BR112012033404B1 - célula recombinante, método para a preparação de um polipeptídeo, composição, método para o tratamento de um substrato que compreende material de carboidrato e uso de um polipeptídeo - Google Patents

Abstract

POLIPEPTÍDEO TENDO OU AUXILIANDO A ATIVIDADE DE DEGRADAÇÃO DE MATERIAL DE CARBOIDRATOS E USOS DOS MESMOS. A invenção refere-se a um polipeptídeo que compreende a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 2 ou uma sequência de aminoácidos codificada pela sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 1, ou um polinucleotídeo variante de polipeptídeo ou uma sua variante, em que o polipeptídeo variante tem identidade de sequência de pelo menos 76% com a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 2 ou o polinucleotídeo codifica para um polipeptídeo variante que tem pelo menos 76% de identidade de sequência com a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 2. A invenção apresenta a sequência de codificação de comprimento completo do gene novo, bem como a sequência de aminoácidos de comprimento total dos equivalentes funcionais de polipeptídeos e funcionais do gene ou da sequência de aminoácidos. A invenção também se refere a métodos para a utilização de polipetídeo em processos industriais. Também estão incluídos na presente invenção são as células transformada com um polinucleotídeo de acordo com a invenção, adequado para a produção destas proteínas.

Description

Declaração de Pesquisa e Desenvolvimento Patrocinados pelo Governo Federal

[0001] Esta invenção foi feita com o apoio do Governo dos Estados Unidos sob a concessão n°. DE-FC36-08G018079, emitida pelo Departamento de Energia. O Governo Governo dos Estados Unidos pode ter certos direitos na presente invenção.

Campo da invenção

[0002] A invenção refere-se a sequências que compreendem genes que codificam polipeptídeos que têm ou auxiliam na atividade de degradação de material de carboidratos. A invenção apresenta a sequência de codificação de comprimento completo do novo gene, bem como a sequência de aminoácidos da proteína funcional de comprimento completo, e as variantes e fragmentos do gene ou da sequência de aminoácidos. A invenção também se refere a métodos para o uso dessas proteínas em processos industriais. Também estão incluídas na presente invenção as células transformadas com um polinucleotídeo de acordo com a invenção, adequadas para a produção destas proteínas. Além disso, a invenção relaciona- se com a expressão bem sucedida de genes que codificam os polipeptídeos tendo atividade de degradação de material de carboidrato em um hospedeiro. O hospedeiro pode ser qualquer hospedeiro adequado, por exemplo, Aspergillus, por exemplo, Aspergillus niger ou Talaromyces, por exemplo, Talaromyces emersonii.

Antecedentes da invenção

[0003] Os carboidratos constituem os compostos orgânicos mais abundantes na Terra. No entanto, grande parte deste carboidrato é sequestrada em polímeros complexos, incluindo amido (o principal carboidrato de armazenamento em sementes e grãos), e uma coleção de carboidratos e lignina conhecidos como lignocelulose. Os componentes principais de carboidratos de lignocelulose são a celulose, hemicelulose, e pectinas. Estes polímeros complexos são muitas vezes referidos coletivamente como lignocelulose.

[0004] A bioconversão de biomassa lignocelulósica renovável para um açúcar fermentável que é posteriormente fermentado para produzir o álcool (por exemplo, etanol), como uma alternativa para os combustíveis líquidos tem atraído uma atenção intensa de investigadores desde 1970, quando a crise do petróleo eclodiu, pela diminuição da produção de petróleo pela OPEC. O etanol tem sido amplamente utilizado como uma mistura de 10% para gasolina nos EUA ou como um combustível limpo para veículos no Brasil nas últimas duas décadas. Mais recentemente, o uso de E85, uma mistura de etanol a 85%, foi aplicado especialmente para aplicações municipais limpas. A importância da produção de bioetanol combustível vai aumentar em paralelo com o aumento dos preços do petróleo e o esgotamento gradual de suas fontes. Além disso, os açúcares fermentáveis são utilizados para produzir polímeros plásticos, e outros produtos de base biológica e esta indústria deve crescer substancialmente, por conseguinte, aumentando a demanda para açúcares fermentáveis de baixo custo abundantes que podem ser usados como um material de alimentação, em vez de matérias-primas à base de petróleo.

[0005] O sequestro de tais grandes quantidades de carboidratos na biomassa vegetal fornece uma fonte abundante de energia potencial sob a forma de açúcares, tanto açúcares com cinco carbonos quanto com seis carbonos que podem ser utilizados para numerosos processos industriais e agrícolas. No entanto, o enorme potencial energético destes carboidratos é atualmente subutilizado, pois os açúcares são trancados em polímeros complexos e, portanto, não são de fácil acesso para a fermentação. Os métodos que geram açúcares a partir de biomassa vegetal podem fornecer matérias-primas economicamente competitivas, abundantes, para fermentação em produtos químicos, plásticos, tais como, por exemplo, ácido succínico e (bio)combustíveis, incluindo etanol, metanol, butanol combustíveis líquidos sintéticos e biogás.

[0006] Independentemente do tipo de matéria-prima celulósica, o custo e a eficiência de enzimas hidrolíticas são fatores principais que limitam a comercialização dos processos de bioconversão da biomassa. Os custos de produção de enzimas produzidas microbianamente estão firmemente relacionados com a produtividade da cepa produtora de enzima e o rendimento da atividade final no caldo de fermentação.

[0007] Apesar da pesquisa contínua das últimas décadas para compreender a degradação da biomassa lignocelulósica enzimática e a produção de celulase, continua sendo desejável identificar ou construir novas celulases e hemicelulases altamente ativas. Seria também altamente desejável construir composições de enzimas altamente eficientes, capazes de realizar a biodegradação rápida e eficiente de materiais lignocelulósicos, em particular, celulases e hemicelulases que aumentaram termoestabilidade.

[0008] Tais enzimas podem ser utilizadas para a produção de açúcares para a fermentação em produtos químicos, plásticos, tais como, por exemplo, ácido succínico e (bio) combustíveis, incluindo etanol, metanol, butanol, combustíveis líquidos sintéticos e produção de biogás, para ensilagem, e também como enzima industrial em outros processos, por exemplo, nas indústrias de alimentação humana ou animal, têxteis, de polpa de papel ou papel ou indústrias de detergentes e outras indústrias.

Sumário da invenção

[0009] A presente invenção fornece polinucleotídeos que codificam polipeptídeos que têm a capacidade de degradar (ou seja, auxiliam na degradação de), um carboidrato (por exemplo, polissacarídeos), em lignocelulose, em particular. Os polinucleotídeos da presente invenção tipicamente codificam um polipeptídeo ou auxiliam na atividade de degradação de carboidratos.

[0010] A invenção fornece também naturalmente e por via recombinante os polipeptídeos produzidos com tal atividade, bem como linhagens de células recombinantes que produzem tais enzimas. Além disso, os métodos de fabricação e uso dos polinucleotídeos e polipeptídeos da presente invenção são fornecidos.

[0011] De acordo com a invenção, é fornecido um polipeptídeo que compreende a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 2 ou uma sequência de aminoácidos codificada pela sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 1, ou um polinucleotídeo variante ou polipeptídeo variante dos mesmos, em que o polipeptídeo variante tem pelo menos 76% de identidade de sequência com a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 2 ou o polinucleotídeo variante codifica um polipeptídeo que tem pelo menos 76% de identidade de sequência com a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 2.

[0012] Os polipeptídeos de acordo com a invenção têm propriedades vantajosas, em particular, a propriedade de ter ou auxiliar na atividade de degradação de material de carboidrato. Em uma modalidade, o polipeptídeo de acordo com a invenção tem atividade de oxidohidrolase. Em uma modalidade, o polipeptídeo tem atividade de GH61.

[0013] Em uma modalidade o polipeptídeo variante tem um resíduo His27 (posicionado como em SEQ ID NO: 2). É aqui assumido que a His27 desempenha um papel na ligação de íons metálicos (Ni2+ e Mg2+ e, potencialmente, outros cátions. Em uma modalidade o polipeptídeo variante tem pelo menos 76% de identidade de sequência com a sequência estabelecida em SEQ ID NO: 2, um resíduo catalítico His27 e oxidohidrolase e/ou atividade de GH61.

[0014] Além disso, os polipeptídeos possuem uma termoestabilidade elevada. Os polipeptídeos, de acordo com a invenção, mantêm uma elevada atividade relativa (% de atividade inicial) como função do tempo de incubação (h), por exemplo, 2 horas, 3 horas, 4 horas, cinco horas, seis horas, oito horas, nove horas, 10 horas ou mais, 20 h ou mais, 30 h ou mais, em especial a temperaturas elevadas, por exemplo, a 60°C ou mais, a 65°C ou mais, ou a 70°C ou mais, por exemplo, 8 horas a 65°C ou 72 horas a 60°C.

[0015] A invenção também fornece um polinucleotídeo que compreende: (a) a sequência de nucleotídeos estabelecida na SEQ ID NO: 1, ou (b) uma sequência de nucleotídeos que se hibridiza de forma seletiva com um polinucleotídeo sendo o complemento reverso da SEQ ID NO: 1, ou (c) uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos cerca de 80% de identidade de sequência com a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1, ou (d) um fragmento de uma sequência de nucleotídeos como definida em (a), (b) ou (c), que tem pelo menos cerca de 100 nucleotídeos de comprimento, ou (e) uma sequência que é degenerada como resultado do código genético para uma sequência, tal como definida em qualquer uma de (a), (b), (c) ou (d), ou (f) uma sequência de nucleotídeos que é o complemento reverso de uma sequência de nucleotídeos como definida em (a), (b), (c), (d) ou (e).

[0016] Também é fornecido um vetor de acordo com a invenção, tal como um vetor de expressão, que incorpora uma sequência de polinucleotídeos da presente invenção e uma célula que compreende um polipeptídeo, um polinucleotídeo ou um vetor da invenção.

[0017] A invenção também fornece:

[0018] um método para a preparação de um polipeptídeo tendo ou auxiliando a atividade de degradação de carboidratos, cujo método compreende o cultivo de uma célula da invenção em condições que permitam a expressão do dito polipeptídeo e, opcionalmente, a recuperação do polipeptídeo expresso;

[0019] um polipeptídeo obtido por um tal método; e

[0020] uma composição que compreende: (i) um polipeptídeo da presente invenção, e (ii) uma celulase e/ou uma hemicelulase e/ou uma pectinase;

[0021] Os polipeptídeos da presente invenção tendo ou auxiliando a atividade de degradação de carboidratos podem ser utilizados em processos industriais. Assim, a invenção fornece um método para o tratamento de um substrato compreendendo um material de carboidratos em que o método compreende o contato do substrato com um polipeptídeo ou uma composição da presente invenção.

[0022] Em particular, a invenção fornece um método para produzir um açúcar ou açúcares a partir de material lenhocelulósico em que o método compreende o contato do material lignocelulósico com um polipeptídeo ou uma composição da presente invenção.

[0023] Açúcares produzidos desta forma podem ser utilizados em um processo de fermentação. Por conseguinte, a presente invenção fornece um método para produzir um produto de fermentação, método esse que compreende: a produção de um açúcar fermentável utilizando o acima descrito; e a fermentação do açúcar fermentável resultante, assim, produzindo um produto de fermentação.

[0024] Uma composição ou um polipeptídeo da invenção pode também ser utilizada, por exemplo, na preparação de um produto alimentar, na preparação de um detergente, na preparação de uma ração para animais, no tratamento de polpa de papel ou na fabricação de um papel ou na preparação de um tecido ou tecido têxtil ou na limpeza do mesmo.

[0025] A invenção também fornece:

[0026] um material processado obtido por contato de um material vegetal ou material lignocelulósico com um polipeptídeo ou uma composição da invenção;

[0027] um alimento ou ração para animais compreendendo um polipeptídeo ou uma composição da invenção; e uma planta ou de uma parte da mesma, que compreende um polinucleotídeo, um polipeptídeo, um vetor ou uma célula de acordo com a invenção.

Breve descrição dos desenhos

[0028] Fig. 1: Mapa de pGBTOP para a expressão de genes de A. niger. Representado são do gene de interesse (GOI) expresso a partir do promotor da glucoamilase (PglaA). Além disso, o flanco de glucoamilase (3'glaA) doa cassete de expressão é descrito. Neste pedido, um gene de interesse é a sequência de codificação de TEMER07589 como definido a seguir.

[0029] Fig. 2: Gráfico de liberação de glicose, expressa em mmol/L, com o tempo, a partir de 2% dm de palha de trigo pré-tratada, incubada com 15 mg de proteína, como BSA equivalente por grama de palha de trigo pré-tratada seca, por 4 misturas de enzimas, que contém 1 BG , 1 CBHI, 1 CBHII 1 e 1 EG ou, auxiliar na atividade de degradação de carboidratos (-- • -- = CEA;. -.. x-.. = CEB; -- ■ -- = TEMER07589) ou pelo produto de celulase clássica (--▲-- = Filtrase® NL).

Breve descrição da listagem de sequências

[0030] SEQ ID NO 1 estabelece a sequência de codificação de TEMER07589;

[0031] SEQ ID NO 2 estabelece a sequência de aminoácidos de TEMER07589;

[0032] SEQ ID NO 3 estabelece a sequência sinal de TEMER07589;

Descrição detalhada da invenção

[0033] Ao longo do presente relatório descritivo e nas reivindicações anexas, as palavras "compreendem" e "incluem" e variações tais como "compreende", "compreendendo", "inclui" e "incluindo", devem ser interpretadas, de modo inclusivo. Isto é, estas palavras pretendem transmitir a possível inclusão de outros elementos ou inteiros não especificamente recitados, onde o contexto o permita.

[0034] Os artigos "um," e "uma" são utilizado aquis para se referir a um ou a mais do que um (isto é, a um ou a pelo menos um) objeto gramatical do artigo. A título de exemplo, "um elemento" pode significar um elemento ou mais de um elemento.

[0035] A presente invenção fornece polinucleotídeos que codificam polipeptídeos, por exemplo, enzimas que têm a capacidade de modificar, por exemplo, degradar, um material de carboidratos. Um material de carboidrato é um material que compreende, consiste em, ou consiste essencialmente em um ou mais carboidratos. As enzimas são aqui uma subclasse de polipeptídeos.

[0036] O substrato aqui (também denominado matéria-prima) é utilizado para se referir a uma substância que compreende o material de carboidrato, que pode ser tratada com enzimas de acordo com a invenção, de modo que o material de carboidrato nela é modificado. Além disso, o material de carboidrato do substrato pode conter qualquer outro componente, incluindo, mas não se limitando a, materiais e amidos de não carboidrato.

[0037] A presente invenção fornece polinucleotídeos que codificam polipeptídeos, por exemplo, enzimas que têm a capacidade de modificar, por exemplo, degradar, um material de carboidratos. Um material de carboidrato é um material que compreende, consiste em, ou consiste essencialmente em um ou mais carboidratos. As enzimas são aqui uma subclasse de polipeptídeos.

[0038] Tipicamente, um polipeptídeo da presente invenção codifica um polipeptídeo tendo pelo menos ou auxiliando uma atividade de degradação de carboidratos, provisoriamente chamada TEMER07589, tendo uma sequência de aminoácidos de acordo com SEQ ID NO: 2, ou uma sequência que é uma variante do mesmo, tipicamente funcionalmente equivalente ao polipeptídeo tendo a sequência de SEQ ID NO: 2, ou uma sequência que é um fragmento de qualquer destes.

[0039] "Ter ou auxiliar na atividade de degradação de carboidratos"é aqui definido como o polipeptídeo que tem atividade de degradação de carboidratos, ou que os polipeptídeos auxiliam na degradação de carboidratos, ou ambos. Em uma modalidade, o polipeptídeo aumenta a atividade de pelo menos uma celulase. Nesta modalidade, quando o polipeptídeo da presente invenção está presente em uma mistura com uma ou mais celulases, por exemplo, em uma mistura com celobiohidrolase (CBH) e beta-glucosidase (BG), isso irá aumentar a atividade dessas celulases, o que resultará em um aumento da atividade da mistura para degradação da celulose. Acredita-se que TEMER07589 pertence à família GH61 de enzimas. As enzimas GH61 nesta família foram originalmente classificadas como uma família de glicosídeo hidrolase com base na medição de atividade de endo-1,4-b-D-glucanase muito fraca de um membro da família (endoglucanase (EC 3.2.1.4)). A estrutura e o modo de ação destas enzimas são, certamente, não canônicos e podem não ser considerados como bona fide glicosidases. No entanto, eles são mantidos na classificação CAZy com base na sua capacidade para aumentar a quebra de lignocelulose, quando utilizados em conjunto com uma celulase ou uma mistura de celulases. Uma visão geral de membros conhecidos da família GH61 é dada na figura 5 de Harris, PV et al., Biochemistry 2010, 49, 3305-3316.

[0040] Em uma modalidade, além da atividade intensificada de celulase, a proteína intensificadora de celulase de acordo com a invenção possui atividade de endoglucanase (EG). Nesta modalidade, a adição de endoglucanase (diferente da proteína intensificadora de celulase de acordo com a invenção) a uma mistura de celulase, que é geralmente essencial para a degradação eficaz de celulose, pode ser evitada.

[0041] Assim, uma endo-β-1,4-glucanase (EC 3.2.1.4) é qualquer polipeptídeo que é capaz de catalisar a endohidrólise de ligações 1,4-β-D-glucosidicas em celulose, lichenina ou β-D-glucanos de cereais. Um tal polipeptídeo pode ser também capaz de hidrolisar as ligações 1,4- nos β- D-glucanos contendo também ligações 1,3-. Esta enzima também pode ser referida como célulase, avicelase, β-1,4- endoglucano hidrolase, β-1,4-glucanase, carboximetil celulose, celudextrinase, endo-1,4-β-D-glucanase, endo-1,4- β-D-glucanohidrolase, endo-1,4-β-D-glucanase ou endoglucanase.

[0042] Em uma modalidade, um polipeptídeo da presente invenção pode ter uma ou mais alternativas e/ou atividades complementares que não o aumento da atividade de celulase e da atividade de endoglucanase como mencionado anteriormente, por exemplo, uma das outras atividades de hidrólise de carboidratos e/ou de degradação de carboidratos aqui mencionadas.

[0043] “Carboidratos”, neste contexto inclui todos os sacarídeos, por exemplo, os polissacarídeos, oligossacarídeos, dissacarídeos ou monossacarídeos.

[0044] Um polipeptídeo de acordo com a invenção pode modificar e/ou degradar um material de carboidratos por degradar quimicamente ou degradar fisicamente tal material ou hidrolisar o carboidrato. Físico inclui, por exemplo, interrupção da interação entre as microfibrilas de celulose e/ou a abertura da estrutura das fibras de celulose. A modificação química do material de carboidratos pode resultar na degradação de materiais tais como, por exemplo, por hidrólise, oxidação ou modificação química, tais como através da ação de uma liase. A modificação física pode ou não ser acompanhada por modificação química.

Materiais de carboidratos adequados

[0045] Um carboidrato não amido adequado para a modificação de um polipeptídeo da presente invenção é a lignocelulose. Os polissacarídeos principais que compreendem diferentes resíduos lignocelulósicos, que podem ser considerados como uma matéria-prima renovável potencial são a celulose (glucanos), hemicelulose (xilanos, heteroxilanos e xiloglucanos). Além disso, algumas hemiceluloses podem estar presentes como glucomananas, por exemplo, em derivados de matérias-primas de madeira. A hidrólise enzimática desses polissacáridos para açúcares solúveis, por exemplo, glicose, xilose, arabinose, galactose, frutose, manose, ramnose, ribose, D-galacturônico e outras hexoses e pentoses ocorre sob a ação de enzimas diferentes que atuam em combinação.

[0046] Além disso, as pectinas e outras substâncias pécticas, tais como arabinanos podem tornar-se consideravelmente proporção de massa seca tipicamente de paredes celulares a partir de tecidos de plantas não lenhosas (cerca de um quarto a metade da massa seca pode ser pectina).

[0047] A celulose é um polissacarídeo linear constituído por resíduos de glicose ligados por ligações β-1,4. A natureza linear das fibras de celulose, assim como a estequiometria da β-glicose ligada (em relação a α) gera estruturas mais propensas à ligação de hidrogênio entre as fitas do que as estruturas α-ligadas altamente ramificadas de amido. Assim, os polímeros de celulose são geralmente menos solúveis, e formam fibras mais firmemente ligadas do que as encontradas em fibras de amido.

[0048] A hemicelulose é um polímero complexo, e a sua composição varia muito frequentemente de organismo para organismo, e de um tipo de tecido para outro. De um modo geral, um componente principal de hemicelulose é xilose β- 1,4-ligada, um açúcar de cinco carbonos. No entanto, esta xilose é muitas vezes ramificada em O-3 e/ou O-2 e pode ser substituídoa com ligações a arabinose, galactose, manose, ácido glucurônico, ácido galacturônico, ou por esterificação de ácido acético (e esterificação do ácido ferúlico com arabinose). A hemicelulose também pode conter glucanos, que é um termo geral para açúcares de seis carbonos β-ligadas (tais como os β-(1,3)(1,4) glucanos e heteroglucanos mencionado anteriormente) e, adicionalmente, glucomananas (em que a glicose e a manose estão presentes no esqueleto linear, ligados uns aos outros por e-ligações).

[0049] A composição, natureza da substituição, e grau de ramificação de hemicelulose é muito diferente nas plantas dicotiledôneas (dicotiledôneas, por exemplo, plantas cujas sementes têm dois cotilédones ou folhas de sementes, tais como feijões, amendoins, amêndoas, ervilhas, vagem), em comparação com plantas monocotiledôneas (monocotiledôneas, isto é, plantas que têm um único cotilédone ou folha de semente, tais como milho, trigo, arroz, relva, cevada). Nas dicotiledóneas, a hemicelulose é composta principalmente de xiloglucanos que são cadeias de glicose 1,4-β-ligadas com cadeias laterais de xilosil 1,6-β-ligadas. Nas monocotiledôneas, incluindo a maioria das culturas de grãos, os principais componentes de hemicelulose são heteroxilanos. Estes são principalmente compostos por polímeros de esqueleto de xilose 1,4-β-ligados com 1,3-α ligações com arabinose, galactose, manose e ácido glucurônico ou ácido 4- O-metil-glucurônico, bem como a xilose modificada por ácidos acéticos ligados a ésteres. Também estão presentes β- glucanos compostos de cadeias de glicose ligadas a 1,3- e 1,4-β. Em monocotiledôneas, a celulose, heteroxilanos e β- glucanos podem estar presentes em quantidades aproximadamente iguais, cada um compreendendo cerca de 1525% de matéria seca de paredes celulares. Além disso, diferentes plantas podem compreender diferentes quantidades de, e diferentes composições de, substâncias pécticas. Por exemplo, a beterraba sacarina contém cerca de 19% de pectina e cerca de 21% de arabinano, em uma base de peso seco.

[0050] Por conseguinte, uma composição da presente invenção pode ser adaptada com vista à matéria-prima particular (também chamada de substrato), que deve ser usada. Isto é, o espectro de atividades em uma composição da presente invenção pode variar dependendo da matéria-prima em questão.

[0051] As combinações de enzimas ou tratamentos físicos podem ser administrados concomitantemente ou sequencialmente. As enzimas podem ser produzidas por via exógena em micro-organismos, leveduras, fungos, bactérias ou plantas, em seguida, isoladas e adicionadas à matéria-prima lignocelulósica. Alternativamente, as enzimas são produzidas, mas não isoladas, e o caldo de fermentação da massa celular bruta, ou o material vegetal (por exemplo, palha de milho), e semelhantes, são adicionados à matéria- prima. Em alternativa, a massa celular bruta ou meio de produção de enzima ou o material vegetal podem ser tratados para evitar o crescimento microbiano adicional (por exemplo, por aquecimento ou por adição de agentes antimicrobianos), em seguida, adicionados à matéria-prima. Essas misturas de enzimas em bruto podem incluir o organismo a produzir a enzima. Alternativamente, a enzima pode ser produzida em uma fermentação que utiliza a matéria-prima (por exemplo, como palha de milho) para fornecer nutrição a um organismo que produz uma enzima(s). Desta forma, as plantas que produzem as enzimas podem servir como a matéria-prima lignocelulósica e ser adicionadas na matéria-prima lignocelulósica.

Atividade enzimática

[0052] Endo-1,4-β-glucanases (EG) e exo- celobiohidrolases (CBH) catalisam a hidrólise de celulose insolúvel para celo-oligossacarídeos (celobiose como produto principal), enquanto as β-glucosidases (BGL) convertem os oligossacarídeos, principalmente celobiose e celotriose à glicose.

[0053] As xilanases juntamente com as enzimas acessórias, por exemplo, α-L-arabinofuranosidases, feruloil e acetilxilano esterases, glucuronidases, e β-xilosidases, catalisam a hidrólise de parte das hemiceluloses.

[0054] As substâncias pécticas incluem pectinas, arabinanos, galactanas e arabinogalactanas. As pectinas são polissacarídeos mais complexos da parede celular de plantas. Elas são construídas em torno de um núcleo de uma cadeia de unidades de ácido galacturônico α(1,4)-D-ligados intercaladas em algum grau com a L-ramnose. Em qualquer uma parede celular, há uma série de unidades estruturais que correspondem a esta descrição e que têm sido geralmente consideradas que, em uma molécula péctica única, as cadeias do núcleo de diferentes unidades estruturais são contínuas umas com as outras.

[0055] As pectinases incluem, por exemplo, uma endo poligalacturonase, uma pectina de metil esterase, uma endo- galactanase, uma beta-galactosidase, uma pectina de acetil esterase, uma endo-pectina liase, pectato liase, alfa ramnosidase, uma exo-galacturonase, uma expoligalacturonato liase, uma ramnogalacturonano hidrolase, uma ramnogalacturonano liase, uma ramnogalacturonano de acetil esterase, um ramnogalacturonano galacturonohidrolase, uma xilogalacturonase, uma α-arabinofuranosidase.

[0056] Os principais tipos de unidade estrutural são: galacturonano (homogalaturonano), que pode ser substituído com metanol no grupo carboxil e acetato em O-2 e O-3; ramnogalacturonano I (RGI), em que as unidades de ácido galacturônico se alternam com unidades de ramnose que portam cadeias laterais de galactano (1,4)-ligado e arabinano (1,5)-ligado. As cadeias laterais de arabinano podem ser ligadas diretamente à ramnose ou indiretamente através das cadeias de galactano; xilogalacturonano, com uma única unidade de xilosil em O-3 de ácido galacturônico (intimamente associado com RGI); e ramnogalacturonano II (RGI I), uma unidade particularmente menor de complexo que contém os açúcares não usuais, por exemplo, apiose. Uma unidade RGII pode conter dois resíduos de apiosil que, em condições iônicas adequadas, podem reversivelmente formar ésteres com borato.

[0057] Tal como estabelecido acima, um polipeptídeo da presente invenção terá tipicamente atividade intensificada de celulase. No entanto, um polipeptídeo da presente invenção pode ter uma ou mais das atividades acima referidas, em complemento ou alternativa a essa atividade. Além disso, uma composição da presente invenção, tal como aqui descrita, pode ter uma ou mais das atividades acima referidas, em adição ao que é fornecido por um polipeptídeo da presente invenção tendo atividade intensificada de celulase.

Sequência de polinucleotídeos

[0058] A invenção fornece as sequências de polinucleotídeos genômicos que compreendem o gene que codifica o TEMER07589 bem como a sua sequência de codificação. Consequentemente, a invenção refere-se a um polinucleotídeo isolado compreendendo a sequência de nucleotídeos do genoma de acordo com a sequência de codificação de nucleotídeos de acordo com a SEQ ID NO: 1 e variantes, tais como equivalentes funcionais, de um ou outro destes.

[0059] Em particular, a invenção diz respeito a um polinucleotídeo isolado que é capaz de hibridizar seletivamente, por exemplo, em condições rigorosas, preferencialmente em condições altamente rigorosas, com o complemento reverso de um polinucleotídeo que compreende a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 1.

[0060] Mais especificamente, a invenção refere-se a um polinucleotídeo que compreende ou consiste essencialmente em uma sequência de nucleotídeos de acordo com SEQ ID NO: 1.

[0061] A invenção também diz respeito a um polinucleotídeo isolado compreendendo ou consistindo essencialmente de uma sequência que codifica pelo menos um domínio funcional de um polipeptídeo de acordo com a SEQ ID NO: 2 ou uma variante do mesmo, tal como um equivalente funcional ou um fragmento de qualquer um destes.

[0062] Tal como utilizado aqui, os termos "gene" e "gene recombinante" referem-se a moléculas de ácidos nucleicos que podem ser isoladas a partir de DNA cromossômico, que incluem uma estrutura de leitura aberta que codifica uma proteína, por exemplo, a proteína intensificadora de celulase de acordo com a presente invenção.

[0063] Um gene pode incluir sequências codificantes, sequências não codificantes, íntrons, e/ou sequências de regulação. Além disso, o termo "gene" pode referir-se a uma molécula de ácido nucleico isolada tal como aqui definido.

[0064] Uma molécula de ácido nucleico da presente invenção, tal como uma molécula de ácido nucleico tendo a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1 ou uma variante do mesmo, tal como um equivalente funcional, pode ser isolada utilizando técnicas padrões de biologia molecular e a informação de sequência aqui fornecida. Por exemplo, utilizando toda ou uma porção da sequência de ácido nucleicos de SEQ ID NO: 1, como sonda de hibridação, as moléculas de ácido nucleico, de acordo com a invenção, podem ser isoladas por meio de técnicas padrões de hibridização e clonagem (por exemplo, como descrito em Sambrook, J., Fritsh, E.F. e Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2° ed, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989).

[0065] Além disso, uma molécula de ácido nucleico compreendendo a totalidade ou uma porção de SEQ ID NO: 1, pode ser isolada pela reação em cadeia da polimerase (PCR) utilizando iniciadores oligonucleotídicos sintéticos projetados com base na informação da sequência contida em SEQ ID NO: 1.

[0066] Um ácido nucleico da invenção pode ser amplificado usando o cDNA, mRNA ou, alternativamente, DNA genômico, como um molde e iniciadores oligonucleotídicos apropriados de acordo com as técnicas padrões de amplificação de PCR. O ácido nucleico assim amplificado pode ser clonado em um vetor adequado e caracterizado por análise da sequência de DNA.

[0067] Além disso, os oligonucleotídeos que correspondem a, ou hibridizam com uma sequência de nucleotídeos de acordo com a invenção podem ser preparados por técnicas sintéticas padrões, por exemplo, utilizando um sintetizador de DNA automático.

[0068] Em uma modalidade preferida, uma molécula de ácido nucleico isolada da presente invenção compreende a sequência de nucleotídeos mostrada na SEQ ID NO: 1.

[0069] Em uma outra modalidade preferida, uma molécula de ácido nucleico isolada da presente invenção compreende uma molécula de ácido nucleico que é o complemento reverso da sequência de nucleotídeos mostrada na SEQ ID NO: 1 ou uma variante da mesma, tal como um equivalente funcional, de qualquer uma dessas sequências de nucleotídeos.

[0070] Uma molécula de ácido nucleico que é complementar a outra sequência de nucleotídeos é uma que é suficientemente complementar para a outra sequência de nucleotídeos de tal modo que pode de hibridizar com a outra sequência de nucleotídeos formando, assim, um duplexo estável.

[0071] Um aspecto a invenção diz respeito a moléculas isoladas de ácidos nucleicos que codificam um polipeptídeo da invenção ou uma variante do mesmo, tal como um equivalente funcional do mesmo, por exemplo, um fragmento ou domínio biologicamente ativo, bem como moléculas de ácido nucleico suficientes para uso como sondas de hibridação para identificar as moléculas de ácido nucleico que codificam um polipeptídeo da invenção e os fragmentos de tais moléculas de ácido nucleico adequados para uso como iniciadores de PCR para a amplificação ou mutação de moléculas de ácidos nucleicos.

[0072] Um polinucleotídeo de acordo com a invenção pode ser "isolado". No contexto da presente invenção, um "polinucleotídeo isolado" ou "ácido nucleico isolado"é um DNA ou RNA que não é imediatamente contíguo a uma ou ambas as sequências codificantes com as quais é imediatamente contíguo (um na extremidade 5' e um sobre a extremidade 3') no genoma que ocorre naturalmente do organismo a partir do qual é derivado. Assim, em uma modalidade, um ácido nucleico isolado inclui algumas ou todas as sequências não codificantes 5' (por exemplo, promotoras) que são imediatamente contíguas à sequência de codificação. O termo inclui assim, por exemplo, um DNA recombinante que é incorporado em um vetor, em um plasmídeo de replicação autônoma ou vírus, ou no DNA genômico de um procariota ou eucariota, ou que existe como uma molécula separada (por exemplo, um cDNA ou um fragmento de DNA genômico produzido por PCR ou por tratamento com endonuclease de restrição) independente de outras sequências. Também inclui um DNA recombinante que é parte de um gene híbrido que codifica um polipeptídeo adicional que é substancialmente livre de material celular, material viral ou meio de cultura (quando produzido por técnicas de DNA recombinante), ou precursores químicos ou outros produtos químicos (quando sintetizados quimicamente). Além disso, um "fragmento de ácido nucleico isolado"é um fragmento de ácido nucleico que não ocorre naturalmente como fragmento e que não seria encontrado no estado natural.

[0073] Como usado aqui, os termos "polinucleotídeo"ou "molécula de ácido nucleico"são destinados a incluir moléculas de DNA (por exemplo, cDNA ou DNA genômico) e moléculas de RNA (por exemplo, mRNA) e análogos de DNA ou RNA gerados utilizando análogos de nucleotídeos. A molécula de ácido nucleico pode ser de fita simples ou de fita dupla, mas preferencialmente é DNA de fita dupla. O ácido nucleico pode ser sintetizado utilizando análogos de oligonucleotídeos ou seus derivados (por exemplo, nucleotídeos de fosforotioato ou inosina). Tais oligonucleotídeos podem ser utilizados, por exemplo, para preparar os ácidos nucleicos que tiveram a capacidade de emparelhamento de bases alterada ou a resistência a nucleases aumentada.

[0074] Outra modalidade da invenção fornece uma molécula de ácido nucleico isolado, que é antisense a uma molécula de ácido nucleico TEMER07589, por exemplo, a fita codificante de uma molécula de ácido nucleico TEMER07589. Também incluídas dentro do escopo da presente invenção estão as fitas complementares de moléculas de ácido nucleico aqui descritas.

[0075] Salvo indicação em contrário, todas as sequências de nucleotídeos determinadas por sequenciação de uma molécula de DNA aqui foram determinadas utilizando um sequenciador de DNA automático e todas as sequências de aminoácidos dos polipeptídeos codificados por moléculas de DNA determinadas aqui foram previstas por translação de uma sequência de DNA determinada como acima. Potanto, como é conhecido na técnica para qualquer sequência de DNA determinada por esta abordagem automatizada, qualquer sequência de nucleotídeos aqui determinada pode conter alguns erros. As sequências de nucleotídeos determinadas pela automatização são tipicamente pelo menos cerca de 90% idênticas, mais tipicamente pelo menos cerca de 95% a pelo menos cerca de 99,9% idênticas à sequência de nucleotídeos real da molécula de DNA sequenciada.

[0076] A sequência real pode ser mais precisamente determinada através de outras abordagens, incluindo os métodos de sequenciamento manual de DNA bem conhecidos na técnica. Como também é conhecido na técnica, uma única inserção ou remoção de uma determinada sequência de nucleotídeos em relação à sequência real irá causar uma mudança de estrutura de tradução da sequência de nucleotídeos de tal modo que a sequência de aminoácidos prevista codificada por uma sequência de nucleotídeos determinada será completamente diferente da sequência de aminoácidos na verdade, codificada pela molécula de DNA sequenciada, começando no ponto de tal inserção ou deleção.

[0077] O versado na técnica é capaz de identificar essas bases erroneamente identificadas e saber como corrigir esses erros.

[0078] Uma molécula de ácido nucleico de acordo com a invenção pode compreender apenas uma porção ou um fragmento da sequência de ácido nucleicos apresentada na SEQ ID NO: 1 (ou uma variante de qualquer uma destas), por exemplo um fragmento que pode ser utilizado como uma sonda ou iniciador ou fragmento que codifica uma porção de um polipeptídeo TEMER07589.

[0079] A sequência de nucleotídeos determinada a partir da clonagem do gene TEMER07589 de cDNA permite a geração de sondas e iniciadores projetados para uso na identificação e/ou clonagem de outros membros da família de TEMER07589, bem como homólogos de TEMER07589 de outras espécies.

[0080] A sonda/iniciador compreende tipicamente um oligonucleotídeo substancialmente purificado que compreende, tipicamente, uma região de sequência de nucleotídeos que hibridiza, preferencialmente, em condições altamente rigorosas com pelo menos cerca de 12 a cerca de 15, preferencialmente de cerca de 18 a cerca de 20, preferencialmente de cerca de 22 a cerca de 25, mais preferencialmente de cerca de 30, cerca de 35, cerca de 40, cerca de 45, cerca de 50, cerca de 55, cerca de 60, cerca de 65, ou cerca de 75 ou mais nucleotídeos consecutivos de uma sequência de nucleotídeos apresentada na SEQ ID NO: 1 ou de uma variante, tal como um equivalente funcional, ou qualquer um dos mesmos.

[0081] As sondas com base nas sequências de nucleotídeos TEMER07589 podem ser usadas para detectar sequências de TEMER07589 transcritas ou genômicas que codificam os mesmos polipeptídeos ou polipeptídeos homólogos, por exemplo, em outros organismos. Em modalidades preferidas, a sonda compreende ainda um grupo marcador fixo na mesma, por exemplo, o grupo marcador pode ser um radioisótopo, um composto fluorescente, uma enzima, ou um cofator de enzima. Estas sondas podem também ser utilizadas como parte de um kit de teste de diagnóstico para a identificação de células que expressam um polipeptídeo TEMER07589.

[0082] Os polinucleotídeos aqui descritos podem ser polinucleotídeos sintéticos. Os polinucleotídeos sintéticos podem ser otimizados no códon de uso, preferencialmente, de acordo com os métodos descritos nos documentos WO2006/077258 e/ou PCT/EP2007/055943, que são aqui incorporados por referência. O documento PCT/EP2007/055943 aborda a otimização par de códons. A otimização de par de códons é um método em que as sequências de nucleotídeos que codificam um polipeptídeo foram modificadas em relação a seu uso de códon, em particular, os pares de códons que são utilizados, para se obter uma melhor expressão da sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo e/ou melhor produção do polipeptídeo codificado. Os pares de códons são definidos como um conjunto de dois tripletos subsequentes (códons) de uma sequência de codificação.

[0083] A invenção refere-se ainda a um construto de ácido nucleico compreendendo o polinucleotídeo como descrito antes. "Construto de ácido nucleico"é aqui definido como uma molécula de ácido nucleico quer de fita simple ou de fita dupla, que é isolada a partir de um gene que ocorre naturalmente ou que tenha sido modificado para conter segmentos de ácido nucleico que são combinados e justapostos de modo que não existiriam de outra forma na natureza. O termo construto de ácido nucleico é sinônimo ao termo "cassete de expressão"quando o construto de ácido nucléico contém todas as sequências de controle necessárias para a expressão de uma sequência de codificação. O termo "sequência de codificação"como aqui definido é uma sequência que é transcrita em RNAm e traduzida em um ativador transcricional de um promotor da protease da invenção. As fronteiras da sequência de codificação são geralmente determinadas pelo códon de iniciação ATG na extremidade 5' do mRNA e um códon de paragem de tradução de sequência de terminação da estrutura de leitura aberta na extremidade 3' do mRNA. Uma sequência de codificação pode incluir, mas não se limita a, DNA, DNAc, e sequências de ácidos nucleicos recombinantes. Preferencialmente, o ácido nucleico tem um teor elevado de GC. O teor de GC aqui indica o número de nucleotídeos G e C no construto, dividido pelo número total de nucleotídeos, expresso em %. O teor de GC é, preferencialmente, 56% ou mais, 57% ou mais, 58% ou mais, 59% ou mais, 60% ou mais, ou na faixa de 56-70%, ou na faixa de 58-65%.

[0084] Preferencialmente, o construto de DNA compreende uma sequência de DNA do promotor, uma sequência de codificação em associação operacional com a referida sequência de DNA do promotor e sequências de controle, tais como:

[0085] - uma sequência de terminação translacional orientada de 5' para 3' selecionada da seguinte lista de sequências: TAAG, TAGA e ATA, preferencialmente, AATA, e/ou

[0086] - um sequência de codificação de iniciador translacional orientada de 5' para 3' selecionada da seguinte lista de sequências: GCTACCCCC; GCTACCTCC; GCTACCCTC; GCTACCTTC; GCTCCCCCC; GCTCCCTCC; GCTCCCCTC; GCTCCCTTC; GCTGCCCCC; GCTGCCTCC; GCTGCCCTC; GCTGCCTTC; GCTTCCCCC; GCTTCCTCC; GCTTCCCTC e GCTTCCTTC, preferencialmente TGC TTC TCC, e/ou

[0087] - uma sequência iniciadora translacional selecionada da seguinte lista de sequências: 5'-mwChkyCAAA- 3'; 5'-mwChkyCACA-3' ou 5'-mwChkyCAAG-3’, utilizando códigos de ambiguidade para nucleotídeos: m (A/C); w (A/T), y (C/T), k (G/T) h (A/C/T), preferencialmente, 5'-CACCGTCAAA-3' ou 5'-CGCAGTCAAG-3'.

[0088] No contexto da presente invenção, o termo "sequência de codificação iniciadora translacional"é definido como os nove nucleotídeos imediatamente a jusante do códon de iniciação do iniciador ou da estrutura de leitura aberta de uma sequência de codificação de DNA. O códon iniciador ou de partida codifica a metionina de AA. O códon iniciador é normalmente ATG, mas também pode ser de qualquer códon de partida funcional tal como GTG.

[0089] No contexto da presente invenção, o termo "sequência de terminação translacional"é definido como os quatro nucleotídeos a partir do códon de paragem translacional na extremidade 3' da estrutura de leitura aberta ou sequência de codificação de nucleotídeos e orientados de 5' para 3'.

[0090] No contexto da presente invenção, o termo "sequência iniciadora translacional"é definido como os dez nucleotídeos, imediatamente a montante do códon iniciador ou de partida da estrutura de leitura aberta de uma sequência de DNA que codifica um polipeptídeo. O códon iniciador ou de partida codifica a metionina AA. O códon iniciador é normalmente ATG, mas também pode ser de qualquer códon de partida funcional tal como GTG. É bem sabido na técnica que o uracil, U, substitui o desoxinucleotídeo timina, T, no RNA.

Homologia e identidade

[0091] Aminoácidos ou sequências de nucleotídeos são considerados homólogos quando exibem certo grau de similaridade. Duas sequências que são homólogas indicam uma origem evolutiva comum. Se duas sequências homólogas estão intimamente relacionadas ou mais distantemente relacionadas é indicado por "identidade percentual" ou "porcentagem de similaridade", que é alta ou baixa, respectivamente. Apesar do argumentado para indicar "identidade percentual" ou "porcentagem de similaridade", o "nível de homologia" ou "homologia percentual"são frequentemente usados como sinônimos.

[0092] Os termos "homologia", "homologia percentual", "identidade percentual" ou "porcentagem de similaridade"são utilizados aqui indiferentemente. Para os fins da presente invenção, define-se aqui que, a fim de determinar a porcentagem de identidade de duas sequências de aminoácidos ou de duas sequências de ácidos nucleicos, as sequências completas estão alinhadas para fins de comparação ótima. De modo a otimizar o alinhamento entre as duas sequências gaps podem ser introduzidos em qualquer uma das duas sequências que são comparadas. Tal alinhamento é realizado ao longo do comprimento completo das sequências a serem comparadas. Alternativamente, o alinhamento pode ser realizado ao longo de um comprimento mais curto, por exemplo, em cerca de 20, cerca de 50, cerca de 100 ou mais ácidos nucleicos/de bases ou aminoácidos. A identidade é a porcentagem de correspondências idênticas entre as duas sequências sobre a região alinhada relatada.

[0093] Uma comparação de sequências e determinação da porcentagem de identidade entre duas sequências pode ser realizada usando um algoritmo matemático. A pessoa versada estará ciente do fato de que vários diferentes programas de computador estão disponíveis para alinhar duas sequências e determinar a homologia entre as duas sequências (Kruskal, J.B. (1983) An overview of Sequence Comparison em D. Sankoff e Kruskal J.B., (ed.), Time warps, string edits and macromolecules: the theory and practice of sequence comparison, pp. 1-44 Addison Wesley). A porcentagem de identidade entre duas sequências de aminoácidos pode ser determinada utilizando o algoritmo de Needleman e Wunsch para o alinhamento de duas sequências. (Needleman, S.B. e Wunsch, C.D. (1970) J. Mol. Biol. 48, 443-453). O algoritmo alinha as sequências de aminoácidos, assim como sequências de nucleotídeos. O algoritmo de Needleman-Wunsch foi implementado no programa de computador NEEDLE. Para os fins da presente invenção, o programa NEEDLE a partir do pacote EMBOSS foi utilizado (versão 2.8.0 ou superior, EMBOSS: The European Molecular Biology Software Suite Open (2000) Rice, P. LongdenJ e Bleasby A. Trends in Genetics 16, (6) pp276- 277, http://emboss.bioinformatics.nl/). Para sequências de polipeptídeos, EBLOSUM62 é utilizado para a matriz de substituição. Para as sequências de nucleotídeos, EDNAFULL é usado. Outras matrizes podem ser especificadas. Os parâmetros opcionais utilizados para o alinhamento das sequências de aminoácidos são uma penalidade de abertura de gap de 10 e uma penalidade de extensão de gap de 0,5. O versado irá apreciar que todos esses parâmetros diferentes irão produzir resultados ligeiramente diferentes, mas que a porcentagem global de identidade de duas sequências não é alterada significativamente quando se utiliza algoritmos diferentes.

Definição de Homologia mundial

[0094] A homologia ou identidade é a porcentagem de correspondências idênticas entre as duas sequências completas sobre a região total alinhada incluindo eventuais lacunas ou extensões. A homologia ou identidade entre as duas sequências alinhadas é calculada como segue: Número de posições correspondentes no alinhamento apresentando um aminoácido idêntico em ambas as sequências, dividido pelo comprimento total do alinhamento, incluindo os gaps. A identidade, tal como aqui definido pode ser obtida a partir de NEDDLE e é marcada na saída do programa como "IDENTITY" (identidade).

Definição de Identidade mais Longa

[0095] A homologia ou identidade entre as duas sequências alinhadas é calculada como segue: Número de posições correspondentes no alinhamento apresentando um aminoácido idêntico em ambas as sequências, dividido pelo comprimento total do alinhamento, após subtração do número total de gaps no alinhamento. A identidade, tal como aqui definido pode ser obtida a partir de NEEDLE usando a opção NOBRIEF e é marcada na saída do programa tal como "a identidade mais longa". Para os fins da invenção o nível de identidade (homologia) entre duas sequências de aminoácidos (ou nucleotídeos) é calculado de acordo com a definição de “identidade mais longa”, como pode ser realizado usando o programa NEEDLE.

[0096] As sequências de polipeptídeos da presente invenção podem ainda ser utilizadas como uma "sequência de busca" para realizar uma procura contra bases de dados de sequências, por exemplo, para identificar outros membros da família ou sequências relacionadas. Tais pesquisas podem ser realizadas utilizando os programas BLAST. O software para realização de análises BLAST está publicamente disponível através do Centro Nacional de Informações sobre Biotecnologia (Http://www.ncbi.nlm.nih.gov). BLASTP é utilizado para as sequências de aminoácidos e de nucleotídeos BLASTN para sequnces. O programa BLAST usa como padrão:

[0097] Custo para abertra de gap: padrão = 5 para nucleotídeos/11 para polipeptídeos

[0098] Custo para extensão de gap: padrão = 2 para nucleotídeos/1 para polipeptídeos -Penalidade para nucleotídeos desemparelhados: padrão = -3 -Recompensa para nucleotídeo correspondente: padrão = 1 - Valor de Espera: padrão = 10 -Tamanho de palavra: padrão = 11 para nucleotídeos / 28 para Megablast / 3 para polipeptídeos

[0099] Além disso, o grau de identidade local (homologia) entre a sequência de busca de aminoácidos ou sequência de busca de ácidos nucleicos e as sequências homólogas recuperadas é determinado pelo programa BLAST. No entanto apenas os segmentos de sequências que são comparados geram uma correpondência acima de certo limiar. Por conseguinte, o programa calcula a identidade apenas para estes segmentos correspondentes. Assim, a identidade calculada desta forma é referida como identidade local.

Hibridização

[0100] Tal como utilizado aqui, o termo "hibridizar seletivamente", "hibridiza seletivamente" e termos semelhantes são utilizados para descrever condições para hibridação e lavagem sob as quais as sequências de nucleotídeos, pelo menos, cerca de 50%, pelo menos cerca de 55%, pelo menos cerca de 60%, em pelo menos cerca de 65%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, mais preferencialmente pelo menos cerca de 85%, ainda mais preferencialmente pelo menos cerca de 90%, preferencialmente pelo menos 95%, mais preferencialmente pelo menos cerca de 98% ou mais, preferencialmente pelo menos cerca de 99% homólogas entre si permanecem tipicamente hibridizadas entre si. Ou seja, tais sequências hibridizantes podem partilhar pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 55%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 65%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80 %, mais preferencialmente pelo menos cerca de 85%, ainda mais preferencialmente pelo menos cerca de 90%, mais preferencialmente pelo menos 95%, mais preferencialmente pelo menos 98% ou mais, preferencialmente pelo menos cerca de 99% de identidade de sequência.

[0101] Um exemplo não limitativo preferido de tais condições de hibridação é a hibridação em 6X citrato de sódio / cloreto de sódio (SSC) a cerca de 45°C, seguido de uma ou mais lavagens em 1 X SSC, SDS 0,1% a cerca de 50°C, preferencialmente a cerca de 55°C, preferencialmente, a cerca de 60°C e ainda mais preferencialmente a cerca de 65°C.

[0102] Condições altamente rigorosas incluem, por exemplo, a hibridação a cerca de 68°C em 5x SSC/ solução de Denhardt 5x / SDS a 1,0 % e lavagem em 0,2 x SSC/SDS 0,1% à temperatura ambiente. Como alternativa, a lavagem pode ser realizada a 42°C.

[0103] O versado na técnica saberá quais condições aplicar às condições de hibridação rigorosas e muito rigorosas. Orientação adicional em relação a essas condições estão prontamente disponíveis na técnica, por exemplo, em Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y.; e Ausubel et al. (Eds.), 1995, Current Protocols in Molecular Biology, (John Wiley & Sons, N.Y.).

[0104] Naturalmente, um polinucleotídeo que hibridiza apenas uma sequência poli A (tal como o trato poli (A) terminal 3' mRNAs), ou para um estiramento complementar de resíduos T (ou U), não seria incluído em um polinucleotídeo da invenção utilizada para hibridizar especificamente com uma porção de um ácido nucleico da presente invenção, uma vez que tal polinucleotídeo hibridizam qualquer molécula de ácido nucleico contendo um estiramento poli(A) ou seu complemento (por exemplo, praticamente qualquer clone de cDNA de fita dupla).

[0105] Em uma abordagem típica, as bibliotecas de DNAc construídas a partir de outros organismos, por exemplo, fungos filamentosos, em particular, a partir da família de micro-organismos Trichomaceae, por exemplo, a partir do gênero Penicillium podem ser rastreadass, como Penicillium decumbens.

[0106] Por exemplo, as cepas de Penicillium podem ser rastreadas para polinucleotídeos TEMER07589 homólogos por meio da análise de Northern blot. Após a detecção de transcritos homólogos à polinucleotídeos de acordo com a invenção, as bibliotecas de DNAc podem ser construídas a partir de RNA isolado da cepa apropriada, utilizando técnicas padrões bem conhecidas dos versados na técnica. Alternativamente, uma biblioteca de DNA genômico total pode ser pesquisada usando uma sonda capaz de hibridizar com um polinucleotídeo TEMER07589 acordo com a invenção.

[0107] As sequências homólogas de genes podem ser isoladas, por exemplo, através da realização de PCR utilizando dois pools de iniciadores oligonucleotídicos degenerados projetados com base nas sequências de nucleotídeos, como ensinado aqui.

[0108] O molde para a reação pode ser DNAc obtido por transcrição reversa do mRNA preparado a partir de cepas conhecidas ou suspeitas de expressar um polinucleotídeo de acordo com a invenção. O produto de PCR pode ser subclonado e sequenciado para assegurar que as sequências amplificadas representam as sequências de uma nova sequência de ácido nucleico TEMER07589, ou um equivalente funcional do mesmo.

[0109] O fragmento de PCR pode então ser usado para isolar um clone de DNAc de comprimento completo por uma variedade de métodos conhecidos. Por exemplo, o fragmento amplificado pode ser marcado e utilizado para pesquisar uma biblioteca de DNAc do bacteriófago ou cosmídeo. Alternativamente, o fragmento marcado pode ser utilizado para pesquisar uma biblioteca genômica.

[0110] A tecnologia de PCR pode também ser utilizada para isolar as sequências de comprimento total de cDNA a partir de outros organismos. Por exemplo, o RNA pode ser isolado, seguindo procedimentos padrões, a partir de uma fonte celular ou tecidual apropriada. A reação de transcrição inversa pode ser executada sobre o RNA utilizando um iniciador oligonucleotídico específico para a extremidade 5' maior do fragmento amplificado para a iniciação da síntese da primeira fita.

[0111] O híbrido de RNA/DNA resultante pode então ser "acabado" (por exemplo, com guaninas) utilizando uma reação de transferase terminal padrão, o híbrido pode ser digerido com RNase H e a síntese da segunda cadeia pode então ser preparada (por exemplo, com um iniciador poli-C). Assim, as sequências de DNAc a montante do fragmento amplificado podem facilmente ser isoladas. Para uma revisão das estratégias de clonagem úteis ver, por exemplo, Sambrook et al., supra,. E Ausubel et al., supra.

Vetores

[0112] Outro aspecto da invenção diz respeito a vetores, incluindo vetores de clonagem e de expressão compreendendo um polinucleotídeo da invenção que codifica um polipeptídeo TEMER07589 ou um equivalente funcional do mesmo e métodos de crescimento, transformação ou transfecção de tais vetores em uma célula hospedeira adequada, por exemplo, em condições em que a expressão de um polipeptídeo da presente invenção ocorre. Como utilizado aqui, o termo "vetor" refere-se a uma molécula de ácido nucleico capaz de transportar outro ácido nucleico ao qual foi ligada.

[0113] Os polinucleotídeos da presente invenção podem ser incorporados em um vetor recombinante replicável, por exemplo, um vetor de clonagem ou de expressão. O vetor pode ser usado para replicar o ácido nucleico em uma célula hospedeira compatível. Assim, em uma modalidade adicional, a invenção fornece um método para fazer os polinucleotídeos da invenção através da introdução de um polinucleotídeo da invenção em um vetor replicável, introdução do vetor em uma célula hospedeira compatível e crescimento da célula hospedeira em condições que provocam a replicação do vetor. O vetor pode ser recuperado da célula hospedeira. As células hospedeiras adequadas são descritas abaixo.

[0114] O vetor no qual o cassete de expressão ou o polinucleotídeo da invenção é inserido pode ser qualquer vetor que pode convenientemente ser submetido a procedimentos de DNA recombinante, e a escolha do vetor dependerá frequentemente da célula hospedeira na qual vai ser introduzido.

[0115] Um vetor de acordo com a invenção pode ser um vetor de replicação autônoma, ou seja, um vetor que existe como uma entidade extracromossômica, cuja replicação é independente da replicação cromossômica, por exemplo, um plasmídeo. Em alternativa, o vetor pode ser um que, quando introduzido em uma célula hospedeira, é integrado no genoma da célula hospedeira e replicado juntamente com o(s) cromossomo(s) em que foi integrado.

[0116] Um tipo de vetor é um "plasmídeo", que se refere a uma alça de DNA de fita dupla circular na qual segmentos de DNA adicionais podem ser ligados. Um outro tipo de vetor é um vetor viral, em que os segmentos de DNA adicionais podem ser ligados no genoma viral. Determinados vetores são capazes de replicação autônoma em uma célula hospedeira na qual são introduzidos (por exemplo, vetores bacterianos tendo uma origem bacteriana de replicação e vetores epissômicos de mamíferos). Outros vetores (por exemplo, vetores não- epissômicos de mamíferos) são integrados no genoma de uma célula hospedeira quando da introdução na célula hospedeira, e assim são replicados juntamente com o genoma do hospedeiro. Além disso, determinados vetores são capazes de dirigir a expressão de genes aos quais estão ligados operativamente. Estes vetores são aqui referidos como "vetores de expressão". Em geral, os vetores de expressão de utilidade em técnicas de DNA recombinante estão muitas vezes na forma de plasmídeos. Os termos "plasmídeo"e "vetor" podem ser utilizados intercambiavelmente neste documento na medida em que o plasmídeo é a forma mais comumente utilizada de vetor. No entanto, a invenção destina-se a incluir outras formas de vetores de expressão, tais como cosmídeos, vetores virais (por exemplo, os retrovírus de replicação defeituosa, adenovírus e vírus adenoassociados) e vetores de fagos, que servem funções equivalentes.

[0117] Para a maioria de fungos e leveduras filamentosos, o construto de vetor de expressão é, preferencialmente, ou integrado no genoma da célula hospedeira de forma a obter transformantes estáveis. No entanto, para certas leveduras vetores epissomais também adequados que estão disponíveis no construto de expressão podem ser incorporados para expressão estável e de alto nível, os exemplos destes incluem vetores derivados de plasmídeos de 2 μ e pKD1 de Saccharomyces e Kluyveromyces, respectivamente, ou vetores contendo uma sequência AMA (por exemplo, AMA1 de Aspergillus). No caso dos construtos de expressão serem integrados no genoma das células hospedeiras, os construtos são integrados em loci aleatório no genoma ou em loci alvos predeterminados usando recombinação homóloga, caso em que os loci alvo compreende preferencialmente um gene altamente expresso.

[0118] Consequentemente, vetores de expressão úteis na presente invenção incluem vetores cromossômicos, epissomalis e derivados de vírus, por exemplo, vetores derivados de plasmídeos bacterianos, bacteriófagos, epissoma de leveduras, elementos cromossômicos de levedura, vírus tais como baculovírus, vírus Papova, vírus vaccinia, adenovírus, vírus pox de aves, vírus da pseudorraiva e retrovírus, e vetores derivados de combinações dos mesmos, tais como os derivados de plasmídeos e de elementos genéticos de bacteriófagos, tais como cosmídeos e fagomídeos.

[0119] Vetores de acordo com a invenção podem ser utilizados in vitro, por exemplo, para a produção de RNA ou utilizado para transfectar ou transformar uma célula hospedeira. O vetor de expressão recombinante pode ser transcrito e traduzido in vitro, por exemplo, usando sequências reguladoras do promotor T7 e polimerase T7.

[0120] Um vetor da invenção pode compreender dois ou mais, por exemplo, três, quatro ou cinco polinucleotídeos da presente invenção, por exemplo, para superexpressão.

[0121] Os vetores de expressão recombinantes da invenção compreendem um ácido nucleico da invenção em uma forma adequada para expressão do ácido nucleico em uma célula hospedeira, o que significa que o vetor de expressão recombinante inclui uma ou mais sequências reguladoras selecionadas com base nas células hospedeiras a serem utilizadas para a expressão, o qual está operativamente ligado à sequência de ácido nucleico a ser expressa.

[0122] Dentro de um vetor, tal como um vetor de expressão "operativamente ligado" quer dizer que a sequência de nucleotídeos de interesse está ligada à(s) sequência(s) reguladora(s) de um modo que permite a expressão da sequência de nucleotídeos (por exemplo, em um sistema de transcrição/tradução in vitro ou em uma célula hospedeira quando o vetor é introduzido na célula hospedeira), ou seja, o termo "operativamente ligado" refere-se a uma justaposição em que os componentes descritos estão em uma relação que lhes permite funcionar na sua forma pretendida. Uma sequência reguladora, tal como um promotor, potenciador ou outro sinal de regulação de expressão "operativamente ligado" a uma sequência de codificação está posicionada de tal forma que a expressão da sequência de codificação é conseguida em condições compatíveis com as sequências de controle ou as sequências estão arranjadas de modo que elas funcionam em conjunto para seu propósito pretendido, por exemplo, a transcrição inicia-se no promotor e prossegue através da sequência de DNA que codifica o polipeptídeo.

[0123] Um vetor ou construto de expressão para uma determinada célula hospedeira pode assim compreender os seguintes elementos operativamente ligados uns aos outros em uma ordem consecutiva desde a extremidade 5'à extremidade 3' em relação à fita de codificação da sequência que codifica o polipeptídeo da primeira invenção: (1) uma sequência promotora capaz de dirigir a transcrição da sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo na dada célula hospedeira, e (2) opcionalmente, uma sequência sinal capaz de dirigir a secreção do polipeptídeo a partir da célula hospedeira dada em um meio de cultura; (3) uma sequência de DNA da invenção codifica uma forma madura e, preferencialmente, ativa do polipeptídeo com atividade de celulase reforço e, preferencialmente, também (4) uma região de terminação de transcrição (terminadora) capaz de terminar a transcrição jusante da sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo.

[0124] A jusante da sequência de nucleotídeos de acordo com a invenção, esta pode ser a região não traduzida 3' contendo um ou mais sítios de terminação da transcrição (por exemplo, um terminador). A origem do terminador é menos crítica. O terminador pode, por exemplo, ser nativo para a sequência de DNA que codifica o polipeptídeo. No entanto, preferencialmente, um terminador de levedura é usado em células hospedeiras de levedura e um terminador de fungo filamentoso é usado em células hospedeiras de fungos filamentosos. Mais preferencialmente, o terminador é endógeno para a célula hospedeira (na qual a sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo deve ser expressa). Na região transcrita, um sítio de ligação ao ribossoma para a tradução pode estar presente. A porção codificante dos transcritos maduros expressos pelas construções incluirá uma tradução iniciando por AUG no começo e um códon de terminação adequadamente posicionado na extremidade do polipeptídeo a ser traduzido.

[0125] A expressão intensificada do polinucleotídeo da invenção pode também ser conseguida através da seleção de regiões reguladoras heterólogas, por exemplo, promotor, líder de secreção e/ou as regiões terminadoras que podem servir para aumentar a expressão e, se desejado, os níveis de secreção do polipeptídeo de interesse a partir do hospedeiro de expressão e/ou para proporcionar o controle indutível da expressão de um polipeptídeo da presente invenção.

[0126] Será apreciado por aqueles versados na técnica que o projeto do vetor de expressão pode depender de fatores tais como a escolha da célula hospedeira a ser transformada, o nível de expressão do polipeptídeo desejado, etc.. Os vetores, tais como vetores de expressão, da presente invenção podem ser introduzidos nas células hospedeiras para, assim, produzirem proteínas ou peptídeos codificados por ácidos nucleicos como aqui descrito (por exemplo, polipeptídeos TEMER07589, formas mutantes de polipeptídeos TEMER07589, fragmentos, variantes ou equivalentes funcionais dos mesmos. Os vetores, tais como vetores de expressão recombinante, da presente invenção podem ser projetados para a expressão de polipeptídeos TEMER07589 em células procarióticas ou eucarióticas.

[0127] Por exemplo, polipeptídeos TEMER07589 podem ser expressos em células bacterianas tais como E. coli, células de inseto (usando vetores de expressão de baculovírus), fungos filamentosos, células de leveduras ou células de mamíferos. As células hospedeiras adequadas são discutidas ainda em Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990). Exemplos representativos de hospedeiros adequados são descritos a seguir.

[0128] Meios de cultura e condições apropriados para as células hospedeiras acima descritas são conhecidos na técnica.

[0129] O termo "sequências de controle" ou "sequências reguladoras"é aqui definido de modo a incluir, pelo menos, qualquer componente que possa ser necessário e/ou vantajoso para a expressão de um polipeptídeo. Qualquer sequência de controle pode ser nativa ou estranha à sequência de ácido nucleico da presente invenção que codifica um polipeptídeo. Tais sequências de controle podem incluir, mas não estão limitados a, um promotor, um líder, sequências de iniciação de tradução ideais (como descrito em Kozak, 1991, J. Biol. Chem. 266:19867-19870), uma sequência sinal de secreção, uma sequência de pró-peptídeo, uma sequência de poliadenilação, um terminador da transcrição. No mínimo, as sequências de controle normalmente incluem um promotor, e sinais de paragem de transcrição e tradução. Tal como estabelecido acima, o termo "operativamente ligado"é aqui definido como uma configuração na qual uma sequência de controle é adequadamente colocada em uma posição em relação à sequência de codificação da sequência de DNA de tal forma que a sequência de controle dirige a produção de um polipeptídeo.

[0130] As sequências de controle podem ser fornecidas com ligantes para o propósito de introduzir sítios de restrição específicos que facilitam a ligação das sequências de controle com a região de codificação da sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo. O termo "operativamente ligado"é aqui definido como uma configuração em que a sequência de controle é adequadamente colocada em uma posição em relação à sequência de codificação da sequência de DNA de tal forma que a sequência de controle dirige a produção de um polipeptídeo.

[0131] A sequência de controle pode ser uma sequência promotora adequada, uma sequência de ácido nucleico, que é reconhecida por uma célula hospedeira para a expressão da sequência de ácido nucleico. A sequência do promotor contém sequências de controle da transcrição, que medeiam a expressão do polipeptídeo. O promotor pode ser qualquer sequência de ácido nucleico, que mostra a atividade transcripcional na célula, incluindo mutantes, truncados, e promotores híbridos, e podem ser obtidos a partir de genes que codificam polipeptídeos extracelulares ou intracelulares ou homólogos ou heterólogos para a célula.

[0132] A sequência de controle pode também ser uma sequência de terminação da transcrição adequada, uma sequência reconhecida por uma célula filamentosa fúngica para terminar a transcrição. A sequência de terminação está operativamente ligada ao terminal 3' da sequência de ácido nucleico que codifica o polipeptídeo. Qualquer terminador, que é funcional na célula pode ser utilizado na presente invenção.

[0133] A sequência de controle pode ser também um terminador. Terminadores preferidos para células fúngicas filamentosas são obtidos dos genes que codificam a amilase de A. oryzae TAKA, glucoamilase de A. niger (glaA), A. nidulans antranilato sintase, A. niger alfa-glucosidase, gene trpC e protease tipo tripsina de Fusarium oxysporum.

[0134] A sequência de controle pode também ser uma sequência líder apropriada, uma região não traduzida de um RNAm que é importante para a tradução pela célula filamentosa fúngica. A sequência líder está operativamente ligada ao terminal 5' da sequência de ácido nucleico que codifica o polipeptídeo. Qualquer sequência líder que é funcional na célula pode ser utilizada na presente invenção. Líderes preferidos para células fúngicas filamentosas são obtidos dos genes que codificam amilase de A. oryzae TAKA e A. nidulans triose fosfato isomerase e A. niger glaA.

[0135] Outras sequências de controle podem ser isoladas a partir do gene IPNS de Penicillium, ou gene pcbC, o gene da beta-tubulina. Todas as sequências de controle citadas no documento WO 01/21779 são incorporadas aqui por referência.

[0136] A sequência de controle pode também ser uma sequência de poliadenilação, uma sequência que está operativamente ligada ao terminal 3' da sequência de ácido nucleico, e que, quando transcrita, é reconhecida por célula de fungo filamentosa como um sinal para adicionar resíduos de poliadenosina para mRNA transcrito. Qualquer sequência de poliadenilação, que é funcional na célula, pode ser utilizada na presente invenção. Sequências de poliadenilação preferidas para as células fúngicas filamentosas são obtidas dos genes que codificam amilase de A. oryzae TAKA, A. niger, glucoamilase de A. nidulans antranilato sintase, protease tipo tripsina de Fusarium oxysporum e A. niger alfa- glucosidase.

[0137] Quando o polipeptídeo de acordo com a invenção deve ser secretado a partir da célula hospedeira para o meio de cultura, uma sequência sinal apropriada pode ser adicionada ao polipeptídeo, a fim de dirigir o polipeptídeo sintetizado de novo para a via de secreção da célula hospedeira. A pessoa versada na técnica sabe qual a escolha de uma sequência sinal adequada para o hospedeiro específico. A sequência sinal pode ser natural para a célula hospedeira, ou pode ser estranha para a célula hospedeira. Como um exemplo, uma sequência sinal a partir de um polipeptídeo nativo para a célula hospedeira pode ser utilizada. Preferencialmente, o dito polipeptídeo nativo é um polipeptídeo altamente secretado, ou seja, um polipeptídeo que é secretado em quantidades superiores a 10% da quantidade total de polipeptídeo a ser secretado. As sequências sinais preferencialmente utilizadas de acordo com a invenção são, por exemplo: pmeA.

[0138] Como uma alternativa para uma sequência sinal, o polipeptídeo da presente invenção pode ser fundido a um polipeptídico transportador secretado, ou parte do mesmo. Esse construto quimérico é dirigido via de secreção por meio da sequência sinal do polipeptídeo transportador, ou parte do mesmo. Além disso, o polipeptídeo transportador irá proporcionar um efeito estabilizador para o polipeptídeo de acordo com a invenção e/ou pode aumentar a solubilidade. Tal polipeptídeo transportador pode ser qualquer polipeptídeo. Preferencialmente, um polipeptídeo altamente secretado é usado como um polipeptídeo transportador. O polipeptídeo transportador pode ser natural ou estranho ao polipeptídeo de acordo com a invenção. O polipeptídeo transportador pode ser nativo ou pode ser estranho para a célula hospedeira. Exemplos de polipeptídeos transportadores são glucoamilase, sequência pré-pró de fator de alfa-acasalamento, domínio de ligação à celulose de proteína A de ligação à celulose de Clostridium cellulovorans, glutationa S-transferase, um domínio de ligação a quitina de quitinase A1 de Bacillus circulans, domínio de ligação à maltose codificado pelo gene de malE E. coli K12, beta-galactosidase e fosfatase alcalina. Um polipeptídeo transportador preferido para a expressão de tal construto quimérico em células de Aspergillus é glucoamilase. A proteína e polipeptídeo transportador pode conter um motivo de aminoácido específico para facilitar o isolamento do polipeptídeo; o polipeptídeo de acordo com a invenção pode ser liberado por um agente de liberação especial. O agente de liberação pode ser uma enzima proteolítica ou um agente químico. Um exemplo de tal motivo de aminoácido é o sítio de clivagem de protease KEX, que é bem conhecido para o versado na técnica.

[0139] Uma sequência sinal pode ser utilizada para facilitar a secreção e isolamento de uma proteína ou polipeptídeo da presente invenção. As sequências sinais são tipicamente caracterizadas por um núcleo de aminoácidos hidrofóbicos, os quais são geralmente clivados da proteína madura durante a secreção em um ou mais ventos de clivagem. Tais peptídeos sinais de processamento contêm sítios que permitem a clivagem da sequência sinal a partir das proteínas maduras à medida que passam através da via secretora. A sequência sinal dirige a secreção da proteína, tal como a partir de um hospedeiro eucariótico para o qual o vetor de expressão é transformado, e a sequência sinal é clivada subsequentemente ou simultaneamente. A proteína pode então ser prontamente purificada a partir do meio extracelular por métodos conhecidos. Alternativamente, a sequência sinal pode ser ligada à proteína de interesse utilizando uma sequência, o que facilita a purificação, tal como com um domínio de GST. Assim, por exemplo, a sequência que codifica o polipeptídeo pode ser fundida com uma sequência marcadora, tal como uma sequência que codifica um peptídeo, o que facilita a purificação do polipeptídeo fundido. Em certas modalidades preferidas deste aspecto da invenção, a sequência marcadora é um peptídeo de hexa-histidina, tal como o tag (identificador) fornecido em um vetor pQE (Qiagen, Inc.), entre outros, muitos dos quais estão disponíveis comercialmente. Como descrito em Gentz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:821-824 (1989), por exemplo, hexa- histidina fornece a purificação conveniente da proteína de fusão. O tag HA é um outro peptídeo útil para a purificação, que corresponde a um epítopo derivado da proteína hemaglutinina da gripe, a qual foi descrita por Wilson et al., Cell 37:767 (1984), por exemplo.

[0140] Preferencialmente, uma proteína de fusão TEMER07589 da invenção é produzida por técnicas de DNA recombinante. Por exemplo, os fragmentos de DNA que codificam as diferentes sequências de polipeptídeos são ligados uns aos outros na estrutura, de acordo com técnicas convencionais, por exemplo, através do emprego de terminais com extremidade romba ou extremidade escalonada para ligação, digestão com enzimas de restrição para fornecer terminais apropriados, preenchimento de extremidades coesivas conforme apropriado, tratamento com fosfatase alcalina para evitar junção indesejável, e ligação enzimática. Em uma outra modalidade, o gene de fusão pode ser sintetizado por técnicas convencionais incluindo sintetizadores de DNA automatizados. Como alternativa, a amplificação por PCR de fragmentos de genes pode ser realizada utilizando iniciadores de ancoragem que dão origem a protusões complementares entre dois fragmentos de genes consecutivos que podem subsequentemente ser recozidos e reamplificados para gerar uma sequência de gene quimérico (ver, por exemplo, Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al. eds John Wiley & Sons:1992). Além disso, muitos vetores de expressão estão comercialmente disponíveis já que codificam uma fração da fusão (por exemplo, um polipeptídeo GST). Um ácido nucleico que codifica TEMER07589 pode ser clonado em tal vetor de expressão de modo que a fração de fusão esteja ligada na estrutura com a proteína TEMER07589.

[0141] Preferencialmente, a eficiência de integração alvo no genoma da célula hospedeira, isto é, a integração no locus alvo predeterminado, é aumentada pela capacidade aumentada de recombinação homóloga na célula hospedeira. Tal fenótipo da célula envolve, preferencialmente, um gene hdfA ou hdfB deficiente, tal como descrito em WO2005/095624. O WO2005/095624 descreve um método preferido para se obter uma célula filamentosa fúngica compreendendo uma maior eficiência de integração alvo.

[0142] Opcionalmente, a célula hospedeira compreende uma resposta de proteína desdobrada elevada (UPR) em comparação com a célula de tipo selvagem para intensificar a capacidade de produção de um polipeptídeo de interesse. UPR pode ser aumentado por técnicas descritas nos documentos US2004/0186070A1 e/ou US2001/0034045A1 e/ou WO01/72783A2 e/ou WO2005/123763. Mais especificamente, o nível de proteína de HAC1 e/ou IRE1 e/ou PTC2 foi modulado, e/ou a proteína SEC61 foi projetada de forma a obter uma célula hospedeira tendo uma elevada UPR.

[0143] Em alternativa, ou em combinação com uma elevada UPR, a célula hospedeira é geneticamente modificada para se obter um fenótipo exibindo expressão inferior da protease e/ou secreção da enzima em comparação com a célula de tipo selvagem, a fim de aumentar a capacidade de produção de um polipeptídeo de interesse. O fenótipo pode ser obtido por delecção e/ou modificação e/ou inativação de um regulador transcricional da expressão de proteases. Esse regulador transcricional é, por exemplo, prtT. Ao abaixar a expressão de proteases por modulação de prtT pode ser realizado por técnicas descritas no documento US2004/0191864A1.

[0144] Em alternativa, ou em combinação com uma UPR elevada e/ou um fenótipo exibindo expressão inferior da protease e/ou secreção da protease, a célula hospedeira exibe um fenótipo de oxalato deficiente de modo a aumentar o rendimento de produção de um polipeptídeo de interesse. Um fenótipo de oxalato deficiente pode ser obtido por meio de técnicas descritas no documento WO2004/070022A2.

[0145] Em alternativa, ou em combinação com um UPR elevada e/ou um fenótipo exibindo expressão inferior da protease e/ou secreção de protease e/ou deficiência de oxalato, a célula hospedeira exibe uma combinação de diferenças fenotípicas em comparação com a célula selvagem para aumentar o rendimento da produção do polipeptídeo de interesse. Estas diferenças podem incluir, mas não se limitam a, baixa expressão de glucoamilase e/ou alfa-amilase A neutra e/ou alfa-amilase B neutra, protease, e hidrolase de ácido oxálico. Ditas diferenças fenotípicas apresentadas pela célula hospedeira podem ser obtidas por modificação genética de acordo com as técnicas descritas no documento US2004/0191864A1.

[0146] Em alternativa, ou em combinação com uma UPR elevada e/ou um fenótipo exibindo expressão de protease inferior e/ou secreção de protease e/ou deficiência de oxalato e uma combinação de diferenças fenotípicas em comparação com a célula selvagem para aumentar o rendimento de produção do polipeptídeo de interesse, a célula hospedeira exibe uma deficiência nos genes de toxinas, desativando a capacidade da célula hospedeira de fungos filamentosos para expressar toxinas. Essas toxinas incluem, mas não estão limitadas a, ocratoxinas, fumonisinas, ácido ciclapiazônico, ácido 3-nitropropiônico, emodina, malformina, aflatoxinas e ácidos secalônico. Tal deficiência é preferencialmente tal como descrito em WO2000/039322.

(Super)expressão

[0147] Em uma modalidade preferida, os polinucleotídeos da presente invenção, tal como aqui descritos, podem ser superexpressos em uma cepa microbiana da invenção em comparação com a cepa microbiana de origem em que o referido gene não é superexpresso. A superexpressão de uma sequência de polinucleotídeos é aqui definida como a expressão do gene da referida sequência que resulta em uma atividade da enzima codificada pela dita sequência em uma cepa microbiana tendo, pelo menos, cerca de 1,5 vezes a atividade da enzima no micróbio de origem, preferencialmente, a atividade da dita enzima é pelo menos cerca de 2 vezes, mais preferencialmente, pelo menos cerca de 3 vezes, mais preferencialmente, pelo menos cerca de 4 vezes, mais preferencialmente, pelo menos cerca de 5 vezes, ainda mais preferencialmente, pelo menos cerca de 10 vezes e mais preferencialmente pelo menos cerca de 20 vezes a atividade da enzima microbiana de origem.

[0148] O vetor pode ainda incluir sequências que flanqueiam o polinucleotídeo dando origem a RNA que compreende sequências homólogas a sequências genômicas eucarióticas ou sequências genômicas virais. Isso permitirá a introdução dos polinucleotídeos da invenção no genoma de uma célula hospedeira.

[0149] Um vetor de clonagem integrativo pode se integrar de forma aleatória ou a uma locus alvo predeterminado no cromossomo(s) da célula hospedeira na qual vai ser integrado. Em uma modalidade preferida da presente invenção, um vetor de clonagem integrador pode compreender um fragmento de DNA que é homólogo a uma sequência de DNA no locus de um alvo predeterminado, no genoma da célula hospedeira para direcionar a integração do vetor de clonagem para esse locus predeterminado. A fim de promover a integração alvo, o vetor de clonagem pode ser preferencialmente linearizado antes da transformação da célula hospedeira. A linearização pode preferencialmente ser realizada de tal modo que pelo menos um, mas preferencialmente, ambas as extremidades do vetor de clonagem sejam flanqueadas por sequências homólogas ao locus alvo. O comprimento das sequências homólogas que flanqueiam o locus alvo é, preferencialmente, pelo menos cerca de 0,1 kb, tal como cerca de pelo menos 0,2kb, mais preferencialmente pelo menos cerca de 0,5 kb, ainda mais preferencialmente pelo menos cerca de 1 kb, mais preferencialmente pelo menos cerca de 2 kb. Preferencialmente, as cepas hospedeiras de origem podem ser modificadas para uma melhor frequência de integração do DNA alvo, tal como descrito no WO05/095624 e/ou WO2007/115886.

[0150] O exemplo de deleção fornecida na presente invenção, utiliza o promotor do gene como flanco-5' e o gene como o flanco-3' para inserir um marcador de seleção entre o promotor e o gene, assim rompendo (isto é, inativando funcionalmente) o gene de transcrição. As sequências de genes acima referidas podem ser usadas para fazer genes inativados funcionalmente semelhantes. Os genes podem ser divididos em dois, fornecendo um flanco-5' e um flanco-3', mas o gene também pode ser utilizado para clonar um pedaço maior de DNA genômico que contém as regiões terminadoras do gene e promotor, o que não pode funcionar como flanco-5'e um flanco- 3'.

[0151] O sistema de vetor pode ser um vetor, tal como um plasmídeo único, ou dois ou mais vetores, tais como dois ou mais plasmídeos, que em conjunto contêm o DNA total a ser introduzido no genoma da célula hospedeira.

[0152] O vetor pode conter um polinucleotídeo da invenção orientado em uma direção antisense para fornecer a produção de RNA antisense.

[0153] O vetor de DNA pode ser introduzido em células procarióticas ou eucarióticas através de transformação convencional ou técnicas de transfecção. Como utilizado aqui, os termos "transformação"e "transfecção" são destinados para se referir a uma variedade de técnicas reconhecidas na técnica para a introdução de ácido nucleico estranho (por exemplo, DNA) em uma célula hospedeira, incluindo copprecipitação de fosfato de cálcio ou cloreto de cálcio, transfecção mediada por DEAE-dextrano, transdução, infecção, lipofecção, transfecção mediada por lipídeos catiônicos ou eletroporação. Os métodos adequados para transformação ou transfecção de células hospedeiras podem ser encontrados em Sambrook, et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2° ed Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989), Davis et al, Basic Methods in Molecular Biology (1986) e outros manuais de laboratório.

[0154] Para a transfecção estável de células de mamífero, sabe-se que, dependendo do vetor de expressão e da técnica de transfecção usada, apenas uma pequena fração das células pode integrar o DNA estranho no seu genoma. De modo a identificar e selecionar estes integrantes, um gene que codifica um marcador selecionável (por exemplo, de resistência a antibióticos) é geralmente introduzido nas células hospedeiras, juntamente com o gene de interesse. Os marcadores selecionáveis preferidos incluem, mas não estão limitados a, aqueles que conferem resistência a fármacos ou que complementam um defeito na célula hospedeira. Eles incluem, por exemplo, os genes marcadores versáteis que podem ser usados para a transformação da maioria dos fungos e leveduras filamentosos, tais como genes de acetamidase ou cDNAs (os genes amdS, niaD, facD ou cDNAs de A. nidulans, A. oryzae ou A. niger) ou genes que fornecem resistência à antibióticos tais como resistência a G418, higromicina, bleomicina, canamicina, metotrexato, fleomicina orbenomíla (benA). Alternativamente, os marcadores de seleção específicos podem ser utilizados como marcadores auxotróficos que requerem cepas hospedeiras mutantes correspondentes: por exemplo, URA3 (de S. cerevisiae ou genes análogos de outras leveduras), pyrG ou pyrA (de A. nidulans ou A. niger), argB (de A. nidulans ou A. niger) ou trpC. Em uma modalidade preferida, o marcador de seleção é deletado a partir da célula hospedeira transformada após introdução do construto de expressão de modo a obter células hospedeiras transformadas capazes de produção do polipeptídeo, que são livres de genes marcadores de seleção.

[0155] Outros marcadores incluem ATP sintetase, subunidade 9 (oliC), orotidina-5'-fosfatodescarboxilase (pvrA), o gene de resistência bacteriana G418 (este também pode ser utilizado em leveduras, mas não em fungos), o gene de resistência a ampicilina (E. coli ), o gene de resistência a neomicina (Bacillus), o gene de resistência a nourseotricina nat1 de Streptomyces nursei, o gene de resistência a piritiamina PTRA de Aspergillus oryzae e o gene de E. coli uidA, que codifica a β-glucuronidase (GUS). Os vetores podem ser usados in vitro, por exemplo, para a produção de RNA ou utilizados para transfectar ou transformar uma célula hospedeira.

[0156] A expressão de proteínas em procarióticos é geralmente realizada em E. coli com vetores contendo promotores constitutivos ou induzíveis dirigindo a expressão de proteínas de fusão ou não fusão. Os vetores de fusão adicionam um número de aminoácidos de uma proteína codificada no mesmo, por exemplo, para o terminal amino da proteína recombinante. Tais vetores de fusão tipicamente servem três propósitos: 1) para aumentar a expressão de proteína recombinante, 2) para aumentar a solubilidade da proteína recombinante, e 3) para auxiliar na purificação da proteína recombinante ao atuar como um ligante na purificação por afinidade. Muitas vezes, nos vetores de expressão de fusão, um sítio de clivagem proteolítica é introduzido na junção da fração de fusão e proteína recombinante para permitir a separação da proteína recombinante a partir da fração de fusão posterior para a purificação da proteína de fusão.

[0157] Como indicado, os vetores de expressão contêm preferencialmente marcadores selecionáveis. Esses marcadores incluem di-hidrofolato redutase ou resistência à neomicina para cultura de células eucarióticas e resistência a tetraciclina ou ampicilina para cultura em E. coli e outras bactérias.

[0158] Os vetores preferidos para uso em bactérias, por exemplo, são descritos em WO-A1-2004/074468, os quais são aqui incluídos por referência. Outros vetores apropriados serão prontamente evidentes para um versado na matéria.

[0159] Para secreção da proteína traduzida para o lúmen do retículo endoplasmático, para o espaço periplasmático ou para o meio extracelular, o sinal de secreção adequado pode ser incorporado no polipeptídeo expresso. Os sinais podem ser endógenos ao polipeptídeo ou podem ser sinais heterólogos.

[0160] O polipeptídeo TEMER07589 pode ser expresso em uma forma modificada, tal como uma proteína de fusão, e pode incluir não só sinais de secreção, mas também regiões funcionais heterólogas adicionais. Assim, por exemplo, uma região de aminoácidos adicionais, particularmente aminoácidos com carga, pode ser adicionada ao terminal-N do polipeptídeo para melhorar a estabilidade e persistência na célula hospedeira, durante a purificação, ou durante o subsequente manuseamento e armazenagem. Além disso, as frações de peptídeo podem ser adicionadas ao polipeptídeo para facilitar a purificação.

[0161] A invenção fornece um polipeptídeo isolado tendo a sequência de aminoácidos de acordo com SEQ ID NO: 2, e uma sequência de aminoácidos obtida por expressão do polinucleotídeo de SEQ ID NO: 1, em um hospedeiro apropriado. Também, um peptídeo ou polipeptídeo compreendendo uma variante dos polipeptídeos acima referidos, tais como um equivalente funcional, está compreendido na presente invenção. Os polipeptídeos acima referidos estão coletivamente compreendidos no termo "polipeptídeos de acordo com a invenção".

[0162] O termo "peptídeo variante" ou "polipeptídeo variante"é definido aqui como um peptídeo ou polipeptídeo, respectivamente, compreendendo uma ou mais alterações, tais como substituições, inserções, deleções e/ou truncamentos de um ou mais resíduos de aminoácidos específicos em uma ou mais posições específicas do peptídeo ou polipeptídeo, respectivamente. Deste modo, um peptídeo sinal variante é um peptídeo sinal constituído por uma ou mais alterações, tais como substituições, inserções, deleções e/ou truncamentos de um ou mais resíduos de aminoácidos específicos em uma ou mais posições específicas do peptídeo sinal.

[0163] O termo "polinucleotídeo" é idêntico ao termo "molécula de ácido nucleico" e pode ser lido aqui intercambiavelmente. O termo refere-se a uma molécula de polinucleotídeo, que é um ácido ribonucleico (RNA) ou ácido desoxirribonucleico (DNA), ou de fita simples ou de fita dupla. Um polinucleotídeo pode tanto estar presente na sua forma isolada, quanto estar compreendido em moléculas ou vetores recombinantes de ácidos nucleicos, ou estar compreendido em uma célula hospedeira.

[0164] O "polinucleotídeo variante"é definido aqui como um polinucleotídeo que compreende uma ou mais alterações, tais como substituições, inserções, deleções e/ou truncamentos de um ou mais nucleotídeos em uma ou mais posições específicas no polinucleotídeo.

[0165] Os termos "peptídeo"e "oligopeptídeo" são considerados sinônimos (conforme é comumente reconhecido) e cada termo pode ser usado indiferentemente, conforme o contexto requer para indicar uma cadeia de pelo menos dois aminoácidos acoplados através de ligações peptídicas. A palavra "polipeptídeo" é usada aqui para cadeias contendo mais do que sete resíduos de aminoácidos. Todas as fórmulas de oligopeptídeos e polipeptídeos ou sequências aqui são escritos da esquerda para a direita e na direção do terminal amino para terminal carboxil. O código de uma letra dos aminoácidos usado aqui é comumente conhecido na técnica e pode ser encontrado em Sambrook, et al. (Molecular Cloning:. A Laboratory Manual, 2° ed Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989).

[0166] Por polipeptídeo ou proteína "isolada" quer-se dizer um polipeptídeo ou uma proteína removida do seu ambiente nativo. Por exemplo, polipeptídeos e proteínas produzidos de forma recombinante, expressos em células hospedeiras são considerados isolados para a finalidade da invenção, tal como são os polipeptídeos nativos ou recombinantes que foram substancialmente purificados por qualquer técnica adequada, tal como, por exemplo, o método de purificação de única etapa descrito em Smith e Johnson, Gene 67:31-40 (1988).

[0167] O polipeptídeo intensificador de celulase TEMER07589 de acordo com a invenção pode ser recuperado e purificado a partir de culturas de células recombinantes por métodos conhecidos na técnica. Mais preferencialmente, a cromatografia líquida de alta eficiência ("HPLC") é utilizada para a purificação.

[0168] Os polipeptídeos da presente invenção incluem produtos naturalmente purificados, produtos de procedimentos sintéticos químicos e produtos produzidos por técnicas recombinantes a partir de um hospedeiro procariótico ou eucariótico, incluindo, por exemplo, leveduras, bactérias, plantas superiores, células de insetos e de mamíferos. Dependente do hospedeiro empregado em um processo de produção recombinante, os polipeptídeos da presente invenção podem ser glicosilados ou podem ser não glicosilados. Além disso, os polipeptídeos da presente invenção podem também incluir um resíduo de metionina modificado inicial, em alguns casos como resultado de processos mediados pelo hospedeiro.

[0169] A invenção também inclui fragmentos biologicamente ativos dos polipeptídeos de acordo com a invenção.

[0170] Os fragmentos biologicamente ativos de um polipeptídeo da invenção incluem polipeptídeos que compreendem as sequências de aminoácidos suficientemente idênticas ou derivadas a partir da sequência de aminoácidos do polipeptídeo TEMER07589 (por exemplo, a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2), que incluem menos aminoácidos do que o polipeptídeo de comprimento completo, mas que exibem pelo menos uma atividade biológica do polipeptídeo correspondente de comprimento completo. Tipicamente, os fragmentos biologicamente ativos compreendem um domínio ou motivo com pelo menos uma atividade do polipeptídeo TEMER07589.

[0171] Um fragmento biologicamente ativo de um polipeptídeo da presente invenção pode ser um polipeptídeo que tem, por exemplo, cerca de 10, cerca de 25, cerca de 50, cerca de 100 ou mais aminoácidos de comprimento, ou pelo menos cerca de 100 aminoácidos, pelo menos, 150, 200 , 250, 300, 350, 400 aminoácidos de comprimento, ou um comprimento até ao número total de aminoácidos do polipeptídeo da presente invenção.

[0172] Além disso, outras porções biologicamente ativas, em que outras regiões do polipeptídeo são excluídas, podem ser preparadas por técnicas recombinantes e avaliadas para uma ou mais das atividades biológicas da forma nativa de um polipeptídeo da presente invenção.

[0173] A invenção também inclui fragmentos de ácido nucleico que codificam os fragmentos biologicamente ativos acima do polipeptídeo TEMER07589.

Polipeptídeos

[0174] Em outro aspecto da presente invenção, polipeptídeos TEMER07589 melhorados são fornecidos. Os polipeptídeos TEMER07589 melhorados são polipeptídeos em que pelo menos uma atividade biológica é melhorada. Tais polipeptídeos podem ser obtidos por introdução aleatória de mutações ao longo de toda ou parte da sequência de codificação TEMER07589, tal como por mutagênese de saturação, e os mutantes resultantes podem ser expressos de forma recombinante e rastreados quanto à atividade biológica.

[0175] Variantes melhoradas das sequências de aminoácidos da presente invenção conduzindo a uma função de reforço melhorada da celulase podem ser obtidas pelos genes correspondentes da presente invenção. Entre tais modificações são incluídas: 1. PCR Erro prone para introduzir mutações aleatórias, seguido de um rastreio das variantes obtidas e isolamento de variantes melhoradas com propriedades cinéticas. 2. Família shuffling de variantes relacionadas aos genes codificando a enzima de reforço de celulase, seguido de um rastreio das variantes obtidas e isolamento de variantes com propriedades cinéticas melhoradas.

[0176] Variantes dos genes da presente invenção, levando a um aumento do nível de RNAm e/ou polipeptídeo, resultando na atividade de reforço de celulase podem ser obtidas pelas sequências polinucleotídicas dos referidos genes. Entre tais modificações incluem: 1. Melhorar o uso de códons, de tal modo que os códons sejam (optimamente) adaptados para o hospedeiro microbiano principal. 2. Melhorar o uso de par de códons de tal modo que os códons sejam (optimamente) adaptados para o hospedeiro microbiano principal. 3. Adição de sequências de estabilização para a informação genômica codificando o polipeptídeo de reforço de celulase resultando em moléculas de mRNA com uma meia-vida aumentada.

[0177] Os métodos preferidos para o isolamento de variantes com propriedades catalíticas melhoradas ou níveis aumentados de mRNA ou polipeptídeo são descritos em WO03/010183 e WO03/0131 1. Os métodos preferidos para aperfeiçoar o uso de códon em cepas microbianas principais são descritos em PCT/EP2007/05594. Os métodos preferidos para a adição de elementos estabilizadores para os genes codificando o polipeptídeo de reforço da celulase da invenção são descritos em WO2005/059149.

[0178] Em uma modalidade preferida, o polipeptídeo TEMER07589 tem uma sequência de aminoácidos de acordo com SEQ ID NO: 2. Em outra modalidade, o polipeptídeo TEMER07589 é substancialmente homólogo à sequência de aminoácidos de acordo com SEQ ID NO: 2 e retém pelo menos uma atividade biológica de um polipeptídeo de acordo com a SEQ ID NO: 2, mas difere na sequência de aminoácidos, devido à variação natural ou mutagênese, tal como descrito.

[0179] Em outra modalidade preferida, o polipeptídeo TEMER07589 tem uma sequência de aminoácidos codificada por um fragmento de ácido nucleico isolado capaz de hibridizar com um ácido nucleico de acordo com a SEQ ID NO: 1, preferencialmente em condições de hibridização altamente rigorosas.

[0180] Consequentemente, o polipeptídeo TEMER07589 é preferencialmente um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 76%, pelo menos 77%, pelo menos 78%, pelo menos 79%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais homóloga à sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 2, e, normalmente, pelo menos, retém uma atividade funcional do polipeptídeo de acordo a SEQ ID NO: 2.

[0181] Equivalentes funcionais de um polipeptídeo de acordo com a invenção também podem ser identificados, por exemplo, por rastreio de bibliotecas combinatórias de mutantes, por exemplo, mutantes de truncamento, do polipeptídeo da presente invenção para aumentar a atividade da celulase. Em uma modalidade, uma biblioteca variada de variantes é gerada por mutagênese combinatória ao nível do ácido nucleico. Uma biblioteca variada de variantes pode ser produzida, por exemplo, ligando enzimaticamente uma mistura de oligonucleotídeos sintéticos em sequências de genes de forma que um conjunto degenerado de sequências de polipeptídeo potenciais seja expresso como polipeptídeos individuais, ou alternativamente, como um conjunto de proteínas de fusão maiores (por exemplo, para exibição de fagos). Há uma variedade de métodos que podem ser usados para produzir bibliotecas de variantes potenciais dos polipeptídeos da presente invenção a partir de uma sequência oligonucleotídica degenerada. Métodos para a síntese de oligonucleotídeos degenerados são conhecidos na técnica (vide, por exemplo, Narang (1983) Tetrahedron 39:3; Itakura et al. (1984) Annu Rev. Biochem 53:323; Itakura et al. (1984) Science 198:1056; Ike et al. (1983) Nucleic Acid Res. 11:477).

[0182] Além disso, as bibliotecas de fragmentos da sequência de codificação de um polipeptídeo da presente invenção podem ser usadas para gerar uma população variada de polipeptídeos para o rastreio de uma seleção subsequente de variantes. Por exemplo, uma biblioteca de fragmentos da sequência de codificação pode ser gerada por tratamento de um fragmento de PCR de cadeia dupla da sequência de codificação de interesse com uma nuclease em condições em que corte ocorre apenas cerca de uma vez por cada molécula, a desnaturação do DNA de cadeia dupla, a renaturação do DNA para formar o DNA de cadeia dupla que pode incluir pares sense/antisense a partir de pares diferentes de produtos cortados, removendo porções de cadeia simples de cadeias duplas reformadas, por tratamento com nuclease S1, e ligando a biblioteca de fragmento resultante em um vetor de expressão. Por este método, uma biblioteca de expressão pode ser derivada que codifica fragmentos de terminal N e internos de diversos tamanhos da proteína de interesse.

[0183] Diversas técnicas são conhecidas na técnica para o rastreio de produtos de genes de bibliotecas combinatórias produzidas por mutações pontuais de truncamento, e para o rastreio de bibliotecas de cDNA para produtos de genes que possuem uma propriedade escolhida. As técnicas mais amplamente utilizadas, que são passíveis de análise por rendimento elevado, para o rastreio de grandes bibliotecas de genes normalmente incluem a clonagem da biblioteca de genes em vetores de expressão replicáveis, a transformação de células apropriadas com a biblioteca de vetores resultante, e expressando os genes combinatórios em condições em que a detecção de uma atividade desejada facilita o isolamento do vetor que codifica o gene cujo produto foi detectado. Mutagênese recursiva para conjunto (REM), uma técnica que aumenta a frequência de mutantes funcionais nas bibliotecas, pode ser utilizada em combinação com os ensaios de rastreio para identificar variantes de um polipeptídeo da presente invenção (Arkin and Yourvan (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7811-7815; Delgrave et al. (1993) Protein Engineering 6(3):327-331).

[0184] Além da sequência de gene TEMER07589 mostrada na SEQ ID NO:1, será evidente para o versado na técnica que os polimorfismos da sequência de DNA podem existir dentro de uma determinada população, o que pode conduzir a alterações na sequência de aminoácidos do polipeptídeo TEMER07589. Tais polimorfismos genéticos podem existir em células a partir de diferentes populações ou dentro de uma população devido à variação alélica natural. As variantes alélicas podem também incluir equivalentes funcionais.

[0185] Os fragmentos de um polinucleotídeo de acordo com a invenção podem compreender também polinucleotídeos que codificam polipeptídeos não funcionais. Tais polinucleotídeos podem funcionar como sondas ou iniciadores para a reação de PCR.

[0186] Os ácidos nucleicos de acordo com a invenção, independentemente do fato de eles codificarem polipeptídeos funcionais ou não funcionais, podem ser utilizados como sondas de hibridização ou iniciadores de reação de cadeia de polimerase (PCR). Utilizações das moléculas de ácido nucleico da presente invenção, que não codificam um polipeptídeo possuindo uma atividade TEMER07589 incluem, interalia, (1) isolamento do gene que codifica as variantes de polipeptídeos TEMER07589 ou variantes alélicas de uma biblioteca de cDNA, por exemplo, a partir de micro-organismos apropriados, (2) hibridização in situ (por exemplo, FISH) para propagações de metafase cromossômicas para fornecer a localização cromossômica exata do gene TEMER07589 como descrito em Verma et al., Human Chromosomes: a Manual of Basic Techniques, Pergamon Press, New York (1988); (3) análise por Northern blot para a detecção da expressão de mRNA TEMER07589 em tecidos e/ou células específicos e 4) sondas e iniciadores que podem ser utilizados como uma ferramenta de diagnóstico para analisar a presença de um ácido nucleico hibridizável para a sonda TEMER07589 em uma dada amostra biológica (por exemplo, tecido).

[0187] Um método de obtenção de um equivalente funcional de um gene TEMER07589 também é englobado na presente invenção. Tal método implica a obtenção de uma sonda marcada que inclui um ácido nucleico isolado que codifica toda ou uma porção da sequência de polipeptídeo de acordo com a SEQ ID NO:2 ou uma variante da mesma; rastreio de uma biblioteca de fragmento de ácido nucleico com a sonda marcada, em condições que permitem a hibridização da sonda com fragmentos de ácidos nucleicos na biblioteca, formando assim cadeias duplas de ácido nucleico, e a preparação de uma sequência de gene de comprimento total a partir dos fragmentos de ácidos nucleicos em qualquer cadeia dupla marcada para se obter um gene relacionado com o gene TEMER07589.

[0188] Em uma modalidade, um ácido nucleico TEMER07589 da invenção é pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87 %, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97 %, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou mais homólogo a uma sequência de ácido nucleico mostrada na SEQ ID NO:1 ou o complemento da mesma.

[0189] Ainda são proporcionadas: células hospedeiras compreendendo um polinucleotídeo ou vetor da invenção. O polinucleotídeo pode ser heterólogo ao genoma da célula hospedeira. O termo "heterólogo", normalmente em relação à célula hospedeira, significa que o polinucleotídeo não ocorre naturalmente no genoma da célula hospedeira ou que o polipeptídeo não é naturalmente produzido por essa célula.

[0190] Em outra modalidade, a presente invenção apresenta, por exemplo, células, células hospedeiras transformadas, ou células hospedeiras recombinantes contendo um ácido nucleico englobado pela invenção. Uma "célula transformada" ou "célula recombinante"é uma célula na qual (ou em um antecessor na qual) foi introduzida, por meio de técnicas de DNA recombinante, um ácido nucleico de acordo com a invenção. Ambas as células procarióticas e eucarióticas são incluídas, por exemplo, bactérias, fungos, leveduras e similares, especialmente preferidas são as células de fungos filamentosos, tais como Aspergillus niger ou Talaromyces emersonii.

[0191] Uma célula hospedeira pode ser escolhida que modula a expressão das sequências inseridas ou modifica e processa o produto do gene de um modo específico e desejado. Tais modificações (por exemplo, glicosilação) e processamento (por exemplo, clivagem) de produtos proteicos podem facilitar o funcionamento ótimo da proteína.

[0192] Diversas células hospedeiras têm mecanismos característicos e específicos para o processamento pós- tradução e modificação de proteínas e produtos de genes. Linhagens de células apropriadas ou sistemas hospedeiros conhecidos pelos versados na técnica da biologia molecular e/ou microbiologia podem ser escolhidas para assegurar a modificação desejada e correta e processamento da proteína estranha expressa. Para esta finalidade, as células hospedeiras eucarióticas que possuem o mecanismo celular para o processamento adequado da transcrição primária, glicosilação e fosforilação do produto do gene podem ser utilizadas. Tais células hospedeiras são bem conhecidas na técnica.

[0193] Se desejado, uma célula tal como descrita acima pode ser utilizada para a preparação de um polipeptídeo de acordo com a invenção. Tal método compreende, normalmente, o cultivo de uma célula hospedeira (por exemplo, transformada ou transfectada com um vetor de expressão, tal como descrito acima) em condições para proporcionar a expressão (pelo vetor) de uma sequência de codificação que codifica o polipeptídeo, e, opcionalmente, a recuperação do polipeptídeo expresso. Os polinucleotídeos da presente invenção podem ser incorporados em um vetor recombinante replicável, por exemplo, um vetor de expressão. O vetor pode ser usado para replicar o ácido nucleico em uma célula hospedeira compatível. Desse modo, em uma modalidade adicional, a invenção fornece um método de fabricação de um polinucleotídeo da invenção através da introdução de um polinucleotídeo da invenção em um vetor replicável, introdução do vetor em uma célula hospedeira compatível e crescimento da célula hospedeira em condições que provocam a replicação do vetor. O vetor pode ser recuperado a partir da célula hospedeira.

[0194] Preferencialmente, o polipeptídeo é produzido como uma proteína secretada, no caso em que a sequência de nucleotídeos codificando uma forma madura do polipeptídeo na construção de expressão está operativamente ligada a uma sequência de nucleotídeo codificando uma sequência sinal. Preferencialmente, a sequência sinal é nativa (homóloga) à sequência de nucleotídeos codificando o polipeptídeo. Alternativamente, a sequência sinal é estranha (heteróloga) à sequência de nucleotídeos codificando o polipeptídeo, no caso em que a sequência sinal é preferencialmente endógena à célula hospedeira na qual a sequência de nucleotídeos de acordo com a invenção, é expressa. Exemplos de sequências sinais adequadas para células hospedeiras de levedura são as sequências sinais derivadas de genes de fator-a de levedura. De forma similar, uma sequência sinal adequada para células hospedeiras de fungos filamentosos é, por exemplo, uma sequência sinal derivada de um gene amiloglucosidase (AG) de fungo filamentoso, por exemplo, o gene glaA de A. niger. Isto pode ser utilizado em combinação com o próprio promotor de amiloglucosidase (também denominada (gluco)amilase), bem como em combinação com outros promotores. Sequências sinais híbridas também podem ser utilizadas com o contexto da presente invenção.

[0195] Preferidos sequências guia de secreção heteróloga são aquelas que se originam do gene de amiloglucosidase fúngico (AG) (glaA-ambas as versões de 18 e 24 aminoácidos, por exemplo, de Aspergillus), o gene de fator-α (por exemplo, leveduras Saccharomyces e Kluyveromyces) ou o gene de α- amilase (Bacillus).

[0196] Os vetores podem ser transformados ou transfectados para uma célula hospedeira adequada, tal como descrito acima, para proporcionar a expressão de um polipeptídeo da presente invenção. Este processo pode compreender a cultura de uma célula hospedeira transformada com um vetor de expressão, tal como descrito acima, em condições para proporcionar a expressão pelo vetor de uma sequência de codificação que codifica o polipeptídeo.

Células hospedeiras

[0197] Desse modo, a invenção proporciona células hospedeiras transformadas ou transfectadas com ou compreendendo um polinucleotídeo ou vetor da invenção. Preferencialmente, o polinucleotídeo é transportado em um vetor para a replicação e expressão do polinucleotídeo. As células serão escolhidas para serem compatíveis com o referido vetor e podem, por exemplo, ser procarióticas (por exemplo, bacterianas), células fúngicas, de levedura, ou plantas.

[0198] Um hospedeiro heterólogo também pode ser escolhido em que o polipeptídeo da presente invenção é produzido de uma forma que é substancialmente livre de outras enzimas que degradam a celulose ou degradam a hemicelulose. Isto pode ser obtido pela escolha de um hospedeiro, que normalmente não produz tais enzimas.

[0199] A presente invenção engloba processos para a produção do polipeptídeo da presente invenção por meio de expressão recombinante de uma sequência de DNA codificando o polipeptídeo. Para este efeito, a sequência de DNA da presente invenção pode ser usada para amplificação de genes e/ou troca de sinais de expressão, tais como promotores, sequências sinais de secreção, de modo a permitir a produção econômica do polipeptídeo em uma célula hospedeira homóloga ou heteróloga adequada. Uma célula hospedeira homóloga é uma célula hospedeira que é da mesma espécie ou que é uma variante dentro da mesma espécie que a espécie a partir da qual a sequência de DNA é derivada.

[0200] As células hospedeiras adequadas são preferencialmente micro-organismos procarióticos tais como bactérias ou, mais preferivelmente, organismos eucarióticos, por exemplo, fungos, tais como leveduras ou fungos filamentosos, ou células de plantas. Em geral, as células de levedura são preferidas a células fúngicas, porque são mais fáceis de manipular. No entanto, algumas proteínas são deficientemente secretadas a partir de leveduras, ou em alguns casos não são processadas corretamente (por exemplo, hiperglicosilação em levedura). Nesses casos, um organismo hospedeiro fungíco deve ser selecionado.

[0201] A célula hospedeira pode superexpressar o polipeptídeo e técnicas para a engenharia de superexpressão são bem conhecidas. O hospedeiro pode, assim, ter duas ou mais cópias da codificação do polinucleotídeo (e o vetor pode, assim, ter duas ou mais cópias em conformidade).

[0202] As bactérias do gênero Bacillussão muito adequadas como hospedeiros heterólogos devido à sua capacidade para secretar proteínas para o meio de cultura. Outras bactérias adequadas tais como hospedeiros são as do gênero Streptomyces e Pseudomonas. Uma célula hospedeira de levedura preferida para a expressão da sequência de DNA codificando o polipeptídeo é a de gêneros Saccharomyces, Kluyveromyces, Hansenula, Pichia, Yarrowia, e Schizosaccharomyces.

[0203] Mais preferivelmente, uma célula hospedeira de levedura é selecionada a partir do grupo consistindo em espécies de Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces lactis (também conhecida como Kluyveromyces marxianus var.lactis), Hansenula polymorpha, Pichia pastoris, Yarrowia lipolytica e Schizosaccharomyces pombe.

[0204] As mais preferidas são, no entanto, as células hospedeiras fúngicas (por exemplo, filamentosas). As células hospedeiras fúngicas filamentosas preferidas são selecionadas a partir do grupo consistindo em gêneros Aspergillus, Trichoderma/Hypocrea, Fusarium, Disporotrichum, Penicillium, Acremonium, Neurospora, Thermoascus, Myceliophtora, Sporotrichum, Thielavia, Chryosporium, Fusarium, Humicola, Neurospora e Talaromyces.

[0205] Mais preferivelmente, uma célula hospedeira fúngica filamentosa é uma das espécies que incluem, mas não estão limitadas a, Aspergillus niger, Aspergillus awamori, Aspergillus tubingensis, Aspergillus aculeatus, Aspergillus foetidus, Aspergillus nidulans, Aspergillus japonicus, Aspergillus oryzae e Aspergillus ficuum, Trichoderma reesei/Hypocrea jecorina, Fusarium graminearum, Talaromyces emersonii, Penicillium decumbens, Acremonium alabamense, Neurospora crassa, Myceliophtora thernaophilurri, Sporotrichum cellulophilum, Disporotrichum dimorphosporum, Talaromyces emersonii, Talaromyces stipitatus e Thielavia terrestris.

[0206] As células hospedeiras de acordo com a invenção incluem células de plantas e a invenção, portanto, estende- se a organismos transgênicos, tais como plantas e suas partes, que contêm uma ou mais células da invenção. As células podem expressar heterologamente o polipeptídeo da invenção ou podem conter heterologamente um ou mais dos polinucleotídeos da invenção. A planta transgênica (ou geneticamente modificada) pode, portanto, ter inserido (por exemplo, de modo estável) no seu genoma uma sequência codificando um ou mais dos polipeptídeos da invenção. A transformação de células de plantas pode ser realizada usando técnicas conhecidas, por exemplo, usando um plasmídeo Ti ou Ri de Agrobacterium tumefaciens. O plasmídeo (ou vetor) pode, assim, conter sequências necessárias para infectar uma planta, e derivados dos plasmídeos Ti e/ou Ri podem ser empregados.

[0207] Alternativamente, a infecção direta de uma parte de uma planta, tal como uma folha, raiz ou caule pode ser efetuada. Nesta técnica, a planta a ser infectada pode ser enrolada, por exemplo, através do corte da planta com uma navalha ou perfuração da planta com uma agulha ou esfregando a planta com um abrasivo. A planta enrolada é então inoculada com Agrobacterium. A planta ou parte da planta pode, então, ser crescida em um meio de cultura adequado e deixada desenvolver uma planta madura. A regeneração das células transformadas em plantas geneticamente modificadas pode ser obtida através de técnicas conhecidas, por exemplo, selecionando rebentos transformados utilizando um antibiótico e por subcultura dos rebentos em um meio contendo os nutrientes apropriados, hormônios de plantas e similares.

[0208] A invenção também inclui células que tenham sido modificadas para expressar o polipeptídeo de reforço de celulase da invenção ou uma sua variante. Tais células incluem linhagens de células eucarióticas transientes, ou preferencialmente mais estáveis, tais como células de mamífero ou células de inseto, células eucarióticas inferiores, tais como células fúngicas (por exemplo, filamentosas) e de levedura ou células procarióticas, tais como células bacterianas.

[0209] Além disso, é possível que os polipeptídeos da presente invenção sejam transitoriamente expressos em uma linhagem celular ou em uma membrana, tal como, por exemplo, em um sistema de expressão de baculovírus. Tais sistemas, os quais são adaptados para expressar os polipeptídeos de acordo com a invenção, também estão incluídos dentro do escopo da presente invenção.

[0210] De acordo com a presente invenção, a produção do polipeptídeo da presente invenção pode ser efetuada através da cultura de hospedeiros de expressão microbianos, que tenham sido transformados com um ou mais polinucleotídeos da presente invenção, em um meio de fermentação de nutriente convencional.

Produção de polipeptídeo/enzima

[0211] As células hospedeiras recombinantes de acordo com a invenção podem ser cultivadas usando procedimentos conhecidos na técnica. Para cada combinação de um promotor e uma célula hospedeira, estão disponíveis condições de cultura que conduzem à expressão da sequência de DNA codificando o polipeptídeo. Após atingir a densidade celular desejada ou titulação do polipeptídeo a cultura é interrompida e o polipeptídeo é recuperado utilizando procedimentos conhecidos.

[0212] O meio de fermentação pode compreender um meio de cultura conhecido contendo uma fonte de carbono (glicose, por exemplo, maltose, melaços, amido, celulose, xilano, pectina, um hidrolisado de biomassa lignocelolítico, etc.), uma fonte de nitrogênio (por exemplo, sulfato de amônio, nitrato de amônio, cloreto de amônio, etc.), uma fonte de nitrogênio orgânico (por exemplo, extrato de levedura, extrato de malte, peptona, etc.) e fontes de nutrientes inorgânicos (por exemplo, fosfato, magnésio, potássio, zinco, ferro, etc.) Opcionalmente, um indutor (por exemplo, celulose, pectina, xilano, maltose, maltodextrina ou xilogalacturonano) pode ser incluído.

[0213] A seleção do meio apropriado pode ser baseada na escolha do hospedeiro de expressão e/ou baseada nos requisitos regulatórios da construção de expressão. Tais meios são bem conhecidos para aqueles versados na técnica. O meio pode, se desejado, conter componentes adicionais que favorecem os hospedeiros de expressão transformados em relação a outros micro-organismos potencialmente contaminantes.

[0214] A produção do polipeptídeo pelo hospedeiro transformado (fermentação) pode ser realizada de acordo com qualquer procedimento conhecido. O tempo de produção pode estender-se ao longo de um período de cerca de 0,5 a cerca de 30 dias. Pode ser um processo por batelada contínua ou batelada alimentada, adequadamente a uma temperatura na faixa de 0 a 100°C ou 0 a 80°C, por exemplo, a partir de cerca de 0 a cerca de 60°C e/ou a um valor de pH, por exemplo, a partir de cerca de 2 a cerca de 10, ou de cerca de 3 a cerca de 9. Condições de fermentação preferidas são uma temperatura na faixa de cerca de 20 a cerca de 55°C e/ou a um pH de cerca de 3 a cerca de 5. As condições apropriadas são usualmente selecionadas com base na escolha do hospedeiro de expressão e do polipeptídeo a ser expresso.

[0215] Após a fermentação, se necessário, as células podem ser removidas do caldo de fermentação por meio de centrifugação ou filtração. Após a fermentação ter parado ou após a remoção das células, o polipeptídeo da invenção pode então ser recuperado e, se desejado, purificado e isolado por meios convencionais.

Composições de polipeptídeos/enzima

[0216] A presente invenção proporciona uma composição compreendendo um polipeptídeo da presente invenção e uma celulase e/ou uma hemicelulase e/ou uma pectinase.

[0217] Quando o polipeptídeo da presente invenção é uma celulase, uma composição da presente invenção compreenderá, normalmente, uma hemicelulase e/ou uma pectinase além do polipeptídeo da invenção.

[0218] Quando o polipeptídeo da presente invenção é uma hemicelulase, uma composição da presente invenção compreenderá, normalmente, uma celulase e/ou uma pectinase além do polipeptídeo da invenção.

[0219] Quando o polipeptídeo da presente invenção é uma pectinase, uma composição da presente invenção compreenderá, normalmente, uma celulase e/ou uma hemicelulase, além do polipeptídeo da invenção.

[0220] Uma composição da invenção pode compreender uma, duas ou três ou mais classes de celulase, por exemplo, uma, duas ou todas de uma endo-1,4-β-glucanase (EG), uma exo- celobio-hidrolase (CBH) e β-glucosidase (BGL).

[0221] Uma composição da invenção pode compreender um polipeptídeo que tem a mesma atividade enzimática, por exemplo, o mesmo tipo de atividade celulase, hemicelulase e/ou pectinase tal como o fornecido por um polipeptídeo da presente invenção.

[0222] Uma composição da invenção pode compreender um polipeptídeo, que tem um tipo diferente de atividade de celulase e/ou atividade de hemicelulase e/ou atividade de pectinase do que o fornecido por um polipeptídeo da presente invenção. Por exemplo, uma composição da invenção pode compreender um tipo de atividade de celulase e/ou hemicelulase e/ou atividade de pectinase fornecida por um polipeptídeo da presente invenção e um segundo tipo de atividade de celulase e/ou hemicelulase e/ou atividade de pectinase é fornecida por uma hemicelulase/pectinase adicional.

[0223] Aqui, uma celulase é qualquer polipeptídeo que seja capaz de degradar ou de celulose. Um polipeptídeo que é capaz de degradar a celulose é um que seja capaz de catalisar o processo de quebra de celulose em unidades menores, tanto parcialmente, por exemplo, em celodextrinas, ou completamente em monômeros de glicose. A celulase de acordo com a presente invenção pode dar origem a uma população mista de celodextrinas e monômeros de glicose quando em contato com a celulase. Tal degradação normalmente terá lugar por meio de uma reação de hidrólise.

[0224] Aqui, uma hemicelulase é qualquer polipeptídeo que seja capaz de degradar ou de hemicelulose. Isto é, uma hemicelulase pode ser capaz de degradar ou um ou mais de xilano, glucuronoxilano, arabinoxilano, glucomanano e xiloglucano. Um polipeptídeo que é capaz de degradar uma hemicelulose é um que seja capaz de catalisar o processo de decomposição da hemicelulose em polissacarídeos menores, tanto parcialmente, por exemplo, em oligossacáridos, quanto completamente em monômeros de açúcar, por exemplo, monômeros de açúcar de hexose ou pentose. A hemicelulase de acordo com a presente invenção pode dar origem a uma população mista de oligossacarídeos e monômeros de açúcar, quando em contato com a hemicelulase. Tal degradação normalmente terá lugar por meio de uma reação de hidrólise.

[0225] Aqui, uma pectinase é qualquer polipeptídeo que seja capaz de degradar ou pectina. Um polipeptídeo que é capaz de degradar a pectina é um que seja capaz de catalisar o processo de decomposição da pectina em unidades menores, tanto parcialmente, por exemplo, em oligossacarídeos, quanto completamente em monômeros de açúcar. A pectinase de acordo com a presente invenção pode dar origem a uma população mista de oligossacarídeos e monômeros de açúcar, quando em contato com a pectinase. Tal degradação normalmente terá lugar por meio de uma reação de hidrólise.

[0226] Consequentemente, uma composição da invenção pode compreender qualquer celulase, por exemplo, uma celobio- hidrolase, uma endo-β-1,4-glucanase, uma β-glucosidase ou uma β-(1,3)(1,4)-glucanase.

[0227] Aqui, uma celobio-hidrolase é qualquer polipeptídeo que seja capaz de catalisar a hidrólise de ligações 1,4-β-D-glucosidicas em celulose ou celotetraose, liberando celobiose a partir das extremidades das cadeias. Esta enzima também pode ser referida como celulase 1,4-β- celobiosidase, 1,4-β-celobio-hidrolase, 1,4-β-D-glucano celobio-hidrolase, avicelase, exo-1,4-β-D-glucanase, reforço de exocelulase ou exoglucanase. Isto pode ter o código EC EC 3.2.1.91. As celobio-hidrolases podem ser subdivididas em celobio-hidrolase I (CBH I) e celobio- hidrolase II (CBH II). CBH I é definida como celobio- hidrolase que hidrolisa celulose predominantemente a partir das extremidades redutoras, a divisão de celobiose. CBH II é definida como celobio-hidrolase que hidrolisa celulose de predominantemente a partir das extremidades não redutoras, a divisão de celobiose.

[0228] Aqui, uma endo-β-1,4-glucanase (EC 3.2.1.4) é qualquer polipeptídeo que é capaz de catalisar a endo- hidrólise de ligações 1,4-β-D-glucosidicas em celulose, ou β-D-glucanos cereais. Tal polipeptídeo pode ser também capaz de hidrolisar as ligações-1,4 em β-D-glucanos contendo também ligações-1,3. Esta enzima também pode ser referida como celulase, avicelase, β-1,4-endoglucan hidrolase, β-1,4- glucanase, celulase, carboximetilcelulose, celudextrinase, endo-1,4-β-D-glucanase, endo-1,4-β-D- glucano-hidrolase, endo-1,4-β-glucanase ou endoglucanase. CEA é aqui uma endoglucanase EC 3.2.1.4 que, com base em sua estrutura 3D é classificada sob a família Glicosil Hidrolase 5 (GH5). Atividades conhecidas pelos elementos da família GH5 incluem quitosanase (EC 3.2.1.132); β-manosidase (CE 3.2.1.25); celulase (EC 3.2.1.4); glucano 1,3-β-glucosidase (EC 3.2.1.58); liqueninase (EC 3.2.1.73); glucano endo-1,6-β- glucosidase (EC 3.2.1.75); manana endo-β-1,4-manosidase (EC 3.2.1.78); endo-β-1,4-xilanase (EC 3.2.1.8); celulose β-1,4- celobiosidase (EC 3.2.1.91); endo-β-1,6-galactanase (EC 3.2.1.-); β-1,3-mananase (EC 3.2.1.-); endo-β-1,4-glucanase xiloglucan-específica (EC 3.2.1.151); manana transglicosilase (EC 2.4.1.-). CEB é aqui uma endoglucanase CE 3.2.1.4 que, com base em sua estrutura 3D é classificada sob a família Glicosil Hidrolase 7 (GH7). Atividades conhecidas pelos elementos da família GH7 incluem endo-β- 1,4-glucanase (EC 3.2.1.4); [reduzindo a ação final] celobio-hidrolase (EC 3.2.1.-); quitosanase (CE 3.2.1.132); endo-β-1,3-1,4-glucanase (EC 3.2.1.73).

[0229] Aqui, uma β-glucosidase (BG abreviada) (EC 3.2.1.21) é qualquer polipeptídeo que é capaz de catalisar a hidrólise de resíduos de β-D-glucose não redutores, terminais com a liberação de β-D-glucose. Tal polipeptídeo pode ter uma especificidade ampla para β-D-glucosideos e também pode hidrolisar um ou mais dos seguintes: um β-D- galactosídeo, um α-L-arabinosideo, um β-D-xilosideo, ou um β-D-fucosideo. Esta enzima também pode ser referida como amidalase, β-D-glucosideo gluco-hidrolase, celobiase ou gentiobiase.

[0230] Aqui uma β-(1,3)(1,4)-glucanase (EC 3.2.1.73) é qualquer polipeptídeo que seja capaz de catalisar a hidrólise de ligações 1,4-β-D-glucosidicas em β-D-glucanos contendo ligações-1,3 e 1,4. Tal polipeptídeo pode agir sobre a lequitina e β-D-glucanos cereais, mas não em β-D-glucanos contendo apenas ligações-1,3 ou 1,4. Esta enzima também pode ser referida como liqueninase, 1,3-1,4-β-D-glucan 4-glucano- hidrolase, β-glucanase, endo-β-1,3-1,4 glucanase, liquenase, ou ligação mista de β-glucanase. Uma alternativa para este tipo de enzima é EC 3.2.1.6, que é descrito como endo-1,3(4)- beta-glucanase. Este tipo de enzima hidrolisa ligações 1,3- ou 1,4- em beta-D-glucanos quando o resíduo de glicose cujo grupo de redução está envolvido na ligação a ser hidrolisada é ele próprio substituído em C-3. Os nomes alternativos incluem endo-1,3-beta-glucanase, laminarinase, 1,3-(1,3, 1,4)-beta-D-glucano 3 (4) glucano-hidrolase; os substratos incluem laminarina, liquenina cereal e beta-D-glucanos.

[0231] Uma composição da invenção pode compreender qualquer hemicelulase, por exemplo, uma endoxilanase, uma β- xilosidase, uma α-L-arabionofuranosidase, uma α-D- glucuronidase, uma acetil xilan esterase, uma feruloil esterase, uma cumaroil esterase, uma α-galactosidase, uma β- galactosidase, uma β-mananase ou uma β-manosidase.

[0232] Aqui, uma endoxilanase (EC 3.2.1.8) é qualquer polipeptídeo que seja capaz de catalisar a endo-hidrólise de ligações 1,4-β-D-xilosidicas em xilanos. Esta enzima também pode ser referida como endo-1,4-β-xilanase ou 1,4-β-D-xilan xilan-hidrolase. Uma alternativa é EC 3.2.1.136, uma glucuronoarabinoxilan endoxilanase, uma enzima que é capaz de hidrolisar as ligações 1,4-xilosídicas em glucuronoarabinoxilanos.

[0233] Aqui, uma β-xilosidase (EC 3.2.1.37) é qualquer polipeptídeo que seja capaz de catalisar a hidrólise de 1,4- β-D-xilanos, para remover resíduos de D-xilose sucessivos a partir de resíduos a partir de terminais não redutores. Tais enzimas podem também hidrolisar xilobiose. Esta enzima também pode ser referida como xilan 1,4-β-xilosidase, 1,4- β-D-xilan xilo-hidrolase, exo-1,4-β-xilosidase ou xilobiase.

[0234] Aqui, uma α-L-arabinofuranosidase (EC 3.2.1.55) é qualquer polipeptídeo que é capaz de atuar em α-L- arabinofuranosídeos, α-L-arabinanos contendo ligações (1,2) e/ou (1,3)- e/ou (1,5), arabinoxilanos e arabinogalactanos. Esta enzima também pode ser referida como α-N- arabinofuranosidase, arabinofuranosidase, ou arabinosidase.

[0235] Aqui, uma α-D-glucuronidase (EC 3.2.1.139) é qualquer polipeptídeo que seja capaz de catalisar uma reação da seguinte forma: alfa-D-glucuronosídeo + H(2)O = um álcool + D-glucuronato. Esta enzima também pode ser referida como alfa-glucuronidase ou alfa-glucosiduronase. Estas enzimas também podem hidrolisar ácido glucurônico 4-O-metilado, que também pode estar presente como um substituinte em xilanos. Alternativo é EC 3.2.1.131: xilan alfa-1,2-glucuronosidase, que catalisa a hidrólise de ligações alfa-1,2-(4-O- metil)glucoronosil.

[0236] Aqui, uma acetil xilan esterase de (EC 3.1.1.72) é qualquer polipeptídeo que seja capaz de catalisar a desacetilação de xilanos e xilo-oligossacarídeos. Tal polipeptídeo pode catalisar a hidrólise de grupos acetila a partir de xilano polimérico, xilose acetilada, glucose acetilada, alfa-naftil acetato ou acetato de p-nitrofenila, mas, normalmente, não a partir de triacilglicerol. Tal polipeptídeo normalmente não age em manana acetilada ou pectina.

[0237] Aqui, uma feruloil esterase (EC 3.1.1.73) é qualquer polipeptídeo que seja capaz de catalisar uma reação na forma: feruloil-sacarídeo + H(2)O = ferulato + sacarídeo. O sacarídeo pode ser, por exemplo, um oligossacarídeo ou um polissacarídeo. Pode normalmente catalisar a hidrólise do grupo 4-hidróxi-3-metoxicinamoil (feruloil) a partir de um açúcar esterificado, que está geralmente em arabinose em substratos "naturais", acetato de p-nitrofenol e ferulato de metila são normalmente substratos pobres. Esta enzima também pode ser referida como hidrolase cinamoil éster, esterase de ácido ferúlico ou esterase de hidroxicinamoil. Pode também ser referida como uma enzima acessória de hemicelulase, uma vez que isso pode ajudar xilanases e pectinases a decompor a hemicelulose e pectina de parede celular de planta.

[0238] Aqui, uma cumaroil esterase (EC 3.1.1.73) é qualquer polipeptídeo que seja capaz de catalisar uma reação na forma: cumaroil-sacarídeo + H(2)O = cumarato + sacarídeo. O sacarídeo pode ser, por exemplo, um oligossacarídeo ou um polissacarídeo. Esta enzima também pode ser referida como trans-4-cumaroil esterase, trans-p-cumaroil esterase, p- cumaroil esterase ou esterase de ácido p-cumárico. Esta enzima também é englobada em EC 3.1.1.73, poderá também ser referida como uma feruloil esterase.

[0239] Aqui, uma α-galactosidase (EC 3.2.1.22) é qualquer polipeptídeo que seja capaz de catalisar a hidrólise de resíduos α-D-galactose não redutores, terminais em α-D- galactosídeos, incluindo oligossacarídeos de galactose, galactomananas, galactanos e arabinogalactanos. Tal polipeptídeo pode também ser capaz de hidrolizar α-D- fucosídeos. Esta enzima também pode ser referida como melibiase.

[0240] Aqui, uma β-galactosidase (EC 3.2.1.23) é qualquer polipeptídeo que seja capaz de catalisar a hidrólise dos resíduos β-D-galactose não redutores terminais em β-D- galactosídeos. Tal polipeptídeo pode ser também capaz de hidrolisar α-L-arabinosideos. Esta enzima também pode ser referida como exo-(1 ^4) -3-D-galactanase ou lactase.

[0241] Aqui, uma β-mananase (EC 3.2.1.78) é qualquer polipeptídeo que seja capaz de catalizar a hidrólise aleatória de ligações 1,4-β-D-manosidicas em mananas, galactomananas e glucomananas. Esta enzima também pode ser referida como manana endo-1,4-β-manosidase ou endo-1,4- mananase.

[0242] Aqui, uma β-manosidase (EC 3.2.1.25) é qualquer polipeptídeo que seja capaz de catalisar a hidrólise dos resíduos β-D-manose não redutores terminais em β-D- manosídeos. Esta enzima também pode ser referida como mananase ou manase.

[0243] Uma composição da invenção pode compreender qualquer pectinase, por exemplo, uma endopoligalacturonase, uma esterase de pectina de metila, uma endo-galactanase, uma beta-galactosidase, uma esterase de acetil pectina, uma liase de endo-pectina, liase de pectato, alfa-ramnosidase, uma exo-galacturonase, uma liase de exo-poligalacturonato, uma hidrolase de ramnogalacturonano, uma liase de ramnogalacturonano, uma esterase de acetil ramnogalacturonano, uma galacturono-hidrolase de ramnogalacturonano ou uma xilogalacturonase.

[0244] Aqui, uma endo-poligalacturonase (EC 3.2.1.15) é qualquer polipeptídeo que seja capaz de catalisar a hidrólise aleatória de ligações 1,4-a-D-galactosidurônicas em pectato e outros galacturonanos. Esta enzima também pode ser referida como despolimerase de poligalacturonase de pectina, pectinase, endopoligalacturonase, pectolase, hidrolase de pectina, poligalacturonase de pectina, glicano-hidrolase de poli-a-1,4-galacturonídeo, endogalacturonase; endo-D- galacturonase ou poli(glicano-hidrolase de 1,4-α-D- galacturonídeo).

[0245] Aqui, uma esterase de metil pectina (EC 3.1.1.11) é qualquer enzima que seja capaz de catalisar a reação de: pectina + n H2O = n metanol + pectato. A enzima pode também ser conhecida como pectinesterase, desmetoxilase de pectina, metoxilase de pectina, metilesterase de pectina, pectase, pectinoesterase ou pectil-hidrolase de pectina.

[0246] Aqui, uma endo-galactanase (EC 3.2.1.89) é qualquer enzima capaz de catalisar a endo-hidrólise de ligações 1,4-β-D-galactosidicas em arabinogalactanos. A enzima pode também ser conhecida como endo-1,4-β- galactosidase arabinogalactano, endo-1,4-β-galactanase, galactanase, arabinogalactanase ou 4-β-D-galactano- hidrolase de arabinogalactano.

[0247] Aqui, uma esterase de acetil pectina é aqui definida como qualquer enzima que tem uma atividade de esterase de acetila que catalisa a desacetilação dos grupos acetila nos grupos hidroxila dos resíduos GaIUA de pectina.

[0248] Aqui, uma liase de endo-pectina (EC 4.2.2.10) é qualquer enzima capaz de catalisar a clivagem eliminatória de éster metílico de (1 ^4) -α-D-galacturonano para proporcionar os oligossacarídeos com grupos 4-desóxi-6-O- metil-α-D-galact-4-enuronosila em suas extremidades não redutoras. A enzima pode também ser conhecida como liase de pectina, transeliminase de pectina; liase de endo-pectina, transeliminase polimetilgalacturônica, metiltranseliminase de pectina, pectoliase, PL, PNL ou PMGL ou liase de (1^4)- 6-O-metil-α-D- galacturonano.

[0249] Aqui, uma liase de pectato (EC 4.2.2.2) é qualquer enzima capaz de catalisar a clivagem eliminatória de (1^4)- α-D-galacturonano para proporcionar oligossacarídeos com grupos 4-desóxi-a-D-4-galact-enuronosila em suas extremidades não redutoras. A enzima também pode ser conhecida como transeliminase poligalacturônica, transeliminase de ácido péctico, liase de poligalacturonato, metiltranseliminase de endopectina, transeliminase de pectato, transeliminase de endogalacturonato, liase de ácido péctico, liase péctica, liase de ácido α-1,4-D- endopoligalacturônico, liase de PGA, PPase-N, liase de ácido endo-α-1,4- poligalacturônico, liase de ácido poligalacturônico, transeliminase de pectina, transeliminase de ácido poligalacturônico ou liase de (1^4)-α-D- galacturonano.

[0250] Aqui, uma alfa-ramnosidase (EC 3.2.1.40) é qualquer polipeptídeo que seja capaz de catalisar a hidrólise dos resíduos α-L-ramnose não redutores terminais em α-L- ramnosídeos ou alternativamente em ramnogalacturonano. Esta enzima também pode ser conhecida como α-L-ramnosidase T, α- L-ramnosidase N ou ramno-hidrolase de a-L-ramnosídeo.

[0251] Aqui, exo-galacturonase (EC 3.2.1.82) é qualquer polipeptídeo capaz de hidrólise de ácido péctico a partir da extremidade não redutora, liberando digalacturonato. A enzima pode também pode ser conhecida como exo-poli-α- galacturonosidase, exopoligalacturonosidase ou exopoligalacturanosidase.

[0252] Aqui, exo-galacturonase (EC 3.2.1.67) é qualquer polipeptídeo capaz de catalisar: (1,4-a-D-galacturonídeo)n + H2O = (1,4-a-D-galacturonídeo)n-1 + D-galacturonato. A enzima pode também ser conhecida como 1,4-α-galacturonidase de galacturano, exopoligalacturonase, hidrolase de poli(galacturonato), exo-D-galacturonase, exo-D- galacturonanase, exopoli-D-galacturonase ou poli(galacturono-hidrolase de 1,4-a-D-galacturonídeo).

[0253] Aqui, liase de exopoligalacturonato (EC 4.2.2.9) é qualquer polipeptídeo capaz de catalisar a clivagem eliminatória de 4-(4-desóxi-a-D-galact-4-enuronosil)-D- galacturonato a partir da extremidade redutora de pectato, isto é, a pectina desesterificada. Esta enzima pode ser conhecida como liase de dissacarídeo de pectato, exo-liase de pectato, transeliminase de ácido exopéctico, liase de exopectato, transeliminase de ácido exopoligalacturônico, PATE, exo-PATE, exo-PGL ou liase de dissacarídeo de extremidade de redução de (1^4)-α-D-galacturonano.

[0254] Aqui, hidrolase de ramnogalacturonano é qualquer polipeptídeo que seja capaz de hidrolisar a ligação entre o ácido galactosilurônico e ramnopiranosil em uma forma tipo endo em estruturas de ramnogalacturonano estritamente alternadas, consistindo em dissacarídeo [(1,2-di-alfa-L- ramnoil-(1,4)-alfa-ácido galactosilurônico)]. (a) Aqui, liase de ramnogalacturonano é qualquer polipeptídeo que seja qualquer polipeptídeo que seja capaz de clivar ligações α-L-Rhap-(1^4)-α-D-GalpA em uma forma tipo endo em ramnogalacturonano por beta-eliminação.

[0255] Aqui, acetil esterase de ramnogalacturonano é qualquer polipeptídeo que catalisa a desacetilação da estrutura principal de alternância de ramnose e resíduos de ácido galacturônico em ramnogalacturonano.

[0256] Aqui, galacturono-hidrolase de ramnogalacturonano é qualquer polipeptídeo que seja capaz de hidrolisar o ácido galacturônico a partir da extremidade não redutora de estruturas de ramnogalacturonano estritamente alternadas em uma exo-forma.

[0257] Aqui, xilogalacturonase é qualquer polipeptídeo que atue sobre xilogalacturonano clivando a estrutura principal do ácido galacturônico substituído por β-xilose em uma forma endo. Esta enzima também pode ser conhecida como hidrolase de xilogalacturonano.

[0258] Aqui, uma α-L-arabinofuranosidase (EC 3.2.1.55) é qualquer polipeptídeo que seja capaz de atuar sobre α-L- arabinofuranosídeos, ligações (1,2) e/ou (1,3)- e/ou (1,5) contendo α-L-arabinanos, arabinoxilanos e arabinogalactanos. Esta enzima também pode ser referida como α-N- arabinofuranosidase, arabinofuranosidase, ou arabinosidase.

[0259] Aqui, endo-arabinanase (EC 3.2.1.99) é qualquer polipeptídeo que seja capaz de catalisar a endo-hidrólise de ligações 1,5-a-arabinofuranosídicas em 1,5-arabinanos. A enzima pode também ser conhecida como endo-arabinase, endo- 1,5-α-L-arabinosidase de arabinano, endo-1,5-α-L- arabinanase, endo-α-1,5-arabanase; endo-arabanase ou 1,5-α- L-arabinano-hidrolase de 1,5-α-L-arabinano.

[0260] Uma composição da presente invenção compreenderá, normalmente, pelo menos, uma celulase e/ou pelo menos uma hemicelulase e/ou, pelo menos, uma pectinase (um dos quais é um polipeptídeo de acordo com a invenção). Uma composição da invenção pode compreender uma celobio-hidrolase, uma endoglucanase e/ou uma β-glucosidase. Tal composição pode também compreender uma ou mais hemicelulases e/ou uma ou mais pectinases.

[0261] Uma ou mais (por exemplo, duas, três, quatro ou todas) de uma amilase, uma protease, uma lipase, uma ligninase, uma hexosiltransferase ou uma glucuronidase pode estar presente em uma composição da invenção.

[0262] "Protease" inclui enzimas que hidrolisam as ligações peptídicas (peptidases), assim como as enzimas que hidrolisam ligações entre os peptídeos e outras porções, tais como açúcares (glicopeptidases). Muitas proteases são caracterizadas sob EC 3.4, e são adequadas para a utilização na invenção aqui incorporadas por referência. Alguns tipos específicos de proteases incluem proteases de cisteína, incluindo a pepsina, papaína e proteases de serina, incluindo quimotripsinas, carboxipeptidases e metaloendopeptidases.

[0263] "Lipase" inclui enzimas que hidrolisam os lipídios, ácidos graxos, e, particularmente acilglicerídeos, incluindo fosfoglicerídeos, lipoproteínas, diacilgliceróis, e similares. Nas plantas, os lipídios são utilizados como componentes estruturais para limitar a perda de água e infecção patogênica. Estes lipídios incluem ceras derivadas de ácidos graxos, bem como cutina e suberina.

[0264] "Ligninase" inclui enzimas que hidrolisam ou podem quebrar a estrutura de polímeros de lignina. As enzimas que degradam a lignina podem incluir peroxidases de lignina, peroxidases de manganês, lacases e esterases de feruloíla, e outras enzimas descritas na técnica conhecida para despolimerizar ou de outra forma quebrar os polímeros de lignina. Enzimas capazes de hidrolisar ligações formadas entre açúcares hemicelulósicos (particularmente arabinose) e lignina também são incluídas. Ligninases incluem, mas não se limitam ao seguinte grupo de enzimas: peroxidases de lignina (EC 1.11.14), peroxidases de manganês (EC 1.11.1.13), as lacases (EC 1.10.3.2) e esterases de feruloíla (EC 3.1.1.73).

[0265] "Hexosiltransferase" (2.4.1-) inclui enzimas que são capazes de transferir grupos glicosila, mais especificamente os grupos hexosila. Além disso, a transferência de um grupo glicosila a partir de um doador contendo glicosila para outro composto contendo glicosila, o receptor, as enzimas também podem transferir o grupo glicosila para água como um receptor. Esta reação é também conhecida como uma reação de hidrólise, em vez de uma reação de transferência. Um exemplo de uma hexosiltransferase que pode ser utilizada na presente invenção é a β- glucanosiltransferase. Tal enzima pode ser capaz de catalisar a degradação de (1,3)(1,4)glucano e/ou celulose e/ou um produto de degradação de celulose.

[0266] "Glucoronidase" inclui as enzimas que catalisam a hidrólise de um glucoronosídeo, por exemplo, β- glucuronosídeo para obter um álcool. Muitas glucuronidases têm sido caracterizadas e podem ser adequadas para utilização na presente invenção, por exemplo, β-glucuronidase (EC 3.2.1.31), hialurono-glucuronidase (EC 3.2.1.36), glucuronosil-disulfoglucosamina glucuronidase (3.2.1.56), β-glucuronidase de glicirrizinato (3.2.1.128) ou α-D- glucuronidase (EC 3.2.1.139).

[0267] Uma composição da invenção pode compreender uma expansina ou proteína tipo expansina, tal como uma swolenina (vide Salheimo et al., Eur. J. Biohem. 269, 4202-4211, 2002) ou uma proteína tipo swolenina.

[0268] Expansinas são implicadas no afrouxamento da estrutura da parede celular durante o crescimento das células das plantas. As expansinas têm sido propostas para romper pontes de hidrogênio entre a celulose e outros polissacarídeos da parede celular sem ter atividade hidrolítica. Dessa forma, elas são pensadas para permitir o deslizamento das fibras de celulose e do alargamento da parede celular. Swolenina, uma proteína similar à expansina contém um domínio de Família de Módulo de Ligação de Carboidrato de terminal N 1 (CBD) e um domínio tipo expansina de terminal C. Para os fins da presente invenção, uma proteína tipo expansina ou uma proteína tipo swolenina similar pode compreender um ou ambos destes domínios e/ou pode perturbar a estrutura das paredes celulares (tal como perturbar a estrutura da celulose), opcionalmente, sem produzir quantidades detectáveis de açúcares de redução.

[0269] A composição da invenção pode compreender o produto de polipeptídeo de uma proteína que integra a celulose, uma estrutura ou uma proteína tipo estruturada, tal como, por exemplo, CipA ou CipC a partir de Clostridium thermocellum ou Clostridium cellulolyticum respectivamente.

[0270] Proteínas de integração de celulose ou estruturadas são multifuncionais que integram subunidades que podem organizar subunidades celulolíticas em um complexo multienzimático. Isto é obtido através da interação de duas classes complementares do domínio, isto é, um domínio de aderência sobre a estrutura e um domínio doquerina em cada unidade enzimática. A subunidade de estrutura também tem um módulo de ligação de celulose (CBM), que medeia a ligação da celulossoma ao seu substrato. Uma proteína de integração de celulose ou estruturada para os fins da presente invenção pode compreender um ou ambos destes domínios.

[0271] Uma composição da invenção pode compreender uma proteína induzida por celulose ou proteína de modulação, por exemplo, como codificado pelo gene cipl ou cip2 ou genes similares a partir de Trichoderma reesei/Hypocrea jecorina (vide Foreman et al., J. Biol. Chem. 278(34), 31988-31997, 2003). O produto de polipeptídeo destes genes são proteínas bimodulares, que contêm um módulo de ligação à celulose e um domínio que funciona ou a atividade não pode ser relacionada com as famílias de hidrolase de glicosila conhecidas. No entanto, a presença de um módulo de ligação à celulose e a corregulação da expressão destes genes com os componentes de celulases indica previamente atividades não reconhecidas com o papel potencial na degradação da biomassa.

[0272] Uma composição da invenção pode compreender um elemento de cada uma das classes dos polipeptídeos mencionados acima, diversos elementos de uma classe de polipeptídeo, ou qualquer combinação destas classes de polipeptídeos.

[0273] Uma composição da presente invenção pode ser composta de polipeptídeos, por exemplo, enzimas, a partir de (1) fornecedores comerciais, (2) polipeptídeos expressando genes clonados, por exemplo, enzimas, (3) caldo complexo (tal como o resultante do crescimento de uma cepa microbiana no meio, em que as cepas secretam proteínas e enzimas no meio, (4) lisados de células de cepas cultivadas como em (3); e/ou (5) polipeptídeos expressando material vegetal, por exemplo, enzimas. Polipeptídeos diferentes, tais como, por exemplo, enzimas, em uma composição da presente invenção podem ser obtidos a partir de diferentes fontes.

Uso dos polipeptídeos

[0274] Os polipeptídeos e as composições de polipeptídeos de acordo com a invenção podem ser utilizados em muitas aplicações diferentes. Por exemplo, eles podem ser utilizados para a produção de açúcares fermentáveis. Os açúcares fermentáveis podem então, como parte de um processo de biocombustível, ser convertidos em biogás ou etanol, butanol, isobutanol, 2-butanol ou outras substâncias apropriadas. Alternativamente, os polipeptídeos e as suas composições podem ser utilizados como enzimas, por exemplo, na produção de produtos alimentícios, em composições de detergentes, na indústria de celulose e papel e em formulações antibacterianas, em produtos farmacêuticos, tais como pastilhas para a garganta, pastas de dentes, e bochechos. Algumas das aplicações serão ilustradas com mais detalhes abaixo.

[0275] Nos usos e métodos descritos abaixo, os componentes das composições descritas acima, podem ser fornecidos simultaneamente (isto é, como uma única composição per se), ou separadamente ou sequencialmente.

[0276] A presente invenção também se refere ao uso do polipeptídeo de reforço de celulase de acordo com a invenção e às composições compreendendo tal enzima em processos industriais.

[0277] Apesar da longa experiência obtida com estes processos, o polipeptídeo de reforço de celulase de acordo com a invenção pode apresentar um determinado número de vantagens significativas sobre as enzimas utilizadas atualmente. Dependendo da aplicação específica, estas vantagens podem incluir aspectos tais como custos de produção mais baixos, maior especificidade para o substrato, antigenicidade reduzida, menor número de ações colaterais indesejáveis, rendimentos mais elevados, quando produzidas em um micro-organismo adequado, pH e intervalos de temperatura mais adequados, não-inibição por produtos derivados de lignina, hidrofóbicos ou menos inibição do produto ou, no caso da indústria alimentícia um melhor sabor ou textura do produto final, bem como os aspectos de qualidade alimentícia e kosher.

[0278] Em princípio, um polipeptídeo de reforço de celulase ou composição da invenção pode ser utilizado em qualquer processo que requer o tratamento de um material que compreende polissacarídeo. Desse modo, um polipeptídeo ou uma composição da presente invenção pode ser utilizado no tratamento de material de polissacarídeo. Desse modo, o material de polissacarídeo é um material que compreende ou consiste essencialmente em um ou, mais normalmente, mais de um polissacarídeo. Normalmente, as plantas e materiais derivados compreendem quantidades significativas de material de polissacarídeo de não amido. Desse modo, um polipeptídeo da invenção pode ser utilizado no tratamento de um material vegetal ou de fungos ou de um material derivado dos mesmos.

Lignocelulose

[0279] Um componente importante do material de polissacarídeo de não amido de planta é lignocelulose (também aqui referida como a biomassa lignocelulolítica). A lignocelulose é o material vegetal que compreende celulose e hemicelulose e lignina. Os polímeros de carboidrato (celulose e hemicelulose) estão fortemente ligados à lignina por hidrogênio e ligações covalentes. Desse modo, um polipeptídeo da invenção pode ser utilizado no tratamento de material lignocelulolítico. Aqui, o material lignocelulolítico é um material que compreende ou consiste essencialmente em lignocelulose. Desse modo, em um método da presente invenção para o tratamento de um polissacarídeo de não amido, o polissacarídeo de não amido pode ser um material lignocelulósico/biomassa.

[0280] Consequentemente, a invenção proporciona um método de tratamento de um substrato compreendendo o polissacarídeo de não amido em que o tratamento compreende a degradação e/ou hidrólise e/ou a modificação de celulose e/ou hemicelulose e/ou uma substância péctica.

[0281] A degradação neste contexto indica que o tratamento resulta na geração de produtos de hidrólise de celulose e/ou hemicelulose e/ou uma substância péctica, sacarídeos, ou seja, de menor comprimento estão presentes como resultado do tratamento do que estão presentes em um polissacarídeo de não amido não tratado similar. Desse modo, a degradação, neste contexto, pode resultar na liberação de oligossacarídeos e/ou monômeros de açúcar.

[0282] Todas as plantas contêm polissacarídeo de não amido como fazem praticamente todos os materiais de polissacarídeos derivados de plantas. Consequentemente, em um método da presente invenção para o tratamento do substrato compreendendo um polissacarídeo de não amido, o referido substrato pode ser fornecido sob a forma de uma planta ou de um material derivado de planta ou de um material compreendendo material vegetal ou derivado de planta, por exemplo, uma polpa de planta, um extrato de planta, um alimento ou ingrediente, portanto, um tecido, um produto têxtil ou uma peça de roupa.

[0283] A biomassa lignocelulolítica adequada para utilização na presente invenção inclui a biomassa, que pode incluir a biomassa virgem e/ou biomassa não virgem, tais como biomassa agrícola, orgânicos comerciais, construção e demolição de detritos, resíduos sólidos municipais, resíduos de papel e resíduos de jardim. As formas mais comuns de biomassa incluem árvores, arbustos e gramíneas, trigo, palha de trigo, bagaço de cana, milho, cascas de milho, sabugo de milho, grão de milho, incluindo fibras de grãos, produtos e subprodutos de moagem de grãos, tais como milho, trigo e cevada (incluindo moagem úmida e moagem a seco), muitas vezes chamados de "farelo ou fibras", bem como os resíduos sólidos municipais, resíduos de papel e de resíduos de jardim. A biomassa também pode ser, mas não está limitado a, material herbáceo, resíduos agrícolas, resíduos florestais, resíduos sólidos municipais, resíduos de papel e resíduos de fábricas de celulose e papel.

[0284] "Biomassa agrícola"inclui galhos, arbustos, canas, cascas de milho e milho, culturas energéticas, florestas, frutas, flores, grãos, gramíneas, plantas herbáceas, folhas, cascas, agulhas, troncos, raízes, mudas, culturas lenhosas de curta rotação, arbustos, panicum, árvores, plantas, cascas de frutas, videiras, polpa de beterraba, triguilho, casca de aveia, e madeiras rígidas e macias (não incluindo floresta com materiais nocivos). Além disso, a biomassa agrícola inclui materiais de resíduos orgânicos gerados a partir de processos agrícolas, incluindo atividades florestais e de agricultura, incluindo especificamente resíduos de madeira florestais. A biomassa agrícola pode ser qualquer um dos singularmente mencionados acima ou em qualquer combinação ou uma mistura dos mesmos. Exemplos adicionais de biomassa adequada são imprimações de pomar, chaparral, resíduos urbanos, moinho de resíduos de madeira, resíduos urbanos, resíduos de registro, desbastes florestais, culturas de lenhosas de curta rotação, resíduos industriais, palha de trigo, palha de aveia, palha de arroz, palha de cevada, palha de centeio, palha de linho, casca de soja, casca de arroz, palha de arroz, alimentação de glúten de milho, casca de aveia, cana-de-açúcar, palha de milho, caule de milho, sabugo de milho, casca de milho, pasto de padraria, pasto, foxtail; polpa de beterraba, polpa de frutas cítricas, cascas de sementes, resíduos animais celulósicos, recortes de grama, algodão, algas, árvores, arbustos, gramíneas, trigo, palha de trigo, bagaço de cana, milho, cascas de milho, placas de milho, grão de milho, fibras de grãos, produtos e subprodutos de moagem de grãos úmida ou seca, resíduos sólidos urbanos, resíduos de papel, resíduos de jardim, material herbáceo, resíduos agrícolas, resíduos florestais, resíduos sólidos urbanos, resíduos de papel, celulose, resíduos de fábricas de celulose, galhos, arbustos, canas, milho, palha de milho, rendimento de energia, floresta, fruta, flor, grão, grama, cultura herbácea, folha, casca, agulha, registro, raiz, muda, arbusto, capim, árvore, planta, casca de fruta, videira, polpa de beterraba açucareira, triguilho, cascas de aveia, madeira rígida ou macia, material de resíduos orgânicos produzidos a partir de um processo de agricultura, resíduos de sivicultura de madeira, ou uma combinação de quaisquer dois ou mais dos mesmos.

[0285] Além da biomassa virgem ou matérias-primas que já foram processadas em alimentos e alimentos para animais, ou indústrias de celulose e polpação, a biomassa/matéria-prima pode ainda ser pré-tratada com calor, modificação mecânica e/ou química, ou qualquer combinação destes métodos, com a finalidade de aumentar a degradação enzimática.

Pré-tratamento

[0286] Antes do tratamento enzimático, a matéria-prima pode ser opcionalmente pré-tratada com calor, modificação mecânica e/ou química, ou qualquer combinação destes métodos, com a finalidade de melhorar a acessibilidade do substrato para a hidrólise enzimática e/ou hidrolisar a hemicelulose e/ou solubilizar a hemiceluloses e/ou celulose e/ou lignina, de qualquer forma conhecida na técnica. O pré- tratamento pode compreender a exposição do material lignocelulósico para água (quente), vapor (explosão de vapor), um ácido, uma base, um calor, um solvente, um peróxido, ozônio, a fragmentação mecânica, moagem, trituração ou despressurização rápida, ou uma combinação de quaisquer dois ou mais dos mesmos. Um pré-tratamento químico é frequentemente combinado com o pré-tratamento térmico, por exemplo, entre 150 a 220°C durante 1 a 30 minutos.

Pré-sacarificação

[0287] Após a etapa de pré-tratamento, uma etapa de liquefação/hidrólise ou pré-sacarificação envolvendo a incubação com uma enzima ou mistura de enzimas podem ser utilizadas. A etapa de pré-sacarificação pode ser realizada em muitas diferentes temperaturas, mas é preferível que a etapa de pré-sacarificação ocorra a uma temperatura mais adequada para a mistura de enzima a ser aplicada, ou a enzima prevista ótima das enzimas a serem aplicadas. A temperatura da etapa de pré-sacarificação pode variar de cerca de 10°C a cerca de 95°C, cerca de 20°C a cerca de 85°C, cerca de 30°C a cerca 70°C, cerca de 40°C a cerca de 60°C, cerca de 37°C a cerca de 50°C, preferencialmente de cerca de 37°C a cerca de 80°C, mais preferivelmente cerca de 60 a 70°C ainda preferencialmente de cerca de 65°C. O pH da mistura de pré- sacarificação pode variar de cerca de 2,0 a cerca de 10,0, mas é preferencialmente cerca de 3,0 a cerca 7,0, preferencialmente cerca de 4,0 a cerca de 6,0, preferencialmente cerca de 4,0 a cerca de 5,0. Novamente, o pH pode ser ajustado para maximizar a atividade enzimática e pode ser ajustado com a adição da enzima.

[0288] A reação da etapa de liquefação/hidrólise ou pré- sacarificação pode ocorrer a partir de vários minutos a várias horas, tais como de cerca de 1 hora a cerca de 120 horas, preferencialmente de cerca de 2 horas a cerca de 48 horas, preferencialmente de cerca de 2 a cerca de 24 horas, preferencialmente, durante cerca de 2 até cerca de 6 horas. O tratamento com celulase pode ocorrer a partir de vários minutos a várias horas, tais como de cerca de 6 horas a cerca de 120 horas, preferencialmente cerca de 12 horas a cerca de 72 horas, preferencialmente cerca de 24 a 48 horas.

Sacarificação

[0289] A presente invenção provê um método para produzir um açúcar a partir de um material lignocelulósico que o método compreende o contato de um polipeptídeo da presente invenção para uma composição da presente invenção com o material lignocelulósico.

[0290] Tal método permite que os açúcares livres (monômeros) e/ou oligossacarídeos a serem gerados a partir de biomassa lignocelulósica. Estes métodos envolvem a conversão de biomassa lignocelulósica em açúcares livres e oligossacarídeos pequenos com um polipeptídeo ou uma composição da invenção.

[0291] O processo de conversão de um carboidrato complexo, tal como lignocelulose em açúcares preferencialmente permite a conversão em açúcares fermentáveis. Tal processo pode ser referido como "sacarificação". Desse modo, um método da invenção pode provocar a liberação de um ou mais açúcares de hexose e/ou pentose, tais como um ou mais de glicose, xilose, arabinose, galactose, ácido galacturônico, ácido glucurônico, manose, ramnose, ribose e frutose.

[0292] Consequentemente, outro aspecto da presente invenção inclui métodos que utilizam o polipeptídeo da composição da invenção, descrita acima, em conjunto com outras enzimas ou tratamentos físicos tais como temperatura e pH para converter a biomassa lignocelulósica em açúcares e oligossacarídeos.

[0293] Embora a composição tenha sido discutida como uma mistura única, reconhece-se que as enzimas podem ser adicionadas sequencialmente, em que a temperatura, pH, e outras condições podem ser alteradas para aumentar a atividade de cada enzima individual. Alternativamente, um pH e uma temperatura ótimos podem ser determinados para a mistura de enzima.

[0294] As enzimas são reagidas com o substrato sob as condições apropriadas. Por exemplo, as enzimas podem ser incubadas a cerca de 25°C, cerca de 30°C, cerca de 35°C, cerca de 37°C, cerca de 40°C, cerca de 45°C, cerca de 50°C, cerca de 55°C, cerca de 60°C, cerca de 65°C, cerca de 70°C, cerca de 75°C, cerca de 80°C, cerca de 85°C, cerca de 90°C ou mais. Isto é, elas podem ser incubadas a uma temperatura de entre cerca de 20°C a cerca de 95°C, por exemplo, em tampões de força iônica baixa a média e/ou a partir de ph baixo a neutro. Por "força iônica média" pretende-se que o tampão tenha uma concentração de íon de cerca de 200 milimolar (mM) ou menos, para qualquer componente de íon único. O pH pode variar entre cerca de pH 2,5, cerca de pH 3,0, cerca de pH 3,5, cerca de pH 4,0, cerca de pH 4,5, cerca de pH 5, a cerca de pH 5,5, cerca de pH 6, a cerca de pH 6,5, cerca de pH 7, a cerca de pH 7,5, cerca pH 8,0, a cerca de pH 8,5. Geralmente, a faixa de pH será de cerca de pH 3,0 a cerca de pH 7. Para a produção de etanol em meio ácido é preferível, por exemplo, pH = 4, enquanto que para a produção de biogás de pH neutro, por exemplo, pH = 7 é desejável. A incubação de combinações de enzimas nestas condições resulta em lançamento ou liberação de quantidades substanciais de açúcar a partir da lignocelulose. Por quantidade substancial destina-se, pelo menos, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou mais de açúcar disponível.

[0295] Os polipeptídeos tais como enzimas, podem ser produzidos tanto exogenamente em micro-organismos, leveduras, fungos, bactérias ou plantas, em seguida, isolados e adicionados, por exemplo, a matéria-prima lignocelulósica. Alternativamente, as enzimas são produzidas, mas não isoladas, e o caldo de fermentação de massa celular bruta, ou de material vegetal (por exemplo, palha de milho), e este pode ser adicionado como, por exemplo, a matéria-prima. Alternativamente, a massa celular bruta ou meio de produção de enzima ou o material vegetal pode ser tratado para prevenir o crescimento microbiano ainda mais (por exemplo, por aquecimento ou por adição de agentes antimicrobianos), em seguida, adicionado, por exemplo, uma matéria-prima. Essas misturas de enzimas brutas podem incluir o organismo produzindo a enzima. Alternativamente, a enzima pode ser produzida em uma fermentação que utiliza como matéria-prima (por exemplo, palha de milho) para proporcionar nutrição a um organismo que produz enzima(s). Dessa forma, as plantas que produzem as enzimas podem elas próprias servir como uma matéria-prima lignocelulósica e serem adicionadas na matéria-prima lignocelulósica.

Fermentação de açúcares

[0296] Os açúcares fermentáveis podem ser convertidos em produtos de fermentação de valor acrescentado úteis, exemplos não limitativos dos quais incluem aminoácidos, vitaminas, produtos farmacêuticos, suplementos para alimentação animal, produtos químicos especiais, matérias- primas químicas, plásticos, solventes, combustíveis, ou outros polímeros orgânicos, ácido láctico, e etanol, incluindo combustível de etanol. Em particular, os açúcares podem ser utilizados como matérias-primas para a fermentação em produtos químicos, plásticos, tais como, por exemplo, ácido succínico e (bio)combustíveis, incluindo combustíveis líquidos sintéticos de etanol, metanol, butanol e biogás.

[0297] Por exemplo, no método da presente invenção, uma enzima ou combinação de enzimas atua sobre um substrato lignocelulósico ou biomassa de planta, que serve como produto alimentício, com a finalidade de converter este substrato complexo em açúcares e oligossacarídeos simples para a produção de etanol ou outros produtos de fermentação úteis.

[0298] Açúcares liberados a partir da biomassa podem ser convertidos em produtos de fermentação úteis, um daqueles, incluindo, mas não limitados a, aminoácidos, vitaminas, produtos farmacêuticos, suplementos para alimentação animal, produtos químicos especiais, matérias-primas químicas, plásticos, e etanol, incluindo o combustível de etanol. Consequentemente, a invenção proporciona um método para a preparação de um produto de fermentação, tal método compreende: a. degradação da lignocelulose, utilizando um método tal como aqui descrito, e b. fermentação do material resultante, para assim preparar um produto de fermentação.

[0299] A fermentação pode ser realizada em condições aeróbicas ou anaeróbicas. Preferencialmente, o processo é realizado em condições limitadas por oxigênio ou microaerofílicas.

[0300] Um processo de fermentação anaeróbico é aqui definido como um processo de fermentação realizado na ausência de oxigênio ou em que substancialmente nenhum oxigênio é consumido, preferencialmente cerca de 5 ou menos, cerca de 2,5 ou menos, ou cerca de 1 mmol/L/h ou menos, e em que moléculas orgânicas servindo tanto como doador de elétrons quanto receptores de elétrons.

[0301] Um processo de fermentação limitado por oxigênio é um processo em que o consumo de oxigênio é limitado pela transferência de oxigênio de gás para líquido. O grau de limitação de oxigênio é determinado pela quantidade e composição do fluxo de gás contínuo bem como as propriedades de transferência de mistura/massa reais do equipamento de fermentação utilizado. Preferencialmente, em um processo em condições limitadas de oxigênio, a taxa de consumo de oxigênio é de pelo menos cerca de 5,5, preferencialmente pelo menos cerca de 6, e preferencialmente pelo menos cerca de 7 mmol/L/h.

[0302] Um método para a preparação de um produto de fermentação pode compreender, opcionalmente, a recuperação do produto de fermentação. SSF

[0303] A fermentação e a sacarificação podem também ser efetuadas em modo de sacarificação e fermentação simuultâneo (SSF). Uma das vantagens deste modo é a redução da inibição de açúcar da hidrólise enzimática (a inibição de açúcar em celulases é descrita por Caminal B&B Vol. XXVII Pp 12821290).

Produtos de fermentação

[0304] Os produtos de fermentação que podem ser produzidos de acordo com a presente invenção incluem aminoácidos, vitaminas, produtos farmacêuticos, suplementos para alimentação animal, produtos químicos especiais, matérias-primas químicas, plásticos, solventes, combustíveis, ou outros polímeros orgânicos, ácido láctico, e etanol, incluindo o combustível de etanol (o termo "álcool"deve ser entendido como incluindo o álcool etílico ou misturas de álcool etílico e água).

[0305] Produtos de valor acrescentado específicos que podem ser produzidos pelos métodos da presente invenção incluem, mas não estão limitados a, biocombustíveis (incluindo etanol e butanol e um biogás), ácido láctico, um plástico, um produto químico da especialidade; um ácido orgânico, incluindo o ácido cítrico , ácido succínico, ácido fumárico, ácido itacônico e ácido maleico; ácido 3-hidróxi- propiônico, ácido acrílico, ácido acético, 1,3-propano-diol; etileno, glicerol, um solvente, um suplemento alimentício animal, um produto farmacêutico, tais como um antibiótico β- lactama ou uma cefalosporina; vitaminas; um aminoácido, tais como lisina, metionina, triptofano, treonina e ácido aspártico; uma enzima industrial, tais como uma protease, uma celulase, uma amilase, uma glucanase, uma lactase, uma lipase, uma liase, uma oxidoredutase, uma transferase ou uma xilanase, e uma matéria-prima química.

Biogás

[0306] A presente invenção, além disso, provê a utilização de um polipeptídeo ou uma composição aqui descrita em um método para a preparação de biogás. Biogás normalmente refere-se a um gás produzido pela decomposição biológica de matéria orgânica, por exemplo, material contendo carboidrato de não amido, na ausência de oxigênio. Biogás se origina de material biogênico e é um tipo de biocombustível. Um tipo de biogás é produzido pela digestão anaeróbica ou fermentação de materiais biodegradáveis, tais como biomassa, estrume ou esgoto, resíduos urbanos, e rendimentos de energia. Este tipo de biogás é composto principalmente de metano e dióxido de carbono. O gás de metano pode ser queimado ou oxidado com oxigênio. O ar contém 21% de oxigênio. Isto permite a liberação de energia de biogás a ser usada como combustível. O biogás pode ser usado como um combustível de baixo custo em todo o país para qualquer finalidade de aquecimento, tal como cozinhar. Também pode ser utilizado em instalações modernas de gestão de resíduos, em que ele pode ser usado para executar qualquer tipo de aquecimento de motor, para gerar tanto energia mecânica quanto elétrica.

[0307] A primeira etapa na produção de biogás microbiano consiste na degradação enzimática de polímeros e substratos complexos (por exemplo, carboidrato de não amido). Consequentemente, a invenção proporciona um método para a preparação de um biogás em que um substrato compreendendo carboidrato de não amido entra em contato com um polipeptídeo ou composição da presente invenção, assim, para obter o material fermentável que pode ser convertido em um biogás por um organismo tal como um micro-organismo. Em tal método, um polipeptídeo da presente invenção pode ser fornecido sob a forma de um organismo, por exemplo, um micro-organismo que expressa tal polipeptídeo.

Uso de enzimas em produtos alimentícios

[0308] Os polipeptídeos e as composições da presente invenção podem ser utilizados em um método para o processamento de material vegetal para degradar ou modificar a celulose ou a hemicelulose ou constituintes de substâncias pécticas das paredes celulares do material vegetal ou fúngico. Tais métodos podem ser úteis para a preparação de um produto alimentício. Consequentemente, a presente invenção provê um método para preparar um produto alimentício cujo método compreende a incorporação de um polipeptídeo ou composição da presente invenção durante a preparação do produto alimentício.

[0309] A invenção também provê um método de tratamento de um material vegetal cujo método compreende o contato do material vegetal com um polipeptídeo ou composição da presente invenção para degradar ou modificar a celulose no material(vegetal). Preferencialmente, o material vegetal é uma celulose de planta ou extrato de planta, tais como sumos.

[0310] Materiais contendo substância péctica/hemicelulose/celulose e planta incluem celulose de planta, partes de plantas e extratos de plantas. No contexto desta invenção, um extrato de um material vegetal é qualquer substância que pode ser derivada a partir de material vegetal por extração (mecânica e/ou química), processamento ou por outras técnicas de separação. O extrato pode ser sumo, néctar, base, ou concentrados feitos a partir dos mesmos. O material vegetal pode compreender ou ser derivado de plantas, por exemplo, cenouras, aipo, cebola, legumes ou leguminosas (soja, grão de soja, ervilha) ou frutas, por exemplo, frutas de caroços ou sementes (maçãs, peras, marmelo, etc.), uvas, tomates, frutas cítricas (laranja, limão, lima, tangerina), melões, ameixas, cerejas, groselhas, framboesas, morangos, amoras, abacaxi e outras frutas tropicais, árvores e suas partes (por exemplo, pólen, de pinheiros), ou cereais (aveia, cevada, trigo, milho, arroz). O material (a ser hidrolisado) também pode ser resíduos agrícolas, tais como a polpa de beterraba açucareira, placa de milho, palha de trigo, cascas de nozes (de solo), ou materiais recicláveis, por exemplo, (resíduos) de papel.

[0311] Os polipeptídeos da presente invenção podem assim ser utilizados para tratar material vegetal incluindo celulose de planta e extratos de planta. Estes também podem ser usados para tratar gêneros alimentícios líquidos ou sólidos ou ingredientes alimentícios comestíveis, ou serem utilizados para a extração de óleos vegetais, tal como o amido ou um agente espessante em alimentos.

[0312] Normalmente, os polipeptídeos da presente invenção são utilizados como uma preparação de composição/enzima, tal como descrito acima. A composição será geralmente adicionada à polpa da planta obtida através de, por exemplo, processamento mecânico tal como a trituração ou moagem de material vegetal. A incubação da composição com a planta normalmente será realizada por um período compreendido entre 10 minutos e 5 horas, tal como 30 minutos a 2 horas, preferencialmente durante cerca de 1 hora. A temperatura de processamento é preferencialmente de cerca de 10°C a cerca de 55°C, por exeplo, de cerca de 15°C a cerca de 25°C, optimamente cerca de 20°C e pode-se utilizar entre cerca de 10 g a cerca de 300 g, preferencialmente de cerca de 30 g a cerca de 70 g, optimamente cerca 50 g de enzima por tonelada de material a ser tratado.

[0313] Todas as enzimas ou as suas composições utilizadas podem ser adicionadas sequencialmente ou simultaneamente à polpa da planta. Dependendo da composição da preparação de enzima, o material vegetal pode ser primeiro macerado (por exemplo, puro) ou liquefeito. Utilizando os polipeptídeos da invenção os parâmetros de processamento tais como o rendimento da extração, a viscosidade do extrato e/ou qualidade do extrato podem ser melhorados.

[0314] Alternativamente, ou adicionalmente ao acima exposto, um polipeptídeo da presente invenção pode ser adicionado ao sumo bruto obtido a partir de prensagem, ou liquefação da polpa vegetal. O tratamento do sumo bruto será realizado de uma forma similar à polpação de planta em relação à dosagem, temperatura e tempo de conservação. Novamente, outras enzimas tais como aquelas discutidas anteriormente podem ser incluídas. Condições de incubação típicas são as descritas no parágrafo anterior.

[0315] Uma vez que o sumo bruto foi incubado com os polipeptídeos da presente invenção, o caldo é em seguida centrifugado ou (ultra)filtrado para produzir o produto final.

[0316] Após o tratamento com o polipeptídeo da presente invenção, o produto (final) pode ser tratado pelo calor, por exemplo, a cerca de 100°C durante um tempo de cerca de 1 minuto a cerca de 1 hora, em condições para inativar parcialmente ou totalmente os polipeptídeos da invenção.

[0317] Uma composição contendo um polipeptídeo da presente invenção pode também ser utilizada durante a preparação de purês de fruta ou vegetais.

[0318] O cozimento do polipeptídeo pode melhorar a estrutura da massa, modificar a sua adesividade ou flexibilidade, melhorar o volume do pão e/ou a estrutura do miolo ou conferir melhores características de textura, tal como a qualidade do pão, miolo, ou migalha.

[0319] A presente invenção refere-se assim a métodos para a preparação de uma massa ou produto alimentício à base de cereais compreendendo a incorporar na massa um polipeptídeo ou composição da presente invenção. Isto pode melhorar uma ou mais propriedades da massa ou produto alimentício à base de cereais obtidas a partir da massa em relação a uma massa ou um produto alimentício à base de cereais, em que o polipeptídeo não é incorporado.

[0320] A preparação do produto alimentício à base de cereais de acordo com a invenção também pode compreender as etapas conhecidas na técnica, tais como ferver, secar, fritar, assar ou vaporizar a massa obtida. Produtos que são feitos a partir de uma massa que é fervida são, por exemplo, macarrão, bolinhos cozidos, produtos que são feitos de massa frita são, por exemplo, rosquinhas, beignets, macarrão frito, produtos que são feitos para a massa de vapor são, por exemplo, pãezinhos e macarrão cozido no vapor, exemplos de produtos feitos de massa seca são massas e macarrão seco e exemplos de produtos feitos de massa cozida são pão, biscoitos, bolo.

[0321] O termo "propriedade melhorada"é aqui definido como qualquer propriedade de uma massa e/ou um produto obtido a partir da massa, em particular um produto alimentício à base de cereais, que é melhorada pela ação do polipeptídeo de acordo com a invenção em relação a uma massa ou um produto no qual o polipeptídeo de acordo com a invenção não é incorporado. A propriedade melhorada pode incluir, mas não está limitada a, força aumentada da massa, elasticidade da massa aumentada, estabilidade da massa aumentada, maquinabilidade da massa melhorada, resistência à prova da massa melhorada, viscosidade da massa reduzida, extensibilidade da massa melhorada, volume do produto alimentício à base de cereais aumentado, formação de bolhas do produto alimentício à base de cereais reduzida, estrutura do miolo do produto cozido melhorada, maciez do produto alimentício à base de cereais melhorada, sabor do produto alimentício àa base de cereal melhorado, antiendurecimento do produto alimentício à base de cereais melhorado. As propriedades melhoradas relacionadas a massas e produtos alimentícios à base de cereais tipo macarrão são, por exemplo, firmeza melhorada, viscosidade reduzida, melhor aderência e perda de cozimento reduzida.

[0322] A propriedade melhorada pode ser determinada comparando uma massa e/ou um produto alimentício à base de cereais preparado com e sem a adição de um polipeptídeo da presente invenção. As qualidades organolépticas podem ser avaliadas usando procedimentos bem estabelecidos na indústria de panificação, e podem incluir, por exemplo, a utilização de um painel de testadores de sabor treinados.

[0323] O termo "massa"é aqui definido como uma mistura de farinha de cereal e outros ingredientes firmes o suficiente para amassar ou enrolar. Exemplos de cereal são trigo, centeio, milho, grão, cevada, arroz, cereais, trigo mourisco e aveia. O trigo é I e aqui a seguir destinado a abranger todas as espécies conhecidas de gênero Triticum, por exemplo, aestivum, durum e/ou spelta. Exemplos de outros componentes são: polipeptídeo de reforço de celulase de acordo com a presente invenção, enzimas adicionais, aditivos químicos e/ou auxiliares de processamento. A massa pode ser fresca, congelada, pré-desbastada, ou pré-cozida. A preparação de uma massa a partir dos ingredientes acima descritos é bem conhecida na técnica e compreende a mistura dos referidos ingredientes e auxiliares de processamento e uma ou mais etapas de moldagem e, opcionalmente, de fermentação. A preparação de massa congelada é descrita por Kulp e Lorenz em Frozen and Refrigerated Doughs and Batters.

[0324] O termo "produto alimentício à base de cereais"é aqui definido como qualquer produto preparado a partir de uma massa, ou de um caráter mole ou quebradiço. Exemplos de produtos alimentícios à base de cereais, de um tipo branco, claro ou escuro, que podem ser vantajosamente produzidos pela presente invenção são o pão (em particular branco, integral ou farinha de pão de centeio), normalmente na forma de pães ou rolos, pão francês tipo baguette, massas, macarrão, rosquinhas, biscoitos, bolo, pão sírio (pita bread), tortilhas, tacos, bolos, panquecas, biscoitos, bolachas, massas de tortas, pão cozido no vapor e pão torrado, e similares.

[0325] O termo "produto cozido"é aqui definido como qualquer produto alimentício à base de cereais preparado cozinhando a massa.

[0326] Os polissacarídeos de não amido (NSP) podem aumentar a viscosidade da digestão que pode, por sua vez, diminuir a disponibilidade de nutrientes e desempenho animal. A utilização do polipeptídeo de reforço de celulase da presente invenção pode melhorar a utilização de fósforo, bem como minerais de cátions e polipeptídeo durante a digestão animal.

[0327] A adição de nutrientes específicos para alimentar melhora a digestão animal e, assim, reduz os custos de alimentação. Um monte de aditivos de alimentação está sendo usado atualmente e novos conceitos são continuamente desenvolvidos. A utilização de enzimas específicas, como enzimas de degradação de carboidratos de não amido poderia quebrar a fibra liberando energia, bem como o aumento da digestibilidade da proteína devido à melhor acessibilidade da proteína quando a fibra é quebrada. Desse modo, o custo da alimentação pode reduzir, bem como os níveis de proteína na alimentação também podem ser reduzidos.

[0328] Polissacarídeos de não amido (NSPs) também estão presentes em praticamente todos os ingredientes da ração de origem vegetal. NSPs são mal utilizados e podem, quando solubilizados, exercer efeitos adversos sobre a digestão. As enzimas exógenas podem contribuir para uma melhor utilização destes NSPs e como consequência reduzir quaisquer efeitos antinutritivos. As enzimas de degradação de carboidratos de não amido da presente invenção podem ser utilizadas para esta finalidade em dietas à base de cereais para aves domésticas e, em menor extensão, nos suínos e outras espécies.

[0329] Um polipeptídeo/enzima de degradação de carboidrato de não amido da presente invenção (de uma composição compreendendo a enzima/polipeptídeo da presente invenção) pode ser utilizado na indústria de detergentes, por exemplo, para a remoção de corantes à base de carboidratos das roupas. A composição de detergente pode compreender uma enzima/polipeptídeo da presente invenção e, além disso, um ou mais de uma celulose, uma hemicelulase, uma pectinase, uma protease, uma lipase, uma cutinase, uma amilase ou uma carbo-hidrase.

Uso de enzimas em composições de detergentes

[0330] Uma composição de detergente que compreende um polipeptídeo ou uma composição da invenção pode estar em qualquer forma conveniente, por exemplo, uma pasta, um gel, um pó ou um líquido. Um detergente líquido pode ser aquoso, contendo normalmente até cerca de 70% de água e entre cerca de 0 e cerca de 30% de material de solvente orgânico ou não aquoso.

[0331] Tal composição de detergente pode, por exemplo, ser formulada como uma composição de detergente para a roupa à máquina ou à mão, incluindo uma composição de aditivo de roupa adequada para o pré-tratamento de tecidos manchados e uma composição de amaciamento do tecido adicionada ao enxágue, ou ser formulada como uma composição de detergente para utilização em operações de limpeza de superfície rígida domésticas gerais, ou ser formulada para operações de lavagem de louça à máquina ou à mão.

[0332] Em geral, as propriedades da enzima devem ser compatíveis com um detergente selecionado (por exemplo, o pH ótimo, a compatibilidade com outros ingredientes enzimáticos e/ou não enzimáticos, etc.) e as enzimas devem estar presentes em uma quantidade eficaz.

[0333] A composição de detergente pode compreender um tensoativo, por exemplo, um agente tensoativo aniônico ou não iônico, um construtor de detergente ou agente complexante, um ou mais polímeros, um sistema de branqueamento (por exemplo, uma fonte de H2O2) ou um estabilizador de enzima. A composição de detergente pode também compreender quaisquer outros ingredientes dos detergentes convencionais tais como, por exemplo, um condicionador incluindo uma argila, um ativador de espuma, um supressor de espuma, um agente anticorrosão, um solo, um agente de suspensão, um agente de redeposição de um solo, um corante, um bactericida, um branqueador óptico, um hidrótropos, um inibidor de manchas ou um perfume.

Uso de enzimas no processamento de papel e celulose

[0334] Uma composição ou um polipeptídeo da presente invenção pode ser utilizado na indústria de papel e celulose, particularmente no processo de branqueamento para aumentar o brilho das celuloses branqueadas por meio de que a quantidade de cloro utilizada nas etapas de branqueamento pode ser reduzida, e para aumentar o grau de refinação de celuloses no processo de papel reciclado (Eriksson, K.E.L., Wood Science and Technology 24 (1990):79-101; Paice, et al., Biotechnol. and Bioeng 32 (1988):235-239 e Pommier et al., Tappi Journal (1989):187-191). Além disso, uma composição ou um polipeptídeo da presente invenção pode ser utilizado para o tratamento da celulase lignocelulósica de modo a melhorar a capacidade de branqueamento da mesma. Desse modo, a quantidade de cloro necessária para obter um branqueamento satisfatório da celulose pode ser reduzida.

[0335] Uma composição ou um polipeptídeo da presente invenção pode ser utilizado em um método para reduzir a taxa em que a celulose que contêm tecidos torna-se rígida ou para reduzir a rigidez de tecidos contendo celulose, o método compreendendo o tratamento de celulose que contêm tecidos com um polipeptídeo ou uma composição tal como descrito acima. A presente invenção adicionalmente se refere a um método para prover uma maior clareza de cor de tecidos contendo celulose coloridos, o método compreendendo o tratamento de tecidos contendo celulose coloridos, com um polipeptídeo ou uma composição conforme descrito acima, e um método para prover uma variação localizada na cor de tecidos contendo celulose coloridos, o método compreendendo o tratamento de tecidos contendo celulose coloridos com um polipeptídeo ou uma composição conforme descrito acima. Os métodos da presente invenção podem ser realizados por tratamento de tecidos contendo celulose, durante a lavagem. No entanto, se desejado, o tratamento dos tecidos pode também ser realizado durante a imersão ou enxágue, ou simplesmente por adição da composição ou do polipeptídeo, tal como descrito acima à água na qual os tecidos são ou serão imersos.

Outros usos de enzima

[0336] Além disso, uma composição ou um polipeptídeo da presente invenção pode também ser usado na formulação antibacteriana assim como em produtos farmacêuticos, tais como pastilhas para a garganta, pastas de dentes, e bochechos.

[0337] Os seguintes exemplos ilustram a invenção:

EXEMPLOS Materiais e Métodos Procedimentos de DNA

[0338] Procedimentos de DNA padrão foram realizados como descrito em outra parte (Sambrook et al., 1989, Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York), a menos que indicado de outra forma. O DNA foi amplificado utilizando a polimerase Physion da enzima de revisão (Finnzymes). As enzimas de restrição foram de Invitrogen ou New England Biolabs. Preparação de amostras de celulase

[0339] As celulases originárias de Talaromyces emersonii foram expressas em Aspergillus niger. Filtrados concentrados de enzimas foram produzidos como descrito em WO2004/030468. Após o crescimento de Aspergillus niger, contendo a expressão adequada os sobrenadantes livres de célula de plasmídeos foram preparados por centrifugação do caldo de fermentação a 5000 xg durante 30 minutos a 4°C. O sobrenadante opcional pode ser ajustado para pH = 5 com KOH a 4N e filtrado estéril através de 2 μm filtro (frasco superior) com sucção, para eliminar qualquer material fúngico. Além disso, os sobrenadantes podem ser filtrados adicionalmente sobre um filtro de microfibra de vidro Whatmann GF/A (150mm 0) para remover quaisquer sólidos. Os sobrenadantes foram ultrafiltrados, concentrados, e armazenados até à sua utilização, a 4°C ou congelados a -20°C.

Método para determinação da proteína total

[0340] O método utilizado foi uma combinação de precipitação de proteína, utilizando ácido acético de tricloro (TCA) para remover as substâncias perturbadoras e permitir a determinação da concentração de proteína, com a reação de Biureto colorimétrica. Durante a reação de biureto, um íon de cobre (II) é reduzido para o cobre (I), o qual forma um complexo com os nitrogênios e os carbonos das ligações peptídicas em uma solução alcalina. A cor violeta indica a presença de proteínas. A intensidade da cor e, portanto, a absorção a 546 nm, é diretamente proporcional à concentração de proteína, de acordo com a lei de BeerLambert. A normalização foi realizada por meio de BSA (Albumina de Soro Bovino) e o teor de proteína foi expresso em g de proteínas, como BSA equivalente/L ou mg de proteína, como BSA equivalente/ml. O teor de proteína foi calculado utilizando protocolos de cálculo padrão conhecidos na técnica, através da representação gráfica de OD546 em função da concentração de amostras com concentração conhecida, seguida pelo cálculo da concentração das amostras desconhecidas utilizando a equação gerada a partir da linha de calibração.

[0341] Preparação de substrato de palha de trigo pré- tratada lavada

[0342] A palha de trigo pré-tratada com ácido diluído pode ser obtida como descrito em Linde, M. et al., Biomass and Bioenergy 32 (2008), 326-332 e o equipamento descrito em Schell, D.J., Applied Biochemistry and Biotechnology (2003), vol. 105-108, pp 69-85, podem ser utilizados. A palha de trigo pré-tratada foi lavada com água até que a solução com palha de trigo ficasse de pH 6,0 ou superior. A água de lavagem foi removida por filtração.

Rastreio para hidrólise de celulose

[0343] A palha de trigo pré-tratada (PWS) de ácido lavada a 2% de solução de substrato de matéria seca (dm) é feita em tampão de acetato de sódio a 50 mM pH 4,5. Para a incubação uma placa de microtítulo de 96 poços de profundidade é usada. Em cada poço 1 mL de substrato é pipetado. As misturas de enzimas foram preparadas a diversas razões de celulases, e foram adicionadas à solução de substrato, a dose de proteína fixa por grama de matéria seca de substrato.

[0344] A placa é incubada a 65°C durante 20 horas. Após a incubação, a reação enzimática é parada por adição de 50 μl de uma solução de hidróxido de sódio a 1M. A placa é então centrifugada durante 15 min a 3220 rcf e o sobrenadante é diluído a uma concentração de glicose entre 40 e 100 μ.

[0345] 50 μl da amostra diluída são pipetados em uma placa de PCR e 150 μl de reagente BCA são adicionados. O reagente BCA é feito recentemente pela mistura de duas soluções de estoque A e B 1:1 v/v. Uma solução A constituída por 54,3 g de Na2CO3, 24,2 g de NaHCO3 e 1,9 g de Na2BCA (Sigma D8284) por cada litro de água (MQ). A solução B continha 31,24 mL de solução de CuSO4.5H2O a 4% (Pierce 185 9078) e 1,26 g de L-lisina (Sigma L5501) por litro de água (MQ). (Concentração final: BCA a 2,5 mM, Cu a 2,5 mM, L-lisina a 4,3 mM, carbonato a 400 mM). A placa é aquecida a 80°C durante 60 minutos. Depois de arrefecer até 150 μl são pipetados em uma segunda placa e a absorvância é medida a 560 nm.

[0346] Em todas as placas o fundo do substrato é analisado, por incubação de substrato, sem adição de enzimas. Para cada medição um padrão de glicose de 55 μm é analisado contra tampão de acetato para calcular o coeficiente de extinção molar de glicose.

[0347] As incubações são realizadas utilizando um bloco de PCR de termociclo Peltier (PTC200) e as medições são realizadas utilizando um leitor de placa de microtítulo (TECAN Sunrise).

[0348] A glicose liberada do substrato pela ação das enzimas foi calculada, como a seguir:

As = absorvância da amostra a 560 nm Ablk = absorvância do substrato inexpressivo em 560 nm Densaio = diluição no ensaio Vensaio = volume de ensaio total (μL) Dincubados = diluição dos incubados I = comprimento do percurso (com) c = = coeficiente de extração molar de glicose-BCA (mmol*L-1*com-1) Vsubstrato = volume do substrato total (μL)

[0349] Este valor foi, além disso, corrigido para a redução do teor de proteína/açúcar na amostra de enzima (analisada pelo ensaio de BCA).

[0350] Hidrólise estendida de celulose

[0351] As incubações de combinações de enzimas de palha de trigo pré-tratada (PWS) de ácido lavada a 2% da solução de substrato de matéria seca (dm), em tampão de acetato de sódio a 50 mM pH 4,5, foram realizadas em escala de 10 mL. As combinações de enzimas foram adicionadas a uma dose de proteína fixa por grama de matéria seca de substrato. As amostras foram tomadas no tempo, até 72 horas de incubação a 65°C. As reações foram terminadas no momento determinado, girando para baixo o resíduo, pipetando o sobrenadante e congelando as amostras até à análise.

[0352] A análise da quantidade de glicose liberada foi realizada utilizando fluxo de RMN. Os espectros de 1H RMN foram registrados em um sistema de RMN melhor Bruker AVANCE II operando com uma frequência de próton de 500 MHz e temperatura da sonda a 27°C.

Exemplo 1 1.1 Construção de plasmídeos de expressão

[0353] A sequência com SEQ ID NO:1 foi clonada no vetor pGBTOP (figura 1), utilizando sítios EcoRI e SnaBI, compreendendo o promotor de glucoamilase e uma sequência de terminador. A parte de E. coli foi removida por digestão com Notl antes da transformação de A. niger. CBS 513.88. 1.2 Transformação de A. niger A. niger WT-1: esta cepa A. niger é CBS513.88 compreendendo deleções dos genes que codificam a glucoamilase (glaA), amilase fúngica e amilase ácida. A. niger WT 1 é construída usando o método "GENE FREE-MARCADOR" como descrito em EP 0 635 574 B1.

[0354] As construções de expressão são cotransformadas na cepa A. niger WT-1 de acordo com o método descrito por Tilburn, J. et al. (1983) Gene 26, 205-221 and Kelly, J. & Hynes, M. (1985) EMBO J., 4, 475-479, com as seguintes modificações:

[0355] - Os esporos são germinados e cultivados durante 16 horas a 30 graus Celsius em um frasco de agitação colocado em um agitador rotativo a 300 rpm, em meio mínimo de Aspergillus (100 ml). O meio mínico de Aspergilluscontém, por litro: 6 g de NaNO3, 0,52 g de KCl, 0,52 g de KH2PO4, 1,12 ml de KOH a 4 M, 0,52 g de MgSO4.7H2O, 10 g de glicose, 1 g de casaminoácidos, 22 mg de ZnSO4.7H2O, 11 mg de H3BO3, 5 mg de FeSO4.7H2O, 1,7 mg de CoCl2.6H2O, 1,6 mg de CuSO4.5H2O, 5 mg de MnCl2.2H2O, 1,5 mg de Na2MoO4.2H2O, 50 mg de EDTA, 2 mg de riboflavina, 2 mg de tiamina-HCl, 2 mg de nicotinamida, 1 mg de piridoxina-HCl, 0,2 mg de ácido pantotênico, 4 g de biotina, 10 ml de penicilina (5000 IU/ml) de estreptomicina (5000 UG/ml) solução (Gibco).

[0356] - Novozym 234® (Novo Industries) em vez de helicase é usado para a preparação de protoplastos;

[0357] - Após a formação do protoplasto (60 a 90 minutos), o tampão KC (KCl a 0,8M, ácido cítrico a 9,5 mM, pH 6,2) é adicionado a um volume final de 45 ml, a suspensão de protoplastos foi centrifugada durante 10 minutos a 3000 rpm a 4 graus Celsius em um rotor tipo “swing-bucket”. Os protoplastos são ressuspensos em 20 ml de tampão KC e subsequentemente 25 ml de tampão STC (sorbitol a 0,2 M, Tris- HCl a 10 mM pH 7,5, CaCl2 a 50 mM) são adicionados. A suspensão de protoplastos é centrifugada durante 10 minutos a 3000 rpm a 4 graus Celsius em um rotor tipo “swing-bucket”, lavada em tampão STC e ressuspensa em tampão STC a uma concentração de protoplastos 10E8/ml;

[0358] - A 200 microlitros da suspensão de protoplastos, o fragmento de DNA, foi dissolvido em 10 microlitros de tampão TE (Tris-HCl a 10 mM pH 7,5, EDTA a 0,1 mM) e 100 microlitros de solução de PEG (20% de PEG 4000 (Merck), sorbitol a 0,8 M, Tris-HCl a 10 mM pH 7,5, CaCl2 a 50 mM) são adicionados;

[0359] - Após a incubação da suspensão de protoplastos- DNA durante 10 minutos à temperatura ambiente, uma solução de 0,5 ml de PEG (60% de PEG 4000 (Merck), Tris-HCl a 10 mM pH 7,5, CaCl2 a 50 mM) é adicionada lentamente, com mistura repetida dos tubos. Após a incubação durante 20 minutos à temperatura ambiente, as suspensões são diluídas com 5 ml de sorbitol a 0,2 M, misturadas por inversão e centrifugadas durante 10 minutos a 4000 rpm à temperatura ambiente. Os protoplastos são ressuspensos suavemente em 1 ml de sorbitol a 1,2 M e plaqueadas em meio de regeneração seletivo sólido constituído por um ou outro meio mínimo de Aspergillus sem riboflavina, tiamina, HCL, nicotinamida, piridoxina, ácido pantotênico, biotina, casaminoácidos e glicose. No caso de seleção de acetamida o meio contém acetamida a 10 mM como a única fonte de nitrogênio e sacarose a 1 M como fonte-C e osmoticum. Alternativamente, os protoplastos são plaqueados em PDA (Potato Dextrose Agar, Oxoid) suplementado com 1 a 50 microgramas/fleomicina ml e sacarose a 1 M como osmosticum. Placas de regeneração são solidificadas usando 2% de ágar (Agar No.1, Oxoid L11). Após incubação durante 6 a 10 dias a 30 graus Celsius, conidiosporos de transformantes são transferidos para placas consistindo em meio seletivo de Aspergillus (meio mínimo contendo acetamida como única fonte de nitrogênio no caso de seleção de acetamida ou PDA suplementado com 1 a 50 microgramas/ml de fleomicina no caso de seleção de fleomicina) com glicose a 2% e agarose a 1,5% (Invitrogen) e incubados durante 5 a 10 dias a 30 graus Celsius. Os transformantes individuais são isolados e esta etapa de purificação seletiva é repetida uma vez em que os transformantes purificados são armazenados.

[0360] Após a transformação, os transformantes foram selecionados em um meio contendo acetamida como única fonte de nitrogênio e purificados por colônia. Os números de cópias foram estimados por PCR quantitativa e os números de cópias baixo e elevado de transformantes foram selecionados. Os transformantes de cópia elevados foram cultivados em frascos de agitação em 100 ml do meio de CSM-MES, tal como descrito em EP 635 574 a 34°C a 170 rpm em um agitador de incubadora usando um frasco agitador 500 ml confundido agitar frasco de reentrâncias no fundo. Após 3 e 4 dias de fermentação, as amostras de sobrenadante foram colhidas para determinar a expressão por SDS-PAGE.

1.3 Teor de proteína

[0361] Os sobrenadantes concentrados e ultrafiltrados das fermentações do frasco de agitação dos transformantes que expressam o polipeptídeo de reforço de celulas (TEMER07589) foram analisados para o teor de proteína. O teor de proteína foi determinado ser de 24 mg de proteína, como BSA equivalente/ml.

Exemplo 2 2.1 Preparação de amostras de celulase

[0362] Duas endoglucanases de Talaromyces emersonii, tal como descrito no Pedido de Patente EP1621628, como CEA (SEQ 1) e CEB (SEQ 3) foram preparadas como descrito no Exemplo 1 para TEMER07589. Além disso, duas exoglucanases, sendo CBHI como descrito no Pedido de Patente EP09158739.4 e CBHII (como descrito no Pedido copendente de Patente de Caso DSM 27829, depositado no mesmo dia que este pedido), foram preparadas de um modo similar. Finalmente, uma beta-glucosidase de Talaromyces emersonii, como é conhecido a partir de Murray et al., Protein Expression and Purification, 2004, 38, 248-257, foi também superexpressa em Aspergillus niger. O teor de proteína das amostras foi determinado e variou de 20 a 60 mg de proteína, como BSA equivalente/ml.

2.2 Hidrólise de celulose pelas misturas de enzima em 2 0 h

[0363] As combinações de quatro celulases foram preparadas. Cada combinação consistiu em 1 BG, 1 CBHI, CBHII 1, e 1 EG. No entanto, para a atividade de reforço de celulase contendo a combinação de celulase, a EG foi omitida e substituída por TEMER07589. Além de endoglucanase diferente, ou atividade de reforço de celulase nas misturas de enzimas, também um pouco de razões diferentes das 4 enzimas foi testado. Todas estas quatro combinações de enzimas foram adicionadas a 5 mg de proteína como BSA equivalente por g de palha de trigo pré-tratada lavada, e pesquisadas quanto à sua capacidade de hidrólise de celulose em incubações de 20 h a 65°C, como descrito acima. Além destas misturas de enzima, um produto de celulase de Talaromyces emersonii clássico, conhecido como Filtrase® NL, foi também incubado em uma dose de proteína similar. A liberação de glicose foi determinada e é apresentada na Tabela 1 para as 4 combinações de enzimas. Para Filtrase® NL, a glicose liberada foi determinada como sendo 30,1 mmol/L.

[0364] Tabela 1: Composição de quatro misturas de composto de 4 combinações de celulase, com diferentes quantidades relativas das quatro celulases (dada em percentagem da dose de proteína total), bem como a glucose liberada (expressa em mmol/L), após 20 h de incubação a pH 4,5 e a 65°C, para cada mistura, quando contendo CEA, CEB ou TEMER07589 como EG.

* EG indica a percentagem de endoglucanase, em caso de CEA e CEB, e indica a percentagem de atividade de reforço de celulase, no caso de TEMER07589, em que a mistura de uma endoglucanase de verdade é omitida.

[0365] A partir destes resultados, é evidente que, para todas as quatro razões de enzimas testadas a atividade de reforço de celulase superou as duas endoglucanases. No entanto, no caso de a razão de enzima ser dada na Mistura 1 e Mistura 4, a mistura de enzima 4 contendo a atividade de reforço de celulase, TEMER07589, em vez de endoglucanase, mesmo superaram Filtrase® NL, que contém diversas endoglucanases, beta-glucosidases e os duas exoglucanases, CBHI e CBHII.

Exemplo 3 3.1 otimização de razão de misturas de enzima 4

[0366] As 3 diferentes de 4 misturas de enzimas como utilizado no Exemplo 2, foram utilizadas em um projeto de mistura que consiste em 10 vértices, e um número total de 55 combinações de razão diferentes para encontrar a razão ótima das quatro enzimas para cada uma das três misturas. Os intervalos das diferentes enzimas testadas neste projeto foram BG 4 a 12%, e cada uma das outras três enzimas em intervalos de 10 a 70%. Em cada série de 55 incubações, três duplicatas foram executadas. O rastreio destas misturas foi realizado em palha de trigo pré-tratada lavada em DM a 2% em um tampão de acetato a 50 mM de pH 4,5. A incubação foi realizada em uma dosagem de proteína total de 5 mg de proteína como BSA equivalente por g de palha de trigo pré- tratada lavada de matéria seca, durante 20 h, a 65°C, em uma placa de microtítulo de 96 poços de profundidade. A capacidade de hidrólise da celulose foi determinada pela glicose liberada como determinado pelo ensaio de redução de açúcar de BCA. A avaliação estatística de todos os dados de cada mistura resultou no índice otimizado das quatro enzimas em cada mistura, conforme indicado na Tabela 2.

[0367] Tabela 2. Composição ótima de 3 diferentes de 4 misturas de enzimas, cada uma contendo BG, 1 CBHI, CBHII 1 e 1 EG ou uma atividade de reforço de celulase, expressa como percentagem da proteína total, para cada uma das enzimas individuais.

* EG indica a percentagem de endoglucanase, em caso de CEA e CEB, e indica a percentagem de atividade de reforço de celulase, no caso de TEMER07589, em que a mistura de uma endoglucanase de verdade é omitida.

3.2 Hidrólise prolongada de 4 misturas de enzimas otimizadas

[0368] As 3 misturas otimizadas foram aplicadas na hidrólise prolongada em escala de 10 mL de escala com palha de trigo pré-tratada a 2% de DM, a pH 4,5 e a 65°C. Como comparação, o anteriormente mencionado Filtrase® NL, um produto de celulase de Talaromyces emersoniiclássico, também foi incubado à mesma concentração, pH e temperatura do substrato. A dose total de proteína em cada uma das incubações foi de 15 mg de proteína, como BSA equivalente por grama de palha de trigo pré-tratada de matéria seca. As incubações duraram 72 horas e em intervalos de tempo de diversas amostras foram tiradas. As amostras foram removidas por rotação, e o sobrenadante foi congelado até a análise por RMN. A liberação de glicose no tempo é apresentada na figura 2. A partir da figura 2, é evidente que a mistura contendo atividade de reforço de celulase, TEMER07589, supera as duas misturas de endoglucanase contendo CEA ou CEB. A mistura contendo a atividade de reforço de celulase adicionalmente tem liberação de glicose ligeiramente superior no final da incubação do que Filtrase® NL.

Claims (8)

1. Célula recombinante caracterizadapor compreender: (i) um polipeptídeo que consiste na sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 2; ou (ii) um polinucleotídeo que consiste na sequência de nucleotídeos estabelecida na SEQ ID NO: 1, ou (iii) um construto de ácido nucleico consistindo no polinucleotídeo de (ii) ou um vetor incorporando o polinucleotídeo de (ii), em que a célula é uma célula fúngica selecionada do grupo que consiste nos gêneros Aspergillus, Trichoderma/Hypocrea, Fusarium, Disporotrichum, Penicillium, Acremonium, Neurospora, Thermoascus, Myceliophtora, Sporotrichum, Thielavia, Chryosporium, Fusarium, Humicola e Neurospora e é diferente das células fúngicas que produzem naturalmente o polipeptídeo de SEQ ID NO: 2.

2. Célula recombinante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadapelo fato de que a célula fúngica é selecionada da espécie Aspergillus oryzae, Aspergillus sojae, Aspergillus nidulans, ou Aspergillus niger.

3. Método para a preparação de um polipeptídeo que consiste na sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 2, o método sendo caracterizadopor consistir no cultivo de uma célula, como definida na reivindicação 1 ou 2, em condições que permitam a expressão do referido polipeptídeo e, opcionalmente, a recuperação do polipeptídeo expresso.

4. Composição caracterizadapor consistir em: (i) um polipeptídeo que consiste na sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 2; e (ii) uma celobio-hidrolase I, uma celobio-hidrolase II e β-glucosidase.

5. Método para o tratamento de um substrato que compreende material de carboidrato, opcionalmente, um material vegetal, o método sendo caracterizadopor consistir em colocar o substrato em contato com um polipeptídeo que consiste na sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 2, e/ou uma composição, como definida na reivindicação 4, e/ou uma célula recombinante, como definida na reivindicação 1 ou 2.

6. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizadopelo fato de que o substrato é um material vegetal e o material vegetal é fornecido sob a forma de uma planta, uma polpa de planta, um extrato de planta, um produto alimentício ou ingrediente derivado dos mesmos, ou um tecido, têxtil ou item de roupa que compreende um material vegetal.

7. Método, de acordo com a reivindicação 5 ou 6, caracterizadopelo fato de que o tratamento compreende a degradação e/ou modificação de celulose e/ou hemicelulose e/ou de uma substância péctica.

8. Uso de um polipeptídeo que consiste na sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 2, e/ou uma composição, como definida na reivindicação 4, e/ou uma célula recombinante, como definida na reivindicação 1 ou 2, caracterizadopelo fato de ser para a produção de açúcar a partir de um material lignocelulósico.

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