KR101518196B1

KR101518196B1 - 식물 병원성 진균에 대한 항균 활성을 갖는 스트렙토마이세스 벨로서스 ｈｒ29 균주

Info

Publication number: KR101518196B1
Application number: KR1020150004297A
Authority: KR
Inventors: 송홍규; 김혜령; 임태빈; 권혁도
Original assignee: 강원대학교산학협력단
Priority date: 2015-01-12
Filing date: 2015-01-12
Publication date: 2015-05-06

Abstract

본 발명은 식물 병원성 진균에 대한 항균 활성을 갖는 스트렙토마이세스 벨로서스 HR29 균주 및 이를 포함하는 식물병 방제용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 스트렙토마이세스 벨로서스 HR29 균주 및 이를 포함하는 식물병 방제용 조성물을 이용하면, 여러 식물병을 일으키는 진균을 효과적으로 저해할 수 있으며, 종래의 합성 농약으로 인한 토양 및 수질 오염 문제를 일으키지 않을 수 있어, 소비자에게 품질이 우수하고, 안전한 농산물을 공급할 수 있다.

Description

식물 병원성 진균에 대한 항균 활성을 갖는 스트렙토마이세스 벨로서스 ＨＲ29 균주{Streptomyces vellosus HR29 Having Anti-fungal Activity}

본 발명은 식물 병원성 진균에 대한 항균 활성을 갖는 스트렙토마이세스 벨로서스 HR29 균주 및 이를 포함하는 식물병 방제용 조성물에 관한 것이다.

최근 전 세계적으로 건강한 삶과 환경 보존을 동시에 추구하고 실천하려는 움직임이 커지고 있다. 그 중에서도 식생활, 특히 농산물은 건강과의 연관성이 강하고 직접 섭취함으로써 효과가 비교적 빠르게 나타나기 때문에 이러한 변화에 민감한데, 우리나라 또한 2000년대 이후 황사, 광우병, 구제역 등의 환경재해, 환경오염에 대한 우려로 인해 안전한 먹거리에 대한 소비자의 관심이 높아지고 있다. 그에 따라 친환경농산물에 대한 선호도가 커지며 친환경농산물 재배를 위한 생물농약과 같은 생물학적 방제에 대한 관심과 연구가 증가하는 추세이다.

농업생산에 있어 농약은 작물의 수량과 품질을 향상시키고 인구증가에 따른 공급량을 증가시킨다는 면에서 중요성이 부각되어 왔으며 지금까지 화학비료와 유기합성농약을 통한 화학적 방제가 주를 이루었다. 하지만 농약의 과다사용으로 인한 난분해성 잔류독성이 공기, 토양, 지하수를 오염시켜 환경과 생태계에 미치는 악영향과 식물병원균의 농약 저항성 획득 등에 의한 약효감소 등의 부작용이 증가하고 있다. 이러한 부작용에 대해 미생물제제를 이용한 생물학적 방제법은 잔류독성이 없고 농업생태계를 교란하지 않는다는 점에서 효과적인 대처법으로 각광받고 있으나, 아직 전 세계 농약시장에서 생물학적 방제에 대한 비중이 낮다.

2010년 한국과학기술연구원의 보고에 따르면 국내외 생물농약 시장 규모는 화학농약 대비 약 11% 수준이며, 국내 미생물농약 시장은 80억 원이다. 그러나 전세계적으로 농약 시장에서 합성농약은 줄어드는 반면 생물농약은 연 평균 약 10% 씩 증가하고 있으며 이에 따라 국내 생물농약 역시 2015년엔 약 1800억 원의 규모로 성장할 것으로 예상하고 있다. 현재 우리나라에서는 시도별 친환경 농산물 인증 사업이 시행되고 있으며 그 규모는 점차 증가하고 있지만 대부분의 미생물제제를 수입에 의존하고 이들 미생물이 우리나라의 기후, 토양과 같은 환경조건에 적응하지 못해 효과를 충분히 발휘하지 못하는 경우가 많다.

병원성 곰팡이에 대한 미생물의 항균기작은 미생물에 의한 직접적 길항작용과 식물의 면역시스템을 자극하는 간접적 길항작용으로 나눌 수 있다. 직접적인 길항작용에 의한 생물학적 방제는 사용하는 미생물이 키티나아제, β-1,3-글루카나제와 같은 세포벽 가수분해효소를 분비하거나 철이온에 대한 높은 친화력을 가지고 병원성 진균과 경쟁하여 포자 발아를 억제하는 시데로포어를 분비하여 경쟁적 길항작용을 나타내거나 병원성 진균의 생장을 직접적으로 억제하는 항생물질을 생산하여 곰팡이의 사멸 또는 생육을 정지시켜 식물병 유발을 감소시킨다.

토양에 존재하는 주된 미생물 중 하나인 방선균은 균사형태를 띠고 형태분화를 하는 그람양성 토양미생물이며 복잡한 형태적 분화뿐만 아니라 스트렙토마이신, 액티노마이신, 린코마이신과 같은 항생제, 항암제, 면역억제제로 대표되는 다양한 종류의 이차대사산물을 생산한다. 실제로 자연계에서 미생물이 생장과정에서 생산한 이차 대사산물 중 10,000 여종의 항생물질을 조사한 결과 방선균, 세균 그리고 곰팡이가 각각 64%, 13% 그리고 23%를 차지하며 방선균이 가장 많은 유용 생리활성 물질을 생산하는 것으로 조사되었다. 또한 방선균은 식물병원균으로부터 뿌리를 보호하고, 다양한 인돌-아세트산(indole-acetic acid, IAA)과 같은 다양한 식물 호르몬을 분비하여 식물체의 발달에 영향을 주기도 한다. 하지만 현재 생물학적 방제에 이용되는 미생물 제제로는 고초균, 효모, 광합성균 등으로 대표되는 다양한 유용미생물을 사용하고 있으나 아직까지 방선균의 연구와 활용은 미비한 상태이다.

한국 특허 출원 제2008-0113298호

본 발명의 일 양상은 식물 병원성 진균에 대한 항균 활성을 갖는 스트렙토마이세스 벨로서스 HR29(Streptomyces vellosus HR29)(수탁번호 KACC92006P) 균주를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 양상은 스트렙토마이세스 벨로서스 HR29(Streptomyces vellosus HR29)(수탁번호 KACC92006P) 균주를 유효성분으로 포함하는 식물병 방제용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 양상은 식물에 상기 균주 또는 방제용 조성물을 접촉시키는 단계를 포함하는 식물병의 방제 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 일 양상은 식물 병원성 진균에 대한 항균 활성을 갖는 스트렙토마이세스 벨로서스 HR29(Streptomyces vellosus HR29)(수탁번호 KACC92006P) 균주를 제공한다.

본 발명은 기존의 미생물 제제에 사용되었던 미생물 종류와는 전혀 다른 신규한 균주로서, 본 발명의 균주는 토양 내 미량 존재하는 필수 생리물질인 철 성분을 선택적으로 흡수하여 병원성 진균을 억제하며 동시에 식물체에는 철을 공급하여 식물 생장을 촉진할 수 있는 것으로 알려진 시데로포어(siderophore)의 분비 능력이 탁월하며, 세포벽 가수분해 효소인 키티나아제(chitinase) 및 β-1,3-글루카나제(β-1,3-glucanase)의 활성이 월등히 높아 친환경적이고 경제적인 미생물 제제로 이용될 수 있는 장점을 가진다.

본 발명은 다양한 식물에 있어서 식물 병원성 진균에 대한 우수한 항균 활성을 나타내는 균주이며, 특히 식량작물, 특용작물, 채소, 과수목 및 화훼 식물에 발생할 수 있는 여러 식물병들에 대한 항균 활성을 나타낼 수 있으나, 이에 한정하지는 않는다.

일 구체예에 따르면, 상기 식물은 오이, 고추, 가지, 감자, 무, 부추, 파, 파프리카, 참외, 메론, 포도, 딸기, 토마토, 벼, 밀, 보리, 호박, 잔디, 담배, 장미 및 인삼으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 식물이나, 이에 한정하지는 않는다.

본 명세서에서 용어, "식물 병원성 진균"은 식물에 침입하여 식물의 잎, 줄기, 뿌리 또는 과실을 손실 및 손상을 일으키는 병원성 진균(fungi)을 의미하며, 일 구체예에 따르면, 상기 식물 병원성 진균은 시들음병균, 덩굴 쪼김병균 및 잎집무늬마름병균으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.

일 구체예에 따르면, 본 발명의 균주는 토양 내 미량 존재하는 필수 생리물질인 철 성분을 선택적으로 흡수하여 병원성 진균을 억제하며 동시에 식물체에는 철을 공급하여 식물 생장을 촉진할 수 있는 시데로포어(siderophore)를 생성하는 것일 수 있다.

일 구체예에 따르면, 본 발명의 균주는 세포벽 가수분해 효소인 키티나아제(chitinase)를 생성하는 것일 수 있으며, β-1,3-글루카나제(β-1,3-glucanase)를 생성하는 것일 수 있다.

본 발명의 다른 양상은 스트렙토마이세스 벨로서스 HR29(Streptomyces vellosus HR29)(수탁번호 KACC92006P) 균주를 유효성분으로 포함하는 식물병 방제용 조성물을 제공한다.

일 구체예에 따르면, 본 발명은 스트렙토마이세스 벨로서스 HR29(수탁번호 KACC92006P) 균주가 1.0 x 10⁶ 내지 1.0 x 10¹² cfu/㎖(colony/㎖)의 양으로 포함되어 있는 배양액 또는 균주 건조 분말 10 내지 70 중량%를 포함할 수 있다.

또한, 스트렙토마이세스 벨로서스 HR29를 포함하는 식물병 방제용 조성물은 계면활성제, 디옥시벤존(Dioxybenzone), 소듐트리이소프로필설포네이트(Sodium triisopropylsulfonate), 대두유, 옥배유, 면실유 등의 식물성 오일 또는 이들 중 2이상의 혼합물로 이루어진 그룹 중에서 선택된 자외선차단제, 글루코오스(Glucose), 수크로오스(Sucrose), 구연산 또는 이들 중 2이상의 혼합물로 이루어진 그룹 중에서 선택된 균주의 영양원, 대두유, 이소프로필산포스페이트(Isopropyl acid phosphate), 소듐트리폴리포스페이트(STPP ; Sodium tripolyphosphate) 또는 이들 중 2이상의 혼합물로 이루어진 그룹 중에서 선택된 안정제, 수용성 전분, 덱스트린, 카르복시메틸셀룰로오스, 폴리아크릴산나트륨, 폴리비닐알코올, 아라비아검, 잔탄검 또는 이들 중 2이상의 혼합물로 이루어진 그룹 중에서 선택된 결합제 및 잔량으로서 증량제 등을 혼합하여 제조될 수 있다.

본 발명에 포함되는 계면활성제는 계면활성이 큰 물질로서 분자 중에 친수성기 및 친유성기를 모두 포함하는 양친매성 물질로서, 세정력, 분산력, 유화력, 가용화력, 습윤력, 살균력, 기포력 및 침투력 등이 우수하며, 본 발명에 포함된 스트렙토마이세스 벨로서스 HR29가 효과적으로 약효를 발현하도록 습윤, 붕괴 및 분산시키는 작용을 한다.

본 발명에 포함될 수 있는 계면활성제로는 음이온성 계면활성제, 양이온성 계면활성제 및 비이온성 계면활성제 등 상용화된 모든 종류의 계면활성제들이 사용될 수 있다.

예를 들면, 음이온성 계면활성제로는 탄소수 8-12의 알킬벤젠설포네이트, 탄소수 3-6의 알킬나프탈렌설포네이트, 탄소수 3-6의 디알킬나프탈렌설포네이트, 탄소수 8-12의 디알킬설포석시네이트, 리그닌설포네이트, 나프탈렌설포석시네이트포르 말린축합물, 탄소수 8-12의 알킬나프탈렌설포네이트포르마린축합물, 탄소수 8-12의 폴리옥시에틸렌알킬페닐설포네이트와 같은 설포네이트의 나트륨염 또는 칼슘염, 탄소수 8-12의 알킬설페이트, 탄소수 8-12의 폴리옥시에틸렌알킬설페이트, 탄소수 8-12의 폴리옥시에틸렌알킬페닐설페이트와 같은 설페이트의 나트륨염 또는 칼슘염, 폴리옥시알킬렌숙시네이트와 같은 숙시네이트의 나트륨염 또는 칼슘염 등을 들 수 있으며, 비이온성 계면활성제로는 탄소수 8-12의 폴리옥시에틸렌알킬에테르, 탄소수 8-12의 폴리옥시에틸렌알킬페닐에테르, 탄소수 8-12의 폴리옥시에틸렌알킬페닐폴리머 등을 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 포함될 수 있는 자외선차단제는 제제된 방제용 조성물의 운반, 저장 및 작물에의 처리 후 등에서 빛에 노출 시 빛 중에 포함된 자외선을 차단하여 방제용 조성물 내의 활성성분으로서의 스트렙토마이세스 벨로서스 HR29의 안정성을 유지하는 기능을 하는 것으로서, 디옥시벤존, 소듐트리이소프로필설포네이트, 대두유, 옥배유, 면실유 등의 식물성 오일 또는 이들 중 2이상의 혼합물로 이루어진 그룹 중에서 선택된 것이 바람직하다. 특히, 불포화기를 많이 포함하는 식물성 오일들이 바람직하다.

본 발명의 조성물에 포함될 수 있는 영양원은 스트렙토마이세스 벨로서스 HR29의 생존을 위한 것으로서, 특히 글루코오스, 수크로오스 등의 당류나 당대사물인 구연산 등을 예로 들 수 있다.

또한, 상기 조성물에 포함될 수 있는 안정제는 본 발명에 따른 방제용 조성물의 안정성을 향상시키기 위하여 첨가되는 성분으로서, 대두유, 이소프로필산포스페이트, 소듐트리폴리포스페이트 등 통상적인 첨가제 등이 사용될 수 있다.

한편, 상기 조성물에 포함될 수 있는 결합제는 본 발명에 따른 방제용 조성물을 구성하는 각 성분들을 긴밀하게 결합 또는 수용토록 하는 것으로서, 일반적으로 널리 사용되는 수용성 전분, 덱스트린, 카르복시메틸셀룰로오스, 폴리아크릴산나트륨, 폴리비닐알코올, 아라비아검, 잔탄검 또는 이들 중 2이상의 혼합물로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.

또한, 상기 조성물에 포함될 수 있는 증량제는 상기 계면 활성제와 함께 사용되어 상기 계면활성제를 흡착 및 분상화시키고, 상기 계면활성제, 자외선차단제, 안정제, 영양원 및 결합제 등과 함께 방제용 조성물의 표면을 이루는 물질로 기능하며, 미생물과 같은 유효성분 및 결합제나 자외선차단제 등과 같은 성분들이 전체 조성에서 적절한 비율로 함유되도록 하기 위하여 전체 조성물의 양을 조절하는 기능을 한다. 이러한 증량제의 사용으로 유효성분이나 기타성분들이 적정량으로 포함될 수 있게 되며, 이들 기능성분들의 과다한 사용을 억제하여 효율적인 방제용 조성물의 제조를 가능하게 하는 역할을 하는 것으로 이해될 수 있다.

예를 들어, 상기 증량제로는 소듐알기네이트(Sodium alginate), 젤라틴화 전분(Pregelatinezed starch ; 예를 들면 상품명 미라스퍼스, 미라젤 등), 옥수수전분, 대두박, 밀기울, 입상섬유질, 유안, 규조토, 제올라이트, 벤토나이트, 탈크, 카올린, 파이로필라이트, 화이트카본 등이 적절하게 사용될 수 있다. 이들은 특별한 기능을 수행하기 위한 것이 아니고, 단지 방제용 조성물의 양을 증량시키기 위한 것으로서, 경제적이고 화학적으로 비활성인 것이 바람직하다.

본 발명의 방제용 조성물을 액상수화제로 제제하는 경우, 상기 증량제로는 물이 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 방제용 조성물은 제형에 제한을 받지 않는다.

즉, 본 발명의 하나의 구체적인 제형의 예로서의 입제 조성물 또는 분상의 수화제 조성물은 증량제로서 물을 제외한 증량제를 사용하여 상기 각 성분들을 균일하게 혼합하여 조성될 수 있으며, 혼합된 분상물 자체로서 수화제로 사용할 수 있고, 입제의 경우에만 상기 혼합물을 반죽한 후, 통상의 조립기를 이용하여 사출성형시키고, 건조시켜서 입상으로 성형할 수 있다. 조립기를 이용한 사출성형은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게는 용이하게 이해될 수 있는 것이다.

본 발명의 다른 하나의 구체적인 제형의 예로서의 액상수화제 조성물은 증량제로서 물을 사용하여 물에 상기 각 성분들을 분산시켜 조성될 수 있다. 특히, 액상수화제 조성물의 경우, 액제 특성상 칼슘카보네이트, 소르비톨(Sorbitol), 소르빈산(Sorbic acid) 또는 이들 중 2이상의 혼합물로 이루어진 그룹 중에서 선택된 첨가제 및 글리콜류의 동결방지제 등이 더 포함될 수 있다.

상기 첨가제는 붕괴, 확산 및 결합 등에 보조적인 역할을 하는 물질로서 상기 계면활성제를 보조하여 작용하는 것으로 여겨지며, 특히 제형의 액상화를 용이하게 하는 것으로 고려된다.

또한, 상기 동결방지제는 본 발명에 따른 조성물이 액상수화제로서 액상으로 존재하기 때문에 동절기의 혹한 중에도 용이하게 보관할 수 있도록 하기 위한 것으로서, 통상 물의 동결방지를 위한 부동액 성분인 글리콜류, 즉 에틸렌글리콜 또는 프로필렌글리콜 등의 글리콜류가 사용될 수 있다.

상기한 바와 같은 제형의 변경은 필요에 따라 적절히 조절될 수 있는 것으로서, 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게는 기본적으로 약리효과를 가지는 본 발명의 균주에 계면활성제, 자외선차단제, 안정제, 미생물의 영양원, 결합제 등을 포함하는 방제용 조성물에 있어서, 다른 보조성분들을 적절히 가감하여 여러 제형으로 구체화시킬 수 있는 것으로 이해될 수 있다.

본 발명의 또 다른 양상은 식물에 식물병원성 진균에 대한 항균 활성을 갖는 스트렙토마이세스 벨로서스 HR29 균주 또는 상기 균주를 포함하는 식물병 방제용 조성물을 접촉시키는 단계를 포함하는 식물병의 방제 방법을 제공한다.

일 구체예에 따르면, 상기 방법은 접촉시키는 단계 이전에 스트렙토마이세스 벨로서스 HR29 균주를 분리 배양하는 단계를 더 포함할 수 있다.

상기 접촉시키는 방법은 스트렙토마이세스 벨로서스 HR29 균주를 식물의 씨앗과 동시에 접촉시키거나 씨앗 발아 후 접촉시킬 수 있으며, 식물 성장 과정 또는 성숙된 식물에 접촉시킴으로써 식물 병원성 진균에 대한 항균 활성을 갖도록 할 수 있다.

또한, 본 발명에서 스트렙토마이세스 벨로서스 HR29 균주를 식물에 접촉시키는 경우, 본 발명은 스트렙토마이세스 벨로서스 HR29 균주, 스트렙토마이세스 벨로서스 HR29 균주가 포함된 배양액 또는 스트렙토마이세스 벨로서스 HR29 균주를 분리시킨 배양액의 방식으로 식물에 접촉시킬 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 제공하는 식물 병원성 진균에 대한 식물의 방제 방법은 상기 스트렙토마이세스 벨로서스 HR29 균주를 이용하는 방법이므로, 본 발명의 명세서의 과도한 중복 기재를 피하기 위하여, 이 둘의 공통된 내용은 생략한다.

본 발명에 따른 스트렙토마이세스 벨로서스 HR29 균주 및 이를 포함하는 식물병 방제용 조성물을 이용하면, 여러 식물병을 일으키는 진균을 효과적으로 저해할 수 있으며, 종래의 합성 농약으로 인한 토양 및 수질 오염 문제를 일으키지 않을 수 있어, 소비자에게 품질이 우수하고, 안전한 농산물을 공급할 수 있다.

도 1은 그람 염색한 Streptomyces vellosus HR29을 400배 배율로 관찰한 사진이다.
도 2는 포테이토 덱스트로스 아가 배지에서 7일 동안 배양한 Streptomyces vellosus HR29가 Fusarium oxysporum f. sp. raphani, F. oxysporum f. sp. niveum, F. oxysporum f. sp. lycopersici 및 Rhizoctonia solani의 성장 저해 결과를 나타낸 사진이다.
도 3은 Streptomyces vellosus HR29에 의한 시데로포어(siderophore) 생성을 King's B 배지에서 확인한 그래프이다.
도 4는 0.2%의 콜로이드 키틴을 포함하는 펩톤 배지에서 Streptomyces vellosus HR29의 키티나아제(chitinase) 활성의 변화를 나타낸 그래프이다.
도 5는 0.2%의 라미나린(laminarin)을 포함하는 펩톤 배지에서 Streptomyces vellosus HR29의 β-1,3-글루카나제 활성의 변화를 나타낸 그래프이다.
도 6는 Benette 배지에서 3일 동안 배양을 통해 Streptomyces vellosus HR29과 다른 유용 미생물 사이의 공생여부 가능성을 나타낸 그래프이다.

이하 하나 이상의 구체예를 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실험 방법

1. 균주의 분리 및 동정

강원도 춘천시 봉의산, 구봉산 등산로 주변 토양으로부터 토양시료를 채취하였다. 채취한 시료는 실험실로 옮겨와 0.85% NaCl 용액 40 ml과 혼합하여 10^-3 ~ 10^-4까지연속 희석하였고, Starch Casein Nitrate (SCN) 아가 평판 배지(Soluble starch 10.0 g, KH₂PO₄ 2.0 g, Casein 0.3 g, MgSO₄7H₂O 0.05 g, CaCO3 0.02 g, FeSO₄7H₂O 0.01 g, Actidione 40/ml, 1 L dH₂O, pH 7.0) 및 Olson's agar 평판 배지(Sodium caseinate 2.0 g, Asparagine 0.1 g, Sodium propionate 4.0 g, K₂HPO₄ 0.5 g, MgSO₄7H₂O 0.1 g, FeSO₄7H₂O 1.0 mg, Agar 15.0 g, Glycerin, 5.0 g, Actidione 40/ml, 1 L dH₂O, pH 7.0)에 100 ㎕씩 첨가하여 도말하였다. 이후, 7~14일 동안 30℃에서 암조건에서 배양한 후, 사상 형태의 집락을 분리하고 현미경으로 균사를 조사하였으며 분리한 균주들은 Benette agar 평판 배지(Glucose 10 g, beef extract 1 g, yeast extract 1 g, Peptone 2 g, 1 L dH₂O)에 획선 배양하여 4℃에서 보관하였다.

상기 분리 과정을 통해 획득한 균주들 중 항진균 활성이 가장 높은 균주를 HR29라고 명명하였으며 Benette agar 평판 배지에 배양하여 (주)마크로젠에 16s rDNA분석을 의뢰하였다. 분석된 염기서열 결과는 National Center for Biotechnology Information(NCBI) 등록 균주들과 상동성을 비교하여 동정하였다.

2. 항진균 활성 조사

식물 병원성 진균류인 시들음병 병원체(Fusarium oxysporum f. sp. raphani), 덩굴 쪼김병 병원체(F. oxysporum f. sp. niveum), 시들음병 병원체(F. oxysporum f. sp. lycopersici) 및 잎집무늬마름병 병원체(Rhizoctonia solani)에 대한 항진균 활성을 알아보기 위해 디스크 확산법(disc plate diffusion)을 이용하였다. 포테이토 덱스트로스 아가(Difco Co.) 평판 배지의 양쪽 끝에 직경 1 cm의 콜크 보러(Cork Borer)를 이용하여 잘라낸 식물 병원성 곰팡이 디스크와 분리균주 디스크를 두어 대치한 실험군과 분리균주 디스크를 놓지 않은 대조군을 각각 30℃에서 7일간 배양하여 생육 저지환(Inhibition zone)의 유무와 크기를 조사하였다.

3. 항진균 물질 생성능 조사

항진균능이 있는 균주들을 대상으로 경쟁적 길항작용으로 곰팡이의 생장을 저해하는 시데로포어(siderophore)의 분비량을 측정하고 곰팡이의 세포벽을 분해시키는 세포벽 가수분해 효소인 키티나아제(chitinase)와 β-1,3-글루카나제의 생산량을 환원당 측정법[3,5-dinitrosalicylic acid(DNS) method]를 통해 정량하였다.

3-1. 시데로포어의 정성 및 정량 분석

균주의 시데로포어 분비 유무를 조사하기 위해, 먼저 Chrome Azurol S (CAS, Sigma) 어세이를 통해 정성적으로 확인하였다. CAS 평판 배지(dark blue solution(Schwyn and Neilands, 1987), Pipes 32.24 g, Agar 16 g, 1 L dH₂O, pH 6.8)에 직경 5 mm 콜크 보러를 이용하여 구멍을 낸 뒤, King's medium B (KB; Peptone 20 g, glycerin 10 ml, KH₂PO₄1.5 g, MgSO₄7H₂O 1.5 g, 1 L dH₂O, pH 7.2)에 배양한 균주 배양액을 70 ㎕를 넣어주었다. CAS 평판 배지는 30℃의 암조건에서 48시간 동안 배양하였으며, 노란색 환의 형성 유무를 확인한 후, 활성 물질을 시데로포어로 판단하고 정량 분석을 진행하였다. 균주는 KB 배지 40 ml에 선배양하였으며 (48시간, 30℃, 150 rpm, 암조건), 배양액은 분광 광도계(Shimadzu UV-1700, Shimadzu Co., Japan)를 이용하여 OD₆₀₀이 1이 되도록 보정한 후, 90 ml의 KB 배지에 10 ml씩 보정된 균주를 접종해서 배양하였다(48시간, 30℃, 150 rpm, 암조건). 24시간 간격으로 균주 배양액을 50 ml 코니컬 튜브에 15 ml씩 넣고 원심분리하고(3400×g, 30분, 4℃) 상등액을 추출하여 1 M HCl로 pH 2.9가 되도록 보정하였다. 보정한 상등액과 동량의 에틸 아세테이트를 혼합하여 Extraction Shaker(Recipro shaker RS-1, Jeio Tech)로 1회 추출하고(300 rpm, 30분) 추출한 용액을 원심분리하여(3400×g, 15분, 4℃) 상층의 에틸 아세테이트 5 ml과 Hathway 반응 용액(0.1 M HCl을 이용해 만든 0.1 M FeCl₃ 1 ml, 0.1 M potassium ferricyanide 1 ml, 0.1 L dH₂O) 5 ml을 30분간 반응시켰다. 반응 후 분광광도계를 이용해 OD₇₀₀에서 흡광도를 측정하였으며(Nagarajkumar et al., 2004). 표준 곡선은 디히드록시 벤조산(dihydroxy benzoic acid)을 이용하여 정량하였다.

3-2. 키티나아제 활성 조사

균주의 키티나아제 활성을 측정하기 위해 먼저 콜로이드 키틴을 제조하였다. 콜로이드 키틴은 5 g의 키틴에 50 ml의 concentrated HCl을 첨가하여 6시간 동안 교반한 후, 4℃에서 250 ml의 100% 에탄올을 첨가하여 계속해서 교반해주었다. 이후 1 M 소듐 아세테이트를 이용하여 pH 6.0-6.5가 되도록 보정한 후, 원심분리하고(3400×g, 40분, 4℃) 상등액을 제거하였다. 제거한 상등액과 동량의 1 M 소듐 아세테이트를 넣고 다시 pH를 측정하여 6.0-6.5로 보정되었는지 확인한 후, 원심분리하여(3400×g, 40분, 4℃) 상등액을 제거하고 남아있는 콜로이드 키틴을 필터 페이퍼 위에 올려놓고 감압하여 사용하였다. 키티나아제 활성을 조사하기 위해서 키틴-펩톤 배지(Glucose 5.0 g, Peptone 2.0 g, 콜로이드 키틴 2.0 g, K₂HPO₄ 1.0 g, MgSO₄7H₂O 0.5 g, NaCl 0.5 g, 1 L dH₂O, pH 6.8) 40 ml에서 선배양한(48시간, 30℃, 150 rpm, 암조건) 균주를 분광 광도계를 이용하여 OD₆₀₀이 1이 되도록 보정한 후, 키틴-펩톤 배지에 10% 접종하여 배양하였다. 24시간 간격으로 균주 배양액 1 ml을 20분간 원심분리(12,000×g, 4℃)한 뒤, 상등액 0.25 ml, 1 M 소듐 아세테이트 버퍼(pH 5.3) 0.3 ml, 및 0.1% 콜로이드 키틴 0.5 ml)을 각각 혼합하여 50℃ 항온 수조에서 4시간 반응시켰다. 키티나아제 활성은 DNS 방법을 사용하여 콜로이드 키틴이 분해하여 생성된 환원당을 정량하였고, 1 unit은 1분간 1 mol의 N-아세틸-D-글루코사민(NAG)을 생성하는 효소량으로 하였다. 또한 Bradford 방법을 이용하여 시료의 단백질량을 정량하였다(Nagarajkumar et al., 2004; Ghose, 1987).

3-3. β-1,3-글루카나제 활성 조사

β-1,3-글루카나제 활성을 조사하기 위해 0.2% 라미나린(laminarin)이 첨가된 펩톤 배지(Glucose 5.0 g, Peptone 2.0 g, 0.2% 라미나린 2.0 g, K₂HPO₄ 1.0 g, MgSO₄7H₂O 0.5 g, NaCl 0.5 g, 1 L dH₂O, pH 6.8) 40 ml에 균주를 선배양 한 후, OD₆₀₀ 1로 보정하여 새로운 라미나린-펩톤 배지에 10% 접종하여 배양하였다(48시간, 30℃, 150 rpm, 암조건). 24시간 간격으로 균주 배양액 1 ml을 원심분리 하고(12,000×g, 20분, 4℃) 상등액 0.25 ml, 0.1 M 포스페이트 버퍼(pH 5.5) 0.5 ml, 0.2% 라미나린 0.5 ml을 각각 혼합하고 2시간 동안 40℃ 항온수조에서 반응시켰다. β-1,3-글루카나제 활성은 DNS 방법을 이용하였으며 1 unit은 1분간 1 mol의 N-아세틸-D-글루코사민(NAG)을 생성하는 효소량으로 하였고, Bradford 방법으로 시료의 단백질을 정량하였다. 표준곡선은 소혈청 알부민(bovin serum albumin)을 이용하였다.

4. 균주 안정성 조사

유용미생물과의 공생 가능 여부를 알아보기 위해 대표적인 유용미생물인 광합성균, 고초균, 효모, 바실러스 균을 이용하여 공생여부 가능성을 알아보았다. 각 유용미생물과 선별한 방선균을 Benette agar 평판 배지에 크로스 배양하여 각각의 저해여부를 측정하였으며(72시간, 30℃) 유용 미생물은 Bacillus subtilis, Pseudomonas azotoformans, Bacillus amyloliquefaciens, Rhodobacter sphaeroides, Rhizobium radiobacter, Sinorhizobium meliloti, Saccharomyces cerevisiae 를 사용하였다.

5. 최적 배양조건 조사

항진균능 활성을 조사하여 선별된 균주를 대상으로 최적 배양 조건을 구축하기 위하여 초기 pH, 온도, 배양 속도, 배지 종류에 따른 생장률을 측정하였다. 모든 조건에서 순수 분리한 HR29 균주를 benette 배지에서 대수생장기가 끝나는 시점까지 선배양 하였으며 선배양한 균주의 배양액은 OD₆₀₀이 1이 되도록 보정하였다. 최적 배양조건 조사를 위해 pH 조건(pH 5, 6, 7, 8 및 9)은 1 M HCl, 1 M NaOH를 이용하여 초기 pH를 조절하고, 배양 온도(10℃, 20℃, 25℃, 30℃ 및 35℃), 배양 속도(120, 150, 180 및 210 rpm), 배지 종류(Benette 배지, ISP2 배지)의 조건으로 보정된 배양액 10 ml을 새로운 Benette 배지 90 ml, ISP2 배지(Yeast extract 4.0 g, Glucose 4.0 g, Malt extract 10.0 g, 1 L dH₂O, pH 7.0)가 들어있는 250 ml 삼각플라스크에 접종한 후, 실험 조건 이외의 환경은 pH 7, 30, 150 rpm, 암조건으로 통일시켰다. 이후 0, 24, 48, 72, 96, 168 및 240시간 진탕 배양하였다. 또한, Fermenter (Liflus GM, Biotron Co.)를 이용한 5 L 배양은 향후 토양 미생물제제 및 생물농약 생산을 목적으로 최소한의 배양 조건으로 배양을 실시하였다. 배양조건은 Benette 배지 조성을 사용하였으며 Benette 배지에서 선배양한 균주(48시간, 30, 150 rpm, 암조건)를 1% 접종하여 24시간 간격으로 배양 기간별 균의 성장을 조사하여 대량배양 조건을 조사하였다.

실험 결과

1. 분리균주의 형태학적 특징 및 동정

항진균 활성이 우수한 방선균을 분리하기 위하여 강원도 춘천시 봉의산, 구봉산 등산로 주변의 유기물이 풍부한 토양에서 총 326개의 방선균을 분리했으며, 항진균능이 가장 우수한 균주를 최종 선발하여 HR29라고 명명하였다. 16s rRNA 유전자 염기서열 분석을 통해 상기 HR29 균주는 Streptomyces vellosus와 99.0%의 상동성을 갖는 것으로 확인되었다(표 1).

HR29 균주의 형태학적 특징을 조사한 결과 균주는 사상형이었으며, 그람염색 결과 그람 양성균으로 조사되었다(도 1). 또한, Benette 배지에서 48시간 배양 후 관찰한 결과 균사가 배지 속으로 신장하는 모습을 볼 수 있었으며, 72시간 이후에는 배지 위로 균사와 포자를 형성함을 확인할 수 있었다.

Strain	Scientific name	Type strain	Pairwise Similarity(%)
HR29	Streptomyces vellosus	NRRL8037	99.0

2. 항진균 활성 조사 결과

디스크 확산법을 통해 4종류의 식물 병원성 곰팡이를 HR29 균주와 함께 7일간 대치 배양하여 생육저지환의 유무와 크기를 조사한 결과, 생육저지환의 크기가 F. oxysporum f. sp. raphani, F. oxysporum f. sp. niveum, F. oxysporum f. sp. lycopersici와 R. solani에 대하여 각각 최대 직경 24, 23, 20 및 10 mm로 조사되었으며, 이는 대조군에 비해 각각 41.4, 39.7, 34.5 및 17.2%의 생육저해능을 보인 것으로 확인되었다(도 2).

3. 항진균능 물질 생성능 조사 결과

3-1. 시데로포어 생성능 조사

Chrome Azurol S 어세이를 통해 정성적으로 탐색한 결과, 노란색 환을 형성하며 활성을 나타낸 HR29 균주를 대상으로 시데로포어 생성능을 조사하였다. 그 결과 배양 후 48시간째 최대 활성을 보이며 0.098 mM 생성하였고, 48시간 이후 활성이 지속적으로 감소하는 경향을 보였다(도 2). 이는 근권세균인 P. fluorescens PFMDU3, PFMDU8, PFMDU9이 분비하는 12~13 mol ml^-1보다 10배 이상 높은 생성량을 나타내는 것으로 확인되었다(Nagarajkumar et al., 2004).

3-2. 키티나아제 활성 조사

세포벽 가수분해 효소인 키티나아제의 활성을 정량하기에 앞서, 정성적으로 탐색하기 위해 키틴-펩톤 평판 배지에 배양한 결과, HR29 균주는 집락을 형성하여 키틴을 이용하는 것으로 나타났다. HR29 균주의 키티나아제 활성을 측정한 결과, 72시간에서 21.28 mol glucose min^-1 mg protein^-1의 높은 수준으로 분비하는 것을 확인할 수 있었다(도 4). 이는 Streptomyces sp. DA11 균주가 최적 배양배지에서 72시간 째 1.56 mol glucose min^-1 mg^-1의 활성을 보인 것에 비해 3배 이상 높은 분비량이며(Han et al., 2008), 최대 0.85 mol glucose min^-1 mg^-1활성을 보인 Aeromonas schubertii 균주와 비교하였을 때도 월등히 높은 결과를 나타내는 것이다(Guo et al., 2004).

3-3. β-1,3-글루카나제 활성 조사

HR29 균주를 대상으로 세포벽 가수분해 효소인 β-1,3-글루카나제 활성을 DNS 방법과 균주의 단백질 정량을 통하여 조사한 결과, 48시간에서 4.65 mol glucose min^-1 mg protein^-1를 생산하며 최대 활성을 보인 후 감소함을 확인할 수 있었다(도 5). 이는 Streptomyces torulosus PCPOK-0324 균주가 최대 1.71 mol glucose min^-1 mg^-1활성을 보인 것에 비해 3배 높은 활성을 나타내는 것이다(Park et al., 2012).

4. 균주 안정성 조사 결과

고초균, 광합성균, 효모 등 대표되는 유용미생물인 B. subtilis, P. azotoformans, B. amyloliquefaciens, R. sphaeroides, R. radiobacter, S. cerevisiae와 S. meliloti 균주와 HR29 균주의 크로스 배양을 통해 공생여부 가능성을 조사한 결과, HR29 균주는 다른 기타 유용미생물의 생장은 억제하지 않고 함께 배양되어 항진균능만 선택적으로 있음을 확인할 수 있었다(도 6).

5. 최적 배양조건 조사

HR29 균주의 최적 배양 조건은 30, 150 rpm, pH 7로 나타났으며 실험에 사용한 Benette 배지 이외에 항진균 물질을 높게 분비한다고 알려지는 ISP2 배지(Valanarasu et al., 2010)와 비교하였을 때 균주의 생장률은 24시간째는 큰 차이를 보이지 않았으나, 48시간 째 Benette 배지에서 2배 이상 높은 생장률을 보였다. 항진균 활성 또한 두 배지에서 큰 차이를 보이지 않았다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

농업생명공학연구원

KACC92006

20141114

Claims

시들음병균, 덩굴 쪼김병균 및 잎집무늬마름병균으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 식물 병원성 진균에 대한 항균 활성을 갖는 스트렙토마이세스 벨로서스 HR29(Streptomyces vellosus HR29)(수탁번호 KACC92006P) 균주.
청구항 제1항에 있어서, 상기 식물은 오이, 고추, 가지, 감자, 무, 부추, 파, 파프리카, 참외, 메론, 포도, 딸기, 토마토, 벼, 밀, 보리, 호박, 잔디, 담배, 장미 및 인삼으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 식물인 것인 균주.
삭제
청구항 제1항에 있어서, 상기 균주는 시데로포어(siderophore)를 생성하는 것인 균주.
청구항 제1항에 있어서, 상기 균주는 키티나아제(chitinase)를 생성하는 것인 균주.
청구항 제1항에 있어서, 상기 균주는 β-1,3-글루카나제(β-1,3-glucanase)를 생성하는 것인 균주.
스트렙토마이세스 벨로서스 HR29(Streptomyces vellosus HR29)(수탁번호 KACC92006P) 균주를 유효성분으로 포함하는 시들음병, 덩굴 쪼김병 및 잎집무늬마름병으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 식물병 방제용 조성물.
삭제
식물에 청구항 제1항의 균주 또는 청구항 제7항의 조성물을 접촉시키는 단계를 포함하는 시들음병, 덩굴 쪼김병 및 잎집무늬마름병으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 식물병의 방제 방법.
삭제