FI87366C - Foerfarande foer framstaellning av antibiotiskt aktiva foereningar och mikroorganismer anvaendbara vid foerfarandet - Google Patents

Foerfarande foer framstaellning av antibiotiskt aktiva foereningar och mikroorganismer anvaendbara vid foerfarandet Download PDF

Info

Publication number
FI87366C
FI87366C FI853520A FI853520A FI87366C FI 87366 C FI87366 C FI 87366C FI 853520 A FI853520 A FI 853520A FI 853520 A FI853520 A FI 853520A FI 87366 C FI87366 C FI 87366C
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
ncib
compounds
formula iii
factor
methanol
Prior art date
Application number
FI853520A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI853520A0 (fi
FI87366B (fi
FI853520L (fi
Inventor
John Barrie Ward
Hazel Mary Noble
Neil Porter
Richard Alan Fletton
David Noble
Original Assignee
American Cyanamid Co
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from GB848423278A external-priority patent/GB8423278D0/en
Priority claimed from GB848432519A external-priority patent/GB8432519D0/en
Application filed by American Cyanamid Co filed Critical American Cyanamid Co
Publication of FI853520A0 publication Critical patent/FI853520A0/fi
Publication of FI853520L publication Critical patent/FI853520L/fi
Priority to FI905608A priority Critical patent/FI95134C/fi
Publication of FI87366B publication Critical patent/FI87366B/fi
Application granted granted Critical
Publication of FI87366C publication Critical patent/FI87366C/fi

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/18—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms containing at least two hetero rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring system, e.g. rifamycin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/01—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing oxygen
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/10—Antimycotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/18—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms containing at least two hetero rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring system, e.g. rifamycin
    • C12P17/181—Heterocyclic compounds containing oxygen atoms as the only ring heteroatoms in the condensed system, e.g. Salinomycin, Septamycin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/465—Streptomyces
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
    • Y10S435/886—Streptomyces

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Heterocyclic Carbon Compounds Containing A Hetero Ring Having Oxygen Or Sulfur (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)

Description

1 8756^
Menetelmä antibioottisesti aktiivisten yhdisteiden valmistamiseksi ja menetelmässä käyttökelpoiset mikro-organismit Tämä keksintö koskee menetelmää uusien antibioot-5 tisten yhdisteiden valmistamiseksi fermentoimalla Strep-tomyces-organismeja sekä tässä menetelmässä käyttökelpoisia Streptomyces-kantoja.
Keksinnön mukaisella menetelmällä voidaan valmistaa uusia yhdisteitä, joilla on kaava (III)
10 OH
“3 Ho CH3
CH "''T\ ^ I
15 3 H [I T ^R1 (111) k, V» 20 H I 3 n » 2
OR
1 2 jossa R on metyyli-, etyyli- tai isopropyyliryhmä ja R on vety tai metyyliryhmä. Näillä yhdisteillä on antibioottinen ja erityisesti endoparasiittien, ektoparasiittien ja sien-25 ten vastainen, insektisidinen, nematosidinen ja akarisidi-nen vaikutus, ja ne ovat erityisen kiintoisia käytettäviksi eläinten ja ihmisten terveydenhoidossa. Näitä yhdisteitä valmistetaan keksinnön mukaisesti fermentoimalla aikaisemmin kuvaamattomia mikro-organismikantoja ja ottamalla yh-30 disteet talteen kuten jäljempänä kuvataan.
Tämä keksintö kattaa yllä esietyn kaavan III mukaisten yhdisteiden valmistuksen sekä erikseen että yhdistelmänä. Tiettyihin käyttötarkoituksiin, esimerkiksi eläinlääketieteessä, voi olla soveltuvampaa käyttää näitä anti-35 biootteja erottamatta niitä erillisiksi komponenteiksi, 2 8 7 .:. 6 6 mutta muihin käyttötarkoituksiin, esimerkiksi lääketieteessä, voi olla edullista käyttää erillisiä yhdisteitä. Tämä keksintö sisältää siten kaavan III mukaisen yhdisteen valmistamisen seoksena ainakin yhden muun kaavan III mukaisen 5 yhdisteen kanssa tai yksittäisenä yhdisteenä, esimerkiksi oleellisesti puhtaana tai oleellisesti vapaana muista mak-rolidiyhdisteistä.
Aluksi yhdessä eristetyt kaavan III mukaiset yhdisteet on helppo erottaa kromatografisesti silikageelillä 10 jäljempänä kuvattavalla tavalla kahdeksi komponenteiksi, joilla on antibioottinen, esimerkiksi matojen vastainen, vaikutus ja jotka sammuttavat UV-fluoresenssin aallonpituudella 254 nm. Komponentille I on luonteenomaista Rf-arvo 0,70-0,75 ja komponentille II Rf-arvo 0,39-0,46, jotka Rf-15 arvot on määritetty ohutkerroskromatografisesti Merck 5735 Silica 60 -levyillä eluenttina kloroformin ja etyyliasetaatin seos (3:1).
Komponentit I ja II voidaan puhdistaa edelleen edellä määritellyiksi kuudeksi kaavan III mukaiseksi yhdis- 20 teeksi. Näille kuudelle kaavan III mukaiselle yhdisteelle 1 2 on annettu nimet tekijä A (R = isopropyyli ja R = vety), 12 1 tekijä B (R = metyyli ja R = metyyli), tekijä C (R = me- 3 ‘-7 "· t ' 1 ' .> u ‘ runsaasti kotieläimissä, kuten sioissa, lampaissa, nautakarjassa, vuohissa ja siipikarjassa ja hevosissa ja lemmikkieläimissä, kuten koirissa ja kissoissa. Karjan loistar-tunnat, jotka johtavat anemiaan, aliravitsemukseen ja pai-5 nonmenetykseen, ovat taloudellisten tappioiden tärkeä aiheuttaja kaikkialla maailmassa.
Esimerkkejä tällaisista eläimiä ja/tai ihmisiä in-fektoivista endoparasiittisuvuista ovat Ancylostoma, Ascaridia, Ascaris, Aspicularis, Bunostomum, Capillaria, 10 Chaberria, Cooperia, Dictyocaulus, OirofIlaria, Enterobius, Haemonchus, Heterakis, Nacator, Nematodirus, Nematospiroi-des, Nippostrongylys, Oesophagostomum, Ostertagia, Oxyuris, Parascaris, Strongylus, Strongyloides, Syphacia, Toxasca-ris, Toxocara, Trichonema, Trichostrongylus, Trichinella, 15 Trichuris ja Uncinaria.
Esimerkkejä eläimiä ja/tai ihmisiä infektoivista ektoparasiiteista ovat niveljalkaiset ektoparasiitit, kuten purevat hyönteiset, lihakärpänen, kirput, täit, punkit, imevät hyönteiset ja kaksisiipiset tuhohyönteiset.
20 Esimerkkejä tällaisista eläimiä ja/tai ihmisiä in fektoivista ektoparasiittisuvuista ovat Ambylomma, Boophi-lus, Coroptes, Culliphore, Damodex, Damolinia, Gastrophi-lus, Haematobia, Haematopinus, Haemophysalis, Hyalomma, Linognathus, Lucilia, Melophygus, Oestrus, Psorergates, 25 Psoroptes, Rhipicephalus, Sarcoptes ja Stomoxys.
Kaavan III mukaisten yhdisteiden on havaittu olevan tehokkaita sekä in vitro että in vivo joukkoa endoparasiit-teja ja ektoparasiitteja vastaan. Erityisesti niiden on havaittu olevan tehokkaita poisankeroisia, kuten lajeja Hae-30 monchus contortus, Ostertagia circumcincta, Trichostronylus colubiformis, Dictyocaulus viviparis, Cooperia oncophera, Ostertagia ostertagi, ja Nippostrongylus braziliensis, ja loispunkkeja kuten Sarcoptes sp. ja Psoroptes sp. vastaan.
Kaavan III mukaiset yhdisteet ovat siksi käyttökel-35 poisia eläinten ja ihmisten, joilla on endo- ja/tai ektopa-rasiitti-infektioita, hoitoon.
4
Loisiaji vaihtelee isännän ja pääasiallisen infek-tiokohdan mukaan. Siten esimerkiksi Haemonchus contortus, Ostertagia clrcumcincta ja Tricostrongylus colubiformis in-fektoivat yleensä lampaita ja niiden pääasiallinen sijain-5 tikohta on maha ja ohutsuoli, kun taas Dictyocaulus vivi- parus, Cooperia oncophora ja Ostertagia ostertagi infektoi-vat yleensä nautakarjaa ja niiden pääasiallinen sijainti-kohta on keuhkot, suolisto tai vastaavasti maha.
Kaavan III mukaisilla yhdisteillä on lisäksi ha-10 vaittu olevan sienten vastainen vaikutus, esimerkiksi
Candida sp.-kantoja, kuten Candida albicansia ja Candida glabrataa, vastaan sekä hiivoja, kuten Saccharomyces carlsbergensisiä vastaan.
Kaavan III mukaisten yhdisteiden on havaittu olevan 15 aktiivisia myös elävää ankeroista Caenorhabditis elegansia vastaan.
Kaavan III mukaiset yhdisteet voidaan formuloida millä tahansa sopivalla tavalla farmaseuttisiksi koostumuksiksi käytettäviksi eläinlääketieteessä tai lääketieteessä. 20 Tällaiset koostumukset voidaan tehdä käyttöön soveltuviksi tavanomaisesti yhden tai useamman kantaja- tai apuaineen avulla.
Tällaisiin koostumuksiin kuuluvat valmisteet, jotka on formuloitu erityisesti parenteraalista (utareensisäi-25 nen antotapa mukaan luettuna), oraalista, rektaalista, paikallista tai istutekäyttöä varten. Kun formuloidaan koostumuksia, joiden tulee olla steriilejä, esimerkiksi ruiskeita (urareensisäiset valmisteet mukaan luettuina), silmätippoja, linimettejä ja istutteita, voi itse aktiivinen aineosa 30 olla valmistettu aseptisesti tai se voidaan steriloida valmistuksen jälkeen sellaisilla menetelmillä kuin gammasätei-lytys tai käsittely etyleenioksidilla.
Kaavan III mukaiset yhdisteet voidaan formuloida eläinlääketieteelliseen tai lääketieteelliseen käyttöön 35 ruiskeiksi, ja nämä voivat olla yksikköannosmuodossa, am- t: 5 n '7 " r ' ' ' ·..! O >" pulleissa tai muissa yhden annoksen sisältävissä säiliöissä, tai monta annosta sisältävissä säiliöissä, joihin voidaan tarpeen vaatiessa lisätä säilöntäainetta. Ruiskekoos-tumukset voivat olla suspensioiden, liuosten tai öljy- tai 5 vesipohjaisten emulsioiden muodssa, ja ne voivat sisältää formuloivia aineita, kuten suspendointi-, stabilointi-, liuotus ja/tai dispergointiaineita. Aktiivinen aineosa voi vaihtoehtoisesti olla steriilin jauheen muodossa, joka saatetaan käyttövalmiiksi lisäämällä sopivaa väliainetta, esi-10 merkiksi steriiliä, pyrogeenivapaata vettä. Öljymäisiin väliaineisiin kuuluvat moniarvoiset alkoholit ja niiden esterit, kuten glyseroliesterit, rasvahapot, kasviöljyt, kuten maapähkinä- tai puuvillansiemenöljy, mineraaliöljyt, kuten parafiiniöljy, ja etyylioleaatti ja muut niiden kaltaiset 15 yhdisteet. Myös muita väliaineita, kuten propyleeniglyko- lia, voidaan käyttää. Eläinlääketieteelliseen käyttöön tarkoitetut koostumukset voidaan formuloida myös utareensisäi-siksi valmisteiksi joissa käytetään joko pitkitetysti tai nopeasti vapauttavaa pohjaa, ja ne voivat olla vesi- tai 20 öljypohjaisia steriilejä liuoksia tai suspensioita. Öljy-mäiset väliaineet voivat olla esimerkiksi edellä kuvattuja ja ne voivat sisältää myös sakeutus- tai suspendointiainet-ta, kuten pehmeitä tai kovia parafiineja, mehiläisvahaa, 12-hydroksisteariinia, hydrattua risiiniöljyä, alumiini-25 stearaatteja tai glyseryylimonostearaattia. Koostumuksissa voidaan käyttää myös tavanomaisia ionittomia, kationisia tai anionisia pinta-aktiivisia aineita joko yksinään tai yhdistelminä.
Kaavan III mukaiset yhdisteet voivat olla eläimille 30 tai ihmisille antamista varten oraaliseen antoon sopivassa muodossa, esimerkiksi liuoksina, siirappeina tai suspensioina tai kuivana jauheena, johon lisätään vettä tai muuta soveltuvaa väliainetta ennen käyttöä, joihin valmisteisiin voidaanlisätä maku- ja väriaineita. Kiinteitä koostu-35 muksia kuten tabletteja, kapseleita, rakeita, pastilleja, 6 Ο Π 7 ί < ' i / J U 0 pillereitä, suuria pillereitä, jauheita, tahnoja tai rakeita, voidaan myös käyttää. Oraaliseen käyttöön tarkoitetut kiinteät ja nestemäiset koostumukset voidaan valmistaa alalla hyvin tunnetuin menetelmin. Tällaiset koostumukset 5 voivat sisältää myös yhtä tai useampaa farmaseuttisesti hyväksyttävää kantaja- tai täyteainetta, jotka voivat olla kiinteitä tai nestemäisiä. Esimerkkejä tällaisista soveltuvista, farmaseuttisesti hyväksyttävistä, kiinteisiin an-tomuotoihin käytettävistä kantaja-aineista ovat mm. sideai-10 neet (esimerkiksi esihyydytetty maissitärkkelys, polyvinyy-lipyrrolidoni tai hydroksipropyylimetyyliselluloosa); täyteaineet (esimerkiksi laktoosi, mikrokiteinen selluloosa tai kalsiumfosfaatti); liukastusaineet (esimerkiksi magne-siumstearaatti, talkki tai piidioksidi); hajoamista edistä-15 vät aineet (esimerkiksi perunatärkkelys tai natriumtärkke-lysglykollaatti); tai kostutusaineet (esimerkiksi natrium-lauryylisulfaattu). Tabletit voidaan päällystää alalla tunnetuin menetelmin. Esimerkkeihin nestemäisiin antomuotoihin käytettäviksi soveltuvista, farmaseuttisesti hyväksyttävis-20 tä lisäaineista kuuluvat suspendointiaineet (esimerkiksi sorbitolisiirappi, metyyliselluloosa tai hydratut ravintorasvat); emulgointiaineet (esimerkiksi lesitiini tai ara-bikumi); vedettömät väliaineet (esimerkiksi manteliöljy, öljymäiset esterit tai etanoli); ja säilöntäaineet (esimer-25 kiksi metyyli- tai propyyli-p-hydroksibentsoaatit tai sor-biinihappo); stabilointi- ja liuotusaineita voidaan myös lisätä.
Suun kautta annettavat tahnat voidaan myös formuloida alalla hyvin tunnetuin menetelmin. Esimerkkeihin tah-30 naformuloihin käytettäviksi soveltuvista farmaseuttisesti hyväksyttävistä lisäaineista kuuluvat suspendointi-tai hyy-telöintiaineet, esimerkiksi alumiinidistearaatti tai hyd-rattu risiiniöljy; dispergointiaineet esimerkiksi polysor-baatit; vedettömät väliaineet, esimerkiksi maapähkinäöljy 35 tai öljymäiset esterit; stabilointi- ja liuotusaineet. Tä- i.
7 87366 män keksinnön mukaisia yhdisteitä voidaan eläinlääketieteessä antaa myös sisällyttämällä niitä eläimen päivittäiseen kiinteään tai nestemäiseen ravintoon, esimerkiksi osaksi päivittäistä rehua tai juomavettä.
5 Bukkaalista antotapaa varten koostumus voi olla ta vanomaisella tavalla formuloituina tabletteina, tahnoina tai pastilleina.
Kaavan III mukaisia yhdisteitä voidaan eläinlääketieteessä antaa oraalisesti myös lääkejuomina, jotka ovat 10 esimerkiksi liuoksia, suspensioita tai dispersioita, jotka sisältävät aktiivista aineosaa yhdessä farmaseuttisesti hyväksyttävän kantaja- tai täyteaineen kanssa.
Tämän keksinnön mukaiset yhdisteet voidaan formuloida myös esimerkiksi peräpuikoiksi, esimerkiksi tavano-15 maisia peräpuikkopohjia sisältäviksi, eläinlääketieteellistä ja lääketieteellistä käyttöä varten.
Kaavan III mukaiset yhdisteet voidaan formuloida paikallista antamista varten eläinlääketieteelliseen ja lääketieteelliseen käyttöön linimenteiksi, voiteiksi, mai-20 doiksi, jauheiksi, pessaareiksi, suihkeiksi, kylvyiksi, aerosoleiksi tai tipoiksi (esimerkiksi silmä- tai nenäti-poiksi). Linimentit ja voiteet voidaan formuloida esimerkiksi vesi tai öljypohjaan lisäten soveltuvia sakeutus- ja/ tai hyytelöintiaineita. Silmään annettavat linimentit voi-25 daan valmistaa steriilisti steriloituja aineosia käyttäen.
Maidot voidaan formuloida vesi- tai öljypohjaan, ja ne sisältävät yleensä myös yhtä tai useampaa emulgointi-, stabilointi-, dispergointi-, suspendointi-, sakeutus tai väriainetta.
30 Jauheet voidaan formuloida käyttämällä apuna mitä tahansa soveltuvaa jauhepohjaa. Tipat voidaan formuloida vesi- tai vedettömään pohjaan, joka myös sisältää yhtä tai useampaa dispergointi-, stabilointi-, liuotus- tai suspendointiainetta. Ne voivat sisältää myös säilöntäai-35 netta.
8 8?366
Inhalaationkautta tapahtuvaa paikallista antamista varten voivat kaavan III mukaiset yhdisteet olla eläinlääketieteellistä tai lääketieteellistä käyttöä varten aerosolisuihkeen tai insufflaattorin muodossa.
5 Kaavan III mukaisia yhdisteitä voidaan antaa yh dessä muiden farmaseuttisesti aktiivistenaineosien kanssa. Sekä eläinlääketieteessä että lääketieteessä käytettävät kaavan III mukaisten yhdisteiden päivittäisannokset ovat soveltuvasti 1-2000 pg/painokilo, edullisesti 10-10 1000 pg/ kg ja edullisemmin 100-500 pg/kg, ja tämä annos voidaan antaa useaan osaan jaettuna, esimerkiksi 1-4 kertaa päivässä.
Eläinlääketieteellistä käyttöä varten voi olla toivottavaa käyttää aktiivisten yhdisteiden lähteenä koko 15 käymislientä komponentteja tai tekijöitä erottamatta. Voi olla soveltuvaa käyttää kuivattua lientä (joka sisältää myseelejä) tai kylmäkuivattuja myseelejä, liemestä kiin-teä-neste-erotusmenetelmillä tai haihdutusmenetelmillä erotettuja eläviä tai kuolleita myseelejä, tai myseelien 20 erotuksen jälkeen jäävää käymislientä.
Myseelit voidaan haluttaessa pastöroida tai edullisemmin kuivata, esimerkiksi suihkutus- tai telakuivai-mella. Liemi tai myseelit voidaan haluttaessa formuloida koostumuksiksi, jotka sisältävät tavanomaisia inerttejä 25 kantaja-, täyte- tai laimennusaineita, joita kuvattiin edellä.
Edellä esitetystä havaitaan, että yleisesti ilmaistuna kaavan III mukaisia yhdisteitä voidaan käyttää infektioiden tai loistartuntojen torjuntaan levittämällä 30 infektion tai loistartunnan aiheuttavaan organismiin tai sen sijaintikohtaan tehokas määrä yhtä tai useampaa mainituista yhdisteistä.
Kaavan III mukaisia yhdisteitä valmistetaan keksinnön mukaisesti siten, että viljellään mikro-organismia 35 Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12015, tai sen mutant- 1: 9 87366 tia Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12111, NCIB 12112, NCIB 12113 tai NCIB 12114, jolloin muodostuu kaavan III mukaista yhdistettä, ja erotetaan sitten haluttaessa vähintään yksi kaavan III mukainen yhdiste käymisliemestä.
5 Käytetty mikro-organismi voi tuottaa pääasiallisesti yhtä tai useampaa kaavan III mukaista yhdistettä.
Taksonomisten tutkimusten perusteella se nimenomainen mikro-organismi, jolla on kyky tuottaa edellä mainittuja yhdisteitä, kuuluu uuteen Streptomyces-suvun 10 lajiin, jolle on annettu nimeksi Streptomyces thermoarchaensis . Näyte tästä mikro-organismista, joka on maasta eristetty näyte, on talletettu pysyvään viljelmäkokelmaan the National Collections of Industrial and Marine Bacteria, Torry Research Station, Aberdeen, Yhdistynyt kuni-15 ngaskunta, ja sille on annettu numero NCIB 12015. Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12015:n morfologiset ja viljelmän ominaispiirteet annetaan jäljempänä, ja tämä organsmi sekä sen neljä mutanttia, jotka tuottavat kaavan III mukaisia yhdisteitä, muodostavat tämän keksinnön yh-20 den osan.
StrcpLomyces thermoarchaensis NCIB 12015:n mutant- teja voi syntyä spontaanisti tai niitä voidaan tuottaa erilaisin menetelmin, joihin kuuluvat H.I. Adlerin kuvaamat menetelmät [Techniques for the Development of Micro-. 25 organisms, teoksessa Radiation and Radiositopes for
Industrial Microorganisms, Proceedings of the Symposium, International Atomic Energy Authority, Wien 1973, s.
241]. Tällaisiin menetelmiin kuuluvat ionisoiva säteily, kemialliset menetelmät, esimerkiksi käsitteleminen N-me-30 tyyli-N'nitro-N-nitrosoguanidiinilla (NTG); lämpö, ge neettiset menetelmät, kuten rekombinaatio, transduktio, transformaatio, lysogenisointi ja lysogeeninen muuttaminen, ja soontaanien mutanttien valikointimenetelmät. Siten on saatu neljä Streptomyces thermoarchaensis NCIB 35 12015:n mutanttikantaa, jotka tuottavat kaavan III mukai- 10 y η - t s Γ» / o o o siä yhdisteitä, ja kukin näistä on talletettu pysyvään viljelmäkokoelmaan the National Collections of Industrial and Marina Bacteria, Torry Research Station, Aberdeen, Yhdistynyt kuningaskunta, ja niille on annettu numerot 5 NCIB 12111, NCIB 12112, NCIB 12113 ja NCIB 12114. Strep-tomyces thermoarchaensis NCIB 12111, 12112, 12113 ja 12114 muodostavat tämän keksinnön osan.
Kanta NCIB 12015 on talletettu 10.9.1984.
Kannat NCIB 12111-4 on talletettu 26.6.1985.
10 Mutanttikannat NCIB 12111, 12112 ja 12113 saatiin käsittelemällä Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12015:n itiöitä NTGrllä ja karakterisoitiin sitten Hollidayn yk-sivaihemenetelmällä [R. Holliday, Nature 178 (1956) 987].
Mutanttikanta NCIB 12114 syntyi Streptomyces ther-15 moarchaensis NCIB 12015:n spontaanin mutaation kautta, ja se identifioitiin streptomysiinille resistentiksi, koska se säilyi hengissä pidettäessä streptomysiinisulfaattipi-toisuudessa 100 pg/ml 28 °C:ssa 5 vrk.
Taksonomiset tutkimukset osoittaavat siihen, että 20 Streptomyces thermoarchaensis NCIB L2015 on aiemmin julkistamaton uutta lajia oleva mikro-organismi, jonka ominaispiirteitä kuvataan jäljempänä ja jotka ominaispiirteet ovat oleellisesti yhteisiä koko tälle lajille.
. . Edullisilla itiönmuodostusalustoilla, kaurajauho- 25 agarilla, mallas-hiiva-agarilla ja epäorgaanisia suoloja sisältävällä tärkkelysagarilla [Shirling, E.B. ja Gottlieb, D., Int. J. Syst. Bacteriol. 16 (1966) 313-340] Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12015 kasvaa runsaana ja muodostaa stabiilin substraattimyseelin ja ylös kohoa-30 van myseelin, jossa on itiöitä avoimissa spiraalirihmois-sa, jotka ovat päähyyfien sivuhaaroina. Näillä alustoilla kääntöpuolen väri on keltainen/ruskea ja sporoforit ovat harmaita. 100-kertaisella suurennuksella tarkasteltuna sporoforit sisältävät 2-5 kierrettä rihmaa kohden ja si-35 sältävät 5-10 itiötä kussakin spiraalin kierteessä. Spo-
11 G n 7CC
U / J U υ
roforit sisältävät keskimäärin 20-50 itiötä. 12 000-ker-taisella suurennuksella tehty pyyhkäisyelektromikroskopia osoittaa itiöiden olevan sileäseinäisiä ja muodoltaan el-lipsoideja sekä mitoiltaan 0,7 x 1,4 pm leveimmiltä koh-5 diltaan mitattuina. Streptomyces thermoarchaensis NCIB
12015 on gram-positiivinen ja pystyy kasvamaan ja tuottamaan itiöitä lämpötilassa 20-50 °C.
Edellä esitettyjen tietojen vertaaminen julkaistuihin kuvauksiin, joita annetaan teoksessa Bergey's Man-10 ual of Determinative Bacteriology (8. p.) viittaa siihen, että organismi Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12015 kuuluu Streptomyces-sukuun.
Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12015:n identifiointi lajiryhmätasolla tehtiin käyttämällä Williamsin 15 et ai. [J. Gen. Microbiol. 129 (1983) 1815-1830] kuvaamaa tietokoneavusteista identifiointimatriisia. Edellä mainittujen kirjoittajien kuvaamien 41 taksonomisen testin tulokset ovat seuraavat Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12015:lie.
12 0 7 '* 'c 0 / J O 6
Ominai suus Tulos
Itiörihma kiehkurainen (verticillati)
Itiörihma retinaculiaperti Itiörihma rectiflexibiles 5 Itiörihma kierteinen (spirales) +
Myseelin fragmentoituminen
Itiön pinta sileä +
Itiön pinta poimuinen
Itiön väri harmaa + 10 Itiön väri punainen
Itiön väri vihreä Kääntöpuoli keltainen/ruskea + Kääntöpuoli punainen/oranssi Melaniinin tuotanto 15 Adonitolin hyväksikäyttö + D-fruktoosin hyväksikäyttö +
Mesoinositolin hyväksikäyttö Inuliinin hyväksikäyttö +
Manritolin hyväksikäyttö 20 Raffinoosin hyväksikäyttö +
Ramnoosin hyväksikäyttö + D-ksyloosin hyväksikäyttö + DL-a-aminovoihapon hyväksikäyttö : L-histidiinin hyväksikäyttö + .25 L-hydroksiproliinin hyväksikäyttö
Allantoiinin hajotus +
Arbutiinin hajotus +
Ksantiinin hajotus +
Pektiinin hajotus + 30 Lesitiinin hajotus
Nitraatin pelkistys +
Vetysulfidin tuotanto +
Natriumatsidin (0,01 % massa/tila-vuus ) sieto 35 Natriumkloridin (7 %, massa/tilavuus) sieto
i3 873cS
Omi nai suus Tulos
Fenolin (0,1 %, massa/tilavuus)sieto +
Kasvu 4rj°:Ksa +
Resistenssi neomysiini 1le (50^ug/ml)
Resistenssi rifapisiinille (50^ug/ml) + 5 Antibioottisuus Aspergillus niger LIV 131:n suhteen +
Antibioottisuus Bacillus subtilis NCIB 3610:n suhteen
Antibioottisuus Streptomyces murinus 10 ISP 5091:n suhteen +
Organismin ei todettu kuuluvan mihinkään 23 tärkeimmästä lajiryhmästä [Williams, S.T. et ai., J. Gen. Microbiol. 129 (1983) 1815-1830] tai mihinkään Williamsin et ai. [J. Gen. Microbiol. 129 (1983) 1743-1813] pienem-15 mistä lajiryhmistä ja yksijäsenisistä ryhmittymistä.
Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12015:n ominaispiirteitä verrattiin myös tunnettujen Streptomyces-lajien kuvauksiin, joita on teoksessa Bergeys's Manual of Determinative Bacteriology (8. p.) ja Shirlingin ja Gottliebin 20 ISP-raporteissa [Int. J. Syst. Bacteriol. 18 (1968) 69-189; Int. J. Syst. Bacteriol. 18 (1968) 279-392; Int. J. Syst. Bacteriol. 19 (1969) 391-512; Int. J. Syst. Bacteriol. 22 (1972) 265-394], ja uusiin lajeihin, joita on perustellusti kuvattu julkaisussa the International Jour-25 nai of Systematic Bacteriology vuodesta 1980 lähtien.
Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12015:n ja kuvattujen lajien välillä ei voitu todeta yhdenmukaisuutta, ja tämän pohjalla uskomme, että Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12015 on ensimmäinen sukuun Streptomyces kuu-30 luvan uuden lajin tunnettu jäsen.
Mutanttikannoilla NCIB 12111, 12112, 12113 ja 12114 on kaikilla suurin piirtein samanlaiset oleelliset ominaisuudet kuin Streptomyces thermoarchaensisilla. NCIB 12111 tarvitsee kuitenkin adeniinia kasvaakseen, NCIB 35 12112 tarvitsee seriiniä kasvaakseen, NCIB 12113 tarvit see histidiiniä kasvaakseen ja NCIB 12114 on streptomy-siiniresistentti.
14 87366
Kaavan III mukaisia yhdisteitä tuottamaan kykenevät mikro-organismit on helppo havaita kätevällä pienois-testillä, jossa käytetään sukkulamatoa Caenoehabditis elegans, esimerkiksi lisäämällä tutkittava näytesukkula-5 matoja sisältävään suspensioon ja tutkimalla tuloksena olevaa vaikutusta matojen elinkykyyn.
Kaavan III mukaisia yhdisteitä voidaan tuottaa fermentoimalla soveltuvaa Streptomyces-organismia tavanomaisin keinoin, ts. viljelemällä Streptomyces-organismia 10 assimiloitavissa olevien hiili- ja typpilähteiden ja mi-neraalisuolojen läsnä ollessa.
Assimiloituvina hiili-, typpi- ja mineraalisuola-lähteinä voivat toimia joko yksinkertaiset tai monimutkaiset ravinteet. Hiililähteisiin kuuluvat yleisesti glu-15 koosi, maltoosi, tärkkelys, glyseroli, melassi, dekstrii-ni, laktoosi, sakkaroosi, fruktoosi, karboksyylihapot, aminohapot, glyseridit, alkoholit, alkaanit ja kasviöljyt. Hiililähteet muodostavat yleensä 0,5-10 paino-% fer-mentointialustasta.
20 Tavallisiin typpilähteisiin kuuluvat soijapapujau- ho, maissiuuteliemet, tislausliemet, hiivauutteet, puuvi-. : lansiemenjauho, peptonit, maapähkinäjauho, mallasuute, • melassi, kaseiini, aminohapposeokset, ammoniakki (kaasu tai liuos), ammoniumsuolat ja nitraatit. Ureaa ja muita 25 amideja voidaan myös käyttää. Typpilähteet muodostavat yleensä 0,1-10 paino-% fermentointialustasta.
Ravinnemineraalisuoloihin, joita voidaan lisätä kasvualustaan, kuuluvat yleisesti käytetyt suolat, joista saadaan natrium-, kalium-, ammonium-, rauta-, magnesium-, 30 sinkki-, nikkeli-, koboltti-, mangaani-, vanadiini-, kro mi-, kalsium-, kupari-, molybdeeni-, boori-, fosfaatti-, sulfaatti-, kloridi- ja karbonaatti-ioneja.
Vaahtoamisenestoainetta voi olla läsnä liiallisen vaahtoamisen estämiseksi, ja sitä voidaanlisätä käymisen 35 aikana tarpeen mukaan.
15 ρ· 7 3 6 6
Strepfcomyces-organismin viljely tehdään yleensä lämpötilassa 20-50 °C, edullisesti 25-40 °C, erityisesti noin 3 °C, ja se tehdään mielellään ilmastaen ja sekoittaen, esimerkiksi ravistelemalla tai sekoittimella. Alus-5 ta voidaan alussa inokuloida pienellä määrällä itiömuo-dossa olevaa mikro-organismia sisältävää suspensiota, mutta kasvun viivästymisen estämiseksi voidaan valmistaa organismia sisältävä vegetatiivinen inokulaatti inokuloi-malla pieni määrä kasvualustaa organismin itiömuodolla ja 10 siirtää saatu vegetatiivinen inokulaatti fermentointilie-meen tai edullisemmin yhteen tai useampaan esikasvatus-vaiheeseen, joissa tapahtuu lisäkasvua ennen siirtämistä lopulliseen käymisliemeen. Fermentointi tehdään yleensä pH-arvossa 5,5-8,5, edullisesti 5,5-7,5.
15 Mikäli halutaan erottaa kaavan III mukaiset yhdis teet sisältävä materiaali fermentointiseoksesta tai eristää jokin komponenteista tai tekijöistä, voidaan se tehdä tavanomaisin eristys- ja erotusmenetelmin. Kaavan III mukaiset yhdisteet ovat pääasiassa solumyseeleissä, mutta 20 niitä voi olla myös käymisliemessä ja eristysmenetelmiä voidaan käyttää myös käymisliemelle joko ennen selkeyttämistä tai sen jälkeen. On huomattava, että valittava eristysmenetelmä voi vaihdella laajasti.
Kaavan III mukaiset yhdisteet voidaan eristää ja 25 erottaa erilaisin fraktiointimenetelmin, esimerkiksi ad-sorptio-eluutiomenetelmin, saostamalla, jakokiteytyksellä ja liuotinuutolla, joita menetelmiä voidaan yhdistellä eri tavoin.
Liuotinuutto ja kromatografia ja jakokiteytys on 30 havaittu parhaiten soveltuviksi tämän keksinnön mukaisten yhdisteiden eristämiseen ja erottamiseen.
Myseelit voidaan kerätä talteen käymisen jälkeen tavanomaisin menetelmin, esimerkiksi suodattamalla tai sentrifugoimalla. Sen jälkeen voidaan materiaali esimer-35 kiksi uuttaa myseeleistä sopivalla orgaanisella liuottimena, kuten ketonilla, esimerkiksi asetonilla, metyyli-etyyliketonilla tai metyyli-isobutyyliketonilla; hiilive- i6 8 7 566 dyllä, esimerkiksi heksaanilla; halogenoidulla hiilivedyllä, esimerkiksi kloroformilla, hiilitetrakloridilla tai metyleenikloridilla; alkoholilla, esimerkiksi metano-lilla tai etanolilla; tai diolilla, esimerkiksi propaani-5 1,2-diolilla; tai esterillä, esimerkiksi metyyliasetaa- tilla tai etyyliasetaatilla. On huomattava, että jos my-seelit sisältävät merkittäviä määriä vettä, on edullista käyttää vesiliukoista liuotinta.
Yleensä tehdään edullisesti useampi kuin yksi uut-10 ta parhaan mahdollisen saannon saavuttamiseksi. Ensimmäinen uutto tehdään edullisesti käyttämällä veteen sekoittuvaa liuotinta, kuten metanolia tai asetonia. Antibiootit voidaan ottaa talteen raakauutteena poistamalla liuotin. Itse uuteliuokset voidaan uuttaa, haluttaessa esi-15 merkiksi haihduttamalla tehtävän liuotintilavuuden pienentämisen jälkeen. Tässä vaiheessa on edullista käyttää veteen sekoittumatonta liuotinta, kuten heksaania, kloroformia, metyleenikloridia tai etyyliasetaattia tai niiden seosta, jolloin lisätään riittävä määrä vettä antibioot-20 tisten yhdisteiden tyydyttävän partition saavuttamiseksi.
Poistamalla veteen sekoittumaton faasi saadaan kaavan III mukaisia yhdisteitä sisältävää materiaalia. Tekijä B voi-• daan haluttaessa erottaa kiteyttämällä sopivasta liuotti- mesta, esimerkiksi isopropanolista.
25 Aktiivisten aineosien ja/tai tekijöiden puhdistus ja/tai erotus (joko täydellisesti tai muista läsnäolevista makrolidiyhdisteistä) voidaan tehdä tavanomaisin menetelmin, kuten esimerkiksi käsittelemällä kromatografises-ti (HPLC mukaan luettuna) soveltuvalla kantajalla, kuten 30 silikalla, ei-funktionaalisella karkeajakoisella adsorp- tiohartsilla, esimerkiksi silloitetulla polystyreenihart-silla, kuten Amberlite XAD-2:lla, XAD-4:llä tai XAD-1180-:llä (Rohm & Haas Ltd), tai S112-hartsilla (Kasteli Ltd) tai orgaanisen liuottimen kanssa yhteensopivalla deks-35 traanilla, kuten Sephadex LH20:llä (Pharmacia UK Ltd), tai HPLC:n ollessa kyseessä, RP-kantajilla, kuten hiilivetyihin sidotulla silikalla, esimerkiksi C^g-sidotulla i.
17 87366 silikalla. Kantaja voi olla kerroksen muodossa tai edullisemmin pylvääseen pakattuna. Ei-funktionaalisten karkeajakoisten hartsien, kuten XAD1180:n tai S112:n, ollessa kyseessä voidaan eluointiin käyttää orgaanisten liuot-5 timien seoksia, kuten asetonitriiliä ja vettä.
Liuos, joka sisältää yhdisteet sopivassa liuotti-messa, pakataan yleensä silika- tai Spehadex-kolonnille, haluttaessa liuotintilavuuden vähentämisen jälkeen. Ko-lonni voidaan mahdollisesti huuhtoa ja eluoida sitten 10 liuottimena, jonka polaarisuus on sopiva. Sephadexin ja silikan ollessa kyseessä voidaan liuottimina käyttää alkoholeja, kuten metanolia; hiilivetyjä, kuten heksaania; asetonitriiliä; halogenoituja hiilivetyjä, kuten kloroformia tai metyleenikloridia; tai estereitä, kuten etyy-15 liasetaattia. Tällaisia liuottimia sekoitettuina keskenään tai veden kanssa voidaan myös käyttää.
Kaavan III mukaisten yhdisteiden eluoitumista ja erottumista/puhdistumista voidaan seurata tavanomaisin menetelmin, kuten kromatografian, esimerkiksi ohutkerros-20 kromatografian ja HPLC:n avulla tai käyttämällä hyväksi yhdisteiden edellä kuvattuja ominaisuuksia.
Silikageelillä tehtävä kromatografia, jossa käytetään edullisesti sellaista eluenttia kuin kloroformin ja etyyliasetaatin seosta, erottaa helposti kaavan III mu-. . 25 kaiset yhdisteet komponentteihin I ja II, jolloin komponentti I eluoituu ensin. Tekijät B, E ja F on sitten helppo saada komponentista I käyttämällä kromatografiaa, esimerkiksi HPLC:tä. Samoin on tekijät A, C ja D helppo eristää komponentista II. Vaihtoehtoisesti voidaan tekijä 30 B erottaa tekijöistä E ja F kiteyttämällä alkoholista, kuten metanolista tai isopropanolista. Tekijät E ja F sisältävät emäliuokset voidaan haluttaessa puhdistaa edelleen esimerkiksi kromatofrafisesti silikalla ja eristää tekijät E ja F HPLC:tä käyttämällä. Kun tekijät on eris-35 tetty, ne voidaan puhdistaa edelleen kiteyttämällä esimerkiksi metanolista, isopropanolista tai metanolin ja veden seoksesta, ja kiteisessä muodossa olevien kaavan 18 87366 III mukaisten yhdisteiden valmistus kuuluu tämän keksinnön piiriin.
Edellä esitettyjä menettelyjä sopivalla tavalla yhdistämällä on kaavan III mukaiset yhdisteet eristetty 5 kiinteinä aineina. On huomattava, että järjestys, jossa edellä mainitut puhdistusvaiheet toteutetaan, ja valittavat vaiheet voivat vaihdella laajasti.
Tekijä B on siten saatu kiteisenä kiinteänä aineena, jonka puhtausaste on yli 90 %. Samoin tekijät A, C, 10 D, E ja F on saatu puhtausasteeltaan yli 90-%:isinä. Tekijöitä voidaan kuitenkin, kuten edellä kuvattiin, käyttää puhtaustasoltaan aiottuun käyttötarkoitukseen soveltuvina. Lääketieteelliseen käyttöön ovat toivottavia puhtausasteet vähintään 90 %, edullisesti yli 95 %. Eläin-15 lääketieteelliseen käyttöön ovat riittäviä alemmat puhtausasteet, esimerkiksi 50 % tai sitä alemmat.
Seuraavat esimerkit valaisevat keksintöä. Esimerkeissä käytetään seuraavia lyhenteitä: TLC - ohutkerros-kromatografia (jossa käytetään Merck 5735 Silica 60 -le-20 vyjä ja eluenttina CHCl^n ja etyyliasetaatin seosta (3:1), ellei toisin mainita); CCM - pylväskromatografia, jossa käytetään Merck 7734 Silica 60 -geeliä (pylväs 200 x 4 cm, ellei toisin mainita) ja eluenttina CHCl^Jn ja etyyliasetaatin seosta (3:1), ellei toisin mainita; 25 HPLC suurtehonestekromatografia: PE - petrolieetteri (kp. 60-80 °C, ellei toisin mainita); EA - etyyliasetaatti.
Alustat A, B ja C, joihin viitataan esimerkeissä, ovat seuraavat:
Alusta A g/1 30 D-glukoosia 15,0
Glyserolia 15,0
Soijapeptonia 15,0
NaCl 3,0
CaC03 1,0 35 Täytetään 1 l:ksi tislatulla vedellä ja pH sääde tään arvoon 7,0 NaOH:n vesiliuoksella ennen autoklavoin-tia.
i, i9 87 ^66
Alusta B g/1 D-glukoosia 2,5
Mallasdekstriiniä MD /Roquette (UK) Ltd7 25,0 Arkasoy 50 (British Arkady Co. Ltd) 12,5 5 Melassia 1,5 K2HP04 0,125
Kalsiumkarbonaattia 1,25 MOPS /3-(N-morfolino)propaanisulfonihappo? 21,0 Täytetään tislatulla vedellä 1 l:ksi ja sääde- 10 tään pH arvoon 6,5 5 N NaOH:lla ennen autoklavointia.
Alusta C q/1 D-glukoosia _ _ 2 / o
Mallasdekstriiniä MD 30E/Roquette (UK) Ltd725,0 Arkasoy 50 12,5 ^ Juurikasmelassia 1,5 K2HP04 0,125
CaC03 1,25
Silicone 1520 (Dow Corning) 0,625 Täytetään tislatulla vedellä 1 l:ksi ja säädetään 20 pH arvoon 6,5 ennen sterilointia.
Esimerkki 1
Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12015:n itiöillä inokuloitiin agarvinopinnat, jotka oli valmistettu seuraavista aineosista: 25 Sill
Hiivauutetta (Oxoid L21) 0,5
Mallasuutetta (Oxoid L39) 30,0
Mykologista peptonia (Oxoid L40) 5,0
Agaria nro 3 (Oxoid L13) 15,0 Täytettiin vedellä 1 l:ksi, pH noin 5,4, ja in-kuboitiin 28°C:ssa 10 vrk. Valmis vinopinta peitettiin sitten 10-%:isella glyseroliliuoksella (6 ml) ja raaputettiin steriilillä välineellä irti itiöt ja myseeli.
Saatu itiösuspensio siirrettiin sitten 0,4 ml:n annoksina 1 S
steriileihin ohuisiin polypropyleeniputkiin, jotka sulatettiin umpeen ja säilytettiin nestetyppihöyryssä käyttöön asti.
2 0 8 7 6 6 6
Yhden putken sisällöllä inokuloitiin 10 ml alustaa A, jota inkuboitiin sitten 28°C:ssa 3 vrk ravistimessa, jossa pyörimisnopeus oli 250 min 1 ja liikeradan halkaisija 50 mm. Tällä inkuboidulla alustalla inokuloitiin (inoku-5 laattipitoisuus 2 %) 15 putkea ja kaksi 250 ml:n erlenmeyer-pulloa, jotka sisälsivät 10 ml ja vastaavasti 50 ml alustaa B.
Putkia ja pulloja inkuboitiin 28°C:ssa 5 vrk, ja suodatettiin sitten viljelmät erikseen alipaineella, ja 10 ravisteltiin soluja 30 min metanolin kanssa, jota käytettiin viljemäsuodoksen kanssa yhtä suuri tilavuus.
Sekä putkissa että pulloissa kasvatettujen solujen uutteiden havaittiin vaikuttavan Caenorhabditis elegansin vastaisesti, ja nämä myseeliuutteet yhdistettiin, haihdu-15 tettiin kuiviin ja uutettiin uudelleen metanolilla, jolloin saatiin tiiviste (6 ml), joka laitettiin metanolin avulla pakattuun Sephadex LH20 -kolonniin (110-2,5 cm), joka eluoitiin metanolilla. Kerättiin 10 ml:n fraktioita.
Fraktiot 21-28 yhdistettiin ja haihdutettiin, 20 jolloin saatiin öljymäinen jäännös (156 mg), joka uutettiin CHCl^rEAilla (3:1), jolloin saatiin uute (3 ml), jolle tehtiin CCM (kolonni 55 x 2,,5 cm). »Kerättiin 1,0 nv.;n fraktioita, jotka analysoitiin TLC:llä käyttämällä fluoresens-si-indikaättoria sisältäviä levyjä. Fraktiot 20-23 ja 25 36-44 antoivat kaksi suurta aluetta, jotka sammuttivat fluoresenssin ja jotka identifioitiin komponentiksi I (Rf 0,70) ja komponentiksi II (Rf 0,43). Haihdutettaessa fraktiot 20-23 saatiin 9 mg komponenttia I kiinteänä aineena^ Amax238 nm' E1 340; Amax245 nm' E1 350; 3a 3(3 ^ ^254 nm, 200. Haihdutettaessa fraktiot 36-44
ITtclX I
saatiin komponenttia II kiinteänä aineena (11 mg); λ 238 nm,
1 Ί - ITlclX
F1 440; ^^245 nm, 460 ; ja λΙΐ13χ^54 nm, 280.
21 87366
Esimerkki 2
Kaksi 250 ml:n erlenmeyerpulloa, jotka sisälsivät 50 ml alustaa A, inokuloitiin kumpikin 0,2 mlrlla Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12015:n itiösuspensiota, 5 joka saatiin esimerkissä 1 kuvatulla tavalla valmistetusta putkesta. Pulloja inkuboitiin 28°C:ssa 3 vrk ravistimessa, jossa kierrosnopeus oli 250 mon ^ ja liikeradan läpimitta 50 mm, ja kummankin pullon sisällöllä inokuloitiin sitten 2 l:n fermentori, joka sisälsi alustaa B (12 1).Viljelmä 10 kerättiin 5 vrk:n kasvatuksen jälkeen ja käsiteltiin esimerkissä 3 kuvatulla tavalla.
Esimerkki 3
Esimerkin 2 mukaisesti saatu fermentointiliemi (12 1) otettiin talteen 5 vrk:n (28°C) kasvatuksen jälkeen 15 ja sentrifugoltiin (15 min 10°C:ssa, 4200 min . Solupel-letti sekoitettiin metanoliin (5 1) ja annettiin seistä 20 tuntia 4°C:ssa. Myseeliuute suodatettiin, haihdutettiin 40°C:ssa ja tislattiin atseotrooppisesti butan-l-olin (100 ml) lisäämisen jälkeen. Uute käsiteltiin sitten 20 metanolilla (5 x 200 ml), yhdistetyt uutteet haihdutettiin 100 ml:ksi ja laitettiin Sephadex LH20 -kolonniin (11.2-5 cm). Kolonni eluoitiin metanolilla, ja kun ensimmäiset 200 ml eluaattia oli heitetty pois, kerättiin 50 ml:n fraktioita. Fraktiot 40-90 yhdistettiin ja haihdutettiin, 25 jolloin saatiin öljymäinen jäännös (3,85 g). Jäännös uutettiin 77 ml:lla CHCl^:EA-seosta (3:1), suodatettiin ja tehtiin sitten CCM keräten noin 15 ml:n fraktioita 200 ml:n esieluaatin jälkeen.
Komponenttia I sisältävät fraktiot 124-142 yhdis-30 tettiin ja haihdutettiin, jolloin saatiin kiinteää ainetta (253 mg), josta 216 mg puhdistettiin HPLCrllä (Zorbax ODS, 25 x 2,1 cm, 80 % CH3CN/H20), Fraktiot 250-320, jotka sisälsivät komponenttia II, yhdistettiin ja haihdutettiin ,joiloin saatiin kiinteää ainetta (602 mg), josta 35 540 mg puhdistettiin HPLC:lla (kuten fraktiot 124-142), ja kerättiin useista ajoista saadut fraktiot.
22 8 7 o 6 6 HPLC-kolonnista eluoituvaa materiaalia seurattiin UV-spektroskopialla aallonpituudella 243 nm. Tällä aallonpituudella absroboivat piikit kuivattiin ja i) niiden vaikutus Caenorhabditis elegansia vastaan tutkittiin ja ii) 5 ne analysoitiin TLC:llä. Neljällä piikillä, jotka vaikuttivat Caenorhabditis elegansin vastaisesti, oli myös Rf-arvo 0,39-0,46 tai 0,70-0,75.
Komponentista I saatiin yksi piikki, jonka Rf-arvo oli 0,70-0,75, ja tälle piikille on annettu nimeksi teki-10 jä B. Komponentista II saatiin kolme piikkiä, joiden Rf-arvo oli 0,39-0,46, ja nämä piikit on nimetty tekijöiksi A, C ja D.
Tekijä A eluoitui HPLC-kolonnista 260-340 ml näytteen ruiskutuksen jälkeen, ja sillä oli TLC:ssa Rf-arvo 0,44. Tekijä B eluoitui HPLC-kolonnista 270-310 ml näytteen ruiskutuksen jälkeen, ja sen Rf-arvo oli 0,72 TLC:ssä.
Tekijä C eluoitui HPLC-kolonnista 160-180 ml näytteen ruiskutuksen jälkeen, ja sen Rf-arvo oli 0,4 TLC:ssä. Tekijä D eluoitui HPLC-kolonnista 220-250 ml näytteen 2q ruiskutuksen jälkeen, ja sen Rf-arvo oli 0,42 TLC:ssä.
Tekijöiden A, B, C ja D muita ominaispiirteitä kuvataan jäljempänä.
Esimerkki 4
Esimerkin 1 mukaisesti valmistetusta putkesta otettua organismin Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12015 itiö-2 5 suspensiota (0,4 ml) käytettiin alustaa A (50 ml) sisältävän 250 ml:n erlenmeyerpullon inokulointiin.Pulloa inku- boitiin 28°C.ssa 4 vrk ravistimessa, jossa kierrosnopeus -1 oli 250 min ja liikeradan läpimitta 50 mm. 8 ml:n annok-silla tätä viljelmää inokuloitiin sitten kaksi 2 1:n tasapohjaista pulloa, jotka kumpikin sisälsivät 400 ml samaa alustaa ja inkuboitiin samoissa olosuhteissa 3 vrk.
Kummankin pullon sisällöllä inokuloitiin sitten fermentori (70 1), joka sisälsi alustaa B (40 1), johon 2^ oli lisätty Silicone 525:ä (Dow-Corning; 0,625 til-%).
23 8736*
Fermentoitiin sekoittaen ja käyttäen riittävää ilmastusta liuenneen hapen pitoisuudenpitämiseksi suurempana kuin 20 % kyllästyspitoisuudesta ja lisättiin silikonivaahdon-alentajaa tarpeen mukaan. Fermentointituote kerättiin 5 10 vrk:n kuluttua, ja liemi (40 1) selkeytettiin sentri- fugoimalla (15 000 min ^). Jäännössupernatatti korvattiin vedellä (5 1), ja talteen otetut solut (1,4 kg) pakastettiin (-20°C).
Jäätyneet solut sulatettiin viikon kuluttua, sus-10 pendoitiin metanoliin (15 1) ja sekoitettiin varovasti 15 tuntia. Suspensio suodatettiin sitten, ja kiinteä jäännös uutettiin uudelleen metanolilla (10 1). Yhdistetty suo-dos (25 1) laimennettiin vedellä (12 1) ja uutettiin PE:llä (25 1). 30 min:n kuluttua kerrokset erotettiin sentri-15 fugoimalla.
Alempi, metanolikerros uutettiin uudelleen kolmesti PE:llä (25, 15 ja 15 1). Yhdistetyt PE-kerrokset (80 1) väkevöitiin johtamalla liuos kolmesti Pfaudler 8,8-12V-27 -kalvohaihduttimen läpi (höyrypaine 0,1 bar, höyryn lämpötila 20 20°C, vesihöyryn lämpötila 127°C), ja tiiviste (8 1) kui vattiin natriumsulfaatilla (1 kg) ja väkevöitiin edelleen alipaineessa 40°C.*ssa pyörivä kalvo -haihduttimessa. Öljy-mäinen jäännös (15 ml) liuotettiin CHCl3:n ja EA:n seokseen (70 ml, tilavuussuhde 3:1) ja liuokselle tehtiin CCM, jossa 25 kerättiin noin 40 ml:n fraktioita 1400 ml:n esieluaatin j älkeen.
Fraktiot 45-65 yhdistettiin ja haihdutettiin, jolloin saatiin tekijää B (940 mg: määritelty esimerkissä 3), joka kiteytettiin kahdesti metanolista ja lopuksi nitrome-30 taanista. Kiteille tehtiin yksikideröntgendiffraktioanalyysi, joka osoitti niiden olevan ortorombisia, kirkkaita prismoja, jossa a = 10,171(3), b = 13,317(5), c = 25,032 (7), 3 -3 V = 3391 A i Z = 4, avaruusryhmä P212^2^, Dc = 1,11 gcm , R = 0,053 2169 havaitulle riippumattomalle heijastukselle 35 (Θ < 58°) mitattuna diffraktometrilla Cu-Κα -säteilyllä (λ= 1,5417 A). Röntgenkristallografisesti määritetty rakenne esitetään kuviossa 5.
24 87366
Esimerkki 5
Valmistettiin Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12015 -inokulaatti esimerkissä 4 kuvatulla tavalla käyttämällä 2 vrk:n kasvatusaikaa, ja inokuloitiin sillä 5 fermentori (70 1), joka sisälsi alustaa B (40 1), johon oli lisätty polypropyleeni 2000:a (0,06 til-%) Silicone 525:n sijasta. Polypropyleeni 2000:a lisättiin tarpeen mukaan käymisen aikana vaahtoamisen estämiseksi. Fermen-tointi tehtiin 28°C.*ssa sekoittaen ja käyttäen riittävää 10 ilmastusta liuenneen hapen tason pitämiseksi yli 30 %:na kyllästyspitoisuudesta. 24 tunnin fermentoinnin jälkeen osa liemestä (1 1) siirrettiin fermentoriin (700 1), joka sisälsi alustaa (450 1), jonka koostumus oli seuraava: aZl 15 D-glukoosia 2,8
Mallasdekstriiniä (MD30E) 27,8
Arkasoy 50 13,9
Melassia 1,7 K2HP4 0,14 20 CaC03 1,39
Silicone 525 (Dow Corning) 0,06 til-% pH säädettiin arvoon 6,5 ennen sterilointia
Fermentoitiin 28°C:ssa sekoittaen ja käyttäen 25 riittävää ilmastusta liuenneen hapen pitoisuuden vetämiseksi yli 20 %:na kyllästyspitoisuudesta. Polypropyleeni 2000 -vaahtoamisenestoainetta lisättiin tarvittaessa. pH säädettiin 2 vrk:n kuluttua 7,2:ksi lisäämällä H2S0^:a. Käymistuote otettiin talteen 5 vrk:n kuluttua.
30 Liemi (450 1) selkeytettiin sentrifugoimalla, ja jäljelle jäänyt supernatantti korvattiin vedellä (20 1). Kerättyjä soluja (25,5 kg) sekoitettiin 1 tunti niin suuressa määrässä metanolia, että kokonaistilavuudeksi tuli 75 1. Suspensio suodatettiin, ja kiinteä jäännös 35 uutettiin uudelleen metanolilla (35 1) ja suodatettiin.
Yhdistetty suodos (87 1) laimennettiin vedellä (40 1) ja il 25 87 366 uutettiin PErllä. Kerrokset erotettiin 30 min:n kuluttua sentrifugoimalla ja alempi metanolifaasi uutettiin uudelleen PE:llä (30 1) veden (40 1) lisäämisen jälkeen. Alempi kerros uutettiin erottamisen jälkeen vielä PE:llä (30 1).
5 Yhdistetyt PE-faasit (85 1) väkevöitiin johtamalla kolmesti Pfandler 8,8-12v-27 -kalvohaihduttimen läpi (höyrynpaine 0,1 bar, höyryn lämpötila 20°C, vesihöyryn lämpötila 127°C). Tiiviste (9 1) kuivattiin natriumsulfaatilla (2 kg) ja väkevöitiin edelleen alipaineessa 40°C:ssa 10 pyörivä kalvo -haihduttimessa. Öljymäinen jäännös (130 g) liuotettiin CHCl^iin, jolloin saatiin 190 ml liuosta, jolle tehtiin CCM /kolonni pakattiin ja pestiin CHC^tlla (500 ml)_7, jossa kerättiin noin 40 ml: n fraktioita 1400 ml:n esieluaatin jälkeen.
15 Fraktiot 32-46 yhdistettiin ja haihdutettiin, jolloin saatiin öljyä (21,1 g). Fraktiot 47-93 yhdistettiin ja haihdutettiin öljyksi (20,1 g), joka liuotettiin CHCl^in ja EA:n seokseen (3:1) , siten , että tilavuudeksi tuli 50 ml, ja tehtiin liuokselle CCM keräten noin 40 ml:n 20 fraktioita 1400 ml:n esieluaatin jälkeen. Fraktiot 22-36 yhdistettiin ja haihdutettiin öljyksi (3,1 g), joka lisättiin öljyyn, joka saatiin ensimmäisestä kolonnista saatuihin fraktioihin 32-46. Yhdistetyt öljyt liuotettiin kiehuvaan metanoliin (4 ml) ja lisättiin tämä liuos kuumaan 25 propan-1-oliin (20 ml),jolloin saatiin seisotuksen jälkeen kiteinen tekijä B (2,57 g).
Tekijän B kiteytyksestä jäänyt emäliuos haihdutettiin öljyksi,joka liuotettiin yhtä suureen tilavuuteen Cl^C^ia ja laitettiin kolonnille (60 x 2,2 cm) , joka 30 sisälsi C^C^tn kanssa pakattua Merck Kieselgel 60 :ä (70-230 mesh ASTM, tuote nro 7734). Kerros pestiin Cf^C^iHa (2 x kerroksen tilavuus) ja eluoitiin CHCl^n ja EA:n seoksella (3:1, 2 x kerroksen tilavuus). Haihdut tamalla eluaatti saatiin öljyä, joka liuotettiin metanoliin 35 ja käsiteltiin preparatiivisella HPLC:llä Spherisorb S5 ODS-2:lla (250 x 20 mm, Phase Sep. Ltd). Näyte (5 ml) 26 ο π ;ν ί Ο I o O 6 pumpattiin kolonnille 1 min:n aikana, ja kolonni eluoitiin asetonitriilin ja veden seoksella (7:3) seuraavissa olosuhteissa:
Aika (min) Virtaus (ml/min) 5 0,00 0,00 )ruiskutus- 1,00 0,00 )aika 1,10 30,00 39,90 30,00 40,00 35,00 10 75,00 35,00 HPLC-kolonnista eluoituvaa materiaalia seurattiin UV-spektroskopialla aallonpituudella 238 nm. Haihduttamalla yhdistetyt fraktiot, jotka sisälsivät ajanhetkellä 26,3 min eluoituneet piikit, saatiin tekijä E kiinteänä aineena.
15 Haihduttamalla yhdistetyt fraktiot, jotka sisälsivät ajanhetkellä 36,4 min eluoituneet piikit, saatiin tekijä F kiinteänä aineena. Tekijöiden E ja F muita ominaisuuksia kuvataan jäljempänä.
Esimerkki 6 20 Käymisliemi (samanlainen kuin esimerkissä 2 val mistettu) , joka otettiin talteen 117 tunnin kuluttua, au-toklavoitiin (121°C, 1 tunti), jäähdytettiin huoneen lämpötilaan ja sekoitettiin magneettisekoittimella, jolloin saatiin homogeeninen solususpensio. Kaksi annosta (2 ml) 25 sentrifugoitiin(12 000 x g, 2 min huoneen lämpötilassa), supernatantit dekantoitiin, ja jäljelle jääneet solut sus-pendoitiin veteen (2 ml), sekoitettiin perusteellisesti ja sentrifugoitiin uudelleen (12 000 x g, 2 min huonoon lämpötilassa) . Supernatanttien dekantoinnin jälkeen solut pestiin 30 vielä kahdesti tislatulla vedellä (2 ml:n annoksilla) - Pestyt solut sekoitettiin sitten perusteellisesti joko veden (2 ml) tai metanolin (2 ml) kanssa, ja annettiin olla huoneen lämpötilassa 1,5 tuntia välillä ravistaen. Suspensiot sentrifugoitiin jälleen (12 000 x g,2 min huoneen lämpö-35 tilassa) ja supernatantit laimennettiin vedellä laimennus-sarjaksi. Vesisuspensiosta erotetut solut suspendoitiin 27 87366 uudelleen veteen ja valmistettiin välittömästi vesilaimennus-sarja. Annos (lO^ul) kutakin laimennosta lisättiin suspensioon (200^ul), joka sisälsi sukkulamatoa Caenorhabditis elegans puskuriliuoksessa, joka sisälsi Na2HP04:a (6 g/1) , 5 K2HP04:a (3 g/1), NaClra (5 g/1) ja MgS04. 7H20:a (0,25 g/1), ja jonka pH oli 7,0. Sukkulamatosupsensiot tutkittiin 4 tunnin kuluttua sen selvittämiseksi, mitkä tutkittavan seoksen laimennokset saivat aikaan täydellisen liikkumisen eston yli 98 %:lla koesuspensiossa olevista sukkulamadois-10 ta. Havaittiin,että metanoliuutteen 5-, 25-, 250- ja 550-kertaiset laimennokset, solususpension 5-, 25-, 250-, 500- ja 1000-kertaiset laimennokset ja vesiuutteen 2-, 4-ja 8-kertaiset laimennokset saivat aikaan tällaisen sukkulamatojen eston kun lisättiin lO^ul laimennosta 200^ul:aan 15 sukkulamatosuspensiota.
Esimerkki 7 250 ml:n erlenmeyerpullot, jotka sisälsivät joko 50 ml alustaa A tai 50 ml alustaa B, inokuloitiin 0,4 ml :11a Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12015 :n 20 itiösuspensiota, joka saatiin esimerkissä 1 kuvatulla tavalla valmistetusta putkesta. Alustaa A tai B sisältäviä pulloja inkuboitiin 28°C:ssa 2 vrk pyöröravistimessa, jossa kierrosnopeus oli 250 min ^ ja liikeradan läpimitta 50 mm. Osalla (8 ml) kumpaakin alustaa inokuloitiinsitten 2 litran 25 tasapohjainen pullo, joka sisälsi 400 ml samaa alustaa (A tai vastaavasti B). Näitä pulloja inkuboitiin samoissa olosuhteissa 2 vrk.
Kaksi 70 l:n fermentoria inokuloitiin kumpikin 2 pullollisella alustaa A ja yksi 70 l:n fermentori kahdel-30 la pullollisella alustaa B. Kukin fermentori sisälsi 40 1 alustaa C.
Fermentoinnit tehtiin 34°C:ssa sekoittaen ja käyttäen riittävää ilmastusta liuenneen hapen pitoisuuden pitämiseksi yli 30 %:na kyllästyspitoisuudesta. Noin 24 tunnin 35 fermentoinnin jälkeen pH säädettiin arvoon 7,2 lisäämällä H2S04:n vesiliuosta. Tarvittaessa lisättiin vaahtoamisen 28 8 7 366 estämiseksi polypropyleeni 2000:a. Nämä fermentointituot-teet kerättiin ja yhdistettiin 5 vrk:n kuluttua.
Vielä yksi fermentori, joka myös inokuloitiin kahdella pullollisella alustaa B, sisälsi alustaa B, johon 5 oli lisätty Silicone 1520:ä (0,06 %). Fermentoitiin 28°C:ssa sekoittaen ja käyttäen riittävää ilmastusta liuenneen hapen pitoisuuden pitämiseksi yli 30 %:na kyllästys-pitoisuudesta. Polypropyleeniglykoli 2000:a lisättiin tarpeen mukaan vaahtoamisen estämiseksi. 24 tunnin kuluttua 10 siirrettiin 9 1 tätä lientä 700 l:n fermentoriin, joka sisälsi 450 1 alustaa C.
Fermentoitiin 34°C:ssa sekoittaen ja ilmastaen riittävästi liuenneen hapen pitoisuuden pitämiseksi yli 30 %:na kyllästyspitoisuudesta. Vaahtoamista estettiin 15 lisäämällä polypropyleeniglykoli 2000:a, ja noin 24 tunnin kuluttua pH säädettiin arvoon 7,2 lisäämällä H2SO^:n vesi-liuosta. Käymistuote otettiin talteen 4 vrk:n kuluttua ja yhdistettiin se edellä kuvattuihin kolmeen 40 l:n erään.
Yhdistetyt liemet sentrifugoitiin Sharpies AS16PY:n 20 läpi virtausnopeudella 120 1/h. Sentrifugiastiaan jäänyt supernatantti korvattiin vedellä.
Kerätyt solut (11,65 kg) emulgoitiin metanoliin (33 1) Silverson-sekoittimen avulla. Suspensio suodatettiin 60 min:n kuluttua harsokankaan läpi, ja jäännös emulgoitiin 25 uudelleen metanoliin (34 1). Suspensio suodatettiin jälleen 40 min:n kuluttua. Metanoliuutoista saadut suodokset yhdistettiin .
Yhdistetyt uuteliuokset (53,5 1) sekoitettiin veteen (27 1) ja PE:iin (27 1). Sekoitettiin 20 min ja ero-30 tettiin faasit Westfalia MEM 1256 -sentrifugilla. Alempi, vesi-metanolikerros (70 1) sekoitettiin veteen (37 1) ja PE:iin (27 1), ja sekoitettiin ja erotettiin kuten edellä. PE-faasin rajapintaemulsio rikottiin asetonilla (4 1).
Alempi vesi-metanolifaasi (108 1) sekoitettiin sitten ve-35 teen (40 1) ja PEriin (27 1) kolmannen kerran, ja sekoitettiin ja erotettiin kuten edellä käyttäen asetonia (4 1) ti 29 H 7 il 6 f· rajapintaemulsion kirkastamiseksi. Nämä kolme heksaani-uutetta yhdistettiin sitten.
Yhdistetyt PE-uuteliuoksst (85 1) väkevöitiin kalvohaihduttimella (höyrynpaine 0,15 bar, höyryn lämpötila 5 26°C). Tiiviste (3 1) kuivattiin natriumsulfaatilla (2 kg) ja haihdutettiin edelleen alipaineessa 40°C:ssa.
Saatu öljy (639 g) liuotettiin 300 ml:aan kloroformin ja EA:n seosta (tilavuussuhde 3:1) ja suodatettiin ja pestiin lasikuitupaperilla. Suodos ja pesuliuokset (1060 ml) 10 käsiteltiin CCM:llä (kolonni 1500 x 100 mm) eluoiden virtausnopeudella 6 1/h.
Fraktiot, jotka eluoituivat alueella 8,8-13,1 1, yhdistettiin ja haihdutettiin alipaineessa öljyksi (56,3 g) kun taas alueella 13,1-24,6 1 eluoituva fraktio haihdutet-15 tiin samalla tavalla alipaineessa vaalean keltaiseksi kiinteäksi aineeksi (153,4 g). Aiemmin fraktion osoitettiin sisältävän suurelta osin tekijää B, kun taas myöhempi fraktio sisälsi tekijöiden A, B, C ja D seosta. Tässä myöhemmässä fraktiossa oleva tekijä B poistettiin asteettain toistamalla edellä kuvattu CCM kahdesti, käyttäen viimeisellä 20 kerralla tuoretta silikaa, samanlaisissa olosvhteissa virtausnopeuden ollessa kuitenkin 3 1/h.
Tekijöitä A, C ja D sisältävät fraktiot eluoituivat toisesta kolonnista alueella 8,8-17,6 1, ja tämän liuoksen sisältämä tekijä B -jäännös eroittui kolmannessa kolonnissa, josta tekijät A, C ja D eluoituivat alueella 14-28 1. Tämä 25 viimeinen yhdistetty eluaatti haihdutettiin alipaineessa kiinteäksi aineeksi (114 g). Kahdesta kolonnista saadut tekijät B sisältävät fraktiot 7,5-8,8 1 ja vastaavasti 10,3-13,4 1) haihdutettiin öljyiksi (10,7 ja vastaavasti 10 g) ja yhdistettiin ensimmäisestä kolonnista saatuun 30 öljyyn.
Tekijään B sisältävät öljyt liuotettiin kiehuvaan metanoliin (25 ml), ja liuos sekoitettiin kiehuvaan propan-1-oliin (100 ml). Jäähdytettäessä liuos 4°C:seen tekijä B kiteytyi. Se erotettiin suodattamalla, pestiin metanolilla 35 (200 ml), jäähdytettiin -20°C:seen ja kuivattiin alipaineessa, jolloin saatiin 25,3 g tekijää B.
30 875 66
Kolmannesta silikapylväästä saatu kiinteä aine, joka sisälsi tekijöitä A, C ja D, kuivattiin alipaineessa vakiopainoon (87 g). Annokset (20 g) tätä kiinteää ainetta liuotettiin metanoliin (190 ml) ja täytettiin 230 mlrksi 5 asetonitriilin ja veden seoksella (tilavuussuhde 7:3).
Liuos käsiteltiin annoksittain (5 ml) kromatografiakolon-nissa (250 x 21,2 mm) Spherisorb ODS-2:lla (hiukkaskoko 5y.um) eluenttina asetonitriilin ja veden seos (7:3). Virtausnopeus pidettiin 20 ml/min:na noin 10 s, nostettiin 10 sitten tasaisesti 34 ml/min:ksi 22 min aikana ja pidettiin tässä arvossa vielä 3 min. Eluoituvat tekijät detektoitiin aallonpituudella 238 nm. Tekijä C eluoitui ajanjaksona 11,0-13,4 min, I ok i j ä I) 11,4-17,4 min ja t ok t j n Λ 17,4- 23,0 min.
15 Kustakin kromatografisesta erotuksesta saadut teki jää C sisältävät fraktiot yhdistettiin ja haihdutettiin alipaineessa kiinteäksi aineeksi. Tekijää A sisältävät fraktiot haihdutettiin samalla tavalla kiinteäksi aineeksi. Myös tekijää D sisältävät fraktiot yhdistettiin ja haihdu-20 tettiin epäpuhtaaksi kiinteäksi aineeksi (7 g). Tämä liuotettiin uudelleen metanoliin (65 ml) , sekoitettiin asetonitriilin ja veden seokseen (7:3), ja käsiteltiin uudelleen kromatografisesti Spherisprb ODS-2 -kolonnilla muuten edellä kuvatulla tavalla mutta käyttäen koko ajan virtausnopeut-25 ta 20 ml/min. Tekijä D eluoitui nyt ajanjaksona 16-20 min, jakustakin kromatografiakäsittelystä saadut nämä fraktiot yhdistettiin. Yhdistetty eluaatti haihdutettiin kiinteäksi aineeksi. Tekijöitä A, C ja vastaavasti D sisältävät kolme kiinteää ainetta kuivattiin P2C>5:llä alipaineessa vakio-30 painoon (55, 7,0 ja vastaavasti 1,21 g) .
Tällä menetelmällä eristettyjen neljän kiinteän aineen osoitettiin kunkin olevan samanlaisia kuin autenttiset tekijöiden A, B, C ja D näytteet.
i 31 Z7Z6f.
Esimerkki_8 250 ml erlenmeyerpullot, jotka sisälsivät 50 ml alustaa B, inokuloitiin 0,5 ml:11a esimerkin 1 mukaisesti valmistetuista putkista saatuja suspensioita ,jotka sisäl-5 sivät Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12111:n, 12112:n, 12113:n ja vastaavasti 12114:n itiöitä.
Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12111:ä, NCIB 12112:a ja NCIB 12113:a sisältäviä pulloja inkuboitiin 31°C:ssa pyöröravistimessa.Streptomyces thermoarchaensis 10 NCIB 12114:ä sisältävää pulloa inkuboitiin 28°C:ssa 2 vrk, ja siirrettiin sitten 1 ml lientä toiseen 250 ml:n erlen-meyerpulloon, joka sisälsi 50 ml alustaa B. Tätä pulloa inkuboitiin 31°C:ssa pyöröravistimessa. Kaikkia pulloja ravisteltiin kierrosnopeudella 250 min ^ kiertoradan läpi-15 mitan Ohiossa 50 mm.
4 vrk:n inkuboinnin jälkeen sentrifugoitiin 10 ml:n näytettä kustakin liemestä kiihtyvyydellä 1250 g 45 min ja käsiteltiin seuraavasti. Supernatantti heitettiin pois, ja pelletti suspendoitiin metanoliin siten, että kokonais-20 tilavuudeksi tuli 10 ml. Suspensiota ravisteltiin voimakkaasti ja jätettiin seisomaan 1 tunniksi välillä sekoittaen. Sitten suspensiota sentrifugoitiin kiihtyvyydellä 10 000 g 5 min,ja supernatantti analysoitiin HPLC:llä (S5 ODS-2, 10 cm x 4,6 mm, 70 % CH3CN/ = ,1 M NH4H2P04).
25 Piikkejä seurattiin aallonpituudella 246 nm.
HPLC-analyysi osoitti tekijöiden A, B, C ja D läsnäolon kussakin tapauksessa.
Esimerkki 9
Tekijöillä A, B, C, D, E ja E’ on havaittu olevan 30 seuraavat ominaispiirteet: i) Ne sisältävät vain hiiltä, vetyä ja happea.
ii) Tekijöiden A, B, C, D, E ja F elektroni-isku (E .I.)massaspektrometriassa saatiin seuraavat tulokset: S / 5 6 6 32
Tekijä molekyyli- vastaa molekyvli- _ ioni_ kaavaa_ A 612,37 C 36H 520 9 B 398,33 C35H50O3 5 C 584,34 ^H.gOg D 598 ,35 C 3 5H 50ϋ 3 E 61 2,3630 C 36H 52° 3
F 626,3807 C37H54°S
10 FAB-massaspektrometriassa (pommitus nopeilla ato meilla) saatiin seuraavat tulokset: 15 Tekij ä +ve FAB -ve FAB mol-oaino A M/Z 635[M+Na]+ M/Z 611[M-H]“ 612 M/Z 613[M+H]+ B M/Z 691[M+H+qlycerol]+ 598 . 20 M/Z 599[M+H]+ M/Z 581 [MH-H20]+ M/Z 563[MH-2H20]+ C M/Z 607[M+Na]+ M/Z 583[M-H]~ 584 25 D M/Z 621 [M+iMa]+ M/Z 597[M-H]~ 598 il 33 87366
Tekijän E kenttädesorptiomassaspektrometriassa saatiin seuraava tulos: M/Z 612 M+; tekijälle F tulos oli M/Z 62 6 M+.
Tekijän A E .I.-massaspektrometriassa, jossa teh-5 tiin tarkka massan mittaus, saatiin seuraavat ionit: 612,37 C36H52Q3; 460,31 448,30 C30HucQ3; 425,23 C26H330 5; 354,22 C23H30O3; 297,22 C2,H29n; 273,1 1 CL5H180c; 247,17 C1SH2,G2; 219,18 C,5H 230; 10 95,05 C8H70.
Tekijän B E.I.-spektri (tarkka massan mittaus) osoitti seuraavat ionit: 593,35 C35Hc0O3; 433,28 C28M3S0^; 420,26 C23H3503; 15 314,19 C2gH2S03; 248,14 C,5H20O2; 151,08 C.}Hu02. .
Tekijän C E.I.-spektri (tarkka massan mittaus) osoitti seuraavat ionit: 584.34 C3uH„803; 560.33 C34H1+007; 438,29 023.4,30,,.
20 Tekijän D E.I.-spektri (tarkka massan mittaus) osoitti seuraavat ionit: #rn p M .0, : 434.29 C ·, q4 «O 3.
5=8,35 C35H50O3; 452,29 Ο,οΗ,ο^- i 29.3 3 25 Tekijän E tarkka massan mittaus E.I.-massa spektrometrian ionisaatiomallilla antoi ionin 452,2908 C29H40O4: tekijäHe F tulos oli 466,3067 C30H24°4· iii) Tekijöillä A, B, C, D, E ja F on bromofor-missa mitattuna karakteristiset IR-spektrit, joissa . . 30 on mm. seuraavat piikit:
Tekijä A: noin 3310 (OH) , 1712 (esteri) ja 998 cm ^ (C-O) ;
Tekijä B: noin 3510 (OH)/1710 (esteri) ja 996 cm ^ (C-O);
Tekijä C: noin 3510 (OH),1712 (esteri) ja 996 cm ^ (C-O);
Tekijä D: noin 3508 (OH),1711 (esteri) ja 996 cm ^ (C-O); 35 Tekijä E: noin 3500 (OH),1708 (esteri) ja 994 cm ^ (C-O); Tekijä F: noin 3500 (OH),1708 (esteri) ja 997 cm ^ (C-O); 34 87366
Tekijöiden A, B, C, D, E ja F spektrit esitetään kokonaisuudessa liitteenä olevien piirrosten kuvioissa 1, 2, 3, 4, 6 ja vastaavasti 7.
iv) Tekijöillä A, B, C, D, E ja F on metanolissa 5 (c = 0,002 %) mitattuna UV-spektri (I = käännekohta ja M = maksimi):
Tekijä Mnm) e} Tekijä x(nm) 10 A 252 (I) 318 D 252 (I) 263 244,5 (M) 468 244.5 (M) 393 239 (I) 430 239 (I) 362 B 252 (I) 302 * E 252 (I) 266 15 244,5 (M) 426 244 (M) 402 239 (I) 394 238 (M) 373 C 252 (I) 316 * F 252 ( I) 285 244,5 (M) 470 244,5 (M) 421 20 239 (O 432 239 (M) 389 (* metanoli_c = 0,001%) : Tulisi ottaa huomioon, että vaikka yllä annetut
λ -arvo ovat kullekin tekijälle karakteristisia, max 1 J
.1. jr heijastavat E -arvot materiaalin puhtautta sellaisena, • · 3 ' 1 ; kun se on saatu. E^-arvojen suhteet ovat kuitenkin karak- : : teristisia itse yhdisteelle.
v) Tekijöiden deuterokloroformiliuoksen protoni-NMR-spektrit (200 MHz) sisältävät signaali /τ-arvot; 3q multiplisiteetit, kvtkentävakiot (Hz) ja intergraalin arvot suluissa/· ί; 35 8 7 366
Teki jp A : 4,1 - 4,4(m,2H);4.61 (leveä s,1H);4.6 - 4,75(m,2H); 4181 (d , 9,1H); 5 ,05 (m, 1H); 5,34( s, 2H); 5 ,69(d , 5,1H); 6,06( d ,5,1H); 6.1 7 ( m, 1H); 6,26(d, 11,1H);6,37(m,1H);6,46(d,10,1H); 6,74(q,2,1H): 7,42(m, 1H);7,7 - 7f9(m,5H); 8,14(s,3H); 8,40(s,3H); 8,47(s,3H); 5 8,01(t, 11,1H); 8,96(d,7,3H); 9,06(d,7,3H ) ; 9,02(d ,7,3H ); 9,13(q,11,1H); 9,21(d,7,3H).
Tpki j M 8 : 4,2 - 4,4(m,2H); 4,55(a,7,1H); 4,65 ( 1 eve ä,s , 1H); 4,6- 4,8(m,2H); 5,06(m,1H); 3,3 - 5,5(m,2H); 6,0l(d5,1H); 6 ,07(d,5,1H) ; 10 6,12(s,1H); 6,24(d,11,1H); 6,24(m,1H); 6,3 - 6,5(m,2H); 6,53(s,3H); 6 ,73(q,2,1H); 7,62(m,1H); 7,6-8,0(m,4H); 8,22(s,3H); 8,35(d , 7,3H); 8 ,41(s ,3H); 8,49(s,3H); 8,62(t,11,1H); 9,03(d,6,3H); 9,12(q , 11,1H) ; 9,22(d,7,3H).
15 Tekj_jäC ^ 4,29(d,11 ,t ,2,1H) ;4,4 - 4,6 ( m , 3H) ; 4,56(L e ve ä s, 1H ) ; 5,14(dd , 15,10,1H); 5,23(m,1H); 5,65(levea S,2H); 5,72(d,6,1H); 5,95(d,10,1H); 5f99(d,6,1H); 6,08(leveä s,1H); 6,1 - 6,4(m,3H); 6,62 ( q, 3 , 1 H); 7,7 - 8,1( m , π. 711); 8,1 8 ( s , 3II); 8,33(s,3H); -.‘7 20 8,48(d,7,3H);8,64(s,3H) ;8,68(t,11 ,1H); 9,00(d,7,3H); 9,08( d ,7,3H); 9,12(q,12,lH).
Tekijä D : 4,18 - 4,4 (m,2H); 4,47 - 4,81 (m,4H); 5,04 (m,lH); 5,35 (s,2H); 5,72 (d,7,lH); 6,07 (d,7,lH); 6,15 - 6,45 (m,4H); 6,74 ·'-· 25 (q,4,1H)7,45 - 8,1 (m,8H); 8,16 (s,3H);8,41 (s,3H);8,49 (s,3H);8,62 (t, 11,1H); 8,92 - 9,05 (m,6H);9,21 (d,7,3H).
Tekijä E: 4,1 - 4,3 (m,2H); 4,5 - 4,8 (m ,4Hkaikklaan)5i04 (m,1H); 5.2 - 5,5 (m,2H); 6,01 (d,5,1H);6,05 (d,5,1H); 6,11 (s,1H); 6,1 * • ; 30 6,4 (m,3H);6,45 (d,10,1H); 6,51 (s,3H);6,70 (q,2,lH); 7,60 (m,1H);8,20 (s ,3H); 8,41 (s,3H); 8,47 (s,3H); 8,60 (t, 11,1H );9,00 (t,7,3H); 9,02 : . (d , 6,3H );9,11 (q,11,1H);9,20 (d,7,3H).
36 8 7 3 6 6
TgJji jä F.: 4,2 ~·ά,4 (m,2H); 4,62 (s,1H); n. 4,70 (m,2H); 4,80 (d ,9,1H); 5,04 (m,1H); 5,2 - 5,5 (m,2H); 5f99 (d,5,1H); 6^05 (d,5,1H);6,11 (s,1H); 6,1 - 6,3 (m,2H);n. 6,36 (m,1H);6,45 (d,10,1H); 6,51 (s , 3H ); 6,70 (q,2,1H );7,42 (m,1H);7,58 (m,1H); 8,19 5 (s,3H);8 ,40 (3,30):8,47 (s,3H);8,60 (t, 11,1H); 8,95 (d , 7,3H);9,05 (d ,7,3H ); 9,01 (d,7,3H); 9,10 (q,11,1H); 9,21 (d,6,3Hl.
13 vi) Tekijöiden deuterokloroformiliuoksen C-NMR- spektrit (kohinan poisto, 25,05 MHz) sisältävät piikit(6--j^q arvot; signaalin multiplisiteetit suluissa) :
TekiiäA: 173,2(s); 142,6(d); 139,2( s); 137,6(s); 137,1 ( s); 137,0(d); 130,4(s); 123,1(d); 120,1(d);117,8(d); 99,5(s); 80,0(s); 79,0(d); 76,5(d); 69,0(d); 68,3»; 67.4(d); 48,2(t); 45.5(d); 40,9(t); 15 40,5(t); 35,8»; 34,5(t); 22,1(a); 34,5(t); 26.6(d); 22.6(a); 22,0(q); 19,7(q); 15,3(q); 13,7(q);10t8(q).
Tekijä B: 173,4(s); 142.1(d); 139,5(s); 137,1(s); 135,7(s); 133,7(s); 123.6(d); 123,3(d);120,0(d);119,3(d); 118.2(d); 99,5(s); 20 80 ,1 (s); 77,3(d);76,6(d);76,4(d); 69,0(d);68,3(d);67,9 *;67,6 - »;57,5(q);48,2(t); 45.4(d); 40,7(t); 40,5(t); 35,8*; 34,5(t); 22,1(q); 'Λ.-; 19,6( q); 1 5,3 (q) ; 13 ,6 (q) ; 12,9( q); 10,5(q).
: Tekijä C; 173,3( s); 142.2(d); 140,3(s); 138,5(s); 137,0(s); 25 ; 1 34,9 (s); 123,9(d); 121, Kd); 120.6(d); 11 8,1 ( d); 100,2(s); 80,6(s); 80,1(d); 77,4(d);69,2(d);69,0(d); 68,3 +;68,Q(d); 67,9(d);48 ,6(t); 46,3(d); 41,4(t); 36,5 *;36,3 *;36,1(d);35 ,0(t); 22 ,6(q);20,0(q); V ' 30 15,4(q);14j3(q);13,1(q);10,8(q).
Tekijäp; 173,2 (s); 142.5 (d); 139,1 (s); 137^5 (s). q37>1 (s).
132,1 (s); 131,4 (d); 123,1 (d);120,1 (d);117rg (d); 99,5 (s); 79,9 (s); 79,2 (d); 76,5 (d);69,0 (d); 68,3*;68,167,6»; 67,4 *; 48,2 35 (t);45,5 (d);40,8 (t); 40,5 (t);35,7 *;34,5 (t);22,0 (q);20,6 (t);19,6 (q); 15,3q);13,7 (q);13,6 (q);10,7 (q).
* multipii siteetti epävarma.

Claims (5)

37 87566
1. Menetelmä antibioottisesti aktiivisten yhdisteiden valmistamiseksi, joilla on kaava III
5 OH /V *CH, CH -'ΛΝ H l 1 (III) -1 ντ I OH I^H m Hhr> 1 0R 2 jossa R on metyyli-, etyyli- tai isopropyyliryhmä ja R on vety tai metyyliryhmä, valmistamiseksi, tunnet- t u siitä, että viljellään mikro-organismia Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12015, tai sen mutanttia Strepto- 20 myces thermoarchaensis NCIB 12111, NCIB 12112, NCIB 12113 tai NCIB 12114, jolloin muodostuu kaavan III mukaista yhdistettä, ja erotetaan sitten haluttaessa vähintään yksi kaavan III mukainen yhdiste käymisliemestä.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, 25 tunnettu siitä, että syntyneessä yhdisteessä R 2 on isopropyyliryhmä ja R on vety.
3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mikro-organismin myseelit saatetaan kosketukseen veteen sekoittuvan liuottimen 30 kanssa yhden tai useamman, kaavan III mukaisen yhdisteen uuttamiseksi niistä.
4. Patenttivaatimuksen 1, 2 tai 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kaavan III mukaista yhdistettä tuotetaan oleellisesti puhtaana.
5. Mikro-organismit Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12015, NCIB 12111, NCIB 12112, NCIB 12113 ja NCIB 12114. 38 87 566
FI853520A 1984-09-14 1985-09-13 Foerfarande foer framstaellning av antibiotiskt aktiva foereningar och mikroorganismer anvaendbara vid foerfarandet FI87366C (fi)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FI905608A FI95134C (fi) 1984-09-14 1990-11-13 Kemiallisia yhdisteitä ja niiden käyttö pestisideinä

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB8423278 1984-09-14
GB848423278A GB8423278D0 (en) 1984-09-14 1984-09-14 Antibiotic compounds
GB848432519A GB8432519D0 (en) 1984-12-21 1984-12-21 Antibiotic compounds
GB8432519 1984-12-21

Publications (4)

Publication Number Publication Date
FI853520A0 FI853520A0 (fi) 1985-09-13
FI853520L FI853520L (fi) 1986-03-15
FI87366B FI87366B (fi) 1992-09-15
FI87366C true FI87366C (fi) 1992-12-28

Family

ID=26288220

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI853520A FI87366C (fi) 1984-09-14 1985-09-13 Foerfarande foer framstaellning av antibiotiskt aktiva foereningar och mikroorganismer anvaendbara vid foerfarandet

Country Status (33)

Country Link
US (2) US4898821A (fi)
JP (2) JPH07116199B2 (fi)
KR (1) KR940004098B1 (fi)
AT (1) AT396250B (fi)
AU (1) AU596565B2 (fi)
BE (1) BE903232A (fi)
BG (1) BG44205A3 (fi)
BR (1) BR8504457A (fi)
CA (1) CA1313155C (fi)
CH (1) CH666690A5 (fi)
CS (1) CS268803B2 (fi)
DE (1) DE3532794A1 (fi)
DK (1) DK162099C (fi)
ES (2) ES8704545A1 (fi)
FI (1) FI87366C (fi)
FR (1) FR2570390B1 (fi)
GB (1) GB2166436B (fi)
GR (1) GR852232B (fi)
HU (1) HU197046B (fi)
IE (1) IE59394B1 (fi)
IL (1) IL76385A (fi)
IT (1) IT1182857B (fi)
LU (1) LU86074A1 (fi)
NL (1) NL8502511A (fi)
NZ (1) NZ213463A (fi)
PH (2) PH21995A (fi)
PL (1) PL152148B1 (fi)
PT (1) PT81125B (fi)
RO (1) RO92478A (fi)
SE (2) SE502748C2 (fi)
SU (1) SU1738090A3 (fi)
UA (1) UA19162A (fi)
ZW (1) ZW15585A1 (fi)

Families Citing this family (69)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
LV5536A3 (lv) * 1984-09-14 1994-03-10 American Cyanamid Co Panemiens antibiotikas s-541 iegusanai streptomicetu celmi-antibiotikas s-541 producenti
US4696922A (en) * 1984-11-26 1987-09-29 Ciba-Geigy Corporation 5-azolylacetoxymilbemycins as ecto- and endoparasites
AU596586B2 (en) * 1985-04-30 1990-05-10 American Cyanamid Company Chemical derivatives of antibiotics S541
AT399441B (de) * 1985-04-30 1995-05-26 American Cyanamid Co Schädlingsbekämpfungsmittel und verfahren zur bekämpfung von schädlingen
ES8800986A1 (es) * 1985-07-27 1987-12-01 Pfizer Un procedimiento para la produccion de un nuevo derivado de avermectina
NZ217567A (en) * 1985-09-13 1988-07-28 Glaxo Group Ltd Avermectin/milbemycin derivatives
CA1288425C (en) * 1986-03-12 1991-09-03 Michael V.J. Ramsay Macrolide compounds
GB8606105D0 (en) * 1986-03-12 1986-04-16 Glaxo Group Ltd Chemical compounds
GB8606120D0 (en) * 1986-03-12 1986-04-16 Glaxo Group Ltd Process
IE60755B1 (en) * 1986-03-12 1994-08-10 American Cyanamid Co Macrolide compound
GB8606116D0 (en) * 1986-03-12 1986-04-16 Glaxo Group Ltd Process
AT398312B (de) * 1986-03-12 1994-11-25 American Cyanamid Co Verfahren zur herstellung einer neuen makroliden verbindung
CA1296329C (en) * 1986-06-06 1992-02-25 Derek R. Sutherland Macrolide compounds
GB8613790D0 (en) * 1986-06-06 1986-07-09 Glaxo Group Ltd Chemical compounds
US5840704A (en) * 1986-07-16 1998-11-24 Pfizer Inc. Antiparasitic agents and process for their preparation
NZ221077A (en) * 1986-07-18 1990-06-26 Ciba Geigy Ag 13b-alkyl milbemycins and use as parasiticides
EP0254583B1 (en) * 1986-07-24 1994-09-07 Beecham Group Plc Parasiticidal milbemycin derivatives, a process for their production, and compositions containing the same
US5149832A (en) * 1986-09-12 1992-09-22 American Cyanamid Company Mono and diacyl derivatives of ll-f28249 compounds
US4916154A (en) * 1986-09-12 1990-04-10 American Cyanamid Company 23-Imino derivatives of LL-F28249 compounds
ATE82017T1 (de) * 1986-09-12 1992-11-15 American Cyanamid Co 23-deoxy-derivate von ll-f28249-verbindungen.
US5019589A (en) * 1986-09-12 1991-05-28 American Cyanamid Company Δ23 -LL-F28249 compounds
EP0259779B1 (en) * 1986-09-12 1994-08-10 American Cyanamid Company 23-Oxo (Keto) and 23-imino Derivatives of LL-F28249 Compounds
US4886828A (en) * 1986-09-12 1989-12-12 American Cyanamid Company Δ22 -derivatives of LL-F28249 compounds
US5525506A (en) * 1987-01-23 1996-06-11 Pfizer Inc. Process for production of avermectins and cultures therefor
US5238848A (en) * 1987-01-23 1993-08-24 Pfizer Inc Cultures for production of avermectins
US5234831A (en) * 1987-01-23 1993-08-10 Pfizer Inc Cultures for production of B avermectins
US5183749A (en) * 1987-02-04 1993-02-02 Sankyo Company, Ltd. Microbial process for the preparation of milbemycin derivatives
US4897416A (en) * 1987-02-18 1990-01-30 Ciba-Geigy Corporation Insecticides and parasiticides
US4886830A (en) * 1987-03-06 1989-12-12 American Cyanamid Company Mono- and diepoxide derivatives of 23-deoxyl-LL-F28249 compounds
US4851428A (en) * 1987-03-06 1989-07-25 American Cyanamid Company Mono- and diepoxide derivatives of Δ22-LL-F28249 compounds
US4956479A (en) * 1987-03-06 1990-09-11 American Cyanamid Company 23-deoxy-27-chloro derivatives of LL-F28249 compounds
US4886829A (en) * 1987-03-06 1989-12-12 American Cyanamid Company 23-Oxo (keto) and 23-imino derivatives of mono- and diepoxy LL-F28249 compounds
US4876272A (en) * 1987-03-06 1989-10-24 American Cyanamid Company Mono- and diepoxide derivatives of LL-F28249 compounds
US4855317A (en) * 1987-03-06 1989-08-08 Ciba-Geigy Corporation Insecticides and parasiticides
US4806527A (en) * 1987-03-16 1989-02-21 Merck & Co., Inc. Avermectin derivatives
US4871719A (en) * 1987-03-24 1989-10-03 Ciba-Geigy Corporation Composition for controlling parasites in productive livestock
EP0285561A3 (de) * 1987-03-27 1989-10-25 Ciba-Geigy Ag Parasitizide und insektizide Milbemycin-Derivate
GB8721375D0 (en) * 1987-09-11 1987-10-21 Glaxo Group Ltd Chemical process
GB8721377D0 (en) * 1987-09-11 1987-10-21 Glaxo Group Ltd Chemical compounds
GB8721378D0 (en) * 1987-09-11 1987-10-21 Glaxo Group Ltd Chemical process
GB8721647D0 (en) * 1987-09-15 1987-10-21 Pfizer Ltd Antiparasitic agents
US5240850A (en) * 1987-10-23 1993-08-31 Pfizer Inc. Cultures for production of avermectin aglycones
ES2045146T3 (es) * 1987-11-09 1994-01-16 Pfizer Avermectinas etiladas.
GB8726730D0 (en) * 1987-11-14 1987-12-16 Pfizer Ltd Antiparasitic agents
GB8803836D0 (en) * 1988-02-18 1988-03-16 Glaxo Group Ltd Compositions
GB8804440D0 (en) * 1988-02-25 1988-03-23 Pfizer Ltd Antiparasitic agents
GB8805978D0 (en) * 1988-03-14 1988-04-13 Glaxo Group Ltd Process
GB8813760D0 (en) * 1988-06-10 1988-07-13 American Cyanamid Co Chemical process
NZ232422A (en) * 1989-02-16 1992-11-25 Merck & Co Inc 13-ketal milbemycin derivatives and parasiticides
US5322692A (en) * 1989-02-28 1994-06-21 American Cyanamid Company Sustained release bolus effective for the prolonged prevention, treatment or control of nematode, acarid and endo- and ectoparasitic infestations of ruminants
US6001822A (en) * 1989-04-11 1999-12-14 Pfizer Inc. Antiparasitic formulations
ES2052173T3 (es) * 1989-04-11 1994-07-01 Pfizer Composiciones inyectables que contienen 25-cyclohexil-avermectina b1.
EP0426948B1 (en) 1989-08-11 1996-05-08 American Cyanamid Company Arylpyrrole insecticidal acaricidal and nematicidal agents and methods
NZ234802A (en) * 1989-08-14 1992-11-25 Merck & Co Inc Long acting injectable formulations comprising an avermectin compound and triacetin. treatment for internal and external parasites of animals
US5830875A (en) * 1989-10-30 1998-11-03 Merck & Co., Inc. 24-and 25-substituted avermectin and milbemycin derivatives
US5055454A (en) * 1989-10-30 1991-10-08 Merck & Co., Inc. 13-epi-avermectin derivatives useful as antiparasitic agents
US5208222A (en) * 1991-03-28 1993-05-04 Merck & Co., Inc. 4"-and 4'-alkylthio avermectin derivatives
US5262400A (en) * 1991-06-20 1993-11-16 Merck & Co., Inc. 4α-substituted avermectin derivatives
MD24C2 (ro) * 1991-07-09 1994-05-31 Fabrica De Parfumerii Si Cosmetica "Viorica" Compoziţie de substanţe odorante
GB9205007D0 (en) * 1992-03-07 1992-04-22 Pfizer Ltd Antiparasitic agents
US5229415A (en) * 1992-03-24 1993-07-20 Merck & Co., Inc. Alkylthio alkyl avermectins are active antiparasitic agents
US6103504A (en) * 1992-03-25 2000-08-15 Pfizer Inc. Process for production of avermectins and cultures therefor
US6486195B1 (en) * 1993-08-19 2002-11-26 Merck & Co., Inc. Thermodynamically stable crystal form of 4″-deoxy-4″-epi-methylamino avermectin B1a/B1b benzoic acid salt and processes for its preparation
JP2855181B2 (ja) 1993-12-10 1999-02-10 敏雄 鈴木 松類の枯損防止用組成物及び防止方法
WO1999017760A2 (en) 1997-10-02 1999-04-15 Microcide Pharmaceuticals, Inc. Fungal or mammalian cell efflux pump inhibitors for enhancing susceptibility of the cell to a drug
ATE320812T1 (de) 2000-10-10 2006-04-15 Wyeth Corp Anthelmintika
GB0205253D0 (en) * 2002-03-06 2002-04-17 Univ Gent Immediate release pharmaceutical granule compositions and a continuous process for making them
JP2008531553A (ja) * 2005-02-25 2008-08-14 メディジーンズ カンパニー リミテッド 血漿または血清を含むアベリノ角膜ジストロフィー治療用の医薬組成物
CN100394983C (zh) * 2006-01-09 2008-06-18 浙江海正药业股份有限公司 含有大豆油的多拉菌素注射液

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS4914624A (fi) * 1972-06-08 1974-02-08
SE434277B (sv) * 1976-04-19 1984-07-16 Merck & Co Inc Sett att framstella nya antihelmintiskt verkande foreningar genom odling av streptomyces avermitilis
IL56149A (en) * 1977-12-19 1989-09-28 Merck & Co Inc 13-halo and 13-deoxy derivatives of c-076 compounds,their preparation and method for the treatment of parasitic infections in animals therewith
US4173571A (en) * 1977-12-19 1979-11-06 Merck & Co., Inc. 13-Halo and 13-deoxy derivatives of C-076 compounds
US4171314A (en) * 1977-12-19 1979-10-16 Merck & Co., Inc. 13-Halo and 13-deoxy C-076 compounds
US4200581A (en) * 1978-08-04 1980-04-29 Merck & Co., Inc. Alkyl derivatives of C-076 compounds
NZ201681A (en) * 1981-09-03 1985-11-08 Merck & Co Inc Avermectin derivatives and parasiticidal compositions
PT80577B (pt) * 1984-06-05 1987-09-18 American Cyanamid Co Processo para a producao de novos agentes macrolidos ll-f28249 uteis no tratamento de infeccoes helminticas por ectoparasitas artropodes e por acarideos
AU596586B2 (en) * 1985-04-30 1990-05-10 American Cyanamid Company Chemical derivatives of antibiotics S541
ES8800986A1 (es) * 1985-07-27 1987-12-01 Pfizer Un procedimiento para la produccion de un nuevo derivado de avermectina

Also Published As

Publication number Publication date
NL8502511A (nl) 1986-04-01
CS268803B2 (en) 1990-04-11
DK418085D0 (da) 1985-09-13
FR2570390B1 (fr) 1987-11-27
AT396250B (de) 1993-07-26
JPH07213278A (ja) 1995-08-15
GB8522699D0 (en) 1985-10-16
DE3532794A1 (de) 1986-04-17
GB2166436B (en) 1989-05-24
CS654685A2 (en) 1989-08-14
ZW15585A1 (en) 1986-04-23
BE903232A (fr) 1986-03-13
US4898821A (en) 1990-02-06
BR8504457A (pt) 1986-07-15
UA19162A (uk) 1997-12-25
FI853520A0 (fi) 1985-09-13
SE469173B (sv) 1993-05-24
PT81125A (en) 1985-10-01
IL76385A0 (en) 1986-01-31
PL255360A1 (en) 1988-02-18
LU86074A1 (fr) 1986-04-03
JPH07116199B2 (ja) 1995-12-13
AU4742685A (en) 1986-03-20
ES8802555A1 (es) 1988-08-01
SE8802985D0 (sv) 1988-08-25
NZ213463A (en) 1993-04-28
RO92478A (ro) 1987-09-30
FI87366B (fi) 1992-09-15
GB2166436A (en) 1986-05-08
SE8504254L (sv) 1986-03-15
PT81125B (pt) 1987-10-20
SE502748C2 (sv) 1995-12-18
PH24247A (en) 1990-05-04
AU596565B2 (en) 1990-05-10
DK162099C (da) 1992-02-24
DK418085A (da) 1986-03-15
DK162099B (da) 1991-09-16
PL152148B1 (en) 1990-11-30
IT1182857B (it) 1987-10-05
SE8504254D0 (sv) 1985-09-13
KR940004098B1 (ko) 1994-05-13
ATA268485A (de) 1992-11-15
JP2566385B2 (ja) 1996-12-25
IE59394B1 (en) 1994-02-23
IT8548551A0 (it) 1985-09-13
US4935531A (en) 1990-06-19
CA1313155C (en) 1993-01-26
SE8802985L (sv) 1988-08-25
ES557237A0 (es) 1988-08-01
GR852232B (fi) 1986-01-14
CH666690A5 (de) 1988-08-15
FR2570390A1 (fr) 1986-03-21
FI853520L (fi) 1986-03-15
IL76385A (en) 1990-09-17
ES546962A0 (es) 1987-04-01
HU197046B (en) 1989-02-28
SU1738090A3 (ru) 1992-05-30
JPS61118387A (ja) 1986-06-05
HUT39779A (en) 1986-10-29
ES8704545A1 (es) 1987-04-01
IE852263L (en) 1986-03-14
PH21995A (en) 1988-05-02
KR860002576A (ko) 1986-04-26
BG44205A3 (en) 1988-10-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
FI87366C (fi) Foerfarande foer framstaellning av antibiotiskt aktiva foereningar och mikroorganismer anvaendbara vid foerfarandet
EP0726902B1 (en) Polycyclic antiparasitic agents, process and strain for their preparation and their use
CA2264066C (en) Antiparasitic compounds isolated from fermentation of nodulisporium sp
NO148856B (no) Fremgangsmaate ved fremstilling av nye anthelmintiske forbindelser betegnet c-076
EP0410615B1 (en) Antiparasitic agent
US5182207A (en) Strains of streptomyces thermoarchaensis
EP0001709A2 (en) Deoxynarasin antibiotics, their production and use
JPH03173892A (ja) Ｌ―６８３，５９０の微生物変換生成物
NZ227005A (en) Polycyclic compounds, derivatives of paraherquamide, from fermentation of penicillium charlesii mf 5123; pesticidal compositions
CA2013412A1 (en) Anthelmintic bioconversion products
IE60755B1 (en) Macrolide compound
AT398312B (de) Verfahren zur herstellung einer neuen makroliden verbindung

Legal Events

Date Code Title Description
MM Patent lapsed
MM Patent lapsed

Owner name: AMERICAN CYANAMID COMPANY