KR20120064291A - 신규한 스트렙토마이세스 젤다나마이시니너스 ｂｓ３２８３ 및 이를 이용한 식물병 방제방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 각종 작물에 발생하는 식물병에 탁월한 효과를 갖는 신규한 스트렙토마이세스 젤다나마이시니너스(Streptomyces geldanamycininus) BS3283 균주, 이를 포함하는 식물병원균 방제용 조성물 및 식물병원균을 생물학적으로 방제하는 방법에 관한 것이다. 상기 균주의 배양액 또는 배양여액을 이용하여 다양한 작물에서 식물 병원균에 의한 발병을 효과적으로 방제 및 예방할 수 있다.

Description

신규한 스트렙토마이세스 젤다나마이시니너스 ＢＳ３２８３ 및 이를 이용한 식물병 방제방법{Novel Streptomyces geldanamycininus BS3283 and method for controlling plant pathogen diseases using the same}
본 발명은 각종 작물에 발생하는 식물병에 탁월한 효과를 갖는 신규한 스트렙토마이세스 젤다나마이시니너스(Streptomyces geldanamycininus) BS3283 균주, 이를 포함하는 식물병원균 방제용 조성물 및 상기 균주를 이용하여 식물병원균을 생물학적으로 방제하는 방법에 관한 것이다.
농작물에 발생하는 각종 병충해는 직접적으로 수확량을 감소시키고, 그 품질에도 영향을 미친다. 특히, 채소, 과일 및 작물에 여러가지 질병을 야기하는 식물병원성 진균의 경우 작물의 안정적 생산에 제한 요인이 되고 있어, 농가에 많은 피해를 주고 있다. 토양 전염 병원성 진균으로서 탄저병 원인균인 콜레토트피쿰 글로에오스포리오이데스(Colletotrichum gloeosporioides), 식물의 상처부위를 통해 감염 또는 전염되어 썩는 부패병균인 푸사리움 옥시포룸(Fusarium oxysporum), 근부병균인 리족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani), 흑색썩음균핵병균인 슬레로티움 세피보룸(Sclerotium cepivorum), 식물역병균인 파이토프토라 캡사이시(Phytophthora capsici) 등과 같은 병원균은 채소, 과일 및 작물의 생산을 급격히 저하시키는 요인이 되어 왔다.
특히, 뿌리썩음병을 일으키는 잿빛곰팡이병의 경우, 불완전균류의 일종인 보트리티스 시네리아(Botrytis cinerea)가 병원균으로서, 방제가 쉽지 않으며 매우 다범성균으로 딸기,토마토, 가지, 피망, 오이, 호박, 양배추, 양상추, 사과, 포도, 키위, 아스파라거스, 감자, 강낭콩, 완두 등 거의 모든 채소와 과일류뿐만 아니라 제라늄이나 장미와 같은 화훼류에 부패병을 일으킨다. 또한, 잿빛곰팡이병은 온실과 포장에서 재배하는 각종 작물에 경제적으로 심각한 피해를 주는 병원균으로 알려져 있다. 구체적으로, 상기 잿빛곰팡이병원균은 18 ? 23℃의 습한 환경에서 잘 번식하기 때문에 이들 균은 난방을 시작함에 의해 저온다습한 온실환경 상태가 조성되면 식물의 노화와 적엽 및 수확 등의 작업으로 생기는 상처를 통해 대상식물에 감염되며 약광상태에서 잘 번식하는 특성을 가지므로, 겨울동안 온실내 채소나 과일의 줄기에 발병함으로써 봄철 수확량을 떨어뜨려 재배 농가에 막대한 손실을 가져온다.
따라서, 상기와 같은 식물병 유발균을 방제하기 위한 농약 개발 및 이의 사용에 관한 연구가 계속되어 유기합성 농약이 개발되었다. 유기합성 농약은 1900년대 초에 처음 개발되어 작물의 보호 수단으로서 매우 유효하며, 작물의 생산증대, 안정 공급, 농업 종사자의 노동력의 경감 등에 매우 큰 역할을 담당하여 왔다. 그러나 오늘날 화학비료나 농약의 과다 사용으로 인하여 염류의 집적현상 등이 나타나고, 화학농약에 대한 내성균이 출현하면서 방제가 어려워졌을 뿐만 아니라 잔류 농약에 의한 환경오염 문제 등 다양한 문제점이 야기되고 있다.
잿빛곰팡이병의 경우도 이에 대한 방제 방법으로서 저항성품종을 이용한 방제, 재배환경 조절 및 병든 식물 제거에 의한 경종적 방제, 살균제를 이용한 화학적 방제 등이 논의되어 왔으나, 저항성 품종의 이용과 경종적 방제는 거의 효과를 거두지 못하고 있는 실정이기 때문에 잿빛곰팡이병 방제는 주로 화학적 방제에 의존하고 있는 실정이다. 그러나 일부 효과를 갖는 농약의 경우에도 잔류독성문제로 인하여 과일을 수확해야하는 딸기나 오이 등에 있어서는 그 사용이 엄격하게 제한되고 있는 실정이다.
따라서, 화학비료나 농약의 사용을 줄이거나 대체할 수 있으며, 인축에 위해가 적고 작물에 피해를 일으키지 않으며, 토양 생태계와 같은 환경에 대한 피해가 적은 생물학적 방제의 기술이 미생물에 의해 가능하다는 것이 국내ㆍ외 여러 연구자들에 의해 입증됨에 따라, 생물 농약에 대한 관심과 연구가 증가하고 있다. 그러한 연구 결과로서, 식물의 근권에 존재하는 일부 방선균은 곰팡이, 세균, 그리고 바이러스성 병원체에 대한 생물학적 방제능력을 갖고 있는 것으로 보고되었다. 또한 그의 구체적인 기작으로서, Fe(III)와 특이적으로 결합하여 식물병원성 곰팡이의 포자발아를 억제시키는 사이데로포아(siderophore)의 생산, 곰팡이의 성장을 저해시키는 항생물질과 작은 분자량을 가진 다양한 물질의 합성, 병원체를 저해하는 다양한 효소의 생산, 그리고 식물체 내에서 전반적인 저항성을 유도하는 등 다양한 기작을 통해 병원균으로부터 식물을 보호하는 작용을 할 수 있음이 보고된 바 있다. 또한, endophytic 방선균의 경우에는 영양분의 동화작용 및 2차 대사산물의 생산에 의해 식물의 생육을 증진시키는 작용도 하는 것으로 보고되었다.
그러나 이러한 많은 연구 사례에도 불구하고 식물병의 방제 효과가 우수하고 저렴하며 안전한 식물병 방제용 생물농약은 아직까지 정착되어 있지 않은 실정이다. 따라서 항균 활성이 우수하며 저독성의 환경친화적 생물농약으로 사용할 수 있는 신규 미생물의 탐색이 여전히 요구되고 있다.
이에, 본 발명자들은 다양한 식물병 유발균에 대한 우수한 항진균 활성을 가지는 신규한 미생물을 탐색하기 위해 예의 노력한 결과, 식물의 근권토양으로부터 신규 방선균 스트렙토마이세스 젤다나마이시니너스 (Streptomyces geldanamycininus) BS3283 균주를 분리하고, 상기 균주 및 그 배양물을 작물에 처리한 결과 잿빛곰팡이병균을 비롯한 다양한 식물병균에 대하여 뛰어난 항균 활성이 있음을 밝혔으며, 상기 균주를 이용하여 식물병을 생물학적으로 방제할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 식물병원균에 대해 항진균 활성을 가지는 신규한 방선균 스트렙토마이세스 젤다나마이시니너스 (Streptomyces geldanamycininus) BS3283 균주(수탁번호: KACC 91612P)를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 균주의 배양물 또는 배양여액을 유효성분으로 포함하는 식물병 방제용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물을 식물에 처리하는 단계를 포함하는, 식물병을 생물학적으로 방제하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 식물병원균에 대해 항진균 활성을 가지는 스트렙토마이세스 젤다나마이시니너스 (Streptomyces geldanamycininus) BS3283 균주(수탁번호: KACC 91612P)를 제공한다.
본 발명의 스트렙토마이세스 젤다나마이시니너스 (Streptomyces geldanamycininus) BS3283 균주는 국내의 식물 근권토양으로부터 분리한 균으로서 각종 식물에 대해 비병원성이다.
상기 스트렙토마이세스 젤다나마이시니너스 (Streptomyces geldanamycininus) BS3283 균주는 식물에 큰 피해를 주는 주요 식물병 유발 균인 잿빛곰팡이균(Botrytis cinerea), 벼도열병균 (Magnaphorthe grisea), 시들음병균(Fusarium oxysporum), 토마토잎곰팡이병균(Fulvia fulva), 파검은무늬병균(Alternaria porri), 사과점무늬낙엽병균(Alternaria mali), 딸기탄저병균(Colletotrichum gloeosporiodes), 고추탄저병균(Colletotrichum acutatum), 인삼뿌리썩음병균(Cylindrocarpon destructans), 인삼모잘록병균(Rhizoctonia solani), 또는 푸른곰팡이균(Trichoderma sp.) 등에 대해 광범위한 항균 활성을 갖는다 (표 1 참조). 바람직하게, 상기 스트렙토마이세스 젤다나마이시니너스 (Streptomyces geldanamycininus) BS3283 균주는 잿빛곰팡이병균(Botrytis cinerea), 벼도열병균(Magnaphorthe grisea), 또는 딸기탄저병균( Colletotrichum gloeosporioides)에 대해 우수한 항균 활성을 가지며, 특히 인삼이나 딸기와 같은 각종 작물에 발생하는 잿빛곰팡이병을 일으키는 보트리티스 시네레아에 대해 매우 탁월한 항진균 활성을 갖는다.
본 발명에서 식물은 작물류, 과일류, 채소류, 또는 화훼류를 제한없이 포함한다.
본 발명의 스트렙토마이세스 젤다나마이시니너스 (Streptomyces geldanamycininus) BS3283 균주가 배양액 중에 생산하는 항진균 활성물질을 조사하기 위해 균 배양액을 원심분리하여 균체를 제거한 후 배양여액을 이용하여 컬럼 크로마토그래피를 실시한 결과, 상기 항진균 활성물질은 도 2의 구조를 가지는 구아니딜푼긴 A(guanidylfungin A)인 것으로 확인되었다.
또한, 본 발명의 스트렙토마이세스 젤다나마이시니너스 (Streptomyces geldanamycininus) BS3283 균주가 포자발아를 억제시키는 사이데로포아(siderophore)를 생산하는지 알아보기 위해 chrome azurol sulfonate assay를 이용한 결과, 상기 BS3283 균주는 사이데로포아 생산균임을 확인할 수 있었다 (실시예 4 참조).
본 발명에서 용어 "사이데로포아"는 가용성인 저분자량(주로 400~2,000 daltons)의 철이온 특이 결합(ferric iron-chelating) 화합물로서, 일반적으로 펩타이드 사슬로 연결된 황록색(yellow-green)의 색소를 띄는 형광성 발색단(fluorescent chromophore)을 말한다. 자연환경에서 미생물이 필요로 하는 철의 양은 그람양성균과 곰팡이의 경우 0.4~4.0μM정도, 그람 음성균의 경우 0.3~1.8μM 정도인데, 토양에는 이러한 철이온의 양이 자신의 생육유지에 충분하지 않기 때문에 모든 토양 미생물들간의 경쟁적 요인이 된다. 따라서 이러한 철이 부족된 환경(low-iron stress)을 극복하기 위해 호기성 및 통성혐기성 미생물들은 사이데로포아를 분비하여 철이온(Fe3+)과 복합체를 형성하여 세포내로 받아들이게 된다. 이러한 철은 일반적으로 식물병원균의 포자발아(spore germination)와 발아관신장(germ tube elongation)에 필수적인 요인이며, 그로 인한 병원균의 식물뿌리 침투 및 감염에 원인이 되기 때문에, 토양의 근권에서 사이데로포아에 의해 뿌리 주변의 철(Fe3 +)을 결합(chelating)하여 식물병원균의 포자발아와 발아관 신장을 억제할 수 있게 된다.
따라서, 사이데로포아 생산 균주인 본 발명의 균주 BS3283에 의한 경쟁적 길항작용을 통해 식물병원균의 생육을 억제할 수 있으며, 기주식물의 근권정착능력을 촉진할 수 있으므로, 상기 균주를 이용할 경우 효과적인 생물학적 방제방법이 될 수 있다.
또한, 본 발명의 스트렙토마이세스 젤다나마이시니너스 (Streptomyces geldanamycininus) BS3283 균주는 셀룰라아제와 프로테아제와 같은 식물병원성 진균의 세포성분을 분해하는 효소를 생산하므로, 상기 균주를 이용하여 식물병원성 진균을 방제할 수 있다 (표 2 참조).
상기와 같이 우수한 항진균 활성을 가지는 본 발명의 균주 BS3283은 토양개량제, 퇴비부숙제, 엽면살포제 또는 관주살포제 등의 유효성분으로 이용될 수 있다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기와 같이 다양한 식물병원균에 우수한 항진균 활성을 갖는 스트렙토마이세스 젤다나마이시니너스 (Streptomyces geldanamycininus) BS3283 균주(수탁번호: KACC 91612P)를 배양하여 그 배양액 또는 배양여액을 유효성분으로 포함하는 식물병 방제용 조성물을 제공한다.
본 발명에서 상기 조성물은 잿빛곰팡이병, 벼도열병, 시들음병, 토마토잎곰팡이병, 파검은무늬병, 사과점무늬낙엽병, 딸기탄저병, 고추탄저병, 인삼뿌리썩음병, 인삼모잘록병, 및 푸른곰팡이병으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 식물병에 대하여 방제효과를 나타낼 수 있으며, 이 중 잿빛곰팡이병균(Botrytis cinerea), 벼도열병균(Magnaphorthe grisea), 및 딸기탄저병균( Colletotrichum gloeosporioides)에 대하여 우수한 방제 효과를 나타낸다. 특히, 보트리티스 시네리에(Botrytis cinerea)에 의한 잿빛곰팡이병의 발생에 탁월한 방제효과를 갖는다.
상기 조성물은 환경친화적인 미생물 농약으로 제형화하여 사용될 수 있다. 본 발명에서 용어 "미생물농약"은 식물의 해충, 잡초, 병원 미생물 등을 방제하기 위하여, 자연에서 분리 선발하거나 용도에 맞게 변형시킨 미생물, 또는 미생물이 분비하는 화합물 등을 제품화한 것을 말하며, 바람직하게 본 발명의 스트렙토마이세스 젤다나마이시니너스 (Streptomyces geldanamycininus) BS3283 균주, 또는 이의 배양액이나 배양여액을 제품화하거나 본 발명의 균주가 생산하는 항진균 활성 물질인 구아니딜푼긴 A(guanidylfungin A)을 유효성분으로 포함하여 제품화할 수 있다.
또한, 상기 조성물에 고흡수성 수지, 식물성 오일류, 영양제, 첨가제와 코팅제를 혼합하여 바이오 그레뉼 복합체를 만들고 건조하여 미생물 살균제제를 제조하여 이용할 수 있다. 이외에도, 상기 조성물은 당업계에 통상적인 방법에 의해 수화제, 입제, 코팅 입제, 바이오 상토, 미생물영양제, 식물 생육촉진제, 토양 개량제, 종자 코팅제, 퇴비 부숙제, 엽면 살포제 또는 관주 살포제 등으로 제형화되어 사용될 수 있다. 이 경우 적용 양 및 농도는, 제형물의 형태, 적용 시기, 장소 및 방법, 해충의 종류, 손해 정도 및 기타 요인들에 따라 당업자에 의해 정해질 수 있다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기에서 기술한 본 발명의 스트렙토마이세스 젤다나마이시니너스 (Streptomyces geldanamycininus) BS3283 균주(수탁번호: KACC 91612P)를 배양하여 그 배양액 또는 배양여액을 식물에 적용하는 단계를 포함하는, 식물병을 생물학적으로 방제하는 방법을 제공한다.
상기 본 발명의 균주 BS3283의 배양액 또는 배양여액은 잿빛곰팡이병, 벼도열병, 시들음병, 토마토잎곰팡이병, 파검은무늬병, 사과점무늬낙엽병, 딸기탄저병, 고추탄저병, 인삼뿌리썩음병, 인삼모잘록병, 및 푸른곰팡이병으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 식물병에 방제 효과를 나타내며, 이 중 잿빛곰팡이병균(Botrytis cinerea), 벼도열병균(Magnaphorthe grisea), 및 딸기탄저병균( Colletotrichum gloeosporioides)에 대하여 우수한 방제 효과를 나타낸다. 특히 인삼 또는 딸기와 같은 작물에 대한 잿빛곰팡이병을 야기하는 보트라이티스 시네리에에 탁월한 방제효과를 갖는다. 따라서, 본 발명의 방제방법에 의할 때 광범위한 식물병원균에 대하여 효과적으로 생물학적 방제를 할 수 있다.
상기 본 발명의 BS3283 균주의 배양액 또는 배양여액을 식물에 적용하는 방법은 소정의 농도로 희석하여 식물의 잎, 뿌리, 줄기 등에 1회 또는 수 회 분무살포할 수 있으며, 이에 제한됨이 없이 당업계에서 통상적인 방법으로 수행하여 방제할 수 있다.
상기 상세히 설명한 바와 같이, 본 발명은 식물 병원성 진균에 대해 광범위한 항진균 활성 스펙트럼을 가지며 항진균 활성이 우수한 신규의 미생물인 스트렙토마이세스 젤다나마이시니너스 (Streptomyces geldanamycininus) BS3283균주를 제공하며, 이를 이용하여 다양한 작물에서 식물 병원균에 의한 발병을 효과적으로 방제 및 예방하는 효과가 있다.
도 1은 스트렙토마이세스 속 컴플렉스(Streptomyces sp. complex) 균주의 16s rRNA 서열 분석에 기초한 계통도(Neighbour-joining tree)를 나타낸 것이다.
도 2는 스트렙토마이세스 젤다나마이시니너스 BS3283 균주가 생산하는 항진균 물질인 구아니딜푼긴 A의 구조를 나타낸 것이다.
도 3은 스트렙토마이세스 젤다나마이시니너스 BS3283 균주가 생산하는 항진균 물질인 구아니딜푼긴 A의 수소핵자기공명(1H-NMR) 스펙트럼 결과(3a) 및 탄소핵자기공명(13C-NMR) 스펙트럼 결과(3b)를 나타낸 것이다.
도 4는 스트렙토마이세스 젤다나마이시니너스 BS3283 균주가 생산하는 항진균 물질인 구아니딜푼긴 A의 COSY 스펙트럼 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 스트렙토마이세스 젤다나마이시니너스 BS3283 균주가 생산하는 항진균 물질인 구아니딜푼긴 A의 HMBC 스펙트럼 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 스트렙토마이세스 젤다나마이시니너스 BS3283 균주가 생산하는 항진균 물질인 구아니딜푼긴 A의 HMQC 스펙트럼 결과를 나타낸 것이다.
이하, 본 발명을 실시예 및 시험예를 통해 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예 및 시험예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예 및 시험예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: BS3283 균주의 분리 및 동정
본 실시예에서는 보트리티스 시네리아를 시험균주로 하여 이에 길항력이 있는 미생물을 분리하기 위하여 전국 각지에서 토양을 채취하였다. 채취한 시료 1g에 멸균수 10 ml 를 혼합하여 28℃에서 10분간 진탕한 후, 토양 희석 한천평판법으로 107 배까지 희석하여 희석액 0.1 ml를 방선균 배양용 고체배지인 MBA(modified benett's agar, glucose 5 g, soluble starch 5 g, malt ext. 1 g, yeast ext. 1 g, N-Z amine 1 g, agar 15 g/L) 배지에 분주하여 배지 전면에 골고루 편 다음, 28℃ 항온기에서 5일간 배양한 후 단일 콜로니 (single colony)를 순수 분리하였다. 분리한 콜로니는 MBA 사면배지에 옮겨 배양 후 4℃에서 보관하였으며, 분리된 각각의 콜로니들은 잿빛곰팡이병균인 보트리티스 시네리아를 시험균으로 하여 강한 항균력을 나타내는 가장 우수한 한 균주를 선별하고, BS3283으로 명명하였다.
상기 과정에서 선별된 BS3283균을 동정하기 위하여, 고체배지(modified benett's agar)에서 배양한 후 형성된 단일 콜로니로부터 DNA를 추출하고 프라이머를 사용하여 PCR 증폭에 의한 산물을 획득, 이를 가지고 염기서열을 조사하였다.
상기 염기서열분석에 기초한 계통도는 도 1에 나타내었으며, BS3283균은 스트렙토마이세스 젤다나마이시니너스(Streptomyces geldanamycininus) 와 같은 그룹에 속하였으며, S. geldanamycinus 의 표준균주와 99%로 가장 높은 nucleotide sequence similarity를 보였다. 그러나 완전히 동일하지 않았기 때문에 상기 종에 속하는 신규한 균주임을 확인할 수 있었다. 따라서, 상기 선별된 BS3283 균주를 스트렙토마이세스 젤다나마이시니너스(Streptomyces geldanamycininus) BS3283으로 명명하고, 국립농과원 농업유전자원센터에 2010년 12월 3일에 수탁번호 KACC 91612P로 기탁하였다.
실시예 2: BS3283 균주의 배양
본 발명의 BS3283균의 배양은 항균활성 물질의 생산량 증대를 위하여 전배양과 본배양을 달리하여 이루어졌다. 먼저 전배양 배지(Soluble starch 10 g, Glycerol 7 g, Bacto peptone 3 g, Soytone peptone 5 g, Yeast extract 3 g, Anti-form 0.5 ml)를 1리터 증류수에 넣어 녹인 후 500 ml 삼각플라스크에 100 ml 씩 분주하고 1.5기압 121로 20분간 고압 살균하여 제조하였다. 제조된 전 배양 배지에 방선균 배양용 고체배지인 MBA에서 배양한 BS3283 균체를 백금이로 취하여 접종(1% 이하)한 후 28에서 100rpm으로 흔들어주면서 2일간 배양하여 종접종원으로 사용하였다.
상기 균의 본배양을 위한 배지는 지에스에스(GSS) 액체배지(Glucose 20 g, Soluble starch 10 g, Meat extract 1 g, Yeast extract 4 g, Sodium chloride 2 g, Dipotassium hydrogen phosphate 0.05 g, Soybean flour 25 g / L, pH 7)로 1L 삼각플라스크에 200 ml 씩 분주하고 1.5기압 121로 20분간 고압 살균하여 제조하였다. 제조된 배지에 종배양한 BS3283 균 배양액을 플라스크 당 3% (v/v)의 양으로 접종한 후 28에서 130rpm으로 5일간 진탕 배양하였다.
실시예 3: BS3283 균의 항균 스펙트럼 조사
본 발명에 의한 BS3283균은 지에스에스(GSS) 액체배지에서 5일간 배양 후 원심분리하여 균체와 배양여액으로 나누고, 배양여액을 페이퍼 디스크(paper disk)에 50씩 점적하고 풍건하였다. 이 페이퍼 디스크를 미리 제작한 병원균 검정용 플레이트에 치상하여 2~3일 배양한 후 생성된 저지환의 크기를 조사하였다. BS3283균의 항균활성 스펙트럼 결과를 하기 표 1에 나타내었다.
병 원 균 항균 활성a (mm)
Botrytis cinerea 28
Magnaporthe grisea 21
Fusarium oxysporum 12
Fulvia fulva 11
Aspergillus niger 0
Alternaria porri 9
Alternaria mali 9
Colletotrichum gloeosporiodes 20.8
Colletotrichum acutatum 16
Pythium sp . 0
Cylindrocarpon destructans 15
Rhizoctonia solani 10
Trichoderma sp. 11
aPaper disk method,
본 실시예에서 확인할 수 있듯이, 본 발명에 의한 균주의 배양여액은 잿빛곰팡이균(Botrytis cinerea), 벼도열병균 (Magnaphorthe grisea), 시들음병균(Fusarium oxysporum), 토마토잎곰팡이병균(Fulvia fulva), 파검은무늬병균(Alternaria porri), 사과점무늬낙엽병균(Alternaria mali), 딸기탄저병균(Colletotrichum gloeosporiodes), 고추탄저병균(Colletotrichum acutatum), 인삼뿌리썩음병균(Cylindrocarpon destructans), 인삼모잘록병균(Rhizoctonia solani), 또는 푸른곰팡이균(Trichoderma sp.)에 대한 항균 활성을 가지고 있는 것을 알 수 있었다. 특히, 본 발명에 의한 균주의 배양여액은 잿빛곰팡이병균(Botrytis cinerea), 벼도열병균(Magnaphorthe grisea), 딸기탄저병균( Colletotrichum gloeosporioides) 등에 대하여 우수한 항균 활성을 나타내었다.
실시예 4: 스트렙토마이세스 젤다나마이시니너스 BS3283 균주의 사이데로포아 생산 및 세포성분 분해효소의 생산
시험예 I. BS3283 균주에 의한 사이데로포아 ( siderophore ) 생산 시험
BS3283 균주에 의한 siderophore 생산 여부를 확인하기 위하여 chrome azurol sulfonate assay를 이용하였다. 먼저 증류수 50ml에 CAS 60.5mg을 녹인 다음 10ml의 1mM FeCl3 ?H2O (10mM HCl 용액)을 넣고 천천히 저으면서 72.9mg의 HDTMA(hexadecyltrimethylammonium bromide)를 증류수 40ml에 녹인 용액을 첨가시켜 고압멸균하여 진한 청색염료를 준비한 다음 H2O 750ml, 10X MM9 salt 100ml, agar 15g, pipes 30.24g, 10% casamino acid 용액 30ml, carbon source와 vitamin 등을 혼합한 용액 (pH 6.8)을 고압 멸균하여 50℃로 식힌 후 준비해둔 CAS 염료용액을 거품이 나지 않도록 첨가하여 plate에 분주하였다. 제조한 CAS 평판배지에 agar well를 만들어 BS3283균 배양액과 배양여액을 각각 20㎕ 씩 점적하고 28℃에서 5일간 배양한 후 주위에 orange halo zone의 생성을 확인하였다.
그 결과, 배양액을 처리한 경우 균의 생육에 따라 18.2mm의 orange halo zone을 확인할 수 있었으며, BS3283균이 siderophore 생산 균주임을 알 수 있었다. 따라서, 본 발명의 균주는 곰팡이균의 포자발아를 억제하여 항진균 효과를 나타냄을 알 수 있었다.
시험예 II . BS3283 균주에 의한 세포성분 분해효소( lytic enzyme ) 생산 시험
BS3283 균주에 의한 식물병원성 진균 세포성분 분해효소 (chitinase, cellulase, protease)의 활성을 표준방법(Manual of methods for general bacteriology)에 의하여 정성분석하였다. 먼저, protease 활성은 skim milk를 기질로 사용하여 만든 평판배지에 agar well를 만들어 BS3283균 배양액과 배양여액을 각각 20 ㎕ 씩 점적하고 28℃에서 5일간 배양한 후 주위에 clear zone의 생성 여부를 확인하였다. 또한 cellulase 활성은 CMC를 기질로 이용하였으며, chitinase 활성은 0.5% colloidal chitin을 기질로 사용하여 동일한 방법으로 배양한 후 plate상의 halo 형성을 조사하였다. BS3283균에 의한 세포성분 분해효소의 생산 시험 결과를 하기 표 2에 나타내었다.
표 2에서 보듯이, BS3283 균주는 배양액과 배양여액 처리 모두에서 cellulase와 protease 생성 여부를 확인할 수 있었으며 chitinase는 생성하지 않음을 알 수 있었다. 따라서, 본 발명의 균주는 cellulase와 protease를 생성하여 병균의 세포성분을 분해하여 항균 효과를 나타냄을 알 수 있었다.
효소 생산 처리 내용 Halo zone (mm)
Cellulase cell 23.1
Broth filtrate 18.4
Protease cell 24.3
Broth filtrate 24.5
Chitinase cell -
Broth filtrate -
실시예 5: 스트렙토마이세스 젤다나마이시니너스 BS3283 을 이용한 잿빛곰팡이병의 생물학적 방제
시험예 I. BS3283 균 배양물의 딸기 잿빛곰팡이병 방제효과
BS3283균 배양물의 딸기 잿빛곰팡이병 방제효과를 알아보기 위해, 균 배양물에 딸기를 15초간 침지 처리하여 풍건한 후 병원균포자 현탁액을 분무 접종하였다. 또한, 네거티브 대조구로서 증류수를 그대로 사용하였고, 포지티브 대조구로서 잿빛곰팡이병에 효과가 있는 디에토펜카프ㆍ가베다수화제를 500배로 희석하여 사용하였다. 처리 7일 후에 이병과율과 방제 효과를 조사하고, 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다.
하기 표 3에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 BS3283균 배양물 처리구의 경우 대조구에 비해 뛰어난 방제 효과를 보였다.
처리 내용 이병과수/전체과수 이병율 (%)
BS3283-배양여액 12/54 22.2
증류수 30/54 55.6
디에토펜카프ㆍ가베다수화제
500배액		 36/54 66.7
시험예 II . BS3283 균 배양물의 인삼 잿빛곰팡이병 방제효과
잿빛곰팡이병은 저장 중 많이 발생하는데 특히 인삼에 심하게 발생하여 큰 피해를 주고 있다. 본 시험예에서는 BS3283균 배양물을 이용한 인삼에서의 잿빛곰팡이병 방제효과가 있는지 여부를 조사하였다.
구체적으로, BS3283균 배양물에 의한 묘삼의 저장 중 잿빛곰팡이병 방제 효과 및 지속효과를 알아보기 위하여, 묘삼을 균 배양여액에 30초간 침지한 후 풍건하여 비닐팩에 넣어 냉장보관(4~7 ℃)하고 냉장보관 15일, 30일 후 묘삼의 건전율과 부패율을 조사하였다. 또한, 네거티브 대조구로서 증류수를 그대로 사용하였고, 포지티브 대조구로서 잿빛곰팡이병에 효과가 있는 디에토펜카프ㆍ가베다수화제를 500배로 희석하여 사용하였다. 처리 후 15일 경과 및 30일이 경과한 후 이병율과 방제가를 조사하였고 그 결과를 하기 표 4에 나타내었다.
표 4에서 보듯이, 무처리구와 증류수를 처리한 경우에는 잿빛곰팡이병이 심하게 발생하였으나(처리 30일 후), BS3283균 배양액 처리구의 경우 전반적으로 묘삼의 상태가 건전하고 50% 이상의 방제효과를 나타내었고, 30일이 경과한 후에도 50% 가 넘는 방제가를 보여 비교적 높은 지속효과를 보임을 알 수 있었다.
처리 내용 (%) 방제가 (%)
15일 후 30일 후 15일 후 30일 후
BS3283 배양여액 16.3 25.6 46.6 52.8
디에토펜카프ㆍ가베다수화제
500배액		 23.1 30.9 24.3 42.9
증류수 40.6 53.1 - 2.0
무처리 30.5 54.2 - -
실시예 6: 스트렙토마이세스 젤다나마이시니너스 BS3283 균주가 생산하는 항진균 물질의 분리 및 정제
스트렙토마이세스 젤다나마이시니너스 BS3283 균주가 생산하는 항진균 활성물질이 무엇인지 동정하기 위해, GSS배지에서 5일간 배양한 균 배양액을 원심분리하여 균체를 제거한 후 배양여액을 이용하여 HP20 컬럼 크로마토그래피를 실시하였다. 그 후 메탄올 (10%~100%)의 용매를 이용하여 RP sep-pak cartridge를 실시한 후 70%의 메탄올을 이용하여 세파덱스 LH-20 컬럼 크로마토그래피를 실시하였다. 각 단계별 활성분획은 잿빛곰팡이병균에 대한 항균활성을 통하여 선별하였으며, 다시 35 ~ 90%의 용매를 이용하여 RP sep-pak cartridge를 실시하여 활성물질을 분리하였다.
BS3283균주가 생산하는 항진균 활성물질의 분자량 및 구조 분석을 위하여 수소핵자기공명 스펙트럼(도 3a 참조)과 탄소핵자기공명 스펙트럼(도 3b 참조)과 2차원 NMR 분광법인 COSY(correlated spectroscopy) 스펙트럼(도 4 참조), HMBC(Heteronuclear Multiple Bond Correlation) 스펙트럼(도 5 참조), 및 HMQC(Heteronuclear Multiple Quantum Correlation) 스펙트럼(도 6 참조)을 측정하여 해석하였다. 상기 기기분석 결과를 근거로 데이터베이스를 검색한 결과, BS3283균주가 생산하는 항진균 활성물질은 구조식이 C58H103N3O18이고 분자량이 1129이며, 도 2의 구조를 가지는 구아니딜푼긴 A(Guanidylfungin A) 화합물로 확인되었다.
활성 물질: Guanidylfungin A 화합물
가) 분자식 : C58H103N3O18
나) 분자량 : 1129
다) 수소핵자기공명스펙트럼 : ppm (600MHz, CD3OD)
라) 탄소핵자기공명스펙트럼 : ppm (125MHz, CD3OD)
마) COSY 스펙트럼 : ppm (600MHz, CD3OD)
바) HMBC 스펙트럼 : ppm (600MHz, CD3OD)
사) HMQC 스펙트럼 : ppm (600MHz, CD3OD)
농업생명공학연구원 KACC91612P 20101129

Claims (10)

  1. 식물병원균에 대해 항진균 활성을 가지는 스트렙토마이세스 젤다나마이시니너스 (Streptomyces geldanamycininus) BS3283 균주(수탁번호: KACC 91612P).
  2. 제1항에 있어서, 상기 식물병원균은 잿빛곰팡이균(Botrytis cinerea), 벼도열병균 (Magnaphorthe grisea), 시들음병균(Fusarium oxysporum), 토마토잎곰팡이병균(Fulvia fulva), 파검은무늬병균(Alternaria porri), 사과점무늬낙엽병균(Alternaria mali), 딸기탄저병균(Colletotrichum gloeosporiodes), 고추탄저병균(Colletotrichum acutatum), 인삼뿌리썩음병균(Cylindrocarpon destructans), 인삼모잘록병균(Rhizoctonia solani), 및 푸른곰팡이균(Trichoderma sp.)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 균주.
  3. 제1항에 있어서, 상기 균주는 항진균 활성물질로서 구아니딜푼긴 A(guanidylfungin A)를 생산하는 것인 균주.
  4. 제1항에 있어서, 상기 균주는 사이데로포아(siderophore)를 생산하는 것인 균주.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 균주의 배양액 또는 배양여액을 유효성분으로 포함하는 식물병 방제용 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 식물병은 잿빛곰팡이병, 벼도열병, 시들음병, 토마토잎곰팡이병, 파검은무늬병, 사과점무늬낙엽병, 딸기탄저병, 고추탄저병, 인삼뿌리썩음병, 인삼모잘록병, 및 푸른곰팡이병으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 조성물.
  7. 제5항에 있어서, 상기 식물병은 보트라이티스 시네리에(Botrytis cinerea)에 의한 인삼 또는 딸기의 잿빛곰팡이병인 조성물.
  8. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 균주의 배양액 또는 배양여액을 식물에 적용하는 단계를 포함하는, 식물병을 생물학적으로 방제하는 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 식물병은 잿빛곰팡이병, 벼도열병, 시들음병, 토마토잎곰팡이병, 파검은무늬병, 사과점무늬낙엽병, 딸기탄저병, 고추탄저병, 인삼뿌리썩음병, 인삼모잘록병, 및 푸른곰팡이병으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 방법.
  10. 제8항에 있어서, 상기 식물병은 보트라이티스 시네리에(Botrytis cinerea)에 의한 인삼 또는 딸기의 잿빛곰팡이병인 방법.
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