LU86074A1 - Composes antibiotiques et leur preparation - Google Patents

Description

I * » „ I * * I La présente invention concerne de nouveaux composés I antibiotiques et des procédés de préparation de ces sub- I " stances. De manière plus particulière» 1*invention concer- I ne des composés antibiotiques que l'on peut obtenir par I 5 la fermentation d*organismes du genre Streptomyces.

I Suivant l'un de ses caractéristiques, la présente in- I vention a pour objet une nouvelle classe de substances I que la demanderesse a appelé Antibiotiques S5^1 et que l1 I on peut préparer en faisant croître une souche d’un micro- I 10 organisme non encore antérieurement décrite, dans des con- I ditions réglées. Les Antibiotiques S541 possèdent une ac- I tivité antibiotique et, plus particulièrement, une acti- I vite anti-endoparasite, anti-ectoparasite, antifongique, I insecticide, nématocide et acaricide et leur utilisation I ~ 15 pour l'agriculture, l'horticulture, la santé animale et I humaine, présente un intérêt spécial. On peut également I _ employer les composés à titre d'intermédiaires pour la I préparation d'autres composés actifs. On peut obtenir les I substances par fermentation et les récupérer sous une for-

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* · 4 a s, me sensiblement pure de la manière décrite dans le pré-sent mémoire.

Les Antibiotiques S541 constituent un groupe de composés apparentés répondant à la formule partielle (I) :

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Ati? 0Lvjf o-s plus particulièrement, la formule partielle (II)

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Six composés répondant à la formule partielle (II) s seront décrits de manière plus particulière dans la sui te du présent mémoire, La présente invention concerne -s les composés qui répondent aux formules partielles sus— 5 · mentionnées, tant individuellement quTen combinaison. Pour certaines utilisations, par exemple en agriculture ou en horticulture, ou en médecine vétérinaire, il peut encore se révéler commode d’utiliser les Antibiotiques S541 sans séparation en leurs composants individuels, mais, à d* 10 autres fins, par exemple en médecine humaine, il peut être préférable de faire appel aux composés individuels.

La portée de la présente invention s*étend par conséquent aussi à un composé suivant 1*invention lorsqu*il se trouve en mélange à au moins un autre composé suivant l’in-15 vention, comme aussi aux composés individuels, par exem-v pie, sous forme sensiblement pure, ou sensiblement en 1* absence d*autres substances du type des macrolides.

Les Antibiotiques S541 tels qu*initialement isolés, peuvent être aisément séparés par chromatographie sur si-20 lice de la manière décrite dans la suite du présent mémoire, en deux composants possédant une activité antibiotique, par exemple anthelmintique et qui éteignent la . fluorescence U.V. à 254 nm. Le composant I se caractérise par une valeur Rf qui fluctue de 0,70 à 0,75 et le compo-25 sant II se caractérise par une valeur,Rf qui fluctue de 0,39 à 0,46, les valeurs Rf étant déterminées par chromatographie en couche mince sur des plaques de silice 60 Merck 5735, en procédant à l*élution avec un mélange de chloroforme et d*acétate d’éthyle (3 : 1). Les composants ç. 30 I et XI (dans lesquels R représente respectivement -CH^ et -H) des Antibiotiques S541 forment une caractéristique supplémentaire de la présente invention.

Les composants I et II peuvent eux-mêmes être davan-vantage purifiés et ont engendré 6 composés de la formule ! _ 4 * « *

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h s partielle (i) possédant une activité antibiotique, par * exemple anthelmintique. Par conséquent, suivant une autre de ses caractéristiques, la présente invention a ' pour objet des composés de la formule générale (III) î 5

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ÇH3 „ Λγ“3 i 10 . /L/CH3 CH3" ni ]% ^-r1 k ν'»1 15 JdhjÛh Γ T H (III) °-4vjL'CH3 OR3 20 Λ dans laquelle R représente un radical méthyle, éthyle ou isopropyle et R représente un atome d*hydrogène ou le 25 radical méthyle.

La demanderesse a appelé les 6 composés de la formu-

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le (III) facteur A (R *= isopropyle, R* = hydrogène), facteur B (R^ » méthyle, R2 = méthyle), facteur C (R^ = méthyle, R2 = hydrogène), facteur D (R*' = éthyle, R2 = hy-c, jo drogène), facteur £ (R1 = éthyle, R2 = méthyle) et facteur F (R = isopropyle, R2 = méthyle). On préfère tout s particulièrement les facteurs A et C.

On obtient les facteurs B, E et F à partir du compo-sant I, alors que les facteurs A, C et D s*obtiennent à par- / f i 5 I ' · » \ tir du composant II.

Les composés conformes à la présente invention possèdent une activité antibiotique, par exemple une activi-^ té anthelmintique, plus particulièrement contre des né- 5 matodes et, plus spécialement, une activité anti-endopa-rasite et anti-ectoparasite. Plus généralement, les composés sont intéressants pour combattre des parasites tels que les ectoparasites et les endoparasites. Les ectoparasites et les endoparasites infectent les êtres humains et i t 10 toute une série d'animaux et prévalent tout particulière ment chez les animaux des fermes, comme les porcs, les moutons, le bétail, les chèvres et la volaille, les chevaux et les animaux domestiques, comme les chiens et les chats. L*infection du cheptel vivant par des parasites, 15 conduisant à une anémie, une malnutrition et une perte de poids, est une cause majeure d'une important perte économique de par le monde.

~ A titre d*exemples de genres d*endoparasites qui in fectent les animaux précités et/ou les êtres humains, on 20 peut citer les suivants :

Ancylostoma, Ascaridia, Ascaris, Aspicularis,

Bunostomum, Capillaria, Chabertia, Cooperia, Dictyocaulus,

PirofilariB, Enterobius, Haemonchus, Heterakis, Necator, Nematodirus, Nematospiroides. Nippostronqylus, Oesophaqostomure, Dstertaqia, 25 Qxyuris, Parascaris. Stronqylus, Stronqyloides, Syphacia, Toxascaris, Toxocara, Trichonema. Trichostronqylus, Trichinella, Trichuris, and Uncinaria.

A titre d*exemples d'ectoparasites infectant les ani-• maux et/ou les êtres humains, on peut citer des ectopara-

Sff 30 sites du type des arthropodes, comme les insectes à morsures, la lucilie, les puces, les poux, les mites, les insectes suceurs, les tiques et d'autres insectes nuisi- r d , L-

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6 » blés diptères.

* A titre d’exemples de genres d’ectoparasites qui infectent les animaux et/ou les êtres humains, on peut ï citer ceux qui suivent : 5 Ambylomma, Boophilus, Coroptes, Culliphore, Damodex,

Damolinia, Gastrophilus, Haematobia, Haematopinue, Haemophysalis,

Hyalomma, Linoqnathus, Lucilia, Melophyqus, Oestrus, Psorerqates, Psoroptea, Rhipicephalus, Sarcoptes and Stomoxys.

Les composés suivant la présente invention se sont 10 révélés être efficaces, tant in vitro qu’in vivo, contre toute une gamme d’endoparasites et d’ectoparasites. De manière plus particulière, la demanderesse a constaté que les composés conformes à la présente invention étaient actifs contre des nématodes parasites, tels que ceux 15 qui suivent î Haemonchus contortus. Ostertagia circumcinc-ta. Trichostrongylus colubiformis. Dlctyocaulus vivipa-ris, Cooperia oncophera. Ostertagia ostertagi et Nippos-trongylus braziliensis. ainsi que des mites parasites, • comme Sarcoptes sp. et Psoroptes sp.

20 Les composés conformes à la présente invention sont par conséquent intéressants pour le traitement des animaux et des êtres humains présentant des infections endoparasi-tiques et/ou ectoparasitiques.

L’espèce du parasite varie en fonction de l’hôte et 25 du site ou endroit prédominant de l’infection. Ainsi, par exemple, les organismes nuisibles Haemonchus contortus. Ostertagia circumcincta et Trichostrongylus colubiformis infectent généralement les moutons et se logent, de manière prédominante,dans l’estomac et l’intestin grêle, 30 tandis que Dictyocaulus vivlparus. Cooperia oncophora et Ostertagia ostertagi infectent généralement le bétail et se logent de manière, prédominante, dans les poumons, les * ? a" 4.

* · · 7 « intestins ou ^estomac respectivement, i Au surplus, on a constaté que les composés suivant la présente invention possédaient une activité antifongi-- que, par exemple, contre des souches de Candida sp. com- 5 me Candida albicans et Candida glabrata et contre des levures, comme Saccharomyces carlsbergensis.

On a également constaté que les composés suivant la présente invention étaient actifs contre le nématode vivant libre Caenorhabditis elegans.

10 On a également constaté que les composés suivant la présente invention étaient efficaces pour combattre des organismes nuisibles appartenant aux insectes, aux acariens et aux nématodes, dans le domaine agricole, horticole, forestier, de la santé publique et des produits 15 emmagasinés. On peut traiter utilement des parasites ou " organismes nuisibles du sol et des récoltes végétales, y compris les céréales (par exemple le blé, l’orge, le maïs et le riz), les légumes (par exemple le soja), les fruits (par exemple les pommes, les raisins et les ci-20 trus), comme aussi les récoltes à racines ou tubercules (par exemple betterave sucrière, pomme de terre).

* De manière plus particulière encore, la demanderes se a découvert que les composés suivant la présente invention étaient actifs, contre par exemple, des aphis et 25 des mites des fruits, tels que les suivants : Aphis fa-bae, Aulacorthum circumflexum. Myzus persicae. Nephotet-tix cincticeps. Nilparvata lugens. Panonychus ulmi. Pho-rodon humuli. Phyllocoptruta oleivora. Tetranychus urti-cae et des membres des genres Trialeuroides; des némato-30 des, comme des membres des genres Aphelencoides. Globode-ra, Heterodera. Meloidogyne et Panagrellus; des lépidop-tères,tels que Heliothis. Plutella et Spodoptera: des charençonsdu grain, comme Anthonomus grandis et Sitophilus granarius; des ténébrions, tels que Iribolium castaneum; / I » « » 8 'λ » des mouches, comme Musca domestjça; des fourmis du genre solénopsis; des adèles; Pear psylla; Thrips tabac!; des blattes comme Blatella germanica et Periplaneta américaine et des moustiques comme Aedes aegypti, 5 La présente invention a par conséquent pour objet des composés répondant à la formule partielle (i) telle que précédemment définie, que l’on peut utiliser à titre d* antibiotique s. De manière plus particulière, on peut utiliser ces substances pour le traitement d’animaux et 10 d’êtres humains infestés d'endoparasites, d’ectoparasites et/ou à infestations fongiques et également dans la domaine agricole, horticole ou forestier, à titre de pesticides, pour combattre des insectes, das acariens et des nématodes nuisibles· On peut également les utiliser de 15 manière générale comme pesticides pour combattre ou maîtriser le développement d’organismes nuisibles en d’autres circonstances, par exemple dans les magasins, les immeubles ou d’autres pièces publiques ou endroits où se logent les organismes nuisibles en question. En général, on 20 peut appliquer les composés soit à l’hôte (animal ou être humain ou plante ou tout au^tre végétation) ou aux orga-* nismes nuisibles ou à leur biotope· On préfère particu lièrement les facteurs A, B, C, D, E et F telsque précédemment définis. On peut présenter les composés suivant 25 l’invention sous forme de compositions convenant à l’administration de toute manière commode pour l’usage en médecine humaine ou en médecine vétérinaire et, par conséquent, l’invention a également pour objet des compositions pharmaceutiques qui comprennent un composé suivant = 30 l’invention adapté à l’usage en médecine humaine ou en médecine vétérinaire. Les compositions de ce genre peu-^ vent être présentées pour l’usage d’une manière classi que à l’aide d’un ou de plusieurs excipients ou véhicu-j les appropriés.

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Les compositions suivant la présente invention englobent celles qui se présentent sous une forme spécialement destinée à l’administration par la voie parentérale (y compris l’administration intramammaire), orale, 5 rectale, topique ou sous forme d’implant. Lorsqu’on 1’ incorpore à une composition dont on exige qu’elle soit stérile, par exemple des injections (y compris des préparations intramammaires), des collyres ou gouttes ophtalmiques, des pommades et des implants, l’ingrédient actif 10 doit lui-même être fabriqué de manière aseptique ou stérilisé après sa fabrication par mise en oeuvre de procédés comme une irradiation par des rayons gamma ou une exposition à l’oxyde d’éthylène.

On peut présenter les composés conformes à l’inven-15 tion sous une forme convenant à l’usage en médecine vétérinaire ou en médecine humaine par injection et on peut les présenter sous la forme de doses unitaires, dans des ampoules, ou dans d'autres récipients contenant des doses unitaires, ou encore dans des récipients qui en contien-20 nent des doses multiples, avec un conservateur additionnel si cela se révèle nécessaire. Les compositions destinées à l'injection peuvent se présenter sous la forme de suspensions, de solutions ou d'émulsions dans des véhicules huileux ou aqueux et peuvent contenir des agents 25 de mise en composition, comme des agents de mise en suspension, de stabilisation, de solubilisation et/ou de dispersion. L’ingrédient actif peut aussi se présenter sous la forme d’une poudre stérile destinée à être ajoutée à un véhicule stérile en vue de la reconstitution du médi-30 cament avant son emploi, par exemple de l'eau apyrogène, stérile. Comme véhicules huileux, on peut citer des alcools polyhydroxylés et leurs esters, comme des esters de glycérol, des acides gras, des huiles végétales, com-j me l’huile d’arachide ou l’huile de graines de coton, •j y* • * . * 10 ί des huiles minérales, comme la paraffine liquide et 1* ' oléate d'éthyle et d'autres composés similaires. On peut également utiliser d*autres véhicules, comme le propylè-v ne glycol. On peut également présenter les compositions 5 destinées à l'usage en médecine vétérinaire sous la forme de préparations intramammaires dans des hases à libération prolongée ou à libération rapide de la substance médicamenteuse et elles peuvent se présenter sous la forme de suspensions ou de solutions stériles dans des vé-10 hicules aqueux ou huileux. Les véhicules huileux peuvent être, par exemple, ceux décrits plus haut et peuvent également contenir un agent de mise en suspension ou un agent épaississant, comme des paraffines molles ou dures, la cire d'abeille, la 12-hydroxy-stéarine, l'huile de ricin 15 hydrogénée, des stéarates d'aluminium, ou le monostéarate de glycéryle. On peut incorporer des agents tensio-actifs non ioniques, cationiques ou anioniques, classiques, seuls ou en combinaison, à la composition.

Les composés conformes à la présente invention peu-20 vent également se présenter pour l'usage en médecine humaine ou en médecine vétérinaire, sous une forme qui con-* vient à l'administration par la voie orale, par exemple sous la forme de solutions, de sirops ou de suspensions, ou sous la forme d'une poudre sèche destinée à être in-25 corporée à de l'eau ou à tout autre véhicule en vue de la reconstitution du médicament avant son emploi, éventuellement avec addition d'agents colorants et de sapidité. On peut également utiliser des compositions solides, comme des comprimés, des gélules, des pilules, des pas-30 ties, des bols, des poudres, des pâtes ou des granules.

Les compositions solides et liquides destinées à 1* administration par la voie orale peuvent se -préparer selon des procédés bien connus des spécialistes de la technique. Des compositions de ce genre peuvent également con-35 ί tenir un ou plusieurs excipients et/ou véhicules pharma--rt

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11 * Φ t » ceutiquement acceptables qui peuvent se trouver sous for-? me solide ou liquide. A titre d’exemples de véhicules ou excipients pharmaeeutiquement acceptables, appropriés à l’emploi sous forme de doses solides, on peut citer des 5 liants (par exemple amidon de maïs prégélatinisé, poly-vinylpyrrolidone ou hydroxypropylméthylcellulose); des charges (par exemple lactose, cellulose microcristalline ou phosphate de calcium); des lubrifiants (par exemple stéarate de magnésium, talc ou silice); des agents de 10 désintégration (par exemple amidon de pomme de terre ou glycolàte d’amidon sodique); ou des agents mouillants (par exemple laurylsulfate de sodium). Les comprimés peuvent être enrobés par mise en oeuvre de procédés bien connus des spécialistes de la technique. Comme exemples d* | ^ 15 additifs pharmaeeutiquement acceptables^ appropriés à 1* usage sous des formes de dosage liquides,on peut citer des agents de mise en suspension (par exemple sirop de sorbitol, méthylcellulose ou graisses comestibles hydrogénées); agents émulsifs (par exemple lécithine ou gomme 20 d’acacia); véhicules non aqueux (par exemple l’huile d* amande, esters huileux ou alcool éthylique); et des con-; * sérvateurs (par exemple p-hydroxybenzoates de méthyle ou de propyle ou acide sorbique); des agents de stabilisation et de solubilisation pouvant également être incorporés 25 aux compositions en question.

On peut préparer des pâtes destinées à l’administra-' tion par la voie orale par mise en oeuvre de procédés bien connus des spécialistes de la technique. A titre d’exemples d’additifs pharmaeeutiquement acceptables appropriés 30 que l’on peut utiliser dans des compositions de pâte, on peut citer des agents de mise en suspension ou de gélification, par exemple distéarate d’aluminium ou huile de ricin hydrogénée; agents dispersants, par exemple po-Jlysorbates, véhicules non aqueux, par exemple huile d’ fi /

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12 I arachide ou esters huileux; agents de stabilisation et > de solubilisation. Les composés suivant la présente in vention peuvent également s*administrer en médecine vétérinaire en les incorporant à la nourriture solide ou 5 liquide quotidienne des animaux, par exemple comme composants de l’alimentation quotidienne de l’animal ou de son eau de boisson.

Aux fins d’administration par la voie buccale, les compositions peuvent prendre la forme de comprimés, de 10 pâtes ou de pastilles que l’on fabrique et présente de manière classique.

On peut également administrer les composés suivant la présente invention par la voie orale en médecine vétérinaire sous la forme d’une potion liquide qui se présen-15 te, par exemple, comme une solution, suspension ou dispersion de l’ingrédient actif en association avec un véhicule ou excipient pharmaceutiquement acceptable.

_· · Les composés suivant l’invention peuvent également se présenter sous la forme de suppositoires, par exemple 20 contenant une base pour suppositoires classique destinée à l’usage en médecine humaine ou en médecine vétérinaire.

* Les composés suivant la présente invention peuvent également se présenter sous une forme convenant à l’administration par la voie topique, pour l’usage en médecine 25 humaine et en médecine vétérinaire, comme des pommades, des crèmes, des lotions, des poudres, des pessaires, des sprays, des bains, des aérosols ou des gouttes (par exemple des gouttes ophtalmiques ou nasales). Les pommades et les crèmes peuvent, par exemple, être composées avec une JO base aqueuse ou huileuse en recourant à l’addition d’ agents épaississants et/ou gélifiants appropriés. Les pommades destinées à être administrées à l’oeil peuvent * se fabriquer d’une manière stérile en utilisant des compo sants stérilisés.

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Des lotions peuvent être composées avec une base >. aqueuse ou huileuse et contiennent également, en général, un ou plusieurs agents émulsifs, agents stabilisants, agents dispersifs, agents de mise en suspension, agents 5 épaississants ou agents colorants.

Des poudres peuvent être formées à l’aide de n1importe quelle base pulvérulente appropriée.

Des gouttes peuvent être composées avec une base aqueuse ou non aqueuse et comprennent également un ou plu-10 sieurs agents dispersifs, agents stabilisants, agents solubilisants ou agents de mise en suspension. Elles peuvent également contenir un conservateur.

Pour 1* administration par la voie topique par inhalation, on peut fournir les composés conformes à la pré-15 sente invention à des fins destinées à l’usage en médeci-~ ne vétérinaire ou en médecine humaine, sous la forme d' un spray d’aérosol ou d’un produit destiné à être administré par l’intermédiaire d’un insufflateur.

Les composés suivant la présente invention peuvent 20 s’administrer en combinaison à d’autres ingrédients phar-maceutiquement actifs. Les doses quotidiennes totales des composés suivant l’invention que l’on utilise tant en médecine humaine quen médecine vétérinaire, varient dans la gamme de 1 à 2000^ug/kg de poids corporel, de préférence 25 de 10 à 1000 ^ig/kg de poids corporel, plus avantageusement encore de 100 à 500 ^ig/kg de poids corporel et peuvent s’administrer en doses subdivisées, par exemple de 1 à h fois par jour.

On peut présenter les composés conformes à la présen-30 te invention de n’importe quelle manière commode pour 1’ usage en horticulture ou en agriculture et, par conséquent, - la portée de la présente invention s’étend également aux compositions comprenant un composé suivant la présente in-J vention^ qui sont adaptées à l'usage horticole ou agricole.

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Ces compositions comprennent des types secs ou liquides, par exemple des poussières, comprenant des concentrés ou bases pour poussières, des poudres, comprenant des poudres solubles ou mouillables, des granules, y compris 5 des microgranules et des granules dispersibles, des boulettes ou des grains, des produits fluides, des émulsions, comme des émulsions diluées ou des concentrés émulsifia-bles, des bains, comme des bains pour racines et des bains pour semences, des apprêts pour semences, des grains ou 10 boulettes pour semences, des concentrés d'huile, des solutions d'huile, des injections, par exemple des injections pour souches, des sprays, des fumées et des brouillards· Généralement, des compositions de ce genre comprennent le composé en association avec un diluant ou véhicu-15 le approprié. Ces véhicules peuvent se présenter sous la forme liquide ou solide et être destinés à faciliter 1* application du composé, que ce soit en le dispersant à 1* endroit où il doit être appliqué, ou que ce soit pour fournir une composition qui peut être transformée par 1’ '20 utilisateur en une préparation dispersible· Des compositions de ce genre sont bien connues des spécialistes de • la technique et peuvent être préparées par mise en oeuvre de procédés classiques, tels que, par exemple, en mélangeant et/ou en broyant le ou les ingrédients actifs en 25 même temps que le véhicule ou le diluant, par exemple le véhicule solide, le solvant ou l'agent tensio-actif.

On peut choisir des véhicules solides appropriés à la confection de compositions comme des poudres, des granulés et des poussières, par exemple, parmi les charges 30 minérales naturelles, comme la terre à diatomées, le talc, la kaolinite, la montmorillonite, la pyrophyllite et 1* attapulgite. Si on le souhaite, de l'acide silicique fortement dispersé ou des polymères absorbants fortement dispersés peuvent être incorporés à la composition. Les h ' - * 15 véhicules absorbeurs granulés que l'on peut utiliser peuvent être poreux (par exemple pierre ponce, brique pilée, sépiolite ou bentonite), ou non poreux (par exemple cal-cite ou sable)· A titre de matières prégranulées, appro-5 priées que l'on peut utiliser et qui peuvent Être de nature organique ou inorganique, on peut citer la dolomie et des résidus de végétaux broyés.

Comme solvants appropriés à utiliser comme véhicules ou diluants, on peut citer des hydrocarbures aromatiques, 10 des hydrocarbures aliphatiques, des alcools et des gly- cols ou leurs éthers, des esters, des cétones, des amides d'acides, des solvants fortement polaires, l'eau et des huiles végétales éventuellement époxydées, . Les compositions en question peuvent également con-15 tenir, seuls ou en combinaison, des agents tensio-actifs non ioniques, cationiques ou anioniques, classiques, par exemple des alcools et des alkylphénols éthoxylés, des sels de métaux alcalins ou de métaux alcalino-terreux d* acides alkylbenzène sulfoniques, d'acides lignosulfoniques 20 ou d'acides sulfosucciniques ou des sulfonates de phénols polymères qui possèdent de bonnes propriétés émulsives, dispersives et/ou mouillantes.

Si on le souhaite, on peut incorporer des stabilisants, des agents antiagglutination , des agents anti-25 mousses, des agents de régulation de. la viscosité, des liants et des additifs, des photostabilisants, comme aussi des agents de fertilisation, des agents de stimulation de l'alimentation ou d'autres substances actives, aux compositions en question. Les composés suivant la présen-- 30 te Invention peuvent également entrer dans les composi tions appropriées en mélange à d'autres insecticides, acaricides et nématocides.

La concentration en principe actif dans les composi- ft I tions varie généralement de 0,01 à 99 % et, plus avanta- ΗΓ 2 / * • * I · 16 geusement, de 0,01 % a 40 %, en poids.

; Les produits industriels sont généralement fournis sous la forme de compositions concentrées destinées à être diluées jusqu*à une concentration appropriée du principe 5 actif, par exemple de 0,001 à 0,0001 % en poids, en vue de leur application.

Pour l*usage en horticulture et en agriculture ou pour l'usage en médecine vétérinaire, il peut être souhaitable d'utiliser le bouillon de fermentation entier ou 10 complet, sans séparation en composants ou facteurs, comme source ' des composés actifs. Il peut convenir d'utiliser le bouillon séché (contenant les mycéliums ) ou d'utiliser les mycéliums lysés, des mycéliums vivants ou morts, séparés du bouillon par mise en oeuvre de techniques 15 d'évaporation ou de séparation solide/liquide, ou d'utiliser le bouillon de fermentation qui subsiste après la séparation des mycéliums . Si on le souhaite, les mycéliums peuvent être pasteurisés ou, plus avantageusement, séchés, par exemple par séchage par pulvérisation ou sé-20 chage au rouleau. Si on le souhaite, le bouillon ou les mycéliums peuvent être transformés en compositions com-• prenant des diluants, excipients ou véhicules inertes ou classiques, de la manière précédemment décrite.

Il faut bien comprendre de ce qui précède qu'en gé-25 néral, on peut utiliser les composés conformes à la présente invention pour combattre des infections ou des infestations en appliquant une quantité efficace d'un ou plusieurs des composés précités à l'organisme responsable de l'infection ou de l'infestation ou à l'endroit où il se 30 loge.

Suivant une autre de ses caractéristiques, la pré-. sente invention a également pour objet un procédé de production des Antibiotiques S541 ou d’un composant ou fac-\ teur de ceux-ci, répondant à la définition précédemment

H

' y— 117 donnée, caractérisé en ce qu’il comprend l’étape consis-? tant à cultiver un organisme du genre Streptomyces capa ble de produire au moins l’un des composés suivant l’invention, de manière qu’au moins l’un desdits composés 5 soit produit et, si on le souhaite, à isoler le composé souhaité· L’organisme en est de préférence un qui produit principalement un ou plusieurs composés suivant l’invention.

Sur base d’études taxonomiques, un micro-organisme 10 particulier capable de produire les substances susmentionnées appartient à une nouvelle espèce du genre Streptomyces et a été dénommé Streptomyces thermoarchaensls.

Un échantillon de ce micro-organisme, qui est un isolat du sol, a été déposé à la collection permanente de cultu-15 res de l’institution britannique dénommée : National Collections of Industrial and Marine Bacteria, Torry Research Station, Aberdeeen, Royaume-Uni et on lui a attribué le numéro d’accès NCIB 12015· Les caractéristiques morphologiques et relatives à la culture du Streptomyces 20 . thermoarchaensls NCIB 12015 sont indiquées dans la suite du présent mémoire et cet organisme, en même temps que df • autres souches de Streptomyces productrices d’Antibioti- ques S541, constitue une autre caractéristique de la présente invention. De manière plus particulière, l’invention 25 s’étend à la nouvelle espèce de Streptomyces dont les membres possèdent les mêmes caractéristiques essentielles de morphologie et de culture que Steptomyces thermoarchaen-sis NCIB 12015.

La portée de la présente invention s’étend également 30 à n’importe quels composés qui sont susceptibles d’être produits par fermentation de Streptomyces thermoarchaensls • NCIB 12015 et qui sont les isomères optiques des composés de la formule (I).

J L’organisme du genre Streptomyces sera de préférence -18- . * . .

i

Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12015 ou un mutant de celui-ci.

Des mutants de Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12015 peuvent surgir spontanément ou peuvent être pro-5 duits par mise en oeuvre de toute une série de procédés, * y compris ceux esquissés dans les techniques pour le dé veloppement de micro-organismes par H.I. Adler dans "Radiation and Radioisotopes for Industrial Microorganisms", Proceedings of the Symposium, Vienna 1973, p241, Intema-X0 tional Atomic Energy Authority. Des procédés de ce genre comprennent un rayonnement ionisant, des procédés chimiques, par exemple le traitement par de la N-mëthyl-N'--nitro-N-nitrosoguanidine (NTG), de la chaleur, des techniques génétiques comme la recombinaison, la transduc-15 tion, la transformation, la lysogénisation et la conversion lysogënique et des techniques sélectives pour l'obtention de mutants spontanés. Ainsi, par exemple, la demanderesse a obtenu 4 souches mutantes de Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12015 et chacune d'entre elles a 20 été déposée à la collection permanente de cultures de l'institution britannique National Collections of Industrial and Marine Bacteria, Torry Research Station, Aberdeen, Royaume-Uni et on a attribué le-s numéros d'accès NCIB 12111, NCIB 12112, NCIB 12113 et NCIB 12114 à ces souches. 25 Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12111, 12112,12113 et 12114 et leurs mutants constituent une caractéristique supplémentaire de la présente invention- Les souches NCIB 12015 et NCIB 12114 - 5 ont été déposées respectivement le 10.9.1984 et le 26.5.1985.

30 Les souches mutantes NCIB 12111, 12112 et 12113 ont été obtenues par le traitement de spores de Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12015 par de la NTG et ont ensuite été caractérisées par le procédé en une étape de Holli- . day (R.Holliday (1956) Nature 178 987).

35 La souche mutante NCIB 12114 surgit par mutation spontanée de Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12015 et fut identifiée comme étant résistante à la streptomycine

L

% I * » » 19 après être demeurée viable suite à 1*exposition à 100 - ^ug/ml de sulfate de streptomycine à 28°C pendant 5 jours.

Des études taxonomiques indiquent que Streptomvces 5 thermoarchaensis NCIB 12015 constitue un micro-organisme antérieurement non encore révélé d'une nouvelle espèce dont les caractéristiques sont décrites dans la suite du présent mémoire et sont essentiellement celles de l'espèce comme un tout. Il faut bien comprendre que la por-10 tée de l'invention s'étend à tous les membres de cette espèce, y compris n'importe quel organisme possédant des caractéristiques essentielles sensiblement similaires.

Sur les milieux de sporulation préférés, à savoir farine d'avoine gélose, malt-levure gélose et sels inor-15 ganiques-amidons gélose (Shirling, E.B. et Gottlieb, D.

(1966) Int. J. Syst, Bacteriol. 1_6, 313-340), Streptomvces thermoarchaensis NCIB 12015 croît abondamment, produisant un mycélium substrat stable et un mycélium aérien portant des spores en chaînes à spirales ouvertes 20 comme ramifications hors des hyphes principales. Sur ces milieux, la pigmentation de l'envers est jaune/brun et les sporophores sont gris. A un agrandissement centuple, les spcrcphores contiennent 2 à 5 tours par chaîne avec 5 à 10 spores dans chaque tour de la spirale. Bn moyenne, 25 les sporophores contiennent entre 20 et 50 spores. La microscopie électronique à balayage avec un agrandissement de 12000 fois révèle que les spores sont à parois lisses et de forme ellipsoïdale avec des dimensions de 0,7 ^pm x 1,4 à leurs points les plus larges. Streptomvces 30 thermoarchaensis NCIB 12015 est Gram-positif et est capable de croître et de sporuler à des températures qui fluctuent de 20°C à 50°C.

Une comparaison des données susmentionnées à des ‘ descriptions publiées dans l'ouvrage de Bergey "Manual

'N

<L

/ 4 20 f of Determinative Bacteriology (8ème édition) indique que 1»organisme Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12015 appartient au genre Streptomyces.

Lfidentification du Streptomyces thermoarchaensis 5 NCIB 12015 au niveau du groupe d’espèce a été effectuée en utilisant une matrice d’identification associée à un ordinateur, décrite par Williams et coli. (J. Gen. Mi-crobiol (1983) 12^, 1815-1830). Les résultats de 41 tests taxonomiques décrits par les auteurs susmentionnés 10 sont les suivants pour Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12015 ï

RESULTAT

CARACTERE -

Chaînes de spores verticillati Chaînes de spores retinaculiaperti - 15 Chaînes de spores rectiflexibiles

Chaînes de spores spirales +

Fragmentation de mycélium -

Spores à surface lisse +

Spores à surface rugueuse - 20 ' Couleur des spores grise +

Couleur des spores rouge Couleur des spores verte

Envers jaune/brun +

Envers rouge/orange · - 25 Production de mélanine

Utilisation d’adonitol

Utilisation de cellobiose +

Utilisation de D-fructose + - Utilisation de méso-inositol - 30 Utilisation d’insuline +

Utilisation de mannitol

Utilisation de raffinose + f Utilisation de rhamnose + /

• * I

21 * * .

RESULTAT

Utilisation de D-xylose +

Utilisation d’acide DL-a-aminobutyrique

Utilisation de L-histidine + 5 Utilisation de L-hydroxyproline - Dégradation d'allantoïne + Dégradation d'arbutine + Dégradation de xanthine + Dégradation de pectine + 10 Dégradation de lécithine Réduction de nitrate +

Production d’hydrogène sulfuré +

Tolérance à l’azotiare de sodium (0,0196,p/v)

Tolérance au chlorure de sodium (796, p/v) 15 Tolérance au phénol (0,196,p/v) +

Croissance à 45°C + Résistance à la néomycine (50 /ig/ml“^) Résistance à la rifampicine (50 /ug/ml’“^) +

Antibiose vis-à-vis de Aspergillus niger LIV 131 + 20 Antibiose vis-à-vis de Bacillus subtilis NCIB 3610 . Antibiose vis-à-vis de Streptomyces mur inus ISP 5091 + L'organisme n'a pas été identifié comme appartenant 25 à l'un quelconque des 23 groupes d'espèces principaux (Williams, S.T, et coll. (1983) J. Gen. Microbiol 12§ f 1815-1830), ni à l'un quelconque des groupes d'espèces mineurs et des amas de membres uniques définis par Williams et collaborateurs (J. Gen. Microbiol. (1983) 129, 1743-ώ 30 1813)· Les caractéristiques de Steptomyces thermoarchaen-

Bis NCIB 12015 ont également été comparées aux descriptions d'espèces de Streptomyces connues dans l'ouvrage de Bergey Manual of Determinative Bacteriology (8ème édition), en rapports ISP par Shirling et Gottlieb (Int. J. Syst.

,SL

» i 22 ' * . .

Bacteriol. (1968) J[8, 69-189; Int. J. Syst. Bacteriol. (1968) 18, 279-392; Int. J. Syst. Bacteriol. (1969). 19, 391-512; Int. J. Syst. Bacteriol (1972) 22, 265-394) et ^ à quelques nouvelles espèces validement décrites dans 1* 5 ouvrage International Journal of Systemstic Bacteriolo-gy depuis 1980.

Aucun appariement n'a pu être établi entre Strep-tomyces thermoarchaensis NCIB 12015 et une espèce décrite et, sur cette base, la demanderesse suppose que Strep-10 tomyces thermoarchaensis NCIB 12015 est le premier membre connu d’une nouvelle espèce appartenant au genre S treptomyces.

Les souches mutantes NCIB 12111, 12112, 12113 et 12114 possèdent toutes des caractéristiques essentielles 15 sensiblement semblables à celles de S trep tomyces thermoarchaensis. Cependant, la souche NCIB 12111 exige de 1* adénine pour 8a croissance, la souches NCIB 12112 exige de la sérine pour sa croissance, la souche NCIB 12113 exige de l'histidine pour sa croissance et la souche 20 NCIB 12114 résiste à la streptomycine.

La production d'Antibiotiques S541 par fermentation . • d’un organisme du type Streptomvces approprié peut s’ef fectuer par mise en oeuvre de moyens classiques, c’est-à-dire par la culture de l'organisme du type Streptomvces 25 en présence de sources assimilables de carbone, d’azote et de eels minéraux.

Les sources assimilables de carbone, d'azote et de substances minérales peuvent être fournies par des substances nutritives simples ou complexes. Les sources de ώ 30 carbone englobent généralement le glucose, le maltose, l’amidon, le glycérol, des mélasses, la dextrine, le lactose, le saacharose, le fructose, des acides carboxyli-ques, des acides aminés, des glycérides, des alcools, des alcanes et des huiles végétales. Les sources de car-35 bone constituent généralement de 0,5 à 10 % en poids du f

V

23 . * . · milieu de fermentation.

Des sources d’azote comprennent généralement la farine de fèves de soja, des liqueurs de macération de maïs, des produits solubles de distilleries, des extraits 5 de levure, la farine de graines de coton, des peptones, la farine de noix broyées, l’extrait de malt, des mélasses, la caséine, des mélanges d’acides aminés, l’ammoniac (gaz ou en solution), des sels d’ammonium ou des nitrates. On peut également utiliser l’urée et d’autres 10 amines. Les sources d’azote constituent généralement de 0,1 à '10 Jé en poids du milieu de fermentation.

Des sels minéraux nutritifs que l’on peut incorporer au milieu de culture , englobent les sels généralement utilisés qui sont capables d’engendrer des ions so-15 dium, potassium, ammonium, fer, magnésium, zinc, nickel, cobalt, manganèse, vanadium, chrome, calcium, cuivre, molybdène, bore, phosphate, sulfate, chlorure et carbonate.

Un antimousses peut être présent pour maîtriser un 20 moussage excessif et on peut l’ajouter par intervalles selon les besoins.

« < * La culture de l’organisme du type Strentomvces s’ef fectue généralement à une température de 20 à 50°C, de préférence de 25 à 40°C, plus particulièrement aux envi- 25 rons de 34eC et elle peut avantageusement avoir lieu » sous aération et agitation, par exemple secouage ou remua-ge. Initialement, on peut inoculer une petite quantité d’une suspension du micro-organisme sporulé au milieu, mais, afin d’éviter un retard ou un décalage de crois-50 sance , on peut préparer un inoculum végétatif de l’organisme en inoculant la forme spore de l’organisme à une petite quantité du milieu de culture et on peut transfé-. rér 1* inoculum végétatif ainsi obtenu dans le milieu de I fermentation, ou bien de manière plus avantageuse encore,

L

• j » · .

24 dans un ou plusieurs étages d'ensemencement où une croissance’ supplémentaire se produit, avant de procéder au transfert dans le milieu de fermentation principal. La fermentation se réalise généralement dans une gamme de 5 pH de 5,5 à 8,5, de préférence de 5,5 à 7,5. On peut procéder à la fermentation pendant une période de 2 à 10 jours, par exemple environ 5 jours.

Lorsqu*il est souhaitable de séparer la matière contenant les Antibiotiques S541 et n*importe quels compo-10 sants ou facteurs de ceux-ci du milieu de fermentation entier- ou d*isoler n*importe lesquels des composants ou facteurs, on peut procéder à cette séparation ou à cet isolement par des techniques de séparation et d*isolement classiques. Les Antibiotiques S541 suivant la présente 15 invention sont contenus de manière prédominante dans les mycéliums des cellules, mais on peut également les trouver dans le bouillon de fermentation et on peut aussi ap-' pliquer les techniques d*isolement au bouillon de fermen tation avant ou après sa clarification. Il faut bien com-20 prendre que le choix des techniques d'isolement peut varier entre de larges limites..

• On peut isoler et séparer les Antibiotiques S541 par mise en oeuvre de toute une série de procédés de fractionnement, par exemple en ayant recours à une absôrption-élu-25 tion, une précipitation, une cristallisation fractionnée . et une extraction par solvant que l'on peut combiner de diverses manières. On a constaté que l'extraction par Bolvant et la chromatographie et la cristallisation fractionnée convenaient de la meilleure manière possible à 1' ώ 30 Isolement et à la séparation des composés suivant la pré-j sente invention.

! Après la fermentation, on peut récolter les mycé- liums en utilisant des méthodes classiques, par exemple la filtration ou la centrifugation. Ensuite, on peut, par 35 f exemple, extraire la matière des mycéliums à l'aide d* j*> 3 . L· · * · » · t 25 un solvant organique approprié, comme une cétone, par r exemple 1'acétone, la méthyléthylcétone ou la méthyliso- butylcétone; un hydrocarbure, par exemple l’hexane; un hydrocarbure halogéné, par exemple le chloroforme, le 5 tétrachlorure de carbone ou le chlorure de méthylène; un alcool, par exemple le méthanol ou l’éthanol; ou un diol, par exemple le propane-1,2-diol; ou un ester, par exemple l’acétate de méthyle ou l’acétate d’éthyle. Il faut bien .comprendre que si les mycéliums contiennent de 10 notables proportions d’eau, il est préférable d’utiliser un solvant soluble dans l’eau.

De manière générale, plus d’une extraction est souhaitable pour obtenir une récupération optimale. De préférence, on procède à la première extraction en utilisant 15 un solvant miscible à l’eau, comme le méthanol ou l’acétone· On peut récupérer les antibiotiques sous la forme d’un extrait brut par élimination du solvant. Les extraits au solvant eux-mêmes peuvent être extraits, si on le souhaite, après réduction du volume du solvant, par exemple, 20 par évaporation, A ce stade, il est préférable d’utiliser un solvant non miscible à l’.eau, tel que l’hexane, le . chloroforme, le chlorure de méthylène ou l’acétate d’éthy le ou leurs mélanges, une proportion suffisante d'eau étant ajoutée pour obtenir une répartition satisfaisante 25 des composés antibiotiques. L'élimination de la phase non miscible à l'eau engendre une matière contenant les Antibiotiques 5541, Si on le souhaite, on peut séparer le facteur B par cristallisation à partir d’un solvant approprié, par exemple l’isopropanol, 30 La purification et/ou la séparation des facteurs et/ ou des composants actifs (complètement ou d'autres composés du type macrolide présents) peut s’effectuer par mise en oeuvre de procédés classiques, tels que, par exemple la chromatographie (y compris la chromatographie en pha-35 se liquide à haute performance) sur un support approprié, D ·* v * · l· 26 comme la silice, une résine d'adsorption macroréticulaire non fonctionnelle, par exemple des résines de polystyrène réticulées, comme l'amberlite XAD-2, XAD-4 ou XAD-1180 (Rohm et Haas Ltd), ou une résine S112 (Kastell * 5 Ltd) ou sur un dextrane réticulé compatible avec un sol- organique, comme le Sephadex LH20 (Pharmacia UK Ltd), ou, dans le cas de la chromatographie en phase liquide à haute performance, des supports de phase inverse, comme une silice liée à un hydrocarbure, par exemple la silice liée 10 à un hydrocarbure en C^g. Le support peut se présenter sous la forme dTun lit, ou bien, de préférence, sous une forme tassée dans une colonne· Dans le cas de résines macroréticulaires non fonctionnelles, telles que XAD-1180 ou S112, on peut utiliser des mélanges de solvants orga-15 niques, comme de l'acétonitrile et d'eau, pour procéder à l'élution.

On charge généralement une solution des composés dans un solvant approprié dans la ou les colonnes de silice ou de Sephadex, si on le souhaite, après avoir d' 20 abord réduit le volume du solvant. On peut éventuellement laver la colonne et l'éluer ensuite avec un solvant Jusqu'à la polarité convenable. Dans le cas du Sephadex et de la silice, on peut utiliser, à titre de solvants, des alcools, tels que le méthanol; des hydrocarbures, tels 25 que l'hexane; l'acétonitrile; des hydrocarbures halogénés, » tels que le chloroforme ou le chlorure de méthylène; ou des estere, tels que l'acétate d'éthyle. On peut également employer des combinaisons de ces solvants, seuls ou avec de l'eau.

30 L'élution et la séparation/purification des compo sés suivant l'invention peut être surveillée par des tech-• niques classiques, comme par chromatographie, par exemple chromatographie en couche mince et chromatographie en phase liquide à haute performance, pu en utilisant des y ik / / 127 propriétés des composés précédemment décrites.

La chromatographie sur silice^ réalisée de préférence en utilisant un éluant tel qu'un mélange de chloroforme et d'acétate d’éthyle, sépare aisément les Antibio-5 tiques S541 en composants I et II, le composant I étant élué en premier lieu. Les facteurs B, E et F peuvent ensuite être aisément obtenus à partir du composant I en se servant d(une chromatographie, par exemple une chromatographie en phase liquide à haute performance. De manière 10 similaire, les facteurs A, C et D peuvent être aisément isolés à partir du composant II. On peut aussi séparer le facteur B à partir des facteurs E et F par cristallisation dans un alcool, tel que le méthanol ou 1*Isopropanol. Si on le souhaite, les liqueurs mères contenant les 15 facteurs E et F peuvent être soumises à une purification plus poussée, par exemple par chromatographie sur silice et les facteurs E et F peuvent être isolés, en se servant d'une chromatographie en phase liquide à haute performance· Une fois obtenus, les facteurs peuvent être davanta-20 ge purifiés par cristallisation, par exemple dans du méthanol, de 1'Isopropanol ou un mélange méthanol/eau et * la portée de l'invention s'étend également aux composés suivant l'invention sous forme cristalline.

Les composés suivant l'invention ont été isolés sous 25 forme de solides par une combinaison -appropriée des procédés susmentionnés. Il faut comprendre que l'ordre dans lequel on effectue les étapes de purification précitées et le choix des procédés de purification que l'on met en oeuvre peuvent varier fortement.

30 Ainsi, le facteur B a été obtenu sous forme d'un solide cristallin possédant une pureté supérieure à 90 %.

- De manière similaire, les facteurs A, C, D, E et F ont également été obtenus en possédant une pureté supérieure à 90 #. Cependant, comme on l'a décrit plus haut, on peut 35 utiliser les facteurs à des taux de pureté appropriés à c*r> 28 ! * % · * v leur utilisation envisagée. Pour l’emploi en médecine humaine, des puretés d’au moins 90 % et de préférence supérieures à 95 % s.ont souhaitables. Pour la mise en oeu-^ vre à l’échelle agricole ou horticole ou en médecine vé- 5 térinaire, des puretés moins élevées suffisent, par exemple des puretés égales ou inférieures à 50 %.

Les exemples qui suivent illustrent la présente invention. Dans ces exemples, on a utilisé les abréviations suivantes : tic *= chromatographie en couche mince 10 (réalisée en utilisant des plaques de silice 60 Merck 5735 et en procédant au développement avec le système CHCl^ : acétate d’éthyle (3 : 1), sauf spécification contraire); CCM *= chromatographie sur colonne en utilisant de la silice 60 Merck 7734 tassée (colonne de 200 x 4 cm 15 sauf spécification contraire) et en procédant à l’élution avec le système CHClj : acétate d'éthyle (3 : 1)» sauf spécification contraire; hplc * chromatographie en phase liquide à haute performance ; PE = éther de pétrole (P.E. 60-80*0 sauf spécification contraire); 1 « litre; EA = 20 acétate d’éthyle.

Les milieux A, B et C auxquels on se réfère dans les • exemples sont les suivants : t

Milieu A

e£1 D-glucose 15,0 25 Glycérol 15,0

Peptone de soja 15,0

NaCl 3,0

CaCOj 1,0

Eau distillée Jusqu’à un litre, pH ajusté à une va-30^ leur de 7,0 à l'aide de NaOH aqueux avant le passage à ^ l’autoclave.

ÿr-) / t * 29 ·*

Milieu B

öd D-glucose 2,5

Dextrine de malt MD 30E (Roquette (UK)Ltd) 25,0 5 Arkasoy 50 (British Arkady C°. Ltd) *12,5 Mélasses "1*5 K2HP04 0,125

Carbonate de calcium 1,25 MOPS (Acide 3-(N-morpholino ) propane-suifonique ) 21,0 10 Eau distillée jusqu’à un litre, pH ajusté à une va leur de 6,5 à l’aide de NaOH 5N avant le passage à l’autoclave.

Milieu C

öd 15 D-glucose 2,5

Dextrine de malt 30E (Roquette (UK) Ltd) 25,0

Arkasoy 50 *12,5 . Mélasses de betteraves ' 1,5 K2HP04 0,125 20 CaCOj 1,25

Silicone 1520 (Dow Corning) 0,625

Eau distillée jusqu’à un litre, pH ajusté à une valeur de 6,5 avant la stérilisation.

Exemple 1 25 On a inoculé des spores de Streptomyces thermoarcha- •ensls NCIB 12015 à des cultures inclinées sur gélose préparées à partir des ingrédients qui suivent : h I * t 1 30 ·» é£l = Extrait de levure (Oxoïd L21) 0,5 '

Extrait de malt (Oxoïd L39) 30,0

Peptone mycologique (Oxoïd L40) 5,0 5 Gélose N° 3 (Oxoïd L13) 15,0

Eau distillée jusqu'à un litre, pH d*environ 5,4 et on a incubé les cultures à 28°C pendant 10 jours.

On a ensuite couvert la culture inclinée arrivée à maturation avec une solution à 10 % de glycérol (6 ml) et on 10 lfa grattée avec un outil stérile de façon à libérer les spores et le Éycéliua .· On a transféré des fractions aliquotes de 0,4 ml de la suspension de spores ainsi obtenue dans des pailles en polypropylène stérile que l'on a ensuite thermoscellées et conservées sous vapeur d'azo-15 te liquide jusqu*au moment où l'on en eut besoin.

On a utilisé le contenu d*une paillette unique pour en inoculer 10 ml de milieu A que l'on a ensuite Incubés à.

L 28eC pendant 3 jours sur un appareil secoueur tournant à 250 tpm avec un mouvement orbital d'un diamètre de 50 mm.

20 On a utilisé ce mileu incubé pour inoculer à raison de 2 J6, 15 tubes et 2 flacons d'-Erlenmeyer de 250 ml conte-nant respectivement 10 ml et 50 ml de mileu B.

On a laissé la culture dans les tubes et flacons se poursuivre à 28°C pendant 5 jours et on a ensuite filtré 25 les cultures séparément sous vide et an a secoué les cellules pendant 30 minutes avec un volume de méthanol égal à celui du filtrat de culture.

On a décelé 1* activité contre Caenorhabditls elegans dans des extraits de cellules dont la croissance s'était 30 poursuivie à la fois dans les tubes et les flacons et on a rassemblé ces extraits mycéliaux ·, on les évaporés jusqu'à siccité et on les a ré-extrait par du méthanol de manière à en obtenir un concentré (6 ml) que l'on a appli- (1 qué à une colonne de Sephadex LH20 (110 x 2,5 cm) tassé

L

a * · * 31 » Λ t et on a ensuite procédé à l*élution avec du méthanol. On v a recueilli des fractions de 10 ml.

On a rassemblé les fractions 21-28 et on les a évaporées pour recueillir un résidu huileux (156 mg) que 1* 5 on a extrait avec un mélange CHCl^ : EA (3 : 1) de façon à obtenir un extrait (3 ml) que l'on a soumis à une CCM (colonne de 55 x 2,5 cm). On a recueilli des fractions de 10 ml et on les a analysées par tic en utilisant des plaques contenant un indicateur fluorescent. Les frac-10 tions 20 à 23 et les fractions 36 à 44 ont donné naissance à deux zones principales qui éteignirent la fluorescence et que la demanderesse a identifié comme étant le composant I (Rf 0,70) et le composant II (Rf 0,43). L· évaporation des fractions 20-23 a engendré le composant I 15 sous la forme d’un solide (9 mg) ^max238nm, E<j340; 245nm, E^350j et 7^254^1, ^200. L’évaporation des fractions 36 à 44 a donné le composant II dans la forme d'un solide (11 mg) λ Ä 238nm, a a a max E.,440; Xmax245nm, E^460; et *max254nm, E1 280.

20 Exemple 2

On a inoculé 0,2 ml d’une suspension de spores de Streptomvces thermoarchaensis NCIB 12015 que l'on avait prélevée d’une paille préparée de la manière décrite à l’exemple 1, à 2 flacons d’Erlenmeyer d'une contenance de 25 250 ml contenant 50 ml de milieu A. On a ensuite incubé les flacons à 28®C pendant 3 jours sur un appareil secou-eur tournant à 250 tpm avec un mouvement orbital d'un diamètre de 50 mm et on a ensuite utilisé le contenu des deux flacons pour inoculer un récipient de fermentation 30 de 20 litres contenant du mileu B (12 litres). On a récolté la culture après 5 jours de croissance et on l’a r L alors traitée de la manière décrite à l'exemple 3.

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A

32 » €

Exemple 3

On a récolté le bouillon de fermentation (12 1) obtenu de la manière décrite à l’exemple 2 après une croissance de 5 jours à 28°C et on l'a centrifugé (4200 tpm à 5 10°C pendant 15 minutes)· On a mélangé la pastille de cel lules à du méthanol (5 l) et on l'a laissé reposer à 4ÖC pendant 20 heures. On a filtré l’extrait mycélial , on l'a évaporé à 40°C et on l'a soumis à une distillation azéotropique après l'addition de butane-1-ol (100 ml). On 10 a alors traité l'extrait par du méthanol (5 fois 200 ml) et on a évaporé les extrait réunis jusqu'à un volume de 100 ml et on a appliqué ce volume à une colonne de Sepha-dex Uî20 (112 x 5 cm)· On a élué la colonne avec du méthanol et après un premier volume de 200 ml, on a re-15 cueilli des fractions de 50 ml. Oh a rassemblé les fractions 40-90 et on les a évaporées jusqu'à obtenir un résidu huileux (3,85 g). On a extrait le résidu avec 77 ml de CHCl^ : EA (3 : 1), on l'a filtré et on l'a ensuite soumis à une CCM, des fractions d'approximativement 15 ml 20 étant recueillies après un premier volume de 200 ml.

On a rassemblé les fractions 124 à 142 contenant le composant I et on les évaporées de façon à obtenir un solide (253 mg) dont on a purifié 216 mg par hplc (Zorbax ODS, 25 x 2,1 cm, CH^CN80 %/E^O. On a rassemblé les frac-25 tions 250 à 320 contenant le composant II et on les a évaporées de façon à recueillir un solide (602 mg) dont on a purifié 540 mg par hplc (comme dans le cas des fractions 124-142) et on a recueilli des fractions de plusieurs essais.

30 On a surveillé la matière s'éluant de la colonne d* hplc par spectroscopie UV à 243 nm. On a soumis le produit correspondant aux pics absorbant à cette longueur d'onde à une dessication et i) on l'a testé quant à son activité contre Caenorhabditis elegans et ii) on l'a analysé par 11 - 33

* . V

1 * ·» tic. Les produits correspondant à 4 pics qui étaient ac-* tifs contre Caenorhabditis elegans avaient également une valeur Rf dans la gamme de 0,39 à 0,46 ou de 0,70 à 0,75.

Le composant I a donné un pic avec une valeur Rf de 5 0,70 à 0,75 et on a attribué la qualité de facteur B au produit correspondant à ce pic. Le composant II a donné 3 pics avec une valeur Rf de 0,39 à 0,46 et on a attribué les qualités de facteurs A, C et D aux produits correspondant à ces 3 pics.

10 Le facteur A s’élua de la colonne d’hplc entre 260 et 340 ml après l’injection de l’échantillon et avec une valeur Rf de 0,44 selon la tic. Le facteur D s’élua de la colonne d'hplc entre 270 et 310 ml après l’injection de l’échantillon et avait une valeur Rf de 0,72 selon la 15 tic. Le facteur C s’élua de la colonne d’hplc entre 160 et 180 ml après l’injection de l’échantillon qui avait mie valeur Rf de 0,4 selon la tic. Le facteur D s’élua de la colonne d’hplc entre 220 et 250 ml après l’injection de l’échantillon et avait une valeur Rf de 0,42 se-20 Ion la tic. Les autres caractéristiques des facteurs A, B, C et D sont décrites dans la suite du présent mémoire.

Exemple 4

On a utilisé 0,4 ml d’une suspension de spores de 1’ organisme Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12015, que 25 l’on avait prélevé d'une paille préparée de la manière décrite à l'exemple 1, pour inoculer un flacon d’Erlenmeyer d’une contenance de 250 ml contenant du milieu A (50 ml).

On a incubé le flacon à 28°C pendant 4 jours sur un appareil secoueur tournant à 250 tpm avec un mouvement orbi-30 tal d’un diamètre de 50 mm.

On a ensuite utilisé des fractions (8 ml) pour ino-' culer chacun de deux flacons à fond plat d’une contenance Λ de 2 litres, contenant chacun 400 ml du même milieu, avant 3 À__ / I · * * * 34 > de procéder à 1*incubation dans les mêmes conditions pendant 3 Jours. On a alors employé le contenu de deux flacons pour inoculer un récipient de fermentation (70 l) contenant du milieu B (40 1) additionné de silicone 525 5 /bow Corning; 0,0625 % (v/v)_/. On a procédé à la fermentation sous agitation et avec une aération suffisant à maintenir un niveau d* oxygène dissous supérieur à 20 % de saturation, un antimousses à base de silicone étant ajouté si cela se révèle nécessaire· On a récolté le «jO bouillon de fermentation après 10 Jours et on a clarifié le bouillon (40 1) par centrifugation (15000 tpm). On a déplacé le produit surnageant résiduel par de l*eau (5 1) et on a congelé les cellules récupérées (1,4 kg) à moins 20e· Après une semaine, on a décongelé les cellules con-15 gelées, on les a mises en suspension dans du méthanol (15 1) et on les a modérément agitées pendant 15 heures·

On a alors filtré la suspension et on a réextrait le résidu solide avec du méthanol (10 1). On a dilué les filtrats réunis (25 1) avec de l*eau (12 1) et on a extrait 20 le tout par du PE (25 l). Après 30 minutes, on a séparé les phases par centrifugation, * On a réextrait la phase méthanollque inférieure à 3 reprises avec du PE (25 1, 15 1 et 15 l). On a concentré les phases au PE réunies (80 l) par 3 passes à travers 25 un évaporateur à pellicule balayée du type Pfaudler 8· 8-12V-27 (tension de vapeur 0,1 bar, température de la vapeur 20e, température de la vapeur d*eau 127e) et on a séché le concentré (8 1) sur du sulfate de sodium (1 kg) et ai l*a ensuite concentré sous pression réduite à 40° dans 30 un évaporateur à film rotatif. On a dissous le résidu huileux (15 ml) dans un mélange de CHCl^ et d»EA (70 ml, 3 : 1 v/v) et on l*a soumis à une CCM, des fractions d1 approximativement 40 ml étant recueillies après un prélèvement [ préalable de 1.400 ml.

L· 1 * 35

On a réuni les fractions 45 à.65 et on les a éva-» porées de façon à obtenir le facteur B (940 mg; comme défini à 1*exemple 3) que l'on a cristallisé à 2 reprises * dans du inéthanol et finalement dans du nitrométhane. On a 5 soumis les cristaux à une analyse par diffraction des rayons X à cristal unique, qui révéla qu'ils étaient constitués de prismes clairs,orthorhombiques, avec a « 10,171 (3), b s 13,317(5), c * 25,032(7)A3, V = 3391Ä3, Z * 4, groupe d'espace P2^2^2^, Dc = 1,18 gern“3, R = 0,053 10 pour 2169 indépendant réflections observées (θζ 58°) les mesures étant effectuées sur undiffractomètre avec rayonnement Cu-Κα (λ « 1,54170^). La structure, telle que déterminée par cristallographie aux rayons X est présentée sur la figure 5.

15 Exemple 5

On a préparé un inoculum de Streptomvces thermoarcha-ensis NCIB 12015 de la manière décrite à l'exemple 4, la période de croissance étant de 2 jours et on l'a utilisé pour inoculer un récipient de fermentation (70 l) conte-20 nent du milieu B (40 1) additionné de polypropylène 2000 (0,06 % v/v) au lieu de silicone 525. On a ajouté du polypropylène 2000 selon les besoins au cours de la totalité de la fermentation pour maîtriser la formation de mousse. On a effectué la fermentation à 28°C, sous une agita-25 tion et une aération suffisant à maintenir un taux d'oxygène dissous supérieur à 30 % de saturation. Après une fermentation de 24 heures, on a transféré une partie du I bouillon (91) dans un fermenteur (7001) contenant du mi- " lieu (450 1) constitué des ingrédients qui suivent : :> I , · 36 *

eQZL

D-glucose 2,8 . Dextrine de malt (MD 30E) 27,8

Arkasoy 50 13,g 5 Mélasses 1,7 k2hpo4 0,14

CaCO^ 1,39

Silicone 525 (Dow Corning) 0,06% (v/v)

Ajusté à pH 6,5 avant la stérilisation, 10 On a effectué la fermentation à 28eC sous agitation et aération suffisant à maintenir un taux d* oxygène dissous supérieur à 20 % de saturation. On a ajouté un agent antimousses constitué de polypropylène 2000 suivant les besoins, Après 2 jours, on a réglé le pH à 7,2 par l'addi-15 tion de HgSO^, On a récolté le bouillon de fermentation après 5 jours.

On a clarifié le bouillon (450 1) par centrifugation et on a déplacé la couche surnageante résiduelle par de 1* eau (20 1), On a agité les cellules récupérées (25,5 kg) 20 pendant une heure dans une quantité suffisante de métha-nol pour obtenir un volume total de 75 1. On a filtré la * suspension et on a réextrait le résidu solide par du métha- nol (35 1) et on l'a filtré. On a dilué les filtrats réunis (87 1) avec de l'eau (40 1) et on a extrait le tout 25 par du PE. Après 30 minutes, on a séparé les phases par centrifugation et on a réextrait la phase méthanolique par du PE (30 1) après addition d'eau (40 1). Après la séparation, on a de nouveau soumis la phase intérieure à une extraction par du PE (30 1). On a concentré les phases au r 30 PE réunies (85 l) et on les a concentrées par 3 passes à travers un évaporateur à film balayé 8.8-12v-27 (tension ' de vapeur 0,1 bar, température de la vapeur 20e, tempéra-t, ture de la vapeur d'eau 127e). On a séché le concentré J (9 v avec du sulfate de sodium (2 kg) et on l'a davanta-

‘ I

37 * e * * ge concentré sous pression réduite à 40e dans un évapo-- rateur à film rotatif. On a dissous le résidu huileux (130 g) dans du CECl^ de façon à obtenir 190 ml et on a soumis cette solution à une ccm /colonne tassée et la-5 vée (500 ml) dans CHCly^t des fractions d1 approximativement 40 ml étant recueillies après un volume préalable de 1400 ml.

On a réuni les fractions 32-46 et on les a évaporées de façon à obtenir une huile (21 ,2 g). On a réuni les 10 fractions 47-93 et on les a évaporées de façon à obtenir une huile (20,1 g) que l'on a dissoute dans un mélange CHClj : SA (3 s 1) jusqu*à un volume de 50 ml et on a soumis la solution à me CCM, les fractions d*approximativement 40 ml étant recueillies après un volume préalable 15 de 1400 ml. On a réuni les fractions 22-36 et on les a évaporées de façon à obtenir une huile (3,1 g) que l*on a ajoutée à 1*huile obtenue au départ des fractions 32-46 de la première colonne. On a dissous les huiles réunies dans du méthanol bouillant (4 ml) et on a ensuite 20 ajouté la solution à du propane-2-ol (20 ml) chaud de façon à obtenir le facteur B (2,57 g) cristallin par repos.

On a évaporé la liqueur mère après cristallisation du facteur B de façon à engendrer une huile que l'on a dissoute dans un égal volume de CHCl^ et on a chargé la 25 solution dans une colonne (30 x 2,2 .cm) de gel de silice Merck 60 (70-230 mesh ASTM, Art, Ne* 7734) tassé dans du CHCl2% On a lavé le lit avec du CHC^ (2 volumes de lit) et on a procédé à l’élut ion avec un mélange de CHCl^ : EA (3 : 1) (2 volumes de lit). 30 L’évaporation de l’éluat a engendré une huile que l’on a dissoute dans du méthanol et soumise à une hplc de préparation sur du Spherisorb S5 ODS-2 (250 mm x 20 mm, Phase Sep. Ltd·). On a pompé l’échantillon (5 ml) sur une co-r? lonne en l’espace d’une minute et on a élué la colonne t.....

/ > t » 38 « avec un mélange d'acétonitrile et d'eau (7 : 3), dans les conditions suivantes :

Durée (minutes) Débit (ml/min) 5 0,00 0,00 ) Moment d* 1,00 0,00 ) injection 1,10 30,00 39,90 30,00 40,00 35,00 10 75,00 35,00

La matière s1éluant de la colonne d'hplc fut surveillée par spectroscopie UV à 238 nm. L'évaporation des filtrats réunis avec des pics s'éluant à 26,3 minutes a donné le facteur E sous forme d'un solide· L'évaporation 15 des fractions réunies avec des pics s'éluant à 36,4 minutes a donné le facteur P sous forme d'un solide. Les autres caractéristiques des facteurs E et F sont décrites dans la suite du présent mémoire.

Exemple 6 20 .. On a passé un bouillon de fermentation (similaire & celui préparé à l'exemple 2), récolté après 117 heures, à l'autoclave (121eC, 1h), on l'a refroidi jusqu'à la température ambiante et on l'a agité sur un agitateur magnétique de manière à obtenir une suspension homogène de cel-25 Iules. On a centrifugé (12000 g, 2 minutes, température ambiante) 2 fractions (2 ml),on a decanté les couches surnageantes et on a mis les cellules résiduelles en suspension dans de l'eau (2 ml), on les a convenablement mélangées et on les a de nouveau soumises à centrifugation (12000 g, 30 2 minutes, température ambiante). Après la décantation ! des couches surnageantes, on a lavé les cellules à 2 re-prises supplémentaires avec de l'eau distillée (fractions 7^ / 39 t . » « · » de 2 ml). On a ensuite vigoureusement mélangé les cellules lavées, soit à de l'eau (2 ml), soit à du méthanol (2 ml) et on a laissé le mélange reposer à la température ambiante pendant 1,5 heure, avec agitation occasion-* 5 nelle. On a de nouveau centrifugé les suspensions (1200 g, 2 minutes, température ambiante) et on a séquentiellement dilué les couches surnageantes dans de l'eau. On a remis les cellules provenant de la suspension aqueuse en suspension dans de 1* eau et on les a immédiatement séquen-10 tiellement diluées dans de l'eau· On a ajouté des fractions (10 jil) de chacune des dilutions à une suspension (200 ^1) du nématode Caenorhabditls elegans dans une solution tampon contenant les ingrédients suivants î Na2HP04 (6 g/l), K.,HP04 (3 g/1), NaCl (5 g/1) et MgS04 15 (0,25 g/1) et on en a ajusté le pH à 7,0. Après 4 heures, - on a examiné les suspensions de nématodes pour trouver quelles étaient les dilutions du mélange soumis à l'essai qui avaient provoqué me inhibition totale de la motilité chez plus de 98 % de nématodes présents dans la suspen-20 sion testée. On a constaté que des dilutions de 1 pour 5, de 1 pour 25, de 1 pour 250 et de 1 pour 500 de l'extrait . méthanolique, de 1 pour 5, de 1 pour 25, de 1 pour 250, de 1 pour 500 et de 1 pour 1000 de la suspension de cellules et de 1 pour 2, de 1 pour 4 et de 1 pour 8 de 1' 25 extrait aqueux, provoquaient une telle inhibition des nématodes, lorsque l'on en ajoutait 10 ^ul à 200 ul de suspensions de nématodes.

Exemple 7

On a inoculé 0,4 ml d'une suspension de spores de 30 Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12015 que l'on avait prélevé d'une paille préparée de la manière décrite à l'exemple 1 à des flacons d'Erlenmeyer d'une contenance de 250 ml, contenant soit 50 ml de milieu A, soit 50 ml ^ de milieu B. On a incubé les flacons contenant le milieu .v « e ^

IAO

A ou le milieu B à 28°C pendant 2 Jours sur un appareil secoueur rotatif fonctionnant à 250 tours/minute avec un excentrique d*un diamètre de 50 mm. On a ensuite utilisé des fraction (8 ml) de chaque milieu pour inoculer des 5 flacons à fond plat d*une contenance de 2 litres, contenant 400 ml du même milieu (A ou B respectivement). On a Incubé ces flacons dans les mêmes conditions pendant 2 jours.

On a inoculé chacun des 2 fermenteurs d,une conte-10 nance de 70 1 par 2 flacons de milieu A et on a Inoculé un autre fermenteur d*une contenance de 70 1 par 2 flacons de milieu B. Chaque fermenteur contenait 40 1 de milieu C·

On a mis les fermentations en oeuvre a 34°, sous agi-15 tation et aération suffisant à maintenir un taux d*oxygè-1 ne dissous supérieur à 30 % de saturation. Après approxi mativement 24 heures de fermentation, on a réglé le pH à 7|2 par 1*addition de Î^SO^ aqueux. On a ajouté un agent antimousse à base de polypropylène glycol 2000 suivant 20 “les besoins. Après 5 jours, on a récolté et rassemblé ces bouillons de fermentation.

* Un autre fermenteur de 70 1 qui était également ino culé par 2 flacons contenant du milieu B, contenait du milieu B complété de silicone 1520 (0,06 %). On a procédé 25 à la fermentation à 28°, sous agitation et aération suffisant à maintenir un taux d*oxygène dissous supérieur à 30 % de saturation. On a ajouté du polypropylène glycol 2000 selon les besoins pour maîtriser la formation de mousse. Après 24 heures, on a transféré une fraction de 30 9 1 dans un fermenteur de 700 1 contenant 450 1 de milieu C.

On a procédé à la fermentation à 34°C, sous agita-1 tion et aération suffisant à maintenir un taux d*oxygène u, dissous supérieur à 30 % de saturation. On a réglé la . » 41 « formation de mousse par 1* addition de polypropylène gly-col 2000 et, après approximativement 24 heures, on a réglé le pH à 7,2 par 1*addition de HgSO^ aqueux. On a récolté le bouillon de fermentation après 4 Jours et on l’a * 5 réuni aux 3 bouillons de fermentation de 40 1 décrits plus haut.

On a centrifugé les bouillons récoltés et rassemblés à travers une centrifugeuse Sharples AS16PY à raison d’environ 120 1/h. On a déplacé la couche surnageante 10 résiduelle dans le bol centrifugateur par de l’eau.

On a émulsionné les cellules récupérées (11,65 kg) dans du inéthanol (33 1) à l’aide d’un mélangeur Silverson. Après 60 minutes, on a filtré la suspension à travers un tissu croisé et on a une fois de plus émulsionné le rési-15 du dans du méthanol (34 1)· On a de nouveau filtré la suspension après 40 minutes. On a réuni les filtrats provenant des 2 extractions méthanoliques.

On a mélangé les extraits réunis (53,5 l) à de l’eau (27 1) et du PE (27 1). Après une agitation de 20 minutes, 20 on a séparé les 2 phases sur une centrifugeuse Westfalia MM 1256. On a mélangé la phase méthanolique aqueuse in- • férieure (70 l) à de l’eau (37 1) et du PE (27 1) et on a agité le tout eton l'a soumis à séparation comme précédemment décrit. On a brisé l’émulsion à l’interface dans la 25 phase au PE à l’aide d’acétone (4 1). On a alors mélangé la phase méthanolique aqueuse inférieure (108 l) à de 1’ eau (40 1) et du PE (27 1) pour la troisième fois et on a agité le tout et on l’a séparé de la manière précédemment décrite, en utilisant de l'acétone (4 l) pour clari-30 fier l’émulsion à l’interface. On a ensuite réuni les 3 extraits à l’hexane.

On a concentré les extraits au PE réunis (85 1) avec un évaporateur à film balayé (tension de vapeur 0,15 bar, [ température de la vapeur 26°). On a séché le concentré L_ ' > • / 142 (3 l) avec du sulfate de sodium (2 kg) et on l'a ensuite davantage évaporé sous pression réduite à 40e. On a dissous 1*huile ainsi obtenue (639 g) dans 300 ml d'un mélange de chloroforme et d'EA (3 · 1 v/v) et on a procédé 1 5 à une filtration et un lavage à travers du papier en fibres de verre. On a soumis le filtrat et les liqueurs de lavage (1060 ml) à une CCM (1500 mm x 100 mm en diamètre) avec une élution à un débit de 6 l/h.

On a rassemblé la fraction s'éluant entre 8,8 et 10 13,1 1 et ôn l'a évaporée à faible pression jusqu'à 1' obtention d'une huile (56,3 g), tandis que l'on a similairement réduit le volume de la fraction s'éluant entre 13,1 1 et 24,6 1 sous presion réduite jusqu'à l'obtention d'un solide jaune pâle (153,4 g). On a montré que la pre-15 mière fraction contenait en grande partie le facteur B, tandis que la dernière fraction contenait un mélange des facteurs A, B, C et D. Le facteur B dans cette dernière fraction fut progressivement enlevé en répétant 2 fois 1' opération de CCM telle que décrite plus haut - la derniè-20 re fols sur de la silice fraîche - dans des conditions similaires, sauf que l'on réduisît le débit à 3 l/h.

* Les pics contenant les facteurs A, C et D de la se conde de ces colonnes s'éluèrent entre 8,8 et 17,6 1, le facteur B résiduel qu'elle contenait étant séparé dans la 25 troisième colonne dont les facteurs A, C et D s'éluèrent entre 14 et 28 1. On a réduit cet éluat rassemblé final sous faible pression jusqu'à l'obtention d'un solide (114 g). Les pics contenant le facteur B provenant des 2 colonnes (7,5 - 8,8 1 et 10,3 - 13,4 1 respectivement) · 30 furent évaporés jusqu'à l'obtention d'huiles (10,7 g et 10 g respectivement) et furent réunis à l'huile obtenue provenant de la première des 3 colonnes. r, On a dissous les huiles contenant le facteur B dans du méthanol bouillant (25 ml) et on les a mélangées à du 3 * / * · * 43 propane-2-ol bouillant (100 ml). Le facteur B cristallisa lors du refroidissement Jusqu*à 4°. On l*a séparé par filtration, lavé avec du méthanol (200 ml), refroidi Jusqu* à -20e et séché sous vide de façon à obtenir 25,3 g 5 de facteur B.

On a séché le solide provenant de la troisième colonne de silice qui contenait les facteurs A, C et D, sous vide et Jusqu*à poids constant (67 g). On a dissous des échantillons (20 g) de ce solide dans du méthanol (190 ml) 10 et on en a amené le volume à 230 ml avec un mélange acé-tonitrile s eau 7 ! 3 (v/v). On a alors chromâtographié ; des fractions (5 ml) de la solution sur une colonne (250 mm x 21,2 mm en diamètre) de spherisorb ODS-2 (diamètre des particules 5 /}im), en se servant d*un mélange d'acéto-15 nitrile et d*eau (7 ï 3) comme solvant d*élution. On a maintenu le débit à 20 ml/minute pendant environ 10 secondes; on l*a ensuite constamment augmenté en 1*espace de 22 minutes jusqu*à 34 ml/minute et on l'a maintenu à cette valeur pendant 3 minutes supplémentaires. On a dé-20 celé les facteurs en cours d'élution à 238 nm. Le facteur C B'élua entre 11,0 et 13,4 minutes, le facteur D entre . 13»4 et 17,4 minutes et le facteur A entre 17,4 et 23,0 minutes.

On a rassemblé les fractions contenant le facteur C 25 provenant de chaque séparation chromatographique et on les a réduites sous faible pression Jusqu'à l'obtention d'un solide. On a similairement réduit les fractions contenant le facteur A Jusqu'à l'obtention d*un solide. On a également rassemblé et réduit les fractions contenant le fac-30 teur D Jusqu'à l'obtention d'un solide impur (7 g). On a redissous ce produit dans du méthanol (25 ml), on a mélan-. gé la solution à un mélange d'acétonitrile et d'eau 7 : 3 et on a rechromâtographié le tout sur une colonne de spherisorb 0DS-2 comme on l'a déjà décrit, sauf que l'on a 35 I maintenu le débit constant à 20 ml/minute au cours de la .....

44 > t % € totalité de l’opération. Le facteur D s'élua à présent entre 16 et 20 minutes et on a rassemblé les fractions * provenant de chaque essai chromatographique. On a réduit l'éluat total jusqu'à l'obtention d'un solide. On a séché 5 les 3 solides contenant les facteurs A, C et D sur du P2°5’ sous vide et dusqu’à poids constant (55 g, 7,0 g * et 1,21 g respectivement). On a montré que les 4 solides isolés conformément à ce procédé étaient similaires à des échantillons authentiques des facteurs A, B, C et D.

10 Exemple 8

On a inoculé 0,5 ml d'une suspension de spores de chacune des souches suivantes : Streptomyces thermoarcha-ensls NCIB 12111, 12112, 12113 et 12114 prélevées à partir de pailles préparées de la manière décrite à l'xemple ~ 15 1, à des flacons d'Erlenmeyer d’une contenance de 250 ml contenant 50 ml de milieu B.

On a incubé les flacons contenant Streptomyces ther-moarchaensls NCIB 12111, NCIB 12112 et NICB 12113 à 31eC sur un appareil secoueur rotatif. On a incubé le flacon 20 contenant Streptomyces thermoarchaensls NCIB 12114 à 28°C pendant 2 jours et on a ensuite transféré un ml de bouillon dans un autre flacon d'Erlenmeyer d’une contenance de 250 ml, contenant .50 ml du milieu B. On a incubé ce flacon à 31 °C sur un appareil secoueur rotatif. On a secoué » 25 tous les flacons à 250 tours/minute avec un excentrique d\n diamètre de 50 mm.

Après 4 jours d’incubation, on a centrifugé un échantillon de 10 ml de chaque bouillon à 1250 g pendant 45 minutes et on l'a traité comme suit. On a écarté la couche 30 surnageante et on a remis la pastille en suspension jusqu' à un volume de 10 ml dans du méthanol. On a vigoureusement secoué la suspension et on l'a abandonnée pendant une heure sous mélange occasionnel. On a ensuite centrifugé la bus- 45 * « k * * % * pension à 10000 g pendant 5 minutes et on a anlysé la couche surnageante par hplc (S5 ODS—2, 10 cm x 4,6 mm, 70 % , CH^CN/0, 1M NH^H2P0^). On a surveillé les pics à 246 nm. L’analyse par hplc a révélé la présence de facteurs 5 A, B, C et dans chaque cas.

Exemple 9

On a constaté que les facteurs A, B, C, D, E et P possédaient les caractéristiques suivantes î i) Ils ne contiennent que du carbone, de l’hydrogène et '10 de l’oxygène seulement.

ii) La spectroscopie de masse à impact électronique (E.I.) des facteurs A,B,C,D,E et F a donné les ré- . sultats suivants :

Facteur ion moléculaire correspondant à la 15 formule moléculaire A 612,37 C36H52°8 B 598,35 C35H50°8 C 584,34 C34h48°8 D 598,35 %Η5008 20 B 612,3638 C36H52°e F 626,3807 C37H54°8 »

La spectrcscopie de masse à bombardement atomique rapide (FAB) a donné les résultats qui suivent : t «

O

ί 46 * * « ·

Facteur +ve FAB -ve FAB pds. mol, A M/Z 635/M+Na7+ M/z 611/M-H7" 612 M/Z 613/ÎI+H7+ B M/Z 69l/M+H+glycérol7+ 598 5 M/Z 599/M+ü7+ M/Z 581/MH-H2Q7+ M/Z 563/MH-2HpQ7+ C M/Z 607/B+Na7* M/Z 583/M-ÏÏ7” 584 B M/Z 621/h+N%7+ M/Z 597/M-H7" 598 # 10 La spectroscopie de nasse à désorption de champ du facteur E a donné le résultat suivant : M/Z 612 M+ et celle du facteur F a donné le résultat suivant : M/Z 626 M+.

Un spectre E.I. du facteur A avec mesure de masse précise a donné des ions à 15 612,37 C36H52Oe; «66,31 448>30 C30H40°3Î 425»23 C26^33®5» 554»22 ^23^30^3’ ^97»22 ^21^29^* 278,11 C15H1805; 247,17 C16H2302; 219,18 C15H230; 95,05 C6H?0.

* - Un spectre E.I. du facteur B avec mesure de masse pré- 20 cise a donné des ions à 598,35 C35H5o°8» ^58,28 C28H38°4' ^20*2^ ^28¾ 6°3’ 314,19 ^20^26¾* 248,14 ^^£0^3' 151,08

Un spectre E.I. du facteur C avec mesure de masse précise a donné des ions à 25 584,34 C^H^Oqj 566,33 C34K4507; 438,28 ^£8^38^4*

Un spectre E.I. du facteur D avec mesure de masse pré-.cise a donné des ions à ί 598,35 ^35^50^8* ^52,29 O^H^qO^; 434,28 ^29^38^3* 'L·- I * « * «ft.

47

Une mesure de masse précise du facteur E dans le mo-d* ionisation E.I. a donné à un ion à 452,2908 ^29^40^4 ^31115 ?-e cas du facteur P, elle a donné un lon à 466,3067 C30H2404.

^ iii) Les facteurs A, B, C, D, S et F possèdent des spectres IR caractéristiques dans lè fcromoforme, comprenant les pics suivants :

Pour le facteur A à environ 3510 (OH), 1712 (estel) et 998 cm"1 (C-0); pour le facteur B à environ 3510 (OH), 10 1710 (ester) et 996 cm"1 (C-Q); pour le facteur C compre nant des pics à environ 3510 (OH), 1712 (ester) et 996 cm"1 (C-0); pour le facteur D comprenant des pics à environ 3508 (OH), 1711 (ester) et 996 cm"1 (C-0); pour le facteur E comprenant des pics à environ 3500 (OH), 1708 15 (ester) et 994 cm"1 (C-0); et pour le facteur F comprenant des pics à environ 3500 (OH), 1708 (ester), et 997 cm"1 (C-0)·

Les spectres complets pour les facteurs A, B, C, D, E .et F sont présentés sur les figures 1,2,3,4,6 et 7 respec - 20 tivement des dessins annexés.

* « . . iv) Les facteurs A, B, C, D, E et F possèdent un spec tre UV dans le méthanol (c *= 0,002 %) montrant les résul-| tat s suivants (I * inflexion et M e maximum) : j Λ *.

I · 48

Facteur λ(ηιη) E^j Facteur X(nm) e]| A 252 (I) 318 D 252 (I) 263 244.5 (M) 468 244,5 (M) 393 239 (I) 430 239 (i) 362 5 B 252 (I) 302 *E 252 (I) 266 244.5 (M) 426 244 (M) 402 239 (X) 394 238 (M) 373 C 252 (I) 316 *F 252 (I) 285 244.5 (M) 470 244,5 (M) 421 10 239 (I) 432 239 (M) 389 (*méthanol c = 0,001 %)

Il faut noter que tandis que les valeurs X^^ susmentionnées sont caractéristiques de chaque facteur, les valeurs E,j réflètent la pureté de la matière telle qu* 15 elle a été obtenue. Cependant, les rapports des valeurs * sont caractéristiques du composé per se.

v) Un spectre de résonance magnétique nucléaire protonique a 200 NHz de la solution de chaque facteur dans le deutéro-chloroforme englobe des signaux ^valeurs^avec 20 multiplicités, constantes de couplage (Hz) et valeurs * d’intégration entre parenthèse$7 centrés à environ ï JELecteur A; 4,1 à 4,4(m,2H);4;61 (large s,1H);4,6 à 4,75(m,2H)i * *,81(d,9,1H)i 5>05(m,1H);5;J4(s,2H)j5;e9(dl5,1H)i 6,06(d,5,1H); 6,17(m,1H); 6/2i(d,11|1H);6/37(m,1H)i6,46(d,10,1H); 6,74(q,2,lH); * 25 7/A2(m,1H);7/7 to 7,9(m,5H); 8,14(s,3H); B,40(s,3H); 8/7(s,3H),· ; e,61(tfnf1H); 8,96(d,7,3H); 9,06(0,7,3H); 9,02(0,7,3H); ï V3(q,11,1H)ï 9,21(d,7,3H).

O ' a- / Γ-'" 49 « &

Facteur B ;ûf2 à 4,4(m,2H); 4,55(q,7,1H); 4765(largets,1H); 4y6 b 4,8(m,2H); 5,06((η,1Η)ΐ 5,3 à 5;5(m,2H); 6,0l(d5,1H); 6,07(d,5,1H) ; 6,12(s,1H); 6;24(df11,1H); 6,24(mf1H); 6,3 à 6#5(m,2H); 6,53(s,3H); i 6,73(q,2,1H); 7,62(m,1H); 7,6-8,0(m,4H); 8,22(s,3H); 8,35(d,7,3H); .5 8,41(s,3H); B,49(s,3H); B,62(t,11,1H); 9,03(df6,3H); 9,12(q,11,1H); 9,22(d,7,3H).

. Facteur C ;4,29(d, 11 ttt2,1H)î4,4 à 4,6((1.,3^4,5603^ s,1H); 5/14(dd,15,10,1H); 5;23(m,1H); 5,65CLarge s,2H); 5,72(d,6,1H); 5,95(d',10,1H); 5,99(d,6,1H); 6,08(large s,1H); 6,1 à 6,4(m,3H); 10 6,62(q,3,1H); 7,7 à B,l(mtca7H);8,18(st3H); B,33(s,3H); 8,48(d,7,3H);8,64(s,3H);8,68(t,11,1H); 9,00(d,7,3H); 9,08(d,7,3H); 9,12(q,12,1H).

Facteur D : 4flB à V K2H>ï 4,47 à 4,B1 (m,4H); 5,04 (m,lH); 5,35 (s,2H); 5,72 (d,7,lH); 6,07 (d,7,lH); 6,15 6,45 (n.,4H); 6,74 15 (q,4,lH)7.45 - 8,1 (m,8H); 8,16 (s,3H);8,41 (s,3H);8;49 (s,3H);8,62 (t,ll,lH)i 8,92 - 9,05 (m,6H);9,21 (d,7,3H).

• Facteur 35 ;4,1 à 4,3 (m,2H); 4,5 à 4,B (m,4H total); 5,04 (m,1H); 5.2 à 5,5 (m,2H); 6,01 (d,5,1H);6,05 (d,5,1H); 6,11 (s,1H); 6,1 à 6,4 (m,3H);6,45 (d,10,1H); 6,51 (s,3H);6,70 (q,2,lH); 7,60 (m,1H);8,20 20 (b,3H); B,41 (s,3H); B,47 (s,3H); B,60 (t|l1,1H);9,00 (t,7,3H); 9,02 (d,6,3H);9,11 (q,11,1H);9,20 (d,7,3H).

Facteur F: 4,2 'à 4,4 (m,2H); 4,62 (s,1H); ce 4,70 (m,2H); 4,80.(d,9,1H); 5,04 (m,1H); 5,2 à 5,5 (m,2H); 5,99 (d,5,1H); 6,05 • (d,5,1H);6,11 (s,1H); 6,1 à 6,3 (m,2H); ca 6,36 (m,1H);6,45 25 (d,10,1H); 6,51 (s,3H); 6,70 (q,2,1H);7,42 ((n,1H);7,58 (m,1H); 8,19 J (s,3H);8,40 (s,3H);B,47 (s,3H);8,60 (t,11,1H); 8,95 (d,7f3H);9,05 D ^ (d,7,3H);9,01 (d,7,3H); 9,10 (qf11,1H); 9,21 (d,6,3H).

J(\j__^-- / 50 r vi) Un spectre de résonance magnétique nucléaire au car-bone-13 à 25,5 NHz à bruit découplé dfune solution de chaque facteur dans le deutéro-chloroforme englobe des 5 pics /valeurs £ avec multiplicités de signaux dans le spectre hors résonance entre parenthèses/ à environ :

Facteur A : 173,2(s)j 142,6(d); 139,2(s); 137,6(s); 137,1(s); 137,0(d); 130,4(s); 123,Kd); 12Ö,1(d);117,8(d); 99,5(s); 80,0(s); 79,0(d); 76,5(d); 69,0(d); 68,3*; 67;4(d); 48,2(0; 45,5(d); 40,9(0; 10 40,5(0; 35,8*; 34,5(0; 22,1(q); 34,5(0; 26,6(d); 22,6(q); 22;0(q)ï 19,7(q); «;3(q)ï 13,7(q);10,B(q).

Facteur B i~173f4(s); 142,1(d); 139,5(s); 137;l(s); 135,7(s); 13.3,7(s); 123,6(d); 123;3(d);120/0(d);119/3(d); 118,2(d); 99,5(s); 80,1(s); 77,3(d);76,6(d);76,4(d); 69,0(d);68,3(d);67,9 *;67,6 15 *;57,5(q);4B,2(Oi 45,4(d); 40,7(0; 40,5(0; 35,8«; 34,5(0; 22,1.(q); 19,6(q); I5,3(q);13,6(q); 12,9(q); 10,5(q).

Facteur C î173,3(s); 142,2(d); 140,3(s); 138,5(s); 137,0(s); 134,9(s); 123,9(d); 121,1(d); 120,6(d); 118,1 (d); 100,2(e); 80,6(s); 80.1 (d); 77,4(d);69,2(d);69,0(d); 68,3 *;6B,0(d); 67,9(d);4B,6(0; 20 46,3(d);41,4(t); 36,5 *;36,3 *;36,1(d);35,0(O; 22,6(q);20,0(q); I5.4(q);14.3(q);13.l(q);10.8(q).

Facteur D : 173,2 <e); 142,5 (d); 139,1 (s); 137,5 (e); 137,1 (s); 132.1 (s); 131,4 (d); 123,1 (d);12Û 1 (d);117,8 (d); 99,5 (s),· 79,9 (b); 79,2 (d); 76,5 (d);69,0 Cd); 6B,3*;6B,1*;67,6*; 67,4 *; 4B,2 ' 25 (t);45,5 (d);40,B (t); 40,5 (t);35,7 *;34,5 (t);22,0 (q);20,6 (t);19,6 (q); 15,3q);13,7 (q);13,6 (q); 10,7 (q).

« L* multiplicité incertaine vii) Bee courbes de dichroïsme circulaire pour les fac- / / . ' * · 51 λ

V

teurs A, B, C et D (solutions à environ 0,1 % dans le méthanol) sont montrées sur la figure 8· Les courtes sont étroitement comparables dans la région 230 à 260 nm associée à l’absorption du chromophore diénique. Ce-5 ci indique que les configurations absolues en C^, Cy, et sont les mêmes dans les 4 cas.

On donne ci-dessous des exemples de compositions suivant la présente invention.

L’expression "ingrédient actif” telle qu’on l’utilise 10 ci-dessous désigne un composé suivant l’invention et peut être, par exemple, l’un des facteurs A, B, C, D, E ou P.

Injection à doses multiples à administrer par la voie parentérale % p/v Gamme 15 Ingrédient actif 4,0 1 - 5 % p/v

Alcool benzylique 2,0

Trlacétäte de glycérine 30,0

Propylène glycol jusqu’à 100,0

Dissoudre l’ingrédient actif dans l’alcool benzyli-20 que et le triacétate de glycéryle. Ajouter le propylène glycol et amener à volume. Filtrer la solution pour éliminer tout agent de contamination particulaire. Introduire aseptiquement le produit dans des «fioles pour injection et les fermer avec des bouchons ou des joints étan-25 ches en caoutchouc maintenus en position par des capsules de recouvrement en aluminium. Finalement stériliser le produit en le chauffant dans un autoclave.

Spray d’aérosol # p/p Gamme 30 Ingrédient actif 0,1 0,01 à 0,50# p/p

Trichloréthane 29,9 j 52 • ’ . *

Trichlorofluorométhane 35,0

Dichlorodifluorométhane 35,0 Mélanger l’ingrédient actif au trichloréthane et introduire le mélange dans le récipient pour aérosol· Purger 5 l’espace supérieur à l’aide de propulseur gazeux et sertir la soupape en position. Introduire le poids nécessaire de propulseur liquide sous pression à travers la soupape. Equiper du dispositif d’actionnement et de coiffes de pulvérisation.

10 Comprimé

Procédé de fabrication - granulation humide mg

Ingrédient actif 250,0

Stéarate de magnésium Λ% p/p 4,5 15 Amidon de mais 5% p/p 22,5

Amidon glycolate de sodium 2% p/p 9,0

Laurylsülfate de sodium 196 p/p 4,5

Cellulose microcristalline jusqu’à un poids de . " noyau de comprimé de 20 450 mg.

Ajouter une quantité suffisante d’une pôte à 10 % d’amidon à l’ingrédient pour produira une masse humide convenant à la granulation. Préparer les granules et les sécher en utilisant un plateau ou un séchoir à lit flui-25 disé. Tamiser à travers un tamis, ajouter les ingrédients résiduels et comprimer en comprimés.

Au besoin, enrober les noyaux de comprimés d’une pellicule en utilisant de l'hydroxypropylméthylcellulo-se ou toute autre matière filmogène similaire, en se ser-30 vant d’un système solvant aqueux ou non aqueux. Un plas-. tifiant et un colorant approprié peuvent être incorporés

JL

/ I. ' 53 à la solution d’enrobage par une pellicule.

Comprimé vétérinaire à l’usage d’animaux petits/domestj-ques

Procédé de fabrication - granulation à sec

5 SE

Ingrédient actif 50f0

Stéarate de magnésium 7f5

Cellulose microcristalline pour faire un poids de noyau de comprimé de 75 f0 10 Mélanger 1*ingrédient actif au stéarate de magnésium et à la cellulose microcristalline. Comprimer le mélange en boudins, briser les boudins en les faisant passer par un granulateur rotatif pour engendrer des comprimés s* écoulant librement. Procéder à la compression en compri-15 més.

Si on le souhaite, on peut enrober les noyaux des comprimés d’une pellicule de la manière décrite plus haut.

. Injection vétérinaire intramammaire mg/dose Limites 20 Ingrédient actif 150 mg 150-500 mg

Polysorbate 60 3,0% p/p) ‘ jusqu’à 3 ou 5 g

Cire d’abeille blanche 6,OSé p/p) jusqu’à 3g jusqu’à 3 ou 5 g

Huile d’arachide 91,0% p/p) jusqu’à 3 ou 5 g 25 Chauffer l’huile d’arachide, la cire d’abeille blanche et le polysorbate 60 jusqu’à 160°C sous agitation. Maintenir . le tout à 160°C pendant 2 heures et le laisser ensuite " refroidir jusqu’à la température ambiante sous agitation.

Ajouter l’ingrédient de manière aseptique au véhicule et 30 r~-j procéder à la dispersion en se servant d’un mélangeur à

Λ J

% 54 * » haute vitesse.Raffiner par passage à travers un broyeur à colloïdes. Introduire le produit de manière aseptique dans des seringues en matière plastique stériles.

'-i

Potion vétérinaire à administrer -par la vole orale 5 # p/v Limites

Ingrédient actif 0,35 0,05-0,50 % p/v

Polysorbate 85 5,0

Alcool benzylique 3,0

Propylène glycol 30,0 10 Phosphate tampon suivant pH 6,0 - 6,5

Eau jusqu*à 100,0 . Dissoudre 1*ingrédient actif dans le polysorbate 85» 1*alcool benzylique et le propylène glycol. Ajouter une proportion de 1*eau et ajuster le pH à 6,0 - 6,5 15 avec le tampon au phosphate, si cela se révèle nécessaire. Amener au volume final avec de l*eau. Introduire le produit dans im récipient pour potions.

Pâte vétérinaire è administrer par la vole orale % p/p Limites 20 Ingrédient actif 7,5 1-10 % p/p

Saccharine 25,0

Polysorbate 85 3,0

Distéarate d*aluminium 5,0

Huile de noix de coco fractionnée 25 jusqu*à 100,0 - Disperser le distéarate d’aluminium dans l*huile de noix de coco fractionnée et le polysorbate 85 sous chauf-> fage. Refroidir jusqu*à la température ambiante et dis-

perser la saccharine dans le véhicule huileux. Répartir 301*ingrédient actif dans la base. Introduire le produit .P

/L·^ « 55 dans desæringues en matière plastique.

/

Granules vétérinaires pour 1Tadministration par la nour-riture ^ ·—* % p/p Limite 5 Ingrédient actif 2,5 0,05-5 % p/p

Farine de pierre calcaire Jusqu’à 100,0 Mélanger l’ingrédient actif à la farine de pierre calcaire. Préparer les granules en mettant en oeuvre un procédé de granulation à l’état humide. Procéder au sé-10 chage en utilisant un plateau ou un séchoir à lit fluidisé. Introduire le produit dans le récipient approprié.

Concentré émulslonnable

Ingrédient actif 50 g v Emulsif anionique 40 g 15 (par exemple phénylsulfonate CALX)

Emulsif non ionique 60 g (par exemple Syperonic ΝΡΊ3) * Solvant aromatique (par exemple Solvesso 100) Jusqu’à 1 litre 20 ’ Mélanger tous les ingrédients et agiter Jusqu’à dissolution.

Granules (a) Ingrédient actif 50 g Résine de bois 40 g 25 Granules de gypse (20-60 mesh) Jusqu’à 1 kg (par exemple Agsorb 100A) - (b) Ingrédient actif 50 g _ . _ M Syperonic NP13 40 g /L- i i t 56 % t

Granules de gypse (20-60 mesh) jusqu*à 1 kg.

Dissoudre tous les ingrédients dans un solvant volatil, par exemple le chlorure de méthylène, et ajouter la solution à des granules roulant dans un mélangeur. Sé-5 cher pour éliminer le solvant.

On a déterminé l*activité des facteurs A, B, C, D, E et F en se servant de toute une série de parasites ou organismes nuisibles et de leurs hOtes, y compris les suivants : 10 Tetranychus urticae, Myzus persicae, Heliothis virescens. Chilo portellus. Meloidogyne incognlta. Panonchus ulmi. Phorodon humull. Aulacorthum circumflexum.

On a utilisé le produit sous la forme d*une préparation liquide. On a réalisé les préparations en dissolvant > 15 le produit dans de 1*acétone. On a ensuite dilué les solu tions avec de l*eau contenant 0,1 % ou 0,01 % en poids d* v un agent mouillant jusqu*à ce que les préparations liqui des continssent la concentration voulue du produit.

Le procédé d*essai adopté eu égard à chaque organis-20 me nuisible ou parasite comprenait le support d*un cer-• tain nombre d*organismes nuisibles ou parasites par un milieu qui était habituellement une plante hôte et le traitement du milieu par la préparation (test résiduel). Dans le cas de Tetranychus urticae. on a traité à la fols 25 les organismes nuisibles ou parasites et le milieu t>ar la préparation (test de contact).

Suivant ce procédé, on a découvert que les facteurs A à F étaient efficaces en concentrations (en poids de I produit) de 500 parties par million ou moins.

-X- 3

Claims (20)

1. 57 * ( t
2. 1. Composé répondant à la formule partielle (I) OH 5 j"> ! , A'"CK3 18^05^20 Η I T ) “3 mE κΎ* ' 10 0-ÎxsJ^rB fil, 0,3
3. 0-S 15
4. 2, Composé suivant la revendication 1, répondant à la formule partielle (II) DH
5. 20 CH? § CH? X H Y^S''" 3 |X *t> V s O* 5 25 ” fili C"3 ΐ B—S 30 . 3. Composé suivant la revendication 2, répondant à I la formule générale (III) L· t 58 > OK trV"3 γίγΜ) Ν' uni h OR* A dans laquelle R représente le radical méthyle, éthyle ou - isopropyle et R représente un atome d'hydrogène ou le - radical méthyle, > '4. Composé suivant la revendication 3, caractérisé 1 2 5 en ce que R représente le radical isopropyle et R représente un atome dhydrogène.
6. 5· Composé suivant la revendication 3» caractérisé en * ce que R représente le radical méthyle et R représente un atome d'hydrogène, 10 6, Composé suivant l'une quelconque des revendications précédentes, sensiblement en l'absence d'autres composés » du type macrolide.
7. 7, Composé suivant l'une quelconque des revendications 1 à 5, sous forme sensiblement pure. 15 8, Composé suivant l'une quelconque des revendica tions 1 à 3, en mélange à au moins un autre composé sui-C vant les revendications précitées; ou les composés de la ^ revendication 3 dans lesquels R représente un atome d» ^ hydrogène en mélange les uns aux autres; ou les composés 20^ suivant la revendication 3, dans lesquels R représente ^ w « 59 * * le radical méthyle, en mélange les uns aux autres.
8. 9. Composé suivant l’une quelconque des revendica- w tions 1 à 5, sous forme d’un bouillon de fermentation entier contenant au moins un composé de ce genre; les ^ 5 solides d'un bouillon de fermentation entier contenant au moins un composé de ce genre, des mycéliums intacts ou lysés, séparés d’un tel bouillon, ou les solides d'un tel bouillon, après séparation des mycéliums intacts ou lysés; ou un tel bouillon après la séparation des 10 mycéliums·
9. 10. Composé suivant la revendication 3, pour l’utilisation à titre d’antibiotique en vue du traitement des être humains ou des animaux.
10. 11. Compositions pour l’utilisation en vue de com- 15 -battre des parasites ou organismes nuisibles, par exem- ç. pie dans le domaine agricole, horticole ou forestier, contenant une quantité efficace d’au moins un composé ^ suivant l’une quelconque des revendication 1 à 10, ainsi qu’un ou plusieurs véhicules et/ou excipients. 20 12· Compositions suivant la revendication 11, carac térisées en ce qu’elles contiennent un composé suivant la • revendication 3, éventuellement en même temps qu’un ou plusieurs agents tensio-actifs, agents antiagglutination ou anticoncrétion, agents antimousses, régulateurs de 25 viscosité, liants, adhésifs, fertilisants, stabilisants % ou autres additifs ou ingrédients actifs.
11. 13. Compositions pour l’utilisation en médecine humaine ou en médecine vétérinaire, contenant une quantité efficace d'au moins un composé suivant l’une quelconque 30 des revendications 1 à 10, en même temps qu’un ou plusieurs véhicules et/ou excipients.
12. 14. Compositions suivant la revendication 13, pour 1’ utilisation en médecine vétérinaire, caractérisées en ce qu’elles contiennent un ou plusieurs composés suivant la i 60 - - w « » * revendication 3, possédant une pureté d'au moins 50 % et j se présentant sous une forme appropriée à l'administration par la voie parentérale (y compris intramammaire), * orale, rectale, topique ou pour l'utilisation sous for-5 me d'implants.
13. 15. Compositions suivant l'une quelconque des revendications 11 à 14, caractérisées en ce qu'elles contiennent un mélange de composés actifs, constitué principalement d'un ou plusieurs composés suivant l'une quelcon- 10 que des revendications 1 à 5. Î6. Compositions suivant l'une quelconque des revendications 11 à 15, caractérisées en ce qu'elles contiennent le composé suivant la revendication 4 ou le composé suivant la revendication 5.
14. 17. Procédé de préparation d'un composé suivant la i revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend l'éta pe de culture d'un micro-organisme du genre Streptomyces, si bien que ledit composé est produit et, si on le souhaite, de séparation subséquente d'un ou plusieurs des- 20 dits composés à partir du bouillon de fermentation.
15. 18. Procédé suivant la revendication 17, caractéri- * sé en ce que le micro-organisme en question est Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12015 ou un mutant de ce dernier ou un autre membre de l'espèce Streptomyces thermoarcha- 25 ensls.
16. 19. Procédé suivant la revendication 17, caractérisé en ce que l'on met les mycéliums du micro-organisme en contact avec un solvant miscible à l'eau de manière à en extraire un ou plusieurs composés suivant la revendication 30 1.
17. 20. Composés du type macrolide qui sont productibles ^ ' par fermentation de Streptomyces thermoarchaensis.
18. 21. Micro-organismes de l'espèce Streptomyces thermo- ^ archaensls · - « “ - “ 61 Λ.
19. 22. Streptomvces thermoarchaensis NCIB 12015 et ses mutants. 2J. Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12111, NCIB ? 12112, NCIB 12113 et NCIB 12114 et leurs mutants.
20. 24. Procédé pour combattre des infections ou des infestations, par exemple, dans le domaine agricole, horticole ou forestier, caractérisé en ce que l'on applique au parasite ou à tout autre organisme nuisible ou au champignon ou à tout autre organisme responsable desdites 10 infections ou infestations, ou à l'endroit où ils logent ou à lèur biotope, une quantité efficace d'un ou plusieurs composés suivant la revendication 1 ou d'une composition suivant la revendication 11. > • » » 7>