FR2570390A1 - Nouveaux composes antibiotiques et procede de preparation - Google Patents

Abstract

L'INVENTION CONCERNE DES COMPOSES ANTIBIOTIQUES ET LEUR PREPARATION. LES COMPOSES REPONDENT A LA FORMULE I. CES COMPOSES PEUVENT POSSEDER UN GROUPE 5-OH OU -OME ET, EN POSITION 25, UN RADICAL ISOPROPYLENE A SUBSTITUTION METHYLIQUE, ETHYLIQUE OU ISOPROPYLIQUE. CES COMPOSES CONVIENNENT EN AGRICULTURE OU EN MEDECINE COMME SUBSTANCES ANTIPARASITAIRES ET SE PREPARENT PAR LA CULTURE DE SOUCHES DE STREPTOMYCES, PLUS PARTICULIEREMENT DE STREPTOMYCES THERMOARCHAENSIS NCIB 12015.

Description

La présente invention concerne de nouveaux composés

antibiotiques et des procédés de préparation de ces sub-

stances. De manière plus particulière, l'invention concer-

ne des composés antibiotiques que l'on peut obtenir par la fermentation d'organismes du genre Streptomyces.

Suivant l'un de ses caractéristiques, la présente in-

vention a pour objet une nouvelle classe de substances que la demanderesse a appelé Antibiotiques S541 et que l'

on peut préparer en faisant croltre une souche d'un micro-

organisme non encore antérieurement décrite, dans des con-

ditions réglées. Les Antibiotiques S541 possèdent une ac-

tivité antibiotique et, plus particulièrement, une acti-

vité anti-endoparasite, anti-ectoparasite, antifongique, insecticide, nématocide et acaricide et leur utilisation pour l'agriculture, l'horticulture, la santé animale et humaine, présente un intérêt spécial. On peut également employer les composés à titre d'intermédiaires pour la préparation d'autres composés actifs. On peut obtenir les

substances par fermentation et les récupérer sous une for-

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me sensiblement pure de la manière décrite dans le pré-

sent mémoire.

Les Antibiotiques S541 constituent un groupe de com-

posés apparentés répondant à la formule partielle (I): OH

C3 CCH3

0-_50F

%%%%12 18 912 H

OH _ OH CH3 H isCH3 H

26 CH3

I g, L,- (

3 2570390

Six composés répondant à la formule partielle (II)

seront décrits de manière plus particulière dans la sui-

te du présent mémoire. La présente invention concerne

les composés qui répondent aux formules partielles sus-

mentionnées, tant individuellement qu'en combinaison. Pour certaines utilisations, par exemple en agriculture ou en horticulture, ou en médecine vétérinaire, il peut encore se révéler commode d'utiliser les Antibiotiques S541 sans séparation en leurs composants individuels, mais, à d' autres fins, par exemple en médecine humaine, il peut

être préférable de faire appel aux composés individuels.

La portée de la présente invention s'étend par conséquent

aussi à un composé suivant l'invention lorsqu'il se trou-

ve en mélange à au moins un autre composé suivant l'in-

vention, comme aussi aux composés individuels, par exem-

ple, sous forme sensiblement pure, ou sensiblement en l'

absence d'autres substances du type des macrolides.

Les Antibiotiques S541 tels qu'initialement isolés,

peuvent être aisément séparés par chromatographie sur si-

lice de la manière décrite dans la suite du présent mé-

moire, en deux composants possédant une activité antibio-

tique, par exemple anthelmintique et qui éteignent la fluorescence U.V. à 254 nm. Le composant I se caractérise

par une valeur Rf qui fluctue de 0,70 à 0,75 et le compo-

sant II se caractérise par une valeur Rf qui fluctue de

0,39 à 0,46, les valeurs Rf étant déterminées par chroma-

tographie en couche mince sur des plaques de silice 60 Merck 5735, en procédant à l'élution avec un mélange de chloroforme et d'acétate d'éthyle (3: 1). Les composants I et II (dans lesquels R2 représente respectivement -CH3 et -H) des Antibiotiques S541 forment une caractéristique

supplémentaire de la présente invention.

Les composants I et II peuvent eux-mêmes être davan-

vantage purifiés et ont engendré 6 composés de la formule

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partielle (I) possédant une activité antibiotique, par exemple anthelmintique. Par conséquent, suivant une autre de ses caractéristiques, la présente invention a pour objet des composés de la formule générale (III): OH

10.,,CH3

''>CH

0 < (III)

i..,R CH3' OR2 dans laquelle R1 représente un radical méthyle, éthyle ou isopropyle et R2 représente un atome d'hydrogène ou le

radical méthyle.

La demanderesse a appelé les 6 composés de la formu-

le (III) facteur A (R1 = isopropyle, R2 = hydrogène), fac-

teur B (R1 = méthyle, R2 = méthyle), facteur C (R1 = mé-

thyle, R2 = hydrogène), facteur D (R1 = éthyle, R2 = hy-

drogène), facteur E (R1 = éthyle, R2 = méthyle) et fac-

teur F (R1 = isopropyle, R2 = méthyle). On préfère tout particulièrement les facteurs A et C.

On obtient les facteurs B, E et F à partir du compo-

sant I, alors que les facteurs A, C et D s'obtiennent à par-

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tir du composant II.

Les composés conformes à la présente invention pos-

sèdent une activité antibiotique, par exemple une activi-

té anthelmintique, plus particulièrement contre des né-

matodes et, plus spécialement, une activité anti-endopa-

rasite et anti-ectoparasite. Plus généralement, les compo-

sés sont intéressants pour combattre des parasites tels

que les ectoparasites et les endoparasites. Les ectopara-

sites et les endoparasites infectent les êtres humains et

toute une série d'animaux et prévalent tout particulière-

ment chez les animaux des fermes, comme les porcs, les

moutons, le bétail, les chèvres et la volaille, les che-

vaux et les animaux domestiques, comme les chiens et les chats. L'infection du cheptel vivant par des parasites, conduisant à une anémie, une malnutrition et une perte de

poids, est une cause majeure d'une important perte écono-

mique de par le monde.

A titre d'exemples de genres d'endoparasites qui in-

fectent les animaux précités et/ou les êtres humains, on peut citer les suivants: Ancylostoma, Ascaridia, Ascaris, Aspicularis, Bunostomum, Capillaria, Chabertia, Cooperia, Dictyocaulus, Dirofilaria, Enterobius, Haemonchus, Heterakis, Necator, Nematodirus, Nematospiroides, Nippostronylus, OesophaQostomum, Ostertaia,, Oxyuris, Parascaris, Stronqylus, Strongyloides, Sypacia, Toxascaris, Toxocara, Trichonema, Trichostrongylus, Trichinella, Trichuris, and Uncinaria.

A titre d'exemples d'ectoparasites infectant les ani-

maux et/ou les êtres humains, on peut citer des ectopara-

sites du type des arthropodes, comme les insectes à mor-

sures, la lucilie, les puces, les poux, les mites, les

insectes suceurs, les tiques et d'autres insectes nuisi-

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bles diptères.

A titre d'exemples de genres d'ectoparasites qui infectent les animaux et/ou les êtres humains, on peut citer ceux qui suivent: Ambylomma, Boophilus, Coroptes, Culliphore, Damodex, Damolinia, Gastrophilus, Haematobia, Haematopinus, Haemophysalis, Hyalomma, Linoqnathus, Lucilia, Melophyqus, Oestrus, Psorergates,

Psoroptes, Rhipicephalus, Sarcoptes and Stomoxys.

Les composés suivant la présente invention se sont révélés être efficaces, tant in vitro qu'in vivo, contre toute une gamme d'endoparasites et d'ectoparasites. De manière plus particulière, la demanderesse a constaté

que les composés conformes à la présente invention étai-

ent actifs contre des nématodes parasites, tels que ceux

qui suivent: Haemonchus contortus, Ostertagia circumcinc-

ta, Trichostrongvlus colubiformis, Dictyocaulus vivipa-

ris, Cooperia oncophera, Ostertagia ostertagi et Nippos-

trongylus braziliensis, ainsi que des mites parasites,

comme Sarcoptes sp. et Psoroptes sp.

Les composés conformes à la présente invention sont par conséquent intéressants pour le traitement des animaux

et des êtres humains présentant des infections endoparasi-

tiques et/ou ectoparasitiques.

L'espèce du parasite varie en fonction de l'hôte et du site ou endroit prédominant de l'infection. Ainsi, par exemple, les organismes nuisibles Haemonchus contortus, Ostertagia circumcincta et Trichostrongylus colubiformis

infectent généralement les moutons et se logent, de ma-

nière prédominante,dans l'estomac et l'intestin grêle, tandis que Dictyocaulus viviparus, Cooperia oncophora et Ostertagia ostertagi infectent généralement le bétail et se logent de manière, prédominante, dans les poumons, les

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intestins ou l'estomac respectivement.

Au surplus, on a constaté que les composés suivant

la présente invention possédaient une activité antifongi-

que, par exemple, contre des souches de Candida sp. com-

me Candida albicans et Candida glabrata et contre des le-

vures, comme Saccharomyces carlsbergensis.

On a également constaté que les composés suivant la

présente invention étaient actifs contre le nématode vi-

vant libre Caenorhabditis elegans.

On a également constaté que les-composés suivant la présente invention étaient efficaces pour combattre des

organismes nuisibles appartenant aux insectes, aux aca-

riens et aux nématodes, dans le domaine agricole, horti-

cole, forestier, de la santé publique et des produits emmagasinés. On peut traiter utilement des parasites ou organismes nuisibles du sol et des récoltes végétales, y compris les céréales (par exemple le blé, l'orge, le mals et le riz), les légumes (par exemple le soja), les

fruits (par exemple les pommes, les raisins et les ci-

trus), comme aussi les récoltes à racines ou tubercules

(par exemple betterave sucrière, pomme de terre).

De manière plus particulière encore, la demanderes-

se a découvert que les composés suivant la présente in-

vention étaient actifs, contre par exemple, des aphis et

des mites des fruits, tels que les suivants: Aphis fa-

bae, Aulacorthum circumflexum, Myzus persicae, Nephotet

tix cincticeps, Nilp2arvata lugense Panonychus ulmi, Pho-

rodon humuli, Phyllocoptruta oleivora, Tetranychus urti-

cae et des membres des genres Trialeuroides; des némato-

des, comme des membres des genres Aphelencoides, Globode-

ra, Heterodera, Meloidogyne et Panaellus; des lépidop-

tères,-tels que Heliothis, Plutella et Spodo2tera; des charençorsdu grain, comme Anthonomus grandis et Sitophilus granarius; des ténébrions, tels que Iribolium castaneum;

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des mouches, comme Musca domestica; des fourmis du genre solénopsis; des adèles; Pear psylla; Thrips tabaci; des

blattes comme Blatella germanica et Periplaneta america-

na et des moustiques comme Aedes aegypti.

La présente invention a par conséquent pour objet des composés répondant à la formule partielle (I) telle que précédemment définie, que l'on peut utiliser à titre d'antibiotiques. De manière plus particulière, on peut utiliser ces substances pour le traitement d'animaux et

d'êtres humains infestés d'endoparasites, d'ectoparasi-

tes et/ou à infestations fongiques et également dans la

domaine agricole, horticole ou forestier, à titre de pes-

ticides, pour combattre des insectes, das acariens et des nématodes nuisibles. On peut également les utiliser de

manière générale comme pesticides pour combattre ou mal-

triser le développement d'organismes nuisibles en d'autres

circonstances, par exemple dans les magasins, les immeu-

bles ou d'autres pièces publiques ou endroits o se logent les organismes nuisibles en question. En général, on peut appliquer les composés soit à l'h8te (animal ou être

humain ou plante ou tout autre végétation) ou aux orga-

nismes nuisibles ou à leur biotope. On préfère particu-

lièrement les facteurs A, B, C, D, E et F telsque précé-

demment définis. On peut présenter les composés suivant

l'invention sous forme de compositions convenant à l'ad-

ministration de toute manière commode pour l'usage en mé-

decine humaine ou en médecine vétérinaire et, par consé-

quent, l'invention a également pour objet des composi- -

tions pharmaceutiques qui comprennent un composé suivant l'invention adapté à l'usage en médecine humaine ou en

médecine vétérinaire. Les compositions de ce genre peu-

vent être présentées pour l'usage d'une manière classi-

que à l'aide d'un ou de plusieurs excipients ou véhicu-

les appropriés.

Les compositions suivant la présente invention en-

globent celles qui se présentent sous une forme spécia-

lement destinée à l'administration par la voie parenté-

rale (y compris l'administration intramammaire), orale, rectale, topique ou sous forme d'implant. Lorsqu'on l' incorpore à une composition dont on exige qu'elle soit

stérile, par exemple des injections (y compris des prépa-

rations intramammaires), des collyres ou gouttes ophtal-

miques, des pommades et des implants, l'ingrédient actif

doit lui-même être fabriqué de manière aseptique ou sté-

rilisé après sa fabrication par mise en oeuvre de procé-

dés comme une irradiation par des rayons gamma ou une

exposition à l'oxyde d'éthylène.

On peut présenter les composés conformes à l'inven-

tion sous une forme convenant à l'usage en médecine vété-

rinaire ou en médecine humaine par injection et on peut les présenter sous la forme de doses unitaires, dans des ampoules, ou dans d'autres récipients contenant des doses

unitaires, ou encore dans des récipients qui en contien-

nent des doses multiples, avec un conservateur addition-

nel si cela se révèle nécessaire. Les compositions des-

tinées à l'injection peuvent se présenter sous la forme

de suspensions, de solutions ou d'émulsions dans des vé-

hicules huileux ou aqueux et peuvent contenir des agents

de mise en composition, comme des agents de mise en sus-

pension, de stabilisation, de solubilisation et/ou de dis-

persion. L'ingrédient actif peut aussi se présenter sous la forme d'une poudre stérile destinée à être ajoutée à

un véhicule stérile en vue de la reconstitution du médi-

cament avant son emploi, par exemple de l'eau apyrogène,

stérile. Comme véhicules huileux, on peut citer des al-

cools polyhydroxylés et leurs esters, comme des esters

de glycérol, des acides gras, des huiles végétales, com-

me l'huile d'arachide ou l'huile de graines de coton, n10 2570390 des huiles minérales, comme la paraffine liquide et 1' oléate d'éthyle et d'autres composés similaires. On peut

également utiliser d'autres véhicules, comme le propylè-

ne glycol. On peut également présenter les compositions destinées à l'usage en médecinevétérinaire sous la for-

me de préparations intramammaires dans des bases à libé-

ration prolongée ou à libération rapide de la substance

médicamenteuse et elles peuvent se présenter sous la for-

me de suspensions ou de solutions stériles dans des vé-

hicules aqueux ou huileux. Les véhicules huileux peuvent

être, par exemple, ceux décrits plus haut et peuvent éga-

lement contenir un agent de mise en suspension ou un agent épaississant, comme des paraffines molles ou dures, la cire d'abeille, la 12-hydroxystéarine, l'huile de ricin

hydrogénée, des stéarates d'aluminium, ou le monostéara-

te de glycéryle. On peut incorporer des agents tensio-

actifs non ioniques, cationiques ou anioniques, classi-

ques, seuls ou en combinaison, à la composition.

Les composés conformes à la présente invention peu-

vent également se présenter pour l'usage en médecine hu-

maine ou en médecine vétérinaire, sous une forme qui con-

vient à l'administration par la voie orale, par exemple sous la forme de solutions, de sirops ou de suspensions,

ou sous la forme d'une poudre sèche destinée à être in-

corporée à de l'eau ou à tout autre véhicule en vue de

la reconstitution du médicament avant son emploi, éven-

tuellement avec addition d'agents colorants et de sapidi-

té. On peut également utiliser des compositions solides,

comme des comprimés, des gélules, des pilules, des pas-

ties, des bols, des poudres, des pâtes ou des granules.

Les compositions solides et liquides destinées à l'

administration par la voie orale peuvent se préparer se-

lon des procédés bien connus des spécialistes de la tech-

nique. Des compositions de ce genre peuvent également con-

tenir un ou plusieurs excipients et/ou véhicules pharma-

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ceutiquement acceptables qui peuvent se trouver sous for-

me solide ou liquide. A titre d'exemples de véhicules ou excipients pharmaceutiquement acceptables, appropriés à l'emploi sous forme de doses solides, on peut citer des liants (par exemple amidon de mais prégélatinisé, poly- vinylpyrrolidone ou hydroxypropylméthylcellulose); des charges (par exemple lactose, cellulose microcristalline ou phosphate de calcium); des lubrifiants (par exemple stéarate de magnésium, talc ou silice); des agents de désintégration (par exemple amidon de pomme de terre ou glycolate d'amidon sodique); ou des agents mouillants

(par exemple laurylsulfate de sodium). Les comprimés peu-

vent être enrobés par mise en oeuvre de procédés bien con-

nus des spécialistes de la technique. Comme exemples d' additifs pharmaceutiquement acceptables appropriés à l' usage sous des formes de dosage liquides,on peut citer des agents de mise en suspension (par exemple sirop de

sorbitol, méthylcellulose ou graisses comestibles hydro-

génées); agents émulsifs (par exemple lécithine ou gomme d'acacia); véhicules non aqueux (par exemple l'huile d'

amande, esters hui-leux ou alcool éthylique); et des con-

servateurs (par exemple-p-hydroxybenzoates de méthyle ou de propyle ou acide sorbique); des agents de stabilisation et de solubilisation pouvant également être incorporés

aux compositions en question.

On peut préparer des pâtes destinées à l'administra-

tion par la voie orale par mise en oeuvre de procédés bien

connus des spécialistes de la technique. A titre d'exem-

ples d'additifs pharmaceutiquement acceptables appropriés que l'on peut utiliser dans des compositions de pâte, on

peut citer des agents de mise en suspension ou de gélifica-

tion, par exemple distéarate d'aluminium ou huile de

ricin hydrogénée; agents dispersants, par exemple po-

lysorbates, véhicules non aqueux, par exemple huile d'

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arachide ou esters huileux; agents de stabilisation et

de solubilisation. Les composés suivant la présente in-

vention peuvent également s'administrer en médecine vé-

térinaire en les incorporant à la nourriture solide ou liquide quotidienne des animaux, par exemple comme compo- sants de l'alimentation quotidienne de l'animal ou de son

eau de boisson.

Aux fins d'administration par la voie buccale, les compositions peuvent prendre la forme de comprimés, de potes ou de pastilles que l'on fabrique et présente de

manière classique.

On peut également administrer les composés suivant

la présente invention par la voie orale en médecine vété-

rinaire sous la forme d'une potion liquide qui se présen-

* te, par exemple, comme une solution, suspension ou dis-

persion de l'ingrédient actif en association avec un vé-

hicule ou excipient pharmaceutiquement acceptable.

Les composés suivant l'invention peuvent également se présenter sous la forme de suppositoires, par exemple contenant une base pour suppositoiresclassique destinée

à l'usage en médecine humaine ou en'médecine vétérinaire.

Les composés suivant la présente invention peuvent

également se présenter sous une forme convenant à l'admi-

nistration par la voie topique, pour l'usage en médecine humaine et en médecine vétérinaire, comme des pommades, des crèmes, des lotions, des poudres, des pessaires, des

sprays, des bains, des aérosols ou des gouttes (par exem-

ple des gouttes ophtalmiques ou nasales). Les pommades et les crèmes peuvent, par exemple, être composées avec une base aqueuse ou huileuse en recourant à l'addition d' agents épaississants et/ou gélifiants appropriés. Les pommades destinées à être administrées à l'oeil peuvent

se fabriquer d'une manière stérile en utilisant des compo-

sants stérilisés.

Des lotions peuvent être composées avec une base aqueuse-ou huileuse et contiennent également, en général, un ou plusieurs agents émulsifs, agents stabilisants, agents dispersifs, agents de mise en suspension, agents épaississants ou agents colorants.

Des poudres peuvent être formées à l'aide de n'impor-

te quelle base pulvérulente appropriée.

Des gouttes peuvent être composées avec une base

aqueuse ou non aqueuse et comprennent également un ou plu-

sieurs agents dispersifs, agents stabilisants, agents so-

lubilisants ou agents de mise en suspension. Elles peu-

vent également contenir un conservateur.

Pour l'administration par la voie topique par inha-

lation, on peut fournir les composés conformes à la pré-

sente invention à des fins destinées à l'usage en médeci-

ne vétérinaire ou en médecine humaine, sous la forme d'

un spray d'aérosol ou d'un produit destiné à être adminis-

tré par l'intermédiaire d'un insufflateur.

Les composés suivant la présente invention peuvent

s'administrer en combinaison à d'autres ingrédients phar-

maceutiquement actifs. Les doses quotidiennes totales des

composés suivant l'invention que l'on utilise tant en mé-

decine humaine quen médecine vétérinaire# varient dans la gamme de 1 à 2000>lg/kg de poids corporel, de préférence

de 10 à 1000 >ig/kg de poids corporel, plus avantageuse-

ment encore de 100 à 500 2g/kg de poids corporel et peu-

vent s'administrer en doses subdivisées, par exemple de

1 à 4 fois par Jour.

On peut présenter les composés conformes à la présen-

te invention de n'importe quelle manière commode pour 1' usage en horticulture ou en agriculture et, par conséquent, la portée de la présente invention s'étend également aux

compositions comprenant un composé suivant la présente in-

vention qui sont adaptées à l'usage horticole ou agricole.

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Ces compositions comprennent des types secs ou liquides, par exemple des poussières, comprenant des concentrés ou

bases pour poussières, des poudres, comprenant des pou-

dres solubles ou mouillables, des granules, y compris des microgranules et des granules dispersibles, des bou- lettes ou des grains, des produits fluides, des émulsions,

comme des émulsions diluées ou des concentrés émulsifia-

bles, des bains, comme des bains pour racines et des bains pour semences, des apçr ts pour semences, des grains ou

boulettes pour semences, des concentrés d'huile, de solu-

tions d'huile, des injections, par exemple des injections

pour souches, des sprays, des fumées et des brouillards.

Généralement, des compositions de ce genre compren-

nent le composé en association avec un diluant ou véhicu-

le approprié. Ces véhicules peuventse présenter sous la forme liquide ou solide et être destinés à faciliter 1' application du composé, que ce soit en le dispersant à 1' endroit o il doit être appliqué, ou. que ce soit pour fournir une composition qui peut être transformée par 1'

utilisateur en une préparation dispersible. Des composi-

tions de ce genre sont bien connues des spécialistes de la technique et peuvent être préparées par mise en oeuvre

de procédés classiques, tels que, par exemple, en mélan-

geant et/ou en broyant le ou les ingrédients actifs en même temps que le véhicule ou le diluant, par exemple le

véhicule solide, le solvant ou l'agent tensio-actif.

On peut choisir des véhicules solides appropriés à

la confection de compositions comme des poudres, des gra-

nulés et des poussières, par exemple, parmi les charges minérales naturelles, comme la terre à diatomées, le talc, la kaolinite, la montmorillonite, la pyrophyllite et l'

attapulgite. Si on le souhaite, de l'acide silicique for-

tement dispersé ou des polymères absorbants fortement dispersés peuvent être incorporés à la composition. Les

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véhicules absorbeurs granulés que l'on peut utiliser peu-

vent être poreux (par exemple pierre ponce, brique pilée,

sépiolite ou bentonite), ou non poreux (par exemple cal-

cite ou sable). A titre de matièresprégranulées, appro-

priées que l'on peut utiliser et qui peuvent être de na- ture organique ou inorganique,onpeut citer la dolomie et

des résidus de végétaux broyés.

Comme solvantsappropriés à utiliser comme véhicules ou diluants, on peut citer des hydrocarbures aromatiques,

des hydrocarbures aliphatiques, des alcools et des gly-

cols ou leurs éthers, des esters, des cétones, des amides d'acides$ des solvants fortement polaires, l'eau et des

huiles végétales éventuellement époxydées.

Les compositions en question peuvent également con-

tenir, seuls ou en combinaison, des agents tensio-actifs non ioniques, cationiques ou anioniques, classiques, par exemple des alcools et des alkylphénols éthoxylés, des sels de métaux alcalins ou de métaux alcalinoterreux d' acides alkylbenzène sulfoniques, d'acides lignosulfoniques ou d'acides sulfosucciniques ou des sulfonates de phénols polymères qui possèdent de bonnes propriétés émulsives,

dispersives et/ou mouillantes.

Si on le souhaite, on peut incorporer des stabill-

sants, des agents antiagglutination, des agents anti-

mousses, des agents de régulation de la viscosité, des

liants et des additifs, des photostabilisants, comme aus-

si des agents de fertilisation, des agents de stimulation de l'alimentation ou d'autres substances actives, aux

compositions en question. Les composés suivant la présen-

te invention peuvent également entrer dans les composi-

tions appropriées en mélange à d'autres insecticides,

acaricides et nématocides.

La concentration en principe actif dans les composi-

tions varie généralement de 0,01 à 99 % et, plus avanta-

geusement, de 0,01 % à 40 %, en poids.

-Lés produits industriels sont généralement fournis sous la forme de compositions concentrées destinées à être diluées Jusqu'à une concentration appropriée du principe actif, par exemple de 0,001 à 0,0001 % en poids, en vue

de leur application.

Pour l'usage en horticulture et en agriculture ou

pour l'usage en médecine vétérinaire, il peut être souhai-

table d'utiliser le bouillon de fermentation entier ou complet, sans séparation en composants ou facteurs, comme source des composés actifs. Il peut convenir d'utiliser

le bouillon séché (contenant les mycéliums) ou d'utili-

ser les mycéliums lysés, des mfycéliums vivants ou morts, séparés du bouillon par mise en oeuvre de techniques

d'évaporation ou de séparation solide/liquide, ou d'utili-

ser le bouillon de fermentation qui subsiste après la sé-

paration des mycéliums. Si on le souhaite, les mycé-

liums peuvent être pasteurisés ou, plus avantageusement,

séchés, par exemple par séchage par pulvérisation ou sé-

chage au rouleau. Si on le souhaite, le bouillon ou les

mycéliums peuvent être transformés en compositions com-

prenant des diluants, excipients ou véhicules inertes ou classiques, de la manière précédemment décrite.

Il faut bien comprendre de ce qui précède qu'en gé-

néral, on peut utiliser les composés conformes à la pré-

sente invention pour combattre des infections ou des in-

festations en appliquant une quantité efficace d'un ou plusieurs des composés précités à l'organisme responsable de l'infection ou de l'infestation ou à l'endroit o il se

loge.

Suivant une autre de ses caractéristiques, la pré-

sente invention a également pour objet un procédé de pro-

duction des Antibiotiques S541 ou d'un composant ou fac-

teur de ceux-ci, répondant à la définition précédemment

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1 7

donnée, caractérisé en ce qu'il comprend l'étape consis-

tant--k cultiver un organisme du genre Streptomyces capa-

ble de produire au moins l'un des composés suivant l'in-

vention, de manière qu'au moins l'un desdits composés soit produit et, si on le souhaite, à isoler le composé souhaité. L'organisme en est de préférence un qui produit

principalement un ou plusieurs composés suivant l'inven-

tion. Sur base d'études taxonomiques, un micro-organisme

particulier capable de produire les substances susmen-

tionnées appartient à une nouvelle espèce du genre StreE-

tomyces et a été dénommé Streptomyces thermoarchaensis.

Un échantillon de ce micro-organisme, qui est un isolat

du sol, a été déposé à la collection permanentede cultu-

res de l'institution britannique dénommée: National Col-

lections of Industrial and Marine Bacteria, Torry Re-

search Station, Aberdeeen, Royaume-Uni et on lui a attri-

bué le numéro d'accès NCIB 12015. Les caractéristiques morphologiques et relatives à la culture du Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12015 sont indiquées dans la suite du présent mémoire et cet organisme, en même temps que d'

autres souches de Streptomyces productrices d'Antibioti-

ques S541, constitue une autre caractéristique de la pré-

sente invention. De manière plus particulière, l'invention

s'étend à la nouvelle espèce de Streptomyces dont les mem-

bres possèdent les mêmes caractéristiques essentielles de

morphologie et de culture que Steptomyces thermoarchaen-

sis NCIB 12015.

La portée de la présente invention s'étend également à n'importe quels composés qui sont susceptibles d'être produits par fermentation de Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12015 et qui sont les isomères optiques des composés

de la formule (I).

L'organisme du genre Streptomyces sera de préférence

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Streptomvoes thermoarchaensis NCIB 12015 ou un mutant de celui-ci. Des mutants de Streptomyces thermoarchaensis NCIB

12015 peuvent surgir spontanément ou peuvent être pro-

duit._par mise en oeuvre de toute une série de procédés,

y compris ceux esquissés dans les techniques pour le dé-

veloppement de micro-organismes par H.I. Adler dans "Ra-

diation and Radioisotopes for Industrial Microorganisms",

Proceedings of the Symposium, Vienna 1973, p241, Interna-

tional Atomic Energy Authority. Des procédés de ce genre

comprennent un rayonnement ionisant, des procédés chimi-

ques, par exemple le traitement par de la N-méthyl-N'-

-nitro-N-nitrosoguanidine (NTG), de la chaleur, des tech-

niques génétiques comme la recombinaison, la transduc-

tion, la transformation, la lysogénisatlon et la conver-

sion lysogénique et des techniques sélectives pour l'ob-

tention de mutants spontanés. Ainsi, par exemple, la de-

manderesse a obtenu 4 souches mutantes de Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12015 et chacune d'entre elles a été déposée à la collection permanente de cultures de 1'

institution britannique National Collections of Industri-

al and Marine Bacteria, Torry Research Station, Aberdeen, Royaume-Uni et on a attribué les numéros d'accès NCIB

12111, NCIB 12112, NCIB 12113 et NCIB 12114 a ces souches.

StreDtom ces thermoarchaensis NCIB 12111, 12112, 12113

et 12114 et leurs mutants constituent une caractéristi-

que supplémentaire de la présente invention.

La souche NCIB 12015 a été déposée le 10 Septembre

1984 et les souches NCIB 12111-4 le 20 Juin 1985.

Les souches mutantes NCIB 12111, 12112 et 12113 ont été obtenues par le traitement de spores de Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12015 par de la NTG et ont ensuite

été caractérisées par le procédé en une étape de Holli-

day (R. Holliday (1956) Nature 178 987).

La souche mutante NCIB 12114 surgit par mutation spontanée de Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12015 et fut identifiée comme étant résistante à la streptomycine après être demeurée viable suite à l'exposition à 100 pug7mi de sulfate de streptomycine à 28 C pendant 5 jours. Des études taxonomiques indiquent que Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12015 constitue un micro-organisme antérieurement non encore révélé d'une nouvelle espèce dont les caractéristiques sont décrites dans la suite du

présent mémoire et sont essentiellement celles de l'es-

pèce comme un tout. Il faut bien comprendre que la por-

O tée de l'invention seétend à tous les membres de cette espèce9 y compris n'importe quel organisme possédant des caractéristiques essentielles sensiblement similaires Sur les milieux de sporulation préfirés, à savoir

farine d'avoine gélose, malt-levure gélose et sels inor-

ganiques-amidons gélose (Shirling, E.B. et Gottlieb, D.

(1966) Int. J. Syst. Bacteriol. 16, 313-340), StrEPto-

ces thermoarchaensis NCIB 12015 croit abondamment, pro-

duisant un mycélium substrat stable et un mycélium aérien portant des spores en chaines à spirales ouvertes ) comme ramifications hors des hyphes principales. Sur ces milieux, la pigmentation de l'envers est jaune/brun et les sporophores sont gris. A un agrandissement centuple, les sporcphores contiennent 2 à 5 tours par chaîne avec à 10 spores dans chaque tour de la spirale. En moyenne, les sporophores contiennent entre 20 et 50 spores. La mi- croscopie électronique à balayage avec un agrandissement de 12000 fois révèle que les spores sont à parois lisses et de forme ellipsoldale avec des dimensions de 0?7 pm x 1,4 Hm à leurs points les plus larges Streptom ces

O thermoarchaensis NCIB 12015 est Gram-positif et est ca-

pable de croître et de sporuler à des températures qui

fluctuent de 200C à 500C.

Une comparaison des données susmentionnées à des

descriptions publiées dans l'ouvrage de Bergey "Manual

of Determinative Bacteriology (8ème édition) indique que

l'orgahisme Streptomyces themoarchaensis NCIB 12015 ap-

partient au genre Streptomyces.

L'tidentification du Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12015 au niveau du groupe d'espèce a été effectuée

en utilisant une matrice d'identification associée à-un-

ordinateur, décrite par Williams et coll. (J. Gen. Mi-

crobiol (1983) 129, 1815-1830). Les résultats de 41 tests taxonomiques décrits par les auteurs susmentionnés sont les suivants pour Streptomyces thermoarchaensis

NCIB 12015:

CARACTERE RESULTAT

Chalnes de spores verticillati

Chainesde spores retinaculiaperti -

ChaLnes-de spores rectiflexibiles -

Chaines de spores spirales + Fragmentation de mycélium Spores à surface lisse +

Spores à surface rugueuse -

Couleur des spores grise +

Couleur des spores rouge -

Couleur des spores verte -

Envers Jaune/brun + Envers rouge/orange

Production de mélanine - -

Utilisation d'adonitol -

Utilisation de cellobiose + Utilisation de D-fructose + Utilisation de méso-inositol Utilisation d'insuline +

Utilisation de mannitol -

Utilisation de raffinose + Utilisation de rhamnose +

21 2570390

CHARACTERE RESULTAT

Utilisation de D-xylose +

Utilisation d'acide DL-a-aminobutyrique -

Utilisation de L-histidine + Utilisation de L-hydroxyproline - Dégradation d'allantoine -- - - + Dégradation d'arbutine + Dégradation de xanthine + Dégradation de pectine +

Dégradation de lécithine -

Réduction de nitrate + Production d'hydrogène sulfuré +

Tolérance à l'azoture de sodium (0,01%,p/v) -

Tolérance au chlorure de sodium (7%, p/v) -

Tolérance au phénol (0,1%,p/v) + Croissance à 45 0C +

Résistance à la néomycine (50 /ug/ml-1) -

Résistance à la rifampicine (50 /ug/ml-1) + Antibiose vis-à-vis de Aspergillus niger LIV 131 + Antibiose vis-à-vis de Bacillus subtilis

NCIB 3610 -

Antibiose vis-à-vis de Streptomyces murinus

ISP 5091 +

L'organisme n'a pas été identifié comme appartenant à l'un quelconque des 23 groupes d'espèces principaux (Williams, S.T. et collo (1983) J. Gen. Microbiol 129,

1815-1830),ni à l'un quelconque des groupes d'espèces mi-

neurs et des amas de membres uniques définis par Williams

et collaborateurs (J. Gen. Microbiol. (1983) 129, 1743-

1813). Les caractéristiques de Stertom ces thermoarchaen-

sis NCIB 12015 ont également été comparées aux descrip-

tions dtespèces de Streptomces connues dans l'ouvrage de Bergey Manual of Determinative Bacteriology (8ème édition),

en rapports ISP par Shirling et Gottlieb (Int. J. Syst.

Bacteriol. (1968) 18, 69-189; Int. J. Syst. Bacteriol.

(19ft) 18, 279-392; Int. J. Syst. Bacteriol. (1969). 19, 391-512; Int. J. Syst. Bacteriol (1972) 22, 265-394) et à quelques nouvelles espèces validement décrites dans 1' ouvrage International Journal of Systematic Bacteriolo-

gy depuis1980.

Aucun appariement n'a pu être établi entre Strep-

tomyces thermoarchaensis NCIB 12015 et une espèce décri-

te et, sur cette base, la demanderesse suppose que Strep-

tomyces thermoarchaensis NCIB 12015 est le premier mem-

bre connu d'une nouvelle espèce appartenant au genre Streptomyces. Les souches mutantes NCIB 12111, 12112, 12113 et 12114 possèdent toutes des caractéristiques essentielles

sensiblement semblables à celles de Streptomyces thermo-

archaensis. Cependant, la souche NCIB 12111 exige de 1' adénine pour sa croissance, la souches NCIB 12112 exige de la sérine pour sa croissance, la souche NCIB 12113 exige de l'histidine pour sa croissance et la souche

NCIB 12114 résiste à la streptomycine.

La production d'Antibiotiques S541 par fermentation-

d'un organisme du type Streptomyces approprié peut s'ef-

fectuer par mise en oeuvre de moyens classiques, c'est-

à-dire par la culture de l'organisme du type Streptomyces en présence de sources assimilables de carbone, d'azote

et de sels minéraux.

Les sources assimilables de carbone, d'azote et de

substances minérales peuvent être fournies par des sub-

stances nutritives simples ou complexes. Les sources de carbone englobent généralement le glucose, le maltose,

l'amidon, le glycérol, des mélasses, la dextrine, le lac-

* tose, le saacharose, le fructose, des acides carboxyli-

ques, des acides aminés, des glycérides, des alcools,

des alcanes et des huiles végétales. Les sources de car-

bone constituent généralement de 0,5 à 10 % en poids du ea4ooua aesnaeautAe snld a.qTuem ap uaTq no 'uoT!auamjae; ap naTIm ael suep nualqo TsuTB J 29A mnlnoouTl a9g -9jsuejXq qnad uo qa axnq.rno ap neaTçTm np 9q.Tquernb aeqqad aun M amsTuegaoîl ap ajods amao; UT luelnoouT ua amsçu -us oi Bp ZT;.ers929A umnlnoour un.zaedaad!nad uo ' aoues 0ú -sToao op a2îluo9p un no p.arnq un aaTAegp uTj$ 4sTem neatTm nu gtnJods amsTute2ao-ozoTm np uoTsuedsns etmpaun 9q.T1uenb aek.!ed eun jaeTnoour. aed uo 'quamaIBT;TuI *eS -unme.a no eo2nooes admeaxa ed 'uoTqeTSe.e uo u4agB snos neoTI Xo.A uemesneae.uea inad eile;.a DOle ep suo. z -Tmua xne ilumaaqTlnotT.ed snId 'DOo0f i q ap aoueagJ9;d ep;?0o0 q OZ ap aaneJ9dmae. aun q quamaleJ9uu anq.oae -las saoXmôo.daegS ad&. np amsTue2Jol ap amnl-no eI ssuToseq sael uoleas salleAee aq.u ed jeano e,l qned uo e jTssaoxa eaessnom oz un JesTaI;em anod quasid ea! qnad sessnom. ue un *a% -euoqeo %ae eanmaolqo 'eaqejlns 'e qdsoqd ejoq 'euapqX -om 'eJATno InoteiBo 'amoaqo 'uImnTpueA lesqueguem III eqoo teXTu 'ouTz 'umnTsgu2em 'Je; 'mnTuowmue 'umnTsselod 'umnTp L -os SUOT sap Jeapuaeue&p selqedo quos Tnb sgsTtT;n %uam -aBeJ9gu9 sles sea.uaqo:Sua ' aejn!no ap naTtm ne jai -od.zoou- q.ned uol enb sjTqTajnu xneTiuTm slas saa uoTe$uama$s ap naTITU np spTod ua % O. I'0o ap ue iButea9u9 %u$nTqsuoo Beozep soa0nos se 'sauTme OI qEta*nBp B9 aB9nsl aBsBI qln zUaweIe2q9 xnad uo "seq.uj.çu 8ep no mnruommegp leas sep '(uonigfos ua no zu.) OBTu oo9uE Uxu 6epToeap se2uelem sep 4euT9seo eM 'ses -EMIgm sep 1t.IE Bp! XejiXq& 'sag9oJq xTou op OUTiej et Isouoded sep 'UO!OO op seuTeJ ep euiJU$ eMI BJfaal ap sTeBaxa sep esalalITIsTp Bp selqnios s%.Tnpoid sap 's5m Bp UOTI.MaJgoB Bp snlanbTI sep 'ros ap seAej Bp aUTJ -B, eU luemal- cjaua2 %uauuaedmoo aozeBp seoanos saa 0uoú0eZIuamjaj ap nGfl m 0620iZ5

dans un ou plusieurs étages d'ensemencement o une crois-

sane- supplémentaire se produit, avant de procéder au transfert dans le milieu de fermentation principal. La fermentation se réalise généralement dans une gamme de pH de 5,5 à 8,5, de préférence de 5,5 à 7,5. On peut procéder à la fermentation pendant une période de 2 à

jours, par exemple environ 5 Jours.

Lorsqu'il est souhaitable de séparer la matière con-

tenant les Antibiotiques S541 et n'importe quels compo-

sants ou facteurs de ceux-ci du milieu de fermentation entier ou d'isoler n'importe lesquels des composants ou facteurs, on peut procéder à cette séparation ou à cet isolement par des techniques de séparation et d'isolement classiques. Les Antibiotiques 3541 suivant la présente invention sont contenus de manière prédominante dans les

mycéliums des cellules, mais on peut également les trou-

ver dans le bouillon de fermentation et on peut aussi ap-

pliquer les techniques d'isolement au bouillon de fermen-

tation avant ou après sa clarification. Il faut bien com-

prendre que le choix des techniques d'isolement peut va-

rier entre de larges limites.

On peut isoler et séparer les Antibiotiques 3541 par

mise en oeuvre de toute une série de procédés de fraction-

nement, par exemple en ayant recours à une absorption-élu-

tion, une précipitation, une cristallisation fractionnée et une extraction par solvant que l'on peut combiner de diverses manières. On a constaté que l'extraction par

solvant et la chromatographie et la cristallisation frac-

tionnée convenaient de la meilleure manière possible à 1'

isolement et à la séparation des composés suivant la pré-

sente invention.

Après la fermentation, on peut récolter les mycé-

liums en utilisant des méthodes classiques, par exemple la filtration ou la centrifugation. Ensuite, on peut, par exemple, extraire la matière des mycéliums à l'aide d' un solvant organique approprié, comme une cétone, par

exemple l'acétone, la méthyléthylcétone ou la méthyliso-

butylcétone; un hydrocarbure, par exemple l'hexane; un hydrocarbure halogéné, par exemple le chloroforme, le tétrachlorure de carbone ou le chlorure de méthylène; un alcool, par exemple le méthanol ou l'éthanol; ou un diol,

par exemple le propane-1,2-diol; ou un ester, par exem-

ple l'acétate de méthyle ou l'acétate d'éthyle. Il faut bien pomprendre que si les mycéliums contiennent de notables proportions d'eau, il est préférable d'utiliser

un solvant soluble dans l'eau.

De manière générale, plus d'une extraction est sou-

haitable pour obtenir une récupération optimale. De pré-

férence, on procède à la première extraction en utilisant

un solvant miscible à l'eau, comme le méthanol ou l'acé-

tone. On peut récupérer les antibiotiques sous la forme d'un extrait brut par élimination du solvant. Les extraits

au solvant eux-mêmes peuvent être extraits, si on le sou-

haite, après réduction du volume du solvant, par exemple, par évaporation. A ce stade, il est préférable d'utiliser un solvant non miscible à l'eau, tel que l'hexane, le

chloroforme, le chlorure de méthylène ou l'acétate d'éthy-

le ou leurs mélanges, une proportion suffisante d'eau étant ajoutée pour obtenir une répartition satisfaisante des composés antibiotiques. L'élimination de la phase non

miscible à l'eau engendre une matière contenant les Anti-

biotiques S541. Si on le souhaite, on peut séparer le fac-

teur B par cristallisation à partir d'un solvant approprié,

par exemple l'isopropanol.

La purification et/ou la séparation des facteurs et/

ou des composants actifs (complètement ou d'autres compo-

sés du type macrolide présents) peut s'effectuer par mise en oeuvre de procédés classiques, tels que, par exemple

la chromatographie (y compris la chromatographie en pha-

se liquide à haute performance)sur un support approprié,

cbmme la silice, une résine d'adsorption macroréticulai-

re non fonctionnelle, par exemple des résines de poly-

styrène réticulées, comme l'amberlite XAD-2, XAD-4 ou XAD-1180 (Rohm et Haas Ltd), ou une résine S112 (Kastell Ltd) ou sur un dextrane réticulé compatible avec un sol- organique, comme le Sephadex LH20 (Pharmacia UK Ltd), ou,

dans le cas de la chromatographie en phase liquide à hau-

te performance, des supports de phase inverse, comme une silice liée à un hydrocarbure, par exemple la silice liée à un hydrocarbure en C18. Le support peut se présenter sous la forme d'un lit, ou bien, de préférence, sous une

forme tassée dans une colonne. Dans le cas de résines ma-

croréticulaires non fonctionnelles, telles que XAD-1180

ou S112, on peut utiliser des mélanges de solvants orga-

niques, comme de l'acétonitrile et d'eau, pour procéder

à l'élution.

On charge généralement une solution des composés

dans un solvant approprié dans la ou les colonnes de si-

lice ou de Sephadex, si on le souhaite, après avoir d' abord réduit le volume du solvant. On peut éventuellement

laver la colonne et l'éluer ensuite avec un solvant Jus-

qu'à la polarité convenable. Dans le cas du Sephadex et de la silice, on peut utiliser, à titre de solvants, des alcools, tels que le méthanol; des hydrocarbures, tels que l'hexane; l'acétonitrile; des hydrocarbures halogénés, tels que le chloroforme ou le chlorure de méthylène; ou des esters, tels que l'acétate d'éthyle. On peut également employer des combinaisons de ces solvants, seuls ou avec

de l'eau.

L'élution et la séparation/purificâtion des compo-

sés suivant l'invention peut être surveillée par des tech-

niques classiques, comme par chromatographie, par exem-

ple chromatographie en couche mince et chromatographie en phase liquide à haute performance, ou en utilisant des

propriétés des composés précédemment décrites.

La chromatographie sur silice, réalisée de préféren-

ce en utilisant un éluant tel qu'un mélange de chlorofor-

me et d'acétate d'éthyle,, sépare aisément les Antibio-

tiques S541 en composants I et Il, le composant I étant

élué en premier lieu. Les facteurs B, E et F peuvent ensui-

te être aisément obtenus à partir du composant I en se

servant d'une chromatographie par exemple une chromato-

graphie en phase liquide à haute performance De manîàre similaire, les facteurs A. C et D peuvent ftre aisément isoldés à partir du composant II@ On peut aussi séparer le

facteur B à partir des facteurs E et F par cristallisa-

tion dans un alcool, tel que le méthanol oulîisopropa-

nol. Si on le souhaite, les liqueurs mères contenant les facteurs E et F peuvent être soumises à une purification plus poussée, par exemple par chromatographie sur silice et les facteurs E et F peuvent- être isolés en se servant

d'une chromatographie en phase liquide à haute performan-

ce. Une fois obtenus, les facteurs peuvent être davanta-

ge purifies par cristallisation, par exemple dans du mé-

thanol, de l'isopropanol ou un mélange méthanol/eau et la portée de l'invention s'étend également aux composés

suivant l'invention sous forme cristalline.

Les composés suivant l'invention ont été isolés sous

forme de solides par une combinaison appropriée des procé-

dés susmentionnés. Il faut comprendre que l'ordre dans le-

quel on effectue les étapes de purification précitées et le choix des procédés de purification que l'on met en

oeuvre peuvent varier fortement.

Ainsi, le facteur B a été obtenu sous forme d'un

solide cristallin possédant une pureté supérieure à 90 %.

De manière similaire, les facteurs A, C, D, X et F ont également été obtenus en possédant une pureté supérieure à 90 %. Cependant, comme on l'a décrit plus haut, on peut utiliser les facteurs à des taux de pureté appropriés à

ldur utilisation envisagée. Pour l'emploi en médecine hu-

maine, des puretés d'au moins 90 % et de préférence su-

périeures à 95 % sont souhaitables. Pour la mise en oeu-

vre à l'échelle agricole ou horticole ou en médecine vé-

térinaire, des puretés moins élevées suffisent, par ex-

emple des puretés égales ou inférieures à 50 %.

Les exemples qui suivent illustrent la présente in-

vention. Dans ces exemples, on a utilisé les abrévia-

tions suivantes: tlc = chromatographie en couche mince (réalisée en utilisant des plaques de silice 60 Merck 5735 et en procédant au développement avec le système

CHCl3: acétate d'éthyle (3: 1), sauf spécification con-

traire); CCM = chromatographie sur colonne en utilisant de la silice 60 Merck 7734 tassée (colonne de 200 x 4 cm sauf spécification contraire) et en procédant à l'élution avec le système CHCl3: acétate d'éthyle (3: 1), sauf spécification contraire; hplc = chromatographie en phase

liquide à haute performance; PE = éther de pétrole (P.E.

-80 C sauf spécification contraire); 1 = litre; EA =

acétate d'éthyle.

Les milieux A, B et C auxquels on se réfère dans les exemples sont les suivants: Milieu A g31- D-glucose 15,0 Glycérol 15,0 Peptone de soja 15,0 NaCl 3,0 CaC03 1,0

Eau distillée Jusqu'à un litre, pH ajusté à une va-

leur de 7,0 à l'aide de NaOH aqueux avant le passage à l'autoclave. Milieu B 1-1 D-glucose 2,5 Dextrine de malt MD 30E (Roquette (UK)Ltd) 25, 0 Arkasoy 50 (British Arkady C . Ltd) 12,5 Mélasses 1,5

K2HP04 0,125

Carbonate de calcium 1,25 MOPS (Acide 3-(N-morpholino)propane-sulfonique) 21,0

Eau distillée jusqu'à un litre, pH ajusté à une va-

leur de 6,5 à l'aide de NaOH 5N avant le passage à l'auto-

clave. Milieu C -1 D-glucose 2,5 Dextrine de malt 30E (Roquette (UK) Ltd) 25,0 Arkasoy 50 12,5 Mélasses de betteraves 1,5

K2HPO4 0,125

CaCO3 1,25 Silicone 1520 (Dow Corning) 0,625 Eau distillée jusqutà un litre, pH ajusté à une valeur de

6,5 avant la stérilisation.

Exemple I

On a inoculé des spores de Streptomyces thermoarcha-

ensis NCIB 12015 à des cultures inclinées sur gélose pré-

parées à partir des ingrédients qui suivent:

2570390U

l g-

Extrait de levure (Oxoid L21) 0,5 Extrait de malt (Oxold L39) 30,0 Peptone mycologique (Oxold L40) 5,0 Gélose N 3 (Oxoid L13) 15,0 Eau distillée jusqu'à un litre, pH d'environ 5,4

et on a incubé les cultures à 28 C pendant 10 jours.

On a ensuite couvert la culture inclinée arrivée à matu-

ration avec une solution à 10 % de glycérol (6 ml) et on l'a grattée avec un outil stérile de façon à libérer les spores et le ihycéliums:. On a transféré-des fractions

aliquotes de 0,4 ml de la suspension de spores ainsi ob-

tenue dans des pailles en polypropylène stérile que l'on

a ensuite thermoscellées et conservées sous vapeur d'azo-

te liquide jusqu'au moment o l'on en eut besoin.

On a utilisé le contenu d'une paillette unique pour en inoculer 10 ml de milieu A que l'on a ensuite incubés à 28 C pendant 3 Jours sur un appareil secoueur tournant à

250 tpm avec un mouvement orbital d'un diamètre de 50 mm.

On a utilisé ce mileu incubé pour inoculer à raison de

2 %, 15 tubes et 2 flacons d'Erlenmeyer de 250 ml conte-

nant respectivement 10 ml et 50 ml de mileu B. On a laissé la culture dans les tubes et flacons se poursuivre à 28 C pendant 5 jours et on a ensuite filtré

les cultures séparément sous vide et on a secoué les cel-

lules pendant 30 minutes avec un volume de méthanol égal

à celui du filtrat de culture.

On a décelé l'activité contre Caenorhabditis elegans dans des extraits de cellules dont la croissance s'était poursuivie à la fois dans les tubes et les flacons et on

a rassemblé ces extraits mycéliaux', on les évaporés Jus-

qu'à siccité et on les a ré-extrait par du méthanol de ma-

nière à en obtenir un concentré (6 ml) que l'on a appli-

qué à une colonne de Sephadex LH20 (110 x 2,5 cm) tassé

31 2570390

I et on a ensuite procédé à l'élution avec du méthanol. On

a recueilli des fractions de 10 ml.

On a rassemblé les fractions 21-28 et on les a éva-

porées pour recueillir un résidu huileux (156 mg) que 1' on a extrait avec un mélange CHCl3: EA (3: 1) de fa- çon à obtenir un extrait (3 ml) que l'on a soumis à une

CCM (colonne de 55 x 2,5 cm). On a recueilli des frac-

tions de 10 ml et on les a analysées par tlc en utilisant

des plaques contenant un indicateur fluorescent. Les frac-

tions 20 à 23 et les fractions 36 à 44 ont donné naissan-

ce à deux zones principales qui éteignirent la fluores-

cence et que la demanderesse a identifié comme étant le composant I (Rf 0, 70) et le composant Il (Rf 0,43). L' évaporation des fractions 20-23 a engendré le composant I sous la forme d'un solide (9 mg) Xmax238nm, E1340; Imm 245nm, E1350; et max254mn, E1200. L'évaporation des fractions 36 à 44 a donné le composant II dans la forme d'un solide (11 mg) Xmax238nm,

Ei440; Xmax245nm, E1460; et Imax254nm, m 280.

Exemple 2

On a inoculé 0,2 ml d'une suspension de spores de Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12015 que l'on avait prélevée d'une paille préparée de la manière décrite à l'exemple 1, à 2 flacons d'Erlenmeyer d'une contenance de 250 ml contenant 50 ml de milieu A. On a ensuite incubé

les flacons à 28 0C pendant 3 jours sur, un appareil secou-

eur tournant à 250 tpm avec un mouvement orbital d'un diamètre de 50 mm et on a ensuite utilisé le contenu des deux flacons pour inoculer un récipient de fermentation

de 20 litres contenant du mileu B (12 litres). On a ré-

colté la culture après 5 jours de croissance et on l'a

alors traitée de la manière décrite à l'exemple 3.

E2emple 3

On a récolté le bouillon de fermentation (12 1) ob-

tenu de la manière décrite à l'exemple 2 après une crois-

sance de 5 jours à 28 C et on l'a centrifugé (4200 tpm à 10 C pendant 15 minutes). On a mélangé lapastille de cel- lules à du méthanol (5 l) et on l'a laissé reposer à 4 C pendant 20 heures. On a filtré l'extrait mycélial, on l'a évaporé à 40 C et on l'a soumis à une distillationazéotropique après l'addition de butane-1-ol (100 ml). On a alors traité l'extrait par du méthanol (5 fois 200 ml) et on a évaporé les extrait réunis Jusqu'à un volume de

ml et on-a appliqué ce volume à une colonne de Sepha-

dex LH20 (112 x 5 cm). On a élué la colonne avec du mé-

thanol et après un premier volume de 200 ml, on a re-

cueilli des fractions de 50 ml. On a rassemblé les frac-

tions 40-90 et on les a évaporées jusqu'à obtenir un ré-

sidu huileux (3,85 g). On a extrait le résidu avec 77 ml de CHC13: EA (3: 1), on l'a filtré et on l'a ensuite soumis à une CCM, des fractions d'approximativement 15 ml

étant recueillies après un premier volume de 200 ml.

On a rassemblé les fractions 124 à 142 contenant le

composant I et on les évaporées de façon à obtenir un so-

lide (253 mg) dont on a purifié 216 mg par hplc (Zorbax

ODS, 25 x 2,1 cm, CH3CN80 %/H20. On a rassemblé les frac-

tions 250 à 320 contenant le composant II et on les a évaporées de façon à recueillir un solide (602 mg) dont

on a purifié 540 mg par hplc (comme dans le cas des frac-

tions 124-142) et on a recueilli des fractions de plusieurs essais. On a surveillé la matière s'éluant de la colonne d' hplc par spectroscopie UV à 243 nm. On a soumis le produit correspondant aux pics absorbant à cette longueur d'onde à une dessication et i) on l'a testé quant à son activité contre Caenorhabditis elegans et ii) on l'a analysé par

tic. Les produits correspondant à 4 pics qui étaient ac-

tifs contre Caenorhabditis elegans avaient également une

valeur Rf dans la gamme de 0,39 à 0,46 ou de 0,70 à 0,75.

Le composant I a donné un pic avec une valeur Rf de 0,70 à 0,75 et on a attribué la qualité de facteur B au produit correspondant à ce pic. Le composant II a donné 3 pics avec une valeur Rf de 0,39 à 0,46 et on a attribué

les qualités de facteurs A, C et D aux produits correspon-

dant à ces 3 pics.

Le facteur A stélua de la colonne d'hplc entre 260 et 340 ml après l'injection de l'échantillon et avec une valeur Rf de 0,44 selon la tlc. Le facteur D s'élua de la colonne d'hplc entre 270 et 310 ml après l'injection de l'échantillon et avait une valeur Rf de 0,72 selon la tlc. Le facteur C s'élua de la colonne d'hplc entre 160 et 180 ml après l'injection de l'échantillon qui avait une valeur Rf de 0,4 selon la tic. Le facteur D s'élua

de la colonne d'hplc entre 220 et 250 ml après l'injec-

tion de l'échantillon et avait une valeur Rf de 0,42 se-

ion la tlc. Les autres caractéristiques des facteurs A,

B, C et D sont décrites dans la suite du présent mémoire.

Exemple 4

On a utilisé 0,4 ml d'une suspension de spores de 1' organisme Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12015, que

l'on avait prélevé d'une paille préparée de la manière dé-

crite à l'exemple 1, pour inoculer un flacon d'Erlenmeyer

d'une contenance de 250 ml contenant du milieu A (50 ml).

On a incubé le flacon à 28 C pendant 4 jours sur un appa-

reil secoueur tournant à 250 tpm avec un mouvement orbi-

tal d'un diamètre de 50 mm.

On a ensuite utilisé des fractions (8 ml) pour ino-

culer chacun de deux flacons à fond plat d'une contenance de 2 litres, contenant chacun 400 ml du même milieu, avant

34 2570390

db procéder à l'incubation dans les mêmes conditions pen-

dant 3 jours. On a alors employé le contenu de deux fla-

cons pour inoculer un récipient de fermentation (70 1) contenant du milieu B (40 l) additionné de silicone 525 (Dow Corning; 0,0625 % (v/v)]. On a procédé à la fermen- tation sous agitation et avec une aération suffisant à maintenir un niveau d'oxygène dissous supérieur à 20 % de saturation, un antimousses à base de silicone étant aJouté si cela se révèle nécessaire. On a récolté le bouillon de fermentation après 10 Jours et on a clarifié le bouillon (40 l) par centrifugation (15000 tpm). On a déplacé le produit surnageant résiduel par de l'eau (5 1) et on a congelé les cellules récupérées (1,4 kg) à moins

. Après une semaine, on a décongelé les cellules con-

gelées, on les a mises en suspension dans du méthanol

(15 l) et on les a modérément agitées pendant 15 heures.

On a alors filtré la suspension et on a réextrait le ré-

sidu solide avec du méthanol (10 1). On a dilué les fil-

trats réunis (25 1) avec de l'eau (12 l) et on a extrait le tout par du PE (25 1). Après 30 minutes, on a séparé

les phases par centrifugation.

On a réextrait la phase méthanolique inférieure à

3 reprises avec du PE (25 l, 15 1 et 15 1). On a concen-

tré les phases au PE réunies (80 l) par 3 passes à travers

un évaporateur à pellicule balayée du type Pfaudler 8.8-

12V-27 (tension de vapeur 0,1 bar, température de la va-

peur 20 , température de la vapeur d'eau 1270) et on a séché le concentré (8 1) sur du sulfate de sodium (1 kg) et o l'aensuite concentré sous pression réduite à 400 dans

un évaporateur à film rotatif. On a dissous le résidu hui-

leux (15 ml) dans un mélange de CHC13 et d'EA (70 ml, 3: 1 v/v) et on l'a soumis à une CCM, des fractions d' approximativement 40 ml étantreoeflhi après un prélèvement

préalable de 1.400 ml.

On a réuni les fractions 45 à.65 et on les a éva-

porées de façon à obtenir le facteur B (940 mg; comme défini à l'exemple 3) que l'on a cristallisé à 2 reprises dans du méthanol et finalement dans du nitrométhane. On a soumis les cristaux à une analyse par diffraction des ray-

ons X à cristal unique, qui révéla qu'ils étaient constl-

tués de prismes clairs,orthorhombiques, avec a = 10,171 (3), b = 13,317(5) = 25,032(7)A3, V = 3391X3, Z 4, groupe d'espace P212121, Dc = 1,18 gcm 39 R = 0,053 pour 2169 indépendant réflections observées (S 58 ) les

mesures étant effectuées sur undiffractomètre avec rayon-

nement Cu-XK (A = 1954178A). La structure, telle que dé-

terminée par cristallographie aux rayons X est présentée

sur la figure 5.

Exemple 5

On a préparé un inoculum de Stre tomyces thermoarcha-

ensis NCIB 12015 de la manière décrite à l'exemple 4, la période de croissance étant de 2 Jours et on l'a utilisé

pour inoculer un récipient de fermentation (70 1) conte-

nant du milieu B (40 1) additionné de polypropylène 2000

(0,06 % v/v) au lieu de silicone 525. On a ajouté du po-

lypropylène 2000 selon les besoins au cours de la totali-

té de la fermentation pour ma triser la formation de mous-

se. On a effectué la fermentation à 28 0C, sous une agita-

tion et une aération suffisant à maintenir un taux d'oxy-

gène dissous supérieur à 30 % de saturation. Après une fermentation de 24 heures, on a transféré une partie du

bouillon (91) dans un fermenteur (7001) contenant du mi-

* lieu (450 1) constitué des ingrédients qui suivent: gl-! D-glucose 2,8 Dextrine de malt (MD 30E) 27,8 Arkasoy 50 13,9 Mélasses 1,7

K2HP04 0,14

CaC03 1,39 Silicone 525 (Dow Corning) 0,06% (v/v)

Ajusté à pH 6,5 avant la stérilisation.

On a effectué la fermentation à 28 C sous agitation et aération suffisant à maintenir un taux d'oxygène dissous

supérieur à 20 % de saturation. On a ajouté un agent anti-

mousses constitué de polypropylène 2000 suivant les be-

soins. Après 2 jours, on a réglé le pH à 7,2 par l'addi-

tion de H2S04. On a récolté le bouillon de fermentation

après 5 Jours.

On a clarifié le bouillon (450 1) par centrifugation et on a déplacé la couche surnageante résiduelle par de 1' eau (20 1). On a agité les cellules récupérées (25,5 kg)

pendant une heure dans une quantité suffisante de métha-

nol pour obtenir un volume total de 75 1. On a filtré la

suspension et on a réextrait le résidu solide par du métha-

nol (35 1) et on l'a filtré. On a dilué les filtrats réu-

nis (87 1) avec de l'eau (40 1) et on a extrait le tout par du PE. Après 30 minutes, on a séparé les phases par centrifugation et on a réextrait la phase méthanolique par

du PE (30 1) après addition d'eau (40 1). Après la sépara-

tion, on a de nouveau soumis la phase intérieure à une extraction par du PE (30 1). On a concentré les phases au PE réunies (85 1) et on les a concentrées par 3 passes à travers un évaporateur à film balayé 8.8-12v27 (tension

de vapeur 0,1 bar, température de la vapeur 20 , tempéra-

ture de la vapeur d'eau 127 ). On a séché le concentré

(9 1) avec du sulfate de sodium (2 kg) et on l'a davanta-

25703U90

gè concentré sous pression réduite à 40 dans un évapo-

rateur à film rotatif. On a dissous le résidu huileux (130 g) dans du CHCl3 de façon à obtenir 190 ml et on a

soumis cette solution à une ccm [colonne tassée et la-

vée (500 ml) dans CHCl37, des fractions d'approximative- ment 40 ml étant recueillies après un volume préalable

de 1400 ml.

On a réuni les fractions 32-46 et on les a évaporées de façon à obtenir une huile (21,2 g). On a réuni les fractions 47-93 et on les a évaporées de façon à obtenir une huile (20,1 g) que l'on a dissoute dans un mélange CHCl3: EA (3: 1) jusqu'à un volume de 50 ml et on a

soumis la solution dune CCM, les fractions d'approximati-

vement 40 ml étant recueillies après un volume préalable de 1400 mi. On a réuni les fractions 22-36 et on les a évaporées de façon à obtenir une huile (3,1 g) que l'on

a ajoutée à l'huile obtenue au départ des fractions 32-

46 de la première colonne. On a dissous les huiles réu-

nies dans du méthanol bouillant (4 ml) et on a ensuite

ajouté la solution à du propane-2-ol (20 ml) chaud de fa-

çon à obtenir le facteur B (2,57 g) cristallin par repos.

On a évaporé la liqueur mère après cristallisation du facteur B de façon à engendrer une huile que l'on a dissoute dans un égal volume de CHCl2 et on a chargé la solution dans une colonne (30 x 2,2 cm) de gel de silice Merck 60 (70-230 mesh ASTM, Art. NO. 7734) tassé dans du CHC12. On a lavé le lit avec du CHC12 (2 volumes de lit) et on a procédé à l'élution

avec un mélange de CHC13: MA (3: 1) (2 volumes de lit).

L'évaporation de l'éluat a engendré une huile que l'on a

dissoute dans du méthanol et soumise à une hplc de prépa-

ration sur du Spherisorb S5 ODS-2 (250 mm x 20 mm, Phase

Sep. Ltd.). On a pompé l'échantillon (5 ml) sur une co-

lonne en l'espace d'une minute et on a élué la colonne SUOTqOeBJ) a*llT$sTp nueel ap OaAe saJTeuUamaeIddns SaSTi -ai Z q selnllao salt gal e uo 'saiuee2euuns saqonoo sap uoTqe!ueogp em sdy a u(aeueTqunm aemeJdma% 'saeinuTm Z 0oç

oooz0) uoTSn;Tzaqueo q sasTmnos neaAnou ap e sel uo a.

8sag9uet91m %uelmqeuaAuoo e saet uo '(lm-Z) neal ap suep uo -Tsuadsns ua sallanpTsJ salnllao sal sTm UO %a sa.uBea2u -ans saqonoo sel 9queoap e uo'(lm Z) SUOToei; Z (aelUeTqme amejladmal. 'sae!nuTm Z 42 OOOZL), 2njTç%aueo 'u saint SZ -Iao ap aueSomoq uoTsuedsns aun JTueqo Be aaTurem ap anb -T.gueum mnaT.B a2e un ans aT9çe mil uo ea aequteqme azn.e.z 9ddma5 etl,nbsn TpTo;ea vl UO '((q. 'Do.ZL) Ae&looqnml 2 'saaeq Lll sqide 9!.oo9a '(z ealdmexel e,edgd TnIaeo eaItelTmTS) uOTeluema$J; ep uoIlTnoq un ssed e uo Oz 9 oldmaxEr eoToomgm quaesd np aens el suep sa!lToap.uos, %ea snmeaoej sap sanbT!sTagoeJuo saeI

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06úOZSZ

dé 2 ml). On a ensuite vigoureusement mélangé les cellu-

les lavées, soit à de l'eau (2 ml), soit à du méthanol

(2 ml) et on a laissé le mélange reposer à la tempéra-

ture ambiante pendant 1,5 heure, avec agitation occasion-

nelle. On a de nouveau centrifugé les suspensions (1200

g, 2 minutes, température ambiante) et on a séquentielle-

ment dilué les couches surnageantes dans de l'eau. On a remis les cellules provenant de la suspension aqueuse en

suspension dans de Veau et on les a immédiatement séquen-

tiellement diluées dans de l'eau0 On a ajouté des frac-

tions (10 ul) de chacune des dilutions à une suspension (200,pl) du nématodo Caenorhabditis olegars dans une

solution tampon contenant les ingrédients suivants.

Na HPO4 (6 g/l), K2HPO4 (3 g/l)g NaCl (5 g/l) et 14gSO4 (0,25 g/l) et on en a ajusté le pH à 7,0. Après 4 heures, on a examiné les suspensions de nématodes pour trouver quelles étaient les dilutions du mélange soumis à l'essai qui avaient provoqué une inhibition totale de la motilité

chez plus de 98 % de nématodes présents dans la suspen-

sion testée. On a constaté que des dilutions de 1 pour 5, de 1 pour 25, de I pour 250 et de 1 pour 500 de l'extrait méthanolique, de 1 pour 5, de 1 pour 25, de 1 pour 250,

de 1 pour 500 et de I pour 1000 de la suspension de cel-

lules et de 1 pour 2, de 1 pour 4 et de 1 pour 8 de 1'

extrait aqueux, provoquaient une telle inhibition des né-

matodes, lorsque l'on en ajoutait 10 au A 200 ul. de sus-

pensions de nématodes.

Exemple

On a inoculé 0,4 ml d'une suspension de spores de Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12015 que l'on avait prélevé d'une paille préparée de la manière décrite à l'exemple 1 à des flacons d'Erlenmeyer d'une contenance de 250 ml, contenant soit 50 ml de milieu A, soit 50 ml de milieu B. On a incubé les flacons contenant le milieu

2570390

A ou le milieu B à 28 C pendant 2 jours sur un appareil secoueur rotatif fonctionnant à 250 tours/minute avec un excentrique d'un diamètre de 50 mm. On a ensuite utilisé des fraction (8 ml) de chaque milieu pour inoculer des flacons à fond plat d'une contenance de 2 litres, conte- nant 400 ml du même milieu (A ou B respectivement). On a incubé ces flacons dans les mêmes conditions pendant 2 Jours.

On a inoculé chacun des 2 fermenteurs d'une conte-

nance de 70 1 par 2 flacons de milieu A et on a inoculé

un autre fermenteur d'une contenance de 70 1 par 2 fla-

cons de milieu B. Chaque fermenteur contenait 40 1 de milieu C.

On a mis les fermentations en oeuvre à 34 , sous agi-

tation et aération suffisant à maintenir un taux d'oxygè-

ne dissous supérieur à 30 % de saturation. Après approxi-

mativement 24 heures de fermentation, on a réglé le pHà 7,2 par l'addition de H2S04 aqueux. On a ajouté un agent antimousse à base de polypropylène glycol 2000 suivant les besoins. Apres 5 Jours, on a récolté et rassemblé ces

bouillons de fermentation.

Un autre fermenteur de 70 1 qui était également ino-

culé par 2 flacons contenant du milieu B, contenait du milieu B complété de silicone 1520 (0,06 %). On a procédé

à la fermentation à 28 , sous agitation et aération suf-

fisant à maintenir un taux d'oxygène-dissous supérieur à % de saturation. On a ajouté du polypropylène glycol 2000 selon les besoins pour maîtriser la formation de mousse. Après 24 heures, on a transféré une fraction de 9 1 dans un fermenteur de 700 1 contenant 450 1 de milieu C.

On a procédé à la fermentation à 34 C, sous agita-

tion et aération suffisant à maintenir un taux d'oxygène dissous supérieur à 30 % de saturation. On a réglé la

41 2570390

fbrmation de mousse par l'addition de polypropylène gly-

col 2000 et, après approximativement 24 heures, on a ré-

glé le pH à 7,2 par l'addition de H2S04 aqueux. On a ré-

colté le bouillon de fermentation après 4 jours et on l'a réuni aux 3 bouillons de fermentation de 40 1 décrits

plus haut.

On a centrifugé les bouillons récoltés et rassem-

blés à travers une centrifugeuse Sharples AS16PY à rai-

son d'environ 120 1/h. On a déplacé la couche surnageante

résiduelle dans le bol centrifugateur par de l'eau.

On a émulsionné les cellules récupérées (11,65 kg)

dans du méthanol (33 1) à l'aide d'un mélangeur Silverson.

Après 60 minutes, on a filtré la suspension à travers un

tissu croisé et on a une fois de plus émulsionné le rési-

du dans du méthanol (34 1). On a de nouveau filtré la

suspension après 40 minutes. On a réuni les filtrats pro-

cn-ant des 2 extractions méthanoliques.

On a mélangé les extraits réunis (53,5 l) à de l'eau (27 l) et du PE (27 1). Après une agitation de 20 minutes, on a séparé les 2 phases sur une centrifugeuse Westfalia

MEM 1256. On a mélangé la phase méthanolique aqueuse in-

férieure (70 1) à de l'eau (37 l) et du PE (27 1) et on

a agité le toutetonl'a somis à séparation comme précédem-

ment décrit. On a brisé l'émulsion à l'interface dans la phase au PE à l'aide d'acétone (4 1). On a alors mélangé l:a phase méthanolique aqueuse inférieure (108 1) à de l' eau (40 l) et du PE (27 1) pour la troisième fois et on

a agité le tout et on l'a séparé de la manière précédem-

ment décrite, en utilisant de l'acétone (4 l) pour clari-

fier l'émulsion à l'interface. On a ensuite réuni les 3

extraits à l'hexane.

On a concentré les extraits au PZ réunis (85 1) avec un évaporateur à film balayé (tension de vapeur 0,15 bar, température de la vapeur 260). On a séché le concentré (3 1) avec du sulfate de sodium (2 kg) et on l'a ensuite

davantage évaporé sous pression réduite à 40 . On a dis-

sous l'huile ainsi obtenue (639 g) dans 300 ml d'un mé-

lange de chloroforme et d'EA (3: 1 v/v) et on a procédé à une filtration et un lavage à travers du papier en fi- bres de verre. On a soumis le filtrat et les liqueurs de

lavage (1060 ml) à une CCM (1500 mm x 100 mm en diamè-

tre) avec une élution à un débit de 6 1/h.

On a rassemblé la fraction s'éluant entre 8,8 et 13,1 1 et on l'a évaporée à faible pression jusqu'à 1'

obtention d'une huile (56,3 g), tandis que l'on a similai-

rement réduit le volume de la fraction s'éluant entre 13,1 1 et 24,6 1 sous presion réduite Jusqu'à l'obtention

d'un solide Jaune pale (153,4 g). On a montré que la pre-

mière fraction contenait en grande partie le facteur B, tandis que la dernière fraction contenait un mélange des facteurs A, B, C et D. Le facteur B dans cette dernière fraction fut progressivement enlevé en répétant 2 fois l'

opération de CCM telle que décrite plus haut - la dernié-

re fois sur de la silice fraîche - dans des conditions si-

milaires, sauf que l'on réduisit le débit à 3 1/h.

Les pics contenant les facteurs A, C et D de la se-

conde de ces colonnes s'éluèrent entre 8,8 et 17,6 l, le facteur B résiduel qu'elle contenait étant séparé dans la troisième colonne dont les facteurs A, C et D s'éluèrent entre 14 et 28 1. On a réduit cet éluat rassemblé final sous faible pression Jusqu'à l'obtention d'un solide (114 g). Les pics contenant le facteur B provenant des 2 colonnes (7,5 - 8,8 1 et 10,3 - 13,4 1 respectivement) furent évaporés Jusqu'à l'obtention d'huiles (10,7 g et g respectivement) et furent réunis à l'huile obtenue

provenant de la première des 3 colonnes.

On a dissous les huiles contenant le facteur B dans du méthanol bouillant (25 ml) et on les a mélangées à du

propane-2-ol bouillant (100 ml). Le facteur B cristalli-

sa lors du refroidissement jusqu'à 4 . On l'a séparé par

filtration, lavé avec du méthanol (200 ml), refroidi jus-

qu'à -20 et séché sous vide de façon à obtenir 25,3 g de facteur B.

On a séché le solide provenant de la troisième colon-

ne de silice qui contenait les facteurs A, C et D, sous vide et jusqu'à poids constant (87 g). On a dissous des échantillons (20 g) de ce solide dans du méthanol (190 mI)

et on en a amené le volume à 230 ml avec un mélange acê-

tonitrile: eau 7 - 3 (v/v).- On a alors chromatographié des fractions(5 ml) de la solution sur une colonne (250 mm x 21,2 mm en diamètre) de spherisorb ODS-2 (diaetrs

des particules 5 /u)0 en se servant d'un mélange d'acto-

nitrile et d'eau (7 g 3) comme solvant délution. On a

maintenu le débit à 20 ml/minute pendant environ 10 se-

condes; on l'a ensuite constamment augmenté en l'espace de 22 minutes Jusqu'à 34 ml/minute et on l'a maintenu à

cette valeur pendant 3 minutes supplémentaires. On a dé-

celé les facteurs en cours délution à 238 nm. Le facteur C s'élua entre 11,0 et 13,4 minutes, le facteur D entre 13,4 et 17,4 minutes et le facteur A entre 17,4 et 23,0 minutes. On a rassemblé les fractions contenant le facteur C provenant de chaque séparation chromatographique et on les a réduites sous faible pression Jusqu'à l'obtention d'un solide. On a similairement réduit les fractions contenant

le facteur A jusqu'à l'obtention deun solide. On a égale-

ment rassemblé et réduit les fractions contenant le fac-

teur D jusqu'à l'obtention d'un solide impur (7 g). On a

redissous ce produit dans du méthanol (25 ml)s on a mélan-

gé la solution à un mélange d'acétonitrile et d'eau 7: 3

et on a rechromatographié le tout sur une colonne de sphe-

risorb ODS-2 comme on l'a déjà décrit, sauf que l'on a maintenu le débit constant à 20 ml/minute au cours de la totalité de l'opération. Le facteur D s'élua à présent entre 16 et 20 minutes et on a rassemblé les fractions provenant de chaque essai chromatographique. On a réduit l'éluat total Jusqu'à l'obtention d'un solide. On a séché les 3 solides contenant les facteurs A, C et D sur du P205, sous vide et Jusqu'à poids constant (55 g, 7,0 g et 1,21 g respectivement). On a montré que les 4 solides isolés conformément à ce procédé étaient similaires à des échantillons authentiques des facteurs A, B, C et D.

Exemple 8

On a inoculé 0,5 ml d'une suspension de spores de

chacune des souches suivantes: Streptomyces thermoarcha-

ensis NCIB 12111, 12112, 12113 et 12114 prélevées à par-

tir de pailles préparées de la manière décrite à l'xemple 1, à des flacons d'Erlenmeyer d'une contenance de 250 ml contenant 50 ml de milieu B.

On a incubé les flacons contenant Streptomyces ther-

moarchaensis NCIB 12111, NCIB 12112 et NICB 12113 à 31 C sur un appareil secoueur rotatif. On a incubé le flacon contenant Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12114 à 28 C

pendant 2 jours et on a ensuite transféré un ml de bouil-

lon dans un autre flacon d'Erlenmeyer d'une contenance de

250 ml, contenant 50 ml du milieu B. On a incubé ce fla-

con à 31 C sur un appareil secoueur rotatif. On a secoué tous les flacons à 250 tours/minute avec un excentrique

dn diamètre de 50 mm. -

Après 4 Jours d'incubation, on a centrifugé un échan-

tillon de 10 ml de chaque bouillon à 1250 g pendant 45 mi-

nutes et on l'a traité comme suit. On a écarté la couche surnageante et on a remis la pastille en suspension jusqu' à un volume de 10 ml dans du méthanol. On a vigoureusement secoué la suspension et on l'a abandonnée pendant une heure

sous mélange occasionnel. On a ensuite centrifugé la sus-

pension à 10000 g pendant 5 minutes et on a anlysé la cou-

che surnageante par hplc (S5 ODS-2, 10 cm x 4,6 mm, 70 %

CH3CN/O, 1M NH4H2P04). On a surveillé les pics à 246 nm.

L'analyse par hplc a révélé la présence de facteurs A, B, C et dans chaque cas.

Exemple 9

On a constaté que les facteurs A, B, C, D, E et F

possédaient les caractéristiques suivantes: -

i) Ils ne contiennent que du carbone, de l'hydrogène et

de l'oxygène seulement.

ii) La spectroscopie de masse à impact électronique

(E.I.) des facteurs A,B,C,D,E et F a donné les ré-

sultats suivants: Facteur ion moléculaire correspondant à la formule moléculaire

A 612,37 C36H5208

B 598,35 C35H5008

C 584,34 C34H4808

D 598,35 C35 H5008

E 612,3638 C36H5208

F 626,3807 C37H5408

La spectroscopie de masse à bombardement atomique rapide (FAB) a donné les résultats qui suivent:

Facteur +ve FAB -ve FAB pds. mol.

A M/Z 635(M+Na+ M/Z 6111M-H7- 612 M/Z 613Lh+HJ+ B M/Z 691[M+H+glycérol7+ 598

M/Z 599[M+HJ+

M/Z 581 [MH-H20.+

M/Z 563fMH-2H +Q7 C M/Z 607LA4+Na,7 M/Z 583úM-I7- 584 D M/Z 621D+Na7+ M/Z 597/M-n7 598 La spectroscopie de masse à désorption de champ du facteur

E a donné le résultat suivant: M/Z 612 M+ et celle du fac-

teur F a donné le résultat suivant: M/Z 626 M+.

Un spectre Z.I. du facteur A avec mesure de masse pré-

cise a donné des ions à

612,37 C36H5208; 466,31 C30H4204; 448,30 C30H4003;

425,23 C26H3305; 354,22 C23H3003; 297,22 C21H290;

278,11 C15H1805; 247,17 C16H2302; 219,18 C15H230;

,05 C6H70.

Un spectre Z.I. du facteur B avec mesure de masse pré-

cise a donné des ions à

598,35 C35H5008; 438,28 C28H3804; 420,26 C28H36O3;

314,19 C20H2603; 248,14 C15H2003; 151,08 C9H1102.

Un spectre E.I. du facteur C avec mesure de masse pré-

cise a donné des ions à

584,34 C34H48o8; 566,33 C34H4607; 438,28 C28H3804.

Un spectre Z.I. du facteur D avec mesure de masse pré-

cise a donné des ions à

598,5 C35H5008; 452,29 C29H4004; 434,28 C29H3803.

47 2570390

Une mesure de masse précise du facteur E dans le mo-

de d' ionisation E.I. a donné à un ion à 452,2908 C29H4004 et dans le cas du facteur F, elle a donné un ion à 466,3067 C30H2404, iii) Les facteurs A, B, Cg D, E et F possèdent des spectres IR caractristiques dans le bromoforme, comprenant les pics suivants: Pour le facteur A à environ 3510 (0H)p 1712 (estez) et 998 cm-' (C-O); pour le facteur B à environ 3510 (OH),

1710 (ester) et 996 c-1 (C-=0); pour le facteur C compre-

nant des pics à environ 3510 (OH)q 1712 (ester) et 996

cm (C-0); pour le facteur D comprenant des pics à envi-

ron 3508 (OH), 1711 (ester) et 996 cm (C-0O)9 pour le facteur E comprenant des pics Aà environ 3500 (OH)9 1708

(ester) et 994 cm-1 (C-O); et pour le facteur F compre-

nant des pics à environ 3500 (OH), 1708 (ester), et 997

cm7 (C-0).

Les spectres complets pour les facteurs A, Bq C, D, E

et F sont présentés sur les figures 1,2,3,4G,6 et 7 respec -

tivement des dessins annexés.

iv) Les facteurs A, B, Cg D, E et F possèdent un spec-

tre UV dans le méthanol (c = 09002 96) montrant les résul-

tats suivants (I = inflexion et M = maximum):

48 2570390

48 Ou> Facteur kX(nm) E1 Facteur k(nmn)

A 252 (I) 318 D 252 (I) 263

244,5 (M) 468 244,5 (M) 393

239 (I) 430 239 (I) 362

B 252 (I) 302 *E 252 (I)-266

244,5 (M) 426 244 (M) 402

239 (I) 394 238 (M) 373

C 252 (I) 316 *F 252 (I) 285

244,5 (M) 470 244,5 (M) 421

239 (I) 432 239 (M) 389

(*méthanol c = 0,001 %)

Il faut noter que tandis que les valeurs -maX susmen-

tionnées sont caractéristiques de chaque facteur, les valeurs E1 reflètentla pureté de la matière telle qu' elle a été obtenue. Cependant, les rapports des valeurs

E1 sont caractéristiques du composé per se.

I

v) Un spectre de résonance magnétique nucléaire protoni-

* que a 200 NHz de la solution de chaque facteur dans le deutérochloroforme englobe des signaux Cyaleurs 'avec multiplicités, constantes de couplage (Hz) et valeurs d'intégration entre parenthèse,7 centrés à environ: Facteur A:4,1 à 4,4(m,2H);4;61(large s,1H);4;6 à 4;75(m,2H); 4, 81(d,9,1H); 5105(m,1H);5,34(s,2H);5169(d,5,1H); 6106(d,5,1H); 6;17(m,1H); 6#26(d,11,1H);6137(m,1H);6,46(d,10,1H); 6,74(q,2,1H); 742(m,1H);77 t 79(m, 5H); 8;14(s,3H); 8,40(s,3H); 8;47(s,3H); 8,61(t,11,1H); 8,96(d,7,3H); 9706(d,7,3H); 9,02(d,7,3H);

O et(,_llleH\ 9121(d_,3H).

49 2570390

Facteur B:4y2 à 4>4(m,2H); 4155(q,7,1H); 4,65(large,s,1H); 4/6 à 4,8(m,2H) ; 5,06(m,1H); 5,3 à 5>5(m,2H); 6z,01(d5,1H); 6/07(d,5,1H); 6,12(s,1H); 6t24(d,11,1H); 6,24(m,1H); 6>3 à 695(m,2H); 6/53(s,3H); 6,73(q,2,1H); 7> 62(m,1H); 7.6-8,0(m,4H); 8,22(s,3H); 8,35(d,7,3H); 8,41(s,3H); 8,49(s,3H); 8,62(t,11,1H); 9,03(d,6,3H); 9112(q,11,1H); 9,22(d,7,3H). Facteur C:4129(d,11,t,2,1H);4t4 à 416(m,3H);4,56(Ia'ge s,lH); ,14(dd,15,10,1H); 5> 23(m,1H); 5,65C[arge s,2H); 5172(d,6,1H); 5795(d,10,1H); 5 99(d,6,iH); 6/08(1arge s,1H); 6)1 à 6,4(m,3H); 6,62(q,3,1H); 77 à 8,1l(m,ca7H);8, B18(s,3H);.833(s,3H); 8,48(d,7,3H);8164(s,3H);8,68(t,11,1H);.9,00(d,7,3H); 9POB(d,7,3H); 9/12(q,12,1H). Facteur D: 4,18 à 4,4 (m,2H); 4147 à 4,81 (m,4H); 5104 (m,lH); ")"5 (s,2H); 5/72 (d,7,1H); 6107 (d,7,1H); 6/15 6,45 (m,4H); 6>74 (q,4,1H)7.45 - 8>1 (m,8H); 8,16 (s,3H);8,41 (s,3H);8>49 (s, 3H);8J62

(t,ll,lH); 8192 - 9,05 (m,6H);9,21 (d,7,3H).

Facteur E:411 à 4y3 (m,2H); 4/5 à 4>8 (m,4H total); 5]04 (m,lH); 5.2 à 5?5 (m,2H); 6,01 (d,5,1H);6)05 (d,5,1H); 6111 (s,1H); 6,1 à 614 (m,3H);6, 45 (d,10,1H); 6151 (s,3H);6,70 (q,2,1H); 7,60 (m,1H);8,20 (s,3H); 8,41 (s, 3H); 8)47 (s,3H); 8160 (t,11,lH);9,00 (t,7,3H); 9102

(d,6,3H);9111 (q,11,1H);9120 (d,7,3H).

Facteur F: 412 'à 4,4- (m,2H); 4,62 (s,1H); ca 4]70 (m,2H); 4180.(d,9,lH); 5104 (m,lH); 512 à 515 (m,2H); 5,99 (d,5,1H); 6/05 (d,5,1H);6 11 (s,lH); 611 à 613 (m,2H); ca 6/36 (m,1H);6,45 (d,10,1H); 6151 (s,3H); 6>70 (q,2, 1H);7,42 (m,1H);7,58 (m,1H); 8,19 (s,3H);8940 (s,3H);847 (s,3H);8 160 (t, 111H); 9 8 95 (d,7,3H);9d05

(d,7,3H);9?01 (d,7,3H); 9/10 (q,ll,lH); 9;21 (d,6,3H).

2570390

vi) Un spectre de résonance magnétique nucléaire au car-

bone-13 à 25,5 NHz à bruit découplé d'une solution de chaque facteur dans le deutéro-chloroforme englobe des pics [valeurs d' avec multiplicités de signaux dans le spectre hors résonance entre parenthèses] à environ: Facteur A: 17312(s); 14216(d); 139,2(s); 13716(s); 13711(s); 137j0(d); 130>4(s); 123j1(d); 120b1(d);117,8(d); 99/5(s); 8010(s); 79'0(d); 76)5(d); 69 0(d); 68>3*; 67,4(d); 48 2(t); 45>5(d); 40,9(t); 40;5(t); 35,8*; 34, 5(t); 22.1(q); 3455(t); 2616(d); 22>6(q); 2210(q);

19 7(q); 15 3(q); 13 7(q);10!8(q).

Facteur B: 173;4(s); 142,1(d); 13915(s); 13711(s); 135,7(s); 13317(s); 123!6(d); 123;3(d);120o0(d);119/3(d); 11812(d); 99,5(s); 801(s); 77!3(d); 7616(d);76/4(d); 6910(d);6813(d);67p9 *;6716 ;5715(q);4812(t); 45,4(d); 4017(t); 4015(t); 3518*; 34,5(t); 22/1(q);

19,6(q); 15y3(q);13/6(q); 12!9(q); 105(q).

Facteur C:173)3(s); 14212(d); 140)3(s); 138>5(s); 137,0(s); 134j9(s); 123, 9(d); 121!1(d); 12016(d);118/1(d); 100,2(s); 8016(s); 801(d); 77,4(d);69, 2(d);69jO(d); 68/3 *;68/0(d); 67,9(d);4816(t); 4613(d);41t4(t); 36!5 *; 3613 *;361(d);35,0(t); 22 6(q);2010(q); 15.4(q);14.3(q);13.1(q);10.e(q). Facteur D: 173)2 (s); 142t5 (d); 13911 (s); 137>5 (s); 13711 (s); 132,1 (s); 131,4 (d); 12311 (d);120 I (d);117/8 (d); 9915 (s); 799 (s); 79,2 (d) ; 76,5 (d);6910 (d); 68,3-;6811*;67-6*; 67,4 *; 48,2 (t);45,5 (d);40,B (t) ; 40,5 (t);35,7 *;3415 (t);2210 (q);20,6 (t);19,6

(q); 1513q);13,7 (q);1316 (q);1017 (q).

*multiplicité incertaine

vii) Des courbes de dichroIsme circulaire pour les fac-

51 2570390

teurs A, B, C et D (solutions à environ 0,1 % dans le méthanol) sont montrées sur la figure 8. Les courbes sont étroitement comparables dans la région 230 à 260

nm associée à l'absorption du chromophore diénique. Ce-

ci indique que les configurations absolues en C2, C7,

C17 et C19 sont les mêmes dans les 4 cas.

On donne ci-dessous des exemples de compositions sui-

vant la présente invention.

L'expression uingrédient actifn telle qu'on l'utilise ci-dessous désigne un composé suivant l'invention et peut être, par exemple, lvun des facteurs A, B, C, D, E ou F. Injection à doses multiples à administrer par la voie rar entérale p/vGamme Ingrédient actif 4,0 1 - 5 % P/v Alcool benzylique 2,0 Triacétate de glycérine 30,0 Propylène glycol jusqu't 100,0

Dissoudre l'ingrédient actif dans I alcool benzyli-

que et le triacétate de glycéryle. Ajouter le propylène

glycol et amener à volume. Filtrer la solution pour éli-

miner tout agent de contamination particulaire. Introdui-

re aseptiquement le produit dans des fioles pour injec-

tion et les fermer avec des bouchons ou des Joints étan-

ches en caoutchouc maintenus en position par des capsules de recouvrement en aluminium. Finalement stériliser le

produit en le chauffant dans un autoclave.

Spray d'aérosol %' /n Gamme Ingrédient actif 0,1 0,01 à 0,50% p/p Trichloréthane 29,9

52 2570390

Trichlorofluorométhane 35,0 Dichlorodifluorométhane 35,0

M6élanger l'ingrédient actif au trichloréthane et intro-

duire le mélange dans le récipient pour aérosol. Purger l'espace supérieur à l'aide de propulseur gazeux et ser-

tir la soupape en position. Introduire le poids nécessai-

re de propulseur liquide sous pression à travers la sou-

pape. Equiper du dispositif d'actionnement et de coiffes

de pulvérisation.

Comprimé Procédé de fabrication - granulation humide mE Ingrédient actif 250,0 Stéarate de magnésium 1% p/p 4,5 Amidon de mals 5% p/p 22,5 Amidon glycolate de sodium 2% p/p 9,0 Laurylsulfate de sodium 1% p/p 4,5 Cellulose microcristalline jusqu'à un poids de noyau de comprimé de

450 mg.

Ajouter une quantité suffisante d'une pâte à 10 % d'amidon à l'ingrédient pour produire une masse humide convenant à la granulation. Préparer les granules et les

sécher en utilisant un plateau ou un séchoir à lit flui-

disé. Tamiser à travers un tamis, ajouter les ingrédients

résiduels et comprimer en comprimés.

Au besoin, enrober les noyaux de comprimés d'une

pellicule en utilisant de l'hydroxypropylméthylcellulo-

se ou toute autre matière filmogène similaire, en se ser-

vant d'un système solvant aqueux ou non aqueux. Un plas-

tifiant et un colorant approprié peuvent être incorporés

à la solution d'enrobage par une pellicule.

Comprimé vétérinaire à l'usage d'animaux petits/domesti-

que s Procédé de fabrication - granulation à sec E Ingrédient actif 50,0 Stéarate de magnésium 7,5 Cellulose microcristalline pour faire un poids de noyau de comprimé de 75,0 Mélanger l'ingrédient actif au stéarate de magnésium et à la cellulose microcristalline. Comprimer le mélange en boudins, briser les boudins en les faisant passer par un granulateur rotatif pour engendrer des comprimés s'

écoulant librement. Procéder à la compression en compri-

més.

Si on le souhaite, on peut enrober les noyaux des

comprimés d'une pellicule de la manière décrite plus haut.

Injection vétérinaire intramammaire m/dose Limites Ingrédient actif 150 mg 150-500 mg Polysorbate 60 3,0% p/p) Jusqu'à 3 ou 5 g

Cire d'abeille blan-

che 6,0% p/p) Jusqu'à 3g jusqu'à 3 ou 5 g Huile d'arachide 91,0% p/p) Jusqu'à 3 ou 5 g Chauffer l'huile d'arachide, la cire d'abeille blanche et le polysorbate 60 Jusqu'à 1600C sous agitation. Maintenir le tout à 160 C pendant 2 heures et le laisser ensuite

refroidir jusqu'à la température ambiante sous agitation.

AJouter l'ingrédient de manière aseptique au véhicule et procéder à la dispersion en se servant d'un mélangeur à haute vitesse.Raffiner par passage à travers un broyeur à colloldes. Introduire le produit de manière aseptique

dans des seringues en matière plastique stériles.

Potion vétérinaire à administrer par la voie orale % P/V Limites Ingrédient actif 0,35 0,05-0,50 % p/v Polysorbate 85 5,0 Alcool benzylique 3,0 Propylène glycol 30,0 Phosphate tampon suivant pH 6,0 - 6, 5 Eau Jusqu'à 100,0 Dissoudre l'ingrédient actif dans le polysorbate , l'alcool benzylique et le propylène glycol. Ajouter une proportion de l'eau et ajuster le pH à 6,0 - 6,5

avec le tampon au phosphate, si cela se révèle nécessaire.

Amener au volume final avec de l'eau. Introduire le pro-

duit dans un récipient pour potions.

Pate vétérinaire à administrer par la voie orale % p/p Limites Ingrédient actif 7,5 1-10 % p/p Saccharine 25,0 Polysorbate 85 3,0 Distéarate d'aluminium 5,0 Huile de noix de coco fractionnée Jusqu'à 100,0 Disperser le distéarate d'aluminium dans l'huile de

noix de coco fractionnée et le polysorbate 85 sous chauf-

fage. Refroidir Jusqu'à la température ambiante et dis-

perser la saccharine dans le véhicule huileux. Répartir l'ingrédient actif dans la base. Introduire le produit

dans des sringues en matière plastique.

Granules vétérinaires pour l'administration par la nour-

riture D 12 Limitee Ingrédient actif 2,5 0,05-5 % p/p Farine de pierre calcaire jusqu'à 100,O Mélanger l'ingrédient actif à la farine de pierre calcaire. Préparer les granules en mettant en oeuvre un

procédé de granulation à l'état humide. Procéder au sé-

chage en utilisant un plateau ou un séchoir à lit flui-

disé. Introduire le produit dans le récipient approprié.

Concentré émulsionnable Ingrédient actif 50 g Emulsif anionique 40 g (par exemple phénylsulfonate CALX) Emulsif non ionique 60 g (par exemple Syperonic NP13) Solvant aromatique (par exemple Solvesso 100> jusqu'à 1 litre Mélanger tous les ingrédients et agiter jusqu'à dissolution. Granules (a) Ingrédient actif 50 g Résine de bois 40 g Granules de gypse (20-60 mesh) Jusqu'à 1 kg (par exemple Agsorb 100OA) (b) Ingrédient actif 50 g Syperonic NP13 40 g

56 2570390

Granules de gypse (20-60 mesh) jusqu'à 1 kg.

Dissoudre tous les ingrédients dans un solvant vo-

latil, par exemple le chlorure de méthylène, et ajouter

la solution à des granules roulant dans un mélangeur. Sé-

cher pour éliminer le solvant. On a déterminé l'activité des facteurs A, B, C, D, X

et F en se servant de toute une série de parasites ou or-

ganismes nuisibles et de leurs hôtes, y compris les sui-

vants: Tetranychus urticae, Myzus persicae, Heliothis virescens, Chilo portellus, Meloidogyne incognita, Panonchus ulmi,

Phorodon humuli, Aulacorthum circumflexum.

On a utilisé le produit sous la forme d'une prépara-

tion liquide. On a réalisé les préparations en dissolvant

le produit dans de l'acétone. On a ensuite dilué les solu-

tions avec de l'eau contenant 0,1 % ou 0,01 % en poids d'

un agent mouillant Jusqu'à ce que les préparations liqui-

des continssent la concentration voulue du produit.

Le procédé d'essai adopté eu égard à chaque organis-

me nuisible ou parasite comprenait le support d'un cer-

tain nombre d'organismes nuisibles ou parasites par un milieu qui était habituellement une plante hôte et le

traitement du milieu par la préparation (test résiduel).

Dans le cas de Tetranychus urticae, on a traité à la fois les organismes nuisibles ou parasites et le milieu par la

préparation (test de contact).

Suivant ce procédé, on a découvert que les facteurs A à F étaient efficaces en concentrations (en poids de

produit) de 500 parties par million ou moins.

L'efficacité des composés selon l'invention chez des

veaux infectés par Dictyocaulus Viviparus a été déterminée.

Des veaux ont été infectés avec Dictyocaulus Viviparus puis traités avec une dose unique (200 microgrammes/kg) du composé selon l'invention 23 jours après l'infection. Les animaux ont été tués 29 jours après l'infection et le nombre de vers a été compté. C'est ainsi par exemple que suivant cette procédure

les facteurs A, B, C et D ont éliminé D Viviparus.

En général, les composés selon l'invention sont non-to-

xiques, aux doses physcologiquement. C'est ainsi, par exemple, que les facteurs A, B, C et D ont des valeurs LD50 d'au moins

mg/kg lorsqu'ils sont testés sur des souris CRH.

Claims (21)

R E V E N D I C A T I O NS

1. Composé répondant à la formule partielle (I) OH

1:!! H

t C H,,CH *2 Composé suivant la revendication 1, répondant à la formule partielle (II) O-H

CH3 H--

vCH3 3. Composé suivant la revendication 2, répondant à la formule générale (III)

59 2570390

:>9 n OH CH3H CA3 CX3 '' "O Ri (

0 <CH3

dans laquelle R représente le radical méthyle, éthyle ou isopropyle et R représente un atome d'hydrogène ou le

radical méthyle.

4. Composé suivant la revendication 3, caractérisé en ce que R1 représente le radical isopropyle et R re-

présente un atome d'hydrogène.

5. Composé suivant la revendication 3, caractérisé en ce que Ri représente le radical méthyle et R2 représente

un atome d'hydrogène. -

6. Composé suivant ltune quelconque des revendications

précédentes, sensiblement en l'absence d'autres composés

du type macrolide. -

7. Composé suivant l'une quelconque des revendica-

tions 1 à 5, sous forme sensiblement pure.

8. Composé suivant l'une quelconque des revendica-

tions 1 à 3, en mélange à au moins un autre composé sui-

vant les revendications précitées; ou les composés de la

revendication 3 dans lesquels R2-représente un atome d' hydrogène en mélange les uns aux autres; ou les composés suivant la revendication 3, dans lesquels R2 représente

I2570390

le radical méthyle, en mélange les uns aux autres.

9. Composé suivant l'une quelconque des revendica-

tions 1 à 5, sous forme d'un bouillon de fermentation entier contenant au moins un composé de ce genre; les solides d'un bouillon de fermentation entier contenant au moins un composé de ce genre, des mycéliums intacts ou lysés, séparés d'un tel bouillon, ou les solides d'un tel bouillon, après séparation des mycéliums intacts ou lysés; ou un tel bouillon après la séparation des

mycéliums.

10. Composé suivant la revendication 3, pour l'uti-

lisation à titre d'antibiotique en vue du traitement des

être humains ou des animaux.

11. Compositions pour l'utilisation en vue de com-

battre des parasites ou organismes nuisibles, par exem-

ple dans le domaine agricole, horticole ou forestier, contenant une quantité efficace d'au moins un composé suivant l'une quelconque des revendication 1 à 10, ainsi

qu'un ou plusieurs véhicules et/ou excipients.

12. Compositions suivant la revendication 11, carac-

térisées en ce qu'elles contiennent un composé suivant la revendication 3, éventuellement en même temps qu'un ou - plusieurs agents tensio-actifs, agents antiagglutination ou anticoncrétion, agents antimousses, régulateurs de viscosité, liants, adhésifs, fertilisants, stabilisants

ou autres additifs ou ingrédients actifs.

13. Compositions pour l'utilisation en médecine hu-

maine ou en médecine vétérinaire, contenant une quantité efficace d'au moins un composé suivant l'une quelconque

des revendications 1 à 10, en même temps qu'un ou plusieurs

véhicules et/ou excipients.

14. Compositions suivant la revendication 13, pour l' utilisation en médecine vétérinaire, caractérisées en ce qu'elles contiennent un ou plusieurs composés suivant la

25703 90

revendication 3, possédant une pureté d'au moins 50 % et

se présentant sous une forme appropriée à l'administra-

tion par la voie parentérale (y compris intramammaire),

orale, rectale, topique ou pour l'utilisation sous for-

me d'implants.

15. Compositions suivant l'une quelconque des reven-

dications 11 à 14, caractérisées en ce qu'elles contien-

nent un mélange de composés actifs, constitué principa-

lement d'un ou plusieurs composés suivant l'une quelcon-

que des revendications 1 à 5.

16. Compositions suivant l'une quelconque des reven-

dications 11 à 15, caractérisées en ce qu'elles contien-

nent le composé suivant la revendication 4 ou le composé

suivant la revendication 5.

17. Procédé de préparation d'un composé suivant la

revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend l'éta-

pe de culture d'un micro-organisme du genre Streptomyces,

si bien que ledit composé est produit et, si on le sou-

haite, de séparation subséquente d'un ou plusieurs des-

dits composés à partir du bouillon de fermentation.

18. Procédé suivant la revendication 17, caractéri-

sé en ce que le micro-organisme en question est Streptomy-

ces thermoarchaensis NCIB 12015 ou un mutant de ce dernier

ou un autre membre de l'espèce Streptomyces thermoarcha-

ensis.

19. Procédé suivant la revendication 17, caractérisé en ce que l'on met les mycéliums du micro-organisme en contact avec un solvant miscible à l'eau de manière à en extraire un ou plusieurs composés suivant la revendication

1.

20. Composés du type macrolide qui sont productibles

par fermentation de Streptomyces thermoarchaensis.

21.Micro-organismes de l'espèce Streptomyces thermo-

archaensis.

62 2570390

22. StreUtomyces thermoarchaensis NCIB 12015 et ses mutants. 23. Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12111, NCIB

12112, NCIB 12113 et NCIB 12114 et leurs mutants.

24. Procédé pour combattre des infections ou des

infestations, par exemple, dans le domaine agricole, hor-

ticole ou forestier, caractérisé en ce que l'on applique au parasite ou à tout autre organisme nuisible ou au champignon ou à tout autre organisme responsable desdites infections ou infestations, ou à l'endroit o ils logent ou à leur biotope, une quantité efficace d'un ou plusieurs composés suivant la revendication 1 ou d'une composition

suivant la revendication 11.