ES2628345T3 - Polipéptido que tiene o que ayuda en la actividad de degradación de materiales glucídicos y usos del mismo - Google Patents

Polipéptido que tiene o que ayuda en la actividad de degradación de materiales glucídicos y usos del mismo Download PDF

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Abstract

Un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID Nº: 2 o una secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia nucleotídica de SEQ ID Nº: 1, o un polipéptido variante o un polinucleótido variante del mismo, en donde el polipéptido variante tiene al menos 95% de identidad de secuencia con la secuencia indicada en SEQ ID Nº: 2 o el polinucleótido variante codifica un polipéptido que tiene al menos 95% de identidad de secuencia con la secuencia indicada en SEQ ID Nº: 2 y en donde el polipéptido tiene o consiste en una actividad de degradación de materiales glucídicos.

Description

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DESCRIPCION
Polipeptido que tiene o que ayuda en la actividad de degradacion de materiales gluddicos y usos del mismo Campo de la invencion
La invencion se refiere a secuencias que comprenden genes que codifican polipeptidos que tienen o ayudan en la actividad de degradacion de materiales gluddicos . La invencion la secuencia codificante de longitud completa del nuevo gen asf como la secuencia de aminoacidos de la protema funcional de longitud complete, y variantes y fragmentos del gen o la secuencia de aminoacidos. La invencion tambien se refiere a metodos para usar estas protemas en procedimientos industriales. Tambien se incluyen en la invencion celulas transformadas con un polinucleotido segun la invencion adecuadas para producir estas protemas. Ademas, la invencion se refiere a la expresion satisfactoria de los genes que codifican polipeptidos que tienen actividad de degradacion de materiales gluddicos en un hospedador. El hospedador puede ser cualquier hospedador adecuado, a modo de ejemplo Aspergillus, p. ej. Aspergillus niger o Talaromyces, p. ej. Talaromyces emersonii.
Antecedentes de la invencion
Los carbohidratos constituyen los compuestos organicos mas abundantes de la tierra. Sin embargo, gran parte de este carbohidrato esta secuestrado en polfmeros complejos incluyendo almidon (el principal carbohidrato de almacenamiento en semillas y cereales), y un conjunto de carbohidratos y lignina conocido como lignocelulosa. Los principales componentes de carbohidrato de la lignocelulosa son celulosa, hemicelulosa y pectinas. Estos polfmeros complejos se denominan a menudo colectivamente lignocelulosa.
La bioconversion de biomasa lignocelulosica renovable en un azucar fermentable que posteriormente se fermenta para producir alcohol (p. ej., etanol) como una alternativa a los combustibles lfquidos ha atrafdo una atencion intensa de los investigadores desde los 1970, cuando estallo la crisis del petroleo debido a una disminucion de la produccion de petroleo por la OPEC. El etanol se ha usado ampliamente como una combinacion al 10% con gasolina en los EE. UU. de A. o como un combustible puro para veldculos en Brasil en las ultimas dos decadas. Mas recientemente, el uso de E85, una combinacion de etanol al 85% se ha puesto en practica especialmente para aplicaciones en ciudades limpias. La importancia del combustible bioetanol se incrementara en paralelo con los incrementos de los precios del petroleo y el agotamiento gradual de sus fuentes. Adicionalmente, se estan usando azucares fermentables para producir plasticos, polfmeros y otros productos basados biologicamente y se espera que esta industria crezca sustancialmente, incrementado por lo tanto la demanda de azucares fermentables abundantes de bajo coste que se puedan usar como una materia prima en lugar de materias primas basadas en petroleo.
El secuestro de estas grandes cantidades de carbohidratos en biomasa vegetal proporciona una fuente abundante de energfa potencial en la forma de azucares, azucares tanto de cinco carbonos como de seis carbonos que se podnan utilizar para numerosos procedimientos industriales y agncolas. Sin embargo, el enorme potencial de energfa de estos carbohidratos actualmente esta infrautilizado debido a que los azucares estan bloqueados en polfmeros complejos, y de ah que no sean facilmente accesibles para la fermentacion. Metodos que generen azucares a partir de biomasa vegetal proporcionanan materias primas economicamente competitivas abundantes para la fermentacion en productos qrnmicos, plasticos, tales como, as a modo de ejemplo, acido sucdnico y (bio)combustibles, incluyendo combustibles lfquidos sinteticos de etanol, metanol y butanol y biogas.
Independientemente del tipo de materia prima celulosica, el coste y la eficacia hidrolttica de las enzimas son factores importantes que restringen la comercializacion de los procedimientos de conversion de biomasa. Los costes de produccion de enzimas producidas microbianamente estan estrechamente conectados con una productividad de la cepa productora de enzimas y el rendimiento de actividad final en el caldo de fermentacion.
A pesar de la investigacion continuada en las ultimas decadas para entender la degradacion enzimatica de biomasa lignocelulosica y la produccion de celulasa, sigue siendo deseable descubrir o manipular nuevas celulasas y hemicelulasas muy activas. Tambien sena muy deseable construir composiciones enzimaticas muy eficaces capaces de realizar una biodegradacion rapida y eficaz de materiales lignocelulosicos, en particular tales estas celulasas y hemicelulasas que tengan termoestabilidad incrementada.
Estas enzimas se pueden usar para producir azucares para la fermentacion en productos qrnmicos, plasticos, tales como, a modo de ejemplo, acido succmico y (bio)combustibles, incluyendo etanol, metanol, butanol, combustibles lfquidos sinteticos y biogas, para ensilaje, y tambien como enzima en otros procedimientos industriales, por ejemplo en las industrias alimentaria o de piensos, textil, de pasta papelera o papel o detergentes y otras industrias.
Sumario de la invencion
La presente invencion proporciona polinucleotidos que codifican polipeptidos que tienen la capacidad de degradar (es decir ayudar en la degradacion de) un carbohidrato (por ejemplo polisacaridos), en particular, lignocelulosa. Los polinucleotidos de la invencion tipicamente codifican un polipeptido que tiene o que ayuda en la actividad de 5 degradacion de carbohidratos.
La invencion tambien proporciona polipeptidos producidos naturalmente y recombinantemente que tienen esta actividad, asf como lmeas celulares recombinantes que producen estas enzimas. Ademas, se proporcionan metodos para elaborar y usar los polinucleotidos y polipeptidos de la invencion.
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Segun la invencion, se proporciona un polipeptido que comprende la secuencia de aminoacidos indicada en SEQ ID N°: 2 o una secuencia de aminoacidos codificada por la secuencia nucleotfdica de SEQ ID N°: 1, o un polipeptido variante o polinucleotido variante del mismo, en donde el polipeptido variante tiene al menos 95% de identidad de secuencia con la secuencia indicada en SEQ ID N°: 2 o el polinucleotido variante codifica un polipeptido que tiene al 15 menos 95% de identidad de secuencia con la secuencia indicada en SEQ ID N°: 2 y en donde el polipeptido tiene o ayuda en la actividad de degradacion de materiales gluddicos .
Los polipeptidos segun la invencion tienen propiedades favorables, en particular la propiedad de tener o ayudar en la actividad de degradacion de materiales gluddicos . En una realizacion, el polipeptido segun la invencion tiene 20 actividad de oxidohidrolasa. En una realizacion, el polipeptido tiene actividad de GH61.
En una realizacion, el polipeptido variante tiene un residuo His27 (posicion como en SEQ ID N°: 2). Se supone en la presente que His27 representa un papel en la union de iones metalicos (Ni2+ y Mg2+ y potencialmente otros cationes. En una realizacion, el polipeptido variante tiene al menos 95% de identidad de secuencia con la secuencia indicada 25 en SEQ ID N°: 2, un residuo catalftico His27 y actividad de oxidohidrolasa y/o GH61.
Ademas, los polipeptidos tienen alta termoestabilidad. Los polipeptidos segun la invencion retienen una alta actividad relativa (% de la actividad inicial) de, como una funcion del tiempo de incubacion (h), p. ej. 2 horas, 3 horas, 4 horas, cinco horas, seis horas, ocho horas, nueve horas, 10 h o mas, 20 h o mas, 30 h o mas, en particular a altas 30 temperaturas, a modo de ejemplo a 60°C o mas, a 65°C o mas, o a 70°C o mas, p. ej. 8 horas a 65°C o 72 horas a 60°C.
La invencion tambien proporciona un polinucleotido que comprende:
(a) la secuencia nucleotfdica indicada en SEQ ID N°: 1; o
35 (b) una secuencia nucleotidica que se hibrida selectivamente con un polinucleotido que es el complemento inverso
de SEQ ID N°: 1; o
(c) una secuencia nucleotidica que tiene al menos aproximadamente 95% de identidad de secuencia con la secuencia nucleotfdica de SEQ ID N°: 1; o
(d) una secuencia que esta degenerada como resultado del codigo genetico en una secuencia segun se define en
40 uno cualquiera de (a), (b) o (c);o
(e) una secuencia nucleotidica que es el complemento inverso de una secuencia nucleotidica segun se define en (a),
(b) , (c) o (d).
Tambien se proporciona segun la invencion un vector, tal como un vector de expresion, que incorpora una secuencia polinucleotfdica de la invencion y una celula que comprende un polipeptido, un polinucleotido o un vector de la 45 invencion.
La invencion tambien proporciona:
un metodo para la preparacion de un polipeptido que tiene o que ayuda en la actividad de degradacion de carbohidratos, metodo que comprende cultivar una celula de la invencion bajo condiciones que permitan la expresion 50 de dicho polipeptido y, opcionalmente, recuperar el polipeptido expresado;
un polipeptido obtenible mediante tal metodo; y
una composicion que comprende: (i) un polipeptido de la invencion y; (ii) a celulasa y/o a hemicelulasa y/o una pectinasa.
Los polipeptidos de la invencion que tienen o ayudan en la actividad de degradacion de carbohidratos se pueden usar en procedimientos industriales. As^ la invencion proporciona un metodo para el tratamiento de un sustrato que 5 comprende material gluddico, metodo que comprende poner en contacto el sustrato con un polipeptido o una composicion de la invencion.
En particular, la invencion proporciona un metodo para producir un azucar o azucares a partir de material lignocelulosico, metodo que comprende poner en contacto el material lignocelulosico con un polipeptido o una 10 composicion de la invencion.
Los azucares producidos de este modo se pueden usar en un procedimiento de fermentacion. Segun esto, la invencion proporciona un metodo para producir un producto de fermentacion, metodo que comprende: producir un azucar fermentable usando lo descrito anteriormente; y fermentar el azucar fermentable resultante, para producir de 15 ese modo un producto de fermentacion.
Un polipeptido o una composicion de la invencion tambien se puede usar, por ejemplo, en la preparacion de un producto alimenticio, en la preparacion de un detergente, en la preparacion de un pienso, en el tratamiento de pasta papelera o en la fabricacion de papel o en la preparacion de una tela o material textil o en la limpieza de los mismos.
20
Se divulga en la presente:
un material procesado obtenible al poner en contacto un material vegetal o material lignocelulosico con un polipeptido o una composicion de la invencion;
un alimento o pienso que comprende un polipeptido o una composicion de la invencion; y
25 una planta o parte de la misma que comprende un polinucleotido, un polipeptido, un vector o una celula segun la invencion.
Breve descripcion de los dibujos
Fig 1: Mapa de pGBTOP para la expresion de genes en A. niger. Se representan el gen de interes (GOI) expresado a partir del promotor de glucoamilasa (PglaA). Ademas, se representa el flanco de glucoamilasa (3'glaA) del casete 30 de expresion. En esta solicitud, un gen de interes es la secuencia codificante de TEMER07589 segun se define posteriormente en la presente.
Fig 2: Grafica de liberacion de glucosa, expresada en mmol/l, en el tiempo, a partir de paja de trigo pretratada con 2% de dm, incubada con 15 mg de protema como equivalente de BSA por gramo de materia seca de la paja de trigo pretratada, mediante una mezcla de 4 enzimas, que contiene 1 BG, 1 CBHI, 1 CBHII y 1 EG o que ayuda en la 35 actividad de degradacion de carbohidratos (--•-- = CEA; -■■x-- = CEB; -■- = TEMER07589) o mediante un producto de celulasa clasico (--▲-- = Filtrase® NL).
Breve descripcion de la lista de secuencias
SEQ ID N°: 1 indica la secuencia codificante de TEMER07589;
SEQ ID N°: 2 indica la secuencia de aminoacidos de TEMER07589;
40 SEQ ID N°: 3 indica la secuencia de senal de TEMER07589.
Descripcion detallada de la invencion
A lo largo de la presente memoria descriptiva y las reivindicaciones adjuntas, las palabras "comprender" e "incluir" y variacion tales como "comprende", "que comprende", "incluye" y "que incluye" se han de interpretar inclusivamente. Esto es, estas palabras estan destinadas a comunicar la posible inclusion de otros elementos o numeros enteros no 45 citados espedficamente, cuando el contexto lo permita.
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Los artmulos "un" y "uno/a" se usan en la presente para referirse a uno o mas de uno (es decir a uno o al menos uno) del objeto gramatical del artmulo. A modo de ejemplo, "un elemento" puede significar un elemento o mas de un elemento.
La presente invencion proporciona polinucleotidos que codifican polipeptidos, p. ej. enzimas que tienen la capacidad de modificar, por ejemplo degradar, un material gluddico. A material gluddico es un material que comprende, consiste en o consiste sustancialmente en uno o mas carbohidratos. Las enzimas son en la presente una subclase de los polipeptidos.
Sustrato (tambien llamado materia prima) se usa en la presente para referirse a una sustancia que comprende material gluddico, que se puede tratar con enzimas segun la invencion, de modo que el material gluddico del mismo se modifique. Ademas del material gluddico, el sustrato puede contener cualquier otro componente, incluyendo, pero no limitado a, un material no gluddico y almidon.
La presente invencion proporciona polinucleotidos que codifican polipeptidos, p. ej. enzimas que tienen la capacidad de modificar, por ejemplo degradar, un material gluddico. Un material gluddico es un material que comprende, consiste en o consiste sustancialmente en uno o mas carbohidratos. Las enzimas son en la presente una subclase de los polipeptidos.
Tfpicamente, un polipeptido de la invencion codifica un polipeptido que tiene al menos o que ayuda en la actividad de degradacion de carbohidratos, llamado tentativamente TEMER07589, que tiene una secuencia de aminoacidos segun SEQ ID N°: 2, o una secuencia que es una variante del mismo, tfpicamente funcionalmente equivalente al polipeptido que tiene la secuencia de SEQ ID N°: 2, o una secuencia que es un fragmento de cualquiera de los mismos.
"Que tiene o que ayuda en la actividad de degradacion de carbohidratos" se define en la presente como que el polipeptido tiene actividad de degradacion de carbohidratos o que el polipeptido ayuda en la degradacion de carbohidratos o ambos. En una realizacion, el polipeptido potencia la actividad de al menos una celulasa. En esa realizacion, cuando el polipeptido de la invencion esta presente en una mezcla con una o mas celulasas, a modo de ejemplo, en una mezcla con celobiohidrolasa (CBH) y beta-glucosidasa (BG), potenciara la actividad de estas celulasas, lo que dara como resultado una actividad superior de la mezcla para degradar celulosa. Se cree que TEMER07589 pertenece a la familia GH61 de enzimas. Las enzimas de esta familia GH61 se clasificaron originalmente como una familia de glucosido hidrolasas basandose en la medida de la actividad de endo-1,4-b-D- glucanasa muy debil en un miembro de la familia (endoglucanasa (EC 3.2.1.4)). La estructura y el modo de accion de estas enzimas son ciertamente no canonicos y no se pueden considerar glucosidasas autenticas. Sin embargo. se mantienen en la clasificacion CAZy basandose en su capacidad para potenciar la descomposicion de lignocelulosa cuando se usan junto con una celulasa o una mezcla de celulasas. Una vision general de miembros conocidos de la familia GH61 se da en la figura 5 de Harris, PV y cols., Biochemistry 2010, 49, 3305-3316.
En una realizacion, ademas de la actividad potenciadora de celulasa, la protema potenciadora de celulasa segun la invencion tiene actividad de endoglucanasa (EG). En esta realizacion, se puede evitar la adicion de una endoglucanasa (distinta a la protema que potencia la celulasa segun la invencion) a una mezcla de celulasas, que habitualmente es esencial para la degradacion eficaz de celulosa.
En la presente, una endo-p-1,4-glucanasa (EC 3.2.1.4) es cualquier polipeptido que sea capaz de catalizar la endohidrolisis de enlaces 1,4-p-D-glucosfdicos en celulosa, liquenina o p-D-glucano de cereales. Este polipeptido tambien puede ser capaz de hidrolizar enlaces 1,4 en p-D-glucanos que tambien contienen enlaces 1,3. Esta enzima tambien se puede denominar celulasa, avicelasa, p-1,4-endoglucano hidrolasa, p-1,4-glucanasa, carboximetil celulasa, celudextrinasa, endo-1,4-p-D-glucanasa, endo-1,4-p-D-glucanohidrolasa, endo-1,4-p-glucanasa o endoglucanasa.
En una realizacion, un polipeptido de la invencion puede tener una o mas actividades alternativas y/o adicionales distintas a la actividad potenciadora de celulasa y la actividad de endoglucanasa que se mencionan anteriormente, por ejemplo una de las otras actividades de degradacion de carbohidratos y/o hidrolizacion de carbohidratos mencionadas en la presente.
Carbohidrato en este contexto incluye todos los sacaridos, por ejemplo polisacaridos, oligosacaridos, disacaridos o monosacaridos.
Un polipeptido segun la invencion puede modificar y/o degradar un material gluddico al degradar qmmicamente o degradar ffsicamente este material o hidrolizar el carbohidrato. Ffsica incluye, p. ej., la interrupcion de la interaccion entre microfibrillas de celulosa y/o la apertura de la estructura de las fibras de celulosa. La modificacion qrnmica del material gluddico puede dar como resultado la degradacion de este material, por ejemplo mediante hidrolisis, oxidacion u otra modificacion qrnmica tal como mediante la accion de una liasa. La modificacion ffsica puede estar acompanada o no por modificacion qrnmica.
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Materiales gluddicos adecuados
Un carbohidrato no amilaceo adecuado para la modificacion por un polipeptido de la invencion es la lignocelulosa. Los principales polisacaridos que comprender diferentes residuos lignocelulosicos, que se pueden considerar una materia prima renovable potencial, son la celulosa (glucanos), hemicelulosas (xilanos, heteroxilanos y xiloglucanos). Ademas, alguna hemicelulosa puede estar presente como glucomananos, por ejemplo en materias primas derivadas de madera. La hidrolisis enzimatica de estos polisacaridos hasta azucares solubles, por ejemplo glucosa, xilosa, arabinosa, galactosa, fructosa, manosa, ramnosa, ribosa, acido D-galacturonico y otras hexosas y pentosas, se produce bajo la accion de diferentes enzimas que actuan en conjunto.
Ademas, pectinas y otras sustancias pecticas tales como arabinanos pueden constituir una proporcion considerable de la masa seca, tfpicamente de paredes celulares de tejidos vegetales no lenosos (de aproximadamente un cuarto a la mitad de la masa seca pueden ser pectinas).
La celulosa en un polisacarido lineal compuesto por residuos de glucosa ligados por enlaces p-1,4. La naturaleza lineal de las fibras celulosicas, asf como la estequiometna de la glucosa liada en p (con relacion a a) genera estructuras mas propensas a entrelazar el enlace de hidrogeno que las estructuras de almidon reticuladas en a altamente ramificadas. Asf, los polfmeros celulosicos son generalmente menos solubles, y forman fibras mas fuertemente unidas que las fibras encontradas en el almidon.
La hemicelulosa es un polfmero complejo, y su composicion a menudo vana ampliamente de organismo a organismo, y de un tipo de tejido a otro. En general, un componente principal de la hemicelulosa es xilosa conectada por p-1,4, un azucar de cinco carbonos. Sin embargo, esta xilosa esta ramificada a menudo en O-3 y/u O-2 y puede estar sustituida con enlaces con arabinosa, galactosa, manosa, acido glucuronico, acido galacturonico o por esterificacion a acido acetico (y esterificacion de acido ferulico a arabinosa). La hemicelulosa tambien puede contener glucano, que es un termino general para azucares de seis carbonos enlazados en p (tales como los glucanos y heteroglucanos p-(1,3)(1,4) mencionados previamente) y adicionalmente glucomananos (en los que estan presentes tanto glucosa como manosa en el esqueleto lineal, enlazadas entre sf por enlaces p).
La composicion, la naturaleza de la sustitucion y el grado de ramificacion de la hemicelulosa son muy diferentes en plantas dicotiledoneas (es decir, plantas cuyas semillas tienen dos cotiledones u hojas primordiales tales como habas, cacahuetes, almendras, guisantes, habichuelas) en comparacion con las plantas monocotiledoneas (es decir, plantas que tienen un solo cotiledon u hoja primordial tales como mafz, trigo, arroz, grammeas, cebada). En las dicotiledoneas, la hemicelulosa esta comprendida principalmente por xiloglucanos que son cadenas de glucosa con enlaces 1,4-p con cadenas laterales de xilosilo con enlaces 1,6-p. En las monocotiledoneas, incluyendo la mayona de los cultivos de cereales, los principales componentes de la hemicelulosa son heteroxilanos. Estos estan comprendidos principalmente por polfmeros de esqueleto de xilosa con enlaces 1,4-p con enlaces 1,3-a con arabinosa, galactosa, manosa y acido glucuronico o acido 4-O-metil-glucuronico asf como xilosa modificada por acidos aceticos con enlaces ester. Tambien se presentan p-glucanos comprendidos por cadenas de glucosilo con enlaces 1,3- y 1,4-p. En las monocotiledoneas, pueden estar presentes celulosa, heteroxilanos y p-glucanos en cantidades aproximadamente iguales, comprendiendo cada uno aproximadamente 15-25% de la materia seca de las paredes celulares. Ademas, diferentes plantas pueden comprender diferentes cantidades de, y diferentes composiciones de, sustancias pecticas. Por ejemplo, la remolacha azucarera contiene aproximadamente 19% de pectina y aproximadamente 21% de arabinano en una base en peso seco.
Segun esto, una composicion de la invencion se puede adaptar en vista de la materia prima (tambien llamada sustrato) particular que se vaya a usar. Es decir, el espectro de actividades en una composicion de la invencion puede variar dependiendo de la materia prima en cuestion.
Las combinaciones de enzimas o los tratamientos ffsicos se pueden administrar simultaneamente o secuencialmente. Las enzimas pueden producirse exogenamente en microorganismos, levadoras, hongos, bacterias o plantas, a continuacion aislarse y anadirse a la materia prima lignocelulosica. Alternativamente, las enzimas se producen, pero no se afslan, y se anaden a la materia prima caldo de fermentacion de la masa celular en bruto, o material vegetal (tal como forraje de mafz) y similares. Alternativamente, la masa celular en bruto o el medio de produccion de enzimas o el material vegetal puede tratarse para prevenir el crecimiento microbiano adicional (por ejemplo, mediante calentamiento o adicion de agentes antimicrobianos), y a continuacion anadirse a la materia prima. Estas mezclas de enzimas en bruto pueden incluir el organismo que produce la enzima. Alternativamente, la enzima se puede producir en una fermentacion que usa materia prima (tal como forraje de mafz) para proporcionar nutricion a un organismo que produce una enzima o enzimas. De este modo, plantas que producen las enzimas pueden servir como la materia prima lignocelulosica y anadirse a la materia prima lignocelulosica.
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Actividad enzimatica
Las endo-1,4-p-glucanasas (EG) y exo-celobiohidrolasas (CBH) catalizan la hidrolisis de celulosa insoluble hasta celooligosacaridos (celobiosa como producto principal), mientras que las p-glucosidasas (BGL) convierten los oligosacaridos, principalmente celobiosa y celotriosa, en glucosa.
Las xilanasas junco con enzimas auxiliares, por ejemplo a-L-arabinofuranosidasas, feruloil y acetilxilano esterasas, glucuronidasas y p-xilosidasas) catalizan la hidrolisis de parte de las hemicelulosas.
Las sustancias pecticas incluyen pectinas, arabinanos, galactanos y arabinogalactanos. Las pectinas son los polisacaridos mas complejos de la pared celular de las plantas. Se acumulan alrededor de una cadena central de unidades de acido D-galacturonico con enlaces a(1,4) intercaladas en algun grado con L-ramnosa. En una pared celular cualquiera hay un numero de unidades estructurales que se ajusta a esta descripcion y generalmente se ha considerado que en una molecula pectica individual, las cadenas centrales de diferentes unidades estructurales son contiguas entre sf.
Las pectinasas incluyen, por ejemplo, una endopoligalacturonasa, una pectina metil esterasa, una endogalactanasa, una betagalactosidasa, una pectina acetil esterasa, una endopectina liasa, pectato liasa, alfa-ramnosidasa, una exogalacturonasa, una expoligalacturonato liasa, una ramnogalacturonano hidrolasa, una ramnogalacturonano liasa, una ramnogalacturonano acetil esterasa, una ramnogalacturonano galacturonohidrolasa, una xilogalacturonasa, una a-arabinofuranosidasa.
Los principales tipos de unidad estructural son: galacturonano (homogalacturonano), que puede estar sustituido con metanol en el grupo carboxilo y acetato en O-2 y O-3; ramnogalacturonano I (RGI), en el que las unidades de acido galacturonico se alternan con unidades de ramnosa que soportan cadenas laterales de galactano con enlaces (1,4) y arabinano con enlaces (1,5). Las cadenas laterales de arabinano pueden estar unidas directamente a la ramnosa o indirectamente a traves de las cadenas de galactano; xilogalacturonano, con unidades de xilosilo individuales en O-3 de acido galacturonico (estrechamente asociadas con RGI); y ramnogalacturonano II (RGII), una unidad secundaria particularmente compleja que contiene azucares inhabituales, por ejemplo apiosa. Una unidad de RGII puede contener dos residuos apiosilo que, bajo condiciones ionicas adecuadas, pueden formar reversiblemente esteres con borato.
Como se indica anteriormente, un polipeptido de la invencion tendra tfpicamente actividad potenciadora de celulasa. Sin embargo, un polipeptido de la invencion puede tener una o mas de las actividades indicadas anteriormente ademas de o alternativamente a esa actividad. Ademas, una composicion de la invencion segun se describe en la presente puede tener una o mas de las actividades mencionadas anteriormente ademas de la proporcionada por un polipeptido de la invencion que tiene actividad potenciadora de celulasa.
Secuencia polinucleotfdica
La invencion proporciona secuencias polinucleotfdicas genomicas que comprende el gen que codifica el TEMER07589 asf como su secuencia codificante. Segun esto, la invencion se refiere a un polinucleotido aislado que comprende la secuencia nucleotfdica genomica segun la secuencia nucleotfdica codificante segun SEQ ID N°: 1 y a variantes, tales como equivalentes funcionales, de cualquiera de los mismos.
En particular, la invencion se refiere a un polinucleotido aislado que es capaz de hibridarse selectivamente, por ejemplo bajo condiciones rigurosas, preferiblemente bajo condiciones muy rigurosas, con el complemento inverso de un polinucleotido que comprende la secuencia indicada en SEQ ID N°: 1.
Mas espedficamente, la invencion se refiere a un polinucleotido que comprende o que consiste esencialmente en una secuencia nucleotfdica segun SEQ ID N°: 1.
La invencion tambien se refiere a un polinucleotido aislado que comprende o que consiste esencialmente en una secuencia que codifica al menos un dominio funcional de un polipeptido segun SEQ ID N°: 2 o una variante del mismo, tal como un equivalente funcional, o un fragmento de cualquiera de los mismos.
Segun se usan en la presente, los terminos "gen" y "gen recombinante" se refieren a moleculas de acido nucleico que se pueden aislar de ADN cromosomico, que incluyen un marco de lectura abierto que codifica una protema, p. ej. la protema que potencia celulasa segun la presente invencion.
Un gen puede incluir secuencias codificante, secuencias no codificantes, intrones y/o secuencias reguladoras. Por otra parte, el termino "gen" se puede referir a una molecula de acido nucleico aislada segun se define en la presente.
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Una molecula de acido nucleico de la presente invencion, tal como una molecula de acido nucleico que tiene la secuencia nucleotidica de SEQ ID N°: 1 o una variante de la misma, tal como un equivalente funcional, se puede aislar usando tecnicas de bilogfa molecular estandar y la informacion de secuencia proporcionada en la presente. Por ejemplo, usando la totalidad o una porcion de la secuencia de acido nucleico de SeQ ID N°: 1 como una sonda de hibridacion, moleculas de acido nucleico segun la invencion se pueden aislar usando tecnicas de hibridacion y clonacion estandar (p. ej., segun se describe en Sambrook, J., Fritsh, E. F., y Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989).
Por otra parte, una molecula de acido nucleico que abarca la totalidad o una porcion de SEQ ID N°: 1 se puede aislar mediante la reaccion en cadena de la polimerasa (PCR) usando cebadores oligonucleotidicos sinteticos disenados basandose en la informacion de secuencia contenida en SEQ ID N°: 1.
Un acido nucleico de la invencion se puede amplificar usando ADNc, ARNm o, alternativamente, ADN genomico, como una plantilla y cebadores oligonucleotfdicos apropiados segun tecnicas de amplificacion por PCR estandar. El acido nucleico asf amplificado se puede clonar en un vector apropiado y caracterizar mediante el analisis de la secuencia de ADN.
Por otra parte, oligonucleotidos correspondientes a o hibridables con una secuencia nucleotfdica segun la invencion se pueden preparar mediante tecnicas sinteticas estandar, p. ej., usando un sintetizador de ADN automatizado.
En una realizacion preferida, una molecula de acido nucleico aislada de la invencion comprende la secuencia nucleotidica mostrada en SEQ ID N°: 1.
En otra realizacion preferida, una molecula de acido nucleico aislada de la invencion comprende una molecula de acido nucleico que es el complemento inverso de la secuencia nucleotidica mostrada en SEQ ID N°: 1 o una variante, tal como un equivalente funcional, de cualquiera de tales secuencias nucleotidicas.
Una molecula de acido nucleico que es complementaria a otra secuencia nucleotfdica es una que es suficientemente complementaria a la otra secuencia nucleotidica de modo que se pueda hibridar a la otra secuencia nucleotidica formando de ese modo un duplex estable.
Un aspecto de la invencion trata de moleculas de acido nucleico aisladas que codifican un polipeptido de la invencion o una variante, tal como un equivalente funcional del mismo, por ejemplo un fragmento o dominio biologicamente activo, asf como moleculas de acido nucleico suficientes para el uso como sondas de hibridacion para identificar moleculas de acido nucleico que codifican un polipeptido de la invencion y fragmentos de tales moleculas de acido nucleico adecuados para el uso como cebadores de PCR para la amplificacion o mutacion de moleculas de acido nucleico.
Un polinucleotido segun la invencion se puede "aislar". En el contexto de esta invencion, un "polinucleotido aislado" o "acido nucleico aislado" en un ADN o ARN que no es inmediatamente contiguo con una o ambas de las secuencias codificantes con las que es inmediatamente contiguo (una en el extremo 5' y una en el extremo 3') en el genoma presente en la naturaleza del organismo del que se deriva. Asf, en una realizacion, un acido nucleico aislado incluye algunas o todas las secuencias no codificantes (p. ej. promotoras) 5' que son inmediatamente contiguas a la secuencia codificante. Por lo tanto, el termino incluye, por ejemplo, un aDn recombinante que se incorpora en un vector, en un plasmido o virus que se replica autonomamente, o en el ADN genomico de un procariota o eucariota, o que existe como una molecula separada (p. ej., un ADNc o un fragmento de ADN genomico producido por PCR o tratamiento con endonucleasas de restriccion) independiente de otras secuencias. Tambien incluye un ADN recombinante que es parte de un gen tubrido que codifica un polipeptido adicional que esta sustancialmente libre de material celular, material viral o medio de cultivo (cuando se produce mediante tecnicas de DNA recombinante), o precursores qrnmicos u otros productos qrnmicos (cuando se sintetiza qmmicamente). Por otra parte, un "fragmento de acido nucleico aislado" es un fragmento de acido nucleico que no esta presente en la naturaleza como un fragmento y no se encontrana en estado natural.
Segun se usan en la presente, los terminos "polinucleotido" o "molecula de acido nucleico" pretenden incluir moleculas de ADN (p. ej., ADNc o ADN genomico) y moleculas de ARN (p. ej., ARNm) y analogos del ADN o ARN generados usando analogos nucleotfdicos. La molecula de acido nucleico puede ser de una sola hebra o de doble hebra, pero preferiblemente es ADN de doble hebra. El acido nucleico se puede sintetizar usando analogos o derivados oligonucleotfdicos (p. ej., nucleotidos de inosina o fosforotioato). Estos oligonucleotidos se pueden usar, por ejemplo, para preparar acidos nucleicos que tienen capacidades de apareamiento de bases alteradas o resistencia a nucleasas incrementada.
Otra realizacion de la invencion proporciona una molecula de acido nucleico aislada que es antisentido con respecto a una molecula de acido nucleico de TEMER07589, p. ej., la hebra codificante de una molecula de acido nucleico de
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TEMER07589. Tambien se incluyen dentro del alcance de la invencion las hebras complementarias de las moleculas de acido nucleico descritas en la presente.
A menos que se indique otra cosa, todas las secuencias nucleotidicas determinadas al someter a secuenciacion a una molecula de ADN en la presente se determinaron usando un secuenciador de ADN automatico y todas las secuencias de aminoacidos de los polipeptidos codificados por moleculas de ADN determinadas en la presente se predijeron mediante la traduccion de una secuencia de ADN determinada como anteriormente. Por lo tanto, como se sabe en la tecnica para cualquier secuencia de ADN determinada mediante este enfoque automatico, cualquier secuencia nucleotfdica determinada en la presente puede contener algunos errores. Las secuencias nucleotfdicas determinadas automaticamente son tfpicamente al menos aproximadamente 90% identicas, mas tfpicamente de al menos aproximadamente 95% a al menos aproximadamente 99,9% identicas a la secuencia nucleotfdica real de la molecula de ADN sometida a secuenciacion.
La secuencia real se puede determinar mas precisamente mediante otros enfoques incluyendo metodos de secuenciacion de ADN manuales muy conocidos en la tecnica. Como tambien se conoce en la tecnica, una sola insercion o eliminacion en una secuencia nucleotfdica determinada comparada con la secuencia real provocara un cambio de marco en la traduccion de la secuencia nucleotfdica de modo que la secuencia de aminoacidos predicha codificada por una secuencia nucleotfdica determinada sera completamente diferente de la secuencia de aminoacidos realmente codificada por la molecula de ADN sometida a secuenciacion, empezando en el punto de esta insercion o eliminacion.
El experto en la tecnica es capaz de identificar estas bases erroneamente identificadas y sabe como corregir estos errores.
Una molecula de acido nucleico segun la invencion puede comprender solo una porcion o un fragmento de la secuencia de acido nucleico mostrada en SEQ ID N°: 1 (o una variante de cualquiera de los mismos), por ejemplo un fragmento que se puede usar como una sonda o cebador o un fragmento que codifica una porcion de un polipeptido TEMER07589.
La secuencia nucleotfdica determinada a partir de la clonacion del gen TEMER07589 y ADNc permite la generacion de sondas y cebadores disenados para el uso en la identificacion y/o clonacion de otros miembros de la familia de TEMER07589, asf como homologos de TEMER07589 procedentes de otras especies.
La sonda/el cebador comprende tfpicamente un oligonucleotido sustancialmente purificado que comprende tfpicamente una region de secuencia nucleotfdica que se hibrida preferiblemente bajo condiciones muy rigurosas a al menos de aproximadamente 12 a aproximadamente 15, preferiblemente de aproximadamente 18 a aproximadamente 20, preferiblemente de aproximadamente 22 a aproximadamente 25, mas preferiblemente aproximadamente 30, aproximadamente 35, aproximadamente 40, aproximadamente 45, aproximadamente 50, aproximadamente 55, aproximadamente 60, aproximadamente 65 o aproximadamente 75 o mas nucleotidos consecutivos de una secuencia nucleotfdica mostrada en SEQ ID N°: 1 o de una variante, tal como un equivalente funcional, de cualquiera de los mismos.
Se pueden usar sondas basadas en las secuencias nucleotfdicas de TEMER07589 para detectar transcritos o secuencias de TEMER07589 genomicas que codifican polipeptidos iguales u homologos, a modo de ejemplo, en otros organismos. En realizaciones preferidas, la sonda comprende ademas un grupo marcador ligado a la misma, p. ej., el grupo marcador puede ser un radioisotopo, un compuesto fluorescente, una enzima o un cofactor enzimatico. Estas sondas tambien se pueden usar como parte de un estuche para pruebas diagnosticas para identificar celulas que expresan un polipeptido TEMER07589.
Los polinucleotidos de la presente pueden ser polinucleotidos sinteticos. Los polinucleotidos sinteticos se pueden optimizar en el uso de codones, preferiblemente segun los metodos descritos en los documentos WO2006/077258 y/o PCT/EP2007/055943. El documento PCT/EP2007/055943 se dirige a la optimizacion de pares de codones. La optimizacion de pares de codones es un metodo en el que las secuencias nucleotfdicas que codifican un polipeptido se han modificado con respecto a su utilizacion de codones, en particular los pares de codones que se usan, para obtener una expresion mejorada de la secuencia nucleotfdica que codifica el polipeptido y/o una produccion mejorada del polipeptido codificado. Los pares de codones se definen como un grupo de dos tripletes (codones) subsiguientes en una secuencia codificante.
La invencion se refiere ademas a una construccion de acido nucleico que comprende el polinucleotido que se describe anteriormente. "Construccion de acido nucleico" se define en la presente como una molecula de acido nucleico, bien de una sola hebra o bien de doble hebra, que se afsla de un gen presente en la naturaleza o que se ha modificado para contener segmentos de acido nucleico que se combinan y yuxtaponen de un modo que de otra forma no existina en la naturaleza. El termino construccion de acido nucleico es sinonimo del termino "casete de expresion" cuando la construccion de acido nucleico contiene todas las secuencias de control requeridas para la expresion de una secuencia codificante. El termino "secuencia codificante", segun se define en la presente, es una
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secuencia que se transcribe en ARNm y se traduce en un activador transcripcional de un promotor de proteasa de la invencion. Los Kmites de la secuencia codificante generalmente estan determinados por el codon de iniciacion ATG en el extremo 5' del ARNm y una secuencia codonica de terminacion de la traduccion que termina el marco de lectura abierto en el extremo 3' del ARNm. Una secuencia codificante puede incluir, pero no se limita a, ADN, ADNc, y secuencias de acido nucleico recombinantes. Preferiblemente, el acido nucleico tiene un alto contenido de GC. El contenido de GC en la presente indica el numero de nucleotidos de G y C en la construccion, dividido por el numero total de nucleotidos, expresado en %. El contenido de GC es preferiblemente 56% o mayor, 57% o mayor, 58% o mayor, 59% o mayor, 60% o mayor, o en el intervalo de 56-70% o el intervalo de 58-65%.
Preferiblemente, la construccion de ADN comprende una secuencia de ADN promotora, una secuencia codificante en asociacion operativa con dicha secuencia de ADN promotora y secuencias de control tales como:
una secuencia de terminacion de la traduccion orientada en la direccion 5' hacia 3' seleccionada de la siguiente lista de secuencias: TAAG, TAGA y TAAA, preferiblemente TAAA, y/o
una secuencia codificante iniciadora de la traduccion orientada en la direccion 5' hacia 3' seleccionada de la siguiente lista de secuencias: GCTACCCCC; GCTACCTCC; GCTACCCTC; GCTACCTTC; GCTCCCCCC; GCTCCCTCC; GCTCCCCTC; GCTCCCTTC; GCTGCCCCC; GCTGCCTCC; GCTGCCCTC; GCTGCCTTC; GCTTCCCCC; GCTTCCTCC; GCTTCCCTC; y GCTTCCTTC, preferiblemente GCT TCC TTC, y/o
una secuencia iniciadora de la traduccion seleccionada de la siguiente lista de secuencias: 5'-mwChkyCAAA-3'; 5'- mwChkyCACA-3' o 5'-mwChkyCAAG-3', que usan codigos de ambiguedad para los nucleotidos: m (A/C); w (A/T); y (C/T); k (G/T); h (A/C/T), preferiblemente 5'-CACCGTCAAA-3' o 5'-CGCAGTCAAG-3'.
En el contexto de esta invencion, el termino "secuencia codificante iniciadora de la traduccion" se define como los nueve nucleotidos inmediatamente aguas abajo del codon iniciador o de iniciacion del marco de lectura abierto de una secuencia codificante de ADN. El codon iniciador o de iniciacion codifica el aminoacido metionina. El codon iniciador es tipicamente ATG, pero tambien puede ser cualquier codon de iniciacion funcional tal como GTG.
En el contexto de esta invencion, el termino "secuencia de terminacion de la traduccion" se define como los cuatros nucleotidos partiendo desde el codon de terminacion de la traduccion en el extremo 3' del marco de lectura abierto o la secuencia nucleotidica codificante y orientados en la direccion 5' hacia 3'.
En el contexto de esta invencion, el termino "secuencia iniciadora de la traduccion" se define como los diez nucleotidos inmediatamente aguas arriba del codon iniciador o de iniciacion del marco de lectura abierto de una secuencia de ADN que codifica un polipeptido. El codon iniciador o de iniciacion codifica el aminoacido metionina. El codon iniciador es tipicamente ATG, pero tambien puede ser cualquier codon de iniciacion funcional tal como GTG. Se sabe bien en la tecnica que el uracilo, U, reemplaza al desoxinucleotidos timina, T, en el ARN.
Homologfa e identidad
Se dice que las secuencias de aminoacidos o nucleotidos son homologas cuando exhiben un cierto nivel de similitud. Dos secuencias que son homologas indican un origen evolutivo comun. Que dos secuencias homologas esten estrechamente relacionadas o mas distantemente relacionadas se indica por el "porcentaje de identidad" o el "porcentaje de similitud", que es alto o bajo, respectivamente. Aunque es discutido, para indicar "porcentaje de identidad " o "porcentaje de similitud", frecuentemente se usan intercambiablemente "nivel de homologfa" o "porcentaje de homologfa".
Los terminos "homologfa", "porcentaje de homologfa", "porcentaje de identidad" o "porcentaje de similitud" se usan intercambiablemente en la presente. Para el proposito de esta invencion, se define aqrn que a fin de determinar el porcentaje de identidad de dos secuencias de aminoacidos o de dos secuencias de acido nucleico, las secuencias completas se alinean con propositos de comparacion optimos. A fin de optimizar el alineamiento entre las dos secuencias se pueden introducir huecos en cualquiera de las dos secuencias que se comparan. Tal alineamiento se lleva a cabo a lo largo de toda la longitud de las secuencias que se comparan. Alternativamente, el alineamiento se puede llevar a cabo a lo largo de una longitud mas corta, por ejemplo a los largo de aproximadamente 20, aproximadamente 50, aproximadamente 100 o mas acidos nucleicos/bases o aminoacidos. La identidad es el porcentaje de emparejamientos identicos entre las dos secuencias a lo largo de la region alineada presentada.
Una comparacion de secuencias y una determinacion del porcentaje de identidad entre dos secuencias se pueden efectuar usando un algoritmo matematico. El experto estara al tanto del hecho de que estan disponibles varios programas informaticos diferentes para alinear dos secuencias y determinar la homologfa entre dos secuencias (Kruskal, J. B. (1983) An overview of squence comparison In D. Sankoff and J. B. Kruskal, (ed.), Time warps, string
edits and macromolecules: the theory and practice of sequence comparison, pp. 1-44 Addison Wesley). El porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoacidos se puede determinar usando el algoritmo de Needleman y Wunsch para el alineamiento de dos secuencias. (Needleman, S. B. y Wunsch, C. D. (1970) J. Mol. Biol. 48, 443453). El algoritmo alinea secuencias de aminoacidos asf como secuencias nucleotidicas. El algoritmo de 5 Needleman-Wunsch se ha aplicado en el programa informatico NEEDLE. Para el proposito de esta invencion, se uso el programa NEEDLE del paquete EMBOSS (version 2.8.0 o superior, EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite (2000) Rice, P. Longden, I. y Bleasby, A. Trends in Genetics 16, (6) pp276-277,
http://emboss.bioinformatics.nl/). Para secuencias polipeptfdicas, se usa EBLOSUM62 para la matriz de sustitucion. Para secuencias nucleotidicas, se usa EADNFULL. Se pueden especificar otras matrices. Los parametros 10 opcionales usados para el alineamiento de secuencias de aminoacidos son una penalizacion por hueco-abertura de 10 y una penalizacion por extension del hueco de 0,5. El experto apreciara que todos estos parametros diferentes daran resultados ligeramente diferentes pero que el porcentaje de identidad global de dos secuencias no se altera significativamente cuando se usan diferentes algoritmos.
Definicion de homologfa global
15 La homologfa o identidad es el porcentaje de emparejamientos identicos entre las dos secuencias completas a lo largo de la region alineada total incluyendo cualesquiera huecos o extensiones. La homologfa o identidad entre las dos secuencias alineadas se calcula como sigue: Numero de posiciones correspondientes en el alineamiento que muestran un aminoacido identico en ambas secuencias dividido por la longitud total del alineamiento incluyendo los huecos. La identidad definida como en la presente se puede obtener a partir de NEEDLE y se marca en los 20 resultados del programa como "IDENTIDAD".
Definicion de la identidad mas larga
La homologfa o identidad entra las dos secuencias alineadas se calcula como sigue: Numero de posiciones correspondientes en el alineamiento que muestran un aminoacido identico en ambas secuencias dividido por la longitud total del alineamiento despues de la sustraccion del numero total de huecos en el alineamiento. La identidad 25 definida como en la presente se puede obtener a partir de NEEDLE al usar la opcion NOBRIEF y se marca en los resultados del programa como "identidad mas larga". Para los propositos de la invencion, el nivel de identidad (homologfa) entre dos secuencias (aminoacido o nucleotido) se calcula segun la definicion de "identidad mas larga" que se puede llevar a cabo al usar el programa NEEDLE.
30 Las secuencias polipeptfdicas de la presente invencion se pueden usar ademas como una "secuencia de consulta" para realizar una busqueda frente a bases de datos de secuencias, por ejemplo para identificar otros miembros de la familia o secuencias relacionadas. Tales busquedas se puede realizar usando los programas BLAST. El software para realizar analisis BLAST esta disponible publicamente a traves de the National Center for Biotechnology Information (
http://www.ncbi.nlm.nih.gov). BLASTP se usa para secuencias de aminoacidos y BLASTN para 35 secuencias nucleotfdicas. El programa BLAST usa como defectos:
Coste para abrir un hueco: defecto = 5 para nucleotidos/11 para polipeptidos
Coste para extender un hueco: defecto = 2 para nucleotidos/1 para polipeptidos
Penalizacion por desemparejamiento de nucleotidos: defecto = -3
Recompensa por emparejamiento de nucleotidos: defecto = 1
40 Valor esperado: defecto = 10
Tamano de la palabra: defecto = 11 para nucleotidos/ 28 para megablast/ 3 para polipeptidos
Por otra parte, el grado de identidad (homologfa) local entre la consulta de la secuencia de aminoacidos o la consulta de la secuencia de acido nucleico y las secuencias homologas recuperadas se determina mediante el programa BLAST. Sin embargo, solamente se comparan los segmentos de secuencia que dan un emparejamiento 45 por encima de un cierto umbral. Segun esto, el programa calcula la identidad solamente para estos segmentos emparejados. Por lo tanto, la identidad calculada de este modo se denomina identidad local.
Hibridacion
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Segun se usa en la presente, el termino "hibridar selectivamente", "se hibrida selectivamente" y terminos similares estan destinados a describir condiciones para la hibridacion y el lavado bajo las que secuencias nucleotidicas al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 55%, al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 65%, al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 75%, al menos
aproximadamente 80%, mas preferiblemente al menos aproximadamente 85%, aun mas preferiblemente al menos aproximadamente 90%, preferiblemente al menos 95%, mas preferiblemente al menos aproximadamente 98% o mas preferiblemente al menos aproximadamente 99% homologas entre sf tipicamente permanecen hibridadas entre sr Es decir, tales secuencias que se hibridan pueden compartir al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 55%, al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 65%, al menos
aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 75%, al menos aproximadamente 80%, mas preferiblemente al menos aproximadamente 85%, aun mas preferiblemente al menos aproximadamente 90%, mas preferiblemente al menos 95%, mas preferiblemente al menos 98% o mas preferiblemente al menos aproximadamente 99% de identidad de secuencia.
Un no limitativo preferidos de estas condiciones de hibridacion es la hibridacion en 6X cloruro sodico/citrato sodico (SSC) a aproximadamente 45°C, seguido por uno o mas lavados en 1 X SSC, 0,1% de SDS a aproximadamente 50°C, preferiblemente a aproximadamente 55°C, preferiblemente a aproximadamente 60°C e incluso mas preferiblemente a aproximadamente 65°C.
Condiciones muy rigurosas incluyen, por ejemplo, hibridacion a aproximadamente 68°C en 5x SSC/5x solucion de Denhardt / 1,0% de SDS y lavado en 0,2x SSC/0,1% de SDS a temperatura ambiente. Alternativamente, el lavado se puede realizar a 42°C.
El experto en la tecnica sabra que condiciones aplicar para condiciones de hibridacion rigurosas y muy rigurosas. Directrices adicionales relativas a estas condiciones estan facilmente disponibles en la tecnica, por ejemplo, en Sambrook y cols., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y.; y Ausubel y cols. (eds.), 1995, Current Protocols in Molecular Biology, (John Wiley & Sons, N.Y.).
Por supuesto, un polinucleotido que se hibrida solamente a una secuencia de poli A (tal como el trecho de poli(A) terminal 3' de ARNm), o a un tramo complementario de residuos de T (o U), no se incluina en un polinucleotido de la invencion usado para hibridarse espedficamente a una porcion de un acido nucleico de la invencion, puesto que este polinucleotido se hibridana a cualquier molecula de acido nucleico que contuviera un tramo de poli (A) o el complemento del mismo (p. ej., practicamente cualquier clon de ADNc de doble hebra).
En un enfoque tfpico, se pueden cribar bibliotecas de ADNs construidas a partir de otros organismos, p. ej. un hongo filamentoso, en particular a partir de la familia de microorganismos Trichomaceae, por ejemplo del genero Penicillium, tal como Penicillium decumbens.
Por ejemplo, las cepas de Penicillium se pueden cribar con respecto a polinucleotidos TEMER07589 homologos mediante analisis de transferencia Northern. Al detectar transcritos homologos a polinucleotidos segun la invencion, se pueden construir bibliotecas de ADNc a partir de ARN aislado de la cepa apropiada, utilizando tecnicas estandar muy conocidas por los expertos en la tecnica. Alternativamente, una biblioteca de ADN genomico total se puede rastrear usando una sonda capaz de hibridarse a un polinucleotido TEMER07589 segun la invencion.
Secuencias genicas homologas se pueden aislar, por ejemplo, al realizar PCR usando dos conjuntos de cebadores oligonucleotfdicos degenerados disenados sobre la base de secuencias nucleotidicas como las mostradas en la presente.
La plantilla para la reaccion puede ser ADNc obtenido mediante transcripcion inversa de ARNm preparado a partir de cepas que se sabe o se sospecha que expresan un polinucleotido segun la invencion. El producto de PCR se puede subclonar y someter a secuenciacion para asegurar que las secuencias amplificadas representen las secuencias de una nueva secuencia de acido nucleico de TEMER07589, o un equivalente funcional de la misma.
A continuacion, el fragmento de PCR se puede usar para aislar un clon de ADNc de longitud completa mediante una variedad de metodos conocidos. Por ejemplo, el fragmento amplificado se puede marcar y usar para cribar una biblioteca de ADNc de bacteriofagos o cosmidos. Alternativamente, el fragmento marcado se puede usar para cribar una biblioteca genomica.
La tecnologfa de PCR tambien se puede usar para aislar secuencias de ADNc de longitud completa de otros organismos. Por ejemplo, el ARN se puede aislar, siguiendo procedimientos estandar, de una fuente celular o tisular apropiada. Una reaccion de transcripcion inversa se puede realizar sobre el ARN usando un cebador oiigonucleotidico espedfico para el extremo mas 5' del fragmento amplificado para el cebado de la smtesis de la primera hebra.
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A continuacion, al tubrido de ARN/ADN resultante se le puede "anadir una cola" (p. ej., con guaninas) usando una reaccion de transferasa terminal estandar, el tubrido se puede digerir con RNasa H, y a continuacion la smtesis de la segunda hebra se puede cebar (p. ej., con un cebador de poli-C). Asf, las secuencias de ADNc aguas arriba del fragmento amplificado se pueden aislar facilmente. Para una revision de estrategias de clonacion utiles, veanse, p. ej., Sambrook y cols., anteriormente; y Ausubel y cols., supra.
Vectores
Otros aspecto de la invencion trata de vectores, incluyendo vectores de clonacion y expresion, que comprenden un polinucleotido de la invencion que codifica un polipeptido TEMER07589 o un equivalente funcional del mismo y metodos de crecimiento, transformacion o transfeccion de estos vectores en una celula hospedadora adecuada, por ejemplo bajo condiciones en las que se produce la expresion de un polipeptido de la invencion. Segun se usa en la presente, el termino "vector" se refiere a una molecula de acido nucleico capaz de transportar otro acido nucleico al que se ha enlazado.
Los polinucleotidos de la invencion se pueden incorporar en un vector replicable recombinante, por ejemplo un vector de clonacion o expresion. El vector se puede usar para replicar el acido nucleico en una celula hospedadora compatible. Asf, en una realizacion adicional, la invencion proporciona un metodo para elaborar polinucleotidos de la invencion al introducir un polinucleotido de la invencion en un vector replicable, introducir el vector en una celula hospedadora compatible y hacer crecer la celula hospedadora bajo condiciones que realizan la replicacion del vector. El vector se puede recuperar de la celula hospedadora. Celulas hospedadoras adecuadas se describen posteriormente.
El vector en el que se inserta el casete de expresion o el polinucleotido de la invencion puede ser cualquier vector que se pueda someter convenientemente a procedimientos de DNA recombinante, y la eleccion del vector dependera a menudo de la celula hospedadora en la que se introduzca.
Un vector segun la invencion puede ser un vector que se replica autonomamente, es decir un vector que existe como una entidad extracromosomica, cuya replicacion es independiente de la replicacion cromosomica, p. ej. un plasmido. Alternativamente, el vector puede ser una que, cuando se introduzca en una celula hospedadora, se integre en el genoma de la celula hospedadora y se replique junto con el cromosoma o los cromosomas en los que se ha integrado.
Un tipo de vector es un "plasmido", que se refiere a un bucle de ADN circula de doble hebra en el que se pueden ligar segmentos de ADN adicionales. Otro tipo de vector es un vector viral, en el que segmentos de aDn adicionales se pueden ligar en el genoma viral. Ciertos vectores son capaces de replicacion autonoma en una celula hospedadora en la que se introducen (p. ej., vectores bacterianos que tienen origen de replicacion bacteriano y vectores mairnferos episomicos). Otros vectores (p. ej., vectores marnfferos no episomicos) se integran en el genoma de una celula hospedadora al introducirse en la celula hospedadora, y de ese modo se replican junto con el genoma del hospedador. Por otra parte, ciertos vectores son capaces de dirigir la expresion de genes a los que estan ligados operativamente. Tales vectores se denominan en la presente "vectores de expresion". En general, los vectores de expresion de utilidad en tecnicas de ADN recombinante estan a menudo en la forma de plasmidos. Los terminos "plasmido" y "vector" se pueden usar intercambiablemente en la presente ya que el plasmido es la forma de vector mas comunmente usada. Sin embargo, la invencion esta destinada a incluir estas otras formas de vectores de expresion, tales como un cosmido, vectores virales (p. ej., retrovirus, adenovirus y virus adenoasociados defectuosos en la replicacion) y vectores fagicos que realizan funciones equivalentes.
Para la mayona de los hongos filamentosos y las levaduras, el vector o la construccion de expresion esta integrado preferiblemente en el genoma de la celula hospedadora a fin de obtener transformantes estables. Sin embargo, para ciertas levaduras, tambien estan disponibles vectores episomicos adecuados en los que se puede incorporar la construccion de expresion para una expresion estable y de alto nivel, ejemplos de los mismos incluyen vectores derivados de los plasmidos 2|j y pKD1 de Saccharomyces y Kluyveromyces, respectivamente, o vectores que contienen una secuencia AMA (p. ej. AMA1 de Aspergillus). En caso de que las construcciones de expresion esten integradas en el genoma de las celulas hospedadoras, las construcciones se integran bien en loci aleatorios en el genoma o bien en loci elegidos predeterminados usando recombinacion homologa, en cuyo caso los loci elegidos comprenden preferiblemente un gen altamente expresado.
Segun esto, vectores de expresion utiles en la presente invencion incluyen vectores cromosomicos, episomicos y derivados de virus, p. ej., vectores derivados de plasmidos bacterianos, un bacteriofago, un episoma de levadura, elementos cromosomicos de levadura, virus tales como baculovirus, papovavirus, virus variolovacunales, adenovirus, virus de viruela aviar, virus de seudorrabias y retrovirus, y vectores derivados de combinaciones de los mismos, tales como los derivados de elementos geneticos de un plasmido y un bacteriofago, tales como cosmidos y fagemidos.
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Los vectores segun la invencion se pueden usar in vitro, por ejemplo para la produccion de ARN o se pueden usar para transfectar o transformar una celula hospedadora. El vector de expresion recombinante se puede transcribir y traducir vitro, por ejemplo usando secuencias reguladoras del promotor T7 y T7 polimerasa.
Un vector de la invencion puede comprender dos o mas, por ejemplo tres, cuatro o cinco, polinucleotidos de la invencion, por ejemplo para la sobreexpresion.
Los vectores de expresion recombinantes de la invencion comprenden un acido nucleico de la invencion en una forma adecuada para la expresion del acido nucleico en una celula hospedadora, lo que significa que el vector de expresion recombinante incluye una o mas secuencias reguladoras, seleccionadas sobre la base de las celulas hospedadoras que se van a usar para la expresion, que esta ligado operativamente a la secuencia de acido nucleico que se va a expresar.
Dentro de un vector, tal como un vector de expresion, "ligado operativamente" esta destinado a significa que la secuencia nucleotidica de interes esta ligada a la secuencia o secuencias reguladoras de un modo que permita la expresion de la secuencia nucleotidica (p. ej., en un sistema de transcripcion/traduccion in vitro o en una celula hospedadora cuando el vector se introduce en la celula hospedadora), es decir, el termino "ligado operativamente" se refiere a una yuxtaposicion en las que los componentes descritos en la presente estan en una relacion que los permite funcional de su modo pretendido. Una secuencia reguladora tal como un promotor, un potenciador u otra senal de regulacion de la expresion "ligada operativamente" a una secuencia codificante esta situada de tal modo que la expresion de la secuencia codificante se alcance bajo una condicion compatible con las secuencias de control o las secuencias esten dispuestas de modo que funcionen de forma concertada para su proposito pretendido, por ejemplo la transcripcion se inicia en un promotor y avanza a traves de la secuencia de ADN que codifica el polipeptido.
Un vector o construccion de expresion para una celula hospedadora dada puede comprender asf los siguientes elementos ligados operativamente entre sf en un orden consecutivo desde el extremo 5' hasta el extremo 3' con relacion a la hebra codificante de la secuencia que codifica el polipeptido de la primar invencion: (1) una secuencia promotora capaz de dirigir la transcripcion de la secuencia nucleotidica que codifica el polipeptido en la celula hospedadora dada; (2) opcionalmente, una secuencia de senal capaz de dirigir la secrecion del polipeptido desde la celula hospedadora dada a un medio de cultivo; (3) una secuencia de ADN de la invencion que codifica una forma madura y preferiblemente activa de un polipeptido que tiene actividad potenciadora de celulasa; y preferiblemente tambien (4) una region de terminacion de la transcripcion (terminador) capaz de terminar la transcripcion aguas abajo de la secuencia nucleotidica que codifica el polipeptido.
Aguas abajo de la secuencia nucleotidica segun la invencion puede haber una region no traducida 3' que contiene uno o mas sitios de terminacion de la transcripcion (p. ej. un terminador). El origen del terminador es menos cntico. El terminador, por ejemplo, puede ser natural a la secuencia de ADN que codifica el polipeptido. Sin embargo, preferiblemente, se usa un terminador de levadura en celulas hospedadoras de levadura y se usa un terminador de hongo filamentoso en celulas hospedadoras de hongos filamentosos. Mas preferiblemente, el terminador es endogeno a la celula hospedadora (en la que se va a expresar la secuencia nucleotfdica que codifica el polipeptido). En la region transcrita, puede estar presente un sitio de union al ribosoma para la traduccion. La porcion codificante de los transcritos maduros expresados por las construcciones incluira un AUG de iniciacion de la traduccion al principio y un codon de terminacion situado apropiadamente al final del polipeptido que se va a traducir.
Tambien se puede alcanzar una expresion potenciada del polinucleotido de la invencion mediante la seleccion de regiones reguladoras heterologas, p. ej. regiones promotora, lfder de secrecion y/o terminadora, que pueden servir para incrementar la expresion y, si se desea, los niveles de secrecion del polipeptido de interes desde el hospedador de expresion y/o proporcionar el control inducible de la expresion de un polipeptido de la invencion.
Sera apreciado por los expertos en la tecnica que el diseno del vector de expresion puede depender de factores tales como la eleccion de la celula hospedadora que se va a transformar, el nivel de expresion de polipeptido deseado, etc. Los vectores, tales como vectores de expresion, de la invencion se pueden introducir en celulas hospedadoras para producir de ese modo protemas o peptidos, codificados por acidos nucleicos segun se describe en la presente (p. ej. polipeptidos TEMER07589, formas mutantes de polipeptidos TEMER07589, fragmentos, variantes o equivalentes funcionales de los mismos. Los vectores, tales como vectores de expresion recombinantes, de la invencion se pueden disenar para la expresion de polipeptidos TEMER07589 en celulas procarioticas o eucarioticas.
Por ejemplo, polipeptidos TEMER07589 se pueden expresar en celulas bacterianas tales como E. coli, celulas de insecto (usando vectores de expresion baculovirales), hongos filamentosos, celulas de levadura o celulas de mairnfero. Celulas hospedadoras adecuadas se analizan adicionalmente en Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990). Ejemplos representativos de hospedadores apropiados se describen posteriormente en la presente.
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Medios de cultivo y condiciones apropiados para las celulas hospedadoras descritas anteriormente se conocen en la tecnica.
El termino "secuencias de control" o "secuencias reguladoras" se define en la presente para incluir al menos un componente que pueda ser necesario y/o ventajoso para la expresion de un polipeptido. Cualquier secuencia de control puede ser natural o extrana a la secuencia de acido nucleico de la invencion que codifica un polipeptido. Estas secuencias de control pueden incluir, pero no se limitan a, un promotor, un lfder, secuencias de iniciacion de la traduccion optimas (como las descritas en Kozak, 1991, J. Biol. Chem. 266:19867-19870), una secuencia senalizadora de secrecion, una secuencia propeptidica, una secuencia de poliadenilacion, un terminador de la transcripcion. Como mmimo, las secuencias de control incluyen tipicamente un promotor, y senales de terminacion de la transcripcion y la traduccion. Segun se indica anteriormente, el termino "ligado operativamente" se define en la presente como una configuracion en la que una secuencia de control esta situada apropiadamente en una posicion con relacion a la secuencia codificante de la secuencia de ADN de modo que la secuencia de control dirija la produccion de un polipeptido.
Las secuencias de control pueden estar provistas de conectores con el proposito de introducir sitios de restriccion espedficos que facilitan la ligacion de las secuencias de control con la region codificante de la secuencia de acido nucleico que codifica un polipeptido. El termino "ligado operativamente" se define en la presente como una configuracion en la que una secuencia de control esta situada apropiadamente en una posicion con relacion a la secuencia codificante de la secuencia de ADN de modo que la secuencia de control dirija la produccion de un polipeptido.
La secuencia de control puede ser cualquier secuencia promotora apropiada, una secuencia de acido nucleico, que sea reconocida por una celula hospedadora para la expresion de la secuencia de acido nucleico. La secuencia promotora contiene secuencias de control de la transcripcion, que median en la expresion del polipeptido. El promotor puede ser cualquier secuencia de acido nucleico, que muestra actividad de transcripcion en la celula, incluyendo promotores mutantes, truncados e hforidos, y se pueden obtener de genes que codifican polipeptidos extracelulares o intracelulares bien homologos o bien heterologos para la celula.
La secuencia de control tambien puede ser una secuencia terminadora de la transcripcion adecuada, una secuencia reconocida por una celula de hongo filamentoso para terminar la transcripcion. La secuencia terminadora esta ligada operativamente al termino 3' de la secuencia de acido nucleico que codifica el polipeptido. Cualquier terminador, que sea funcional en la celula, se puede usar en la presente invencion.
La secuencia de control tambien puede ser un terminador. Terminadores preferidos para celulas de hongos filamentosos se obtienen a partir de los genes que codifican TAKA amilasa de A. oryzae, glucoamilasa (glaA) de A. niger, antranilato sintasa de A. nidulans, alfa-glucosidasa de A. niger, gen trpC y proteasa tripsinoide de Fusarium oxysporum.
La secuencia de control tambien puede ser una secuencia lfder adecuada, una region no traducida de un ARNm que es importante para la traduccion de la celula de hongo filamentoso. La secuencia lfder esta conectada operativamente al termino 5' de la secuencia de acido nucleico que codifica el polipeptido. Cualquier secuencia lfder, que sea funcional en la celula, se puede usar en la presente invencion. Lfderes preferidos para celulas de hongos filamentosos se obtienen de los genes que codifican TAKA amilasa de A. oryzae y triosa fosfato isomerasa de A. nidulans y glaA de A. niger.
Otras secuencias de control se pueden aislar del gen IPNS de Penicillium, o gen pcbC, el gen de beta tubulina. Secuencias de control se citan en el documento WO 01/21779.
La secuencia de control tambien puede ser una secuencia de poliadenilacion, una secuencia que esta conectada operativamente al termino 3' de la secuencia de acido nucleico y que, cuando se transcribe, es reconocida por la celula de hongo filamentoso como una senal para anadir residuos de poliadenosina a ARNm transcrito. Cualquier secuencia de poliadenilacion, que sea funcional en la celula, se puede usar en la presente invencion. Secuencias de poliadenilacion preferidas para celulas de hongos filamentosos se obtienen de los genes que codifican TAKA amilasa de A. oryzae, glucoamilasa de A. niger, antranilato sintasa de A. nidulans, proteasa tripsinoide de Fusarium y alfa-glucosidasa de A. niger.
Cuando el polipeptido segun la invencion se va a secretar desde la celula hospedadora al medio de cultivo, una secuencia de senal apropiada se puede anadir al polipeptido a fin de dirigir el polipeptido sintetizado de novo a la ruta de secrecion de la celula hospedadora. El experto en la tecnica conoce la seleccion de una secuencia de senal apropiada para un hospedador espedfico. La secuencia de senal puede ser natural a la celula hospedadora, o puede ser extrana a la celula hospedadora. Como un ejemplo, se puede usar una secuencia de senal procedente de un polipeptido natural para la celula hospedadora. Preferiblemente, dicho polipeptido natural es un polipeptido altamente secretado, es decir un polipeptido que se secreta en cantidades superiores al 10% de la cantidad total de
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polipeptido que se secreta. Las secuencias de senal usadas preferiblemente segun la invencion son, por ejemplo: pmeA.
Como una alternativa para una secuencia de senal, el polipeptido de la invencion se puede fusionar a un polipeptido portador secretado, o parte del mismos. Tal construccion quimerica se dirige a la ruta de secrecion por medio de la secuencia de senal del polipeptido portador, o parte del mismo. Ademas, el polipeptido portador proporcionara un efecto estabilizante al polipeptido segun la invencion y/o puede potenciar la solubilidad. Tal polipeptido portador puede ser cualquier polipeptido. Preferiblemente, un polipeptido altamente secretado se usa como un polipeptido portador. El polipeptido portador puede ser natural o extrano al polipeptido segun la invencion. El polipeptido portador puede ser natural o puede ser extrano a la celula hospedadora. Ejemplos de tales polipeptidos portadores son glucoamilasa, preprosecuencia de factor de emparejamiento alfa, dominio de union a celulosa de protema A que se une a celulosa de Clostridium cellulovorans, glutationa S-transferasa, dominio de union a quitina de quitinasa A1 de Bacillus circulans, dominio de union a maltosa codificado por el gen malE de E. coli K12, beta-galactosidasa y fosfatasa alcalina. Un polipeptido portador preferido para la expresion de esta construccion quimerica en celulas de Aspergillus es la glucoamilasa. La protema y el polipeptido portadores pueden contener un motivo de aminoacido espedfico para facilitar el aislamiento del polipeptido; el polipeptido segun la invencion se puede liberar mediante un agente de liberacion especial. El agente de liberacion puede ser una enzima proteolttica o un agente qrnmico. Un ejemplo de este motivo de aminoacido es el sitio de escision de proteasa KEX, que es muy conocido por los expertos en la tecnica.
Una secuencia de senal se puede usar para facilitar la secrecion y el aislamiento de una protema o un polipeptido de la invencion. Las secuencias de senal se caracterizan tfpicamente por un nucleo de aminoacidos hidrofobos, que are generalmente se escinden de la protema madura durante la secrecion en uno o mas episodios de escision. Estos peptidos de senal contienen sitios de procesamiento que permiten la escision de la secuencia de senal de las protemas maduras a medida que pasan a traves de la ruta secretora. La secuencia de senal dirige la secrecion de la protema, tal como desde un hospedador eucariotico en el que se transforma el vector de expresion, y la secuencia de senal se escinde posteriormente o simultaneamente. A continuacion, la protema se puede purificar facilmente del medio extracelular mediante metodos conocidos. Alternativamente, la secuencia de senal se puede conectar a la protema de interes usando una secuencia, lo que facilita la purificacion, tal como con un dominio GST. Asf, a modo de ejemplo, la secuencia que codifica el polipeptido se puede fusionar a una secuencia marcadora, tal como una secuencia que codifica un peptido, lo que facilita la purificacion del polipeptido fusionado. En ciertas realizaciones preferidas de este aspecto de la invencion, la secuencia marcadora es un peptido de hexahistidina, tal como la etiqueta tag proporcionada en un vector pQE (Qiagen, Inc.), entre otras, muchas de las cuales estan disponibles comercialmente. Segun se describe en Gentz y cols, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:821-824 (1989), a modo de ejemplo, la hexahistidina proporciona una purificacion conveniente de la protema de fusion. La etiqueta HA es otro peptido util para la purificacion que corresponde a un epttopo derivado de protema de hemaglutinina de la gripe, que se ha descrito por Wilson y cols., Cell 37:767 (1984), a modo de ejemplo.
Preferiblemente, una protema de fusion de TEMER07589 de la invencion se produce mediante tecnicas de DNA recombinante estandar. Por ejemplo, fragmentos de ADN que codifican las diferentes secuencias polipeptfdicas se ligan entre sf en el marco segun tecnicas convencionales, por ejemplo al emplear terminos de extremos romos o extremos escalonados para la ligacion, digestion con enzimas de restriccion para proporcionar terminos apropiados, relleno de extremos cohesivos segun sea apropiado, tratamiento con fosfatasa alcalina para evitar un ensamblaje no deseable, y ligacion enzimatica. En otra realizacion, el gen de fusion se puede sintetizar mediante tecnicas convencionales incluyendo sintetizadores de ADN automaticos. Alternativamente, la amplificacion por PCR de fragmentos genicos se puede llevar a cabo usando cebadores de anclaje, que dan lugar a protuberancias complementarias entre dos fragmentos genicos consecutivos que posteriormente se puedan renaturalizar y reamplificar para generar una secuencia genica quimerica (vease, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel y cols. John Wiley & Sons: 1992). Por otra parte, estan disponibles muchos vectores de expresion que ya codifican un resto de fusion (p. ej., un polipeptido GST). Un acido nucleico que codifica TEMER07589 se puede clonar en este vector de expresion de modo que el resto de fusion este conectado en el marco a la protema de TEMER07589.
Preferiblemente, la eficacia de la integracion dirigida en el genoma de la celula hospedadora, es decir la integracion en un locus elegido predeterminado, es incrementada por las capacidades de recombinacion homologa aumentadas de la celula hospedadora. Tal fenotipo de la celula implica preferiblemente un gen hdfA o hdfB deficiente segun se describe en el documento WO2005/095624. El documento WO2005/095624 divulga un metodo preferido para obtener una celula de hongo filamentoso que comprende una eficacia incrementada de integracion dirigida.
Opcionalmente, la celula hospedadora comprende una respuesta de protema desplegada (UPR) elevada en comparacion con la celula silvestre para potenciar las capacidades de produccion de un polipeptido de interes. La UPR se puede incrementar mediante las tecnicas descritas en los documentos US2004/0186070A1 y/o US2001/0034045A1 y/o WO01/72783A2 y/o WO2005/123763. Mas espedficamente, el nivel protemico de HAC1 y/o IRE1 y/o PTC2 se ha modulado, y/o la protema SEC61 se ha manipulado para obtener una celula hospedadora que tiene una UPR elevada.
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Alternativamente, o en combinacion con una UPR elevada, la celula hospedadora se modifica geneticamente para obtener un fenotipo que exhibe menor expresion de proteasa y/o secrecion de proteasa en comparacion con la celula silvestre a fin de potenciar las capacidades de produccion de un polipeptido de interes. Este fenotipo se puede obtener mediante eliminacion y/o modificacion y/o inactivacion de un regulador transcripcional de la expresion de proteasas. Este regulador transcripcional es, p. ej., prtT. La reduccion de la expresion de proteasas mediante la modulacion de prtT se puede realizar mediante las tecnicas descritas en el documento US2004/0191864A1.
Alternativamente, o en combinacion con una UPR elevada y/o un fenotipo que exhibe menor expresion de proteasa y/o secrecion de proteasa, la celula hospedadora exhibe un fenotipo deficiente en oxalato a fin de potenciar el rendimiento de produccion de un polipeptido de interes. Un fenotipo deficiente en oxalato se puede obtener mediante las tecnicas descritas en el documento WO2004/070022A2.
Alternativamente, o en combinacion con una UPR elevada y/o un fenotipo que exhibe menor expresion de proteasa y/o secrecion de proteasa y/o deficiencia de oxalato, la celula hospedadora exhibe una combinacion de diferencias fenotfpicas en comparacion con la celula silvestre para potenciar el rendimiento de produccion del polipeptido de interes. Estas diferencias pueden incluir, pero no se limitan a, expresion disminuida de glucoamilasa y/o alfa-amilasa neutra A y/o alfa-amilasa neutra B, proteasa y acido oxalico hidrolasa. Dichas diferencias fenotfpicas exhibidas por la celula hospedadora se pueden obtener mediante modificacion genetica segun las tecnicas descritas en el documento US2004/0191864A1.
Alternativamente, o en combinacion con una UPR elevada y/o un fenotipo que exhibe menor expresion de proteasa y/o secrecion de proteasa y/o deficiencia de oxalato y una combinacion de diferencias fenotfpicas en comparacion con la celula silvestre para potenciar el rendimiento de produccion del polipeptido de interes, la celula hospedadora exhibe una deficiencia en genes de toxina, inhabilitando la capacidad de la celula hospedadora de hongo filamentoso para expresar toxinas. Estas toxinas incluyen, pero no se limitan a, ocratoxinas, fumonisinas, acido ciclapiazonico, acido 3-nitropropionico, emodina, malformina, aflatoxinas y acidos secalonicos. Esta deficiencia es preferiblemente tal como se describe en el documento WO2000/039322.
(Sobre)expresion
En una realizacion preferida, los polinucleotidos de la presente invencion que se describen en la presente se pueden sobreexpresar en una cepa microbiana de la invencion en comparacion con la cepa microbiana original en la que dicho gen no se sobreexpresa. La sobreexpresion de una secuencia polinucleotfdica se define en la presente como la expresion de dicho gen de secuencia que da como resultado una actividad de la enzima codificada por dicha secuencia en una cepa microbiana que es al menos aproximadamente 1,5 veces la actividad de la enzima en la cepa microbiana original; preferiblemente la actividad de dicha enzima es al menos aproximadamente 2 veces, mas preferiblemente al menos aproximadamente 3 veces, mas preferiblemente al menos aproximadamente 4 veces, mas preferiblemente al menos aproximadamente 5 veces, aun mas preferiblemente al menos aproximadamente 10 veces y lo mas preferiblemente al menos aproximadamente 20 veces la actividad de la enzima en la cepa microbiana original.
El vector puede incluir ademas secuencias que flanquean el polinucleotido dando lugar a ARN que comprenden secuencias homologas a secuencias genomicas eucarioticas o secuencias genomicas virales. Esto permite la introduccion de los polinucleotidos de la invencion en el genoma de una celula hospedadora.
Un vector de clonacion integrador se puede integrar aleatoriamente o en un locus elegido predeterminado en el cromosoma o los cromosomas de la celula hospedadora en la que se va a integrar. En una realizacion preferida de la invencion, un vector de clonacion integrador puede comprender un fragmento de ADN que es homologo a una secuencia de ADN en un locus elegido predeterminado en el genoma de la celula hospedadora para dirigir la integracion del vector de clonacion en este locus predeterminado. A fin de promover la integracion dirigida, el vector de clonacion preferiblemente se puede linealizar antes de la transformacion de la celula hospedadora. La linealizacion se puede realizar preferiblemente de modo que al menos uno pero preferiblemente cualquier extremo del vector de clonacion este flanqueado por secuencias homologas al locus elegido. La longitud de las secuencias homologas que flanquean el locus elegido es preferiblemente al menos aproximadamente 0,1 kb, tal como aproximadamente al menos 0,2 kb, mas preferiblemente al menos aproximadamente 0,5 kb, aun mas preferiblemente al menos aproximadamente 1 kb, lo mas preferiblemente al menos aproximadamente 2 kb. Preferiblemente, las cepas hospedadoras originales se pueden modificar para una frecuencia mejorada de la integracion de ADN elegido, segun se describe en los documentos WO05/095624 y/o WO2007/115886.
El ejemplo de eliminacion proporcionado en la presente invencion usa el promotor del gen como flanco 5' y el gen como el flanco 3' para insertar un marcador de seleccion entre el promotor y el gen, alterando (es decir inactivando funcionalmente) de ese modo la transcripcion genica. Las secuencias genicas dadas anteriormente se pueden usar para elaborar genes funcionalmente inactivados similares. Los genes se pueden dividir en dos, dando un flanco 5' y
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un flanco 3', pero el gen tambien se puede usar para clonar un trozo mas grande de ADN genomico que contiene las regiones promotora y terminadora del gen, que pueden funcionar como flanco 5' y flanco 3'.
El sistema vectorial puede ser un solo vector, tal como un solo plasmido, o dos o mas vectores, tales como dos o mas plasmidos, que juntos contiene el ADN total que se va a introducir en el genoma de la celula hospedadora.
El vector puede contener un polinucleotido de la invencion orientado en una direccion antisentido para proporcionar la produccion de ARN antisentido.
El ADN del vector se puede introducir en celulas procarioticas o eucarioticas a traves de tecnicas de transformacion o transfeccion convencionales. Segun se usa en la presente, los terminos "transformacion” y "transfeccion" pretenden referirse a una variedad de tecnicas reconocidas en la especialidad para introducir un acido nucleico (p. ej., ADN) extrano en una celula hospedadora, incluyendo coprecipitacion con fosfato calcico o cloruro calcico, transfeccion mediada por DEAE-dextrano, transduccion, infeccion, lipofeccion, transfeccion mediada por lfpidos cationicos o electroporacion. Metodos adecuados para transformar o transfectar celulas hospedadoras se pueden encontrar en Sambrook y cols. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989), Davis y cols., Basic Methods in Molecular Biology (1986) y otros manuales de laboratorio.
Para la transfeccion estable de celulas de mairnfero, se sabe que, dependiendo del vector de expresion y la tecnica de transfeccion usados, solo una pequena fraccion de celulas puede integrar el ADN extrano en su genoma. A fin de identificar y seleccionar estos integrantes, un gen que codifica un marcador seleccionable (p. ej., resistencia a antibioticos) se introduce generalmente en las celulas hospedadoras junto con el gen de interes. Marcadores seleccionables preferidos incluyen, pero no se limitan a, los que confieren resistencia a farmacos o que complementan un defecto en la celula hospedadora. Incluyen, p. ej., genes marcadores versatiles que se pueden usar para la transformacion de la mayona de los hongos filamentosos y las levaduras tales como genes de acetamidasa o ADNc (los genes amdS, niaD, facA o ADNcs de A. nidulans, A. oryzae o A. niger), o genes que proporcionan resistencia a antibioticos como resistencia a G418, higromicina, bleomicina, kanamicina, metotrexato, fleomicina o benomilo (benA). Alternativamente, se pueden usar marcadores de seleccion espedficos tales como marcadores auxotroficos que requieren cepas hospedadoras mutantes correspondientes: p. ej. URA3 (procedente de S. cerevisiae o genes analogos procedentes de otras levaduras), pyrG o pyrA (procedentes de A. nidulans o A. niger), argB (procedente de A. nidulans o A. niger) o trpC. En una realizacion preferida, el marcador de seleccion se elimina de la celula hospedadora transformada despues de la introduccion de la construccion de expresion a fin de obtener celulas hospedadoras transformadas capaces de producir el polipeptido que esten libres de genes marcadores de seleccion.
Otros marcadores incluyen ATP sintetasa, subunidad 9 (oliC), orotidina-5'-fosfatodescarboxilasa (pvrA), el gen de resistencia a G418 bacteriano (este tambien se pueden usar en levaduras, pero no en hongos), el gen de resistencia a ampicilina (E. coli), el gen de resistencia a neomicina (Bacillus), el gen de resistencia a nourseotricina natl procedente de Streptomyces nursei, el gen de resistencia a piritiamina ptrA de Aspergillus oryzae y el gen uidA de E. coli, que codifica p-glucuronidasa (GUS). Los vectores de pueden usar in vitro, por ejemplo para la produccion de ARN o se pueden usar para transfectar o transformar una celula hospedadora.
La expresion de protemas en procariotas se lleva a cabo a menudo en E. coli con vectores que contienen promotores constitutivos o inducibles que dirigen la expresion de protemas bien de fusion o bien no de fusion. Los vectores de fusion anaden un numero de aminoacidos a una protema codificada en los mismos, p. ej. al termino amino de la protema recombinante. Tales vectores de fusion consiguen tfpicamente tres propositos: 1) incrementar la expresion de protema recombinante; 2) incrementar la solubilidad de la protema recombinante; y 3) ayudar en la purificacion de la protema recombinante al actuar como un ligando en la purificacion por afinidad. A menudo, en vectores de expresion de fusion, se introduce un sitio de escision proteolftica en la union de la protema de fusion y la protema recombinante para permitir la separacion de la protema recombinante del resto de fusion despues de la purificacion de la protema de fusion.
Segun se indica, los vectores de expresion preferiblemente contendran marcadores seleccionables. Estos marcadores incluyen dihidrofolato reductasa o resistencia a neomicina para un cultivo de celulas eucarioticas y resistencia a tetraciclina o ampicilina para cultivar en E. coli y otras bacterias.
Vectores preferidos para el uso en bacterias se divulgan, por ejemplo, en el documento WO-A1-2004/074468. Otros vectores adecuados seran facilmente evidentes para el experto.
Para la secrecion de la protema traducida en la luz del retmulo endoplasmico, en el espacio periplasmico o en el ambiente extracelular, una senal de secrecion apropiada se puede incorporar en el polipeptido expresado. Las senales pueden ser endogenas al polipeptido o pueden ser senales heterologas.
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El polipeptido TEMER07589 se puede expresar en una forma modificada, tal como una protema de fusion, y puede incluir no solo senales de secrecion sino tambien regiones funcionales heterologas adicionales. As^ a modo de ejemplo, una region de aminoacidos, particularmente aminoacidos cargados, adicionales se puede anadir al termino N del polipeptido para mejorar la estabilidad y la persistencia en la celula hospedadora, durante la purificacion o durante el manejo y el almacenamiento posteriores. Ademas, se pueden anadir restos peptfdicos al polipeptido para facilitar la purificacion
La invencion proporciona un polipeptido aislado que tiene la secuencia de aminoacidos segun SEQ ID N°: 2 y una secuencia de aminoacidos obtenible al expresar el polinucleotido de SEQ ID N°: 1 en un hospedador apropiado. Ademas, un peptido o polipeptido que comprende una variante de los polipeptidos anteriores, tal como un equivalente funcional, esta comprendido dentro de la presente invencion. Los polipeptidos anteriores estan comprendidos colectivamente en el termino "polipeptidos segun la invencion"
El termino "peptido variante" o "polipeptido variante" se define en la presente como un peptido o polipeptido, respectivamente, que comprende una o mas alteraciones, tales como sustituciones, inserciones, eliminaciones y/o truncamientos de uno o mas residuos de aminoacido espedficos en una o mas posiciones en el peptido o polipeptido, respectivamente. Segun esto, un peptido de senal variante es un peptido de senal que comprende una o mas alteraciones, tales como sustituciones, inserciones, eliminaciones y/o truncamientos de uno o mas residuos de aminoacido espedficos en el peptido de senal.
El termino "polinucleotido" es identico al termino "molecula de acido nucleico" y se puede usar en la presente intercambiablemente. El termino se refiere a una molecula de polinucleotido, que es una molecula de acido ribonucleico (ARN) o acido desoxirribonucleico (ADN), bien de una sola hebra o de doble hebra. Un polinucleotido bien puede estar presente en forma aislada o bien estar comprendido en moleculas o vectores de acido nucleico recombinantes, o bien estar comprendido en una celula hospedadora.
El termino "polinucleotido variante" se define en la presente como un polinucleotido que comprende una o mas alteraciones, tales como sustituciones, inserciones, eliminaciones y/o truncamientos de uno o mas nucleotidos en una o mas posiciones espedficas en el polinucleotido.
Los terminos "peptido" y "oligopeptido" se consideran sinonimos (segun se reconoce comunmente) y cada uno de los terminos se puede usar intercambiablemente, segun requiera el contexto, para indicar una cadena de al menos dos aminoacidos acoplados por enlaces peptidflicos. La palabra "polipeptido" se usa en la presente para cadenas que contienen mas de siete residuos de aminoacido. Todas las formulas o secuencias de oligopeptidos y polipeptidos de la presente se escriben de izquierda a derecha y en la direccion del termino ammico al termino carboxflico. El codigo de aminoacidos de una letra usado en la presente se conoce comunmente en la tecnica y se puede encontrar en Sambrook, y cols. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989)
Por polipeptido o protema "aislados" se entiende un polipeptido o una protema retirados de su ambiente natural. Por ejemplo, los polipeptidos y las protemas producidos recombinantemente expresados en celulas hospedadoras se consideran aislados para el proposito de la invencion ya que son polipeptidos naturales o recombinantes que se han purificado sustancialmente mediante cualquier tecnica adecuada tal como, por ejemplo, el metodo de purificacion en una sola etapa divulgado en Smith y Johnson, Gene 67:31-40 (1988).
El polipeptido potenciador de TEMER07589 celulasa segun la invencion se puede recuperar y purificar de cultivos celulares recombinantes mediante metodos conocidos en la tecnica. Lo mas preferiblemente, se emplea para la purificacion cromatograffa de lfquidos de alto rendimiento ("HPLC").
Los polipeptidos de la presente invencion incluyen productos purificados naturalmente, productos de procedimientos qmmicos sinteticos y productos producidos mediante tecnicas recombinantes a partir de un hospedador procariotico o eucariotico, incluyendo, por ejemplo, celulas de bacterias, levaduras, plantas superiores, insectos y mairnferos. Dependiendo del hospedador empleado en un procedimiento de produccion recombinante, los polipeptidos de la presente invencion pueden ser glicosilados o pueden ser no glicosilados. Ademas, los polipeptidos de la invencion tambien pueden incluir un residuo de metionina modificado inicial, en algunos casos como resultado de procesos mediados por el hospedador.
La invencion tambien ofrece fragmentos biologicamente activos de los polipeptidos segun la invencion.
Fragmentos biologicamente activos de un polipeptido de la invencion incluyen polipeptidos que comprenden secuencias de aminoacidos suficientemente identicas a o derivadas de la secuencia de aminoacidos del polipeptido TEMER07589 (p. ej., la secuencia de aminoacidos de SEQ ID N°: 2), que incluyen menos aminoacidos que el polipeptido de longitud completa pero que exhiben al menos una actividad biologica del correspondiente polipeptido de longitud completa. Tfpicamente, los fragmentos biologicamente activos comprenden un dominio o motivo con al menos una actividad del polipeptido TEMER07589.
Un fragmento biologicamente activo de un polipeptido de la invencion puede ser un polipeptido que tiene, por ejemplo, aproximadamente 10, aproximadamente 25, aproximadamente 50, aproximadamente 100 o mas aminoacidos de longitud o al menos aproximadamente 100 aminoacidos, al menos 150, 200, 250, 300, 350, 400 5 aminoacidos de longitud, o de una longitud hasta el numero total de aminoacidos del polipeptido de la invencion.
Por otra parte, otras porciones biologicamente activas, en las que se eliminan otras regiones del polipeptido, se pueden preparar mediante tecnicas recombinantes y evaluar con respecto a una o mas de las actividades biologicas de la forma natural de un polipeptido de la invencion.
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La invencion tambien presente fragmentos de acido nucleico que codifican los fragmentos biologicamente activos anteriores del polipeptido TEMER07589.
Polipeptidos
En otro aspecto de la invencion, se proporcionan polipeptidos TEMER07589 mejorados. Los polipeptidos 15 TEMER07589 mejorados son polipeptidos en los que al menos una actividad biologica se mejora. Estos polipeptidos se pueden obtener al introducir aleatoriamente mutaciones a lo largo de la totalidad o parte de la secuencia codificante de TEMER07589, tal como mediante mutagenesis de saturacion, y los mutantes resultantes se pueden expresar recombinantemente y cribar con respecto a una actividad biologica.
20 Variantes mejoradas de las secuencias de aminoacidos de la presente invencion que conducen a una funcion de potenciacion de celulasa mejorada se pueden obtener mediante los correspondientes genes de la presente invencion. Entre estas modificaciones se incluyen:
1. PCR tendente a erros para introducir mutaciones aleatorias, seguido por un cribado de variantes obtenidas y aislamiento de variantes con propiedades cinetica mejoradas
25 2. Barajado familiar de variantes relacionadas de los genes que codifican la enzima potenciadora de celulasa,
seguido por un cribado de las variantes obtenidas y aislamiento de variantes con propiedades cineticas mejoradas
Variantes de los genes de la presente invencion que conducen a un nivel incrementado de ARNm y/o polipeptido, que dan como resultado mas actividad potenciadora de celulasa, se pueden obtener mediante las secuencias polinucleotfdicas de dichos genes. Entre estas modificaciones, se incluyen:
30 1. Mejorara la utilizacion de codones de tal modo que los codones de adapten (optimamente) al hospedador
microbiano original.
2. Mejorar la utilizacion de pares de codones de tal modo que los codones se adapten (optimamente) al hospedador microbiano original
3. Adicion de secuencias estabilizantes a la informacion genomica que codifica el polipeptido potenciador de 35 celulasa dando como resultado moleculas de ARNm con una semivida incrementada
Metodos preferidos para aislar variantes con propiedades catalfticas mejoradas o niveles incrementados de ARNm o polipeptido se describen en los documentos WO03/010183 y WO03/01311. Metodos preferidos para optimizar la utilizacion de codones en cepas microbianas originales se describen en el documento PCT/EP2007/05594. Metodos preferidos para la adicion de elementos estabilizantes a los genes que codifican el polipeptido potenciador de 40 celulasa de la invencion se describen en el documento WO2005/059149.
En una realizacion preferida, el polipeptido TEMER07589 tiene una secuencia de aminoacidos segun SEQ ID N°: 2. En otra realizacion, el polipeptido TEMER07589 es sustancialmente homologo a la secuencia de aminoacidos segun SEQ ID N°: 2 y retiene al menos una actividad biologica de un polipeptido segun SEQ ID N°: 2, y sin embargo difiere 45 en la secuencia de aminoacidos debido a variacion natural o mutagenesis segun se describe.
En una realizacion preferida adicional, el polipeptido TEMER07589 tiene una secuencia de aminoacidos codificada por un fragmento de acido nucleico aislado capaz de hibridarse a un acido nucleico segun SEQ ID N°: 1, preferiblemente bajo condiciones de hibridacion muy rigurosas.
Segun esto, el polipeptido TEMER07589 es preferiblemente un polipeptido que comprende una secuencia de aminoacidos al menos 76%, al menos 77%, al menos 78%, al menos 79%, al menos 80%, al menos 81%, al menos
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Tambien se pueden identificar equivalentes funcionales de un polipeptido segun la invencion, p. ej., mediante bibliotecas combinatorias de mutantes, p. ej. mutantes de truncamiento, del polipeptido de la invencion para la actividad potenciadora de celulasa. En una realizacion, se genera una biblioteca variegada de variantes mediante mutagenesis combinatoria a nivel de acidos nucleicos. Una biblioteca variegada de variantes se puede producir, por ejemplo, al ligar enzimaticamente una mezcla de oligonucleotidos sinteticos en secuencias genicas de modo que un grupo degenerado de secuencias polipeptfdicas potenciales sea expresable como polipeptidos individuales, o, alternativamente, como un grupo de protemas de fusion mayores (p. ej. para la exhibicion de fagos). Existe una variedad de metodos que se pueden usar para producir bibliotecas de variantes potenciales de los polipeptidos de la invencion a partir de una secuencia oligonucleotfdica degenerada. Se conocen en la tecnica metodos para sintetizar oligonucleotidos degenerados (veanse, p. ej., Narang (1983) Tetrahedron 39:3; Itakura y cols. (1984) Annu. Rev. Biochem. 53:323; Itakura y cols. (1984) Science 198:1056; Ike y cols. (1983) Nucleic Acid Res. 11:477).
Ademas, se pueden usar bibliotecas de fragmentos de la secuencia codificante de un polipeptido de la invencion para generar una poblacion variegada de polipeptidos para secretar una seleccion posterior de variantes. Por ejemplo, se puede generar una biblioteca de fragmentos de secuencias codificantes al tratar un fragmento de PCR de doble hebra de la secuencia codificante de interes con una nucleasa bajo condiciones en las que se produce melladura solo aproximadamente una vez por molecula, desnaturalizar el ADN de doble hebra, renaturalizar el ADN para formar ADN de doble hebra que puede incluir pares de sentido/antisentido de diferentes productos mellados, retirar porciones de una sola hebra de duplex reformados mediante tratamiento con S1 nucleasa y ligar la biblioteca de fragmentos resultante en un vector de expresion. Mediante este metodo, se puede derivar una biblioteca de expresion que codifica fragmentos N-terminales e internos de diversos tamanos de la protema de interes.
Se conocen varias tecnicas en la especialidad para cribar productos genicos de bibliotecas combinatorias mediante mutaciones puntuales de truncamiento, y para cribar bibliotecas de ADNc con respecto a productos genicos que tengan una propiedad seleccionada. Las tecnicas mas ampliamente usadas, que estan disponibles para un analisis de alto rendimiento, para cribar bibliotecas genicas grandes incluyen tipicamente clonar la biblioteca genica en vectores de expresion replicables, transformar celulas apropiadas con la biblioteca de vectores resultante y expresar los genes combinatorios bajo condiciones en las que la deteccion de una actividad deseada facilite el aislamiento del vector que codifica el gen cuyo producto se detectaba. La mutagenesis recursiva de conjunto (REM), una tecnica que potencia la frecuencia de mutantes funcionales en las bibliotecas, se puede usar en combinacion con los ensayos de cribado para identificar variantes de un polipeptido de la invencion (Arkin y Yourvan (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7811-7815; Delgrave y cols. (1993) Protein Engineering 6(3): 327-331).
Ademas de la secuencia genica de TEMER07589 mostrada en SEQ ID N°: 1, sera evidente para el experto que pueden existir polimorfismos de secuencia de ADN dentro de una poblacion dada, que pueden conducir a cambios en la secuencia de aminoacidos del polipeptido TEMER07589. Tales polimorfismos geneticos pueden existir en celulas procedentes de diferentes poblaciones o dentro de una poblacion debido a variacion alelica. Las variantes alelicas tambien pueden incluir equivalentes funcionales.
Los fragmentos de un polinucleotido segun la invencion tambien pueden comprender polinucleotidos que codifiquen polipeptidos funcionales. Estos polinucleotidos pueden funcionar como sonda o cebadores para una reaccion PCR.
Los acidos nucleicos segun la invencion independientemente de si codifican polipeptidos funcionales o no funcionales se pueden usar como sondas de hibridacion o cebadores de la reaccion en cadena de la polimerasa (PCR). Usos de las moleculas de acido nucleico de la presente invencion que no codifican un polipeptido que tiene una actividad de TEMER07589 incluyen, entre otros, (1) aislar el gen que codifica el polipeptido TEMER07589 o variantes alelicas del mismo de una biblioteca de ADNc, p. ej. de microorganismos adecuados; (2) hibridacion in situ (p. ej. FISH) a extensiones cromosomicas metafasicas para proporcionar una localizacion cromosomica precisa del gen TEMER07589 segun se describe en Verma y cols., Human Chromosomes: a Manual of Basic Techniques, Pergamon Press, Nueva York (1988); (3) analisis por transferencia Northern para detectar la expresion de ARNm de TEMER07589 en tejidos y/o celulas espedficos y 4) sondas y cebadores que se pueden usar como una herramienta de diagnostico para analizar la presencia de un acido nucleico hibridable a la sonda de TEMER07589 en una muestra biologica (p. ej. tejido).
Tambien es abarcado por la invencion un metodo para obtener un equivalente funcional de un gen TEMER07589. Este metodo implica obtener una sonda marcada que incluye un acido nucleico aislado que codifica la totalidad o una porcion de la secuencia polipeptfdica segun SEQ ID N°: 2 o una variante del mismo; cribar una biblioteca de fragmentos de acido nucleico con la sonda marcada bajo condiciones que permitan la hibridacion de la sonda a fragmentos de acido nucleico de la biblioteca, formado de ese modo duplex de acido nucleico, y preparar una
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secuencia genica de longitud completa a partir de los fragmentos de acido nucleico en cualquier duplex marcado para obtener un gen relacionado con el gen TEMER07589.
En una realizacion, un acido nucleico de TEMER07589 de la invencion es al menos 80%, al menos 81%, al menos 82%, al menos 83%, al menos 84%, al menos 85%, al menos 86%, al menos 87%, al menos 88%, al menos 89%, al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99% o mas homologo a una secuencia de acido nucleico mostrada en SEQ ID N°: 1 o el complemento de la misma.
Se proporcionan ademas celulas hospedadoras que comprenden un polinucleotido o vector de la invencion. El polinucleotido puede ser heterologo al genoma de la celula hospedadora. El termino "heterologo", habitualmente con respecto a la celula hospedadora, significa que el polinucleotido no esta presente naturalmente en el genoma de la celula hospedadora o que el polipeptido no es producido naturalmente por esa celula.
En otra realizacion, la invencion presenta celulas, p. ej., celulas hospedadoras transformadas o celulas hospedadoras recombinantes que contienen un acido nucleico abarcado por la invencion. Una "celula transformada" o "celula recombinante" es una celula en la que (o en un progenitor de la cual) se ha introducido, por medio de tecnicas de ADN recombinante, un acido nucleico segun la invencion. Se incluyen celulas tanto procarioticas como eucarioticas, p. ej., bacterias, hongos, levaduras y similares, se prefieren especialmente celulas procedentes de hongos filamentosos, tales como Aspergillus niger o Talaromyces emersonii.
Se puede elegir una celula hospedadora que module la expresion de las secuencias insertadas o modifique y procese el producto genico de un modo deseado espedfico. Estas modificaciones (p. ej., glicosilacion) y el procesamiento (p. ej., escision) de productos protemicos pueden facilitar el funcionamiento optimo de la protema.
Diversas celulas hospedadoras tienen mecanismos caractensticos y espedficos para el procesamiento y la modificacion postraduccionales de protemas y productos genicos. Lmeas celulares o sistemas hospedadores apropiados familiares para los expertos en la tecnica de la biologfa molecular y/o la microbiologfa se pueden elegir para asegurar la modificacion y el procesamiento deseados y correctos de la protema extrana expresada. A este fin, se pueden usar celulas hospedadoras eucarioticas que poseen la maquinaria celular para un procesamiento apropiado del transcrito primario, glicosilacion y fosforilacion del producto genico. Estas celulas hospedadoras son muy conocidas en la tecnica.
Si se desea, una celula como la descrita anteriormente se puede usar en la preparacion de un polipeptido segun la invencion. Este metodo comprende tfpicamente cultivar una celula hospedadora (p. ej. transformada o transfectada con un vector de expresion como el descrito anteriormente) bajo condiciones que proporcionen la expresion (mediante el vector) de una secuencia codificante que codifica el polipeptido, y opcionalmente recuperar el polipeptido expresado. Los polinucleotidos de la invencion se pueden incorporar en un vector replicable recombinante, p. ej. un vector de expresion. El vector se puede usar para replicar en acido nucleico en una celula hospedadora compatible. Asf, en una realizacion adicional, la invencion proporciona un metodo para elaborar un polinucleotido de la invencion al introducir un polinucleotido de la invencion en un vector replicable, introducir el vector en una celula hospedadora compatible y hacer crecer la celula hospedadora bajo condiciones que lleven a cabo la replicacion del vector. El vector se puede recuperar de la celula hospedadora.
Preferiblemente, el polipeptido se produce como una protema secretada, en cuyo caso la secuencia nucleotfdica que codifica una forma madura del polipeptido en la construccion de expresion se conecta operativamente a una secuencia nucleotfdica que codifica una secuencia de senal. Preferiblemente, la secuencia de senal es natural (homologa) a la secuencia nucleotfdica que codifica el polipeptido. Alternativamente, la secuencia de senal es extrana (heterologa) a la secuencia nucleotfdica que codifica el polipeptido, en cuyo caso la secuencia de senal es preferiblemente endogena a la celula hospedadora en la que se expresa la secuencia nucleotfdica segun la invencion. Ejemplos de secuencias de senal adecuadas para celulas hospedadoras de levadura son las secuencias de senal derivadas de genes de factor a de levadura. De forma similar, una secuencia de senal adecuada para celulas hospedadoras de hongos filamentosos es, p. ej., una secuencia de senal derivada de un gen de amiloglucosidasa (AG) de hongo filamentoso, p. ej. el gen glaA de A. niger. Este se puede usar en combinacion con el propio promotor de amiloglucosidasa (tambien llamada (gluco)amilasa), asf como en combinacion con otros promotores. Tambien se pueden usar secuencias de senal hteridas con el contexto de la presente invencion.
Secuencias lfder de secrecion heterologas preferidas son las que se originan a partir del gen de amiloglucosidasa (AG) fungica (glaA-las versiones tanto de 18 como de 24 aminoacidos, p. ej., procedentes de Aspergillus), el gen de factor a (levaduras, p. ej. Saccharomyces y Kluyveromyces) o el gen de a-amilasa (Bacillus).
Los vectores se pueden transformar o transfectar en una celula hospedadora adecuada segun se describe anteriormente para proporcionar la expresion de un polipeptido de la invencion. Este procedimiento puede comprender cultivar una celula hospedadora transformada con un vector de expresion segun se describe
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anteriormente bajo condiciones que proporcionen la expresion mediante el vector de una secuencia codificante que codifica el polipeptido.
Celulas hospedadoras
La invencion proporciona asf celulas hospedadoras transformadas o transfectadas con o que comprenden un polinucleotido o vector de la invencion. Preferiblemente, el polinucleotido es portado en un vector para la replicacion y la expresion del polinucleotido. Las celulas se elegiran para que sean compatibles con dicho vector y pueden ser, por ejemplo, celulas procarioticas (por ejemplo bacterianas), fungicas, de levadura o vegetales.
Tambien se puede elegir un huesped heterologo en el que el polipeptido de la invencion se produce en una forma que esta sustancialmente libre de otras enzimas de degradacion de celulosa o de degradacion de hemicelulosa. Esto se puede conseguir al elegir un huesped que no produzca normalmente estas enzimas.
La invencion abarca procedimientos para la produccion del polipeptido de la invencion por medio de la expresion recombinante de una secuencia de ADN que codifica el polipeptido. Con este proposito, la secuencia de ADN de la invencion se puede usar para la amplificacion genica y/o el intercambio de senales de expresion, tales como promotores, secuencias de senal de secrecion, a fin de permitir la produccion economica del polipeptido en una celula hospedadora homologa o heterologa adecuada. Una celula hospedadora homologa es una celula hospedadora que es de la misma especie o que es una variante dentro de la mima especie que la especie de la que se deriva la secuencia de ADN.
Celulas hospedadoras adecuadas con preferiblemente microorganismos procarioticos tales como bacterias, o mas preferiblemente organismos eucarioticos, por ejemplo hongos, tales como levaduras u hongos filamentosos, o celulas vegetales. En general, las celulas de levadura se prefieren sobre las celulas fungicas debido a que son mas faciles de manipular. Sin embargo, algunas protemas bien son secretadas escasamente de las levaduras o bien en algunos casos no se procesan apropiadamente (p. ej. hiperglicosilacion en levadura). En estos casos, se debe seleccionar un organismo hospedador fungico.
La celula hospedadora puede sobreexpresar el polipeptido, y se conocen bien las tecnicas para manipular la sobreexpresion. El hospedador puede tener asf dos o mas copias del polinucleotido codificante (y segun esto el vector puede tener asf dos o mas copias).
Las bacterias del genero Bacillus son muy adecuadas como hospedadores heterologos debido a su capacidad para secretar protemas en el medio de cultivo. Otras bacterias adecuadas como hospedadores son las de los generos Streptomyces y Pseudomonas. Una celula hospedadora de levadura preferida para la expresion de la secuencia de ADN que codifica el polipeptido es de los generos Saccharomyces, Kluyveromyces, Hansenula, Pichia, Yarrowia, y Schizosaccharomyces.
Mas preferiblemente, una celula hospedadora de levadura se selecciona del grupo que consiste en las especies Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces lactis (tambien conocida como Kluyveromyces marxianus var. lactis), Hansenula polimorpha, Pichia pastoris, Yarrowia lipolitica y Schizosaccharomyces pombe.
Sin embargo, las mas preferidas son las celulas hospedadoras de hongos (p. ej. filamentosos). Celulas hospedadoras de hongos filamentosos preferidas se seleccionan del grupo que consiste en los generos Aspergillus, Trichoderma/Hypocrea, Fusarium, Disporotrichum, Penicillium, Acremonium, Neurospora, Thermoascus, Myceliophtora, Sporotrichum, Thielavia, Chryosporium, Fusarium, Humicola, Neurospora y Talaromyces.
Mas preferiblemente, una celula hospedadora de hongo filamentosos es de las especies que incluyen, pero no se limitan a, Aspergillus niger, Aspergillus awamori, Aspergillus tubingensis, Aspergillus aculeatus, Aspergillus foetidus, Aspergillus nidulans, Aspergillus japonicus, Aspergillus oryzae and Aspergillus ficuum, Trichoderma reesei/Hypocrea jecorina, Fusarium graminearum, Talaromyces emersonii, Penicillium decumbens, Acremonium alabamense, Neurospora crassa, Myceliophtora thernaophilurri, Sporotrichum cellulophilum, Disporotrichum dimorphosporum, Talaromyces emersonii, Talaromyces stipitatus y Thielavia terrestris.
Las celulas hospedadoras segun la invencion incluyen celulas vegetales, y la invencion se extiende por lo tanto a organismos transgenicos, tales como plantas y partes de las mismas, que contienen una o mas celulas de la invencion. Las celulas pueden expresar heterologamente el polipeptido de la invencion o pueden contener heterologamente uno o mas de los polinucleotidos de la invencion. Por lo tanto, la planta transgenica (o geneticamente modificada) puede tener insertado (p. ej. establemente) en su genoma una secuencia que codifica uno o mas de los polipeptidos de la invencion. La transformacion de celulas vegetales se puede realizar usando tecnicas conocidas, por ejemplo usando un plasmido Ti o Ri procedente de Agrobacterium tumefaciens. El plasmido (o vector) puede contener asf secuencias necesarias para infectar una planta, y se pueden emplear derivados de los plasmidos Ti y/o Ri.
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Alternativamente, se puede efectuar la infeccion directa de una planta, tal como una hoja, ra^z o tallo. En esta tecnica la planta que se va a infectar se puede herir, por ejemplo, al cortar la planta con una cuchilla o perforar la planta con una aguja o frotar la planta con un abrasivo. A continuacion, la herida se inocula con la Agrobacterium. A continuacion, la planta o parte de planta se puede hacer crecer sobre un medio de cultivo adecuado y dejar desarrollar hasta una planta madura. La regeneracion de plantas transformadas en plantas geneticamente modificadas se puede conseguir al usar tecnicas conocidas, por ejemplo al seleccionar brotes transformados usando un antibiotico y subcultivar los brotes sobre un medio que contienen los nutrientes, hormonas de plantas y similares apropiados.
La invencion tambien incluye celulas que se han modificado para expresar el polipeptido mejorador de celulasa de la invencion o una variante del mismo. Estas celulas incluyen lmeas celulares eucarioticas superiores transitorias, o preferiblemente estables, tales como celulas de mairnferos o celulas de insectos, celulas eucarioticas inferiores, tales como celulas de levaduras y hongos (p. ej. filamentosos) o celulas procarioticas tales como celulas bacterianas.
Tambien es posible que los polipeptidos de la invencion se expresen transitoriamente en una lmea celular o sobre una membrana, tal como, por ejemplo, en un sistema de expresion de baculovirus. Estos sistemas, que se adaptan para expresar los polipeptidos segun la invencion, tambien se incluyen dentro del alcance de la presente invencion.
Segun la presente invencion, la produccion del polipeptido de la invencion se puede efectuar mediante el cultivo de hospedadores de expresion microbianos, que se han transformado con uno o mas polinucleotidos de la presente invencion, en un medio de fermentacion con nutrientes convencional.
Produccion de polipeptidos/enzimas
Las celulas hospedadoras recombinantes segun la invencion se pueden cultivar usando procedimientos conocidos en la tecnica. Para cada combinacion de un promotor y una celula hospedadora, estan disponibles condiciones de cultivo que conducen a la expresion de la secuencia de ADN que codifica el polipeptido. Despues de alcanzar la densidad o concentracion celular deseada del polipeptido, el cultivo se detiene y el polipeptido se recupera usando procedimientos conocidos.
El medio de fermentacion puede comprender un medio de cultivo conocido que contiene una fuente de carbono (p. ej. glucosa, maltosa, melazas, almidon, celulosa, xilano, pectina, hidrolizado de biomasa lignocelolftica, etc.), una fuente de nitrogeno (p. ej. sulfato amonico, nitrato amonico, cloruro amonico, etc.), una fuente de nitrogeno organico (p. ej. extracto de levadura, extracto de malta, peptona, etc.) y fuentes de nutrientes inorganicos (p. ej. fosfato, magnesio, potasio, cinc, hierro, etc.). Opcionalmente, se puede incluir un inductor (p. ej. celulosa, pectina, xilano, maltosa, maltodextrina o xilogalacturonano).
La seleccion del medio apropiado se puede basar en la eleccion del hospedador de expresion y/o basar en los requisitos reguladores de la construccion de expresion. Estos medios son conocidos por los expertos en la tecnica. Si se desea, el medio puede contener componentes adicionales que favorecen los hospedadores de expresion transformados sobre otros microorganismos potencialmente contaminantes.
La produccion de polipeptido por el hospedador transformado (fermentacion) se puede realizar segun cualquier procedimiento conocido. El tiempo de produccion se puede prolongar durante un penodo de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 30 dfas. Puede ser un procedimiento discontinuo, continuo o alimentado por lotes, adecuadamente a una temperatura en el intervalo de 0-100°C o 0-80°C, por ejemplo, de aproximadamente 0 a aproximadamente 60°C y/o a un pH, por ejemplo, de aproximadamente 2 a aproximadamente 10, o de aproximadamente 3 a aproximadamente 9. Condiciones de fermentacion preferidas son una temperatura en el intervalo de aproximadamente 20 a aproximadamente 55°C y/o a un pH de aproximadamente 3 a aproximadamente 5. Las condiciones apropiadas se seleccionan habitualmente basandose en la eleccion del hospedador de expresion y el polipeptido que se va a expresar.
Despues de la fermentacion, si es necesario, las celulas se pueden retirar del caldo de fermentacion por medio de centrifugacion o filtracion. Despues de que la fermentacion se haya detenido o despues de la retirada de las celulas, el polipeptido de la invencion se puede recuperar y, si se desea, purificar y aislar por medios convencionales.
Composiciones de polipeptido/enzima
La invencion proporciona una composicion que comprende un polipeptido de la invencion y una celulasa y/o una hemicelulasa y/o una pectinasa.
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Cuando el polipeptido de la invencion es una celulasa, una composicion de la invencion comprendera tipicamente una hemicelulasa y/o una pectinasa ademas del polipeptido de la invencion.
Cuando el polipeptido de la invencion es una hemicelulasa, una composicion de la invencion tipicamente comprendera una celulasa y/o una pectinasa ademas del polipeptido de la invencion.
Cuando el polipeptido de la invencion es una pectinasa, una composicion de la invencion comprendera tipicamente una celulasa y/o una hemicelulasa ademas del polipeptido de la invencion.
Una composicion de la invencion comprendera una, dos o tres o mas clases de celulasa, por ejemplo una, dos o la totalidad de una endo-1,4-p-glucanasa (EG), una exo-celobiohidrolasa (CBH) y una p-glucosidasa (BGL).
Una composicion de la invencion puede comprender un polipeptido que tiene la misma actividad enzimatica, por ejemplo el mismo tipo de actividad de celulasa, hemicelulasa y/o pectinasa que el proporcionado por un polipeptido de la invencion.
Una composicion de la invencion puede comprender un polipeptido que tiene un tipo diferente de actividad de celulasa y/o actividad de hemicelulasa y/o actividad de pectinasa que el proporcionado por un polipeptido de la invencion. Por ejemplo, una composicion de la invencion puede comprender un tipo de actividad de celulasa y/o hemicelulasa y/o actividad de pectinasa proporcionado por un polipeptido de la invencion y un segundo tipo de actividad de celulasa y/o hemicelulasa y/o actividad de pectinasa proporcionado por una hemicelulasa/pectinasa adicional.
En la presente, una celulasa es cualquier polipeptido que sea capaz de degradar celulosa. Un polipeptido que es capaz de degradar celulosa es uno que es capaz de catalizar el proceso de descomponer la celulosa en unidades menores, bien parcialmente, por ejemplo en celodextrinas, o bien completamente en monomeros de glucosa. Una celulasa segun la invencion puede dar lugar a una poblacion mixta de celodextrinas y monomeros de glucosa cuando se pone en contacto con la celulasa. Esta degradacion tendra lugar tipicamente por medio de una reaccion de hidrolisis.
En la presente, una hemicelulasa es cualquier polipeptido que sea capaz de degradar hemicelulosa. Es decir, una hemicelulasa puede ser capaz de degradar uno o mas de of xilano, glucuronoxilano, arabinoxilano, glucomanano y xiloglucano. Un polipeptido que es capaz de degradar una hemicelulosa es uno que es capaz de catalizar el proceso de descomposicion de la hemicelulosa en polisacaridos menores, bien parcialmente, por ejemplo en oligosacaridos, o bien completamente en monomeros sacaricos, por ejemplo monomeros sacaricos de hexosa o pentosa. Una hemicelulasa segun la invencion puede dar lugar a una poblacion mixta de oligosacaridos y monomeros sacaricos cuando se pone en contacto con la hemicelulasa. Tal degradacion tendra lugar tipicamente por medio de una reaccion de hidrolisis.
En la presente, una pectinasa es cualquier polipeptido que sea capaz de degradar pectina. Un polipeptido que sea capaz de degradar pectina es uno que es capaz de catalizar el proceso de descomposicion de pectina en unidades menores, bien parcialmente, por ejemplo en oligosacaridos, o bien completamente en monomeros sacaricos. Una pectinasa segun la invencion puede dar lugar a una poblacion mixta de oligosacaridos y monomeros sacaricos cuando se pone en contacto con la pectinasa. Tal degradacion tendra lugar tipicamente por medio de una reaccion de hidrolisis.
Segun esto, una composicion de la invencion puede comprender cualquier celulasa, por ejemplo, una celobiohidrolasa, una endo-p-1,4-glucanasa, una p-glucosidasa o una p-(1,3)(1,4)-glucanasa.
En la presente, una celobiohidrolasa es cualquier polipeptido que sea capaz de catalizar la hidrolisis de enlaces 1,4- p-D-glucosfdicos en celulosa o celotetraosa, liberando celobiosa de los extremos de las cadenas. Esta enzima tambien se puede denominar celulasa, 1,4-p-celobiosidasa, 1,4-p-celobiohidrolasa, 1,4-p-D-glucano celobiohidrolasa, avicelasa, exo-1,4-p-D-glucanasa, potenciador de exocelulasa o exoglucanasa. Puede tener el codigo EC EC 3.2.1.91. Las celobiohidrolasas se pueden subdividir en celobiohidrolasa I (CBH I) y celobiohidrolasa II (CBH II). CBH I se define como celobiohidrolasas que hidrolizan celulosa predominantemente desde los extremos reductores, fragmentando la celobiosa. CBH II se define como celobiohidrolasas que hidrolizan celulosa predominantemente desde los extremos no reductores, fragmentando la celobiosa.
En la presente, una endo-p-1,4-glucanasa (EC 3.2.1.4) es cualquier polipeptido que sea capaz de catalizar la endohidrolisis de enlaces 1,4-p-D-glucosfdicos en celulosa, liquenina o p-D-glucano de cereales. Este polipeptido tambien puede ser capaz de hidrolizar enlaces 1,4 en p-D-glucano que tambien contiene enlaces 1,3. Esta enzima tambien se puede denominar celulasa, avicelasa, p-1,4-endoglucano hidrolasa, p-1,4-glucanasa, carboximetilcelulasa, celudextrinasa, endo-1,4-p-D-glucanasa, endo-1,4-p-D-glucanohidrolasa, endo-1,4-p- glucanasa o endoglucanasa. CEA es en la presente una endoglucanasa EC 3.2.1.4 que basandose en su estructura tridimensional se clasifica bajo la familia de glicosil hidrolasas 5 (GH5). Actividades conocidas para miembros de la
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familia GH5 incluyen quitosanasa (EC 3.2.1.132); p-manosidasa (EC 3.2.1.25); celulasa (EC 3.2.1.4); glucano 1,3-p- glucosidasa (EC 3.2.1.58); liqueninasa (EC 3.2.1.73); glucano endo-1,6-p-glucosidasa (EC 3.2.1.75); manano endo- p-1,4-manosidasa (EC 3.2.1.78); endo-p-1,4-xilanasa (EC 3.2.1.8); celulosa p-1,4-celobiosidasa (EC 3.2.1.91); endo- p-1,6-galactanasa (EC 3.2.1.-); p-1,3-mananasa (EC 3.2.1.-); endo-p-1,4-glucanasa espedfica de xiloglucano (EC 3.2.1.151); manano transglicosilasa (EC 2.4.1.-). CEB en la presente una endoglucanasa EC 3.2.1.4 que basandose en su estructura tridimensional se clasifica bajo la familia de glicosil hidrolasa 7 (GH7). Actividades conocidas para miembros de la familia GH7 incluyen endo-p-1,4-glucanasa (EC 3.2.1.4); celobiohidrolasa [que actua sobre extremos reductores] (EC 3.2.1.-); quitosanasa (EC 3.2.1.132); endo-p-1,3-1,4-glucanasa (EC 3.2.1.73)
En la presente, una p-glucosidasa (abreviada BG) (EC 3.2.1.21) es cualquier polipeptido que sea capaz de catalizar la hidrolisis de residuos de p-D-glucosa no reductores terminales con liberacion de p-D-glucosa. Este polipeptido puede tener una amplia especificidad para p-D-glucosidos y tambien puede hidrolizar uno o mas de los siguientes: a p-D-galactosido, un a-L-arabinosido, un p-D-xilosido o un p-D-fucosido. Esta enzima tambien se puede denominar amigdalasa, p-D-glucosido glucohidrolasa, celobiasa o gentiobiasa.
En la presente, una p-(1,3)(1,4)-glucanasa (EC 3.2.1.73) es cualquier polipeptido que sea capaz de catalizar la hidrolisis de enlaces 1,4-p-D-glucosfdicos en p-D-glucanos que contienen uniones 1,3 y 1,4. Este polipeptido puede actuar sobre liquenina y p-D-glucanos de cereales, pero no sobre p-D-glucanos que contienen solamente uniones 1,3 o 1,4. Esta enzima tambien se puede denominar liqueninasa, 1,3-1,4-p-D-glucano 4-glucanohidrolasa, p- glucanasa, endo-p-1,3-1,4 glucanasa, liquenasa o p-glucanasa con enlaces mixtos. Una alternativa para este tipo de enzima es EC 3.2.1.6, que se describe como endo-1,3(4)-beta-glucanasa. Este tipo de enzima hidroliza enlaces 1,3 o 1,4 en beta-D-glucanos cuando el residuo de glucosa cuyo grupo reductor esta implicado en el enlace que se va a hidrolizar esta el mismo sustituido en C-3. Nombres alternativos incluyen endo-1,3-beta-glucanasa, laminarinasa,
1.3- (1,3;1,4)-beta-D-glucano 3 (4) glucanohidrolasa; los sustratos incluyen laminarina, liquenina y beta-D-glucanos de cereales.
Una composicion de la invencion puede comprender cualquier hemicelulasa, por ejemplo, una endoxilanasa, una p- xilosidasa, una a-L-arabionofuranosidasa, una a-D-glucuronidasa, una acetil xilano esterasa, una feruloil esterasa, una cumaroil esterasa, una a-galactosidasa, una p-galactosidasa, una p-mananasa o una p-manosidasa.
En la presente, una endoxilanasa (EC 3.2.1.8) es cualquier polipeptido que sea capaz de catalizar la endohidrolisis de enlaces 1,4-p-D-xilosfdicos en xilanos. Esta enzima tambien se puede denominar endo-1,4-p-xilanasa o 1,4-p-D- xilano xilanohidrolasa. Una alternativa es EC 3.2.1.136, una glucuronoarabinoxilano endoxilanasa, una enzima que es capaz de hidrolizar enlaces 1,4 xilosfdicos en glucuronoarabinoxilanos.
En la presente, una p-xilosidasa (EC 3.2.1.37) es cualquier polipeptido que sea capaz de catalizar la hidrolisis de
1.4- p-D-xilanos, para retirar residuos de D-xilosa sucesivos de terminos no reductores. Estas enzimas tambien pueden hidrolizar xilobiosa. Esta enzima tambien se puede denominar xilano 1,4-p-xilosidasa, 1,4-p-D-xilano xilohidrolasa, exo-1,4-p-xilosidasa oxilobiasa.
En la presente, una a-L-arabinofuranosidasa (EC 3.2.1.55) es cualquier polipeptido que sea capaz de actuar sobre a-L-arabinofuranosidos, a-L-arabinanos que contienen enlaces (1,2) y/o (1,3) y/o (1,5), arabinoxilanos y arabinogalactanos. Esta enzima tambien se puede denominar a-N-arabinofuranosidasa, arabinofuranosidasa o arabinosidasa.
En la presente, una a-D-glucuronidasa (EC 3.2.1.139) es cualquier polipeptido que sea capaz de catalizar una reaccion de la siguiente forma: alfa-D-glucuronosido + H(2)O = un alcohol + D-glucuronato. Esta enzima tambien se puede denominar alfa-glucuronidasa o alfa-glucosiduronasa. Estas enzimas tambien pueden hidrolizar acido glucoronico metilado en 4-O, que tambien puede estar presente como un sustituyente en xilanos. Una alternativa es EC 3.2.1.131: xilano alfa-1,2-glucuronosidasa, que cataliza la hidrolisis de enlaces alfa-1,2-(4-O-metil)glucuronosilo.
En la presente, una acetil xilano esterasa (EC 3.1.1.72) es cualquier polipeptido que sea capaz de catalizar la desacetilacion de xilanos y xilo-oligosacaridos. Este polipeptido puede catalizar la hidrolisis de grupos acetilo de xilano polimerico, xilosa acetilada, glucosa acetilada, acetato de naftilo alfa o acetato de p-nitrofenilo, pero, tipicamente, no de triacilglicerol. Este polipeptido tipicamente no actua sobre manano o pectina acetilados.
En la presente, una feruloil esterasa (EC 3.1.1.73) es cualquier polipeptido que sea capaz de catalizar una reaccion de la forma: feruloil-sacarido + H(2)O = ferulato + sacarido. El sacarido puede ser, por ejemplo, un oligosacarido o un polisacarido. Tfpicamente, puede catalizar la hidrolisis del grupo 4-hidroxi-3-metoxicinamono (feruloMo) de un azucar esterificado, que habitualmente es arabinosa en sustratos 'naturales'. El acetato de p-nitrofenol y el ferulato de metilo son sustratos tfpicamente mas pobres. Esta enzima tambien se puede denominar ester cinamoflico hidrolasa, acido ferulico esterasa o hidroxicinamoil esterasa. Tambien se puede denominar una enzima accesoria de hemicelulasa, ya que puede ayudar a las xilanasas y pectinasas a descomponer la hemicelulosa y la pectina de la pared de celulas vegetales.
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En la presente, una cumaroil esterasa (EC 3.1.1.73) es cualquier polipeptido que sea capaz de catalizar una reaccion de la forma: cumaroil-sacarido + H(2)O = cumarato + sacarido. El sacarido puede ser, por ejemplo, un oligosacarido o un polisacarido. Esta enzima tambien se puede denominar trans-4-cumaroil esterasa, trans-p- cumaroil esterasa, p-cumaroil esterasa o acido p-cumarico esterasa. Esta enzima tambien esta dentro de EC 3.1.1.73 de modo que tambien se puede denominar una feruloil esterasa.
En la presente, una a-galactosidasa (EC 3.2.1.22) es cualquier polipeptido que sea capaz de catalizar la hidrolisis de residuos de a-D-galactosa no reductores terminales en a-D-galactosidos, incluyendo oligosacaridos de galactosa, galactomananos, galactanos y arabinogalactanos. Este polipeptido tambien puede ser capaz de hidrolizar a-D- fucosidos. Esta enzima tambien se puede denominar melibiasa.
En la presente, una p-galactosidasa, (EC 3.2.1.23) es cualquier polipeptido que sea capaz de catalizar la hidrolisis de residuos de p-D-galactosa no reductores terminales en p-D-galactosidos. Este polipeptido tambien puede ser capaz de hidrolizar a-L-arabinosidos. Esta enzima tambien se puede denominar exo-(1->4)-p-D-galactanasa o lactasa.
En la presente, una p-mananasa (EC 3.2.1.78) es cualquier polipeptido que sea capaz de catalizar la hidrolisis aleatoria de enlaces 1,4-p-D-manosfdicos en mananos, galactomananos y glucomananos. Esta enzima tambien se puede denominar manano endo-1,4-p-manosidasa o endo-1,4-mananasa.
En la presente, una p-manosidasa (EC 3.2.1.25) es cualquier polipeptido que sea capaz de catalizar la hidrolisis de residuos de p-D-manosa no reductores terminales en p-D-manosidos. Esta enzima tambien se puede denominar mananasa o manasa.
Una composicion de la invencion puede comprender cualquier pectinasa, por ejemplo una endopoligalacturonasa, una pectina metil esterasa, una endo-galactanasa, una beta galactosidasa, una pectina acetil esterasa, una endo- pectina liasa, pectato liasa, alfa-ramnosidasa, una exo-galacturonasa, una exo-poligalacturonato liasa, una ramnogalacturonano hidrolasa, una ramnogalacturonano liasa, una ramnogalacturonano acetil esterasa, una ramnogalacturonano galacturonohidrolasa o una xilogalacturonasa.
En la presente, una endo-poligalacturonasa (EC 3.2.1.15) es cualquier polipeptido que sea capaz de catalizar la hidrolisis aleatoria de enlaces 1,4-a-D-galactosiduronicos en pectato y otros galacturonanos. Esta enzima tambien se puede denominar poligalacturonasa pectina despolimerasa, pectinasa, endopoligalacturonasa, pectolasa, pectina hidrolasa, pectina poligalacturonasa, poli-a-1,4-galacturonido glicanohidrolasa, endogalacturonasa; endo-D- galacturonasa o poli(1,4-a-D-galacturonido) glicanohidrolasa.
En la presente, una pectina metil esterasa (EC 3.1.1.11) es cualquier enzima que sea capaz de catalizar la reaccion: pectina + n H2O = n metanol + pectato. La enzima tambien se ha conocido como pectinesterasa, pectina desmetoxilasa, pectina metoxilasa, pectina metilesterasa, pectasa, pectinoesterasa o pectina pectilhidrolasa.
En la presente, una endo-galactanasa (EC 3.2.1.89) es cualquier enzima capaz de catalizar la endohidrolisis de enlaces 1,4-p-D-galactosfdicos en arabinogalactanos. La enzima tambien se puede conocer como arabinogalactano endo-1,4-p-galactosidasa, endo-1,4-p-galactanasa, galactanasa, arabinogalactanasa o arabinogalactano 4-p-D- galactanohidrolasa.
En la presente, una pectina acetil esterasa se define en la presente como cualquier enzima que tenga actividad de acetil esterasa que catalice la desacetilacion de los grupos acetilo en los grupos hidroxilo de residuos de GalUA de pectina.
En la presente, un endo-pectina liasa (EC 4.2.2.10) es cualquier enzima capaz de catalizar la escision eliminativa de ester metflico de (1^4)-a-D-galacturonano para dar oligosacaridos con grupos 4-desoxi-6-O-metil-a-D-galact-4- enuronosilo en sus extremos no reductores. La enzima tambien se puede conocer como pectina liasa, pectina trans- eliminasa; endo-pectina liasa, polimetilgalacturonico transeliminasa, pectina metiltranseliminasa, pectoliasa, PL, PNL o PMGL o (1^4)-6-O-metil-a-D-galacturonano liasa.
En la presente, una pectato liasa (EC 4.2.2.2) es cualquier enzima capaz de catalizar la escision eliminativa de (1^4)-a-D-galacturonano para dar oligosacaridos con grupos 4-desoxi-a-D-galact-4-enuronosilo en sus extremos no reductores. La enzima tambien se puede conocer como poligalacturonico transeliminasa, acido pectico transeliminasa, poligalacturonato liasa, endopectina metiltranseliminasa, pectato transeliminasa, endogalacturonato transeliminasa, acido pectico liasa, liasa pectica, acido a-1,4-D-endopoligalacturonico liasa, PGA liasa, PPasa-N, acido endo-a-1,4-poligalacturonico liasa, acido poligalacturonico liasa, pectina trans-eliminasa, acido poligalacturonico trans-eliminasa o (1^4)-a-D-galacturonano liasa.
En la presente, una alfa ramnosidasa (EC 3.2.1.40) es cualquier polipeptido que sea capaz de catalizar la hidrolisis de residuos de a-L-ramnosa no reductores terminales en a-L-ramnosidos o alternativamente en
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ramnogalacturonano. Esta enzima tambien se puede conocer como a-L-ramnosidasa T, a-L-ramnosidasa N o a-L- ramnosido ramnohidrolasa.
En la presente, exo-galacturonasa (EC 3.2.1.82) es cualquier polipeptido capaz de la hidrolisis de acido pectico del digalacturonato del extremo no reductor, liberando digalacturonato. La enzima tambien se puede conocer como exo- poli-a-galacturonosidasa, exopoligalacturonosidasa o exopoligalacturanosidasa.
En la presente, exo-galacturonasa (EC 3.2.1.67) es cualquier polipeptido capaz de catalizar: (1,4-a-D-galacturonido)n + H2O = (1,4-a-D-galacturonido)n-i + D-galacturonato. La enzima tambien se puede conocer como galacturano 1,4-a- galacturonidasa, exopoligalacturonasa, poli(galacturonato) hidrolasa, exo-D-galacturonasa, exo-D-galacturonanasa, exopoli-D-galacturonasa o poli(1,4-a-D-galacturonido) galacturonohidrolasa.
En la presente, exopoligalacturonato liasa (EC 4.2.2.9) es cualquier polipeptido capaz de catalizar la escision eliminativa de 4-(4-desoxi-a-D-galact-4-enuronosil)-D-galacturonato del extremo reductor de pectato, es decir pectina desesterificada. Esta enzima se puede conocer como pectato disacarido-liasa, pectato exo-liasa, acido exopectico transeliminasa, exopectato liasa, acido exopoligalacturonico trans-eliminasa, PATE, exo-PATE, exo-PGL o endo- disacarido-liasa reductora de (1^4)-a-D-galacturonano.
En la presente, ramnogalacturonano hidrolasa es cualquier polipeptido que sea capaz de hidrolizar el enlace entre acido galactosiluronico y ramnopiranosilo de un modo endo en estructuras de ramnogalacturonano estrictamente alternas, que consisten en el disacarido [acido (1,2-alfa-L-ramnoil-(1,4)-alfa-galactosiluronico].
En la presente, ramnogalacturonano liasa es cualquier polipeptido que sea capaz de escindir enlaces a-L-Rhap- (1^4)-a-D-GalpA de un modo endo en ramnogalacturonano mediante beta-eliminacion.
En la presente, ramnogalacturonano acetil esterasa es cualquier polipeptido que catalice la desacetilacion del esqueleto de residuos de ramnosa y acido galacturonico alternativos en ramnogalacturonano.
En la presente, ramnogalacturonano galacturonohidrolasa es cualquier polipeptido que sea capaz de hidrolizar acido galacturonico del extremo no reductor de estructuras de ramnogalacturonano estrictamente alternas de un modo exo.
En la presente, xilogalacturonasa es cualquier polipeptido que actua sobre xilogalacturonano al escindir el esqueleto de acido galacturonico sustituido con p-xilosa de un modo endo. Esta enzima tambien se puede conocer como xilogalacturonano hidrolasa.
En la presente, una a-L-arabinofuranosidasa (EC 3.2.1.55) es cualquier polipeptido que sea capaz de actuar sobre a-L-arabinofuranosidos, a-L-arabinanos que contienen enlaces (1,2) y/o (1,3) y/o (1,5), arabinoxilanos y arabinogalactanos. Esta enzima tambien se puede denominar a-N-arabinofuranosidasa, arabinofuranosidasa o arabinosidasa.
En la presente, endo-arabinanasa (EC 3.2.1.99) es cualquier polipeptido que sea capaz de catalizar la endohidrolisis de enlaces 1,5-a-arabinofuranosfdicos en 1,5-arabinanos. La enzima tambien se puede conocer como endo- arabinasa, arabinano endo-1,5-a-L-arabinosidasa, endo-1,5-a-L-arabinanasa, endo-a-1,5-arabanasa; endo- arabanasa o 1,5-a-L-arabinano 1,5-a-L-arabinanohidrolasa.
Una composicion de la invencion comprendera tfpicamente al menos una celulasa y/o al menos una hemicelulasa y/o al menos una pectinasa (una de las cuales es un polipeptido segun la invencion). Una composicion de la invencion puede comprender una celobiohidrolasa, una endoglucanasa y/o una p-glucosidasa. Esta composicion tambien puede comprender una o mas hemicelulasas y/o una o mas pectinasas.
Una o mas (por ejemplo dos, tres, cuatro o la totalidad) de una amilasa, una proteasa, una lipasa, una ligninasa, una hexosiltransferasa o una glucuronidasa pueden estar presentes en una composicion de la invencion.
"Proteasa" incluye enzimas que hidrolizan uniones peptfdicas (peptidasas), asf como enzimas que hidrolizan uniones entre peptidos y otros restos, tales como azucares (glicopeptidasas). Muchas proteasas se caracterizan bajo EC 3.4, y son adecuadas para el uso en la invencion. Algunos tipos espedficos de proteasas incluyen cistema proteasas incluyendo pepsina, papama y serina proteasas incluyendo quimotripsinas, carboxipeptidasas y
metaloendopeptidasas.
"Lipasa" incluye enzimas que hidrolizan lfpidos, acidos grasos y acilgliceridos, incluyendo fosfogliceridos, lipoprotemas, diacilgliceroles y similares. En plantas, se usan lfpidos como componentes estructurales para limitar la perdida de agua y la infeccion por patogenos. Estos lfpidos incluyen ceras derivadas de acidos grasos, asf como cutina y suberina.
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"Ligninasa" incluye enzimas que pueden hidrolizar o descomponer la estructura de poKmeros de lignina. Enzimas que puede descomponer la lignina incluyen lignina peroxidasas, manganeso peroxidasas, lacasas y feruloil esterasas, y otras enzimas descritas en la tecnica conocidas por despolimerizar o romper de otro modo poKmeros de lignina. Tambien se incluyen enzimas capaces de hidrolizar uniones formadas entre azucares hemicelulosicos (notablemente arabinosa) y lignina. Las ligninasas incluyen, pero no se limitan a, el siguiente grupo de enzimas: lignina peroxidasas (EC 1.11.14), manganeso peroxidasas (EC 1.11.1.13), lacasas (EC 1.10.3.2) y feruloil esterasas (EC 3.1.1.73).
"Hexosiltransferasa" (2.4.1-) incluyen enzimas que son capaces de transferir grupos glicosilo, mas espedficamente grupos hexosilo. Ademas de la transferencia de un grupo glicosilo desde un donante que contiene glicosilo a otro compuesto que contiene glicosilo, el aceptor, las enzimas tambien pueden transferir el grupo glicosilo a agua como un aceptor. Esta reaccion tambien se conoce como una reaccion de hidrolisis, en lugar de una reaccion de transferencia. Un ejemplo de una hexosiltransferasa que se puede usar en la invencion es una U- glucanosiltransferasa. Esta enzima puede ser capaz de catalizar la degradacion de (1,3)(1,4)glucano y/o celulosa y/o un producto de degradacion de celulosa.
"Glucuronidasa" incluye enzimas que catalizan la hidrolisis de un glucoronosido, por ejemplo p-glucuronosido para dar un alcohol. Se han caracterizado muchas glucuronidasas y pueden ser adecuadas para el uso en la invencion, por ejemplo p-glucuronidasa (EC 3.2.1.31), hialurono-glucuronidasa (EC 3.2.1.36), glucuronosil-disulfoglucosamina glucuronidasa (3.2.1.56), glicirrizinato p-glucuronidasa (3.2.1.128) o a-D-glucuronidasa (EC 3.2.1.139).
Una composicion de la invencion puede comprender una expansina o una protema similar a expansina, tal como una swollenina (vease Salheimo y cols., Eur. J. Biohem. 269, 4202-4211,2002) o una protema similar a swollenina.
Las expansinas estan implicadas en el aflojamiento de la estructura de la pared celular durante el crecimiento de celulas vegetales. Se ha propuesto que las expansinas rompen la union de hidrogeno entre celulosa y otros polisacaridos de la pared celular sin tener actividad hidrolftica. De este modo, se cree que permiten el deslizamiento de fibras de celulosa y el engrosamiento de la pared celular. La swollenina, una protema similar a expansina, contienen un dominio de la familia del modulo de union a carbohidrato N-terminal 1 (CBD) y un dominio similar a expansina C-terminal. Para los propositos de esta invencion, una protema similar a expansina o una protema similar a swollenina puede comprender uno o ambos de tales dominios y/o puede romper la estructura de las paredes celulares (tal como rompiendo la estructura de la celulosa), opcionalmente sin producir cantidades detectables de azucares reductores.
Una composicion de la invencion puede comprender el producto polipeptfdico de una protema integrante de celulosa, escafoldina o una protema similar a escafoldina, por ejemplo CipA o CipC de Clostridium thermocellum o Clostridium cellulolyticum, respectivamente.
Las escafoldinas y las protemas integrantes de celulosa son subunidades integradoras multifuncionales que pueden organizar subunidades celulolfticas en un complejo multienzimatico. Esto se efectua mediante la interaccion de dos clases complementarias de dominio, es decir un dominio de cohesion sobre escafoldina y un dominio de dockerina sobre cada unidad enzimatica. La unidad de escafoldina tambien soporta un modulo de union a celulosa (CBM) que media en la ligacion del celulosoma a su sustrato. Una escafoldina o protema integradora de celulosa para los propositos de esta invencion puede comprender uno o ambos de tales dominios.
Una composicion de la invencion puede comprender una protema inducida por celulosa o una protema moduladora, por ejemplo como la codificada por el gen cip1 o cip2 o genes similares procedentes de Trichoderma reesei / Hypocrea jecorina (vease Foreman y cols., J. Biol. Chem. 278(34), 31988-31997, 2003). El producto polipeptfdico de estos genes son protemas bimodulares, que contienen un modulo que se une a celulosa y un dominio cuya funcion o actividad no se pueden relacionar con familias de glicosil hidrolasa conocidas. Sin embargo, la presencia de un modulo que se une a celulosa y la corregulacion de la expresion de estos genes con componentes de celulasas indica actividades previamente no reconocidas con un papel potencial en la degradacion de biomasa.
Una composicion de la invencion puede estar compuesta de un miembro de cada una de las clases de los polipeptidos mencionados anteriormente, varios miembros de una clase de polipeptido, o cualquier combinacion de estas clases de polipeptidos.
Una composicion de la invencion puede estar compuesta por polipeptidos, por ejemplo enzimas, de (1) proveedores comerciales; (2) genes clonados que expresan polipeptidos, por ejemplo enzimas; (3) caldo complejo (tal como el resultante del crecimiento de una cepa microbiana en un medio, en donde las cepas secretan protemas y enzimas al medio; (4) lisados celulares de cepas desarrolladas como en (3); y/o (5) material vegetal que expresa polipeptidos, por ejemplo enzimas. Diferentes polipeptidos, por ejemplo enzimas en una composicion de la invencion, se pueden obtener de diferentes fuentes.
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Uso de los polipeptidos
Los polipeptidos y las composiciones polipeptfdicas segun la invencion se pueden usar en muchas aplicaciones diferentes. A modo de ejemplo, se pueden usar para producir azucares fermentables. Los azucares fermentables se pueden convertir a continuacion, como parte de un procedimiento para biocombustible, en biogas o etanol, butanol, isobutanol, 2-butanol u otras sustancias adecuadas. Alternativamente, los polipeptidos y sus composiciones se pueden usar como enzima, a modo de ejemplo en la produccion de productos alimenticios, en composiciones detergentes, en la industria del papel y la pasta papelera y en formulaciones antibacterianas, en productos farmaceuticos tales como pastillas para la garganta, pastas de dientes y colutorios. Algunos de los usos se ilustraran con mas detalle posteriormente.
En los usos y los metodos descritos posteriormente, los componentes de las composiciones descritas anteriormente se pueden proporcionar concomitantemente (es decir como una sola composicion de por sf) o separadamente o secuencialmente.
La invencion tambien se refiere al uso del polipeptido potenciador de celulasa segun la invencion y composiciones que comprenden tan enzima en procedimientos industriales.
A pesar de la experiencia a largo plazo obtenida con estos procedimientos, el polipeptido potenciador de celulasa segun la invencion puede presentar un numero de ventajas significativas sobre enzimas usadas normalmente. Dependiendo de la aplicacion espedfica, estas ventajas pueden incluir aspectos tales como menores costes de produccion, especificidad superior hacia el sustrato, antigenicidad reducida, menos actividades secundarias no deseables, rendimientos superiores cuando se producen en un microorganismo adecuado, intervalos de pH y temperatura mas adecuados, falta de inhibicion por productos derivados de lignina hidrofobos o menos inhibicion de productos, o, en el caso de la industria alimentaria, un sabor o una textura mejores de un producto final asf como calidad alimentaria y aspectos de conformidad con la ley judfa.
En principio, un polipeptido o una composicion potenciadores de celulasa de la invencion se puede usar en cualquier procedimiento que requiera el tratamiento de un material que comprende polisacarido. Asf, un polipeptido o una composicion de la invencion se puede usar en el tratamiento de un material polisacarico. En la presente, un material polisacarico es un material que comprende o consiste esencialmente en uno o, mas tfpicamente, mas de un polisacarido.
Tfpicamente, plantas y material derivado de las mismas comprende cantidades significativas de material polisacarico no amilaceo. Segun esto, un polipeptido de la invencion se puede usar en el tratamiento de un material vegetal o fungico o un material derivado del mismo.
Lignocelulosa
Un importante componente del material polisacarico vegetal no amilaceo es la lignocelulosa (tambien denominada en la presente biomasa lignocelulolttica). La lignocelulosa es un material vegetal que comprende celulosa y hemicelulosa y lignina. Los polfmeros gluddicos (celulosa y hemicelulosas) estan fuertemente unidos a la lignina por uniones de hidrogeno y covalentes. Segun esto, un polipeptido de la invencion se puede usar en el tratamiento de material lignocelulolftico. En la presente, el material lignocelulolftico es un material que comprende o consiste esencialmente en lignocelulosa. Asf, en un metodo de la invencion para el tratamiento de un polisacarido no amilaceo, el polisacarido no amilaceo puede ser un material/biomasa lignocelulosicos.
Segun esto, la invencion proporciona un metodo para tratar un sustrato que comprende polisacarido no amilaceo en el que el tratamiento comprende la degradacion y/o hidrolisis y/o modificacion de celulosa y/o hemicelulosa y/o una sustancia pectica.
Degradacion en este contexto indica que el tratamiento da como resultado la generacion de productos de hidrolisis de celulosa y/o hemicelulosa y/o una sustancia pectica, es decir sacaridos de longitud mas corta estan presentes como resultado del tratamiento que los que estan presentes en un polisacarido no amilaceo no tratado similar. Asf, la degradacion en este contexto puede dar como resultado la liberacion de oligosacaridos y/o monomeros sacaricos.
Todas las plantas contienen polisacarido no amilaceo como virtualmente todos los materiales polisacaricos derivados de plantas. Segun esto, en un metodo de la invencion para el tratamiento de un sustrato que comprende un polisacarido no amilaceo, dicho sustrato se puede proveer en la forma de una planta o un material derivado de planta o un material que comprende una planta o material derivado de planta, por ejemplo una pulpa vegetal, un extracto vegetal, un producto alimenticio o ingrediente para el mismos, una tela, un producto textil o una prenda de.
Biomasa lignocelulolftica adecuada para el uso en la invencion incluye biomasa y puede incluir biomasa virgen y/o biomasa no virgen tal como biomasa agncola, productos organicos comerciales, desechos de construccion y
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demolicion, desechos solidos municipales, papel residual y desechos de jardm. Formas comunes de biomasa incluyen arboles, arbustos y hierbas, trigo, paja de trigo, bagazo de cana de azucar, mafz, cascaras de ir^z, mazorcas de mafz, grano de maz incluyendo fibra procedentes de los granos, productos y subproductos de la molienda de granos tales como mafz, trigo y cebada (incluyendo molienda en humedo y molienda en seco) a menudo llamados "salvado o fibra" asf como desechos solidos municipales, papel residual y desechos de jardm. La biomasa tambien puede ser, pero no se limita a, material herbaceo, residuos agncolas, residuos forestales, desechos solidos municipales, papel residual y residuos de fabricas de papel y pasta papelera. "Biomasa agncola" incluye ramas, matorrales, canas, mafz y cascaras de mafz, cultivos energeticos, bosques, frutos, flores, granos, hierbas, cultivos herbaceos, hojas, corteza, agujas, troncos, rames, pimpollos, cultivos lenosos de rotacion breve, arbustos, pastos varilla, arboles, hortalizas, cascaras de fruta, vides, pulpa de remolacha azucarera, harinillas de trigo, cascaras de avena y maderas duras y blandas (sin incluir maderas con materiales nocivos). Ademas, la biomasa agncola incluye materiales residuales organicos generados de procedimientos agncolas incluyendo actividades de labranza y forestales, espedficamente desechos de madera de bosques. La biomasa agncola puede ser cualquiera de las mencionadas singularmente o en cualquier combinacion de las mismas. Ejemplos adicionales de biomasa adecuada son preparaciones de huertos, un chaparral, desechos de molienda, desechos de madera urbanos, desechos municipales, desechos de maderos, aclaramientos forestales, cultivos lenosos de rotacion breve, desechos industriales, paja de trigo, paja de avena, paja de arroz, paja de cebada, paja de centeno, paja de lino, cascaras de soja, cascaras de arroz, paja de arroz, piensos de gluten de trigo, cascaras de avena, cana de azucar, harina de mafz, tallos de mafz, mazorcas de mafz, cascaras de mafz, bromo, maicillo oriental, cola de zorra; pulpa de remolacha azucarera, pulpa de dtricos, cascaras de semillas, desechos animales celulosicos, cortes de cesped, algodon, algas marinas, arboles, arbustos, hierbas, trigo, paja de trigo, bagazo de cana de azucar, mafz, cascaras de mafz, mazorcas de mafz, grano de mafz, fibra procedente de granos, productos y subproductos procedentes de moliendas en humedo o en seco de granos, desechos solidos municipales, papel residual, desechos de jardm, material herbaceo, residuos agncolas, residuos forestales, desechos solidos municipales, papel residual, pasta papelera, residuos de fabricas de papel, ramas, matorrales, canas, cascaras de mafz, un cultivo energetico, un bosque, una fruta, una flor, un grano, una hierba, un cultivo herbaceo, una hoja, corteza, una aguja, un tronco, una rafz, un pimpollo, un arbusto, pasto varilla, un arbol, una hortaliza, cascara de fruta, una vid, pulpa de remolacha azucarera, harinillas de trigo, cascaras de avena, madera dura o blanda, material residual organico generado a partir de un procedimiento agncola, desechos de madera de bosques, o una combinacion de cualesquiera dos o mas de los mismos.
Aparte de la biomasa virgen o materias primas ya procesadas en las industrias de los alimentos y los piensos o el papel y la pasta papelera, la biomasa/materia prima se puede pretratar adicionalmente con calor, modificacion mecanica y/o qmmica o cualquier combinacion de tales metodos a fin de potenciar la degradacion enzimatica.
Pretratamiento
Antes del tratamiento enzimatico, la materia prima se puede pretratar opcionalmente con calor, modificacion mecanica y/o qmmica o cualquier combinacion de estos metodos a fin de potenciar la accesibilidad del sustrato a la hidrolisis enzimatica y/o hidrolizar la hemicelulosa y/o solubilizar la hemicelulosa y/o celulosa y/o lignina, de cualquier modo conocido en la tecnica. El pretratamiento puede comprender exponer al material lignocelulosico a agua (caliente), vapor de agua (explosion de vapor de agua), un acido, una base, un disolvente, calor, un peroxido, ozono, corte mecanico, trituracion, molienda o despresurizacion rapida, o una combinacion de dos o mas de los mismos. Un pretratamiento qmmico a menudo se combina con pretratamiento termico, p. ej. entre 150-220°C durante de 1 a 30 minutos.
Presacarificacion
Despues de la etapa de pretratamiento, se puede utilizar una etapa de licuefaccion/hidrolisis o presacarificacion que implica la incubacion con una enzima o mezcla de enzimas. La etapa de presacarificacion se puede realizar a muchas temperaturas diferentes pero se prefiere que la etapa de presacarificacion se produzca a la temperatura mas adecuada para la mezcla de enzimas que se aplique, o el optimo enzimatico predicho de las enzimas que se van a aplicar. La temperatura de la etapa de presacarificacion puede variar de aproximadamente l0°C a
aproximadamente 95°C, de aproximadamente 20°C a aproximadamente 85°C, de aproximadamente 30°C a
aproximadamente 70°C, de aproximadamente 40°C a aproximadamente 60°C, de aproximadamente 37°C a
aproximadamente 50°C, preferiblemente de aproximadamente 37°C a aproximadamente 80°C, mas preferiblemente aproximadamente 60-70°C e incluso mas preferiblemente alrededor de 65°C. El pH de la mezcla de presacarificacion puede variar de aproximadamente 2,0 a aproximadamente 10,0, pero preferiblemente es de aproximadamente 3,0 a aproximadamente 7,0, mas preferiblemente de aproximadamente 4,0 a aproximadamente 6,0, aun mas preferiblemente de aproximadamente 4,0 a aproximadamente 5,0. De nuevo, el pH se puede ajustar para maximizar la actividad enzimatica y se puede ajustar con la adicion de la enzima.
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La reaccion de la etapa de licuefaccion/hidrolisis o presacarificacion se puede producir de varios minutos a varias horas, tal como de aproximadamente 1 hora a aproximadamente 120 horas, preferiblemente de aproximadamente 2 horas a aproximadamente 48 horas, mas preferiblemente de aproximadamente 2 a aproximadamente 24 horas, lo mas preferiblemente durante de aproximadamente 2 a aproximadamente 6 horas. El tratamiento con celulasa se puede producir de varios minutos a varias horas, tal como de aproximadamente 6 horas a aproximadamente 120 horas, preferiblemente de aproximadamente 12 horas a aproximadamente 72 horas, mas preferiblemente aproximadamente de 24 a 48 horas.
Sacarificacion
La invencion proporciona un metodo para producir un azucar a partir de un material lignocelulosico, metodo que comprende poner en contacto un polipeptido de la invencion o una composicion de la invencion con el material lignocelulosico.
Este metodo permite que se generen azucares libres (monomeros) y/o oligosacaridos a partir de biomasa lignocelulosica. Estos metodos implican convertir biomasa lignocelulosica en azucares libres y oligosacaridos pequenos con un polipeptido o una composicion de la invencion.
El procedimiento de convertir un carbohidrato complejo tal como lignocelulosa en azucares permite preferiblemente la conversion en azucares fermentables. Este procedimiento se puede denominar "sacarificacion". Segun esto, un metodo de la invencion puede dar como resultado la liberacion de uno o mas azucares de hexosa y/o pentosa, tales como una o mas de glucosa, xilosa, arabinosa, galactosa, acido galacturonico, acido glucuronico, manosa, ramnosa, ribosa y fructosa.
Segun esto, otro aspecto de la invencion incluye metodos que utilizan el polipeptido o la composicion de la invencion descritos anteriormente junto con enzimas o tratamientos ffsicos tales como temperatura y pH para convertir la biomasa vegetal lignocelulosica en azucares y oligosacaridos.
Aunque la composicion se ha analizado como una sola mezcla, se sebe que las enzimas se pueden anadir secuencialmente, donde la temperatura, el pH y otras condiciones se pueden alterar para incrementar la actividad de cada enzima individual. Alternativamente, se pueden determinar un pH y una temperatura optimos para la mezcla de enzimas.
Las enzimas se hacen reaccionar con un sustrato bajo condiciones apropiadas. Por ejemplo, las enzimas se pueden incubar a aproximadamente 25°C, aproximadamente 30°C, aproximadamente 35°C, aproximadamente 37°C, aproximadamente 40°C, aproximadamente 45°C, aproximadamente 50°C, aproximadamente 55°C,
aproximadamente 60°C, aproximadamente 65°C, aproximadamente 70°C, aproximadamente 75°C,
aproximadamente 80°C, aproximadamente 85°C, aproximadamente 90°C o mas. Esto es, se pueden incubar a una temperatura de aproximadamente 20°C a aproximadamente 95°C, por ejemplo en tampones de fuerza ionica de baja a media y/o desde pH bajo a neutro. Por "fuerza ionica media" se entiende que el tampon tiene una concentracion ionica de aproximadamente 200 milimolar (mM) o menos para cualquier componente ionico simple. El pH puede variar de aproximadamente pH 2,5, aproximadamente pH 3,0, aproximadamente pH 3,5,
aproximadamente pH 4,0, aproximadamente pH 4,5, aproximadamente pH 5, aproximadamente pH 5,5, aproximadamente pH 6, aproximadamente pH 6,5, aproximadamente pH 7, aproximadamente pH 7,5, aproximadamente pH 8,0, a aproximadamente pH 8,5. Generalmente, el intervalo de pH sera de aproximadamente pH 3,0 a aproximadamente pH 7. Para la produccion de etanol se prefiere un medio acido, p. ej. pH=4, mientras que para la produccion de biogas es deseable un pH neutro, p. ej. pH=7. La incubacion de combinaciones de enzimas bajo estas condiciones da como resultado la emision o liberacion de cantidades sustanciales del azucar desde la lignocelulosa. Por cantidad sustancial se entiende al menos 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o mas de azucar disponible.
Los polipeptidos, tales como enzimas, pueden producirse exogenamente en microorganismos, levaduras, hongos, bacterias o plantas, a continuacion aislarse y anadirse, por ejemplo, a materia prima lignocelulosica. Alternativamente, las enzimas se producen, pero no se afslan, y se pueden anadir caldo de fermentacion de la masa celular en bruto, o material vegetal (tal como harina de mafz) y similares a, por ejemplo, la materia prima. Alternativamente la masa celular en bruto o el medio de produccion de enzimas o el material vegetal pueden tratarse para evitar un crecimiento microbiano adicional (por ejemplo, mediante calentamiento o adicion de agentes antimicrobianos), a continuacion anadirse a, por ejemplo, una materia prima. Estas mezclas de enzimas en bruto pueden incluir pueden incluir el organismo que produce la enzima. Alternativamente, la enzima puede ser producida en una fermentacion que usa materia prima (tal como harina de mafz) para proporcionar nutricion a un organismo que produce una enzima o enzimas. De este modo, plantas que producen las enzimas pueden servir ellas mismas como una materia prima lignocelulosica y ser anadidas a materia prima lignocelulosica.
Fermentacion de azucares
Los azucares fermentables se pueden convertir en productos de fermentacion utiles con valor anadido, ejemplos no limitativos de los cuales incluyen aminoacidos, vitaminas, productos farmaceuticos, suplementos para piensos, productos qmmicos especializados, materias primas qmmicas, plasticos, disolventes, combustibles, u otros polfmeros organicos, acido lactico y etanol, incluyendo etanol combustible. En particular, los azucares se pueden 5 usar como materias primas para fermentacion en productos qmmicos, plasticos, tales como, a modo de ejemplo, acido succmico y (bio)combustibles, incluyendo los combustibles lfquidos sinteticos etanol, metanol, butanol y biogas.
A modo de ejemplo, en el metodo de la invencion, una enzima o combinacion de enzimas actua sobre un sustrato 10 lignocelulosico o biomasa vegetal, sirviendo como la materia prima, a fin de convertir este sustrato complejo en azucares simples y oligosacaridos para la produccion de etanol u otros productos de fermentacion utiles.
Los azucares liberados de la biomasa se pueden convertir en productos de fermentacion utiles tales como uno de los que incluyen, pero no limitados a, aminoacidos, vitaminas, productos farmaceuticos, suplementos para piensos, 15 productos qmmicos especializados, materias primas qmmicas, plasticos y etanol, incluyendo etanol combustible.
Segun esto, la invencion proporciona un metodo para la preparacion de un producto de fermentacion, metodo que comprende:
a. degradar lignocelulosa usando un metodo como en descrito en la presente; y 20 b. fermentacion del material resultante,
para preparar de ese modo un producto de fermentacion.
La fermentacion se puede llevar a cabo bajo condiciones aerobias o anaerobias. Preferiblemente, el procedimiento se lleva a cabo bajo condiciones microaerofilas o de oxfgeno limitado.
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Un procedimiento de fermentacion anaerobia se define en la presente como un procedimiento de fermentacion realizado en ausencia de oxfgeno o en el que sustancialmente no se consuma oxfgeno, preferiblemente aproximadamente 5 o menos, aproximadamente 2,5 o menos o aproximadamente 1 mmol/l/h o menos, y en donde las moleculas organicas sirven de donante de electrones y de aceptores de electrones.
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Un procedimiento de fermentacion con oxfgeno limitado es un procedimiento en el que el consumo de oxfgeno esta limitado por la transferencia de oxfgeno del gas al lfquido. El grado de limitacion de oxfgeno esta determinado por la cantidad y la composicion del flujo de gas entrante asf como las propiedades de mezcladura/transferencia de masas reales del equipo de fermentacion usado. Preferiblemente, en un procedimiento bajo condiciones con oxfgeno 35 limitado, la velocidad de consumo de oxfgeno es al menos aproximadamente 5,5, mas preferiblemente al menos aproximadamente 6 y aun mas preferiblemente al menos aproximadamente 7 mmol/l/h.
Un metodo para la preparacion de un producto de fermentacion puede comprender opcionalmente la recuperacion del producto de fermentacion.
40 SSF
La fermentacion u la sacarificacion tambien se pueden ejecutar en modo de sacarificacion y fermentacion simultaneas (SSF). Una de las ventajas de este modo es la reduccion de la inhibicion sacarica sobre la hidrolisis enzimatica (la inhibicion sacarica sobre celulasas es descrita por Caminal B&B Vol XXVII Pp 1282-1290).
Productos de fermentacion
45 Productos de fermentacion que se pueden producir segun la invencion incluyen aminoacidos, vitaminas, productos farmaceuticos, suplementos para piensos, productos qmmicos especializados, materias primas qmmicas, plasticos, disolventes, combustibles, u otros polfmeros organicos, acido lactico, y etanol, incluyendo etanol (entendiendose que el termino "etanol" incluye alcohol etflico o mezclas de alcohol etflico y agua).
50 Productos de valor anadido espedficos que se pueden producir mediante los metodos de la invencion incluyen, pero
no se limitan a, biocombustibles (incluyendo etanol y butanol y un biogas); acido lactico; un plastico; un producto qmmico especializado; un acido organico, incluyendo acido dtrico, acido succmico, acido fumarico, acido itaconico y acido maleico; acido 3-hidoxi-propionico, acido acnlico; acido acetico; 1,3-propano-diol; etileno, glicerol; un disolvente; un suplemento para piensos; un producto farmaceutico, tal como un antibiotico de p-lactama o una 55 cefalosporina; vitaminas; un aminoacido, tal como lisina, metionina, triptofano, treonina y acido aspartico; una
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enzima industrial, tal como una proteasa, una celulasa, una amilasa, una glucanasa, una lactasa, una lipasa, una liasa, una oxidorreductasa, una transferasa o una xilanasa; y una materia prima qmmica.
Biogas
La invencion tambien proporciona el uso de un polipeptido o una composicion como los descritos en la presente en un metodo para la preparacion de biogas. Biogas se refiere tfpicamente a un gas producido mediante la descomposicion biologica de materia organica, por ejemplo un material que contiene carbohidratos no amilaceos, en ausencia de oxfgeno. El biogas se origina a partir de material biogenico y es un tipo de biocombustible. Un tipo de biogas se produce mediante digestion o fermentacion anaerobia de materiales biodegradables tales como biomasa, estiercol o aguas residuales, desechos municipales y cultivos energeticos. Este tipo de biogas esta comprendido principalmente por metano y dioxido de carbono. El metano gaseoso se puede quemar u oxidar con oxfgeno. El aire contienen 21% de oxfgeno. Esta liberacion de energfa permite que el biogas se use como un combustible. El biogas se puede usar como un combustible de bajo coste en cualquier pafs con cualquier proposito de calentamiento, tal como cocinar. Tambien se puede utilizar en instalaciones modernas de gestion de residuos en las que se puede usar para poner en marcha cualquier tipo de motor termico, para generar energfa bien mecanica o bien electrica.
La primera etapa en la produccion microbiana de biogas consiste en la degradacion enzimatica de polfmeros y sustratos complejos (por ejemplo un carbohidrato no amilaceo). Segun esto, la invencion proporciona un metodo para la preparacion de un biogas en el que un sustrato que comprende un carbohidrato no amilaceo se pone en contacto con un polipeptido o una composicion de la invencion, para dar de ese modo un material fermentable que puede ser convertido en un biogas por un organismo tal como un microorganismo. En este metodo, un polipeptido de la invencion se puede proporcionar por medio de un organismo, por ejemplo un microorganismo que expresa tal polipeptido.
Uso de enzimas en productos alimenticios
Los polipeptidos y las composiciones de la invencion se pueden usar en un metodo para procesar material vegetal para degradar o modificar los constituyentes de celulosa o hemicelulosa o sustancia pectica de las paredes celulares del material vegetal o fungico. Estos metodos pueden ser utiles en la preparacion de un producto alimenticio. Segun esto, la invencion proporciona un metodo para preparar un producto alimenticio, metodo que comprende incorporar un polipeptido o una composicion de la invencion durante la preparacion del producto alimenticio.
La invencion tambien proporciona un metodo para procesar un material vegetal, metodo que comprende poner en contacto el material vegetal con un polipeptido o una composicion de la invencion para degradar o modificar la celulosa en el material (vegetal). Preferiblemente, el material vegetal es una pulpa vegetal o un extracto vegetal, tal como zumos.
Los materiales vegetales y que contienen celulosa/hemicelulosa/sustancia pectica incluyen pulpa vegetal, partes de plantas y extractos vegetales. En el contexto de esta invencion, un extracto procedente de un material vegetal es cualquier sustancia que se pueda derivar de material vegetal mediante extraccion (mecanica y/o qmmica), procesamiento o mediante otras tecnicas de separacion. El extracto puede ser zumo, nectar, base o concentrados hechos de los mismos. El material vegetal puede comprender o derivarse de hortalizas, p. ej., zanahorias, apio, cebollas, legumbres o plantas leguminosas (soja, habas de soja, guisantes) o fruta, p. ej., pomos o frutas con pepitas (manzanas, peras, membrillo, etc.), uvas, tomates, cftricos (naranja, limon, lima, mandarina), melones, ciruelas, cerezas, grosellas negras, grosellas rojas, frambuesas, fresas, arandanos, pina y otras frutas tropicales, arboles y partes de los mismos (p. ej. polen, de pinos), o cereales (avena, cebada, trigo, mafz, arroz). El material (que va a ser hidrolizado) tambien pueden ser residuos agncolas, tal como pulpa de remolacha azucarera, mazorcas de mafz, paja de trigo, cascaras de nuez (trituradas) o materiales reciclables, p. ej. papel (residual).
Los polipeptidos de la invencion se pueden usar asf para tratar material vegetal incluyendo pulpa vegetal y extractos vegetales. Tambien se pueden usar para tratar productos alimenticios lfquidos o solidos o ingredientes de productos alimenticios comestibles, o se pueden usar en la extraccion de aceites vegetales, almidon o como un espesante en alimentos.
Tfpicamente, los polipeptidos de la invencion se usan como una composicion/preparacion enzimatica segun se describe anteriormente. La composicion se anadira generalmente a pulpa vegetal obtenible, por ejemplo, mediante procesamiento mecanico tal como triturando o moliendo material vegetal. La incubacion de la composicion con la planta se llevara a cabo tfpicamente durante un tiempo de 10 minutos a 5 horas, tal como de 30 minutes a 2 horas, preferiblemente durante aproximadamente 1 hora. La temperatura de procesamiento es preferiblemente de aproximadamente 10°C a aproximadamente 55°C, p. ej. de aproximadamente 15°C a aproximadamente 25°C, optimamente aproximadamente 20°C y se pueden usar de aproximadamente 10 g a aproximadamente 300 g,
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preferiblemente de aproximadamente 30 g a aproximadamente 70 g, optimamente aproximadamente 50 g de enzima por tonelada de material que se va a tratar.
Toda la enzima o las enzimas o sus composiciones usadas se pueden anadir secuencialmente o al mismo tiempo a la pulpa vegetal. Dependiendo de la composicion de la preparacion enzimatica, el material vegetal en primer lugar se puede macerar (p. ej. hasta un pure) o licuar. Usando los polipeptidos de la invencion, se pueden mejorar parametros de procesamiento tales como el rendimiento de la extraccion, la viscosidad del extracto y/o la calidad del extracto.
Alternativamente, o ademas de lo anterior, un polipeptido de la invencion se puede anadir a zumo en crudo obtenido del prensado o la licuefaccion de la pulpa vegetal. El tratamiento del zumo en crudo se llevara a cabo de un modo similar a la pulpa vegetal con respecto a la dosificacion, la temperatura y el tiempo de espera. De nuevo, se pueden incluir otras enzimas tales como las analizadas previamente. Condiciones de incubacion tfpicas son como las descritas en al parrafo previo.
Una vez que el zumo en crudo se ha incubado con los polipeptidos de la invencion, a continuacion el zumo se centrifuga o se (ultra)filtra para producir el producto final.
Despues del tratamiento con el polipeptido de la invencion, el producto (final) se puede tratar termicamente, p. ej. a aproximadamente 100°C durante un tiempo de aproximadamente 1 minuto a aproximadamente 1 hora, bajo condiciones para inactivar parcialmente o totalmente el polipeptido o los polipeptidos de la invencion.
Una composicion que contiene un polipeptido de la invencion tambien se puede usar durante la preparacion de pures de frutas u hortalizas.
En el horneado, el polipeptido puede mejorar la estructura de la masa, modificar su adherencia o flexibilidad, mejorar el volumen de la barra y/o la estructura de la miga o impartir mejores caractensticas de textura tales como rotura, desmenuzamiento o calidad de la miga.
La presente invencion se refiere asf a metodos para preparar una masa o un producto alimenticio basado en cereales que comprender incorporar en la masa un polipeptido o una composicion de la presente invencion. Esto puede mejorar una mas propiedades de la masa o el producto alimenticio basado en cereales obtenido a partir de la masa con relacion a una masa o un producto alimenticio basado en cereales en los que no se incorpore el polipeptido.
La preparacion del producto alimenticio basado en cereales segun la invencion puede comprender ademas etapas conocidas en la tecnica tales como ebullicion, secado, fritura, tratamiento al vapor u horneado de la masa obtenida.
Productos que se elaboran a partir de una masa que se hierve son, por ejemplo, tallarines hervidos, empanadillas, productos que se elaboran a partir de masa frita son, por ejemplo, rosquillas, bunuelos, tallarines fritos, productos que se elaboran a partir de masa tratada al vapor son, por ejemplo bollos al vapor o tallarines al vapor, ejemplos de productos elaborados a partir de masa desecada son pasta y tallarines desecados y ejemplos de productos elaborados a partir de masa horneada son pan, galletas, torta.
El termino "propiedad mejorada" se define en la presente como cualquier propiedad de una masa y/o un producto obtenido a partir de la masa, particularmente un producto alimenticio basado en cereales, que se mejore mediante la accion del polipeptido segun la invencion con relacion a una masa o producto en los que no se incorpore el polipeptido segun la invencion. La propiedad mejorada puede incluir, pero no se limita a, resistencia incrementada de la masa, elasticidad incrementada de la masa, estabilidad incrementada de la masa, capacidad de trabajado a maquina mejorada de la masa, impermeabilizacion mejorada de la masa, adherencia reducida de la masa, extensibilidad mejorada de la masa, volumen incrementado del producto alimenticio basado en cereales, ampollamiento reducido producto alimenticio basado en cereales, estructura de la miga mejorada del producto horneado, suavidad mejorada del producto alimenticio basado en cereales, sabor mejorado del producto alimenticio basado en cereales, antienranciamiento mejorado del producto alimenticio basado en cereales. Propiedades mejoradas relacionadas con el tipo de pasta y tallarm de los productos basados en cereales son, por ejemplo, firmeza mejorada, adherencia reducida, cohesividad mejorada y perdida por coccion reducida.
La propiedad mejorada se puede determinar por comparacion con una masa y/o un producto alimenticio basado en cereales preparados con y sin la adicion de un polipeptido de la presente invencion. Las cualidades organolepticas se pueden evaluar usando procedimientos bien establecidos en la industria, y pueden incluir, por ejemplo, el uso de un grupo de degustadores entrenados.
El termino "masa" se define en la presente como una mezcla de harina de cereal y otros ingredientes suficientemente firme para amasar o tratar con rodillo. Ejemplos de cereales son trigo, centeno, mafz, cebada, arroz, semola, trigo sarraceno y avena. Se pretende ahora y posteriormente que el trigo abarque todas las especies
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conocidas del genera Triticum, por ejemplo aestivum, durum y/o spelta. Ejemplos de otros ingredientes adecuados son: el polipeptido potenciador de celulasa segun la presente invencion, enzimas adicionales, aditivos qmmicos y/o adyuvantes de procesamiento. La masa puede ser fresca, congelada, preparada o prehorneada. La preparacion de una masa a partir de los ingredientes descritos anteriormente es muy conocida en la tecnica y comprende la mezcladura de dichos ingredientes y adyuvantes de procesamiento y una o mas etapas de moldeo y opcionalmente fermentacion. La preparacion de masa congelada es descrita por Kulp y Lorenz en Frozen and Refrigerated Doughs and Batters.
El termino "producto alimenticio basado en cereales" se define en la presente como cualquier producto preparado a partir de una masa, de caracter bien blando o bien crujiente. Ejemplos de productos alimenticios basados en cereales, ya sea de un tipo blanco, claro u oscuro, que se pueden producir ventajosamente mediante la presente invencion son pan (en particular pan blanco, integral o de centeno), tipicamente en la forma de barras o rollos, pan frances de tipo baguette, pasta, tallarines, rosquillas, bagels, torta, pan de pita, tortillas, tacos, tortas, panqueques, bizcochos, galletas, masas quebradas, pan al vapor y pan crujiente, y similares.
El termino "producto horneado" se define en la presente como cualquier producto alimenticio basado en cereales preparado al hornear la masa.
Los polisacaridos no amilaceos (NSP) pueden incrementar la viscosidad de la masa digerida, lo que, a su vez, puede disminuir la disponibilidad de nutrientes y el rendimiento animal. El uso del polipeptido potenciador de celulasa de la presente invencion puede mejorar la utilizacion de fosforo asf como minerales cationicos y polipeptido durante la digestion del animal.
Anadir nutrientes espedficos al pienso mejora la digestion del animal y de ese modo reduce los costes del pienso. Se esta usando actualmente una gama de aditivos para piensos y se estan desarrollando continuamente nuevos conceptos. El uso de enzimas espedficas como enzimas de degradacion de carbohidratos no amilaceos podna descomponer la fibra liberando energfa asf como incrementar la digeribilidad de proterna debido a una mejor accesibilidad de la proterna cuando la fibra se descompone. De este modo, se podna disminuir el coste del pienso asf como tambien se podnan reducir los niveles de proterna en el pienso.
Los polisacaridos no amilaceos (NSP) tambien estan presente virtualmente en todos los ingredientes de piensos de origen vegetal. Los NSP se utilizan escasamente y, cuando se solubilizan, pueden ejercer efectos adversos sobre la digestion. Las enzimas exogenas pueden contribuir a una mejor utilizacion de estos NSP y como consecuencia reducir cualesquiera efectos antinutricionales. Las enzimas de degradacion de carbohidratos no amilaceos de la presente invencion se pueden usar con este proposito en dietas basadas en cereales para aves de corral y, en un grado menor, para cerdos y otras especies.
Un polipeptido/una enzima de degradacion de carbohidratos no amilaceos de la invencion (o una composicion que comprende el polipeptido/la enzima de la invencion) se puede usar en la industria de los detergentes, por ejemplo para la eliminacion de la ropa de manchas basadas en carbohidratos. Una composicion detergente puede comprender un polipeptido/una enzima de la invencion y, ademas, una o mas de una celulasa, una hemicelulasa, una pectinasa, una proteasa, una lipasa, una cutinasa, una amilasa o una carbohidrasa.
Uso de enzimas en composiciones detergentes
Una composicion detergente que comprende un polipeptido o una composicion de la invencion puede estar en cualquier forma conveniente, por ejemplo una pasta, un gel, un polvo o un lfquido. Un detergente lfquido puede ser acuoso, conteniendo tfpicamente hasta aproximadamente 70% de agua y de aproximadamente 0 a aproximadamente 30% de disolvente organico o material no acuoso.
Esta composicion detergente se puede formular, por ejemplo, como una composicion detergente para lavar a mano o a maquina adecuada para el pretratamiento de tejidos manchados y una composicion suavizante de tejidos anadida en el enjuague, o se puede formular como una composicion detergente para uso en operaciones de limpieza de superficies duras domesticas generales, o se puede formular para operaciones de lavado de vajillas a mano o a maquina.
En general, las propiedades de la enzima deben ser compatibles con el detergente seleccionado (por ejemplo, optimo de pH, compatibilidad con otros ingredientes enzimaticos y/o no enzimaticos, etc.) y la enzima o las enzimas deben estar presentes en una cantidad eficaz.
Una composicion detergente puede comprender un tensioactivo, por ejemplo un tensioactivo anionico o no ionico, un mejorador del detergente o un agente complejante, uno o mas polfmeros, un sistema blanqueador (por ejemplo una fuente de H2O2) o un estabilizante de enzimas. Una composicion detergente tambien puede comprender cualquier otro ingrediente de detergentes convencional tal como, por ejemplo, un acondicionador incluyendo una arcilla, un
estimulante de la espuma, un supresor de jabonaduras, un agente anticorrosion, un agente de suspension de manchas, un agente antirredeposicion de manchas, un tinte, un bactericida, un abrillantador optico, un hidrotropo, un inhibidor del deslustre o un perfume.
Uso de enzimas en procesamiento de papel y pasta papelera
5 Un polipeptido o una composicion de la presente invencion se puede usar en la industria del papel y la pasta papelera, entre otras cosas en el procedimiento de blanqueo para mejorar el brillo de pastas papeleras blanqueadas, con lo que se puede reducir la cantidad de cloro usada en las fases de blanqueo, y para incrementar la libertad de las pastas papeleras en el procedimiento de reciclaje de papel (Eriksson, K. E. L., Wood Science and Technology 24 (199o):79-1o1; Paice, y cols., Biotechnol. and Bioeng. 32 (1988):235-239 y Pommier y cols., Tappi Journal 10 (1989):187-191). Por otra parte, un polipeptido o una composicion de la invencion se puede usar para el tratamiento
de pasta papelera lignocelulosica a fin de mejorar la capacidad de blanqueo de la misma. De ese modo, se puede reducir la cantidad de cloro necesaria para obtener un blanqueo satisfactorio de la pasta papelera.
Un polipeptido o una composicion de la invencion se puede usar en un metodo para reducir la velocidad a la que las 15 telas que contienen celulosa se hacen duras o para reducir la dureza de telas que contienen celulosa, comprendiendo el metodo tratar telas que contienen celulosa con un polipeptido o una composicion como los descritos anteriormente. La presente invencion se refiere ademas a un metodo que proporciona aclaramiento del color de telas que contienen celulosa coloreadas, comprendiendo el metodo tratar telas que contienen celulosa coloreadas con un polipeptido o una composicion como los descritos anteriormente, y un metodo para proporcionar 20 una variacion localizada en el color de telas que contienen celulosa coloreadas, comprendiendo el metodo tratar telas que contienen celulosa coloreadas con un polipeptido o una composicion como los descritos anteriormente. Los metodos de la invencion se pueden llevar a cavo al tratar telas que contienen celulosa durante el lavado. Sin embargo, si se desea, el tratamiento de las telas tambien se puede llevar a cabo durante el remojo o el enjuague o simplemente al anadir el polipeptido o la composicion que se describe anteriormente a agua en la que estan 25 sumergidas las telas.
Otros usos de las enzimas
Ademas, un polipeptido o una composicion de la presente invencion tambien se puede usar en una formulacion antibacteriana asf como en productos farmaceuticos tales como pastillas para la garganta, pastas de dientes y un colutorio.
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Los siguientes Ejemplos ilustran la invencion:
Ejemplos
Materiales y metodos Procedimientos con ADN
35 Se llevaron a cabo procedimientos con ADN estandar segun se describe en otras partes (Sambrook y cols., 1989, Molecular cloning: a laboratory manual, 2a Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York) a menos que se indique otra cosa. El ADN se amplifico usando la enzima a prueba de lectura enzima polimerasa Physion (Finnzymes). Las enzimas de restriccion eran de Invitrogen o New England Biolabs.
Preparacion de muestras de celulasa
40 Celulasas originarias de Talaromyces emersonii se expresaron en Aspergillus niger. Se produjeron filtrados concentrados de las enzimas segun se describe en el documento WO2004/030468. Despues de hacer crecer Aspergillus niger que contema los plasmidos de expresion apropiados, se prepararon sobrenadantes libres de celulas mediante la centrifugacion del caldo de fermentacion a 5.000 x g durante 30 minutos a 4°C. Opcionalmente, el sobrenadante se puede ajustar hasta pH=5 con KOH 4 N y filtrarse esterilmente sobre un filtro de 2 pm (tapon de 45 botella) con succion para retirar cualquier material fungico. Ademas, los sobrenadantes se pueden filtrar adicionalmente sobre un filtro de microfibra de vidrio GF/A Whatman (150 mm 0) para retirar cualquier solido. Los sobrenadantes se ultrafiltraron, se concentraron y se almacenaron hasta el uso a 4°C o se congelaron a -20°C.
Metodo para la determinacion de protemas totales
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El metodo era una combinacion de precipitacion de protema usando acido tricloroacetico (TCA) para retirar sustancias molestas y permite la determinacion de la concentracion de protema con la reaccion colorimetrica del biuret. En la reaccion del biuret, un ion cobre (II) se reduce hasta cobre (I), que forma un complejo con los nitrogenos y los carbonos de las uniones peptfdicas en una solucion alcalina. Un color violeta indica la presencia de protemas. La intensidad del color, y de ah la absorcion a 546 nm, es directamente proporcional a la concentracion de protema, segun la ley de Beer-Lambert. La estandarizacion se realizo usando BSA (albumina de suero bovino) y el contenido de protema se expreso en g de protema como equivalente de BSA/l o mg de protema como equivalente de BSA/ml. El contenido de protema se calculo usando protocolos de calculo estandar conocidos en la tecnica, al representar la OD546 frente a la concentracion de muestras con concentracion conocida, seguido por el calculo de la concentracion de las muestras desconocidas usando la ecuacion generada a partir de la curva de calibracion.
Preparacion de sustrato de paja de trigo pretratado lavado
Se obtuvo paja de trigo pretratada en acido diluido como se describe en Linde, M. y cols, Biomass and Bioenergy 32 (2008), 326-332 y se puede usar el equipo que se describe en Schell, D.J., Applied Biochemistry and Biotechnology (2003), vol. 105-108, pp 69-85. La paja de trigo pretratada se lavo con agua hasta que la solucion con paja de trigo tema pH 6,0 o superior. El agua de lavado se filtro.
Cribado con respecto a la hidrolisis de celulosa
Una solucion de sustrato de materia seca (dm) de paja de trigo pretratada (PWS) acida lavada al 2% se elabora en tampon de acetato sodico 50 mM, pH 4,5. Para la incubacion, se usa una microplaca de 96 pocillos hondos. Se pipetea a cada pocillo 1 ml de sustrato.
Se prepararon mezclas de enzimas a diversas relaciones de las celulasas, y se anadieron a la solucion de sustrato a una dosis de protema fija por gramo de materia seca de sustrato.
La placa se incubo a 65°C durante 20 horas. Despues de la incubacion, la reaccion enzimatica se detiene al anadir 50 |jl de una solucion de hidroxido sodico 1 M. A continuacion, la placa se centrifuga durante 15 min. a 3220 rcf y el sobrenadante se diluye hasta una concentracion de glucosa entre 40 y 100 jM.
Se pipetean 50 jl de muestra diluida en una placa de PCR y se anaden 150 jl de reactivo BCA. El reactivo BCA se elabora recientemente al mezclar dos soluciones de reserva A y B 1:1 v/v. La solucion A consistfa en 54,3 g de Na2CO3, 24,2 de NaHCO3 y 1,9 g de Na2BCA (Sigma D8284) por litro de agua (MQ). La solucion B contema 31,24 ml de solucion al 4% de CuSO4.5H2O (Pierce 185 9078) y 1,26 g de L-lisina (Sigma L5501) por litro de agua (MQ). (Concentracion final: 2,5 mM de BCA, 2,5 mM de Cu, 4,3 mM de L-lisina y 400 mM de carbonato). La placa se calienta hasta 80°C durante 60 minutos. Despues de enfriar, se pipetean 150 jl en una segunda placa y la absorbancia se mide a 560 nm.
En cada placa se analiza el fondo del sustrato, al incubar el sustrato sin adicion de enzimas. Para cada medida, se analiza un estandar de glucosa de 55 jM frente a tampon de acetato para calcular el coeficiente de extincion molar de la glucosa.
Las incubaciones se realizan usando un bloque de PCR termociclador Peltier (PTC200) y las medidas se realizan usando un lector de placas de microvaloracion (TECAN Sunrise).
Se calculo la glucosa liberada del sustrato por la accion de las enzimas, como se da posteriormente:
* Glucosa liberada (mmol/l)
(4s — Abl) * Densayo * V ensayo * Dincubados I * e * Vsustrato
As = absorbancia de la muestra a 560 nm
Abl = absorbancia del blanco del sustrato a 560 nm
Densayo = dilucion en el ensayo
Vensayo = volumen total den ensayo (jl)
Dincubados = dilucion de los incubados I = longitud de recorrido (cm)
£ = coeficiente de extincion molar de la glucosa-BCA (mmol*l'1*cm'1) Vsustrato = volumen total del sustrato (jl)
Este valor tambien se corrigio para el contenido de azucares reductores/protemas en la muestra de enzimas (analizada mediante el ensayo de BCA)
Hidrolisis ampliada de celulosa
Las incubaciones de combinaciones de enzimas sobre solucion de sustrato de materia seca (dm) de paja de trigo 5 pretratada (PWS) acida lavada al 2% en tampon de acetato sodico 50 mM, pH 4,5, se realizaron a una escala de 10 ml. Las combinaciones de enzimas se anadieron a dosis de protema fijas por gramo de materia seca de sustrato. Las muestras se recogieron a tiempo, hasta 72 horas de incubacion a 65°C. Las reacciones se terminaron en un tiempo dado, al centrifugar el residuo, pipetear el sobrenadante y congelar las muestras hasta el analisis.
10 El analisis de la cantidad de glucosa liberada se realizo usando NMR de flujo. Los espectros de 1H NMR se registraron en un sistema de NMR BrukerAVANCE II BEST que funcionaba a una frecuencia protonica de 500 MHz y una temperatura de la sonda de 27°C.
Ejemplo 1
1.1. Construccion de plasmidos de expresion
15 La secuencia que tema SEQ ID N°: 1 se clono en el vector pGBTOP (Fig. 1) usando los sitios EcoRI y SnaBI, que comprenden la secuencia promotora y terminadora de glucoamilasa. La parte de E.coli se recupero mediante digestion con Notl antes de la transformacion de A. niger CBS 513.88.
1.2. Transformacion de A. niger
A. niger WT-1: Esta cepa de A. niger es CBS513.88 que comprende eliminaciones de los genes que codifican 20 glucoamilasa (glaA), amilasa fungica y amilasa acida. A. niger Wt 1 se construye al usar el enfoque "libre de gen marcador" que se describe en el documento EP 0 635 574 B1.
Las construcciones de expresion se cotransformaron hasta la cepa A. niger WT-1 segun el metodo descrito por Tilburn, J. y cols. (1983) Gene 26, 205-221 y Kelly, J. & Hynes, M. (1985) EMBO J., 4, 475-479 con las siguientes 25 modificaciones:
- Las esporas se germina y se cultivan durante 16 horas a 30 grados Celsius en un matraz agitado colocado en un agitador giratorio a 300 rpm en medio mmimo de Aspergillus (100 ml). El medio mmimo de Aspergillus contiene por litro: 6 g de NaNOs, 0,52 g de KCl, 1,52 g de KH2PO4, 1,12 ml de KOH 4 M, 0,52 g de MgSO4.7H2O, 10 g de glucosa, 1 g de casaminoacidos, 22 mg de ZnSO4.7H2O, 11 mg de H3BO3, 5 mg de FeSO4.7H2O, 1,7 mg de
30 CoCl2.6H2O, 1,6 mg de CuSO4.5H2O, 5 mg de MnCl2.2H2O, 1,5 mg de Na2MoO4.2H2O, 50 mg de EDTA, 2 mg de
riboflavina, 2 mg de HCl de tiamina, 2 mg de nicotinamida, 1 mg de HCl de piridoxina, 0,2 mg de acido pantotenico, 4 g de biotina, 10 ml de solucion de penicilina (5000 UI/ml) y estreptomicina (5000 UG/ml) (Gibco).
- Se usa Novozym 234™ (Novo Industries) en lugar de helicasa para la preparacion de protoplastos;
- Despues de la formacion de protoplastos (60-90 minutos), se anadio tampon de KC (0,8 M de KCI, 9,5 mM de
35 acido cftrico, pH 6,2) hasta un volumen final de 45 ml, la suspension de protoplastos se centrifuga durante 10
minutos a 3.000 rpm a 4 grados Celsius en un rotor de alabes oscilantes. Los protoplastos se resuspenden en 20 ml de tampon de KC y posteriormente se anaden 25 ml de tampon de STC (1,2 M de sorbitol, 10 mM de Tris-HCl pH 7,5, 50 mM de CaCh). La suspension de protoplastos se centrifuga durante 10 minutos a 3000 rpm a 4 grados Celsius en un rotor de alabes oscilantes, se lava en tampon de STC y se resuspende en tampon de STC a una 40 concentracion de 10E8 protoplastos/ml;
- Se anade a 200 microlitros de la suspension de protoplastos el fragmento de ADN, disuelto en 10 microlitros de tampon de TE (10 mM de Tris-HCl pH 7,5, 0,1 mM de EDTA) y 100 microlitros de soluciones de PEG (20% de PEG 4000 (Merck), 0,8 M de sorbitol, 10 mM de Tris-HCl pH 7,5, 50 mM de CaCh);
- Despues de la incubacion de la suspension de protoplastos de ADN durante 10 minutos a temperatura ambiente, 45 se anadieron lentamente 1,5 ml de solucion de pEg (60% de PEG 4000 (Merck), 10 mM de Tris-HCl pH 7,5, 50 mM
de CaCl2), con mezcladura repetida de los tubos. Despues de la incubacion durante 20 minutos a temperatura ambiente, las suspensiones se diluyen con 5 ml de sorbitol 1,2 M, se mezclaron mediante inversion y se centrifugaron durante 10 minutos a 4000 rpm a temperatura ambiente. Los protoplastos se resuspenden suavemente
en 1 ml de sorbitol 1,2 M y se siembran sobre medio de regeneracion solido selectivo que consiste en medio mmimo de Aspergillus sin riboflavina, HCl de tiamina, nicotinamida, piridoxina, acido pantotenico, biotina, casaminoacidos y glucosa. En el caso de la seleccion de acetamida, el medio contiene 10 mM de acetamida como la unica fuente de nitrogeno y 1 M de sacarosa como fuente osmotica y de C. Alternativamente, los protoplastos se siembran sobre 5 PDA (agar de dextrosa de patata, Oxoid) complementado con 1-50 microgramos/ml de fleomicina y 1 M de sacarosa como osmotico. Las placas de regeneracion se solidifican usando 2% de agar (agar N° 1, Oxoid L11). Despues de la incubacion durante 6-10 dfas a 30 grados Celsius, las conidiosporas de los transformantes se transfieren a placas que consisten en medio selectivo de Aspergillus (medio mmimo que contiene acetamida como unica fuente de nitrogeno en el caso de la seleccion de acetamida o PDA complementado con 1-50 microgramos/ml de fleomicina en 10 el caso de la seleccion de fleomicina) con 2% de glucosa y 1,5% de agarosa (Invitrogen) y se incuban durante 5-10 dfas a 30 grados Celsius. Se aislaron transformantes individuales y esta etapa de purificacion selectiva se repite una vez tras lo cual los transformantes purificados se almacenaron.
Despues de la transformacion, los transformantes se seleccionaron sobre medios que comprendfan acetamida como la unica fuente de nitrogeno y las colonias se purificaron. Los numeros de copias se estimaron mediante PCR 15 cuantitativa y se seleccionaron los transformantes de bajo y alto numero de copias. Los transformantes de alto numero de copias se cultivaron en matraces agitados en 100 ml de medio CSM-MES segun se describe en el documento EP 635 574 a 34°C a 170 rpm en un agitador incubador usando un matraz agitador de 500 ml con deflectores. Despues de 3 y 4 dfas de fermentacion, las muestras de sobrenadante se recogieron para determinar la expresion mediante SDS-PAGE.
20 1.3 Contenido de protema
Se analizo en contenido de protema de los sobrenadantes ultrafiltrados y concentraron de las fermentaciones en matraz agitado de los transformantes que expresan polipeptido potenciador de celulasa (TEMER07589). Se determino que el contenido de protema era 24 mg de protema como equivalentes de BSA/ml.
Ejemplo 2
25 2.1 Preparacion de muestras de celulasa
Dos endoglucanasas procedentes de Talaromyces emersonii, como las descritas en la patente EP1621628, como CEA (SEQ 1) y CEB (SEQ 3) se prepararon como se describe en el Ejemplo 1 para TEMER07589. Adicionalmente, se prepararon de forma similar dos exoglucanasas, que son CBHI segun se describe en la solicitud de patente EP09158739.4 y CBHII (segun se describe en la solicitud de patente en tramitacion junto con la presente DSM Caso 30 27829, presentada el mismo dfa que esta solicitud). Finalmente, una beta-glucosidasa procedente de Talaromyces
emersonii, como se conoce de Murray y cols., Protein expression and Purification, 2004, 38, 248-257, tambien se sobreexpreso en Aspergillus niger. Los contenidos de protema de estas muestras se determinaron y clasificaron de 20 a 60 mg de protema como equivalentes de BSA/ml.
2.2 Hidrolisis de celulosa mediante mezclas de enzimas en 20 h
35 Se prepararon combinaciones de 4 celulasas. Cada combinacion consistfa en 1 BG, 1 CBHI, 1 CBHII y 1 EG. Sin embargo, para la combinacion de celulasas que contema actividad potenciadora de celulasa, se omitio la EG y se reemplazo por TEMER07589. Aparte de una actividad potenciadora de endoglucanasa o celulasa diferente en las mezclas de enzimas, tambien se probaron una pocas relaciones diferentes de las 4 enzimas. Todas estas combinaciones de 4 enzimas se anadieron en 5 mg de protema como equivalentes de BSA por g de paja de trigo 40 pretratada lavada, y se cribaron con respecto a su capacidad de hidrolisis de celulosa en incubaciones de 20 h a 65°C, segun se describe anteriormente. Ademas de estas mezclas de enzimas, un producto de celulasa de Talaromyces emersonii clasico, conocido como Filtrase® NL, tambien se incubo a una dosis de protema similar.
Se determino la liberacion de glucosa, y se muestra en la Tabla 1 para las mezclas de 4 enzimas. Para Filtrase® NL, 45 se determino que la glucosa liberada era 30,1 mmol/l.
Tabla 1: Composicion de 4 mezclas compuestas por combinaciones de 4 celulasas, con cantidades relativas variables de las 4 celulasas (dadas como porcentaje de la dosis de protema total), y la glucosa liberada (expresada como mmol/l) despues de 20 h de incubacion a pH 4,5 y 65°C, para cada mezcla, cuando contienen CEA, CEB o 50 TEMER07589 como EG.
Porcentaje de cada una de las 4 enzimas en la mezcla Glucosa liberada (mmol/l)
BG CBHI CBHlI EG* CEA CEB TEMER07589
Mezcla 1
4% 14% 25% 57% 17,3 13,6 31,2
Mezcla 2
4% 18% 10% 68% 17,0 15,7 21,6
Mezcla 3
8% 14% 25% 53% 26,4 13,8 28,1
Mezcla 4
8% 20% 29% 43% 18,4 12,0 31,9
* EG indica el porcentaje de endoglucanasa, en el caso de CEA y CEB, e indica el porcentaje de actividad potenciadora de celulasa en el caso de TEMER07589, mezcla en la que se omite una endoglucanasa verdadera.
5 A partir de estos resultados, esta claro que para las 4 relaciones de enzimas probadas, la actividad potenciadora de celulasa superaba a las dos endoglucanasas. Sin embargo, en el caso de la relacion de enzimas que se da en la Mezcla 1 y la Mezcla 4, la mezcla de 4 enzimas que contiene actividad potenciadora de celulasa, TEMER07589, en lugar de endoglucanasa, incluso superaba a Filtrase® NL, que contiene varias endoglucanasas, beta-glucosidasas y las dos exoglucanasas, CBHI y CBHlI.
10 Ejemplo 3
3.1 Optimizacion de la relacion de mezclas de 4 enzimas
Las 3 mezclas de 4 enzimas diferentes que se usan en el Ejemplo 2 se usaron en un diseno de mezcla que consistfa en 10 vertices, y un numero total de 55 combinaciones de relaciones diferentes para encontrar la relacion optima de las 4 enzimas para cada una de las 3 mezclas. Los intervalos de las diferentes enzimas probadas en este diseno 15 eran BG 4-12%, y cada una de las otras 3 enzima en los intervalos de 10-70%. En cada serie de 55 incubaciones, se efectuaron 3 duplicados. El cribado de estas mezclas se realizo sobre paja de trigo pretratada lavada a 2% de DM en tampon de acetato 50 mM de pH 4,5. La incubacion se realizo a una dosis de protema total de 5 mg de protema como equivalentes de BSA por g de materia seca de paja de trigo pretratada lavada, durante 20 h a 65°C, en placas de microvaloracion de 96 pocillos hondos. La capacidad de hidrolisis de celulosa se determino mediante la glucosa 20 liberada segun se determina mediante el ensayo de azucares reductores con BCA. La evaluacion estadfstica de todos los datos para cada mezcla daba como resultado la relacion optimizada de las 4 enzimas en cada mezcla, segun se da en la Tabla 2.
Tabla 2. Composicion optima de 3 mezclas de 4 enzimas diferentes, que contema cada una 1 BG, 1 CBHI, 1 CBHlI y 25 1 EG o actividad potenciadora de celulasa, expresada como porcentaje de la protema total, para cada enzima
individual.
BG CBHI CBHII m G) *
Mezcla CEA
12% 36% 34% 18%
Mezcla CEB
4% 13% 15% 68%
Mezcla TEMER07589
9% 30% 24% 37%
* EG indica el porcentaje de endoglucanasa, en el caso de CEA y CEB, e indica el porcentaje de actividad potenciadora de celulasa en el caso de TEMER07589, mezcla en la que se omite una endoglucanasa verdadera.
30 3.2 Hidrolisis ampliada de mezclas de 4 enzimas optimizadas
Las 3 mezclas optimizadas se aplicaron en la hidrolisis ampliada a una escala de 10 ml con 2% de DM de paja de trigo pretratada, a pH 4,5 y 65°C. Como comparacion, la Filtrase® NL previamente mencionada, un producto de celulasa de Talaromyces emersonii clasico, tambien se incubo a una concentracion de sustrato, un pH y una temperatura iguales. La dosis de protema total en cada una de las incubaciones era 15 mg de protema como 35 equivalentes de BSA por gramo de materia seca de paja de trigo pretratada. Las incubaciones duraban 72 horas y se tomaron muestras a diversos intervalos de tiempo. Las muestras se centrifugaron y el sobrenadante se congelo hasta el analisis mediante NMR. La liberacion de glucosa con el tiempo se muestra en la Figura 2.
A partir de la Fig. 2, esta claro que la mezcla que contiene actividad potenciadora de celulasa, TEMER07589, supera 40 a las mezclas de dos endoglucanasas que contienen CEA o CEB. La mezcla que contiene actividad potenciadora de celulasa tiene una liberacion de glucosa incluso ligeramente superior el final de la incubacion que la Filtrase® NL.

Claims (20)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    55
    REIVINDICACIONES
    1. Un polipeptido que comprende la secuencia de aminoacidos indicada en SEQ ID N°: 2 o una secuencia de aminoacidos codificada por la secuencia nucleotfdica de SEQ ID N°: 1, o un polipeptido variante o un polinucleotido variante del mismo, en donde el polipeptido variante tiene al menos 95% de identidad de secuencia con la secuencia indicada en SEQ ID N°: 2 o el polinucleotido variante codifica un polipeptido que tiene al menos 95% de identidad de secuencia con la secuencia indicada en SEQ ID N°: 2 y en donde el polipeptido tiene o consiste en una actividad de degradacion de materiales gluddicos .
  2. 2. Un polinucleotido que comprende:
    (a) la secuencia nucleotidica indicada en SEQ ID N°: 1; o
    (b) una secuencia nucleotidica que se hibrida selectivamente con un polinucleotido que es el complemento inverso de SEQ ID N°: 1; o
    (c) una secuencia nucleotidica que tiene al menos 95% de identidad de secuencia con la secuencia nucleotfdica de SEQ ID N°: 1; o
    (d) una secuencia que esta degenerada como resultado del codigo genetico hasta una secuencia como la definida en uno cualquiera de (a), (b) o (c); o
    (e) una secuencia nucleotidica que es el complemento inverso de una secuencia nucleotidica como la definida en (a), (b), (c) o (d).
  3. 3. Un polinucleotido segun la reivindicacion 2, que codifica un polipeptido segun la reivindicacion 1.
  4. 4. Un polinucleotido segun la reivindicacion 2 o 3, que es una secuencia de ADN.
  5. 5. Una construccion de acido nucleico que comprende el polinucleotido segun una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4.
  6. 6. Un vector que incorpora una secuencia polinucleotidica segun una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4.
  7. 7. Una celula recombinante transformada con un polinucleotido segun una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, una construccion de acido nucleico segun la reivindicacion 5 o un vector segun la reivindicacion 6.
  8. 8. Una celula segun la reivindicacion 7, en donde la celula es una celula fungica.
  9. 9. Una celula segun la reivindicacion 8, en donde la celula fungica se selecciona del grupo que consiste en los generos Aspergillus, Trichoderma/Hypocrea, Fusarium, Disporotrichum, Penicillium, Acremonium, Neurospora, Thermoascus, Myceliophtora, Sporotrichum, Thielavia, Chryosporium, Fusarium, Humicola, Neurospora y Talaromyces.
  10. 10. Una celula segun una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, en la que uno o mas genes estan eliminados, inactivados o alterados totalmente o en parte, en donde opcionalmente el gen codifica una proteasa.
  11. 11. Un metodo para la preparacion de un polipeptido segun la reivindicacion 1, que tiene actividad de degradacion de materiales gluddicos y/o actividad de hidrolizacion de carbohidratos, metodo que comprende cultivar una celula segun cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10 bajo condiciones que permiten la expresion de dicho polipeptido y, opcionalmente, recuperar el polipeptido expresado.
  12. 12. Una composicion que comprende: (i) un polipeptido segun la reivindicacion 1, y (ii) una celulasa y/o una hemicelulasa y/o una pectinasa.
  13. 13. Una composicion segun la reivindicacion 12, en la que la celulasa es una celobiohidrolasa, celobiohidrolasa I, celobiohidrolasa II, una endo-p-1,4-glucanasa, una p-glucosidasa o una p-(1,3)(1,4)-glucanasa.
  14. 14. Una composicion segun la reivindicacion 12 o 13, en la que la hemicelulasa es una endoxilanasa, una p- xilosidasa, una a-L-arabinofuranosidasa, una a-D-glucuronidasa, una acetil xilano esterasa, una feruloil esterasa, una cumaroil esterasa, una a-galactosidasa, una p-galactosidasa, una p-mananasa o una p-manosidasa.
    5
    10
    15
    20
    25
  15. 15. Una composicion segun una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14, en la que la pectinasa es una endopoligalacturonasa, una pectina metil esterasa, una endo-galactanasa, una betagalactosidasa, una pectina acetil esterasa, una endo-pectina liasa, pectato liasa, alfa-ramnosidasa, una exo-galacturonasa, una exopoligalacturonato liasa, una ramnogalacturonano hidrolasa, una ramnogalacturonano liasa, una ramnogalacturonano acetil esterasa, una ramnogalacturonano galacturonohidrolasa, una xilogalacturonasa, una alfa-arabinofuranosidasa o una endo- arabinanasa.
  16. 16. Una composicion segun una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 15, que comprende una ligninasa, una expansina, un polipeptido similar a expansina, una swollenina o el producto polipeptidico de un gen que codifica una protema integradora de celulosa o una protema inducida por celulosa.
  17. 17. Un metodo para el tratamiento de un sustrato que comprende material gluddico, opcionalmente un material vegetal, metodo que comprende poner en contacto el sustrato con un polipeptido segun la reivindicacion 1 y/o una composicion segun una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 16.
  18. 18. Un metodo segun la reivindicacion 17, en el que el sustrato es un material vegetal y el material vegetal se proporciona en la forma de una planta, una pulpa vegetal, un extracto vegetal, un producto alimenticio o un ingrediente derivado del mismos o un tejido, un material textil o una prenda de vestir que comprende un material vegetal.
  19. 19. Uso de un polipeptido segun la reivindicacion 1 y/o una composicion segun una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 16, para producir azucar a partir de un material lignocelulosico.
  20. 20. Un procedimiento para la preparacion de un producto de fermentacion, procedimiento que comprende:
    a) degradar lignocelulosa al poner en contacto la lignocelulosa con un polipeptido segun la reivindicacion 1 y/o una composicion segun una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 16,
    b) fermentar el material resultante para preparar un producto de fermentacion, y
    c) opcionalmente, recuperar el producto de fermentacion.
    imagen1
    imagen2
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