecto, alta pressão significa : pressão na faixa de preferivelmente cerca de 300 a cerca de 600 psi, mais É preferivelmente cerca de 350 a cerca de 550 psi, e acima de tudo preferivelmente cerca de 400 a cerca de 500 psi, tal como em torno de 450 psi. Em um outro aspecto, alta temperatura significa temperaturas na faixa de — cercade 100 a cerca de 300ºC, preferivelmente cerca de 140 a cerca de 235ºC. Em um aspecto preferido, o pré-tratamento mecânico é realizado em um processo em lotes, sistema hidrolisador de arma a vapor que usa alta pressão e alta temperatura da maneira definida anteriormente, por exemplo, um hidrolisador Sunds disponível pela Sunds Defibrator AB, Suécia.

Pré-tratamento químico e físico combinado: O material celulósico pode ser pré-tratado tanto física quanto quimicamente. Por exemplo, a etapa de pré-tratamento pode envolver o tratamento com ácido fraco ou diluído e tratamento com alta temperatura e/ou pressão. Os pré- tratamentos físicos e químicos podem ser realizados sequencialmente ou simultaneamente, da maneira desejada. Um pré-tratamento mecânico também pode ser incluído. Dessa maneira, em um aspecto preferido, o material celulósico é submetido aos pré-tratamento mecânico, químico ou físico, ou qualquer combinação destes, para promover a separação e/ou liberação de celulose, * hemicelulose e/ou lignina.

Pré-tratamento biológico: O termo “pré-tratamento biológico” refere-se a qualquer pré-tratamento biológico que promove a separação e/ou liberação de celulose, hemicelulose e/ou lignina do material celulósico ou contendo xilano. As técnicas de pré-tratamento biológico podem envolver aplicar microrganismos que solubilizam lignina (ver, por exemplo, Hsu, T.- A., 1996, Pretreatments of biomass, em Handbook on Bioethanol: Production and Utilization, Wyman, C. E., ed., Taylor & Francis, Washington, DC, 179- 212; Ghosh e Singh, 1993, Physicochemical and biological treatments for enzymatic/microbial conversion of cellulosic biomass, Adv. Appl. Microbiol.

: 39: 295-333; McMillan, J. D., 1994, Pretreating lignocellulosic biomass: a review, em Enzymatic Conversion of Biomass for Fuels Production, Himmel, Ê M. E., Baker, J. O., e Overend, R. P., eds., ACS Symposium Series 566, American Chemical Society, Washington, DC, capítulo 15; Gong, C. S., Cao, NJ, Du J, e Tsao, G. T., 1999, Ethanol production from renewable resources, em Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, Scheper, T,, ed., Springer-Verlag Berlin Heidelberg, Alemanha, 65: 207-241; Olsson e Hahn-Hagerdal, 1996, Fermentation of lignocellulosic hydrolysates for ethanol production, Enz. Microb. Tech. 18: 312-331; e Vallander e Eriksson, 1990, Production of ethanol from lignomaterial celulósicos: State of the art, Adv. Biochem. Eng./Biotechnol. 42: 63-95).

Sacarificação. Na etapa da hidrólise, também conhecida como sacarificação, o material celulósico ou contendo xilano, por exemplo, pré- tratado, é hidrolisado para quebrar a celulose e, alternativamente também,

hemicelulose em açúcares fermentáveis, tais como glicose, celobiose, xilose, xilulose, arabinose, manose, galactose e/ou oligossacarídeos solúveis. À . hidrólise é realizada enzimaticamente por uma composição de enzimas na presença de um polipeptídeo com atividade de celobioidrolase da presente É 5 invenção. As enzimas das composições podem ser adicionadas S sequencialmente.

A hidrólise enzimática é realizada preferivelmente em um ambiente aquoso adequado em condições que podem ser facilmente determinadas pelos versados na técnica. Em um aspecto, a hidrólise é realizada em condições adequadas para a atividade da(s) enzima(s), isto é, ideal para a(s) enzima(s). A hidrólise pode ser realizada como um processo em lote alimentado ou contínuo, onde o material celulósico é alimentado gradualmente, por exemplo, por uma enzima contendo a solução de hidrólise.

A sacarificação é realizada em geral em reatores de tanque agitado ou fermentadores em pH, temperatura e condições de mistura E controlados. O tempo do processo, temperatura e condições de pH adequados podem ser facilmente determinados pelos versados na técnica. Por exemplo, a sacarificação pode durar até 200 horas, mas é tipicamente realizada de maneira preferível em cerca de 12 a cerca de 96 horas, mais preferivelmente — cercade 16 acerca de 72 horas, e acima de tudo preferivelmente cerca de 24 a cerca de 48 horas. A temperatura está na faixa de preferivelmente cerca de 25ºC a cerca de 70ºC, mais preferivelmente cerca de 30ºC a cerca de 65ºC, e mais preferivelmente cerca de 40ºC a 60ºC, em particular cerca de 50ºC. O pH está na faixa de preferivelmente cerca de 3 a cerca de 8, mais preferivelmente cerca de 3,5 a cerca de 7, e acima de tudo preferivelmente cerca de 4 a cerca de 6, em particular cerca de pH 5. O teor dos sólidos secos está na faixa de preferivelmente cerca de 5 a cerca de 50 % em peso, mais preferivelmente cerca de 10 a cerca de 40 % em peso, e acima de tudo preferivelmente cerca de 20 a cerca de 30 % em peso.

Fermentação.

Os açúcares fermentáveis obtidos do material celulósico hidrolisado podem ser fermentados por um ou mais (vários) í microrganismos fermentadores capazes de fermentar o açúcares direta ou indiretamente em um produto de fermentação desejado. “Fermentação” ou í 5 — “processo de fermentação” refere-se a qualquer processo de fermentação ou ; qualquer processo que compreende uma etapa de fermentação.

Processos de fermentação também incluem processos de fermentação usados na indústria de consumo de álcool (por exemplo, cerveja e vinho), indústria de panificação (por exemplo, produtos de panificação fermentados), indústria de couro e indústria do tabaco.

As condições de fermentação dependem do produto de fermentação desejado e do organismo fermentador, e podem ser facilmente determinadas pelos versados na técnica.

Na etapa de fermentação, os açúcares, liberados do material celulósico como um resultado das etapas de pré-tratamento e hidrólise enzimática e, são fermentados em um produto, por exemplo, etanol, por um : organismo fermentador, tal como levedura.

A hidrólise (sacarificação) e fermentação podem ser separadas ou simultâneas, da maneira descrita aqui.

Qualquer material celulósico hidrolisado adequado pode ser usado na etapa de fermentação na prática da presente invenção.

O material é em pgeral selecionado com base no produto de fermentação desejado, isto é, a substância a ser obtida da fermentação, e no processo empregado, da maneira bem conhecida na técnica.

Entende-se aqui que o termo “meio de fermentação” refere-se a um meio antes do(s) microrganismo(s) fermentador(s) ser(m) adicionado(s), — tal comoum meio que resulta de um processo de sacarificação, bem como um meio usado em um processo de sacarificação e fermentação simultânea (SSF). “Microrganismo — fermentador” — refere-se a qualquer microrganismo, incluindo organismos bacterianos e fúngicos, adequados para uso em um processo de fermentação desejado para produzir um produto de fermentação. O organismo fermentador pode ser organismos fermentadores de C; e/ou Cs, ou uma combinação destes. Tanto os organismos E fermentadores C; quanto C; são bem conhecidos na técnica. Os microrganismos fermentadores adequados são capazes de fermentar, isto é, É 5 convertes, açúcares, tais como glicose, xilose, xilulose, arabinose, maltose, manose, galactose, ou oligossacarídeos, direta ou indiretamente no produto de fermentação desejado.

Exemplos de organismos fermentadores bacterianos e fúngicos que produzem etanol são descritos por Lin et al., 2006, Appl. Microbiol.

—Biotechnol. 69: 627-642.

Exemplos de microrganismos fermentadores que podem fermentar açúcares C; incluem organismos bacterianos e fúngicos, tal como levedura. As leveduras preferidas incluem cepas de Saccharomyces Spp., preferivelmente Saccharomyces cerevisiae.

Exemplos de organismos fermentadores que podem fermentar : açúcares Cs incluem organismos bacterianos e fúngicos, tais como algumas leveduras. As leveduras que fermentam Cs; preferidas incluem cepas de Pichia, preferivelmente Pichia stipitis, tal como Pichia stipitis CBS 5773; cepas de Candida, preferivelmente Candida boidinii, Candida brassicae, Candida sheatae, Candida diddensii, Candida pseudotropicalis, ou Candida utilis.

Outros “organismos fermentadores incluem cepas de Zymomonas, tal como Zymomonas mobilis; Hansenula, tal como Hansenula anomala; Kluyveromyces, tal como K. fragilis; Schizosaccharomyces, tal como SS pombe; E. coli, especialmente cepas de E. coli que foram geneticamente modificadas para melhorar o rendimento de etanol; Clostridium, tais como Clostridium acetobutylicum, Chlostridium thermocellum e Chlostridium phytofermentins, Geobacillus sp., Thermoanaerobacter, tal como Thermoanaerobacter saccharolyticum; e

Bacillus, tal como Bacillus coagulans. Em um aspecto preferido, a levedura é uma Saccharomyces : spp. Em um aspecto mais preferido, a levedura é Saccharomyces cerevisiae. Em um outro aspecto mais preferido, a levedura é Saccharomyces distaticus. ! 5 Emum outro aspecto mais preferido, a levedura é Saccharomyces uvarum. Em um outro aspecto preferido, a levedura é um Kluyveromyces. Em um outro aspecto mais preferido, a levedura é Kluyveromyces marxianus. Em um outro aspecto mais preferido, a levedura é Kluyveromyces fragilis. Em um outro aspecto preferido, a levedura é um Candida. Em um outro aspecto mais preferido, a levedura é Candida boidinii. Em um outro aspecto mais preferido, a levedura é Candida brassicae. Em um outro aspecto mais preferido, a levedura é Candida diddensil. Em um outro aspecto mais preferido, a levedura é Candida pseudotropicalis. Em um outro aspecto mais preferido, a levedura é Candida utilis. Em um outro aspecto preferido, a levedura é um

15. Clavispora. Em um outro aspecto mais preferido, a levedura é Clavispora : lusitaniae. Em um outro aspecto mais preferido, a levedura é Clavispora opuntiae. Em um outro aspecto preferido, a levedura é uma Pachysolen. Em um outro aspecto mais preferido, a levedura é Pachysolen tannophilus. Em um outro aspecto preferido, a levedura é uma Pichia. Em um outro aspecto mais preferido, a levedura é uma Pichia stipitis. Em um outro aspecto preferido, a levedura é uma Bretannomyces. Em um outro aspecto mais preferido, a levedura é Bretannomyces clausenii (Philippidis, G. P., 1996, Cellulose bioconversion technology, em Handbook on Bioethanol: Production and Utilization, Wyman, C. E., ed., Taylor & Francis, — Washington, DC, 179-212).

As bactérias que podem fermentar de maneira eficiente a hexose e pentose em etanol incluem, por exemplo, Zymomonas mobilis, Clostridium —acetobutylicum, Clostridium thermocellum, Chlostridium phytofermentans, Geobacillus sp., Thermoanaerobacter saccharolyticum, e

Bacillus coagulans (Philippidis, 1996, supra).

Em um aspecto preferido, a bactéria é uma Zymomonas. Em . um aspecto mais preferido, a bactéria é Zymomonas mobilis. Em um outro aspecto preferido, a bactéria é um Clostridium. Em um outro aspecto mais é 5 — preferido, a bactéria é Clostridium thermocellum.

As leveduras adequadas disponíveis comercialmente para a produção de etanol inclui, por exemplo, levedura ETANOL RED'TY (Fermentis/Lesaffre, USA), FALI"M (Fleischmann's Yeast, USA), levedura fresca SUPERSTART!M e THERMOSACC'Y (Ethanol Technology, WI, USA), BIOFERM'Y AFT e XR (NABC - North American Bioproducts Corporation, GA, USA), GERT STRAND'Y (Gert Strand AB, Sweden) e FERMIOL'Y (DSM Specialties).

Em um aspecto preferido, o microrganismo fermentador foi geneticamente modificado para fornecer a capacidade de fermentar açúcares —pentose, tais como como microrganismos que utilizam xilose, que utilizam : arabinose e que co-utilizam xilose e arabinose.

A clonagem de genes heterólogos em vários microrganismos fermentadores levou à construção de organismos capazes de converter hexoses e pentoses em etanol (co-fermentação) (Chen e Ho, 1993, Cloning and improving the expression of Pichia stipitis xylose reductase gene in Saccharomyces cerevisiae, Appl. Biochem. Biotechnol. 39-40: 135-147; Ho et al., 1998, Genetically engineered Saccharomyces yeast capable of effectively cofermenting glucose and xylose, Appl. Environ. Microbiol. 64: 1852-1859; Kotter e Ciriacy, 1993, Xylose fermentation by Saccharomyces cerevisiae, Appl. Microbiol. Biotechnol. 38: 776-783; Walfridsson et al., 1995, Xylose- metabolizing Saccharomyces cerevisiae strains overexpressing the TKL1 and TAL! genes encoding the pentose fosfato pathway enzymes transketolase and transaldolase, Appl. Environ. Microbiol. 61: 4184-4190; Kuyper et al., 2004, Minimal metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae for efficient anaerobic xylose fermentation: a proof of principle, FEMS Yeast Research 4: 655-664; Beall et al., 1991, Parametric studies of ethanol production from : xylose and other sugars by recombinant Escherichia coli, Biotech.

Bioeng. 38: 296-303; Ingram et al., 1998, Metabolic engineering of bacteria for ethanol É 5 production, Biotechnol.

Bioeng. 58: 204-214; Zhang et al., 1995, Metabolic engineering of a pentose metabolism pathway in ethanologenic Zymomonas mobilis, Science 267: 240-243; Deanda et al., 1996, Development of an arabinose-fermenting Zymomonas mobilis strain by metabolic pathway engineering, Áppl.

Environ.

Microbiol. 62: 4465-4470; WO 2003/062430, —xiloseisomerase). Em um aspecto preferido, o microrganismo fermentador geneticamente modificado é Saccharomyces cerevisiae.

Em um outro aspecto preferido, o microrganismo fermentador geneticamente modificado é Zymomonas mobilis.

Em um outro aspecto preferido, o microrganismo fermentador geneticamente modificado é Escherichia coli.

Em um outro : aspecto preferido, o microrganismo fermentador geneticamente modificado é ' Klebsiella oxytoca.

Em um outro aspecto preferido, o microrganismo fermentador geneticamente modificado é Kluyveromyces sp.

Sabe-se bem na técnica que os organismos descritos anteriormente também podem ser usados para produzir outras substâncias, da maneira descrita aqui.

O microrganismo fermentador é tipicamente adicionado à lignocelulose degradada ou hidrolisado e a fermentação é realizada por cerca de 8 a cerca de 96 horas, tal como cerca de 24 a cerca de 60 horas.

À temperatura está tipicamente entre cerca de 26ºC a cerca de 60ºC, em particular cerca de 32ºC ou 50ºC, e em cerca de pH 3 a cerca de pH 8, tal como em torno de pH 4-5, 6, ou 7. Em um aspecto preferido, a levedura e/ou um outro microrganismo é aplicado ao material celulósico degradado e a fermentação é realizada por cerca de 12 a cerca de 96 horas, tal como tipicamente 24-60 horas. Em um aspecto preferido, o temperatura está preferivelmente entre : cerca de 20ºC a cerca de 60ºC, mais preferivelmente cerca de 25ºC a cerca de 50ºC, e acima de tudo preferivelmente cerca de 32ºC a cerca de 50ºC, em ; 5 — particular cerca de 32ºC ou 50ºC, e o pH está em geral em cerca de pH 3 a cerca de pH 7, preferivelmente em torno de pH 4-7. Entretanto, alguns organismos fermentadores, por exemplo, bactérias, apresentam maior temperatura ideal de fermentação. A levedura ou um outro microrganismo que preferivelmente aplicado em quantidades de aproximadamente 10 a 10”, de maneira preferível de aproximadamente 10º a 10º, de maneira essencial aproximadamente contagens de 2 x 10º células viáveis por mL de caldo de fermentação. Diretriz adicional com relação ao uso de levedura para a fermentação pode ser encontrada em, por exemplo, “The Alcohol Textbook” (Editors K. Jacques, T.P. Lyons e D.R. Kelsall, Nottingham University Press,

15. Reino Unido 1999), que é aqui incorporado pela referência.

. Para a produção de etanol, após a fermentação, a lama fermentada é destilada para extrair o etanol. O etanol obtido de acordo com os métodos da invenção pode ser usado, por exemplo, como combustível etanol, etanol para bebidas, isto é, espíritos neutros potáveis ou etanol industrial.

Um estimulador de fermentação pode ser usado em combinação com qualquer dos processos aqui descritos para melhorar adicionalmente o processo de fermentação e, em particular, o desempenho do microrganismo fermentador, tal como, melhoria da taxa e rendimento de etanol. Um “estimulador de fermentação” refere-se aos estimuladores para — crescimento dos microrganismos fermentadores, em particular, leveduras. Os estimuladores de fermentação preferíveis para crescimento incluem vitaminas e minerais. Exemplos de vitaminas incluem multivitaminas, biotina, pantotenato, ácido nicotínico, meso-inositol, tiamina, piridoxina, ácido para- aminobenzóico, ácido fólico, riboflavina e vitaminas A, B, C, D, e E. Ver, por exemplo, Alfenore et al., Improving ethanol production and viability of Saccharomyces cerevisiae by a vitamin feeding strategy during fed-batch process, Springer-Verlag (2002), que é aqui incorporado pela referência. Exemplos de minerais incluem minerais e sais minerais que podem suprir : S nutrientes que compreendem P, K, Mg, S, Ca, Fe, Zn, Mn, e Cu.

Produtos de fermentação: Um produto de fermentação pode ser qualquer substância derivada da fermentação. O produto de fermentação pode ser, sem limitação, um álcool (por exemplo, arabinitol, butanol, etanol, glicerol, metanol, 1,3-propanediol, sorbitol e xilitol); um ácido orgânico (por exemplo, ácido acético, ácido acetônico, ácido adípico, ácido ascórbico, ácido cítrico, ácido 2,5-diceto-D-glucônico, ácido fórmico, ácido fumárico, ácido glucárico, ácido glucônico, ácido glucurônico, ácido glutárico, ácido 3- hidroxipropiônico, ácido itacônico, ácido lático, ácido málico, ácido malônico, ácido oxálico, ácido oxaloacético, ácido propiônico, ácido —succeínico e ácido xilônico); uma cetona (por exemplo, acetona); um 2” aminoácido (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico, glicina, lisina, serina e treonina) e um gás (por exemplo, metano, hidrogênio (H>), dióxido de carbono (CO;) e monóxido de carbono (CO)). O produto de fermentação também pode ser proteína como um produto de alto valor.

Em um aspecto preferido, o produto de fermentação é um álcool. Será entendido que o termo “álcool” inclui uma substância que contém uma ou mais frações hidroxila. Em um aspecto mais preferido, o álcool é arabinitol. Em um outro aspecto mais preferido, o álcool é butanol. Em um outro aspecto mais preferido, o álcool é etanol. Em um outro aspecto mais — preferido, o álcool é glicerol. Em um outro aspecto mais preferido, o álcool é metanol. Em um outro aspecto mais preferido, o álcool é 1,3-propanediol. Em um outro aspecto mais preferido, o álcool é sorbitol. Em um outro aspecto mais preferido, o álcool é xilitol. Ver, por exemplo, Gong, C. S., Cao, N. J., Du, J., e Tsao, G. T., 1999, Ethanol production from renewable resources, em

Advances em Biochemical Engineering/Biotechnology, Scheper, T., ed.

Springer-Verlag Berlin Heidelberg, Alemanha, 65: 207-241; Silveira, M.

M., ã e Jonas, R., 2002, The biotechnological production of sorbitol, Appl.

Microbiol.

Biotechnol. 59: 400-408; Nigam e Singh, 1995, Processs for — fermentative production of xilitol — a sugar substitute, Process Biochemistry 30 (2): 117-124; Ezeji et al., 2003, Production of acetone, butanol and ethanol by Clostridium beijerinckii BAIO1 e in situ recovery by gas stripping, World

Journal of Microbiology and Biotechnology 19 (6): 595-603. Em um outro aspecto preferido, o produto de fermentação é um ácido orgânico.

Em um outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido acético.

Em um outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido acetônico.

Em um outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido adípico.

Em um outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido ascórbico.

Em um outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido cítrico.

Em um outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido 2,5- : diceto-D-glucônico.

Em um outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é É ácido fórmico.

Em um outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido fumárico.

Em um outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido glucárico.

Em um outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido —glucônico.

Em um outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido glucurônico.

Em um outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido glutárico.

Em um outro aspecto preferido, o ácido orgânico é ácido 3- hidroxipropiônico.

Em um outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido itacônico.

Em um outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é — ácido lático.

Em um outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido málico.

Em um outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido malônico.

Em um outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido oxálico.

Em um outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido propiônico.

Em um outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido s3 sucínico. Em um outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido xilônico. Ver, por exemplo, Chen e Lee, 1997, Membrane-mediated extractive . fermentation for lactic acid production from cellulosie biomass, Appl. Biochem. Biotechnol. 63-65: 435-448.

3 Em um outro aspecto preferido, o produto de fermentação é uma cetona. Será entendido que o termo “cetona” inclui uma substância que contém uma ou mais frações de cetona. Em um outro aspecto mais preferido, a cetona é acetona. Ver, por exemplo, Qureshi e Blaschek, 2003, supra.

Em um outro aspecto preferido, o produto de fermentação é um aminoácido. Em um outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido aspártico. Em um outro aspecto mais preferido, o aminoácido é ácido glutâmico. Em um outro aspecto mais preferido, o aminoácido é glicina. Em um outro aspecto mais preferido, o aminoácido é lisina. Em um outro aspecto mais preferido, o aminoácido é serina. Em um outro aspecto mais preferido, o aminoácido é treonina. Ver, por exemplo, Richard e Margaritis, 2004, é Empirical modeling of batch fermentation kinetics for poly(glutamic acid) : production and other microbial biopolymers, Biotechnology e Bioengineering 87 (4): 501-515.

Em um outro aspecto preferido, o produto de fermentação é um gás. Em um outro aspecto mais preferido, o gás é metano. Em um outro aspecto mais preferido, o gás é H7. Em um outro aspecto mais preferido, o gás é CO». Em um outro aspecto mais preferido, o gás é CO. Ver, por exemplo, Kataoka et al., 1997, Studies on hidrogen production by continuous culture system of hidrogen-producing anaerobic bacteria, Water Science and Technology 36 (6-7): 41-47; e Gunaseelan, 1997, em Biomass and Bioenergy, 13 (1-2), 83-114, Anaerobic digestion of biomass for methane production: a review. Recuperação. O(s) produto(s) de fermentação pode(m) ser opcionalmente recuperado(s) do meio de fermentação usando qualquer método conhecido na técnica incluindo, mas sem limitação, cromatografia, procedimentos * eletroforéticos, solubilidade diferencial, destilação ou E extração. Por exemplo, o álcool é separado do material celulósico fermentado e purificado por métodos convencionais de destilação. O etanol com uma ; 5 — pureza de até cerca de 96 vol. % pode ser obtido, o qual pode ser usado, por exemplo, como combustível etanol, etanol para bebidas, isto é, espíritos neutros potáveis ou etanol industrial.

Peptídeo sinal A presente invenção também diz respeito a um polinucleotídeo isolado que codifica um peptídeo sinal compreendendo ou consistindo nos aminoácidos | a 18 de SEQ ID NO: 2, ou 1 a 25 de SEQ IDNO: 4. Em um aspecto, o polinucleotídeo apresenta os nucleotídeos 1 a 54 de SEQ ID NO: 1 ou 1 a 75 de SEQ ID NO: 3. Os polinucleotídeos podem compreender adicionalmente um gene que codifica uma proteína, que é operavelmente ligado ao peptídeo sinal.

. A presente invenção também diz respeito aos construtos de ácido nucleico, expressão vetores e células hospedeiras recombinantes que compreendem tais polinucleotídeos.

A presente invenção também diz respeito aos métodos de — produzir uma proteína compreendendo: (a) cultivar uma célula hospedeira recombinante que compreende um polinucleotídeo como este, operavelmente ligado a um gene que codifica a proteína; e (b) recuperar o proteína. A proteína pode ser natural ou heteróloga a uma célula hospedeira. O termo “proteína” não significa aqui que se refere a um tamanho — específico do produto codificado e, portanto, inclui peptídeos, oligopeptídeos, e polipeptídeos. O termo “proteína” também inclui dois ou mais polipeptídeos combinados para formar o produto codificado. As proteínas também incluem polipeptídeos híbridos e polipeptídeos fundidos. Preferivelmente, a proteína é um hormônio ou variante deste,

enzima, receptor ou porção deste, anticorpo ou porção deste, ou repórter.

Por exemplo, a proteína pode ser uma oxidorredutase, transferase, hidrolase, liase, : isomerase, ou ligase tal como uma aminopeptidase, amilase, carboidrase, carboxipeptidase, catalase, celulase, quitinase, cutinase, ciclodextrina S 5 glicosiltransferase, desoxirribonuclease, esterase, alfa-galactosidase, beta- galactosidase, glicoamilase, alfa-glucosidasc, beta-glucosidase, invertase, laccase, uma outra lipase, manosidase, mutanase, oxidase, enzima pectinolítica, peroxidase, fitase, polifenoloxidase, enzima proteolítica, ribonuclease, transglutaminase ou xilanase.

O gene pode ser obtido de qualquer procarioto, eucarioto, ou outra fonte.

Lista das modalidades preferidas.

Modalidade 1. Um polipeptídeo isolado que apresenta atividade de celobioidrolase selecionado do grupo que consiste em: (a) um polipeptídeo que apresenta pelo menos 90 % de : identidade de sequência com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2, ou um polipeptídeo que apresenta pelo menos 80 % de identidade de sequência com : o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 4; (b) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo que — apresenta pelo menos 90 % de identidade de sequência com a sequência que codifica o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1, ou a sequência de DNAc deste, ou um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo que apresenta pelo menos 80 % de identidade de sequência com a sequência que codifica o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 3 ou a sequência de DNA genômico deste; (c) um variante que compreende uma substituição, eliminação e/ou inserção de um ou mais (vários) aminoácidos do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 ou de SEQ ID NO: 4; e (d) um fragmento do polipeptídeo de (a), (b), ou (c) que

9% apresenta atividade de celobioidrolase. Modalidade 2. O polipeptídeo da modalidade 1, que apresenta ” pelo menos 90 %, por exemplo pelo menos 92 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 %, ou 100 —“%deidentidade de sequência com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2.

Modalidade 3. O polipeptídeo da modalidade 1, que apresenta pelo menos 80 %, por exemplo pelo menos 85 %, pelo menos 87 %, pelo menos 90 %, pelo menos 92 %, pelo menos 95 %, por exemplo, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 %, ou 100 % de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 4.

Modalidade 4. Os polipeptídeos de qualquer das modalidades 1-3, que compreende ou que consiste em SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO. 4.

Modalidade 5. Os polipeptídeos da modalidade 4, que compreendem ou que consistem no polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 ou 155 SEQIDNO:4.

' Modalidade 6. Os polipeptídeos da modalidade 5, em que o polipeptídeo maduro apresenta os aminoácidos 19 a 455 de SEQ ID NO: 2 ou 26 a 537 de SEQ ID NO: 4.

Modalidade 7. Um polipeptídeo isolado que compreende um — domínio catalítico selecionado do grupo que consiste em: (a) um domínio catalítico que apresenta pelo menos 90 % de identidade de sequência com o domínio catalítico de SEQ ID NO: 2, ou um domínio catalítico que apresenta pelo menos 80 % de identidade de sequência com o domínio catalítico de SEQ ID NO: 4; (b) um domínio catalítico codificado por um polinucleotídeo que apresenta pelo menos 90 % de identidade de sequência com a sequência que codifica o domínio catalítico de SEQ ID NO: 1, ou um domínio catalítico codificado por um polinucleotídeo que apresenta pelo menos 80 % de identidade de sequência com a sequência que codifica o domínio catalítico de

SEQ ID NO: 3; (c) um variante de um domínio catalítico que compreende uma e substituição, eliminação e/ou inserção de um ou mais (vários) aminoácidos do domínio catalítico de SEQ ID NO: 2 ou de SEQ ID NO: 4; e É 5 (d) um fragmento de um domínio catalítico de (a), (b), ou (c), que apresenta atividade de celobioidrolase.

Modalidade 8. O polipeptideco da modalidade 7, que compreende ou que consiste no domínio catalítico de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4. Modalidade 9. O polipeptídeo da modalidade 8, em que o domínio catalítico apresenta os aminoácidos 19 a 455 de SEQ ID NO: 2 ou 26 a 465 de SEQ ID NO: 4. Modalidade 10. O polipeptídeo de qualquer das modalidades 7-9, que compreende adicionalmente um domínio de ligação à celulose.

Modalidade 11. Uma composição que compreende o : polipeptídeo de qualquer das modalidades 1-10. ó Modalidade 12. Um polinucleotídeo isolado que codifica o polipeptídeo de qualquer das modalidades 1-10. Modalidade 13. Um construto de ácido nucleico ou vetor de expressão que compreende o polinucleotidco da modalidade 12 operavelmente ligado a uma ou mais (várias) sequências controle, que direcionam a produção do polipeptídeo em um hospedeiro de expressão.

Modalidade 14. Uma célula hospedeira recombinante que compreende o polinucleotídeo da modalidade 12 operavelmente ligado a uma —oumais sequências controle, que direcionam a produção do polipeptídeo.

Modalidade 15. Um Método para produzir o polipeptídeo de qualquer das modalidades 1-10 compreendendo: (a) cultivar uma célula, que em sua forma tipo selvagem produz o polipeptídeo, em condições que conduzem para a produção do polipeptídeo; e (b) recuperar o polipeptídeo.

& : Modalidade 16. Um Método para produzir um polipeptídeo que apresenta atividade de celobioidrolase compreendendo: i 5 (a) cultivar a célula hospedeira recombinante da modalidade 14 em condições que conduzem para a produção do polipeptídeo; e (b) recuperar o polipeptídeo.

Modalidade 17. Um método para degradar ou converter um material celulósico compreendendo: tratar o material celulósico com uma — composição de enzima na presença do polipeptídeo que apresenta atividade de celobioidrolase de qualquer das modalidades 1-10.

Modalidade 18. O método da modalidade 17, em que o material celulósico é pré-tratado.

Modalidade 19. O método de da modalidade 17 ou 18, que compreende adicionalmente recuperar o material celulósico degradado.

* Modalidade 20. O método de qualquer das modalidades 17-19, - em que a composição de enzima compreende uma ou mais (várias) enzimas selecionadas do grupo que consiste em uma celulase, um polipeptídeo GH61 com melhor atividade celulolítica, uma hemicelulase, uma expansina, uma esterase, uma laccase, uma enzima ligninolítica, uma pectinase, uma peroxidase, uma protease e uma swolenina.

Modalidade 21. O método da modalidade 20, em que a celulase é uma ou mais enzimas selecionadas do grupo que consiste em uma endoglucanase, uma celobioidrolase adicional e uma beta-glucosidase.

Modalidade 22. O método da modalidade 21, em que a hemicelulase é uma ou mais enzimas selecionadas do grupo que consiste em uma xilanase, uma acetilxilano esterase, uma feruloil esterase, uma arabinofuranosidase, uma xilosidase e uma glucuronidase.

Modalidade 23. Um método para sintetizar um produto de fermentação compreendendo: (a) sacarificar um material celulósico com uma composição de : enzima na presença de um polipeptídeo com atividade de endoglucanase de qualquer das modalidades 1-10; (b) fermentar o material celulósico sacarificado com um ou mais microrganismos fermentadores para sintetizar o produto de fermentação; e (c) recuperar o produto de fermentação a partir da fermentação.

Modalidade 24. O método da modalidade 23, em que o material celulósico é pré-tratado.

Modalidade 25. O método da modalidade 23 ou 24 em que a composição de enzima compreende uma ou mais enzimas selecionadas do grupo que consiste em uma celulase, um polipeptideo GH61 com melhor atividade celulolítica, uma hemicelulase, uma expansina, uma esterase, uma . laccase, uma enzima ligninolítica, uma pectinase, uma peroxidase, uma ; protease e uma swolenina.

Modalidade 26. O método da modalidade 25, em que a celulase é uma ou mais enzimas selecionadas do grupo que consiste em uma — endoglucanase, uma celobioidrolase adicional e uma beta-glucosidase.

Modalidade 27. O método da modalidade 25, em que a hemicelulase é uma ou mais enzimas selecionadas do grupo que consiste em uma xilanase, uma acetilxilano esterase, uma feruloil esterase, uma arabinofuranosidase, uma xilosidase e uma glucuronidase.

Modalidade 28. O método de qualquer das modalidades 23-27, em que as etapas (a) e (b) são realizadas simultaneamente em uma sacarificação e fermentação simultânea.

Modalidade 29. O método de qualquer das modalidades 23-28, em que o produto de fermentação é um álcool, um ácido orgânico, uma cetona, um aminoácido, ou um gás. Modalidade 30. Um Método para fermentar um material S celulósico compreendendo: fermentar o material celulósico com um ou mais microrganismos fermentadores, em que o material celulósico é sacarificado com uma composição de enzima na presença de um polipeptídeo que apresenta atividade de celobioidrolase de qualquer das modalidades 1-10.

Modalidade 31. O método da modalidade 30, em que o material celulósico é pré-tratado antes da sacarificação.

A presente invenção é descrita adicionalmente pelos exemplos a seguir, que não devem ser interpretados como limitantes do escopo da invenção.

Exemplos Cepas A cepa Talaromyces byssochlamydoides CBS413.71 foi usada como a fonte dos genes da família GH7. * A cepa Aspergillus oryzae MT3568 foi usada para a expressão : heteróloga dos genes da família GH7, que codificam o polipeptídeo que apresenta homologia com os polipeptídeos com atividade de celobioidrolase. A. oryzae MT3568 é uma cepa com gene amad'S (acetamidase) interrompido derivada de Aspergillus oryzae JaL355 (WO 2002/40694), em que auxotrofia de pyrG foi recuperada interrompendo o gene acetamidase (amadS) de A. oryzae com o gene pyrG. Meios O meio YP+2 % glicose era composto de 1 % de extrato de — levedura, 2% de peptona e 2 % de glicose.

As placas de ágar PDA eram compostos de infusão de batata (a infusão de batata foi realizada fervendo 300 g de batatas picadas (lavadas, mas não descascadas) em água por 30 minutos, e a seguir decantando ou espremendo o caldo por meio de morim. A água destilada foi então adicionada até o volume total da suspensão atingir um litro, seguido por 20 g de dextrose e 20 g de ágar em pó. O meio foi esterilizado autoclavando em 15 . psi por 15 minutos (Bacteriological Analytical Manual, 8º Edição, Revisão A, 1998).

: S As placas de LB eram compostas de 10 g de de Bacto- Triptona, 5 g de extrato de levedura, 10 g de cloreto de sódio, 15 g de Bacto- ágar, e água deionizada para 1 litro.

O meio LB era composto de 10 g de Bacto-Triptona, 5 g de extrato de levedura, e 10 g de cloreto de sódio, e água deionizada para 1 litro. As placas de sacarose COVE eram compostas de 342 g de sacarose, 20 g de ágar em pó, 20 mL de solução de sal de COVE, e água deionizada para 1 litro. O meio foi esterilzado autoclavando em 15 psi por 15 minutos (Bacteriological Analytical Manual, 8º Edição, Revisão A, 1998). O meio foi resfriado a 60ºC e foram adicionados acetamida 10 mM, CsCI 15 15" mM,Triton X-100 (50 uL/500 mL). $ A solução de sal de COVE era composta de 26 g de MgSO,:7H2O, 26 g de KCL, 26 g de KH,PO,, 50 mL de solução de metal traço COVE, e água deionizada para 1 litro. A solução de metal traço COVE era composta de 0,04 g de —NaB(O;10H,0, 0,4 g de CuSO,'5H,O, 1,2 g de FeSO4 7H,0O, 0,7 g de MnSO, H,O, 0,8 g de NaMoO,2H,0, 10 g de ZnSO,4 7H,0, e água deionizada para 1 litro. Exemplo 1: clonagem de dois genes da família GH7 a partir de Talaromyces byssochlamydoides Um conjunto de oligonucleotídeos iniciadores degenerados mostrados a seguir (SEQ ID NO: 5 a 10) foram determinados de acordo com a estratégia descrita por Rose et al., 1998, Nucleic Acids Research 26: 1628- 1635, para alvejar os genes que codificam celobioidrolase que pertence à família GH7.

Forl GTCGTTCTTGATGCgaaytggementes SEQ ID NO: 5 For2 “CCTGCGCCCAGAACtgygenbtnga SEQ ID NO: 6 : For3 TGACGTCGATGTCTCCAATytncenteygeg SEQ ID NO: 7 Revl GCATCCGTCGGGTAGTCGswrtenareca — SEQ ID NO: 8 À Rev2 GTCGGGTAGTCGGAATCCarccanwncat —SEQ ID NO: 9 Rev3 GCCTGGCGTGTCGcangegrtgngeg SEQ ID NO: 10 Os nucleotídeos em letra maiúscula representam o grampo consensual do oligonucleotídeo iniciador e os nucleotídeos em letra minúscula representam a parte central degenerada dos oligonucleotídeos (Rose et al., 1998, Nucleic Acids Research 26: 1628-1635).

A triagem de PCR foi realizada usando duas PCRs sucessivas. Nove reações de PCR foram realizadas com os conjuntos de oligonucleotídeo iniciador Forl/Revl, Forl/Rev2, For2/Revl, For2/Rev2, For3/Revl, For3/Rev2, Forl/Rev3, For2/Rev3, e For3/Rev3. Os oligonucleotídeos iniciadores sentido (0,33 ul de uma solução estoque 10 uM) foram Ê 10 — combinados com seus oligonucleotídeos iniciadores reversos correspondentes (0,33 uL de uma solução estoque 10 uM) em uma mistura de 10 uL contendo 0,33 ul de DNA genômico e 5 uL de mistura principal 1 para PCR REDDYMIX'Y Extensor (ABgene Ltd., Surrey, Reino Unido). O DNA genômico foi obtido a partir de micélio fresco de Talaromyces

15. byssochlamydoides (ver a parte de cepa) crescido on PDA (ver seção de meios), de acordo com o procedimento descrito no estojo FastDNAG& SPIN (Q-BIOgene, Carlsbad, CA, USA). A reação de PCR foi realizada usando um termociclador DYADG (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA) programado para um ciclo a 94ºC por 2 minutos; 9 ciclos cada um a 94ºC por 15 segundos, 68ºC por 30 segundos com uma diminuição de 1ºC para cada ciclo, e 68ºC por 1 minuto 45 segundos; 24 ciclos cada um a 94ºC por 15 segundos, 68ºC por 30 segundos, e 68ºC por 1 minuto 45 segundos; e extensão a 68ºC por 7 minutos.

Os produtos de PCR obtidos durante a primeira PCR foram re- amplificados com seus oligonucleotídeos iniciadores correspondentes, á transferindo 0,5 uL da primeira reação de PCR para uma segunda misstura de 20 uL contendo a mesma concentração de oligonucleotídeos iniciadores, Í 5 —dNTPs, DNA polimerase e tampão.

A segunda PCR foi realizada usando um termociclador DYADQO programado para um ciclo a 94ºC por 2 minutos; 34 ciclos cada um a 94ºC por 15 segundos, 58ºC por 30 segundos, e 68ºC por 1 minuto 45 segundos; e uma extensão final a 68ºC por 7 minutos.

Os produtos de PCR obtidos durante a segunda amplificação foram analisados por eletroforese em gel de agarose a 1 %, usando tampão Tris base 40 mM — acetato de sódio 20 MM — EDTA dissódico 1 mM (TAE). As bandas únicas que variam de 200 a 1.200 nucleotídeos em tamanho foram cortadas do gel e purificadas usando um estojo GFEX& PCR DNA and Gel Band Purification (GE Healthcare, Hillerod, Dinamarca), de acordo com as instruções do fabricante.

As amostras purificadas de DNA foram E sequenciadas diretamente com oligonucleotídeos iniciadores usados para amplificação.

As sequências foram montadas por SegMan v7.2.1 (DNA star, Madison, WI, USA) em contíguos que foram usados como moldes para determinar os oligonucleotídeos iniciadores de caminhada no gene mostrados a seguir (SEQID NO: 11 a 22), seguindo as restrições descritas no protocolo do estojo GENE WALKING SPEEDUPY (Seegene, Inc., Seoul, Coréia). 5220CBH1-1ITSPIf AACAACTTTGATACACACGGCGG SEQ ID NO: 11 S 5220CBH1-1TSP2f CTGCAGCAGGGTATGGTTCTGG SEQ ID NO: 12 5220CBH1-1TSP3f TGGTGATGAGTCTGTGGGACGG SEQ ID NO: 13 5220CBH1-1TSPIr GTCAGCAGCCATGGTAACAAGG SEQ ID NO: 14 5220CBH1-1TSP2r TGEGTAACAAGGTACAGAGCGCCG SEQ ID NO: 15 5220CBH1-1TSP3r GTITACAGAGCGCCGTTTAATCCGC SEQ ID NO: 16 5220CBH1-2TSP1f ACTGTACCGCTGAGAATTCTGTC SEQ ID NO: 17 5220CBH1-2TSP2f GCATGAGTGGTGTCAGTGAGGC SEQ ID NO: 18

5220CBH1-2TSP3f TGGTGTCAGTGAGGCTCTGTCC SEQ ID NO: 19 5220CBH1-2TSPIr CCATAACAACGAGGTAGAGGGC SEQ ID NO: 20 : 5220CBH1-2TSP2r CAGGGCAGGTTTGAGACATCCAC SEQ ID NO: 21 5220CBH1-2TSP3r TCTGGTAGTGGGTGTCATCCGC SEQ ID NO: 22

A caminhada no gene baseou-se no protocolo do estojo GENE WALKING SPEEDUP'M, com algumas mudanças mínimas.

Três amplificações por PCR foram realizadas e, em todos os casos, a mistura principal 1 e PCR REDDYMIX'Y Extensor (ABgene Ltd., Surrey, Reino — Unido) foiusadaem vez da mistura de enzima de PCR presente no estojo.

À etapa 1 da PCR GeneWalking foi realizada em um volume total de 15 uL, misturando 1,2 uL de oligonucleotídeo iniciador 1 a 4 (2,5 uM) a partir do estojo GENE WALKING SPEEDUP'Y e 0,3 ul do oligonucleotídeos iniciadores SEQ ID NO: 11 ou SEQ ID NO: 14 (10 uM), na presença de 7,5 uL de mistura principal 1 de PCR REDDYMIX'Y Extensor, e 0,4 uL de DNA genômico de T. byssochlamydoides.

A PCR foi realizada usando um : termociclador DYADQG programado para um ciclo a 94ºC por 3 minutos, h seguido por 1 minuto a 42ºC e 2 minutos a 68ºC; 30 ciclos cada um a 94ºC por 30 segundos, 58ºC por 30 segundos, e 68ºC por 1 minuto e 40 segundos; e alongamento a 68ºC por 7 minutos.

Uma alíquota de 0,5 uL da reação de amplificação foi transferida para um segundo tubo de PCR contendo um 20 ul de mistura composta de 10 ul de mistura principal 1 de PCR REDDYMIX'TY Extensor, 1 uL de oligonucleotídeo iniciador 5 (10 uM) do estojo, 1 uL de oligonucleotídeos iniciadores SEQ ID NO: 12 ou SEQ ID NO: 15(10 UM). A amplificação foi realizada em um termociclador DYADE programado para desnaturação a 94ºC por 3 minutos; 35 ciclos cada um a 94ºC por 30 segundos, 58ºC por 30 segundos, e 68ºC por 1 minuto e 40 segundos; e alongamento a 68ºC por 7 minutos.

Uma alíquota de 0,5 uL da segunda reação de amplificação foi transferida para um terceiro tubo de PCR — contendo uma mistura de 20 uL composta de 10 uL de mistura principal 1 de

PCR REDDYMIX'TY Extensor, 1 uL de oligonucleotídeo iniciador 6 (10 uM) do estojo, 1 uL de oligonucleotídeos iniciadores SEQ ID NO: 13 ou SEQ ID . NO: 16 (10 uM). A amplificação foi realizada em um termociclador DYADR programado para desnaturação a 94ºC por 3 minutos; 35 ciclos cada um a É 5 —94ºCT por 30 segundos, 58ºC por 30 segundos, e 68ºC por 1 minuto e 40 segundos; e alongamento a 68ºC por 7 minutos.

Similarmente, três reações sucessivas de PCR foram realizadas a fim de identificar a extremidade 5º e a extremidade 3º do segundo gene de Talaromyces byssochlamydoides, usando os oligonucleotídeos iniciadores -. SEQ ID NO: 17 a 22. Os produtos de PCR foram sequenciados diretamente usando os dois oligonucleotídeos iniciadores específicos, os quais foram usados para a última PCR.

As cromatografias de sequência resultantes foram montadas por SegMan v7.2.1 (DNA star, Madison, WI, USA), e os contíguos resultantes foram analisados por blastx contra as bases de dados de proteína, : incluindo Uniprot.

Os contíguos diferentes foram analisados com relação às : suas identidades com as proteínas que pertencem à família GH7. Com base nas análises blast, o códon inicial dos genes foi identificado e os oligonucleotídeos iniciadores mostrados a seguir foram determinados para — clonar os genes no vetor de expressão pDAu109 (WO 2005/042735), usando um estojo de clonagem de PCR IN-FUSION'Y Dry-Down (BD Biosciences, Palo Alto, CA, USA). 5220CBHIIF ACACAACTGGGGATCCACCATGTTTCGACGGGCTCTT TTCCTGTCC (SEQ ID NO: 23) 5220CBHI2F ACACAACTGGGGATCCACCATGTCCGCCTCTCTTTCTT ACAGACTCTACG (SEQ ID NO: 24) De maneira similar, o resultado da análise blastx para a extremidade 3º dos genes identifica um códon de parada para cada um dos — dois genes da família GH7 identificados em Talaromyces byssochlamydoides.

Os oligonucleotídeos iniciadores reversos mostrados a seguir foram determinados para clonar os genes no vetor de expressão pDAu109 (WO : 2005/042735) usando um estojo de clonagem por PCR IN-FUSION'Y Dry- Down (BD Biosciences, Palo Alto, CA, USA). É 5220CBHIIR AGATCTCGAGAAGCTTACGAAGTGGTGAAGGTCGAGT TGATTG (SEQ ID NO: 25) 5220CBHDOR AGATCTCGAGAAGCTTACAGACACTGGGAGTAGTAA GGGTTC (SEQ ID NO: 26) Os dois genes de celobioidrolase foram amplificados por PCR usando os oligonucleotídeos iniciadores de clonagem sentido e reverso anteriores (SEQ ID NO 23 a 26), com o DNA genômico da cepa 7. byssochlamydoides CBS413.71. A PCR foi composta de 1 uL de DNA genômico, 2,5 uL de oligonucleotídeo iniciador sentido para clonagem (10 uM),2,5 uL de oligonucleotídeo iniciador reverso para clonagem (10 uM), 10 uL de tampão HF 5X (Finnzymes Oy, Finlândia), 1,6 uL de MgCl, 50 : mM, 2 uL de dNTP 10 mM, 0,5 ul de DNA polimerase PHUSION& (Finnzymes Oy, Finlândia), e água grau PCR para 50 uL. A reação de amplificação foi realizada usando um termociclador DYADG programado —para2 minutos a 98ºC, seguido por 19 ciclos do tipo touchdown cada um a 98ºC por 15 segundos, 70ºC (-1ºC/ciclo) por 30 segundos, e 72ºC por 2 minutos e 30 segundos; e 25 ciclos cada um a 98ºC por 15 segundos, 60ºC por 30 segundos, 72ºC por 2 minutos e 30 segundos, e 5 minutos a 72ºC.

Os produtos de PCR foram isolados em eletroforese em gel de agarose a 1,0 % usando tampão TAE, onde badas de PCR de aproximadamente 1,5 a 1,6 kb foram excisadas do gel e purificadas usando um estojo GFX& PCR DNA and Gel Band Purification (GE Healthcare, Hillerod Dinamarca), de acordo com as instruções do fabricante. Os fragmentos que correspondem aos genes de Talaromyces byssochlamydoides e celobioidrolase foram clonados no vetor de expressão pDAu109 (WO

2005/042735), previamente linearizado com Bam HI e Hind III, usando um estojo de clonagem por PCR IN-F' USTION'" Dry-Down (BD Biosciences, Palo . Alto, CA, USA), de acordo com as instruções do fabricante.

Um volume de 2,5 uL da mistura de ligação diluída foi usado Á 5 para transformar células quimicamente competentes de E. coli TOPIO (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Três colônias foram selecionadas em placas de ágar LB contendo 100 ug de ampicilina por mL e cultivadas por toda a noite em 3 mL de meio LB suplementado com 100 ug de ampicilina por mL.

O DNA plasmidial foi purificado usando um estojo E.Z.N.A.& Plasmid Mini (Omega Bio-Tek, Inc., Norcross, GA, USA), de acordo com as instruções do fabricante.

As duas sequências de gene de celobioidrolase de Talaromyces byssochlamydoides foram verificadas por sequenciamento Sanger antes da expressão heteróloga.

Dois plasmídeos determinados como IF317%1 (contendo o gene SEQ ID NO: 1), e IF314%1 (contendo o gene SEQ ID NO: 3) foram selecionados para a expressão heteróloga de sua celobioidrolase em ” uma célula hospedeira de Aspergillus oryzae.

À Exemplo 2: Caracterização dos DNAs genômicos de Talaromyces byssochlamydoides que codificam os polipeptídeos da família GH7 A sequência de DNA genômico (SEQ ID NO: 1) e sequência deduzida de aminoácidos (SEQ ID NO: 2) do gene GH7 de Talaromyces byssochlamydoides estão na lista de sequências.

A primeira sequência codificante (SEQ ID NO: 1) tem 1.507 bp, incluindo o códon de parada com 2 introns previstos (604 a 667 e 1.236 a 1.310). A proteína prevista codificada — apresenta 455 aminoácidos.

Usando o programa SignalP, versão 3 (Nielsen et al., 1997, Protein Engineering 10: 1-6), um peptídeo sinal de 18 resíduos foi previsto.

O domínio catalítico previsto foi identificado a partir da posição 19 a 455, da maneira definida pelo grupo CaZy (www.cazy.org). A proteína madura prevista contém 437 aminoácidos com uma massa molecular prevista de 46,4 kDa e um ponto isoelétrico de 3,9. Um alinhamento global comparativo aos pares da sequência de : aminoácidos (SEQ ID NO: 2) foi determinado usando o algoritmo de Needleman e Wunsch (Needleman e Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443- É 5 453), com penalidade de abertura de intervalo de 10, penalidade de extensão de intervalo de 0,5 e a matriz EBLOSUMO6?2. O alinhamento mostrou que a sequência deduzida de aminoácidos do DNAc de T. byssochlamydoides que codifica um polipeptídeo da família GH7, que apresenta homologia com as proteínas com atividade de celobioidrolase, compartilha 87,41 % de identidade (excluindo os intervalos) com a sequência deduzida de aminoácidos de uma celobioidrolase de Talaromyces emersonii (GENESEQP: AYL28232). A sequência de DNA genômico (SEQ ID NO: 3) e sequência deduzida de aminoácidos (SEQ ID NO: 4) do gene GH7 de Talaromyces byssochlamydoides estão na lista de sequências. À segunda sequência é. codificante (SEQ ID NO: 3) apresenta 1.614 bp incluindo o códon de parada. : A proteína prevista codificada apresenta 537 aminoácidos. Usando o programa SignalP (Nielsen et al., 1997, Protein Engineering 10: 1-6) um peptídeo sinal de 25 resíduos foi previsto. Diferentes domínios (da maneira —definidapelo grupo CaZy (www.cazy.org)) também são previstos na proteína: as posições de domínio catalítico 26 a 465 de SEQ ID NO: 4, as posições ligadoras 452 a 495 de SEQ ID NO: 4, e um motivo de ligação de celulose (CBMI) a partir das posições 502 a 537 de SEQ ID NO: 4. A proteína madura prevista contém 512 aminoácidos com uma massa molecular prevista de 53,5 —KkDaeum ponto isoelétrico de 3,7.

Um alinhamento global aos pares comparativo de sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 4) foi determinado usando o algoritmo de Needleman e Wunsch (Needleman e Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443- 453), com penalidade de abertura de intervalo de 10, penalidade de extensão de intervalo de 0,5 e a matriz EBLOSUMO6?2. O alinhamento mostrou que a sequência deduzida de aminoácidos do DNAc de T. byssochlamydoides que : codifica um polipeptídeo da família GH7, que apresenta homologia com as proteínas com atividade de celobioidrolase, compartilha 78,94 % de É 5 — identidade (excluindo intervalos) com a sequência deduzida de aminoácidos de uma proteína glicosil hidrolase da família 7 de Neosartorya fischeri (SWISSPROT:AI1DAP8). Exemplo 3: Transformação de Aspergillus oryzae com genes que codificam celobioidrolases de Talaromyces byssochlamydoides Os protoplastos de Aspergillus oryzae MT3568 foram preparados de acordo com WO 95/002043. Cem uL de protoplastos foram misturados com 2,5-15 ug dos vetores de expressão de Aspergillus, IF317H1 e IF314%1 (Exemplo 1), e 250 uL de PEG 4000 60 % (Applichem, Darmstadt, Alemanha) (polietileno glicol, peso molecular 4.000), CaCl; 10 mM e Tris- HCl 10mMM pH 7,5, e suavemente misturados.

A mistura foi incubada a 37ºC por 30 minutos e os protoplastos foram semeados em placas de COVE para é seleção.

Após a incubação por 4-7 dias a 37ºC, os esporos de oito transformantes foram inoculados em 0,5 mL de meio YP suplementado com 2 % de maltodextrina em placas de 96 poços profundos.

Após 4 dias de cultivo —a30ºC,os caldos de cultura foram analisados por SDS-PAGE para identificar os transformantes que produzem as maiores quantidades de celobioidrolases recombinantes de Talaromyces byssochlamydoides.

Os esporos do melhor transformante foram semeados em placas COVE contendo TRITON& X-100 0,01 %, a fim de isolar colônias únicas.

A semeadura foi repetida duas vezes no total em placas de COVE contendo nitrato de sódio 10 mM.

Exemplo 4. Purificação de celobioidrolase I GH7 de Talaromyces byssochlamydoides O caldo de Aspergillus oryzae contendo celobioidrolase I GH7 de Talaromyces byssochlamydoides (P247B5, revelado em SEQ ID NO: 2) foi filtrado usando uma membrana de 0,22 um EXPRESS'Y Plus (Millipore, . Bedford, MA, USA). O caldo filtrado foi concentrado e o tampão foi trocado usando um concentrador em centrífuga Vivacell 100 spin, equipado com uma : 5 —membrana de polietersulfona de 10 kDa (Sartorius Stedim Biotech S.A., Aubagne Cedex, França) com Tris-HCl 20 mM, pH 8,5, e a seguir foi purificado em uma coluna de cromatografia de troca iônica MonoQ'Y HR 16/10 (GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA) em Tris-HCl 20 mM, pH 8,5, em um gradiente de NaCl linear de 0 a 6 M.

As frações contendo a —celobioidrolase I foram agrupadas com base em SDS-PAGE sem corante 8-16 % da CRITERIONGO (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA). À concentração de proteínas foi determinada usando um estojo de ensaio de proteína em microplaca BCATY (Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA, USA), em que a albumina sérica bovina foi usada como uma proteína padrão.

Exemplo 5: Ensaio de hidrólise de resíduo de milho pré- : tratado : O resíduo de milho foi pré-tratado no U.S.

Department of Energy National Renewable Energy Laboratory (NREL) usando 1,4 % em peso de ácido sulfúrico a 165ºC e 107 psi por 8 minutos.

Os sólidos insolúveis em água no resíduo de milho pré-tratado (PCS) continham 56,5 % de celulose, 4,6 % de hemiceluloses e 28,4 % de lignina.

À celulose e hemicelulose foram determinadas por uma hidrólise de ácido sulfúrico em duas etapas, com análise subsequente de açúcares por cromatografia líquida de alto desempenho, usando o procedimento analítico padrão NREL 4002. À —lignina foi determinada gravimetricamente após hidrolisar as frações de celulose e hemicelulose com ácido sulfúrico usando o procedimento analítico padrão NREL %003. O PCS não lavado moído (peso seco 32,35 %) foi preparado moendo a lama completa de PCS em um moedor de multi-utilidades úmido

Cosmos ICMG 40 (EssEmm Corporation, Tamil Nadu, Índia). A hidrólise de PCS foi conduzida usando placas de poços : fundos de 2,2 mL (Axygen, Union City, CA, Estados Unidos), em um volume de reação total de 1,0 mL.

A hidrólise foi realizada com 50 mg de sólidos ê 5 insolúveis de PCS por mL de tampão de acetato de sódio 50 mM pH 5,0, contendo sulfato de manganês 1 mM e vários carregamentos proteicos de várias composições de enzima (expresso como mg de proteína por grama de celulose). As composições de enzima foram preparadas da maneira descrita no exemplo 6, e a seguir foram adicionadas simultaneamente a todos os — poços, em um volume que varia de 50 uL a 200 uL, para um volume final de 1 mL em cada reação.

As placas foram então seladas usando um selador quente de placas ALPS-300TYM (Abgene, Epsom, Reino Unido), totalmente misturadas e incubadas em uma temperatura específica por 72 horas.

Todos os experimentos relatados foram realizados em triplicata.

Após a hidrólise, as amostras foram filtradas usando uma placa s de 96 poços com filtro de 0,45 um MULTISCREENQ (Millipore, Bedford, : MA, Estados Unidos), e os filtrados foram analisados com relação ao teor de açúcar da maneira descrita a seguir.

Quando não usadas imediatamente, as alíquotas filtradas foram congeladas a -20ºC.

As concentrações de açúcar das amostras diluídas em H,SO, 0,005 M foram medidas usando uma coluna de 4,6 x 250 mm AMINEXG& HPX-87H (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, Estados Unidos) por eluição com 0,05 % p/p de ácido benzóico-H,SO, 0,005 M a 65ºC, em uma vazão de 0,6 mL por minuto, e a quantificação por integração dos sinais de glicose, celobiose e xilose a partir da detecção do índice refrativo (CHEMSTATIONGO, AGILENT& 1100 HPLC, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, Estados Unidos) foi calibrada por amostras puras de açúcar.

Os equivalentes de glicose e celobiose resultantes foram usados para calcular o percentual da conversão de celulose para cada reação.

A glicose, celobiose e xilose foram medidas individualmente.

As concentrações medidas de açúcar foram ajustadas com o fator de diluição apropriado.

No caso de PCS não lavado, as concentrações líquidas dos : açúcares produzidos enzimaticamente foram determinadas ajustando as concentrações medidas de açúcar às concentrações de açúcar anteriores é 5 correspondentes em PCS não lavado nos pontos de tempo zero.

Todos os processamentos de dados de HPLC foram realizados usando o software MICROSOFT EXCELY (Microsoft, Richland, WA, Estados Unidos). O grau de conversão de celulose em glicose foi calculado usando a seguinte equação: % de conversão = (concentração de glicose / — concentração de glicose em uma digestão limite) x 100. A fim de calcular o % de conversão, um ponto de conversão de 100 % foi ajustado, com base em uma celulase controle (100 mg de celulase de Trichoderma reesei por grama celulose), e todos os valores foram divididos por este número e a seguir multiplicado por 100. Os pontos de dados em triplicata tiveram suas médias —calculadase o desvio padrão foi calculado. ' Exemplo 6: Preparação de composição de enzima em : temperatura elevada Preparação de celobioidrolase II de Aspergillus fumigatus.

À celobioidrolase II de Aspergillus fumigatus GH6A (SEQ ID NO: 18 em WO 2011/057140) foi preparada de maneira recombinante em Aspergillus oryzae, da maneira descrita em WO 2011/057140. O caldo filtrado de celobioidrolase U de Aspergillus fumigatus GH6A teve seu tampão trocado por Tris 20 MM pH 8,0, usando uma coluna de 400 mL SEPHADEX'TY G-25 (GE Healthcare, Reino Unido) de acordo com as instruções do fabricante.

As frações foram agrupadas e ajustadas para sulfato de amônio 1,2 M - Tris 20 MM pH 8,0. À proteína equilibrada foi carregada em uma coluna de fluxo rápido PHENYL SEPHAROSE'!Y 6 (sub alto) (GE Healthcare, Piscataway, NJ, Estados Unidos), equilibrada em Tris 20 mM pH 8,0, com sulfato de amônio 1,2 M, e as proteínas ligadas foram eluídas com Tris 20 mM pH 8,0 sem nenhum sulfato de amônio. As frações foram agrupadas. Preparação do polipeptídeo de Penicillium sp. (emersonii) - GH61A com melhor atividade celulolítica. O polipeptídeo de Penicillium sp. (emersonii) GH61A (SEQ ID NO: 2 em WO 2011/041397) foi preparado de Ú 5 —maneirarecombinante e purificado de acordo com WO 2011/041397.

Preparação de endoglucanase II de Trichoderma reesei GH5. A endoglucanase II de Trichoderma reesei GH5 (SEQ ID NO: 22 em WO 2011/057140) foi preparada de maneira recombinante de acordo com WO 2011/057140. O caldo filtrado de endoglucanase UI de Trichoderma reesei GHS foi dessalinizado e o tampão foi trocado em Tris 20 mM pH 8,0, usando fluxo tangencial (membrana de 10 K, Pall Corporation), de acordo com as instruções do fabricante.

Preparação de beta-glucosidase de Aspergillus fumigatus Cel3A. A beta-glucosidase de Aspergillus fumigatus Cel3A (SEQ ID NO: 2 em WO 2005/047499) foi preparada de maneira recombinante, de acordo com “ WO 2005/047499, usando Aspergillus oryzae como um hospedeiro. O caldo : filtrado de beta-glucosidase de Aspergillus fumigatus Cel3A foi concentrado e o tampão foi trocado usando um concentrador de fluxo tangencial equipado com uma membrana de polietersulfona de 10 kDa, com Tris-HC1 20 mM pH 8,5. A amostra foi colocada em uma coluna de alto desempenho Q SEPHAROSEQG (GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA), equilibrada em Tris 20 mM pH 8,5, e as proteínas ligadas foram eluídas com um gradiente linear de cloreto de sódio 0-600 mM. As frações foram concentradas e colocadas em uma coluna SUPERDEX& 75 HR 26/60 equilibrada com Tris 20 mM - — cloreto de sódio 150 mM pH 8,5.

Preparação de xilanase de Aspergillus fumigatus GH10. À xilanase de Aspergillus fumigatus GH10 (xyn3) (SEQ ID NO: 48 em WO 2011/057140) foi preparada de maneira recombinante, de acordo com WO 2006/078256, usando Aspergillus oryzae BECh2 (WO 2000/39322) como um hospedeiro. O caldo filtrado de xilanase (xyn3) de Aspergillus fumigatus NNO055679 GHIO foi dessalinizado e o tampão foi trocado em acetato de . sódio 50 mM pH 5,0, usando uma coluna de dessalinização HIPREPGQ 26/10, de acordo com as instruções do fabricante.

: 5 Preparação de beta-xilosidase de Talaromyces emersonii GH3. A beta-xilosidase de Talaromyces emersonii GH3 (SEQ ID NO: 60 em WO 2011/057140) foi preparada de maneira recombinante em Aspergillus oryzae, da maneira descrita em WO 2011/057140. A beta-xilosidase de Talaromyces emersonii GH3 foi dessalinizada e o tampão foi trocado em acetato de sódio 50 mM pH 5,0, usando fluxo tangencial (membrana de 10 K, Pall Corporation), de acordo com as instruções do fabricante.

A concentração de proteina para cada um dos monocomponentes descritos anteriormente foi determinada usando um estojo de ensaio de proteína em microplaca BCATY, em que a albumina sérica bovina foi usada como uma proteína padrão. Uma composição de enzima e " temperatura elevada era composta de cada um dos monocomponentes, À preparada da maneira descrita anteriormente, da maneira a seguir: 25 % de celobioidrolase II de Aspergillus fumigatus Cel6A, 15 % de polipeptídeo com melhor atividade celulolítica de Penicillium emersonir GH61A, 10 % de —endoglucanase II de Trichoderma reesei GH5, 5 % de xilanase (xyn3) de Aspergillus fumigatus GH10, 5 % de beta-glucosidase mutante de Aspergillus Jumigatus e 3 % de beta-xilosidase de Talaromyces emersonii. A composição de enzima em temperatura elevada é aqui determinada como “composição de enzima em temperatura elevada sem celobioidrolase 1”.

Exemplo 7: Efeito de celobioidrolase I GH7 de Talaromyces byssochlamydoides (SEQ ID NO: 2, P247B5) em uma composição de enzima em temperatura elevada usando PCS moído não lavado a 50-65ºC A celobioidrolase 1 GH7 de Talaromyces byssochlamydoides (P247B5) foi avaliada em uma composição de enzima sem celobioidrolase I

À 115 em temperatura elevada, a 50ºC, 55ºC, 60ºC e 65ºC, usando PCS moído não lavado como um substrato.

A composição de enzima sem celobioidrolase | em temperatura elevada (Exemplo 6) foi adicionada às reações de hidrólise de PCS em 1,9 mg de proteína total por g de celulose e 3,0 mg de proteína total 1 5 —porg de celulose, e os resultados de hidrólise foram comparados com os resultados para uma composição de enzima em temperatura elevada similar com celobioidrolase I GH7 adicionada (3,0 mg proteína por g de celulose). O ensaio foi realizado da maneira descrita no exemplo 5. As reações de 1 mL com PCS moído não lavado (5 % de sólidos insolúveis) foram conduzidas por 72 horas em acetato de sódio 50 mM, pH 5,0, tampão contendo sulfato de manganês 1 mM.

Todas as reações foram realizadas em triplicata e envolveram mistura simples no começo da hidrólise.

Os resultados mostrados na tabela 1 demonstram que a 50ºC, 55ºC, 60ºC e 65ºC a composição de enzima em temperatura elevada, que incluía celobioidrolase I GH7 de Talaromyces byssochlamydoides (P247B5), ' supera significativamente a composição de enzima que não contém nenhuma : celobioidrolase I.

Tabela 1. % Conversão (celulose em glicose) Composição Composição HT com 37 % de CBHI GH7 de 7. byssochlamydoides (3.0 mg/g

Claims (1)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Célula hospedeira microbiana transgênica, caracterizada pelo fato de que compreende o polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo tendo atividade celobioidrolase, em que o polinucleotídeo compreende ou consiste em SEQIDNO:l, SEQID NO:3, a sequência que codifica o polipeptídeo maduro do mesmo, ou uma subsequência do mesmo que codifica um fragmento tendo atividade celobioidrolase.

   2. Célula hospedeira microbiana transgênica de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo tendo atividade — celobioidrolase compreende ou consiste em SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, o polipeptídeo maduro do mesmo, ou um fragmento do mesmo tendo atividade celobioidrolase.

   3. Método para produzir um polipeptídeo, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) cultivar a célula hospedeira microbiana transgênica como definida na reivindicação | ou 2, sob condições adequadas para a produção do polipeptídeo; e (b) recuperar o polipeptídeo.

   4. Método para produzir um mutante de uma célula originária, caracterizado pelo fato de compreender inativar ou deletar um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo tendo atividade celobioidrolase, em que o polinucleotídeo compreende ou consiste em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, ou uma subsequência do mesmo que codifica um fragmento tendo atividade celobioidrolase; que resulta no mutante produzindo menos do polipeptídeo do —queacélula originária.

   5. Célula hospedeira microbiana transgênica, caracterizada pelo fato de compreender uma construção de ácido nucleico ou um vetor de expressão — que compreende um gene codificanto uma proteína, operacionalmente ligado a um polinucleotídeo que codifica um peptídeo sinal compreendendo ou consistindo nos aminoácidos 1 a 18 de SEQ ID NO:2, ou nos aminoácidos 1 a 25 de SEQ ID NO:4; em que o gene é estranho ao polinucleotídeo que codifica o peptídeo sinal.

   6. Método para produzir uma proteína, caracterizado pelo fato — dequecompreende: (a) cultivar a célula hospedeira microbiana transgênica como definida na reivindicação 5, sob condições que conduzam a produção da proteína; e (b) recuperar a proteína.

   7. Método para degradar um material celulósico, caracterizado pelo fato de que compreende: tratar o material celulósico com uma composição de enzima na presença de um polipeptídeo tendo atividade celobioidrolase, compreendendo ou consistindo em SEQ ID NO:2, SEQ ID NO4 o polipeptídeo maduro do mesmo, ou um fragmento do mesmo tendo atividade

   15. celobioidrolase.

   8. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente recuperar o material celulósico degradado.

   9. Método para produzir um produto de fermentação, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) sacarificar um material celulósico com uma composição de enzima na presença de um polipeptídeo tendo atividade celobioidrolase compreendendo ou consistindo em SEQ ID NO:2, SEQ ID NOX4, o polipeptídeo maduro do mesmo, ou um fragmento do mesmo tendo atividade celobioidrolase; (b) fermentar o material celulósico sacarificado com um ou mais microrganismos fermentadores para produzir o produto de fermentação; e (c) recuperar o produto de fermentação a partir da fermentação.

   10. Método para fermentar um material celulósico,

   caracterizado pelo fato de que compreende: fermentar o material celulósico com um ou mais microrganismos fermentadores, em que o material celulósico é sacarificado com uma composição de enzima na presença de um polipeptídeo tendo atividade celobioidrolase, compreendendo ou consistindo em SEQ ID —NO:2,SEQID NO, o polipeptídeo maduro do mesmo, ou um fragmento do mesmo tendo atividade celobioidrolase.

   11. Método, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a fermentação do material celulósico produz um produto de fermentação.

   12. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente recuperar o produto de fermentação a partir da fermentação.

   13. Construção de ácido nucleico ou um vetor de expressão, caracterizado pelo fato de compreender um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo tendo atividade celobioidrolase, em que o polinucleotídeo compreende ou consiste em SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, a sequência que codifica o polipeptídeo maduro do mesmo, ou uma subsequência do mesmo que codifica um fragmento tendo atividade celobioidrolase; operacionalmente ligado a uma ou mais sequências de controle que direcionam a produção do — polipeptídeo em um hospedeiro de expressão.

   14. Método para produção de um polipeptídeo tendo atividade celobioidrolase, caracterizado pelo fato de compreender: (a) cultivar uma planta transgênica ou célula de planta compreendendo um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo tendo — atividade celobioidrolase, em que o polinucleotídeo compreende ou consiste em SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, a sequência que codifica o polipeptídeo maduro do mesmo, ou uma subsequência do mesmo que codifica um fragmento tendo atividade celobioidrolase, sob condições que conduzam a produção do polipeptídeo; e

   (b) recuperar o polipeptídeo.

   15. Polipeptídeo isolado tendo atividade celobioidrolase, caracterizado pelo fato de que é selecionado do grupo que consiste em: (a) um polipeptídeo tendo pelo menos 90 % de identidade de — sequência com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2, ou um polipeptídeo tendo pelo menos 80 % de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 4; (b) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo tendo pelo menos 90 % de identidade de sequência com a sequência que codifica o —polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1, ou a sequência de cDNA deste, ou um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo tendo pelo menos 80 % de identidade de sequência com a sequência que codifica o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 3, ou a sequência de DNA genômico deste; (c) uma variante que compreende uma substituição, deleção

   15. e/ou inserção de um ou mais (vários) aminoácidos do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 ou de SEQID NO: 4; e (d) um fragmento do polipeptídeo de (a), (b), ou (c) que apresenta atividade de celobioidrolase.

   16. Polinucleotídeo isolado, caracterizado pelo fato de que —codificao polipeptídeo como definido na reivindicação 15.