JP2017532055A

JP2017532055A - 糸状真菌二重突然変異宿主細胞

Info

Publication number: JP2017532055A
Application number: JP2017522807A
Authority: JP
Inventors: 裕晃宇田川
Original assignee: ノボザイムスアクティーゼルスカブ
Priority date: 2014-10-29
Filing date: 2015-10-28
Publication date: 2017-11-02
Also published as: US20170313997A1; CN107075451A; EP3212768A1; WO2016066690A1

Abstract

本発明は、α−グルカン合成に関与する２つ以上のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが不活性化された、目的のポリペプチドを産生する突然変異糸状真菌宿主細胞；前記突然変異体におけるポリペプチドの生成方法並びにそのような突然変異体の構築方法に関する。

Description

配列表の参照
本出願は、コンピュータ読み取り可能な形態の配列表を含んでおり、これは本明細書において参照により援用される。

リポータタンパク質の発現を駆動する細胞壁ストレス誘導プロモータによる、糸状真菌における抗真菌化合物の同定のためのリポータ系が開示されており；このような誘導プロモータの１つが、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）ａｇｓＡプロモータであり；変性プライマーを用いた完全長ａｇｓＡ遺伝子ならびに他の真菌からのａｇｓ相同体の単離が記載されている（国際公開第０３／０２０９２２号パンフレット）。また、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）ａｇｓＡにおけるａｇｓＡの不活性化も記載されている（ＤａｍｖｅｌｄＲ．ｅｔａｌ．２００４．ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆａｇｓＡ，ｏｎｅｏｆｆｉｖｅ１，３−ａｌｐｈａ−Ｄ−ｇｌｕｃａｎｓｙｎｔｈａｓｅ−ｅｎｃｏｄｉｎｇｇｅｎｅｓｉｎＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ，ｉｓｉｎｄｕｃｅｄｉｎｒｅｓｐｏｎｓｅｔｏｃｅｌｌｗａｌｌｓｔｒｅｓｓ．ＦｕｎｇａｌＧｅｎｅｔｉｃｓａｎｄＢｉｏｌｏｇｙ４２（２００５）１６５−１７７）。

また、５つの１，３−α−Ｄ−グルカンシンターゼコード遺伝子のもう１つのａｇｓＥが欠失したアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）突然変異体も開示されている；このような突然変異体において、グルコースオキシダーゼ、ホスホリパーゼＡ２およびリパーゼ発現が改善されることが報告されている（国際公開第２０１４／０１３０７４号パンフレット）。

本発明は、α−グルカン合成に関与する２つ以上のポリペプチドが不活性化された糸状真菌発現宿主に関する。

本発明者らは、対象の酵素の生産性を高めることに関心を有し、文献に報告されていることとは反対に、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）のＡｇｓＡまたはＡｇｓＥを不活性化した単一突然変異体が、彼らが試験したプロテアーゼの低い発現をもたらすことを見出した（以下に示す）。しかし、本発明者らが驚いたことに、二重突然変異体は、有意に高いプロテアーゼ発現をもたらした（以下に示す）。

従って、第１の態様では、本発明は、対象のポリペプチドを産生する突然変異糸状真菌宿主細胞に関し、ここで、α−グルカン合成に関与する２つ以上のポリペプチドをコードする２つ以上のポリヌクレオチドが不活性化され、前記２つ以上のポリペプチドは、以下のものからなる群から選択される：
（ａ）配列番号３のアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）ＡｇｓＡポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、α−グルカン合成に関与するポリペプチド、および配列番号６のアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）ＡｇｓＥポリペプチドと少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、α−グルカン合成に関与するポリペプチド；
（ｂ）（ｉ）配列番号１のアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）ａｇｓＡゲノムヌクレオチド配列と少なくとも７０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むゲノムポリペプチド、および配列番号４のアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）ａｇｓＥゲノムヌクレオチド配列と少なくとも７０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むゲノムポリヌクレオチドによりコードされる、α−グルカン合成に関与するポリペプチド；または
（ｉｉ）（ｉ）配列番号２および配列番号５にそれぞれ示すｃＤＮＡヌクレオチド配列；ならびに
（ｃ）中度の緊縮条件下で、以下：
（Ｉ）それぞれ、配列番号１のアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）ａｇｓＡゲノムヌクレオチド配列および配列番号４のアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）ａｇｓＥゲノムヌクレオチド配列と；
（ＩＩ）（Ｉ）配列番号２および配列番号５にそれぞれ示すｃＤＮＡヌクレオチド配列と、または
（ＩＩＩ）（Ｉ）もしくは（ＩＩ）の完全長補体と
ハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされる、α−グルカン合成に関与する２つのポリペプチド。

第２の態様では、本発明は、突然変異糸状真菌宿主細胞において対象のポリペプチドを生成する方法に関し、前記方法は、以下：
（ａ）対象のポリペプチドの産生を促す条件下で、本発明の第１の態様で定義した通りの突然変異糸状真菌宿主細胞を培養するステップ；および、任意選択で、
（ｂ）対象のポリペプチドを回収するステップ
を含む。

第３の態様では、本発明は、突然変異した糸状真菌宿主細胞を構築する方法に関し、前記方法は、糸状真菌宿主細胞において２つ以上のポリペプチドをそれぞれコードする２つ以上のポリヌクレオチドを不活性化するステップを含み、上記２つ以上のポリペプチドは、以下のものからなる群から選択される：
（ａ）配列番号３のアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）ＡｇｓＡポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、α−グルカン合成に関与するポリペプチド、および配列番号６のアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）ＡｇｓＥポリペプチドと少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、α−グルカン合成に関与するポリペプチド；
（ｂ）（ｉ）配列番号１のアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）ａｇｓＡゲノムヌクレオチド配列と少なくとも７０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むゲノムポリペプチド、および配列番号４のアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）ａｇｓＥゲノムヌクレオチド配列と少なくとも７０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むゲノムポリヌクレオチドによりコードされる、α−グルカン合成に関与するポリペプチド；または
（ｉｉ）（ｉ）配列番号２および配列番号５にそれぞれ示すｃＤＮＡヌクレオチド配列；ならびに
（ｃ）中度の緊縮条件下で、以下：
（Ｉ）それぞれ、配列番号１のアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）ａｇｓＡゲノムヌクレオチド配列および配列番号４のアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）ａｇｓＥゲノムヌクレオチド配列と；
（ＩＩ）（Ｉ）配列番号２および配列番号５にそれぞれ示すｃＤＮＡヌクレオチド配列と、または
（ＩＩＩ）（Ｉ）もしくは（ＩＩ）の完全長補体と
ハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされる、α−グルカン合成に関与する２つのポリペプチド。

以下の実施例で使用される株の構築戦略の図を示す。プラスミドｐＨＵｄａ１６８５の概略マップを示す。プラスミドｐＨＵｄａ１７０１の概略マップを示す。プラスミドｐＨＵｄａ１６５７の概略マップを示す。プラスミドｐＨＵｄａ１６９４の概略マップを示す。

定義
ｃＤＮＡ：「ｃＤＮＡ」という用語は、真核細胞または原核細胞から得られる成熟したスプライシングされたｍＲＮＡ分子からの逆転写により調製されることが可能であるＤＮＡ分子を意味する。ｃＤＮＡは、対応するゲノムＤＮＡ中に存在し得るイントロン配列を欠いている。初期の一次ＲＮＡ転写物は、成熟型のスプライシングされたｍＲＮＡとして出現する前にスプライシングを含む一連のステップを介して処理されるｍＲＮＡの前駆体である。

コード配列：「コード配列」という用語は、ポリペプチドのアミノ酸配列を直接規定するポリヌクレオチドを意味する。コード配列の境界は、一般に、オープンリーディングフレームによって決定されるが、これは、ＡＴＧ、ＧＴＧ、またはＴＴＧなどの開始コドンで開始し、ＴＡＡ、ＴＡＧ、またはＴＧＡなどの終止コドンで終了する。コード配列は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ、またはこれらの組合せのいずれであってもよい。

核酸構築物：「核酸構築物」という用語は、一本鎖または二本鎖いずれかの核酸分子を意味し、これは、天然の遺伝子から単離されるか、もしくは、そうでなければ自然に存在しないであろう様式で核酸のセグメントを含有するよう修飾されるか、または、合成物であり、これは、１つまたは複数の制御配列を含む。

作動可能にリンクされた：「作動可能にリンクされた」という用語は、制御配列がコード配列の発現を指令するように、ポリヌクレオチドのコード配列に対して適切な位置に制御配列を配置する構造を意味する。

制御配列：「制御配列」という用語は、本発明の成熟型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現に必要な核酸配列を意味する。各制御配列は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに対して在来（すなわち、同じ遺伝子に由来する）もしくは外来の（すなわち、異なる遺伝子に由来する）ものであっても、または、相互に在来もしくは外来のものであってもよい。このような制御配列としては、これらに限定されないが、リーダ、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、プロモータ、シグナルペプチド配列、および転写ターミネータが挙げられる。少なくとも、制御配列は、プロモータ、ならびに、転写および翻訳終止シグナルを含む。制御配列は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのコード領域と制御配列の連結を促進させる特定の制限部位を導入する目的で、リンカーを備えていてもよい。

発現：「発現」という用語は、限定するものではないが、転写、転写後修飾、翻訳、翻訳後修飾および分泌物を含むポリペプチドの生成に関与するいずれかのステップを含む。

発現ベクター：「発現ベクター」という用語は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、また、その発現をもたらす制御配列に作動可能にリンクされている直鎖または環状ＤＮＡ分子を含む。

宿主細胞：「宿主細胞」という用語は、本発明のポリヌクレオチドを含む核酸構築物または発現ベクターによる形質転換、形質移入、形質導入などに対する感受性を有するあらゆる細胞型を意味する。「宿主細胞」という用語は、複製の最中に生じる突然変異による親細胞と同じではない親細胞のあらゆる子孫を包含する。

単離された：「単離された」という用語は、自然界においては生じない形態または環境にある物質を意味する。単離された物質の非限定的な例としては、（１）いずれかの非天然物質、（２）限定するものではないが、自然界において関連している天然構成成分の１種または複数種もしくは全てから少なくとも部分的に取り出されたいずれかの酵素、変異体、核酸、タンパク質、ペプチドもしくは補因子を含むいずれかの物質；（３）自然界において見出される物質に対して人為的に修飾されたいずれかの物質；または、（４）自然界で関連する他の成分に対して物質量の増加により修飾されたいずれかの物質（例えば、宿主細胞中の組み換え産物；物質をコードする遺伝子の複数のコピー；物質をコードする遺伝子と自然界で関連するプロモータより強力なプロモータの使用）が挙げられる。単離された物質は、発酵ブロスサンプル中に存在してもよい。

非常に高度の緊縮条件：「非常に高度の緊縮条件」という用語は、長さが少なくとも１００ヌクレオチドのプローブに関して、１２〜２４時間の標準的なサザンブロッティング法に続く、４２℃、５×ＳＳＰＥ、０．３％ＳＤＳ、２００マイクログラム／ｍｌ断片処理および修飾済みのサケ精子ＤＮＡ、ならびに、５０％ホルムアミドでのプレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションを意味する。キャリア材料は、最終的に、２×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳを用いて、７０℃で１５分間ずつ３回洗浄される。

高度の緊縮条件：「高度の緊縮条件」という用語は、長さが少なくとも１００ヌクレオチドのプローブに関して、１２〜２４時間の標準的なサザンブロッティング法に続く、４２℃、５×ＳＳＰＥ、０．３％ＳＤＳ、２００マイクログラム／ｍｌ断片処理および修飾済みのサケ精子ＤＮＡ、ならびに、５０％ホルムアミドでのプレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションを意味する。キャリア材料は、最終的に、２×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳを用いて、６５℃で１５分間ずつ３回洗浄される。

中度−高度の緊縮条件：「中−高度の緊縮条件」という用語は、長さが少なくとも１００ヌクレオチドのプローブに関して、１２〜２４時間の標準的なサザンブロッティング法に続く、４２℃、５×ＳＳＰＥ、０．３％ＳＤＳ、２００マイクログラム／ｍｌ断片処理および修飾済みのサケ精子ＤＮＡ、ならびに、３５％ホルムアミドでのプレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションを意味する。キャリア材料は、最終的に、２×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳを用いて、６０℃で１５分間ずつ３回洗浄される。

低度の緊縮条件：「低度の緊縮条件」という用語は、長さが少なくとも１００ヌクレオチドのプローブに関して、１２〜２４時間の標準的なサザンブロッティング法に続く、４２℃、５×ＳＳＰＥ、０．３％ＳＤＳ、２００マイクログラム／ｍｌ断片処理および修飾済みのサケ精子ＤＮＡ、ならびに、２５％ホルムアミドでのプレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションを意味する。キャリア材料は、最終的に、２×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳを用いて、５０℃で１５分間ずつ３回洗浄される。

極めて低度の緊縮条件：「極めて低度の緊縮条件」という用語は、長さが少なくとも１００ヌクレオチドのプローブに関して、１２〜２４時間の標準的なサザンブロッティング法に続く、４２℃、５×ＳＳＰＥ、０．３％ＳＤＳ、２００マイクログラム／ｍｌ断片処理および修飾済みのサケ精子ＤＮＡ、ならびに、２５％ホルムアミドでのプレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションを意味する。キャリア材料は、最終的に、２×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳを用いて、４５℃で１５分間ずつ３回洗浄される。

配列同一性：２つのアミノ酸配列間または２つのヌクレオチド配列間の関連性は、「配列同一性」というパラメータによって表される。

本発明の目的のために、２つのアミノ酸配列間の配列同一性の程度は、好ましくはバージョン５．０．０以降のＥＭＢＯＳＳパッケージ（ＥＭＢＯＳＳ：ＴｈｅＥｕｒｏｐｅａｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙＯｐｅｎＳｏｆｔｗａｒｅＳｕｉｔｅ，Ｒｉｃｅｅｔａｌ．，２０００，ＴｒｅｎｄｓＧｅｎｅｔ．１６：２７６−２７７）のＮｅｅｄｌｅプログラムにおいて実装されている、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（ＮｅｅｄｌｅｍａｎａｎｄＷｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３）を用いて判定される。用いられるパラメータは、１０のギャップオープンペナルティ、０．５のギャップエクステンションペナルティおよびＥＢＬＯＳＵＭ６２（ＢＬＯＳＵＭ６２のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換マトリックスである。Ｎｅｅｄｌｅ標識された「最長の同一性」（−ｎｏｂｒｉｅｆオプションを用いて得られる）の出力が同一性割合として用いられ、以下のように算出される：
（同等の残基×１００）／（アラインメントの長さ−アラインメント中のギャップの総数）

本発明の目的のために、２つのデオキシリボヌクレオチド配列間の配列同一性の程度は、好ましくはバージョン５．０．０以降のＥＭＢＯＳＳパッケージ（前述のＥＭＢＯＳＳ：ＴｈｅＥｕｒｏｐｅａｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙＯｐｅｎＳｏｆｔｗａｒｅＳｕｉｔｅ，Ｒｉｃｅｅｔａｌ．，２０００）のＮｅｅｄｌｅプログラムにおいて実装されている、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（前述のＮｅｅｄｌｅｍａｎａｎｄＷｕｎｓｃｈ，１９７０）を用いて判定される。用いられるパラメータは、１０のギャップオープンペナルティ、０．５のギャップエクステンションペナルティおよびＥＤＮＡＦＵＬＬ（ＮＣＢＩＮＵＣ４．４のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換マトリックスである。Ｎｅｅｄｌｅ標識された「最長の同一性」（−ｎｏｂｒｉｅｆオプションを用いて得られる）の出力が同一性割合として用いられ、以下のように算出される：
（同等のデオキシリボヌクレオチド×１００）／（アラインメントの長さ−アラインメント中のギャップの総数）

α−グルカン合成に関与する：「α−グルカン合成に関与する」という用語は、このように関与するポリヌクレオチドが、α−グルカン、特にα−Ｄ−グルカンの合成に参加する酵素をコードすることを意味する。本発明に関連して、好ましいコードされたポリペプチドは、１，３α−Ｄ−グルカンシンターゼ、最も好ましくは、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）由来のＡｇｓＡおよびＡｇｓＥまたはそれらの対立遺伝子相同体もしくは変異体である。

上の発明の概要に既に概説したように、本発明の第１の態様は、対象のポリペプチドを産生する突然変異糸状真菌宿主細胞に関し、ここで、α−グルカン合成に関与する２つ以上のポリペプチドをコードする２つ以上のポリヌクレオチドが不活性化されており、第２の態様は、第１の態様で定義した通りの突然変異宿主細胞において対象のポリペプチドを生成する方法に関し、また、第３の態様は、突然変異糸状真菌宿主細胞を構築する方法に関する。

本発明の態様は全て、糸状真菌宿主細胞においてα−グルカン合成に関与する２つ以上のポリペプチドをコードする２つ以上のポリヌクレオチドの不活性化を必要とし、前記２つ以上のポリペプチドは、以下のものからなる群から選択される：
（ａ）配列番号３のアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）ＡｇｓＡポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも６０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、α−グルカン合成に関与するポリペプチド、および配列番号６のアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）ＡｇｓＥポリペプチドと少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、α−グルカン合成に関与するポリペプチド；好ましくは、各ポリペプチドは、それぞれ、配列番号３または６に対して、少なくとも６５％、例えば、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％の配列同一性を有する。一態様では、ポリペプチドは、それぞれ、配列番号３または６のポリペプチドと、１０以下、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０アミノ酸だけ異なる。アミノ酸変異は、副次的な性質のものであってもよく、すなわち、タンパク質の折り畳みおよび／もしくは活性に顕著に影響しない保存的アミノ酸置換もしくは挿入；小さな欠失、アミノ−端子メチオニン残基などの小さなアミノ−もしくはカルボキシル−末端伸長；小さなリンカーペプチド；あるいは、正味電荷または他の機能、例えば、ポリヒスチジン配列、抗原性エピトープもしくは結合性ドメインなどを変化させることによって精製を促進させる小さな伸長であってもよく；
（ｂ）（ｉ）配列番号１のアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）ａｇｓＡゲノムヌクレオチド配列と少なくとも６０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むゲノムポリペプチド、および配列番号４のアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）ａｇｓＥゲノムヌクレオチド配列と少なくとも６０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むゲノムポリヌクレオチドによりコードされる、α−グルカン合成に関与するポリペプチド；好ましくは、各ゲノムポリヌクレオチドは、それぞれ、配列番号１または４に対して、少なくとも６５％、例えば、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％の配列同一性を有する。一態様では、ポリヌクレオチドは、それぞれ、配列番号１または４のポリヌクレオチドと、１０以下、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０ヌクレオチドだけ異なり、または
（ｉｉ）（ｉ）配列番号２のアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）ａｇｓＡｃＤＮＡヌクレオチド配列と少なくとも６０％の配列同一性を有するｃＤＮＡヌクレオチド配列、および配列番号５のアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）ａｇｓＥｃＤＮＡヌクレオチド配列と少なくとも６０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによりコードされる、α−グルカン合成に関与するポリペプチド；好ましくは、各ｃＤＮＡポリヌクレオチドは、それぞれ、配列番号２または５に対して、少なくとも６５％、例えば、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％の配列同一性を有する。一態様では、ポリヌクレオチドは、それぞれ、配列番号２または５のポリヌクレオチドと、１０以下、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０ヌクレオチドだけ異なり；ならびに
（ｃ）極めて低度、低度、中度、中−高度、高度もしくは極めて高度の緊縮条件下で、以下：
（Ｉ）それぞれ、配列番号１のアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）ａｇｓＡゲノムヌクレオチド配列および配列番号４のアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）ａｇｓＥゲノムヌクレオチド配列と；
（ＩＩ）（Ｉ）配列番号２および配列番号５にそれぞれ示すｃＤＮＡヌクレオチド配列と、または
（ＩＩＩ）（Ｉ）もしくは（ＩＩ）の完全長補体と
ハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされる、α−グルカン合成に関与する２つのポリペプチド。（Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．，１９８９，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，２ｄｅｄｉｔｉｏｎ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，ＮｅｗＹｏｒｋ）。

本発明の好ましい実施形態では、２つ以上のポリヌクレオチドは、配列番号３のアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）ＡｇｓＡポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列若しくはその対立遺伝子変異体を含むか、またはそれから構成される、α−グルカン合成に関与するポリペプチド、および配列番号６のアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）ＡｇｓＥポリペプチドと少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列若しくはその対立遺伝子変異体を含むか、またはそれから構成される、α−グルカン合成に関与するポリペプチドをコードする。別の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３もしくは６の成熟型ポリペプチドを含むか、またはそれから構成される。

配列番号１または２のポリヌクレオチドもしくはそのサブ配列および配列番号３のポリペプチドもしくはその断片、ならびに配列番号４または５のポリヌクレオチドもしくはそのサブ配列、配列番号６のポリペプチドもしくはその断片は、当技術分野で公知の方法に従い、様々な属または種の株由来のα−グルカン合成に関与するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを同定し、クローン化するための核酸プローブの設計に用いられ得る。特に、このようなプローブは、標準的なサザンブロッティング法の後に、含まれる対応する遺伝子を同定および単離するために、対象の細胞のゲノムＤＮＡもしくはｃＤＮＡとのハイブリダイゼーションに用いられることができる。このようなプローブは、配列全体よりかなり短くてよいが、少なくとも１５、例えば、少なくとも２５、少なくとも３５、または少なくとも７０ヌクレオチドと、少なくとも１５ヌクレオチドの長さであるべきである。好ましくは、核酸プローブは、例えば、少なくとも２００ヌクレオチド、少なくとも３００ヌクレオチド、少なくとも４００ヌクレオチド、少なくとも５００ヌクレオチド、少なくとも６００ヌクレオチド、少なくとも７００ヌクレオチド、少なくとも８００ヌクレオチド、または少なくとも９００ヌクレオチドといった、少なくとも１００ヌクレオチドの長さである。ＤＮＡおよびＲＮＡのいずれを用いてもよい。プローブは、典型的には、対応する遺伝子を検出するために標識化される（例えば、^３２Ｐ、^３Ｈ、^３５Ｓ、ビオチンまたはアビジンで）。このようなプローブは本発明によって包含される。

このような他の系統から調製したゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリは、上記のプローブとハイブリダイズし、α−グルカン合成に関与するポリペプチドをコードするＤＮＡについてスクリーニングされ得る。このような他の系統由来のゲノムまたは他のＤＮＡは、アガロースもしくはポリアクリルアミドゲル電気泳動、または、他の分離技術によって分離され得る。これらのライブラリからのＤＮＡまたは分離されたＤＮＡが、ニトロセルロースもしくは他の好適なキャリア材料に移され、固定化され得る。ハイブリダイズするクローンまたはＤＮＡを同定するために、キャリア材料がサザンブロッティングに用いられる。

本発明の目的に関して、ハイブリダイゼーションとは、極めて低度〜極めて高度の緊縮条件下で、（ｉ）配列番号１もしくは４；（ｉｉ）配列番号１もしくは４の成熟型ポリペプチドコード配列；（ｉｉｉ）配列番号２もしくは５に示されるｃＤＮＡ配列；（ｉｖ）その完全長相補体；または（ｖ）そのサブ配列に対応する標識核酸プローブに、ポリヌクレオチドがハイブリダイズすることを意味する。核酸プローブがこれらの条件下でハイブリダイズする分子は、例えば、Ｘ線フィルムまたは当技術分野では公知の他のいずれかの検出手段によって検出することができる。

保存的アミノ酸置換の例は、塩基性アミノ酸（アルギニン、リシンおよびヒスチジン）、酸性アミノ酸（グルタミン酸およびアスパラギン酸）、極性アミノ酸（グルタミンおよびアスパラギン）、疎水性アミノ酸（ロイシン、イソロイシンおよびバリン）、芳香族アミノ酸（フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシン）、および、小さいアミノ酸（グリシン、アラニン、セリン、スレオニンおよびメチオニン）の群の範囲内である。特異活性を一般に改変しないアミノ酸置換は技術分野において公知であり、例えば、Ｈ．ＮｅｕｒａｔｈａｎｄＲ．Ｌ．Ｈｉｌｌ，１９７９，Ｉｎ，ＴｈｅＰｒｏｔｅｉｎｓ，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋに記載されている。頻繁に生じる置換は、Ａｌａ／Ｓｅｒ、Ｖａｌ／Ｉｌｅ、Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｇｌｙ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｓｎ、Ａｌａ／Ｖａｌ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ｔｙｒ／Ｐｈｅ、Ａｌａ／Ｐｒｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｌｅｕ／Ｖａｌ、Ａｌａ／ＧｌｕおよびＡｓｐ／Ｇｌｙである。

単一もしくは複数のアミノ酸置換、欠失、および／または挿入は、Ｒｅｉｄｈａａｒ−ＯｌｓｏｎａｎｄＳａｕｅｒ，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ２４１：５３−５７；ＢｏｗｉｅａｎｄＳａｕｅｒ，１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６：２１５２−２１５６；国際公開第９５／１７４１３号パンフレット；または、国際公開第９５／２２６２５号パンフレットにより開示されているものなどの公知の突然変異誘発方法、組換え法、および／または、シャッフリング法、これに続く関連するスクリーニング法を用いて行い、テストすることが可能である。用いられることが可能である他の方法としては、エラープローンＰＣＲ、ファージディスプレイ（例えば、Ｌｏｗｍａｎｅｔａｌ．，１９９１，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３０：１０８３２−１０８３７；米国特許第５，２２３，４０９号明細書；国際公開第９２／０６２０４号パンフレット）、および、領域特異的突然変異誘発（Ｄｅｒｂｙｓｈｉｒｅｅｔａｌ．，１９８６，Ｇｅｎｅ４６：１４５；Ｎｅｒｅｔａｌ．，１９８８，ＤＮＡ７：１２７）が挙げられる。

突然変異誘発／シャッフリング法は、宿主細胞によって発現されたクローン化突然変異誘発ポリペプチドの活性を検出するために、高スループット自動スクリーニング法と組み合わせることが可能である（Ｎｅｓｓｅｔａｌ．，１９９９，ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１７：８９３−８９６）。活性ポリペプチドをコードする突然変異誘発ＤＮＡ分子は、宿主細胞から回収可能であり、技術分野における標準的な方法を用いて直ぐに配列決定されることが可能である。これらの方法では、ポリペプチドにおける個別のアミノ酸残基の重要性を直ぐに判定することが可能である。

ポリヌクレオチド
本発明は、また、本明細書に記載される通り、α−グルカン合成に関与するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの不活性化に関する。

ポリヌクレオチドの単離またはクローン化に用いられる技術は技術分野において公知であり、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡからの単離、または、これらの組み合わせが含まれる。ゲノムＤＮＡからのポリヌクレオチドのクローン化は、例えば、発現ライブラリの周知のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）または抗体スクリーニングを用いて共有される構造機構を伴うクローン化されたＤＮＡ断片を検出することにより実施されることが可能である。例えば、Ｉｎｎｉｓｅｔａｌ．，１９９０，ＰＣＲ：ＡＧｕｉｄｅｔｏＭｅｔｈｏｄｓａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋを参照のこと。リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、連結活性化転写（ＬＡＴ）およびポリヌクレオチドベース増幅（ＮＡＳＢＡ）などの他の核酸増幅法が用いられ得る。ポリヌクレオチドは、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）の系統、または、関連する生体からクローン化され得、それ故、例えば、ポリヌクレオチドの領域をコードするポリペプチドの対立形質もしくは種変異体であり得る。

本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの修飾は、ポリペプチドに実質的に類似するポリペプチドを合成するのに必要であり得る。ポリペプチドに「実質的に同様」という用語は、ポリペプチドの非天然形態を指す。これらのポリペプチドは、天然のソースから単離されたポリペプチドとはいくらかの操作法で異なっていてもよく、例えば、特異活性、耐熱性、至適ｐＨなどが異なる変異体である。変異体は、配列番号１もしくは４のポリペプチドコード配列として表されるポリヌクレオチドに基づいて；または配列番号２もしくは５（例えば、そのサブ配列）におけるｃＤＮＡに基づいて構築され得、および／または、ポリペプチドのアミノ酸配列に変化をもたらさないが、酵素の生成のために意図される宿主生体のコドン利用に対応するヌクレオチド置換の導入により、または、異なるアミノ酸配列をもたらし得るヌクレオチド置換の導入により構築され得る。ヌクレオチド置換の概要については、例えば、Ｆｏｒｄｅｔａｌ．，１９９１，ＰｒｏｔｅｉｎＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ２：９５−１０７を参照のこと。

ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの不活性化または除去
本発明の様々な態様および実施形態は全て、糸状真菌宿主細胞においてα−グルカン合成に関与する２つ以上のポリペプチドをコードする２つ以上のポリヌクレオチドの不活性化を必要とする。

このような不活性化は、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもしくはその一部を破壊するか、または欠失させることにより達成することができ、これによって、同じ条件下で培養したとき、親細胞より少ないポリペプチドを産生する突然変異細胞が得られる。

突然変異細胞は、当技術分野で公知の方法、例えば、挿入、破壊、置換、または欠失を用いて、ポリヌクレオチドの発現を排除することによって構築することができる。好ましい態様では、ポリヌクレオチドは不活性化される。不活性化しようとするポリヌクレオチドは、例えば、活性に不可欠なコード領域もしくはその部分、またはコード領域の発現に必要な調節エレメントであってもよい。このような調節または制御配列の例は、プロモータ配列またはその機能性部分、すなわち、ポリヌクレオチドの発現に作用する上で十分な部分であってよい。不活性化が考えられる他の制御配列として、限定するものではないが、リーダ、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、シグナルペプチド配列、転写ターミネータ、および転写アクチベータが挙げられる。

ポリヌクレオチドの不活性化は、親配列を突然変異誘発に付し、ポリヌクレオチドの発現が排除された突然変異細胞を選択することにより実施され得る。突然変異誘発は、特異的またはランダムのいずれであってもよく、例えば、物理的もしくは化学的突然変異誘発因子の使用、好適なオリゴヌクレオチドの使用、またはＤＮＡ配列をＰＣＲ突然変異誘発に付すことにより、実施され得る。さらに、突然変異誘発は、これらの突然変異誘発因子の任意の組み合わせの使用により実施してもよい。

本発明の目的に好適な物理的または化学的突然変異誘発因子の例としては、紫外線（ＵＶ）照射、ヒドロキシルアミン、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）、Ｏ−メチルヒドロキシルアミン、亜硝酸、メタンスルホン酸エチル（ＥＭＳ）、亜硫酸水素ナトリウム、ギ酸、およびヌクレオチド類似体が挙げられる。

このような因子が使用される場合、突然変異誘発は、典型的に、好適な条件下、突然変異誘発しようとする親細胞を最適な突然変異誘発因子の存在下でインキュベートし、当該遺伝子の発現を示さない突然変異細胞をスクリーニングおよび／または選択することにより、実施される。

ポリヌクレオチドの不活性化は、当該遺伝子、またはその転写もしくは翻訳に必要な調節エレメントにおける１つまたは複数のヌクレオチドの挿入、置換、もしくは欠失によって達成され得る。例えば、終止コドンの導入、開始コドンの除去、またはオープンリーディングフレーム内の変更をもたらすように、ヌクレオチドを挿入または除去することができる。このような不活性化は、当技術分野で公知の方法に従って、部位特異的突然変異誘発またはＰＣＲ突然変異誘発により達成され得る。原則として、不活性化は、ｉｎｖｉｖｏで、すなわち、不活性化しようとするポリヌクレオチドを発現する細胞に対し直接、実施してよいが、以下に例示するように、ｉｎｖｉｔｒｏで実施するのが好ましい。

ポリヌクレオチドの発現を排除するための好都合な方法の一例は、遺伝子置換、遺伝子欠失、または遺伝子破壊の技術に基づく。例えば、遺伝子破壊方法では、内因性ポリヌクレオチドに対応する核酸配列をｉｎｖｉｔｒｏで突然変異させて、欠陥核酸配列を生成した後、これを親細胞に形質転換することにより、欠陥遺伝子を生成する。相同組換えにより、内因性ポリヌクレオチドを欠陥核酸配列で置換する。欠陥ポリヌクレオチドもマーカをコードするのが望ましい場合もあり、ポリヌクレオチドが修飾または破壊されている形質転換体の選択のために、このマーカを使用することができる。一態様では、ポリヌクレオチドは、本明細書に記載するものなどの選択マーカによって破壊する。

本発明はさらに、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはその制御配列の破壊もしくは欠失、またはポリペプチドをコードする抑制遺伝子を含む親細胞の突然変異細胞に関し、これにより、親細胞と比較して少ないポリペプチドを産生するか、またはポリペプチドを一切産生しない突然変異細胞が得られる。

ポリペプチド欠失突然変異細胞は、ネイティブおよび異種ポリペプチドの発現のための宿主細胞として特に有用である。従って、本発明はさらに、ネイティブまたは異種ポリペプチドを生成する方法にも関し、これは、（ａ）ポリペプチドの産生を促す条件下で突然変異細胞を培養するステップ；および（ｂ）ポリペプチドを回収するステップを含む。「異種ポリペプチド」という用語は、宿主細胞に対してネイティブではないポリペプチド、例えば、ネイティブタンパク質の変異体を意味する。宿主細胞は、ネイティブまたは異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの２つ以上のコピーを含み得る。

本発明の好ましい実施形態では、２つ以上のポリヌクレオチドの不活性化は、２つ以上のポリヌクレオチドおよび／またはそれぞれのプロモータの突然変異により；好ましくは、宿主細胞のゲノムからの２つ以上のポリヌクレオチドおよび／またはそれぞれのプロモータの部分的もしくは完全な欠失により、実施する。

核酸構築物
本発明はまた、制御配列と適合性の条件下で、好適な宿主細胞におけるコード配列の発現を指令する１つまたは複数の制御配列に作動可能にリンクされた、本発明の対象のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸構築物にも関する。

ポリヌクレオチドは、対象のポリペプチドの発現をもたらすために様々な方法で操作してもよい。ベクターに挿入する前のポリヌクレオチドの操作は、発現ベクターに応じて望ましいか、または必要となり得る。組換えＤＮＡ法を使用してポリヌクレオチドを修飾する技術は、当技術分野で公知である。

制御配列は、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現のための宿主細胞によって認識されるポリヌクレオチドであるプロモータであり得る。プロモータは、ポリペプチドの発現を媒介する転写制御配列を含有する。プロモータは、ミュータント、切断およびハイブリッドプロモータを含む宿主細胞において転写活性を示すいずれかのポリヌクレオチドであり得、ならびに、宿主細胞に対して相同性または非相同性である細胞外または細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から得られ得る。

糸状真菌宿主細胞において本発明の核酸構築物の転写を指令する好適なプロモータの例としては、以下：アスペルギルス・ニズランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｄｕｌａｎｓ）アセトアミダーゼ、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）中性α−アミラーゼ、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）酸安定α−アミラーゼ、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）またはアスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓａｗａｍｏｒｉ）グルコアミラーゼ（ｇｌａＡ）、アスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡアミラーゼ、アスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｒｙｚａｅ）アルカリ性タンパク分解酵素、アスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｒｙｚａｅ）トリオースリン酸イソメラーゼ、フザリウム・オキシスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）トリプシン様プロテアーゼ（国際公開第９６／００７８７号パンフレット）、フザリウム・ベネナツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍｖｅｎｅｎａｔｕｍ）アミログルコシダーゼ（国際公開第００／５６９００号パンフレット）、フザリウム・ベネナツム・ダリア（ＦｕｓａｒｉｕｍｖｅｎｅｎａｔｕｍＤａｒｉａ）（国際公開第００／５６９００号パンフレット）、フザリウム・ベネナツム・クイン（ＦｕｓａｒｉｕｍｖｅｎｅｎａｔｕｍＱｕｉｎｎ）（国際公開第００／５６９００号パンフレット）、リゾムコール・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒｍｉｅｈｅｉ）リパーゼ、リゾムコール・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒｍｉｅｈｅｉ）アスパラギン酸プロテイナーゼ、トリコデルマ・レエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｒｅｅｓｅｉ）β−グルコシダーゼ、トリコデルマ・レエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｒｅｅｓｅｉ）セロビオヒドロラーゼＩ、トリコデルマ・レエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｒｅｅｓｅｉ）セロビオヒドロラーゼＩＩ、トリコデルマ・レエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｒｅｅｓｅｉ）エンドグルカナーゼＩ、トリコデルマ・レエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｒｅｅｓｅｉ）エンドグルカナーゼＩＩ、トリコデルマ・レエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｒｅｅｓｅｉ）エンドグルカナーゼＩＩＩ、トリコデルマ・レエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｒｅｅｓｅｉ）エンドグルカナーゼＶ、トリコデルマ・レエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｒｅｅｓｅｉ）キシラナーゼＩ、トリコデルマ・レエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｒｅｅｓｅｉ）キシラナーゼＩＩ、トリコデルマ・レエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｒｅｅｓｅｉ）キシラナーゼＩＩＩ、トリコデルマ・レエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｒｅｅｓｅｉ）β−キシロシダーゼ、およびトリコデルマ・レエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｒｅｅｓｅｉ）翻訳伸長因子、ならびに、ＮＡ２−ｔｐｉプロモータ（非翻訳リーダが、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）トリオースリン酸イソメラーゼ遺伝子由来の非翻訳リーダで置換された、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）中性α−アミラーゼ遺伝子由来の修飾プロモータ；非限定的例としては、非翻訳リーダがアスペルギルス・ニズランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｄｕｌａｎｓ）またはアスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｒｙｚａｅ）トリオースリン酸イソメラーゼ遺伝子由来の非翻訳リーダで置換された、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）中性α−アミラーゼ遺伝子由来の修飾プロモータが挙げられる）の遺伝子から得られるプロモータ；ならびに、その突然変異体、切断およびハイブリッドプロモータがある。その他のプロモータは、米国特許第６，０１１，１４７号明細書に記載されている。

制御配列はまた、宿主細胞によって認識されて転写を終結させる転写ターミネータであり得る。ターミネータは、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの３’−末端に作動可能にリンクする。本発明においては、宿主細胞において機能するいずれかのターミネータが用いられ得る。

糸状真菌宿主細胞の好ましいターミネータは、下記の遺伝子から得られる：アスペルギルス・ニズランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｄｕｌａｎｓ）アセトアミダーゼ、アスペルギルス・ニズランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｄｕｌａｎｓ）アントラニル酸シンターゼ、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）グルコアミラーゼ、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）α−グルコシダーゼ、アスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡアミラーゼ、フザリウム・オキシスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）トリプシン様プロテアーゼ、トリコデルマ・レエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｒｅｅｓｅｉ）β−グルコシダーゼ、トリコデルマ・レエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｒｅｅｓｅｉ）セロビオヒドロラーゼＩ、トリコデルマ・レエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｒｅｅｓｅｉ）セロビオヒドロラーゼＩＩ、トリコデルマ・レエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｒｅｅｓｅｉ）エンドグルカナーゼＩ、トリコデルマ・レエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｒｅｅｓｅｉ）エンドグルカナーゼＩＩ、トリコデルマ・レエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｒｅｅｓｅｉ）エンドグルカナーゼＩＩＩ、トリコデルマ・レエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｒｅｅｓｅｉ）エンドグルカナーゼＶ、トリコデルマ・レエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｒｅｅｓｅｉ）キシラナーゼＩ、トリコデルマ・レエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｒｅｅｓｅｉ）キシラナーゼＩＩ、トリコデルマ・レエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｒｅｅｓｅｉ）キシラナーゼＩＩＩ、トリコデルマ・レエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｒｅｅｓｅｉ）β−キシロシダーゼ、ならびに、トリコデルマ・レエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｒｅｅｓｅｉ）翻訳伸長因子。

制御配列は、プロモータの下流で、かつ遺伝子のコード配列の上流のｍＲＮＡ安定化領域であってもよく、これは、遺伝子の発現を増大させる。

制御配列はまた、リーダ、すなわち、ｍＲＮＡの非翻訳領域であってもよく、これは、宿主細胞による翻訳にとって重要である。リーダは、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの５’−末端に作動可能にリンクさせる。宿主細胞において機能性であれば、どんなリーダを用いてもよい。

糸状真菌宿主細胞の好ましいリーダは、アスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡアミラーゼおよびアスペルギルス・ニズランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｄｕｌａｎｓ）トリオースリン酸イソメラーゼの遺伝子から得られる。

制御配列はまた、ポリヌクレオチドの３’−末端に作動可能にリンクし、転写された場合に、ポリアデノシン残基を転写ｍＲＮＡに負荷するシグナルとして宿主細胞により認識される配列であるポリアデニル化配列であり得る。宿主細胞において機能するポリアデニル化配列のいずれかが用いられ得る。

糸状真菌宿主細胞の好ましいポリアデニル化配列は、アスペルギルス・ニズランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｄｕｌａｎｓ）アントラニル酸シンターゼ、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）グルコアミラーゼ、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）α−グルコシダーゼ、アスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡアミラーゼ、およびフザリウム・オキシスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）トリプシン様プロテアーゼの遺伝子から得られる。

制御配列はまた、ポリペプチドのＮ−末端にリンクしたシグナルペプチドをコードし、および、ポリペプチドを細胞の分泌経路に送るシグナルペプチドコード領域であり得る。ポリヌクレオチドのコード配列の５’−末端は、ポリペプチドをコードするコード配列のセグメントと共に、翻訳読み枠に元々リンクしたシグナルペプチドコード配列を本質的に含有し得る。または、コード配列の５’−末端は、コード配列に対して外来性のシグナルペプチドコード配列を含有し得る。コード配列がシグナルペプチドコード配列を元々含有していない場合には、外来性のシグナルペプチドコード配列が必要とされる場合がある。または、外来性のシグナルペプチドコード配列は単に、ポリペプチドの分泌を増強するために天然シグナルペプチドコード配列を置き換えてもよい。しかしながら、発現ポリペプチドを宿主細胞の分泌経路に送るいずれかのシグナルペプチドコード配列がもちいられてもよい。

糸状真菌宿主細胞の効果的なシグナルペプチドコード配列は、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）中性アミラーゼ、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）グルコアミラーゼ、アスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡアミラーゼ、フミコラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａｉｎｓｏｌｅｎｓ）セルラーゼ、フミコラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａｉｎｓｏｌｅｎｓ）エンドグルカナーゼＶ、フミコラ・ラヌギノサ（Ｈｕｍｉｃｏｌａｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）リパーゼおよびリゾムコール・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒｍｉｅｈｅｉ）アスパラギン酸プロテイナーゼの遺伝子から得られるシグナルペプチドコード配列である。

制御配列はまた、ポリペプチドのＮ−末端でプロペプチド位置をコードするプロペプチドコード配列であり得る。得られたポリペプチドは、酵素原またはプロポリペプチド（または、いくつかの場合においてチモーゲン）として公知である。プロポリペプチドは、一般に非活性であり、プロポリペプチドからのプロペプチドの触媒または自己触媒切断によって活性ポリペプチドに転換されることが可能である。プロペプチドコード配列は、古草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）アルカリ性タンパク分解酵素（ａｐｒＥ）、古草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）中性タンパク分解酵素（ｎｐｒＴ）、ミセリオフトラ・テルモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）ラッカーゼ（国際公開第９５／３３８３６号パンフレット）、リゾムコール・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒｍｉｅｈｅｉ）アスパラギン酸プロテイナーゼおよびサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）α−因子の遺伝子から得られ得る。

シグナルペプチドおよびプロペプチド配列の両方が存在する場合、プロペプチド配列はポリペプチドのＮ−末端に隣接して位置されており、また、シグナルペプチド配列は、プロペプチド配列のＮ−末端に隣接して位置されている。

宿主細胞の増殖に対してポリペプチドの発現を調節する調節配列を付加することが望ましい場合もある。調節配列の例は、調節化合物の存在を含む化学的または物理的刺激に応じて、遺伝子の発現をオンオフさせるものである。糸状菌においては、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）グルコアミラーゼプロモータ、アスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡα−アミラーゼプロモータ、およびアスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｒｙｚａｅ）グルコアミラーゼプロモータ、トリコデルマ・レエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｒｅｅｓｅｉ）セロビオヒドロラーゼＩプロモータおよびトリコデルマ・レエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｒｅｅｓｅｉ）セロビオヒドロラーゼＩＩプロモータが用いられ得る。調節配列の他の例は、遺伝子増幅を可能とするものである。真核系において、これらの調節配列は、メトトレキセートの存在下で増幅されるジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子、および、重金属を伴って増幅されるメタロチオネイン遺伝子を含む。これらの事例において、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、調節配列と作動可能にリンクしているであろう。

本発明の好ましい実施形態では、対象のポリペプチドは、宿主細胞に対して相同的または異種であり；好ましくは、対象のポリペプチドは、分泌されたポリペプチドであり；より好ましくは、これは、ホルモン、酵素、受容体もしくはその一部、抗体もしくはその一部、またはリポータであり；さらに好ましくは、対象のポリペプチドは、ヒドロラーゼ、イソメラーゼ、リガーゼ、リアーゼ、オキシドレダクターゼもしくはトランスフェラーゼであり；最も好ましくは、対象のポリペプチドは、α−ガラクトシダーゼ、α−グルコシダーゼ、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、β−キシロシダーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セロビオヒドロラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エンドグルカナーゼ、エステラーゼ、グルコアミラーゼ、インベルターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、マンノシダーゼ、ムタナーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素、ペルオキシダーゼ、フィターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、タンパク質分解酵素、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼ、またはキシラーゼである。

発現ベクター
本発明はまた、本明細書に定義した通りの対象のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、プロモータ、ならびに、転写および翻訳終止シグナルを含む組換え発現ベクターに関する。種々のヌクレオチドおよび制御配列が一緒になって、このような部位でポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの挿入または置換を可能とするために１つまたは複数の好都合な制限部位を含み得る組換え発現ベクターが生成される。または、ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを含む核酸構築物を発現に適切なベクターに挿入することにより発現され得る。発現ベクターの形成において、コード配列は、コード配列が、発現に適切な制御配列と作動可能にリンクするようベクター中に位置されている。

組換え発現ベクターは、組換えＤＮＡ法に簡便に供されることが可能であり、ポリヌクレオチドの発現をもたらすことが可能であるいずれかのベクター（例えば、プラスミドまたはウイルス）であり得る。ベクターの選択は、典型的には、ベクターが導入される宿主細胞に対するベクターの親和性に応じることとなる。ベクターは、直鎖または閉鎖された環状プラスミドであり得る。

ベクターは、例えばプラスミド、染色体外要素、微小染色体または人工染色体といった、自己複製ベクター（すなわち、染色体外のエンティティとして存在し、その複製が染色体複製とは無関係なベクター）であり得る。ベクターは、自己複製を確実とするための何らかの手段を含有し得る。または、ベクターは、宿主細胞に導入された際に、ゲノム中に統合され、および、中に統合された染色体と一緒に複製されるものであり得る。しかも、単一のベクターもしくはプラスミド、または、一緒になって、宿主細胞のゲノムに導入される全ＤＮＡを含有する２つ以上のベクターもしくはプラスミド、または、トランスポゾンが用いられてもよい。

ベクターは、形質転換、形質移入、形質導入などされた細胞の選択を容易とする１つまたは複数の選択マーカを含有することが好ましい。選択マーカは、その生成物が、殺生剤またはウイルス耐性、重金属に対する耐性、栄養要求体に対する原栄養性などをもたらす遺伝子である。

糸状真菌宿主細胞に使用される選択マーカとして、限定するものではないが、ａｄｅＡ（ホスホリボシルアミノイミダゾール−スクシノカルボキサミドシンターゼ）、ａｄｅＢ（ホスホリボシル−アミノイミダゾールシンターゼ）、ａｍｄＳ（アセトアミダーゼ）、ａｒｇＢ（オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ）、ｂａｒ（ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ）、ｈｐｈ（ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ）、ｎｉａＤ（硝酸レダクターゼ）、ｐｙｒＧ（オロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼ）、ｓＣ（硫酸アデニルトランスフェラーゼ）、およびｔｒｐＣ（アントラニル酸シンターゼ）、ならびにこれらの同等物が挙げられる。アスペルギルス・ニズランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｄｕｌａｎｓ）またはアスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｒｙｚａｅ）ａｍｄＳおよびｐｙｒＧ遺伝子ならびにストレプトマイセス・ハイグロスコピクス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ）ｂａｒ遺伝子が、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）細胞での使用に好ましい。ａｄｅＡ、ａｄｅＢ、ａｍｄＳ、ｈｐｈ、及びｐｙｒＧ遺伝子が、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）細胞での使用に好ましい。

選択マーカは、国際公開第２０１０／０３９８８９号パンフレットに記載されている通り、二重選択マーカ系であってもよい。一態様では、二重選択マーカは、ｈｐｈ−ｔｋ二重選択マーカ系である。

ベクターは、宿主細胞のゲノムへのベクターの統合、または、ゲノムとは無関係の細胞中のベクターの自律複製を許容する要素を含有することが好ましい。

宿主細胞ゲノムへの統合に関して、ベクターは、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの配列、または、相同的もしくは非相同的組換えによるゲノムへの統合に係るベクターのいずれかの他の要素に依存し得る。または、ベクターは、染色体における正確な位置での宿主細胞のゲノムへの相同的組換えによる統合をもたらす追加のポリヌクレオチドを含有していてもよい。正確な位置で統合される可能性を高めるために、統合要素は、相同的組換えの確率を高めるために対応する標的配列に対して高度の配列同一性を有する、１００〜１０，０００塩基対、４００〜１０，０００塩基対および８００〜１０，０００塩基対などの十分な数の核酸を含有しているべきである。統合要素は、宿主細胞のゲノム中の標的配列と相同的であるいずれかの配列であり得る。さらに、統合要素は、非コーディングまたはコーディングポリヌクレオチドであり得る。他方で、ベクターは、非相同的組換えにより宿主細胞のゲノムに統合され得る。

自律複製に関して、ベクターは、対象の宿主細胞におけるベクターの自律的な複製を可能とする複製起点をさらに含んでいてもよい。複製起点は、細胞において機能する自律複製を媒介するいずれかのプラスミドレプリケータであり得る。「複製起点」または「プラスミドレプリケータ」という用語は、インビボでのプラスミドまたはベクターの複製を可能とするポリヌクレオチドを意味する。

糸状真菌細胞において有用な複製起点の例は、ＡＭＡ１およびＡＮＳ１（Ｇｅｍｓｅｔａｌ．，１９９１，Ｇｅｎｅ９８：６１−６７；Ｃｕｌｌｅｎｅｔａｌ．，１９８７，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１５：９１６３−９１７５；国際公開第００／２４８８３号パンフレット）である。ＡＭＡ１遺伝子の単離およびＡＭＡ１遺伝子を含むプラスミドまたはベクターの構築は、国際公開第００／２４８８３号パンフレットに開示されている方法に従って達成可能である。

本発明のポリヌクレオチドの２つ以上のコピーが宿主細胞に挿入されて、ポリペプチドの生成が高められてもよい。ポリヌクレオチドのコピーの数は、配列の少なくとも１つの追加のコピーを宿主細胞ゲノムに統合することにより、または、増幅可能な選択マーカ遺伝子をポリヌクレオチドに含めることにより増加させることが可能であり、ここで、選択マーカ遺伝子の増幅されたコピー、従って、ポリヌクレオチドの追加のコピーを含有する細胞は、適切な選択可能な薬剤中で細胞を培養することにより選択可能である。

上記の要素を連結して本発明の組換え発現ベクターを構築するために用いられる手法は、当業者に周知である（例えば、前述のＳａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．，１９８９を参照のこと）。

宿主細胞
本発明はまた、本発明のポリペプチドの生成をもたらす１つまたは複数の制御配列に作動可能にリンクした本発明のポリヌクレオチドを含む組換え宿主細胞に関する。ポリヌクレオチドを含む構築物もしくはベクターは、構築物もしくはベクターが染色体性組み込み体として、もしくは、既述の自己複製余剰−染色体性ベクターとして維持されるよう宿主細胞に導入される。「宿主細胞」という用語は、複製の最中に生じる突然変異により親細胞と同等ではない親細胞のいずれかの子孫を包含する。宿主細胞の選択は、ポリペプチドをコードする遺伝子およびそのソースに大きく依存することとなる。

突然変異糸状真菌宿主細胞は、アクレモニウム属（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、アウレオバシジウム属（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ）、ブエルカンデラ属（Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ）、セリポリオプシス属（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ）、クリソスポリウム属（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、コプリヌス属（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ）、コリオルス属（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ）、クリプトコッカス属（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、フィリバシジウム属（Ｆｉｌｉｂａｓｉｄｉｕｍ）、フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、フミコラ属（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、マグナポルテ属（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ）、ムコール属（Ｍｕｃｏｒ）、ミセリオフトラ属（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）、ネオカリマスチクス属（Ｎｅｏｃａｌｌｉｍａｓｔｉｘ）、ニューロスポラ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、パエシロマイセス属（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ）、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、ファネロケーテ属（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ）、フレビア属（Ｐｈｌｅｂｉａ）、ピロマイセス属（Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ）、プレウロツス属（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ）、シゾフィルム属（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ）、タラロマイセス属（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）、テルモアスクス属（Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ）、チエラビア属（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）、トリポクラジウム属（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）、トラメテス属（Ｔｒａｍｅｔｅｓ）またはトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）細胞であり得る。

例えば、糸状真菌宿主細胞は、アスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルス・フォエティダス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｆｏｅｔｉｄｕｓ）、アスペルギルス・フミガーツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、アスペルギルス・ジャポニクス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、アスペルギルス・ニズランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｒｙｚａｅ）、ヤケイロタケ（Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａａｄｕｓｔａ）、セリポリオプシス・アネイリナ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓａｎｅｉｒｉｎａ）、セリポリオプシス・カレギエア（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓｃａｒｅｇｉｅａ）、セリポリオプシス・ギルベスセンス（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓｇｉｌｖｅｓｃｅｎｓ）、セリポリオプシス・パンノシンタ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓｐａｎｎｏｃｉｎｔａ）、セリポリオプシス・リブロサ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓｒｉｖｕｌｏｓａ）、セリポリオプシス・スブルファ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓｓｕｂｒｕｆａ）、セリポリオプシス・スブベルミスポラ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓｓｕｂｖｅｒｍｉｓｐｏｒａ）、クリソスポリウム・イノプス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍｉｎｏｐｓ）、クリソスポリウム・ケラチノフィルム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍｋｅｒａｔｉｎｏｐｈｉｌｕｍ）、クリソスポリウム・ルクノウェンス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）、クリソスポリウム・メルダリウム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍｍｅｒｄａｒｉｕｍ）、クリソスポリウム・パンニコラ（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍｐａｎｎｉｃｏｌａ）、クリソスポリウム・クイーンスランジクム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍｑｕｅｅｎｓｌａｎｄｉｃｕｍ）、クリソスポリウム・トロピクム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍｔｒｏｐｉｃｕｍ）、クリソスポリウム・ゾナツム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍｚｏｎａｔｕｍ）、コプリヌス・シネレウス（Ｃｏｐｒｉｎｕｓｃｉｎｅｒｅｕｓ）、クリオルス・ヒルスツス（Ｃｏｒｉｏｌｕｓｈｉｒｓｕｔｕｓ）、フザリウム・バクテリジオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍｂａｃｔｒｉｄｉｏｉｄｅｓ）、フザリウム・セレアリス（Ｆｕｓａｒｉｕｍｃｅｒｅａｌｉｓ）、フザリウム・クロークウェレンス（Ｆｕｓａｒｉｕｍｃｒｏｏｋｗｅｌｌｅｎｓｅ）、フザリウム・クルモルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍｃｕｌｍｏｒｕｍ）、フザリウム・グラミネアルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）、フザリウムグラミヌム（Ｆｕｓａｒｉｕｍｇｒａｍｉｎｕｍ）、フザリウム・ヘテロスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍｈｅｔｅｒｏｓｐｏｒｕｍ）、フザリウム・ネグンディ（Ｆｕｓａｒｉｕｍｎｅｇｕｎｄｉ）、フザリウム・オキシスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、フザリウム・レチクランツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍｒｅｔｉｃｕｌａｔｕｍ）、フザリウム・ロゼウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍｒｏｓｅｕｍ）、フザリウム・サムブシヌム（Ｆｕｓａｒｉｕｍｓａｍｂｕｃｉｎｕｍ）、フザリウム・サルコクロウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍｓａｒｃｏｃｈｒｏｕｍ）、フザリウムス・ポロトリキオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｉｏｉｄｅｓ）、フザリウム・スルフレウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｕｌｐｈｕｒｅｕｍ）、フザリウム・トルロスム（Ｆｕｓａｒｉｕｍｔｏｒｕｌｏｓｕｍ）、フザリウム・トリコテシオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｉｏｉｄｅｓ）、フザリウム・ベネナツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍｖｅｎｅｎａｔｕｍ）、フミコラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａｉｎｓｏｌｅｎｓ）、フミコラ・ラヌギノサ（Ｈｕｍｉｃｏｌａｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）、ムコール・ミエヘイ（Ｍｕｃｏｒｍｉｅｈｅｉ）、ミセリオフトラ・テルモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａｃｒａｓｓａ）、ペニシリウム・プルプロゲヌム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍｐｕｒｐｕｒｏｇｅｎｕｍ）、ファネロケーテ・クリソスポリウム（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、フレビア・ラジアタ（Ｐｈｌｅｂｉａｒａｄｉａｔａ）、プレウロツス・エリンギイ（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓｅｒｙｎｇｉｉ）、チエラビア・テルレストリス（Ｔｈｉｅｌａｖｉａｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）、トラメテス・ビロサ（Ｔｒａｍｅｔｅｓｖｉｌｌｏｓａ）、トラメテス・ベルシコロル（Ｔｒａｍｅｔｅｓｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）、トリコデルマ・ハルジアヌム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｈａｒｚｉａｎｕｍ）、トリコデルマ・コニンギイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｋｏｎｉｎｇｉｉ）、トリコデルマ・ロンギブラキアツム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）、トリコデルマ・レエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｒｅｅｓｅｉ）またはトリコデルマ・ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｖｉｒｉｄｅ）細胞であり得る。

真菌細胞は、それ自体公知の様式でのプロトプラスト形成、プロトプラストの形質転換、および、細胞壁の再生を含むプロセスにより形質転換され得る。アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）およびトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）宿主細胞の形質転換に好適な手法は、欧州特許第２３８０２３号明細書、Ｙｅｌｔｏｎｅｔａｌ．，１９８４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８１：１４７０−１４７４、ならびにＣｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎｅｔａｌ．，１９８８，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ６：１４１９−１４２２に記載されている。フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）種の形質転換に好適な方法は、Ｍａｌａｒｄｉｅｒｅｔａｌ．，１９８９，Ｇｅｎｅ７８：１４７−１５６および国際公開第９６／００７８７号パンフレットに記載されている。

生成方法
本発明は、本発明のポリペプチドを生成する方法に関し、この方法は、（ａ）ポリペプチドの産生を促す条件下で、本発明の第１または第３の態様で定義した通りの組換えもしくは突然変異糸状真菌宿主細胞を培養するステップ；および、任意選択で、（ｂ）ポリペプチドを回収するステップを含む。

宿主細胞は、技術分野において既知である方法を用いてポリペプチドの生成に好適な栄養培地中で培養される。例えば、細胞は、好適な培地中ならびにポリペプチドの発現および／または単離が許容される条件下で行われる、振盪フラスコ培養により、および、実験用もしくは産業用発酵槽における小規模もしくは大規模発酵（連続式、バッチ式、フェドバッチ式または固体状発酵を含む）により培養され得る。培養は、炭素および窒素源および無機塩を含む好適な栄養培地において、技術分野において公知である手法を用いて行われる。好適な媒体は、商業的な供給者から入手可能であるか、または、公開された組成に従って調製され得る（例えば、ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎのカタログ）。ポリペプチドが栄養培地に分泌される場合、ポリペプチドは培地から直接回収可能である。ポリペプチドが分泌されない場合、細胞ライセートから回収可能である。

ポリペプチドは、ポリペプチドに特異的な技術分野において公知である方法を用いて検出され得る。これらの検出方法として、限定するものではないが、特定の抗体の使用、酵素産物の形成、または、酵素基質の消失などが挙げられる。例えば、酵素アッセイを用いてポリペプチドの活性を判定してもよい。

ポリペプチドは技術分野において公知である方法を用いて回収され得る。例えば、ポリペプチドは、特にこれらに限定されないが、収集、遠心分離、ろ過、抽出、噴霧乾燥、蒸発または沈殿を含む従来の手法により栄養培地から回収され得る。一態様では、ポリペプチドを含む発酵ブロスを回収する。

ポリペプチドは、実質的に純粋なポリペプチドを得るために、特にこれらに限定されないが、クロマトグラフィ（例えば、イオン交換、親和性、疎水性、クロマトフォーカシングおよびサイズ排除）、電気泳動的手法（例えば、分取等電点電気泳動）、較差溶解度（例えば、硫酸アンモニウム沈殿）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、または、抽出（例えば、ＰｒｏｔｅｉｎＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ＪａｎｓｏｎおよびＲｙｄｅｎ編，ＶＣＨＰｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，１９８９を参照のこと）を含む技術分野において公知である多様な手法によって精製され得る。

代替的な態様においては、ポリペプチドは回収されず、ポリペプチドを発現する本発明の宿主細胞がポリペプチドのソースとして用いられ得る。

培養および対象の産物の回収に用いる方法は、当技術分野で公知の方法により実施してよい。

Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）α−グルカンシンターゼ遺伝子及び遺伝子産物
アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）α−グルカンシンターゼ（ａｇｓＡ）遺伝子は、配列番号１（ゲノムＤＮＡ）および配列番号２（ｃＤＮＡ）に示される。コードされたＡｇｓＡシンターゼのアミノ酸は、配列番号３に示される。

アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）α−グルカンシンターゼ（ａｇｓＥ）遺伝子は、配列番号４（ゲノムＤＮＡ）および配列番号５（ｃＤＮＡ）に示される。コードされたＡｇｓＡシンターゼのアミノ酸は、配列番号６に示される。

材料および方法
分子クローニング技術は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．，Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｌｏｎｉｎｇ：ａｌａｂｏｒａｔｏｒｙｍａｎｕａｌ（２ｎｄｅｄｎ．）ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，ＮｅｗＹｏｒｋに記載されている。

酵素
ＤＮＡ操作のための酵素（例えば、制限エンドヌクレアーゼ、リガーゼなど）は、ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．から入手可能であり、製造者の指示に従って使用した。

培地および溶液
ＡＭＧ微量金属溶液は、０．３ｇのクエン酸、０．６８ｇのＺｎＣｌ_２、０．２５ｇのＣｕＳＯ_４・５Ｈ_２Ｏ、０．０２４ｇのＮｉＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏ、１．３９ｇのＦｅＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、１．３５６ｇのＭｎＳＯ_４・５Ｈ_２Ｏ、および１リットルまでの脱イオン水から構成された。

ＣＯＶＥ−Ｎ−ｇｌｙプレートは、２１８ｇのソルビトール、１０ｇのグリセロール、２．０２ｇのＫＮＯ_３、５０ｍｌのＣＯＶＥ塩溶液、２５ｇのノーブル（Ｎｏｂｌｅ）寒天、および１リットルまでの脱イオン水から構成された。

ＣＯＶＥ培地は、３４２．３ｇのスクロース、２０ｍｌの５０×ＣＯＶＥ塩溶液、１０ｍｌの１Ｍアセトアミド、１０ｍｌの１．５ＭＣｓＣｌ２、２５ｇのノーブル寒天、および１リットルまでの脱イオン水から構成された。

ＣＯＶＥ２培地は、３０ｇのスクロース、２０ｍｌの５０×ＣＯＶＥ塩溶液、１０ｍｌの１Ｍアセトアミド、２５ｇのノーブル寒天、および１リットルまでの脱イオン水から構成された。

ＣＯＶＥ−Ｎプレートは、３４２．３ｇのスクロース、２０ｍｌのＣＯＶＥ塩溶液、３ｇのＮａＮＯ_３、３０ｇのノーブル寒天、および１リットルまでの脱イオン水から構成された。

ＣＯＶＥ−Ｎトップアガロースは、３４２．３ｇのスクロース、２０ｍｌのＣＯＶＥ塩溶液、３ｇのＮａＮＯ_３、１０ｇの低融点アガロース、および１リットルまでの脱イオン水から構成された。

ＣＯＶＥ−ＮＪＰプレートは、３０ｇのスクロース、２０ｍｌのＣＯＶＥ塩溶液、３ｇのＮａＮＯ_３、３０ｇのノーブル寒天、および１リットルまでの脱イオン水から構成された。

ＣＯＶＥ塩溶液は、２６ｇのＫＣｌ、２６ｇのＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、７６ｇのＫＨ_２ＰＯ_４、５０ｍｌのＣＯＶＥ微量金属溶液、および１リットルまでの脱イオン水から構成された。

ＣＯＶＥ微量金属溶液は、０．０４ｇのＮａ_２Ｂ_４Ｏ_７・１０Ｈ_２Ｏ、０．４ｇのＣｕＳＯ_４・５Ｈ_２Ｏ、１．２ｇのＦｅＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、１．０ｇのＭｎＳＯ_４・５Ｈ_２Ｏ、０．８ｇのＮａ_２ＭｏＯ_４・２Ｈ_２Ｏ、１０ｇのＺｎＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、および１リットルまでの脱イオン水から構成された。

ＬＢ培地は、１０ｇのトリプトン、５ｇの酵母エキス、５ｇの塩化ナトリウム、および１リットルまでの脱イオン水から構成された。

ＬＢプラスアンピシリンプレートは、１０ｇのトリプトン、５ｇの酵母エキス、５ｇの塩化ナトリウム、１５ｇのバクト（Ｂａｃｔｏ）寒天、１ｍｌ当たり１００μｇのアンピシリン、および１リットルまでの脱イオン水から構成された。

ＭＳＳ培地は、７０ｇのスクロース、１００ｇのダイズ粉末、３滴のプロニック（ｐｌｕｒｏｎｉｃ）消泡剤、および１リットルまでの脱イオン水から構成され；ｐＨを６．０に調節した。

尿素を含まないＭＵ−１ｇｌｕ培地は、２６０ｇのグルコース、３ｇのＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、６ｇのＫ_２ＳＯ_４、５ｇのＫＨ_２ＰＯ_４、０．５ｍｌのＡＭＧ微量金属溶液、数滴の消泡剤、および１リットルまでの脱イオン水から構成され；ｐＨを４．５に調節した。

５０％尿素は、５００ｇの尿素と１リットルまでの脱イオン水から構成された。

ＹＰＧ培地は、１０ｇの酵母エキス、２０ｇのバクト（Ｂａｃｔｏ）ペプトン、２０ｇのグルコース、および１リットルまでの脱イオン水から構成された。

ＳＴＣは、０．８Ｍソルビトール、２５ｍＭまたは５０ｍＭトリスｐＨ８、および２５ｍＭまたは５０ｍＭＣａＣｌ_２から構成された。

ＳＰＴＣは、ＳＴＣバッファー中４０％ポリエチレングリコール４０００（ＰＥＧ４０００）から構成された。

ＳＯＣ培地は、２０ｇのトリプトン、５ｇの酵母エキス、０．５ｇのＮａＣｌ、１０ｍｌの２５０ｍＭＫＣｌ、および１リットルまでの脱イオン水から構成された。

ＴＡＥバッファーは、４．８４ｇのトリス塩基、１．１４ｍｌの氷酢酸、２ｍｌの０．５ＭＥＤＴＡｐＨ８．０、および１リットルまでの脱イオン水から構成された。

購入した材料
プラスミド構築および増幅のために、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５−α（Ｔｏｙｏｂｏ）を使用した。ＰＣＲ断片のクローニングのために市販のプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ−（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ＃２１２２０６）を使用した。Ｑｉａｇｅｎ（登録商標）ＰｌａｓｍｉｄＫｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）で、増幅プラスミドを回収した。ＤＮＡ連結キット（Ｔａｋａｒａ）またはＴ４ＤＮＡリガーゼ（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ）を用いて、連結反応を実施した。Ｅｘｐａｎｄ（商標）ＰＣＲシステム（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ）を用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を実施した。ＰＣＲ断片の精製およびアガロースゲルからのＤＮＡ断片の抽出のために、ＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）ＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用した。

株
ノボザイム（Ｎｏｖｏｚｙｍｅ）により発現宿主株アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）を単離し、これを、アミログリコシダーゼ活性およびαアミラーゼ活性の発現を破壊するように遺伝子改変した後、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）シトシンデアミナーゼ遺伝子（ｆｃｙ１）を導入した。

プラスミド
プラスミドｐＨＵｄａ８０１は、国際公開第２０１２１６００９３号パンフレットの実施例４に記載されている。

プラスミドｐＨＵｄａ１０１９は、国際公開第２０１２１６００９３号パンフレットの実施例２に記載されている。

酵素遺伝子の発現のベクター用のプラスミドｐＲｉｋａ１４７は、国際公開第２０１２１６００９３号パンフレットの実施例９に記載されている。

アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）の形質転換
親アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）宿主細胞の形質転換は、Ｙｅｌｔｏｎｅｔａｌ．，“ＴｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｄｕｌａｎｓｂｙｕｓｉｎｇａｔｒｐＣｐｌａｓｍｉｄ，“ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ．１９８４Ｍａｒ；８１（５）：１４７０−４に記載されているように、糸状真菌での形質転換のための公知の一般的方法を用いて、下記の通り達成した：
宿主株がｐｙｒＧ欠失突然変異体である場合には、１０ｍＭウリジンで補充した１００ｍｌのＹＰＧ培地に、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）宿主株を接種し、３２℃、８０ｒｐｍで１６時間インキュベートした。ペレットを収集し、０．６ＭＫＣｌで洗浄した後、１ｍｌ当たり２０ｍｇの最終濃度で市販のβ−グルカナーゼ製品（ＧＬＵＣＡＮＥＸ（商標）、ＮｏｖｏｚｙｍｅｓＡ／Ｓ，Ｂａｇｓｖａｅｒｄ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を含有する２０ｍｌの０．６ＭＫＣｌに再懸濁させた。プロトプラストが形成されるまで、懸濁液を３２℃、８０ｒｐｍでインキュベートし、続いてＳＴＣバッファーで２回洗浄した。プロトプラストをヘマトメータで計数してから、ＳＴＣ：ＳＴＰＣ：ＤＭＳＯの８：２：０．１溶液に再懸濁させ、最終濃度２．５×１０^７プロトプラスト／ｍｌに調節した。約４μｇのプラスミドＤＮＡを１００μｌのプロトプラスト懸濁液に添加し、穏やかに混合した後、氷上で３０分間インキュベートした。１ｍｌのＳＰＴＣを添加し、プロトプラスト懸濁液を３７℃で２０分間インキュベートした。１０ｍｌの５０℃のＣＯＶＥ−Ｎトップアガロースを添加後、混合物を最少培地に注ぎ、これらのプレートを３０℃で５日間インキュベートした。

ＰＣＲ増幅
５×ＰＣＲバッファー（ＭｇＣｌ２を含む）２０μｌ
２．５ｍＭｄＮＴＰミックス１０μｌ
フォワードプライマー（１００μＭ）１μｌ
リバースプライマー（１００μＭ）１μｌ
エキスパンドハイフィディリティポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ）１μｌ
鋳型ＤＮＡ（５０〜１００ｎｇ／μｌ）１μｌ
蒸留水１００μｌまで

リポータ酵素生成のための振盪フラスコ培養
選択した形質転換体の胞子を１００ｍｌのＭＳＳ培地に接種し、３０℃で３日間培養した。１０％のシード培養物を実験室規模のタンク内のＭＵ−１ｇｌｕ培地に移し、ここに適切な量のグルコースおよびアンモニウムを供給し、３４℃で６日間培養した。上清を遠心分離により取得した。遠心分離後の培養物上清を酵素アッセイに用いた。

サザンハイブリダイゼーション
選択した形質転換体の菌糸体を、３ｍｌのＹＰＧ培地中の一晩培養物から採取し、蒸留水で洗浄した。粉砕した菌糸体を、ＦａｓｔＤＮＡＳＰＩＮＫｉｔｆｏｒＳｏｉｌ（ＭＰＢｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）を用いたゲノムＤＮＡ調製に、製造者の指示に従って供した。ＰＣＲＤＩＧプローブ合成キット（ＲｏｃｈｅＡｐｐｌｉｅｄＳｃｉｅｎｃｅ，ＩｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓＩＮ）を用い、製造者の指示に従って非放射性プローブを合成した。ＱＩＡｑｕｉｃｋ（商標）ＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮＩｎｃ．，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用い、製造者の指示に従ってＤＩＧ標識プローブをゲル精製した。

５マイクログラムのゲノムＤＮＡを適切な制限酵素で１６時間完全に消化した（４０μｌ総量、４Ｕ酵素／μｌＤＮＡ）後、０．８％アガロースゲル上で泳動させた。ＤＮＡは、０．２ＭＨＣｌで処理することによりゲル中で断片化し、変性させ（０．５ＭＮａＯＨ、１．５ＭＮａＣｌ）、中和した（１Ｍトリス、ｐＨ７．５；１．５ＭＮａＣｌ）後、２０×ＳＳＣ中でＨｙｂｏｎｄＮ＋膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に転移した。ＤＮＡを膜にＵＶ架橋させてから、２０ｍｌのＤＩＧＥａｓｙＨｙｂ（ＲｏｃｈｅＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）において４２℃で１時間プレハイブリダイズした。変性プローブをＤＩＧＥａｓｙＨｙｂバッファーに直接添加し、４２℃で一晩ハイブリダイゼーションを実施した。ハイブリダイゼーション後の洗浄（各々、２×ＳＳＣ、室温で５分を２回、および０．１×ＳＳＣ、６８℃で１５分を２回）に続いて、ＤＩＧ検出システムおよびＣＰＤ−Ｓｔａｒ（Ｒｏｃｈｅ）を用いた化学発光検出を製造者のプロトコルに従って実施した。ＤＩＧ標識ＤＮＡＭｏｌｅｃｕｌａｒＷｅｉｇｈｔＭａｒｋｅｒＩＩ（Ｒｏｃｈｅ）を標準的マーカに用いた。

ブラッドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）アッセイ（全タンパク質判定）
ブラッドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）アッセイ、すなわち比色タンパク質分析は、色素ＣｏｏｍａｓｓｉｅＢｒｉｌｌｉａｎｔＢｌｕｅＧ−２５０の吸光度シフトに基づき、この場合、酸性条件下で、色素の赤色形態が、より青色の形態に変換されて、アッセイ対象のタンパク質に結合する。色素とタンパク質の結合は、青色のアニオン形態を安定化させる。５９５ｎｍでの吸光度の増加は、結合した色素の量、従って、サンプル中に存在するタンパク質の量（濃度）に比例する。

酵素サンプルを蒸留水で適度に希釈してから、それらのタンパク質の量をＱｕｉｃｋＳｔａｒｔ（商標）ブラッドフォードタンパク質アッセイ（ＢｒａｄｆｏｒｄＰｒｏｔｅｉｎＡｓｓａｙ）（Ｂｉｏ−Ｒａｄｉｎｃ．）の使用により、製造者の指示に従って測定した。

実施例１：アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）ａｇｓＡ遺伝子の標的遺伝子破壊のためのベクターである、プラスミドｐＨＵｄａ１６８５の構築
プラスミドｐＨＵｄａ１６８５は、ターミネータ反復配列を有する選択マーカとしてのＡ．ニズランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）オロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子（ｐｙｒＧ）により分離されるアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）α−グルカンシンターゼ（ａｇｓＡ）遺伝子の５’および３’フランキング領域と、ヒト単純ヘルペスウイルス１（ＨＳＶ−１）チミジンキナーゼ遺伝子を含むように構築した。ＨＳＶ−１チミジンキナーゼ遺伝子は、ａｇｓＡ遺伝子の３’フランキング領域の３’側に位置し、これによって、ａｇｓＡ遺伝子座への組み込みを正しくターゲティングしないアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）形質転換体の対抗選択が可能になる。プラスミドは、以下に記載する通り、いくつかのステップで構築した。

Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）ａｇｓＡの５’フランキング領域を含有するＰＣＲ産物は、下記のプライマーを用いて作製した。
プライマーａｇｓＡ１（センス）：５’ｇｇｔｇｇｃｇｇｃｃｇｃｃｔｇｔｇａａｔａｇｃｔａｃｃａｇｃ（配列番号７）
プライマーａｇｓＡ２（アンチセンス）：５’ｃｔｃｃａｃｔａｇｔｔｇｃｔａａｔｇｔａｔｔａｔｃｃａｔｇａ（配列番号８）

約１００ｎｇのアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）Ｃ３１０５のゲノムＤＮＡ、１μｌのＥｘｐａｎｄＨｉｇｈＦｉｄｅｌｉｔｙポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ）、１００μＭのプライマーａｇｓＡ１、１００μＭのプライマーａｇｓＡ２、５×ＰＣＲバッファー（ＭｇＣｌ２を含む）、２０μｌの２．５ｍＭｄＮＴＰミックス（総量；１００μｌ）から構成される反応物中のＰＣＲにより、所望の断片を増幅した。反応物をＢｉｏ−Ｒａｄ（登録商標）Ｃ１０００Ｔｏｕｃｈ（商標）ＴｈｅｒｍａｌＣｙｃｌｅｒにおいてインキュベートしたが、これは、９４℃で２分を１サイクル；各々が９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、および７２℃で２分を３０サイクル；７２℃で７分を１サイクル；ならびに４℃での保持のようにプログラムした。得られた２，５０９ｂｐのＰＣＲ断片は、ＴＡＥバッファーを用いた０．８％アガロースゲル電気泳動により精製し、ゲルから切除した後、ＱＩＡＱＵＩＣＫ（登録商標）ＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔを用いて抽出した。精製した２，５０９ｂｐのＰＣＲ断片は、ＮｏｔＩおよびＳｐｅＩにより消化した。

プラスミドｐＨＵｄａ８０１（国際公開第２０１２１６００９３Ａ１号パンフレットの実施例４）は、ＮｏｔＩおよびＳｐｅＩで消化した後、ＴＡＥバッファーを用いた０．８％アガロースゲル電気泳動により精製したが、ここでは、９，５５８ｂｐ断片をゲルから切除し、ＱＩＡＱＵＩＣＫ（登録商標）ＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔを用いて抽出した。１μｌの上記９，５５８ｂｐ断片、３μｌの上記２，５０９ｂｐＰＣＲ断片、１μｌの５×リガーゼバッファー、５μｌの２×リガーゼバッファー、および１μｌのリガーゼから構成される反応物中で、９，５５８ｂｐ断片を２，５０９ｂｐ断片と連結させた（ＲｏｃｈｅＲａｐｉｄＤＮＡＬｉｇａｔｉｏｎＫｉｔ）。連結反応物を室温で１０分間インキュベートした。５μｌの連結混合物をＤＨ５−αケミカルコンピテント大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞に形質転換した。形質転換体をＬＢプラスアンピシリンプレート上に延ばし、３７℃で一晩インキュベートした。ＱＩＡミニ−プレップキットを用いて、いくつかの形質転換体からプラスミドＤＮＡを精製した。適切な制限酵素の使用により、プラスミドＤＮＡを適切な連結反応についてスクリーニングした後、ＴＡＥバッファーを用いた０．８％アガロースゲル電気泳動に付した。１つのプラスミドをｐＨＵｄａ８０１−５’ａｇｓＡと称した。

Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）ａｇｓＡの３’フランキング領域を含むＰＣＲ産物は、下記のプライマーを用いて作製した。
プライマーａｇｓＡ３（センス）：５’ｃｔｔｃｔａｇａｇｔｔｔａａａｃａａｃｃｇｃｃｔｃａｇｃａｇ（配列番号９）
プライマーａｇｓＡ４（アンチセンス）：５’ｔｔａａｔｔａａａｇａａｇｇｇｃａｔｔｃｔａｔｇｇａｃｇｔａ（配列番号１０）

約１００ｎｇのアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）Ｃ３１０５のゲノムＤＮＡ、１μｌのＥｘｐａｎｄＨｉｇｈＦｉｄｅｌｉｔｙポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ）、１００μＭのプライマーａｇｓＡ３、１００μＭのプライマーａｇｓＡ４、５×ＰＣＲバッファー（ＭｇＣｌ２を含む）、２０μｌの２．５ｍＭｄＮＴＰミックス（総量；１００μｌ）から構成される反応物中のＰＣＲにより、所望の断片を増幅した。反応物をＢｉｏ−Ｒａｄ（登録商標）Ｃ１０００Ｔｏｕｃｈ（商標）ＴｈｅｒｍａｌＣｙｃｌｅｒにおいてインキュベートしたが、これは、９４℃で２分を１サイクル；各々が９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、および７２℃で２分を３０サイクル；７２℃で７分を１サイクル；ならびに４℃での保持のようにプログラムした。得られた２，２９９ｂｐのＰＣＲ断片は、ＴＡＥバッファーを用いた０．８％アガロースゲル電気泳動により精製し、ゲルから切除した後、ＱＩＡＱＵＩＣＫ（登録商標）ＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔを用いて抽出した。精製した２，２９９ｂｐのＰＣＲ断片は、ＸｂａＩおよびＰａｃＩにより消化した。

プラスミドｐＨＵｄａ８０１−５’ａｇｓＡは、ＸｂａＩおよびＰａｃＩで消化した後、ＴＡＥバッファーを用いた０．８％アガロースゲル電気泳動により精製し、ここで、１０，０３０ｂｐ断片をゲルから切除し、ＱＩＡＱＵＩＣＫ（登録商標）ＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔを用いて抽出した。１μｌの上記１０，０３０ｂｐ断片、３μｌの上記２，２９９ｂｐ断片、１μｌの５×リガーゼバッファー、５μｌの２×リガーゼバッファーおよび１μｌのリガーゼから構成される反応物中で、１０，０３０ｂｐ断片を２，２９９ｂｐＰＣＲ断片と連結させた（ＲｏｃｈｅＲａｐｉｄＤＮＡＬｉｇａｔｉｏｎＫｉｔ）。連結反応物を室温で１０分間インキュベートした。５μｌの連結混合物をＤＨ５−αケミカルコンピテント大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞に形質転換した。形質転換体をＬＢプラスアンピシリンプレート上に延ばし、３７℃で一晩インキュベートした。ＱＩＡミニ−プレップキットを用いて、いくつかの形質転換体からプラスミドＤＮＡを精製した。適切な制限酵素の使用により、プラスミドＤＮＡを適切な連結反応についてスクリーニングした後、ＴＡＥバッファーを用いた０．８％アガロースゲル電気泳動に付した。１つのプラスミドをｐＨＵｄａ１６８５と称した（図２）。

実施例２：アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）ａｇｓＥ遺伝子の標的遺伝子破壊のためのベクターである、プラスミドｐＨＵｄａ１７０１の構築
プラスミドｐＨＵｄａ１７０１は、選択マーカとしてのＡ．ニズランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）アセトアミダーゼ遺伝子（ａｍｄＳ）により分離されるアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）α−グルカンシンターゼ（ａｇｓＥ）遺伝子の５’および３’フランキング領域と、ヒト単純ヘルペスウイルス１（ＨＳＶ−１）チミジンキナーゼ遺伝子を含むように構築した。ＨＳＶ−１チミジンキナーゼ遺伝子は、ａｇｓＥ遺伝子の３’フランキング領域の３’側に位置し、これによって、ａｇｓＥ遺伝子座に正しくターゲティングしないアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）形質転換体の対抗選択が可能になる。プラスミドは、以下に記載する通り、いくつかのステップで構築した。

Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）ａｇｓＥの５’フランキング領域を含むＰＣＲ産物は、下記のプライマーを用いて作製した。
プライマーａｇｓＥ１（センス）：５’ａｃｃｇｃｇｇｔｃｔｔｔｃａｇｃｃａｇｇｇａａｔｇｇｃｔ（配列番号１１）
プライマーａｇｓＥ２（アンチセンス）：５’ｔｔａｃｔａｇｔａｃａｃａａｔａｇｔｇｃａｇｇｔｇａｔｇｔｃ（配列番号１２）

約１００ｎｇのアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）Ｃ３１０５のゲノムＤＮＡ、１μｌのＥｘｐａｎｄＨｉｇｈＦｉｄｅｌｉｔｙポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ）、１００μＭのプライマーａｇｓＥ１、１００μＭのプライマーａｇｓＥ２、５×ＰＣＲバッファー（ＭｇＣｌ２を含む）、２０μｌの２．５ｍＭｄＮＴＰミックス（総量；１００μｌ）から構成される反応物中で、所望の断片をＰＣＲにより増幅した。反応物をＢｉｏ−Ｒａｄ（登録商標）Ｃ１０００Ｔｏｕｃｈ（商標）ＴｈｅｒｍａｌＣｙｃｌｅｒにおいてインキュベートしたが、これは、９４℃で２分を１サイクル；各々が９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、および７２℃で２分を３０サイクル；７２℃で７分を１サイクル；ならびに４℃での保持のようにプログラムした。得られた２，３００ｂｐのＰＣＲ断片は、ＴＡＥバッファーを用いた０．８％アガロースゲル電気泳動により精製し、ゲルから切除した後、ＱＩＡＱＵＩＣＫ（登録商標）ＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔを用いて抽出した。精製した２，３００ｂｐのＰＣＲ断片は、ＳａｃＩＩおよびＳｐｅＩにより消化した。

プラスミドｐＨＵｄａ８０１（国際公開第２０１２１６００９３Ａ１号パンフレットの実施例４）は、ＳａｃＩＩおよびＳｐｅＩで消化した後、ＴＡＥバッファーを用いた０．８％アガロースゲル電気泳動により精製し、ここで、９，５６１ｂｐ断片をゲルから切除し、ＱＩＡＱＵＩＣＫ（登録商標）ＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔを用いて抽出した。１μｌの上記９，５６１ｂｐ断片、３μｌの上記２，３００ｂｐ断片、１μｌの５×リガーゼバッファー、５μｌの２×リガーゼバッファーおよび１μｌのリガーゼから構成される反応物中で、９，５６１ｂｐ断片を２，３００ｂｐＰＣＲ断片と連結させた（ＲｏｃｈｅＲａｐｉｄＤＮＡＬｉｇａｔｉｏｎＫｉｔ）。連結反応物を室温で１０分間インキュベートした。５μｌの連結混合物をＤＨ５−αケミカルコンピテント大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞に形質転換した。形質転換体をＬＢプラスアンピシリンプレート上に延ばし、３７℃で一晩インキュベートした。ＱＩＡミニ−プレップキットを用いて、いくつかの形質転換体からプラスミドＤＮＡを精製した。適切な制限酵素の使用により、プラスミドＤＮＡを適切な連結反応についてスクリーニングした後、ＴＡＥバッファーを用いた０．８％アガロースゲル電気泳動に付した。１つのプラスミドをｐＨＵｄａ８０１−５’ａｇｓＥと称した。

Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）ａｇｓＥの３’フランキング領域を含有するＰＣＲ産物は、下記のプライマーを用いて作製した。
プライマーａｇｓＥ３（センス）：５’ｔｔｔｃｔａｇａｃｇｃｃｔｔａａｔｇａｔｇｔｇｇｔｇｇｔｇ（配列番号１３）
プライマーａｇｓＥ４（アンチセンス）：５’ｔｔａａｔｔａａａｔｇｇｃｇｃｃｃａｃｔｇｃｔａｃａｇｇ（配列番号１４）

約１００ｎｇのアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）Ｃ３１０５のゲノムＤＮＡ、１μｌのＥｘｐａｎｄＨｉｇｈＦｉｄｅｌｉｔｙポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ）、１００μＭのプライマーａｇｓＥ３、１００μＭのプライマーａｇｓＥ４、５×ＰＣＲバッファー（ＭｇＣｌ２を含む）、２０μｌの２．５ｍＭｄＮＴＰミックス（総量；１００μｌ）から構成される反応物中のＰＣＲにより、所望の断片を増幅した。反応物をＢｉｏ−Ｒａｄ（登録商標）Ｃ１０００Ｔｏｕｃｈ（商標）ＴｈｅｒｍａｌＣｙｃｌｅｒにおいてインキュベートしたが、これは、９４℃で２分を１サイクル；各々が９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、および７２℃で２分を３０サイクル；７２℃で７分を１サイクル；ならびに４℃での保持のようにプログラムした。得られた２，２８０ｂｐのＰＣＲ断片は、ＴＡＥバッファーを用いた０．８％アガロースゲル電気泳動により精製し、ゲルから切除した後、ＱＩＡＱＵＩＣＫ（登録商標）ＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔを用いて抽出した。精製した２，２８０ｂｐのＰＣＲ断片をＸｂａＩおよびＰａｃＩにより消化した。

プラスミドｐＨＵｄａ８０１−５’ａｇｓＥは、ＸｂａＩおよびＰａｃＩで消化した後、ＴＡＥバッファーを用いた０．８％アガロースゲル電気泳動により精製し、ここで、９，８３０ｂｐ断片をゲルから切除し、ＱＩＡＱＵＩＣＫ（登録商標）ＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔを用いて抽出した。１μｌの上記９，８３０ｂｐ断片、３μｌの上記２，２８０ｂｐ断片、１μｌの５×リガーゼバッファー、５μｌの２×リガーゼバッファーおよび１μｌのリガーゼから構成される反応物中で、９，８３０ｂｐ断片を２，２８０ｂｐＰＣＲ断片と連結させた（ＲｏｃｈｅＲａｐｉｄＤＮＡＬｉｇａｔｉｏｎＫｉｔ）。連結反応物を室温で１０分間インキュベートした。５μｌの連結混合物をＤＨ５−αケミカルコンピテント大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞に形質転換した。形質転換体をＬＢプラスアンピシリンプレート上に延ばし、３７℃で一晩インキュベートした。ＱＩＡミニ−プレップキットを用いて、いくつかの形質転換体からプラスミドＤＮＡを精製した。適切な制限酵素の使用により、プラスミドＤＮＡを適切な連結反応についてスクリーニングした後、ＴＡＥバッファーを用いた０．８％アガロースゲル電気泳動に付した。１つのプラスミドをｐＨＵｄａ８０１−５’ａｇｓＥ−３’ａｇｓＥと称した。

プラスミドｐＨＵｄａ８０１−５’ａｇｓＥ−３’ａｇｓＥは、ＸｂａＩおよびＳｐｅＩで消化した後、ＴＡＥバッファーを用いた０．８％アガロースゲル電気泳動により精製し、ここで、９，９４６ｂｐ断片をゲルから切除し、ＱＩＡＱＵＩＣＫ（登録商標）ＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔを用いて抽出した。プラスミドｐＨＵｄａ１０１９（国際公開第２０１２１６００９３号パンフレットの実施例２に記載）は、ＸｂａＩおよびＡｖｒＩＩで消化した後、ＴＡＥバッファーを用いた０．８％アガロースゲル電気泳動により精製し、ここで、ａｍｄＳ遺伝子、Ａ．オリゼー（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）ｔｅｆ１（翻訳伸長因子１）プロモータおよびＡ．オリゼー（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）ｎｉａＤ（硝酸レダクターゼ）ターミネータを含む３，１１４ｂｐ断片をゲルから切除し、ＱＩＡＱＵＩＣＫ（登録商標）ＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔを用いて抽出した。１μｌの上記９，９４６ｂｐ断片、３μｌの上記３，１１４ｐ断片、１μｌの５×リガーゼバッファー、５μｌの２×リガーゼバッファーおよび１μｌのリガーゼから構成される反応物中で、９，９４６ｂｐ断片を３，１１４ｂｐ断片と連結させた（ＲｏｃｈｅＲａｐｉｄＤＮＡＬｉｇａｔｉｏｎＫｉｔ）。連結反応物を室温で１０分間インキュベートした。５μｌの連結混合物をＤＨ５−αケミカルコンピテント大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞に形質転換した。形質転換体をＬＢプラスアンピシリンプレート上に延ばし、３７℃で一晩インキュベートした。ＱＩＡミニ−プレップキットを用いて、いくつかの形質転換体からプラスミドＤＮＡを精製した。適切な制限酵素の使用により、プラスミドＤＮＡを適切な連結反応についてスクリーニングした後、ＴＡＥバッファーを用いた０．８％アガロースゲル電気泳動に付した。１つのプラスミドをｐＨＵｄａ１７０１と称した（図３）。

実施例３：アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）Ｃ３１０５ａｇｓＡ遺伝子の破壊
Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）Ｃ３１０５のｐｙｒＧ遺伝子を以下の通りレスキューした。株Ｃ３１０５を、１０ｍＭウリジンおよび１ｇ／Ｌの５−フルオロ−オロチン酸（５−ＦＯＡ）を含有するＣｏｖｅ−ＮＪＰ培地に３０℃で５日かけて接種した。ｐｙｒＧ遺伝子を欠失した株は、５−ＦＯＡの存在下で増殖するであろう；この遺伝子を保持する株は、５−ＦＯＡを、毒性中間体である５−フルオロ−ＵＭＰに変換するであろう。増殖したコロニーを、無菌爪楊枝を用いて、１０ｍＭウリジンで補充したＣＯＶＥ−Ｎ−ｇｌｙプレートに移し、３０℃で７日間増殖させた。単離した株をＭ１４０５と称した。

アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）株Ｍ１４０５のプロトプラストは、１０ｍＭウリジンで補充した１００ｍｌのＹＰＧ培地においてこの株を３２℃で１６時間にわたり８０ｒｐｍで穏やかに攪拌しながら培養することにより調製した。ペレットを収集し、０．６ＭＫＣｌで洗浄した後、１ｍｌ当たり２０ｍｇの最終濃度で市販のβ−グルカナーゼ製品（ＧＬＵＣＡＮＥＸ（商標）、ＮｏｖｏｚｙｍｅｓＡ／Ｓ，Ｂａｇｓｖａｅｒｄ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を含有する２０ｍｌの０．６ＭＫＣｌに再懸濁させた。プロトプラストが形成されるまで、懸濁液を３２℃、８０ｒｐｍでインキュベートした。ＭＩＲＡＣＬＯＴＨ（登録商標）でライニングした漏斗を介して５０ｍｌの無菌プラスチック製遠心管中にプロトプラストを濾過した後、０．６ＭＫＣｌで洗浄して、捕捉したプロトプラストを抽出した。合わせた濾過物および上清を２，０００ｒｐｍで１５分間の遠心分離により収集した。上清を廃棄し、ペレットを１０〜２５ｍｌのＳＴＣで洗浄し、２，０００ｒｐｍで１０分間再度遠心分離し、続いてＳＴＣバッファーで２回洗浄した。プロトプラストをヘマトメータで計数してから、ＳＴＣ：ＳＴＰＣ：ＤＭＳＯの８：２：０．１溶液に再懸濁させ、最終濃度２．５×１０^７プロトプラスト／ｍｌに調節した。

約１０μｇのｐＨＵｄａ１６８５を０．３ｍｌのＭ１４０５プロトプラスト懸濁液に添加し、穏やかに混合した後、氷上で３０分間インキュベートした。３ｍｌのＳＰＴＣを添加し、プロトプラスト懸濁液を３７℃で２０分間インキュベートした。１２ｍｌの５０℃のＣＯＶＥ−Ｎトップアガロースを添加後、混合物をＣＯＶＥ−Ｎプレートに注ぎ、これらのプレートを３０℃で７日間インキュベートした。増殖した形質転換体を、ｐＨＵｄａ１６８５に存在する単純ヘルペスウイルス（ｈｅｒｐｅｓｓｉｍｐｌｅｘｖｉｒｕｓ）（ＨＳＶ）チミジンキナーゼ遺伝子（ＴＫ）を発現する細胞を殺傷する薬剤である、１．５μＭ５−フルオロ−２−デオキシウリジン（ＦｄＵ）で補充したＣＯＶＥ−ＮＪＰプレートに無菌爪楊枝で移した。単一の胞子単離物をＣＯＶＥ−Ｎ−ｇｌｙプレートに移した。

ａｇｓＡ遺伝子を破壊する、ｐＨＵｄａ１６８５を含有するアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）株Ｍ１４０５の形質転換体候補をサザン分析によりスクリーニングした。胞子精製形質転換体の各々を３ｍｌのＹＰＧ培地で培養し、２００ｒｐｍで振盪しながら３０℃で２日間インキュベートした。ＭＩＲＡＣＬＯＴＨ（登録商標）でライニングした漏斗を用いて、バイオマスを収集した。粉砕した菌糸体を、ＦａｓｔＤＮＡＳＰＩＮＫｉｔｆｏｒＳｏｉｌ（ＭＰＢｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）を用いたゲノムＤＮＡ調製に製造者の指示に従って供した。

ａｇｓＡ遺伝子座の破壊を確認するために、サザンブロット分析を実施した。各形質転換体からの５μｇのゲノムＤＮＡをＳｐｅＩで消化した。ゲノムＤＮＡ消化反応物は、５μｇのゲノムＤＮＡ、１μｌのＳｐｅＩ、２μｌの１０×ＮＥＢｕｆｆｅｒ４、および２０μｌまでの水から構成された。ゲノムＤＮＡ消化物を３７℃で約１６時間インキュベートした。消化物は、ＴＡＥバッファーを用いた０．８％アガロースゲル電気泳動に付し、ＴＵＲＢＯＢＬＯＴＴＥＲ（登録商標）を用いて、ｈｙｂｏｎｄＮ＋（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＨ，ＵＳＡ）上に、製造者の推奨事項に従い約１時間ブロッティングした。この膜を５００ｂｐジゴキシゲニン標識アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）ｇａｓＡプローブとハイブリダイズしたが、このプローブは、以下に示すプライマーａｇｓＡ５（センス）およびａｇｓＡ６（アンチセンス）を用いたＰＣＲによるジゴキシゲニン−１１−ｄＵＴＰの組み込みにより合成したものである。
フォワードプライマー（ａｇｓＡ５）：５’ａｇｃａｇｔｃｔｃｇｇｃｇｇｃｇａｇｇａ（配列番号１５）
リバースプライマー（ａｇｓＡ６）：５’ａｔｔｇｃｃｃａａｇｃｇｇｃｇｔｃｔｃａ（配列番号１６）

増幅反応物（１００μｌ）は、最終容量１００μｌで、２００μＭのＰＣＲＤＩＧＬａｂｅｌｉｎｇＭｉｘ（バイアル２）（ＲｏｃｈｅＡｐｐｌｉｅｄＳｃｉｅｎｃｅ，ＰａｌｏＡｌｔｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、０．５μＭのプライマー、ＥＸＰＡＮＤ（登録商標）ＨｉｇｈＦｉｄｅｌｉｔｙＥｎｚｙｍｅミックス（バイアル１）（ＲｏｃｈｅＡｐｐｌｉｅｄＳｃｉｅｎｃｅ，ＰａｌｏＡｌｔｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、および鋳型としての１μｌ（１００ｐｇ／μｌ）のｐＨＵｄａ１６８５から構成された。増幅反応物をＢｉｏ−Ｒａｄ（登録商標）Ｃ１０００Ｔｏｕｃｈ（商標）ＴｈｅｒｍａｌＣｙｃｌｅｒにおいてインキュベートしたが、これは、９４℃で２分を１サイクル；各々が９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、および７２℃で２分を３０サイクル、ならびに４℃での保持のようにプログラムした。ＰＣＲ産物は、ＴＡＥバッファーを用いた０．８％アガロースゲル電気泳動により精製し、ここで、０．５ｋｂ断片をゲルから切除した後、ＱＩＡＱＵＩＣＫ（登録商標）ＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔを用いて抽出した。変性プローブをＤＩＧＥａｓｙＨｙｂバッファーに直接添加し、４２℃で一晩ハイブリダイゼーションを実施した。ハイブリダイゼーション後の洗浄（各々、２×ＳＳＣ、室温で５分を２回、および０．１×ＳＳＣ、６８℃で１５分を２回）に続いて、ＤＩＧ検出システムおよびＣＰＤ−Ｓｔａｒ（Ｒｏｃｈｅ）を用いた化学発光検出を製造者のプロトコルに従って実施した。ＤＩＧ標識ＤＮＡＭｏｌｅｃｕｌａｒＷｅｉｇｈｔＭａｒｋｅｒＩＩ（Ｒｏｃｈｅ）を標準的マーカに用いた。

ａｇｓＡ遺伝子座における正しい組み込み（１１．９ｋｂから４．７ｋｂにシフトしたハイブリダイズバンド）を有する形質転換体ａｇｓＡ突然変異株Ｍ１４０５−１６８５−１６を後の実験のために選択した。図１を参照されたい。

実施例４：Ｃ３１０５およびＭ１４０５−１６８５−１６におけるアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）ａｇｓＥ遺伝子の破壊
アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）株Ｃ３１０５およびＭ１４０５−１６８５−１６のプロトプラストは、１００ｍｌのＹＰＧ培地においてこの株を３２℃で１６時間にわたり８０ｒｐｍで穏やかに攪拌しながら培養することにより調製した。ペレットを収集し、０．６ＭＫＣｌで洗浄した後、１ｍｌ当たり２０ｍｇの最終濃度で市販のβ−グルカナーゼ製品（ＧＬＵＣＡＮＥＸ（商標）、ＮｏｖｏｚｙｍｅｓＡ／Ｓ，Ｂａｇｓｖａｅｒｄ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を含有する２０ｍｌの０．６ＭＫＣｌに再懸濁させた。プロトプラストが形成されるまで、懸濁液を３２℃、８０ｒｐｍでインキュベートした。ＭＩＲＡＣＬＯＴＨ（登録商標）でライニングした漏斗を介して５０ｍｌの無菌プラスチック製遠心分離管中にプロトプラストを濾過した後、０．６ＭＫＣｌで洗浄して、捕捉したプロトプラストを抽出した。合わせた濾過物および上清を２，０００ｒｐｍで１５分間の遠心分離により収集した。上清を廃棄し、ペレットを１０〜２５ｍｌのＳＴＣで洗浄し、２，０００ｒｐｍで１０分間再度遠心分離し、続いてＳＴＣバッファーで２回洗浄した。プロトプラストをヘマトメータで計数してから、ＳＴＣ：ＳＴＰＣ：ＤＭＳＯの８：２：０．１溶液に再懸濁させ、最終濃度２．５×１０^７プロトプラスト／ｍｌに調節した。

約１０μｇのｐＨＵｄａ１７０１を０．３ｍｌのプロトプラスト懸濁液に添加し、穏やかに混合した後、氷上で３０分間インキュベートした。３ｍｌのＳＰＴＣを添加し、プロトプラスト懸濁液を３７℃で２０分間インキュベートした。１２ｍｌの５０℃のＣＯＶＥトップアガロースを添加後、混合物をＣＯＶＥプレートに注ぎ、これらのプレートを３０℃で７日間インキュベートした。増殖した形質転換体を、ｐＨＵｄａ１７０１に存在する単純ヘルペスウイルス（ｈｅｒｐｅｓｓｉｍｐｌｅｘｖｉｒｕｓ）（ＨＳＶ）チミジンキナーゼ遺伝子（ＴＫ）を発現する細胞を殺傷する薬剤である、１．５μＭ５−フルオロ−２−デオキシウリジン（ＦｄＵ）で補充したＣＯＶＥ−２プレートに無菌爪楊枝で移した。単一の胞子単離物をＣＯＶＥ−Ｎ−ｇｌｙプレートに移した。

ａｇｓＥ遺伝子を破壊する、ｐＨＵｄａ１７０１を含有するアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）株Ｃ３１０５およびＭ１４０５−１６８５−１６の形質転換体候補をサザン分析によりスクリーニングした。胞子精製形質転換体の各々を３ｍｌのＹＰＧ培地で培養し、２００ｒｐｍで振盪しながら３０℃で２日間インキュベートした。ＭＩＲＡＣＬＯＴＨ（登録商標）でライニングした漏斗を用いて、バイオマスを収集した。粉砕した菌糸体を、ＦａｓｔＤＮＡＳＰＩＮＫｉｔｆｏｒＳｏｉｌ（ＭＰＢｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）を用いたゲノムＤＮＡ調製に製造者の指示に従って供した。

ａｇｓＥ遺伝子座の破壊を確認するために、サザンブロット分析を実施した。各形質転換体からの５μｇのゲノムＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩで消化した。ゲノムＤＮＡ消化反応物は、５μｇのゲノムＤＮＡ、０．５μｌのＨｉｎｄＩＩＩ、０．５μｌのＸｂａＩ、２μｌの１０×ＮＥＢｕｆｆｅｒ４、および２０μｌまでの水から構成された。ゲノムＤＮＡ消化物を３７℃で約１６時間インキュベートした。消化物は、ＴＡＥバッファーを用いた０．８％アガロースゲル電気泳動に付し、ＴＵＲＢＯＢＬＯＴＴＥＲ（登録商標）を用いて、ｈｙｂｏｎｄＮ＋（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＨ，ＵＳＡ）上に、製造者の推奨事項に従い約１時間ブロッティングした。この膜を５００ｂｐジゴキシゲニン標識アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）ａｇｓＥプローブとハイブリダイズしたが、このプローブは、以下に示すプライマーａｇｓＥ５（センス）およびａｇｓＥ６（アンチセンス）を用いたＰＣＲにより、ジゴキシゲニン−１１−ｄＵＴＰの組み込みにより合成したものである。
フォワードプライマー（ａｇｓＥ５）：５’ａｃｃｇｇｇｃａｔｇａａｃａｔｔｔａａｃ（配列番号１７）
リバースプライマー（ａｇｓＥ６）：５’ａａｇｔａｔｔｔａｔｔｇｔａｔｔｔｔｇｇ（配列番号１８）

増幅反応物（１００μｌ）は、最終容量１００μｌで、２００μＭのＰＣＲＤＩＧＬａｂｅｌｉｎｇＭｉｘ（バイアル２）（ＲｏｃｈｅＡｐｐｌｉｅｄＳｃｉｅｎｃｅ，ＰａｌｏＡｌｔｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、０．５μＭのプライマー、ＥＸＰＡＮＤ（登録商標）ＨｉｇｈＦｉｄｅｌｉｔｙＥｎｚｙｍｅミックス（バイアル１）（ＲｏｃｈｅＡｐｐｌｉｅｄＳｃｉｅｎｃｅ，ＰａｌｏＡｌｔｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、および鋳型としての１μｌ（１００ｐｇ／μｌ）のｐＨＵｄａ１６８５から構成された。増幅反応物をＢｉｏ−Ｒａｄ（登録商標）Ｃ１０００Ｔｏｕｃｈ（商標）ＴｈｅｒｍａｌＣｙｃｌｅｒにおいてインキュベートしたが、これは、９４℃で２分を１サイクル；各々が９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、および７２℃で３０秒を３０サイクル、ならびに４℃での保持のようにプログラムした。ＰＣＲ産物は、ＴＡＥバッファーを用いた０．８％アガロースゲル電気泳動により精製し、ここで、０．５ｋｂ断片をゲルから切除した後、ＱＩＡＱＵＩＣＫ（登録商標）ＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔを用いて抽出した。変性プローブをＤＩＧＥａｓｙＨｙｂバッファーに直接添加し、４２℃で一晩ハイブリダイゼーションを実施した。ハイブリダイゼーション後の洗浄（各々、２×ＳＳＣ、室温で５分を２回、および０．１×ＳＳＣ、６８℃で１５分を２回）に続いて、ＤＩＧ検出システムおよびＣＰＤ−Ｓｔａｒ（Ｒｏｃｈｅ）を用いた化学発光検出を製造者のプロトコルに従って実施した。ＤＩＧ標識ＤＮＡＭｏｌｅｃｕｌａｒＷｅｉｇｈｔＭａｒｋｅｒＩＩ（Ｒｏｃｈｅ）を標準的マーカに用いた。

ａｇｓＥ遺伝子座での正しい組み込みを付与する（５．４ｋｂから３．２ｋｂにシフトしたハイブリダイズバンドにより示される）Ｃ３１０５およびＭ１４０５−１６８５−１６からそれぞれ作製された２つの株、Ｍ１４０５−１７０１−１および１６８５−１７０１−１１を後の実験のために選択した。図１を参照されたい。

実施例５：サーモアスカス・オーランティアカス（Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ）金属−プロテアーゼ遺伝子（ａｐ０２５）発現ベクターｐＨＵｄａ１６５７およびｐＨＵｄａ１６９４の構築
プラスミドｐＨＵｄａ１６５７は、タンデムで配置されたアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）中性アミラーゼプロモータＩＩ（Ｐｎａ２）およびグルコアミラーゼターミネータ（Ｔａｍｇ）により駆動されるサーモアスカス・オーランティアカス（Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ）金属−プロテアーゼ遺伝子（ａｐ０２５）の２コピー、選択マーカとしてのＡ．ニズランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）アセトアミダーゼ遺伝子（ａｍｄＳ）、ならびにアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）酸安定性アミラーゼプロモータ（ＰａｓａＡ）およびＡ．オリゼー（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）硝酸レダクターゼターミネータ（Ｔｎｉａｄ）により駆動される酵母サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒａｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＦＬＰ組換え遺伝子（ｆｌｐ）を含有するように構築した。プラスミドｐＨＵｄａ１６９４は、選択マーカとして、ａｍｄＳ選択マーカではなく、Ａ．ニズランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）オロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子（ｐｙｒＧ）を有する以外は、ｐＨＵｄａ１６５７と同じ構築物である。プラスミドは、以下に記載するようにいくつかのステップで構築した。

ｐＨＵｄａ１２６０の構築
プラスミドｐＨＵｄａ１２６０は、ｐＲｉｋａ１４７においてＡ．ニズランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）オロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子（ｐｙｒＧ）からＡ．ニズランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）アセトアミダーゼ遺伝子（ａｍｄＳ）に変更することにより構築した。

プラスミドｐＲｉｋａ１４７（国際公開第２０１２１６００９３号パンフレットの実施例９に記載）をＳｐｈＩおよびＳｐｅＩで消化した後、その末端をＴ４ＤＮＡポリメラーゼの使用により、製造者のプロトコル（ＮＥＢ，ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．）に従って充填した。この断片を、ＴＡＥバッファーを用いた０．８％アガロースゲル電気泳動により精製し、ここで、９，２４１ｂｐ断片をゲルから切除した後、ＱＩＡＱＵＩＣＫ（登録商標）ＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔを用いて抽出した。

プラスミドｐＨＵｄａ１０１９（国際公開第２０１２１６００９３号パンフレットの実施例２に記載）をＸｂａＩおよびＡｖｒＩＩで消化した後、その末端をＴ４ＤＮＡポリメラーゼの使用により、製造者のプロトコル（ＮＥＢ，ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．）に従って充填した。この断片を、ＴＡＥバッファーを用いた０．８％アガロースゲル電気泳動により精製したが、ここで、ａｍｄＳ遺伝子、Ａ．オリゼー（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）ｔｅｆ１（翻訳伸長因子１）プロモータおよびＡ．オリゼー（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）ｎｉａＤ（硝酸レダクターゼ）ターミネータを含有する３，１１４ｂｐ断片をゲルから切除した後、ＱＩＡＱＵＩＣＫ（登録商標）ＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔを用いて抽出した。１μｌの上記９，２４１ｂｐ断片、３μｌの上記３，１１４ｐ断片、１μｌの５×リガーゼバッファー、５μｌの２×リガーゼバッファーおよび１μｌのリガーゼから構成される反応物中で、９，２４１ｂｐ断片を３，１１４ｂｐ断片と連結させた（ＲｏｃｈｅＲａｐｉｄＤＮＡＬｉｇａｔｉｏｎＫｉｔ）。連結反応物を室温で１０分間インキュベートした。５μｌの連結混合物をＤＨ５−αケミカルコンピテント大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞に形質転換した。形質転換体をＬＢプラスアンピシリンプレート上に延ばし、３７℃で一晩インキュベートした。ＱＩＡミニ−プレップキットを用いて、いくつかの形質転換体からプラスミドＤＮＡを精製した。適切な制限酵素の使用により、プラスミドＤＮＡを適切な連結反応についてスクリーニングした後、ＴＡＥバッファーを用いた０．８％アガロースゲル電気泳動に付した。１つのプラスミドをｐＨＵｄａ１２６０と称した（ＰＷＬ：プラスミドマップおよび全配列？）。

プラスミドｐＨＵｄａ１６５７の構築
サーモアスカス・オーランティアカス（Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ）金属−プロテアーゼ遺伝子（ａｐ０２５）を含有するＰＣＲ産物は、下記のプライマーを用いて作製した。
プライマーａｐ０２５−１（センス）：５’ｔｔｔｇｇａｔｃｃａｃｃａｔｇｃｇｔｔｔｃａｔｔｔｃｔｇｔｃｔｃｃ（配列番号１９）
プライマーａｐ０２５−２（アンチセンス）：５’ｃｃａｃｇｔｇｔｔａｇｃａａｃｃａａｇｇｔａｔａｔｇｇｃａｔ（配列番号２０）

国際公開第２００３０４８３５３号パンフレットに記載のａｐ０２５ｃＤＮＡ遺伝子を有するプラスミドＤＮＡ約１００ｎｇ、１μｌのＥｘｐａｎｄＨｉｇｈＦｉｄｅｌｉｔｙポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ）、１００μＭのプライマーａｐ０２５−１、１００μＭのプライマーａｐ０２５−２、５×ＰＣＲバッファー（ＭｇＣｌ２を含む）、２０μｌの２．５ｍＭｄＮＴＰミックス（総量；１００μｌ）から構成される反応物中のＰＣＲにより、所望の断片を増幅した。反応物をＢｉｏ−Ｒａｄ（登録商標）Ｃ１０００Ｔｏｕｃｈ（商標）ＴｈｅｒｍａｌＣｙｃｌｅｒにおいてインキュベートしたが、これは、９４℃で２分を１サイクル；各々が９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、および７２℃で１分を３０サイクル；７２℃で７分を１サイクル；ならびに４℃での保持のようにプログラムした。得られた１，０７３ｂｐのＰＣＲ断片は、ＴＡＥバッファーを用いた０．８％アガロースゲル電気泳動により精製し、ゲルから切除した後、ＱＩＡＱＵＩＣＫ（登録商標）ＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔを用いて抽出した。精製した１，０７３ｂｐのＰＣＲ断片をＢａｍＨＩおよびＰｍＩＩにより消化した。

プラスミドｐＨＵｄａ１２６０は、ＢａｍＨＩおよびＰｍＩＩで消化した後、ＴＡＥバッファーを用いた０．８％アガロースゲル電気泳動により精製したが、ここでは、１０，５１２ｂｐ断片をゲルから切除し、ＱＩＡＱＵＩＣＫ（登録商標）ＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔを用いて抽出した。１μｌの上記１０，５１２ｂｐ断片、３μｌの上記１，０７３ｂｐ断片、１μｌの５×リガーゼバッファー、５μｌの２×リガーゼバッファーおよび１μｌのリガーゼから構成される反応物中で、１０，５１２ｂｐ断片を１，０７３ｂｐＰＣＲ断片と連結させた（ＲｏｃｈｅＲａｐｉｄＤＮＡＬｉｇａｔｉｏｎＫｉｔ）。連結反応物を室温で１０分間インキュベートした。５μｌの連結混合物をＤＨ５−αケミカルコンピテント大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞に形質転換した。形質転換体をＬＢプラスアンピシリンプレート上に延ばし、３７℃で一晩インキュベートした。ＱＩＡミニ−プレップキットを用いて、いくつかの形質転換体からプラスミドＤＮＡを精製した。適切な制限酵素の使用により、プラスミドＤＮＡを適切な連結反応についてスクリーニングした後、ＴＡＥバッファーを用いた０．８％アガロースゲル電気泳動に付した。１つのプラスミドをｐＨＵｄａ１５５５と称した。

プラスミドｐＨＵｄａ１５５５をＳｐｅＩで消化した後、ＴＡＥバッファーを用いた０．８％アガロースゲル電気泳動により精製し、ここで、１１，５８５ｂｐ断片をゲルから切除し、ＱＩＡＱＵＩＣＫ（登録商標）ＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔを用いて抽出した。

プラスミドｐＨＵｄａ１５５５をＮｈｅＩおよびＳｐｅＩで消化した後、ＴＡＥバッファーを用いた０．８％アガロースゲル電気泳動により精製し、ここで、ａｐ０２５遺伝子、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）中性アミラーゼプロモータＩＩ（Ｐｎａ２）およびグルコアミラーゼターミネータ（Ｔａｍｇ）を含有する２，６９９ｂｐ断片をゲルから切除し、ＱＩＡＱＵＩＣＫ（登録商標）ＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔを用いて抽出した。１μｌの上記１１，５８５ｂｐ断片、３μｌの上記２，６９９ｂｐ断片、１μｌの５×リガーゼバッファー、５μｌの２×リガーゼバッファーおよび１μｌのリガーゼから構成される反応物中で、１１，５８５ｂｐ断片を２，６９９ｂｐ断片と連結させた（ＲｏｃｈｅＲａｐｉｄＤＮＡＬｉｇａｔｉｏｎＫｉｔ）。連結反応物を室温で１０分間インキュベートした。５μｌの連結混合物をＤＨ５−αケミカルコンピテント大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞に形質転換した。形質転換体をＬＢプラスアンピシリンプレート上に延ばし、３７℃で一晩インキュベートした。ＱＩＡミニ−プレップキットを用いて、いくつかの形質転換体からプラスミドＤＮＡを精製した。適切な制限酵素の使用により、プラスミドＤＮＡを適切な連結反応についてスクリーニングした後、ＴＡＥバッファーを用いた０．８％アガロースゲル電気泳動に付した。１つのプラスミドをｐＨＵｄａ１６５７と称した（図４）。

プラスミドｐＨＵｄａ１６９４の構築
プラスミドｐＲｉｋａ１４７をＮｈｅＩおよびＳｐｅＩで消化した後、ＴＡＥバッファーを用いた０．８％アガロースゲル電気泳動により精製したが、ここで、７，２６８ｂｐ断片をゲルから切除し、ＱＩＡＱＵＩＣＫ（登録商標）ＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔを用いて抽出した。

プラスミドｐＨＵｄａ１６５７をＮｈｅＩおよびＳｐｅＩで消化した後、ＴＡＥバッファーを用いた０．８％アガロースゲル電気泳動により精製したが、ここでは、ａｐ０２５遺伝子のタンデム構築物、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）中性アミラーゼプロモータＩＩ（Ｐｎａ２）およびグルコアミラーゼターミネータ（Ｔａｍｇ）を含有する５，０３６ｂｐ断片をゲルから切除し、ＱＩＡＱＵＩＣＫ（登録商標）ＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔを用いて抽出した。１μｌの上記７，２６８ｂｐ断片、３μｌの上記５，０３６ｂｐ断片、１μｌの５×リガーゼバッファー、５μｌの２×リガーゼバッファーおよび１μｌのリガーゼから構成される反応物中で、７，２６８ｂｐ断片を５，０３６ｂｐ断片と連結させた（ＲｏｃｈｅＲａｐｉｄＤＮＡＬｉｇａｔｉｏｎＫｉｔ）。連結反応物を室温で１０分間インキュベートした。５μｌの連結混合物をＤＨ５−αケミカルコンピテント大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞に形質転換した。形質転換体をＬＢプラスアンピシリンプレート上に延ばし、３７℃で一晩インキュベートした。ＱＩＡミニ−プレップキットを用いて、いくつかの形質転換体からプラスミドＤＮＡを精製した。適切な制限酵素の使用により、プラスミドＤＮＡを適切な連結反応についてスクリーニングした後、ＴＡＥバッファーを用いた０．８％アガロースゲル電気泳動に付した。１つのプラスミドをｐＨＵｄａ１６９４と称した（図５）。

実施例６：アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）株Ｃ３１０５およびＭ１４０５−１６８５−１６へのサーモアスカス・オーランティアカス（Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ）金属−プロテアーゼ遺伝子（ａｐ０２５）発現ベクターｐＨＵｄａ１６５７の導入
ａｐ０２５発現プラスミドは、ｆｌｐリコンビナーゼにより、４つの事前に指定された遺伝子座、すなわち、中性アミラーゼＩ（ａｍｙＡ）、中性アミラーゼＩＩ（ａｍｙＢ）、酸安定性アミラーゼ（ａｓａＡ）および推定アルカリスルファターゼ（ｐａｙＡ）に導入すべきである。

アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）株Ｃ３１０５およびＭ１４０５−１６８５−１６のプロトプラストは、１００ｍｌのＹＰＧ培地においてこの株を３２℃で１６時間にわたって８０ｒｐｍで穏やかに攪拌しながら培養することにより調製した。ペレットを収集し、０．６ＭＫＣｌで洗浄した後、１ｍｌ当たり２０ｍｇの最終濃度で市販のβ−グルカナーゼ製品（ＧＬＵＣＡＮＥＸ（商標）、ＮｏｖｏｚｙｍｅｓＡ／Ｓ，Ｂａｇｓｖａｅｒｄ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を含有する２０ｍｌの０．６ＭＫＣｌに再懸濁させた。プロトプラストが形成されるまで、懸濁液を３２℃、８０ｒｐｍでインキュベートした。ＭＩＲＡＣＬＯＴＨ（登録商標）でライニングした漏斗を介して５０ｍｌの無菌プラスチック製遠心管中にプロトプラストを濾過した後、０．６ＭＫＣｌで洗浄して、捕捉したプロトプラストを抽出した。合わせた濾過物および上清を２，０００ｒｐｍで１５分間の遠心分離により収集した。上清を廃棄し、ペレットを１０〜２５ｍｌのＳＴＣで洗浄し、２，０００ｒｐｍで１０分間再度遠心分離した後、ＳＴＣバッファーで２回洗浄した。プロトプラストをヘマトメータで計数してから、ＳＴＣ：ＳＴＰＣ：ＤＭＳＯの８：２：０．１溶液に再懸濁させ、最終濃度２．５×１０^７プロトプラスト／ｍｌに調節した。

約１０μｇのｐＨＵｄａ１６５７を０．３ｍｌのプロトプラスト懸濁液に添加し、穏やかに混合した後、氷上で３０分間インキュベートした。３ｍｌのＳＰＴＣを添加し、プロトプラスト懸濁液を３７℃で２０分間インキュベートした。Ｃ３１０５およびＭ１４０５−１６８５−１６に存在するアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）シトシンデアミナーゼ（ｆｃｙ１）遺伝子を発現する細胞を殺傷する薬剤である、５０マイクログラム／ｍｌの５’フルオロシトシン（５ＦＣ）で補充した１２ｍｌの５０℃のＣＯＶＥトップアガロースを添加後、混合物をＣＯＶＥプレートに注ぎ、これらのプレートを３０℃で１０日間インキュベートした。増殖した形質転換体を、１０μｇ／ｍｌの５’フルオロシトシン（５ＦＣ）で補充したＣＯＶＥ−２プレートに無菌爪楊枝で移した。単一の胞子単離物をＣＯＶＥ−Ｎ−ｇｌｙプレートに移した。

ａｐ０２５遺伝子を導入する、ｐＨＵｄａ１６５７を含有するアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）株Ｃ３１０５およびＭ１４０５−１６８５−１６の形質転換体候補をサザン分析によりスクリーニングした。胞子精製形質転換体の各々を３ｍｌのＹＰＧ培地で培養し、２００ｒｐｍで振盪しながら３０℃で２日間インキュベートした。ＭＩＲＡＣＬＯＴＨ（登録商標）でライニングした漏斗を用いて、バイオマスを収集した。粉砕した菌糸体を、ＦａｓｔＤＮＡＳＰＩＮＫｉｔｆｏｒＳｏｉｌ（ＭＰＢｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）を用いたゲノムＤＮＡ調製に製造者の指示に従って供した。

４つの事前に指定された遺伝子座（ａｍｙＡ、ａｍｙＢ、ａｓａＡ、ｐａｙＡ）でのａｐ０２５遺伝子の導入を確認するために、サザンブロット分析を実施した。各形質転換体からの５μｇのゲノムＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩで消化した。ゲノムＤＮＡ消化反応物は、５μｇのゲノムＤＮＡ、０．５μｌのＨｉｎｄＩＩＩ、２μｌの１０×ＮＥＢｕｆｆｅｒ４、および２０μｌまでの水から構成された。ゲノムＤＮＡ消化物を３７℃で約１６時間インキュベートした。消化物は、ＴＡＥバッファーを用いた０．５％アガロースゲル電気泳動に付し、ＴＵＲＢＯＢＬＯＴＴＥＲ（登録商標）を用いて、ｈｙｂｏｎｄＮ＋（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＨ，ＵＳＡ）上に、製造者の推奨事項に従い約１時間ブロッティングした。この膜を５００ｂｐジゴキシゲニン標識ａｐ０２５プローブとハイブリダイズしたが、このプローブは、以下に示すプライマーａｐ０２５−３（センス）およびａｐ０２５−４（アンチセンス）を用いたＰＣＲによるジゴキシゲニン−１１−ｄＵＴＰの組み込みにより合成したものである。
フォワードプライマー（ａｐ０２５−３）：５’ａｇｇａｔｃａｇｔｔｃｃｔｇｃｔｃｃｇｇ（配列番号２１）
リバースプライマー（ａｐ０２５−４）：５’ｇｇｔａｔａｔｇｇｃａｔｔｃｇｃａｔａｇ（配列番号２２）

増幅反応物（１００μｌ）は、最終容量１００μｌで、２００μＭのＰＣＲＤＩＧＬａｂｅｌｉｎｇＭｉｘ（バイアル２）（ＲｏｃｈｅＡｐｐｌｉｅｄＳｃｉｅｎｃｅ，ＰａｌｏＡｌｔｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、０．５μＭのプライマー、ＥＸＰＡＮＤ（登録商標）ＨｉｇｈＦｉｄｅｌｉｔｙＥｎｚｙｍｅミックス（バイアル１）（ＲｏｃｈｅＡｐｐｌｉｅｄＳｃｉｅｎｃｅ，ＰａｌｏＡｌｔｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、および鋳型としての１μｌ（１００ｐｇ／μｌ）のｐＨＵｄａ１５５５から構成された。増幅反応物をＢｉｏ−Ｒａｄ（登録商標）Ｃ１０００Ｔｏｕｃｈ（商標）ＴｈｅｒｍａｌＣｙｃｌｅｒにおいてインキュベートしたが、これは、９４℃で２分を１サイクル；各々が９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、および７２℃で３０秒を３０サイクル、ならびに４℃での保持のようにプログラムした。ＰＣＲ産物は、ＴＡＥバッファーを用いた０．８％アガロースゲル電気泳動により精製し、ここで、０．５ｋｂ断片をゲルから切除した後、ＱＩＡＱＵＩＣＫ（登録商標）ＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔを用いて抽出した。変性プローブをＤＩＧＥａｓｙＨｙｂバッファーに直接添加し、４２℃で一晩ハイブリダイゼーションを実施した。ハイブリダイゼーション後の洗浄（各々、２×ＳＳＣ、室温で５分を２回、および０．１×ＳＳＣ、６８℃で１５分を２回）に続いて、ＤＩＧ検出システムおよびＣＰＤ−Ｓｔａｒ（Ｒｏｃｈｅ）を用いた化学発光検出を製造者のプロトコルに従って実施した。ＤＩＧ標識ＤＮＡＭｏｌｅｃｕｌａｒＷｅｉｇｈｔＭａｒｋｅｒＩＩ（Ｒｏｃｈｅ）を標準的マーカに用いた。

親株Ｃ３１０５およびＭ１４０５−１６８５−１６からそれぞれ作製され、各々が４つの遺伝子座での正しい組み込み（６．６ｋｂ、７．０ｋｂ、８．６ｋｂおよび１０．１ｋｂのサイズの４つのハイブリダイズバンド）を有する、２つの株Ｃ３１０５−１６５７−８および１６８５−１６５７−１６を後の実験のために選択した。図１を参照されたい。

実施例７：アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）株、Ｍ１４０５−１７０１−１および１６８５−１７０１−１１へのサーモアスカス・オーランティアカス（Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ）金属−プロテアーゼ遺伝子（ａｐ０２５）発現ベクターｐＨＵｄａ１６９４の導入
ａｐ０２５発現プラスミドは、ＦＬＰリコンビナーゼにより、４つの事前に指定された遺伝子座、すなわち、中性アミラーゼＩ（ａｍｙＡ）、中性アミラーゼＩＩ（ａｍｙＢ）、酸安定性アミラーゼ（ａｓａＡ）および推定アルカリスルファターゼ（ｐａｙＡ）に導入すべきである。

Ｍ１４０５−１７０１−１および１６８５−１７０１−１１のｐｙｒＧ遺伝子を以下の通りレスキューした。両方の株を、１０ｍＭウリジンおよび１ｇ／Ｌの５−フルオロ−オロチン酸（５−ＦＯＡ）を含有するＣｏｖｅ−ＮＪＰ培地に３０℃で５日かけて接種した。ｐｙｒＧ遺伝子を欠失した株は、５−ＦＯＡの存在下で増殖し；この遺伝子を保持する株は、５−ＦＯＡを、毒性中間体である５−フルオロ−ＵＭＰに変換するであろう。増殖したコロニーを、１０ｍＭウリジンで補充したＣＯＶＥ−Ｎ−ｇｌｙプレートに無菌爪楊枝で移し、３０℃で７日間増殖させた。Ｍ１４０５−１７０１−１、１６８５−１７０１−１１から単離した株をそれぞれＭ１４０５−１７０１−Ｐ２および１６８５−１７０１−１１−Ｐ１と称した。

アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）株Ｍ１４０５−１７０１−Ｐ２および１６８５−１７０１−１１−Ｐ１のプロトプラストは、１０ｍＭウリジンで補充した１００ｍｌのＹＰＧ培地においてこの株を３２℃で１６時間にわたり８０ｒｐｍで穏やかに攪拌しながら培養することにより、調製した。ペレットを収集し、０．６ＭＫＣｌで洗浄した後、１ｍｌ当たり２０ｍｇの最終濃度で市販のβ−グルカナーゼ製品（ＧＬＵＣＡＮＥＸ（商標）、ＮｏｖｏｚｙｍｅｓＡ／Ｓ，Ｂａｇｓｖａｅｒｄ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を含有する２０ｍｌの０．６ＭＫＣｌに再懸濁させた。プロトプラストが形成されるまで、懸濁液を３２℃、８０ｒｐｍでインキュベートした。ＭＩＲＡＣＬＯＴＨ（登録商標）でライニングした漏斗を介して５０ｍｌの無菌プラスチック製遠心管中にプロトプラストを濾過した後、０．６ＭＫＣｌで洗浄して、捕捉したプロトプラストを抽出した。合わせた濾過物および上清を２，０００ｒｐｍで１５分間の遠心分離により収集した。上清を廃棄し、ペレットを１０〜２５ｍｌのＳＴＣで洗浄し、２，０００ｒｐｍで１０分間再度遠心分離した後、ＳＴＣバッファーで２回洗浄した。プロトプラストをヘマトメータで計数してから、ＳＴＣ：ＳＴＰＣ：ＤＭＳＯの８：２：０．１溶液に再懸濁させ、最終濃度２．５×１０^７プロトプラスト／ｍｌに調節した。

約１０μｇのｐＨＵｄａ１６９４を０．３ｍｌのプロトプラスト懸濁液に添加し、穏やかに混合した後、氷上で３０分間インキュベートした。３ｍｌのＳＰＴＣを添加し、プロトプラスト懸濁液を３７℃で２０分間インキュベートした。Ｍ１４０５−１７０１−Ｐ２および１６８５−１７０１−１１−Ｐ１に存在するアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）シトシンデアミナーゼ（ｆｃｙ１）遺伝子を発現する細胞を殺傷する薬剤である、５０μｇ／ｍｌの５’フルオロシトシン（５ＦＣ）で補充した１２ｍｌの５０℃のＣＯＶＥ−Ｎトップアガロースを添加後、混合物をＣＯＶＥ−Ｎプレートに注ぎ、これらのプレートを３０℃で１０日間インキュベートした。増殖した形質転換体を、１０マイクログラム／ｍｌの５’フルオロシトシン（５ＦＣ）で補充したＣＯＶＥ−ＮＪＰプレートに無菌爪楊枝で移した。単一の胞子単離物をＣＯＶＥ−Ｎ−ｇｌｙプレートに移した。

ａｐ０２５遺伝子を導入する、ｐＨＵｄａ１６９４を含有するアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）株Ｍ１４０５−１７０１−Ｐ２および１６８５−１７０１−１１−Ｐ１の形質転換体候補をサザン分析によりスクリーニングした。胞子精製形質転換体の各々を３ｍｌのＹＰＧ培地で培養し、２００ｒｐｍで振盪しながら３０℃で２日間インキュベートした。ＭＩＲＡＣＬＯＴＨ（登録商標）でライニングした漏斗を用いて、バイオマスを収集した。粉砕した菌糸体を、ＦａｓｔＤＮＡＳＰＩＮＫｉｔｆｏｒＳｏｉｌ（ＭＰＢｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）を用いたゲノムＤＮＡ調製に製造者の指示に従って供した。

４つの事前に指定された遺伝子座（ａｍｙＡ、ａｍｙＢ、ａｓａＡ、ｐａｙＡ）でのａｐ０２５遺伝子の導入を確認するために、サザンブロット分析を実施した。各形質転換体からの５μｇのゲノムＤＮＡをＡｖｒＩＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化した。ゲノムＤＮＡ消化反応物は、５μｇのゲノムＤＮＡ、０．５μｌのＨｉｎｄＩＩＩ、２μｌの１０×ＮＥＢｕｆｆｅｒ４、および２０μｌまでの水から構成された。ゲノムＤＮＡ消化物を３７℃で約１６時間インキュベートした。消化物は、ＴＡＥバッファーを用いた０．５％アガロースゲル電気泳動に付し、ＴＵＲＢＯＢＬＯＴＴＥＲ（登録商標）を用いて、ｈｙｂｏｎｄＮ＋（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＨ，ＵＳＡ）上に、製造者の推奨事項に従い約１時間ブロッティングした。この膜を５００ｂｐジゴキシゲニン標識ａｐ０２５プローブとハイブリダイズしたが、このプローブは、以下に示すプライマーａｐ０２５−３（センス）およびａｐ０２５−４（アンチセンス）を用いたＰＣＲによる、ジゴキシゲニン−１１−ｄＵＰの組み込みにより合成したものである。
フォワードプライマー（ａｐ０２５−３）：５’ａｇｇａｔｃａｇｔｔｃｃｔｇｃｔｃｃｇｇ（配列番号２３）
リバースプライマー（ａｐ０２５−４）：５’ｇｇｔａｔａｔｇｇｃａｔｔｃｇｃａｔａｇ（配列番号２４）

増幅反応物（１００μｌ）は、最終容量１００μｌで、２００μＭのＰＣＲＤＩＧＬａｂｅｌｉｎｇＭｉｘ（バイアル２）（ＲｏｃｈｅＡｐｐｌｉｅｄＳｃｉｅｎｃｅ，ＰａｌｏＡｌｔｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、０．５μＭのプライマー、ＥＸＰＡＮＤ（登録商標）ＨｉｇｈＦｉｄｅｌｉｔｙＥｎｚｙｍｅミックス（バイアル１）（ＲｏｃｈｅＡｐｐｌｉｅｄＳｃｉｅｎｃｅ，ＰａｌｏＡｌｔｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、および鋳型としての１μｌ（１００ｐｇ／μｌ）のｐＨＵｄａ１５５５から構成された。増幅反応物をＢｉｏ−Ｒａｄ（登録商標）Ｃ１０００Ｔｏｕｃｈ（商標）ＴｈｅｒｍａｌＣｙｃｌｅｒにおいてインキュベートしたが、これは、９４℃で２分を１サイクル；各々が９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、および７２℃で３０秒を３０サイクル、ならびに４℃での保持のようにプログラムした。ＰＣＲ産物は、ＴＡＥバッファーを用いた０．８％アガロースゲル電気泳動により精製し、ここで、０．５ｋｂ断片をゲルから切除した後、ＱＩＡＱＵＩＣＫ（登録商標）ＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔを用いて抽出した。変性プローブをＤＩＧＥａｓｙＨｙｂバッファーに直接添加し、４２℃で一晩のハイブリダイゼーションを実施した。ハイブリダイゼーション後の洗浄（各々、２×ＳＳＣ、室温で５分を２回、０．１×ＳＳＣ、６８℃で１５分を２回）に続いて、ＤＩＧ検出システムおよびＣＰＤ−Ｓｔａｒ（Ｒｏｃｈｅ）を用いた化学発光検出を製造者のプロトコルに従って実施した。ＤＩＧ標識ＤＮＡＭｏｌｅｃｕｌａｒＷｅｉｇｈｔＭａｒｋｅｒＩＩ（Ｒｏｃｈｅ）を標準的マーカに用いた。

Ｍ１４０５−１７０１および１６８５−１７０１−１１からそれぞれ作製され、各々が４つの遺伝子座での正しい組み込み（６．０ｋｂ、６．３ｋｂ、７．３ｋｂおよび９．４ｋｂのサイズの４つのハイブリダイズバンド）を有する、２つの株１７０１−１６９４−１および１６８５−１７０１−１８を後の実験のために選択した。図１を参照されたい。

実施例８：振盪フラスコ培養物中のＡＰ０２５プロテアーゼ発現評価
アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）株Ｃ３１０５−１６５７−８、１６８５−１６５７−１６、１７０１−１６９４−１および１６８５−１７０１−１６９４−１８をＣＯＶＥ−Ｎ−ｇｌｙプレート上で３０℃にて約１週間培養した。無菌のトランスファーピペットを用いて、各プレートから小さな栓子の一片をつまみ、これらを各々５００ｍｌフラスコ内の１００ｍｌのＭＳＳ培地に接種した。これらのフラスコを３０℃、２００ｒｐｍで３日間インキュベートした。次に、１０ｍｌの培養ブロスを５００ｍｌフラスコ内の１００ｍｌのＭＵ１ｇｌｕ培地に移した。これらのフラスコを３０℃、２００ｒｐｍで６日間インキュベートした。各培養物を１０ｍｌの試験管中、５，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、プロテアーゼ生産性を決定するために培養上清を回収した。プロテアーゼ生産性アッセイは、ＱｕｉｃｋＳｔａｒｔ（商標）ブラッドフォードタンパク質アッセイキット（ＢｒａｄｆｏｒｄＰｒｏｔｅｉｎＡｓｓａｙＫｉｔ）（Ｂｉｏ−Ｒａｄｉｎｃ．）を用いて実施した。培養上清は、蒸留水で適度に希釈した。ウシ血清アルブミン（ＷＡＫＯカタログ番号５１９−８３９２１）は、蒸留水中０．５ｍｇ／ｍｌの濃度で出発し、０．１ｍｇ／ｍｌの濃度で終了するいくつかのステップで希釈した。標準を含む各希釈物５μｌずつを９６ウェル平底プレートに移した。２５０μｌの１×ＤｙｅＲｅａｇｅｎｔ溶液を各ウェルに添加し、室温で５分間インキュベートした。反応の終点を５９５ｎｍで測定した。作成した標準曲線からの外挿により、全タンパク質生産性を決定し、１００％に設定したアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）株Ｃ３１０５−１６８５−８と比較した。

振盪フラスコ内で、単一のａｇｓＡまたはａｇｓＥ遺伝子破壊株は、親参照株アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）株Ｃ３１０５−１６５７−８と同等か、またはそれより若干低いプロテアーゼＡＰ０２５生産性を示したものの、ａｇｓＡおよびａｇｓＥ二重遺伝子破壊株は、参照株アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）株Ｃ３１０５−１６５７−８より２３％高いＡＰ０２５生産性を付与した（表１）。

Claims

対象のポリペプチドを産生する突然変異糸状真菌宿主細胞であって、ここで、α−グルカン合成に関与する２つ以上のポリペプチドをコードする２つ以上のポリヌクレオチドが不活性化され、前記２つ以上のポリペプチドは、以下：
（ａ）配列番号３のアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）ＡｇｓＡポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、α−グルカン合成に関与するポリペプチド、および配列番号６のアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）ＡｇｓＥポリペプチドと少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、α−グルカン合成に関与するポリペプチド；
（ｂ）（ｉ）配列番号１のアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）ａｇｓＡゲノムヌクレオチド配列と少なくとも７０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むゲノムポリペプチド、および配列番号４のアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）ａｇｓＥゲノムヌクレオチド配列と少なくとも７０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むゲノムポリヌクレオチドによりコードされる、α−グルカン合成に関与するポリペプチド；または
（ｉｉ）（ｉ）配列番号２および配列番号５にそれぞれ示すｃＤＮＡヌクレオチド配列；ならびに
（ｃ）中度の緊縮条件下で、以下：
（Ｉ）それぞれ、配列番号１のアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）ａｇｓＡゲノムヌクレオチド配列および配列番号４のアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）ａｇｓＥゲノムヌクレオチド配列と；
（ＩＩ）（Ｉ）配列番号２および配列番号５にそれぞれ示すｃＤＮＡヌクレオチド配列と、または
（ＩＩＩ）（Ｉ）もしくは（ＩＩ）の完全長補体と
ハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされる、α−グルカン合成に関与する２つのポリペプチド
からなる群から選択される、突然変異糸状真菌宿主細胞。
アクレモニウム属（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、アウレオバシジウム属（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ）、ブエルカンデラ属（Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ）、セリポリオプシス属（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ）、クリソスポリウム属（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、コプリヌス属（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ）、コリオルス属（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ）、クリプトコッカス属（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、フィリバシジウム属（Ｆｉｌｉｂａｓｉｄｉｕｍ）、フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、フミコラ属（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、マグナポルテ属（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ）、ムコール属（Ｍｕｃｏｒ）、ミセリオフトラ属（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）、ネオカリマスチクス属（Ｎｅｏｃａｌｌｉｍａｓｔｉｘ）、ニューロスポラ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、パエシロマイセス属（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ）、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、ファネロケーテ属（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ）、フレビア属（Ｐｈｌｅｂｉａ）、ピロマイセス属（Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ）、プレウロツス属（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ）、シゾフィルム属（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ）、タラロマイセス属（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）、テルモアスクス属（Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ）、チエラビア属（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）、トリポクラジウム属（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）、トラメテス属（Ｔｒａｍｅｔｅｓ）、またはトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）細胞である、請求項１に記載の突然変異糸状真菌宿主細胞。
アスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルス・フォエティダス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｆｏｅｔｉｄｕｓ）、アスペルギルス・フミガーツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、アスペルギルス・ジャポニクス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、アスペルギルス・ニズランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｒｙｚａｅ）、ヤケイロタケ（Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａａｄｕｓｔａ）、セリポリオプシス・アネイリナ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓａｎｅｉｒｉｎａ）、セリポリオプシス・カレギエア（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓｃａｒｅｇｉｅａ）、セリポリオプシス・ギルベスセンス（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓｇｉｌｖｅｓｃｅｎｓ）、セリポリオプシス・パンノシンタ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓｐａｎｎｏｃｉｎｔａ）、セリポリオプシス・リブロサ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓｒｉｖｕｌｏｓａ）、セリポリオプシス・スブルファ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓｓｕｂｒｕｆａ）、セリポリオプシス・スブベルミスポラ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓｓｕｂｖｅｒｍｉｓｐｏｒａ）、クリソスポリウム・イノプス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍｉｎｏｐｓ）、クリソスポリウム・ケラチノフィルム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍｋｅｒａｔｉｎｏｐｈｉｌｕｍ）、クリソスポリウム・ルクノウェンス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）、クリソスポリウム・メルダリウム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍｍｅｒｄａｒｉｕｍ）、クリソスポリウム・パンニコラ（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍｐａｎｎｉｃｏｌａ）、クリソスポリウム・クイーンスランジクム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍｑｕｅｅｎｓｌａｎｄｉｃｕｍ）、クリソスポリウム・トロピクム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍｔｒｏｐｉｃｕｍ）、クリソスポリウム・ゾナツム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍｚｏｎａｔｕｍ）、コプリヌス・シネレウス（Ｃｏｐｒｉｎｕｓｃｉｎｅｒｅｕｓ）、クリオルス・ヒルスツス（Ｃｏｒｉｏｌｕｓｈｉｒｓｕｔｕｓ）、フザリウム・バクテリジオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍｂａｃｔｒｉｄｉｏｉｄｅｓ）、フザリウム・セレアリス（Ｆｕｓａｒｉｕｍｃｅｒｅａｌｉｓ）、フザリウム・クロークウェレンス（Ｆｕｓａｒｉｕｍｃｒｏｏｋｗｅｌｌｅｎｓｅ）、フザリウム・クルモルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍｃｕｌｍｏｒｕｍ）、フザリウム・グラミネアルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）、フザリウム・グラミヌム（Ｆｕｓａｒｉｕｍｇｒａｍｉｎｕｍ）、フザリウム・ヘテロスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍｈｅｔｅｒｏｓｐｏｒｕｍ）、フザリウム・ネグンディ（Ｆｕｓａｒｉｕｍｎｅｇｕｎｄｉ）、フザリウム・オキシスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、フザリウム・レチクランツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍｒｅｔｉｃｕｌａｔｕｍ）、フザリウム・ロゼウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍｒｏｓｅｕｍ）、フザリウム・サムブシヌム（Ｆｕｓａｒｉｕｍｓａｍｂｕｃｉｎｕｍ）、フザリウム・サルコクロウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍｓａｒｃｏｃｈｒｏｕｍ）、フザリウムス・スポロトリキオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｉｏｉｄｅｓ）、フザリウム・スルフレウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｕｌｐｈｕｒｅｕｍ）、フザリウム・トルロスム（Ｆｕｓａｒｉｕｍｔｏｒｕｌｏｓｕｍ）、フザリウム・トリコテシオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｉｏｉｄｅｓ）、フザリウム・ベネナツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍｖｅｎｅｎａｔｕｍ）、フミコラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａｉｎｓｏｌｅｎｓ）、フミコラ・ラヌギノサ（Ｈｕｍｉｃｏｌａｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）、ムコール・ミエヘイ（Ｍｕｃｏｒｍｉｅｈｅｉ）、ミセリオフトラ・テルモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａｃｒａｓｓａ）、ペニシリウム・プルプロゲヌム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍｐｕｒｐｕｒｏｇｅｎｕｍ）、ファネロケーテ・クリソスポリウム（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、フレビア・ラジアタ（Ｐｈｌｅｂｉａｒａｄｉａｔａ）、プレウロツス・エリンギイ（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓｅｒｙｎｇｉｉ）、チエラビア・テルレストリス（Ｔｈｉｅｌａｖｉａｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）、トラメテス・ビロサ（Ｔｒａｍｅｔｅｓｖｉｌｌｏｓａ）、トラメテス・ベルシコロル（Ｔｒａｍｅｔｅｓｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）、トリコデルマ・ハルジアヌム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｈａｒｚｉａｎｕｍ）、トリコデルマ・コニンギイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｋｏｎｉｎｇｉｉ）、トリコデルマ・ロンギブラキアツム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）、トリコデルマ・レエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｒｅｅｓｅｉ）、またはトリコデルマ・ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｖｉｒｉｄｅ）細胞である、請求項１または２に記載の突然変異糸状真菌宿主細胞。
前記対象のポリペプチドが、前記宿主細胞に対して相同的または異種であり；好ましくは、前記対象のポリペプチドは、分泌されたポリペプチドであり；より好ましくは、これは、ホルモン、酵素、受容体もしくはその一部、抗体もしくはその一部、またはリポータであり；さらに好ましくは、前記対象のポリペプチドは、ヒドロラーゼ、イソメラーゼ、リガーゼ、リアーゼ、オキシドレダクターゼもしくはトランスフェラーゼであり；最も好ましくは、前記対象のポリペプチドは、α−ガラクトシダーゼ、α−グルコシダーゼ、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、β−キシロシダーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セロビオヒドロラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エンドグルカナーゼ、エステラーゼ、グルコアミラーゼ、インベルターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、マンノシダーゼ、ムタナーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素、ペルオキシダーゼ、フィターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、タンパク質分解酵素、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼ、またはキシラーゼである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の突然変異糸状真菌宿主細胞。
前記２つ以上のポリヌクレオチドの不活性化が、前記２つ以上のポリヌクレオチドおよび／またはそれぞれのプロモータの突然変異により；好ましくは、前記宿主細胞のゲノムからの前記２つ以上のポリヌクレオチドおよび／またはそれぞれのプロモータの部分的もしくは完全な欠失により、実施される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の突然変異糸状真菌宿主細胞。
前記２つ以上のポリヌクレオチドが、配列番号３のアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）ＡｇｓＡポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、またはそれから構成されるα−グルカン合成に関与するポリペプチド、および配列番号６のアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）ＡｇｓＥポリペプチドと少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、またはそれから構成されるα−グルカン合成に関与するポリペプチドをコードする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の突然変異糸状真菌宿主細胞。
突然変異糸状真菌宿主細胞において対象のポリペプチドを生成する方法であって、前記方法が、以下：
（ａ）前記対象のポリペプチドの産生を促す条件下で、請求項１〜６のいずれか１項に記載の突然変異糸状真菌宿主細胞を培養するステップ；および、任意選択で、
（ｂ）前記対象のポリペプチドを回収するステップ
を含む方法。
突然変異した糸状真菌宿主細胞を構築する方法であって、前記方法は、糸状真菌宿主細胞において２つ以上のポリペプチドをそれぞれコードする２つ以上のポリヌクレオチドを不活性化するステップを含み、前記２つ以上のポリペプチドが、以下：
（ａ）配列番号３のアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）ＡｇｓＡポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、α−グルカン合成に関与するポリペプチド、および配列番号６のアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）ＡｇｓＥポリペプチドと少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、α−グルカン合成に関与するポリペプチド；
（ｂ）（ｉ）配列番号１のアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）ａｇｓＡゲノムヌクレオチド配列と少なくとも７０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むゲノムポリペプチド、および配列番号４のアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）ａｇｓＥゲノムヌクレオチド配列と少なくとも７０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むゲノムポリヌクレオチドによりコードされる、α−グルカン合成に関与するポリペプチド；または
（ｉｉ）（ｉ）配列番号２および配列番号５にそれぞれ示すｃＤＮＡヌクレオチド配列；ならびに
（ｃ）中度の緊縮条件下で、以下：
（Ｉ）それぞれ、配列番号１のアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）ａｇｓＡゲノムヌクレオチド配列および配列番号４のアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）ａｇｓＥゲノムヌクレオチド配列と；
（ＩＩ）（Ｉ）配列番号２および配列番号５にそれぞれ示すｃＤＮＡヌクレオチド配列と、または
（ＩＩＩ）（Ｉ）もしくは（ＩＩ）の完全長補体と
ハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされる、α−グルカン合成に関与する２つのポリペプチド
からなる群から選択される方法。
前記糸状真菌宿主細胞が、アスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルス・フォエティダス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｆｏｅｔｉｄｕｓ）、アスペルギルス・フミガーツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、アスペルギルス・ジャポニクス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、アスペルギルス・ニズランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｒｙｚａｅ）、ヤケイロタケ（Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａａｄｕｓｔａ）、セリポリオプシス・アネイリナ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓａｎｅｉｒｉｎａ）、セリポリオプシス・カレギエア（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓｃａｒｅｇｉｅａ）、セリポリオプシス・ギルベスセンス（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓｇｉｌｖｅｓｃｅｎｓ）、セリポリオプシス・パンノシンタ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓｐａｎｎｏｃｉｎｔａ）、セリポリオプシス・リブロサ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓｒｉｖｕｌｏｓａ）、セリポリオプシス・スブルファ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓｓｕｂｒｕｆａ）、セリポリオプシス・スブベルミスポラ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓｓｕｂｖｅｒｍｉｓｐｏｒａ）、クリソスポリウム・イノプス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍｉｎｏｐｓ）、クリソスポリウム・ケラチノフィルム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍｋｅｒａｔｉｎｏｐｈｉｌｕｍ）、クリソスポリウム・ルクノウェンス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）、クリソスポリウム・メルダリウム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍｍｅｒｄａｒｉｕｍ）、クリソスポリウム・パンニコラ（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍｐａｎｎｉｃｏｌａ）、クリソスポリウム・クイーンスランジクム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍｑｕｅｅｎｓｌａｎｄｉｃｕｍ）、クリソスポリウム・トロピクム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍｔｒｏｐｉｃｕｍ）、クリソスポリウム・ゾナツム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍｚｏｎａｔｕｍ）、コプリヌス・シネレウス（Ｃｏｐｒｉｎｕｓｃｉｎｅｒｅｕｓ）、クリオルス・ヒルスツス（Ｃｏｒｉｏｌｕｓｈｉｒｓｕｔｕｓ）、フザリウム・バクテリジオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍｂａｃｔｒｉｄｉｏｉｄｅｓ）、フザリウム・セレアリス（Ｆｕｓａｒｉｕｍｃｅｒｅａｌｉｓ）、フザリウム・クロークウェレンス（Ｆｕｓａｒｉｕｍｃｒｏｏｋｗｅｌｌｅｎｓｅ）、フザリウム・クルモルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍｃｕｌｍｏｒｕｍ）、フザリウム・グラミネアルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）、フザリウム・グラミヌム（Ｆｕｓａｒｉｕｍｇｒａｍｉｎｕｍ）、フザリウム・ヘテロスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍｈｅｔｅｒｏｓｐｏｒｕｍ）、フザリウム・ネグンディ（Ｆｕｓａｒｉｕｍｎｅｇｕｎｄｉ）、フザリウム・オキシスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、フザリウム・レチクランツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍｒｅｔｉｃｕｌａｔｕｍ）、フザリウム・ロゼウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍｒｏｓｅｕｍ）、フザリウム・サムブシヌム（Ｆｕｓａｒｉｕｍｓａｍｂｕｃｉｎｕｍ）、フザリウム・サルコクロウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍｓａｒｃｏｃｈｒｏｕｍ）、フザリウムス・スポロトリキオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｉｏｉｄｅｓ）、フザリウム・スルフレウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｕｌｐｈｕｒｅｕｍ）、フザリウム・トルロスム（Ｆｕｓａｒｉｕｍｔｏｒｕｌｏｓｕｍ）、フザリウム・トリコテシオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｉｏｉｄｅｓ）、フザリウム・ベネナツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍｖｅｎｅｎａｔｕｍ）、フミコラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａｉｎｓｏｌｅｎｓ）、フミコラ・ラヌギノサ（Ｈｕｍｉｃｏｌａｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）、ムコール・ミエヘイ（Ｍｕｃｏｒｍｉｅｈｅｉ）、ミセリオフトラ・テルモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａｃｒａｓｓａ）、ペニシリウム・プルプロゲヌム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍｐｕｒｐｕｒｏｇｅｎｕｍ）、ファネロケーテ・クリソスポリウム（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、フレビア・ラジアタ（Ｐｈｌｅｂｉａｒａｄｉａｔａ）、プレウロツス・エリンギイ（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓｅｒｙｎｇｉｉ）、チエラビア・テルレストリス（Ｔｈｉｅｌａｖｉａｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）、トラメテス・ビロサ（Ｔｒａｍｅｔｅｓｖｉｌｌｏｓａ）、トラメテス・ベルシコロル（Ｔｒａｍｅｔｅｓｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）、トリコデルマ・ハルジアヌム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｈａｒｚｉａｎｕｍ）、トリコデルマ・コニンギイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｋｏｎｉｎｇｉｉ）、トリコデルマ・ロンギブラキアツム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）、トリコデルマ・レエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｒｅｅｓｅｉ）、またはトリコデルマ・ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｖｉｒｉｄｅ）細胞である、請求項８に記載の方法。
前記糸状真菌宿主細胞が、対象のポリペプチドを産生し；好ましくは、前記対象のポリペプチドは、宿主細胞に対して相同的または異種であり；より好ましくは、前記対象のポリペプチドは、分泌されたポリペプチドであり；さらに好ましくは、これは、ホルモン、酵素、受容体もしくはその一部、抗体もしくはその一部、またはリポータであり；さらに好ましくは、前記対象のポリペプチドは、ヒドロラーゼ、イソメラーゼ、リガーゼ、リアーゼ、オキシドレダクターゼもしくはトランスフェラーゼであり；最も好ましくは、前記対象のポリペプチドは、α−ガラクトシダーゼ、α−グルコシダーゼ、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、β−キシロシダーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セロビオヒドロラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エンドグルカナーゼ、エステラーゼ、グルコアミラーゼ、インベルターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、マンノシダーゼ、ムタナーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素、ペルオキシダーゼ、フィターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、タンパク質分解酵素、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼ、またはキシラーゼである、請求項８または９に記載の方法。
前記２つ以上のポリヌクレオチドの不活性化が、前記２つ以上のポリヌクレオチドおよび／またはそれぞれのプロモータの突然変異により；好ましくは、前記宿主細胞のゲノムからの前記２つ以上のポリヌクレオチドおよび／またはそれぞれのプロモータの部分的もしくは完全な欠失により、実施される、請求項８〜１０のいずれか１項に記載の方法。