ES2350048T3 - Mutantes fúngicos filamentosos con eficiencia mejorada de recombinación homóloga. - Google Patents
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Abstract
Método para aumentar la eficiencia de integración direccionada de un polinucleótido en un sitio predeterminado del genoma de una célula fúngica filamentosa con preferencia para NHR, en donde dicho polinucleótido tiene una región de homología con dicho sitio predeterminado, comprendiendo dicho método proporcionar un mutante de una célula fúngica filamentosa parental, en donde la relación de NHR/HR está reducida al menos en un 50% en el mutante en comparación con dicha relación en dicho organismo parental medida en las mismas condiciones, en donde el mutante es, preferiblemente de modo inducible, deficiente en al menos un componente implicado en NHR, y/o tiene una cantidad reducida de al menos uno de dichos al menos un componente, en donde dicho componente se selecciona del grupo constituido por homólogos fúngicos filamentosos de levadura KU80, KU70, RAD50, MRE11, XRS2, LIG4, SIR4, LIFL y NEIL.
Description
Mutantes fúngicos filamentosos con eficiencia
mejorada de recombinación homóloga.
La invención se refiere al campo de la biología
molecular. La misma se refiere particularmente a métodos para
mejorar la eficiencia de la integración directa de ácidos nucleicos
en el genoma de un hongo filamentoso, y usos de los mismos.
Las células eucariotas son organismos preferidos
para la producción (recombinante) de polipéptidos y metabolitos
secundarios. Cuando se construye, por ejemplo, una cepa de
producción de proteínas, el sitio de integración del gen de interés
que codifica la proteína a producir es crucial para la regulación de
la transcripción y/o expresión del gen integrado de interés. Dado
que en la mayoría de los organismos eucariotas la integración del
DNA en el genoma ocurre con alta frecuencia de modo aleatorio, la
construcción de una cepa de producción de proteínas por tecnología
de DNA recombinante conduce a menudo a la integración aleatoria
indeseable de la casete de expresión que comprende el gen que
codifica la proteína a producir. Esta "integración múltiple
aleatoria" descontrolada de una casete de expresión es un proceso
potencialmente peligroso, que puede conducir a una modificación
indeseable del genoma del hospedador. Por consiguiente, es sumamente
deseable poder construir una cepa de producción de proteínas
asegurando el direccionamiento correcto de la casete de expresión
con eficiencia alta.
Adicionalmente, ahora que está haciéndose
disponible la secuencia de genomas completos de una cantidad
creciente de organismos, ello abre la oportunidad de construir
bibliotecas genómicas que abarcan sobreexpresión y deleción. Un
requisito importante para la construcción eficiente de tales
bibliotecas es que el organismo en cuestión pueda transformarse
eficientemente y que la homología requerida necesaria para dirigir
la integración direccionada de un ácido nucleico en el genoma sea
relativamente corta.
Las células eucariotas tienen al menos dos
caminos separados (uno por recombinación homóloga y otro por
recombinación no homóloga) a través de los cuales los ácidos
nucleicos (en particular, por supuesto, DNA) pueden integrarse en
el genoma hospedador. La levadura Saccharomyces cerevisiae es
un organismo con preferencia para recombinación homóloga (HR). La
relación de recombinación no homóloga a homóloga (NHR/HR) de este
organismo puede variar desde aproximadamente 0,07 a 0,007.
WO 02/052026 describe mutantes de
Saccharomyces cerevisiae que tienen una eficiencia de
direccionamiento mejorada de secuencias de DNA a su genoma. Tales
cepas mutantes son deficientes en un gen implicado en NHR
(KU70).
Contrariamente a Saccharomyces
cerevisiae, la mayoría de los eucariotas superiores tales como
células de hongos filamentosos hasta células de mamífero, tienen
preferencia para NHR. Entre los hongos filamentosos, la relación
NHR/HR está comprendida entre 1 y más de 100. En tales organismos,
la frecuencia de integración direccionada es bastante baja. Para
mejorar esta frecuencia, la longitud de las regiones homólogas que
flanquean una secuencia de polinucleótidos a integrar en el genoma
de tales organismos tiene que ser relativamente larga, por ejemplo
de al menos 2000 pb para romper un solo gen y al menos 500 pb para
cribado de transformantes supuestos. La necesidad de tales regiones
flanqueantes representa una carga pesada cuando se somete a
clonación el constructo de DNA que comprende dicho polinucleótido y
cuando se transforma con él el organismo. Además, los genes vecinos
que caen dentro de dichas regiones flanqueantes pueden verse
alterados fácilmente durante los procesos de recombinación que
siguen a la transformación, causando con ello efectos secundarios
indeseables e inesperados.
Células de mamífero deficientes de KU70 han sido
ya aisladas (Pierce et al, Genes and Development, (2001),
15:3237-3242). Estos mutantes tienen una frecuencia
de reparación dirigida por homología 6 veces mayor, pero no
presentan aumento alguno en la eficiencia de la integración
direccionada dirigida por homología. Esto sugiere que los
resultados obtenidos en organismos que tienen preferencia para HR
(Saccharomyces cerevisiae) no pueden extrapolarse a
organismos con preferencia para NHR.
Ninomiya et al, Genes Genet. Syst. (2003)
78: 463, resumen 1D-10, describe el análisis de
genes de recombinación no homóloga, ncku70 y ncku80,
en Neurospora crassa. La frecuencia de integración homóloga
de DNA ectópico en el mutante ncku era mayor que la del tipo
salvaje.
Sorprendentemente, se ha encontrado que la
conducción de los caminos de integración de los ácidos nucleicos
hacia HR en los hongos filamentosos daba como resultado una
eficiencia mejorada para la integración direccionada de ácidos
nucleicos en el genoma de los hongos filamentosos.
La Figura 1 representa el vector de
reemplazamiento pDEL-HDFA utilizado para desactivar
el gen hdfA en Aspergillus niger (A. niger). El
vector de reemplazamiento comprende las regiones flanqueantes de
hdfA, el marcador amdS y DNA de E. coli. El DNA
de E. coli se separó por digestión con las enzimas de
restricción AscI y NotI, antes de transformación de las cepas de
A. niger.
La Figura 2 representa el vector de
reemplazamiento pDEL-HDFB utilizado para desactivar
el gen hdfB en A. niger. El vector de reemplazamiento
comprende las regiones flanqueantes de hdfB, el marcador
amdS y DNA de E. coli. El DNA de E. coli se
separó por digestión con las enzimas de restricción AscI y NotI,
antes de transformación de las cepas de A. niger.
La Figura 3 representa la estrategia utilizada
para seleccionar el gen hdfA de A. niger. El constructo de
DNA utilizado comprende el marcador de selección amdS
flanqueado por las regiones homólogas (5' y 3') del gen hdfA
(1). Este constructo se integra por doble recombinación homóloga (X)
en el locus genómico de hdfA (2) y reemplaza la copia del gen
genómico hdfA (3). Subsiguientemente, la recombinación en las
repeticiones directas (U) elimina el marcador amdS, dando
como resultado la escisión precisa del gen hdfA (4).
La Figura 4 representa la estrategia utilizada
para seleccionar el gen hdfB de A. niger. El
constructo de DNA comprende el marcador de selección amdS
flanqueado por las regiones homólogas (5' y 3') del gen hdfB
(1). Este constructo se integra por recombinación doble homóloga (X)
en el locus genómico hdfB (2) y reemplaza la copia del gen
genómico hdfB (3). Subsiguientemente, la recombinación en las
repeticiones directas (U) elimina el marcador amdS, dando
como resultado una escisión precisa del gen hdfB (4).
La Figura 5 representa la estrategia esquemática
utilizada para integrar un constructo de DNA en el genoma de A.
niger por recombinación homóloga simple. El vector de expresión
comprende el marcador seleccionable amdS y un gen de interés
flanqueado por las regiones homólogas del locus glaA (3'
glaA y 3'' glaA, respectivamente) para dirigir la
integración en el locus genómico glaA.
La presente invención proporciona un método de
acuerdo con la reivindicación 1.
En el contexto de la invención, el camino HR se
define como todos los genes y elementos que están implicados en el
control de la integración direccionada de polinucleótidos en el
genoma de un hospedador, teniendo dichos polinucleótidos una cierta
homología con un cierto sitio predeterminado del genoma de un
hospedador en el que se direcciona la integración. El camino NHR se
define como todos los genes y elementos que están implicados en el
control de la integración del polinucleótido en el genoma de un
hospedador, con indiferencia del grado de homología de dichos
polinucleótidos con la secuencia genómica del hospedador.
La conducción comprende proporcionar un mutante
de una célula parental de hongo filamentoso, en donde la relación
NHR/HR se ha reducido en el mutante al menos un 50%, y muy
preferiblemente al menos 100% en comparación con dicha relación en
dicho organismo parental.
De acuerdo con otra realización preferida, la
célula fúngica filamentosa de la invención tiene una relación
NHR/HR, que es al menos 200, al menos 50, al menos 10 tal como se
mide por el ensayo siguiente. Preferiblemente, la relación de la
célula fúngica filamentosa es al menos 1, más preferiblemente al
menos 0,5, aún más preferiblemente al menos 0,1, todavía más
preferiblemente al menos 0,05, aún más preferiblemente al menos
0,01, todavía más preferiblemente al menos 0,005, aún más
preferiblemente al menos 0,001, aún más preferiblemente al menos
0,0005, todavía más preferiblemente al menos 0,0001 y muy
preferiblemente al menos 0,00001.
De acuerdo con una realización más preferida, la
célula fúngica filamentosa de la invención tiene una relación
NHR/HR, que es menor que 200, aún más preferiblemente menor que 50,
menor que 10 tal como se mide por el ensayo siguiente. Aún más
preferiblemente, la relación de la célula fúngica filamentosa es
menor que 1, aún más preferiblemente menor que 0,5, todavía más
preferiblemente menor que 0,1, aún más preferiblemente menor que
0,05, todavía más preferiblemente menor que 0,01, aún mas
preferiblemente menor que 0,005, todavía más preferiblemente menor
que 0,001, aún más preferiblemente menor que 0,0005, todavía más
preferiblemente menor que 0,0001 y muy preferiblemente menor que
0,00001.
La relación NHR/HR se mide preferiblemente por
el ensayo que se describe en WO 02/052026 (Tabla 2, p 23). De
acuerdo con una realización preferida, el organismo parental es una
de las células de hongos filamentosos que se definen en la sección
célula hospedadora. De acuerdo con otra realización preferida, la
célula de hongo filamentoso de la invención procede de una especie
que se define en la sección de células hospedadoras.
Alternativamente y de acuerdo con una
realización menos preferida, la relación NHR/HR en un hongo
filamentoso se monitoriza utilizando técnicas conocidas por las
personas expertas tales como perfilado de la transcripción y/o
transferencia Northern y/o transferencia Western de al menos uno de
los componentes siguientes implicados en tales caminos: KU70, KU80,
MRE11, RAD50, RAD51, RAD52, XRS2, SIR4, y LIG4.
En el contexto de esta invención, "una región
de homología" significa "al menos una" región de homología.
Un sitio predeterminado se define en esta memoria como un sitio
dentro del material genético contenido por una célula hospedadora
en el cual se integra un polinucleótido con homología para este
mismo sitio con un método de acuerdo con la invención.
En una realización preferida, la invención
proporciona un método para aumentar la eficiencia de integración
direccionada de un polinucleótido a un sitio predeterminado en el
genoma de una célula de hongo filamentoso con una preferencia para
NHR, en donde dicho polinucleótido tiene una región de homología con
dicho sitio predeterminado que comprende conducir un camino de
integración hacia HR por proporcionar un hongo filamentoso, en
donde la eficiencia del camino NHR se ha reducido y la relación
NHR/HR ha disminuido en comparación con la eficiencia del camino
NHR y/o la relación NHR/HR del hongo filamentoso del que se origina
aquél en las mismas condiciones. De acuerdo con una realización
preferida, el organismo parental es uno de los hongos filamentosos
que se definen en la sección célula hospedadora.
La eficiencia del camino NHR se mide
preferiblemente en el ensayo que se describe en WO 02/052026 (Tabla
2, p 23).
Alternativamente y de acuerdo con una
realización menos preferida, la eficiencia del camino NHR en un
hongo filamentoso se monitoriza utilizando técnicas bien conocidos
por las personas expertas tales como perfilado transcripcional y/o
transferencia Northern y/o Western de los componentes implicados en
dicho camino. Más preferiblemente, se monitoriza el nivel de
expresión de al menos uno de los componentes siguientes: KU70,
KU80, MRE11, RAD50, RAD51, RAD52, XRS2, SIR4, y LIG4. Aún más
preferiblemente, se monitoriza el nivel de expresión de los
componentes homólogos del complejo KU. Muy preferiblemente, se
monitoriza el nivel de expresión de KU70 y/o KU80 homólogos.
Una eficiencia NHR reducida significa al menos
menor que en la célula parental de la que se origina la célula
obtenida. Preferiblemente, reducida significa dos veces menor, más
preferiblemente 10 veces menor, aún más preferiblemente 100 veces
menor, muy preferiblemente más de 1000 veces menor y aún más
preferiblemente indetectable utilizando transferencia Northern o
Western, técnicas de red o un cribado fenotípico.
Un cribado típico fenotípico que podría
utilizarse comprende los pasos siguientes: transformar los mutantes
NHR supuestos con una casete de expresión que comprende un gen
marcador de selección flanqueado por secuencias homólogas de un
sitio genómico predeterminado. El gen marcador de selección
utilizado en este cribado fenotípico puede seleccionarse de cierto
número de genes marcadores que son útiles para transformación de
hongos filamentosos. A modo de ejemplo, estos marcadores incluyen,
pero sin carácter limitante, el gen marcador de selección dominante
y bi-direccional tal como un gen de acetamidasa
(amdS) (EP 635574B o WO 97/06261), genes marcadores
auxótrofos tales como argB, trpC o pyrG, y genes de
resistencia a antibióticos que proporcionan resistencia contra v.g.
fleomicina (el producto codificado por el gen ble confiere
resistencia a fleomicina), higromicina B o G418. Un gen
marcador de selección preferido es el gen ble que codifica
una proteína que confiere resistencia a fleomicina. Los mutantes
NHR supuestos contienen ya en este sitio genómico predeterminado un
gen marcador de selección bidireccional tal como un gen amdS,
gen de nitrato-reductasa (niaD), gen de
sulfato-permeasa (SutB) o gen PyrG. El
gen niaD ha sido ya descrito en otro lugar (Gouka RJ, van
Hartingsveldt W, Bovenberg RA, van den Hondel CA, van Gorcom RF.
Cloning of the nitrate-nitrite reductase gene
cluster of Penicillium chrysogenum and use of the niaD
gene as a homologous selection marker. J Biotechnol. 1991 Sep;
20(2):189-99). El gen niaD permite la
selección directa de transformantes en placas que contiene clorato,
dado que las células se hacen resistentes al clorato. El gen
sutB ha sido descrito en otro lugar (van de Kamp M,
Pizzinini E, Vos A, van der Lende TR, Schuurs TA, Newbert RW, Turner
G, Konings WN, Driessen AJ. Sulfate transport in Penicillium
chrysogenum: cloning and characterization of the sutA and
sutB genes. J. Bacteriol. 1999
Dec;181(23):7228-34). Un gen marcador de
selección preferido es la secuencia codificante de amdS de
A. nidulans fusionada al promotor gpdA de A.
nidulans (EP 635574B). Pueden utilizarse también genes
amdS de otros hongos filamentosos (WO 97/06261). En la forma
preferida del cribado fenotípico, el gen amdS se presenta en
el sitio genómico predeterminado y el gen ble se utiliza como
el gen a direccionar al sitio predeterminado. En los mutantes no
mejorados en HR, la casete ble se integrará aleatoriamente
en el genoma, permitiendo que muchos transformantes crezcan sobre un
medio selectivo doble que contiene a la vez acetamida y fleomicina;
y un número relativamente pequeño de transformantes crecerán en
placas de fluoroacetamida-fleomicina. En los
mutantes con HR aumentada, resistirán un número limitado de
transformantes en las placas selectivas dobles
acetamida-fleomicina dado que la casete amdS
se intercambia eficazmente con la casete ble. En este caso,
aparecerán más mutantes en las placas selectivas dobles de
fluoroacetamida-fleomicina.
El hongo filamentoso que tiene una eficiencia
NHR disminuida y una relación disminuida NHR/HR es un hongo
filamentoso en el cual se ha inhibido un componente implicado en
NHR. En este contexto, "un" significa "al menos uno": al
menos un componente implicado en NHR se ha inhibido en un hongo
filamentoso dado. La inhibición puede realizarse por regulación
descendente del nivel de expresión de un gen implicado en NHR o
desactivación de un gen de codifica un componente implicado en NHR
y/o por regulación descendente del nivel de expresión de un
componente implicado en NHR, y/o reducción (temporal) de la
actividad (de proteína) de un componente implicado en NHR y una
combinación de estas posibilidades.
Preferiblemente, el hongo filamentoso obtenido
tiene la expresión de un gen implicado en NHR regulada en sentido
descendente por comparación con la expresión de dicho gen en la
célula del hongo filamentoso parental de la que se origina en las
mismas condiciones. De acuerdo con una realización preferida, el
hongo filamentoso parental es uno de los hongos filamentosos que se
definen en la sección célula hospedadora.
El nivel de expresión de un gen, o una secuencia
de DNA está regulado en sentido descendente cuando el nivel de
expresión de este gen específico o secuencia de DNA en el hongo
filamentoso obtenido es menor que el nivel de expresión del mismo
gen o secuencia de DNA en el hongo filamentoso parental del que se
origina, preferiblemente 3 veces menor, más preferiblemente 4 veces
menor, muy preferiblemente más de 4 veces menor y aún más
preferiblemente indetectable utilizando transferencia Northern o
Western o técnicas ómicas como transcriptómicas y proteómicas.
La regulación descendente y/o ascendente del
nivel de expresión de una secuencia de DNA puede monitorizarse por
cuantificación de la cantidad de mRNA correspondiente presente en
una célula por transferencia Northern (en Molecular Cloning: A
Laboratory Manual, Sambrook et al., Nueva York: Cold Spring
Harbour Press, 1989) por ejemplo, y/o por cuantificación de la
cantidad de proteína correspondiente presente en una célula por
transferencia Western, por ejemplo. La diferencia en la cantidad de
mRNA puede cuantificarse también por análisis de redes de DNA
(Eisen, M.B. y Brown, P.O. DNA arrays for analysis of gene
expression. Methods Enzyrnol. 1999:303:179-205).
La regulación descendente del nivel de expresión
de al menos un gen o secuencia de DNA puede obtenerse por
manipulación genética mediante una de las técnicas siguientes o por
una combinación de las mismas:
a. utilización de técnicas recombinantes de
manipulación genética,
b. sometimiento del hongo filamentoso a
mutagénesis.
Alternativamente o en combinación con las
técnicas arriba mencionadas y de acuerdo con otra realización
preferida, puede obtenerse la regulación descendente del nivel de
expresión de al menos un gen o secuencia de DNA por sometimiento del
hongo filamentoso a un compuesto/composición
inhibidor(a).
El hongo filamentoso obtenido puede
seleccionarse subsiguientemente por monitorización del nivel de
expresión de dicho gen o secuencia de DNA. Opcionalmente, el hongo
filamentoso se selecciona subsiguientemente por medida de su
eficiencia de los caminos NHR y/o HR y/o su relación NHR/HR. En el
contexto de la invención, la eficiencia del camino HR de un hongo
filamentoso puede medirse por la eficiencia de la integración
direccionada de una secuencia polinucleotídica dada en un sitio
predeterminado en el genoma del hongo filamentoso utilizando una o
más regiones de homología dadas. En el contexto de la invención, la
eficiencia del camino NHR de un hongo filamentoso puede medirse por
la eficiencia de la integración no direccionada de una secuencia
polinucleotídica dada en el genoma del hongo filamentoso con
indiferencia de cualesquiera regiones de homología.
Más preferiblemente, la regulación descendente
de la expresión de al menos una secuencia de DNA se realiza con
técnicas recombinantes de manipulación genética tales como se
definen en el paso a. para obtener un hongo filamentoso
recombinante. Muy preferiblemente, el paso a. comprende seleccionar
la secuencia de DNA; aún más preferiblemente, la secuencia de DNA
delecionada se reemplaza por una variante no funcional de la misma,
y aún más preferiblemente la deleción y la reposición se realizan
por reemplazamiento de genes, preferiblemente como se describe en EP
357127B.
En casos de deleción o reposición de al menos
una secuencia de DNA del hongo filamentoso seleccionado, tiene que
introducirse una secuencia de DNA apropiada en el locus diana. El
locus diana es en este caso la secuencia de DNA implicada en el
camino NHR a seleccionar o reemplazar. La secuencia de DNA apropiada
está presente preferiblemente en un vector de clonación. Vectores
de clonación adecuados son aquéllos que son capaces de integrarse en
el locus diana predeterminado en los cromosomas de la célula
hospedadora fúngica filamentosa utilizada. Un vector de clonación
integrador preferido comprende un fragmento de DNA, que es homólogo
a la secuencia de DNA a seleccionar o reemplazar para
direccionamiento de la integración del vector de clonación a este
locus predeterminado. Con objeto de promover la integración
direccionada, el vector de clonación se linealiza preferiblemente
antes de la transformación de la célula hospedadora.
Preferiblemente, la linealización se realiza de tal manera que al
menos uno pero preferiblemente ambos extremos del vector de
clonación se flanquean por secuencias homólogas a la secuencia de
DNA a seleccionar o reemplazar.
La longitud de las secuencias homólogas que
flanquean la secuencia de DNA a seleccionar o reemplazar es
preferiblemente menor que 2 kb, aún preferiblemente menor que 1 kb,
toda-vía más preferiblemente menor que 0,5 kb, aún
más preferiblemente menor que 0,2 kb, todavía más preferiblemente
menor que 0,1 kb, aún más preferiblemente menor que 50 pb y muy
preferiblemente menor que 30 pb.
El gen marcador de selección en el vector de
clonación puede seleccionarse de un número de genes marcadores que
son útiles para transformación de hongos filamentosos. A modo de
ejemplo, estos marcadores incluyen, pero sin carácter limitante,
genes marcadores de selección dominantes y bidireccionales tales
como un gen de acetamidasa (amdS) (EP 635574B o WO
97/06261), genes marcadores auxótrofos tales como argB, trpC, o
pyrG y genes de resistencia a antibióticos que proporcionan
resistencia contra, v.g., fleomicina, higromicina B o G418. Un gen
marcador de selección apropiado es la secuencia codificante
amdS de A. nidulans fusionada al promotor gpdA
de A. nidulans (EP635574B). Pueden utilizarse también genes
amdS de otros hongos filamentosos (WO 97/06261). El gen
marcador de selección amdS tiene la ventaja de que puede
utilizarse varias veces en la misma cepa para reemplazar y/o
seleccionar secuencias de DNA distintas. Por medio de
contraselección en medio de fluoroacetamida como se describe en EP
635574B, la cepa resultante está exenta de marcador y puede
utilizarse para modificaciones ulteriores de genes. Una estrategia
preferida para regulación descendente de la expresión de una
secuencia de DNA dada comprende la deleción de la secuencia de DNA
de tipo salvaje y/o reemplazamiento por una secuencia de DNA
modificada, cuyo producto de expresión no es funcional. La deleción
y el reemplazamiento se realizan preferiblemente por la técnica de
reemplazamiento de genes descrita en EP 0 357 127 B1. La deleción
específica de un gen se realiza preferiblemente utilizando el gen
amdS como gen marcador de selección como se describe en EP
635574B.
Alternativamente o en combinación con otras
técnicas mencionadas, puede utilizarse una técnica basada en
recombinación in vivo de cósmidos en E. coli, como se
describe en: A rapid method for efficient gene replacement in the
filamentous fungus Aspergillus nidulans (2000) Chaveroche,
MK., Ghico, JM. y d'Enfert C; Nucleic acids Research, vol 28, no 22.
Esta técnica es aplicable a otros hongos filamentosos como por
ejemplo A. niger.
La regulación descendente de la expresión de una
secuencia de DNA puede conseguirse también utilizando ácidos
nucleicos antisentido, o por mutagénesis UV o mediante productos
químicos (Mattem, I.E., van Noort J.M., van den Berg, P., Archer, D.
B., Roberts, I.N. y van den Hondel, C. A., Isolation and
characterization of mutants of Aspergillus niger deficient in
extracellular proteases. Mol Gen Genet. 1992 Aug; 234(2):
332-6.).
Preferiblemente, la deficiencia introducida en
el camino NHR es una deficiencia inducible. Esto puede realizarse
por reemplazamiento de las regiones reguladoras endógenas del gen
que codifica el componente implicado en la NHR por nuevas regiones
reguladoras, preferiblemente utilizando un promotor reprimible o
regulable, más preferiblemente utilizando un promotor que pueda ser
activado/desactivado: mediante represión por glucosa, o represión
por amoniaco, o represión por pH. Ejemplos de promotores reprimidos
por glucosa son el promotor pcbAB de Penicillium
chrysogenum (Martin JF, Casqueiro J, Kosalkova K, Marcos AT,
Gutiérrez S. Penicillin and cephalosporin biosynthesis: mechanism
of carbon catabolite regulation of penicillin production. Antonie
Van Leeuwenhoek. 1999 Jan-Feb;
75(1-2): 21-31. Revisión.) o
el promotor de glucoamilasa de Aspergillus niger. Ejemplos de
promotores susceptibles de activación/desactivación se describen en
las publicaciones siguientes:
- An activator/repressor dual system allows
tight tetracycline-regulated gene expression in
budding yeast: Belli et al, (1998) Nucl. Acid Research. vol
26, n.4: 942-947.
- A lightswitchable gene promoter system:
Shimizu-Sato et al, (2002) Nat. Biotech. Vol
20, no 10: 1041-1044.
De acuerdo con una realización preferida, el
hongo filamentoso es deficiente en al menos uno de sus genes
endógenos, que son homólogos con los genes de levadura siguientes
implicados en el camino NHR KU70, KU80, RAD50, MRE11, XRS2 y SIR4
(van den Bosch et al (2002): DNA
double-strand break repair by homologous
recombination. Biol. Chem. Vol. 383: 873-892 y
Allen et al, (2003): Interactive competition between
homologous recombination and non-homologous end
joining. Mol. Cancer Res., vol 1: 913-920).
Todas las clases de mutantes que tienen al menos
un componente implicado en NHR, que ya no es capaz o es al menos
significativamente menos capaz de realizar su función en el proceso
de NHR, son mutantes contemplados en esta memoria. Preferiblemente,
el componente implicado en NHR ha sido inhibido de tal modo que la
eficiencia del camino NHR en el mutante obtenido es menor que 90%
de la actividad en la célula parental de la que procede en las
mismas condiciones medidas en el ensayo definido anteriormente, aún
preferiblemente menor que 80%, más preferiblemente menor que 80%,
todavía más preferiblemente menor que 70%, y muy preferiblemente
menor que 50%.
De acuerdo con una realización preferida, el
hongo filamentoso parental es uno de los hongos filamentosos que se
definen en la sección célula hospedadora.
Preferiblemente, la célula de hongo filamentoso
es deficiente en al menos uno de los genes siguientes:
- hdfA como se identifica en SEQ ID NO: 2
ó 19 u homólogos del mismo, o
- hdfB como se identifica en SEQ ID NO: 5
ó 22 u homólogos del mismo, o ambos.
De acuerdo con otra realización preferida, el
hongo filamentoso tiene la cantidad de al menos una de las proteínas
codificadas por estos genes hdfA y hdfB que se reduce
después de la inducción.
De acuerdo con otra realización preferida, la
regulación descendente del nivel de expresión de al menos un gen o
secuencia de DNA puede obtenerse por modificación genética
sometiendo el hongo filamentoso a mutagénesis. Las células fúngicas
filamentosas pueden someterse a mutagénesis aleatoria y
subsiguientemente a un ensayo de selección para aislar los mutantes
con HR mejorado respecto a la población total diversa de
mutantes.
De acuerdo con una realización preferida de la
presente invención, una de las células fúngicas filamentosas
definidas en la sección célula hospedadora se utiliza como cepa de
partida para realizar la mutagénesis.
Por ejemplo, la cepa de partida se somete a
irradiación UV de tal modo que el porcentaje de supervivencia esté
comprendido entre 0,001 por ciento y 60 por ciento. Preferiblemente,
el porcentaje de supervivencia está comprendido entre 0,01 por
ciento y 50 por ciento. Es bien conocido por las personas expertas
que las conidiosporas son el material preferido para la mutagénesis
de hongos filamentosos por medios físicos o químicos. Los mutantes
pueden obtenerse también sin embargo a partir de células de micelio.
Asimismo, pueden aplicarse otros tratamientos mutagénicos distintos
de UV como agentes químicos (v.g. NTG). El método de selección
descrito en esta memoria puede aplicarse para seleccionar mutantes
obtenidos de conidiosporas o células de micelio.
Preferiblemente, la mutagénesis implica a
conidiosporas. La irradiación UV se aplica preferiblemente durante
tiempos diferentes tales como 7,5, 15 y 30 minutos para obtener
niveles de tasa de mutación ligeros, medios y fuertes en las
células. Las muestras mutadas pueden re-esporularse
directamente o incubarse durante un periodo de recuperación
prolongado en un medio rico tal como YNB o YEPD (véase la definición
en el Ejemplo 9) antes de inducir la esporulación (por ejemplo como
se describe en el Ejemplo 9).
Los lotes esporulados pueden testarse luego en
cuanto a su eficiencia en direccionamiento de genes. Esto podría
testarse por el método siguiente. Pueden transformarse protoplastos
con al menos uno, preferiblemente dos o más fragmentos de DNA que
llevan casetes de expresión de marcadores de selección funcionales.
Los genes marcadores de selección en las casetes de expresión
pueden seleccionarse de cierto número de genes marcadores que son
útiles para la transformación de hongos filamentosos. A modo de
ejemplo, estos marcadores incluyen, pero sin carácter limitante,
genes marcadores de selección dominantes y bidireccionales tales
como un gen de acetamidasa (amdS) (EP 635574B o WO
97/06261), genes marcadores auxótrofos tales como argB, trpB,
o pyrG y genes de resistencia a antibióticos que
proporcionan resistencia contra v.g. fleomicina, higromicina B o
G418. Preferiblemente, los marcadores de selección utilizados son
los genes ble y amdS. La casete de amdS
utilizada es la secuencia codificante de A. nidulans
fusionada al promotor gpdA de A. nidulans (EP
635574B). Pueden utilizarse también genes amdS de otros
hongos filamentosos (WO 97/06261). El gen ble codifica una
proteína capaz de conferir resistencia a fleomicina. El gen
amdS codifica una proteína que permite a las células crecer
en acetamida como única fuente de nitrógeno (como se describe en EP
635574B). Los métodos aplicados para transferencia de DNA a
protoplastos de hongos filamentosos son bien conocidos en la
técnica y se describen en muchas referencias, con inclusión de
Finkelstein y Ball (compiladores), Biotechnology of Filamentous
Fungi, technology and products,
Butterworth-Heinemann (1992); Bennett y Lasure
(eds.) More Gene Manipulations in fungi, Academic Press (1991);
Tumer, en: Pühler (ed), Biotechnology, second completely revised
edition, VHC (1992). La transformación de protoplastos mediada por
Ca-PEG se utiliza como se describe en EP
635574B.
Para seleccionar la integración direccionada de
estas dos casetes de expresión a dos locus específicos distintos en
el genoma de los hongos filamentosos pueden añadirse tramos cortos
homólogos de DNA, por ejemplo por PCR en ambos lados de los
fragmentos de DNA. Varios tipos de constructo podrían hacerse para
aumentar las probabilidades de seleccionar un mutante que tenga una
eficiencia de direccionamiento mejorada: los tramos homólogos de DNA
podrían variar típicamente desde 30 pb a 1000 pb, preferiblemente
30 pb a 700 pb, más preferiblemente 30 pb a 500 pb, aún más
preferiblemente 30 pb a 300 pb, todavía más preferiblemente 30 pb a
200 pb, aún más preferiblemente 30 pb a 100 pb, y muy
preferiblemente 30 pb. En teoría todos los loci en el genoma de los
hongos filamentosos podrían seleccionarse para integración
direccionada de las casetes de expresión. Preferiblemente, el locus
en el que tendrá lugar el direccionamiento es tal que cuando el gen
de tipo salvaje presente en este locus ha sido reemplazado por el
gen comprendido en la casete de expresión, el mutante obtenido
exhibirá un cambio detectable por un ensayo dado. Preferiblemente,
el locus es el locus niaD, rompiendo con ello el gen de
nitrato-reductasa (Gouka RJ, van Hartingsveldt W,
Bovenberg RA, van den Hondel CA, van Gorcom RF. Cloning of the
nitrate-nitrite reductase gene cluster of
Penicillium chrysogenum and use of the niaD gene as a
homologous selection marker. J Biotechnol. 1991 Sep; 20(2):
189-99), permitiendo la selección directa de
transformantes en placas que contienen clorato, dado que las células
se vuelven resistentes al clorato. Otro locus preferido es el locus
sutB, rompiendo con ello el gen de
sulfato-permeasa (van de Kamp M, Pizzinini E, Vos
A, van der Lende TR, Schuurs TA, Newbert RW, Tumer G, Konings WN,
Driessen AJ. Sulfate transport in Penicillium chrysogenum:
cloning and characterization of the sutA and sutB
genes. J. Bacteriol. 1999
Dec;181(23):7228-34), permitiendo la
selección directa de transformantes en placas que contienen
seleniato. Los mutantes con ambos marcadores de selección presentes
y que tienen las dos alteraciones resultantes de la desactivación
de los genes presentes en los loci de integración, son cepas con
integración direccionada mejorada.
De acuerdo con otra realización preferida, el
hongo filamentoso mutante que tiene una eficiencia reducida en el
camino NHR, o una relación NHR/HR reducida y/o una eficiencia
elevada del camino HR se obtiene por disminución, más
preferiblemente inhibición parcial o muy preferiblemente inhibición
completa de un componente implicado en NHR.
La inhibición parcial o completa de un
componente implicado en NHR puede obtenerse por diferentes métodos,
por ejemplo por un anticuerpo dirigido contra dicho componente o un
inhibidor químico o un inhibidor proteínico o un inhibidor físico.
(Tour O. et al, (2003) Nat. Biotech: Genetically targeted
chromophore-assisted light inactivation. Vol. 21.
no. 12: 1505-1508) o inhibidor peptídico o una
molécula antisentido o molécula de RNAi (R.S. Kamath et al,
(2003) Nature: Systematic functional analysis of the
Caenorhabditis elegans genome using RNAi, vol. 421,
231-237). Con indiferencia de la clase de inhibición
(parcial o más preferiblemente completa) es importante que un
componente implicado en NHR ya no es capaz o al menos es
significativamente menos capaz de realizar su función en el proceso
de NHR como se ha definido arriba.
Los componentes implicados en NHR son homólogos
fúngicos filamentosos de levadura KU70, RAD50, MREII, XRS2, LIG4,
SIR4, KU80, LIFL o NEIL. Debido a que la nomenclatura de los genes
difiere entre los organismos, un equivalente funcional o un
funcional y/o un fragmento funcional del mismo, todos ellos
definidos en esta memoria como siendo capaces de realizar (en
función, no en cantidad) al menos una función de los genes de
levadura KU70, RAD50, MREII, XRS2, LIG4, SIR4, KU80, LIFL o NEIL se
incluyen también en la presente invención. Por inhibición
transitoria (parcial o más preferiblemente completa) de un
componente implicado en NHR, se integra un ácido nucleico en
cualquier posición deseada sin modificar de modo permanente un
componente implicado en NHR e impidiendo los efectos secundarios
indeseables causados por la presencia permanente de un componente
modificado de este tipo en NHR.
Además de las técnicas arriba mencionadas o como
alternativa, es posible también obtener una eficiencia NHR reducida
por inhibición de la actividad de proteínas, que están implicadas en
NHR o relocalizar las proteínas implicadas en NHR por medio de
secuencias señal alternativas (Ramón de Lucas, J., Martínez O, Pérez
P., Isabel López, M., Valenciano, S. y Laborda, F. The
Aspergillus nidulans carnitine carrier encoded by the
acuH gene is exclusively located in the mitochondria. FEMS
Microbiol Lett. 2001 Jul 24; 201(2): 193-8.)
o señales de retención (Derkx, P. M. y Madrid, S. M. The foldase
CYPB is a component of the secretory pathway of Aspergillus
niger and contains the endoplasmic reticulum retention signal
HEEL. Mol. Genet. Genomics. 2001 Dec; 266(4):
537-45.).
Alternativamente o en combinación con las
técnicas arriba mencionadas, la inhibición de la actividad de las
proteínas puede obtenerse también por mutagénesis UV o química
(Mattem, I.E., van Noort J.M., van den Berg, P., Archer, D. B.,
Roberts, I.N. y van den Hondel, C. A., Isolation and
characterization of mutants of Aspergillus niger deficient
in extracellular proteases. Mol Gen Genet. 1992 Aug;
234(2):332-6.) o por el uso de inhibidores
como el inhibidor proteasómico
(clasto-lactacistin-\beta-lactona,
Affinity Research Products Ltd.,
CW8405-Z02185.).
De acuerdo con otra realización preferida, la
conducción hacia HR comprende añadir un exceso de pequeños
polinucleótidos bicatenarios capaces de fijarse a y limitar con
ello la expresión de los componentes de NHR, a continuación del
polinucleótido a integrar (Agrawal N. et al.: RNA
interference: biology, mechanism and applications. Microbiol. Mol.
Biol. Rev., vol. 67, no. 4:657-685).
En una realización preferida, la invención
proporciona un método para aumentar la eficiencia de integración
direccionada de un polinucleótido a un sitio predeterminado, con lo
cual dicho polinucleótido tiene homología en o alrededor de dicho
sitio predeterminado, en un hongo filamentoso con preferencia para
NHR que comprende conducir un camino de integración hacia HR
proporcionando una célula fúngica filamentosa, en donde la
eficiencia del camino HR ha sido elevada comparada con el o uno de
los hongos filamentosos parentales de los que se origina en las
mismas condiciones. La eficiencia del camino HR se ensaya
preferiblemente por el mismo ensayo que el utilizado para
determinar la relación NHR/HR. De acuerdo con una realización
preferida, el organismo parental es uno de los hongos filamentosos
definidos en la sección células hospedadoras.
Elevado significa al menos mayor que en la
célula parental de la que se origina la célula obtenida.
Preferiblemente, elevado significa 2 veces mayor, más
preferiblemente 3 veces mayor, aún más preferiblemente 4 veces
mayor, todavía más preferiblemente más de 4 veces mayor, utilizando
transferencia Northern, o Western o la técnica de redes o un cribado
fenotípico.
De acuerdo con otra realización preferida, el
hongo filamentoso tiene el nivel de expresión de al menos un gen
implicado en HR, que ha sido regulado en sentido ascendente por
comparación con el nivel de expresión del mismo gen en la célula
fúngica filamentosa de la que se origina. Esto puede hacerse por un
aumento del nivel de expresión de un gen que codifica un componente
implicado en HR y/o por aumento del nivel de expresión de un
componente implicado en HR y/o por aumento (temporal) de la
actividad del componente implicado en HR.
Preferiblemente, el hongo filamentoso obtenido
tiene la expresión de un gen implicado en HR, que ha sido regulado
en sentido ascendente por comparación con la expresión de dicho gen
en la célula fúngica filamentosa de la que procede.
El nivel de expresión de una secuencia de DNA
está regulado en sentido ascendente cuando el nivel de expresión de
la secuencia de DNA específica en el hongo filamentoso obtenido es
mayor que el nivel de expresión de la misma secuencia de DNA en el
hongo filamentoso parental del que se origina, preferiblemente 3
veces mayor, más preferiblemente 4 veces mayor, muy preferiblemente
más de 4 veces mayor utilizando transferencia Northern, o Western,
o técnica de redes. De acuerdo con una realización preferida, el
organismo parental es uno de los hongos filamentosos que se definen
en la sección célula hospedadora.
La regulación ascendente del nivel de expresión
de al menos una secuencia de DNA puede obtenerse por manipulación
genética mediante una de las técnicas siguientes o por una
combinación de las mismas:
c. utilizando técnicas recombinantes de
manipulación genética,
d. sometiendo el hongo filamentoso a
mutagénesis.
\newpage
Alternativamente o en combinación con las
técnicas arriba mencionadas y de acuerdo con otra realización
preferida, la regulación ascendente del nivel de expresión de al
menos un gen o secuencia de DNA puede obtenerse sometiendo el hongo
filamentoso a un compuesto/composición activador(a).
El hongo filamentoso puede seleccionarse
subsiguientemente por monitorización del nivel de expresión de dicha
secuencia de DNA y opcionalmente la eficiencia del camino HR del
hongo filamentoso. La eficiencia HR de un hongo filamentoso puede
medirse por la eficiencia de la integración direccionada de una
secuencia polinucleotídica dada a un sitio predeterminado en el
genoma del hongo filamento utilizando una o más regiones de
homología dadas.
Preferiblemente, la regulación ascendente de la
expresión de al menos una secuencia de DNA se realiza con técnicas
recombinantes de manipulación genética tales como se definen en el
paso a. para obtener un hongo filamentoso recombinante.
Preferiblemente, el paso a. comprende transformar el hongo
filamentoso con un constructo de DNA que comprende la secuencia de
DNA, estando preferiblemente dicha secuencia de DNA enlazada de modo
operativo a un promotor de un gen fuertemente expresado. El
promotor seleccionado puede ser más fuerte que el promotor endógeno
de la secuencia de DNA a sobreexpresar. El promotor para expresión
de la secuencia de DNA se deriva preferiblemente de un gen fúngico
fuertemente expresado.
Varios genes fúngicos preferidos fuertemente
expresados se dan a modo de ejemplo: los genes de amilasa,
glucoamilasa, alcohol-deshidrogenasa, xilanasa,
gliceraldehído-fosfato-deshidrogenasa
o celobiohidrolasa de Aspergilli o Trichoderma. Genes
fuertemente expresados muy preferidos para estos propósitos son un
gen de glucoamilasa de Aspergillus niger, un gen de
TAKA-amilasa de Aspergillus oryzae, un gen
gpdA de Aspergillus nidulans o un gen de
celobiohidrolasa de Trichoderma reesei. Un promotor de
glucoamilasa es el promotor más preferido a utilizar. Estos genes
fuertemente expresados son adecuados no sólo como loci diana para
integración de vectores de clonación, sino también como fuente de
genes fúngicos fuertemente expresados.
De acuerdo con otra realización preferida, el
paso a. comprende aumentar el número de copias de la secuencia de
DNA en la célula fúngica filamentosa, preferiblemente por
integración en su genoma de copias de la secuencia de DNA, más
preferiblemente por direccionamiento de la integración de la
secuencia de DNA en un locus fuertemente expresado, preferiblemente
en un locus de glucoamilasa.
La regulación ascendente de la expresión de la
secuencia de DNA puede lograrse por aumento del número de copias de
la secuencia de DNA mediante introducción de al menos una copia de
la secuencia de DNA en el hongo filamentoso o por cambio por un
promotor más fuerte o cambio por un gen que codifica una proteína
con cinética y/o duración de vida mejores. La secuencia de DNA
puede estar presente en un plásmido o integrarse en el genoma. La
persona experta puede seleccionar entre dos posibilidades
alternativas:
- -
- sobreexpresar al menos una secuencia endógena de DNA del hongo filamentoso que está implicado en el camino HR. En este caso, el hongo filamentoso comprende varias copias de su secuencia endógena de DNA;
- -
- sobreexpresar al menos un DNA heterólogo implicado en HR. En este caso, el hongo filamentoso tendría su secuencia de DNA endógena implicada en HR y, adicionalmente, al menos una copia de una secuencia de DNA heteróloga implicada en HR. Esta secuencia de DNA heteróloga es un homólogo de su secuencia endógena de DNA correspondiente.
El hongo filamentoso puede transformarse con una
o más copias de la secuencia de DNA (derivada, inter alia,
de Tilburn et al, 1983, Gene 26:
205-221). La secuencia de DNA puede integrarse de
manera estable en el genoma del hongo filamentoso o introducirse en
la célula como parte de una molécula de DNA capaz de replicación
autónoma. La secuencia de DNA está presente preferiblemente en un
vector de clonación. Cualquier vector de clonación capaz de
transformar una célula hospedadora de hongo filamentoso es adecuado
para uso en la presente invención. Vectores de clonación para uso
en la invención comprenden por tanto vectores de clonación
integradores, que se integran aleatoriamente o en un locus diana
predeterminado en los cromosomas de la célula hospedadora del hongo
filamentoso. así como vectores de clonación mantenidos de modo
autónomo tales como vectores que comprenden la secuencia AMA1. En
una realización preferida de la invención, el vector integrador de
clonación comprende un fragmento de DNA, que es homólogo a una
secuencia de DNA en un locus diana predeterminado en el genoma de
la célula hospedadora del hongo filamentoso para direccionamiento de
la integración del vector de clonación a este locus predeterminado.
Con objeto de promover una integración direccionada, el vector de
clonación se linealiza preferiblemente antes de la transformación
de la célula hospedadora. La linealización se realiza
preferiblemente de tal manera que al menos uno pero preferiblemente
los dos extremos del vector de clonación están flanqueados por
secuencias homólogas en el locus diana. La longitud de las
secuencias homólogas que flanquean el locus diana es
preferiblemente al menos 30 pb, preferiblemente al menos 50 pb, más
preferiblemente al menos 0,1 kb, aún más preferiblemente al menos
0,2 kb, más preferiblemente al menos 0,5 kb, aún más preferiblemente
al menos 1 kb, y muy preferiblemente al
menos 2 kb.
menos 2 kb.
Preferiblemente, la secuencia de DNA en el
vector de clonación, que es homólogo al locus diana se deriva de un
locus fuertemente expresado, lo que significa que se deriva de un
gen, que es capaz de un nivel de expresión alto en la célula
hospedadora del hongo filamentoso. Un gen capaz de nivel de
expresión alto, es decir un gen fuertemente expresado, se define en
esta memoria como un gen cuyo mRNA puede constituir al menos 0,5%
(p/p) del mRNA celular total, v.g. en condiciones inducidas, o
alternativamente, un gen cuyo producto génico puede constituir al
menos 1% (p/p) de la proteína celular total, o, en el caso de
producto génico secretado, puede secretarse hasta un nivel de al
menos 0,1 g/l (como se describe en EP 357 127 B1).
Para aumentar aún más el número de copias de la
secuencia de DNA a sobreexpresar, puede utilizarse la técnica de
conversión de genes como se describe en WO 98/46772.
Las personas expertas apreciarán la posibilidad
de que la secuencia de DNA homóloga para direccionamiento y la
secuencia promotora pueden coincidir en un fragmento de DNA. la
lista de genes fuertemente expresados dada anteriormente es adecuada
también como locus diana.
Un ejemplo de un vector de clonación mantenido
autónomamente es un vector de clonación que comprende la secuencia
AMA1. AMA1 es un fragmento de DNA genómico de 6,0 kb aislado de
Aspergillus nidulans, que es capaz de mantenimiento autónomo
en Aspergillus (véase v.g. Aleksenko y Clutterbuck (1997),
Fungal Genet. Biol. 21: 373-397).
De acuerdo con otra realización preferida del
método de la invención, el paso a. comprende transformar el hongo
filamentoso con un constructo de DNA que comprende un gen marcador
de selección. El gen marcador de selección en el vector de
clonación puede seleccionarse de cierto número de genes marcadores
que son útiles para transformación de hongos filamentosos. A modo
de ejemplo, estos marcadores incluyen, pero sin carácter limitante,
genes marcadores de selección dominantes y bidireccionales tales
como un gen amdS (EP 635574, WO 97/06261), genes marcadores
auxótrofos tales como argB, trpC, o pyrG y genes de
resistencia a antibióticos que proporcionan resistencia contra,
v.g., flomicina, higromicina B o G418. Se prefiere el uso de un gen
marcador de selección dominante y bidireccional. Preferiblemente, se
prefiere un gen amdS, más preferiblemente un gen amdS
de Aspergillus nidulans o Aspergillus niger. Un gen
marcador de selección muy preferido es la secuencia codificante de
amdS de A. nidulans, fusionada al promotor
gpdA de A. nidulans (véase EP 635574). Pueden
utilizarse también genes amdS de otros hongos filamentosos
(WO 97/06261). El gen marcador de selección amdS tiene la
ventaja de que puede utilizarse varias veces en la misma cepa para
introducir, sobreexpresar y/o seleccionar secuencias de DNA
distintas. Por medio de contraselección en medio de fluoroacetamida
como se describe en EP 635574, la cepa resultante está exenta de
marcadores y puede utilizarse para modificaciones de genes
ulteriores.
Alternativamente o además de las técnicas ya
mencionadas, la regulación ascendente de la expresión de una
secuencia de DNA puede lograrse utilizando mutagénesis UV o química
(Mattem, I.E., van Noort J.M., van den Berg, P., Archer, D. B.,
Roberts, I.N. y van den Hondel, C. A., Isolation and
characterization of mutants of Aspergillus niger deficient in
extracellular proteases. Mol Gen Genet. 1992 Aug; 234(2):
332-6.).
Además de y/o en combinación con la regulación
ascendente de la expresión de secuencias de DNA implicadas en HR,
es también posible obtener una eficiencia HR incrementada por
aumento de la actividad de las proteínas implicadas en HR por
mutagénesis UV o química (Mattem, I.E., van Noort J.M., van den
Berg, P., Archer, D. B., Roberts, I.N. y van den Hondel, C. A.,
Isolation and characterization of mutants of Aspergillus
niger deficient in extracellular proteases. Mol Gen Genet. 1992
Aug; 234(2): 332-6.).
La persona experta comprendería que para
conseguir la regulación ascendente de la expresión de una secuencia
de DNA, puede hacerse uso de cada una de las técnicas descritas por
separado o en combinación.
La persona experta comprendería también que para
obtener un hongo filamentoso con una relación HR/NHR incrementada,
y con una eficiencia NHR reducida y/o una eficiencia HR elevada,
puede hacerse uso de al menos una de cualquiera de las técnicas
descritas para respectivamente regulación descendente y ascendente
de la expresión de un gen dado en un hongo filamentoso.
Preferiblemente, todas las técnicas realizadas sobre los hongos
filamentosos para obtener un hongo filamentoso recombinante que
tenga a la vez una eficiencia NHR reducida y una eficiencia HR
elevada se han realizado utilizando un marcador de selección
dominante y bi-direccional, preferiblemente un gen
amdS, más preferiblemente un gen amdS de
Aspergillus nidulans o Aspergillus niger. El hongo
filamentoso obtenido puede seleccionarse subsiguientemente por
monitorización del nivel de expresión de dicha secuencia de DNA
como se ha descrito anteriormente, utilizando por ejemplo
transferencia Northern y/o Western y/o cribado de redes y/o
fenotipos. Opcionalmente, se monitoriza la eficiencia de los caminos
NHR y/o HR de la célula. La eficiencia de estos caminos de un hongo
filamentoso puede monitorizarse como se ha definido
anteriormente.
Preferiblemente, la modificación implicada en el
camino HR es una modificación inducible. Esto puede lograrse por
reemplazamiento de las regiones reguladoras endógenas del gen que
codifica el componente implicado en la HR por regiones reguladoras
inducibles, preferiblemente por utilización de un promotor
inducible. Ejemplos de promotores inducibles son el promotor de
glucoamilasa de Aspergillus niger, el promotor de amilasa
TAKA de Aspergillus oryzae, el promotor paf (Marx, F.,
Haas, H., Reindl, M., Stoffler, G., Lottspeich, F. y RedI, B.
Cloning, structural organization and regulation of expression of the
Penicillium chrysogenum paf gene encoding an abundantly
secreted protein with antifungal activity Gene 167
(1-2), 167-171 (1995) o el promotor
pcbC de Penicillium chrysogenum (Martin JF, Casqueiro
J, Kosalkova K, Marcos AT, Gutiérrez S. Penicillin and
cephalosporin biosynthesis: mechanism of carbon catabolite
regulation of penicillin production. Antonie Van Leeuwenhoek. 1999
Jan-Feb; 75(1-2):
21-31. Review.) o los sistemas de
activación/desactivación citados anteriormente para regulación
descendente de la expresión de los genes implicados en NHR.
De acuerdo con una realización preferida, los
genes implicados en el camino HR que se modifican son los genes
siguientes u homólogos de los mismos: RAD51, RAD52.
Todas las clases de mutantes que tienen al menos
un componente implicado en HR, que es más capaz o al menos
significativamente más capaz de realizar su función en el proceso de
HR son mutantes contemplados por la presente invención.
Preferiblemente, la actividad de los componentes implicados en HR se
han modificado de tal modo que la eficiencia del camino HR es mayor
que 110% de la eficiencia de la célula parental de la que se origina
en las mismas condiciones tal como se mide en el ensayo definido
anteriormente en esta memoria, más preferiblemente más de 200%, muy
preferiblemente más de 500%. De acuerdo con una realización
preferida, el organismo parental es uno de los hongos filamentosos
que se definen en la sección de células hospedadoras. Los métodos de
acuerdo con la presente invención, como se ha expuesto extensamente
pero sin carácter limitante anteriormente, pueden utilizarse en una
gran variedad de aplicaciones. Algunas aplicaciones específicas se
describen a continuación.
\vskip1.000000\baselineskip
De acuerdo con ello, la presente invención se
refiere adicionalmente al hongo filamentoso per se, que se
utiliza preferiblemente en el método de la invención para aumentar
la eficiencia de integración direccionada de un polinucleótido en
un sitio predeterminado en el genoma de dicha célula fúngica
filamentosa, teniendo dicho hongo filamentoso preferencia para NHR,
y en donde dicho polinucleótido tiene una región de homología con
dicho sitio predeterminado y comprendiendo dicho método conducir un
camino de integración hacia HR. Las características del hongo
filamentoso que pueden utilizarse en este método se han definido
anteriormente.
El hongo filamentoso utilizado preferiblemente
en el método de la invención es un mutante que procede de una
célula parental, en donde la relación de NHR/HR está reducida y/o en
donde la eficiencia del camino NHR se ha reducido y/o la eficiencia
del camino HR se ha elevado en dicha célula mutante en comparación
con dicha relación y dichas eficiencias en dicho organismo parental
en las mismas condiciones. El ensayo utilizado para determinar la
relación NHR/HR y/o la eficiencia del camino NHR y/o la eficiencia
del camino HR ha sido descrito anteriormente.
La célula hospedadora de la presente invención
es un hongo filamentoso, que es capaz de transformarse con un
vector de clonación. Para la mayoría de los hongos filamentosos
testados hasta ahora, se ha encontrado que los mismos podrían
transformarse utilizando protocolos de transformación desarrollados
para Aspergillus (derivado de inter alia Tilbum et
al. 1983, Gene 26: 305-221). La persona
experta reconocerá que la transformación con éxito de la especie
hospedadora de hongos filamentosos no se limita al uso de vectores,
sistemas marcadores de selección, promotores y protocolos de
transformación ilustrados específicamente en esta memoria.
Un hongo filamentoso se define en esta memoria
como un microorganismo eucariota de la subdivisión Eumycotina en
forma filamentosa, es decir cuyo crecimiento vegetativo ocurre por
elongación de hifas. Células hospedadoras fúngicas de hongos
filamentosos preferidas se seleccionan del grupo constituido por los
géneros Aspergillus, Trichoderma, Fusarium, Penicillium, y
Acremonium.
En una realización más preferida de la
invención, la célula hospedadora fúngica filamentosa se selecciona
del grupo constituido por A. nidulans, A. oryzae, A. sojae,
Aspergilli del grupo A. niger, Trichoderma reesei y
especies de Penicillium. Preferiblemente, el
Penicillium es una especie Penicillium chrysogenum o
Penicillium citrinum.
El grupo de A. niger, se define en esta
memoria de acuerdo con Raper y Fennell (1965), en:
The Genus Aspergillus, The Williams &
Wilkins Company, Baltimore, pp 293-344) y comprende
todas las especies de Aspergillium (negras) incluidas en
dicho artículo por estos autores. Células hospedadoras fúngicas
filamentosas muy preferidas se seleccionan del grupo constituido por
Aspergilli del grupo A. niger, A. oryzae, Trichoderma
reesei y Penicillium chrysogenum.
De acuerdo con una realización preferida, el
organismo parental es la célula fúngica filamentosa depositada
Aspergillus niger CBS513.88, Aspergillus oryzae ATCC
20423, IFO 4177, ATCC 1011, ATCC 9576,
ATCC14488-14491, ATCC 11601, ATCC12892,
Penicillium chrysogenum CBS 455.95 o Penicillium
citrinum ATCC 38065, Penicillium chrysogenum P2,
Acremonium chrysogenum ATCC 36225 o ATCC 48272,
Trichoderma reesei ATCC 26921 o ATCC 56765 o ATCC 26921,
Aspergillus sojae ATCC11906, Chrysosporium lucknowense
ATCC44006, Claviceps paspali CBS110.22, Claviceps
purpurea CBS164.59, Penicillium brevicompactum ATCC 9056,
Aspergillus terreus ATCC 20542, Aspergillus nidulans
ATCC 28901 y/o derivados de las mismas.
De acuerdo con otra realización preferida, la
célula fúngica filamentosa de la invención tiene una relación
NHR/HR, que es al menos 200, al menos 50, al menos 10 tal como se
mide por el ensayo siguiente. Preferiblemente, la relación de la
célula fúngica filamentosa es al menos 1, más preferiblemente al
menos 0,5, aún más preferiblemente al menos 0,1, todavía más
preferiblemente al menos 0,05, aún más preferiblemente al menos
0,01, todavía más preferiblemente al menos 0,005, aún más
preferiblemente al menos 0,001, todavía más preferiblemente al menos
0,0005, aún más preferiblemente al menos 0,0001 y muy
preferiblemente al menos 0,00001.
\newpage
De acuerdo con una realización más preferida, la
célula fúngica filamentosa de la invención tiene una relación
NHR/HR, que es menor que 200, aún más preferiblemente menor que 50,
menor que 10 tal como se mide por el ensayo siguiente. Aún más
preferiblemente, la relación de la célula fúngica filamentosa es
menor que 1, aún más preferiblemente menor que 0,5, todavía más
preferiblemente menor que 0,05, aún más preferiblemente menor que
0,01, todavía más preferiblemente menor que 0,005, aún más
preferiblemente menor que 0,001, aún más preferiblemente menor que
0,0005, todavía más preferiblemente menor que 0,0001 y muy
preferiblemente menor que 0,00001.
La relación de NHR/HR se mide preferiblemente
por el ensayo que se describe en WO 02/052026 (Tabla 2, p 23).
Preferiblemente, la célula fúngica filamentosa
es deficiente en un gen que codifica un componente implicado en NHR,
y/o tiene un nivel reducido de un componente implicado en NHR.
Aún más preferiblemente, la célula fúngica
filamentosa es deficiente en al menos uno de los genes siguientes:
hdfA u homólogos del mismo como se identifican en SEQ ID NO:
2 ó 19, hdfB u homólogos del mismo como se identifican en
SEQ ID NO: 5 ó 22 o ambos, y/o tiene, preferiblemente, una cantidad
reducida de al menos una de las proteínas codificadas por estos
genes. Muy preferiblemente, la célula fúngica filamentosa es
indeciblemente deficiente en al menos uno de los genes siguientes:
hdfA u homólogos del mismo como se identifican en SEQ ID NO:
2 ó 19, hdfB u homólogos del mismo como se identifican en SEQ
ID NO: 5 ó 22 o ambos, y/o tiene, con preferencia induciblemente,
una cantidad reducida de al menos una de las proteínas codificadas
por estos genes.
De acuerdo con otra realización preferida, la
célula fúngica filamentosa es tal que en su genoma, un gen implicado
en NHR ha sido reemplazado por un gen no funcional o por un
marcador de selección o por otro gen.
De acuerdo con otra realización preferida, el
mutante tiene un nivel incrementado de un componente implicado en
HR.
El hongo filamentoso de acuerdo con la invención
puede haberse obtenido por técnicas de biología molecular. Un hongo
filamentoso obtenido por un método de ingeniería genética de este
tipo se define como un hongo filamentoso recombinante. Sin embargo,
un hongo filamentoso recombinante en el contexto de la invención
podría haber sido sometido con anterioridad a una técnica de
mutagénesis para conseguir otro efecto deseado. De acuerdo con una
realización muy preferida, el hongo filamentoso obtenido es un hongo
filamentoso recombinante.
\vskip1.000000\baselineskip
De acuerdo con una realización preferida, se
proporciona un método que comprende al menos los pasos de introducir
un polinucleótido de interés en el hongo filamentoso de la
invención, por ejemplo por el proceso de transformación o
electroporación, e integración de dicho polinucleótido en el
material genético de dicha célula. La integración es un proceso
complejo en el cual una secuencia de ácido nucleico se convierte en
parte del material genético de una célula hospedadora. Un paso en
el proceso de integración del ácido nucleico es la recombinación;
por recombinación, se intercambian o insertan secuencias de ácido
nucleico y el ácido nucleico introducido se convierte en parte del
material genético de una célula hospedadora. En principio, son
posibles dos vías diferentes de recombinación: homóloga e ilegítima
o NHR. La mayor parte de los eucariotas (superiores) no practican HR
o al menos no lo hacen significativamente, aunque las proteínas
esenciales para realizar un proceso de este tipo están disponibles.
Una razón para este fenómeno es que el uso frecuente de
recombinación homóloga en los eucariotas (superiores) podría
conducir a reordenamientos cromosómicos indeseables debido a la
presencia de secuencias repetitivas de ácido nucleico. Para
realizar la HR por un método de acuerdo con la invención, es
importante proporcionar un polinucleótido que tiene homología con un
sitio predeterminado. Está claro para una persona experta en la
técnica que el porcentaje de homología y la longitud de una o más
regiones homólogas juegan un papel importante en el proceso de
recombinación homóloga. El porcentaje de homología está
preferiblemente próximo al 100%. Una persona experta en la técnica
es sabedora del hecho de que porcentajes de homología menores se
utilizan también en el campo de la recombinación homóloga, pero
dependiendo, por ejemplo, de las regiones de homología y su
distribución global, pueden conducir a una eficiencia menor de HR,
si bien son todavía útiles y por consiguiente se incluyen en la
presente invención. Adicionalmente, la longitud de una región
(cuasi) homóloga es aproximadamente 3 kb, lo que es suficiente para
dirigir la recombinación homóloga. Al menos una región homóloga es
necesaria para recombinación, pero más preferiblemente se utilizan
para la integración direccionada dos regiones homólogas
flanqueantes del ácido nucleico de interés. El investigador experto
en la técnica conoce el modo de seleccionar el porcentaje de
homología apropiado, el grado de homología y la cantidad de
regiones homólogas. Al proporcionar una homología de este tipo, un
ácido nucleico se integra en cada una de las posiciones deseadas
dentro del material genético de una célula hospedadora. Está claro
para una persona experta en la técnica que la invención tal como se
describe en esta memoria se utiliza para conducir cualquier ácido
nucleico (preferiblemente DNA) a cualquier sitio predeterminado con
tal que la longitud de homología y el porcentaje de homología sean
lo bastante altos para proporcionar/permitir la HR.
Antes de la culminación de la presente
invención, no podría haber sido integrado fácilmente un
polinucleótido en cualquier posición deseada en el genoma de un
hongo filamentoso dado. El método de acuerdo con la invención se
aplica, por ejemplo, para afectar a la función génica de diversas
maneras, no sólo para la desactivación completa, sino también para
mediar cambios en el nivel de expresión o en la regulación de la
expresión, cambios en la actividad de proteínas o el
direccionamiento subcelular de una proteína codificada. La
desactivación completa, que no puede realizarse usualmente por los
métodos existentes tales como la tecnología antisentido o la
tecnología del RNAi (Zrenner R, Willmitzer L, Sonnewald U. Analysis
of the expression of potato
uridinediphosphate-glucose pyrophosphorylase and
its inhibition by antisense RNA. Planta.
(1993);190(2):247-52.) es útil por ejemplo
para la desactivación de genes que controlan ramas laterales
indeseables de caminos metabólicos, por ejemplo para aumentar la
producción de metabolitos secundarios específicos tales como
antibióticos (beta-lactamas) o carotenoides. La
desactivación completa es útil también para reducir la producción de
compuestos tóxicos o indeseables (crisogenina en
Penicillium; aflatoxina en Aspergillus: McDonald KD
et al: heterokaryon studies and the genetic control of
penicillin and chrysogenin production in Penicillium
chrysogenum. J Gen Microbiol. (1963)
33:375-83). La desactivación completa es también
útil para alterar la morfología de un organismo de tal manera que el
proceso de fermentación y el procesamiento aguas abajo se
mejore.
La invención permite reemplazar secuencias
reguladoras existentes por secuencias reguladoras alternativas a fin
de alterar la expresión de genes endógenos (v.g. la expresión en
respuesta a inductores específicos).
Un aspecto de la presente invención se refiere
al reemplazamiento de un gen activo por un gen inactivo de acuerdo
con un método de la invención. La desactivación completa, que
usualmente no puede realizarse por los métodos existentes tales
como la tecnología antisentido o la tecnología del RNAi, es útil por
ejemplo para la desactivación de genes que controlan ramas
laterales indeseables de caminos metabólicos, por ejemplo para
aumentar la calidad de productos a granel tales como almidón, o para
aumentar la producción de metabolitos secundarios específicos o con
objeto de inhibir la formación de metabolitos indeseables.
Otro aspecto de la invención se refiere a la
reprogramación metabólica extensa o manipulación genética de una
célula fúngica filamentosa. La introducción de caminos nuevos
completos y/o modificación de caminos indeseables conducirá a la
obtención de una célula específicamente adaptada para la producción
de un compuesto específico tal como una proteína o un
metabolito.
Otro aspecto de la presente invención se refiere
al reemplazamiento de un gen inactivo o alterado por un gen activo.
Por ejemplo, después de tandas sucesivas de mutagénesis clásica, a
menudo ocurre que la cepa fúngica filamentosa seleccionada tiene
algunos genes endógenos alterados o incluso desactivados durante el
proceso aleatorio de mutagénesis.
En otro aspecto adicional de la invención se
proporciona un método para introducir una sustancia que confiere a
una célula fúngica filamentosa resistencia a una sustancia
antibiótica. En otro aspecto adicional de la invención, se
proporciona un método que confiere una propiedad deseada a una
célula fúngica filamentosa. En una realización preferida, se
utiliza un vehículo de suministro de genes para suministrar un
polinucleótido deseado a un sitio predeterminado. Los vehículos de
suministro de genes son bien conocidos en la técnica y han sido
descritos anteriormente en la descripción.
Asimismo, otro método preferido de acuerdo con
un aspecto adicional de la invención consiste en efectuar la
expresión predecible de transgenes que codifican nuevos productos,
por ejemplo por reemplazamiento de secuencias codificantes
existentes de genes que dan un perfil de expresión deseado por
aquéllos correspondientes a un nuevo producto deseado. De acuerdo
con una realización más preferida, el hongo filamentoso
proporcionado por la invención comprende adicionalmente un
constructo de DNA que comprende un gen deseado que codifica una
proteína deseada a producir.
Preferiblemente, el gen deseado que codifica la
proteína deseada a producir se inserta en un vector de expresión,
que se utiliza subsiguientemente para transformar la célula
hospedadora obtenida. En el vector de expresión, la secuencia de
DNA puede estar enlazada operativamente a señales de expresión
apropiadas, tales como un promotor, opcionalmente una secuencia
señal y un terminador, que son capaces de dirigir la expresión y
síntesis de la proteína en el organismo hospedador.
Más preferiblemente, el gen deseado está
enlazado operativamente a un promotor y a una señal de secreción.
La estrategia, que puede utilizarse para expresar el gen deseado es
la misma que la descrita en la sección de regulación ascendente de
la expresión de una secuencia de DNA, cuyo producto de expresión
está implicado en HR: aumento del número de copias, integración del
direccionamiento, uso de un promotor de un gen fuertemente
expresado, elección del gen marcador de selección y combinaciones de
los mismos.
La proteína deseada es preferiblemente una
enzima. Si la proteína no se secreta naturalmente, el polinucleótido
codificante de la proteína puede modificarse para tener una
secuencia señal de acuerdo con métodos bien conocidos en la
técnica. Las proteínas que son secretadas pueden ser proteínas
endógenas que se expresan naturalmente, pero también pueden ser
heterólogas. Heterólogo significa que el gen codificado por la
proteína (sic) no se produce en condición nativa en el hongo
filamentoso de tipo salvaje. Ejemplos de enzimas que pueden ser
producidas por el hongo filamentoso de la invención son
carbohidrasas, v.g. celulasas tales como endoglucanasas,
\beta-glucanasas, celobiohidrolasas o
\beta-glucosidasas, hemicelulasas o enzimas
pectinolíticas tales como xilanasas, xilosidasas, mananasas,
galactanasas, galactosidasas, ramnogalacturonasas, arabanasas,
galacturonasas, liasas, o enzimas amilolíticas; fosfatasas tales
como fitasas, esterasas tales como lipasas, enzimas proteolíticas,
oxidorreductasas tales como oxidasas, transferasas, o isomerasas.
Más preferiblemente, el gen deseado codifica una fitasa.
Como otro ejemplo, secuencias codificantes
existentes se modifican de tal modo que la proteína codificada
tiene características optimizadas por ejemplo para producir una
proteína con características térmicas mejoradas y/o propiedades
cinéticas mejoradas (Km, Kcat), y/o estabilidad enzimática mejorada,
y/o gama de sustratos ampliada, y/o duración de vida incrementada,
etc.
La invención se refiere adicionalmente al uso
del hongo filamentoso de la invención para producir un polipéptido
de interés. Alternativamente, el hongo filamentoso obtenido puede
utilizarse para producir un metabolito secundario. Metabolitos
secundarios preferidos son compuestos carotenoides, compuestos de
\beta-lactama, fármacos, compuestos antitumorales,
etc.
Preferiblemente, el hongo filamentoso obtenido
en la presente invención se utiliza para producir la proteína
deseada por cultivo de la célula hospedadora transformada en
condiciones que conducen a la expresión de la secuencia de DNA que
codifica la proteína deseada, y recuperación de la proteína deseada
como se describe por ejemplo en las referencias siguientes:
- Li, Z. J., Shukla, V.,
Fordyce, A. P., Pedersen, A. G., Wenger, K. S.,
Marten, M. Fungal morphology and fragmentation behavior in a
fed-batch Aspergillus oryzae fermentation at
the production scale. Biotechnol Bioeng. 2000 Nov 5;
70(3): 300-12.
- Withers, J. M., Swift, R. J.,
Wiebe, M. G., Robson, G. D., Punt, P. J., van
den Hondel, C. A. Optimization and stability of glucoamylase
production by recombinant strains of Aspergillus niger in
chemostat culture. Biotechnol Bioeng. 1998 Aug 20;
59(4): 407-18.
- Amanullah, Christensen, L. H.,
Hansen, K., Nienow, A. W., Thomas, R. C.
Dependence of morphology on agitation intensity in
fed-batch cultures of Aspergillus oryzae and
its implications for recombinant protein production. Biotechnol
Bioeng. 2002 Mar 30; 77(7): 815-26.
\vskip1.000000\baselineskip
Se describen adicionalmente las secuencias de
cDNA aisladas siguientes:
SEQ ID NO: 2 hdfA de A. niger,
SEQ ID NO: 19 hdfA de Penicillium
chrysogenum
SEQ ID NO: 5 hdfB de A niger
SEQ ID NO: 22 hcffB de Penicillium
chrysogenum
y homólogos de las mismas.
Cada una de SEQ ID NO: 1, 18, 4 y 21 corresponde
respectivamente a la secuencia genómica de DNA asociada con cada una
de las secuencias de cDNA arriba indicadas.
Cada una de SEQ ID NO: 3, 20, 6 y 23
corresponde respectivamente a la secuencia proteínica codificada por
la secuencia de DNA respectiva indicada anteriormente.
La información de secuencia tal como se
proporciona en esta memoria no debe interpretarse tan estrechamente
que requiera la inclusión de bases identificadas erróneamente. Las
secuencias específicas descritas en esta memoria pueden utilizarse
fácilmente para aislar el gen completo de hongos filamentosos, en
particular A. niger o Penicillium chrysogenum que, a
su vez, puede someterse fácilmente a análisis de secuencia
ulteriores identificando con ello los errores de secuenciación.
A no ser que se indique otra cosa, todas las
secuencias de nucleótidos determinadas por secuenciación de una
molécula de DNA en esta memoria se determinaron utilizando un
secuenciador automático de DNA y todas las secuencias de
aminoácidos de los polipéptidos codificados por las moléculas de DNA
determinadas en esta memoria se predijeron por traducción de una
secuencia de DNA determinada como anteriormente. Por tanto, como es
conocido en la técnica para cualquier secuencia de DNA determinada
por este método automático, cualquier secuencia de nucleótidos
determinada en esta memoria puede contener algunos errores. Las
secuencias de nucleótidos determinadas por automatización tienen
típicamente una identidad de al menos aproximadamente 90%, más
típicamente de al menos 95% hasta al menos aproximadamente 99,9%
con la secuencia de nucleótidos real de la molécula de DNA
secuenciada. La secuencia real puede determinarse más precisamente
por otros enfoques que incluyen métodos manuales de secuenciación
de DNA bien conocidos en la técnica. Como se conoce también en la
técnica, una sola inserción o deleción en una secuencia de
nucleótidos determinada comparada con la secuencia real causará un
desplazamiento del marco en la traducción de la secuencia de
nucleótidos de tal modo que la secuencia de aminoácidos predicha
codificada por una secuencia de nucleótidos determinada será
completamente diferente de la secuencia de aminoácidos codificada
realmente por la molécula de DNA secuenciada, comenzando en el punto
de dicha inserción o deleción.
La persona experta en la técnica es capaz de
identificar tales bases identificadas erróneamente y conoce del modo
de corregir dichos errores.
El término "homólogo" se define a
continuación. Los homólogos pueden entenderse con el significado de
derivados de otro hongo filamentoso distinto de Aspergillus
niger o Penicillium chrysogenum.
El DNA de longitud total de otros organismos
puede obtenerse en un método típico, utilizando bibliotecas de cDNA
o DNA genómico construidas a partir de otros organismos, v.g. hongos
filamentosos, en particular de las especies Aspergillus o
Penicillium por cribado de las mismas.
Se describen también parálogos de hdfA
y/o hdfB. Parálogos significa secuencias de DNA homólogas a
SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 18 o SEQ ID NO: 21 y
derivadas de A. niger o Penicillium chrysogenum,
respectivamente.
Por ejemplo, pueden cribarse cepas de
Aspergillus o Penicillium respecto a polinucleótidos
hdfA y/o hdfB homólogos por análisis mediante
transferencia Northern. Después de la detección de transcritos
homólogos a polinucleótidos descritos en esta memoria, pueden
construirse bibliotecas de cDNA a partir del RNA aislado de la cepa
apropiada, utilizando métodos estándar bien conocidos por los
expertos en la técnica. Alternativamente, puede cribarse una
biblioteca genómica de cDNA total utilizando una sonda hibridable a
un polinucleótido hdfA y/o hdfB, como se ha
descrito.
Pueden aislarse secuencias de genes homólogos,
por ejemplo, por realización de PCR utilizando dos agrupaciones de
iniciadores oligonucleotídicos degenerados diseñadas sobre la base
de las secuencias de nucleótidos que se exponen en esta memoria.
El molde para la reacción puede ser cDNA
obtenido por transcripción inversa de mRNA preparado a partir de
cepas que se sabe o se sospecha expresan un polinucleótido como se
ha descrito. El producto PCR puede subclonarse y secuenciarse para
asegurar que las secuencias amplificadas representan las secuencias
de una nueva secuencia de ácido nucleico hdfA y/o
hdfB, o un equivalente funcional de las mismas.
El fragmento PCR puede utilizarse luego para
aislar un clon de cDNA de longitud total por una diversidad de
métodos conocidos. Por ejemplo, el fragmento amplificado puede
marcarse y utilizarse para cribar una biblioteca de bacteriófagos o
cósmidos de cDNA. Alternativamente, el fragmento marcado puede
utilizarse para cribar una biblioteca genómica.
Puede utilizarse también tecnología PCR para
aislar secuencias de cDNA de longitud total de otros organismos.
Por ejemplo, puede aislarse RNA, siguiendo procedimientos estándar,
a partir de una fuente celular o tisular apropiada. Puede
realizarse una reacción de transcripción inversa sobre el RNA
utilizando un iniciador oligonucleotídico específico para el
extremo más próximo a 5' del fragmento amplificado para el cebado de
la síntesis de la primera cadena.
El híbrido RNA/DNA resultante puede luego
"proveerse de colas" (v.g. con guaninas) utilizando una
reacción estándar de transferasa terminal, pudiendo digerirse el
híbrido con RNasa H, y pudiendo cebarse luego la síntesis de la
segunda cadena (v.g., con un iniciador poli-C). Así,
las secuencias de cDNA situadas aguas arriba del fragmento
amplificado pueden aislarse fácilmente. Para una revisión de
estrategias de clonación útiles, véase, v.g. Sambrook et al.,
vide supra; y Ausubel et al., vide infra.
Los "homólogos" pueden entenderse también
con el significado de equivalentes funcionales.
Los términos "equivalentes funcionales" y
"variantes funcionales" se utilizan intercambiablemente en esta
memoria. Equivalentes funcionales de DNA de hdfA y/o
hdfB son fragmentos de DNA aislados que codifican un
polipéptido que exhibe una función particular del hdfA y/o
hdfB. Un equivalente funcional de un polipéptido de
hdfA y/o hdfB como se ha descrito es un polipéptido
que exhibe al menos una función como parte del complejo de NHR. Los
equivalentes funcionales abarcan por tanto también fragmentos
biológicamente activos.
Los equivalentes funcionales de proteínas o
polipéptidos pueden contener sólo sustituciones conservadoras de
uno o más aminoácidos de secuencias que tienen SEQ ID NO: 3 ó 6 ó 20
ó 23, o sustituciones, inserciones o deleciones de aminoácidos no
esenciales. De acuerdo con ello, un aminoácido no esencial es un
residuo que puede estar alterado en una de dichas secuencias sin
alterar sustancialmente la función biológica. Por ejemplo, los
residuos de aminoácidos que están conservados entre las proteínas
hdfA y/o hdfB como se han descrito, se predice que
serán particularmente no susceptibles de alteración. Adicionalmente,
los aminoácidos conservados entre las proteínas hdfA y/o
hdfB como se han descrito no son probablemente susceptibles
de alteración.
El término "sustitución conservadora" debe
entenderse que significa una sustitución en la cual el residuo de
aminoácido está reemplazado con un residuo de aminoácido que tiene
una cadena lateral similar. Estas familias son conocidas en la
técnica e incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (v.g.
lisina, arginina e histidina), cadenas laterales ácidas (v.g. ácido
aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares sin carga
(v.g., glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina,
cisteína), cadenas laterales no polares (v.g., alanina, valina,
leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano),
cadenas laterales ramificadas en beta (v.g., treonina, valina,
isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (v.g. tirosina,
fenilalanina, triptófano, histidina).
Los equivalentes funcionales de ácido nucleico
pueden contener típicamente mutaciones silenciosas o mutaciones que
no alteran la función biológica del polipéptido codificado. De
acuerdo con ello, se describen moléculas de ácido nucleico que
codifican proteínas hdfA y/o hdfB que contienen
cambios en residuos de aminoácidos que no son esenciales para una
actividad biológica particular. Tales proteínas hdfA y/o
hdfB difieren en secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 ó
6, ó 20, ó 23 y retienen todavía al menos una de sus actividades
biológicas. En una realización, la molécula de ácido nucleico
aislada comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una
proteína, en donde la proteína comprende una secuencia de
aminoácidos sustancialmente homóloga que tiene una homología de al
menos aproximadamente 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%,
97%, 98%, 99% o más con la secuencia de aminoácidos que se muestra
en SEQ ID NO: 3 ó 6 ó 20 ó 23. Por ejemplo, se proporciona
orientación concerniente al modo de producir sustituciones de
aminoácidos fenotípicamente silenciosas en Bowie, J.U. et
al., Science 243: 1306-1310 (1990), en donde los
autores indican que existen dos métodos principales para estudiar
la tolerancia al cambio de una secuencia de aminoácidos. El primer
método está basado en el proceso de la evolución, en el cual las
mutaciones son aceptadas o rechazadas por selección natural. El
segundo método utiliza ingeniería genética para introducir cambios
de aminoácidos en posiciones específicas de un gen clonado y
selecciona o criba a fin de identificar las secuencias que mantienen
la funcionalidad. Como afirman los autores, estos estudios han
revelado que las proteínas son sorprendentemente tolerantes a las
sustituciones de aminoácidos. Los autores indican adicionalmente que
los cambios son probablemente permisivos en una determinada
posición de la proteína. Por ejemplo, la mayoría de los residuos de
aminoácidos ocultos requieren cadenas laterales no polares, en
tanto que pocos rasgos de cadenas laterales superficiales se
conservan generalmente. Otras sustituciones fenotípicamente
silenciosas de este tipo se describen en Bowie et al. y en
las referencias citadas en dicho lugar.
Una molécula de ácido nucleico aislada que
codifica una proteína de hdfA y/o hdfB homóloga a la
proteína de acuerdo con SEQ ID NO: 3 ó 6 ó 20 ó 23 puede crearse
por introducción de una o más sustituciones, adiciones o deleciones
de nucleótidos en las secuencias de nucleótidos codificantes de
acuerdo con SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 5, o SEQ ID NO: 19 o SEQ ID
NO: 22 de tal modo que se introducen una o más sustituciones,
deleciones o inserciones de aminoácidos en la proteína codificada.
Tales mutaciones pueden introducirse por técnicas estándar, tales
como mutagénesis orientada y mutagénesis mediada por PCR.
El término "equivalentes funcionales"
abarca también ortólogos de la proteína hdfA y/o hdfB
de A. niger. Los ortólogos de la proteína hdfA y/o
hdfB de A. niger son proteínas que pueden asilarse de
otras cepas o especies y poseen una actividad biológica similar o
idéntica. Dichos ortólogos pueden identificarse fácilmente dado que
comprenden una secuencia de aminoácidos que es sustancialmente
homóloga a SEQ ID NO: 3 ó 6 ó 20 ó 23.
Los "homólogos" pueden entenderse también
con el significado de "sustancialmente homólogos". El término
"sustancialmente homólogo" se refiere a una primera secuencia
de aminoácidos o nucleótidos que contiene un número suficiente o
mínimo de aminoácidos o nucleótidos idénticos o equivalentes (v.g.
con cadena lateral similar) a una segunda secuencia de aminoácidos
o nucleótidos tales que la primera y la segunda secuencias de
aminoácidos o nucleótidos tienen un dominio común. Por ejemplo, las
secuencias de aminoácidos o nucleótidos que contienen un dominio
común que tiene aproximadamente 45%, con preferencia aproximadamente
50%, con preferencia aproximadamente 60%, con preferencia
aproximadamente 65%, con más preferencia aproximadamente 70%, aún
más preferiblemente aproximadamente 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%,
97%, 98% o 99% de identidad o más se definen en esta memoria como
suficientemente idénticos.
Se describen asimismo ácidos nucleicos que
codifican otros miembros de la familia de hdfA y/o
hdfB, que tienen una secuencia de nucleótidos que difiere de
SEQ ID NO: 2 ó 5 ó 19 ó 22. Además, ácidos nucleicos que codifican
proteínas hdfA y/o hdfB de diferentes especies, que
tienen por tanto una secuencia de nucleótidos que difiere de SEQ ID
NO: 2 ó 5 ó 19 ó 22.
Moléculas de ácido nucleico correspondientes a
variantes (v.g. variantes alélicas naturales) y homólogos del DNA
hdfA y/o hdfB descritos pueden aislarse sobre la base
de su homología con los ácidos nucleicos hdfA y/o
hdfB descritos en esta memoria utilizando los cDNAs descritos
en esta memoria o un fragmento adecuado de los mismos, con una
sonda de hibridación de acuerdo con técnicas estándar de
hibridación, preferiblemente en condiciones de hibridación muy
severas.
"La severidad" de las reacciones de
hibridación puede ser determinada fácilmente por una persona con
experiencia ordinaria en la técnica, y generalmente es un cálculo
empírico dependiente de la longitud de la sonda, la temperatura de
lavado, y la concentración de sales. En general, las sondas más
largas requieren mayores temperaturas para reasociación apropiada,
mientras que las sondas más cortas precisan temperaturas más bajas.
La hibridación depende generalmente de la capacidad del DNA
desnaturalizado para reasociarse cuando están presentes cadenas
complementarias en un ambiente por debajo de su temperatura de
fusión. Cuanto mayor es el grado de homología deseado entre la
sonda y la secuencia hibridable, tanto mayor es la temperatura
relativa que puede utilizarse. Como resultado, se sigue que las
temperaturas relativas más altas tenderán a hacer las condiciones de
reacción más severas, mientras que las temperaturas más bajas lo
harán menos.
\newpage
Para detalles y explicación adicionales de la
severidad de las reacciones de hibridación, véase Ausubel et
al, Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience
Publishers (1995).
Las "condiciones severas" o "condiciones
de alta severidad", como se definen en esta memoria, pueden ser
identificadas como aquéllas que: (1) emplean baja concentración
iónica y alta temperatura para lavado, por ejemplo cloruro de sodio
0,015 M/citrato de sodio 0,0015 M/dodecilsulfato de sodio 0,1% a
50ºC; (2) emplean durante la hibridación un agente
desnaturalizante, tal como formamida, por ejemplo, 50% (v/v)
formamida con tampón de 0,1% seroalbúmina bovina/0,1% Ficoll/0,1%
polivinilpirrolidona/fosfato de sodio 50 mM a pH 6,5 con cloruro de
sodio 750 mM, citrato de sodio 75 mM a 42ºC; o (3) emplean 50%
formamida, 5 x SSC (NaCl 0,75 M, citrato de sodio 0,075 M), fosfato
de sodio 50 mM (pH 6,8), pirofosfato de sodio 0,1%, 5 x solución de
Denhardt, DNA de esperma de salmón tratado por ultrasonidos (50
Rg/ml), 0,1% de SDS, y 10% de sulfato de dextrano a 42ºC, con
lavados a 42ºC en 0,2 x SSC (cloruro de sodio/citrato de sodio) y
5% de formamida a 55ºC, seguido por un lavado de alta severidad
consistente en 0,1 x SSC que contiene EDTA a 55ºC.
Las "condiciones moderadamente severas"
pueden identificarse como ha sido descrito por Sambrook et
al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Nueva York,: Cold
Spring Harbour Press, 1989, incluyen el uso de solución de lavado y
condiciones de hibridación (v.g., temperatura, concentración iónica
y tanto por ciento de SDS) menos severas que las arriba descritas.
Un ejemplo de condiciones moderadamente severas es incubación
durante una noche a 37ºC en una solución que comprende: 20% de
formamida, 5% SSC (NaCl 150 mM, citrato trisódico 15 mM), fosfato
de sodio 50 mM (pH 7,6), 5 x solución de Denhardt, 10% sulfato de
dextrano, y 20 mg/ml de DNA de esperma de salmón desnaturalizado
cizallado, seguido por lavado de los filtros en 1 x SSC a
aproximadamente 37-50ºC. El profesional experto
reconocerá el modo de ajustar la temperatura, la concentración
iónica, etc. según sea necesario para acomodar factores tales como
longitud de sonda y análogos, o por utilización de un algoritmo
adecuado para determinación de la semejanza de secuencias.
Las secuencias homólogas (similares o idénticas)
pueden determinarse también utilizando un "algoritmo de
comparación de secuencias". La alineación óptima de las
secuencias para comparación puede conducirse, v.g., por el algoritmo
de homología local de Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482
(1981), por el algoritmo de alineación de homología de Needleman
& Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443 (1970), por el método de
búsqueda de semejanza de Pearson & Lipman, Proc. Nat'l Acad.
Sci. USA 85: 2444 (1988), por implementaciones computerizadas de
estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, y TFASTA en el Wisconsin
Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr.,
Madison, WI), o por inspección visual. Un ejemplo de un algoritmo
que es adecuado para determinación de la semejanza de secuencias es
el algoritmo BLAST, que se describe en Altschul, et al., J.
Mol. Biol. 215: 403-410 (1990).
El software para realización de los análisis
BLAST está disponible públicamente del National Center for
Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/).
Este algoritmo implica identificar primeramente pares de secuencias
de registro alto (HSPs) por identificación de palabras cortas de
longitud W en la secuencia de consulta que coinciden o satisfacen
cierto registro umbral de valor positivo T cuando se alinean con una
palabra de la misma longitud en una secuencia de bases de datos.
Estos aciertos iniciales de palabra de proximidad actúan como
puntos de partida para encontrar HSPs más largos que contienen los
mismos. Los aciertos de palabras se expanden en ambas direcciones a
lo largo de cada una de las dos secuencias que se comparan hasta
donde pueda incrementarse el registro de alineación acumulativo. La
extensión de los aciertos de palabras se interrumpe cuando: el
registro de alineación acumulativo disminuye por la cantidad X con
respecto a un valor máximo alcanzado; el registro acumulativo
desciende a cero o por debajo de cero; o se alcanza el final de
cualquiera de las secuencias.
Los parámetros del algoritmo BLAST W, T, y X
determinan la sensibilidad y velocidad de la alineación. El programa
BLAST utiliza como defectos una longitud de palabra W de 11,
alineaciones de la matriz de registro BLOSUM62 (véase Henikoff
& Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915 (1989)) (B) de
50, la expectativa (E) de 10, M = 5, N = 4, y una comparación de
ambas cadenas.
El algoritmo BLAST realiza luego un análisis
estadístico de la semejanza entre dos secuencias (véase, v.g.,
Karlin & Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
90:5873-5787 (1993)). Una medida de la semejanza
proporcionada por el algoritmo BLAST es la probabilidad de suma más
pequeña (P(N)), que proporciona una indicación de la
probabilidad por la cual podría producirse casualmente una
coincidencia entre dos secuencias de nucleótidos o aminoácidos. Por
ejemplo, se considera que una secuencia de aminoácidos es similar a
una proteína tal como una proteasa si la probabilidad de suma más
pequeña en una comparación de la secuencia de aminoácidos testada
con una proteína tal como una secuencia de aminoácidos de proteasa
es menor que aproximadamente 0,1, más preferiblemente menor que
aproximadamente 0,01, y muy preferiblemente menor que
aproximadamente 0,001. Preferiblemente, la semejanza es al menos
40% de homología con una de las secuencias de DNA que tienen SEQ ID
NO: 2, 5, 19 y 22. Más preferiblemente, la semejanza es al menos
50%, más preferiblemente al menos 60%, más preferiblemente al menos
70%, más preferiblemente al menos 80%, y más preferiblemente al
menos 90%.
Además de las variantes alélicas existentes
naturalmente de la secuencia hdfA y/o hdfB, las
personas expertas reconocerán que pueden introducirse cambios por
mutación en las secuencias de nucleótidos de SEQ ID NO: 2 ó 5 ó 19
ó 22, conduciendo con ello a cambios en la secuencia de aminoácidos
de la proteína hdfA y/o hdfB sin alterar
sustancialmente la función de la proteína hdfA y/o
hdfB.
Se describen también proteínas hdfA y/o
hdfB deterioradas. Las proteínas hdfA y/o hdfB
deterioradas son proteínas en las cuales al menos una actividad
biológica está reducida. Tales proteínas pueden obtenerse por
introducción de mutaciones de modo aleatorio a lo largo de la
totalidad o parte de la secuencia codificante de hdfA y/o
hdfB, por ejemplo por mutagénesis de saturación, y los
mutantes resultantes pueden expresarse recombinantemente y cribarse
respecto a actividad biológica. Por ejemplo, la técnica proporciona
ensayos estándar para medida de su actividad enzimática y por
consiguiente pueden seleccionarse fácilmente proteínas deterioradas.
Preferiblemente, el ensayo es uno descrito anteriormente (véase por
ejemplo WO 02/052026 página 23 o el ensayo de cribado
fenotípico).
En una realización preferida, la proteína
hdfA y/o hdfB tiene una secuencia de aminoácidos de
acuerdo con SEQ ID NO: 3 ó 6 ó 20 ó 23. En otra realización, el
polipéptido hdfA y/o hdfB es sustancialmente homólogo
a la secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID NO: 3 ó 6 ó 20 ó
23 y que retiene al menos una actividad biológica de un polipéptido
de acuerdo con SEQ ID NO: 3 ó 6 ó 20 ó 23, pero difiere en secuencia
de aminoácidos debido a la variación natural o mutagénesis como se
ha descrito arriba.
En una realización preferida adicional, la
proteína hdfA y/o hdfB tiene una secuencia de
aminoácidos codificada por un fragmento de ácido nucleico aislado
capaz de hibridarse a un ácido nucleico de acuerdo con SEQ ID NO: 2
ó 5 ó 19 ó 22, preferiblemente en condiciones de hibridación muy
severas.
De acuerdo con ello, la proteína hdfA y/o
hdfB es una proteína que comprende una secuencia de
aminoácidos al menos aproximadamente 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%,
90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más homóloga a la secuencia de
aminoácidos que se muestra en SEQ ID NO: 3 ó 6 ó 20 ó 23 y que
retiene al menos una actividad funcional del polipéptido de acuerdo
con SEQ ID NO: 3 ó 6 ó 20 ó 23.
Equivalentes funcionales de una proteína como se
describe pueden identificarse también v.g. por cribado de
bibliotecas combinatorias de mutantes, v.g. mutantes de truncación,
de la proteína descrita para una actividad dada. En una
realización, se genera una biblioteca diversificada de variantes por
mutagénesis combinatoria a nivel del ácido nucleico. Una biblioteca
diversificada de variantes puede producirse, por ejemplo, por
ligación enzimática de una mezcla de oligonucleótidos sintéticos en
secuencias génicas tales que puede expresarse un conjunto
degenerado de secuencias potenciales de proteínas como polipéptidos
individuales, o alternativamente, como una serie de proteínas de
fusión más largas (v.g., para presentación de fago). Existe una
diversidad de métodos que pueden utilizarse para producir
bibliotecas de variantes potenciales de los polipéptidos como se
describen a partir de una secuencia de oligonucleótidos degenerada.
Métodos para la síntesis de oligonucleótidos degenerados se conocen
en la técnica (véase, v.g., Narang (1983) Tetrahedron 39:3; Itakura
et al. (1984) Annu. Rev. Biochem. 53:323; Itakura et
al. (1984) Science 198:1056; Ike et al. (1983) Nucleic
Acid Res. 11:477).
Adicionalmente, pueden utilizarse bibliotecas de
fragmentos de la secuencia codificante de un polipéptido como se
describe para generar una población diversificada de polipéptidos
para cribado de una selección subsiguiente de variantes. Por
ejemplo, puede generarse una biblioteca de fragmentos de secuencias
codificantes por tratamiento de un fragmento PCR bicatenario de la
secuencia codificante de interés con una nucleasa en condiciones en
las cuales ocurre desplazamiento de la mella sólo aproximadamente
una vez por molécula, desnaturalización del DNA bicatenario,
renaturalización del DNA para formar DNA bicatenario que puede
incluir pares sentido/antisentido de productos mellados
diferentemente, eliminación de porciones monocatenarias de dúplex
nuevamente formados por tratamiento con nucleasa S1, y ligación de
la biblioteca de fragmentos resultante en un vector de expresión.
Por este método, puede derivarse una biblioteca de expresión que
codifica fragmentos N-terminales e internos de
diversos tamaños de la proteína de interés.
Se conocen en la técnica varios métodos para
cribado de productos génicos de bibliotecas combinatorias fabricados
por mutaciones puntuales de truncación, y para cribado de
bibliotecas de cDNA respecto a productos génicos que tengan una
propiedad seleccionada. Las técnicas más generalmente utilizadas,
que son susceptibles de análisis de alta capacidad, para cribado de
grandes bibliotecas de genes, incluyen típicamente clonación de la
biblioteca de genes en vectores de expresión replicables,
transformación de las células apropiadas con la biblioteca de
vectores resultante, y expresión de los genes combinatorios en
condiciones en las cuales la detección de una actividad deseada
facilita el aislamiento del vector codificante del gen cuyo producto
se ha detectado. La mutagénesis recurrente conjunta (REM), una
técnica que mejora la frecuencia de mutantes funcionales en las
bibliotecas, puede utilizarse en combinación con los ensayos de
cribado para identificar variantes de una proteína como se describe
(Arkin y Yourvan (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:78117815;
Delgrave et al. (1993) Protein Engineering
6(3):327-331).
Además de las secuencias génicas hdfA y/o
hdfB que se muestran en SEQ ID NO: 2 y 5 y 19 y 22, será
evidente para las personas expertas en la técnica que pueden existir
polimorfismos de secuencia de DNA que pueden conducir a cambios en
la secuencia de aminoácidos de la proteína hdfA y/o
hdfB, dentro de una población dada. Tales polimorfismos
genéticos pueden existir en células de poblaciones diferentes o
dentro de una población debido a variación alélica natural. Las
variantes alélicas pueden incluir también equivalentes
funcionales.
Fragmentos de un polinucleótido como se ha
descrito pueden comprender también polinucleótidos que no codifican
polipéptidos funcionales. Tales polinucleótidos pueden funcionar
como sondas o iniciadores para una reacción PCR.
Los ácidos nucleicos como se ha descrito, con
indiferencia de que codifiquen polipéptidos funcionales o no
funcionales, pueden utilizarse como sondas de hibridación o
iniciadores a la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Los
usos de las moléculas de ácido nucleico como se han descrito que no
codifican un polipéptido que tenga actividad hdfA y/o
hdfB incluyen, inter alia, (1) aislamiento del gen
codificante de la proteína hdfA y/o hdfB, o variantes
alélicas del mismo a partir de una biblioteca de cDNA, v.g. de otros
organismos distintos de A. niger o Penicillium
chrysogenum, (2) hibridación in situ (v.g. FISH) a
extensiones cromosómicas en metafase a fin de proporcionar
localización cromosómica precisa del gen hdfA y/o hdfB
como se describe en Venma et al., Human Chromosomes: a
Manual of Basic Techniques, Pergamon Press, Nueva York (1988); (3)
análisis por transferencia Northern para detectar la expresión de
mRNA de hdfA y/o hdfB en tejidos y/o células
específicos, y (4) sondas e iniciadores que pueden utilizarse como
herramienta de diagnóstico para analizar la presencia de un ácido
nucleico hibridable a la sonda hdfA y/o hdfB en una
muestra biológica dada (v.g. tejido).
Se describe también un método de obtención de un
equivalente funcional de un gen o cDNA de hdfA y/o
hdfB. Un método de este tipo implica la obtención de una
sonda marcada que incluye un ácido nucleico aislado que codifica la
totalidad o una porción de la secuencia de acuerdo con SEQ ID NO: 2
ó 5 ó 19 ó 22 o una variante de la misma; cribado de una biblioteca
de fragmentos de ácido nucleico con la sonda marcada en condiciones
que permiten la hibridación de la sonda a fragmentos de ácido
nucleico en la biblioteca, formando con ello dúplex de ácido
nucleico, y preparación de una secuencia de genes de longitud total
a partir de los fragmentos de ácido nucleico en cualquier dúplex
marcado para obtener un gen afín al gen hdfA y/o
hdfB.
En una realización, un ácido nucleico de
hdfA y/o hdfB es al menos 45%, 50%, 55%, 60%, 65%,
70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%,
99%, o más, homólogo a una secuencia de ácido nucleico representada
en SEQ ID NO: 1, ó 2, ó 4 ó 5 ó 18, ó 19, ó 21, ó 22.
En otra realización preferida, un polipéptido de
hdfA y/o hdfB es al menos 60%, 65%, 70%, 75%, 80%,
85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o más,
homólogo a la secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID NO: 3
ó 6 ó 20 ó 23.
Se describen secuencias de DNA que tienen SEQ ID
NO: 1, ó 2, ó 4, ó 5, ó 18, ó 19, ó 21, ó 22 per se y
homólogos de las mismas como se definen arriba. Se describen
también secuencias de DNA afines a estas secuencias de DNA y
obtenidas por degeneración del código genético. Se describen también
secuencias de DNA afines a DNA SEQ ID NO: 2, 5, 19, y 22 y
obtenidas por hibridación (véase el párrafo anterior). Se describen
también polipéptidos aislados codificados por estas secuencias de
DNA u homólogos de las mismas como se definen arriba. Los
polipéptidos hdfA y hdfB tienen una función implicada
en NHR. Todos estos polipéptidos pueden utilizarse en el método de
la invención para obtener hongos filamentosos, que pueden tener
eficiencias de direccionamiento mejoradas.
La invención se ilustrará con mayor detalle en
los ejemplos que siguen. Tales ejemplos no tienen por objeto limitar
el alcance de la invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Se secuenció y analizó DNA genómico de la cepa
CBS513.88 de Aspergillus niger. Se identificaron dos genes
con proteínas traducidas anotadas como homólogos a KU60 y KU80, y se
designaron hdfA y hdfB respectivamente. Secuencias de
los loci hdfA y/o hdfB, que comprenden el marco de
lectura abierto (ORF) (con intrones) y aproximadamente 1000 pb 5' y
3' de los genes, se muestran en los listados de secuencias 1 y 4. Se
diseñaron vectores de reemplazamiento de genes para hdfA y
hdfB de acuerdo con principios conocidos y se construyeron
de acuerdo con procedimientos de clonación rutinarios (véanse las
Figuras 1 y 2). En esencia, estos vectores comprenden
aproximadamente regiones flanqueantes de 1000 pb de los ORFs de
hdf para recombinación homóloga en los loci genómicos
predestinados. Adicionalmente, los mismos contienen el marcador de
selección bi-direccional amdS de A.
nidulans, en medio de repeticiones directas. El diseño general
de estos vectores de deleción se ha descrito previamente en EP
635574B y WO 98/46772.
\vskip1.000000\baselineskip
Se aisló DNA lineal del vector de deleción
pDEL-HDFA (Figura 1) y se utilizó para transformar
Aspergillus niger CBS513.88 utilizando un método descrito
anteriormente (Biotechnology of Filamentous fungi: Technology and
Products. (1992) Reed Publishing (USA); Chapter 6: Transformation
pages 113 to 156). Este DNA lineal puede integrarse en el genoma en
el locus hdfA, sustituyendo así el gen hdfA por el gen
amdS como se representa en la Figura 3. Se seleccionaron
transformantes en medio de acetamida y se purificaron colonias de
acuerdo con procedimientos estándar como se describen en EP 635574B.
Las esporas se extendieron en placas sobre medio de
fluoro-acetamida para seleccionar cepas, que perdían
el marcador amdS. Las colonias en crecimiento se
diagnosticaron por PCR para integración en el locus hdfA y
las cepas candidato se testaron por análisis Southern respecto a
deleción del gen hdfA. La deleción del gen hdfA era
detectable por una reducción de tamaño de \sim 2,2 kb de los
fragmentos de DNA que abarcaban el locus entero y se hibridaban a
sondas apropiadas. Aproximadamente 8 cepas exhibían una eliminación
del gen genómico de hdfA de una agrupación de aproximadamente
400 transformantes iniciales.
La cepa dHDFA se seleccionó como una cepa
representativa con el gen hdfA desactivado.
\vskip1.000000\baselineskip
Se aisló DNA lineal del vector de deleción
pDEL-HDFB (Figura 2) y se utilizó para transformar
la cepa CBS513.88 de Aspergillus niger. Este DNA lineal
puede integrarse en el genoma en el locus hdfB, sustituyendo
así el gen hdfB por amdS (Figura 4). Se utilizó la
misma técnica de reemplazamiento de genes que se ha descrito en el
Ejemplo 2. Se seleccionaron transformantes en medio de acetamida y
se purificaron colonias de acuerdo con procedimientos estándar. Se
extendieron esporas en medio de fluoro-acetamida
para seleccionar las cepas, que perdían el marcador amdS (EP
635574B). Las colonias en crecimiento se diagnosticaron por PCR
respecto a integración en el locus hdfB y las cepas candidato
se testaron por análisis Southern respecto a deleción del gen
hdfB. La deleción del gen hdfB era detectable por
reducción de tamaño de \sim 2,6 kb de los fragmentos de DNA que
abarcaban el locus entero y se hibridaban a sondas apropiadas.
Aproximadamente 7 cepas exhibían una eliminación del gen genómico
hdfB de una agrupación de aproximadamente 370 transformantes
iniciales.
La cepa dHDFB se seleccionó como una cepa
representativa con el gen hdfB desactivado.
\vskip1.000000\baselineskip
Se aisló DNA lineal del vector de deleción
pDEL-HDFB (Figura 2) y se utilizó para transformar
la cepa dHDFA obtenida en el Ejemplo 2. Este DNA lineal puede
integrarse en el genoma en el locus hdfB, reemplazando así
amdS por el gen hdfB (Figura 4). La técnica de
reemplazamiento de genes utilizada en la misma descrita en el
Ejemplo 2. Se seleccionaron transformantes en medio de acetamida y
se purificaron colonias de acuerdo con procedimientos estándar. Las
esporas se extendieron en placas sobre medio de
fluoro-acetamida para seleccionar las cepas, que
perdían el marcador amdS. Las colonias en crecimiento se
diagnosticaron por PCR respecto a integración en el locus
hdfB y las cepas candidato se testaron por análisis Southern
para deleción del gen hdfB. La deleción del gen hdfB
era detectable por reducción de tamaño de \sim 2,6 kb de los
fragmentos de DNA que abarcaban el locus entero y se hibridaban a
sondas apropiadas. Aproximadamente 15 cepas exhibían eliminación
del gen genómico de hdfB de una agrupación de aproximadamente
380 transformantes iniciales.
La cepa dHDFAB se seleccionó como cepa
representativa con ambos genes hdfA y hdfB
desactivados.
\vskip1.000000\baselineskip
Un mecanismo por el cual puede integrarse DNA en
el genoma de Aspergillus niger en un locus predestinado es
mediante una recombinación homóloga simple. El DNA homólogo se
alinea y se integra en la posición genómica por recombinación
(véase la Figura 5). Se utilizaron dos vectores para testar la
eficiencia de direccionamiento por una sola recombinación homóloga
de las cepas de Aspergillus niger obtenidas en los Ejemplos
2, 3 y 4. Los dos vectores comprenden regiones homólogas al locus
de glucoamilasa (glaA) para dirigir la recombinación y la
integración resultante (Figura 5).
El primer vector diseñado para tal integración
homóloga ha sido ya descrito anteriormente en WO 02/45524
(pGBFIN11-EPO). Este vector contiene el gen
codificante de la endoproteasa específica de prolina.
El segundo vector (pGBFIN11-PLA)
contiene el gen codificante de fosfolipasa A1 (PLA1) de A.
oryzae. El gen codificante de esta enzima ha sido ya publicado
(Watanabe I, et al., Biosci. Biotechnol. Biochem. (1999),
vol 63, número 5, páginas 820-826). Este gen se
clonó en pGBFIN11 utilizando la misma técnica que se ha descrito
en WO 02/045524 para clonación del gen de la endoproteasa específica
de prolina en pGBFIN11-EPO.
Las cepas CBS513.88, dHDFA, dHDFB y dHDFAB se
transformaron con los plásmidos pGBFIN11-EPO o
pGBFIN11-PLA de acuerdo con técnicas de
transformación descritas anteriormente en el Ejemplo 2. Los
resultados obtenidos eran los mismos con ambos plásmidos
utilizados. Se encontraron respectivamente 5%, 10%, 10% y 10%, de
transformantes con plásmidos integrados en el locus diana. Por
tanto, se llegó a la conclusión de que la desactivación de al menos
un gen hdf en Aspergillus niger conduce a un aumento
significativo de la eficiencia de direccionamiento de estas cepas a
través de un solo suceso de recombinación homólogo.
\vskip1.000000\baselineskip
La eficiencia de direccionamiento se evaluó
ulteriormente por transformación de la cepa dHDFA con vectores de
deleción diseñados para desactivación de varios genes codificantes
de amilasa del genoma. Las regiones flanqueantes de los genes se
clonaron esencialmente como se describe en el Ejemplo 1, y los
vectores resultantes se linealizaron y se utilizaron para
transformar protoplastos de CBS513.88 y la cepa dHDFA. La frecuencia
de direccionamiento se evaluó por análisis PCR y ensayos en placas
basados en actividad indicativos de la desactivación de los genes
correspondientes. Lo último se hizo por propagación de
transformantes en placas PDA complementadas con 0,4% de agar y
tinción subsiguiente con una solución yodo/yoduro de potasio (Lugol,
Sigma L 6146). Como puede verse en la Tabla 1 siguiente, la
frecuencia de direccionamiento, a juzgar por los análisis PCR y/o
los ensayos en placas basados en actividad indicativos de la
desactivación de los genes correspondientes, mejoraba
significativamente con respecto a la observada con la cepa
CBS513.88.
\vskip1.000000\baselineskip
Estos descubrimientos proporcionan respaldo
adicional para la conclusión de los autores de la invención de que
la desactivación de al menos uno de los genes hdf en
Aspergillus niger da como resultado un aumento significativo
de la eficiencia de direccionamiento de los vectores para
integración por recombinación homóloga doble.
\vskip1.000000\baselineskip
En una serie separada de experimentos, se
investigó ulteriormente el efecto de la longitud de las regiones
flanqueantes sobre la eficiencia de transformación y la frecuencia
de direccionamiento por recombinación homóloga doble. Protoplastos
de las cepas CBS513.88 y dHDFA se transformaron con fragmentos PCR
que abarcaban el marcador amdS de A. nidulans
flanqueado por regiones flanqueantes de amyBII de longitud
variable. Los datos presentados en la Tabla 2 demuestran claramente
que, además de eficiencias mejoradas de transformación global, el
direccionamiento de las casetes integradoras estaba muy mejorado en
la cepa dHDFA.
\vskip1.000000\baselineskip
No se observó diferencia fenotípica alguna
durante el crecimiento de las cepas dHDFA, dHDFB o dHDFAB en medios
sólidos o matraces de sacudidas. Las cepas dHDFA, dHDFB y dHDFAB
transformadas con los plásmidos pGBFIN11-EPO o
pBGFIN11-PLA secretaban todas ellas enzima activa en
el medio como se determinó de acuerdo con los procedimientos
siguientes.
El medio sólido era el medio agar de
patata-dextrosa (PDA) (Difco, POTATO DEXTROSE AGAR,
medio de cultivo, no. de catálogo 213400, año
1996-1997).
Se realizaron experimentos en matraces de
sacudidas en 100 ml del medio como se describe en EP 635574B a 34ºC
y 170 rpm en un agitador-incubador de sacudidas
utilizando un matraz de sacudidas de 500 ml con placas de
desviación. Después de 4 días de fermentación, se tomaron muestras
para determinar la actividad de proteasa específica de prolina o la
actividad de fosfolipasa.
La actividad proteolítica de la endoproteasa
específica de prolina se midió espectrofotométricamente a lo largo
del tiempo a pH 5 y aproximadamente 37ºC utilizando como sustrato
Z-Gly(cina)-Pro(lina)-pNA.
1 U de endoproteasa específica de prolina se define como la
cantidad de enzima que convierte 1 micromol de
Z-Gly(cina)-Pro(lina)-pNA
por minuto a pH 5 y 37ºC.
Para determinar la actividad de fosfolipasa PLA1
de Aspergillus niger (PLA1) espectrofotométricamente, se
utiliza un sustrato artificial:
1,2-ditiodioctanoil-fosfatidilcolina
(diC8, sustrato). PLA1 hidroliza el enlace sulfuro en la posición
A1, disociando ácido tio-octanoico. El ácido
tio-octanoico reacciona con
4,4-ditiopiridina (reactivo de color,
4-DTDP), formando 4-tiopiridona. La
4-tiopiridona está en equilibrio tautomérico con
4-mercaptopiridina, que absorbe radiación que tiene
una longitud de onda de 334 nm. Se mide el cambio de extinción a
dicha longitud de onda. Una unidad es la cantidad de enzima que se
libera de 1 nmol de ácido tio-octanoico a partir de
1,2-ditiodioctanoil-fosfatidilcolina
por minuto a 37ºC y pH 4,0.
La solución sustrato se prepara disolviendo 1 g
de cristales de diC8 en 66 ml de etanol y añadiendo 264 ml de
tampón acetato. El tampón acetato comprende tampón acetato 0,1 M de
pH 3,85 que contiene 0,2% de Triton-X100. El
reactivo de color es una solución 11-mM de
4,4-ditiodipiridina. El mismo se preparó por pesada
de 5,0 mg de 4,4-ditiodipiridina en un vaso de
muestra Eppendorf de 2 ml y disolución en 1,00 ml de etanol. Se
añadió 1,00 ml de agua mili-Q.
Es interesante que los cambios morfológicos
tales como diferencias de color o aparición de colonias ocurrían
menos frecuentemente para los transformantes obtenidos a partir de
las cepas dHDFA, dHDFB y dHDFAB que para los transformantes
obtenidos a partir de CBS513.88. Esto podría ser debido a una
reducción de las integraciones aleatorias (NHR) impidiendo así
cambios fenotípicos inesperados.
\vskip1.000000\baselineskip
Para aislar mutantes con una eficiencia mejorada
de direccionamiento génico se aplicó una combinación de mutagénesis
clásica y biología molecular. Se obtuvieron esporas de
Penicillium chrysogenum (CBS455.95) a partir de colonias
esporulantes en YEPD (2% Extracto de Levadura de Difco, 1% peptona
de Difco, 2% glucosa). Estas esporas se lavaron en agua estéril del
grifo y se sometieron 10 ml de una suspensión que contenía 10^{8}
conidiosporas por ml a irradiación UV a 254 nm (Sylvania, tubo
Black Light Blue de 15 vatios, modelo FT15T8/BLB). Se aplicó
irradiación UV durante 7,5, 15 ó 30 minutos mientas las suspensiones
se agitaban lentamente mediante sacudidas. Estos tiempos diferentes
de irradiación se seleccionaron para obtener en las células niveles
de tasa de mutación suaves, medios y fuertes. Después de una hora
de recuperación en la oscuridad, las células de estos 3 puntos
temporales se dividieron en dos partes alícuotas iguales. La primera
muestra se re-esporuló directamente como se ha
descrito arriba (Hersbach, GJM, Van der Beek, CP y Van Dijck, PWM.
The Penicillins: properties, biosynthesis and fermentation. en:
Vandamme EJ (ed) Biotechnology of Industrial Antibiotics (pp
45-140). Marcel Dekker, Nueva York) y la otra
muestra se incubó durante un periodo de recuperación prolongado en
medio YNB (Base de Levadura Nitrogenada de 0,67% p/v con
aminoácidos (Difco), 2,0% p/v glucosa) durante 4 horas a 25ºC antes
de inducir la esporulación.
Se obtuvieron terceras muestras mutagenizadas
por germinación de esporas de tipo salvaje durante una noche en
YNB, seguida por dos pasos de lavado en agua estéril del grifo, y se
resuspendieron en agua estéril del grifo. Se aplicó de nuevo
irradiación UV durante 7,5, 15 y 30 minutos mientras las
suspensiones se agitaban lentamente mediante sacudidas. Estas
muestras se re-esporularon directamente (como se ha
descrito arriba) después de 1 hora de recuperación en la
oscuridad.
Para seleccionar los mutantes deseados de estas
poblaciones mutagenizadas, se inocularon las poblaciones
mutagenizadas en medio YEPD. Después de la germinación, se siguió
el desarrollo de las células utilizando microscopía óptica
estándar. Cuando se desarrollaron bien las hifas medias de un
cultivo, se cosecharon las células y se incubaron con enzimas de
lisis para obtener protoplastos. Los protoplastos se transformaron
con 2 fragmentos de DNA que llevaban casetes de expresión de
marcadores de selección funcionales, ble y amdS. El
gen ble codifica una proteína capaz de conferir resistencia
a la fleomicina (Kolar M, Punt PJ, van den Hondel CA, Schwab H.
Transformation of Penicillium chrysogenum using dominant
selection markers and expression of an Escherichia coli
lacZ fusion gene. Gene. 1988; 62(1):127-34).
El gen amdS codifica una proteína que permite que las
células crezcan en acetamida como única fuente de nitrógeno (como se
describe en EP 635 574B). Los métodos aplicados para la
transferencia de DNA a protoplastos de P. chrysogenum son
bien conocidos en la técnica y se describen en muchas referencias,
con inclusión de Finkelstein y Ball (eds.), Biotechnology of
filamentous fungi, technology and products,
Butterworth-Heinemann (1992); Bennett y Lasure
(eds.) More Gene Manipulations in fungi, Academic Press (1991);
Turner, en: Pühler (ed), Biotechnology, second completely revised
edition, VHC (1992). La transformación de protoplastos mediada por
Ca-PEG se utiliza como se describe en EP 635574.
Para seleccionar la integración direccionada de
estas casetes de expresión en loci específicos del genoma de
Penicillium, se añadieron tramos cortos homólogos de DNA por
PCR en ambos lados de los fragmentos de DNA. Se produjeron 3 tipos
de constructo: el primer tipo contiene tramos homólogos de DNA de 30
pb, el segundo de 50 pb y el tercero de 100 pb. La selección se
realizó transformando los mutantes obtenidos de los nueve lotes
esporulados con dos constructos de DNA (ble y amdS)
con tramos homólogos de 30, 50 ó 100 pb que definían 27 lotes
distintos. El gen ble se direccionó al locus niaD,
rompiendo con ello el gen de nitrato-reductasa
(Gouka RJ, van Hartingsveldt W, Bovenberg RA, van den Hondel CA, van
Gorcom RF. Cloning of the nitrate-nitrite reductase
gene cluster of Penicillium chrysogenum and use of the
niaD gene as a homologous selection marker. J Biotechnol.
1991 Sep; 20(2):189-99), lo que permite la
selección directa de transformantes en placas que contienen
clorato, dado que las células se vuelven resistentes al clorato. El
gen amdS se direccionó al locus sutB, rompiendo con
ello el gen de sulfato-permeasa (van de Kamp M,
Pizzinini E, Vos A, van der Lende TR, Schuurs TA, Newbert RW, Turner
G, Konings WN, Driessen AJ. Sulfate transport in Penicillium
chrysogenum: cloning and characterization of the sutA and
sutB genes. J. Bacteriol. 1999
Dec;181(23):7228-34), lo que permite la
selección directa de transformantes en placas que contienen
seleniato. Se seleccionaron primeramente los transformantes en
clorato y se testaron luego respecto a seleniato. Adicionalmente,
se demostró la presencia de los marcadores de selección por
crecimiento en placas que contenían acetamida como única fuente de
nitrógeno (EP 635574B) y subsiguientemente en placas que contenían
fleomicina. Como control se transformó también P. chrysogenum
CBS455.95 de tipo salvaje con los mismos fragmentos de DNA. Los
mutantes con ambos marcadores de selección presentes y resistentes a
la vez contra clorato y seleniato son cepas con integración mejorada
direccionada.
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(Formulario pasa a página
siguiente)
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<110> DSM IP Assets B.V.
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<120> Mutantes fúngicos filamentosos con
eficiencia mejorada de recombinación homóloga
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\vskip0.400000\baselineskip
<130> 24181WO
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\vskip0.400000\baselineskip
<160> 17
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\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2284
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<212> DNA
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<213> Aspergillus niger
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<400> 1
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
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<211> 1947
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<212> DNA
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<213> Aspergillus niger
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
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<211> 648
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<212> PRT
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<213> Aspergillus niger
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
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\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
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<211> 2651
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<212> DNA
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<213> Aspergillus niger
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<400> 4
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\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2178
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<212> DNA
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<213> Aspergillus niger
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
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\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 725
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Aspergillus niger
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4501
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Aspergillus niger
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
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<211> 4702
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
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<213> Aspergillus niger
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
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\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
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<211> 3965
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<212> DNA
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<213> Aspergillus niger
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
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\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 10
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<211> 1497
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<212> DNA
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<213> Aspergillus niger
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<221> CDS
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<222> (1)..(1497)
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<400> 10
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<210> 11
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<211> 498
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<212> PRT
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<213> Aspergillus niger
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
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<211> 3697
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<212> DNA
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<213> Aspergillus niger
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<400> 12
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\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 13
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<211> 1497
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<212> DNA
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<213> Aspergillus niger
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<220>
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<221> CDS
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<222> (1)..(1497)
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<400> 13
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
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<211> 498
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<212> PRT
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<213> Aspergillus niger
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
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<211> 3570
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<212> DNA
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<213> Aspergillus niger
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
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<210> 16
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<211> 1518
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<212> DNA
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<213> Aspergillus niger
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<220>
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<221> CDS
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<222> (1)..(1518)
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<400> 16
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<210> 17
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<211> 2505
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<212> PRT
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<213> Aspergillus niger
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
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<210> 18
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<211> 2935
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<212> DNA
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<213> Penicillium chrysogenum
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<400> 18
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
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<211> 1977
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<212> DNA
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<213> Penicillium chrysogenum
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
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<222> (1)..(1977)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
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<211> 658
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<212> PRT
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<213> Penicillium chrysogenum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
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<211> 3605
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
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<213> Penicillium chrysogenum
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 21
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2157
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
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<213> Penicillium chrysogenum
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
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<221> CDS
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<222> (1)..(2157)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 718
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Penicillium chrysogenum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (22)
1. Método para aumentar la eficiencia de
integración direccionada de un polinucleótido en un sitio
predeterminado del genoma de una célula fúngica filamentosa con
preferencia para NHR, en donde dicho polinucleótido tiene una región
de homología con dicho sitio predeterminado, comprendiendo dicho
método proporcionar un mutante de una célula fúngica filamentosa
parental, en donde la relación de NHR/HR está reducida al menos en
un 50% en el mutante en comparación con dicha relación en dicho
organismo parental medida en las mismas condiciones, en donde el
mutante es, preferiblemente de modo inducible, deficiente en al
menos un componente implicado en NHR, y/o tiene una cantidad
reducida de al menos uno de dichos al menos un componente, en donde
dicho componente se selecciona del grupo constituido por homólogos
fúngicos filamentosos de levadura KU80, KU70, RAD50, MRE11, XRS2,
LIG4, SIR4, LIFL y NEIL.
2. El método de acuerdo con la reivindicación 1,
en donde un gen implicado en NHR ha sido reemplazado por una
variante no funcional.
3. El método de acuerdo con la reivindicación 1
ó 2, en donde el mutante tiene un nivel incrementado de un
componente implicado en HR.
4. El método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 3, en donde se utiliza una célula fúngica
filamentosa que tiene una relación NHR/HR menor que 50,
preferiblemente menor que 10, aún más preferiblemente menor que 1, y
muy preferiblemente menor que 0,001.
5. Un mutante de una célula fúngica filamentosa
parental, teniendo el organismo parental una preferencia para NHR,
en donde la relación de NHR/HR está reducida al menos en un 50% en
el mutante en comparación con dicha relación en dicho organismo
parental medida en las mismas condiciones, en donde el mutante es,
preferiblemente de modo inducible, deficiente en al menos un
componente implicado en NHR, y/o tiene una cantidad reducida de al
menos uno de dichos al menos un componente, en donde dicho
componente se selecciona del grupo constituido por homólogos
fúngicos filamentosos de levadura KU80, KU70, RAD50, MRE11, XRS2,
LIG4, SIR4, LIFL y NEIL.
6. La célula fúngica filamentosa mutante de
acuerdo con la reivindicación 5, en donde en el genoma del organismo
un gen implicado en NHR ha sido reemplazado por una variante no
funcional.
7. La célula fúngica filamentosa mutante de
acuerdo con la reivindicación 5 ó 6, en donde el mutante tiene un
nivel incrementado de un componente implicado en HR.
8. La célula fúngica filamentosa mutante de
acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, en donde
el mutante es un mutante recombinante.
9. El mutante de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 5 a 8 que tiene una relación NHR/HR menor que
50, preferiblemente menor que 10, aún más preferiblemente menor que
1, y muy preferiblemente menor que 0,001.
10. El mutante de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 5 a 8 en donde un camino no deseado se ha
modificado, preferiblemente por desactivación de genes.
11. La célula fúngica filamentosa mutante de
acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 10
transformada con un constructo de DNA que comprende una secuencia de
DNA que comprende un gen de interés que codifica un polipéptido de
interés.
12. La célula fúngica filamentosa mutante de
acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 11, en donde
la célula fúngica filamentosa es una especie de Aspergillus,
Penicillium o Trichoderma.
13. La célula fúngica filamentosa mutante de
acuerdo con la reivindicación 12, en donde el Aspergillus es
una especie de Aspergillus niger o una especie de
Aspergillus oryzae.
14. La célula fúngica filamentosa mutante de
acuerdo con la reivindicación 12, en donde el Penicillium es
una especie de Penicillium chrysogenum o Penicillium
citrinum.
15. Uso de la célula fúngica filamentosa de una
cualquiera de las reivindicaciones 5 a 14, para producir un
polipéptido de interés.
16. Uso de la célula fúngica filamentosa mutante
de una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 14, para producción de
un metabolito.
17. Uso de acuerdo con la reivindicación 16, en
donde el metabolito es un compuesto carotenoide o un compuesto de
beta-lactama.
\newpage
18. Método para producción de un polipéptido de
interés, que comprende:
- a)
- proporcionar un mutante de una célula fúngica filamentosa parental, en donde la relación de NHR/HR está reducida al menos en un 50 en el mutante en comparación con dicha relación en dicho organismo parental medida en las mismas condiciones, en donde el mutante es, preferiblemente de modo inducible, deficiente en al menos un componente implicado en NHR, y/o tiene una cantidad reducida de al menos uno de dichos al menos un componente, en donde dicho componente se selecciona del grupo constituido por homólogos fúngicos filamentosos de levadura KU80, KU70, RAD50, MRE11, XRS2, LIG4, SIR4, LIFL y NEIL,
- b)
- transformar el mutante obtenido en (a) con un constructo de DNA que comprende una secuencia de DNA que comprende un gen de interés que codifica un polipéptido de interés,
- c)
- cultivar la célula obtenida en (b) en condiciones que conducen a la producción del polipéptido de interés, y
- d)
- recuperar el polipéptido de interés.
\vskip1.000000\baselineskip
19. Un método para producir un metabolito en
donde se utiliza el hongo filamentoso de una cualquiera de las
reivindicaciones 5 a 14.
20. El método de acuerdo con la reivindicación
18 ó 19, en donde un gen implicado en NHR ha sido reemplazado por
una variante no funcional.
21. El método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 18 a 20, en donde el mutante tiene un nivel
incrementado de un componente implicado en HR.
22. El método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 18 a 21, en donde la célula fúngica filamentosa
mutante es una especie de Aspergillus, Penicillium o
Trichoderma.
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