ES2802807T3 - Polipéptido degradador de carbohidratos y sus usos - Google Patents

Abstract

Un polipéptido que tiene actividad como hemicelulasa que comprende la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO: 32 o una secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia nucleotídica de SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 34 o uno de sus polipéptidos variantes o polinucleótidos variantes, en donde el polipéptido variante tiene al menos 75% de identidad de secuencia con la secuencia indicada en SEQ ID NO: 32, o el polinucleótido variante codifica un polipéptido que tiene al menos 75% de identidad de secuencia con la secuencia indicada en SEQ ID NO: 32.

Description

DESCRIPCIÓN

Polipéptido degradador de carbohidratos y sus usos

Campo de la invención

La invención se refiere a secuencias que comprenden genes que codifican polipéptidos que tienen actividad degradadora de materiales lignocelulósicos. La invención presenta la secuencia codificante de longitud completa del nuevo gen así como la secuencia de aminoácidos de la proteína funcional de longitud completa, y variantes y fragmentos del gen o la secuencia de aminoácidos. La invención también se refiere a métodos para usar estas proteínas en procedimientos industriales. También se incluyen en la invención células transformadas con un polinucleótido según la invención adecuadas para producir estas proteínas. Además, la invención se refiere a la expresión satisfactoria de los genes que codifican polipéptidos que tienen actividad degradadora de materiales lignocelulósicos en un organismo hospedador tal como Aspergillus n igery/o Rasamsonia emersonii.

Antecedentes de la invención

Los carbohidratos constituyen los compuestos orgánicos más abundantes de la tierra. Sin embargo, mucho de este carbohidrato está secuestrado en polímeros complejos incluyendo almidón (el principal carbohidrato de almacenamiento en semillas y cereales), y un conjunto de carbohidratos y lignina conocido como lignocelulosa. Los principales componentes glucídicos de la lignocelulosa son celulosa, hemicelulosa y pectinas. A menudo, estos polímeros complejos se denominan colectivamente lignocelulosa.

La bioconversión de biomasa lignocelulósica renovable en un azúcar fermentable que posteriormente se fermenta para producir alcohol (p. ej., etanol) como una alternativa a los combustibles líquidos ha atraído una gran atención de los investigadores desde los 70, cuando estalló la crisis del petróleo debido a la disminución de la producción de petróleo por la OPEC. El etanol se ha usado ampliamente como una combinación al 10% con gasolina en los EE. UU. de A. o como un combustible puro para vehículos en Brasil en las dos últimas décadas. Más recientemente, el uso de E85, una combinación de etanol al 85%, se ha establecido especialmente para aplicaciones a ciudades limpias. La importancia del bioetanol combustible se incrementará en paralelo con los incrementos en los precios para el crudo y el agotamiento gradual de sus fuentes. Adicionalmente, se están usando azúcares fermentables para producir plásticos, polímeros y otros productos de base biológica y se espera que esta industria crezca sustancialmente incrementando por lo tanto la demanda de azúcares fermentables de bajo coste abundantes que se puedan usar como una materia prima en lugar de materias primas de base petrolífera.

El secuestro de estas grandes cantidades de carbohidratos en biomasa vegetal proporciona una fuente copiosa de energía potencial en forma de azúcares, azúcares tanto de cinco carbonos como de seis carbonos que se podrían utilizar para numerosos procedimientos industriales y agrícolas. Sin embargo, el enorme potencial energético de estos carbohidratos está actualmente infrautilizado debido a que los azúcares están bloqueados en polímeros complejos, y de ahí que no sean fácilmente accesibles para la fermentación. Los métodos que generen azúcares de biomasa vegetal proporcionarán materias primas económicamente competitivas copiosas para la fermentación en productos químicos, plásticos, tales como, a modo de ejemplo, ácido succínico y (bio)combustibles, incluyendo los combustibles líquidos sintéticos etanol, metanol, butanol y biogás.

Independientemente del tipo de materia prima celulósica, el coste y la eficacia hidrolítica de las enzimas son factores importantes que restringen la comercialización de los procedimientos de bioconversión de biomasa. Los costes de producción de enzimas producidas microbianamente están estrechamente ligados a una productividad de la cepa productora de enzimas y el rendimiento de actividad final en el caldo de fermentación.

A pesar de la investigación continuada de las últimas décadas por entender la degradación enzimática de biomasa lignocelulósica y la producción de celulasa, sigue siendo deseable descubrir o manipular nuevas celulasas y hemicelulasas muy activas. También sería muy deseable construir composiciones enzimáticas altamente eficaces capaces de realizar una biodegradación rápida y eficaz de materiales lignocelulósicos, en particular celulasas y hemicelulasas tales que tengan termoestabilidad incrementada.

Estas enzimas se pueden usar para producir azúcares para la fermentación en productos químicos, plásticos, tales como a modo de ejemplo ácido succínico y (bio)combustibles, incluyendo etanol, metanol, butanol, combustibles líquidos sintéticos y biogás, para ensilado, y también como enzima en otros procedimientos industriales, por ejemplo en las industrias alimenticia o de piensos, textil, de la pasta papelera o el papel o los detergentes y otras industrias.

El documento WO 2007/091231 describe enzimas de Talaromyces mersonii incluyendo alfa-arabinofuranosidasas.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona un polipéptido que tiene actividad como hemicelulasa o una actividad según la Tabla 1 que comprende la secuencia de aminoácidos indicada en la SEQ ID NO: 32 o una secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia nucleotídica de SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 34 o uno de sus polipéptidos variantes o polinucleótidos variantes, en donde el polipéptido variante tiene al menos 75% de identidad de secuencia con la secuencia indicada en SEQ ID NO: 32 o el polinucleótido variante codifica un polipéptido que tiene al menos 75% de identidad de secuencia con la secuencia indicada en SEQ ID NO: 32.

Tabla 1: m r T m r l r ín l in n i n i i

El polipéptido de la invención tiene actividad como alfa-arabinofuranosidasa.

Por otra parte, la invención proporciona una secuencia de ácido nucleico que codifica una hemicelulasa, en donde la secuencia de ácido nucleico se selecciona del grupo que consiste en:

(a) una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos 70% de identidad con la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 31 SEQ ID NO: 34 o SEQ ID NO: 35;

(b) una secuencia de ácido nucleico que codifica (i) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 32, (ii) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 70% de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 32, o (iii) una secuencia de aminoácidos que difiere en 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 32; o

(c) una secuencia nucleotídica que es el complemento inverso de una secuencia nucleotídica como la definida en (a) o (b).

La invención también proporciona un constructo o vector de ácido nucleico que comprende el polinucleótido de la invención y una célula que comprende un polipéptido de la invención o un constructo o vector de ácido nucleico de la invención.

Según un aspecto de la invención, la célula es una célula fúngica, preferiblemente una célula fúngica seleccionada del grupo que consiste en los géneros Acremonium, Agaricus, Aspergillus, Aureobasidium, Chrysosporium, Coprinus, Cryptococcus, Filibasidium, Fusarium, Humicola, Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Piromyces, Panerochaete, Pleurotus, Schizophyllum, Talaromyces, Rasamsonia, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium y Trichoderma.

Según otro aspecto de la invención, uno o más genes de la célula de la invención se eliminan, inactivan o alteran totalmente o en parte, en donde opcionalmente el gen codifica una proteasa.

La invención también proporciona un método para la preparación de un polipéptido según la invención que tiene actividad como hemicelulasa o una según la Tabla 1, método que comprende cultivar una célula de la invención bajo condiciones que permitan la expresión de dicho polipéptido y, opcionalmente, recuperar el polipéptido expresado. Por otra parte, la invención proporciona una composición que comprende: (i) un polipéptido de la invención y; (ii) una celulasa y/o una hemicelulasa adicional y/o una pectinasa, preferiblemente la celulasa es una GH61, celobiohidrolasa, celobiohidrolasa I, celobiohidrolasa II, endo-p-1,4-glucanasa, p-glucosidasa o p-(1,3)(1,4)-glucanasa y/o la hemicelulasa es una endoxilanasa, p-xilosidasa, a-L-arabinofuranosidasa, a-D-glucuronidasa, feruloilesterasa, cumaroilesterasa, a-galactosidasa, p-galactosidasa, p-mananasa o p-manosidasa.

Adicionalmente, la invención proporciona un método para el tratamiento de un sustrato que comprende hemicelulosa, opcionalmente un material vegetal, método que comprende poner en contacto el sustrato con un polipéptido de la invención y/o una composición de la invención.

Otro aspecto de la invención se refiere al uso de un polipéptido de la invención y/o una composición de la invención para producir azúcar a partir de un material lignocelulósico.

La invención también proporciona:

un método para la preparación de un polipéptido que tiene actividad degradadora de material glucídico o hidrolizante de carbohidratos, método que comprende cultivar una célula de la invención bajo condiciones que permitan la expresión de dicho polipéptido y, opcionalmente, recuperar el polipéptido expresado;

un polipéptido obtenible mediante este método; y

una composición que comprende: (i) un polipéptido de la invención y; (ii) una celulasa y/o una hemicelulasa y/o una pectinasa.

Los polipéptidos de la invención que tienen actividad degradadora de material glucídico o hidrolizante de carbohidratos se pueden usar en procedimientos industriales. Así, la invención proporciona un método para el tratamiento de un sustrato que comprende material glucídico, método que comprende poner en contacto el sustrato con un polipéptido o una composición de la invención.

En particular, la invención proporciona un método para producir un azúcar o azúcares a partir de material lignocelulósico, método que comprende poner en contacto el material lignocelulósico con un polipéptido o una composición de la invención.

Los azúcares producidos de este modo se pueden usar en un procedimiento de fermentación. Según esto, la invención proporciona un método para producir un producto de fermentación, método que comprende: producir un azúcar fermentable usando lo descrito anteriormente; y fermentar el azúcar fermentable resultante, para producir de ese modo un producto de fermentación.

También se puede usar un polipéptido o una composición de la invención, por ejemplo, en la preparación de un producto alimenticio, en la preparación de un detergente, en la preparación de un pienso, en el tratamiento de pasta papelera o en la fabricación de un papel o en la preparación de una tela o material textil o en su limpieza.

Breve descripción de los dibujos

Fig 1: Mapa de pGBTOP para la expresión de genes en A. niger. Se representan el gen de interés (GOI) expresado a partir del promotor de glucoamilasa (PglaA). Además, se representa el flanco de glucoamilasa (3'glaA) del casete de expresión. En esta solicitud, un gen de interés es la secuencia codificante de Temer00088, Temer09484, Temer08028, Temer02362, Temer08862, Temer04790, Temer05249, Temer06848, Temer02056, Temer03124, Temer09491, Temer06400, Temer08570, Temer08163 o Temer07305 según se define posteriormente en la presente.

La Fig. 2 muestra un diagrama esquemático del plásmido Te pep.bbn, que es la base para el constructo de sobreexpresión de Temer00088, Temer09484, Temer08028, Temer02362, Temer08862, Temer04790, Temer05249, Temer06848, Temer02056, Temer03124, Temer09491, Temer06400, Temer08570, Temer08163 o Temer07305 en R. emersonii que se orienta al locus RePepA . El vector comprende una región de flanqueo 5’ de 1500 pb 1,5 kb aguas arriba del ORF de RePepA para la orientación en el locus RePepA , un sitio lox66, la parte 5’ no funcional de la región codificante ble (5'ble) conducida por el promotor gpdA de A. nidulans, y un gen ccdB .

La Fig. 3 muestra un diagrama esquemático del plásmido pEBA1006 que se usaba en el método de orientación génica bipartito en combinación con el vector de expresión pEBA que contiene Temer00088, Temer09484, Temer08028, Temer02362, Temer08862, Temer04790, Temer05249, Temer06848, Temer02056, Temer03124, Temer09491, Temer06400, Temer08570, Temer08163 o Temer07305 con el objetivo de reemplazar el OFR RePepA y aproximadamente 1500 nucleótidos aguas arriba del codón ATG de partida mediante el casete de expresión de Temer00088, Temer09484, Temer08028, Temer02362, Temer08862, Temer04790, Temer05249, Temer06848, Temer02056, Temer03124, Temer09491, Temer06400, Temer08570, Temer08163 o Temer07305 en Rasamsonia emersonii. El vector comprende la parte 3' de la región codificante ble, el terminador trpC de A. nidulans, un sitio lox71, una región de flanqueo 3’ de 2500 pb del ORF de RePepA , y el esqueleto de pUC19 (Invitrogen, Breda, Países Bajos). El ADN de E. coli se retiró mediante digestión con la enzima de restricción Notl, antes de la transformación de las cepas de R. emersonii.

La Fig. 4 muestra un diagrama esquemático del plásmido de expresión pEBA que contiene Temer00088, Temer09484, Temer08028, Temer02362, Temer08862, Temer04790, Temer05249, Temer06848, Temer02056, Temer03124, Temer09491, Temer06400, Temer08570, Temer08163 o Temer07305 que se usaba en el método de orientación génica bipartito en combinación con el vector pEBA1006 con el objetivo de reemplazar el ORF de RePepA y aproximadamente 1500 nucleótidos aguas arriba del codón ATG de partida mediante el casete de expresión de Temer00088, Temer09484, Temer08028, Temer02362, Temer08862, Temer04790, Temer05249, Temer06848, Temer02056, Temer03124, Temer09491, Temer06400, Temer08570, Temer08163 o Temer07305 en Rasamsonia emersonii. El vector comprende una región de flanqueo 5’ de 1500 pb 1,5 kb aguas arriba del ORF de RePepA para la orientación en el locus RePepA , consistiendo el casete de expresión de Temer00088, Temer09484, Temer08028, Temer02362, Temer08862, Temer04790, Temer05249, Temer06848, Temer02056, Temer03124, Temer09491, Temer06400, Temer08570, Temer08163 o Temer07305 en el promotor 2 de R. emersonii, la región codificante de Temer00088, Temer09484, Temer08028, Temer02362, Temer08862, Temer04790, Temer05249, Temer06848, Temer02056, Temer03124, Temer09491, Temer06400, Temer08570, Temer08163 o Temer07305 y el terminador amdS (TamdS) de A.nidulans, un sitio lox66, la parte 5’ no funcional de la región codificante ble (5' ble) conducida por el promotor gpdA de A.nidulans. El ADN de E. coli se retiró mediante digestión con la enzima de restricción Noti, antes de la transformación de las cepas de R. emersonii.

Fig. 5 Cromatograma obtenido mediante cromatografía de intercambio aniónico de alta resolución que muestra la formación de oligómeros por Temer04790 de Rasamsonia emersonii en comparación con una mezcla de celulasas comercial después de la incubación sobre xiloglucano durante 24 h de incubación a pH 4,5 y 60°C.

Breve descripción del listado de secuencias

La Tabla 2 muestra SEQ ID NO's de secuencias codificantes optimizadas para pares de codones, SEQ ID NO's de secuencias de aminoácidos, SEQ ID NO's de secuencias de señalización, SEQ ID NO's de secuencias de ADN genómicas y SEQ ID NO's y de secuencias codificantes silvestres de la presente invención.

SEQ ID NO: 76 RePepA de R. emersonii (secuencia genómica incluyendo flancos)

SEQ ID NO: 77 RePepA de R. emersonii (ADNc)

SEQ ID NO: 78 RePepA de R. emersonii (proteína)

SEQ ID NO: 79 Promotor gdpA de A. nidulans y parte 5' de la región codificante ble

SEQ ID NO: 80 parte 3' de la región codificante ble y terminador TrpC de A. nidulans

SEQ ID NO: 81 Promotor 2 de R. emersonii

SEQ ID NO: 82 Terminador AmdS de A.nidulans

Descripción detallada de la invención

A lo largo de la presente memoria descriptiva y las reivindicaciones adjuntas, las palabras "comprender" e "incluir" y variaciones tales como "comprende", "que comprende", "incluye" y "que incluye" se han de interpretar inclusivamente. Esto es, estas palabras están destinadas a transmitir la posible inclusión de otros elementos o números enteros no citados específicamente, cuando el contexto lo permita.

Los artículos "un" y "uno(a)" se usan en la presente para referirse a uno o a más de uno (es decir a uno o al menos uno) del objeto gramatical del artículo. A modo de ejemplo, "un elemento" puede significar un elemento o más de un elemento.

La presente invención proporciona polinucleótidos que codifican polipéptidos, p. ej. enzimas, que tienen la capacidad de modificar, por ejemplo degradar, un material glucídico. Un material glucídico es un material que comprende, consiste en o consiste sustancialmente en uno o más carbohidratos. Las enzimas son en la presente una subclase de polipéptidos.

Sustrato (también llamado materia prima) se usa en la presente para referirse a una sustancia que comprende material glucídico, que se puede tratar con enzimas según la invención, de modo que el material glucídico de la misma se modifique. Además del material glucídico, el sustrato puede contener cualquier otro componente, incluyendo, pero no limitado a, material no glucídico y almidón.

La presente invención proporciona polinucleótidos que codifican polipéptidos, p. ej. enzimas que tienen la capacidad de modificar, por ejemplo degradar, un material glucídico. Un material glucídico es un material que comprende, consiste en o consiste sustancialmente en uno o más carbohidratos. Las enzimas son en la presente una subclase de polipéptidos.

Una p-xilosidasa (EC 3.2.1.37) es cualquier polipéptido que sea capaz de catalizar la hidrólisis de 1,4-p-D-xilanos, para retirar residuos de D-xilosa sucesivos de los extremos no reductores. Estas enzimas también pueden hidrolizar xilobiosa. Esta enzima también se puede denominar xilano 1,4-p-xilosidasa, 1,4-p-D-xilano xilohidrolasa, exo-1,4-pxilosidasa o xilobiasa.

En la presente, una a-galactosidasa (EC 3.2.1.22; GH27) es cualquier polipéptido que sea capaz de catalizar la hidrólisis de residuos de a-D-galactosa no reductores terminales en a-D-galactósidos, incluyendo oligosacáridos de galactosa, galactomananos, galactanos y arabinogalactanos. Este polipéptido también puede ser capaz de hidrolizar a-D-fucósidos. Esta enzima también se puede denominar melibiasa.

En la presente, una xiloglucanasa es una endo-p-1,4-glucanasa específica de xiloglucano, que cataliza la escisión de xiloglucano, un esqueleto de residuos de glucosa con enlaces p1 ^ 4 , la mayoría de los cuales sustituidos con cadenas laterales de xilosa con enlaces 1 -6.

TEMER05249

Típicamente, un polipéptido de la invención codifica un polipéptido que tiene al menos actividad como alfaarabinofuranosidasa, tentativamente llamado TEMER05249, que tiene una secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO: 32, o una secuencia que es una de sus variantes, típicamente funcionalmente equivalente al polipéptido que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 32, o una secuencia que es un fragmento de cualquiera de ellas.

En la presente, una a-L-arabinofuranosidasa (EC 3.2.1.55) es cualquier polipéptido que sea capaz de actuar sobre a-L-arabinofuranósidos, a-L-arabinanos que contienen enlaces (1,2) y/o (1,3) y/o (1,5), arabinoxilanos y arabinogalactanos. Esta enzima también se puede denominar a-N-arabinofuranosidasa, arabinofuranosidasa o arabinosidasa.

Un polipéptido de la invención puede tener una o más actividades degradadoras de carbohidratos y/o hidrolizadoras de carbohidratos alternativas y/o adicionales distintas a la actividad como alfa-arabinofuranosidasa, por ejemplo una de las otras actividades degradadoras de carbohidratos y/o hidrolizadoras de carbohidratos mencionadas en la presente.

En la presente, una endoxilanasa (EC 3.2.1.8) es cualquier polipéptido que sea capaz de catalizar la endohidrólisis de enlaces glicosídicos 1,4-p-D en xilanos. Esta enzima también se puede denominar endo-1,4-p-xilanasa o 1,4-p-D-xilano xilanohidrolasa. Una alternativa es EC 3.2.1.136, una glucuronoarabinoxilano endoxilanasa, una enzima que es capaz de hidrolizar enlaces glicosídicos 1,4 en glucuronoarabinoxilanos.

En la presente, una p-manosidasa (EC 3.2.1.25) es cualquier polipéptido que sea capaz de catalizar la hidrólisis de residuos de p-D-manosa no reductores terminales en p-D-manósidos. Esta enzima también se puede denominar mananasa o manasa.

En la presente, una feruloilesterasa (EC 3.1.1.73; CE1) es cualquier polipéptido que sea capaz de catalizar una reacción en la forma: feruloil-sacárido H(2)O = ferulato sacárido. El sacárido puede ser, por ejemplo, un oligosacárido o un polisacárido. Típicamente, puede catalizar la hidrólisis del grupo 4-hidroxi-3-metoxicinamoílo (feruloílo) de un azúcar esterificado, que habitualmente es arabinosa en sustratos 'naturales'. El acetato de p-nitrofenol y el ferulato de metilo son sustratos típicamente más pobres. Esta enzima también se puede denominar éster cinamoílico hidrolasa, ácido ferúlico esterasa o hidroxicinamoilesterasa. También se puede denominar enzima auxiliar de hemicelulasa, ya que ayuda a las xilanasas y pectinasas a romper la hemicelulosa y la pectina de la pared celular vegetal.

En la presente, una a-D-glucuronidasa (EC 3.2.1.139; GH115) es cualquier polipéptido que sea capaz de catalizar una reacción de la siguiente forma: alfa-D-glucuronósido H(2)O = un alcohol D-glucuronato. Esta enzima también se puede denominar alfa-glucuronidasa o alfa-glucosiduronasa. Estas enzimas también pueden hidrolizar ácido glucurónico 4-O-metilado, que también puede estar presente como un sustituyente en xilanos. Una alternativa es EC 3.2.1.131: xilano alfa-1,2-glucuronosidasa, que cataliza la hidrólisis de enlaces alfa-1,2-(4-O-metil)glucuronosilo.

Carbohidrato en este contexto incluye todos los sacáridos, por ejemplo polisacáridos, oligosacáridos, disacáridos o monosacáridos.

Un polipéptido según la invención puede modificar un material glucídico al degradar químicamente o degradar físicamente este material o hidrolizar el carbohidrato. La modificación química del material glucídico puede dar como resultado la degradación de este material, por ejemplo mediante hidrólisis, oxidación u otra modificación química tal como mediante la acción de una liasa. La modificación física puede estar acompañada o no por modificación química.

Materiales glucídicos adecuados

Los materiales lignocelulolíticos o lignocelulósicos o la biomasa son abundantes en la naturaleza y tienen gran valor como fuentes de energía alternativas. Los biocombustibles de segunda generación, también conocidos como biocombustibles avanzados, son combustibles que se pueden fabricar a partir de diversos tipos de biomasa. Biomasa es un término amplio que significa cualquier fuente de carbono orgánico que se renueve rápidamente como parte del ciclo del carbono. La biomasa se deriva de materiales vegetales pero también puede incluir materiales animales. La composición de la biomasa lignocelulósica varía, el componente principal es celulosa (35-50%), seguido por xilano (20-35%, un tipo de hemicelulosa) y lignina (10-25%), además de componentes secundarios tales como proteínas, aceites y cenizas que constituyen la fracción restante de la biomasa lignocelulósica. La biomasa lignocelulósica contiene una variedad de carbohidratos. El término carbohidrato es el más común en bioquímica, donde es un sinónimo de sacárido. Los carbohidratos (sacáridos) se dividen en cuatro agrupaciones químicas: monosacáridos, disacáridos, oligosacáridos y polisacáridos. En general, los monosacáridos y disacáridos, que son carbohidratos menores (de peso molecular inferior), se denominan comúnmente azúcares.

Un carbohidrato no amiláceo adecuado para la modificación por un polipéptido de la invención es la lignocelulosa. Los principales polisacáridos que comprenden diferentes residuos lignocelulósicos, que se pueden considerar como una materia prima renovable potencial, son celulosa (glucanos), hemicelulosas (xilanos, heteroxilanos y xiloglucanos). Además, algo de hemicelulosa puede estar presente como glucomananos, por ejemplo en materias primas derivadas de madera. La hidrólisis enzimática de estos polisacáridos hasta azúcares solubles, por ejemplo glucosa, xilosa, arabinosa, galactosa, fructosa, manosa, ramnosa, ribosa, ácido D-galacturónico y otras hexosas y pentosas, se produce bajo la acción de diferentes enzimas que actúan conjuntamente.

La lignina rellena los espacios de la pared celular entre los componentes de celulosa, hemicelulosa y pectina, especialmente en traqueidas del xilema, elementos vasculares y esclereidas. Está enlazada covalentemente a hemicelulosa y, por lo tanto, retícula diferentes polisacáridos vegetales, confiriendo resistencia mecánica a la pared celular y por extensión a la planta como un todo. La lignina es un material polimérico aromático reticulado altamente hidrófobo que está formado por diferentes monómeros de monolignol, que pueden estar metoxilados en diversos grados. Existen tres monómeros de monolignol, metoxilados hasta diversos grados: alcohol p-cumarílico, alcohol coniferílico y alcohol sinapílico. Estos lignoles están incorporado en la lignina en la forma de los fenilpropanoides phidroxifenilo (H), guayacilo (G) y siringilo (S), respectivamente. La biodegradación de lignina es un requisito previo para procesar biocombustible procedente de materias primas vegetales. La lignina se puede degradar al aplicar diferentes métodos de pretratamiento, o al usar ligninasas o enzimas modificadoras de lignina (LME's). La mejora de la degradación de lignina conduciría al resultado del procesamiento del biocombustible hasta una mejor ganancia o un mejor factor de eficacia, por ejemplo al mejorar la accesibilidad a los componentes (hemi)celulósicos o al retirar enlaces de lignina-(hemi)celulosa en oligosacáridos liberados mediante la acción de (hemi)celulasas.

Además, las pectinas y otras sustancias pécticas tales como los arabinanos pueden constituir una proporción considerable de la masa seca típicamente de paredes celulares de tejidos de plantas no leñosas (alrededor de un cuarto a la mitad de la masa seca pueden ser pectinas).

La celulosa es un polisacárido lineal compuesto por residuos de glucosa enlazados por uniones p-1,4. La naturaleza lineal de las fibras de celulosa, así como la estequiometría de la glucosa con enlazada en p (con relación a a), genera estructuras más tendentes a unión por hidrógeno intercatenaria que las estructuras con enlaces a altamente ramificadas del almidón. Así, los polímeros de celulosa son generalmente menos solubles, y forman fibras más estrechamente unidas que las fibras encontradas en el almidón.

La hemicelulosa es un polímero complejo, y su composición a menudo varía ampliamente de organismo a organismo y de un tipo de tejido a otro. En general, un componente principal de la hemicelulosa es xilosa con enlaces p-1,4, un azúcar de cinco carbonos. Sin embargo, esta xilosa a menudo está ramificada en O-3 y/u O-2 y puede estar sustituida con enlaces a arabinosa, galactosa, manosa, ácido glucurónico, ácido galacturónico o por esterificación a ácido acético (y esterificación de ácido ferúlico a arabinosa). La hemicelulosa también puede contener glucano, que es un término general para azúcares de seis carbonos con enlaces p (tales como los glucanos y heteroglucanos p-(1,3)(1,4) mencionados previamente) y adicionalmente glucomananos (en los que están presentes tanto glucosa como manosa en el esqueleto lineal, enlazadas entre sí por enlaces p).

La composición, la naturaleza de la sustitución y el grado de ramificación de hemicelulosa es muy diferente en plantas dicotiledóneas (es decir, una planta cuyas semillas tienen dos cotiledones u hojas seminales tales como habas, cacahuetes, almendras, guisantes, frijoles) en comparación con plantas monocotiledóneas (es decir, plantas que tiene un solo cotiledón u hoja seminal tales como maíz, trigo, arroz, hierbas, cebada). En la dicotiledóneas, la hemicelulosa está comprendida principalmente por xiloglucanos que son cadenas de glucosa con enlaces 1,4-p con cadenas laterales de xilosilo con enlaces 1,6-p. En las monocotiledóneas, incluyendo la mayoría de los cultivos de cereales, los principales componentes de la hemicelulosa son heteroxilanos. Estos están comprendidos principalmente por polímeros del esqueleto de xilosa con enlaces 1,4-p con enlaces 1,3-a con arabinosa, galactosa, manosa y ácido glucurónico o ácido 4-O-metil-glucurónico así como xilosa modificada mediante ácidos acéticos con enlaces éster. También están presentes p-glucanos comprendidos por cadenas de glucosilo con enlaces 1,3 y 1,4-B. En las monocotiledóneas, pueden estar presentes celulosa, heteroxilanos y p-glucanos en cantidades aproximadamente iguales, comprendiendo cada uno aproximadamente 15-25% de la materia seca de paredes celulares. Además, diferentes plantas pueden comprender cantidades diferentes de, y diferentes composiciones de, sustancias pécticas. Por ejemplo, la remolacha azucarera contiene alrededor de 19% de pectina y alrededor de 21% de arabinano sobre una base en peso seco.

Según esto, una composición de la invención se puede ajustar a la vista de la materia prima (también llamada sustrato) particular que se vaya a usar. Es decir, el espectro de actividades en una composición de la invención puede variar dependiendo de la materia prima en cuestión.

Las combinaciones de enzimas o los tratamientos físicos se pueden administrar concomitantemente o secuencialmente. Las enzimas se pueden producir exógenamente en microorganismos, levaduras, hongos, bacterias o plantas, y a continuación aislarse y añadirse a la materia prima lignocelulósica. Alternativamente, las enzimas se producen, pero no se aíslan, y se añaden a la materia prima caldo de fermentación de la masa celular cruda, o material vegetal (tal como rastrojo de maíz) y similares. Alternativamente, la masa celular cruda o el medio de producción de enzimas o el material vegetal se pueden tratar para prevenir el crecimiento microbiano adicional (por ejemplo, mediante calentamiento o adición de agentes antimicrobianos), y a continuación se añade a la materia prima. Estas mezclas de enzimas crudas puede incluir el organismo que produce la enzima. Alternativamente, la enzima se puede producir en una fermentación que usa materia prima (tal como rastrojo de maíz) para proporcionar nutrición a un organismo que produce una enzima o enzimas. De este modo, plantas que producen las enzimas pueden servir como la materia prima lignocelulósica y añadirse a la materia prima lignocelulósica.

Actividad enzimática

Las endo-1,4-p-glucanasas (EG) y las exocelobiohidrolasas (CBH) catalizan la hidrólisis de celulosa insoluble hasta celooligosacáridos (celobiosa como un producto principal), mientras que las p-glucosidasas (BGL) convierten los oligosacáridos, principalmente celobiosa y celotriosa, en glucosa.

Las xilanasas junto con otras enzimas auxiliares, por ejemplo a-L-arabinofuranosidasas, feruloil y acetilxilano esterasas, glucuronidasas y p-xilosidasas) catalizan la hidrólisis de parte de las hemicelulosas.

Las sustancias pécticas incluyen pectinas, arabinanos, galactanos y arabinogalactanos. Las pectinas son los polisacáridos más complejos en la pared celular vegetal. Se acumulan alrededor de una cadena central de unidades de ácido D-galacturónico con enlaces a(1,4) intercalados en algún grado con L-ramnosa. En cualquier pared celular existe un número de unidades estructurales que se ajustan a esta descripción y generalmente se ha considerado que en una molécula péctica individual, las cadenas centrales de diferentes unidades estructurales son continuas entre sí.

Las pectinasas incluyen, por ejemplo, una endopoligalacturonasa, una pectina metilesterasa, una endogalactanasa, una p-galactosidasa, una pectina acetilesterasa, una endopectina liasa, pectato liasa, a-ramnosidasa, una exogalacturonasa, un exopoligalacturonato liasa, una ramnogalacturonano hidrolasa, una ramnogalacturonano liasa, una ramnogalacturonano acetil esterasa, una ramnogalacturonano galacturonohidrolasa, una xilogalacturonasa, una a-arabinofuranosidasa.

Los principales tipos de unidad estructural son: galacturonano (homogalacturonano), que puede estar sustituido con metanol en el grupo carboxilo y acetato en O-2 y O-3; ramnogalacturonano I (RGI), en el que unidades de ácido galacturónico se alternan con unidades de ramnosa que soportan galactano con enlaces (1,4) y arabinano con enlaces (1,5). Las cadenas laterales de arabinano pueden estar ligadas directamente a ramnosa o indirectamente a través de cadenas de galactano; xilogalacturonano, con unidades de xilosilo simples en O-3 del ácido galacturónico (estrechamente asociado con RGI); y ramnogalacturonano II (RGII), una unidad secundaria particularmente compleja que contiene azúcares inusuales, por ejemplo apiosa. Una unidad de RGII puede contener dos residuos de apiosilo que, bajo condiciones iónicas adecuadas, pueden formar reversiblemente ésteres con borato.

Según se indica anteriormente, un polipéptido de la invención tendrá típicamente una actividad según la Tabla 1. Sin embargo, un polipéptido de la invención puede tener una o más de las actividades indicadas anteriormente además de o alternativamente a esa actividad. Además, una composición de la invención según se describe en la presente puede tener una o más de las actividades mencionadas anteriormente además de la proporcionada por un polipéptido de la invención que tiene una actividad según la Tabla 1.

Secuencia polinucleotídica

La invención proporciona secuencias polinucleotídicas genómicas que comprenden el gen que codifica el Temer05249 así como su secuencia codificante. Según esto, la invención se refiere a un polinucleótido aislado que comprende la secuencia nucleotídica genómica según la secuencia nucleotídica codificante según SEQ ID NO: 31 o SEQ ID NO: 34 o SEQ ID NO: 35 y a variantes, tales como equivalentes funcionales, de cualquiera de las mismas.

En particular, la invención se refiere a un polinucleótido aislado que es capaz de hibridarse selectivamente, por ejemplo bajo condiciones rigurosas, preferiblemente bajo condiciones muy rigurosas, con el complemento inverso de un polinucleótido que comprende la secuencia indicada en SEQ ID NO: 31 o en SEQ ID NO: 34 o en SEQ ID NO: 35.

Más específicamente, la invención se refiere a un polinucleótido que comprende o que consiste esencialmente en una secuencia nucleotídica según SEQ ID NO: 31 o SEQ ID NO: 34 o SEQ ID NO: 35.

La invención también se refiere a un polinucleótido aislado que comprende o que consiste esencialmente en una secuencia que codifica al menos un dominio funcional de un polipéptido según SEQ ID NO: 32 o una de sus variantes, tal como un equivalente funcional, o un fragmento de cualquiera de las mismas.

Según se usan en la presente, los términos "gen" y "gen recombinante" se refieren a moléculas de ácido nucleico que se pueden aislar de ADN cromosómico, que incluyen un marco de lectura abierta que codifica una proteína, p. ej. la actividad según la presente invención.

Un gen puede incluir secuencias codificantes, secuencias no codificantes, intrones y/o secuencias reguladoras. Por otra parte, el término "gen" se puede referir a una molécula de ácido nucleico aislada según se define en la presente.

Una molécula de ácido nucleico de la presente invención, tal como una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia nucleotídica de SEQ ID NO: 31 o SEQ ID NO: 34 o SEQ ID NO: 35 o una de sus variantes, tales como un equivalente funcional, se puede aislar usando técnicas de biología molecular estándar y la información de secuencias proporcionada en la presente. Por ejemplo, usar la totalidad o una porción de la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 31 como una sonda de hibridación, se pueden aislar moléculas de ácido nucleico según la invención usando técnicas de hibridación y clonación estándar (p. ej., según se describe en Sambrook, J., Fritsh, E. F., y Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989).

Por otra parte, una molécula de ácido nucleico que abarca la totalidad o una porción de SEQ ID NO: 31 o SEQ ID NO: 34 o SEQ ID NO: 35 se puede aislar mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) usando sondas oligonucleotídicas sintéticas diseñadas basándose en la información de secuencia contenida en SEQ ID NO: 31 o en SEQ ID NO: 34 o en SEQ ID NO: 35.

Un ácido nucleico de la invención se puede amplificar usando ADNc, ARNm o, alternativamente, ADN genómico, como una plantilla y cebadores oligonucleotídicos apropiados según técnicas de amplificación por PCR estándar. El ácido nucleico así amplificado se puede clonar en un vector apropiado y caracterizar mediante análisis de secuencias de ADN.

Por otra parte, oligonucleótidos correspondientes a o hibridables a una secuencia nucleotídica según la invención se pueden preparar mediante técnicas sintéticas estándar, p. ej., usando un sintetizador de ADN automatizado.

En una realización preferida, una molécula de ácido nucleico aislada de la invención comprende la secuencia nucleotídica mostrada en SEQ ID NO: 31 o en SEQ ID NO: 34 o en SEQ ID NO: 35.

En otra realización preferida, una molécula de ácido nucleico aislada de la invención comprende una molécula de ácido nucleico que es el complemento inverso de la secuencia nucleotídica mostrada en SEQ ID NO: 31 o en SEQ ID NO: 34 o en s Eq ID NO: 35 o una variante, tal como un equivalente funcional, de cualquiera de estas secuencias nucleotídicas.

Una molécula de ácido nucleico que es complementaria a otra secuencia nucleotídica es una que es suficientemente complementaria a la otra secuencia nucleotídica de modo que se pueda hibridar a la otra secuencia nucleotídica formando de ese modo un dúplex estable.

Un aspecto de la invención trata de moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican un polipéptido de la invención o una variante, tal como uno de sus equivalentes funcionales, por ejemplo un fragmento o dominio biológicamente activo, así como moléculas de ácido nucleico suficientes para el uso como sondas de hibridación para identificar moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido de la invención y fragmentos de estas moléculas de ácido nucleico adecuados para el uso como cebadores de PCR para la amplificación o mutación de moléculas de ácido nucleico.

Un polinucleótido según la invención puede estar "aislado". En el contexto de esta invención, un "polinucleótido aislado" o "ácido nucleico aislado" es un ADN o ARN que no es inmediatamente contiguo con una o ambas de las secuencias codificantes con las que es inmediatamente contiguo (una en el extremo 5' y una en el extremo 3') en el genoma presente en la naturaleza del organismo del que se deriva. Así, en una realización, un ácido nucleico aislado incluye alguna o todas las secuencias no codificantes (p. ej. promotoras) 5’ que son inmediatamente contiguas a la secuencia codificante. Por lo tanto, el término incluye, por ejemplo, un ADN recombinante que está incorporado en un vector, en un plásmido o virus autónomamente replicativo, o en el ADN genómico de un procariota o eucariota, o que existe como una molécula separada (p. ej., un ADNc o un fragmento de ADN genómico producido mediante PCR o tratamiento con endonucleasas de restricción) independientemente de otras secuencias. También incluye un ADN recombinante que es parte de un gen híbrido que codifica un polipéptido adicional que está sustancialmente libre de material celular, material viral o medio de cultivo (cuando se produce mediante técnicas de ADN recombinante), o precursores químicos u otros productos químicos (cuando se sintetiza químicamente). Por otra parte, un "fragmento de ácido nucleico aislado" es un fragmento de ácido nucleico que no está presente en la naturaleza como un fragmento y no se encontraría en estado natural.

Según se usan en la presente, los términos "polinucleótido" o "molécula de ácido nucleico" están destinados a incluir moléculas de ADN (p. ej., ADNc o ADN genómico) y moléculas de ARN (p. ej., ARNm) y análogos del ADN o ARN generados usando análogos nucleotídicos. La molécula de ácido nucleico puede ser monocatenaria o bicatenaria, pero, preferiblemente, es ADN bicatenario. El ácido nucleico se puede sintetizar usando análogos o derivados oligonucleotídicos (p. ej., nucleótidos de inosina o fosforotioato). Estos oligonucleótidos se pueden usar, por ejemplo, para preparar ácidos nucleicos que tienen capacidades alteradas de apareamiento de bases o una resistencia incrementada a nucleasas.

Otra realización de la invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que es antisentido con respecto a una molécula de ácido nucleico de Temer05249, p. ej., la hebra codificante de una molécula de ácido nucleico de Temer05249. También se incluyen dentro del alcance de la invención las hebras complementarias de las moléculas de ácido nucleico descritas en la presente.

A menos que se indique otra cosa, todas las secuencias nucleotídicas determinadas al secuenciar una molécula de ADN se determinaron en la presente usando un secuenciador de ADN automatizado y todas las secuencias de aminoácidos de polipéptidos codificados por moléculas de ADN determinadas en la presente se predijeron mediante la traducción de una secuencia de ADN determinada como anteriormente. Por lo tanto, como se sabe en la especialidad para cualquier secuencia de ADN determinada mediante este enfoque automatizado, cualquier secuencia nucleotídica determinada en la presente puede contener algunos errores. Las secuencias nucleotídicas determinadas mediante automatización son típicamente al menos aproximadamente 90% idénticas, más típicamente de al menos aproximadamente 95% a al menos aproximadamente 99,9% idénticas, a la secuencia nucleotídica real de la molécula de ADN secuenciada.

La secuencia real se puede determinar más precisamente mediante otros enfoques incluyendo métodos de secuenciación de ADN manuales muy conocidos en la especialidad. Como también se conoce en la especialidad, una sola inserción o eliminación en una secuencia nucleotídica determinada en comparación con la secuencia real provocará un cambio de marco en la traducción de la secuencia nucleotídica de modo que la secuencia de aminoácidos predicha codificada por una secuencia nucleotídica determinada será completamente diferente de la secuencia de aminoácidos realmente codificada por la molécula de ADN secuenciada, empezando en el punto de esta inserción o eliminación.

El experto en la especialidad es capaz de identificar estas bases erróneamente identificadas y sabe cómo corregir estos errores.

Una molécula de ácido nucleico según la invención puede comprender solamente una porción o un fragmento de la secuencia de ácido nucleico mostrada en SEQ ID NO: 31 o en SEQ ID NO: 34 o en SEQ ID NO: 35 (o de una variante de cualquiera de las mismas), por ejemplo un fragmento que se puede usar como una sonda o cebador o un fragmento que codifica una porción de una proteína Temer05249.

La secuencia nucleotídica determinada a partir de la clonación del gen Temer05249 y ADNc permite la generación de sondas y cebadores diseñados para el uso en la identificación y/o la clonación de otros miembros de la familia Temer05249, así como homólogos de Temer05249 procedentes de otras especies.

La sonda/el cebador comprende típicamente un oligonucleótido sustancialmente purificado que comprende típicamente una región de secuencia nucleotídica que se hibrida preferiblemente bajo condiciones muy rigurosas a al menos de aproximadamente 12 a aproximadamente 15, preferiblemente de aproximadamente 18 a aproximadamente 20, preferiblemente de aproximadamente 22 a aproximadamente 25, más preferiblemente aproximadamente 30, aproximadamente 35, aproximadamente 40, aproximadamente 45, aproximadamente 50, aproximadamente 55, aproximadamente 60, aproximadamente 65 o aproximadamente 75 o más nucleótidos consecutivos de una secuencia nucleotídica mostrada en SEQ ID NO: 31 o en SEQ ID NO: 34 o en SEQ ID NO: 35 o de una variante, tal como un equivalente funcional, de cualquiera de las mismas.

Sondas basadas en secuencias nucleotídicas de Temer05249 se pueden usar para detectar transcritos o secuencias de Temer05249 genómicas que codifican proteínas iguales u homólogas, por ejemplo, en otros organismos. En realizaciones preferidas, la sonda comprende además un grupo de etiquetado ligado a la misma, p. ej., el grupo de etiquetado puede ser un radioisótopo, un compuesto fluorescente, una enzima o un cofactor enzimático. Tales sondas también se pueden usar como parte de un estuche de pruebas diagnósticas para identificar células que expresan una proteína TEMER09484.

Los polinucleótidos de la presente pueden ser polinucleótidos sintéticos. Los polinucleótidos sintéticos se pueden optimizar en uso en codones, preferiblemente según los métodos descritos en los documentos WO2006/077258 y/o PCT/EP2007/055943. El documento PCT/EP2007/055943 se dirige a la optimización de pares de codones. La optimización de pares de codones es un método en el que las secuencias nucleotídicas que codifican un polipéptido se han modificado con respecto a su utilización de codones, en particular los pares de codones que se usan, para obtener una expresión mejorada de la secuencia nucleotídica que codifica el polipéptido y/o la producción mejorada del polipéptido codificado. Los pares de codones se definen como un conjunto de dos tripletes (codones) posteriores en una secuencia codificante.

La invención se refiere además a un constructo de ácido nucleico que comprende el polinucleótido que se describe anteriormente. "Constructo de ácido nucleico" se define en la presente como una molécula de ácido nucleico, bien mono- o bien bicatenaria, que se aísla de un gen presente en la naturaleza o que se ha modificado para contener segmentos de ácido nucleico que están combinados y yuxtapuestos de un modo que de otra manera no existiría en la naturaleza. El término constructo de ácido nucleico es sinónimo al término "casete de expresión" cuando el constructo de ácido nucleico contiene todas las secuencias de control requeridas para la expresión de una secuencia codificante. El término "secuencia codificante" según se define en la presente es una secuencia que se transcribe en ARNm y se traduce en un activador transcripcional de un promotor de proteasa de la invención. Los límites de la secuencia codificante se determinan generalmente mediante el codón de partida ATG en el extremo 5' del ARNm y una secuencia de codón de parada de la traducción que termina el marco de lectura abierto en el extremo 3' del ARNm. Una secuencia codificante puede incluir, pero no se limita a, ADN, ADNc y secuencias de ácido nucleico recombinantes.

Preferiblemente, el ácido nucleico tiene alto contenido de GC. El contenido de GC indica en la presente el número de nucleótidos G y C en la construcción, dividido por el número total de nucleótidos, expresado en %. El contenido de GC es preferiblemente 56% o más, 57% o más, 58% o más, 59% o más, 60% o más, o en el intervalo de 56-70% o el intervalo de 58-65%. Preferiblemente, la construcción de ADN comprende una secuencia de ADN promotora, una secuencia codificante en asociación operativa con dicha secuencia de ADN promotora y secuencias de control tales como:

- una secuencia de terminación de la traducción orientada en la dirección 5' a 3' seleccionada de la siguiente lista de secuencias: TAAG, TAGA y TAAA, preferiblemente TAAA, y/o

- una secuencia codificante iniciadora de la traducción orientada en la dirección 5' a 3' seleccionada de la siguiente lista de secuencias: GCTACCCCC; GCTACCTCC; GCTACCCTC; GCTACCTTC; GCTCCCCCC; GCTCCCTCC; GCTCCCCTC; GCTCCCTTC; GCTGCCCCC; GCTGCCTCC; GCTGCCCTC; GCTGCCTTC; GCTTCCCCC; GCTTCCTCC; GCTTCCCTC; y GCTTCCTTC, preferiblemente GCT TCC TTC, y/o

- una secuencia iniciadora de la traducción seleccionada de la siguiente lista de secuencias: 5'-mwChkyCAAA-3'; 5'-mwChkyCACA-3' o 5'-mwChkyCAAG-3', usando códigos de ambigüedad para nucleótidos: m (A/C); w (A/T); y (C/T); k (G/T); h (A/C/T), preferiblemente 5'-CACCGTCAAA-3' o 5'-CGCAGTCAAG-3'.

En el contexto de esta invención, el término "secuencia codificante iniciadora de la traducción" se define como los nueve nucleótidos inmediatamente aguas abajo del codón iniciador o de partida del marco de lectura abierto de una secuencia codificante de ADN. El codón iniciador o de partida codifica el AA metionina. El codón iniciador es típicamente ATG, pero también puede ser cualquier codón de partida funcional tal como GTG.

En el contexto de esta invención, el término "secuencia de terminación de la traducción" se define como los cuatro nucleótidos partiendo del codón de parada de la traducción en el extremo 3' del marco de lectura abierto o la secuencia codificante nucleotídica y orientados en la dirección 5' a 3'.

En el contexto de esta invención, el término "secuencia iniciadora de la traducción" se define como los diez nucleótidos inmediatamente aguas arriba del codón iniciador o de partida del marco de lectura abierto de una secuencia de ADN que codifica un polipéptido. El codón iniciador o de partida codifica el AA metionina. El codón iniciador es típicamente ATG, pero también puede ser cualquier codón de partida funcional tal como GTG. Se sabe bien en la especialidad que el uracilo, U, reemplaza al desoxinucleótido timina, T, en el ARN.

Homología e identidad

Se dice que las secuencias de aminoácidos o nucleotídicas son homólogas cuando exhiben un cierto nivel de similitud. Dos secuencias que son homólogas indican un origen evolutivo común. Que dos secuencias homólogas estén estrechamente relacionadas o más distantemente relacionadas se indican por el "porcentaje de identidad" o "porcentaje de similitud", que es alto o bajo, respectivamente. Aunque es discutible, para indicar el "porcentaje de identidad" o el "porcentaje de similitud", se usan frecuentemente de forma intercambiable el "nivel de homología" o "el porcentaje de homología".

Los términos "homología", "porcentaje de homología", "porcentaje de identidad" o "porcentaje de similitud" se usan intercambiablemente en la presente. Para el propósito de esta invención, se define aquí que a fin de determinar el porcentaje de identidad de dos secuencias de aminoácidos o de dos secuencias de ácido nucleico, las secuencias completas se alinean con propósitos de comparación óptimos. A fin de optimizar la alineación entre las dos secuencias, se pueden introducir huecos en cualquiera de las dos secuencias que se comparan. Este alineamiento se lleva a cabo a lo largo de toda la longitud de las secuencias que se comparan. Alternativamente, el alineamiento se puede llevar a cabo a lo largo de una longitud más corta, por ejemplo a lo largo de aproximadamente 20, aproximadamente 50, aproximadamente 100 o más ácidos nucleicos/bases o aminoácidos. La identidad es el porcentaje de coincidencias de identidad entre las dos secuencias sobre la región alineada presentada.

Una comparación de secuencias y una determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias se pueden efectuar usando un algoritmo matemático. El experto conocerá el hecho de que están disponibles varios programas informáticos diferentes para alinear dos secuencias y determinar la homología entre dos secuencias (Kruskal, J. B. (1983) An overview of sequence comparison en D. Sankoff y J. B. Kruskal, (ed.), Time warps, string edits and macromolecules: the theory and practice of sequence comparison, pp. 1-44 Addison Wesley). El porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos se pueden determinar usando el algoritmo de Needleman y Wunsch para el alineamiento de dos secuencias. (Needleman, S. B. y Wunsch, C. D. (1970) J. Mol. Biol. 48, 443-453). El algoritmo alinea secuencias de aminoácidos así como secuencias nucleotídicas. El algoritmo de Needleman-Wunsch se ha ejecutado en el programa informático NEEDLE. Para el propósito de esta invención, se usó el programa NEEDLE del lote EMBOSS (versión 2.8.0 o superior, EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite (2000) Rice,P. Longden,l. y Bleasby,A. Trends in Genetics 16, (6) pp276-277, http://emboss.bioinformatics.nl/). Para secuencias de proteínas, se usa EBLOSUM62 para la matriz de sustitución. Para secuencias nucleotídicas, se usa EDNAFULL. Se pueden especificar otras matrices. Los parámetros opcionales usados para el alineamiento de secuencias de aminoácidos son una penalización por apertura de hueco de 10 y una penalización por extensión del hueco de 0,5. El experto apreciará que todos estos parámetros diferentes darán resultados ligeramente diferentes pero que el porcentaje de identidad global de dos secuencias no se altera significativamente cuando se usan diferentes algoritmos.

Definición de Homología Global

La homología o identidad es el porcentaje de coincidencias idénticas entre las dos secuencias completas a lo largo de la región alineada total incluyendo cualesquiera huecos o extensiones. La homología o identidad entre las dos secuencias alineadas se calcula como sigue: Número de posiciones correspondientes en el alineamiento que muestra un aminoácido idéntico en ambas secuencias dividido por la longitud total del alineamiento incluyendo los huecos. La identidad definida como en la presente se puede obtener a partir de NEEDLE y está marcada en la salida del programa como "IDENTITY".

Definición de la Identidad más Larga

La homología o identidad entre las dos secuencias alineadas se calcula como sigue: Número de posiciones correspondientes en el alineamiento que muestran un aminoácido idéntico en ambas secuencias dividido por la longitud total del alineamiento después de la sustracción del número total de huecos del alineamiento. La identidad definida como en la presente se puede obtener a partir de NEEDLE al usar la opción NOBRIEF y se marca en la salida del programa como "identidad más larga". Para los propósitos de la invención, el nivel del identidad (homología) entre dos secuencias (aminoácido o nucleótido) se calcula según la definición de "identidad más larga" que se puede llevar a cabo al usar el programa NEEDLE.

Las secuencias proteínicas de la presente invención se pueden usar además como "secuencia incógnita" para realizar una búsqueda frente a bases de datos de secuencias, por ejemplo para identificar otros miembros de la familia o secuencias relacionadas. Estas búsquedas se pueden realizar usando los programas BLAST. El software para realizar análisis BLAST está disponible públicamente a través de the National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). BLASTP se usa para secuencias de aminoácidos y BLASTN para secuencias nucleotídicas. El programa BLAST usa como defectos:

- Coste para abrir un hueco: defecto = 5 para nucleótidos/ 11 para proteínas

- Coste para extender un hueco: defecto = 2 para nucleótidos/ 1 para proteínas

- Penalización para divergencia de nucleótidos: defecto = -3

- Recompensa para coincidencia de nucleótidos: defecto = 1

- Valor esperado: defecto = 10

- Tamaño de palabra: defecto = 11 para nucleótidos/ 28 para megablast/ 3 para proteínas

Por otra parte, el grado de identidad (homología) local entre la incógnita de secuencia de aminoácidos o la incógnita de secuencia de ácido nucleico y las secuencias homólogas recuperadas se determina mediante el programa BLAST. Sin embargo, solamente se comparan los segmentos de secuencia que dan una coincidencia por encima de un cierto umbral. Según esto, el programa calcula la identidad solamente para estos segmentos coincidentes. Por lo tanto, la identidad calculada de este modo se denomina identidad local.

Vectores

Otro aspecto de la invención trata de vectores, incluyendo vectores de clonación y expresión, que comprenden un polinucleótido de la invención que codifica una proteína TEMER09484 o uno de sus equivalentes funcionales y métodos de crecimiento, transformación o transfección de estos vectores en una célula hospedadora adecuada, por ejemplo bajo condiciones en las que se produce la expresión de un polipéptido de la invención. Según se usa en la presente, el término "vector" se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al que se ha enlazado.

Los polinucleótidos de la invención se pueden incorporar a un vector replicable recombinante, por ejemplo un vector de clonación o expresión. El vector se puede usar para replicar el ácido nucleico en una célula hospedadora compatible. Así, en una realización adicional, la invención proporciona un método para elaborar polinucleótidos de la invención al introducir un polinucleótido de la invención en un vector replicable, introducir el vector en una célula hospedadora compatible y hacer crecer la célula hospedadora bajo condiciones que lleven a cabo la replicación del vector. El vector se puede recuperar de la célula hospedadora. Células hospedadoras adecuadas se describen posteriormente.

El vector en el que se inserta el casete de expresión o polinucleótido de la invención puede ser cualquier vector que se pueda someter convenientemente a procedimientos de ADN recombinante, y la elección del vector dependerá a menudo de la célula hospedadora en la que se vaya a introducir.

Un vector según la invención puede ser un vector autónomamente replicativo, es decir un vector que existe como una entidad extracromosómica, cuya replicación es independiente de la replicación cromosómica, p. ej. un plásmido. Alternativamente, el vector puede ser uno que, cuando se introduce en una célula hospedadora, se integra en el genoma de la célula hospedadora y se replica junto con el cromosoma o los cromosomas en los que se ha integrado.

Un tipo de vector es un "plásmido", que se refiere a un ciclo de ADN bicatenario circular al que se pueden ligar segmentos de ADN adicionales. Otro tipo de vector es un vector viral, en el que se pueden ligar segmentos de ADN adicionales en el genoma viral. Ciertos vectores son capaces de replicación autónoma en una célula hospedadora en la que se introducen (p. ej., vectores bacterianos que tienen un origen de replicación bacteriano y vectores de mamífero episómicos). Otros vectores (p. ej., vectores de mamífero no episómicos) se integran en el genoma de una célula hospedadora tras la introducción en la célula hospedadora, y de ese modo se replican junto con el genoma del hospedador. Por otra parte, ciertos vectores son capaces de dirigir la expresión de genes a los que están enlazados operativamente. Estos vectores se denominan en la presente "vectores de expresión". En general, los vectores de expresión de utilidad en técnicas de ADN recombinante están a menudo en forma de plásmidos. Los términos "plásmido" y "vector" se pueden usar intercambiablemente en la presente ya que el plásmido es la forma de vector más comúnmente usada. Sin embargo, la invención está destinada a incluir estas otras formas de vectores de expresión, tales como un cósmido, vectores virales (p. ej., retrovirus, adenovirus y virus adenoasociados defectuosos en cuanto a la replicación) y vectores fágicos que realizan funciones equivalentes.

Los vectores según la invención se pueden usar in vitro, por ejemplo para la producción de ARN, o se pueden usar para transfectar o transformar una célula hospedadora.

Un vector de la invención puede comprender dos o más, por ejemplo tres, cuatro o cinco polinucleótidos de la invención, por ejemplo para la sobreexpresión.

Los vectores de expresión recombinantes de la invención comprenden un ácido nucleico de la invención en una forma adecuada para la expresión del ácido nucleico en una célula hospedadora, lo que significa que el vector de expresión recombinante incluye una o más secuencias reguladoras, seleccionadas basándose en las células hospedadoras que se van a usar para la expresión, que están enlazadas operativamente a la secuencia de ácido nucleico que se va a expresar.

Dentro de un vector, tal como un vector de expresión, "enlazado operativamente" se pretende indicar que la secuencia nucleotídica de interés está enlazada a la secuencia o las secuencias reguladoras de un modo que permita la expresión de la secuencia nucleotídica (p. ej., en un sistema de transcripción/traducción in vitro o en una célula hospedadora cuando el vector se introduce en la célula hospedadora), es decir el término "enlazado operativamente" se refiere a una yuxtaposición en la que los componentes descritos están en una relación que los permita funcionar en su modo pretendido. Una secuencia reguladora tal como un promotor, potenciador u otra señal de regulación de la expresión "enlazado operativamente" a una secuencia codificante está situado de tal modo que la expresión de la secuencia codificante se alcance bajo una condición compatible con las secuencias de control o las secuencias están dispuestas de modo que funcionen conjuntamente para su propósito pretendido, por ejemplo la transcripción se inicia en un promotor y avanza a través de secuencia de ADN que codifica el polipéptido.

Un vector o constructo de expresión para una célula hospedadora dada puede comprender así los siguientes elementos enlazados operativamente entre sí en un orden consecutivo del extremo 5' al extremo 3' con relación a la hebra codificante de la secuencia que codifica el polipéptido de la primera invención: (1) una secuencia promotora capaz de dirigir la transcripción de la secuencia nucleotídica que codifica el polipéptido en la célula hospedadora dada; (2) opcionalmente, una secuencia de señalización capaz de dirigir la secreción del polipéptido procedente de la célula hospedadora dada en un medio de cultivo; (3) una secuencia de ADN de la invención que codifica una forma madura y preferiblemente activa de un polipéptido que tiene actividad como celobiohidrolasa; y preferiblemente también (4) una región de terminación de la transcripción (terminador) capaz de terminar la transcripción aguas abajo de la secuencia nucleotídica que codifica el polipéptido.

Aguas abajo de la secuencia nucleotídica según la invención puede existir una región no traducida 3' que contiene uno o más sitios de terminación de la transcripción (p. ej. un terminador). El origen del terminador es menos crítico. Por ejemplo, el terminador puede ser natural a la secuencia de ADN que codifica el polipéptido. Sin embargo, preferiblemente, se usa un terminador de levadura en células hospedadoras de levadura y se usa un terminador de hongo filamento en células hospedadoras de hongo filamentoso. Más preferiblemente, el terminador es endógeno a la célula hospedadora (en la que se va a expresar la secuencia nucleotídica que codifica el polipéptido). En la región transcrita, puede estar presente un sitio de unión al ribosoma para la traducción. La porción codificante de los transcritos maduros expresados por los constructos incluirán un AUG iniciador de la traducción al principio y un codón de terminación situado apropiadamente en el extremo del polipéptido que se va a traducir.

Una expresión potenciada del polinucleótido de la invención también se puede alcanzar mediante la selección de regiones reguladoras heterólogas, p. ej. regiones promotoras, líderes de secreción y/o terminadoras, que pueden servir para incrementar los niveles de expresión y, si se desea, secreción de la proteína de interés desde el hospedador de expresión y/o para proporcionar el control inducible de la expresión de un polipéptido de la invención.

Será apreciado por los expertos en la especialidad que el diseño del vector de expresión puede depender de factores tales como la elección de la célula hospedadora que se va a transformar, el nivel de expresión de proteína deseado, etc. Los vectores, tales como vectores de expresión, de la invención se pueden introducir en células hospedadoras para producir de ese modo proteínas o péptidos, codificados por ácidos nucleicos según se describe en la presente (p. ej. proteínas TEMER09484, formas mutantes de proteínas TEMER09484, sus fragmentos, variantes o equivalentes funcionales. Los vectores, tales como vectores de expresión recombinantes, de la invención se pueden diseñar para la expresión de proteínas TEMER09484 en células procarióticas o eucarióticas.

Por ejemplo, las proteínas TEMER09484 se pueden expresar en células bacterianas tales como E. coli, células de insecto (usando vectores de expresión baculovirales), hongos filamentosos, células de levadura o células de mamífero. Células hospedadoras adecuadas se analizan adicionalmente en Goeddel, Gene Expresión Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990). Ejemplos representativos de hospedadores apropiados se describen posteriormente en la presente.

Medios y condiciones de cultivo apropiados para las células hospedadoras descritas anteriormente son conocidos en la especialidad.

El vector de expresión recombinante se puede transcribir y traducir in vitro, por ejemplo usando secuencias reguladoras promotoras de T7 y polimerasa de T7.

Para la mayoría de los hongos filamentosos y las levaduras, el vector o constructo de expresión preferiblemente se integra en el genoma de la célula hospedadora a fin de obtener transformantes estables. Sin embargo, para ciertas levaduras también están disponibles vectores episómicos adecuados en los que se puede incorporar el constructo de expresión para una expresión estable y de alto nivel, ejemplos de los mismos incluyen vectores derivados de los plásmidos 2p y pKD1 de Saccharomyces y Kluyveromyces, respectivamente, o vectores que contienen una secuencia AMA (p. ej. AMA1 de Aspergillus). En caso de que los constructos de expresión estén integrados en el genoma de la célula hospedadora, los constructos bien están integrados en locus aleatorios del genoma, o bien en locus diana predeterminados usando recombinación homóloga, en cuyo caso los locus diana comprenden preferiblemente un gen altamente expresado.

Según esto, vectores de expresión útiles en la presente invención incluyen vectores cromosómicos, episómicos y derivados de virus, p. ej., vectores derivados de plásmidos bacterianos, bacteriófago, episoma de levadura, elementos cromosómicos de levadura, virus tales como baculovirus, papovavirus, virus vacunales, adenovirus, poxvirus aviares, virus de pseudorrabia y retrovirus, y vectores derivados de sus combinaciones, tales como los derivados de elementos genéticos plasmídicos y bacteriofágicos, tales como cósmidos y fagémidos.

El término "secuencias de control" o "secuencias reguladoras" se define en la presente para incluir al menos cualquier componente que pueda ser necesario y/o ventajoso para la expresión de un polipéptido. Cualquier secuencia de control puede ser natural o extraña a la secuencia de ácido nucleico de la invención que codifica un polipéptido. Estas secuencias de control pueden incluir, pero no se limitan a, un promotor, un líder, secuencias de iniciación de la traducción óptimas (según se describe en Kozak, 1991, J. Biol. Chem. 266:19867-19870), una secuencia de señalización de la secreción, una secuencia propeptídica, una secuencia de poliadenilación, un terminador de la transcripción. Como mínimo, las secuencias de control incluyen típicamente un promotor y señales de parada de la transcripción y la traducción. Como se indica anteriormente, el término "enlazado operativamente" se define en la presente como una configuración en la que una secuencia de control está situada apropiadamente en una posición relativa a la secuencia codificante de la secuencia de ADN de modo que la secuencia de control dirija la producción de un polipéptido.

Las secuencias de control pueden estar provistas de enlazadores con el propósito de introducir sitios de restricción específicos que faciliten la ligación de las secuencias de control con la región codificante de la secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido. El término "enlazado operativamente" se define en las presente como una configuración en la que una secuencia de control está situada apropiadamente en una posición relativa a la secuencia codificante de la secuencia de ADN de modo que la secuencia de control dirija la producción de un polipéptido.

La secuencia de control puede ser una secuencia promotora apropiada, una secuencia de ácido nucleico, que es reconocida por una célula hospedadora para la expresión de la secuencia de ácido nucleico. La secuencia promotora contiene secuencias de control de la transcripción, que median en la expresión del polipéptido. El promotor puede ser cualquier secuencia de ácido nucleico que muestre actividad de transcripción en la célula, incluyendo promotores mutantes, truncados e híbridos, y se puede obtener a partir de genes que codifican polipéptidos extracelulares o intracelulares bien homólogos o bien heterólogos a la célula.

El término "promotor" se define en la presente como una secuencia de ADN que se une a ARN polimerasa y dirige la polimerasa al sitio de inicio de la transcripción aguas abajo correcto de una secuencia de ácido nucleico que codifica un compuesto biológico para iniciar la transcripción. La ARN polimerasa cataliza eficazmente el ensamblaje de ARN mensajero complementario a la hebra de ADN apropiada de una región codificante. Se entenderá además que el término "promotor" incluye la región no codificante 5' (entre el promotor y el inicio de la traducción) para la traducción después de la transcripción en ARNm, elementos de control de la transcripción de acción cis tales como potenciadores, y otras secuencias nucleotídicas capaces de interactuar con factores de transcripción. El promotor puede ser cualquier secuencia promotora apropiada adecuada para una célula hospedadora eucariótica o procariótica, que muestre actividad de transcripción, incluyendo promotores mutantes, truncados e híbridos, y se puede obtener de polinucleótidos que codifican polipéptidos extracelulares o intracelulares bien homólogos (naturales) o bien heterólogos (extraños) a la célula. El promotor puede ser un promotor constitutivo o inducible.

Preferiblemente, el promotor es un promotor inducible. Más preferiblemente, el promotor es un promotor inducible por carbohidrato. Promotores inducibles por carbohidrato que se usan preferiblemente se seleccionan de un promotor inducible por almidón (es decir un promotor inducible mediante almidón, uno de sus monómeros, uno de sus dímeros, uno de sus oligómeros, tal como, por ejemplo, un promotor inducible por maltosa, un promotor inducible por isomaltosa), un promotor inducible por celulosa (es decir un promotor inducible mediante celulosa, uno de sus monómeros, uno de sus dímeros y/o uno de sus oligómeros, tal como, por ejemplo, un promotor inducible por celobiosa, un promotor inducible por soforosa), un promotor inducible por hemicelulosa (es decir un promotor inducible mediante hemicelulosa, uno de sus monómeros, uno de sus dímeros y/o uno de sus oligómeros, tal como, p. ej., un promotor inducible por xilano, un promotor inducible por arabinosa, un promotor inducible por xilosa), un promotor inducible por pectina (es decir un promotor inducible mediante pectina, uno de sus monómeros, uno de sus dímeros y/o uno de sus oligómeros tal como, por ejemplo, un promotor inducible por ácido galacturónico, un promotor inducible por ramnosa), un promotor inducible por arabinano (es decir un promotor inducible mediante arabinano, uno de sus monómeros, uno de sus dímeros y/o uno de sus oligómeros tal como, por ejemplo, un promotor inducible por arabinosa), un promotor inducible por glucosa, un promotor inducible por lactosa, un promotor inducible por galactosa. Otros promotores inducibles son promotores inducibles por cobre, ácido oleico.

Promotores adecuados en hongos filamentosos son promotores que se pueden seleccionar del grupo que incluye, pero no se limita a, promotores obtenidos de los polinucleótidos que codifican TAKA amilasa de A. oryzae , proteinasa aspártica de Rhizomucor miehei , promotor gpdA de Aspergillus, alfa-amilasa neutra de A. n ig e r, alfa-amilasa estable a los ácidos de A. niger, glucoamilasa (glaA) de A. niger o A. awamori, endoxilanasa (xlnA) o beta-xilosidasa (xlnD) de A. niger o A. awam ori, celobiohidrolasa I (CBHI) de T. reesei, lipasa de R. miehei , proteasa alcalina de A. oryzae , fosfato de triosa isomerasa de A. oryzae , acetamidasa de A. nidulans , amiloglucosidasa de Fusarium venenatum (documento WO 00/56900), Dania de Fusarium venenatum (documento WO 00/56900), Quinn de Fusarium venenatum (documento WO 00/56900), proteasa tripsinoide de Fusarium oxysporum (documento WO 96/00787), beta-glucosidasa de Trichoderma reesei , celobiohidrolasa I de Trichoderma reesei, celobiohidrolasa II de Trichoderma reesei, endoglucanasa I de Trichoderma reesei, endoglucanasa II de Trichoderma reesei, endoglucanasa III de Trichoderma reesei, endoglucanasa IV de Trichoderma reesei, endoglucanasa V de Trichoderma reesei, xilanasa I de Trichoderma reesei, xilanasa II de Trichoderma reesei, beta-xilosidasa de Trichoderma reesei, así como el promotor NA2-tpi (un híbrido de los promotores procedentes de los polinucleótidos que codifican alfa-amilasa neutra de A. niger y fosfato de triosa isomerasa de A. oryzae ), y sus promotores mutantes, truncados e híbridos. Otros ejemplos de promotores son los promotores descritos en los documentos WO2006/092396 y WO2005/100573. Un ejemplo más del uso de promotores se describe en el documento WO2008/098933. Promotores inducibles por carbohidrato preferidos que se pueden usar en hongos filamentosos son la TAKA amilasa de A. oryzae , alfa-amilasa neutra de A. niger, alfa-amilasa estable a los ácidos de A. niger, glucoamilasa (glaA) de A. niger o A. awamori, endoxilanasa (xlnA) o beta-xilosidasa (xlnD) de A. niger o A. awamori, beta-glucosidasa de Trichoderma reesei, celobiohidrolasa I de Trichoderma reesei, celobiohidrolasa II de Trichoderma reesei, endoglucanasa I de Trichoderma reesei, endoglucanasa II de Trichoderma reesei, endoglucanasa III de Trichoderma reesei, endoglucanasa IV de Trichoderma reesei, endoglucanasa V de Trichoderma reesei, xilanasa I de Trichoderma reesei, xilanasa II de Trichoderma reesei, beta-xilosidasa de Trichoderma reesei, así como el promotor NA2-tpi (un híbrido de los promotores procedentes de los polinucleótidos que codifican alfa-amilasa neutra de A. niger y fosfato de triosa isomerasa de A. oryzae ) según se define anteriormente.

Ejemplos de estos promotores procedentes de microorganismos grampositivos incluyen, pero no se limitan a, gnt (promotor de operón de gluconato); penP de Bacillus licheniformis; glnA (glutamina sintetasa); xilAB (operón de xilosa); araABD (operón de L-arabinosa) y promotor Pspac, un promotor SPO1/lac híbrido que puede estar controlado por inductores tales como isopropil-p-D-tiogalactopiranósido [IPTG] ((Yansura D.G., Henner D.J. Proc Natl Acad Sci U S A. 198481 (2):439-443). Los activadores también son proteínas que se unen a ADN específicas de una secuencia que inducen actividad promotora. Ejemplos de estos promotores procedentes de microorganismos grampositivos incluyen, pero no se limitan a, sistemas de dos componentes (PhoP-PhoR, DegU-DegS, Spo0A-Phosphorelay), LevR, Mry y GltC. (ii) La producción de factores sigma secundarios puede ser responsable principalmente de la transcripción a partir de promotores específicos. Ejemplos de microorganismos grampositivos incluyen, pero no se limitan a, los promotores activados mediante factores sigma específicos de la esporulación: oF, oE, oG y oK y factor sigma de estrés general, oB. La respuesta mediada por oB es inducida por limitación de energía y estreses ambientales (Hecker M, Volker U. Mol Microbiol. 1998; 29(5):1129-1136.). (iii) La atenuación y la antiterminación también regulan la transcripción. Ejemplos de microorganismos grampositivos incluyen, pero no se limitan a, operón trp y gen sacB. (iv) Otros promotores regulados en vectores de expresión se basan en el sistema regulador sacR que confiere inducibilidad por sacarosa (Klier AF, Rapoport G. Annu Rev Microbiol. 1988; 42:65-95).

Promotores inducibles adecuados útiles en bacterias, tales como Bacilli, incluyen: promotores procedentes de microorganismos grampositivos tales como, pero no limitados a, SP01-26, SP01-15, veg, pyc (promotor de piruvato carboxilasa) y amyE. Ejemplos de promotores procedentes de microorganismos gramnegativos incluyen, pero no se limitan a, tac, tet, trp-tet, Ipp, lac, Ipp-lac, laclq, T7, T5, T3, gal, trc, ara, SP6, A-PR y A-PL.

Ejemplos adicionales de promotores útiles en células bacterianas, tales como Bacilli, incluyen los promotores de aamilasa y SPo2 así como promotores procedentes de genes de proteasa extracelulares.

Otro ejemplo de un promotor adecuado es el promotor obtenido del operón lac de E. coli. Otro ejemplo es el promotor del gen de agarasa de Streptomyces coelicolor (dagA). Otro ejemplo es el promotor del gen de proteasa alcalina de Bacillus lentus (aprH). Otro ejemplo es el promotor del gen de proteasa alcalina de Bacillus licheniformis (gen de Carlsberg de subtilisina). Otro ejemplo es el promotor del gen de levansucrasa de Bacillus subtilis (sacB). Otro ejemplo es el promotor del gen de alfa-amilasa de Bacillus subtilis (amyF). Otro ejemplo es el promotor del gen de alfa-amilasa de Bacillus licheniformis (amyL). Otro ejemplo es el promotor del gen de amilasa maltogénica de Bacillus stearothermophilus (amyM). Otro ejemplo es el promotor del gen de alfa-amilasa de Bacillus amyloliquefaciens (amyQ). Otro ejemplo es un promotor de "consenso" que tiene la secuencia TTGACA para la región "-35" y TATAAT para la región ''-10''. Otro ejemplo es el promotor del gen de penicilinasa de Bacillus licheniformis (penP). Otro ejemplo son los promotores de los genes xilA y xilB de Bacillus subtilis.

Preferiblemente, la secuencia promotora es de un gen altamente expresado. Ejemplos de genes altamente expresados preferidos de los que se pueden seleccionar promotores y/o que están comprendidos en locus diana predeterminados preferidos para la integración de constructos de expresión incluyen pero no se limitan a genes que codifican enzimas glucolíticas tales como fosfato de triosa isomerasas (TPI), fosfato de gliceraldehído deshidrogenasas (GAPDH), fosfoglicerato cinasas (PGK), piruvato cinasas (PYK o PKI), alcohol deshidrogenasas (ADH), así como genes que codifican amilasas, glucoamilasas, proteasas, xilanasas, celobiohidrolasas, p-galactosidasas, alcohol (metanol) oxidasas, factores de elongación y proteínas ribosómicas. Ejemplos específicos de genes altamente expresados adecuados incluyen, p. ej., el gen LAC4 procedente de Kluyveromyces sp., los genes de metanol oxidasa (AOX y MOX) procedentes de Hansenula y Pichia, respectivamente, los genes de glucoamilasa (glaA) procedentes de A. niger y A. awamori, el gen de TAKA-amilasa de A. oryzae, el gen gdpA de A. nidulans y los genes de celobiohidrolasa de T. reesei.

Promotores que se pueden usar en levadura incluyen, p. ej., promotores procedentes de genes glucolíticos, tales como los promotores de fosfofructocinasa (PFK), fosfato de triosa isomerasa (TPI), 3-fosfato de gliceraldehído deshidrogenasa (GPD, TDH3 o GAPDH), piruvato cinasa (PYK), promotores de fosfoglicerato cinasa (PGK) procedentes de levaduras u hongos filamentosos; más detalles acerca de estos promotores procedentes de levadura se pueden encontrar en (el documento WO 93/03159). Otros promotores útiles son promotores de genes que codifican proteínas ribosómicas, promotor del gen de lactasa (LAC4), promotores de alcohol deshidrogenasa (ADHI, ADH4 y similares) y el promotor de enolasa (ENO). Otros promotores, tanto constitutivos como inducibles, y potenciadores o secuencias activadoras aguas arriba serán conocidos por los expertos en la especialidad. Los promotores usados en las células hospedadoras de la invención se pueden modificar, si se desea, para afectar a sus características de control. Promotores adecuados en este contexto incluyen promotores naturales tanto constitutivos como inducibles así como promotores manipulados, que son muy conocidos para el experto en la especialidad. Promotores adecuados en células hospedadoras eucarióticas pueden ser GAL7, GAL10, o GAL1, CYC1, HIS3, ADH1, PGL, PH05, GAPDH, ADC1, TRP1, URA3, LEU2, ENO1, TPI1 y AOX1. Otros promotores adecuados incluyen PDC1, GPD1, PGK1, TEF1 y TDH3. Ejemplos de promotores inducibles por carbohidratos que se pueden usar son promotores GAL, tales como promotores g Al 1 o GAL10.

Todos los susodichos promotores están fácilmente disponibles en la especialidad.

La transcripción del ADN que codifica los polipéptidos de la presente invención por eucariotas superiores se puede incrementar al insertar una secuencia potenciadora en el vector. Los potenciadores son elementos de acción cis de ADN, habitualmente de aproximadamente 10 a 300 pb, que actúan para incrementar la actividad de transcripción de un promotor en un tipo de célula hospedadora dado. Ejemplos de potenciadores incluyen el potenciador de SV40, que está situado en el último lado del origen de replicación en los pb 100 a 270, el potenciador del promotor temprano de citomegalovirus, el potenciador de polioma en el último lado del origen de replicación y potenciadores de adenovirus.

La secuencia de control también puede ser una secuencia terminadora de la transcripción adecuada, una secuencia reconocida por una célula de hongo filamentoso para terminar la transcripción. La secuencia terminadora está enlazada operativamente al extremo 3' de la secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido. Cualquier terminador, que sea funcional en la célula, se puede usar en la presente invención.

La secuencia de control también puede ser un terminador. Terminadores preferidos para células de hongos filamentosos se obtienen de los genes que codifican TAKA amilasa de A. oryzae , glucoamilasa (glaA) de A. niger, antranilato sintasa de A. nidulans , alfa-glucosidasa de A. niger, gen trpC y proteasa tripsinoide de Fusarium oxysporum.

La secuencia de control también puede incluir una secuencia líder adecuada, una región no traducida de un ARNm que es importante para la traducción por la célula de hongo filamentoso. La secuencia líder está enlazada operativamente al extremo 5' de la secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido. Cualquier secuencia líder, que sea funcional en la célula, se puede usar en la presente invención. Líderes preferidos para células de hongos filamentosos se obtienen de los genes que codifican TAKA amilasa de A. oryzae y fosfato de triosa isomerasa de A. nidulans y glaA de A. niger. Otras secuencias preferidas se aíslan y/o se divulgan en el documento WO2006/077258.

Otras secuencias de control se pueden aislar del gen IPNS de Penicillium, o el gen pcbC, el gen de beta-tubulina. Todas las secuencias de control se citan en el documento WO 01/21779.

La secuencia de control también puede ser una secuencia de poliadenilación, una secuencia que está enlazada operativamente al extremo 3' de la secuencia de ácido nucleico y que, cuando se transcribe, es reconocida por la célula de hongo filamentoso como una señal para añadir residuos de poliadenosina a RNAm transcrito. Cualquier secuencia de poliadenilación, que sea funcional en la célula, se puede usar en la presente invención. Secuencias de poliadenilación preferidas para células de hongos filamentosos se obtienen a partir de los genes que codifican TAKA amilasa de A. oryzae, glucoamilasa de A. niger, antranilato sintasa de A. nidulans, proteasa tripsinoide de Fusarium oxysporum y alfa-glucosidasa de A. niger.

Cuando el polipéptido según la invención se va a secretar de la célula hospedadora en el medio de cultivo, se puede añadir al polipéptido una secuencia de señalización apropiada a fin de dirigir el polipéptido sintetizado de novo a la ruta de secreción de la célula hospedadora. El experto en la especialidad conoce la selección de una secuencia de señalización apropiada para un hospedador específico. La secuencia de señalización puede ser natural a la célula hospedadora o puede ser extraña a la célula hospedadora. Como un ejemplo, se puede usar una secuencia de señalización procedente de una proteína natural a la célula hospedadora. Preferiblemente, dicha proteína natural es una proteína altamente secretada, es decir una proteína que se secreta en cantidades superiores al 10% de la cantidad total de proteína que se secreta. Las secuencias de señalización usadas preferiblemente según la invención son, por ejemplo: pmeA.

Como una alternativa para una secuencia de señalización, el polipéptido de la invención se puede fusionar a una proteína portadora secretada, o una de sus partes. Este constructo quimérico se dirige a la ruta de secreción por medio de la secuencia de señalización de la proteína portadora, o una de sus partes. Además, la proteína portadora proporcionará un efecto estabilizante al polipéptido según la invención y/o puede potenciar la solubilidad. Esta proteína portadora puede ser cualquier proteína. Preferiblemente, se usa una proteína altamente secretada como una proteína portadora. La proteína portadora puede ser natural o extraña al polipéptido según la invención. La proteína portadora puede ser natural o puede ser extraña a la célula hospedadora. Ejemplos de estas proteínas portadoras son glucoamilasa, secuencia prepro de factor alfa-Mating, dominio de unión a celulosa de proteína A de unión a celulosa de Clostridium cellulovorans, glutationa S-transferasa, dominio de unión a quitina de quitinasa A1 de Bacillus circulans, dominio de unión a maltosa codificado por el gen malE de E. coli K12, beta-galactosidasa y fosfatasa alcalina. Una proteína portadora preferida para la expresión de este constructo quimérico en células de Aspergillus es la glucoamilasa. La proteína portadora y el polipéptido según la invención pueden contener un motivo de aminoácido específico para facilitar el aislamiento del polipéptido; el polipéptido según la invención se puede liberar mediante un agente de liberación especial. El agente de liberación puede ser una enzima proteolítica o un agente químico. Un ejemplo de este motivo de aminoácido es el sitio de escisión de proteasa KEX, que es muy conocido para el experto en la especialidad.

Se puede usar una secuencia de señalización para facilitar la secreción y el aislamiento de una proteína o un polipéptido de la invención. Las secuencias de señalización se caracterizan típicamente por un núcleo de aminoácidos hidrófobos, que generalmente se escinden de la proteína madura durante la secreción en uno o más episodios de escisión. Estos péptidos de señalización contienen sitios de procesamiento que permiten la escisión de la secuencia de señalización de las proteína maduras a medida que pasan a través de la vía secretora. La secuencia de señalización dirige la secreción de la proteína, tal como a partir de un hospedador eucariota en el que se transforma el vector de expresión, y la secuencia de señalización se escinde posteriormente o simultáneamente. A continuación, la proteína se puede purificar fácilmente del medio extracelular mediante métodos conocidos. Alternativamente, la secuencia de señalización se puede enlazar a la proteína de interés usando una secuencia que facilite la purificación, tal como con un dominio GST. Así, a modo de ejemplo, la secuencia que codifica el polipéptido se puede fusionar a una secuencia marcadora, tal como una secuencia que codifica un péptido, lo que facilita la purificación del polipéptido fusionado. En ciertas realizaciones preferidas de este aspecto de la invención, la secuencia marcadora es un péptido de hexahistidina, tal como la etiqueta proporcionada en un vector pQE (Qiagen, Inc.), entre otros, muchos de los cuales están disponibles comercialmente. Según se describe en Gentz y cols, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:821-824 (1989), a modo de ejemplo, la hexa-histidina proporciona una purificación conveniente de la proteína de fusión. La etiqueta de HA es otro péptido útil para la purificación que corresponde a un epítopo derivado de proteína de hemaglutinina de gripe, que ha sido descrito por Wilson y cols., Cell 37:767 (1984), a modo de ejemplo.

Preferiblemente, una proteína de fusión TEMER09484 de la invención se produce mediante técnicas de ADN recombinante estándar. Por ejemplo, fragmentos de ADN que codifican las diferentes secuencias polipeptídicas se ligan conjuntamente en el marco según técnicas convencionales, por ejemplo al emplear terminaciones de extremos romos o extremos escalonados para la ligación, digestión con enzimas de restricción para proporcionar terminaciones apropiadas, relleno de extremos cohesivos según sea apropiado, tratamiento con fosfatasa alcalina para evitar un empalme no deseable, y ligación enzimática. En otra realización, el gen de fusión se puede sintetizar mediante técnicas convencionales incluyendo sintetizadores de ADN automáticos. Alternativamente, la amplificación por PCR de fragmentos génicos se puede llevar a cabo usando cebadores de anclaje, que dan lugar a protuberancias complementarias entre dos fragmentos génicos consecutivos que posteriormente se pueden renaturalizar y reamplificar para generar una secuencia génica quimérica (véase, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel y cols. John Wiley & Sons: 1992). Por otra parte, están disponibles comercialmente muchos vectores de expresión que ya codifican un resto de fusión (p. ej., un polipéptido de GST). Un ácido nucleico que codifica TEMER09484 se puede clonar en uno de estos vectores de expresión de modo que la proteína de fusión esté enlazada en el marco a la proteína TEMER09484.

(Sobre)expresión

En una realización preferida, los polinucleótidos de la presente invención según se describen en la presente se pueden sobreexpresar en una cepa microbiana de la invención en comparación con la cepa microbiana original en la que dicho gen no se sobreexpresa. La sobreexpresión de una secuencia polinucleotídica se define en la presente como la expresión de dicho gen de secuencia que da como resultado una actividad de la enzima codificada por dicha secuencia en una cepa microbiana que es al menos aproximadamente 1,5 veces la actividad de la enzima en la cepa microbiana original; preferiblemente la actividad de dicha enzima es al menos aproximadamente 2 veces, más preferiblemente al menos aproximadamente 3 veces, más preferiblemente al menos aproximadamente 4 veces, más preferiblemente al menos aproximadamente 5 veces, aún más preferiblemente al menos aproximadamente 10 veces y lo más preferiblemente al menos aproximadamente 20 veces la actividad de la enzima en la cepa microbiana original.

El vector puede incluir además secuencias que flanquean el polinucleótido dando lugar a ARN que comprende secuencias homólogas a secuencias genómicas eucarióticas o secuencias genómicas virales. Esto permitirá la introducción de los polinucleótidos de la invención en el genoma de una célula hospedadora.

Un vector de clonación integrador se puede integrar aleatoriamente o en un locus diana predeterminado en el cromosoma o los cromosomas de la célula hospedadora en la que se va a integrar. En una realización preferida de la invención, un vector de clonación integrador puede comprender un fragmento de ADN que es homólogo a una secuencia de ADN en un locus diana predeterminado en el genoma de la célula hospedadora para orientar la integración del vector de clonación hacia este locus predeterminado. A fin de promover la integración orientada, preferiblemente, el vector de clonación se puede linealizar antes de la transformación de la célula hospedadora. La linealización se puede realizar preferiblemente de modo que al menos uno pero preferiblemente cualquier extremo del vector de clonación esté flanqueado por secuencias homólogas al locus diana. La longitud de las secuencias homólogas que flanquean el locus diana es preferiblemente al menos aproximadamente 0,1 kb, tal como aproximadamente al menos 0,2 kb, más preferiblemente al menos aproximadamente 0,5 kb, aún más preferiblemente al menos aproximadamente 1 kb, lo más preferiblemente al menos aproximadamente 2 kb. Preferiblemente, las cepas hospedadoras originales se pueden modificar para una frecuencia mejorada de la integración de ADN orientada, según se describe en los documentos WO05/095624 y/o WO2007/115886.

El ejemplo de eliminación proporcionado en la presente invención usa el promotor del gen como flanco 5' y el gen como el flanco 3' para insertar un marcador de selección entre el promotor y el gen, alterando (es decir inactivando funcionalmente) de ese modo la transcripción génica. Las secuencias génicas dadas anteriormente se pueden usar para elaborar genes inactivados funcionalmente similares. Los genes se pueden dividir en dos, dando un flanco 5' y un flanco 3', pero el gen también se puede usar para clonar una sección mayor de ADN genómico que contiene las regiones promotora y terminadora del gen, que a continuación puede funcionar como flanco 5' y flancos 3'.

El sistema vectorial puede ser un solo vector, tal como un solo plásmido, o dos o más vectores, tales como dos o más plásmidos, que contienen conjuntamente el ADN total que se va a introducir en el genoma de la célula hospedadora.

El vector puede contener un polinucleótido de la invención orientado en una dirección antisentido para proporcionar la producción de ARN antisentido.

El ADN vectorial se puede introducir en células procarióticas o eucarióticas a través de técnicas de transformación o transfección convencionales. Según se usan en la presente, los términos "transformación" y "transfección" están destinados a referirse a una variedad de técnicas reconocidas en la especialidad para introducir ácido nucleico (p. ej., ADN) extraño en una célula hospedadora, incluyendo coprecipitación con fosfato cálcico o cloruro cálcico, transfección mediada por DEAE-dextrano, transducción, infección, lipofección, transfección mediada por lípidos catiónicos o electroporación. Métodos adecuados para transformar o transfectar células hospedadoras se pueden encontrar en Sambrook y cols. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989), Davis y cols., Basic Methods in Molecular Biology (1986) y otros manuales de laboratorio.

El experto en la especialidad sabe como transformar células con el uno o más casetes de expresión y el marcador seleccionable. Por ejemplo, el experto puede usar uno o más vectores de expresión, en donde el uno o más vectores de clonación comprenden los casetes de expresión y el marcador seleccionable.

La transformación de la célula hospedadora microbiana mutante se puede efectuar mediante cualesquiera métodos conocidos adecuados, incluyendo, p. ej., métodos de electroporación, bombardeo de partículas o bombardeo de microproyectiles, métodos protoplásticos y transformación mediada por Agrobacterium (AMT). Preferiblemente, se usa el método protoplástico. Procedimientos para la transformación son descritos por J.R.S. Fincham, Transformation in fungi. 1989, Microbiological reviews. 53, 148-170.

La transformación puede implicar un procedimiento que consiste en la formación de protoplastos, la transformación de los protoplastos y la regeneración de la pared celular de un modo conocido de por sí. Procedimientos para la transformación de células de Aspergillus se describen en el documento EP 238023 y Yelton y cols., 1984, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 81:1470-1474. Procedimientos adecuados para la transformación de Aspergillus y otras células hospedadoras de hongos filamentosos usando Agrobacterium tumefaciens se describen, p. ej., en De Groot y cols., Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of filamentous fungi. Nat Biotechnol.

1998, 16:839-842. Erratum en: Nat Biotechnol 1998 16:1074. Un método adecuado para transformar especies de Fusarium es descrito por Malardier y cols., 1989, Gene 78:147156 o en el documento WO 96/00787. Se pueden aplicar otros métodos tales como un método que usa transformación biolística como el descrito en: Christiansen y cols., Biolistic transformation o f the obligate plant pathogenic fungus, Erysiphe graminis f.sp. hordei. 1995, Curr Genet.

29:100-102. Una levadura se puede transformar usando los procedimientos descritos por Becker y Guarente, En Abelson, J. N. y Simon, M. I., editores, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Volumen 194, pp 182-187, Academic Press, Inc., Nueva York; Ito y cols., 1983, Journal of Bacteriology 153: 163; y Hinnen y cols., 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75: 1920.

A fin de aumentar la cantidad de copias del polinucleótido que codifica el compuesto de interés o que codifica un compuesto implicado en la producción por la célula del compuesto de interés (el gen) en la célula hospedadora microbiana mutada, se pueden requerir múltiples transformaciones. De este modo, se puede influir en las relaciones de las diferentes enzimas producidas por la célula hospedadora. Además, un vector de expresión puede comprender múltiples casetes de expresión para incrementar la cantidad de copias del polinucleótido o los polinucleótidos que se van a transformar.

Otro modo podría ser elegir diferentes secuencias de control para los diferentes polinucleótidos, que - dependiendo de la elección - pueden provocar una producción superior o inferior del polipéptido o los polipéptidos deseados.

Las células transformadas con el marcador seleccionable se pueden seleccionar basándose en la presencia del marcador seleccionable. Habitualmente, en el caso de la transformación de células (de Aspergillus), cuando la célula se transforma con todo el material de ácido nucleico al mismo tiempo, cuando el marcador seleccionable está presente, también están presentes el polinucleótido o los polinucleótidos que codifican el polipéptido o los polipéptidos deseados.

Para la transfección estable de células de mamífero, se sabe que, dependiendo del vector de expresión y la técnica de transfección usados, solo una pequeña fracción de células puede integrar el ADN extraño en su genoma. A fin de identificar y seleccionar estos integrantes, un gen que codifica un marcador seleccionable (p. ej., resistencia a antibióticos) se introduce generalmente en las células hospedadoras junto con el gen de interés. Marcadores seleccionables preferidos incluyen, pero no se limitan a, los que confieren resistencia a fármacos o que complementan un defecto de la célula hospedadora. Incluyen, p. ej., genes marcadores versátiles que se pueden usar para la transformación de la mayoría de los hongos filamentosos y las levaduras tales como genes de acetamidasa o ADNcs (los genes amdS, niaD, facA o ADNcs de A. nidulans, A. oryzae o A. niger) o genes que proporcionan resistencia a antibióticos como resistencia a G418, higromicina, bleomicina, kanamicina, metotrexato, fleomicina o benomilo (benA). Alternativamente, se pueden usar marcadores de selección específicos tales como marcadores auxotróficos que requieren cepas hospedadoras mutantes correspondientes: p. ej. URA3 (procedente de S. cerevisiae o genes análogos procedentes de otras levaduras), pyrG o pyrA (procedentes de A. nidulans o A. niger), argB (procedente de A. nidulans o A. niger) o trpC. En una realización preferida, el marcador de selección se elimina de la célula hospedadora transformada después de la introducción de la construcción de expresión a fin de obtener células hospedadoras transformadas capaces de producir el polipéptido que estén libres de genes marcadores de selección.

Otros marcadores incluyen ATP sintetasa, subunidad 9 (oliC), 5'-fosfato de orotidina descarboxilasa (pvrA), el gen de resistencia a G418 bacteriano (este también se puede usar en levadura, pero no en hongos), el gen de resistencia a ampicilina (E. coli), el gen de resistencia a neomicina (Bacillus) y el gen uidA de E. coli, que codifica p-glucuronidasa (GUS). Los vectores se pueden usar in vitro, por ejemplo para la producción de ARN o se pueden usar para transfectar o transformar una célula hospedadora.

La expresión de proteínas en procariotas se lleva a cabo a menudo en E. coli con vectores que contienen promotores constitutivos o inducibles que dirigen la expresión de proteínas bien de fusión o bien que no son de fusión. Los vectores de fusión añaden un número de aminoácidos a una proteína codificada en los mismos, p. ej. a la terminación amino de la proteína recombinante. Estos vectores de fusión tienen típicamente tres propósitos: 1) incrementar la expresión de proteína recombinante; 2) incrementar la solubilidad de la proteína recombinante; y 3) ayudar a la purificación de la proteína recombinante al actuar como un ligando en la purificación por afinidad. A menudo, en vectores de expresión de fusión, se introduce un sitio de escisión proteolítica en la unión del resto de fusión y la proteína recombinante para potenciar la separación de la proteína recombinante del resto de fusión después de la purificación de la proteína de fusión.

Según se indica, los vectores de expresión contendrán preferiblemente marcadores seleccionables. Estos marcadores incluyen dihidrofolato reductasa o resistencia a neomicina para el cultivo de células eucarióticas y resistencia a tetraciclina o ampicilina para el cultivo en E. coli y otras bacterias.

Vectores preferidos para el uso en bacterias se describen, por ejemplo, en el documento WO-A1-2004/074468, que de ese modo son incluidos por la presente mediante referencia. Otros vectores adecuados serán fácilmente evidentes para el experto.

Para la secreción de la proteína traducida en la luz del retículo endoplásmico, en el espacio periplásmico o en el ambiente extracelular, una señal de secreción apropiada se puede incorporar en el polipéptido expresado. Las señales pueden ser endógenas al polipéptido o pueden ser señales heterólogas.

El polipéptido TEMER09484 se puede expresar en una forma modificada, tal como una proteína de fusión, y puede incluir no solo señales de secreción sino también regiones funcionales heterólogas adicionales. Así, a modo de ejemplo, una región de aminoácidos, particularmente aminoácidos cargados, adicionales se puede añadir a la terminación N del polipéptido para mejorar la estabilidad y la persistencia en la célula hospedadora, durante la purificación o durante el manejo y el almacenamiento posteriores. Además, se pueden añadir restos peptídicos al polipéptido para facilitar la purificación.

La invención proporciona un polipéptido aislado que tiene la secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO: 32 y una secuencia de aminoácidos obtenible al expresar el polinucleótido de SEQ ID NO: 31 o SEQ ID NO: 34 o SEQ ID NO: 35 en un hospedador apropiado. Además, un péptido o polipéptido que comprende una variante de los polipéptidos anteriores, tal como un equivalente funcional, está comprendido dentro de la presente invención. Los polipéptidos anteriores están comprendidos colectivamente en el término "polipéptidos según la invención".

El término "péptido variante" o "polipéptido variante" se define en la presente como un péptido o polipéptido, respectivamente, que comprende una o más alteraciones, tales como sustituciones, inserciones, eliminaciones y/o truncamientos de uno o más residuos de aminoácido específicos en una o más posiciones específicas en el péptido o polipéptido, respectivamente. Según esto, un péptido de señalización variante es un péptido de señalización que comprende una o más alteraciones, tales como sustituciones, inserciones, eliminaciones y/o truncamientos de uno o más residuos de aminoácido específicos en una o más posiciones específicas en el péptido de señalización.

El término "polinucleótido" es idéntico al término "molécula de ácido nucleico" y se pueden leer intercambiablemente en la presente. El término se refiere a una molécula de polinucleótido, que es una molécula de ácido ribonucleico (ARN) o ácido desoxirribonucleico (ADN), bien monocatenaria o bien bicatenaria. Un polinucleótido bien puede estar presente en forma aislada o bien estar comprendido en moléculas de ácido nucleico o vectores recombinantes, o bien estar comprendido en una célula hospedadora.

El término "polinucleótido variante" se define en la presente como un polinucleótido que comprende una o más alteraciones, tales como sustituciones, inserciones, eliminaciones y/o truncamientos de uno o más nucleótidos en una o más posiciones específicas del polinucleótido.

Los términos "péptido" y "oligopéptido" se consideran sinónimos (como se reconoce comúnmente) y cada término se puede usar intercambiablemente, según requiera el contexto, para indicar una cadena de al menos dos aminoácidos acoplados por enlaces peptidílicos. La palabra "polipéptido" se usa en la presente para cadenas que contienen más de siete residuos de aminoácido. Todas las fórmulas o secuencias de oligopéptidos y polipéptidos de la presente se escriben de izquierda a derecha y en la dirección de la terminación amino a la terminación carboxi. El código de una letra usado en la presente es comúnmente conocido en la especialidad y se puede encontrar en Sambrook y cols. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a, ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989)

Por polipéptido o proteína "aislados" se entiende un polipéptido o una proteína retirados de su ambiente natural. Por ejemplo, polipéptidos y proteínas producidos recombinantemente expresados en células hospedadoras se consideran aislados para el propósito de la invención ya que son polipéptidos naturales o recombinantes que se han purificado sustancialmente mediante cualquier técnica adecuada tal como, por ejemplo, el método de purificación en una sola etapa divulgado en Smith y Johnson, Gene 67:31-40 (1988).

La proteína Temer05249 según la invención se puede recuperar y purificar de cultivos celulares recombinantes mediante métodos conocidos en la especialidad. Lo más preferiblemente, se emplea para la purificación cromatografía de líquidos de alta resolución ("HPLC").

Polipéptidos de la presente invención incluyen productos purificados naturalmente, productos de procedimientos sintéticos químicos y productos producidos mediante técnicas recombinantes a partir de un hospedador procariótico o eucariótico, incluyendo, por ejemplo, células de bacterias, levaduras, plantas superiores, insectos y mamíferos. Dependiendo del hospedador empleado en un procedimiento de producción recombinante, los polipéptidos de la presente invención pueden estar glicosilados o pueden estar no glicosilados. Además, los polipéptidos de la invención también pueden incluir un residuo de metionina modificado inicial, en algunos casos como resultado de procesos mediados por el hospedador.

La invención también presenta fragmentos biológicamente activos de los polipéptidos según la invención.

Fragmentos biológicamente activos de un polipéptido de la invención incluyen polipéptidos que comprenden secuencias de aminoácidos suficientemente idénticas a o derivadas de la secuencia de aminoácidos de la proteína Temer05249 (p. ej., la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 32), que incluyen menos aminoácidos que la proteína de longitud completa pero que exhiben al menos una actividad biológica de la proteína de longitud completa correspondiente. Típicamente, los fragmentos biológicamente activos comprenden un dominio o motivo con al menos una actividad de la proteína Temer05249.

Un fragmento biológicamente activo de una proteína de la invención puede ser un polipéptido que tiene una longitud de, por ejemplo, aproximadamente 10, aproximadamente 25, aproximadamente 50, aproximadamente 100 o más aminoácidos o tiene una longitud de al menos aproximadamente 100 aminoácidos, al menos 150, 200, 250, 300, 350, 400 aminoácidos, o de una longitud hasta el número total de aminoácidos del polipéptido de la invención.

Por otra parte, otras porciones biológicamente activas, en las que se eliminan otras regiones de la proteína, se pueden preparar mediante técnicas recombinantes y evaluar con respecto a una o más de las actividades biológicas de la forma natural de un polipéptido de la invención. La invención también presenta fragmentos de ácido nucleico que codifican los fragmentos biológicamente activos anteriores de la proteína Temer05249.

Proteínas

En otro aspecto de la invención, se proporcionan proteínas Temer05249 mejoradas. Proteínas Temer05249 mejoradas son proteínas en las que se mejora al menos una actividad biológica. Estas proteínas se pueden obtener al introducir aleatoriamente mutaciones a lo largo de la totalidad o parte de la secuencia codificante de Temer05249, tal como mediante mutagénesis de saturación, y los mutantes resultantes se pueden expresar recombinantemente y cribar con respecto a una actividad biológica. A modo de ejemplo, la especialidad proporciona ensayos estándar para medir la actividad enzimática de la proteína de la invención y así se pueden seleccionar fácilmente proteínas mejoradas.

Variantes mejoradas de las secuencias de aminoácidos de la presente invención que conducen a una función como celobiohidrolasa mejorada se pueden obtener mediante los genes correspondientes de la presente invención. Entre estas modificaciones se incluyen:

1. PCR propensa a errores para introducir mutaciones aleatorias, seguido por un cribado de las variantes obtenidas y un aislamiento de las variantes con propiedades cinéticas mejoradas

2. Redistribución familiar de variantes relacionadas de los genes que codifican la celobiohidrolasa, seguida por un cribado de las variantes obtenidas y un aislamiento de las variantes con propiedades cinéticas mejoradas

Variantes de los genes de la presente invención que conducen a un nivel incrementado de ARNm y/o proteína, dando como resultado más de una actividad según la Tabla 1, se pueden obtener mediante las secuencias polinucleotídicas de dichos genes. Entre estas modificaciones se incluyen:

1. Mejorar la utilización de codones de tal modo que los codones se adapten (óptimamente) al hospedador microbiano original.

2. Mejorar la utilización de los pares de codones de tal modo que los codones se adapten (óptimamente) al hospedador microbiano original.

3. Adición de secuencias estabilizantes de información genómica que codifican la celobiohidrolasa dando como resultado moléculas de ARNm con una semivida incrementada

Métodos preferidos para aislar variantes con propiedades catalíticas mejoradas o niveles incrementados de ARNm o proteína se describen en los documentos WO03/010183 y WO03/01311. Métodos preferidos para optimizar la utilización de codones en cepas microbianas originales se describen en el documento PCT/EP2007/05594. Métodos preferidos para la adición de elementos estabilizantes a los genes que codifican la celobiohidrolasa de la invención se describen en el documento WO2005/059149.

En una realización preferida, la proteína de la invención tiene una secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO: 32. En otra realización, el polipéptido de la invención es sustancialmente homólogo a la secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO: 32 y retiene al menos una actividad biológica de un polipéptido según SEQ ID NO: 32 y sin embargo difiere en la secuencia de aminoácidos debido a variación natural o mutagénesis según se describe.

En una realización preferida adicional, la proteína de la invención tiene una secuencia de aminoácidos codificada por un fragmento de ácido nucleico aislado capaz de hibridarse a un ácido nucleico según SEQ ID NO: 31 o SEQ ID NO: 34 o SEQ ID NO: 35, preferiblemente bajo condiciones de hibridación muy rigurosas.

Según esto, la proteína Temer05249 o la proteína de la invención es preferiblemente una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 50%, al menos 60%, al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 95%, 96%, 97%, 98%, 97%, 98%, 99%, 99,8%, 99,9% o más homóloga a la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 32 y, típicamente, retiene al menos una actividad funcional del polipéptido según SEQ ID NO: 32.

Según un aspecto de la invención, el polipéptido de la invención puede comprender la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO: 32 o una secuencia de aminoácidos que difiere en 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 aminoácidos de la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO: 32 y de ese modo el polipéptido todavía tiene la actividad o función del polipéptido de la invención. El experto apreciará que estos pequeños cambios de aminoácidos en el polipéptido de la invención pueden estar presentes (por ejemplo mutaciones presentes en la naturaleza) o se pueden elaborar (por ejemplo usando tecnología de ADNr) sin pérdida de la función o actividad de la proteína. En caso de que estas mutaciones estén presentes en un dominio de unión, un sitio activo u otro dominio funcional del polipéptido, una propiedad del polipéptido puede cambiar (por ejemplo su termoestabilidad) pero el polipéptido puede mantener su actividad como hemicelulasa. En caso de que esté presente una mutación que no esté cerca del sitio activo, el dominio de unión u otro dominio funcional, se puede esperar menos efecto.

También se pueden identificar equivalentes funcionales de una proteína según la invención, p. ej. al cribar bibliotecas combinatorias de mutantes, p. ej. mutantes de truncamiento, de la proteína de la invención con respecto a una actividad según la Tabla 1. En una realización, se genera una biblioteca variegada de variantes mediante mutagénesis combinatoria a nivel de ácido nucleico. Una biblioteca variegada de variantes se puede producir, por ejemplo, al ligar enzimáticamente una mezcla de oligonucleótidos sintéticos en secuencias génicas de modo que un conjunto degenerado de secuencias proteínicas potenciales sea expresable como polipéptidos individuales o, alternativamente, como un conjunto de proteínas de fusión mayores (p. ej. para presentación en fagos). Existe una variedad de métodos que se pueden usar para producir bibliotecas de variantes potenciales de los polipéptidos de la invención a partir de una secuencia oligonucleotídica degenerada. Métodos para sintetizar oligonucleótidos degenerados son conocidos en la especialidad (véanse, p. ej., Narang (1983) Tetrahedron 39:3; Itakura y cols. (1984) Annu. Rev. Biochem.

53:323; Itakura y cols. (1984) Science 198:1056; Ike y cols. (1983) Nucleic Acid Res. 11:477).

Además, se pueden usar bibliotecas de fragmentos de la secuencia codificante de un polipéptido de la invención para generar una población variegada de polipéptidos para cribar una selección posterior de variantes. Por ejemplo, se puede generar una biblioteca de fragmentos de secuencias codificantes al tratar un fragmento de PCR bicatenario de la secuencia codificante de interés con una nucleasa bajo condiciones en las que se produce melladura solo aproximadamente una vez por molécula, desnaturalizar el ADN bicatenario, renaturalizar el ADN para formar ADN bicatenario que puede incluir pares de sentido/antisentido procedentes de diferentes productos mellados, retirar porciones monocatenarias de dúplex reformados mediante tratamiento con nucleasa S1, y ligar la biblioteca de fragmentos resultante en un vector de expresión. Mediante este método, se puede derivar una biblioteca de expresión que codifica fragmentos N-terminales e internos de diversos tamaños de la proteína de interés.

Se conocen en la especialidad varias técnica para cribar productos génicos de bibliotecas combinatorias elaboradas mediante mutaciones puntuales de truncamiento, y para cribar bibliotecas de ADNc para productos génicos que tienen una propiedad seleccionada. Las técnicas más ampliamente usadas, que son propensas al análisis de alto rendimiento, para cribar grandes bibliotecas génicas incluyen típicamente clonar la biblioteca génica en vectores de expresión replicables, transformar células apropiadas con la biblioteca de vectores resultante y expresar los genes combinatorios bajo condiciones en las que la detección de una actividad deseada facilite el aislamiento del vector que codifica el gen cuyo producto se detectaba. La mutagénesis recursiva en conjunto (REM), una técnica que potencia la frecuencia de mutantes funcionales en las bibliotecas, se puede usar en combinación con los ensayos de cribado para identificar variantes de una proteína de la invención (Arkin y Yourvan (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7811-7815; Delgrave y cols. (1993) Protein Engineering 6(3): 327-331).

Además de la secuencia génica de Temer05249 mostrada en SEQ ID NO: 31 o en SEQ ID NO: 34 o en SEQ ID NO: 35, será evidente para el experto en la especialidad que pueden existir polimorfismos de secuencias de ADN dentro de una población dada, lo que puede conducir a cambios en la secuencia de aminoácidos de la proteína Temer05249. Estos polimorfismos genéticos pueden existir en células procedentes de diferentes poblaciones o dentro de una población debido a variación alélica natural. Las variantes alélicas también pueden incluir equivalentes funcionales.

Los fragmentos de un polinucleótido según la invención también pueden comprender polinucleótidos que no codifican polipéptidos funcionales. Estos polinucleótidos pueden funcionar como sondas o cebadores para una reacción de PCR.

Los ácidos nucleicos según la invención independientemente de si codifican polipéptidos funcionales o no funcionales se pueden usar como sondas de hibridación o cebadores de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Usos de las moléculas de ácido nucleico de la presente invención que no codifican un polipéptido que tienen una actividad de Temer05249 incluyen, entre otros, (1) aislar el gen que codifica la proteína Temer05249, o sus variantes alélicas, de una biblioteca de ADNc, p. ej. de microorganismos adecuados; (2) hibridación in situ (p. ej. FISH) a extensiones cromosómicas metafásicas para proporcionar una localización cromosómica precisa del gen Temer05249 según se describe en Verma y cols., Human Chromosomes: a Manual of Basic Techniques, Pergamon Press, Nueva York (1988); (3) análisis por transferencia Northern para detectar la expresión de ARNm de Temer05249 en tejidos y/o células específicos y 4) sondas y cebadores que se pueden usar como una herramienta diagnóstica para analizar la presencia de un ácido nucleico hibridable a la sonda de Temer05249 en una muestra biológica (p. ej. tejido) dada.

También es abarcado por la invención un método para obtener un equivalente funcional de un gen Temer05249. Este método implica obtener una sonda etiquetada que incluye un ácido nucleico aislado que codifica la totalidad o una porción de la secuencia proteínica según SEQ ID NO: 32 o una de sus variantes; cribar una biblioteca de fragmentos de ácido nucleico con la sonda etiquetada bajo condiciones que permitan la hibridación de la sonda a fragmentos de ácido nucleico en la biblioteca, formando de ese modo dúplex de ácido nucleico, y preparar una secuencia génica de longitud completa procedente de los fragmentos de ácido nucleico en cualquier dúplex etiquetado para obtener un gen relacionado con el gen Temer05249.

En una realización, un ácido nucleico de Temer05249 de la invención es al menos 50%, al menos 60%, al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más homólogo a una secuencia de ácido nucleico mostrada en SEQ ID NO: 31 o en SEQ ID NO: 34 o en SeQ ID NO: 35 o su complemento.

También se proporcionan células hospedadoras que comprenden un polinucleótido o vector de la invención. El polinucleótido puede ser heterólogo al genoma de la célula hospedadora. El término ''heterólogo'', habitualmente con respecto a la célula hospedadora, significa que el polinucleótido no se presenta en la naturaleza en el genoma de la célula hospedadora o que el polipéptido no es producido naturalmente por esa célula.

En otra realización, la invención presenta células, p. ej., células hospedadoras transformadas o células hospedadoras recombinantes, que contienen un ácido nucleico abarcado por la invención. Una "célula transformada" o "célula recombinante" es una célula en la que (o en un progenitor de la cual) se ha introducido, por medio de técnicas de ADN recombinante, un ácido nucleico según la invención. Se incluyen células tanto procarióticas como eucarióticas, p. ej., bacterias, hongos, levaduras y similares, de forma especialmente preferible son células de hongos filamentosos, tales como Aspergillus niger.

Se puede elegir una célula hospedadora que module la expresión de las secuencias insertadas, o modifique y procese el producto génico de un modo deseado específico. Estas modificaciones (p. ej., glicosilación) y procesamiento (p. ej., escisión) de productos proteínicos pueden facilitar el funcionamiento opcional de la proteína.

Diversas células hospedadoras tienen mecanismos característicos y específicos para el procesamiento y la modificación postraduccionales de proteínas y productos génicos. Líneas celulares o sistemas hospedadores apropiados familiares para los expertos en la especialidad de la biología molecular y/o la microbiología se pueden elegir para asegurar la modificación y el procesamiento deseados y correctos de la proteína extraña expresada. A este fin, se pueden usar células hospedadoras eucarióticas que poseen la maquinaria celular para el procesamiento apropiado del transcrito primario, la glicosilación y la fosforilación del producto génico. Estas células hospedadoras son muy conocidas en la especialidad.

Si se desea, una célula según se describe anteriormente se puede usar en la preparación de un polipéptido según la invención. Este método comprende típicamente cultivar una célula hospedadora (p. ej. transformada o transfectada con un vector de expresión según se describe anteriormente) bajo condiciones que proporcionen la expresión (por el vector) de una secuencia codificante que codifica el polipéptido, y opcionalmente recuperar el polipéptido expresado. Los polinucleótidos de la invención se pueden incorporar en un vector replicable recombinante, p. ej. un vector de expresión. El vector se puede usar para replicar el ácido nucleico en una célula hospedadora compatible. Así, en una realización adicional, la invención proporciona un método para elaborar un polinucleótido de la invención al introducir un polinucleótido de la invención en un vector replicable, introducir el vector en una célula hospedadora compatible y hacer crecer la célula hospedadora bajo condiciones que efectúen la replicación del vector. El vector se puede recuperar de la célula hospedadora.

Preferiblemente, el polipéptido se produce como una proteína secretada, en cuyo caso la secuencia nucleotídica que codifica una forma madura del polipéptido en la construcción de expresión está enlazada operativamente a una secuencia nucleotídica que codifica una secuencia de señalización. Preferiblemente, la secuencia de señalización es natural (homóloga) a la secuencia nucleotídica que codifica el polipéptido. Alternativamente, la secuencia de señalización es extraña (heteróloga) a la secuencia nucleotídica que codifica el polipéptido, en cuyo caso la secuencia de señalización preferiblemente es endógena a la célula hospedadora en la que se expresa la secuencia nucleotídica según la invención. Ejemplos de secuencias de señalización adecuadas para células hospedadoras de levadura son las secuencias de señalización derivadas de genes de factor a de levadura. De forma similar, una secuencia de señalización adecuada para células hospedadoras de hongo filamentoso es, p. ej., una secuencia de señalización derivada de un gen de amiloglucosidasa (AG) de hongo filamentosos, p. ej. el gen glaA de A. niger. Este se puede usar en combinación con el propio promotor de amiloglucosidasa (también llamada (gluco)amilasa), así como en combinación con otros promotores. También se pueden usar secuencias de señalización híbridas con el contexto de la presente invención.

Secuencias líder de secreción heterólogas preferidas son las que se originan a partir del gen de amiloglucosidasa (AG) fúngica (glaA-ambas versiones de 18 y 24 aminoácidos, p. ej., procedentes de Aspergillus), el gen del factor a (levaduras, p. ej. Saccharomyces y Kluyveromyces) o el gen de a-amilasa (Bacillus).

Los vectores se pueden transformar o transfectar en una célula hospedadora adecuada según se describe anteriormente para la expresión de un polipéptido de la invención. Este procedimiento puede comprender cultivar una célula hospedadora transformada con un vector de expresión según se describe anteriormente bajo condiciones que proporcionen la expresión por el vector de una secuencia codificante que codifica el polipéptido.

Células hospedadoras

La invención proporciona así células hospedadoras transformadas o transfectadas con o que comprenden un polinucleótido o vector de la invención. Preferiblemente, el polinucleótido es soportado en un vector para la replicación y la expresión del polinucleótido. Las células se elegirán para que sean compatibles con dicho vector y, por ejemplo, pueden ser células procarióticas (por ejemplo bacterianas), fúngicas, de levadura o vegetales.

También se puede elegir un hospedador heterólogo en el que el polipéptido de la invención se produce en una forma que está sustancialmente libre de otras enzimas degradadoras de celulosa o degradadoras de hemicelulosa. Esto se puede conseguir al elegir un hospedador que normalmente no produce estas enzimas.

La invención abarca procedimientos para la producción del polipéptido de la invención por medio de expresión recombinante de una secuencia de ADN que codifica el polipéptido. Con este propósito, la secuencia de ADN de la invención se puede usar para la amplificación génica y/o el intercambio de señales de expresión, tales como promotores, secuencias de señalización de secreción, a fin de permitir la producción económica del polipéptido en una célula hospedadora homóloga o heteróloga adecuada. Una célula hospedadora homóloga es una célula hospedadora que es de la misma especie o que es una variante dentro de la misma especie que la especie de la que se deriva la secuencia de ADN.

Células hospedadoras adecuadas son preferiblemente microorganismos procarióticos tales como bacterias, o más preferiblemente organismos eucarióticos, por ejemplo hongos, tales como levaduras u hongos filamentosos, o células vegetales. En general, las células de levadura se prefieren sobre las células fúngicas debido a que son más fáciles de manipular. Sin embargo, algunas proteínas bien son escasamente secretadas desde las levaduras o bien en algunos casos no son procesadas apropiadamente (p. ej. hiperglicosilación en levadura). En estos casos, se debe seleccionar un organismo hospedador fúngico.

La célula hospedadora puede sobreexpresar el polipéptido, y se conocen bien técnicas para manipular la sobreexpresión. El hospedador puede tener así dos o más copias del polinucleótido codificante (y, según esto, el vector puede tener así dos o más copias).

En el contexto de la presente invención, la "célula hospedadora microbiana parental" y la "célula hospedadora microbiana mutante" puede ser cualquier tipo de célula hospedadora. Las realizaciones específicas de la célula hospedadora microbiana mutante se describen posteriormente en la presente. Estará claro para los expertos en la técnica que las realizaciones aplicables a la célula hospedadora microbiana mutante son asimismo aplicables a la célula hospedadora microbiana parental a menos que se indique otra cosa.

La célula hospedadora microbiana muíante según la presente invención puede ser una célula procariótica. Preferiblemente, la célula hospedadora procariótica es una célula bacteriana. El término "célula bacteriana" incluye microorganismos tanto gramnegativos como grampositivos. Bacterias adecuadas se pueden seleccionar, p. ej., de Escherichia, Anabaena, Caulobactert, Gluconobacter, Rhodobacter, Pseudomonas, Paracoccus, Bacillus, Brevibacterium, Corynebacterium, Rhizobium (Sinorhizobium), Flavobacterium, Klebsiella, Enterobacter, Lactobacillus, Lactococcus, Methylobacterium, Staphylococcus o Streptomyces. Preferiblemente, la célula bacteriana se selecciona del grupo que consiste en B. subtilis, B. amyloliquefaciens, B. licheniformis, B. puntis, B. megaterium, B. halodurans, B. pumilus, G. oxydans, Caulobactert crescentus CB 15, Methylobacterium extorquens, Rhodobacter sphaeroides, Pseudomonas zeaxanthinifaciens, Paracoccus denitrificans, E. coli, C. glutamicum, Staphylococcus carnosus, Streptomyces lividans, Sinorhizobium melioti y Rhizobium radiobacter.

Según una realización, la célula hospedadora microbiana mutante según la invención es una célula hospedadora eucariótica. Preferiblemente, la célula eucariótica es una células de mamífero, insecto, planta, hongo o alga. Células de mamífero preferidas incluyen, p. ej., células de ovario de hámster chino (CHO), células COS, células 293, células PerC6 e hibridomas. Células de insecto preferidas incluyen, p. ej., células Sf9 y Sf21 y sus derivados. Más preferiblemente, la célula eucariótica es una célula fúngica, es decir una célula de levadura, tal como una cepa de Candida, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces o Yarrowia. Más preferiblemente, la célula hospedadora eucariótica es una Kluyveromyces lactis, S. cerevisiae, Hansenula polymorpha, Yarrowia lipolytica o Pichia pastoris o una célula de hongo filamentoso. Lo más preferiblemente, la célula eucariótica es una célula de hongo filamentoso.

Hongos filamentosos incluyen todas las formas filamentosas de la subdivisión Eumycota y Oomycota (según se define por Hawksworth y cols., En Ainsworth and Bisby's Dictionary of The Fungi, 8a edición, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, Reino Unido). Los hongos filamentosos se caracterizan por una pared micelar compuesta por quitina, celulosa, glucano, quitosano, manano y otros polisacáridos complejos. El crecimiento vegetativo es mediante elongación de las hifas y el catabolismo del carbono es obligadamente aeróbico. Cepas de hongos filamentosos incluyen, pero no se limitan a, cepas de Acremonium, Agaricus, Aspergillus, Aureobasidium, Chrysosporium, Coprinus, Cryptococcus, Filibasidium, Fusarium, Humicola, Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Piromyces, Panerochaete, Pleurotus, Schizophyllum, Talaromyces, Rasamsonia, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium y Trichoderma.

Células de hongos filamentosos preferidas pertenecen a una especie de un género Acremonium, Aspergillus, Chrysosporium, Myceliophthora, Penicillium, Talaromyces, Rasamsonia, Thielavia, Fusarium o Trichoderma, y lo más preferiblemente una especies de Aspergillus niger, Acremonium alabamense, Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus sojae, Aspergillus fumigatus, Talaromyces emersonii, Rasamsonia emersonii, Aspergillus oryzae, Chrysosporium lucknowense, Fusarium oxysporum, Myceliophthora thermophila, Trichoderma reesei, Thielavia terrestris o Penicillium chrysogenum. Una célula hospedadora más preferida pertenece al género Aspergillus o Rasamsonia, más preferiblemente la célula hospedadora pertenece a la especie Aspergillus niger o Rasamsonia emersonii. Cuando la célula hospedadora según la invención es una célula hospedadora de Aspergillus niger, la célula hospedadora es preferiblemente CBS 513.88, CBS124.903 o uno de sus derivados.

Varias cepas de hongos filamentosos son fácilmente accesibles al público en un número de colecciones de cultivo, tales como the American Type Culture Collection (ATCC), Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM), Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS), Agricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center (NRRL) y All-Russian Collection of Microorganisms of Russian Academy of Sciences, (abreviatura en ruso - VKM, abreviatura en inglés - RCM), Moscú, Rusia. Cepas útiles en el contexto de la presente invención pueden ser CBS 513.88 de Aspergillus niger, CBS124.903, ATCC 20423 de Aspergillus oryzae, IFO 4177, ATCC 1011, CBS205.89, ATCC 9576, ATCC14488-14491, ATCC 11601, ATCC12892, CBS 455.95 de P. chrysogenum, Wisconsin54-1255 (ATCC28089) de P. chrysogenum, ATCC 38065 de Penicillium citrinum, P2 de Penicillium chrysogenum, NRRL8126 de Thielavia terrestris, CBS 124.902 de Talaromyces emersonii, ATCC 36225 o ATCC 48272 de Acremonium chrysogenum, ATCC 26921 o ATCC 56765 o At CC 26921 de Trichoderma reesei, ATCC11906 de Aspergillus sojae, C1 de Myceliophthora thermophila, Garg 27K, VKM-F 3500 D, C1 de Chrysosporium lucknowense, Garg 27K, VKM-F 3500 D, ATCC44006 y sus derivados.

Según una realización de la invención, cuando la célula hospedadora microbiana mutante según la invención es una célula hospedadora de hongo filamentoso, la célula hospedadora microbiana mutante puede comprender una o más modificaciones en su genoma de modo que la célula hospedadora microbiana mutante sea deficiente en la producción de al menos un producto seleccionado de glucoamilasa (glaA), alfa-amilasa estable a los ácidos (amyA), alfa-amilasa neutra (amyBI y amyBII), ácido oxálico hidrolasa (oahA), una toxina, preferiblemente ocratoxina y/o fumonisina, un regulador transcripcional de proteasa prtT, PepA, un producto codificado por el gen hdfA y/o hdfB, una péptido sintasa no ribosómica npsE, si se compara con una célula hospedadora original y se mide bajo las mismas condiciones.

Por lo tanto, cuando la célula hospedadora microbiana mutante según la invención es una célula hospedadora de hongo filamentoso, la célula hospedadora puede comprender una o más modificaciones en su genoma para dar como resultado una deficiencia en la producción de la proteasa aspártica extracelular principal PepA. Por ejemplo, la célula hospedadora según la invención puede comprender además una alteración del gen pepA que codifica la proteasa aspártica extracelular principal PepA.

Cuando la célula hospedadora microbiana mutante según la invención es una célula hospedadora de hongo filamentoso, la célula hospedadora según la invención puede comprender adicionalmente una o más modificaciones en su genoma para dar como resultado una deficiencia en la producción del producto codificado por el gen hdf A y/o hdfB. Por ejemplo, la célula hospedadora según la invención puede comprender además una alteración del gen hdfA y/o hdfB. Células hospedadoras de hongo filamentoso que son deficientes en un producto codificado por el gen hdfA y/o hdfB se han descrito en el documento WO 2005/095624.

Cuando la célula hospedadora microbiana mutante según la invención es una célula hospedadora de hongo filamentoso, la célula hospedadora según la invención puede comprender adicionalmente una modificación en su genoma que da como resultado la deficiencia en la producción de la péptido sintasa no ribosómica npsE. Estas células hospedadoras deficientes en la producción de péptido sintasa no ribosómica npsE se han descrito en el documento WO 2012/001169 (npsE tiene una secuencia genómica como la representada en SEQ ID NO: 35, una secuencia codificante representada en SEQ ID NO: 36, el ARNm representado en SEQ ID NO: 37 y la proteína nrps en SEQ ID NO: 38 del documento WO 2012/001169).

Cuando la célula hospedadora microbiana mutante según la invención es una célula hospedadora de hongo filamentoso, la célula hospedadora puede comprender adicionalmente al menos dos dominios de ADN sustancialmente homólogos adecuados para la integración de una o más copias de un polinucleótido que codifica un compuesto de interés en el que al menos uno de los al menos dos dominios de ADN sustancialmente homólogos está adaptado para tener una preferencia de integración potenciada para el polinucleótido que codifica un compuesto de interés en comparación con el dominio de ADN sustancialmente homólogo a partir del que se origina, y en donde el dominio de ADN sustancialmente homólogo, donde el dominio de ADN sustancialmente homólogo adaptado a partir del que se origina tiene una frecuencia de conversión génica que es al menos 10% superior que uno de los otros de los al menos dos dominios de ADN sustancialmente homólogos. Estas células se han descrito en el documento WO2011/009700. Las cepas que contienen dos o más copias de estos dominios de ADN sustancialmente homólogos también se denominan en lo sucesivo en la presente cepa que contiene dos o más amplicones. Ejemplos de células hospedadoras que comprenden estos amplicones se describen, p. ej., en van Dijck y cols, 2003, Regulatory Toxicology and Pharmacology 28; 27-35: On the safety of a new generation of DSM Aspergillus niger enzyme production strains. En van Dijck y cols, se describe una cepa de Aspergillus niger que comprende 7 locus génicos de glucoamilasa amplificados, es decir 7 amplicones. Células hospedadoras preferidas dentro de este contexto son células hospedadoras de hongo filamentoso, preferiblemente células hospedadoras de A. niger , que comprenden dos o más amplicones, preferiblemente dos o más amplicones Ag/aA (que comprenden preferiblemente 3, 4, 5, 6, 7 amplicones Ag/aA) en donde el amplicón que tiene la frecuencia de conversión génica más alta se ha adaptado para tener una preferencia de integración potenciada para el polinucleótido que codifica un compuesto de interés en comparación con el amplicón a partir del que se origina. La adaptación del amplicón se puede realizar según uno cualquiera de los métodos descritos en el documento WO 2011/009700. Un ejemplo de estas células hospedadoras, descrito en el documento WO2011/009700, son células hospedadoras que comprenden tres amplicones Ag/aA que son un amplicón truncado por BamHI, un amplicón truncado por Sa/l y un amplicón truncado por Bg/ll y en donde el amplicón de BamHI se ha adaptado para tener una preferencia de integración potenciada para un polinucleótido que codifica un compuesto de interés en comparación con el amplicón de BamHI a partir del que se origina. Las células hospedadoras que comprenden dos o más amplicones en las que un amplicón se ha adaptado para tener una preferencia de integración potenciada para un polinucleótido que codifica un compuesto de interés en comparación con el amplicón a partir del que se origina se denominan en la presente posteriormente células hospedadoras que comprenden un amplicón adaptado.

Cuando la célula hospedadora microbiana mutante según la invención es una célula hospedadora de hongo filamentoso, la célula hospedadora según la invención puede comprender adicionalmente una modificación de Sec61. Una modificación de SEC61 preferida es una modificación que da como resultado un mutante unidireccional de SEC61; es decir un mutante en el que la proteína sintetizada de novo puede entrar en el ER a través de SEC61, pero la proteína no puede abandonar el Er a través de SEC61. Estas modificaciones se describen a fondo en el documento WO 2005/123763. Lo más preferiblemente, la modificación de SEC 61 es la mutación S376W en la que la Serina 376 se reemplaza por triptófano.

Las células hospedadoras según la invención incluyen células vegetales, y por lo tanto la invención se extiende a organismos transgénicos, tales como plantas y sus partes, que contienen una o más células de la invención. Las células pueden expresar heterólogamente el polipéptido de la invención o pueden contener heterólogamente uno o más de los polinucleótidos de la invención. Por lo tanto, la planta transgénica (o genéticamente modificada) puede tener insertado (p. ej. establemente) en su genoma una secuencia que codifica uno o más de los polipéptidos de la invención. La transformación de células vegetales se puede realizar usando técnicas conocidas, por ejemplo usando un plásmido Ti o Ri procedente de Agrobacterium tumefaciens. El plásmido (o vector) puede contener así secuencias necesarias para infectar una planta, y se pueden emplear derivados de los plásmidos Ti y/o Ri.

Alternativamente, se puede afectar a la infección directa de una parte de una planta, tal como una hoja, raíz o tallo. En esta técnica, la planta que se va a infectar se puede herir, por ejemplo al cortar la planta con una cuchilla o pinchar la planta con una ajuga o frotar la planta con un abrasivo. A continuación, la herida se inocula con la Agrobacterium. A continuación, la planta o parte de planta se puede hacer crecer sobre un medio de cultivo adecuado y dejar desarrollar hasta una planta madura. La regeneración de células transformadas en plantas genéticamente modificadas se puede conseguir usando técnicas conocidas, por ejemplo al seleccionar brotes transformados usando un antibiótico y al subcultivar los brotes en un medio que contiene los nutrientes apropiados, hormonas vegetales y similares.

La invención también incluye células que se han modificado para expresar la celobiohidrolasa de la invención o una de sus variantes. Estas células incluyen líneas celulares eucarióticas superiores transitorias, o preferiblemente estables, tales como células de mamífero o células de insecto, células eucarióticas inferiores, tales como células de levadura y hongos (p. ej. filamentosos) o células procarióticas tales como células bacterianas.

También es posible que las proteínas de la invención se expresen transitoriamente en una línea celular o sobre una membrana, tal como, por ejemplo, en un sistema de expresión baculoviral. Estos sistemas, que están adaptados para expresar las proteínas según la invención, también se incluyen dentro del alcance de la presente invención.

Según la presente invención, la producción del polipéptido de la invención puede estar afectada por el cultivo de hospedadores de expresión microbianos, que se han transformado con uno o más polinucleótidos de la presente invención, en un medio de fermentación con nutrientes convencional.

Producción de polipéptidos/enzimas

Las células hospedadoras recombinantes según la invención se pueden cultivar usando procedimientos conocidos en la especialidad. Para cada combinación de un promotor y una célula hospedadora, están disponibles condiciones de cultivo que conducen a la expresión de la secuencia de ADN que codifica el polipéptido. Después de alcanzar la densidad celular o el título deseados del polipéptido, el cultivo se detiene y el polipéptido se recupera usando procedimientos conocidos.

El medo de fermentación puede comprender un medio de cultivo conocido que contiene una fuente de carbono (p. ej. glucosa, maltosa, melaza, almidón, celulosa, xilano, pectina, hidrolizado de biomasa lignocelolítica, etc.), una fuente de nitrógeno (p. ej. sulfato amónico, nitrato amónico, cloruro amónico, etc.), una fuente de nitrógeno orgánico (p. ej., extracto de levadura, extracto de malta, peptona, etc.) y fuentes de nutrientes inorgánicos (p. ej. fosfato, magnesio, potasio, cinc, hierro, etc.). Opcionalmente, se puede incluir un inductor (p. ej. celulosa, pectina, xilano, maltosa, maltodextrina o xilogalacturonano).

La selección del medio apropiado se puede basar en la elección del hospedador de expresión y/o basar en los requisitos reguladores de la construcción de expresión. Estos medios son conocidos por los expertos en la especialidad. Si se desea, el medio puede contener componentes adicionales que favorezcan los hospedadores de expresión transformados sobre otros microorganismos potencialmente contaminantes.

La fermentación se puede realizar a lo largo de un período de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 30 días. Puede ser un procedimiento discontinuo, continuo o semicontinuo, adecuadamente a una temperatura en el intervalo de 0-100°C o 0-80°C, por ejemplo, de aproximadamente 0 a aproximadamente 50°C y/o a un pH, por ejemplo, de aproximadamente 2 a aproximadamente 10. Condiciones de fermentación preferidas son una temperatura en el intervalo de aproximadamente 20 a aproximadamente 45°C y/o a un pH de aproximadamente 3 a aproximadamente 9. Las condiciones apropiadas se seleccionan habitualmente basándose en la elección del hospedador de expresión y la proteína que se vaya a expresar.

Después de la fermentación, si es necesario, las células se pueden retirar del caldo de fermentación por medio de centrifugación o filtración. Después de que la fermentación se haya detenido o después de la retirada de las células, el polipéptido de la invención se puede retirar a continuación y, si se desea, purificar y aislar por medios convencionales.

Composiciones de polipéptido/enzima

La invención proporciona una composición que comprende un polipéptido de la invención y una celulasa y/o una hemicelulasa y/o una pectinasa y/o ligninasa o una enzima modificadora de lignina.

Cuando el polipéptido de la invención sea una celulasa, una composición de la invención comprenderá típicamente una hemicelulasa y/o una pectinasa y/o ligninasa o una enzima modificadora de lignina además del polipéptido de la invención.

Cuando el polipéptido de la invención sea una hemicelulasa, una composición de la invención comprenderá típicamente una celulasa y/o una pectinasa y/o ligninasa o una enzima modificadora de lignina además del polipéptido de la invención.

Cuando el polipéptido de la invención sea una pectinasa, una composición de la invención comprenderá típicamente una celulasa y/o una hemicelulasa y/o ligninasa o una enzima modificadora de lignina además del polipéptido de la invención.

Cuando el polipéptido de la invención sea una ligninasa o una enzima modificadora de lignina, una composición de la invención comprenderá típicamente una celulasa y/o una hemicelulasa y/o una pectinasa además del polipéptido de la invención.

Una composición de la invención puede comprender una, dos, tres o más clases de celulasa, por ejemplo una, dos o todas de una GH61, una endo-1,4-3-glucanasa (EG), una exocelobiohidrolasa (CBH) y una p-glucosidasa (BGL).

Una composición de la invención puede comprender un polipéptido que tiene la misma actividad enzimática, por ejemplo el mismo tipo de actividad como celulasa, hemicelulasa y/o pectinasa que el proporcionado por un polipéptido de la invención.

Una composición de la invención puede comprender un polipéptido que tiene un tipo diferente de actividad como celulasa y/o actividad como hemicelulasa y/o actividad como pectinasa que el proporcionado por un polipéptido de la invención. Por ejemplo, una composición de la invención puede comprende un tipo de actividad como celulasa y/o hemicelulasa y/o actividad como pectinasa proporcionado por un polipéptido de la invención y un segundo tipo de actividad como celulasa y/o hemicelulasa y/o actividad como pectinasa proporcionado por una hemicelulasa/pectinasa adicional.

En la presente, una celulasa es cualquier polipéptido que sea capaz de degradar o celulosa. Un polipéptido que sea capaz de degradar celulosa es uno que sea capaz de catalizar el proceso de descomposición de celulosa en unidades menores, bien parcialmente, por ejemplo en celodextrinas, o bien completamente en monómeros de glucosa. Una celulasa según la invención puede dar lugar a una población mixta de celodextrinas y monómeros de glucosa cuando se ponga en contacto con la celulasa. Está degradación tendrá lugar típicamente por medio de una reacción de hidrólisis.

En la presente, una hemicelulasa es cualquier polipéptido que sea capaz de degradar o hemicelulosa. Es decir, una hemicelulasa puede ser capaz de degradar uno o más de xilano, glucuronoxilano, arabinoxilano, glucomanano y xiloglucano. Un polipéptido que sea capaz de degradar una hemicelulosa es uno que sea capaz de catalizar el proceso de descomposición de la hemicelulosa en polisacáridos menores, bien parcialmente, por ejemplo en oligosacáridos, o bien completamente en monómeros sacáricos, por ejemplo los monómeros sacáricos hexosa o pentosa. Una hemicelulasa según la invención puede dar lugar a una población mixta de oligosacáridos y monómeros sacáricos cuando se ponga en contacto con la hemicelulasa. Esta degradación tendrá lugar típicamente por medio de una reacción de hidrólisis.

En la presente, una pectinasa es cualquier polipéptido que sea capaz de degradar o pectina. Un polipéptido que sea capaz de degradar pectina es uno que sea capaz de catalizar el proceso de descomposición de pectina en unidades menores, bien parcialmente, por ejemplo en oligosacáridos, o bien completamente en monómeros sacáricos. Una pectinasa según la invención puede dar lugar a una población mixta de oligosacáridos y monómeros sacáricos cuando se ponga en contacto con la pectinasa. Esta degradación tendrá lugar típicamente por medio de una reacción de hidrólisis.

En la presente, una ligninasa o una enzima modificadora de lignina es cualquier polipéptido que sea capaz de degradar o modificar lignina o sus componentes de degradación. Un polipéptido que sea capaz de degradar o modificar lignina es uno que sea capaz de catalizar el proceso de descomposición de lignina en unidades menores, parcialmente, por ejemplo en compuestos monofenílicos. Una ligninasa o una enzima modificadora de lignina según la invención puede dar lugar a una población mixta de compuestos fenólicos cuando se pone en contacto con la lignina. Esta degradación tendrá lugar típicamente por medio de una reacción de oxidación. En la presente, una ligninasa o una enzima modificadora de lignina también puede ser cualquier polipéptido que sea capaz de degradar productos de degradación fenólicos de lignina. Un polipéptido que sea capaz de degradar productos de degradación fenólicos de lignina es uno que sea capaz de catalizar el proceso de descomposición de productos de degradación fenólicos de lignina en unidades todavía menores, por ejemplo al catalizar una reacción de apertura de anillo del anillo fenólico. Una ligninasa o una enzima modificadora de lignina según la invención puede dar lugar a una población mixta de productos de degradación de anillo abierto de compuestos fenólicos cuando se ponga en contacto con los productos de degradación fenólicos de lignina. Esta degradación tendrá lugar típicamente por medio de una reacción de oxidación. La ligninasa o una enzima modificadora de lignina puede ser capaz además de romper enlaces entre celulosa o hemicelulosa y la lignina o sus productos de degradación. Enzimas que pueden descomponer incluyen lignina peroxidasas, manganeso peroxidasas, lacasas y feruloilesterasas, y otras enzimas conocidas en la técnica para despolimerizar o romper de otro modo polímeros de lignina. También se incluyen enzimas capaces de hidrolizar uniones formadas entre azúcares hemicelulósicos (notablemente arabinosa) y lignina. Las ligninasas incluyen, pero no se limitan a, el siguiente grupo de enzimas: lignina peroxidasas (EC 1.11.14), manganeso peroxidasas (EC 1.11.1.13), lacasas (EC 1.10.3.2) y feruloilesterasas (EC 3.1.1.73).

Según esto, una composición de la invención puede comprender cualquier celulasa, por ejemplo, una GH61, una celobiohidrolasa, una endo-p-1,4-glucanasa, una p-glucosidasa o una p-(1,3)(1,4)-glucanasa.

Las proteínas GH61 (familia de glucósido hidrolasas 61 o a veces denominadas EGIV) son polisacárido monooxigenasas (PMO's) dependientes de oxígeno según la última bibliografía. A menudo, en la bibliografía, se menciona que estas proteínas potencian la acción de celulasas sobre sustratos de lignocelulosa. GH61 se clasificó originalmente como endoglucanasa basándose en la medida de una actividad como endo-1,4-p-d-glucanasa muy débil en un miembro de la familia. El término "GH61", según se usa en la presente, se ha de entender como una familia de enzimas, que comparten porciones de secuencia conservadas y pliegues comunes que se van a clasificar en la familia 61 del sistema de clasificación CAZY GH bien establecido (http://www.cazy.org/GH61 .html). La familia 61 de glucósido hidrolasas es un miembro de la familia de glucósido hidrolasas EC 3.2.1. GH61 se usa en la presente como si fuera parte de las celulasas.

En la presente, una celobiohidrolasa (EC 3.2.1.91) es cualquier polipéptido que sea capaz de catalizar la hidrólisis de enlaces 1,4-p-D-glucosídicos en celulosa o celotetraosa, liberando celobiosa de los extremos no reductores de las cadenas. Esta enzima también se puede denominar celulasa 1,4-p-celobiosidasa, 1,4-p-celobiohidrolasa, 1,4-p-D-glucano celobiohidrolasa, avicelasa, exo-1,4-p-D-glucanasa, exocelobiohidrolasa o exoglucanasa. Puede tener el código EC EC 3.2.1.91.

En la presente, una endo-p-1,4-glucanasa (EC 3.2.1.4) es cualquier polipéptido que sea capaz de catalizar la endohidrólisis de enlaces 1,4-p-D-glucosídicos en celulosa, liquenina o p-D-glucanos de cereales. Este polipéptido también puede ser capaz de hidrolizar enlaces 1,4 en p-D-glucanos que también contienen enlaces 1,3. Esta enzima también se puede denominar celulasa, avicelasa, p-1,4-endoglucano hidrolasa, p-1,4-glucanasa, carboximetil celulasa, celudextrinasa, endo-1,4-p-D-glucanasa, endo-1,4-p-D-glucanohidrolasa, endo-1,4-p-glucanasa o endoglucanasa. La endo-glucanasa también puede catalizar la escisión de xiloglucano, un esqueleto de residuos de glucosa con enlaces p1 — ^4, la mayoría de los cuales sustituidos con cadenas laterales de xilosa con enlaces 1-6, y la enzima se denomina entonces una endo-p-1,4-glucanasa específica de xiloglucano o una xiloglucanasa.

En la presente, una p-glucosidasa (EC 3.2.1.21) es cualquier polipéptido que sea capaz de catalizar la hidrólisis de residuos de p-D-glucosa no reductores terminales con liberación de p-D-glucosa. Este polipéptido puede tener una amplia especificidad para p-D-glucósidos y también puede hidrolizar uno o más de los siguientes: un p-D-galactósido, un a-L-arabinósido, un p-D-xilósido o un p-D-fucósido. Esta enzima también se puede denominar amigdalasa, p-D-glucósido glucohidrolasa, celobiasa o gentobiasa.

En la presente, una p-(1,3)(1,4)-glucanasa (EC 3.2.1.73) es cualquier polipéptido que sea capaz de catalizar la hidrólisis de enlaces 1,4-p-D-glucosídicos en p-D-glucanos que contengan uniones 1,3 y 1,4. Tal polipéptido puede actuar sobre liquenina y p-D-glucanos de cereales, pero no sobre p-D-glucanos que contienen solamente uniones 1,3 o 1,4. Esta enzima también se puede denominar liqueninasa, 1,3-1,4-p-D-glucano 4-glucanohidrolasa, p-glucanasa, endo-p-1,3-1,4-glucanasa, liquenasa o p-glucanasa de enlaces mixtos. Una alternativa para este tipo de enzima es EC 3.2.1.6, que se describe como endo-1,3(4)-beta-glucanasa. Este tipo de enzima hidroliza enlaces 1,3 o 1,4 en beta-D-glucanos cuando el residuo de glucosa cuyo grupo reductor está implicado en el enlace que se va a hidrolizar esté él mismo sustituido en C-3. Nombres alternativos incluyen endo-1,3-beta-glucanasa, laminarinasa, 1,3-(1,3;1,4)-beta-D-glucano 3 (4) glucanohidrolasa; sustratos incluyen laminarina, liquenina y beta-D-glucanos de cereales.

Una composición de la invención puede comprender cualquier hemicelulasa, por ejemplo, una endo-xilanasa, una pxilosidasa, una a-L-arabionofuranosidasa, una a-D-glucuronidasa, una celobiohidrolasa, una feruloilesterasa, una cumaroilesterasa, una a-galactosidasa, una p-galactosidasa, una p-mananasa o una p-manosidasa.

En la presente, una endoxilanasa (EC 3.2.1.8) es cualquier polipéptido que sea capaz de catalizar la endohidrólisis de enlaces 1,4-p-D-xilosídicos en xilanos. Esta enzima también se puede denominar endo-1,4-p-xilanasa o 1,4-p-D-xilano xilanohidrolasa. Una alternativa es EC 3.2.1.136, una glucuronoarabinoxilano endoxilanasa, una enzima que es capaz de hidrolizar enlaces 1,4 xilosídicos en glucuronoarabinoxilanos.

En la presente, una p-xilosidasa (EC 3.2.1.37; GH3) es cualquier polipéptido que sea capaz de catalizar la hidrólisis de 1,4-p-D-xilanos, para retirar residuos de D-xilosa sucesivos de las terminaciones no reductoras. Estas enzimas también pueden hidrolizar xilobiosa. Esta enzima también se puede denominar xilano 1,4-p-xilosidasa, 1,4-p-D-xilano xilohidrolasa, exo-1,4-p-xilosidasa o xilobiasa.

En la presente, una a-L-arabinofuranosidasa (EC 3.2.1.55) es cualquier polipéptido que sea capaz de actuar sobre a-L-arabinofuranósidos, a-L-arabinanos que contienen enlaces (1,2) y/o (1,3) y/o (1,5), arabinoxilanos y arabinogalactanos. Esta enzima también se puede denominar a-N-arabinofuranosidasa, arabinofuranosidasa o arabinosidasa.

En la presente, una a-D-glucuronidasa (EC 3.2.1.139) es cualquier polipéptido que sea capaz de catalizar una reacción de la siguiente forma: alfa-D-glucuronósido H(2)O = un alcohol D-glucuronato. Esta enzima también se puede denominar alfa-glucuronidasa o alfa-glucosiduronasa. Estas enzimas también pueden hidrolizar ácido glucurónico metilado en 4-O, que también puede estar presente como un sustituyente en xilanos. Una alternativa es EC 3.2.1.131: xilano alfa-1,2-glucuronosidasa, que cataliza la hidrólisis de enlaces alfa-1,2-(4-O-metil)glucuronosílicos.

En la presente, una acetil xilano esterasa (EC 3.1.1.72) es cualquier polipéptido que sea capaz de catalizar la desacetilación de xilanos y xilooligosacáridos. Este polipéptido puede catalizar la hidrólisis de grupos acetilo de xilano polimérico, xilosa acetilada, glucosa acetilada, acetato de alfa-naftilo o acetato de p-nitrofenilo, pero, típicamente, no de triacetilglicerol. Típicamente, este polipéptido no actúa sobre manano acetilado o pectina.

En la presente, una feruloilesterasa (EC 3.1.1.73) es cualquier polipéptido que sea capaz de catalizar una reacción de la forma: feruloil-sacárido H(2)O = ferulato sacárido. El sacárido puede ser, por ejemplo, un oligosacárido o un polisacárido. Típicamente, puede catalizar la hidrólisis del grupo 4-hidroxi-3-metoxicinamoílo (feruloílo) desde un azúcar esterificado, que habitualmente es arabinosa en sustratos 'naturales'. Típicamente, el acetato de p-nitrofenol y el ferulato de metilo son sustratos más pobres. Esta enzima también se puede denominar éster cinamoílico hidrolasa, ácido ferúlico esterasa o hidroxicinamoilesterasa. También se puede denominar una enzima auxiliar de hemicelulasa, puesto que puede ayudar a la xilanasas y pectinasas a descomponer la hemicelulosa y la pectina de la pared celular de la planta.

En la presente, una cumaroilesterasa (EC 3.1.1.73) es cualquier polipéptido que sea capaz de catalizar una reacción de la forma: cumaroil-sacárido H(2)O = cumarato sacárido. El sacárido puede ser, por ejemplo, un oligosacárido o un polisacárido. Esta enzima también se puede denominar trans-4-cumaroilesterasa, trans-p-cumaroilesterasa, pcumaroilesterasa o ácido p-cumárico esterasa. Esta enzima también se encuentra dentro de EC 3.1.1.73, de modo que también se puede denominar una feruloilesterasa.

En la presente, una a-galactosidasa (EC 3.2.1.22) es cualquier polipéptido que sea capaz de catalizar la hidrólisis de residuos de a-D-galactosa no reductores terminales en a-D-galactósidos, incluyendo oligosacáridos de galactosa, galactomananos, galactanos y arabinogalactanos. Este polipéptido también puede ser capaz de hidrolizar a-D-fucósidos. Esta enzima también se puede denominar melibiasa.

En la presente, una p-galactosidasa (EC 3.2.1.23) es cualquier polipéptido que sea capaz de catalizar la hidrólisis de residuos de p-D-galactosa no reductores terminales en p-D-galactósidos. Este polipéptido también puede ser capaz de hidrolizar a-L-arabinósidos. Esta enzima también se puede denominar exo-(1->4)-p-D-galactanasa o lactasa.

En la presente, una p-mananasa (EC 3.2.1.78) es cualquier polipéptido que sea capaz de catalizar la hidrólisis aleatoria de enlaces 1,4-p-D-manosídicos en mananos, galactomananos y glucomananos. Esta enzima también se puede denominar manano endo-1,4-p-manosidasa o endo-1,4-mananasa.

En la presente, una p-manosidasa (EC 3.2.1.25) es cualquier polipéptido que sea capaz de catalizar la hidrólisis de residuos de p-D-manosa no reductores terminales en p-D-manósidos. Esta enzima también se puede denominar mananasa o manasa.

Una composición de la invención puede comprender cualquier pectinasa, por ejemplo una endopoligalacturonasa, una pectina metil esterasa, una endo-galactanasa, una beta galactosidasa, una pectina acetil esterasa, una endo-pectina liasa, pectato liasa, alfa ramnosidasa, una exogalacturonasa, una exopoligalacturonato liasa, una ramnogalacturonano hidrolasa, una ramnogalacturonano liasa, una ramnogalacturonano acetil esterasa, una ramnogalacturonano galacturonohidrolasa o una xilogalacturonasa.

En la presente, una endo-poligalacturonasa (EC 3.2.1.15) es cualquier polipéptido que sea capaz de catalizar la hidrólisis aleatoria de enlaces 1,4-a-D-galactosidurónicos en pectato y otros galacturonanos. Esta enzima también se puede denominar poligalacturonasa pectina despolimerasa, pectinasa, endopoligalacturonasa, pectolasa, pectina hidrolasa, pectina poligalacturonasa, poli-a-1,4-galacturónido glucanohidrolasa, endogalacturonasa; endo-D-galacturonasa o poli(1,4-a-D-galacturónido) glucanohidrolasa.

En la presente, una pectina metil esterasa (EC 3.1.1.11) es cualquier enzima que sea capaz de catalizar la reacción: pectina n H2O = n metanol pectato. La enzima también se puede conocer como pectinesterasa, pectina desmetoxilasa, pectina metoxilasa, pectina metilesterasa, pectasa, pectinoesterasa o pectina pectilhidrolasa.

En la presente, una endo-galactanasa (EC 3.2.1.89) es cualquier enzima capaz de catalizar la endohidrólisis de enlaces 1,4-p-D-galactosídicos en arabinogalactanos. La enzima también se puede conocer como arabinogalactano endo-1,4-p-galactosidasa, endo-1,4-p-galactanasa, galactanasa, arabinogalactanasa o arabinogalactano 4-p-D-galactanohidrolasa.

En la presente, una pectina acetil esterasa se define en la presente como una enzima que tiene una actividad como acetil esterasa que cataliza la desacetilación de los grupos acetilo en los grupos hidroxilo de residuos de GalUA de pectina.

En la presente, una endo-pectina liasa (EC 4.2.2.10) es cualquier enzima capaz de catalizar la escisión eliminativa de éster metílico de (1 ^-4)-a-D-galacturonano para dar oligosacáridos con grupos 4-desoxi-6-O-metil-a-D-galact-4-enuronosilo en sus extremos no reductores. La enzima también se puede conocer como pectina liasa, pectina transeliminasa; endo-pectina liasa, transeliminasa polimetilgalacturónica, pectina metiltranseliminasa, pectoliasa, PL, PNL o PMGL o (1^-4)-6-O-metil-a-D-galacturonano liasa.

En la presente, una pectato liasa (EC 4.2.2.2) es cualquier enzima capaz de catalizar la escisión eliminativa de (1 ^ 4 ) -a-D-galacturonano para dar oligosacáridos con grupos 4-desoxi-a-D-galact-4-enuronosilo en sus extremos no reductores. La enzima también se puede conocer como transeliminasa poligalacturónica, ácido péctico transeliminasa, poligalacturonato liasa, endopectina metiltranseliminasa, pectato transeliminasa, endogalacturonato transeliminasa, ácido péctico liasa, liasa péctica, a-1,4-D-endopoli(ácido galacturónico) liasa, PGA liasa, PPasa-N, endo-a-1,4-poli(ácido galacturónico) liasa, poli(ácido galacturónico) liasa, pectina transeliminasa, poli(ácido galacturónico) trans­ eliminasa o (1^4)-a-D-galacturonano liasa.

En la presente, una alfa ramnosidasa (EC 3.2.1.40) es cualquier polipéptido que sea capaz de catalizar la hidrólisis de residuos de a-L-ramnosa no reductores terminales en a-L-ramnósidos o alternativamente en ramnogalacturonano. Esta enzima también se puede conocer como a-L-ramnosidasa T, a-L-ramnosidasa N o a-L-ramnósido ramnohidrolasa.

En la presente, exogalacturonasa (EC 3.2.1.82) es cualquier polipéptido capaz de hidrólisis de ácido péctico desde el extremo no reductor, liberando digalacturonato. La enzima también se puede conocer como exo-poli-agalacturonosidasa, exopoligalacturonosidasa o exopoligalacturanosidasa.

En la presente, exogalacturonasa (EC 3.2.1.67) es cualquier polipéptido capaz de catalizar: (1,4-a-D-galacturónido)ⁿ + H2O = (1,4-a-D-galacturónido)^n-1 + D-galacturonato. La enzima también se puede conocer como galacturano 1,4-agalacturonidasa, exopoligalacturonasa, poli(galacturonato) hidrolasa, exo-D-galacturonasa, exo-D-galacturonanasa, exo-poli-D-galacturonasa o poli(1,4-a-D-galacturónido) galacturonohidrolasa.

En la presente, exo-poligalacturonato liasa (EC 4.2.2.9) es cualquier polipéptido capaz de catalizar la escisión eliminativa de 4-(4-desoxi-a-D-galact-4-enuronosil)-D-galacturonato desde el extremo reductor de pectato, es decir pectina desesterificada. Esta enzima se puede conocer como pectato disacárido-liasa, pectato exo-liasa, ácido exopéctico transeliminasa, exo-pectato liasa, exopoli(ácido galacturónico)-trans-eliminasa, PATE, exo-PATE, exo-PGL o extremo reductor de (1^4)-a-D-galacturonano disacárido-liasa.

En la presente, ramnogalacturonano hidrolasa es cualquier polipéptido que sea capaz de hidrolizar el enlace entre ácido galactosilurónico y ramnopiranosilo de un modo endo en estructuras de ramnogalacturonano estrictamente alternas, que consisten en el disacárido [ácido (1,2-alfa-L-ramnoil-(1,4)-alfa-galactosilurónico].

En la presente, ramnogalacturonano liasa es cualquier polipéptido que sea capaz de escindir enlaces a-L-Rhap-(1^4)-a-D-GalpA de un modo endo en ramnogalacturonano mediante beta-eliminación.

En la presente, ramnogalacturonano acetil esterasa es cualquier polipéptido que catalice la desacetilación del esqueleto de residuos de ramnosa y ácido galacturónico alternos en ramnogalacturonano.

En la presente, ramnogalacturonano galacturonohidrolasa es cualquier polipéptido que sea capaz de hidrolizar ácido galacturónico desde el extremo no reductor de estructuras de ramnogalacturonano estrictamente alternas de un modo exo.

En la presente, xilogalacturonasa es cualquier polipéptido que actúe sobre xilogalacturonano al escindir el ácido galacturónico sustituido con p-xilosa de un modo endo. Esta enzima también se puede conocer como xilogalacturonano hidrolasa.

En la presente, una a-L-arabinofuranosidasa (EC 3.2.1.55) es cualquier polipéptido que sea capaz de actuar sobre a-L-arabinofuranósidos, a-L-arabinanos que contienen enlaces (1,2) y/o (1,3) y/o (1,5), arabinoxilanos y arabinogalactanos. Esta enzima también se puede denominar a-N-arabinofuranosidasa, arabinofuranosidasa o arabinosidasa.

En la presente, endo-arabinanasa (EC 3.2.1.99) es cualquier polipéptido que sea capaz de catalizar la endohidrólisis de enlaces 1,5-a-arabinofuranosídicos en 1,5-arabinanos. La enzima también se puede conocer como endoarabinasa, arabinano endo-1,5-a-L-arabinosidasa, endo-1,5-a-L-arabinanasa, endo-a-1,5-arabanasa; endoarabanasa o 1,5-a-L-arabinano 1,5-a-L-arabinanohidrolasa.

Una composición de la invención comprenderá típicamente al menos una celulasa y/o al menos una hemicelulasa y/o al menos una pectinasa (una de las cuales es un polipéptido según la invención). Una composición de la invención puede comprender una celobiohidrolasa, una endoglucanasa y/o una p-glucosidasa. Esta composición también puede comprender una o más hemicelulasas y/o una o más pectinasas.

Una o más (por ejemplo dos, tres, cuatro o la totalidad) de una amilasa, una proteasa, una lipasa, una ligninasa, una hexosiltransferasa o una glucuronidasa pueden estar presentes en una composición de la invención.

"Proteasa" incluye enzimas que hidrolizan uniones peptídicas (peptidasas), así como enzimas que hidrolizan uniones entre péptidos y otros restos, tales como azúcares (glucopeptidasas). Muchas proteasas se caracterizan bajo EC 3.4, y son adecuadas para el uso en la invención incorporada en la presente mediante referencia. Algunos tipos específicos de proteasas incluyen, cisteína proteasas incluyendo pepsina, papaína y serina proteasas incluyendo quimotripsinas, carboxipeptidasas y metaloendopeptidasas.

"Lipasa" incluye enzimas que hidrolizan lípidos, ácidos grasos y acilglicéridos, incluyendo fosfoglicéridos, lipoproteínas, diacilgliceroles y similares. En plantas, se usan lípidos como componentes estructurales para limitar la pérdida de agua y la infección por patógenos. Estos lípidos incluyen ceras derivadas de ácidos grasos, así como cutina y suberina.

"Hexosiltransferasa" (2.4.1-) incluye enzimas que sean capaces de transferir grupos glicosilo, más específicamente grupos hexosilo. Además, para la transferencia de un grupo glicosilo de un donante que contiene grupo glicosilo a otro compuesto que contiene glicosilo, el aceptor, las enzimas también pueden transferir el grupo glicosilo a agua como un aceptor. Esta reacción también se conoce como una reacción de hidrólisis, en lugar de una reacción de transferencia. Un ejemplo de una hexosiltransferasa que se puede usar en la invención es una p-glucanosiltransferasa. Esta enzima puede ser capaz de catalizar la degradación de (1,3)(1,4)glucano y/o celulosa y/o un producto de degradación de celulosa.

"Glucuronidasa" incluye enzimas que catalizan la hidrólisis de un glucoronósido, por ejemplo p-glucuronósido, para dar un alcohol. Se han caracterizado muchas glucuronidasas y pueden ser adecuadas para el uso en la invención, por ejemplo p-glucuronidasa (EC 3.2.1.31), hialurono-glucuronidasa (EC 3.2.1.36), glucuronosil-disulfoglucosamina glucuronidasa (3.2.1.56), glicirricinato p-glucuronidasa (3.2.1.128) o a-D-glucuronidasa (EC 3.2.1.139).

Una composición de la invención puede comprender una expansina o proteína de tipo expansina, tal como una swollenina (véase Salheimo y cols., Eur. J. Biochem. 269, 4202-4211,2002) o una proteína tipo swollenina.

Las expansinas están implicadas en la pérdida de la estructura de la pared celular durante el crecimiento de la célula vegetal. Se ha propuesto que las expansinas alteran la unión por hidrógeno entre la celulosa y otros polisacáridos de la pared celular sin tener actividad hidrolítica. De este modo, se cree que permiten el deslizamiento de fibras de celulosa y el engrosamiento de la pared celular. La swollenina, una proteína de tipo expansina, contiene un dominio de la familia 1 de módulos de unión glucídicos (CBD) N-terminal y un dominio de tipo expansina C-terminal. Para los propósitos de esta invención, una proteína de tipo expansina o una proteína de tipo swollenina puede comprender uno o ambos de estos dominios y/o puede alterar la estructura de paredes celulares (tal como alterar la estructura de la celulosa), opcionalmente sin producir cantidades detectables de azúcares reductores.

Una composición de la invención puede comprender el producto polipeptídico de una proteína integradora de celulosa, un andamiaje o una proteína de tipo andamiaje, por ejemplo CipA o CipC procedentes de Clostridium thermocellum o Clostridium cellulolyticum, respectivamente.

Los andamiajes y las proteínas integradoras de celulosa son subunidades integradoras multifuncionales que pueden organizar subunidades celulolíticas en un complejo multienzimático. Esto se efectúa mediante la interacción de dos clases de dominio complementarias, es decir un dominio de cohesión sobre un andamiaje y un dominio de dockerina sobre cada unidad enzimática. La subunidad de andamiaje también soporta un módulo de unión a celulosa (CBM) que media en la ligazón del celulosoma a su sustrato. Un andamiaje o una proteína integradora de celulosa, para los propósitos de esta invención, puede comprender uno o ambos de estos dominios.

Una composición de la invención puede comprender una proteína inducida por celulosa o proteína moduladora, por ejemplo como la codificada por el gen cip1 o cip2 o genes similares procedentes de Trichoderma reesei / Hypocrea jacorina (véase Foreman y cols., J. Biol. Chem. 278(34), 31988-31997, 2003). El producto polipeptídico de estos genes son proteínas bimodulares, que contienen un módulo de unión a celulosa y un dominio cuya función o actividad no se puede relacionar con familias de glicosil hidrolasa conocidas. No obstante, la presencia de un módulo que se une a celulosa y la corregulación de la expresión de estos genes con componentes de celulasas indica actividades previamente no reconocidas con un papel potencial en la degradación de biomasa.

Una composición de la invención puede estar compuesta por un miembro de cada una de las clases de los polipéptidos mencionados anteriormente, varios miembros de una clase de polipéptido o cualquier combinación de estas clases de polipéptidos.

Una composición de la invención puede estar compuesta por polipéptidos, por ejemplo enzimas, procedentes de (1) proveedores comerciales; (2) genes clonados que expresan polipéptidos, por ejemplo enzimas; (3) caldo complejo (tal como el resultante del crecimiento de una cepa microbiana en medio, en donde las cepas secretan proteínas y enzimas en el medio); (4) lisados celulares de cepas desarrolladas como en (3); y/o (5) material vegetal que expresa polipéptidos, por ejemplo enzimas. Diferentes polipéptidos, por ejemplo enzimas, en una composición de la invención se pueden obtener de diferentes fuentes.

Uso de los polipéptidos

Los polipéptidos y las composiciones polipeptídicas según la invención se pueden usar en muchas aplicaciones diferentes. A modo de ejemplo, se pueden usar para producir azúcares fermentables. A continuación, los azúcares fermentables, como parte de un procedimiento para un biocombustible, se pueden convertir en biogás o etanol, butanol, isobutanol, 2-butanol u otras sustancias adecuadas. Alternativamente, los polipéptidos y sus composiciones se pueden usar como enzima, a modo de ejemplo en la producción de productos alimenticios, en composiciones detergentes, en la industria del papel y la pasta papelera y en formulaciones antibacterianas, en productos farmacéuticos tales como pastillas para la garganta, pastas dentífricas y colutorios. Algunos de los usos se ilustrarán con más detalle posteriormente.

En los usos y los métodos descritos posteriormente, los componentes de las composiciones descritas anteriormente se pueden proporcionar concomitantemente (es decir como una sola composición de por sí) o separadamente o secuencialmente.

La invención también se refiere al uso de la celobiohidrolasa según la invención y composiciones que comprenden esta enzima en procedimientos industriales.

A pesar de la experiencia prolongada obtenida con estos procedimientos, la celobiohidrolasa según la invención puede presentar un número de ventajas significativas sobre enzimas actualmente usadas. Dependiendo de la aplicación específica, estas ventajas pueden incluir aspectos tales como menores costes de producción, especificidad superior hacia el sustrato, antigenicidad reducida, menos actividades secundarias no deseables, rendimientos superiores cuando se produzcan en un microorganismo adecuado, intervalos de pH y temperatura más adecuados, falta de inhibición por productos hidrófobos derivados de lignina o menos inhibición de producto o, en el caso de la industria alimentaria, un mejor sabor o textura de un producto final así como calidad alimentaria y aspectos relacionados con la ley judía.

En principio, una celobiohidrolasa o una composición de la invención se puede usar en cualquier procedimiento que requiera el tratamiento de un material que comprende polisacárido. Así, un polipéptido o una composición de la invención se puede usar en el tratamiento de material polisacárico. En la presente, material polisacárico es un material que comprende o consiste esencialmente en uno o, más típicamente, más de un polisacárido.

Típicamente, las plantas y el material derivado de las mismas comprenden cantidades significativas de material polisacárico no amiláceo. Según esto, un polipéptido de la invención se puede usar en el tratamiento de un material vegetal o fúngico o un material derivado del mismo.

Lignocelulosa

Un componente importante del material polisacárico no amiláceo vegetal es la lignocelulosa (también denominada en la presente biomasa lignocelulolítica). La lignocelulosa es material vegetal que comprende celulosa y hemicelulosa y lignina. Los polímeros glucídicos (celulosa y hemicelulosas) están estrechamente unidos a la lignina mediante uniones por hidrógeno y covalentes. Según esto, un polipéptido de la invención se puede usar en el tratamiento de material lignocelulolítico. En la presente, material lignocelulolítico es un material que comprende o consiste esencialmente en lignocelulosa. Así, en un método de la invención para el tratamiento de un polisacárido no amiláceo, el polisacárido no amiláceo puede ser un material lignocelulósico/una biomasa.

Según esto, la invención proporciona un método para tratar un sustrato que comprende polisacárido no amiláceo en el que el tratamiento comprende la degradación y/o la hidrolisis y/o la modificación de celulosa y/o hemicelulosa y/o una sustancia péctica.

Degradación, en este contexto, indica que el tratamiento da como resultado la generación de productos de hidrólisis de celulosa y/o hemicelulosa y/o una sustancia péctica, es decir sacáridos de longitud más corta están presentes como resultado del tratamiento que los que están presentes en un polisacárido no amiláceo no tratado similar. Así, la degradación en este contexto puede dar como resultado le emisión de oligosacáridos y/o monómeros sacáricos.

Todas las plantas contienen polisacárido no amiláceo como virtualmente todos los materiales polisacáricos derivados de plantas. Según esto, en un método de la invención para el tratamiento de un sustrato que comprende un polisacárido no amiláceo, dicho sustrato se puede proporcionar en la forma de una planta o un material derivado de planta o un material que comprende una planta o un material derivado de planta, por ejemplo una pasta papelera vegetal, un extracto vegetal, un producto alimenticio o un ingrediente, por lo tanto, una tela, un producto textil o una prenda de vestir.

Biomasa lignocelulolítica para el uso en la invención incluye biomasa y puede incluir biomasa virgen y/o biomasa no virgen tal como biomasa agrícola, materiales orgánicos comerciales, residuos de construcción y demolición, residuos sólidos municipales, papel residual y residuos de jardín. Formas comunes de biomasa incluyen árboles, arbustos y hierbas, trigo, paja de trigo, bagazo de caña de azúcar, maíz, cáscaras de maíz, mazorcas de maíz, granos de maíz incluyendo fibra procedente de granos, productos y subproductos de molienda de cereales tales como maíz, trigo y cebada (incluyendo molienda en húmedo y molienda en seco) a menudo llamados "salvado o fibra" así como residuos sólidos municipales, papel residual y residuos de jardines. La biomasa también puede ser, pero no se limita a, material herbáceo, residuos agrícolas, residuos forestales, residuos sólidos municipales, papel residual y residuos de pasta papelera y molienda de papel. "Biomasa agrícola" incluye ramas, matorrales, cañas, maíz y cáscaras de maíz, cultivos energéticos, bosques, frutos, flores, cereales, hierbas, cultivos herbáceos, hojas, corteza, agujas, leños, raíces, plántulas, cultivos leñosos de rotación corta, arbustos, pastos varilla, árboles, hortalizas, cáscaras de fruta, vides, pulpa de remolacha azucarera, moyuelo de trigo, cáscaras de avena y maderas duras y blandas (sin incluir maderas con materiales nocivos). Además, la biomasa agrícola incluye materiales residuales orgánicos generados de procedimientos agrícolas incluyendo actividades agrícolas y forestales, incluyendo específicamente residuos madereros forestales. La biomasa agrícola puede ser cualquiera de las susodichas individualmente o en cualquiera de sus combinaciones o mezclas. Ejemplos adicionales de biomasa adecuada son preparación de huertos, chaparrales, residuo de molienda, residuos madereros urbanos, residuos municipales, residuos de explotación forestal, aclarados forestales, cultivos leñosos de rotación corta, residuos industriales, paja de trigo, paja de avena, paja de arroz, paja de cebada, paja de centeno, paja de lino, cáscaras de soja, cáscaras de arroz, paja de arroz, alimentación de gluten de maíz, cáscaras de avena, caña de azúcar, rastrojo de maíz, tallos de maíz, mazorcas de maíz, cáscaras de maíz, hierba de pradera, zacate maicero, cola de zorra; pulpa de remolacha azucarera, pulpa de cítricos, cáscaras de semillas, residuos animales celulósicos, cortes de césped, algodón, algas marinas, árboles, arbustos, hierbas, trigo, paja de trigo, bagazo de caña de azúcar, maíz, cáscaras de maíz, mazorcas de maíz, grano de maíz, fibra de granos, productos y subproductos procedentes de molienda en húmedo o en seco de cereales, residuos sólidos municipales, papel residual, residuos de jardines, material herbáceo, residuos agrícolas, residuos forestales, residuos sólidos municipales, papel residual, pasta papelera, residuos de molienda de papel, ramas, matorrales, cañas, maíz, cáscaras de maíz, un cultivo energético, bosques, una fruta, una flor, un cereal, una hierba, un cultivo herbáceo, una hoja, corteza, una aguja, un leño, una raíz, una plántula, un arbusto, pasto varilla, un árbol, una hortaliza, piel de fruta, una vid, pulpa de remolacha azucarera, moyuelo de trigo, cáscaras de avena, madera dura o blanda, material residual orgánico generado a partir de un procedimiento agrícola, residuos madereros forestales, o una combinación de cualesquiera dos o más de los mismos.

Aparte de biomasa virgen o materias primas ya procesadas en las industrias de alimentos y piensos o del papel y la reducción a pasta papelera, la biomasa/materia prima se puede pretratar adicionalmente con calor, modificación mecánica y/o química o cualquier combinación de estos métodos a fin de potenciar la degradación enzimática.

Pretratamiento

Antes del tratamiento enzimático, la materia prima se puede pretratar opcionalmente con calor, modificación mecánica y/o química o cualquier combinación de estos métodos a fin de potenciar la accesibilidad del sustrato a la hidrólisis enzimática y/o hidrolizar la hemicelulosa y/o solubilizar la hemicelulosa y/o la celulosa y/o la lignina, de cualquier modo conocido en la especialidad. El pretratamiento puede comprender exponer el material lignocelulósico a agua (caliente), vapor de agua (explosión de vapor de agua), un ácido, una base, un disolvente, calor, un peróxido, ozono, desfibración mecánica, trituración, molienda o despresurización rápida, o una combinación de cualesquiera dos o más de los mismos. Este pretratamiento químico a menudo se combina con pretratamiento térmico, p. ej. entre 150-220°C durante de 1 a 30 minutos.

Presacarificación

Después de la etapa de pretratamiento, se puede utilizar una etapa de licuefacción/hidrólisis o presacarificación que implica la incubación con una enzima o mezcla de enzimas. La etapa de presacarificación se puede realizar a muchas temperaturas diferentes pero se prefiere que la etapa de presacarificación se produzca a la temperatura más adecuada para la mezcla de enzimas que se prueba, o el óptimo de enzima predicho de las enzimas que se van a probar. La temperatura de la etapa de presacarificación puede variar de aproximadamente 10°C a aproximadamente 95°C, aproximadamente 20°C a aproximadamente 85°C, aproximadamente 30°C a aproximadamente 70°C, aproximadamente 40°C a aproximadamente 60°C, aproximadamente 37°C a aproximadamente 50°C, preferiblemente de aproximadamente 37°C a aproximadamente 80°C, más preferiblemente aproximadamente 60-70°C, aún más preferiblemente alrededor de 65°C. El pH de la mezcla de presacarificación puede variar de aproximadamente 2,0 a aproximadamente 10,0, pero preferiblemente es de aproximadamente 3,0 a aproximadamente 7,0, más preferiblemente de aproximadamente 4,0 a aproximadamente 6,0, aún más preferiblemente de aproximadamente 4,0 a aproximadamente 5,0. De nuevo, el pH se puede ajustar para maximizar la actividad enzimática y se puede ajustar con la adición de la enzima. La comparación de los resultados del ensayo procedentes de esta prueba permitirá modificar el método para adaptarse mejor a las enzimas que se prueban.

La reacción de la etapa de licuefacción/hidrólisis o presacarificación se puede producir de varios minutos a varias horas, tal como de aproximadamente 1 hora a aproximadamente 120 horas, preferiblemente de aproximadamente 2 horas a aproximadamente 48 horas, más preferiblemente de aproximadamente 2 a aproximadamente 24 horas, lo más preferiblemente durante de aproximadamente 2 a aproximadamente 6 horas. El tratamiento de celulasa se puede producir de varios minutos a varias horas, tal como de aproximadamente 6 horas a aproximadamente 120 horas, preferiblemente de aproximadamente 12 horas a aproximadamente 72 horas, más preferiblemente aproximadamente de 24 a 48 horas.

Sacarificación

La invención proporciona un método para producir un azúcar a partir de un material lignocelulósico, método que comprende poner en contacto un polipéptido de la invención para una composición de la invención con el material lignocelulósico.

Este método permite que se generen azúcares libres (monómeros) y/u oligosacáridos a partir de biomasa lignocelulósica. Estos métodos implican convertir biomasa lignocelulósica en azúcares libres y oligosacáridos pequeños con un polipéptido o una composición de la invención.

El procedimiento de convertir un carbohidrato complejo tal como lignocelulosa en azúcares permite preferiblemente la conversión en azúcares fermentables. Este procedimiento se puede denominar "sacarificación". Según esto, un método de la invención puede dar como resultado la emisión de uno o más azúcares de hexosa y/o pentosa, tales como uno o más de glucosa, xilosa, arabinosa, galactosa, ácido galacturónico, ácido glucurónico, manosa, ramnosa, ribosa y fructosa.

Según esto, otro aspecto de la invención incluye métodos que utilizan el polipéptido de la composición de la invención descrito anteriormente junto con enzimas adicionales o tratamientos físicos tales como temperatura y pH para convertir la biomasa vegetal lignocelulósica en azúcares y oligosacáridos.

Aunque la composición se ha analizado como una sola mezcla, se sabe que las enzimas se pueden añadir secuencialmente cuando la temperatura, el pH y otras condiciones se puedan alterar para incrementar la actividad de cada enzima individual. Alternativamente, se pueden determinar un pH y una temperatura óptimos para la mezcla de enzimas.

Las enzimas se hacen reaccionar con sustrato bajo cualesquiera condiciones apropiadas. Por ejemplo, las enzimas se pueden incubar a aproximadamente 25°C, aproximadamente 30°C, aproximadamente 35°C, aproximadamente 37°C, aproximadamente 40°C, aproximadamente 45°C, aproximadamente 50°C, aproximadamente 55°C, aproximadamente 60°C, aproximadamente 65°C, aproximadamente 70°C, aproximadamente 75°C, aproximadamente 80°C, aproximadamente 85°C, aproximadamente 90°C o más. Esto es, se pueden incubar a una temperatura de aproximadamente 20°C a aproximadamente 95°C, por ejemplo en tampones de fuerza iónica baja a media y/o de pH bajo a neutro. Por "fuerza iónica media" se entiende que el tampón tiene una concentración iónica de aproximadamente 200 milimolar (mM) o menos para cualquier componente iónico individual. El pH puede variar de aproximadamente pH 2,5, aproximadamente pH 3,0, aproximadamente pH 3,5, aproximadamente pH 4,0, aproximadamente pH 4,5, aproximadamente pH 5, aproximadamente pH 5,5, aproximadamente pH 6, aproximadamente pH 6,5, aproximadamente pH 7, aproximadamente pH 7,5, aproximadamente pH 8,0, a aproximadamente pH 8,5. Generalmente, el intervalo de pH será de aproximadamente pH 3,0 a aproximadamente pH 7. Para la producción de etanol, se prefiere un medio ácido, p. ej. pH=4, mientras que para la producción de biogás es deseable pH neutro, p. ej. pH=7. La incubación de combinaciones de enzimas bajo estas condiciones da como resultado la liberación o la emisión de cantidades sustanciales del azúcar desde la lignocelulosa. Por cantidad sustancial se entiende al menos 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o más de azúcar disponible.

Los polipéptidos, tales como enzimas, se pueden producir exógenamente en microorganismos, levaduras, hongos, bacterias o plantas, y a continuación aislarse y añadirse, por ejemplo, a materia prima lignocelulósica. Alternativamente, las enzimas se producen, pero no se aíslan, y caldo de fermentación de masa celular cruda o material vegetal (tal como rastrojo de maíz) y similares se pueden añadir a, por ejemplo, la materia prima. Alternativamente, la masa celular cruda o el medio de producción de enzimas o el material vegetal se puede tratar para prevenir un crecimiento microbiano adicional (por ejemplo, mediante calentamiento o adición de agentes antimicrobianos) y a continuación añadir a, por ejemplo, una materia prima. Estas mezclas de enzimas brutas pueden incluir el organismo que produce la enzima. Alternativamente, la enzima se puede producir en una fermentación que usa materia prima (tal como rastrojo de maíz) para proporcionar nutrición a un organismo que produce una enzima o enzimas. De este modo, plantas que producen las enzimas pueden servir ellas mismas como una materia prima lignocelulósica y se pueden añadir a materia prima lignocelulósica.

Fermentación de azúcares

Los azúcares fermentables se pueden convertir en productos de fermentación útiles con valor añadido, ejemplos no limitativos de los cuales incluyen aminoácidos, vitaminas, productos farmacéuticos, complementos para piensos, productos químicos especializados, materias primas químicas, plásticos, disolventes, combustibles, u otros polímeros orgánicos, ácido láctico y etanol, incluyendo etanol combustible. En particular, los azúcares se pueden usar como materias primas para fermentación en productos químicos, plásticos, tales como, a modo de ejemplo, ácido succínico, y (bio)combustibles, incluyendo etanol, metanol, butanol, combustibles líquidos sintéticos y biogás.

A modo de ejemplo, en el método de la invención, una enzima o combinación de enzimas actúa sobre un sustrato lignocelulósico o biomasa vegetal, sirviendo como la materia prima, a fin de convertir este sustrato complejo en azúcares simples y oligosacáridos para la producción de etanol u otros productos de fermentación útiles.

Los azúcares liberados de biomasa se pueden convertir en productos de fermentación útiles tales como uno de los que incluyen, pero no se limitan a, aminoácidos, vitaminas, productos farmacéuticos, complementos para piensos, productos químicos especializados, materias primas químicas, plásticos y etanol, incluyendo etanol combustible

Según esto, la invención proporciona un método para la preparación de un producto de fermentación, método que comprende:

a. degradar lignocelulosa usando un método según se describe en la presente; y

b. fermentación del material resultante,

para preparar de ese modo un producto de fermentación.

La fermentación se puede llevar a cabo bajo condiciones aeróbicas o anaeróbicas. Preferiblemente, el procedimiento se lleva a cabo bajo condiciones microaerófilas o de oxígeno limitado.

Un procedimiento de fermentación anaeróbica se define en la presente como un procedimiento de fermentación realizado en ausencia de oxígeno o en el que sustancialmente no se consume oxígeno, preferiblemente aproximadamente 5 o menos, aproximadamente 2,5 o menos o aproximadamente 1 mmol/l/h o menos, y en donde moléculas orgánicas sirven tanto como donantes de electrones como aceptores de electrones.

Un procedimiento de fermentación con oxígeno limitado es un procedimiento en el que el consumo de oxígeno está limitado por la transferencia de oxígeno del gas al líquido. El grado de limitación de oxígeno está determinado por la cantidad y la composición del flujo de gas entrante así como las propiedades de mezcladura/transferencia de masa reales del equipo de fermentación usado. Preferiblemente, en un procedimiento bajo condiciones de oxígeno limitado, la velocidad de consumo de oxígeno es al menos aproximadamente 5,5, más preferiblemente al menos aproximadamente 6 y aún más preferiblemente al menos aproximadamente 7 mmol/l/h.

Un método para la preparación de un producto de fermentación puede comprender opcionalmente la recuperación del producto de fermentación.

SSF

La fermentación y la sacarificación también se pueden ejecutar en un modo de sacarificación y fermentación simultáneas (SSF). Una de las ventajas de este modo es la reducción de la inhibición del azúcar durante la hidrólisis enzimática (la inhibición de azúcar sobre celulasas es descrita por Caminal B&B Vol XXVII Pp 1282-1290).

Productos de fermentación

Productos de fermentación que se pueden producir según la invención incluyen aminoácidos, vitaminas, productos farmacéuticos, complementos para piensos, productos químicos especializados, materias primas químicas, plásticos, disolventes, combustibles, u otros polímeros orgánicos, ácido láctico, y etanol, incluyendo etanol combustible (entendiéndose que el término "etanol" incluye alcohol etílico o mezclas de alcohol etílico y agua).

Productos de valor añadido específicos que se pueden producir mediante los métodos de la invención incluyen, pero no se limitan a, biocombustibles (incluyendo etanol y butanol y un biogás); ácido láctico; un plástico; un producto químico especializado; un ácido orgánico, incluyendo ácido cítrico, ácido succínico, ácido fumárico, ácido itacónico y ácido maleico; ácido 3-hidroxipropiónico, ácido acrílico; ácido acético; 1,3-propanodiol; etileno, glicerol; un disolvente; un complemento para piensos; un producto farmacéutico, tal como un antibiótico de p-lactama o una cefalosporina; vitaminas; un aminoácido, tal como lisina, metionina, triptófano, treonina y ácido aspártico; una enzima industrial, tal como una proteasa, una celulasa, una amilasa, una glucanasa, una lactasa, una lipasa, una liasa, una oxidorreductasa, una transferasa o una xilanasa; y una materia prima química.

Biogás

La invención también proporciona el uso de un polipéptido o una composición según se describen en la presente en un método para la preparación de biogás. Biogás se refiere típicamente a un gas producido por la descomposición biológica de materia orgánica, por ejemplo material que contiene carbohidratos no amiláceos, en ausencia de oxígeno. El biogás se origina a partir de material biogénico y es un tipo de biocombustible. Un tipo de biogás se produce mediante digestión o fermentación anaeróbica de materiales biodegradables tales como biomasa, estiércol o aguas residuales, residuos municipales y cultivos energéticos. Este tipo de biogás está comprendido principalmente por metano y dióxido de carbono. El metano gaseoso se puede quemar u oxidar con oxígeno. El aire contiene 21% de oxígeno. Esta liberación de energía permite que el biogás se use como un combustible. El biogás se puede usar como un combustible de bajo coste en cualquier país para cualquier propósito de calentamiento, tal como cocinar. También se puede utilizar en instalaciones modernas de tratamiento de residuos en las que se puede usar para poner en marcha cualquier tipo de motor calentador, para generar energía bien mecánica o bien eléctrica.

La primera etapa en la producción de biogás microbiano consiste en la degradación enzimática de polímeros y sustratos complejos (por ejemplo carbohidrato no amiláceo). Según esto, la invención proporciona un método para la preparación de un biogás en el que un sustrato que comprende carbohidrato no amiláceo se pone en contacto con un polipéptido o una composición de la invención, para dar de ese modo material fermentable que puede ser convertido en un biogás por un organismo tal como un microorganismo. En este método, un polipéptido de la invención se puede proporcionar por medio de un organismo, por ejemplo un microorganismo que exprese este polipéptido.

Uso de enzimas en productos alimenticios

Los polipéptidos y las composiciones de la invención se pueden usar en un método de procesamiento de material vegetal para degradar o modificar la celulosa o hemicelulosa o constituyentes de sustancias pécticas de las paredes celulares del material vegetal o fúngico. Estos métodos pueden ser útiles en la preparación de un producto alimenticio. Según esto, la invención proporciona un método para preparar un producto alimenticio, método que comprende incorporar un polipéptido o una composición de la invención durante la preparación del producto alimenticio.

La invención también proporciona un método de procesamiento de un material vegetal, método que comprende poner en contacto el material vegetal con un polipéptido o una composición de la invención para degradar o modificar la celulosa del material (vegetal). Preferiblemente, el material vegetal es una pulpa vegetal o un extracto vegetal, tal como jugos.

La presente invención también proporciona un método para reducir la viscosidad, la transparencia y/o la capacidad de filtración de un extracto vegetal, método que comprende poner en contacto en extracto vegetal con un polipéptido o una composición de la invención en una cantidad eficaz en la degradación de celulosa o hemicelulosa o sustancias pécticas contenidas en el extracto vegetal.

Materiales vegetales y que contienen celulosa/hemicelulosa/sustancia péctica incluyen pulpa vegetal, partes de plantas y extractos de plantas. En el contexto de esta invención, un extracto procedente de un material vegetal es cualquier sustancia que se pueda derivar de material vegetal mediante extracción (mecánica y/o química), procesamiento o mediante otras técnicas de separación. El extracto puede ser jugo, néctar, base o concentrados elaborados de los mismos. El material vegetal puede comprender o derivarse de hortalizas, p. ej., zanahorias, apio, cebollas, legumbres o plantas leguminosas (soja, haba de soja, guisantes) o fruta, p. ej., pomos o frutas de semilla (manzanas, peras, membrillo, etc.), uvas, tomates, cítricos (naranja, limón, lima, mandarina), melones, ciruelas, cerezas, grosellas negras, grosellas rojas, frambuesas, fresas, arándanos, piña y otras frutas tropicales, árboles y sus partes (p. ej. polen, procedente de pinos), o cereales (avena, cebada, trigo, maíz, arroz). El material (que se va a hidrolizar) también pueden ser residuos agrícolas, tales como pulpa de remolacha azucarera, mazorcas de maíz, paja de trigo, cáscaras de nuez (trituradas), o materiales reciclables, p. ej. papel (residual).

Los polipéptidos de la invención se pueden usar así para tratar material vegetal incluyendo pulpa vegetal y extractos vegetales. También se pueden usar para tratar productos alimenticios líquidos o sólidos o ingredientes comestibles de productos alimenticios, o usar en la extracción de café, aceites vegetales, almidón o como un espesante en alimentos.

Típicamente, los polipéptidos de la invención se usan como una composición/preparación enzimática según se describe anteriormente. La composición se añadirá generalmente a pulpa vegetal obtenible, por ejemplo, mediante procesamiento mecánico tal como trituración o molienda de material vegetal. La incubación de la composición con la planta típicamente se llevará a cabo durante un tiempo de 10 minutos a 5 horas, tal como de 30 minutos a 2 horas, preferiblemente durante aproximadamente 1 hora. La temperatura de procesamiento es preferiblemente de aproximadamente 10°C a aproximadamente 55°C, p. ej. de aproximadamente 15°C a aproximadamente 25°C, óptimamente aproximadamente 20°C, y se pueden usar de aproximadamente 10 g a aproximadamente 300 g, preferiblemente de aproximadamente 30 g a aproximadamente 70 g, óptimamente aproximadamente 50 g de enzima por tonelada de material que se va a tratar.

La totalidad de la enzima o las enzimas o sus composiciones usada se puede añadir secuencialmente o al mismo tiempo a la pulpa vegetal. Dependiendo de la composición de la preparación enzimática, el material vegetal se puede macerar (p. ej. hasta un puré) o licuar en primer lugar. Usando los polipéptidos de la invención, se pueden mejorar parámetros de procesamiento tales como el rendimiento de la extracción, la viscosidad del extracto y/o la calidad del extracto.

Alternativamente, o además de lo anterior, un polipéptido de la invención se puede añadir al jugo en bruto obtenido a partir del prensado o licuado de la pulpa vegetal. El tratamiento del jugo en bruto se puede llevar a cabo de un modo similar a la pulpa vegetal con respecto a la dosificación, la temperatura y el tiempo de espera. De nuevo, se pueden incluir otras enzimas tales como las analizadas previamente. Condiciones de incubación típicas son como las descritas en el párrafo previo.

Una vez que el jugo en bruto se ha incubado con los polipéptidos de la invención, a continuación, el jugo se centrifuga o (ultra)filtra para producir el producto final.

Después del tratamiento con el polipéptido de la invención, el producto (final) se puede tratar térmicamente, p. ej. a aproximadamente 100°C, durante un tiempo de aproximadamente 1 minuto a aproximadamente 1 hora, bajo condiciones que inactiven parcialmente o totalmente el polipéptido o los polipéptidos de la invención.

Una composición que contiene un polipéptido de la invención también se puede usar durante la preparación de purés de frutas u hortalizas.

El polipéptido de la invención también se puede usar en fabricación de cerveza, elaboración de vino, destilación o la panificación. Por lo tanto, se puede usar en la preparación de bebidas alcohólicas tales como vino y cerveza. Por ejemplo, puede mejorar la capacidad de filtración o la transparencia, por ejemplo de cervezas, mosto (p. ej. que contiene malta de cebada y/o sorgo) o vino.

Por otra parte, un polipéptido o una composición de la invención se puede usar para el tratamiento de orujo de cerveza, es decir residuos de la producción de mosto de cerveza que contienen cebada o cebada malteada y otros cereales, a fin de mejorar la utilización de los residuos para, p. ej., piensos.

La proteína puede ayudar en la retirada de sustancias orgánicas disueltas de caldo o medio de cultivo, por ejemplo cuando residuo de destilería de origen orgánico se bioconvierte en biomasa microbiana. El polipéptido de la invención puede mejorar la capacidad de filtración y/o reducir la viscosidad en jarabes de glucosa, tales como los procedentes de cereales producidos por licuefacción (p. ej. con a-amilasa).

En la panificación, el polipéptido puede mejorar la estructura de la masa, modificar su pegajosidad o flexibilidad, mejorar el volumen de la barra y/o la estructura de la miga o impartir mejores características de textura tales como calidad de rotura, desmenuzamiento o desmigado.

La presente invención se refiere así a métodos para preparar una masa o un producto alimenticio a base de cereales que comprende incorporar en la masa un polipéptido o una composición de la presente invención. Esto puede mejorar una o más propiedades de la masa o el producto alimenticio a base de cereales obtenido a partir de la masa con relación a una masa o un producto alimenticio a base de cereales en los que no se incorpore el polipéptido.

La preparación del producto alimenticio a base de cereales según la invención puede comprender además etapas conocidas en la especialidad tales como ebullición, secado, fritura, tratamiento al vapor o cocción de la masa obtenida.

Productos que se elaboran a partir de una masa que se hierve son por ejemplo tallarines hervidos, empanadillas, productos que se elaboran a partir de masa frita son por ejemplo rosquillas, buñuelos, tallarines fritos, productos que se elaboran a partir de masa al vapor son por ejemplo bollos al vapor y tallarines al vapor, ejemplos de productos elaborados a partir de masa deshidratada son pasta y tallarines deshidratados y ejemplos de productos elaborados a partir de masa cocida son pan, galletas y bizcochos.

El término "propiedad mejorada" se define en la presente como cualquier propiedad de una masa y/o un producto obtenido a partir de la masa, particularmente un producto alimenticio a base de cereales, que se mejore mediante la acción del polipéptido según la invención con relación a una masa o producto en los que no se incorpore el polipéptido según la invención. La propiedad mejorada puede incluir, pero no se limita a, resistencia incrementada de la masa, elasticidad incrementada de la masa, estabilidad incrementada de la masa, capacidad de trabajado a máquina mejorada de la masa, impermeabilización mejorada de la masa, pegajosidad reducida de la masa, extensibilidad mejorada de la masa, volumen incrementado del producto alimenticio a base de cereales, vesiculación reducida del producto alimenticio a base de cereales, estructura de la miga mejorada del producto cocido, blandura mejorada del producto alimenticio a base de cereales, aroma mejorado del producto alimenticio a base de cereales, antienranciamiento mejorado del producto alimenticio a base de cereales. Propiedades mejoradas relacionadas con productos a base de cereales de tipo pasta y tallarín son por ejemplo firmeza mejorada, pegajosidad reducida, cohesión mejorada y pérdida por cocción reducida.

La propiedad mejorada se puede determinar mediante la comparación de una masa y/o un producto alimenticio a base de cereales preparados con y sin la adición de un polipéptido de la presente invención. Las cualidades organolépticas se pueden evaluar usando procedimientos bien establecidos en la industria de fabricación de pan y pueden incluir, por ejemplo, el uso de un grupo de catadores entrenados.

El término "masa" se define en la presente como una mezcla de harina de cereal y otros ingredientes suficientemente firme para amasar o tratar con rodillo. Ejemplos de cereales son trigo, centeno, maíz, cebada, arroz, sémola, trigo sarraceno y avena. Trigo pretende abarcar ahora y posteriormente en la presente todas las especies conocidas del género Triticum, por ejemplo harinero, duro y/o espelta. Ejemplos de otros ingredientes adecuados son: la celobiohidrolasa según la presente invención, enzimas adicionales, aditivos químicos y/o adyuvantes de procesamiento. La masa puede ser fresca, congelada, preparada o precocida. La preparación de una masa a partir de los ingredientes descritos anteriormente es muy conocida en la especialidad y comprende la mezcladura de dichos ingredientes y adyuvantes de procesamiento y una o más etapas de moldeo y opcionalmente fermentación. La preparación de una masa congelada es descrita por Kulp y Lorenz en Frozen and Refrigerated Doughs and Batters.

El término "producto alimenticio a base de cereales" se define en la presente como cualquier producto preparado a partir de una masa, de carácter bien blando o bien crujiente. Ejemplos de productos alimenticios a base de cereales, ya sean de tipo blanco, claro u oscuro, que pueden ser producidos ventajosamente mediante la presente invención son pan (en particular pan blanco, integral o de centeno), típicamente en la forma de barras o rollos, pan francés de tipo baguette, pasta, tallarines, rosquillas, bagels, bizcocho, pan de pita, tortillas, tacos, bizcochos, panqueques, pasteles, galletas, tartaletas, pan al vapor y pan crujiente y similares.

El término "producto cocido" se define en la presente como cualquier producto alimenticio a base de cereales preparado al cocer la masa.

Los polisacáridos no amiláceos (NSP) pueden incrementar la viscosidad de los digestos lo que, a su vez, puede disminuir la disponibilidad de nutrientes y el rendimiento de los animales. El uso de la celobiohidrolasa de la presente invención puede mejorar la utilización de fósforo así como minerales catiónicos y proteína durante los digestos animales.

Añadir nutrientes específicos al pienso mejora la digestión de los animales y de ese modo reduce los costes del pienso. Se está usando actualmente una gran cantidad de aditivos de piensos y se desarrollan continuamente nuevos conceptos. El uso de enzimas específicas como enzimas degradadoras de carbohidratos no amiláceos podría descomponer la fibra liberando energía así como incrementando la digeribilidad de proteínas debido a la mejor accesibilidad de la proteína cuando la fibra se descompone. De este modo, el coste del pienso disminuiría así como también se podrían reducir los niveles de proteína en el pienso.

También están presentes polisacáridos no amiláceos (NSPs) virtualmente en todos los ingredientes de piensos de origen vegetal. Los NSPs son poco utilizados y, cuando están solubilizados, pueden ejercer efectos adversos sobre la digestión. Las enzimas exógenas pueden contribuir a una mejor utilización de estos NSPs y, como consecuencia, reducen cualesquiera efectos antinutricionales. Las enzimas degradadoras de carbohidratos no amiláceos de la presente invención se pueden usar con este propósito en dietas basadas en cereales para aves de corral y, en una menor extensión, para cerdos y otras especies.

Un polipéptido/enzima degradadores de carbohidratos no amiláceos de la invención (de una composición que comprende el polipéptido/la enzima de la invención) se puede usar en la industria de los detergentes, por ejemplo para la eliminación de manchas glucídicas de la ropa. Una composición detergente puede comprender un polipéptido/una enzima de la invención y, además, una o más de una celulasa, una hemicelulasa, una pectinasa, una proteasa, una lipasa, una cutinasa, una amilasa o una carbohidrasa.

Uso de enzimas en composiciones detergentes

Una composición detergente que comprende un polipéptido o una composición de la invención puede estar en cualquier forma conveniente, por ejemplo una pasta, un gel, un polvo o un líquido. Un detergente líquido puede ser acuoso, conteniendo típicamente hasta aproximadamente 70% de agua y de aproximadamente 0 a aproximadamente 30% de disolvente orgánico o material no acuoso.

Esta composición detergente se puede formular, por ejemplo, como una composición detergente para lavar la ropa a mano o a máquina que incluye una composición aditiva para la ropa para el pretratamiento de telas manchadas y una composición suavizante para ropa añadida por enjuague, o se puede formular como una composición detergente para el uso en operaciones de limpieza de superficies duras domésticas generales, o se puede formular para operaciones de lavado de platos a mano o a máquina.

En general, las propiedades de la enzima deben ser compatibles con el detergente seleccionado (por ejemplo, óptimo de pH, compatibilidad con otros ingredientes enzimáticos y/o no enzimáticos, etc.) y la enzima o las enzimas deben estar presentes en una cantidad eficaz.

Una composición detergente puede comprender un tensioactivo, por ejemplo un tensioactivo aniónico o iniónico, un mejorador del detergente o un agente complejante, uno o más polímeros, un sistema blanqueador (por ejemplo una fuente de H2O2 ) o un estabilizante de la enzima. Una composición detergente también puede comprender cualquier otro ingrediente detergente convencional tal como, por ejemplo, un acondicionador incluyendo una arcilla, un reforzador de la espuma, un supresor de las jabonaduras, un agente anticorrosivo, un agente de suspensión de la suciedad, un agente contra la redeposición de la suciedad, un colorante, un bactericida, un abrillantador óptico, un hidrótropo, un inhibidor del deslustre o un perfume.

Uso de enzimas en el procesamiento de papel y pasta papelera

Un polipéptido o una composición de la presente invención se puede usar en la industria del papel y la pasta papelera, entre otras cosas en el procedimiento de blanqueo para potenciar el brillo de pastas papeleras blanqueadas con lo que la cantidad de cloro usada en las fases de blanqueo se puede reducir, y para incrementar la frescura de las pastas papeleras en el procedimiento de reciclado de papel (Eriksson, K. E. L., Wood Science and Technology 24 (1990):79-101; Paice y cols., Biotechnol. and Bioeng. 32 (1988):235-239 y Pommier y cols., Tappi Journal (1989):187-191). Por otra parte, un polipéptido o una composición de la invención se puede usar para el tratamiento de pasta papelera lignocelulósica a fin de mejorar su capacidad de blanqueo. De ese modo, se puede reducir la cantidad de cloro necesaria para obtener un blanqueo satisfactorio de la pasta papelera.

Un polipéptido o una composición de la invención se puede usar en un método para reducir la velocidad a la que las telas que contienen celulosa se vuelven ásperas o para reducir la aspereza de las telas que contienen celulosa, comprendiendo el método tratar las telas que contienen celulosa con un polipéptido o una composición como los descritos anteriormente. La presente invención se refiere además a un método que proporciona clarificación cromática de telas que contienen celulosa, comprendiendo el método tratar telas que contienen celulosa coloreadas con un polipéptido o una composición como los descritos anteriormente, y un método para proporcionar una variación localizada en el color de telas que contienen celulosa coloreadas, comprendiendo el método tratar telas que contienen celulosa coloreadas con un polipéptido o una composición como los descritos anteriormente. Los métodos de la invención se pueden llevar a cabo al tratar telas que contienen celulosa durante el lavado. Sin embargo, si se desea, el tratamiento de las telas también se puede llevar a cabo durante la imbibición o el enjuague o simplemente al añadir el polipéptido o la composición que se describen anteriormente a agua en la que las telas están sumergidas o se van a sumergir.

Otros usos de la enzima

Además, un polipéptido o una composición de la presente invención también se puede usar en una formulación antibacteriana así como en productos farmacéuticos tales como pastillas para la garganta, pastas dentífricas y colutorios.

Los siguientes Ejemplos ilustran la invención:

EJEMPLOS

Información experimental

Cepas y composiciones enzimáticas

La cepa de Aspergillus niger se deposita en the CBS Institute bajo el número de depósito CBS 513.88.

La cepa de Rasamsonia (Talaromyces) emersonii TEC-142 se deposita en CENTRAAL BUREAU VOOR SCHIMMELCULTURES, Uppsalalaan 8, P.O. Box 85167, NL-3508 AD Utrecht, Países Bajos, el 1 de julio de 2009 teniendo el Número de Registro CBS 124902. TEC-142S es un aislado individual de TEC-142.

La cepa de Rasamsonia (Talaromyces) emersonii se depositó en CENTRAAL BUREAU VOOR SCHIMMELCULTURES, Uppsalalaan 8, P.O. Box 85167, NL-3508 AD Utrecht, Países Bajos, en diciembre de 1964 teniendo el Número de Registro CBS 393.64. Otras cepas adecuadas se pueden usar igualmente en los presentes ejemplos para mostrar el efecto y las ventajas de la invención. Por ejemplo, TEC-101, TEC-147, TEC-192, TEC-201 o TEC-210 son cepas de Rasamsonia adecuadas que se describen en el documento WO2011/000949.

La composición que contenía celulasa TEC-210 se produce según los procedimientos tales como inoculación y fermentación que se describen en el documento WO2011/000949.

La beta-glucosidasa (BG) se produce mediante sobreexpresión de EBA4 en Aspergillus niger según se describe en el documento WO2011/098577, seguido por fermentación del transformante de Aspergillus niger. EBA4 es una BG de Rasamsonia emersonii (Talaromyces emersonii) y se identifica en el documento WO2011/098577 como betaglucosidasa (BG) de T. emersonii y se representa mediante SEQ ID NO: 5 en el documento WO2011/098577.

Celluclast (Trichoderma celulasa) se obtuvo de Sigma

Técnicas de bilogía molecular

En estas cepas, usando técnicas de biología molecular conocidas por los expertos (véase: Sambrook & Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a Ed., CSHL Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001), varios genes se sobreexpresaron y otros se regularon a la baja según se describe posteriormente. Ejemplos del diseño general de vectores de expresión para la sobreexpresión génica y vectores de alteración para la regulación a la baja, la transformación, el uso de marcadores y medios selectivos se pueden encontrar en los documentos WO199846772, WO199932617, WO2001121779, WO2005095624, WO2006040312, EP635574B, WO2005100573, WO2011009700, WO2012001169 y WO2011054899. Todos los vectores de sustitución génica comprenden regiones de flanqueo de aproximadamente 1 - 2 kb de las secuencias de ORF respectivas, para orientarse para la recombinación homóloga en los locus genómicos predestinados. Además, los vectores de A. niger contienen el marcador de selección amdS bidireccional de A. nidulans para la transformación, en repeticiones directas intermedias. El método aplicado para la eliminación génica en todos los ejemplos presentes usa ADN lineal, que se integra en el genoma en el locus homólogo de las secuencias de flanqueo mediante un cruce doble, sustituyendo así el gen que se va a eliminar por el gen amdS. Después de la transformación, las repeticiones directas permiten la retirada del marcador de selección mediante un (segundo) episodio de recombinación homóloga. La retirada del marcador amdS se puede realizar al sembrar en placa sobre medio de fluoroacetamida, dando como resultado la selección de cepas libres de gen marcador. Usando esta estrategia de transformación y la contraselección posterior, que también se describe como el enfoque "LIBRE DE GEN MARCADOR" en el documento EP 0635574, el marcador amdS se puede usar indefinidamente en programas de modificación de cepas.

Medios y soluciones:

Agar de dextrosa de patata, PDA, (Fluka, N° Cat. 70139): por litro: Extracto de patata 4 g; Dextrosa 20 g; Bactoagar 15 g; pH 5,4; Esterilícese 20 min a 120°C.

Medio de agar de Rasamsonia: por litro: Fracción salina n° 315 g; Celulosa 30 g; Bactopeptona 7,5 g; Harina de cereal 15 g; KH²PO⁴5 g; CaCl².2agua 1 g; Bactoagar 20 g; pH 6,0; Esterilícese 20 min a 120°C.

Composición de la fracción salina: La "fracción salina n° 3" se ajustaba a la divulgación del documento WO98/37179, Tabla 1. Las desviaciones de la composición de esta tabla eran CaCl².2agua 1,0 g/l, KCl 1,8 g/l, ácido cítrico 1ac 0,45 g/l (agente quelante).

Medios de matraz agitador para R asam sonia

Medio para Rasamsonia 1: por litro: Glucosa 20 g; Extracto de levadura (Difco) 20 g; Clerol FBA3107 (AF) 4 gotas; pH 6.0; Esterilícese 20 min a 120°C.

Medio para Rasamsonia 2: por litro: Fracción salina n° 3 15 g; Celulosa 20 g; Bactopeptona 4 g; Harina de cereal 7,5 g; KH²PO⁴ 10 g; CaCl².2H² O 0,5 g; Clerol FBA3107 (AF) 0,4 ml; pH 5; Esterilícese 20 min a 120°C.

Medio para Rasamsonia 3: por litro: Fracción salina n° 3 15 g; glucosa 50 g; Bactopeptona 7,5 g; KH²PO⁴10 g; CaCl².2H² O 0,5 g; Clerol FBA3107 (AF) 0,4 ml; pH 5; Esterilícese 20 min a 120°C.

Preparación discontinua de esporas para R asam sonia

Las cepas se hicieron crecer a partir de soluciones madre sobre medio de agar para Rasamsonia en placas de Petri de 10 cm de diámetro durante 5-7 días a 40°C. Para fermentaciones en MTP, las cepas se hicieron crecer en placas de 96 pocillos que contenían medio de agar para Rasamsonia. Las soluciones madre de las cepas se almacenaron a -80°C en glicerol al 10%.

Aislamiento de ADN cromosómico

Las cepas se hicieron crecer en medio YGG (por litro: 8 g de KCI, 16 g de glucosa.H²O, 20 ml de extracto de levadura al 10%, 10 ml de 100xpen/estrep, 6,66 g de YNB+aminoácidos, 1,5 g de ácido cítrico y 6 g de K²HPO⁴) durante 16 horas a 42°C, 250 rpm, y el ADN cromosómico se aisló usando el DNeasy plant mini kit (Qiagen, Hilden, Alemania).

Fermentación en MTP de Rasam sonia

Se usaron placas de microvaloración (MTP) de 96 pocillos con cepas de R. emersonii esporuladas para recolectar esporas para fermentaciones en MTP. Para hacer esto, se añadieron a cada pocillo 200 gl de medio para Rasamsonia 1 diluido 10 veces y, después de resuspender la mezcla, se incubaron 100 gl de suspensión de esporas en agitadores higrométricos (Infors) para 44°C a 550 rpm y 80% de humedad durante 16 horas. Posteriormente, se usaron 50 gl del precultivo para inocular 250 gl de medio para Rasamsonia 2 en placas MTP. Las placas de 96 pocillos se incubaron en agitadores higrométricos (Infors) para 44°C a 550 rpm, y 80% de humedad durante 6 días. Las placas se centrifugaron y los sobrenadantes se recolectaron.

Protocolo de crecim iento de Rasam sonia en matraces agitadores

Las esporas se inocularon directamente en matraces agitadores de 500 ml que contenían 100 ml de medio para Rasamsonia bien 2 o bien 3 y se incubaron a 45°C a 250 rpm en un agitador incubador durante 3-4 días. Alternativamente, las esporas se inocularon en matraces agitadores de 100 ml que contenían medio para Rasamsonia 1 y se incubaron a 45°C a 250 rpm en un agitador incubador durante 1 día (precultivo) y, posteriormente, 5 o 10 ml de biomasa procedente del precultivo se transfirieron a matraces agitadores de 500 ml que contenían 100 ml de medio para Rasamsonia 2 o 3 y se hicieron crecer bajo condiciones como las descritas anteriormente.

Análisis de proteínas

Se separaron muestras de proteínas bajo condiciones reductoras sobre NuPAGE 4-12% Bis-Tris gel (Invitrogen, Breda, Países Bajos) y se tiñeron. Los geles se tiñeron bien con InstantBlue (Expedeon, Cambridge, Reino Unido), bien con SimplyBlue safestain (Invitrogen, Breda, Países Bajos) o bien con Sypro Ruby (Invitrogen, Breda, Países Bajos) según las instrucciones del fabricante.

Contenido de proteína total

El contenido de proteínas del sobrenadante recuperado se determinó según el método de Bradford. La cantidad de proteína en las muestras de enzimas se determinó con el ensayo de proteínas de Bradford, usando reactivo para proteínas de Coomassie. Se mezclaron 25 gl de muestra de enzima apropiadamente diluida con 1,2 ml de reactivo de Coomassie. Después de 10 minutos a temperatura ambiente, la absorbancia de la mezcla a 595 nm se determinó usando un espectrofotómetro (Uvikon XL). El contenido de proteína se calculó en comparación con un estándar de BSA.

Ensayo de actividad de liberación de azúcar desde materia prima de rastrojo de maíz pretratada con ácido

Para cada condición de ensayo de (hemi-)celulasa, el sobrenadante del cultivo enzimático se analizó por duplicado según el siguiente procedimiento: 5 mg de proteína/g de materia prima seca del sobrenadante del cultivo enzimático se transfirieron a un vial adecuado que contenía 800 gl de materia seca al 2,5 % (p/p) de un sustrato de rastrojo de maíz suavemente pretratado con ácido en un tampón de citrato 50 mM, se tamponaron a pH 3,5 o pH 4,5 o 5,0. Adicionalmente, como una muestra en blanco, se añadió a otro vial la misma cantidad de sobrenadante de cultivo enzimático, donde los 800 gl de materia seca al 2,5% (p/p) de un sustrato de rastrojo de maíz suavemente pretratado con ácido en un tampón de citrato 50 mM se reemplazaron por 800 gl de tampón de citrato 50 mM, tamponado a pH 4,5. Las muestras de ensayo tamponadas a pH 3,5 se incubaron a 65°C durante 72 horas. Las muestras de ensayo tamponadas a pH 5,0 se incubaron a 50°C durante 72 horas. Las muestras de ensayo tamponadas a pH 4,5 y las muestras en blanco para la corrección del contenido de azúcares monoméricos en los sobrenadantes enzimáticos se incubaron a 65°C durante 72 horas. Además, muestras de ensayo tamponadas a pH 4,5 se incubaron a 75°C durante 72 horas.

Además de las incubaciones individuales que se describen anteriormente, el sobrenadante de cultivo enzimático también se probó en combinación con dos mezclas de hemicelulasas diferentes; TEC-210 (Rasamsonia emersonii) a la que se añadía beta-glucosidasa (BG) adicional (cepa de Aspergillus n igerque expresa una BG procedente de Rasamsonia emersonii) (0,08 mg/g de materia seca) y Celluclast (Trichoderma reesei) a la que se añadía BG (Novozym-188) adicional (0,08 mg/g de materia seca). Las mezclas se añadieron hasta una concentración de 1 mg de proteína/g de materia seca de la materia prima. Estas incubaciones se realizaron en las mismas condiciones que se describen anteriormente.

Para cada procedimiento, se realizó un ensayo en el que el sobrenadante enzimático se reemplazaba por agua desmineralizada, a fin de corregir posibles azúcares monoméricos presentes en la materia prima después de la incubación.

Después de la incubación de las muestras de ensayo, se añadió a cada vial un volumen fijado de un patrón interno, ácido maleico (20 g/l), EDTA (40 g/l) y DSS (5-sulfonato de 2,2-dimetil-2-silapentano) (0,5 g/l). Después de la centrifugación, se transfirieron 650 pl del sobrenadante a un nuevo vial.

El sobrenadante de las muestras se liofiliza durante la noche, posteriormente, se añaden 50 pl de D2O al residuo secado y se liofilizan una vez más. El residuo secado se disuelve en 600 pl de D2O. Se registran espectros de 1D 1H NMR unidimensionales en un Bruker Avance III HD 400 MHz, equipado con una criosonda enfriada con N², usando un programa pulsátil sin supresión de agua a una temperatura de 17°C con un impulso de excitación de 90 grados, un tiempo de adquisición de 2,0 s y un retardo de relajación de 10 s. Las concentraciones de analito se calculan basándose en las siguientes señales (5 relativa a DSS (ácido 4,4-dimetil-4-silapentano-1-sulfónico)): 1/2 del pico de p-glucosa a 4,63 ppm (d, 0,31 H, J = 8 Hz), 1/2 del pico de p-xilosa a 4,56 ppm (d, 0,315 H, J = 8 Hz), el pico de xilooligo a 4,45 ppm (d, 1H, J=8Hz), / del anómero p del extremo reductor del pico de celobiosa a 4,66 ppm (d, 0,31 H, J=8 Hz). El usuario de señal para el pico de patrón:ácido maleico a 6,26 ppm (s, 2H)

La solución de enzima (hemi)-celulasa puede contener azúcares residuales. Por lo tanto, los resultados del ensayo se corrigen con respecto al contenido de azúcar medido después de la incubación de la solución enzimática.

Medida de la actividad como B-xilosidasa

Este ensayo mide la liberación de p-nitrofenol mediante la acción de p-xilosidasa sobre p-nitrofenil-p-D-xilopiranósido (PNPX). Una unidad de actividad como p-xilosidasa es la cantidad de enzima que libera 1 micromol de p-nitrofenol en un minuto a 60°C y pH 4,5. Se prepara tampón de acetato (0,1 M, pH 4,5) como sigue: se disuelven 8,2 g de acetato sódico anhidro en agua destilada de modo que el volumen final de la solución sea 1000 ml (Solución A). En un matraz separado, se mezclan 6,0 g (5,72 ml) de ácido acético glacial con agua destilada para formar el volumen total de 1000 ml (Solución B). El tampón de acetato 0,1 M final, pH 4,5, se prepara al mezclar la Solución A con la Solución B hasta que el pH de la solución resultante sea igual a 4,5. Se añade una gota (~ 25 pl) de Triton X-100 / l de solución tamponadora. Se usa PNPX (Sigma) como el sustrato de ensayo.

Se disuelven 100 mg de PNPX en 84 ml de tampón de acetato 0,1 M para obtener una solución madre 4,4 mM. El reactivo de parada (solución de carbonato sódico 1 M) se prepara como sigue: se disuelven 10,6 g de carbonato sódico anhidro en 50 ml de agua destilada y el volumen de la solución se ajusta hasta 100 ml. Este reactivo se usa para terminar la reacción enzimática.

Para la incubación con enzima, se mezclan 0,1 ml de solución madre de PNPX 4,4 mM con 0,1 ml de la muestra de enzima diluida apropiada y se incuban a 60°C durante 60 minutos. Después de 60 minutos de incubación, se mezclan 0,1 ml de la mezcla de reacción con 0,1 ml de solución de carbonato sódico 1 M y la absorbancia se mide a 405 nm en placas de microvaloración como A^s.

Para el blanco del sustrato, se mezclan 0,1 ml de solución madre de PNPX 4,4 mM con 0,1 ml de tampón de acetato 0,1 M, pH 4,5 y se tratan igual que las muestras: se incuban a 60°C durante 60 minutos después de lo cual se mezclan 0,1 ml de la mezcla de reacción con 0,1 ml de solución de carbonato sódico 1 M y la absorbancia a 405 nm se mide en placas de microvaloración como A^sb.

Los blancos de enzima (sin adición de sustrato) se miden para corregir el color de fondo que se origina a partir de las enzimas. Se mezclan 0,1 ml de la enzima disuelta apropiada con 0,1 ml de tampón de acetato 0,1 M, pH 4,5, y se incuban a 60°C durante 60 minutos. Después de 60 minutos de incubación, se mezclan 0,1 ml de la mezcla de reacción con 0,1 ml de solución de carbonato sódico 1 M y la absorbancia se mide a 405 nm en placas de microvaloración como A^eb.

Una curva de calibración de p-nitrofenol (diluido apropiadamente en tampón de acetato 0,1 M, pH 4,5) mezclado en una relación de 1:1 con solución de carbonato sódico 1 M se usa para cuantificar su liberación del PNPX mediante la acción de la enzima.

Después de la incubación de la enzima con sustrato, se usa la absorbancia corregida (= A^s-A^eb-A^sb), para calcular la cantidad de p-nitrofenol liberada por la enzima.

La actividad se expresa como la cantidad de enzima requerida para liberar p-nitrofenol 1 pM/min bajo las condiciones de ensayo.

Este ensayo se puede usar para probar la actividad de enzimas tales como, pero no limitadas a, enzimas GH3, GH30, GH39, GH43, GH52, y GH54.

Ensayo de actividad como B-xilosidasa 2

Este ensayo mide la liberación de xilosa mediante la acción de p-xilosidasa sobre xilobiosa.

Se preparó tampón de acetato sódico (0,05 M, pH 4,5) como sigue. Se disolvieron 4,1 g de acetato sódico anhidro o 6,8 g de acetato sódico * 3H²O en agua destilada hasta un volumen final de 1000 ml (Solución A). En un matraz separado, se mezclaron 3,0 g (2,86 ml) de ácido acético glacial con agua destilada para formar el volumen total de 1000 ml (Solución B). El tampón de acetato sódico 0,05 M final, pH 4,5, se preparó al mezclar la Solución A con la Solución B hasta que el pH de la solución resultante fuera igual a 4,5. La xilobiosa se adquirió de Sigma y se disolvió en tampón de acetato sódico pH 4,5 hasta una concentración de 100 ug/ml.

El ensayo se realizó como se detalla posteriormente.

El sobrenadante de cultivo enzimático se añadió al sustrato en una dosificación de 1 y 5 mg de proteína/g de sustrato que a continuación se incubó a 62°C durante 24 horas. La reacción se detuvo al calentar las muestras durante 10 minutos a 100°C. La liberación de xilosa se analizó mediante cromatografía de intercambio aniónico de alta resolución.

Blanco del sustrato

En lugar de sobrenadante de cultivo enzimático, la misma cantidad de tampón se añadió a la solución de sustrato que a continuación se incubó a 62°C durante 24 horas. La reacción se detuvo al calentar las muestras durante 10 minutos a 100°C. La muestra se analizó mediante cromatografía de intercambio aniónico de alta resolución. El análisis se realizó usando un sistema de HPLC Dionex equipado con una columna Dionex CarboPac PA-1 (2 mm de diámetro interno x 250 mm) en combinación con una columna de seguridad CarboPac PA (2 mm de diámetro interno x 50 mm) y un detector de PAD Dionex (Dionex Co. Sunnyvale). Se usó un caudal de 0,3 ml/min con el siguiente gradiente de acetato sódico en NaOH 0,1 M: 0-20 min, 0-180 mM. Cada elución era seguida por una etapa de lavado de 5 min acetato sódico 1000 mM en NaOH 0,1 M y una etapa de equilibración de 15 min. NaOH 0,1 M.

En el caso de que estuvieran presentes compuestos interferentes que compliquen la identificación de xilosa, el análisis se realizó mediante marcha isocrática sobre H²O durante un gradiente de 30 min (se añadió NaOH 0,5 M después de la columna en 0,1 ml/min para la detección) seguido por una etapa de lavado de 5 min acetato sódico 1000 mM en NaOH 0,1 M y una etapa de equilibración de 15 min H²O.

Se usaron patrones de xilosa y xilobiosa (Sigma) para la identificación del sustrato y el producto formado por la enzima.

Este ensayo se puede usar para probar la actividad de enzimas tales como, pero no limitadas a, enzimas GH3, GH30, GH39, GH43, GH52 y GH54.

Ensayo de actividad como B-xilosidasa 3

Se realizó el mismo ensayo que se describe anteriormente con sustratos de xilano como arabinoxilano de avena, xilano de madera de haya y xilano de madera de abedul (Sigma) en lugar de xilobiosa para medir la actividad como xilosidasa sobre sustratos poliméricos.

Las condiciones de ensayo eran las mismas con la excepción de que todos los sustratos se disolvían hasta una concentración de 2 mg/ml. La incubación se realizó a 60°C durante 24 h a una dosificación de 10 mg/g. Después de la xilosa y la xilobiosa, también se cuantificaron xilotriosa y xilotetraosa.

Medida de actividad como a-galactosidasa

Este ensayo mide la liberación de p-nitrofenol mediante la acción de a-galactosidasa sobre p-nitrofenil-a-D-galactopiranósido (PNPG). Una unidad de actividad como a-galactosidasa es la cantidad de enzima que emite 1 micromol de p-nitrofenol en un minuto a 60°C y pH 4,5. Se prepara tampón de acetato (0,1 M, pH 4,5) como sigue: se disuelven 8,2 g de acetato sódico anhidro en agua destilada de modo que el volumen final de la solución sea 1000 ml (Solución A). En un matraz separado, se mezclan 6,0 g (5,72 ml) de ácido acético glacial con agua destilada para formar el volumen total de 1000 ml (Solución B). El tampón de acetato 0,1 M final, pH 4,5, se prepara al mezclar la Solución A con la Solución B hasta que el pH de la solución resultante sea igual a 4,5. Se añade una gota (~ 25 pl) de Triton X-100 / l de solución tamponadora. Se usa PNPG (Sigma) como el sustrato de ensayo.

Se elabora una solución madre de PNPG 4,4 mM en tampón de acetato 0,1 M. El reactivo de parada (solución de carbonato sódico 1 M) se prepara como sigue: se disuelven 10,6 g de carbonato sódico anhidro en 50 ml de agua destilada y el volumen de la solución se ajusta hasta 100 ml. Este reactivo se usa para terminar la reacción enzimática.

Para la incubación con enzima, se mezclan 0,1 ml de solución madre de PNPG 4,4 mM con 0,1 ml de la muestra de enzima diluida apropiada y se incuban a 60°C durante 60 minutos. Después de 60 minutos de incubación, se mezclan 0,1 ml de la mezcla de reacción con 0,1 ml de solución de carbonato sódico 1 M y la absorbancia se mide a 405 nm en placas de microvaloración como As

Para el blanco del sustrato, se mezclan 0,1 ml de solución madre de PNPG 4,4 mM con 0,1 ml de tampón de acetato 0,1 M, pH 4,5, y se tratan igual que las muestras: se incuban a 60°C durante 60 minutos, después de lo cual se mezclan 0,1 ml de la mezcla de reacción con 0,1 ml de solución de carbonato sódico 1 M y la absorbancia a 405 nm se mide en placas de microvaloración como A^sb.

Se miden los blancos de la enzima (sin adición de sustrato) para corregir el color de fondo que se origina a partir de las enzimas. Se mezclan 0,1 ml de la muestra de enzima fluida apropiada con 0,1 ml de tampón de acetato 0,1 M, pH 4,5, y se incuban a 60°C durante 60 minutos. Después de 60 minutos de incubación, se mezclan 0,1 ml de la mezcla de reacción con 0,1 ml de solución de carbonato sódico 1 M y la absorbancia se mide a 405 nm en placas de microvaloración como A^eb.

Se usa una curva de calibración de p-nitrofenol (diluido apropiadamente en tampón de acetato 0,1 M, pH 4,5) mezclado en una relación de 1:1 con solución de carbonato sódico 1 M para cuantificar su liberación desde PNPG mediante la acción de la enzima.

Después de la incubación de enzima con sustrato, la absorbancia corregida (= A^s-A^eb-A^sb) se usa para calcular la cantidad de p-nitrofenol liberada por la enzima.

La actividad se expresa como la cantidad de enzima requerida para liberar p-nitrofenol 1 pM/min bajo las condiciones de ensayo.

Este ensayo se puede usar para probar la actividad de enzimas tales como, pero no limitadas a, enzimas GH4, GH27 y GH36.

Ensayo de actividad como xiloglucanasa 1

Se preparó tampón de acetato sódico (0,05 M, pH 4,5) como sigue. Se disolvieron 4,1 g de acetato sódico anhidro en agua destilada hasta un volumen final de 1000 ml (Solución A). En un matraz separado, se mezclaron 3,0 g (2,86 ml) de ácido acético glacial con agua destilada para formar el volumen total de 1000 ml (Solución B). El tampón de acetato sódico 0,05 M final, pH 4,5, se preparó al mezclar la Solución A con la Solución B hasta que el pH de la solución resultante fuera 4,5.

Se disolvió xiloglucano de tamarindo en tampón de acetato sódico para obtener 2,0 mg/ml. El sobrenadante de cultivo enzimático se añadió al sustrato en una dosificación de 10 mg de proteína/ g de sustrato que a continuación se incubó a 60°C durante 24 horas. La reacción se detuvo al calentar las muestras durante 10 minutos a 100°C. La liberación de oligosacáridos se analizó mediante cromatografía de intercambio aniónico de alta resolución.

Como una muestra en blanco, el sustrato se trató y se incubó del mismo modo pero entonces sin la adición de enzima.

Como una referencia, el sustrato también se incubó bajo las mismas condiciones con una preparación de celulasa comercial procedente de Trichoderma Reesei (Celluclast; Sigma) que se diluyó 50 veces, después de lo cual se añadieron a la incubación 20 pl.

El análisis se realizó usando un sistema de HPLC Dionex equipado con una columna Dionex CarboPac PA-1 (2 mm de diámetro interno x 250 mm) en combinación con una columna de seguridad CarboPac PA (2 mm de diámetro interno x 50 mm) y un detector de PAD Dionex (Dionex Co. Sunnyvale). Se usó un caudal de 0,3 ml/min con el siguiente gradiente de acetato sódico en NaOH 0,1 M: 0-40 min, 0-150 mM. Cada elución fue seguida por una etapa de lavado de 5 min acetato sódico 1000 mM en NaOH 0,1 M y una etapa de equilibración de 15 min NaOH 0,1 M.

Este ensayo se usó para probar la actividad de enzimas tales como, pero no limitadas a, enzimas GH5, GH12, GH16, GH44 y GH74.

Ensayo de actividad como xiloglucanasa 2

El siguiente ejemplo ilustra el ensayo para medir la actividad como xiloglucanasa. Esta actividad se demostró al usar xiloglucano como sustrato y un ensayo de azúcares reductores (PAHBAH) como método de detección. Los valores se compararon con un patrón, que se preparó usando una preparación de celulasa comercial procedente de Trichoderma Reesei (Celluclast; Sigma).

Reactivo A: se suspendieron 5 g de hidrazida de ácido p-hidroxibenzoico (PAHBAH) en 60 ml de agua, se añadieron 4,1 ml de ácido clorhídrico concentrado y el volumen se ajustó hasta 100 ml. Reactivo B: se disolvieron 24,9 g de citrato trisódico en 500 ml de agua. Se añadieron a esta solución 2,2 g de cloruro cálcico y 40 g de hidróxido sódico. El volumen se ajustó hasta 2 l con agua. Ambos reactivos se almacenaron a temperatura ambiente. Reactivo de trabajo: se añadieron 10 ml de Reactivo A a 40 ml de Reactivo B. Esta solución se preparó recientemente todos los días y se almacenó sobre hielo entre usos. Usando los reactivos anteriores, el ensayo se realizó según se detalla posteriormente

Junto con el xiloglucano, también se usó carboximetilcelulosa como un sustrato para determinar la especificidad de la enzima.

Después de la incubación, 10 gl de cada pocillo se mezclaron con 200 gl de reactivo de trabajo. Estas soluciones se calentaron a 70°C durante 30. Después de enfriar, las muestras se analizaron al medir la absorbancia a 405 nm. Se usó glucosa como un patrón para cuantificar extremos reductores formados como equivalentes de glucosa.

Como controles, los sustratos también se incubaron sin la adición de sobrenadante de cultivo enzimático y los sobrenadantes de cultivo enzimático se incubaron sin sustrato.

Este ensayo se puede usar para probar la actividad de enzimas tales como, pero no limitadas a, enzimas GH5, GH12, GH16, GH44 y GH74.

Ensayo de actividad como xiloglucanasa 3

Se prepara tampón de acetato sódico (0,05 M, pH 4,5) como sigue. Se disolvieron 4,1 g de acetato sódico anhidro en agua destilada hasta un volumen final de 1000 ml (Solución A). En un matraz separado, se mezclan 3,0 g (2,86 ml) de ácido acético glacial con agua destilada para formar el volumen total de 1000 ml (Solución B). El tampón de acetato sódico 0,05 M final, pH 4,5, se prepara al mezclar la Solución A con la Solución B hasta que el pH de la solución resultante sea 4,5.

Se disuelve xiloglucanano de tamarindo en tampón de acetato sódico para obtener 2,0 mg/ml. La enzima se añade al sustrato en una dosificación de 10 mg de proteína / g de sustrato que a continuación se incuba a 60°C durante 24 horas. La reacción se detiene al calentar las muestras durante 10 minutos a 100°C. La formación de oligosacáridos de peso molecular inferior se analiza mediante cromatografía de exclusión por tamaño de alta resolución.

Como una muestra en blanco, el sustrato se trata y se incuba del mismo modo pero entonces sin la adición de enzima.

Como una referencia, el sustrato también se incuba bajo las mismas condiciones con una preparación de celulasa comercial procedente de, p. ej., Aspergillus n igero Trichoderma Reesei (el patrón de celulasa a su propia temperatura óptima en caso de inactividad a 60°C).

El análisis se realiza usando cromatografía de exclusión por tamaño de alta resolución (HPSEC) realizada en tres columnas de gel de TSK (6,0 mmx15,0 cm por columna) en serie SuperAW4000, SuperAW3000, SuperAW2500; Tosoh Bioscience), en combinación con una columna de seguridad PWX (Tosoh Bioscience). La elución se realiza a 55°C con nitrato sódico 0,2 M a 0,6 ml/min. El eluido se comprobó usando un detector del índice de refracción (RI) Shodex RI-101 (Kawasaki). La calibración se realizó al usar pululanos (Associated Polymer Labs Inc., Nueva York, EE. UU. de A.) con un peso molecular en el intervalo de 0,18-788 kDa.

Este ensayo se puede usar para probar la actividad de enzimas tales como, pero no limitadas a, enzimas GH5, GH12, GH16, GH44 y GH74.

Ensayo de actividad como a-arabinofuranosidasa

El siguiente ejemplo ilustra un ensayo para medir la capacidad de a-arabinofuranosidasas para retirar los residuos de a-L-arabinofuranosilo desde residuos de xilosa sustituidos.

Para la degradación completa de arabinoxilanos hasta arabinosa y xilosa, se necesitan varias actividades enzimáticas, incluyendo endoxilanasas y arabinofuranosidasas. La molécula de arabinoxilano procedente de trigo está altamente sustituida con residuos de arabinosilo. Estos pueden estar sustituidos bien en la posición C2 o bien la C3 del residuo de xilosilo (sustitución individual), o tanto en la posición C2 como la C3 de la xilosa (sustitución doble).

Se prepararon oligosacáridos sustituidos individualmente y doblemente al incubar arabinoxilano de trigo (WAX; 10 mg/ml; Megazyme, Bray, Irlanda) en tampón de acetato 50 mM pH 4,5 con una cantidad apropiada de endoxilanasa (procedente de Aspergillus awamori, Kormelink F. y cols; Journal of Biotechnology (1993) 27: 249-265) 48 horas a 40°C para producir una cantidad suficiente de arabinoxilooligosacáridos. La reacción se detuvo al calentar las muestras a 100°C durante 10 minutos. Las muestras se centrifugaron durante 5 minutos a 10.000 x g. El sobrenadante se usó para experimentos adicionales. La degradación del arabinoxilano estaba seguida por análisis de los azúcares reductores formados y cromatografía de intercambio aniónico de alta resolución (HPAEC).

El sobrenadante de cultivo enzimático se añadió a los arabinoxilooligosacáridos sustituidos individualmente y doblemente (WAX tratado con endoxilanasa; 2 mg/ml) en una dosificación de 10 mg de proteína/g de sustrato en tampón de acetato sódico 50 mM que a continuación se incubó a 65°C durante 24 horas. La reacción se detuvo al calentar las muestras a 100°C durante 10 minutos. Las muestras se centrifugaron durante 5 minutos a 10.000 x g. La liberación de arabinosa fue seguida por análisis de HPAEC.

El análisis se realizó usando un sistema de HPLC Dionex equipado con una columna Dionex CarboPac PA-1 (2 mm de diámetro interno x 250 mm) en combinación con una columna de seguridad CarboPac PA (2 mm de diámetro interno x 50 mm) y un detector de PAD Dionex (Dionex Co. Sunnyvale). Se usó un caudal de 0,3 ml/min con el siguiente gradiente de acetato sódico en NaOH 0,1 M: 0-40 min, 0-400 mM. Cada elución fue seguida por una etapa de lavado de 5 min acetato sódico 1000 mM en NaOH 0,1 M y una etapa de equilibración de 15 min NaOH 0,1 M. La liberación de arabinosa se identificó y se cuantifico mediante un patrón (Sigma).

Este ensayo se puede usar para probar la actividad de enzimas tales como, pero no limitadas a, enzimas GH3, GH43, GH51, GH54 y GH62.

Ensayo de actividad como endoxilanasa

Las endoxilanasas son enzimas capaces de hidrolizar una unión p-1,4 en el esqueleto de xilano, produciendo xilooligosacáridos cortos. Este ensayo mide la liberación de xilosa y xilooligosacáridos mediante la acción de xilanasas sobre arabinoxilano de trigo (WAX) (Megazyme, Viscosidad media 29 cSt), arabinoxilano de avena, xilano de madera de haya y xilano de madera de abedul (Sigma).

Se preparó tampón de acetato sódico (0,05 M, pH 4,5) como sigue; se disolvieron 4,1 g de acetato sódico anhidro en agua destilada hasta un volumen final de 1000 ml (Solución A). En un matraz separado, se mezclaron 3,0 g (2,86 ml) de ácido acético glacial con agua destilada para formar el volumen total de 1000 ml (Solución B). El tampón de acetato sódico 0,05 M final, pH 4,5, se preparó al mezclar la Solución A con la Solución B hasta que el pH de la solución resultante fuera 4,5. Cada sustrato se disolvió en tampón de acetato sódico para obtener 2,0 mg/ml. El sobrenadante de cultivo enzimático se añadió al sustrato en una dosificación de 10 mg de proteína/g de sustrato que a continuación se incubó a 60°C durante 20 horas. La reacción se detuvo al calentar las muestras durante 10 minutos a 100°C. La liberación de xilosa y xilooligosacáridos se analizó mediante cromatografía de intercambio aniónico de alta resolución.

Como una muestra en blanco, el sustrato se trató y se incubó del mismo modo pero entonces sin la adición de enzima.

El análisis se realizó usando un sistema de HPLC Dionex equipado con una columna Dionex CarboPac PA-1 (2 mm de diámetro interno x 250 mm) en combinación con una columna de seguridad CarboPac PA (2 mm de diámetro interno x 50 mm) y un detector de PAD Dionex (Dionex Co. Sunnyvale). Se usó un caudal de 0,3 ml/min con el siguiente gradiente de acetato sódico en NaOH 0,1 M: 0-40 min, 0-400 mM. Cada elución fue seguida por una etapa de lavado de 5 min acetato sódico 1000 mM en NaOH 0,1 M y una etapa de equilibración de 15 min NaOH 0,1 M. Se usaron patrones de xilosa, xilobiosa y xilotriosa (Sigma) para identificar estos oligómeros liberados por la acción de la enzima.

Este ensayo se puede usar para probar la actividad de enzimas tales como, pero no limitadas a, enzimas GH5, GH8, GH10 y GH11.

Medida de la actividad como q/B-xilosidasa

Este ensayo mide la liberación de p-nitrofenol mediante la acción de a/p-xilosidasa sobre p-nitrofenil-a/p-D-xilopiranósido (PNPX). Una unidad de actividad como p-xilosidasa es la cantidad de enzima que emite 1 micromol de p-nitrofenol en un minuto a 60°C y pH 4,5. Se prepara tampón de acetato (0,1 M, pH 4,5) como sigue: se disuelven 8,2 g de acetato sódico anhidro en agua destilada de modo que el volumen final de la solución sea 1000 ml (Solución A). En un matraz separado, se mezclan 6,0 g (5,72 ml) de ácido acético glacial con agua destilada para formar el volumen total de 1000 ml (Solución B). El tampón de acetato 0,1 M final, pH 4,5, se prepara al mezclar la Solución A con la Solución B hasta que el pH de la solución resultante sea igual a 4,5. Se añade una gota (~ 25 pl) de Triton X-100/l de solución tamponadora. Se usa PNPX (Sigma) como el sustrato de ensayo.

Se disuelven 100 mg de PNPX en 84 ml de tampón de acetato 0,1 M para obtener una solución madre 4,4 mM. El reactivo de parada (solución de carbonato sódico 1 M) se prepara como sigue: se disuelven 10,6 g de carbonato sódico anhidro en 50 ml de agua destilada y el volumen de la solución se ajusta hasta 100 ml. Este reactivo se usa para terminar la reacción enzimática.

Para la incubación con enzima, se mezclan 0,1 ml de solución madre de PNPX 4,4 mM con 0,1 ml de la muestra de enzima diluida apropiada y se incuban a 60°C durante 60 minutos. Después de 60 minutos de incubación, se mezclan 0,1 ml de la mezcla de reacción con 0,1 ml de solución de carbonato sódico 1 M y la absorbancia se mide a 405 nm en placas de microvaloración como A^s.

Para el blanco del sustrato, se mezclan 0,1 ml de solución madre de PNPX 4,4 mM con 0,1 ml de tampón de acetato 0,1 M, pH 4,5 y los mismos se tratan como las muestras: se incuban a 60°C durante 60 minutos después de lo cual se mezclan 0,1 ml de la mezcla de reacción con 0,1 ml de solución de carbonato sódico 1 M y la absorbancia a 405 nm se mide en placas de microvaloración como A^sb.

Los blancos de la enzima (sin adición de sustrato) se miden para corregir el color de fondo que se origina a partir de las enzimas. Se mezclan 0,1 ml de la muestra de enzima diluida apropiada con 0,1 ml de tampón de acetato 0,1 M, pH 4,5, y se incuban a 60°C durante 60 minutos. Después de 60 minutos de incubación, se mezclan 0,1 ml de la mezcla de reacción con 0,1 ml de solución de carbonato sódico 1 M y la absorbancia se mide a 405 nm en placas de microvaloración como A^eb.

Se usa una curva de calibración de p-nitrofenol (diluido apropiadamente en tampón de acetato 0,1 M, pH 4,5) mezclado en una relación de 1:1 con solución de carbonato sódico 1 M para cuantificar su liberación desde PNPX por la acción de la enzima.

Después de la incubación de enzima con sustrato, se usa la absorbancia corregida (= A^s-A^eb-A^sb) para calcular la cantidad de p-nitrofenol liberada por la enzima.

La actividad se expresa como la cantidad de enzima requerida para liberar p-nitrofenol 1 pM/min bajo las condiciones de ensayo.

Este ensayo se puede usar para probar la actividad de enzimas tales como, pero no limitadas a, enzimas GH3, GH30, GH31, GH39, GH43, GH52 y GH54.

Medida de la actividad como a/B-manosidasa

Este ensayo mide la liberación de p-nitrofenol mediante la acción de a/p-manosidasa sobre p-nitrofenil-a/p-D-manopiranósido (PNPM). Una unidad de actividad como a/p-manosidasa es la cantidad de enzima que libera 1 micromol de p-nitrofenol en un minuto a 60°C y pH 4,5. Se prepara tampón de acetato (0,1 M, pH 4,5) como sigue: se disuelven 8,2 g de acetato sódico anhidro en agua destilada de modo que el volumen final de la solución sea 1000 ml (Solución A). En un matraz separado, se mezclan 6,0 g (5,72 ml) de ácido acético glacial con agua destilada para formar el volumen total de 1000 ml (Solución B). El tampón de acetato 0,1 M final, pH 4,5 se prepara al mezclar la Solución A con la Solución B hasta que el pH de la solución resultante sea igual a 4,5. Se añade una gota (~ 25 pl) de Triton X-100/l de solución tamponadora. Se usa PNPM (Sigma) como el sustrato de ensayo.

Se elabora una solución madre de PNPM 4,4 mM en tampón de acetato 0,1 M. El reactivo de parada (solución de carbonato sódico 1 M) se prepara como sigue: se disuelven 10,6 g de carbonato sódico anhidro en 50 ml de agua destilada y el volumen de la solución se ajusta hasta 100 ml. Este reactivo se usa para terminar la reacción enzimática.

Para la incubación con enzima, se mezclan 0,1 ml de solución madre de PNPM 4,4 mM con 0,1 ml de la muestra de enzima diluida apropiada y se incuban a 60°C durante 60 minutos. Después de 60 minutos de incubación, se mezclan 0,1 ml de la mezcla de reacción con 0,1 ml de solución de carbonato sódico 1 M y la absorbancia se mide a 405 nm en placas de microvaloración como A^s.

Para el blanco del sustrato, se mezclan 0,1 ml de solución madre de PNPM 4,4 mM con 0,1 ml de tampón de acetato 0,1 M, pH 4,5 y se tratan igual que las muestras: se incuban a 60°C durante 60 minutos después de lo cual se mezclan 0,1 ml de la mezcla de reacción con 0,1 ml de solución de carbonato sódico 1 M y la absorbancia a 405 nm se mide en placas de microvaloración como A^sb.

Se miden los blancos de enzima (sin adición de sustrato) para corregir el color de fondo que se origina a partir de las enzimas. Se mezclan 0,1 ml de la muestra de enzima diluida apropiada con 0,1 ml de tampón de acetato 0,1 M, pH 4,5, y se incubaron a 60°C durante 60 minutos. Después de 60 minutos de incubación, se mezclan 0,1 ml de la mezcla de reacción con 0,1 ml de solución de carbonato sódico 1 M y la absorbancia se mide a 405 nm en placas de microvaloración como A^eb.

Se usa una curva de calibración de p-nitrofenol (diluido apropiadamente en tampón de acetato 0,1 M, pH 4,5) mezclado en una relación de 1:1 con solución de carbonato sódico 1 M para cuantificar su liberación desde PNPM por la acción de la enzima.

Después de la incubación de enzima con sustrato, se usa la absorbancia corregida (= A^S-A^EB-A^SB) para calcular la cantidad de p-nitrofenol liberada por la enzima.

La actividad se expresa como la cantidad de enzima requerida para liberar p-nitrofenol 1 pM/min bajo las condiciones de ensayo.

Este ensayo se puede usar para probar la actividad de enzimas tales como, pero no limitadas a, enzimas GH1, GH2, GH5, GH38, GH47, GH92 y GH125.

Medida de la actividad como feruloilesterasa

Sustratos sintéticos: El cafeato de metilo, el cumarato de metilo, el sinapinato de metilo y el ferulato de metilo se obtienen de Apin Chemicals. La actividad hacia estos sustratos sintéticos se determina al incubar la enzima con el sustrato en una dosificación de aproximadamente 5 mg/g de DM a un pH de 5,0 (tampón de acetato sódico 50 mM). La reacción se realizará a 60°C durante hasta 24 h.

Al final de la incubación, las muestras se hierven durante 5 minutos para inactivar las enzimas y se centrifugan a temperatura ambiente (10 min, 10.000 x g). La liberación de ácido hidroxicinámico desde el sustrato se mide mediante análisis por RP-UHPLC-MS en modo de ionización negativo según se describe previamente (Appeldoorn y cols., 2010) en un sistema de UHPLC Accela (Thermo Scientific) equipado con una columna Hypersyl GOLD (2,1 mm x 150 mm, 1,9 pm de tamaño de partícula; Thermo Scientific). La fase móvil está compuesta por (A) H2O 1% (v/v) de acetonitrilo 0,2% (v/v) de ácido acético y (B) acetonitrilo 0,2% (v/v) de ácido acético. El caudal es 0,4 ml/min y la temperatura de la columna es 30°C. El perfil de elución es como sigue: primeros 5 min, isocrático 0% de B; 5-23 min, lineal de 0 a 50% de B; 23-24 min, lineal de 50 a 100% de B; 24-27 min, isocrático a 100% de B; 27-28 min, lineal de 100 a 0% de B, seguido por reacondicionamiento de la columna durante 7 min. Los datos espectrales se recogen de 200 a 600 nm y la cuantificación se realiza a 320 nm. Los contenidos de ácidos ferúlico, cafeico, sinápico y cumárico se identifican y se cuantifican basándose en patrones.

Se recogen datos de MS en el modo negativo con un voltaje de pulverización iónica de 3,5 kV, un voltaje capilar de -20 V y una temperatura capilar de 350°C. Se realizan barridos de MS completos dentro del intervalo m/z 150-1500, y se obtienen los datos de MS2 de los iones más intensos.

Este ensayo se puede usar para probar la actividad de enzimas tales como, pero no limitadas a, enzimas CE1.

Medida de la actividad como feruloilesterasa

Sustrato presente en la naturaleza: Oligómeros de arabinoxilano purificados a partir de fibra de maíz (CF) pretratada (1 mg/ml cada uno) (Appeldoorn y cols 2010) se incuban con esterasas de ácido ferúlico en una dosificación de aproximadamente 5 mg/g de DM a un pH de 5,0 (tampón de acetato sódico 50 mM). La reacción se realizará a 60°C durante hasta 24 h.

Al final de la incubación, las muestras se hierven durante 5 minutos para inactivar las enzimas y se centrifugan a temperatura ambiente (10 min, 10.000 x g). La liberación de ácido hidroxicinámico del sustrato se mide mediante análisis por RP-UHPLC-MS en modo de ionización negativo según se describe previamente (Appeldoorn y cols., 2010) en un sistema de UHPLC Accela (Thermo Scientific) equipado con una columna Hypersyl GOLD (2,1 mm x 150 mm, 1,9 pm de tamaño de partícula; Thermo Scientific). La fase móvil está compuesta por (A) H2O 1% (v/v) de acetonitrilo 0,2% (v/v) de ácido acético y (B) acetonitrilo 0,2% (v/v) de ácido acético. El caudal es 0,4 ml/min y la temperatura de la columna es 30°C. El perfil de elución es como sigue: primeros 5 min, isocrático 0% de B; 5-23 min, lineal de 0 a 50% de B; 23-24 min, lineal de 50 a 100% de B; 24-27 min, ¡socrático a 100% de B; 27-28 min, lineal de 100 a 0% de B, seguido por reacondicionamiento de la columna durante 7 min. Se recogen datos espectrales de 200 a 600 nm, y la cuantificación se realiza a 320 nm. Los contenidos de ácidos ferúlico y cumárico se identifican y cuantifican basándose en patrones.

Se recogen datos de MS en el modo negativo con un voltaje de pulverización iónica de 3,5 kV, un voltaje capilar de -20 V y una temperatura capilar de 350°C. Se realizaron barridos de MS completos dentro del intervalo m/z 150-1500, y se obtienen datos de MS2 de los iones más intensos.

La cantidad total de ácido ferúlico con enlaces éster en oligómeros de maíz se determinó después de hidrólisis alcalina y extracción con éter etílico usando el método de UHPLC descrito anteriormente.

Referencia: MAAIKE M. APPELDOORN y cols, J. Agric. Food Chem. 2010, 58, 11294-11301

Este ensayo se puede usar para probar la actividad de enzimas tales como, pero no limitadas a, enzimas CE1.

Ensayo de actividad como a-glucuronidasa

El siguiente ejemplo ilustra el ensayo para medir la actividad como a-glucuronidasa hacia ácidos aldourónicos (Megazyme). Este ensayo mide la liberación de xilosa y xilooligómeros por la acción de la a-glucuronidasa sobre los oligosacáridos de glucuronoxilano.

Se preparó tampón de acetato sódico (0,05 M, pH 4,5) como sigue. Se disolvieron 4,1 g de acetato sódico anhidro en agua destilada hasta un volumen final de 1000 ml (Solución A). En un matraz separado, se mezclaron 3,0 g (2,86 ml) de ácido acético glacial con agua destilada para formar el volumen total de 1000 ml (Solución B). El tampón de acetato sódico 0,05 M final, pH 4,5, se preparó al mezclar la Solución A con la Solución B hasta que el pH de la solución resultante fuera 4,5.

Para determinar la actividad sobre oligómeros pequeños, los ácidos aldourónicos se disuelven en tampón de acetato sódico para obtener 1,0 mg/ml. El sobrenadante de cultivo enzimático se añadió al sustrato en una dosificación de 1 y 10 mg de proteína/g de sustrato que a continuación se incubó a 60°C durante 24 horas. La reacción se detuvo al calentar las muestras durante 10 minutos a 100°C. La liberación de xilooligómeros como resultado de la retirada de ácido 4-O-metilglucurónico se analizó mediante cromatografía de intercambio aniónico de alta resolución

Como una muestra en blanco, el sustrato se trató y se incubó del mismo modo pero entonces sin la adición de enzima.

El análisis se realizó usando un sistema de HPLC Dionex equipado con una columna Dionex CarboPac PA-1 (2 mm de diámetro interno x 250 mm) en combinación con una columna de seguridad CarboPac PA (2 mm de diámetro interno x 50 mm) y un detector de PAD Dionex (Dionex Co. Sunnyvale). Se usó un caudal de 0,3 ml/min con el siguiente gradiente de acetato sódico en NaOH 0,1 M: 0-40 min, 0-400 mM. Cada elución fue seguida por una etapa de lavado de 5 min acetato sódico 1000 mM en NaOH 0,1 M y una etapa de equilibración de 15 min NaOH 0,1 M.

Se usaron patrones de xilosa, xilobiosa y xilotriosa (Sigma) para identificar los xilooligómeros liberados por la acción de la enzima que retira el ácido 4-O-metilglucurónico de estos oligómeros.

Este ensayo se puede usar para probar la actividad de enzimas tales como, pero no limitadas a, enzimas GH67 y GH115.

Ejemplo 1: Construcción de vectores de expresión de A. n iger

Este Ejemplo describe la construcción de un constructo de expresión para la sobreexpresión de Temer00088, Temer09484, Temer08028, Temer02362, Temer08862, Temer04790, Temer05249, Temer06848, Temer02056, Temer03124, Temer09491, Temer06400, Temer08570, Temer08163 o Temer07305 en A. niger. ADN genómico de la cepa de Rasamsonia emersonii CBS393.64 se secuenció y analizó. Se identificaba el gen con proteína traducida anotado como actividad según la Tabla 1. Secuencias del gen Temer00088, Temer09484, Temer08028, Temer02362, Temer08862, Temer04790, Temer05249, Temer06848, Temer02056, Temer03124, Temer09491, Temer06400, Temer08570, Temer08163 y Temer07305 de R. emersonii, que comprenden la secuencia de ORF optimizada para el par de codones, la secuencia proteínica, la secuencia de señalización, la secuencia genómica y la secuencia de ADNc silvestre se muestran en los listados de secuencias SEQ ID NO: 1 a 75.

Construcción de plásmidos de expresión

La secuencia que tiene SEQ ID NO: 1, 6, 11, 16, 21, 26, 31, 36, 41, 46, 51, 56, 61, 66 o 71 se clona en el vector pGBTOP (Fig. 1) usando los sitios EcoRI y PacI, que comprenden la secuencia promotora y terminadora de glucoamilasa. La parte de E.coli se retiró mediante digestión con Notl antes de la transformación de CBS 513.88 de A. niger .

Transformación de A. n igery fermentaciones en matraces agitadores

La cepa de A. niger CBS513.88 se cotransforma con los constructos de expresión y un plásmido que contiene marcador de selección apropiado (amdS o fleomicina) según el método descrito en la sección de información experimental. De cepas de A.niger recombinantes y de control se genera una gran partida de esporas al sembrar esporas o micelios en placas de PDA (agar de dextrosa de patata, Oxoid), preparadas según las instrucciones del fabricante. Después del crecimiento durante 3-7 días a 30 grados Celsius, las esporas se recogen después de añadir a las placas 0,01% de Triton X-100. Después de lavar con agua estéril, aproximadamente 10⁷ esporas de transformantes seleccionados y cepas de control se inoculan en matraces agitadores de 100 ml con pantallas que contienen 20 ml de medio de precultivo líquido que consiste en, por litro: 30 g de maltosa.H²O; 5 g de extracto de levadura; 10 g de caseína hidrolizada; 1 g de KH²PO⁴ ; 0,5 g de MgSO⁴.7H² O; 0,03 g de ZnCb; 0,02 g de CaCh; 0,01 g de MnSO⁴.4H² O; 0,3 g de FeSO⁴.7H² O; 3 g de Tween 80; 10 ml de penicilina (5000 IU/ml)/estreptomicina (5000 UG/ml); pH 5,5. Estos cultivos se desarrollaron a 34 grados Celsius durante 16-24 horas. Se inocularon 10 ml de este cultivo a matraces agitadores de 500 ml con pantallas que contienen 100 ml de medio de fermentación que consiste en, por litro: 70 g de glucosa.H²O; 25 g de caseína hidrolizada; 12,5 g de extracto de levadura; 1 g de KH²PO⁴ ; 2 g de K²SO⁴ ; 0,5 g de MgSO⁴.7H² O; 0,03 g de ZnCL; 0,02 g de CaCL; 0,01 g de MnSO⁴.4H² O; 0,3 g de FeSO⁴.7H² O; 10 ml de penicilina (5000 IU/ml)/estreptomicina (5000 UG/ml); ajustados hasta pH 5,6. Estos cultivos se desarrollan a 34 grados Celsius hasta que toda la glucosa se agotaba (habitualmente después de 4-7 días). Las muestras tomadas del caldo de fermentación se centrifugan (10 min a 5000 x g) en una centrífuga de cubetas basculantes y los sobrenadantes se recogieron y se filtraron sobre un filtro de 0,2 gm (Nalgene)

Los sobrenadantes se analizaron con respecto a la expresión de Temer00088, Temer09484, Temer08028, Temer02362, Temer08862, Temer04790, Temer05249, Temer06848, Temer02056, Temer03124, Temer09491, Temer06400, Temer08570, Temer08163 y Temer07305 mediante SDS-PAGE y medidas de proteínas totales.

Ejemplo 2: Construcción de vectores de expresión de R. em ersonii.

Este Ejemplo describe la construcción de un constructo de expresión para la sobreexpresión de Temer00088, Temer09484, Temer08028, Temer02362, Temer08862, Temer04790, Temer05249, Temer06848, Temer02056, Temer03124, Temer09491, Temer06400, Temer08570, Temer08163 o Temer07305 en R. emersonii. El casete de expresión se orientaba integrado en el locus RePepA.

A fin de orientar los constructos de promotor-indicador en el locus pepA, se clonaron vectores de expresión para la orientación. El gen con proteína traducida anotado como proteasa pepA se identificó en el genoma. Secuencias de pepA de Rasamsonia emersonii (RePepA), que comprenden la secuencia genómica del ORF y aproximadamente 3000 pb de la región 5' y 2500 pb de las regiones de flanqueo 3', secuencia de ADNc y proteínica secuencia, se muestran en el listado de secuencias 76, 77 y 78, respectivamente.

Se construyeron dos vectores según procedimientos de clonación habituales para orientar al locus RePepA. Los fragmentos insertados de ambos vectores juntos se pueden aplicar en el llamado método de "orientación génica bipartito" (Nielsen y cols., 2006, 43: 54-64). Este método está usando dos fragmentos de ADN no funcionales de un marcador de selección que están solapados (véase además el documento WO2008113847 para detalles adicionales del método bipartito) junto con secuencias de orientación génica. Tras la recombinación homóloga correcta, el marcador de selección se vuelve funcional mediante la integración en un locus diana homólogo. Como también se detalla en el documento WO 2008113847, dos vectores de eliminación diferentes, Te pep.bbn y pEBA1006, se diseñaron y se construyeron para que fueran capaces de proporcionar las dos moléculas de ADN solapadas para la orientación génica bipartita. El primer vector Te pep.bbn (disposición general como en la Fig. 2) comprende una región de flanqueo 5’ de 1500 pb aproximadamente 1,5 kb aguas arriba del ORF de RePepA en el locus RePepA (ORF y aproximadamente 1500 pb del promotor de RePepA ), un sitio lox66 y la parte 5' no funcional de la región codificante ble conducida por el promotor gpdA de A.nidulans (secuencia PgpdA-ble que carece de las últimas 104 bases de la secuencia codificante en el extremo 3' de ble, SEQ ID NO: 79). Para permitir la clonación eficaz de casetes de promotor-indicador en E.coli, se insertó un gen ccdB entre la región de flanqueo RePepA 5’ y el sitio lox66. El segundo vector pEBA1006 (disposición general como en la Fig. 3) comprende la parte 3' no funcional de la región codificante ble y el terminador trpC de A.nidulans (secuencia ble-TtrpC que carece de las primeras 12 bases de la secuencia codificante en el extremo 5' de ble, SEQ ID NO: 80), un sitio lox71 y una región de flanqueo 3’ de 2500 pb del OFR de RePepA para la orientación en el locus RePepA . Tras la recombinación homóloga, los fragmentos no funcionales primero y segundo se hacen funcionales produciendo un casete de ble funcional. Las regiones de flanqueo génicas tanto aguas arriba como aguas abajo de RePepA orientan para la recombinación homóloga de los fragmentos bipartitos en el locus genómico de RePepA predestinado.

El gen ccdB en el vector Te pep.bbn se reemplaza por casetes de expresión de Temer00088, Temer09484, Temer08028, Temer02362, Temer08862, Temer04790, Temer05249, Temer06848, Temer02056, Temer03124, Temer09491, Temer06400, Temer08570, Temer08163 o Temer07305 según procedimientos de clonación habituales. El promotor 2 de R. emersonii, representado por SEQ ID NO: 81, se clona aguas arriba de la región codificante de Temer00088, Temer09484, Temer08028, Temer02362, Temer08862, Temer04790, Temer05249, Temer06848, Temer02056, Temer03124, Temer09491, Temer06400, Temer08570, Temer08163 o Temer07305 de R. emersonii con el terminador amdS de A. nidulans, generando el constructo pEBA. La secuencia terminadora amdS de A. nidulans está representada por SEQ ID NO: 82. Una representación esquemática de pEBA para la sobreexpresión del gen de interés (g O i) que es Temer00088, Temer09484, Temer08028, Temer02362, Temer08862, Temer04790, Temer05249, Temer06848, Temer02056, Temer03124, Temer09491, Temer06400, Temer08570, Temer08163 o Temer07305 se muestra en la Figura 4.

Ejemplo 3: Sobreexpresión del gen Temer00088, Temer09484, Temer08028, Temer02362, Temer08862, Temer04790, Temer05249, Temer06848, Temer02056, Temer03124, Temer09491, Temer06400, Temer08570, Temer08163 o Temer07305 en Rasamsonia em ersonii

ADN lineales de pEBA y pEBA1006 se aíslan y se usan para transformar Rasamsonia emersonii usando un método como el descrito previamente en el documento WO2011/054899. Los ADNs lineales se pueden integrar conjuntamente en el genoma en el locus RePepA , sustituyendo así el gen RePepA por el gen Temer00088, Temer09484, Temer08028, Temer02362, Temer08862, Temer04790, Temer05249, Temer06848, Temer02056, Temer03124, Temer09491, Temer06400, Temer08570, Temer08163 o Temer07305 y ble. Los transformantes se seleccionan en medio de fleomicina y las colonias se purifican y se prueban según procedimientos como los descritos en el documento WO2011/054899. Las colonias crecientes se diagnostican mediante PCR con respecto a la integración en el locus RePepA usando un cebador en el promotor gpdA del casete de eliminación y un cebador dirigido contra la secuencia genómica directamente aguas arriba de la región de orientación 5'. Se obtienen posibles transformantes en los que RePepA se reemplaza por casetes de Temer00088, Temer09484, Temer08028, Temer02362, Temer08862, Temer04790, Temer05249, Temer06848, Temer02056, Temer03124, Temer09491, Temer06400, Temer08570, Temer08163 o Temer07305/b/e.

Ejemplo 4: actividad enzimática en cepas de Rasamsonia em ersonii que sobreexpresan Temer00088, Temer09484, Temer08028, Temer02362, Temer08862, Temer04790, Temer05249, Temer06848, Temer02056, Temer03124, Temer09491, Temer06400, Temer08570, Temer08163 o Temer07305

Cepas que sobreexpresan Temer00088, Temer09484, Temer08028, Temer02362, Temer08862, Temer04790, Temer05249, Temer06848, Temer02056, Temer03124, Temer09491, Temer06400, Temer08570, Temer08163 o Temer07305 se fermentan en un matraz agitador en medio para Rasamsonia 3 y los sobrenadantes se analizan con respecto a la actividad según la Tabla 1 en un ensayo adecuado. Se observa un incremento en la actividad en sobrenadantes de cepas que sobreexpresan Temer00088, Temer09484, Temer08028, Temer02362, Temer08862, Temer04790, Temer05249, Temer06848, Temer02056, Temer03124, Temer09491, Temer06400, Temer08570, Temer08163 o Temer07305 en comparación con la cepa silvestre, indicando que la sobreexpresión de Temer00088, Temer09484, Temer08028, Temer02362, Temer08862, Temer04790, Temer05249, Temer06848, Temer02056, Temer03124, Temer09491, Temer06400, Temer08570, Temer08163 o Temer07305 mejora la actividad en R. emersonii.

Ejemplo 5: Fermentación en matraz agitador de A sperg illus n iger

Aproximadamente 10⁷ esporas de transformantes seleccionados y cepas de control se inocularon en matraces agitadores de 100 ml con pantallas que contenían 20 ml de medio de precultivo líquido que consistía en, por litro: 30 g de maltosa.H²O; 5 g de extracto de levadura; 10 g de caseína hidrolizada; 1 g de KH² PO⁴; 0,5 g de MgSO⁴.7H² O; 0,03 g de ZnCb; 0,02 g de CaCb; 0,01 g de MnSO⁴.4H²O; 0,3 g de FeSO⁴.7H² O; 3 g de Tween 80; 10 ml de penicilina (5000 IU/ml)/estreptomicina (5000 UG/ml); pH 5,5. Estos cultivos se desarrollaron a 34 grados Celsius durante 16-24 horas. Se inocularon 10 ml de este cultivo en matraces agitadores de 500 ml con pantallas que contenían 100 ml de medio de fermentación que consistía en, por litro: 70 g de glucosa.H²O; 25 g de caseína hidrolizada; 12,5 g de extracto de levadura; 1 g de KH² PO⁴ ; 2 g de K²SO⁴ ; 0,5 g de MgSO⁴.7H² O; 0,03 g de ZnCl² ; 0,02 g de CaCl² ; 0,01 g de MnSO⁴.4H² O; 0,3 g de FeSO⁴.7H² O; 10 ml de penicilina (5000 IU/ml)/estreptomicina (5000 UG/ml); ajustados hasta pH 5,6. Estos cultivos se desarrollaron a 34 grados Celsius hasta que se agotaba toda la glucosa (habitualmente después de 4-7 días). Muestras tomadas del caldo de fermentación se centrifugaron (10 min at 5000 x g) en una centrífuga de cubetas basculantes y los sobrenadantes se recogieron y se filtraron sobre un filtro de 0,2 gm (Nalgene) Determinación de la concentración en matraces agitadores y la concentración de proteína con el método de TCA-biuret

A fin de obtener mayores cantidades de material para una prueba adicional, los sobrenadantes de fermentación obtenidos como se describe anteriormente (volumen entre 75 y 100 ml) se concentraron usando un filtro giratorio de 10 kDa hasta un volumen de aproximadamente 5 ml. Posteriormente, se determinó la concentración de proteína en el sobrenadante concentrado a través de un método de TCA-biuret.

Muestras de proteína concentradas (sobrenadantes) se diluyeron con agua hasta una concentración entre 2 y 8 mg/ml. Se realizaron diluciones de albúmina sérica bovina (BSA) (0, 1,2, 5, 8 y 10 mg/ml) y se incluían como muestras para generar una curva de calibración. De cada muestra de proteína diluida, 270 gl se transfirieron a un tubo de 10 ml que contenía 830 gl de una solución de ácido tricloroacético al 12% (p/v) en acetona y se mezclaron a fondo. Posteriormente, los tubos se incubaron sobre agua de hielo durante una hora y se centrifugaron durante 30 minutos, a 4°C y 6000 rpm. El sobrenadante se descartó y las pellas se secaron al invertir los tubos sobre un tejido y dejarlas reposar durante 30 minutos a temperatura ambiente. Posteriormente, se añadieron a la pella del tubo 3 ml de mezcla de reactivos de biuret BioQuant y la pella se solubilizó tras la mezcladura seguido por la adición de 1 ml de agua. El tubo se mezcló a fondo y se incubó a temperatura ambiente durante 30 minutos. La absorción de la mezcla se midió a 546 nm con una muestra de agua usada como una medida del blanco y la concentración de proteína se calculó a través de la línea de calibración de BSA.

Ejemplo 6: Identificación de la actividad como beta-xilosidasa de Temer09484 de Rasamsonia em ersonii termófila sobre xilobiosa

La actividad como beta-xilosidasa de Temer09484 de Rasamsonia emersonii se analizó según se describe anteriormente. El sobrenadante de fermentación en matraz agitador de Temer09484 A. n igerse concentró y se ensayó en dos dosificaciones con respecto a la liberación de xilosa desde xilobiosa después de la incubación durante 24 horas a pH 4,5 y 62°C. La enzima mostraba una liberación de xilosa significativa desde xilobiosa según se muestra en la Tabla 3. Esta muestra que Temer09484 tiene actividad como beta-xilosidasa.

Tabla 3: Efecto de Temer09484 de Rasamsonia emersonii sobre la liberación de xilosa desde xilobiosa (100 ug/ml) después de 24 h de incubación a pH 4,5 y 62°C.

Ejemplo 7: Identificación de la actividad como beta-xilosidasa de Temer09484 de Rasamsonia em ersonii term ófila sobre sustratos de xilano poliméricos

Como un segundo experimento, también se analizó la actividad como beta-xilosidasa de Temer09484 de Rasamsonia emersonii sobre sustratos de xilano poliméricos. El sobrenadante del matraz de Temer09484 A. niger se dosificó en 10 mg/g a tres sustratos de xilano poliméricos diferentes. Se liberaba xilosa desde los tres sustratos (Tabla 4) mientras que no se formaban xilooligómeros. Esta muestra que Temer09484 también tiene actividad como beta-xilosidasa sobre sustratos poliméricos junto con oligómeros pequeños según se muestra en el Ejemplo 6.

Tabla 4: Efecto de Temer09484 de Rasamsonia emersonii sobre la liberación de xilosa desde varios sustratos de xilano después de la incubación durante 24 h a pH 4,5 y 60°C con una dosificación 10 mg/g de DM.

* Todos los sustratos contienen < 3,0 ug/ml de xilosa cuando no se añadía enzima

Ejemplo 8. Mejora de dos mezclas de celulosa diferentes mediante la adición de Temer09484 para la h idrólisis de materias primas lignocelulósicas

El sobrenadante de la fermentación en matraz agitador de Temer09484 A. n igerse concentró y se agregó una materia prima de rastrojo de maíz pretratada con ácido suave según se describe anteriormente. La enzima mostraba una liberación de xilosa significativa desde esta materia prima en un amplio intervalo de temperaturas (50, 65 y 75°C) y valores de pH (3,5 - 4,5 - 5,0) usados durante las 72 horas de incubación según se muestra en la Tabla 5. Esta muestra que Temer09484 es importante para la hidrólisis de materias primas lignocelulósicas.

Tabla 5: Efecto de Temer 09484 de Rasamsonia emersonii sobre la liberación de xilosa (g/l) desde materia prima de rastrojo de maíz pretratada suavemente con ácido después de 72 h de incubación en diferentes condiciones de temperatura/pH.

El sobrenadante de la fermentación en matraz agitador de Temer09484 A. niger también se probó en combinación con 2 mezclas de celulosas diferentes: TEC-210 y Celluclast, ambas con BG adicional añadida. La liberación de xilosa desde rastrojo de maíz pretratado suavemente con ácido se mejoraba para ambas mezclas de celulosas mediante la adición de Temer09484 en un amplio intervalo de temperaturas (50, 65 y 75°C) y valores de pH (3,5 - 4,5 - 5,0) usado durante las 72 horas de incubación según se muestra en la Tabla 6. Esta muestra que Temer09484 se puede usar para mejorar mezclas de celulosas en un amplio intervalo de temperaturas y valores de pH usados para la hidrólisis de materias primas lignocelulósicas.

Tabla 6: Efecto de Temer09484 de Rasamsonia emersonii cuando se han agregado dos mezclas de celulosas diferentes sobre la liberación de xilosa (g/l) desde materia prima de rastrojo de maíz pretratada suavemente con ácido después de 72 h de incubación a diferentes condiciones de temperatura/pH.

Ejemplo 9: Identificación de la actividad como beta-xilosidasa de Temer00088 de R asam sonia em ersonii termófila sobre xilobiosa

La actividad como beta-xilosidasa de Temer00088 de Rasamsonia emersonii se analizó según se describe anteriormente. El sobrenadante de la fermentación en matraz agitador de Temer00088 A. niger se concentró y se ensayó en dos dosificaciones para la liberación de xilosa desde xilobiosa después de la incubación durante 24 horas a pH 4,5 y 62°C. La enzima mostraba una liberación de xilosa significativa desde xilobiosa según se muestra en la Tabla 7. Esta muestra que Temer00088 tiene actividad como beta-xilosidasa.

Tabla 7: Efecto de Temer00088 de Rasamsonia emersonii sobre la liberación de xilosa desde xilobiosa (100 ug/ml) después de 24 h de incubación a pH 4,5 y 62°C.

Ejemplo 10: Identificación de actividad como beta-xilosidasa de Temer00088 de Rasamsonia emersonii termófila sobre sustratos de xilano poliméricos

Como un segundo experimento, también se analizó la actividad como beta-xilosidasa de Temer00088 de Rasamsonia emersonii sobre sustratos de xilano poliméricos. El sobrenadante del matraz agitador de Temer00088 A. niger se dosificó en 10 mg/g a los tres sustratos de xilano poliméricos diferentes. Se liberaba xilosa de los tres sustratos (Tabla 8) mientras que no se formaban xilooligómeros. Esta muestra que Temer00088 también tiene actividad como betaxilosidasa sobre sustratos poliméricos junto con oligómeros pequeños según se muestra en el Ejemplo 9.

Tabla 8: Efecto de Temer 00088 de Rasamsonia emersonii sobre la liberación de xilosa desde varios sustratos de xilano después de la incubación durante 20 h a pH 4,5 y 60°C con una dosificación de 10 mg/g de DM.

* Todos los sustratos contienen < 3,0 ug/ml de xilosa cuando no se añadía enzima

Ejemplo 11. Mejora de dos mezclas de celulosa diferentes mediante la adición de Temer00088 para la h idrólisis de materias primas lignocelulósicas

El sobrenadante de la fermentación en matraz agitador de Temer00088 A. niger se concentró y se agregó una materia prima de rastrojo de ácido pretratada con ácido suave según se describe anteriormente. La enzima mostraba una liberación de xilosa significativa desde esta materia prima en un amplio intervalo de temperaturas (50, 65 y 75°C) y valores de pH (3,5 - 4,5 - 5,0) usado durante las 72 horas de incubación según se muestra en la Tabla 3. Esta muestra que Temer00088 es importante para la hidrólisis de materias primas lignocelulósicas.

Tabla 9: Efecto de Temer00088 de Rasamsonia emersonii sobre la liberación de xilosa (g/l) desde materia prima de rastrojo de maíz pretratada suavemente con ácido después de 72 h de incubación a diferentes condiciones de temperatura/pH.

El sobrenadante de la fermentación en matraz agitador de Temer00088 A. niger también se probó en combinación con 2 mezclas de celulosas diferentes: TEC-210 y Celluclast, ambas con BG adicional añadida. La liberación de xilosa desde rastrojo de maíz pretratado suavemente con ácido se mejoraba para ambas mezclas de celulosas mediante la adición de Temer00088 en un amplio intervalo de temperaturas (50, 65 y 75°C) y valores de pH (3,5 - 4,5 - 5,0) usados durante las 72 horas de incubación según se muestra en la Tabla 10. Esta muestra que Temer00088 se puede usar para mejorar las mezclas de celulosas en un amplio intervalo de temperaturas y valores de pH usados para la hidrólisis de materias primas lignocelulósicas.

Tabla 10 Efecto de Temer00088 de Rasamsonia emersonii cuando se agrega a dos mezclas de celulosas diferentes durante la liberación de xilosa (g/l) desde materia prima de rastrojo de maíz pretratada suavemente con ácido después de 72 h de incubación a diferentes condiciones de temperatura/pH.

Ejemplo 12: Identificación de endoglucanasa específica de xiloglucano de Rasamsonia emersonii termófila

La actividad como xiloglucanasa de Temer04790 de Rasamsonia emersonii se analizó según se describe anteriormente. El sobrenadante de la fermentación en matraz agitador de Temer04790 A. n igerse concentró, se añadió al sustrato xiloglucano y se incubó durante 24 horas a pH 4,5 y 60°C. La enzima era capaz de liberar varios oligómeros según se muestra en la Figura 6. Esta muestra que Temer04790 es activo sobre xiloglucano y libera oligómeros similares como la mezcla de celulasas comercial Celluclast de Trichoderma reesei.

Para cuantificar la cantidad de oligómeros, se midieron los extremos reductores formados después de la incubación tanto de Temer04790 como de la mezcla de celulasas. También se usó carboximetilcelulosa como sustrato para determinar la especificidad de las enzimas y una temperatura superior, 75°C, después de 60°C. Temer04790 es específico hacia xiloglucano ya que apenas se observó actividad sobre CMC en contraste con la mezcla de celulasas (Tabla 11). Por otra parte, Temer04790 todavía era activo a 75°C mientras que la mezcla de celulasas era casi inactiva sobre xiloglucano a 75°C.

Tabla 11: Efecto de Temer04790 de Rasamsonia emersonii sobre la hidrólisis de xiloglucano (tamarindo) y carboximetilcelulosa (CMC) (Sigma) medido mediante la formación de extremos reductores expresados como equivalentes de glucosa (ug/ml) después de una incubación de 24 h a pH 4,5 a 60°C y 75°C .

* Celluclast procedente de Thrichoderma reesei (Sigma)

Ejemplo 13: Identificación de actividad como arabinofuranosidasa de Rasam sonia em ersonii termófila

La actividad como arabinofuranosidasa de Temer05249 de Rasamsonia emersonii se analizó según se describe anteriormente. El sobrenadante de la fermentación en matraz agitador de Temer05249 A. niger se concentró y se añadió a arabinoxilooligómeros en 10 mg/g seguido por incubación durante 24 horas a pH 4,5 y 65°C. La enzima mostraba una liberación de arabinosa significativa desde arabinoxilooligómeros según se muestra en la Tabla 12. Esta muestra que Temer05249 tiene actividad como arabinofuranosidasa.

Tabla 12: Efecto de Temer05249 de Rasamsonia emersonii sobre la liberación de arabinosa desde arabinoxilano de trigo, que se preincubaba con una endoxilanasa, después de la incubación durante 24 h a pH 4,5 y 65°C en una dosificación de 10 mg/g de DM.

Ejemplo 14: Identificación de actividad como endoxilanasa de Rasam sonia em erson ii termófila

La actividad como endoxilanasa de Temer03124 de Rasamsonia emersonii se analizó como se describe anteriormente. El sobrenadante de la fermentación en matraz agitador de Temer03124 A . niger se concentró y se añadió a varios sustratos de xilano en 10 mg/g seguido por incubación durante 20 horas a pH 4,5 y 60°C. La enzima mostraba una liberación significativa de xilosa y una gama de xilooligómeros según se muestra en la Tabla 13. Esta muestra que Temer03124 tiene actividad como endoxilanasa.

Tabla 13: Efecto de Temer03124 de Rasamsonia emersonii sobre la liberación de xilosa y oligómeros de xilosa desde varios sustratos de xilano después de la incubación durante 20 h a pH 4,5 y 60°C en una dosificación de 10 mg/g de DM.

* Todos los sustratos contienen < 3,5 ug/ml de cada producto medido si no se añade enzima

Ejemplo 15: Identificación de actividad como endoxilanasa de Rasam sonia em e rso n ii termófila

La actividad como endoxilanasa de Temer08570 de Rasamsonia emersonii se analizó según se describe anteriormente. El sobrenadante de la fermentación en matraz agitador de Temer08570 A. niger se concentró y se añadió a varios sustratos de xilano en 10 mg/g seguido por incubación durante 20 horas a pH 4,5 y 60°C. La enzima mostraba una liberación significativa de xilosa y una gama de xilooligómeros según se muestra en la Tabla 14. Esta muestra que Temer08570 tiene endo-xilanasa con xilobiosa, xilotriosa y xilotetraosa como productos.

Tabla 14: Efecto de Temer08570 de Rasamsonia emersonii sobre la liberación de xilosa y oligómeros de xilosa desde varios sustratos de xilano después de la incubación durante 20 h a pH 4,5 y 60°C en una dosificación de 10 mg/g de DM.

* Todos los sustratos contienen < 3,5 ug/ml de cada producto medido si no se añade enzima

Ejemplo 16: Identificación de actividad como endoxilanasa de Rasam sonia em erson ii termófila

La actividad como endoxilanasa de Temer08163 de Rasamsonia emersonii se analizó según se describe anteriormente. El sobrenadante de la fermentación en matraz agitador de Temer08163 A. niger se concentró y se añadió a varios sustratos de xilano en 10 mg/g seguido por incubación durante 20 horas a pH 4,5 y 60°C. La enzima mostraba una liberación significativa de xilobiosa y xilosa según se muestra en la Tabla 15. Esta muestra que Temer08570 tiene actividad como endoxilanasa con xilobiosa como producto principal que era 12 - 25 veces superior que la cantidad de xilosa liberada.

Tabla 15: Efecto de Temer08163 de Rasamsonia emersonii sobre la liberación de xilosa y oligómeros de xilosa desde varios sustratos de xilano después de la incubación durante 20 h a pH 4,5 y 60°C en una dosificación de 10 mg/g de DM.

* Todos los sustratos contienen < 3,5 ug/ml de cada producto medido.

Claims (14)

REIVINDICACIONES

1. Un polipéptido que tiene actividad como hemicelulasa que comprende la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO: 32 o una secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia nucleotídica de SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 34 o uno de sus polipéptidos variantes o polinucleótidos variantes, en donde el polipéptido variante tiene al menos 75% de identidad de secuencia con la secuencia indicada en SEQ ID NO: 32, o el polinucleótido variante codifica un polipéptido que tiene al menos 75% de identidad de secuencia con la secuencia indicada en SEQ ID NO: 32.

2. Un polipéptido según la reivindicación 1, que tiene actividad como alfa-arabinofuranosidasa.

3. Una secuencia de ácido nucleico aislada que codifica una hemicelulasa, en donde la secuencia de ácido nucleico se selecciona del grupo que consiste en:

(a) una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos 70% de identidad con la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 34 o SEQ ID NO: 35;

(b) una secuencia de ácido nucleico que codifica (i) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 32, (ii) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 75% de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 32, o (iii) una secuencia de aminoácidos que difiere en 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 aminoácidos con respecto a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 32; o

(c) una secuencia de ácido nucleico que es el complemento inverso de una secuencia de ácido nucleico como la definida en (a) o (b).

4. Un constructo o vector de ácido nucleico que comprende la secuencia de ácido nucleico según la reivindicación 3.

5. Una célula recombinante que comprende un polipéptido según la reivindicación 1 o 2, una secuencia de ácido nucleico según la reivindicación 3 o una construcción o vector de ácido nucleico según la reivindicación 4, preferiblemente la célula es una célula fúngica, preferiblemente una célula fúngica seleccionada del grupo que consiste en los géneros Acremonium, Agaricus, Aspergillus, Aureobasidium, Chrysosporium, Coprinus, Cryptococcus, Filibasidium, Fusarium, Humicola, Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Piromyces, Panerochaete, Pleurotus, Schizophyllum, Talaromyces, Rasamsonia, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium y Trichoderma.

6. Una célula según la reivindicación 5, en la que uno o más genes se eliminan, inactivan o alteran totalmente o en parte, en donde opcionalmente el gen codifica una proteasa.

7. Un método para la preparación de un polipéptido según la reivindicación 1 o 2, que tiene actividad como hemicelulasa, método que comprende cultivar una célula según la reivindicación 5 o 6 bajo condiciones que permitan la expresión de dicho polipéptido y, opcionalmente, recuperar el polipéptido expresado.

8. Una composición que comprende: (i) un polipéptido según la reivindicación 1 o 2 y; (ii) una celulasa y/o una hemicelulasa adicional y/o una pectinasa.

9. Una composición según la reivindicación 8, en donde la celulasa es una GH61, celobiohidrolasa I, celobiohidrolasa II, endo-p-1,4-glucanasa, p-glucosidasa o p-(1,3)(1,4)-glucanasa y/o en donde la hemicelulasa adicional es una endoxilanasa, p-xilosidasa, a-L-arabinofuranosidasa, a-D-glucuronidasa, feruloilesterasa, cumaroilesterasa, agalactosidasa, p-galactosidasa, p-mananasa o p-manosidasa.

10. Una composición según la reivindicación 8 o 9, en donde la composición es un caldo de fermentación de masa celular cruda.

11. Un método para el tratamiento de un sustrato que comprende hemicelulosa, opcionalmente un material vegetal, método que comprende poner en contacto el sustrato con un polipéptido según la reivindicación 1 o 2 y/o una composición según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10.

12. Un método según la reivindicación 11, en donde antes del tratamiento enzimático el sustrato se pretrata con calor, modificación mecánica y/o química o cualquier combinación de estos métodos.

13. Un método para producir un producto de fermentación, método que comprende producir un azúcar fermentable al poner en contacto material lignocelulósico con un polipéptido según la reivindicación 1 o 2 y/o una composición según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, y fermentar el azúcar fermentable resultante para producir de ese modo el producto de fermentación.

14. Uso de un polipéptido según la reivindicación 1 o 2 y/o una composición según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, para producir azúcar a partir de un material lignocelulósico.