KR100790314B1

KR100790314B1 - 항균 활성을 가지는 스트렙토마이세스 라세이 ｍｓ５３균주로부터 생산되는 신규 항생물질 살라세인 및 그의제조방법

Info

Publication number: KR100790314B1
Application number: KR1020060110868A
Authority: KR
Inventors: 김범석; 이동호; 박철남
Original assignee: 고려대학교 산학협력단
Priority date: 2006-11-10
Filing date: 2006-11-10
Publication date: 2008-01-02

Abstract

본 발명은 고추 역병균 및 오이 탄저병원균에 대해 항균 활성을 가지는 스트렙토마이세스 라세이 MS53 균주 (Streptomyces laceyi MS53)로부터 생산되는 하기 화학식 1로 표시되는 신규 항생물질 살라세인 (salaceyin) 및 그의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에 의한 신규 화합물 살라세인 A 및 살라세인 B는 식물병원성 진균에 항균활성이 탁월할 뿐만 아니라 자연환경 속에서 다른 미생물에 의해 자연적으로 분해되는 생분해성이 큰 환경친화적 천연 농업용 살균제로서 유용하게 사용될 수 있다.

(화학식 1)

고추 역병, 오이탄저병, 살라세인 A (salaceyin A), 살라세인 B (salaceyin B), 살균제

Description

항균 활성을 가지는 스트렙토마이세스 라세이 ＭＳ５３ 균주로부터 생산되는 신규 항생물질 살라세인 및 그의 제조방법{Salaceyin from Streptomyces laceyi MS53 strain effective against plant pathogens and preparation method thereof}

도 1a 및 도 1b는 본 발명에 의한 화학식 1의 화합물 살라세인 A (salaceyin A) 와 살라세인 B(salaceyin B)의 ¹H 핵자기 공명 스펙트럼 결과를 나타낸 도면이고,

도 2a 및 도 2b는 본 발명에 의한 화학식 1의 화합물 살라세인A(salaceyin A) 와 살라세인 B(salaceyin B)의 ¹³C 핵자기 공명 스펙트럼 결과를 나타낸 도면이고,

도 3은 온실조건의 폿트 실험에서 본 발명에 의한 항균물질인 살라세인 A 의 고추 역병균인 파이토프소라 캡시사이(Phytophthora capsici)에 대한 방제효과를 상용살균제인 메타락실(metalaxyl)과 비교 실험한 결과를 도시한 그래프이고,

도 4는 온실조건의 폿트 실험에서 본 발명에 의한 항균물질인 살라세인 A 의 오이 탄저병원균인 콜레토트리쿰 오비큘라레에 대한 방제효과를 상용살균제인 클로로탈로닐(Chlorothalonil)과 비교 실험한 결과를 도시한 그래프이다.

본 발명은 항균 활성을 가지는 스트렙토마이세스 라세이 MS53 균주 로부터 생산되는 신규 항생물질 살라세인 및 그의 제조방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 고추 역병균 및 오이 탄저병원균 등의 식물병원균에 대해 항균 활성을 가지는 스트렙토마이세스 라세이 MS53 균주 (Streptomyces laceyi MS53)로부터 생산되는 하기 화학식 1로 표시되는 신규 항생물질 살라세인 A(salaceyin A) 및 살라세인 B(salaceyin B) 및 그의 제조방법에 관한 것이다.

(화학식 1)

주) 1: salaceyin A, 2: salaceyin B

고추역병(Phytophthora blight)은 경제적으로 중요한 식물병으로 전 생육기에 걸쳐 주로 뿌리와 줄기 부위에 발생되지만, 병원균이 빗물에 튀어 올라 잎, 열매, 가지 등의 지상부에도 발생하는 병으로, 유묘기 감염시 식물 전체가 시들어 죽게 되고, 생육 중기 또는 후기의 병든 그루는 시들다 적황색으로 변해 말라 죽게 된다.

고추역병을 일으키는 병원균인 파이토프소라 캡시사이(Phytophthora capsici)는 반수생균으로 물속이나 배양기상에서 유주자낭을 형성하며 유주자낭에서 유출된 유주자는 2개의 편모를 갖고 있어 물속을 유영하며 전반이 된다. 고추역병의 병원균은 병든 식물체의 조직에서 균사 또는 난포자의 상태로 월동한 후 재 발아하여 1차 전염원이 되며 다음과 같다.

고추역병은 육묘상에서부터 전 생육기에 발생되며 시설재배에서는 연중 발생되는 것으로, 토양이 장기간 습도가 높거나 배수가 불량하고 침수될 시 병발생 확률이 높아진다. 특히 상기 고추역병은 종자전염도 가능하며, 대부분의 전염원은 토양에서 유입되어 방제상의 어려움이 있다.

오이탄저병을 일으키는 병원균인 콜레토트리쿰 오비큘라레(Colletotrichum orbiculare)는 분생포자층에서 분생포자와 강모(剛毛)를 형성하는 진균계의 불완전균류로서 생육적온 22∼28℃에서 오이를 비롯한 모든 박과 채소작물을 침해하여 탄저병을 일으킨다. 탄저병균은 주로 강우시 흙탕물이 튀어서 잎이나 덩굴에 부착되어 전염이 되며 오이의 탄저병에 등록된 약제가 없어 수박의 탄저병에 등록된 약제를 사용하고 있는 실정이다.

이와 같은 고추역병(Phytophthora blight) 및 오이탄저병은 경제적으로 매우 중요한 식물병으로 고추 생산 등에 있어 큰 감수요인이 되고 있다. 이러한 식물병의 방제를 위해 저항성 품종의 재배, 윤작 등이 행해지고 있지만 가장 효율적인 방법은 살균제를 이용한 화학적 방제이며 이로 인한 환경 및 인축에 대한 부작용이 심각한 수준에 이르러 사회문제를 유발하고 있는 실정이다.

유기합성농약의 사용은 환경에 대한 부담이나 농산물에 대한 잔류성 때문에 생물학적 방제와 같은 친환경적 방제방법으로 점차 대체되고 있는 추세이다.

이러한 관점에서 보면 식물병을 방제하기 위한 저독성이며 환경에 부작용을 일으키지 않는 무공해 친환경적 살균제의 개발이 계속적으로 절실하게 요구되는 상황이라 할 수 있다.

특히 저독성 무공해 살균제로서 미생물로부터 분비되는 이차대사산물을 활용하는 방안이 제시되고 있으며, 이는 미생물 이차대사산물이 식물병 방제를 위한 살균제로서 여러 가지 유용한 특성이 있기 때문이다. 즉, 미생물 유래 항생물질은 자연상태에서 생합성된 물질이므로 자연 환경에서 빠르게 분해되어 토양 잔류 독성에 의한 피해가 적으며, 화학구조와 생물학적 효과가 다양하여 유기합성 농약에 대한 약제 저항성을 가진 병원성 균주의 출현, 토양 내 잔류, 인축에 대한 피해 등을 포함한 부작용을 줄일 수 있는 장점을 가지고 있다.

이미, 기존에 알려진 많은 수의 항생물질이 방선균으로부터 분리되었고 특히 스트렙토마이세스(Streptomyces)속의 방선균은 아미노글리코사이드(aminoglycosides), 안쓰라사이클린(anthracyclines), 글리코펩타이드(glucoprptides), 베타락탐(β-lactams), 마크로라이드(macrolides), 핵산계(nucleocides), 펩타이드계(peptides), 폴리엔(polyenes) 등의 다양한 종류의 화학구조를 가진 항생물질을 생성하는 것으로 잘 알려져 있다. 이로 인해 새로운 항균활성물질을 탐색하기 위한 노력이 방선균속에서 계속되어 오고 있다.

본 발명자들은 고려대학교 식물약학실험실에서 여러 식물내생 미생물을 채집하여 이로부터 항진균성 항생물질들을 개발하기 위한 연구를 수행하던 중, 항진균 성이 뛰어난 방선균을 발견하게 되었다. 상기 방선균으로부터 단일성분으로 분리 및 정제된 화합물의 약효를 스크리닝한 결과 식물병원진균 및 난균류에 대해서 항균활성 효과가 있음을 확인하고, 상기 화합물에 대한 분자구조를 규명한 결과, 신규 화합물인 살라세인 A(salaceyin A) 와 살라세인 B(salaceyin B)임을 확인하였다.

따라서 본 발명의 목적은 상기 종래 기술의 문제점 및 상기 요구를 해결하기 위한 안출된 것으로, 스트렙토마이세스 라세이 MS53 균주로부터 분리, 추출한 항균 활성이 우수한 신규 화합물 살라세인 A(salaceyin A)와 살라세인 B(salaceyin B)를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 살라세인 A 및 살라세인 B를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 스트렙토마이세스 라세이 MS53 균주로부터 분리, 추출한 항균 활성이 우수한 신규 화합물 살라세인 A(salaceyin A) 및 살라세인 B(salaceyin B) 중 하나 이상을 유효성분으로 함유하여 방제효과뿐만 자연환경 속에서 다른 미생물에 의해 자연적으로 분해되는 생분해성이 큰 환경친화적 천연 식물병 방제용 살균제 조성물을 제공하는 것이다.

또한 본 발명은 스트렙토마이세스 라세이 MS53를 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명자들은 상기 목적을 달성하고자 예의 연구를 계속하던 중 아주까리 식물내에서 내생근권 방선균을 분리ㆍ배양하여 매우 우수한 항균활성을 나타내는 상기 화학식 1의 신규 화합물 살라세인 A(salaceyin A)와 살라세인 B(salaceyin B)를 분리ㆍ정제하고 이를 생산하는 내생 근권 방선균을 스트렙토마이세스 라세이MS53 (Streptomyces laceyi MS53) 동정한 후 식물병원진균 등에 대한 억제활성을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

(화학식 I)

R은 CH₃(1:salaceyin A) 또는 CH₂CH₃(2:salaceyin B)임.

따라서 본 발명은 스트렙토마이세스 라세이 MS53 균주로부터 분리, 추출한 항균 활성이 우수한 신규 화합물 살라세인 A(salaceyin A)와 살라세인 B(salaceyin B) 및 상기 살라세인 A 및 살라세인 B를 제조하는 방법을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 스트렙토마이세스 라세이 MS53 균주로부터 분리, 추출한 항균 활성이 우수한 신규 화합물 살라세인 A와 살라세인 B를 유효성분으로 함유하여 방제효과 뿐만 자연환경 속에서 다른 미생물에 의해 자연적으로 분해되는 생분해성이 큰 환경친화적 천연 식물병 방제용 살균제 조성물을 제공한다.

상기에서 식물병은 파이토프쏘라 캡시사이(Phytophthora capsici), 콜레토 트리쿰 오비큘레어(Colletotrichum orbiculare) 또는 클라도스포리움 쿠쿠메리눔 (Cladosporium cucumerinum) 등이다.

나아가, 본 발명은 항균 활성을 갖는 스트렙토마이세스 라세이MS53 (Streptomyces laceyi MS53) 균주(미생물 기탁번호 : KACC 91276P)를 제공한다.

이하, 첨부된 도면을 참조하면서 본 발명의 구성을 상세하게 설명하면 다음과 같다.

본 발명자들은 먼저 살라세인 A와 살라세인 B를 생산하는 미생물을 아주까리 식물의 표면 살균된 줄기로부터 분리하였고 이 미생물의 분류를 위하여 화학분류적인 실험을 수행하였다. 그 결과, 이 방선균의 세포벽이 LL-다이아미노피멜산(LL-diaminopimelic acid)을 포함함을 확인하고 16S ribosomal DNA 시퀀스 분석을 한 결과 스트렙토마이세스 라세이(Streptomyces laceyi)와 99.38%의 일치(1460/1469 bp)를 보여 상기 미생물을 스트렙토마이세스 라세이 MS53 (Streptomyces laceyi MS53)로 동정하였다. 또한 상기 균주를 농업생명공학연구원에 2006년 10월 30일자로 기탁하였다(미생물 기탁번호 : KACC 91276P).

화학식 1의 신규 화합물 살라세인 A와 살라세인 B는 상기 스트렙토마이세스 라세이MS53 (Streptomyces laceyi MS53) 균주를 배양한 다음 그의 대사산물로부터 분리ㆍ정제한다.

상기 화합물 살라세인 A와 살라세인 B를 대량생산하기 위해서는 통기식 교반배양법을 사용하는 것이 바람직하고, 소량 생산하기 위해서는 플라스크를 이용한 진탕 배양법이 바람직하다. 대형 용기를 사용하여 배양하는 경우에는 먼저 소량 배 지에 상기 균주를 접종하여 배양한 다음 그 배양물을 대형 용기로 옮겨 배양 생산하는 것이 바람직하다. 배양온도는 28℃로 하며 배양 시간은 생산량에 따라 다르지만 통상 3일에서 7일로 한다.

상기 배양에 의해 생산되는 신규 화합물 살라세인 A와 살라세인 B는 배양액에서 발견되며 이 생산균의 배양여액에서 신규 화합물 살라세인 A와 살라세인 B를 분리하기 위해서는 미생물의 대사산물을 분리하는데 사용되는 일반적인 방법을 이용할 수 있다. 예를 들어 배양물 중에 함유된 다른 물질과 살라세인 A와 살라세인 B의 용해도를 이용한 방법, 이온 결합력의 차이를 이용한 방법, 흡착 친화력의 차이를 이용하는 방법, 분자량의 차이를 이용하는 방법 등을 단독 또는 병용하여 반복 사용할 수 있다.

구체적으로 신규 화합물 살라세인 A와 살라세인 B 생산균의 배양물은 물과 혼합되지 않는 유기 용매를 사용하여 액-액 분배를 통해 정제하며 상기 용매에는 에틸아세테이트를 사용함이 바람직하다. 이 외에 흡착 크로마토그래피용 담체로 실리카겔을 이용하여 활성 분획을 얻고 겔 여과 크로마토그래피를 사용시 겔로서 세파덱스 LH-20(파마시아)을 이용하는 것이 바람직하다. 상기의 과정을 통해 얻은 화합물을 순상 및 역상용 박층크로마토 그래피를 이용하여 활성분획을 얻고 이를 고속 액체크로마토그래피를 사용하여 정제한다.

이상의 분리ㆍ정제 과정을 단독 또는 병용하여 반복 사용함으로써 상기 화학식 1의 신규 화합물 살라세인 A와 살라세인 B를 분리ㆍ정제할 수 있다. 본 발명에 의한 살라세인 A 및 살라세인 B는 미생물 배양에 보편적으로 사용되는 배양법으로 생산이 가능하여 추출 및 정제에도 특별한 방법이 요구되는 것이 아니어서 공업적으로 대량 생산할 수 있다.

본 발명에 의한 살라세인 A 와 살라세인 B를 분석한 결과, 살라세인 A의 분자식은 C₁₈H₂₈O₃ 이고, 살라세인 B의 분자식은 C₁₉H₃₁O₃ 였다. 또한 도 1 내지 도 2에 도시된 바와 같이 핵자기공명(Nuclear magnetic resonance, NMR) 스펙트럼 분석결과 살라세인 A는 6-(9-메틸데실) 살리신산 (6-(9-methyldecyl)salicylic acid)이고, 살라세인 B는 6-(9-메틸운데실) 살리신산 (6-(9-methylundecyl)salicylic acid)이다. 본 발명에 의한 항균물질 살라세인 A 와 살라세인 B는 지금까지 보고된바 없는 신규 살리실산 유도체로 확인되어, 본 발명자들은 이 신규 항생물질을 살리세인 A 및 살리세인 B로 명명하였다.

상기 스트렙토마이세스 라세이 MS53 (Streptomyces laceyi MS53) 균주의 배양액에서 생산된 화합물의 항균 활성효과를 조사하기 위해, 본 발명에서는 여러 식물 병원균을 대상으로 그들의 항균 활성을 분석하였다.

그 결과, 본 발명의 화합물은 식물 병원균에 대해 탁월한 항균 작용을 나타내기 때문에 농업용 살균제로서 유용함을 확인하였다(도 3 및 도 4 참조).

상기 과정을 통하여 얻은 본 발명의 화합물은 농업용 살균제의 활성 성분으로서 희석제, 전착제, 상승제, 접착제, 분산제 및 희석제 등과 같은 적당한 보조제와 함께 혼합하여 제제화될 수 있다.

본 발명의 화합물을 함유하는 살균제 조성물은 수화 분말, 또는 분말, 과립, 현탁액, 유화 농축물, 훈증제, 기체 및 페이스트 등으로 제조될 수 있으며, 이렇게 제조된 조성물은 바람직한 농도로 물로 희석하여 사용하거나, 또는 무기 분말과 혼합하고 균질하게 파쇄 및 혼합하여 분진으로 사용할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1. 스트렙토마이세스 라세이 MS53 ( Streptomyces laceyi MS53 ) 균주의 동정

분리된 본 발명의 균주 MS53은 세포벽이 LL-다이아미노피멜산(LL-diaminopimelic acid)을 포함함을 확인하였다. 또한 16S ribosomal DNA 시퀀스 분석을 한 결과 스트렙토마이세스 라세이(Streptomyces laceyi)와 99.38%의 일치(1460/1469 bp)를 보여 상기 미생물을 스트렙토마이세스 라세이 MS53 (Streptomyces laceyi MS53)로 동정하였다. 또한 상기 균주를 농업생명공학연구원에 2006년 10월 30일자로 기탁하였다(미생물 기탁번호 : KACC 91276P).

실시예 2. 항균물질 살라세인 A와 살라세인 B의 분리 및 정제

(단계 1) 스트렙토마이세스 라세이MS53 (Streptomyces laceyi MS53) 균주의 배양

상기 화합물을 생산하는 스트렙토마이세스 라세이MS53 (Streptomyces laceyi MS53)균주를 먼저 ISP4 아가 배지에서 전배양 한 후 완전히 균체를 자라게 하며 ISP 4 아가 배지 성분은 다음과 같다.

<시드용 아가 배지 조성>

가용성 녹말 ㆍㆍㆍㆍㆍㆍ10.0g/L

효모 추출물 ㆍㆍㆍㆍㆍㆍ 1.0g/L

CaCO₃ ㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍ 2.0g/L

(NH4)₂SO₄ ㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍ 2.0g/L

K₂HPO₄ ㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍ 1.0g/L

MgSO₄ㆍ7H₂Oㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍ 1.0g/L

NaCl ㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍ 1.0g/L

FeSO₄ㆍ7H₂O ㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍ1.0mg/L

MnCl₂ㆍ7H₂O ㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍ 1.0mg/L

ZnSO₄ㆍ7H₂O ㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍ 1.0mg/L

1000 ml 배플(baffled) 배양 플라스크에 300 ml을 넣은 변형된 YEME배지를 가열 증기멸균시킨 후 (120℃, 15분) ISP4아가 배지에서 전배양한 균체의 현탁액을 접종하여 28℃조건에서 3일간 회전진탕배양(170rpm)하였다. 변형된 YEME배지의 조 성은 다음과 같다.

<시드용 배지조성>

효모 추출물ㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍ0.3%

펩톤(박토사)ㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍ 0.5%

맥아 추출물ㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍ0.3%

포도당 ㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍ1%

자당 ㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍ 10.3%

MgCl₂ㆍ6H₂O ㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍ 0.1%

하기 조성을 갖는 생산용 배지 8L를 1000 ml 배플(baffled) 배양 플라스크에 각각 300mL을 담아 가열 증기 멸균하였다(120℃, 15분). 여기에 각각 상기의 시드용 배양액 20 ml를 접종하여 28℃ 조건으로 7일간 회전진탕(170rpm) 배양하였다.

<생산용 배지조성>

효모 추출물 ㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍ 0.3%

펩톤(박토사) ㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍ0.5%

맥아 추출물 ㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍ 0.3%

포도당 ㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍ 1%

자당 ㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍ 10.3%

MgCl₂ㆍ6H₂O ㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍ 0.1%

(단계 2) 분리 및 정제

스트렙토마이세스 라세이 MS53 (Streptomyces laceyi MS53) 균주를 생산용 배지에서 상기 과정으로 배양하여 얻은 배양액 8L를 원심분리하여 균체와 배양액을 분리하였다. 상기에서 얻은 배양액에서 신규 화합물 살라세인 A와 살라세인 B는 분액여두를 사용하여 에틸아세테이트로 추출이 가능하며 배양액 2배의 에틸아세테이트를 이용하여 추출한다.

이렇게 얻은 에틸아세테이트에 가용성인 추출액을 감압상태에서 농축 후 1.3g을 얻었다.

이 후 실리카겔 크로마토그래피를 수행하였다. 이동상은 클로로포름과 메탄올을 이용하여 구분 용출 하였으며 활성분획은 박층크로마토그래피를 수행하였다. 클로로포름-메탄올(15:1) 비율의 전개용매로 전개 시킨 후, 본 발명의 화합물에 해당하는 밴드를 취하였다.

이렇게 얻은 활성분획을 클로로포름-메탄올(1:1) 용액을 용리액으로 사용하여 세파덱스 LH-20 컬럼에 통과시켜 이중 활성 분획을 역상 고속 액체크로마토그래피(YMC-Pack Pro 를 C18, 250ｘ20 mm i.d., MeCN-H₂O (0.05% TFA) gradient, 10ml/min)를 수행하여 살라세인 A (10.0mg, 0.77% w/w)와 살라세인 B (2.0mg, 0.15% w/w)를 최종 정제하였다.

이와 같이 정제한 화합물의 이화학적 특성은 다음과 같고 도 1a 내지 도 2b 에 나타나 있다.

살라세인 A( 6-(9- methyldecyl ) salicylic acid )

(1) 물질의 성상 : 무색 무정형 가루

(2) 분자식 : C₁₈H₂₈O₃ (positive HRFABMS)

(3) 질량분석 : ESI-MS m/z 291.4 m/z［M - H］-, 583.7 ［2M - H］- HRFABMS m/z 293.2119, calculated for C₁₈H₂₉O₃, 293.2117

(4) 자외선 흡수 스펙트럼 (MeOH) : λ_max(logε)244(3.72), 310(3.51)nm

(5) ¹H 핵자기공명 스펙트럼 (500MHz, CDCl₃) : AMX spin system (1,2,3-trisubstituted benzene ring ), δH 6.85 (1H, doublet, J=8.0 Hz, H-3), 7.34(1H,triplet, J=7.6 and 8.0 Hz, H-4), 6.75(1H,doublet, J=7.6Hz, H5)

(6) ¹³C 핵자기공명 스펙트럼 : In the aliphatic region, a benzylic methylene signal at δ_H 2.96(2H, triplet, J=7.6 Hz , H-1’), a homobenzylic methylene signal at δ_H1.49 (1H, octet like multiplet, H-6’), and 0.83 (6H, doublet, H-10’ and H-11’) as well as the overlapped signal ［δH1.23~1.35 (10H, multiplet, H-3’,4’,5’,6’, and 7’) and 1.14(2H, multiplet, H-8’)

(7) HMBC : H-5/C-1, C-1’, H-1’/C-1, C-5, C-6

살라세인 B( 6-(9- methylundecyl ) salicylic acid )

(1) 물질의 성상 : 무색 무정형 가루

(2) 분자식 : C₁₉H₃₁O₃ (positive HRFABMS)

(3) 질량분석 : ESI-MS m/z 305.4 ［M - H］-, 611.6 ［2M - H］- HRFABMS m/z 307.2274, calculated for C₁₉H₃₁O₃, 307.2273

(4) 선광도 : ［α］D +5.0 (C 0.1, CHCl₃)

(5) 자외선 흡수 스펙트럼 (MeOH) : λ_max(logε)244(3.56), 310(3.55)nm

(6) ¹H 핵자기공명 스펙트럼 (500 MHz, CDCl₃) 과 ¹³C 핵자기공명 스펙트럼은 살라세인 A와 동일하며, 단지 예외는 살라세인 B(salaceyin B)의 9-메틸데실(9-methyldecyl) 기의 시그널(signal)뿐이다. 수소핵자기공명스펙트럼에서의 이소-타입 메틸 브랜치 시그널(iso-type methyl branch signals, 9-methyldecyl unit)의 결여와 말단의 메틸그룹 [11.40 (C-11)] 업필드(upfield)로의 이동으로 볼 때 안티이소-타입 메틸 브랜치드 체인(anteiso-type methyl branched chain)을 가지고 있는 것으로 확인되어 살라세인 B(salaceyin B)의 구조임을 확인된다.

실시예 3: 신규 화합물 살라세인 A와 살라세인 B의 구조 결정

상기의 분석 결과로부터 신규 화합물 살라세인 A와 살라세인 B의 구조를 다음과 같이 결정하였다. 먼저 고분해능 질량분석 스펙트럼 및 ¹H 핵자기공명 스펙트 럼, ¹³C 핵자기공명 스펙트럼의 분석 결과로부터 분자식을 각각 C₁₈H₂₈O₃ 과 C₁₉H₃₁O₃ 로 결정하였다.

실시예 4 : 신규 화합물 살라세인 A와 사라세인 B의 식물병원균에 대한 항균활성

고추역병을 일으키는 파이토프소라 캡시사이(Phytophthora capsici), 오이에 탄저병을 일으키는 콜레토트리쿰 오비큘레어(Colletotrichum orbiculare) 외에 알터나리아 말리 ( Alternaria mali ), 보트리티스 시네레아 (Botrytis cinerea), 클라도스포리움 쿠쿠메리눔 (Cladosporium cucumerinum), 실린드로카르폰 데스트럭탄스(Cylindrocarpon destructans), 다이디멜라 브리오니에 (Didymella bryoniae), 푸자리움 옥시스포룸 f.sp 라이코펄시사이 (Fusarium oxysporum f.sp. lycopersici), 마그나포르테 그리시아 (Magnaporthe grisea), 라이족도니아 솔라니(Rhizoctoia solani), 칸디다 알비칸스 (Candida albicans), 사카로마이세스 세레비시에 (Saccharomyces cerevisiae), 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis), 얼위니아 카로토보라 pv 카로토보라 (Erwinia carotovora pv carotovora), 랄스토니아 소라나세아룸(Ralstonia solanacearum) 등의 식물병원균을 덱스트로스 한천 (potato dextrose agar) 배지에서 배양했다.

상기 실시예 2에서 분리ㆍ정제한 신규 화합물 살라세인 A(salaceyin A)와 살라세인 B(salaceyin B)를 마이크로 웰 플레이크(micro-well plate)에 1%의 감자한 천 배지 및 보통한천배지와 섞어 일련의 농도 (4 ~ 256 ㎍/㎖) 로 담은 후, 각각의 진균포자 또는 유주자 또는 세균 현탁액을 10⁶ 개/㎖ 및 10⁷ 개/㎖ 의 농도로 맞추어서 각각의 웰 (well)에 넣었다. 접종된 마이크로 웰 플레이트는 28(±1)℃에서 100rpm으로 2일 내지 4일간 배양한 후, 곰팡이 및 유주자 또는 세균의 생장이 일어나지 않는 농도 중 가장 낮은 농도를 최소억제농도(minimum inhibitory concentration; MIC)로 평가하였으며, 그 결과는 하기 표 1에 나타내었다.

이 결과 상기 신규 화합물 살라세인 A(salaceyin A)와 살라세인 B( salaceyin B)는 파이토프소라 캡시사이(Phytophthora capsici), 콜레토트리쿰 오비큘레어(Colletotrichum orbiculare) 및 클라도스포리움 쿠쿠메리눔 (Cladosporium cucumerinum)에 대해 높은 수준의 항균활성을 보였음을 확인하였고 살라세인 B(salaceyin B)보다는 살라세인 A(salaceyin A)의 효과가 더 우수함을 확인하였다.

실시예 5 : 온실조건에서 신규 화합물 살라세인의 고추역병 및 탄저병 방제 효과를 각각 이에 대한 상용 살균제인 메타락실( metalaxyl ) 및 클로로타로 닐( Chlorothalonil)의 방제 효과와 비교

( 시험예 1) 고추역병에 대한 방제효과

온실조건 하에서 고추 유묘에서의 신규 화합물 살라세인 A의 방제효과를 알아보기 위하여 이에 대한 상용 살균제인 메타락실(metalaxyl)을 이용하여 병원균을 접종하기 1일전에 각각을 농도별로 처리하여 각 처리구와 약제를 처리하지 않은 무처리구에서의 병피해도를 평가하였다.

먼저 고추 종자는 플라스틱 트레이(50 X 40 X 15 cm³)에 증기 멸균된 혼합토양 (피트모스 : 펄라이트 : 버미쿨라이트, 5:3:2 v:v:v)과 모래와 양토를 1:1:1(v:v:v)로 섞은 곳에 파종하였다. 이 후 4엽까지 자란 유묘(seedling)를 상기의 토양이 들어있는 플라스틱 폿트(4 X 4 X 7 cm³)에 이식하였다. 고추식물은 일분지기까지 온실에서 재배하였다(28(±2)℃, 5000 lux, 16시간/1일).

상기 실시예 2에서 분리한 신규 화합물 살라세인을 상용 살균제인 메타락실(metalaxyl)과 방제효과를 비교하기 위해 각각 아세톤과 메탄올에 녹였다. 이를 계면활성제(Tween 20, 0.5g/L)에 희석한 후 식물에 각각 10mg/L, 50mg/L, 100mg/L, 그리고 500mg/L의 농도로 처리하였다.

병 접종시에는 토양으로부터 1cm 상단의 고추식물 줄기부위에 상처 내고 고추 역병균 유주자 현탁액(10⁵ zoospores mL^-1)을 적신 솜을 상처부위에 플라스틱 테이프를 이용하여 고정시켰다. 병 피해도(disease severity)는 무처리 고추유묘가 완전히 병들어 죽었을 때를 기준으로 병의 증상이 전혀 보이지 않았을 때를 0, 고추유묘가 완전히 죽었을 때를 5로 나타내어 10회 반복 실험을 실시하였다.

실험결과, 고추역병균 접종 후 약제를 처리하지 않은 고추식물의 유묘는 완전히 죽은 반면 신규 화합물 살라세인을 500mg/L의 농도로 처리한 고추식물은 효과적으로 방제할 수 있었다 (도 3 참조). 또한 고추역병균 접종 후의 처리보다 처리전의 효과가 우수한 것으로 보았을 때 치료적 효과(curative properties)보다 예방적 효과(preventive properties)가 더 뛰어남을 보였다. 고추역병균 접종전 신규 화합물 살라세인 A의 처리는 메타락실(metalaxyl)과 비교하여 차이를 보이지 않았다.

( 시험예 2) 오이 탄저병에 대한 방제효과

온실조건 하에서 오이 유묘에서의 신규 화합물 살라세인 A의 방제효과를 알아보기 위하여 이에 대한 상용 살균제인 클로로타로닐(Chlorothalonil)을 이용하여 병원균을 접종하기 1일전에 각각을 농도별로 처리하여 각 처리구와 약제를 처리하지 않은 무처리구에서의 병피해도를 평가하였다. 병피해도는 엽면적당 병반면적율을 평가하여 비교하였다.

먼저 오이 종자는 위와 마찬가지로 플라스틱 트레이(50 X 40 X 15 cm³)에 증기 멸균된 혼합토양 (피트모스 : 펄라이트 : 버미쿨라이트, 5:3:2 v:v:v)과 모래와 양토를 1:1:1(v:v:v)로 섞은 곳에 파종하였다. 오이식물은 온실조건(28(±2)℃, 5000 lux, 16시간/1일)에서 재배하였다.

상기 실시예 2에서 분리한 신규 화합물 살라세인을 상용 살균제인 클로로타로닐(Chlorothalonil)과 방제효과를 비교하기 위해 아세톤과 메탄올에 녹인 후 이를 계면활성제(Tween 20, 0.5g/L)에 희석하여 식물에 각각 10mg/L, 50mg/L, 100mg/L, 그리고 500mg/L의 농도로 처리하였다.

병 접종시에는 각각의 약재를 3엽까지 자란 오이 유묘의 1엽 부위에 콜레토트리쿰 오비큘레어(Colletotrichum orbiculare) 분생포자 현탁액(10⁶ conidia mL^-1)을 계면활성제(Tween 20, 0.5g/L)과 혼합하여 오이잎에 살포하였다. 접종된 오이식물은 습도 50% 및 28(±1)℃의 항온항습실로 옮겨 24시간 동안 발병을 유도한 후 온실로 옮겼다.

오이의 병 피해도(disease severity)는 접종 후 7일에 1엽의 병반으로 평가하였으며. 10개의 오이 식물잎의 단위면적당 병반의 수를 평균통계로 평가하였다.

실험결과, 오이탄저병균 접종후 6일째에 신규 화합물 살라세인 A를 500mg/L의 농도로 처리한 오이식물의 잎에선 병반을 거의 찾아볼 수 없었으며 상용 살균제인 클로로타로닐(Chlorothalonil)과 유사하게 방제효과를 보였다(도 4 참조).

위의 시험예 1과 2는 본 발명을 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명한 것이다.

상기 시험예 1과 2에서 측정한 처리구 및 대조구를 하기 도 3과 4에 나타내었으며 위의 시험예에서 보았듯이 신규 화합물 살라세인 A는 고추역병 및 오이탄저병의 병 방제용 약제로서 탁월한 효과를 가지고 있음을 확인하였으며 이는 또한 미생물유래로서 자연환경상에서 미생물에 의해 쉽게 분해될 수 있어 토양잔류효과도 기존의 살균제에 비해 현저히 낮다는 것을 확인할 수 있다.

이상에서 살펴본 바와 같이, 본 발명은 항진균성 활성을 갖는 스트렙토마이세스 라세이 MS53 (Streptomyce laceyi MS53), 이 균주로부터 생산되는 신규 화합물 살라세인 A, 살라세인 B 및 그의 공업적 대량 제조 방법을 제공하고, 고추역병 및 오이탄저병 등에 방제효과가 있을 뿐만 아니라 자연환경에서의 미생물에 의한 생분해성이 큰 환경친화적 농업용 살균제를 제공하는 효과가 있어 식물병 방제산업상 유용한 발명인 것이다.

Claims

하기 화학식으로 표시되는 항균활성을 가지는 살라세인.

(화학식 1)

R은 CH₃ 또는 CH₂CH₃임.
제1항에 있어서, 상기 살라세인은 스트렙토마이세스 라세이 MS53 (Streptomyces laceyi MS53) 균주(미생물 기탁번호 : KACC 91276P)로부터 생산되는 것을 특징으로 하는 살라세인.
삭제
제1항 기재의 살라세인을 유효성분으로 함유함을 특징으로 하는, 식물병 방제용 살균제 조성물.
제4항에 있어서, 상기 식물병은 파이토프쏘라 캡시사이(Phytophthora capsici), 콜레토트리쿰 오비큘레어(Colletotrichum orbiculare) 또는 클라도스포리움 쿠쿠메리눔 (Cladosporium cucumerinum)에 의해 발생되는 식물병임을 특징으로 식물병 방제용 살균제 조성물.
항균 활성을 가지는 스트렙토마이세스 라세이 MS53 (Streptomyces laceyi MS53) 균주(미생물 기탁번호 : KACC 91276P).
제6항 기재의 스트렙토마이세스 라세이 MS53 균주 또는 그 배양액을 함유하는 것을 특징으로 하는 식물병 방제용 살균제 조성물.
제7항에 있어서, 상기 식물병은 파이토프쏘라 캡시사이(Phytophthora capsici), 콜레토트리쿰 오비큘레어(Colletotrichum orbiculare) 또는 클라도스포리움 쿠쿠메리눔 (Cladosporium cucumerinum)에 의해 발생되는 식물병임을 특징으로 하는 식물병 방제용 살균제 조성물.