KR102199005B1 - 휴미콜라 속 js-0112 균주 및 이를 함유하는 항진균제 조성물 - Google Patents

휴미콜라 속 js-0112 균주 및 이를 함유하는 항진균제 조성물 Download PDF

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김진철
웅엔티투항
유난희
박애란
배창환
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안능호
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Abstract

본 발명은 항진균 활성을 갖는 휴미콜라 속(Humicola sp.) JS-0112 균주(수탁번호 KACC 83027BP) 및 이를 유효성분으로 포함하는 항진균제 조성물, 및 식물병 방제용 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 휴미콜라 속(Humicola sp.) JS-0112 균주는 다양한 식물병 원인균에 대한 항진균 활성을 가지는 것을 실험적으로 확인하였는바, 관련 식물병 방제 용도로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

휴미콜라 속 JS-0112 균주 및 이를 함유하는 항진균제 조성물{Novel Humicola sp. JS-0112 strain and Antimicrobial Composition comprising the same}
본 발명은 항진균 활성을 보이는 휴미콜라 속 JS-0112 균주 및 이를 함유하는 항진균제 조성물에 관한 것이다.
식물의 병징은 식물 병원체인 세균, 진균 및 바이러스에 의해 일어난다.
특히 진균의 경우 그 종류가 매우 다양하고 진균이 자랄 때 균사를 생성하여 식물체 내로 침투하고 포자를 형성하기 때문에 작물 병 방제가 어렵다. 또한, 진균의 균사와 포자는 강우 및 바람과 같은 환경적인 요인에 의해 토양이나 다른 작물로 전파가 되고 작업자의 옷에 묻어 다른 작물로 전파가 되기도 하므로 병의 확산 속도가 빠르다. 이러한 이유로 진균에 의한 식물 병 발생은 작물 재배에 많은 어려움을 주고 있다.
한편, 화학 농약은 종류에 따라 잔류성의 차이가 있으며, 화학 농약의 분해 산물이 환경 및 인체에 미치는 영향에 대한 연구가 미비한 상황이다. 또한, 진균에 의한 식물 병징의 방제를 위해 살균제의 사용이 증가함에 따라 살균제에 대한 내성을 가지는 식물 병원성 진균이 발생할 수 있으며, 많은 양의 살균제 사용은 토양 및 수질 환경 오염을 유발 시킬 수 있다.
최근 천연물을 이용한 친환경 농법이 많이 연구되고 사회적으로도 화학농약에 대한 불감증이 증가하고 있으므로, 천연물 및 미생물을 이용한 식물병 방제에 대한 연구가 많이 이뤄지고 있다. 추가적으로 이러한 연구에 사용되는 미생물은 환경 및 인체에 무해한 미생물을 많이 이용하며 현재 농촌진흥청에서는 화학 농약 및 비료로 대체 가능한 농업용 유용 미생물의 목록을 고시하고 있는 것으로 알려져 있다.
국내공개특허 제10-2013-0070880호
본 발명자들은 항진균용 미생물 제제를 개발하고자 하였다. 그 결과, 본 발명의 신규한 휴미콜라 속(Humicola sp.) JS-0112 균주에 다양한 식물병 원인균에 대한 항진균 활성이 있다는 것을 규명함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 항진균 활성을 갖는 수탁번호 KACC 83027BP의 휴미콜라 속(Humicola sp.) JS-0112 균주를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 휴미콜라 속(Humicola sp.) JS-0112 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물, 상기 배양물의 건조물, 상기 균주의 배양 상등액 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 항진균제 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 휴미콜라 속(Humicola sp.) JS-0112 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물, 상기 배양물의 건조물, 상기 균주의 배양 상등액 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 식물병 방제용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명자들은 항진균용 미생물 제제를 개발하고자 하였다. 그 결과, 본 발명의 신규한 휴미콜라 속(Humicola sp.) JS-0112 균주에 다양한 식물병 원인균에 대한 항진균 활성이 있다는 것을 규명하였다.
본 발명은 항진균 활성을 갖는 수탁번호 KACC 83027BP의 휴미콜라 속(Humicola sp.) JS-0112 균주, 상기 균주의 배양물 등을 유효성분으로 포함하는 항진균제 조성물, 및 식물병 방제용 조성물에 관한 것이다.
이하, 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.
본 발명의 일 양태는 수탁번호 KACC 83027BP의 휴미콜라 속(Humicola sp.) JS-0112 균주에 관한 것이다.
상기 균주는 서열번호 1의 ITS 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.
상기 서열번호 1의 염기서열은 공시 균주인 Humicola sp. L-2와 99%의 상동성을 가지고, 양 균주간 1%의 상이성이 인정되어 신규한 균주로 판명되었다.
상기 균주는 서열번호 2의 LSU 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.
상기 서열번호 2의 염기서열은 공시 균주인 Humicola variabilis CBS 125842와 99%의 상동성을 가지고, 양 균주간 1%의 상이성이 인정되어 신규한 균주로 판명되었다.
상기 휴미콜라 속(Humicola sp.) JS-0112 균주의 ITS(internal transcribed space region) 및 LSU(large subunit ribosome) 부위 염기서열은 NCBI 데이터베이스와 hoc BLAST 데이터베이스의 Blast 검색을 통해 확인되었다.
상기 JS-0112 균주의 ITS(서열번호 1) 및 LSU(서열번호 2) 부위의 염기서열은 NIBI GenBank에 등록하여 각각 MN006389 및 MN006390의 등록번호를 부여 받았다.
상기 수득된 신규한 균주를 휴미콜라 속(Humicola sp.) JS-0112 균주로 명명하고, 2019년 9월 26일자로 국립농업과학원 미생물은행(Korean Agricultural Culture Collection, KACC)에 기탁하여 수탁번호 KACC 83027BP를 부여 받았다.
상기 휴미콜라 속(Humicola sp.) JS-0112 균주는 갯씀바귀(Ixeris repens) 뿌리로부터 분리 및 동정하여 얻을 수 있으며, 상기 균주의 균체 성상은 다음과 같다:
균체의 콜로니는 엷은 황갈색의 마우스 회색을 띈다.
균주 플러그를 접종한 부위는 악간 높고 주름이 잡힌 모습이며, 플러그 접종 부위 중앙은 핑크색을 띄고 가장자리로 갈수록 점점 짙은 오렌지색으로 바뀌고, 균체의 가장자리는 흰색을 나타낸다.
균사를 따라 매우 짧은 간격으로 분생자병(conidiophore)에서 두꺼운 세포벽과 색소를 갖는 단일 세포 분생포자(conidia)를 형성하고 있다.
본 발명의 실시예에 따르면, 상기 휴미콜라 속(Humicola sp.) JS-0112 균주의 항진균 활성을 균주와 다양한 식물병원성 진균의 대치배양을 통해 확인하였다(도 2).
상기 휴미콜라 속(Humicola sp.) JS-0112 균주는 항진균 활성을 가진다.
상기 진균은 콜레토트리쿰 코코데스(Colletotrichum coccodes), 가우만노마이세스 그라미니스(Gaeumannonmyces graminis), 라파엘라 퀘르쿠스-몽골리케(Raffaelea quercus-mongolicae), 라이족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani), 스클레로티니아 호모에오카르파(Sclerotinia homoeocarpa), 파이토프토라 캑토룸(Phytophthora cactorum), 파이토프토라 캄비보라(Phytophthora cambivora), 파이토프토라 시나모미(Phytophthora cinnamomi), 피시움 그라미니콜라(Pythium graminicola) 및/또는 피시움 울티뭄(Pythium ultimum)일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 휴미콜라 속(Humicola sp.) JS-0112 균주는 항진균 활성을 통한 식물병 방제 활성을 가진다.
상기 식물병은 고추탄저병, 밤나무줄기마름병, 벼이삭마름병, 잔디테이크올패취병, 참나무시들음병, 잔디라이족토니아마름병, 잔디동전마름병, 사과역병, 낙엽송역병, 잔디피시움잎마름병 및/또는 오이모잘록병일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 일 양태는 수탁번호 KACC 83027BP의 휴미콜라 속(Humicola sp.) JS-0112 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물, 상기 배양물의 건조물, 상기 균주의 배양 상등액 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함하는 항진균제 조성물에 관한 것이다.
따라서 본 발명은 휴미콜라 속(Humicola sp.) JS-0112 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물, 상기 배양물의 건조물, 상기 균주의 배양 상등액 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 항진균용 미생물 제제를 제공할 수 있는 것이고, 상기 미생물 제제를 처리함으로써 항진균 방법을 제공할 수 있는 것이다.
상기 미생물 제제는 통상적인 방법으로 항진균용으로 제형화할 수 있으며, 건조분말 형태 또는 액상비료 형태로 제조할 수 있는 것이다. 구체적으로, 본 발명에 의한 미생물 제제는 액상 형태로 제조될 수 있으며 이에 증량제를 첨가하여 가루분말의 형태로 이용하거나 이를 제형화하여 과립화시킬 수도 있다. 그러나 그 제형에 특별히 한정되지는 않는다.
본 발명에서 상기 미생물 제제는 균주 또는 이의 배양물에 첨가제, 증량제, 영양제등의 부가제를 첨가하여 제조할 수 있다. 이때, 첨가제로는 폴리카복실레이트, 소듐 리그노설포네이트, 칼슘 리그노설포네이트, 소듐 다이알킬 설포석시네이트, 소듐 알킬 아릴 설포네이트, 폴리옥시에틸렌 알킬 페닐 에테르, 소듐 트리폴리포스페이트, 폴리옥시에틸렌 알킬 아릴 포스포릭 에스테르, 폴리옥시에틸렌 알킬 아릴 에테르, 폴리옥시에틸렌 알킬 아릴 폴리머, 폴리옥시알킬온 알킬 페닐 에테르, 폴리옥시에틸렌 노닐 페닐 에테르, 소듐 설포네이트 나프탈렌 포름알데히드, 트리톤 100 및 트윈 80으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 사용할 수 있고, 증량제 및 영양제로는 skim milk(배지), 콩가루, 쌀, 밀, 황토, 규조토, 벤토나이트 (bentonite), 덱스트린, 포도당 및 전분으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 또는 둘 이상을 사용하며, 붕해제로는 벤토나이트(bentonite), 탈크(talc), 다이아라이트(dialite), 카올린(kaolin) 및 칼슘 카보네이트(calcium carbonate)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 미생물 제제를 토양 또는 식물에 처리함으로써 진균의 생육을 억제하는 방법을 제공한다. 이때, 처리방법에는 일반적으로 행하고 있는 방법, 즉 살포(예를 들면 분무, 미스팅, 아토마이징, 분말 살포, 과립 살포, 수면시용, 상시용 등), 토양시용(예를 들면 혼입, 관주 등), 표면사용(예를 들면 도포, 도말법, 피복 등), 침지, 독이, 훈연 시용 등에 의해 행할 수 있다. 그 사용량은, 그 제형, 피해상황, 적용방법, 적용장소 등에 따라 적절히 결정할 수 있다.
본 발명에서, 상기 방법에 따라 처리되는 제제에 함유된 미생물의 유효량은 경작지 면적(㎡) 당 1 내지 1Х10100의 미생물 수로 포함될 수 있다. 또한, 상기 방법 중 살포에 의해 처리되는 제제에 함유된 미생물의 유효량은 ml당 1 내지 1Х10100의 미생물 농도로 포함될 수 있으며, 침지에 의해 처리되는 조성물에 함유된 미생물의 유효량은 ml당 1 내지 1Х10100의 미생물 농도로 포함될 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 양태는 수탁번호 KACC 83027BP의 휴미콜라 속(Humicola sp.) JS-0112 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물, 상기 배양물의 건조물, 상기 균주의 배양 상등액 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함하는 식물병 방제용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 상기 각 조성물은 유효성분인 상기 균주, 이의 배양물, 배양물의 농축물, 배양물의 건조물 및/또는 상기 균주의 배양 상등액 외에 균체를 포함하는 배양물, 균체의 추출물, 이들의 농축액, 농축물, 건조물, 또한 필요에 따라서 희석액, 희석물 등을 포함할 수 있으며, 배양액, 배양물을 처리하여 얻어지는 모든 상태의 것을 포함할 수 있다.
상기 균주의 배양법, 추출법, 분리법, 농축법, 건조법, 희석법 등은 특별히 한정되지 않는다.
상기 균주를 배양하기 위한 배지로는 통상적으로 탈지유, 훼이, 카제인 등의 우유 단백질, 당류, 효모 엑기스 등을 포함하고 있으며, 배양 방법으로는 일반적인 각종 호기적 또는 혐기적인 방법을 적당히 사용할 수 있다.
상기 균주를 배양한 후에는 필요에 따라 배양물이나 그 상층액을 농축, 건조, 희석할 수도 있다.
또한, 원심분리법이나 막분리법을 사용하여 배양물의 상층액과 균체를 분리하여 균체를 농축한 상태로 회수할 수도 있다. 그리고 균체에 초음파 처리나 효소 처리 등을 행하여 균체 내의 성분을 추출하거나, 배양물이나 그 상층액, 균체나 그 추출물 등을 건조할 수도 있다. 이들은 본 발명의 상기 조성물의 유효 성분으로서 사용할 수 있다.
상기 균주 및 이를 포함하는 각 조성물의 중복되는 내용은 본 명세서의 복잡성을 고려하여 생략한다.
본 발명은 항진균 활성을 갖는 휴미콜라 속(Humicola sp.) JS-0112 균주(수탁번호 KACC 83027BP) 및 이를 유효성분으로 포함하는 항진균제 조성물, 및 식물병 방제용 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 휴미콜라 속(Humicola sp.) JS-0112 균주는 다양한 식물병 원인균에 대한 항진균 활성을 가지는 것을 실험적으로 확인하였는바, 관련 식물병 방제 용도로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 휴미콜라 속(Humicola sp.) JS-0112 균주의 형태학적/분자생물학적 동정결과로, (a) PDA 배지에서 배양된 JS-0112 균체의 사진, (b) 해부현미경을 통한 JS-0112 균사 및 분생포자경 사진, 및 (c) JS-0112 균주의 ITS 및 LSU 부위의 염기서열의 계통도 분석결과이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 휴미콜라 속(Humicola sp.) JS-0112 균주의 10개의 식물병원성 진균에 대한 항진균 활성을 확인한 결과이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예: 휴미콜라 속( Humicola sp.) JS-0112의 분리
국립생물자원관에서 채집한 대한민국 전역의 28종의 식물체에 대하여 식물내생곰팡이를 분리하였다. 식물내생곰팡이 분리 방법은 다음과 같다. 흐르는 물로 세척하고 건조시킨 후, 줄기(stem)는 25mm, 잎(leaf) 및 뿌리(root)는 1-2mm로 잘라 1.5% NaOCl에 3분, 70% 에탄올로 2분간 처리하여 표면 살균하였고, 멸균수에 1분간 3번 반복하여 헹구어 주었다.
표면 살균된 식물체 조각을 멸균된 종이에 두어 수분을 제거한 후, 50ppm 로즈뱅갈(rose Bengal) 100ppm 가나마이신(kanamycin) 및 100ppm 스트렙토마이신(streptomycin)을 넣어 멸균한 PDA(potato dextrose agar) 배지 또는 MEA(malt extract agar) 배지에 올리고, 23℃에서 5-10일 동안 배양하였다.
식물체 조각으로부터 뻗어 나온 식물내생곰팡이 균사의 가장자리를 멸균된 새 PDA 배지에 옮긴 후, 식물내생곰팡이를 순수 분리하여 배양하였다. 순수 분리된 219개의 식물내생곰팡이는 글리세롤 스탁으로 -80℃에서 보관하여 사용하였다. 분리된 219개의 식물내생곰팡이는 하기 표 1에 나타내었다.
일련번호 코드 식물내생곰팡이 종명 식물체
종명 조직
1 JS-0001 Colletotrichum boninense Cephalotaxus harringtonia leaf
2 JS-0002 Colletotrichum boninense Cephalotaxus harringtonia leaf
3 JS-0004 Phyllosticta pyrolae Cephalotaxus harringtonia leaf
4 JS-0020 Phomopsis sp. Euonymus japonicus leaf
5 JS-0042 Glomerella acutata Ulmus davidiana var. japonica stem
6 JS-0043 Aureobasidium pullulans Ulmus davidiana var. japonica stem
7 JS-0044 Phomopsis sp. Ulmus davidiana var. japonica stem
8 JS-0045 Diaporthe sp. Ulmus davidiana var. japonica stem
9 JS-0046 Diaporthe sp. Ulmus davidiana var. japonica stem
10 JS-0047 Diaporthe sp. Ulmus davidiana var. japonica stem
11 JS-0048 Phomopsis sp. Ulmus davidiana var. japonica leaf
12 JS-0061 Diaporthe eres Morus alba stem
13 JS-0062 Alternaria alternata Morus alba stem
14 JS-0064 Alternaria alternata Morus alba stem
15 JS-0065 Phomopsis longicolla Morus alba stem
16 JS-0066 Phomopsis longicolla Morus alba stem
17 JS-0067 Cladosporium sp. Morus alba stem
18 JS-0112 Humicola sp. Ixeris repens root
19 JS-0169 Fusarum solani Morus alba leaf
20 JS-0170 Fusarium solani Morus alba leaf
21 JS-0171 Phomopsis sp. Morus alba stem
22 JS-0174 Fusarium solani Morus alba stem
23 JS-0175 Aschersonia sp. Morus alba stem
24 JS-0176 Phoma sp. Morus alba leaf
25 JS-0228 Phoma sp. Morus alba leaf
26 JS-0229 Alternaria alternata Morus alba stem
27 JS-0230 Paraconiothyrium sp. Morus alba stem
28 JS-0255 Colletotrichum boninense Morus alba stem
29 JS-0284 Phomopsis sp. Morus alba stem
30 JS-0358 Glomerella acutata Morus alba leaf
31 JS-0360 Phoma herbarum Morus alba leaf
32 JS-0361 Colletotrichum nymphaeae Morus alba leaf
33 JS-0369 Glomerella cingulata Morus alba stem
34 JS-0432 Diaporthe helianthi Plantago major f. jezomariima leaf
35 JS-0433 Diaporthe phaseolorum Plantago major f. jezomariima leaf
36 JS-0434 Colletotrichum gloeosporioides Plantago major f. jezomariima leaf
37 JS-0435 Alternaria arborescens Plantago major f. jezomariima leaf
38 JS-0436 Colletotrichum gloeosporioides Plantago major f. jezomariima stem
39 JS-0437 Phomopsis sp. Plantago major f. jezomariima root
40 JS-0439 Phomopsis liquidambari Plantago major f. jezomariima root
41 JS 0440 Guignardia mangiferae Plantago major f. jezomariima root
42 JS 0441 Fusarium oxysporum Plantago major f. jezomariima root
43 JS JS-0496 Alternaria alternata Phytolacca americana stem
44 JS-0497 Fusarium lateritium Phytolacca americana fruit
45 JS J JS-0595 Cladosporium sp. Davallia mariesii root
46 JS-0596 Pestalotiopsis sp. Davallia mariesii root
47 JS-0611 Alternaria tenuissima Ixeris repens stem
48 JS-0613 Alternaria tenuissima Ixeris repens leaf
49 JS-0614 Fusarium armeniacum Ixeris repens leaf
50 JS-0639 Fusarium acuminatum Illicium anisatum leaf
51 JS-0783 Fusarium lateritium Korthalsella japonica stem
52 JS-0785 Glomerella fioriniae Korthalsella japonica leaf
53 JS-0786 Glomerella fioriniae Korthalsella japonica leaf
54 JS-0845 Alternaria sp. Cudrania tricuspidata stem
55 JS-0847 Alternaria sp. Cudrania tricuspidata stem
56 JS-0877 Glomerella fioriniae Zanthoxylum schinifolium leaf
57 JS-0878 Alternaria sp. Zanthoxylum schinifolium leaf
58 JS-0879 Phomopsis sp. Zanthoxylum schinifolium leaf
59 JS-0894 Cladosporium oxysporum Abies koreana stem
60 JS-0895 Helotiales sp. Abies koreana stem
61 JS-0932 Fusarium sp. Euonymusfortunei var. radicans stem
62 JS-0933 Glomerella fioriniae Euonymusfortunei var. radicans stem
63 JS-0935 Neofabraea malicorticis Euonymusfortunei var. radicans leaf
64 JS-0960 Alternaria alternata Taxus cuspidata stem
65 JS-0962 Lophiostoma sp. Taxus cuspidata leaf
66 JS-0971 Neonectria veuillotiana Taxus cuspidata stem
67 JS-0972 Aspergillus flavus Taxus cuspidata stem
68 JS-0973 Gelasinospora brevispora Taxus cuspidata stem
69 JS-0974 Pestalotiopsis sp. Taxus cuspidata stem
70 JS-0975 Aureobasidium sp. Taxus cuspidata stem
71 JS-0977 Aspergillus fumigatus Taxus cuspidata stem
72 JS-0978 Neonectria galligena Taxus cuspidata stem
73 JS-0979 Glomerella fioriniae Taxus cuspidata stem
74 JS-0982 Pestalotiopsis sp. Taxus cuspidata stem
75 JS-0983 Davidiella sp. Taxus cuspidata stem
76 JS-1043 Helminthosporium sp. Torreya nucifera stem
77 JS-1067 Pestalotiopsis microspora Eriobotrya japonica stem
78 JS-1068 Glomerella fioriniae Eriobotrya japonica stem
79 JS-1069 Glomerella fioriniae Eriobotrya japonica stem
80 JS-1071 Pestalotiopsis microspora Eriobotrya japonica stem
81 JS-1072 Glomerella fioriniae Eriobotrya japonica leaf
82 JS-1073 Glomerella fioriniae Eriobotrya japonica leaf
83 JS-1075 Glomerella fioriniae Eriobotrya japonica leaf
84 JS-1170 Pestalotiopsis sp. Taxus cuspidata stem
85 JS-1171 Bionectria ochroleuca Taxus cuspidata stem
86 JS-1172 Glomerella fioriniae Taxus cuspidata leaf
87 JS-1173 Colletotrichum aenigma Taxus cuspidata leaf
88 JS-1250 Coniothyrium sp. Abies nephrolepis stem
89 JS-1252 Fusarium cortaderiae Abies nephrolepis leaf
90 JS-1263 Pestalotiopsis sp. Dryopteris pacifica stem
91 JS-1265 Hypocrea lixii Abies nephrolepis stem
92 JS-1283 Alternaria alternata Abies holophylla stem
93 JS-1285 Phoma sp. Abies holophylla stem
94 JS-1286 Amphirosellinia nigrospora Abies holophylla stem
95 JS-1287 Biscogniauxia maritima Abies holophylla leaf
96 JS-1291 Microdiplodia sp. Abies koreana stem
97 JS-1293 Periconia macrospinosa Abies koreana stem
98 JS-1297 Arthrinium arundinis Abies holophylla leaf
99 JS-1303 Dicarpella dryina Abies koreana stem
100 JS-1309 Phomopsis sp. Abies koreana leaf
101 JS-1311 Hypocrea alni Abies koreana stem
102 JS-1312 Hypocrea lixii Abies koreana stem
103 JS-1316 Diaporthe sp. Abies koreana leaf
104 JS-1317 Phomopsis sp. Abies koreana leaf
105 JS-1320 Fusarium ciliatum Abies holophylla stem
106 JS-1324 Coniochaeta sp. Abies koreana stem
107 JS-1326 Phanerochaete sordida Abies koreana stem
108 JS-1330 Fusarium ciliatum Abies koreana stem
109 JS-1334 Phomopsis sp. Abies koreana leaf
110 JS-1337 Nigrospora sp. Abies koreana leaf
111 JS-1339 Dicarpella dryina Abies nephrolepis stem
112 JS-1344 Alternaria brassicicola Abies nephrolepis leaf
113 JS-1345 Daldinia childiae Abies koreana stem
114 JS-1346 Diaporthe sp. Abies koreana stem
115 JS-1347 Nemania diffusa Abies koreana stem
116 JS-1348 Diaporthe eres Abies koreana stem
117 JS-1349 Diaporthe sp. Abies koreana stem
118 JS-1352 Diaporthe sp. Abies koreana stem
119 JS-1353 Diaporthe sp. Abies koreana stem
120 JS-1356 Alternaria brassicicola Abies koreana stem
121 JS-1358 Alternaria sp. Abies koreana stem
122 JS-1367 Mollisia fusca Abies koreana stem
123 JS-1368 Mycosphaerella sp. Abies koreana stem
124 JS-1370 Diaporthe sp. Abies koreana stem
125 JS-1372 Dictyochaeta simplex Polystichum tsus-simense leaf
126 JS-1373 Nectria rigidiuscula Polystichum tsus-simense leaf
127 JS-1374 Fusarium sp. Polystichum tsus-simense leaf
128 JS-1378 Pestalotiopsis sp. Polystichum tsus-simense leaf
129 JS-1384 Neofusicoccum mangiferae Polystichum lepidocaulon stem
130 JS-1386 Pestalotiopsis sp. Polystichum lepidocaulon leaf
131 JS-1387 Pestalotiopsis protearum Polystichum lepidocaulon stem
132 JS-1395 Gibberella sp. Polystichum lepidocaulon leaf
133 JS-1396 Fusarium solani Polystichum lepidocaulon stem
134 JS-1398 Gibberella sp. Polystichum lepidocaulon leaf
135 JS-1399 Glomerella fioriniae Polystichum lepidocaulon leaf
136 JS-1400 Alternaria sp. Polystichum lepidocaulon stem
137 JS-1402 Lasiodiplodia pseudotheobromae Polystichum lepidocaulon stem
138 JS-1413 Alternaria sp. Pteris cretica stem
139 JS-1414 Chaetomium sp. Pteris cretica stem
140 JS-1415 Pestalotiopsis protearum Pteris cretica leaf
141 JS-1416 Nemania diffusa Pteris cretica leaf
142 JS-1418 Colletotrichum aenigma Dryopteris erythrosora stem
143 JS-1419 Amphirosellinia nigrospora Dryopteris erythrosora stem
144 JS-1420 Glomerella fioriniae Dryopteris erythrosora stem
145 JS-1421 Bionectria ochroleuca Dryopteris erythrosora stem
146 JS-1423 Colletotrichum gloeosporioides Dryopteris erythrosora leaf
147 JS-1439 Alternaria arborescens Cyclosorus acuminatus stem
148 JS-1440 Gibellulopsis nigrescens Cyclosorus acuminatus leaf
149 JS-1441 Glomerella fioriniae Cyclosorus acuminatus leaf
150 JS-1442 Colletotrichum boninense Cyclosorus acuminatus leaf
151 JS-1455 Alternaria sp. Cyrtomium falcatum stem
152 JS-1456 Colletotrichum aenigma Cyrtomium falcatum leaf
153 JS-1458 Lasiodiplodia pseudotheobromae Coniogramme intermedia stem
154 JS-1459 Nigrospora sp. Coniogramme intermedia leaf
155 JS-1463 Colletotrichum boninense Dryopteris bissetiana stem
156 JS-1465 Pestalotiopsis protearum Dryopteris bissetiana leaf
157 JS-1466 Phaeosphaeriopsis sp. Dryopteris bissetiana leaf
158 JS-1467 Fusarium sp. Dryopteris bissetiana leaf
159 JS-1468 Pestalotiopsis jesteri Dryopteris bissetiana leaf
160 JS-1483 Colletotrichum aenigma Dryopteris bissetiana stem
161 JS-1485 Nemania diffusa Dryopteris bissetiana stem
162 JS-1486 Colletotrichum aenigma Dryopteris bissetiana leaf
163 JS-1488 Alternaria arborescens Torreya nucifera stem
164 JS-1491 Nemania diffusa Torreya nucifera leaf
165 JS-1493 Nemania diffusa Torreya nucifera leaf
166 JS-1494 Pestalotiopsis sp. Dryopteris varia stem
167 JS-1495 Colletotrichum aenigma Dryopteris varia stem
168 JS-1496 Colletotrichum aenigma Dryopteris varia leaf
169 JS-1497 Colletotrichum aenigma Dryopteris varia leaf
170 JS-1575 Colletotrichum aenigma Euonymus japonicus leaf
171 JS-1576 Colletotrichum sp. Euonymus japonicus leaf
172 JS-1583 Halorosellinia sp. Dryopteris bissetiana stem
173 JS-1585 Alternaria sp. Dryopteris varia stem
174 JS-1604 Alternaria sp. Abies koreana stem
175 JS-1605 Celosporium larixicola Abies koreana stem
176 JS-1606 Alternaria tenuissima Abies koreana leaf
177 JS-1608 Hormonema sp. Abies koreana stem
178 JS-1612 Colletotrichum aenigma Abies koreana stem
179 JS-1614 Colletotrichum kahawae Abies koreana stem
180 JS-1615 Alternaria sp. Abies koreana stem
181 JS-1616 Alternaria sp. Abies koreana leaf
182 JS-1618 Alternaria sp. Abies koreana stem
183 JS-1623 Fusarium sp. Abies koreana stem
184 JS-1626 Alternaria sp. Abies koreana leaf
185 JS-1632 Alternaria sp. Abies koreana stem
186 JS-1633 Phialocephala fortinii Abies koreana stem
187 JS-1634 Nemania sp. Abies koreana stem
188 JS-1635 Aschersonia sp. Abies koreana stem
189 JS-1638 Pestalotiopsis sp. Abies koreana stem
190 JS-1639 Fusarium sp. Abies koreana stem
191 JS-1642 Hormonema sp. Abies koreana stem
192 JS-1643 Phialocephala fortinii Abies koreana leaf
193 JS-1644 Alternaria alternata Abies koreana stem
194 JS-1647 Phaeosphaeriopsis sp. Abies koreana stem
195 JS-1650 Colletotrichum aenigma Abies koreana stem
196 JS-1651 Colletotrichum aenigma Abies koreana stem
197 JS-1652 Hormonema sp. Abies koreana stem
198 JS-1654 Alternaria sp. Abies koreana stem
199 JS-1655 Nemania sp. Abies koreana stem
200 JS-1656 Helminthosporium velutinum Abies koreana stem
201 JS-1658 Hormonema sp. Abies koreana stem
202 JS-1660 Mollisia fusca Abies koreana stem
203 JS-1661 Phialocephala sp. Abies koreana stem
204 JS-1662 Nigrospora sp. Abies koreana stem
205 JS-1664 Hormonema sp. Abies koreana stem
206 JS-1665 Hormonema sp. Abies koreana stem
207 JS-1666 Epicoccum nigrum Abies koreana stem
208 JS-1668 Nemania sp. Abies koreana stem
209 JS-1669 Hormonema sp. Abies koreana stem
210 JS-1670 Diaporthe sp. Abies koreana stem
211 JS-1676 Nemania diffusa Dryopteris erythrosora stem
212 JS-1682 Monochaetia sp. Dryopteris bissetiana stem
213 JS-1706 Pestalotiopsis sp. Torreya nucifera leaf
214 JS-1707 Fusarium lateritium Torreya nucifera leaf
215 JS-1709 Glomerella fioriniae Torreya nucifera stem
216 JS-1712 Colletotrichum aenigma Torreya nucifera stem
217 JS-1729 Nemania sp. Abies koreana stem
218 JS-1731 Nemania diffusa Abies koreana stem
219 JS-1733 Nodulisporium sp. Abies koreana stem
실험예 1: 항진균 활성을 갖는 균주의 선발
상기 실험예 1에서 분리된 219개의 식물내생곰팡이 중에서 항진균 활성을 갖는 균주를 선발하기 위하여, 식물내생곰팡이 배양여액과 균사 추출물을 이용하여 식물병원성 진균인 스클레로티니아 호모에오카르파(Sclerotinia homoeocarpa; 잔디동전마름병 원인균; 대한민국, 대정골프엔지니어링 연구소)에 대하여 항진균 활성을 조사하였다.
1-1. 219개 식물내생곰팡이 균주의 배양여액 준비
PDA 배지에서 배양된 219개 식물내생곰팡이 균주의 균체 가장자리 직경 5mm 균사 조각(10개)을 떼어 내 200mL의 멸균된 PDB 배지에 접종하고 25℃, 150rpm에서 14일동안 진탕배양하였다. 그 다음, 4겹의 멸균거즈를 통해 배양액으로부터 균체를 여과하고, 여과액을 0.2μm 필터막에 통과시켜 219개 식물내생곰팡이 균주의 배양여액을 준비하였다.
1-2. 219개 식물내생곰팡이 균주의 균체 추출물 준비
상기 1-1의 4겹의 멸균거즈를 통해 배양액으로부터 여과된 균체에 아세톤을 넣어 추출하고 필터페이퍼를 통해 여과하였다. 여과된 균체의 아세톤 추출물은 감압식 회전 농축기를 사용하여 농축한 후, 메탄올을 넣어 50 mg·mL-1 스탁으로 준비하였다.
1-3. 스클레로티니아 호모에오카르파( S. homoeocarpa ) 균주가 혼합된 PDB 배지 준비
스클레로티니아 호모에오카르파(S. homoeocarpa) 균주는 PDB 배지에 접종하고 25℃, 150rpm에서 5일동안 진탕배양하였다. 그 다음, 4겹의 멸균거즈를 통해 배양액으로부터 균체를 여과하고, 멸균한 증류수로 세척한 후 멸균수로 50 mg/mL 수준으로 희석한 후 균질기(homogenizer)로 10초간 마쇄하였다. 마쇄된 균질액을 멸균한 PDB 배지에 1% 접종하여 병원성 진균이 혼합된 PDB 배지를 준비하였다.
1-4. 식물내생곰팡이 배양여액의 96-웰 마이크로플레이트 생물검정법
96-웰 플레이트의 첫 번째 웰에 상기 1-3의 병원성 진균이 혼합된 PDB 배지 180μL와 상기 1-1의 식물내생곰팡이 배양여액 20μL를 분주하고 잘 섞어서 배양여액 10% 처리구를 제조하였다. 그 다음, 두 번째 웰에 상기 1-3의 병원성 진균이 혼합된 PDB 배지를 100μL 분주하고 상기 10% 처리구 웰로부터 100μL를 회수하여 두 번째 웰에 분주하여 잘 섞어서 5% 처리구를 제조하였다. 이와 같이, 1/2씩 순차적으로 열 번째 웰까지 희석하여 10%부터 0.0195%까지 처리하였으며, 처리구 당 3반복으로 실시하였다.
1-5. 식물내생곰팡이 균체 추출물의 96-웰 마이크로플레이트 생물검정법
96-웰 플레이트의 첫 번째 웰에 상기 1-3의 병원성 진균이 혼합된 PDB 배지 198μL와 상기 1-2의 식물내생곰팡이 균체 추출물 2μL를 분주하고 잘 섞어서 균체 추출물 500 μg·mL-1 처리구를 제조하였다. 그 다음, 두 번째 웰에 상기 1-3의 병원성 진균이 혼합된 PDB 배지를 100μL 분주하고 500 μg·mL-1 처리구 웰로부터 100μL를 회수하여 두 번째 웰에 분주하여 잘 섞어서 250 μg·mL-1 처리구를 제조하였다. 이와 같이, 1/2씩 순차적으로 여섯 번째 웰까지 희석하여 500 μg·mL-1부터 15.625 μg·mL-1까지 처리하였으며, 처리구 당 3반복으로 실시하였다.
1-6. 결과
스클레로티니아 호모에오카르파(S. homoeocarpa) 균사 생장을 완전히 저해하는 최소농도를 최소생육저해농도(minimun inhibitory concentraton, MIC)로 결정하였고, 스클레로티니아 호모에오카르파(S. homoeocarpa)의 최적생장조건(PDB 배지, 25℃, 5일)에서 정치배양한 후, 최소생육저해억제농도(MIC)를 확인하였다.
그 결과, 219개의 식물내생곰팡이 중에서 갯씀바귀(Ixeris repens)의 뿌리에서 분리한 JS-0112 균주 및 뽕나무(Morus alba) 잎에서 분리한 JS-0169 균주가 스클레로티니아 호모에오카르파(S. homoeocarpa)에 대한 항진균 활성을 나타내었다. 특히 JS-0112 균주는 MIC 값이 배양여액 1.25%, 균체 추출물 125 μg·mL-1으로 JS-0169 균주(배양여액 >20%)보다 강한 항진균 활성을 나타내어 본 발명에서 선발되었다.
실험예 2: JS-0112 균주의 형태학적/분자생물학적 동정 및 계통학적 분류
상기 실험예 1의 결과에 기초하여, 선발된 JS-0112 균주를 형태학적 및 분자생물학적 분석을 통하여 동정하였다.
2-1. 형태학적 분석
JS-0112 균주를 멸균한 PDA 배지에 접종한 후, 25℃에서 7일간 정치배양하였다.
도 1a에서 확인할 수 있듯이, 배양된 JS-0112 균체의 콜로니는 엷은 황갈색의 마우스 회색을 띄었다. 균주 플러그를 접종한 부위는 악간 높고 주름이 잡힌 모습이며, PDA 플레이트의 아래쪽에서 본 균체는 플러그 접종 부위 중앙은 핑크색을 띄고 가장자리로 갈수록 점점 짙은 오렌지색으로 바뀌고, 균체의 가장자리는 흰색을 나타내었다.
또한, 도 1b에 확인할 수 있듯이, 현미경을 통해 JS-0112 균주를 관찰한 결과, 휴미콜라 속(Humicola sp.)의 특징 중 하나인 균사를 따라 매우 짧은 간격으로 분생자병(conidiophore)에서 두꺼운 세포벽과 색소를 갖는 단일 세포 분생포자(conidia)를 형성하고 있었다.
2-2. 분자생물학적 분석
PDA 배지에서 얻은 JS-0112 균체 조각을 Qiagen Plant DNA extraction kit(Qiagen, Hilden, Germany)를 이용하여 프로토콜에 따라서 균주의 게놈 DNA(gDNA)를 추출하였다. JS-0112 균주의 gDNA, PCR-프리믹스(Polymerase chain reaction-premix, iNtRON Biotechnology), 및 균주의 ITS(internal transcribed space region) 및 LSU(large subunit ribosome) 암호화 부위를 증폭할 수 있는 프라이머 세트[IFS1F(5'-CTT GGT CAT TTA GAG GAA GTA A-3': 서열번호 3), ITS4(5'-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3'; 서열번호 4) 및 LR5(5'-TCC TGA GGG AAA CTT CG-3': 서열번호 5)]를 혼합한 후 PCR을 수행하였다. PCR반응은 95℃ 5분을 시작으로 95℃ 30초, 55℃ 30초, 72℃ 1분을 30번 반복한 후, 72℃ 7분, 12℃에서 증폭을 끝냈다.
증폭된 PCR 산물은 마크로젠(서울, 대한민국)에 염기서열 분석을 의뢰하였다. 얻어진 염기서열은 Sequencer 5.0(AnnArbor, MI, USA)을 이용하여 정렬되었고, JS-0112 균주의 ITS 및 LSU 부위 염기서열을 NCBI 데이터베이스와 hoc BLAST 데이터베이스의 Blast 검색을 통해 분석하였다. Blast 검색을 통해 유사성이 높은 염기서열을 NCBI 데이터베이스로부터 확보하고, Clustal W를 사용하여 multiple alingment로 염기서열을 정렬/편집 한 후, 메가 프로그램 버전 7의 boot-strap trials set 1,000 조건에서 neighbour-joining (NJ) 알고리즘을 바탕으로 분석하였다. [한편, 상기 JS-0112 균주의 ITS(서열번호 1) 및 LSU(서열번호 2) 부위의 염기서열은 NIBI GenBank에 등록하여 각각 MN006389 및 MN006390의 등록번호를 부여 받았다.]
도 1c에서 확인할 수 있듯이, JS-0112 균주는 계통도 상에서 휴미콜라 풀버리콜라(Humicola pulvericola)와 가장 유사하지만 부트스트랩 값이 90이하로 휴미콜라 속(Humicola genus)의 신종으로 동정되었다.
실험예 3: 휴미콜라 속( Humicola sp.) JS-0112 균주의 항진균 활성 평가
상기 실험예 2의 결과에 기초하여, 분류된 휴미콜라 속(Humicola sp) JS-0112 균주가 다양한 식물병원성 진균의 생장에 미치는 영향을 조사하였다. 사용된 식물병원성 진균 및 이의 최적생장조건은 하기 표 2에 나타내었다.
식물병원성 진균 배양 조건 구입처
배지 온도 (℃) 배양기간
진균류
크리포넥트리아 파라시티카
(Cryphonectria parasitica)
: 밤나무줄기마름병 원인균		 PDA, PDB 25 5 국립농업과학원
미생물은행
KACC40323
푸사리움 그라미네아룸(Fusarium graminearum)
: 벼이삭마름병 원인균		 PDA, PDB 25 3 Z-3639, Bowden & Leslie(1999)
라파엘라 퀘르쿠스-몽골리케(Raffaelea quercus-mongolicae)
: 참나무시들음병 원인균		 PDA, PDB 25 5 국립농업과학원
미생물은행
KACC44403
라이족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani)
: 잔디라이족토니아마름병 원인균		 PDA, PDB 25 5 대한민국, 대정골프엔지니어링
스클레로티니아 호모에오카르파(Sclerotinia homoeocarpa)
: 잔디동전마름병 원인균		 PDA, PDB 25 5 대한민국, 대정골프엔지니어링
난균류
파이토프토라 캑토룸
(Phytophthora cactorum)
: 사과역병 원인균		 V8, PDB 25 3,5 국립농업과학원
미생물은행
KACC40166
파이토프토라 캄비보라(Phytophthora cambivora)
: 사과역병 원인균		 V8, PDB 25 3,5 국립농업과학원
미생물은행
KACC40159
파이토프토라 시나모미(Phytophthora cinnamomi)
: 낙엽송역병 원인균		 V8, PDB 25 3,5 국립농업과학원
미생물은행
KACC40182
피시움 그라미니콜라(Pythium graminicola)
: 잔디피시움잎마름병 원인균		 PDA, PDB 25 2 국립농업과학원
미생물은행
KACC40155
피시움 울티뭄
(Pythium ultimum)
: 오이모잘록병 원인균		 PDA, PDB 25 2 KACC40705
상기 표 2의 10가지 식물병원성 진균은 멸균한 PDA 또는 V8 배지에 접종하여 최적생장조건에서 정치배양하여 준비하였고, 휴미콜라 속(Humicola sp.) JS-0112 균주는 PDA 배지에서 정치배양하여 준비하였다.
식물병원성 진균 및 JS-0112 균주의 균체 가장자리에서 각각 직경 5 mm 균사 조각을 떼어내어, 각각 9 cm 페트리디쉬에 멸균하여 굳힌 PDA 배지의 한쪽과 반대쪽에 대치하게 접종하였다(T).
무처리구는 JS-0112 균주를 접종하지 않고 식물병원성 진균만 접종하였고, 처리 당 2반복을 실시하였으며 무처리구의 식물병원성 진균의 균사가 균체로 충분히 자랄 때까지 25℃에서 3~10일간 정치배양한 후 식물병원성 진균의 균사 생장 정도를 관찰하였다(CK).
도 2에서 확인할 수 있듯이, 휴미콜라 속(Humicola sp.) JS-0112 균주는 10가지 식물병원성 진균의 균사 생장을 모두 억제하였다.
구체적으로, 푸사리움 그라미네아룸(F. graminearum) 균사 생장을 약하게 억제하였고(도 2b), 라이족토니아 솔라니(R. solani) 균사 생장을 조금 더 억제하였다(도 2i).
또한, 크리포넥트리아 파라시티카(C. parasitica, 도 2a), 라파엘라 퀘르쿠스-몽골리케(R. quercus-mongolicae, 도 2h) 및 스클레로티니아 호모에오카르파(S. homoeocarpa, 도 2j) 균사의 생장을 강하게 억제하였다.
특히, 파이토프토라 속(Phytophthora genus, 도 2c, d, e)의 식물병원성 진균은 휴미콜라 속(Humicola sp.) JS-0112 균주에 강하게 민감하였고, 피시움 속(Phythium genus, 도 2f, g)의 식물병원성 진균의 균사 생장은 완전히 저해되었다.
실험예 4: 휴미콜라 속( Humicola sp.) JS-0112 균주의 항진균 활성 스펙트럼 평가
상기 실험예 3의 결과에 기초하여, 분류된 휴미콜라 속(Humicola sp) JS-0112 균주가 다양한 식물병원성 진균의 생육을 저해하는 최소생육억제농도(MIC) 값을 조사하였다. 사용된 식물병원성 진균 및 이의 최적생장조건은 하기 표 3에 나타내었다.
식물병원성 진균 배양 조건 구입처
배지 온도 (℃) 배양기간
진균류
보트리티스 시네레아
(Botrytis cinerea)
: 토마토잿빛곰팡이병 원인균		 PDA, PDB 25 5 국립농업과학원
미생물은행
KACC40574
콜레토트리쿰 코코데스(Colletotrichum coccodes)
: 고추탄저병 원인균		 PDA, PDB 25 5 국립농업과학원
미생물은행
KACC40010
크리포넥트리아 파라시티카
(Cryphonectria parasitica)
: 밤나무줄기마름병 원인균		 PDA, PDB 25 5 국립농업과학원
미생물은행
KACC40323
푸사리움 그라미네아룸(Fusarium graminearum)
: 벼이삭마름병 원인균		 PDA, PDB 25 3 Z-3639, Bowden & Leslie(1999)
푸사리움 옥시스포룸 에프 에스피. 라이코펄시시
(Fusarium oxysporum f. sp. lycorpersici)
: 토마토시들음병 원인균		 PDA, PDB 25 3 한국화학연구원
(KRICT)
가우만노마이세스 그라미니스(Gaeumannonmyces graminis)
: 잔디테이크올패취병 원인균		 PDA, PDB 25 3 대한민국, 대정골프엔지니어링
라파엘라 퀘르쿠스-몽골리케
(Raffaelea quercus-mongolicae)
: 참나무시들음병 원인균		 PDA, PDB 25 5 국립농업과학원
미생물은행
KACC44403
라이족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani)
: 잔디라이족토니아마름병 원인균		 PDA, PDB 25 5 대한민국, 대정골프엔지니어링
스클레로티니아 호모에오카르파(Sclerotinia homoeocarpa)
: 잔디동전마름병 원인균		 PDA, PDB 25 5 대한민국, 대정골프엔지니어링
난균류
파이토프토라 캑토룸
(Phytophthora cactorum)
: 사과역병 원인균		 V8, PDB 25 3,5 국립농업과학원
미생물은행
KACC40166
파이토프토라 캄비보라(Phytophthora cambivora)
: 사과역병 원인균		 V8, PDB 25 3,5 국립농업과학원
미생물은행
KACC40159
파이토프토라 시나모미(Phytophthora cinnamomi)
: 낙엽송역병 원인균		 V8, PDB 25 3,5 국립농업과학원
미생물은행
KACC40182
피시움 그라미니콜라(Pythium graminicola)
: 잔디피시움잎마름병 원인균		 PDA, PDB 25 2 국립농업과학원
미생물은행
KACC40155
피시움 울티뭄
(Pythium ultimum)
: 오이모잘록병 원인균		 PDA, PDB 25 2 KACC40705
4-1. 휴미콜라 속( Humicola sp) JS-0112 균주의 배양여액 준비
PDA 배지에서 배양된 휴미콜라 속(Humicola sp) JS-0112 균주의 균체 가장자리 직경 5mm 균사 조각(10개)을 떼어 내 200mL의 멸균된 PDB 배지에 접종하고 25℃, 150rpm에서 14일동안 진탕배양하였다. 그 다음, 4겹의 멸균거즈를 통해 배양액으로부터 균체를 여과하고, 여과액을 0.2μm 필터막에 통과시켜 휴미콜라 속(Humicola sp) JS-0112 균주의 배양여액을 준비하였다.
4-2. 14가지 식물병원성 진균이 혼합된 PDB 배지 준비
상기 표 3에 기재된 14가지 식물병원성 진균을 PDB 배지에 접종하고 25℃, 150rpm에서 5일동안 진탕배양하였다. 그 다음, 4겹의 멸균거즈를 통해 배양액으로부터 균체를 여과하고, 멸균한 증류수로 세척한 후 멸균수로 50 mg/mL 수준으로 희석한 후 균질기(homogenizer)로 10초간 마쇄하였다. 마쇄된 균질액을 멸균한 PDB 배지에 1% 접종하여 병원성 진균이 혼합된 PDB 배지를 준비하였다.
4-3. 휴미콜라 속( Humicola sp) JS-0112 균주 배양여액의 96-웰 마이크로플레이트 생물검정법
96-웰 플레이트의 첫 번째 웰에 상기 4-2의 병원성 진균이 혼합된 PDB 배지 180μL와 상기 4-1의 식물내생곰팡이 배양여액 20μL를 분주하고 잘 섞어서 배양여액 10% 처리구를 제조하였다. 그 다음, 두 번째 웰에 상기 4-2의 병원성 진균이 혼합된 PDB 배지를 100μL 분주하고 상기 10% 처리구 웰로부터 100μL를 회수하여 두 번째 웰에 분주하여 잘 섞어서 5% 처리구를 제조하였다. 이와 같이, 1/2씩 순차적으로 열 번째 웰까지 희석하여 10%부터 0.0195%까지 처리하였으며, 처리구 당 3반복으로 실시하였다. 끝으로, 상기 14가지 식물병원성 진균이 처리된 플레이트를 25℃에서 4-5일 동안 정치배양한 후, 최소생육저해억제농도(MIC)를 확인하였다. 그 결과는 하기 표 4에 나타내었다.
식물병원성 진균 최소생육억제농도 (%)
진균류
보트리티스 시네레아
(Botrytis cinerea)		 >10
콜레토트리쿰 코코데스(Colletotrichum coccodes) 1.25
크리포넥트리아 파라시티카(Cryphonectria parasitica) >10
푸사리움 그라미네아룸(Fusarium graminearum) >10
푸사리움 옥시스포룸 에프 에스피. 라이코펄시시
(Fusarium oxysporum f. sp. lycorpersici)		 -
가우만노마이세스 그라미니스
(Gaeumannonmyces graminis)		 5
라파엘라 퀘르쿠스-몽골리케(Raffaelea quercus-mongolicae) 1.25
라이족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani) 0.625
스클레로티니아 호모에오카르파(Sclerotinia homoeocarpa) 1.25
난균류
파이토프토라 캑토룸
(Phytophthora cactorum)		 0.156
파이토프토라 캄비보라
(Phytophthora cambivora)		 0.156
파이토프토라 시나모미
(Phytophthora cinnamomi)		 0.156
피시움 그라미니콜라
(Pythium graminicola)		 0.078
피시움 울티뭄
(Pythium ultimum)		 0.039
-: 생육을 억제하지 않음.
상기 표 3에서 확인할 수 있듯이, 푸사리움 옥시스포룸 에프 에스피. 라이코펄시시(F. oxysporum f. sp. lycorpersici)를 제외한 13가지 식물병원성 진균에 대하여 다양한 MIC 값으로 균사 생육을 억제하였다.
특히, 휴미콜라 속(Humicola sp) JS-0112 균주 배양여액은 보트리티스 시네레아(B. cinerea), 크리포넥트리아 파라시티카(C. parasitica), 푸사리움 그라미네아룸(F. graminearum)에 대하여 낮은 항진균 활성(MIC 값이 10% 이상)을 나타내었다.
흥미롭게도, 휴미콜라 속(Humicola sp) JS-0112 균주 배양여액은 테스트된 모든 난균류(Oomycetes) 식물병원성 진균에 대하여 강한 항진균 활성(MIC 값이 0.039-0.156%)을 나타내었다. 특히, 피시움 울티뭄(P.ultimum)의 MIC 값은 0.39%으로 휴미콜라 속(Humicola sp) JS-0112 균주 배양여액에 매우 민감하였다
농업생명공학연구원 KACC83027BP 20190926
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Claims (7)

  1. 항진균 활성을 갖는 수탁번호 KACC 83027BP의 휴미콜라 속(Humicola sp.) JS-0112 균주.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 균주는 서열번호 1의 ITS 염기서열 및 서열번호 2의 LSU 염기서열을 포함하는 것인, 균주.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 균주는 고추 탄저병, 잔디테이크올패치병, 참나무시들음병, 잔디라이족토니아마름병, 잔디동전마름병, 사과역병, 낙엽송역병, 잔디피시움잎마름병 및 오이모잘록병으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 식물병에 항균 효과를 나타내는 것인, 균주.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항의 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물, 상기 배양물의 건조물, 상기 균주의 배양 상등액 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함하는 항진균제 조성물.
  5. 제 4 항에 있어서, 상기 진균은 콜레토트리쿰 코코데스(Colletotrichum coccodes), 가우만노마이세스 그라미니스(Gaeumannonmyces graminis), 라파엘라 퀘르쿠스-몽골리케(Raffaelea quercus-mongolicae), 라이족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani), 스클레로티니아 호모에오카르파(Sclerotinia homoeocarpa), 파이토프토라 캑토룸(Phytophthora cactorum), 파이토프토라 캄비보라(Phytophthora cambivora), 파이토프토라 시나모미(Phytophthora cinnamomi), 피시움 그라미니콜라(Pythium graminicola) 및 피시움 울티뭄(Pythium ultimum)으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, 조성물.
  6. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항의 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물, 상기 배양물의 건조물, 상기 균주의 배양 상등액 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함하는 식물병 방제용 조성물.
  7. 제 6 항에 있어서, 상기 식물병은 고추 탄저병, 잔디테이크올패치병, 참나무시들음병, 잔디라이족토니아마름병, 잔디동전마름병, 사과역병, 낙엽송역병, 잔디피시움잎마름병 및 오이모잘록병으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, 조성물.
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