KR20120028083A - 항균 활성을 갖는 스트렙토마이세스 프사모티쿠스 균주 및 이를 이용한 항생물질의 제조방법 - Google Patents

항균 활성을 갖는 스트렙토마이세스 프사모티쿠스 균주 및 이를 이용한 항생물질의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 식물병원진균인 토마토 시들음병균 등에 대해 항균효과를 가지는 항생물질인 스트레버틴을 생성, 분비하는 스트렙토마이세스 프사모티쿠스 KP1404 균주 (Streptomyces psammoticus strain KP1404) 및 이 균주로부터 생산되는 항생물질의 제조 방법에 관한 것이다. 상기한 본 발명에 의하면 자연환경에서의 미생물에 의한 생분해성이 큰 환경친화적 살균제 조성물을 제공하는 효과가 있고, 방제하기 힘든 토양 전염 병원균이 푸자리움 옥시스포럼 f.sp. 라이코펄시사이가 일으키는 토마토 시들음병 등에 대한 방제 효과가 있어 식물병 방제산업상 유용하게 이용될 수 있다.

Description

항균 활성을 갖는 스트렙토마이세스 프사모티쿠스 균주 및 이를 이용한 항생물질의 제조방법{Streptomyces psammoticus strain effective against plant pathogens and method for preparing antibiotics using the same}
본 발명은 항균 활성을 갖는 스트렙토마이세스 프사모티쿠스 균주 및 이를 이용한 항생물질의 제조방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게, 본 발명은 토마토 시들음병균, 오이, 고추 탄저병균, 균핵병균 등의 식물병원진균에 대해 항균활성이 우수한 스트레버틴을 생성, 분비하여 항균 활성을 가지는 스트렙토마이세스 프사모티쿠스 균주 및 이 균주로부터 생산되는 항생물질의 제조방법에 관한 것이다.
일반적으로, 토마토 시들음병(Fusarium wilt)은 전국 토마토 재배 지역에 발생하여 많은 피해를 주고 있는 대표적인 토양전염병해로서 이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다.
토마토에 시들음병을 일으키는 푸자리움 옥시스포럼 f.sp. 라이코펄시사이 (Fusarium oxisporum f.sp. lycopersici)는 토양전염 병원균으로 주로 병든 식물체의 조직이나 토양 속에서 균사와 후막포자 상태로 월동하고, 이듬해 1차 전염원이 된다. 푸자리움 옥시스포럼 f.sp. 라이코펄시사이는 토양전염 병원균으로 물로 이동되는 거리는 매우 짧고 주로 흙 입자에 이동된다. 병원균은 주로 가는 뿌리나 상처를 통해 침입하는데, 포장 정식직후에 감염되는 경우가 많다. 서늘한 지방에서는 병 발생이 적고, 감염되어도 병증상이 잘 나타나지 않다가 생육중기나 후기에 기온이 올라가면 병증상이 다발생하며, 적합한 온도는 24~30℃이며, 16℃ 이하나 35℃ 이상에서는 거의 발생하지 않는다고 알려져 있다. 일반적으로 산성토양과 사질 양토에서 발생이 많은데, 이는 토양수분의 불균형에 의해 식물체가 스트레스를 받아 약해지므로 병원균의 침입이 용이해지기 때문이다. 병원균은 토양 중에 널리 분포하며, 월동체인 후막포자는 기주가 없이도 토양 내에서 수년간 생존하기 때문에 방제가 매우 어려운 병해이다.
시들음병이 발생하기 쉬운 곳에서는 저항성 품종을 재배하든지 또는 저항성 대목을 사용해서 접목재배를 하도록 한다. 저항성이 아닌 품종을 재배할 때는 우선 모판의 흙과 정식토양을 약제나 증기로 소독한 후에 재배한다. 시판되고 있는 대목용 품종 가운데 저항성을 나타내는 것은 KNVF와 내병신교1호 뿐이므로 이들에 접목해서 재배하는 것이 안전하다. 그리고 종자는 처음부터 소독을 해서 쓰도록 하고, 생육기 약제방제는 발병부위에 벤레이트수화제(유효성분: 베노밀 50%) 1,000배액을 3~4회 관주처리 하여 방제한다.
하지만 최근에 유기합성 살균제에 대한 저항성 식물병원균 출현과 환경에 대한 부작용 때문에 식물병을 방제할 새로운 친환경 살균제에 대한 필요성이 증가하고 있다. 미생물로부터 유래한 2차 대사물질은 다양한 화학구조를 가지고 있을 뿐만 아니라 생물학적인 활성을 지니고 있으며 바이오스피어(생물권)에서 쉽게 분해가 잘된다고 보고되어 있다 (Tanaka and Omura, 1993). 그러므로, 미생물 유래 2차 대사산물은 가능성 있는 살균제의 원천으로서 중요하다.
폴리엔 항생제인 니스타틴이 1950년대 처음 보고된 이래로, 다양한 폴리엔 항생제가 미생물, 식물 및 동물로부터 분리되었다. 특별히 암포테리신B, 필리핀, 니스타틴A, 라파마이신, 그리고 비리데노마이신과 같은 200여 종의 폴리엔 항생제가 스트렙토마이세스 종들로부터 분리되었다(Trejo and Bennett, 1963, Whitfield et al., 1955, Hasegawa et al., 1975, Baker et al., 1978, Cai et al., 2007, Thirsk and Whiting, 2002). 그것들 중에 암포테리신B, 니스타틴A는 임상적으로 중요한 항진균 항생제이고, 라파마이신은 면역억제제로서 사용되고 있다 (Gupte et al., 2002, Stepkowski et al., 1991). 그러나 최근에 나타마이신-리그노설포네이트, 나타마이신-포스페이트, 나타마이신-포타슘 포스페이트 조합을 가진 폴리엔 항생제가 몇몇 식물 병원 곰팡이에 대해 방제 효과가 있음이 보고되었다 (Van der et al., 2006, Stark et al., 2008). 또한 철쭉 (Rhododendron)에서 분리한 스트렙토마이세스 종이 생산하는 폴리엔 항생제는 온실조건하에서 파이토프쏘라 시나모미에 대해 항진균 활성을 보여주었다(Kunoh, 2002). 이러한 결과는 식물병 방제제로서 폴리엔 항생제의 가능성을 보여준다.
스트레버틴과 그것의 파생물질은 펜타엔 모이어티가 있는 큰 락톤 링의 특징을 가지고 있으며 스트렙토버티실리움 LL-30F848에서 분리되었다. 스트레버틴 A는 사과나무 화상병균, 잿빛 곰팡이 병균에 대해서 실험실 상에서 항균활성을 보였다 (Schlingmann et al., 1999). 하지만, 스트레버틴과 그것의 파생물질이 스트렙토버티실리움 LL-30F848에서 분리된 이래로 온실 조건하에서 스트레버틴 A와 B의 식물병 방제 효과에 대한 연구는 없었으며, 스트렙토마이세스에서 분리된 예는 없었다.
본 발명은 상기와 같은 종래기술의 문제점 및 요구를 해결하고자 하는 것으로, 그 목적은 방제하기 힘든 토양전염성 병원균인 프자리움 옥시스포럼 f.sp.라이코펄시사이가 일으키는 토마토 시들음병을 포함한 식물병원성 진균에 대한 항균 활성을 가지는 저독성이고 환경에 해가 없는 친환경적인 살균제를 제조할 수 있는 스트렙토마이세스 프사모티쿠스 균주를 제공하고자 하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 균주를 이용하여 저독성이고 친환경적인 항생물질을 제조할 수 있는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 더욱 명확하게 된다.
본 발명은 항균 활성을 갖는 스트렙토마이세스 프사모티쿠스 균주(Streptomyces psammoticus, 수탁번호: KACC91580P)를 제공한다.
또한 본 발명은 이 균주의 균사체 등으로부터 분리, 추출되는 항생물질 스트레버틴 A와 B(화학식 1)의 제조방법을 제공하는 것이다.
Figure pat00001
본 발명의 목적을 달성하기 위해, 본 발명자들은 한국 구리 지역의 토양에서 90여개의 방선균을 분리하여 3% TSA 상에서 6가지 식물병원균에 대해 검정한 결과 항균활성이 뛰어난 폴리엔 항생제인 스트레버틴을 생산하는 균주 스트렙토마이세스 프사모티쿠스 KP1404를 선발하여 동정하고, 식물병원 진균에 대한 인비트로 상(in vitro)에서의 항균효과와 토마토 시들음병에 대한 방제 효과를 온실조건하에서 생물검정한 결과 유의적으로 높은 수준의 항균활성을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명자들은 계속적인 연구를 통해 KP1404 균주를 동정하였고, 그것의 세포 추출물로부터 항균활성을 가진 물질을 순화, 정제하여 화학구조를 밝혔으며, 여러 식물병원 진균에 대한 인비트로 상에서의 항균효과와 토마토 시들음병에 대한 방제 효과를 온실조건하에서 생물 검정하였다. 그 결과 확인된 항생물질인 스트레버틴 A와 B가 스트렙토마이세스에서 발견된 것은 처음이며, 본 연구자들이 식물병원 진균 특히, 토마토 시들음병 균, 고추 탄저병균, 균핵병균 뿐만 아니라 다른 여러 식물병원균에 대해서도 유의적으로 높은 수준의 항균활성을 가지고 있음을 확인하였다.
또한, 본 발명은 스트렙토마이세스 프사모티쿠스 균주 (Streptomyces psammoticus, 수탁번호: KACC91580P)를 GSM 배지(glucose starch molasses medium)에서 배양하는 단계; 및 상기 균주의 균사, 포자 또는 이들의 혼합물로부터 스트레버틴 A 또는 B를 분리 및 정제하는 단계를 포함하는 식물병원균에 항균 활성을 갖는 항생물질 제조방법을 제공한다.
본 발명에 의한 균주는 GSM 배지에서 대량 배양되어 항생물질 생산량을 높일 수 있다.
본 발명에서 상기 식물병원균은 푸자리움 옥시스포룸 f.sp. 라이코펄시사이(Fusarium oxysporum f.sp. lycopersici), 마그나포르테 그리시아 (Magnaporthe grisea), 알터나리아 말리 (Alternaria mali), 아스퍼질러스 오라이제 (Aspergillus oryzae), 설코스포라 카네선스 (Cercospora canescens), 콜레토트리쿰 코코데스(Colletotrichum cocodes), 콜레토트리쿰 그로에오스포리오이데스 (Colletotrichum gloeosporioides), 콜레토트리쿰 오비큘레어 (Colletotrichum orbiculare), 푸자리움 옥시스포룸 f.sp 쿠쿠메리눔 (Fusarium oxysporum f.sp. cucumerinum), 실린드로카르폰 데스트럭탄스 (Cylindrocarpon destructans), 디아포르테 시트리 (Diaporthe citri), 스크렐로티니아 스크렐로티오름 (Sclerotinia sclerotiorum) 및 잔토모나스 캄페스트리스 pv. 베시카토리아 (Xanthomonas campestris pv. vesicatoria)로 이루어진 그룹에서 선택되는 하나 이상의 병원균임이 바람직하고, 푸자리움 옥시스포룸 f.sp. 라이코펄시사이가 가장 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 상기 제조된 스트레버틴 A 또는 B를 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 토마토 시들음병 방제용 살균제 조성물을 제공한다. 본 발명에 의한 살균제 조성물은 상기 스트레버틴 A 또는 B는 1 ~ 500 ㎍ mL-1을 함유하는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 스트레버틴 A 또는 B의 함유량이 1 ㎍ mL-1 미만이면 방제효과가 낮으며, 500 ㎍ mL-1를 초과하는 경우 부작용이 있을 수 있으며 살균제 조성물의 생산단가가 높아진다.
본 발명은 검체 균주가 기질 균사를 생성하고, 포자 형태가 원통형이며 포자의 배열이 렉터플렉서블(rectiflexible)형인 지를 확인하는 단계; 및 검체 균주의 16S rDNA와 서열번호 1의 염기서열을 대비 분석하는 단계를 포함하는 스트렙토마이세스 프사모티쿠스 균주(Streptomyces psammoticus, 수탁번호: KACC91580P)를 동정하는 방법을 제공한다.
본 발명자는 16S rDNA 분석, 형태적인 특징, 배양학적 특성, 생리 및 생화학적 특성을 기초하여 본 발명에 의한 균주가 길항 방선균 스트렙토마이세스 프사모티쿠스라는 것을 동정하였다 (표 1 참조).
또한, 본 발명은 상기 동정방법에 의해 동정된 스트렙토마이세스 프사모티쿠스 균주의 균사, 포자 또는 이들의 혼합물의 메탄올 추출물을 식물체 또는 토양에 처리하는 단계를 포함하는 식물병 방제방법을 제공한다.
상기 스트렙토마이세스 프사모티쿠스 균주에서 스트레버틴 A 또는 B를 분리 및 정제하는 단계를 더 포함할 수 있다.
이상에서 살펴본 바와 같이, 본 발명은 방선균 유래의 천연물질인 항균물질 스트레버틴 A와 B를 유효성분으로 함유함으로써 상용 살균제인 베노밀 수준의 방제효과를 가지고 있으면서도 자연환경에서의 미생물에 의한 생분해성이 큰 환경친화적 살균제 조성물을 제공하는 효과가 있고, 방제하기 힘든 토양 전염 병원균이 푸자리움 옥시스포럼 f.sp. 라이코펄시사이가 일으키는 토마토 시들음병 방제 등에 효과가 있어 식물병 방제산업상 유용한 발명인 것이다.
도 1은 본 발명에 의한 스트렙토마이세스 프사모티쿠스 균주 KP1404의 6종류의 식물병원진균에 대한 항균활성을 나타내는 도면이다. A: 고추 역병균 B: 오이 탄저병균, C: 모잘록병균, D: 토마토 시들음병균, E: 벼도열병균, F: 감귤 검은점 무늬병균
도 2는 본 발명에 의한 스트렙토마이세스 프사모티쿠스 균주 KP1404의 배지별 조추출물의 고추 탄저병균과 토마토 시들음병균에 대한 저지원 크기를 나타내는 그래프이다.
도 3은 본 발명에 의한 스트렙토마이세스 프사모티쿠스 균주 KP1404의 16S rDNA 염기서열이다.
도 4는 본 발명에 의한 스트렙토마이세스 프사모티쿠스 균주 KP1404의 계통도이다.
도 5는 본 발명에 의한 스트렙토마이세스 프사모티쿠스 균주 KP1404의 주사 전자현미경 사진이다.
도 6은 본 발명에 의한 스트렙토마이세스 프사모티쿠스 균주 KP1404의 균사 추출액에서 스트레버틴 A와 B를 정제하는 과정을 보인 블록도이다.
도 7은 온실조건의 폿트 실험에서 본 발명에 의한 항균물질인 스트레버틴 A와 B의 토마토 시들음병에 대한 방제효과를 상용살균제인 베노밀(benomyl)과 비교 실험한 결과를 도시한 그래프이다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
<실시예 1> 스트렙토마이세스 프사모티쿠스 균주의 분리
길항 방선균을 선발하기 위하여 구리 지역의 표토로부터 20 cm 깊이의 토양을 채취하여 토양 시료 10 g을 100 mL의 멸균수에 혼합하고 회전 진탕기(170 rpm)에서 3시간 동안 진탕하여 토양 현탁액을 제조하였다. 상기 현탁액을 와트만 제 1 여과지(Whatman No. 1 filter paper)를 통과시켜 여과하고, 멸균수로 1:10 (v:v) 비율로 10-5까지 희석하였다.
각각의 희석액 100 μL를 휴믹 애시드 비타민 한천배지(humic acid vitamin agar medium: 1.0g humic acid, 0.5g Na2HPO4, 1.71g KCl, 0.05g MgSO4?7H2O, 0.01g FeSO4?7H2O, 0.02g CaCO3, 0.5mg thiamine-HCl, 0.5mg riboflavin, 0.5mg niacin, 0.5mg pyridoxin-HCl, 0.5mg inositol, 0.5mg Ca-pantothenate, 0.5mg p-aminobenzoic acid, 0.25mg biotin, 50mg cycloheximide, 18g agar, 1 L H2O, adjusted to pH 7.2; vitamins and cycloheximide were filter-sterilized)에 접종하고, 접종된 휴믹 애시드 비타민 한천배지를 28℃ 배양기에서 14일간 균총(colony)이 발생될 때 까지 배양시켰다. 상술한 바와 같이하여 발생한 균총들 가운데 방선균으로 보이는 균총, 즉 일반 세균과는 달리 기질균사를 형성하며 한천 배지상에서 딱딱한 균총을 형성한 균총을 선택하여 고추 역병균, 오이 탄저병균, 토마토 시들음병균, 모잘록병균, 벼도열병균, 및 감귤 검은점 무늬병균에 대한 항균 활성을 시험하였다.
이를 위하여 선발된 방선균류를 3% TSA (tryptic soybean agar)의 중앙에 도말하고 (streaking)하고 28℃에서 2일간 배양한 후, 그 배지 중앙으로부터 30mm 떨어진 곳에 증식중인 고추 역병균, 오이 탄저병균, 토마토 시들음병균, 모잘록병균, 벼도열병균, 감귤 검은점 무늬병균 등 식물병원 진균의 배양체로부터 떼어낸 균사절편 (mycelia disk, 직경 5mm)을 놓고 다시 7일간 배양한 뒤 저지원을 측정하였다.
그 결과 토마토 시들음병균 등 식물 병원성 진균의 균사 생장을 강하게 저해하는 것으로 나타났다 (도 1).
한편, 상기 선발된 길항 방선균의 보관방법은 다음과 같다. 일일 사용을 위해서는 3% TSA 배지에 접종하여 사용하였고, 장기보관을 위해서 3% TSB에서 2일간 순수배양하여 40% 그리세롤과 혼합하고 -80℃에서 보관하였다.
<실시예 2> 길항 방선균이 생성하는 항생물질의 항균활성 검정과 항생물질 생산을 위한 최적 배지 결정
선발된 길항 방선균이 생성하는 항생물질의 항균활성과 항생물질 생산을 위한 최적 배지를 미리 검정하기 위하여 다음과 같은 방법으로 항생물질 조추출물을 추출하여 제조하였다.
이와 같이 조추출물을 추출하는 것은 미생물이 생성하는 항생물질의 완전 순화에는 시간과 비용이 많이 투자되므로 검정 초기 단계에서 항생물질 생산을 위한 최적배지를 결정하고, 과연 이 균주가 생성하는 물질이 실제로 식물상에서 병방제 효과가 있는지를 검정하기 위한 것이다. 스트렙토마이세스 프사모티쿠스 KP1404가 생성하는 이차 대사산물을 회수하기 위해서는 메탄올을 사용한 유기용매 추출법을 사용한다.
상기 길항 방선균은 진탕 플라스크 배양으로 3% tryptic soy broth (BactoTM), production medium (PM : 30 g glucose, 30 g soybean meal, 5 g pharmamedia, 1 g yeast extract, 3 g CaCO3, in 1 L distilled water, pH to 8.0), glucose starch molasses medium (GSM : 10 g soluble starch, 20 g glucose, 5 mL molasses, 5 g yeast extract, 5g peptone, 2g CaCO3 in 1 L distilled water, pH to 7.0), glucose starch soybean meal medium (GSS : 10 g starch, 20 g glucose, 25 g soybean meal, 4 g yeast extract, 1 g beef extract, 2 g NaCl, 0.5 g KH2PO4 in 1 L distilled water, pH to 7.0)과 starch calcium chloride MOPS medium (SCM : 15 g soluble starch, 20 g soytone(Difco), 0.1 g CaCl2, 1.5 g yeast extract, 10.5 g MOPS in 1 L distilled water, pH to 7.2)에서 발효시켜, 28℃에서 5일간 배양한 후, 상기 배양액들을 10000g로 원심분리(cetrifuse)하여 배양 여액을 버리고 남아있는 세포를 90 min 간 초음파 분쇄기(sonicator)에서 메탄올을 사용하여 추출하였다. 또한, 상기 유기용매 층은 37℃ 감압 증류기에서 농축한 후, 남아있는 잔류물을 최소량의 메탄올에 용해시켜 4℃에서 보관하였다.
이렇게 제조된 길항 방선균의 항생물질 조추출물들을 가지고 다음과 같은 방법으로 생물학적 검정(bioassay)을 실시하였다. 항생물질 조추출물들의 생물학적 검정은 오이 탄저병균과 토마토 시들음병균이 접종된 PDA(prtato dextrose agar: 24g potato destrose, 0.7% agar and distilled water 1 L) 배지에서 페이퍼디스크법(paperdisk method)을 이용하여 수행한 것으로, 이를 좀 더 구체적으로 설명하면 다음과 같다.
오이 탄저병과 토마토 시들음병균의 경우 각각의 100 mL PDA (agar 0.7%) 배지에 오이 탄저병균의 분생포자 현탁액(108 conidia mL-1) 1 mL과 토마토 시들음병균의 분생포자 현탁액 (108 conidia mL-1)을 각각 혼합하여 생물검정 평판 배지를 만들었다. 그리고 상기 항생물질 조추출물들을 적신 멸균여과지 (filter paper disk, 8mm)을 상온에서 1시간 건조하여 대상 병원진균이 접종된 배지(seeded media)에 올려놓고, 그 평판을 28℃ 배양기에서 24시간 배양한 결과 생성된 저지원의 지름으로 저지원 크기를 평가하였다 (도 2).
<실시예 3> 16S rDNA 분석과 생리 및 생화학적 특성을 기초로 한 길항방선균 KP1404의 동정
길항방선균 KP1404 균주의 16S rDNA 분석을 기초로 하여 길항방선균 KP1404 균주의 16S rDNA 염기서열 (GeneBank accession number: GU166432)은 Streptomyces psammoticus 균주 NBRC13971의 염기서열과 99.93% 일치하였다 (GeneBank accession number: AB184554) (도 3 및 4).
상기 선발된 본 발명의 방선균 균주 KP1404는 기질 균사를 배지상에서 생성하는 방선균의 특징을 갖고 있으며, 상기 방선균 균주 KP1404의 동정(identification)을 위한 생리 및 생화학적 그리고 형태학적 시험은 모두 버지스 매뉴얼 시스테메틱 박테리올로지 (bergey`s manual of systematic bacteriology)에서 서술한 방법에 따라 시행하였다.
길항방선균 KP1404 균주의 배양학적 특성을 6가지 ISP 배지와 베넷 배지에서 알아보았다. 길항방선균 KP1404 균주는 ISP4와 ISP6 배지를 제외한 모든 배지에서 잘 자랐으며 ISP1, ISP5, ISP6를 제외한 모든 배지상에서 기중 균사의 색이 흰색을 보였다. 기질 균사의 색은 ISP4 배지를 제외한 모든 배지상에서 노란색 또는 갈색을 보였다. 배양 후 10일 후에 ISP3, ISP5 그리고 베넷 배지에서 노란색 또는 노란빛의 갈색 색소를 분비하였다.
KP1404 균주의 포자 모양을 주사 전자 현미경을 통해 확인하였다 (도 5). KP1404 균주의 포자는 0.8 에서 1 ㎛의 원통형으로 포자의 배열은 렉터플렉서블(rectiflexible)형이며, 표면은 매끄러웠다.
방선균의 세포벽 구성성분의 하나인 디아미노 피메릭 엑시드 (DAP) 이성질체 확인을 위해, KP1404 균주의 세포벽 구성성분을 분석한 결과, LL-form의 DAP를 가지고 있는 것으로 확인되었다.
이상의 결과와 전자현미경하에서의 형태적인 특성, 및 배양학적 특성을 종합하여, 길항 방선균 KP1404 균주를 스트렙토마이세스 프사모티쿠스 (Streptomyces psammoticus) 균주 KP1404로 동정하였다.
Figure pat00002
<실시예 4> 항생물질 스트레버틴의 분리 및 정제
본 발명자들은 한국 구리시에서 수집한 토양시료로부터 약 90여 개의 미생물을 분리하여 3% TSA 배지에서 병방제 효과를 검정한 결과 토마토 시들음병균에 대하여 항균효과가 뛰어난 방선균 균주를 선발하여 항균활성 물질 스트레버틴(strevertene)을 분리, 정제하고, 그 구조를 결정하였다.
방선균 균주 스트렙토마이세스 프사모티쿠스(Stretomyces psammoticus) KP1404을 28℃에서 5일간 GSM (glucose starch molasses medium: 10 g soluble starch, 20 g glucose, 5 mL molasses, 5 g yeast extract, 5 g peptone, 2 g calcium carbonate, in 1 L distilled water, pH to 7.0)에서 배양한 후 원심분리하여 분리한 방선균 균체를 메탄올을 이용하여 추출하였다.
분리한 추출액은 감압 농축한 후 Diaion？ HP-20 크로마토그래피를 행하였다. 각 분획은 물과 메탄올을 일정비율로 섞어 전개 시켰으며, 그 중 활성분획을 모아 C18 크로마토그래피를 실시하였다. 각 분획은 물과 메탄올을 일정비율로 섞어 전개시켰으며, 그중 활성분획을 모아 동결 건조기를 사용하여 건조시킨 후 DMSO(dimetylsulfoxide)로 녹인 후 유속 2 mL min-1, UV 검출기 254nm, 용매 0.1% 포믹엑시드를 포함한 57%-74% 메탄올을 이용하는 분취 조건으로, C18 역상 column을 이용한 HPLC 시스템을 통해 항균물질 스트레버틴 A와 B를 분리 정제 하였다(도 6).
<실시예 5> 항균물질 스트레버틴의 여러 가지 식물병원 세균 및 진균에 대한 억제시험
토마토 시들음병균인 푸자리움 옥시스포룸 f.sp. 라이코펄시사이(Fusarium oxysporum f.sp. lycopersici)를 비롯하여 벼도열병균 마그나포르테 그리시아 (Magnaporthe grisea), 알터나리아 브라시콜라(Alternaria brassicola), 알터나리아 말리(Alternaria mali), 아스퍼질러스 오라이제(Aspergillus oryzae), 설코스포라 카네선스(Cercospora canescens), 콜레토트리쿰 코코데스(Colletotrichum cocodes), 콜레토트리쿰 그로에오스포리오이데스(Colletotrichum gloeosporioides), 콜레토트리쿰 오비큘레어(Colletotrichum orbiculare), 푸자리움 옥시스포룸 f.sp 쿠쿠메리눔 (Fusarium oxysporum f.sp. cucumerinum), 실린드로카르폰 데스트럭탄스(Cylindrocarpon destructans), 디아포르테 시트리(Diaporthe citri), 라이족도니아 솔라니(Rhizoctoia solani), 스크렐로티니아 스크렐로티오름(Sclerotinia sclerotiorum), 잔토모나스 캄페스트리스 pv. 베시카토리아(Xanthomonas campestris pv. vesicatoria) 등의 식물병원 진균들을 2.4% PDA (potato dextrose agar) 배지에서 배양하고 식물병원 세균들을 3% TSA(Tryptic soybean agar)에서 배양했다.
상기 실시예 4에서 분리 및 정제한 스크레버틴 A와 B를 마이크로 웰 플레이트(micro-well plate)에 4 X PDA 또는 4 X TSA 및 멸균수와 섞어 일련의 농도 (1 ~ 100 ㎍ mL-1) 로 담은 후, 각각의 분생포자 및 세균 현탁액을 4 X 106개 mL-1의 농도로 맞추어서 각각의 웰 (well)에 넣었다. 접종된 마이크로 웰 플레이트는 28℃에서 1일 내지 3일간 배양한 후, 곰팡이 또는 세균의 생장이 일어나지 않는 농도 중 가장 낮은 농도를 최소억제농도 (minimum inhibitory concentration; MIC)로 평가하였으며, 그 결과는 하기 표 2 여러 식물병원진균 및 식물병원세균에 대한 스트레버틴 A와 B의 최소억제 농도 (MIC)로 나타냈다. 상기 스트레버틴 A와 B는 알터나리아 브라시콜라 (Alternaria brassicola)와 라이족토니아 솔라니(Rhizoctoia solani)를 제외한 대부분의 식물병원 진균과, 잔토모나스 캄페스트리스 pv. 베시카토리아 (Xanthomonas campestris pv. vesicatoria)에 대해 높은 수준의 항균활성을 보여주는 것을 확인하였다.
Figure pat00003
<실시예 6> 온실조건의 토마토 유묘에서 스트레버틴 A와 B, 토마토 시들음병 방제용 살균제인 베노밀과의 방제효과를 비교
온실조건하에서 토마토 유묘에서의 토마토 시들음병에 대한 스트레버틴 A와 B 그리고 농용살균제인 베노밀과의 방제효과를 비교하기 위하여, 스트레버틴 A와 B 와 베노밀을 토마토 시들음병균을 접종한 후 농도별로 5 mL씩 처리하여 각 처리구와 약제 처리를 하지 않은 무처리구에서의 병피해도를 평가하였다. 병피해도는 토마토의 시들은 정도를 평가하여 비교하였다.
보다 구체적으로 살펴보면, 토마토 식물에서 토마토 시들음병균의 감염에 대한 길한 방선균 KP1404 균주가 생성하는 항진균 활성물질인 스트레버틴 A와 B의 병발생 억제 효과는 다음과 같이 평가하였다.
먼저, 토마토 시들음병에 이병성 품종인 토마토 종자 (품종: 광복)를 고압 증기 멸균한 혼합토양(peat moss, perlite, and vermiculite, 5:3:2. v/v/v)이 담긴 36-플라스틱 폿트에 파종하였다. 4엽기까지 자란 유묘(seedling) 45주를 토마토 시들음병균의 분생포자 현탁액에 유묘 뿌리를 10분간 침지 시킨 후, 고압 증기 멸균한 혼합토양이 담긴 36-프라스틱 폿트에 이식하였다. 그 후, 스트레버틴 A와 B를 농도별로 토마토 식물이 있는 폿트에 5 mL씩 토양 관주하였다. 병피해도 (disease severity)는 토마토 시들음병을 접종한 후 10일 후에 스트레버틴 A와 B를 처리한 토마토 유묘에서 나타난 병징을 보고 병징이 전혀 보이지 않은 경우를 0, 토마토 유묘가 완전히 죽었을 경우를 5로 나타내어 3반복 실험을 실시하였다.
실험 결과, 토마토 시들음병균 접종 후 6일 째 약제를 처리하지 않은 토마토 식물은 식물전체가 시들고 있는 것을 볼 수 있었으며 대조약제인 베노밀과 스트레버틴 A와 B를 처리한 토마토 식물에서 어떤 병징도 관찰되지 않았다. 접종 후 10일 후에 약제를 처리하지 않은 식물의 대부분이 시들어 고사하였지만, 베노밀과 스트레버틴 A와 B를 1 ㎍ mL-1 처리한 토마토 식물에서 약간의 시들음 증세만 관찰되었을 뿐 다른 농도에서는 뚜렷한 병징이 관찰되지 않았다 (도 7 참조).
이상과 같은 시험결과를 볼 때, 본 발명에 사용되는 스트레버틴 A와 B는 상용 살균제인 베노밀과 비교하여 토마토 시들음병 방제효과의 면에서 차이를 보이지 않았다. 따라서 스트레버틴 A와 B는 토마토 시들음병 방제용 약제로서 탁월한 효과를 가지고 있음을 확인할 수 있었다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였으나, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 균등물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
농업생명공학연구원 KACC91580 20100824
<110> Korea University Industrial and Academic Collaboration Foundation <120> Streptomyces psammoticus strain effective against plant pathogens and method for preparing antibiotics using the same <130> P11-100712-01 <160> 1 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1380 <212> DNA <213> Streptomyces psammoticus KP1404 <400> 1 tgcagtcgaa cggtgaagcc cttcggggtg gatcagtggc gaacgggtga gtaacacgtg 60 ggcaatctgc cctgcactct gggacaagcc ctggaaacgg ggtctaatac cggatatgac 120 cttcctccgc atgggggttg gtggaaagct ccggcggtgc aggatgagcc cgcggcctat 180 cagcttgttg gtggggtaat ggcctaccaa ggcgacgacg ggtagccggc ctgagagggc 240 gaccggccac actgggactg agacacggcc cagactccta cgggaggcag cagtggggaa 300 tattgcacaa tgggcgaaag cctgatgcag cgacgccgcg tgagggatga cggccttcgg 360 gttgtaaacc tctttcagca gggaagaagc gcaagtgacg gtacctgcag aagaagcacc 420 ggctaactac gtgccagcag ccgcggtaat acgtagggtg cgagcgttgt ccggaattat 480 tgggcgtaaa gagctcgtag gcggcctgtc gcgtcggatg tgaaagcccg gggcttaacc 540 ccgggtctgc attcgatacg ggcaggctag agtgtggtag gggagatcgg aattcctggt 600 gtagcggtga aatgcgcaga tatcaggagg aacaccggtg gcgaaggcgg atctctgggc 660 cattactgac gctgaggagc gaaagcgtgg ggagcgaaca ggattagata ccctggtagt 720 ccacgccgta aacgttggga actaggtgtt ggcgacattc cacgtcgtcg gtgccgcagc 780 taacgcatta agttccccgc ctggggagta cggccgcaag gctaaaactc aaaggaattg 840 acgggggccc gcacaagcag cggagcatgt ggcttaattc gacgcaacgc gaagaacctt 900 accaaggctt gacatatgcc ggaaacatcc agagatgggt gcccccttgt ggtcggtata 960 caggtggtgc atggttgtcg tcagctcgtg tcgtgagatg ttgggttaag tcccgcaacg 1020 agcgcaaccc ttgttctgtg ttgccagcga gtaatgtcgg ggactcacag gagactgccg 1080 gggtcaactc ggaggaaggt ggggacgacg tcaaatcatc atgcccctta tgtcttgggc 1140 tgcacacgtg ctacaatggt cggtacaaag ggctgcgatg ccgtgaggcg gagcgaatcc 1200 caaaaagccg gcctcagttc ggattggggt ctgcaactcg accccatgaa gttggagttg 1260 ctagtaatcg cagatcagca tgctgcggtg aatacgttcc cgggccttgt acacaccgcc 1320 cgtcacgtca cgaaagtcgg taacacccga agccggtggc ctaacccgta agggatggag 1380 1380

Claims (6)

  1. 항균 활성을 갖는 스트렙토마이세스 프사모티쿠스 균주(Streptomyces psammoticus, 수탁번호: KACC91580P).
  2. 스트렙토마이세스 프사모티쿠스 균주 (Streptomyces psammoticus, 수탁번호: KACC91580P)를 GSM 배지(glucose starch molasses medium)에서 배양하는 단계; 및
    상기 균주의 균사, 포자 또는 이들의 혼합물로부터 스트레버틴 A 또는 B를 분리 및 정제하는 단계를 포함하는 식물병원균에 항균 활성을 갖는 항생물질 제조방법.
  3. 제2항에 의해서 제조된 스트레버틴 A 또는 B를 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 식물병 방제용 살균제 조성물.
  4. 검체 균주가 기질 균사를 생성하고, 포자 형태가 원통형이며 포자의 배열이 렉터플렉서블(rectiflexible)형인 지를 확인하는 단계; 및
    검체 균주의 16S rDNA와 서열번호 1의 염기서열을 대비 분석하는 단계를 포함하는 스트렙토마이세스 프사모티쿠스 균주(Streptomyces psammoticus, 수탁번호: KACC91580P)를 동정하는 방법.
  5. 검체 균주가 기질 균사를 생성하고, 포자 형태가 원통형이며 포자의 배열이 렉터플렉서블(rectiflexible)형인 지를 확인하고, 검체 균주의 16S rDNA와 서열번호 1의 염기서열을 대비 분석하는 단계를 포함하는 스트렙토마이세스 프사모티쿠스 균주(Streptomyces psammoticus, 수탁번호: KACC91580P)를 동정하는 단계; 및
    상기 스트렙토마이세스 프사모티쿠스 균주의 균사, 포자 또는 이들의 혼합물의 메탄올 추출물을 식물체 또는 토양에 처리하는 단계를 포함하는 식물병 방제방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 스트렙토마이세스 프사모티쿠스 균주에서 스트레버틴 A 또는 B를 분리 및 정제하는 단계를 더 포함하는 식물병 방제방법.



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