KR940004098B1 - 신규 항생제 화합물의 제조 방법 - Google Patents

신규 항생제 화합물의 제조 방법 Download PDF

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Abstract

내용 없음.

Description

신규 항생제 화합물의 제조 방법
제1도는 인자 A의 IR 스펙트럼.
제2도는 인자 B의 IR 스펙트럼.
제3도는 인자 C의 IR 스펙트럼.
제4도는 인자 D의 IR 스펙트럼.
제5도는 X선 결정법에 의해서 측정된 인자 B의 구조.
제6도는 인자 E의 IR 스펙트럼.
제7도는 인자 F의 IR 스펙트럼.
제8도는 인자 A,B,C 및 D(메탄올중 약 0.1%)에 대한 원편광이색성 커브.
본 발명은 신규 항생제 및 이들의 제조 방법에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 미생물 스트렙토마이세스(Streptomyces)를 발효시켜서 얻을 수 있는 항생제의 제조 방법에 관한 것이다.
일면에 있어서, 본 발명은 조절된 조건하에서 이후에 기술하는 미생물 균주를 성장시켜서 제조할 수 있는 신규 물질(본 발명자들이 항생제 S541로 명명함)을 제공한다. 항생물질 S541은 항생 작용, 특히 항-내부 기생충, 항-외부 기생충, 항-진균, 살충, 살선충 및 진드기 구충 작용을 갖고, 농업, 원예, 동물 및 인체건강에 특히 중요하게 사용된다. 이 화합물은 또한 다른 유효 화합물의 제조시에 중간체로서 사용될 수도 있다. 이 화합물은 발효시켜서 이하에 기재한 바와 같이 실질적으로 순수한 형태로 회수할 수 있다.
항생제 S541은 다음과 같은 부분 구조식(I), 더 구체적으로는 부분 구조식(Ⅱ)를 갖는 관련 화합물들로 이루어진 군이다.
Figure kpo00001
부분 구조식(Ⅱ)를 갖는 6개 화합물들은 이후에 더욱 구체적으로 기술한다.
본 발명은 상기 부분 구조식을 갖는 화합물을 개별적으로, 또는 혼합된 것을 모두 포함한다. 특정 용도에 있어서, 예를 들면 농업, 원예 또는 수의 약품에 있어서, 항생물질 S541을 개별 성분들로 분리시키지 않고서 사용하는 것이 더욱 적합하지만, 다른 용도에 있어서, 예를 들면, 인체 의약품에 있어서는, 개별 화합물을 사용하는 것이 적합할 수 있다. 그러므로, 본 발명은 1종 이상의 본 발명의 다른 화합물과 혼합시킨 본 발명의 화합물 및 실질적으로 순수한 형태 또는 실질적으로 기타 마크로리드(macrolide) 화합물이 없는 개별 화합물을 포함한다.
처음에 단리된 항생물질 S541은 이후 기재하는 바와 같이, 실리카를 사용해서 크로마토그래피시켜서 항생작용(예, 구충 작용)을 갖고 254mm에서 u.v.형광이 없어지는 2개의 성분으로 쉽게 분리시킬 수 있다. 성분 I은 0.70 내지 0.75 범위의 Rf값을 갖는 특징이 있고, 성분 Ⅱ는 0.39 내지 0.46 범위의 Rf값을 갖는 특징이 있으며, 이 Rf값은 용출제로서 클로로포름 : 에틸아세테이트(3 : 1)을 사용하는 Merck5735 실리카 60 플레이트상에서 박충 크로마토그래피에 의해 측정하였다. 항생물질 S541의 성분 I 및 Ⅱ(여기에서, R2는 각각 -CH3및 -H임)는 본 발명의 추가의 일면을 구성한다.
본 발명자들은 성분 I 및 Ⅱ를 더 정제시켜, 항생 작용(예, 구충 작용)을 갖는 부분 구조식(I)의 6가지의 화합물을 생성시켰다. 따라서, 본 발명의 추가의 일면은 하기 일반식(Ⅲ)의 화합물을 제공한다.
Figure kpo00002
[상기 식 중, R1은 메틸, 에틸 또는 이소프로필기이고, R2는 수소 원자 또는 메틸기이다.]
본 발명자들은 일반식(Ⅲ)의 6가지의 화합물을 각각 인자A(R1=이소프로필, R2=수소), 인자 B(R1=메틸, R2=메틸), 인자 C(R1=메틸, R2=수소), 인자 D(R1=에틸, R2=수소), 인자 E(R1=에틸, R2=메틸) 및 인자 F(R1=이소프로필, R2=메틸)로 정의했다. 이중 인자 A 및 C가 특히 적합하다.
인자 B,E 및 F는 성분(I)로부터 얻는 반면에, 인자 A,C 및 D는 성분(Ⅱ)로부터 얻는다.
본 발명의 화합물은 항생 작용(예, 구충작용)을 가지며, 예를들면, 선충에 대해서 구충 작용을 가지며, 특히 내부 기생충 및 외부 기생충 억제 작용을 갖는다. 일반적으로, 이들 화합물은 외부 기생충 및 내부 기생충과 같은 기생충을 박멸시키는데 유용하다. 외부 기생충 및 내부 기생충은 인체 및 여러 종류의 동물을 감염시키고, 특히 돼지, 양, 소, 염소 및 가금, 말과 같은 농장 동물과 애완용 동물(예, 개 및 고양이)에 만연되고 있다. 빈혈증, 영양실조 및 체중 감소를 초래하는, 가축의 기생충 감염은 전세계를 통해서 경제적 손실을 야기시키는 주요인이다.
이와 같이 동물 및(또는) 인체를 감염시키는 내부 기생충의 일반적인 예로는 십이지장충속, 아스카리디아속(Ascaridia), 화충속(Ascaris), 선충류(Aspicularis), 부노스토뭄속(Bunostomum), 카필라리아속(Capillaria), 카베르티아속(Chabertia), 쿠페리아( Cooperia), 폐충속, 디로필라리아속(Dirofilaria), 요충속, 꼬임털선충속, 헤테라키스속(Heterakis), 아메리카구충속, 네마토디루스속(Nematodirus), 네마토스피로이드스속(Nematospiroides), 니포스트론길루스속(Nippostrongylus), 오에소파고스토뭄속(Oesophagostomum), 오스데르타기아속(Ostertagia), 요충속, 파라스카리스속(Parascaris), 원충속, 간충속, 사이파시아속(Syphacia), 톡사스카리스속(Toxascaris), 톡소카라속(Toxocara), 트리코네마속(Trichonema), 털선충속, 트리키넬라속(Trichinella), 편충속 및 유구충속이 있다.
동물 및(또는) 인체를 감염시키는 외부 기생충의 예로는 교충, 집파리, 벼룩, 이, 진드기, 흡충, 참진드기 및 기타 쌍시류 해충과 같은 절지동물 기생충이 있다.
이와 같이 동물 및(또는) 인체를 감염시키는 외부 기생충의 속의 예로는 참진드기속, 소진드기속, 코롭테스속(Coroptes), 쿨리포속(Culliphore), 다모덱스속(Damodex), 다몰리니아속(Damolinia), 말파리속, 해마토비아속(Haematobia), 짐승이속, 해모피살리스속(Haemophysalis), 참진드기속, 개이속, 금파리속, 멜로피구스속(Melophygus), 쇠파리속, 소레르게이트속(Psorergates), 진드기속, 리피세팔루스속(Rhipicephalus), 움진드속 및 침파리속이 있다.
본 발명에 의한 화합물은 광범위의 내부 기생충 미치 외부 기생충에 대해서 시험관내 및 생체내 시험에서 모두 유효한 것으로 발견되었다. 특히, 본 발명자들은 본 발명에 의한 화합물이 다음과 같은 기생 선충과 진드기에 대해서 유효한 것을 발견했다. 즉, 꼬임털선충, 오스테르타기아 시컴신크타(Ostertagia circumcincta), 트리코스트롱길러스 콜루비포르미스(Trichostrongylus colubiformis), 소폐충, 쿠페리아 온코페라(Cooperia oncophera), 오스테르타기아 오스테르타기(Ostertagia ostertagi) 및 니포스트롬길러스 브라질리엔시스(Nippostrongylus braziliensis) 및 옴진드기종 및 진드기종.
그러므로, 본 발명의 화합물은 내부 기생충 및(또는) 외부 기생충에 감염된 동물 및 인체를 치료하기 위하여 사용된다.
기생충의 종류는 숙주 및 주된 감염 부위에 따라서 다양할 수 있다. 그러므로, 예를 들면 꼬임털선충, 오스테르타기아 서컴신크타(Ostertagia circumcincta) 및 트리코스트롬길러스 콜루비포르미스(Trichostrongylus colubiformis)는 일반적으로 양을 감염시키고, 위 및 소장중에 주로 기생하는 반면에, 소폐층, 구페리아 온코포라(Cooperia omcophora) 및 오스테르타기아 오스테르타기(Ostertagia ostertagi)는 일반적으로 소를 감염시키고, 주로 폐, 장 또는 위에 기생한다.
또한, 본 발명자들은 본 발명의 화합물들이 칸디다종(Candida sp) [예, 아구창 칸디다(Candida albicans) 및 칸디다 글라브라타(candi da glabrata)]의 균주와 효모 [예, 사카로마이세스 킬스베겐시스(Saccharomyces carlsbergensis)]에 대해서 항진균 작용이 있음을 발견했다.
본 발명의 화합물은 또한 선충 케노르합디티스 엘레간스(Caenorhabditis elegans)에 대해서도 유효한 것으로 밝혀졌다.
본 발명의 화합물은 또한 농업, 원예, 임업, 공중 보건 및 저장 생산물에 있어서, 곤충, 진드기 및 선충류 등의 해충을 박멸시킴에 있어서 유효한 것으로 밝혀졌다.
토양 및 농작물[곡물(예, 밀, 보리, 옥수수 및 벼), 채소(예, 콩), 과일(예, 사과, 포도 및 감귤류) 뿐만 아니라 뿌리 작물(예, 사탕무우, 감자)을 포함]에 기생하는 해충도 유용하게 박멸시킬 수 있다.
특히, 본 발명자들은 본 발명의 화합물들이 예를 들면, 과일 진드기, 진딧물[예, 아피스 파배(Aphis fabae), 아울라코르덤 서쿰플렉스(Aulacorthum circumflexum), 복숭아흑진듯물, 끝동매미충, 벼멸구, 파노니쿠스 울미(Panonychus ulmi), 포로돈 후물리(Phorodon humuli), 필로콥트루타 올레이보가(Phyllocoptruta oleivora), 트라니쿠스 우르티캐(Tetranychus urticae), 및 트리아레우로이드스속(Trialeuroides)에 속하는 진드기류], 선충류[예, 아펠렌 코이드스(Aphelencoides), 글로보데라(globodera), 헤테로데라(heterodera), 멜로이도긴(Meloidogyne) 및 파나그렐루스(Panagrellus)에 속하는 선충류], 나비목[예, 헬리오티스(Heliothes), 프루텔라(Plutella) 및 스포도프테라(Spodoptera)], 곡류의 바구미[예, 안토노무스 그란디스(Anthonomus grandis) 및 시토필러스 그라나리우스(Sitophilus granarius)], 가루딱정벌레[예, 트리볼륨 카스타니움(Tribolium castaneum)], 파리[예, 집파리], 불개미, 잎벌레, 피어 프실라(Peat psylla), 트립스 타바시(Thrips tagaci), 바퀴벌레[예, 바퀴 및 이질바퀴] 및 모기(예, 열대숲 모기)]에 대해서 유효한 것을 발견했다.
그러므로, 본 발명에 의해서, 본 발명자들은 항생물질로서 사용될 수 있는, 상기 부분 구조식(I)을 갖는 화합물을 제공한다. 특히, 이 화합물은 내부 기생충, 외부 기생충 및(또는) 진균에 감염된 동물 및 인체의 치료에 유용하고, 농업, 원예 또는 삼림지에 있어서 곤충, 진드기 및 선충류 해충을 박멸시키기 위해서 살충제로서 유용하게 사용될 수 있다. 이 화합물들은 또한 기타 환경(예, 상가 빌딩 또는 기타 공공 장소 또는 해충이 있는 장소)에 있어서 해충을 박멸시키거나 구충시키기 위한 살충제로서 사용될 수 있다. 일반적으로, 이 화합물들은 숙주(동물, 인체, 식물 또는 기타 초목)에 사용되거나, 또는 해충 그 자체 또는 해충 서식지에 사용될 수 있다. 특히 적합한 것은 상기 인자 A,B,C,D,E 및 F이다. 본 발명의 화합물은 인체 및 수의약품에 있어서 투여하기에 편리한 방법으로 제제할 수 있으며, 그러므로, 본 발명의 수의 및 인체 약품용으로 사용하기에 적합한 본 발명에 의한 화합물로 되는 제약 조성물도 포함한다. 이와 같은 조성물은 1종 이상의 적당한 담체 또는 부형제를 사용해서 통상적인 방법으로 제제할 수 있다.
본 발명의 조성물은 특히 비경구(유선내 투여 포함), 경구, 직장, 국소 또는 피하 주입용의 제제형으로 제제한 것을 포함한다. 멸균 상태가 요구되는 조성물, 예를 들면 주사제(유선내 제제형 포함), 안약, 연고제 및 피하 주입제를 제제하는 경우에는, 유효 화합물 그 자체는 ｒ-선을 쬐이거나, 또는 산화에틸렌에 노출시키는 등의 방법으로 제조후, 멸균 또는 무균 상태로 제조한다.
본 발명에 의한 화합물은 주사제로서 인체 및 수의 약품용으로 제조할 수 있고, 앰3플제 또는 기타 단위-복용 용기 형태의 단위 복용형태로 제제하거나 또는 필요에 따라서, 방부제를 첨가해서 다중-복용 용기 형태로 제제할 수 있다. 주사액제는 현탁액제, 용액제, 또는 유성 또는 수성 부형제 중의 유제 형태일 수 있고, 현탁제, 안정화제, 가용화제 및(또는) 분산제와 같은 제형화제를 함유시킬 수도 있다. 별법으로, 본 발명에 의한 유효 성분을 사용전에 적합한 부형제, 예를 들면 피로겐이 없는 살균수로 재구성하는 살균 산제 형태로 제제할 수 있다. 유성 부형제에는 다가 알코올 및 그의 에스테르(예, 글리세롤 에스테르), 지방산, 식물성 오일(예, 낙화 생유 또는 면실유), 광유(예, 파라핀액), 에틸 올레이트 및 기타 유사 화합물을 포함한다. 프로필렌 글리콜과 같은 기타 부형제를 사용할 수도 있다.
수의약 조성물은 또한 장기간 작용 기재 또는 신속 방출 기재중의 유선내 투여 제제물로 제제할 수 있고, 수용액 또는 유성부형제중의 멸균 용액 또는 현탁액으로 제제할 수 있다. 유성 부형제는 예를 들면 상기의 것일 수 있으며, 또한, 연질 또는 경질 파라핀, 밀납, 12-히드록시 스테아린, 수소, 첨가된 피마자유, 스테아린산알루미늄 또는 모노스테아린산 글리세릴과 같은 농후제 또는 현탁제를 함유할 수 있다. 통상의 비이온성, 양이온성 또는 음이온성 계면 활성제를 조성물중에서 단독으로 또는 혼합해서 사용할 수 있다.
본 발명의 화합물은 또한 경구 투여에 적합한 형태(예를들면, 임의로 풍미제 및 착색제를 첨가한 용액제, 시럽제 또는 현탁액제, 또는 사용전에 물이나 기타 적당한 부형제를 이용하여 구성하는 건조 분말제의 형태)로 수의용 또는 인체용으로 제제할 수 있다. 또한, 정제, 갭슐제, 설하정제, 환제, 거환제(巨丸劑), 분제, 페이스트제 또는 과립제와 같은 고상 조성물이 사용될 수도 있다. 경구용으로 사용되는 고상 또는 액상 조성물은 이 분야에 공지된 방법에 의해서 제조할 수 있다. 경구용으로 사용되는 고상 또는 액상 조성물은 이 분야에 공지된 방법에 의해서 제조할 수 있다. 이런 조성물은 또한 고상 또는 액상형으로 1개 이상의 약물학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 함유할 수도 있다. 고상 복용 형태로 사용하기 위한 약물학적으로 허용되는 적합한 담체의 예로는 다음과 같은 것들이 포함된다. 즉, 결합제(예, 미리 젤라틴화시킨 옥수수 전분), 폴리비닐피롤리돈, 또는 히드록시프로필메틸셀룰로오스, 충전제(예, 락토오스, 미세 결정 셀룰로오스 또는 인산칼슘), 윤할제(예, 스테아린산 마그네슘, 활석 또는 실리카), 붕해제(예, 감자 전분 또는 글리콜산 전분 나트륨), 또는 습윤제(예, 황산 라우릴 나트륨)이다. 정제는 당 업계에 공지된 방법으로 피복시킬 수 있다.
액상 복용 형태로 사용하기 위한 약물학적으로 허용되는 적합한 첨가제의 예에는 다음과 같은 것들이 있다. 즉, 현탁제(예, 소르비톨 시럽, 메틸 셀룰로오스 또는 수소 첨가된 식용 지방), 유화제(예, 레시틴 또는 아카시아), 비수성 부형제(예, 아몬드유, 유성 에스테르 또는 에틸 알코올) 및 방부제(예, 메틸 또는 프로필 P-히드록시벤조에이트 또는 소르브산), 안정화제 및 가용화제가 또한 포함된다.
경구 투여용 페이스트제는 당 업계에 공지된 방법으로 제제할 수 있다. 페이스트제에 사용하기에 적합한 약물학적으로 허용되는 첨가제의 예로는 현탁제 또는 겔화제, (예, 디스테아린산 알루미늄 또는 수소 첨가된 피마자유), 분산제(예, 폴리소르베이트), 비수성 부형제(예, 낙화생유 또는 유성 에스테르), 안정화제 및 가용화제를 포함된다. 본 발명의 화합물은 또한 매일 공급되는 동물의 고상 또는 액상 사료물과 혼합해서(예를들면, 매일 공급되는 동물의 사료 또는 음료수의 일부로서) 수의약품으로 투여할 수 있다.
구강 투여용 약제는 통상적인 방법으로 제제된 정제, 페이스트제 또는 설하정의 형태로 복용할 수 있다.
본 발명의 화합물은 또한 예를들면, 유효 성분과 약물학적으로 허용되는 담체 또는 부형제로 이루어지는 용액제, 현탁제 또는 분산제로 되는 액상 음악 형태의 수의약품으로도 경구 투여할 수 있다.
본 발명의 화합물은, 인체 및 수의약품에 사용하기 위해서 통상적인 좌약 기재를 함유하는 좌약으로 제제할 수 있다.
본 발명에 의한 화합물은 인체 및 수의약품에 사용하기 위해서 연고제, 크림제, 로숀제, 분제, 페서리, 분무제, 디프제(dip), 에어로졸 또는 점적제(예, 안약 또는 코약)와 같은 국소 투여형으로 제제할 수 있다.
연고제 및 크림제는 예를 들면, 수성 또는 유성 기재에 적합한 농후제 및(또는) 겔화제를 첨가해서 제제할 수 있다. 눈에 투여하기 위한 연고제는 멸균시킨 성분을 사용해서 멸균 방법으로 제제할 수 있다.
로션제는 수성 또는 유성 기재로 제제할 수 있고, 일반적으로 1종 이상의 유화제, 안정화제, 분산제, 현탁제, 농후제 또는 착색제를 함유시킬 수도 있다.
산제는 적합한 산제 기재를 이용해서 제제할 수 있다. 점적제는 수성 또는 비수성 기재로 제제할 수 있고, 또한 1종 이상의 분산제, 안정화제, 가용화제 또는 현탁제를 함유시킬 수도 있다. 이 점적제는 또한 방부제를 함유시킬 수도 있다.
흡인 국소 투여의 경우에는, 본 발명의 화합물을 에어로졸 분무제 또는 취입제의 형태로 인체 및 수의약품용으로도 투여할 수 있다.
본 발명의 화합물은 기타 약물학적 유효 성분과 혼합시켜 투여할 수 있다. 인체 및 수의약품 모두에 사용되는 본 발명에 의한 화합물의 1일 총 투여량은 1-2000㎍/kg(체중), 적합하기로는 10-1000㎍/kg, 더욱 적합하기로는 100-500㎍/kg(체중)이고, 분할 투여량(예, 1일-4회)으로 분할 투여할 수도 있다.
본 발명에 의한 화합물은 원예 또는 농업용으로 사용하기에 편리한 방법으로 제제할 수 있으므로, 본 발명의 범위에는 원예 또는 농업용에 적합한 본 발명에 의한 화합물로 되는 조성물이 포함된다. 예를 들면, 분진제(분진 기재 또는 농축물 포함), 산제(가용성 또는 습윤성 산제 포함), 과립제(미세 과립 및 분산시킬 수 있는 과립 포함), 펠릿제, 유동제, 에멀젼제(예, 희석 에멀젼 또는 유화시킬 수 있는 농축물), 디프제(예, 뿌리 디프제 및 종자 디프제), 종자 드레싱, 종자 펠릿, 오일 농축제, 오일 용액제, 주사제(예, 줄기 주사제), 분무제, 연막제 및 연무제가 있다.
일반적으로 이와 같은 제제물은 적당한 담체 또는 희석제와 함께 혼합시킨 화합물을 포함한다. 여기에서, 담체는 액상 또는 고상이며, 이것은 화합물이 투여되는 곳에서 화합물을 분산시킴으로써 화합물의 투여에 도움을 주거나 또는 사용자가 분산제로 만들 수 있는 제제물을 제공하도록 사용되는 것이다. 이와 같은 제제물은 당 업계에 공지되어 있고, 통상적인 방법, 예를 들면 유효 성분을 담체 또는 희석제(예, 고상 담체, 용매 또는 계면 활성제)와 함께 혼합 및(또는) 분쇄해서 제제할 수 있다.
분제, 과립제 및 산제와 같은 제제물에 사용하기 위한 적합한 고상 담체는 예를 들면, 천연 광물 충진제(예, 규조토, 활석, 고령토, 몬트모릴로나이트, 엽락석 또는 아타풀기트)로 부터 선택할 수 있다. 고분산 규산, 또는 고분산 흡수제 폴리머를 필요에 따라서, 조성물중에 포함시킬 수 있다. 과립형 흡수 담체가 사용될 수도 있으며, 이것은 다공질(예, 경석(經石), 벽돌가루, 해포석 또는 벤토나이트), 또는 비다공질(예, 방해석 또는 모래)일 수 있다. 미리 과립화시킨 적합한 물질들을 사용할 수 있으며, 이것은 유기 또는 무기물질로서, 백운석 및 분쇄된 식물 잔류물을 포함한다.
담체 또는 희석제로서 사용하기에 적합한 용매에는 방향족 탄화수소, 지방족 탄화수소, 알코올 및 글리콜 또는 이들의 에테르, 에스테르, 케톤, 산 아미드, 강한 극성 용매, 그리고 임의로 에폭시화시킨 식물성 오일 및 물이 포함된다.
통상의 비이온성, 양이온성 또는 음이온성 계면 활성제로서 에톡실화 알킬 페놀 및 알코올, 알킬 벤젠 술폰산, 리그노술폰산 또는 술포숙신산의 알칼리금속 또는 알칼리토금속염, 또는 양호한 유화성, 분산성 및(또는) 습윤성을 갖는 중합체 페놀의 술포네이트를 또한 단독으로 혼합시켜 조성물중에 사용할 수도 있다.
필요에 따라서, 안정화제, 항점결제, 소포제, 점도 조절제, 결합제, 광안정제와 비료, 사육 촉진제, 또는 기타 유효 성분들을 이 조성물에 포함시킬 수 있다. 본 발명의 화합물은 또한 기타 살충제, 진드기구충제 및 선구충제와 혼합해서 제제할 수 있다.
제제물에 있어서, 유효 물질의 농도는 일반적으로 0.01 내지 99중량%이고, 더욱 적합하기로는 0.01 내지 40중량%이다.
시판품은 일반적으로 사용시에 유효 성분을 적당한 농도, 예를 들면 0.001 내지 0.0001중량%까지 희석시켜서 사용할 수 있는 농축 조성물이다.
원예 및 농업 분야에서 사용하거나, 또는 수의약품으로 사용하기 위해서는 유효 화합물의 공급원으로서 완전한 발요액을 개별 성분 또는 인자로 분리시키지 않고 사용하는 것이 적합하다. 건조 발효액(균사체 함유)을 사용하거나, 또는 용해된 균사체, 즉 고액상 분리 또는 증발 방법을 사용해서 발효액으로부터 분리시킨 살아 있거나 또는 죽은 균사체를 사용하거나 또는 균사체 분리 후 남아 있는 발효액을 사용하는 것이 적합하다. 필요에 따라서, 균사체를 저온 살균시키거나, 더욱 적합하기로는, 건조(예, 분무 건조 또는 로울러 건조)시킬 수 있다. 필요에 따라서, 발효액 또는 균사체를 상기한 통상의 불활성 담체, 부형제 또는 희석제를 포함하는 조성물로 제제할 수 있다.
상기로부터, 감염 또는 침습에 관여하는 미생물 또는 그 서식지에 본 발명에 의한 화합물중 1종 이상 화합물의 유효량을 사용해서 이 미생물에 의한 감염 또는 침습을 예방할 수 있음은 이해될 것이다.
본 발명의 또 다른 일면에 의하면, 본 발명자들은 앞서 정의한 항생물질 S541, 또는 그 성분 또는 인자의 제조 방법을 제공한다. 즉, 이 방법은 본 발명의 적어도 1종 이상을 생성할 수 있는 스트렙토 마이세스를 배양시켜서 상기 화합물중 적어도 1종 이상을 생성시키고, 필요에 따라서 그로부터 이 화합물을 단리시키는 단계로 된다. 상기 미생물중 주로 본 발명의 화합물 1종 이상을 생산하는 것이 바람직하다.
이 미생물의 분류학적 연구에 의하면, 상기 물질들을 생성할 수 있는 특수한 미생물은 스트렙토마이세스의 신규한 종이며, 스트렙토마이세스 써모아르카엔시스(Streptomyces thermoarchaensis)로 명명되었다. 토양에서 단리시킨 이 미생물의 샘플을 영국 애버딘 소재, 토리 연구소, 국립 공업 및 해상 박테리아 수집소(National Collections of Industrial and Marine Bacteria)의 영구 배양 수집소에 1984년 9월 10일자로 기탁하였으며, 기탁번호 NCIB 12015를 부여 받았다(상기 균주는 1985년 9월 24일자로 한국과학기술원에 미생물 수탁번호 : KCTC 제8169P호로 기탁됨). 스트렙토마이세스 써모아르카엔시스 NCIB 12015의 형태학적 및 배양 특성을 이후에 기재하였으며, 이 미생물은 스트렙토마이세스의 균주가 생성하는 다른 항생물질 S541과 함께 본 발명의 또 다른 일면을 제공한다. 특히, 본 발명은 스트렙토마이세스 써모아르카엔시스 NCIB 12015와 동일한 본질적인 형태학적 또는 배양 특성을 갖는 스트렙토마이세스의 신규한 종을 포함한다.
본 발명은 또한 스트렙토마이세스 써모아르카엔시스 NCIB 12015를 발효시켜서 생성할 수 있는 화합물 및 일반식(I)의 화합물의 광학 이성질체이다.
스트렙토마이세스 속의 미생물로는 스트렙토마이세스 써모아르카엔시스 NCIB 12015 또는 그의 돌연변이체가 적합하다.
스트렙토마이세스 써모아르카엔시스 NCIB 12015의 돌연변이체는 자연발생적으로 생성되거나 또는 에이치. 아이. 아들러(H. I. Adler)에 의한 미생물의 발육 방법[radiation and Radioisotopes for Industrial Microorganisms', Proceedings of the Symposium, 비엔나 1973, 241페이지, 국제 원자력기구 참조]에 기재된 것을 포함한 여러가지 벙법으로 만들 수 있다. 이와 같은 방법들은 이온화 방사, 화학적 방법[예, N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘(NTG)으로 처리], 가열, 유전적 방법(예, 재조합, 형질도입, 향질전환, 용원화 및 용원적 전환) 및 자연발생적 돌연변이체에 관한 선별 기술이 포함된다. 그리하여, 본 발명자들은 스트렙토마이세스 써모아르카엔시스 NCIB 12015의 돌연변이체 규주 4종을 얻어서, 이 각각을 영국 애버딘 소재 토리연구소, 국립 공업 및 해상 박테리아 수집소의 영국 배양 수집소에 1985년 6월 26일자로 기탁하였으며, 이들은 각각 기탁번호 NCIB 12111, NCIB 12112, NCIB12113 및 NCIB 12114를 부여받았다(이들 균주들은 1985년 12월 9일 한국과학기술원에 각각 기탁번호 KCTC 제8172P호, 동제8173P호, 동제8174P호 및 동제 8175P호로 기탁됨). 또한 스트렙토마이세스 써모아르카엔시스 NCIB 12111, 12112, 12113 및 12114 및 그 돌연변이체는 본 발명의 추가의 일면을 제공한다.
돌연변이체 균주 NCIB 12111, 12112 및 12113은 스트렙토마이세스 써모아르카엔시스 NCIB 12015의 포자를 NTG로 처리해서 얻었으며, 이들은 홀리데이의 1단계 방법[알. 홀리데이(R. Holliday), 1956년, Nature, 제178권, 978페이지 참조]에 의해서 특성화하였다.
돌연변이체 균주 NCIB 12114는 스트렙토마이세스 써모아르카엔시스 NCIB 12015의 자연발생적 돌연변이에 의해서 생성되었으며, 이것은 28℃에서 스트렙토마이신 황산염 100㎍.ml에 5일 동안 노출시킨 후에 살아 남을 수 있고, 스트렙토마이신에 대해 내성이 있는 것으로서 동정되었다.
분류학적인 연구 결과, 스트렙토마이세스 써모아르카엔시스 NCIB 12015는 신규한 종의 미생물인 것으로 나타났으며, 이 미생물의 특성은 이후에 기술하며, 이 특성은 전체적으로 볼때 본질적으로 상기 종의 특성이다. 본 발명은 실질적으로 유사한 본질적 특성을 갖는 미생물을 포함해서, 이 종에 속하는 미생물 모두를 포함한다.
적합한 포자 형성 배지, 즉 오오트밀 한천, 맥아-이스트 한천 및 무기염-전분 한천[셜링, 이. 비(Shirling, E. B.)및 고틀리에, 디.(Gottlieb, D.) 1966년, Int.J.Syst.Bacterial. 제16권, 313-340 페이지 참조]에서, 스트렙토마이세스 써모아르카엔시스 NCIB 12015는 안정한 기질 균사체와 주균사체의 측지로서 열린 나선형 사슬에 포자를 갖는 호기성 균사체를 풍부하게 생성하며 성장한다. 이들 배지 상에서, 역착색은 황색/갈색이고, 포자체는 회색이다. 100배 확대해 본 결과, 포자체는 매 나선형 회진시 5-10개 포자체를 갖고 사슬당 2-5번 회전을 하는 것으로 발견되었다. 평균적으로, 포자체는 20 내지 50개의 포자를 갖는다. 12,000배 확대의 주사 전자 현미경에서 포자는 완만하게 둘러싸여지고, 가장 넓은 지점에서 0.7㎛×1.4㎛의 크기를 갖는 타원형인 것으로 나타났다. 스트렙토마이세스 써모아르카엔시스 NCIB 12015는 그림 양성균으로서, 20℃ 내지 50℃ 온도에서 성장하여, 포자 형성을 할 수 있다.
베르기(Bergey)의 Manual of Determinative Bacteriology(제8판)에 기재된 내용과 상기 데이타를 비교해 보면, 스트렙토마이세스 써모아르카엔시스 NCIB 12015가 스트렙토마이세스에 속하는 것을 알 수 있다.
어떤 그룹의 종에 속하는지에 대한 스트렙토마이세스 써모아르카엔시스 NCIB 12015의 동정은 윌리암(Williams)등의 [J. Gen. Microbiol(1983), 129, 제 1815-1830 페이지 참조]에 기재된 컴퓨터화된 동정 매트릭스를 이용해서 행했다. 스트렙토마이세스 써모아르카엔시스 NCIB 12015에 관해서 상기 저자에 의해 보고된 41가지의 분류학적 시험 결과는 다음과 같다.
Figure kpo00003
이 미생물은 23가지의 중요 즉 그룹[윌리암즈, 에스. 티.(Williams, S. T.)등 (1983), J. Gen. Microbiol 129, 제1815-1830 페이지 참조]중의 어떠한 것 또는 윌리암즈 및 그의 공동 연구자의 [J. Gen. Microbiol(1983), 129, 제1743-1813 페이지 참조]에 의해서 정의된 소규모 종 그룹 및 단일 성분의 집락체 중 어느 것에도 속하지 않는 것으로 동정되었다. 스트렙토마이세스 써모아르카엔시스 NCIB 12015의 특성을 또한 베르기(Bergey)의 Manual of Determinative Bacteriology(제8판), 실링(Shirling) 및 고틀리에(Gottlieb)의 ISP보고서[Int. J. Syst. Bacteriol. (1968)제18권, 제69-189페이지, Int. J. Syst. Bacteriol. (1968) 18권, 279-392페이지, Int. J. Syst. Bacteriol. (1969)제19권, 제391-512페이지, Int. J. Syst. Bacteriol. (1972)제22권, 제265-394페이지]에 기재된 공지 스트렙토마이세스 종에 관한 기재 내용 및 1980년 이후 International Joural of Systematic Bacteriology에 기재된 신규 종들과 비교했다.
스트렙토마이세스 써모아르카엔시스 NCIB 12015와 공지된 종사이에 아무런 일치점이 없었으며, 이를 근거로 해서 본 발명자들은 스트렙토마이세스 써모아르카엔시스 NCIB 12015가 스트렙토마이세스에 속하는 신규한 종 중 최초로 알려진 것으로 생각한다.
돌연변이 균주 NCIB 12111, 12112, 12113 및 12114는 모두 스트렙토마이세스 써모아르카엔시스와 실질적으로 유사한 본질적 특성을 갖는다. 그러나, NCIB 12111는 성장을 위해 아데닌을 필요로 하며, NCIB 12112는 성장을 위해 세린을 필요로하고, NCIB 12113은 성장을 위해서 히스티딘을 필요로하며, NCIB 12114는 스트렙토마이신에 대해서 내성을 갖는다.
적합한 스트렙토마이세스속 미생물의 발효에 의한 항생 물질 S541의 제조는 종래의 방법, 예를들면 탄소, 질소 및 무기염 등의 동화가능한 공급원 존재하에서 스트렙토마이세스속 미생물을 배양시키는 방법으로 행할 수 있다.
탄소, 질소 및 무기물 등의 동화가능한 공급원은 단순 또는 복합 영양제 물질로부터 제공될 수 있다. 탄소원은 일반적으로 글루코오스, 말토오스, 전분, 글리세롤, 당밀, 덱스트린, 락토오스, 수크로오스, 프락토오스, 카르복실산, 아미노산, 글리세라이드, 알코올, 알칸 및 식물성 오일이 포함된다. 탄소원은 일반적으로 발효 배지 중량에 대해서 0.5 내지 10중량%로 구성된다.
질소원은 일반적으로 콩가루, 옥수수로 담근 주류, 증류액, 이스트 추출액, 면실가루, 펩톤, 분쇄한 땅콩가루, 맥아 추출액, 당밀, 카제인, 아미노산 혼합물, 암모니아(가스 또는 용액), 암모늄염 또는 질산염이 포함된다. 우레아 및 기타 아미드가 또한 사용될 수 있다. 질소원을 일반적으로 발효 배지의 중량에 대해서 0.1 내지 10중량%로 사용한다.
배양 배지에 혼합시킬 수 있는 무기 영양 염류는 일반적으로 나트륨, 칼륨, 암모늄, 철, 마그네슘, 아연, 니켈, 코발트, 망간, 바나듐, 크롬, 칼슘, 구리, 몰리브덴, 보론, 인산염, 황산염, 염소 및 탄산염 이온이 포함된다.
소포제는 과량의 발포를 제어하기 위해서 사용하며, 요구되는 시간 간격으로 첨가한다.
스트렙토마이세스속 미생물의 배양은 일반적으로 20°-50℃, 적합하기로는 25°-40℃, 특히 적합하기로는 약 34℃에서 행하고, 흔들어 주거나 또는 교반시킴으로써 통기 또는 진탕시켜 주는 것이 적합하다. 배지는 포자가 형성된 미생물의 현탁액 소량을 초기에 접종시킬 수 있으나, 미생물의 영양 접종물의 성장 지체기를 피하기 위해서, 소량의 배지를 미생물 포자형과 접종시켜서 제조할 수 있고, 이와같이 하여 얻어진 영양 접종물을 발효 배지로 옮기거나 또는, 더욱 적합하기로는 주 발효 배지로 옮기기 전에 더 성장이 일어나는 1가지 이상의 종자 배양 단계로 옮기는 것이 좋다. 발효는 일반적으로 pH 5.5 내지 8.5, 적합하기로는 5.5 내지 7.5에서 행한다.
발효는 2-10일 동안, 예를들면 약 5일 동안 행한다.
항생물질 S541 및 그의 성분들 또는 인자들을 함유하는 물질을 전체 발효액으로부터 분리시키는 것이 요구되거나, 또는 성분 또는 인자들을 단리시키는 것이 요구되는 경우에, 이것은 종래의 단리 및 분리법을 사용해서 행할 수 있다. 본 발명에 의한 항생물질 S541은 주로 세포의 균사체 중에 함유되어 있으나, 발효액중에서도 또한 발견될 수 있고, 정징화(淸澄化)시키기 전 또는 후에 발효액에 대해 단리방법을 응용할 수 있다. 단리 방법의 선택은 널리 변화될 수 있다.
항생물질 S541은 여러가지 분별법, 예를들면 흡착-용출법, 침전법, 분별 결정법 및 용매 추출법을 여러 가지로 혼용해서 단리 및 분리시킬 수 있다.
용매 추출, 크로마토그래피, 분별 결정법이 본 발명의 화합물을 단리 및 분리시키는 데 가장 적합한 방법인 것으로 발견되었다.
발효시킨 다음에, 균사체를 통상적인 방법, 예를들면 여과 또는 원심분리를 사용해서 수확할 수 있다. 그 후에, 예를들면, 물질을 적당한 유기 용매, 예를들면 케톤(아세톤, 메틸 에틸케톤 또는 메틸이소부틸 케톤), 탄화수소(헥산), 할로겐화 탄화수소(클로로포름, 사염화탄소 또는 염화메틸렌), 알코올(메탄올 또는 에탄올), 디올(프로판 1,2-디올) 또는 에스테르(메틸 아세테이트 또는 에틸 아세테이트)를 사용해서 균사체로부터 추출시킬 수 있다. 균사체가 충분한 양의 물을 함유할 경우에는, 수용성 용매를 사용하는 것이 적합하다.
일반적으로, 최적 회수율을 얻기 위해서 1회 이상의 추출을 행하는 것이 적합하다. 최초 추출은 수혼화성 용매(예, 메탄올 또는 아세톤)을 사용해서 행하는 것이 적합하다. 항행물질은 용매를 제거함으로써 조 추출물로서 회수할 수 있다. 용매 추출액은 필요에 따라서, 예를들면, 용매를 증발시켜 감량시킨 후, 그 자체로 추출할 수 있다. 이 단계에서, 수불혼화성 요매(예, 헥산, 클로로포름, 염화메틸렌 또는 에틸 아세테이트 또는 그 혼합물)을 사용하는 것이 적합하며, 항생물질 화합물을 만족할 정도로 분할시키기 위해서 충분한 양의 물을 첨가한다. 수불혼화성 상을 제거해서 항생물질 S541을 함유하는 물질을 얻었다. 필요에 따라서, 인자 B는 적합한 용매(예, 이소프로판올)로부터 결정화시켜서 분리시킬 수 있다.
유효성분들 및(또는) 인자들을 완전하게 또는 존재하는 기타 마크로리드 화합물로부터 정제 및(또는) 분리시키는 것은 통상적인 방법, 예를들면 실리카, 비(非)기능성 거대 망상형 흡착 수지[예를들면, 가교 폴리스티렌 수지(예, Amberlite XAD-2, XAD-4 또는 XAD-1180수지(Rohm ＆ Haas Ltd.)], 또는 S112수지(Kastell Ltd.)와 같은 적합한 지지체 상에서, 또는 유기 용매-혼화성 가교된 덱스트린[예, Sephadex LH 20(Pharmacia UK Ltd.)], 또는 고성능 애체 크로마토그래피의 경우에는 역상 지지체[예, 탄화수소-결합 실리카(예, C18-결합 실리카)]를 지지체로 하는 크로마토그래피(고성능 액체 크로마토그래피 포함)을 사용해서 행할 수 있다. 지지체는 베드(bed)형, 더욱 적합하기로는 컬럼에 충전시켜서 사용할 수 있다. 비기능성 거대 망상형 수지(예, XAD-1180 또는 S112)의 경우에, 아세토니트릴과 같은 유기 용매와 물과의 혼합물의 용출제로 사용할 수 있다.
적합한 용매 중에 용해시킨 화합물의 용액은, 필요에 따라서 먼저 용매의 부피를 감량시킨후, 일반적으로 실리카 또는 Sephadex컬럼에 장전한다. 컬럼을 임의로 세척하고, 이어서, 적합한 극성 용매를 사용해서 용출시킨다. Sephadex 및 실리카의 경우에, 알코올(예, 메탄올), 탄화수소(예, 헥산), 아세토니트릴, 할로겐화 탄화수소(예, 클로로포름 또는 염화메틸렌), 또는 에스테르(예, 에틸 아세테이트)를 용매로서 사용할 수 있다. 이 용매들은 단독으로, 또는 물과 혼합시켜서 사용할 수도 있다.
본 발명의 화합물의 용출 및 분리/정제는 통상적인 방법, 예를들면, 크로마토그래피(예, 박층 크로마토그래피 및 고성능 액체 크로마토그래피)시켜서 측정하거나, 또는 상기 화합물의 특성들을 이용해서 측정할 수 있다.
실리카, 적합하기로는 용출제로서 예를들면 클로로포름: 에틸 아세테이트를 사용해서 크로마토그래피시키면, 항생물질 S541을 성분 I 및 Ⅱ로 쉽게 분리시킬 수 있는데, 여기에서 성분 I이 먼저 용출된다. 이어서, 인자 B, E 및 F는 크로마토그래피(예, 고성능 액체 크로마토그래피)를 이용해서 성분 I로 부터 쉽게 얻을 수 있다. 이와 유사한 방법으로, 인자 A,C 및 D는 성분 Ⅱ로부터 쉽게 단리시킬 수 있다. 다른 방법으로, 인자 B는 알코올(예, 메탄올 또는 이소-프로판올)을 사용해서 결정화시켜서 인자 E 및 F로부터 분리시킬 수 있다. 필요에 따라서, 인자 E 및 F를 함유하는 모액을 실리카 상에서 크로마토그래피시키는 것과 같이 더 정제시키고, 인자 E 및 F는 고성능 액체 크로마토그래피를 사용해서 단리시킬 수 있다. 이와같이 하여 얻어진 인자들을 예를들면 메탄올, 이소프로판올, 또는 메탄올/물 혼합물을 사용해서 결정화시켜서 더 정제시킬 수 있고, 본 발명은 결정형의 본 발명에 의한 화합물을 포함한다.
상기 방법을 적합하게 병용해서, 본 발명에 의한 화합물을 고상물로 단리시킬 수 있다. 상기 정제 단계들을 행하는 순서와 이 정제 단계들의 선택은 널리 변화시킬 수 있다.
그러므로, 인자 B는 90%이상의 순도를 갖는 결정형 고상물로 얻었다. 이와 유사하게, 인자 A,C,D,E 및 F도 90%이상의 순도로서 얻었다. 그러나, 이 인자들은 상기한 바와 같이, 그의 용도에 적합한 순도로 사용될 수 있다. 인체 의약품에 사용하기 위해서는, 90%이상의 순도, 적합하기로는 95%초과의 순도가 좋다. 수의 또는 농업 또는 원예용에 사용하기 위해서는, 저 순도(예, 50%이하)로도 충분하다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해서 더욱 구체적으로 설명한다. 이 실시예에서, 다음과 같은 약자를 사용했다. tlc-박층 크로마토그래피(달리 기재하지 않는 한, Merck 5735실리카 60플레이트를 이용하고, ChCL3: 에틸 아세테이트(3: 1)로 전개), CCM-컬럼 크로마토그래피[Merck 7734실리카 60 충전(달리 기재하지않는한, 200×4cm 컬럼을 사용함), 용출제로서 CHCL3: 에틸아세테이트(3 :1)을 사용함], hplc-고성능 액체 크로마토그래피, PE-석유 에테르(달리 기재하지 않는 한, 비점 : 60°-80℃의 것을 사용), L-리터, EA-에틸 아세테이트.
실시예에 기재된 배지 A,B 및 C는 다음과 같다.
Figure kpo00004
PH는 자동 멸균시키기 전에, NaOH수용액을 사용해서 pH 7.0으로 조절시켰다.
Figure kpo00005
PH는 자동 멸균 시키기 전에, 5N NaOH를 사용해서 pH 6.5로 조절시켰다.
Figure kpo00006
PH는 멸균시키기 전에, pH 6.5로 조절시켰다.
[실시예 1]
스트렙토마아세스 서모아르카엔시스 NCIB 12015의 표자를 다음 성분으로 이루어진 한천 사면판에 접종시켰다.
Figure kpo00007
pH는 약 5.4로 조절했다.
28℃에서 10일 동안 배양시켰다. 이어서, 성장된 사면판을 10% 글리세롤 용액 6ml로 덮고, 멸균 도구를 사용해서 긁어서 포자 및 균사체를 흩어지게 하였다. 생성된 포자 현탁액의 분취량 0.4ml를 멸균 폴리프로필렌 스트로우에 옮기고, 이것을 가열, 밀봉시키고, 필요할 때까지 액체 질소 증기 중에서 저장했다.
단일 스트로우의 내용물을 사용해서 배지 A 10ml를 접종시키고, 이어서 이것을 직경 50ml의 궤도 운동을 하면서 240rpm으로 회전하는 진탕기 중에서 28℃에서 3일 동안 배양시켰다. 배양시킨 이 배양물을 사용해서, 배지 B를 각각 10ml 및 50ml함유하는 15개의 튜우브 및 2개의 250ml용 엘렌마이어 플라스크 중에서 2%농도로 접종시켰다.
이 튜우브 및 플라스크에 넣은 배지를 28℃에서 5일 동안 성장시키고, 이어서 이 배양물을 진공 하에서 분리해서 여과시키고, 세포를 배양 여액과 동일한 양의 메탄올을 첨가해서 30분 동안 진탕시켰다.
캐노르합디티스 엘레간스(Caenorhabditis elegans)에 대한 활성을 튜우브 및 플라스크 중에서 성장시킨 세포 추출액 중에서 검사하고, 이 추출물을 증량시켜서, 증발, 건조시킨 후, 메탄올을 사용해서 재 추출시켜서 농축물(6ml)을 얻고, 이 농축물을 Sephadex LH20으로 충전된 컬럼(110×2.5cm)을 사용해서 메탄올로 용출시켰다. 이어서, 분획물 10ml를 모았다.
분획물 21-28을 모아, 증발시켜서 유성 잔류물 156mg을 얻고, 이것을 CHC3: EA(3 : 1)을 사용하며 추출시켜서 추출물 3ml를 얻고, 이 추출물을 CCM(55×2.5cm 컬럼)으로 크로마토그래피시켜서 분획물 10ml를 모으고, 형광 지지제를 함유하는 플레이트를 사용해서 tlc시켜서 분석했다. 분획물 20 내지 23 및 분(Rf 0.43)로 동정되었다. 분획물 20-23을 증발시켜서 고상물로서 성분 I(9mg)을 얻었다. λmax 238nm, E1 1340 ; λmax 245nm, E1 1350 ; 및 λmax 254nm, E1 1200. 분획물 36 내지 44를 증발시켜서 고상물로서 성분 Ⅱ(11mg)을 얻었다. λmax 238nm, E1 1440 ; λmax 245nm, E1 1460 ; 및 λmax 254nm, E1 1280.
[실시예 2]
배지 A 50ml를 넣은 2개의 250ml용 엘렌마이어 플라스크 각각을 실시예 1에 기재된 방법으로 제조한 스트로우로부터 취한 스트렙토마이세스 써모아르카엔시스 NCIB 12015의 포자 현탁액 0.2ml로 접종시켰다. 이 플라스크를 직경 50ml의 궤도 운동을 하면서 250rpm으로 회전하는 진탕기 중에서 28℃에서 3일 동안 배양시키고, 이어서 양쪽 플라스크의 내용물을 사용해서 배지 B 12L를 함유하는 20L 발효 용기를 접종시켰다. 이 배양물을 5일 동안 성장시킨 후 수확해서 실시예 3에 기재된 방법으로 처리했다.
[실시예 3]
실시예 2에 기재된 방법으로 얻은 발효 브로쓰 12L를 28℃에서 5일 동안 성장시킨 후 수확하고, 원심분리(4,200rpm, 10℃에서 15분 동안)시켰다. 세포 펠렛을 메탄올 5L와 혼합시키고, 4℃에서 20시간 동안 방치시켰다. 균사체 추출액을 여과시키고, 40℃에서 증발시킨 후, 이어서 여기에 부탄-1-올 100ml를 첨가한 후에 공비 증류시켰다. 이어서, 이 추출액을 메탄올(200ml×5회)로 처리하고, 합한 추출액을 증발시켜 100ml로 만들고, Sephadex LH20 컬럼(112×5cm)에 가하였다. 이 컬럼을 메탄올로 용출시키고, 처음에 200ml를 분획시킨후에, 분획물 50ml를 모았다. 분획물 40-90을 합하고, 증발시켜서 유성 잔류물 3.85g을 얻었다. 이 잔류물을 CHC3: EA(3.1) 77ml를 사용해서 추출시키고, 이어서 여과시킨후, CCM시켜, 처음에 200ml를 분획시킨후에, 분획물 약 15ml를 모았다.
성분 I를 함유하는 분획물 124 내지 142를 모으고, 증발시켜서 고상물 253mg을 얻고, 이중 216mg을 hplc(Zorbdx ODS, 25×2.1cm, 80% CH3CN/H2O)로 정제시켰다. 성분 Ⅱ를 함유하는 분획물 250 내지 320을 합하고, 증발시켜서 고상물 602mg을 얻고, 이중 540mg을 hplc(상기 분획물 124-142의 경우와 동일)시키고, 이를 수차례 행하여 분획물을 모았다.
hplc 컬럼으로부터 용출시킨 물질을 243nm에서 uv분광 검사법으로 감시했다. 이 파장에서 흡수되는 피이크를 건조시키고, i) 캐노르합디티스 엘레간스에 대한 활성을 시험하고, ⅱ) tlc에 의해서 분석했다. 캐노르합디티스 엘레간스에 대해서 활성인 4개의 피이크는 또한 0.30 내지 0.46, 또는 0.70 내지 0.75의 R 값을 가졌다.
성분 I은 R 값이 0.70 내지 0.75인 1개 피이크를 나타내고, 이 피이크를 인자 B로 명명하였다. 성분 Ⅱ는 R 값이 0.39 내지 0.46인 3개의 피이크를 나타내고, 이들 피이크를 인자 A,C 및 D로 명명하였다.
인자 A는 샘플을 주입한 후에 hplc 컬럼으로부터 260 내지 340ml로 용출되었고, tlc에 의한 Rf 값, 0.44를 가졌다. 인자 B는 샘플을 주입한 후에 hplc 컬럼으로부터 270 내지 310ml로 용출되었고, tlc에 의해서 Rf 값 0.72를 가졌다. 인자 C는 샘플을 주입한 후에 hplc 컬럼으로부터 160 내지 180ml로 용출되었고, tlc에 의한 Rf 값 0.4를 가졌다. 인자 D는 샘플을 주입한 후에 hplc 컬럼으로부터 220 내지 250ml로 용출되었고, tlc에 의해서 Rf 값 0.42를 가졌다. 인자 A,B,C 및 D의 추가 특성들을 이후에 기재하였다.
[실시예 4]
실시예 1에 기재된 방법으로 제조한 스트로우로부터 얻은 스트렙토마이세스 써모아르카엔시스 NCIB 12015 미생물의 포자 현탁액 0.4ml을 사용해서 배지 50ml를 넣은 250ml용 엘렌마이어 플라스크내에 접종시켰다. 이 플라스크를 직경 50mm의 궤도 운동을 하면서 250rpm로 회전하는 진탕기 중에서 28℃에서 4일 동안 배양시켰다. 이어서, 분취량 8ml를 사용해서, 동일한 조건하에서 3일 동안 배양시키기 전에, 동일한 배지를 400ml씩 넣은 바닥이 평평한 2개의 2L용 플라스크 각각에 접종시켰다.
이어서, 두 플라스크의 내용물을 실리콘(Sillcone) 525[다우-코닝사 제품, 0.0625%(v/v)]로 보충시킨 배지 B 40 L를 함유하는 70L용 발효 용기 중에 접종시켰다. 발효는 산소 용해 농도를 포화 농도의 20% 이상으로 유지시키기 위해 충분한 교반 및 통기를 하면서 행하고, 필요한 만큼 실리콘 소포제를 첨가해서 행하였다. 10일 후, 발효액을 수확하고, 발효액 40L를 원심분리기(15000rpm)를 사용해서 청징하였다. 잔류 상징액을 물 5L로 대체시키고, 회수된 세포 1.4kg을 -20℃에서 냉동시켰다.
1주일 후, 냉동 세포를 해동시켜서, 메탄올 15L 중에 현탁시키고, 15시간 동안 온화하게 교반시켰다. 이어서, 현탁액을 여과하고, 고상 잔류물을 메탄올 10L를 사용해서 재추출시켰다. 합한 여액 25L를 물 12L를 사용해서 희석시키고, PE 25L로 추출시켰다. 이어서, 30분 후, 원심분리에 의해서 상들을 분리시켰다.
제부 메탄올 상을 PE(25L, 15L 및 15L)를 사용해서 3회 재추출시켰다. 합한 PE상 80L를 Pfaudler 8.8-12v-27 와이프시킨-필름 증발기[중기압 약 0.1기압(0.1bar), 증기 온도 20℃, 스팀 온도 127℃]를 3회 통과시켜서 농축시키고, 농축물 8L를 황산나트륨 1kg을 사용해서 건조시킨 후, 40℃, 회전 필름 증발기중에서 감압 하에 더 농축시켰다. 유성 잔류물 15ml를 CHCl3및 EA(70ml, 3 : 1 v/v)의 혼합물 중에 용해시키고, CCM 시켜서 처음에 1400ml를 분획시킨 후 40ml의 분획물들을 모았다.
분획물 45-65를 합하고, 증발시켜서, 인자 B(실시예 3에서 정의된 바와 같음)940mg을 얻고, 이것을 처음에는 메탄올을 사용하고, 최종적으로 니트로메탄을 사용해서 2회 결정화시켰다. 이 결정은 단결정 X-선회절 분석법으로 분석한 결과, 사방 정계에 속하고, 격자 상수가 a=10.171(3), b=(13.317(5), c=25.032(7) Å이며 격자부피가 v=3391Å3, z=4이고, 공간군 p2 1 2 1 2이고, Dc=1.18g㎝-3, Cu-Kα방사선(λ=1.54178Å)으로 회전계로 측정한 2169개의 독립적으로 관찰된 회절(θ≤58°)에 대한 R=0.053인 투명한 프리즘이었다. X선 결정법으로 측정한 구조를 제5도에 나타냈다.
[실시예 5]
스트렙토마이세스 써모아르카엔시스 NCIB 12015의 접종물을 성장 기간을 2일로 해서, 실시예 4에 기재된 방법으로 제조하고, 실리콘 525 대신에 폴리프로필렌 2000(0.06% v/v)로 보충시킨 배지 B 40L를 함유하는 70L용 발효 용기 중에서 접종시켰다. 이어서, 폴리프로필렌 2000을 기포 발생을 제어하기 위해서 전발효 공정에 걸쳐서 필요량 첨가했다. 발효는 용해 산소 농도가 포화 농도 30%이상을 유지시키기에 충분한 정도로 교반 및 통기시켰다. 24시간 동안 발효시킨 후, 발효액 중 일부량 9L를 다음과 같은 성분으로 되는 배지 450L를 함유하는 700L용 발효 용기에 옮겼다.
Figure kpo00008
발효는 용해 산소 농도를 포화농도 20% 이상으로 유지시키기 위해서 충분할 정도로 교반 및 통기시키면서 28℃에서 행했다. 여기에 소포제 폴리프로필렌 2000을 필요량 첨가했다. 2일 후, pH를 H2SO4를 첨가해서 7.2로 조절했다. 발효물은 5일후 수확했다.
발효액 450L를 원심분리시켜서 청정시키고, 잔류 상층액을 물 20L로 대체시켰다. 회수된 세포 25.5kg을 총 부피를 75L로 만들기에 충분한 양의 메탄올 중에서 1시간 동안 교반시켰다. 이 현탁액을 여과하고, 고상 잔류물을 메탄올 35L를 사용해서 재추출시키고, 여과시켰다. 합한 여액 87L를 물 40L를 사용해서 희석시키고, PE를 사용해서 추출시켰다. 30분 후, 원심분리시켜서 상을 분리시키고, 저부 메탄올 상을 물 40L를 첨가한 후에 PE 30L를 사용해서 재추출시켰다. 분리시킨후, 저부 상을 PE 30L로 재추출시켰다. 합한 PE층 85L를 Pfandler 8,8-12v 와이프시킨-필름 증발기[증기압 0.1기압(0.1bar), 증기 온도 20℃, 스팀 온도 127℃]를 3회 통과시켜서 농축시켰다. 농축물 9L를 황산나트륨 2kg을 사용해서 건조시키고, 40℃에서 회전 필름 증발기 중에서 감압하에 더욱 농축시켰다. 유성 잔류물 130g을 CHCl3중에서 용해시켜서 총부피를 190ml로 하고, 이 용액을 CCM(컬럼을 충전시키고 CHCl3500ml 중에 세척했음)시켜서, 처음에 1400ml를 분획시킨 후, 약 40ml의 분획물들을 모았다.
분획물 32-46를 합하고, 증발시켜서 오일 21.2g을 얻었다. 분획물 47-93을 합하고, 증발시켜서 오일 20.1g을 얻고, 이것을 CHCl3: EA(3 : 1)중에서 50ml까지 용해시킨 후, CCM시켜서, 처음에 1400ml를 분획시킨후, 약 40ml의 분획물들을 수집하였다. 분획물 22-36을 합하고, 증발시켜서 오일 3.1g을 얻고, 이것을 최초 컬럼을 분획물 32-46으로부터 얻은 오일에 첨가했다. 합친 오일을 비등하는 메탄올 4ml중에 용해시키고, 이어서 이것을 가온시킨 프로판-2-올20ml에 첨가해서, 방치후 결정질 인자 B 2.57g을 얻었다.
인자 B를 결정하시킨 후, 모액을 증발시켜 오일을 얻고, 이것을 동량의 CH2Cl2중에서 Merck Kieslgel 60(70-230 메쉬 ASTM, Art. No. 7734)로 채워진 컬럼(30×2.2cm)에 충전했다. 베드(bed)를 CH2Cl2(베드 용적의 2배)를 사용해서 세척하고, CHCl3: EA(3 : 1) (베드 용적의 2배)을 사용해서 용출시켰다. 용출물을 증발시켜서 오일을 얻고, 이 오일을 메탄올 중에서 용해시키고, Spherisorb S5 ODS-2(250mm×20mm,phase Sep. Ltd)로 예비 hplc시켰다. 샘플 5ml를 분에 걸쳐서 컬럼에 펌프로 주입시키고, 컬럼을 다음과 같은 조건하에서 용출제로서 아세토니트릴 : 물(7 : 3)을 사용해서 용출시켰다.
Figure kpo00009
hplc 컬럼으로부터 용출시킨 물질을 238nm에서 UV분광 검사법으로 확인했다. 26.3분에 용출되는 피이크를 갖는 분획물을 합하여 증발시켜서 고상물로서 인자 E를 얻었다. 36.4분에서 용출되는 피이크를 갖는 분획물을 합하여 증발시켜서 고상물로서 인자 F를 얻었다. 인자 E 및 F의 추가 특성들은 이후에 기재했다.
[실시예 6]
117시간 후 수확한 발효 브로쓰(실시예 2에서 제조된 것과 유사함)를 자동 멸균(121℃, 1시간)시키고, 실온으로 냉각시킨 후, 자기 교반기로 교반시켜서 균질한 세포 현탁액을 얻었다. 2개의 분취물(2ml)를 원심분리(12,000g, 2분, 실온)시켜서, 상층액을 따라내고, 잔류 세포를 물 2ml 중에 현탁시킨 후, 철저히 혼합시키고, 다시 원심분리(12,000g, 2분, 실온)시켰다. 상층액을 따라낸 후, 세포를 증류수(2ml)로 2회 이상 세척했다. 이어서, 세척한 세포를 물 2ml 또는 메탄올 2ml와 철저히 혼합시키고, 실온에서 때때로 진탕시키면서 1.5시간 동안 방치했다. 이 현탁액을 다시 원심분리(12,000g, 2분, 실온)시키고, 이어서 상층액을 물로 희석했다. 수성 현탁액으로부터 얻은 세포를 물 중에 다시 현탁시킨후, 즉시 물로 희석시켰다. 각 희석액의 분액(10㎕1)들을 Na2HPO4(6g/L), K2HPO4(3g/L), NaCl(5g/L) 및 MgSO4, 7H2O(0.25g/L)를 함유하는 완충액중의 캐노르합디티스 엘레간스 선충의 현탁액 200㎕1에 첨가하고, pH를 7.0으로 조절했다. 4시간 후, 선충 현탁액을 검사해서 피검 혼합물중 어느 희석액이 분석 현탁액 중에서 선충 운동성의 역제를 98% 이상으로 일으키는 가를 시험했다. 그리하여, 본 발명자들은 피검 혼합물 : 메탄올 추출액 1 : 5, 1 : 25, 1 : 250, 1 : 500, 피검 화합물 : 세포 현탁액 1 :5, 1 : 25, 1 : 250, 1 : 500 및 1 : 1000 및 피검 화합물 : 수성 추출액의 희석액 1 : 2, 1 : 4 및 1 : 8의 희석액 10㎕1를 선충 현탁액 200㎕1에 첨가했을때 선충이 98% 이상 억제되는 것을 발견했다.
[실시예 7]
배지 A 50ml 또는 배지 B 50ml를 함유하는 250ml용 엘렌마이어 플라스크를 실시예 1에서 기재한 방법으로 제조한 스트로우로부터 얻은 스트렙토마이세스 써모아르카엔시스 NCIB 12015의 포자 현탁액 0.4ml로 접종시켰다. 배지 A 또는 배지 B를 함유하는 플라스크를 직경 50mm의 궤도 운동을 하면서 250 회전/분으로 작동하는 회전 진탕기 중에서 28℃에서 2일 동안 배양시켰다. 이어서, 각 배지로부터 분획물(8ml)들을 취해서 동일한 배지(각각 A 또는 B) 400ml를 넣은 바닥이 평평한 2L 용 플라스크 중에서 접종시켰다. 이 플라스크를 같은 조건하에서 2일 동안 배양시켰다.
2개의 70L용 발효기 각각을 배지 A의 플라스크 2개로 접종시키고, 다른 70L용 발효기를 배지 B의 플라스크 2개로 접종시켰다. 각 발효기에는 배지 C 40L를 함유시켰다.
발효는 산소 용해 농도를 포화 농도의 30% 이상으로 유지하기에 충분할 정도로 교반 및 통기시키면서 34℃에서 행했다. 약 24시간 동안 발효시킨 후, 여기에 H2SO4수용액을 첨가해서 pH를 7.2로 조절시켰다. 소포제 폴리프로필렌 글리콜 2000을 필요량 첨가했다. 5일 후, 이 발효물을 수확해서 증량시켰다.
또 다른 70L용 발효기(이것 또한 배지 B를 넣은 2개의 플라스크로 접종되어 있음)에 실리콘 1520(0.06%)으로 보충시킨 배지 B를 넣었다. 발효는 산소 용해 농도를 포화 농도의 30% 이상으로 유지하기에 충분할 정도로 교반 및 통기시키면서 28℃에서 행했다. 폴리프로필렌 글리콜 2000을 발포를 제어하기 위해서 필요량 첨가했다. 24시간 후, 분취량 9L를 배지 C 450L를 함유하는 700L용 발효기에 옮겼다.
발효는 산소 용해 농도를 포화 농도의 30% 이상으로 유지하기에 충분할 정도로 교반 및 통기시키면서 34℃에서 행했다. 폴리프로필렌 글리콜 2000을 첨가해서 발포를 제어했으며, 약 24시간후, H2SO4수용액을 첨가해서 pH를 7.2로 조절시켰다. 4일 후, 발효물을 수거하고, 3개의 상기 발효액 40L를 사용해서 증량시켰다.
증량시킨 수확한 발효 브로쓰를 약 12L/h에서 Sharples AS16PY에 통과시켜 원심분리시켰다. 이어서, 원심분리 용기 중의 잔류 상층액을 물로 대체시켰다.
회수된 세포 11.65kg을 Silverson 혼합기를 사용해서 메탄올 33L 중에서 에멀전화시켰다. 60분 후, 이 현탁액을 능직천을 통과시켜서 여과하고, 잔류물을 다시 한번 메탄올 34L 중에서 에멜전화시켰다. 40분 후, 현탁액을 다시 여과시켰다. 2개의 메탄올 추출액으로부터 얻은 여액을 합했다.
합친 추출액 53.5L를 물 27L 및 PE 27L와 혼합시켰다. 이어서, 이 혼합물을 20분 동안 교반시킨 후, 2개의 상을 Westfalia MEM 1256 원심분리기를 이용해서 분리시켰다. 저부 메탄올 수용액상 70L를 물 37L 및 PE 27L와 혼합해서 교반시킨 후, 전과 같은 방법으로 분리시켰다. PE상 중의 계면 에멀젼을 아세톤 4L를 첨가해서 제거시켰다. 이어서, 저부 메탄올 수용액상 108L를 물 40L 및 PE 27L와 1/3시간 동안 혼합시키고, 교반시킨 후, 전과 같은 방법으로 분리시키고, 이어서, 아세톤 4L를 사용해서 계면 에멜젼을 제거시켰다. 이어서, 3개의 헥산 추출액을 합했다.
합친 PE 추출액 85L를 와이프시킨 플림 증발기(증기압 약 0.15바아, 증기 온도 26℃)를 사용해서 농축시켰다. 이 농축물 3L를 황산나트륨 2kg을 사용해서 건조시키고, 이어서 40℃, 감압하에서 더 증발시켰다.
결과적인 오일 639g을 클로로포름 및 EA (3 : 1 v/v)의 혼합물 300ml중에 용해시키고, 여과시킨 후, 유리섬유지를 통과시켜 세척했다. 여액 및 세척액 1060ml를 유속 6L/h로 용출시키면서 CCM(1500mm×100mm직경)으로 처리했다.
8.8L와 13.1L 사이에서 용출되는 용출물은 증량시킨 후 저압하에서 증발시켜서 오일 56.3g을 얻은 한편, 13.1L와 24.6L 사이에서 용출되는 용출물은 저압 하에서 유사하게 농축시켜서 담황색 고상물 153.4g을 얻었다. 전자의 분획물은 주로 인자 B를 함유하는 반면에, 후자의 분획물은 인자 A,B,C 및 D의 혼합물을 함유하는 것으로 밝혀졌다. 이 후자의 분획물 중의 인자 B는 유속을 3L/h로 감소시킨 점을 제외하고는, 상기한 것과 유사한 조건 하에서 상기의 CCM을 2회 반복해서 점진적으로 제거시켰으며, 이때 2회 째에는 새로운 실리카를 사용해서 행했다.
이들 컬럼 중 제2컬럼으로부터 얻은 인자 A,C 및 D를 함유하는 피이크는 8.8L와 17.6L사이에서 용출되었으며, 제2컬럼에 잔류하는 인자 B는 제3컬럼에서 분리되고, 이 제3컬럼에서는 인자 A,C 및 D가 14L와 28L 사이에서 용출되었다. 최종적으로 증량시킨 용출물을 저압 하에서 농축시켜서 고상물 114g을 얻었다. 2개의 컬럼(각각 7.5-8.8L 및 10.3-13.4L)으로부터 얻어지는 인자 B를 함유하는 피이크를 증발시켜서 오일(각각 10.7g 및 10g)을 얻고, 이것을 3개의 컬럼 중 제1컬럼으로부터 얻은 오일과 합했다.
인자 B를 함유하는 오일을 비등 메탄올 25ml중에 용해시키고, 비등 프로판-2-올 100ml와 혼합시켰다. 이어서, 4℃로 냉각시켜서, 인자 B를 결정화시켰다. 이것을 여과시켜 분리하고, 메탄올 200ml로 세척시킨 후, -20℃로 냉각시키고, 진공 하에서 건조시켜서 인자 B를 25.3g얻었다.
인자 A,C 및 D를 함유하는 제3실리카 컬럼으로부터 얻은 고상물을 진공하에서 건조시켜서 일정 중량 87g으로 만들었다. 이 고상물의 샘플(20g)들을 메탄올 190ml중에 용해시키고, 여기에 아세토니트릴 : 물[7 : 3 (v/v)]을 첨가해서 230ml로 만들었다. 이어서, 이 용액의 분취량 5ml를 용출제로서 아세토니트릴 : 물[7 :3 (v/v)]을 사용하는 Spherisorb ODS-2(입자 직경 5㎛) 컬럼(지경 250mm×21.2mm)에서 크로마토그래피시켰다. 유속을 약 10초 동안 20ml/분으로 유지시키고, 이어서 22분간에 걸쳐서 34ml/분으로 일정하게 증가시킨 후, 이 유속으로 3분 동안 더 유지시켰다. 이어서, 용출 인자들을 238nm에서 검출했다. 인자 C는 11.0 내지 13.4분에서 용출되었고, 인자 D는 13.4 내지 17.4분, 그리고 인자 A는 17.4 내지 23.0분에서 용출되었다.
각 크로마토그래피 분리물로부터 얻은 인자 C를 함유하는 분획물을 증량시키고, 저압에서 감량시켜서 고상물로 얻었다. 인자 A를 함유하는 분획물로 유사하게 감량시켜서 고상물로 얻었다. 인자 D를 함유하는 분획물을 또한 증량시킨 후, 감량시켜서 불순물에 섞인 고상물 7g을 얻었다. 이것을 메탄올 65ml중에 다시 용해시키고, 아세토니트릴 : 물(7 : 3)과 혼합하고, 유속을 20ml/분으로 일정하게 유지시킨 것을 제외하고는 상기와 같이 Spherisorb ODS2 컬럼으로 다시 크로마토그래피시켰다. 이때에, 인자 D는 16 내지 20분 사이에서 용출되었으며, 매회 크로마토그래피시킨 것으로부터 얻은 이 분획물을 증량시켰다. 증량시킨 용출물을 감량시켜서 고상물을 얻었다. 인자 A,C 및 D를 함유하는 3개의 고상물을 P2O5를 사용해서 진공 하에서 건조시켜서 일정 중량(각각 55g, 7.0g 및 1.21g)을 얻었다.
이와 같은 방법으로 단리시킨 4개의 고상물은 각각 인자 A,B,C 및 D의 신뢰할만한 샘플들과 유사한 것으로 밝혀졌다.
[실시예 8]
배지 B 50ml를 함유하는 250ml용 엘렌마이어 플라스크를 실시예 1에서 기재된 방법으로 제조한 스트로우로부터 취한 스트렙토마이세스 써모아르카엔시스 NCIB 12111, 12112, 12113 및 12114 각각의 포자 현탁액 0.5ml로 접종시켰다.
스트렙토마이세스 써모아르카엔시스 NCIB 12111, NCIB 12112 및 NCIB 12113을 넣은 플라스크를 31℃에서 회전 진탕기 중에서 배양시켰다. 스트렙토마이세스 써모아르카엔시스 NCIB 12114를 넣은 플라스크를 28℃에서 2일 동안 배양시키고, 이어서 배양액 1ml를 배지 B 50ml를 넣은 또 다른 250ml용 엘렌마이어 플라스크에 옮겼다. 이 플라스크를 31℃에서 회전 진탕기를 사용해서 배양시켰다. 모든 플라스크는 직경 50mm의 궤도 운동을 하면서 250회전/분으로 회전하는 진탕기 중에서 진탕시켰다.
접종 4일 후, 각 샘플 배양액 10ml를 45분 동안 1250×g로 원심 분리시키고, 다음과 같이 처리했다. 상층액을 제거하고, 펠릿을 메탄올 10ml 중에 재현탁시켰다. 이 현탁액을 격렬하게 진탕시키고, 때때로 혼합시켜 주면서 1시간동안 방치했다. 이어서, 연탁액을 5분 동안 10000×g로 원심분리시키고, 상층액을 hplc(S5 ODS-2, 10cm×4.6mm, 70% CH3CN/0.1M NH4H2PO4)에 의해서 분석했다. 피이크는 246nm에서 확인되었다.
hplc에 의해서 분석한 결과, 각 경우에 있어서, 인자 A,B,C 및 D의 존재를나타냈다.
[실시예 9]
인자 A,B,C,D,E 및 F가 다음과 같은 특성을 갖는 것으로 발견되었다.
1) 이들은 탄소 수소 및 산소만을 함유한다.
2) 인자 A,B,C,D,E 및 F의 전자 충격(E.I.) 질량 분석에 의해서 다음과 같은 결과가 얻어졌다.
Figure kpo00010
고속 원자 충격(FAB) 질량 분석에 의해서 다음과 같은 결과가 얻어졌다.
Figure kpo00011
피일드 탈착(Field Desorption) 질량 분석 결과, 인자 E의 경우 M/Z 612M+, 그리고, 인자 F의 경우 M/Z 612M+가 얻어졌다. 정확한 질량 측정과 함께 인자 A의 E.I. 스펙트럼에 의해서 다음의 이온들이 얻어졌다.
612.37 C36H52O8; 466.31 C30H42O4; 448.30 C30H40O3; 425.23 C26H33O5; 354.22 C23H30O3; 297.22 C21H29O ; 278.11 C15H18O5; 247.17 C16H23O2; 219.18 C15H23O ; 95.05 C5H7O.
정확한 질량 측정으로 인자 B의 E.I. 스펙트럼에 의해서 다음에서 이온들이 얻어졌다.
598.35 C35H50O8; 438.28 C28H38O4; 420.26 C28H36O3; 314.19 C20H26O3; 248.14 C15H20O3; 151.08 C9H11O2.
정확한 질량 측정으로 인자 C의 E.I. 스펙트럼에 의해 다음에서 이온들이 얻어졌다.
584.34 C34H48O8; 566.33 C34H46O7; 438.28 C28H38O4
정확한 질량 측정으로 인자 D의 E.I. 스펙트럼에 의해서 다음에서 이온들이 얻어졌다.
598.35 C35H50O8; 452.29 C29H40O4; 434.28 C29H38O3
정확한 질량 측정으로 인자 E의 E.I. 이온화 방식(ionization mode)에 의해서 다음에서 이온들이 얻어졌다.
452.2908 C29H40O4
인자 F에 대한 이온은 다음과 같다.
466.3067 C30H24O4
3) 인자 A, B, C, D, E 및 F는 브로모포름(CHBr3)중에서 다음과 같은 피이크를 포함해서, 특징적인 IR 스펙트럼을 갖는다.
인자 A : 약 3510(OH), 1712(에스테르) 및 998cm-1(C-O)에서 피이크
인자 B : 약 3510(OH), 1710(에스테르) 및 996cm-1(C-O)에서 피이크
인자 C : 약 3510(OH), 1712(에스테르) 및 996cm-1(C-O)에서 피이크
인자 D : 약 3508(OH), 1711(에스테르) 및 996cm-1(C-O)에서 피이크
인자 E : 약 3500(OH), 1708(에스테르) 및 994cm-1(C-O)에서 피이크
인자 F : 약 3500(OH), 1708(에스테르) 및 997cm-1(C-O)에서 밴드
인자 A, B, C, D, E 및 F에 대한 총 스펙트럼은 각각 제1, 2, 3, 4, 6 및 7도에 나타낸다.
4) 인자 A, B, C, D, E 및 F는 메탄올 (c=0.002%)중에서 다음과 같은 uv 스펙트럼을 갖는다(여기에서, I=변곡점 및 M=최대값).
Figure kpo00012
상기 λmax 값들은 각 인자의 특성치가 되지만, E1 1값은 각 인자가 얻어졌을때 물질의 순도를 나타내는 것임을 유의해야 한다. 그러나, E1 1값들의 비율들은 화합물 그 자체의 특성치이다.
5) 중수소-클로로포름 중에서 각 인자 용액의 200MHz 양성자 nmr 스펙트럼은 대략 다음에 중심이 의치한 시그날[τ값, 괄호안에 다중도, 커플링 상수(Hz) 및 적분치를 표시함을 포함]한다.
Figure kpo00013
vi) 중수소-클로로포름 중에서 각 인자 용액의 노이즈 성분을 제거한 25.05MHz 탄소-13nmr 스펙트럼은 대략 다음에 위치한 피이크[δ값, 괄호 안에 이탈 공명(off-resonance) 스펙트럼 시그날의 다중도를 표시함]을 포함한다.
Figure kpo00014
* 다중도는 불확실함.
7) 인자 A, B, C 및 D(메탄올 중의 약 0.1% 용액)에 대한 원편광이색성 커브를 제8도에 나타냈다. 이 커브는 디엔 발색단의 흡수와 연관된 230 내지 260nm 영역에서 거의 유사하다. 이것은 4가지 인자 모두에 있어 C2, C7, C17및 C19에서의 절대 배열이 같다는 것을 나타내 주고 있다.
다음의 예들은 본 발명에 의한 재형의 실시예이나 하기에서 "유효성분"이란 용어는 본 발명의 화합물을 의미하고, 예를 들면, 인자 A, B, C, D, E 또는 F중의 하나일 수 있다.
Figure kpo00015
유효 성분을 벤질 알코올 및 글리세릴 트리아세테이트 중에 용해시켰다. 여기에, 프로필렌 글리콜을 첨가해서 증량시켰다. 이 용액을 여과해서 미립자 불순물들을 모두 제거했다. 생성물을 무균상태로 주사병에 넣고, 고무 마개 또는 플러그를 사용해서 밀봉하고, 알루미늄 포장물 중에 넣었다. 최종적으로 이 생성물을 오토클레이브 중에서 가열해서 멸균시켰다.
Figure kpo00016
유효성분을 트리클로로에탄과 혼합시키고, 에어로졸 용기에 넣었다. 포사제 가스로 상부 공간을 퍼징(purging) 시키고, 벨브를 끼웠다. 액체 포사제 필요량을 가압 하에서 밸브를 통해서 충전시켰다. 이 용기에 작동기(actuator) 및 분진 캡(dust-cap)을 부착시켰다.
Figure kpo00017
유효 성분에 10% 전분 페이스트 충분량을 첨가해서 과립화시키기에 적합한 습윤 덩어리를 만들었다. 과립들을 제조하고, 트레이 또는 유동상 건조기를 사용해서 건조시켰다. 이어서, 체를 통과시켜 체질하고, 나머지 성분을 첨가한 후, 압차시켜 정제로 만들었다.
필요에 따라서, 수성 또는 비수성 용매계를 사용하고, 히드록시프로필메틴 셀룰로오스 또는 기타 유사한 필름 형성 물질을 사용해서 정제 코오를 필름으로 피복시켰다. 가소제 또는 적당한 착색제를 필름 피복용 용액에 포함시킬 수 있다.
Figure kpo00018
유효 성분을 스테아린산마그네슘 및 미세 결정성 셀룰로오스와 혼합시켰다. 이 혼합물을 슬러그로 압착시켰다. 이 슬러그를 회전 과립화기를 통과시켜서 분쇄하고, 자유 유동형 정제를 만든 후, 압착시켜서 정제를 만들었다.
필요에 따라서, 이 정제 코오는 상기 기재한 바와 같이 필름 피복시켰다.
Figure kpo00019
낙화유생, 백 밀납 및 폴리소르베이트 60을 교반하에 160℃까지 가열시켰다. 160℃에서 2시간 동안 유지시킨후, 이어서 교반 하에 실온으로 냉각시켰다. 유효 성분을 부형제에 무균적으로 첨가하고, 고속 혼합기를 사용해서 분산시켰다. 이어서, 콜로이드 밀을 통과시켜서 정제한 후, 생성물을 무균적으로 멸균 플라스틱 주사기에 주입시켰다.
Figure kpo00020
유효 성분을 폴리소르베이트 85, 벤질알코올 및 프로필렌글리콜 중에 용해시켰다. 이어서, 소량의 물을 첨가하고, 필요에 따라서, 인산염 완충액을 사용해서 pH 6.0-6.5로 조절했다. 이어서, 물을 첨가해서 최종 부피로 만들었다. 생성물을 음악 용기에 주입시켰다.
Figure kpo00021
분류시킨 코코낫 오일 및 폴리소르베이트 85 중에 디스테아린산 알루미늄을 가열하에 분산시켰다. 이어서, 이 분산물을 실온으로 냉각시키고, 유성 부형제 중에 사카린을 분산시켰다. 이어서, 이 기재에 유효 성분을 분산시킨 후, 이것을 플라스틱주사기에 주입시켰다.
Figure kpo00022
유효 성분을 석회석 분말과 혼합시킨 후, 습식 과립화법을 사용해서 과립을 제제했다. 이어서, 트레이 또는 유동상 건조기를 사용해서 건조 시켰다. 이것을 적당한 용기에 주입시켰다.
Figure kpo00023
Figure kpo00024
성분들을 모두 휘발성 용매(예, 염화 메틸렌)중에 용해시켜서, 혼합기 중에서 회전하고 있는 과립에 첨가했다. 이어서, 건조시켜서 용매를 제거했다.
인자 A, B, C, D, E 및 F의 활성을 다음과 같은 여러가지 해충 및 그의 숙주를 이용해서 측정했다. 즉, 테트라니쿠스 우르티캐(T etranychus)(프랑스 콩 및 Myrobalan B 플럼), 미주스퍼시캐(Myzus persicae)(중국 양배추 및 무우), 헬리오티스 비레센스(Heliothis virescens)(목화), 킬로 포르텔루스(Chilo portellus)(평지콩), 멜로이도긴 인코그니타(Meloidogyne incognits)[멍빈(Mung besn)], 파논쿠스 올미(Panonchus ulmi)(Myrobalan B 플럼), 포로돈 후물리(Phorodon humuli)(호프), 아우라코르트덤 서쿰플렉썸(Aulacorthum circumflexum)(시클라덴)이다.
생성물은 액상 제제물의 형태로 사용했으며, 이 제제물은 생성물을 아세톤 중에 용해시켜서 만들었다. 이어서, 이 용액을 습윤제 0.1 내지 0.01 중량%를 함유하는 물로 희석해서, 액상 제제물이 요구되는 농도의 생성물을 함유할 수 있도록 했다.
각 해충에 관해서 적용한 시험 방법은 통상적으로 숙주 식물인 배지 상에서 많은 해충을 부양시키고, 이 배지를 제제물로 처리하는 것이다(잔류 시험). 테트라니쿠스 우르티캐의 경우에는, 해충과 배지 모두를 제제물로 처리했다(접촉 시험).
이 시험 방법에 의해서, 인자 A 내지 F가 500ppm이하의 농도(생성물의 중량)에서 유효한 것으로 발견되었다.

Claims (15)

  1. 스트렙토마이세스 속의 미생물을 배양시켜서 하기 일반식(Ⅲ)의 화합물을 제조하고, 이어서 필요에 따라서 발효 브로쓰로부터 1종 이상의 하기 구조식(Ⅲ)의 화합물을 분리시킴을 특징으로 하는 하기 일반식(Ⅲ)의 화합물의 제조방법.
    Figure kpo00025
    (식 중, R1은 메틸, 에틸 또는 이소프로필기이고, R2는 수소 또는 메틸기임)
  2. 제1항에 있어서, 제조된 화합물 중 R1이 이소프로필기이고, R2가 수소인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 제조된 화합물 중 R1이 메틸기이고, R2가 수소인 방법.
  4. 제1항, 4항 또는 5항에 있어서, 미생물이 주로 제1항에서 정의한 바와 같은 일반식(Ⅲ)의 화합물 1종 이상을 생성하는 방법.
  5. 제1항, 2항 또는 3항에 있어서, 미생물이 스트렙토마이세스 써모아르카엔시스 종인 방법.
  6. 제1항, 2항 또는 3항에 있어서, 미생물이 스트렙토마이세스 써모아르카엔시스 NCIB 12015 또는 그의 돌연변이체인 방법.
  7. 제1항, 2항 또는 3항에 있어서, 미생물이 스트렙토마이세스 써모아르카엔시스 NCIB 12111, NCIB 12112, NCIB 12113 또는 NCIB 12114 또는 그의 돌연변이체인 방법.
  8. 제1항, 2항 또는 3항에 있어서, 미생물을 20°-50℃에서 배양시키는 방법.
  9. 제1항, 2항 또는 3항에 있어서, 미생물을 pH 5.5 내지 8.5에서 발효시키는 방법.
  10. 제1항, 2항 또는 3항에 있어서, 미생물을 2 내지 10일동안 발효시키는 방법.
  11. 제1항, 2항 또는 3항에 있어서, 미생물의 균사체를 수혼화성 용매와 접촉시켜서, 그로부터 1종 이상의 제1항의 화합물을 추출시키는 방법.
  12. 제1항, 2항 또는 3항에 있어서, 일반식(Ⅲ)의 화합물을 실질적으로 순수한 형태로 제조하는 방법.
  13. 제1항, 2항 또는 3항에 있어서, 실질적으로 기타 마크로리드 화합물을 함유하지 않는 일반식(Ⅲ)의 화합물을 제조하는 방법.
  14. 제1항, 2항 또는 3항에 있어서, 제1항에서 정의된 바와 같은 화합물의 혼합물, 또는 R2가 수소인 제1항에서 정의된 바와 같은 화합물들의 혼합물, 또는 R2가 메틸기인 제1항에서 정의된 바와 같은 화합물들의 혼합물을 제조하는 방법.
  15. 제1항, 2항 또는 3항에 있어서, 생성물이 1종 이상의 제1항에서 정의된 일반식(Ⅲ)의 화합물을 함유하는 전발효브로쓰, 이와 같은 발효 브로쓰의 고형분, 발효 브로쓰로부터 분리시킨 손상되지 않거나 용해된 균사체, 손상되지 않거나 용해된 균사체를 분리시킨 후의 발효 브로쓰의 고형분 ; 또는 균사체를 분리시킨 후의 발효 브로쓰 형태인 방법.
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